CN118064414A - 治疗同型半胱氨酸尿症的酶替代疗法优化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PEG化人截短的胱硫醚合酶蛋白的方法，该蛋白在氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变(htCBS C15S)。用5kDa、10kDa或20kDa NHS酯PEG分子之一将htCBS C15SPEG化。在该方法中使用了对PEG化过程的过程监控，以降低未PEG化的htCBS C15S和PEG化不足的htCBS C15S的水平。PEG化htCBS C15S的给药在同型半胱氨酸尿症的整个治疗过程中均具有功效。

Description

治疗同型半胱氨酸尿症的酶替代疗法优化
本申请为申请号201880025544.X，申请日为2018年4月17日，发明名称为“治疗同型半胱氨酸尿症的酶替代疗法优化”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月17日提交的美国临时专利申请62/486,246的优先权，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表文件名为20891004PCT_SL.txt，于2018年4月17日创建，大小为10,794字节。序列表的电子格式信息通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及表征PEG化的人截短的胱硫醚β合酶(htCBS)缀合物，以鉴定其作为经典同型半胱氨酸尿症的酶替代疗法可再现生产和进一步临床开发的适用性。
发明背景
人胱硫醚β合酶(CBS，KEGG酶识别码：EC 4.2.1.22)是硫氨基酸代谢的重要酶，其活性决定硫在甲硫氨酸(Met)循环中的循环利用或其通过转硫途径转化为半胱氨酸的合成。参见Finkelstein,J.D.,J.Nutr.Biochem.1990,1,228-237，其全部内容通过引用并入本文。硫氨基酸代谢的关键中间体是非蛋白氨基酸同型半胱氨酸(Hcy)，它可以通过Met合酶或甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶的作用转化回Met，或通过CBS经由转硫途径重新定向至半胱氨酸生物合成。CBS是依赖吡哆醛5'磷酸的同四聚体血红素蛋白，它催化Hcy与丝氨酸形成胱硫醚(Cth)和水的缩合。随后，Cth在胱硫醚γ裂解酶的作用下水解为半胱氨酸(Cys)、α酮丁酸酯和氨，从而完成了必需氨基酸Met向Cys的转化。CBS的活性以及因此通过转硫途径的硫通量被酶C末端调节结构域的自抑制功能减弱。S腺苷甲硫氨酸与该结构域的结合导致调节结构域的构象重排，随后释放自抑制性模块和该酶的4-5倍活化。参见Ereno-Orbea等,Proc Natl Acad Sci U S A 2014,111,(37),E3845-52，其全部内容通过引用并入本文。可以通过去除C末端调节结构域并随后形成二聚化的、永久活化的人截短酶(htCBS)来实现相似水平的CBS激活。参见Kery等,Arch Biochem Biophys 1998,355,(2),222-32，其全部内容通过引用并入本文。
CBS活性缺乏导致经典的同型半胱氨酸尿症(HCU)，这是一种常染色体隐性遗传的罕见代谢性疾病。参见Mudd等,Disorders of transsulfuration.In The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease,第8版；Scriver,C.R.；Beaudet,A.L.；Sly,W.S.；Valle,D.；Childs,B.；Kinzler,K.；Vogelstein,B.,Eds.McGraw-Hill:New York,2001；pp 2007-2056，其全部内容通过引用并入本文。CBS的失活主要是由于存在错义的致病突变，导致HCU患者血浆样品中Hcy、Met和S腺苷同型半胱氨酸严重升高，反之则缺乏Cth和Cys降低。这些生化后遗症伴有结缔组织疾病，如脱位的光学晶状体(optic lenses)、四肢长且瘦和骨质疏松、血栓栓塞、认知障碍和其他临床症状。参见Mudd等人。目前HCU的治疗主要是对症治疗，旨在通过无Met L-氨基酸补充的蛋白质限制饮食来降低血浆和组织中的Hcy浓度。参见Komrower等,Arch Dis Child 1966,41,(220),666-71，其全部内容通过引用并入本文。这种饮食干预通常与甜菜碱结合使用，甜菜碱可促进Hcy重新甲基化回到Met。参见Smolin等J Pediatr 99(3),467-472(1981)，其全部内容通过引用并入本文。此外，通过刺激残留的CBS活性并因此缓解临床表现并放松饮食习惯，补充吡咯醛5'磷酸前体吡哆醇(维生素B6)对约50％的HCU患者有效。参见Barber等JPediatr 75(3),463-778(1969)，其全部内容通过引用并入本文。尽管Met限制一般可有效降低血浆Hcy水平，但HCU患者对饮食的依从性很差，因此会出现症状。参见Walter等,Eur.J.Pediatr.1998,157(Suppl 2),S71-S76，其全部内容通过引用并入本文。因此，在本领域中需要一种替代疗法，其不需要严格的饮食但是可以实现Hcy水平的类似降低并且防止临床症状的发作和/或恶化。
最近已经描述了使用PEG化的htCBS的HCU的酶替代疗法(ERT)。参见Bublil等,JClin Invest 2016,126,(6),2372-84和国际申请PCT/2016/061050，其全部内容通过引用并入本文。PEG化是将感兴趣的蛋白与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分或分子缀合，并且是公认的、可接受的改变多种药物的药代动力学特征以提高其治疗潜力的策略。参见Fishburn等,J Pharm Sci 2008,97,(10),4167-83，其全部内容通过引用并入本文。未修饰的htCBS表现出从疾病小鼠模型的循环中的快速清除(静脉注射后消除半衰期为2.7小时)。已观测到htCBS的PEG化可延长IV给药后PEG化htCBS的消除半衰期6-11倍，改善“仅人类”(HO)小鼠中鼠同型半胱氨酸尿的血浆代谢谱，并通过防止肝脏损害拯救CBS敲除(KO)小鼠免于新生小鼠致死性。参见Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84；其各自的全部内容通过引用并入本文。
在本领域中长期需要设计和表征PEG化的htCBS缀合物，该缀合物在制备过程中表现出高再现性和控制性，并且具有长期功效。在以前的研究中，观测到将C15S点突变引入htCBS可减少蛋白质聚集体和高阶寡聚物的形成，并改善20kDa直链马来酰亚胺活化的PEG分子的PEG化分布。参见Bublil等人。本文表征了用马来酰亚胺(MA)或N羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯活化的PEG分子进行PEG化的各种htCBS C15S缀合物(进一步称为PEG-htCBS C15S)在被清除期中断的单次给药或多次重复给药后纠正鼠同型半胱氨酸尿症的代谢特征的潜力。根据其药效学对PEG-htCBS C15S缀合物进行排序。另外，获得了对PEG-htCBS制备的可再现性和一致性以及由PEG分子修饰的位点的表征的洞察。确定了监测和评估htCBS C15SPEG化程度的测定法。
发明概述
在本文中，本发明的多个实施方案提供一种PEG化在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶蛋白(CBS)或其变体(htCBS C15S)的方法，所述方法包括：(a)将htCBS C15S与溶液中的一个或多个NHS酯PEG分子以摩尔比过量至约40倍的NHS酯PEG分子缀合以产生一个批次，其中多个NHS酯PEG分子为5kDa、10kDa或20kDa NHS酯PEG分子；(b)将该批次的尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)分析的色谱图的保留时间与具有可接受的PEG化的htCBS C15S的SEC-HPLC分析的色谱图的保留时间进行比较以鉴定PEG化不足，其中PEG化不足的批次的保留时间大于具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间；和(c)向该批次中添加另外的NHS酯PEG分子，以减少该批次中的PEG化不足的量，从而使htCBS C15S PEG化。
在本文中，本发明的多个实施方案提供一种PEG化在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶蛋白(CBS)或其变体(htCBS C15S)的方法，所述方法包括：(a)将htCBS C15S与溶液中的一个或多个NHS酯PEG分子以摩尔比过量小于约40倍的NHS酯PEG分子缀合以产生一个批次，其中多个NHS酯PEG分子为5kDa、10kDa或20kDa NHS酯PEG分子；(b)将该批次的非还原毛细管电泳(NR-CE)分析的保留时间与具有可接受的PEG化的htCBS C15S的NR-CE分析的保留时间进行比较以鉴定PEG化不足，其中PEG化不足的批次的保留时间小于具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间；和(c)向该批次中添加另外的NHS酯PEG分子，以减少该批次中的PEG化不足的量，从而使htCBS C15S PEG化。
在某些实施方案中，NHS酯PEG分子以约10倍的摩尔过量存在。在某些实施方案中，NHS酯PEG分子以约20倍的摩尔过量存在。或者，NHS酯PEG分子以小于20倍、小于10倍、小于5倍或小于2倍的摩尔过量存在。某些实施方案要求多个NHS酯PEG分子由约5kDa的NHS酯(5NHS)PEG分子组成。在某些实施方案中，多个NHS酯PEG分子由约20kDa的NHS酯(20NHS)PEG分子组成。在某些实施方案中，多个NHS酯PEG分子小于约20kDa。例如，多个NHS酯PEG分子由约10kDa的NHS酯(10NHS)PEG分子组成。在某些实施方案中，PEG化不足的htCBS C15S包含少于15个、少于10个、少于5个或少于1个PEG化的氨基酸。在某些实施方案中，具有可接受的PEG化的htCBS C15S包含至少1个PEG化的氨基酸。
在某些实施方案中，PEG化不足的htCBS C15S批次的保留时间大于约9.50分钟、约9.75分钟、约10.00分钟和约10.25分钟。在某些实施方案中，PEG化不足的htCBS C15S批次的保留时间为约9.60分钟至约9.70分钟。在某些实施方案中，具有可接受的PEG化的htCBSC15S的保留时间在约9.50分钟至约9.60分钟的范围内。在某些实施方案中，具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间小于约9.53分钟。例如，PEG化不足的PEG化的htCBS C15S包含零(0)个PEG化氨基酸。
在本文中，本发明的多个实施方案提供一种在整个治疗过程中维持治疗受试者同型半胱氨酸尿症功效的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用治疗有效量的使用上述方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)。在某些实施方案中，治疗功效可维持长达2周、长达1个月、长达6个月或长达1年。或者，治疗功效可维持长于1年。
在本文中，本发明的多个实施方案提供一种降低同型半胱氨酸尿症患者同型半胱氨酸(Hcy)水平的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的使用上述方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)。在某些实施方案中，Hcy水平降低了选自以下的范围：约5％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％以及约90％至约100％。
在本文中，本发明的多个实施方案提供一种提高同型半胱氨酸尿症患者半胱氨酸(Cys)水平的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用治疗有效量的使用上述方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)。在某些实施方案中，变体与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，将由所述给药步骤产生的治疗效果维持至少6小时、至少12小时、至少18小时或至少24小时。
在本文中，本发明的多个实施方案提供一种药物组合物，其包括使用上述方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物中的变体与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
附图简要说明
图1显示了与未修饰的htCBS C15S蛋白相比，多个20NHS PEG-htCBS C15S批次的非还原毛细管电泳(NR-CE)图。
图2显示了使用浅盐梯度(5％，10-110mM NaCl)在DEAE Sepharose上的400MAPEG-htCBS C15S物质的色谱分离。直线代表在280nm处的吸光度，而峰则显示了流动相的电导率变化。使用带有1.03版Biologic LP Data View软件的/>Biologic LP色谱系统生成两条线。“S”代表泵的启动和由软件程序记录的时间点，“E”代表泵的操作结束和由软件程序记录的时间点。“M”代表如图中的标签所示的库1和库2监视开始时的手动指定点。
图3A-3C显示了使用Lys-C消化的马来酰亚胺PEG化图谱。这些图显示在作为参考的未修饰的htCBS C15S(图3A)、同PEG化400MA PEG-htCBS C15S(P1)(图3B)和半PEG化400MAPEG-htCBS C15S(P2)(图3C)蛋白的Lys-C消化后还原的烷基化LC-MS肽图。
图4A-4C显示了使用NTCB消化的马来酰亚胺PEG化图谱。这些图显示在作为参考的未修饰的htCBS C15S(图4A)、同PEG化400MAPEG-htCBS C15S(P1)(图4B)和半PEG化400MAPEG-htCBS C15S(P2)(图4C)蛋白样品的NTCB处理后的LC-MS肽图。
图5显示了与未修饰的htCBS C15S相比，各种NHS PEG-htCBS C15S缀合物的CBS比活性。条形表示3次独立测量的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
图6显示了在清除实验中对5NHS PEG-htCBS C15S的评估。在HO小鼠中反复给予5NHS PEG-htCBS C15S(SC，7.5mg/kg)后，Hcy(正方形)、Cth(圆圈)和Cys(菱形)血浆水平。点代表单独HO小鼠的平均值(n＝6)，误差条表示SEM。
图7A-7B显示了与注射了PBS的+/-雄性小鼠(实线和正方形)和雌性小鼠(虚线和正方形)相比的20NHS PEG-htCBS C15S处理的CBS KO雄性小鼠(实线和圆圈)和雌性小鼠(虚线和圆圈)的体重(图7A)和体重增加(图7B)。图中标出了每组中的受试者数。从第二日龄开始，小鼠每周3次接受7.5mg/kg的皮下注射。
图8A-8B显示了用20NHS PEG-htCBS C15S长期处理I278T小鼠的效果，其维持改善的血浆硫氨基酸谱。图8A显示了断奶的(第21天)I278T小鼠(n＝3)中的代谢物浓度，所述小鼠每周用20NHS PEG-htCBS C15S(SC，7.5mg/kg)处理3周，持续约9个月。第21天显示处理开始前的Hcy(实线和正方形)、Cth(虚线和圆圈)和Cys(虚线和菱形)的血浆水平，而第28天和第63天显示分别进行第3次和第18次注射(即周末清除)后72小时的血浆水平。所有随后的时间点均显示给药后24小时血浆硫氨基酸。图8B显示了从26周龄开始每周3次持续约6个月注射20NHS PEG-htCBS C15S(SC，7.5mg/kg)的成年完全症状I278T小鼠(n＝10)的结果。第182天显示处理前的初始水平，所有随后的时间点代表给药后24小时的血浆代谢物。符号代表单独小鼠的平均值，误差线表示平均值的标准误差(SEM)。
图9A-9C显示了20NHS PEG-htCBS C15S在单次剂量施用后和重复施用SpragueDawley大鼠后的药代动力学。图9A示出了在单次SC施用8mg/kg(实线)或24mg/kg 20NHSPEG-htCBS C15S(虚线)后，雄性(黑色正方形，每组n＝11)和雌性大鼠(灰色圆圈，每组n＝8)的血浆中CBS比活性的半对数图。反复SC注射4mg/kg(图9B)或24mg/kg 20NHS PEG-htCBSC15S(图9C)后，雄性(黑色，n＝8)和雌性大鼠(灰色，n＝8)血浆中CBS的比活性。灰色箭头表示每2天总共给药9剂的给药时间点。所有图中的数据点表示平均值，误差线表示SEM。
发明详述
I.序言
由于CBS丢失而导致的同型半胱氨酸尿症(HCU)导致同型半胱氨酸(Hcy)积累和半胱氨酸(Cys)耗尽。在本领域中长期需要优化的靶向治疗，其将解决潜在的酶缺乏症，因此本文已经探索了基于PEG化的人截短的CBS(PEG-htCBS)的酶替代疗法的开发。观测到效力的减弱，这保证了对几种不同的PEG-htCBS C15S缀合物的筛选。根据PEG-htCBS C15S缀合物在反复给药被清除期中断后纠正鼠同型半胱氨酸尿症的血浆代谢物谱的功效进行排序。观测到CBS与马来酰亚胺PEG分子不一致地偶联。相反地，具有20kDa直链NHS-PEG的PEG-htCBS C15S缀合物显示出极少的效能损失，这可能是由于可重现的PEG化产生了用每个肽平均5个PEG化修饰的物质。另外，开发了测定法以监测CBS PEG化的程度。这些结果鉴定了最适合制备和临床开发的那些PEG-htCBS C15S缀合物。
无论是小分子药物还是生物药物，任何新型治疗开发工作的不可分割的部分都是进入临床试验的主要候选药物的选择、优化和表征。尽管有效，但是通过饮食限制来降低甲硫氨酸(Met)摄入的HCU的治疗非常难以继续，并导致严重的患者依从性问题。参见Walter等,Eur.J.Pediatr.1998,157(Suppl 2),S71-S76，其全部内容通过引用并入本文。HCU当前可用的治疗方法(即节食、吡哆醇和/或甜菜碱补充剂)的治疗目标是降低或使血浆Hcy水平正常化，因为Hcy的波动和高水平的Hcy通常与严重的并发症(尤其是血栓栓塞事件)相关。参见Morris等,Guidelines for the diagnosis and management of cystathioninebeta-synthase deficiency.J Inherit Metab Dis 2016，其全部内容通过引用并入本文。开发替代疗法(例如ERT)将减少或消除对饮食限制的依赖，这将使HCU患者及其家人享有更好的生活质量。为了实现这一治疗目标(即降低Hcy的血浆水平或使其正常化)，先前已使用了20kDa直链马来酰亚胺活化的PEG分子修饰的htCBS C15S变体，并使用HCU鼠模型提供了概念验证。参见Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84和国际申请PCT/2016/061050，其全部内容通过引用并入本文。
存在从缀合物异构体的异构混合物向单一修饰形式的治疗性大分子的PEG化趋势，例如产物的表征/鉴定和制备过程的可重复性。参见Pasut等,JControl Release 2012,161,(2),461-72，其全部内容通过引用并入本文。使用马来酰亚胺PEG分子对可及的Cys残基进行修饰是位点选择性PEG化最常用的方法之一。尽管在htCBS中将最容易接近的半胱氨酸残基15诱变成丝氨酸(C15S)，除未修饰酶的部分外，还观测到多种PEG化物质。参见Frank等,Biochemistry 2006,45,(36),11021-9，其全部内容通过引用并入本文。尽管单独的物质在色谱上是可分离的，但这种操作肯定会导致大量损失和/或可能使该方法在经济上不可行。htCBS C15S的马来酰亚胺PEG化被定位到含有残基C272和C275的肽，其中前一个残基是修饰的主要位点。两个Cys残基任一个的诱变将最有可能提高PEG化的可再现性；然而，预期到血红素饱和度和催化活性的大大降低。参见Taoka等,Biochemistry 2002,41,(33),10454-61，其全部内容通过引用并入本文。
基于苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)的针对苯丙酮尿症ERT的开发中采用了类似的PEG化策略。与本文所述的CBS不同，PAL是一种起源于蓝细菌和真菌物种的四聚体非哺乳动物酶。参见Sarkissian等,Proc Natl Acad Sci U S A2008,105,(52),20894-9，其全部内容通过引用并入本文。因此，这种外源蛋白的免疫原性代表了一个重大问题，并且使用PAL测试了各种PEG化方案。参见Gamez等,Molecular therapy:the journal of the AmericanSociety of Gene Therapy 2005,11,(6),986-9，其全部内容通过引用并入本文。PAL与范围从直链5kDa到直至支链40kDa的NHS酯PEG缀合，其中直链20kDa PEG-PAL缀合物表现出最佳的性能并掩盖了免疫原性。PEG-PAL免疫原性的降低与附着在PAL亚单位上的PEG数量成正比，基于凝胶的估计为每个PAL单体6-8个PEG可最有效地抑制免疫反应。参见Gamez等人。
当对PKU小鼠模型施用PEG-PAL时，在短期研究中血浆苯丙氨酸水平降至零，在长期研究中也克服了最初的免疫应答。参见Sarkissian等,Proc Natl Acad Sci U S A2008,105,(52),20894-9，其全部内容通过引用并入本文。需要考虑Hcy的代谢和病理生理学。与苯丙氨酸不同，Hcy是血浆中以多种化学形式(占总Hcy库的一部分)存在的具有氧化还原活性的巯基分子：硫代内酯(<1％)、游离还原(约2％)、二硫键(约18％)和蛋白质结合(约80％)。Refsum等,Clin Chem 1985,31,624-628；Rasmussen等Ann Clin Biochem 2000,37(Pt 5),627-48；Jakubowski,H.,Anal Biochem 2002,308,(1),112-9，通过引用将其全部内容并入本文。
游离Hcy显著增加到HCU中总血浆Hcy的10-25％。参见Mansoor等,Metabolism1993,42,1481-1485。此外，在同型半胱氨酸尿症中，Hcy基本上取代了与血浆白蛋白结合的Cys，这可能有助于降低HCU中发现的血浆Cys的水平。参见Bar-Or等,Biochem Biophys ResCommun 2004,325,(4),1449-53，其全部内容通过引用并入本文。白蛋白仅在肝脏中合成，在健康人中血浆浓度为33-52g/l，仅占约40％，而其余约60％的白蛋白留在血管外空间。参见Boldt等,Br J Anaesth 2010,104,(3),276-84，其全部内容通过引用并入本文。理论上，仅游离Hcy代表CBS的底物。因此，连续给予20NHS PEG-htCBS C15S后，HO小鼠体内总Hcy降低了50-80％，这可以通过与其他形式(二硫键和蛋白质结合型)相比，将代谢物的平衡转移为游离Hcy来解释。参见Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84和国际申请PCT/2016/061050，其全部内容通过引用并入本文。循环中的20NHS PEG-htCBS C15S充当过量Hcy的“槽(sink)”，以改善Hcy血浆水平。无法使水平正常化的可能原因可能是细胞内Hcy的恒定通量(特别是从肝脏中Hcy结合到新合成的白蛋白)，血管内和血管外Hcy库之间的动态平衡(主要由白蛋白介导)和同型半胱氨酸尿症诱导的促氧化环境，有利于总Hcy库的二硫键和蛋白质结合形式。然而，最近出版的HCU诊断和治疗指南建议将血浆总Hcy保持在100μM以下，以防止进展和/或发生严重并发症。参见Morris等,Guidelines for the diagnosisand management of cystathionine beta-synthase deficiency.J Inherit Metab Dis2016，其全部内容通过引用并入本文。从本文的结果中推断出数值，所述结果来自同型半胱氨酸饲喂标准无限制食物的同型半胱氨酸HO小鼠，所述食物的每公斤饲料含4-5g Met(相当于18-19％的蛋白质)。向人HCU患者给予20NHS PEG-htCBS C15S而无需任何其他治疗即可产生指南推荐的总Hcy血浆水平。基于本文的结果，已经开始使用20NHS PEG-htCBS C15S作为HCU的ERT在人体中进行GLP毒理学(GLP-tox)研究。
II.表征PEG化htCBS C15S的方法
A.htCBS C15S的PEG化(PEG-htCBS C15S)程度
在某些实施方案中，htCBS C15S的PEG化程度可用于定义各个PEG-htCBS C15S的接受标准。在一些实施方案中，PEG分子是ME-200GS(也称为20NHS)。
在某些实施方案中，尺寸排阻色谱法(SEC)-高效液相色谱法(HPLC)用于在加工期间将PEG-htCBS C15S的批次与未修饰的htCBS C15S进行比较。通过比可接受的PEG化作用的保留时间更长的保留时间来鉴定出PEG化不足的htCBS批次。在某些实施方案中，大于约9.5分钟、约9.75分钟、约10分钟和约10.25分钟的保留时间表明PEG化不足(＜1PEG/蛋白质或＜5PEG/蛋白质)。例如，9.6至9.7分钟、例如9.67分钟的保留时间可能表明PEG化不足。
在某些实施方案中，确定小于约9.6分钟、约9.4分钟、约9.2分钟和约9分钟的保留时间以表明可接受的PEG化(至少1PEG/蛋白质)。例如，9.5至9.6分钟、例如9.53分钟的保留时间可能表明可接受的PEG化。
在一些实施方案中，可以针对PEG化不足的批次将另外的PEG分子添加到反应混合物中，以潜在挽救PEG化的程度。在PEG化过程中通过SEC-HPLC进行的比较可进行多次。或者，在PEG化过程中通过SEC-HPLC进行的比较可进行一次。
在某些实施方案中，非毛细管电泳用于定量多种PEG-htCBS C15S物质。通过未修饰酶的存在和低分子量PEG-htCBS C15S物质增加的出现，鉴定出PEG化不足的PEG-htCBSC15S的批次。在某些实施方案中，液相色谱-质谱法(LC-MS)用于估计每个肽的PEG分子的数量。在某些实施方案中，观测到至少七个PEG化的赖氨酸在具有可接受的PEG化的PEG化的htCBS C15S中被修饰。例如，htCBS C15S的K25、K30、K211、K247、K271、K405和K406可以是PEG化的。赖氨酸可以具有不同程度的PEG化。更具体地，htCBS C15S的K25和K30可以被完全PEG化，而其他赖氨酸可以被部分PEG化。
在某些实施方案中，可接受的PEG化定义为每个htCBS C15S蛋白约5个PEG化位点。或者，可接受的PEG化可以选自每个htCBS CBS蛋白1-5个PEG化位点、3-7个PEG化位点和5-9个PEG化位点的至少一个范围。例如，htCBS C15S的可接受的PEG化可以包括每个蛋白质一个PEG化的赖氨酸。或者，htCBS C15S的可接受的PEG化可以包括每个蛋白质约5个PEG化的赖氨酸。
B.优化PEG缀合
先前已观测到多种方法，例如在PEG化之前用三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原可及的半胱氨酸以提高修饰酶的产量，或采用多种PEG化方案在过程中获得一致性，部分提高了PEG化的一致性。
htCBS的马来酰亚胺PEG化可为位点特异性的。在某些实施方案中，在马来酰亚胺PEG化期间，首先将htCBS C15S在C272处PEG化。或者，在马来酰亚胺PEG化期间，将htCBSC15S在C272和C275处PEG化。
或者，可以通过5、10或20kDa的直链NHS酯PEG分子中的至少一种将htCBS C15SPEG化。在某些实施方案中，NHS酯PEG分子对htCBS C15S的PEG化导致可再现的模式。在某些实施方案中，用相对于CBS蛋白多达20倍过量的PEG分子进行PEG化。例如，使用约10倍至20倍过量的5kDa NHS酯PEG(5NHS)、10kDa NHS酯PEG(10NHS)或20kDa NHS酯PEG(20NHS)分子进行htCBS C15S的PEG化。
或者，用相对于CBS蛋白约40倍至约60倍过量的PEG分子进行PEG化。在一个方面，使用约40倍过量的5kDa NHS酯PEG(5NHS)、10kDa NHS酯PEG(10NHS)或20kDa NHS酯PEG(20NHS)分子进行htCBS C15S的PEG化。或者，使用小于约40倍过量的5kDa NHS酯PEG(5NHS)、10kDa NHS酯PEG(10NHS)或20kDa NHS酯PEG(20NHS)分子进行htCBS C15S的PEG化。
在某些实施方案中，与含有残留硫酸铵的混合物中的htCBS C15S的PEG化模式相比，从未经修饰的CBS蛋白(例如未经修饰的htCBS C15S)的批次中除去来自色谱纯化的残留硫酸铵，以提高PEG化模式的可再现性。例如，可以使用缓冲液交换技术除去硫酸铵。
PEG化后，未反应的PEG分子从PEG化混合物中除去，以通过增加渗滤膜的表面积来降低其粘度。例如，表面积增加约2倍、约3倍或约4倍。或者，可以通过稀释PEG化混合物来降低粘度。例如，将PEG化混合物稀释约2倍。在某些实施方案中，未反应的PEG分子或未修饰的htCBS C15S从混合物中去除以降低免疫原性。
III.使用PEG化的htCBS C15S进行治疗
在某些实施方案中，可以给予哺乳动物经5kDa NHS酯PEG分子或20kDa NHS酯PEG分子PEG化的htCBS C15S。例如5NHS PEG-htCBS C15S或20NHS PEG-htCBS C15S。给予5NHSPEG-htCBS C15S或20NHS PEG-htCBS C15S可将血浆或肾脏、肝脏或脑组织中的Hcy水平降低至少40％。例如，Hcy水平降低超过40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。给予5NHS PEG-htCBS C15S或20NHS PEG-htCBS C15S可将血浆或肾脏、肝脏或脑组织中的Cth水平增加至少70％。例如，Cth水平增加了至少80％、至少90％或至少99％。给予5NHS PEG-htCBS C15S或20NHS PEG-htCBS C15S可将血浆或肾脏、肝脏或脑组织中的Cys水平增加至少30％。例如Cys水平增加至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
给予20NHS PEG-htCBS C15S可将血浆或肾脏、肝脏或脑组织中的高甲硫氨酸水平(Hlth)降低至少50％。例如，Hlth水平降低至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
给予20NHS PEG-htCBS C15S的治疗效果可能持续至少12小时、至少24小时、至少48小时或至少72小时。具体而言，治疗效果可持续约24小时。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)是在甲硫氨酸循环的近端部分参与甲硫氨酸向同型半胱氨酸转化的代谢物。参见Krijt等J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci.2009年7月15日；877(22-3):2061–2066，其全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，同型半胱氨酸尿症导致S-腺苷甲硫氨酸(SAM)与S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)(SAM/SAH)的比率降低，这表明甲基化能力降低。在某些实施方案中，可以通过向受试者施用PEG-htCBS C15S来增加或标准化SAM/SAH比。例如，给予20NHS PEG-htCBSC15S缀合物减少了SAH积累，从而增加了SAM/SAH比，由此使受试者体内代谢物的平衡正常化。
IV.剂量和给药
在某些实施方案中，可以通过肠胃外给药将PEG-htCBS C15S给予受试者。
在某些实施方案中，可以通过皮下(SC)、静脉内(IV)或腹膜内(IP)注射将PEG-htCBS C15S给予受试者。作为非限制性实例，可以通过皮下给药将PEG-htCBS C15S给予受试者。作为非限制性实例，可以通过静脉内给药将PEG-htCBS C15S给予受试者。作为非限制性实例，可以通过腹膜内给药将PEG-htCBS C15S给予受试者。
在某些实施方案中，可以至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或超过20次将PEG-htCBS C15S使用给受试者。
在某些实施方案中，可以每分钟、2分钟、3分钟、4分钟，5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、每小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、每天、2天、3天、4天、5天、6天、每周、每两周、3周、每月、2个月、每季度、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、每年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或18个月重复PEG-htCBS C15S的给药。
在某些实施方案中，PEG-htCBS C15S的给药可以是相隔数分钟、数小时、数天或数周的一系列剂量。一系列剂量的数量可以是2、3、4、5或6。作为非限制性实例，向受试者间隔24小时给药3剂。作为另一非限制性实例，向受试者间隔12小时给药5剂。
在某些实施方案中，PEG-htCBS C15S的施用可以遵循一系列剂量的给药方案，该一系列剂量在第一系列和第二系列剂量之间具有间隙。剂量之间的间隙可以为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、每月、2个月、每季度、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或18个月。一系列剂量的数量可以是2、3、4、5或6。作为非限制性实例，可以给予受试者相隔12小时的第一系列的5剂，然后在第一剂后14天给予受试者相隔12小时的第二系列的5剂。作为另一个非限制性实例，在8周的时间内给予受试者两剂，其中第一剂为每周两次，共两周，第二剂为每周三次，共6周。
在一个实施方案中，PEG-htCBS C15S可以在受试者甜菜碱给药后至少给药一次。甜菜碱给药和PEG-htCBS C15S给药之间的时间可以为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、每月、2个月、每季度、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或18个月。作为非限制性实例，可以在受试者甜菜碱给药后14天将PEG-htCBS C15S给予受试者。作为另一非限制性实例，可以在受试者甜菜碱给药后将2剂给予受试者。可以在甜菜碱给药后14和15天给予PEG-htCBS C15S突变体。
在一个实施方案中，PEG-htCBS C15S突变体可以与甜菜碱联合给予受试者。可以至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或超过15次给予该联合。
在一个实施方案中，PEG-htCBS C15S突变体可以在受试者最初接受甜菜碱之后与甜菜碱联合给予受试者。联合治疗和最初甜菜碱给药之间的时间可以为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、每月、2个月、每季度、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或18个月。作为非限制性实例，可以在受试者首次接受甜菜碱后14天将联合给予受试者。作为另一非限制性实例，可以在甜菜碱首次给药后将2剂给予受试者。可以在甜菜碱给药后14和15天给予该联合。
在一个实施方案中，给予受试者的PEG-htCBS C15S突变体的剂量可以为0.01mg/kg至1mg/kg，例如0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg或1mg/kg、或者5至8mg/kg，例如5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg或8mg/kg。或者，给予受试者的PEG-htCBSC15S突变体的剂量可以为约2mg/kg至约8mg/kg、约4mg/kg至约16mg/kg、约6mg/kg至24mg/kg。例如，剂量为约24mg/kg或约8mg/kg。
在一个实施方案中，PEG-htCBS C15S可以与另一种用于治疗CBSDH的治疗剂共同给药。如本文所用，“共同给药”是指两种或更多种组分的给药。共同给药的组分包括但不限于PEG-htCBS C15S、甜菜碱或维生素B6。共同给药是指同时给予两种或更多种组分或在给药之间间隔一段时间，例如1秒、5秒、10秒、15秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、1.5天、2天或超过3天。
V.定义
除非上下文另外明确指出，否则本说明书中使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数引用。因此，例如，提及一种“聚合物”包括单一聚合物以及两种或更多种相同或不同的聚合物，或者提及一种“赋形剂”包括单一赋形剂以及两种或更多种相同或不同的赋形剂之类的。
在提供数值的范围的情况下，意图是在该范围的上限和下限与该规定范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个居中值都包括在本公开中并且具体公开。例如，如果声称1μm至8μm的范围，则其是指2μm、3μm、4μm、5μm、6μm和7μm也被明确公开，以及大于或等于1μm的值的范围以及小于或等于8μm的值的范围。
“重组”在用于指代例如细胞、核酸、多肽、表达盒或载体时，是指已经通过引入新部分或改变现有部分修饰的材料或与该材料的天然或天然形式相对应的材料，或者与之相同但由合成材料生产或衍生。例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中找不到的基因(即“外源核酸”)，或者以不同水平表达的基因，通常表达不足或根本不表达。
重组技术可以包括，例如，使用重组核酸(例如编码蛋白或反义序列的cDNA)插入表达系统，例如表达载体中；将得到的构建体引入细胞中，并且该细胞表达核酸和蛋白质(如果合适)。重组技术还包括将核酸与来自不同来源的编码或启动子序列连接到一个表达盒或载体中，以表达融合蛋白、组成型表达蛋白或诱导型表达蛋白。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类。
“相关的”是指与疾病、病况或表型的发展或表现相吻合。相关可能是由于但不限于负责管家功能的基因，这些基因的改变可以为多种疾病和病况提供基础，与特定疾病、病况或表型有关的途径的一部分的那些基因，和间接导致疾病、病况或表型表现的那些基因。
“生理条件”或“生理溶液”是指具有与完整哺乳动物细胞或活哺乳动物的组织空间或器官中的条件基本相似的离子强度、pH和温度的水性环境。通常，生理条件包括具有约150mM NaCl、pH 6.5-7.6和约22-37℃的温度的水溶液。通常，生理条件是用于生物大分子的分子间缔合的合适结合条件。例如，在37℃下150mM NaCl、pH 7.4的生理条件通常是合适的。
“药学上可接受的赋形剂或载体”是指可以任选地包含在本发明的组合物中并且不会对患者产生显著的有害毒理作用的赋形剂。该术语是指可以与活性化合物(例如PEG-htCBS C15S)结合进入哺乳动物受试者体内而对受试者没有显著的不良毒理作用的赋形剂。
本文所用的术语“赋形剂”或“运载体”是指本身不是治疗剂的任何物质，其用作用于递送治疗剂的载体并且适合于施用于受试者(例如哺乳动物)或添加到药物组合物中以改善其处理或储存性能或允许或促进将剂量单位的组合物形成适合于口服的离散制品(例如胶囊或片剂)。赋形剂和运载体包括本领域已知的任何此类材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，它们是无毒的并且不会以有害的方式与组合物的其他组分相互作用。给药可以意指口服给药、吸入、肠内给药、喂食、通过静脉内注射接种。所述赋形剂可以包括标准药物赋形剂，并且还可以包括可以用于制备人类和/或动物食用的食品和饮料、饮食或诱饵制剂或其他食品的任何组分。
“渗透剂”、“药物”和“药理活性剂”或任何其他类似的术语是指适于通过本领域先前已知的方法和/或通过本公开所教导的方法施用的任何化学或生物材料或化合物，包括肽，其诱导期望的生物学或药理作用，其可以包括但不限于(1)对生物体具有预防作用并防止不希望的生物学作用，例如预防感染，(2)减轻由疾病引起的状况，例如减轻因疾病引起的疼痛或炎症，和/或(3)从生物体缓解、减轻或完全消除疾病。该作用可以是局部的(例如提供局部麻醉作用)，或者可以是全身的。本公开不涉及(drawn to)新的渗透剂或新类别的活性剂。相反，其限于现有技术中存在的或以后可被确立为活性剂并且适合于通过本公开进行递送的药剂或渗透剂的递送方式。
术语“约”(特别是关于给定数量时)意在涵盖正负5％的偏差。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的情况可能存在或可能不存在或不发生，因此该描述包括情况存在或发生的情况以及不存在或不发生的情况。
某个特征或实体的“基本上不存在”或“基本上不含”是指几乎完全或完全不存在该特征或实体。例如，对于施用PEG-htCBS C15S的受试者，基本上不存在可观测到的副作用意味着该副作用要么是不可检测的，要么仅以可忽略的程度发生，例如，与在未经治疗的患者中观测到的相同副作用的频率或强度相比，降低程度或频率约50％或更多。
与本发明组合物有关的术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但足够量的活性剂(或含有活性剂的组合物)，以在要治疗的对象的血液中或在作用位点(例如细胞内)提供所需水平，和/或提供所需的生理、生物物理、生化、药理或治疗反应，例如改善同型半胱氨酸尿症的表现。所需的确切量将因受试者而异，并且取决于许多因素，例如活性剂、组合物的活性、所采用的递送装置、组合物的物理特性、预期的患者用途(即，每日给药剂量的数量)，以及患者考虑因素，例如受试者的种类、年龄和一般状况、所治疗疾病的严重程度、受试者正在服用的其他药物、给药方式等。基于本文提供的信息，本领域技术人员可以容易地确定这些因素和考虑。基于本文提供的信息，本领域普通技术人员可以使用常规实验来确定在任何情况下的适当“有效”量。
术语“生物活性”是指本领域技术人员通常归因于核酸或蛋白质的任何生物活性。生物活性的例子是酶活性，二聚化、折叠或结合另一种蛋白质或核酸分子的能力等。
术语“核酸”可以是RNA形式或DNA形式，并且包括信使RNA、合成RNA和DNA、cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义、互补)链。
如本文所用，“变体”是不相同但在野生型核酸或氨基酸序列的全长上具有显著同源性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的核酸、蛋白质或多肽，其如公共序列数据库(例如GenBank)中的序列所示。如本文所用，“蛋白质，多肽或其肽片段”是指尽管二肽、三肽和四肽也考虑并包括在内但具有长度为通常至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的氨基酸序列的全长蛋白质或其一部分。
如本文所用，“突变体”是经设计或工程化以改变与糖基化、蛋白稳定化和/或配体结合有关的特性或功能的突变蛋白。
如本文所用，相对于给定细胞、多肽、核酸、性状或表型的术语“天然”或“野生型”是指通常在自然界中发现的形式。
如本文所用，术语“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”具有其常规含义，并且可互换地用于表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不论其长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脂化、肉豆蔻化、泛素化等)如何。此外，本文描述的多肽不限于特定长度。该定义中包括D-和L-氨基酸，以及D-和L-氨基酸的混合物。该术语也不指或排除多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。多肽可以是完整的蛋白质或其子序列。多肽也可以指包含表位的氨基酸子序列，即基本上负责多肽的免疫原性并且能够引起免疫应答的抗原决定簇。
“对应于......的位置”是指相对于另一参考核酸分子或蛋白的核酸分子或蛋白中的目标位置(即碱基编号或残基编号)。可以通过比较和比对序列以最大化匹配核苷酸或残基的数量来确定相应位置，例如，使得序列之间的同一性大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。然后，给目标位置指定参考核酸分子中分配的编号。例如，如果基因-X中的特定多态性出现在SEQ ID No.X的核苷酸2073处，为了鉴定另一个等位基因或分离物中的相应核苷酸，则将序列进行比对，然后鉴定与2073对齐的位置。由于各种等位基因可能具有不同的长度，因此标记为2073的位置可能不是核苷酸2073，而是位于“对应于”参考序列中的位置的位置。
“序列同一性百分比”和“百分比同源性”在本文中可互换使用，是指多核苷酸和多肽之间的比较，并通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定，其中与用于两个序列最佳比对的参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即缺口)。可以通过确定两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基出现的位置的数目以产生匹配的位置的数目、用匹配的位置的数目除以在比较窗口中的位置的总数并将结果乘以100得出序列同一性的百分比来计算百分比。或者，可以通过确定两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基出现的位置的数目或者用缺口将核酸碱基或氨基酸残基对齐以产生匹配的位置的数目、用匹配的位置的数目除以在比较窗口中的位置的总数并将结果乘以100得出序列同一性的百分比来计算百分比。本领域技术人员会意识到，有许多已建立的算法可用于比对两个序列。可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的寻找相似的方法、通过这些算法的计算机化实现(GCGWisconsin Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过目视检查(一般参见Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1995增补版)(Ausubel))。适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的示例是BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.3389-3402中分别进行了描述。可通过美国国家生物技术信息中心网站公开获得进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过在查询序列中识别长度为“W”的短词来识别高评分序列对(HSP)，所述短词在与数据库序列中的相同长度的词对齐时匹配或满足某个正值阈值分数“T”。T被称为邻词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻词命中作为启动搜索以找到含有它们的更长的HSP的“种子”。然后，只要能够增加累积比对分数，词的命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当满足以下情况时，停止在每个方向上的词的命中的扩展：累积比对分数从其最大实现值的数量X下降；由于一个或多个负得分残基排列的累积，累积得分为零或低于零；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用词长(W)为11、期望(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用词长(W)为3、期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
尽管所有上述算法和程序均适用于确定序列比对和序列同一性百分比，但出于本文公开的目的，通常使用GCG Wisconsin软件包中的BESTFIT或GAP程序(Madison WI)并使用提供的默认参数确定％序列同一性。
关于本文所述的肽，可以使用术语“L或D形式的氨基酸”。本领域技术人员将认识到，构成本发明化合物的各种Xn残基关于其Cα碳可能呈L-或D-构型。在一个实施方案中，特定化合物的所有Cα碳都具有相同的构型。在本发明的一些实施方案中，化合物关于一个或多个Cα碳具有特定的手性和/或在特定位置包括非肽键以赋予该化合物特定的性质。例如，众所周知的是，全部或部分由D-氨基酸组成的肽比其相应的L-肽对应物对蛋白酶更具抗性。因此，在一个实施方案中，化合物是由全部或部分D-氨基酸组成的肽。或者，对蛋白酶具有良好稳定性的化合物可包括肽类似物，所述肽类似物在指定位置包括极性相反的肽键。例如，对胰蛋白酶样蛋白酶具有稳定性的化合物包括在每个L-Arg或L-Lys残基之前具有相反极性的肽键的肽类似物；对胰凝乳蛋白酶样蛋白酶具有稳定性的化合物包括在每个中小型L-脂肪残基或L-非极性残基之前具有相反极性肽键的肽类似物。在另一个实施方案中，对蛋白酶具有稳定性的化合物包括完全由极性相反的肽键组成的肽类似物。对蛋白酶具有稳定性的其他实施方案对本领域技术人员将是显而易见的。在本文中描述了化合物的其他具体实施方案。
本文描述了用于PEG-htCBS C15S蛋白的设计、制备、制造和/或配制的组合物、方法、工艺、试剂盒和装置。在下面所附描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管与本文中所述的那些相似或等价的任何材料和方法可以用于实践或测试本发明，现在描述优选的材料和方法。本发明的其他特征、目的和优点将由该描述而变得显而易见。在该描述中，单数形式也包括复数，除非上下文另外明确指出。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。如有冲突，将以本说明书为准。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
VI.实施例
实施例1.实验步骤
A.化学品
除非另有说明，否则所有材料均购自或FISHERL-[14C]-丝氨酸获自/>Life Sciences。
B.动物
University of Colorado Denver Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)根据动物规程#B-49414(03)1E批准了所有动物规程，该委员会是AAALAC-认证的(#00235)、由Public Health Service-承保(#A 3269-01)和USDA-许可的(#84-R-0059)机构。如Maclean等,Mol.Genet.Metab.2010,101,(2-3),153-62；Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84和国际申请PCT/2016/061050(其全部内容通过引用并入本文)所述，先前已经产生了“仅人类”(HO)小鼠，并对其进行了繁殖和基因分型。将动物以来自TEKLAD GLOBAL RODENT/>(Harlan,Livermore,CA,USA)的标准挤压日粮2918、2919或2920X饲养。使用用于下颌下出血的一次性使用的刺血针将血液收集到带有凝胶的/>T-MLHG肝素锂(12.5IU)试管中(Terumo MedicalCorporation,NJ,USA)。然后将试管以1200xg离心10分钟，然后将血浆转移到1.5ml试管中，并在-80℃下保存。
C.代谢物浓度的测定
如先前所述，通过稳定同位素稀释气相色谱质谱法测定血浆代谢物。参见Allen等,Metabolism 1993,42,1448-1460。在不知道动物基因型和/或治疗方案的情况下，以盲法进行了分析。
D.尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)
CBS和PEG-htCBS C15S制剂在BioSEC-5 7.8x300 mm,孔径的柱(Agilent,CA,USA)上分离。平衡柱，并在室温下在100mM磷酸钠，pH 6.8、150mM NaCl中以1ml/min的流速运行。将于流动相中稀释至终浓度2mg/ml的蛋白质样品通过10μl样品环上样到色谱柱上，并使用UV检测器在225nm波长处进行检测。使用32karat软件(BECKMAN/>CA,USA)记录并分析色谱图。
E.非还原毛细管电泳(NR-CE)
CBS和PEG-htCBS C15S制剂在配备了30cm长、50μm ID裸熔硅胶毛细管的PA800毛细管电泳系统(BECKMANCA,USA)上进行了分析。切割毛细管，使其总长度为30cm，从样品引入口到检测窗口的距离约为20cm，并安装在具有100x800μm孔的筒中。在用水冲洗并最终用SDS MW样品缓冲液平衡之前，先用0.1M NaOH洗涤，再用0.1M HCl洗涤对毛细管进行预处理。将浓度低于10mg/ml且处于含有高盐的制剂中的蛋白质样品在水中进行缓冲液交换两次(每次约稀释7倍)以去除基质干扰，稀释至最终浓度1mg/ml，并通过在80℃下加热5分钟使其变性。使用电动注射(5kV)通过高分辨率方法加载样品20秒，并在15kV电压下分离50分钟。在220nm的UV波长记录并使用32karat软件(BECKMAN/>CA,USA)分析电泳图。
F.蛋白质纯化和PEG化
如Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84、国际申请PCT/2016/061050(通过引用将其全部内容并入本文)所述，表达并纯化了带有C15S突变的人截短的CBS(htCBS C15S)。配制纯化的酶并使用配备有XL 50ULTRAcel 30筒(再生纤维素30kDa分子量截止(MWCO)膜)的/>Tangential Flow Filter(TFF)系统(EMD Millipore,MA,USA)浓缩至200mM磷酸钾pH 6.5或100mM磷酸钠pH 7.2中。具有马来酰亚胺或NHS酯偶联基团的活化的PEG分子购自NOF Corporation(日本)。分别在100mM磷酸钾pH 6.5和50mM磷酸钠pH 7.2中，通过以所需的摩尔比(通常为CBS蛋白:PEG＝1:10)添加溶解在/>纯净水中的PEG分子至5mg/ml的最终蛋白质浓度进行htCBS C15S与马来酰亚胺和NHS酯PEG分子的PEG化。在4℃下过夜进行反应。随后，将反应混合物用/>纯净水稀释两次，将缓冲液更换为Gibco 1x PBS(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)，并使用带有/>XL 50Biomax100筒(聚醚砜100kDa MWCO膜)的/>TFF系统进行浓缩。将最终的PEG-htCBS C15S缀合物过滤除菌(Millipore的0.2μm PVDF膜滤器)，等分，在液氮中速冻并保存在-80℃。
G.蛋白质凝胶电泳
根据制造商的建议，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准，通过Bradford测定法(Thermo Pierce,MA,USA)测定蛋白浓度。使用10％Tris-甘氨酸扩展(TGX)凝胶(/>CA,USA)通过SDS-PAGE分离变性的蛋白质，而天然样品则在4–15％/>TGX凝胶中通过天然PAGE进行分离。为了可视化，用Simple Blue(Invitrogen，CA，USA)将凝胶染色。如Kurfurst等,Anal Biochem 1992,200,(2),244-8(该文献通过引用整体并入本文)中所述，使用碘化钡染色使游离PEG分子和PEG化的htCBSC15S可视化。
H.CBS活性测定
通过使用L-[14C]-丝氨酸作为具有以下修饰的标记底物，通过先前描述的放射性同位素测定来确定CBS活性。参见Kraus等,Methods Enzymol 1987,143,388-94；Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84，其全部内容通过引用并入本文。在总体积为100μl的样品中测定4或5μl未稀释的血浆30分钟。通过将20μl反应混合物与5μL冷冻过甲酸(30％H2O2：100％甲酸＝1：9)混合来终止反应，并按照原始操作流程所述进行进一步处理。
I.PEG化定位
htCBS C15S的马来酰亚胺和NHS酯PEG化的定位使用6538型ESI-QTOF质谱仪(Agilent,CA,USA)进行。原样使用作为对照的未修饰的酶和PEG化的CBS(未修饰的htCBSC15S、20NHS PEG htCBS-C15S和400MAPEG-htCBS C15S)或通过在37℃下将pH 11.5的样品孵育22小时来进行去PEG化处理(20NHS PEG-htCBS C15S)。在消化之前，将所有样品进行缓冲液交换，变性，用10mM DTT还原并用30mM碘乙酰胺烷基化。将400MAPEG-htCBS C15S和20NHS PEG-htCBS C15S分别用Lys-C和Asp-N(1:50(w/w)的比例，37℃)消化过夜。还使用2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸(NTCB)对20NHS PEG-htCBS C15S缀合物进行化学消化，以进一步区分哪些半胱氨酸残基已被修饰。使用带有UV检测的RP-HPLC(Agilent)在C18柱(XbridgeBEH130 3.5μm，4.6x150 mm)上分离肽，并使用MassHunter软件(Agilent,CA,USA)分析LC/UV/MS/MS色谱图。使用BioConfirm软件包(Agilent,CA,USA)进行肽定位和序列匹配，并进行人工验证以确保正确分配。
J.统计分析
所有数据均以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。使用不成对、双尾Studentt检验对两组进行统计学比较。通过ANOVA对3个或更多因子水平进行统计学分析，然后通过Tukey的多重比较检验确定显著性。确定小于0.05的p值对应于统计显著性。
实施例2.优化htCBS C15S的PEG化
为了理解PEG化模式并优化缀合反应以产生更均一的修饰，分离了各个PEG-htCBSC15S物质，并随后鉴定了以ME-400MA马来酰亚胺PEG分子靶向的残基(图2)。首先，将PEG化反应加载到在低电导率和更高pH(10mM TRIS.HCl pH 8.5)缓冲液中平衡的DEAESepharose色谱柱上，以增强所有400MA PEG-htCBS C15S物质的结合力，并在浅盐梯度下进行(5％，10-110mM NaCl)洗脱蛋白。图2显示了这样的一个运行的色谱图和两个库的回收率，随后将其与未修饰的htCBS C15S和400MA PEG-htCBS C15S反应混合物一起在SDS-PAGE和天然PAGE上进行分析。库的凝胶分析提供了证据，表明400MA PEG-htCBS C15S由至少3种不同的PEG-htCBS C15S物质组成。
库1(P1)富集的形式具有比库2(P2)中回收的形式更弱的负电荷(图2)和更多的PEG部分。P1中主要的400MA PEG-htCBS C15S缀合物由二聚体htCBS C15S组成，其中每种蛋白质均用ME-400MA修饰至相同程度，每个CBS二聚体最可能有2个PEG(同PEG化二聚体)。此外，P1包含少量400MA PEG-htCBS C15S物种，其具有另外1个或2个PEG部分。另一方面，P2的主要400MA PEG-htCBS C15S形式包含一种二聚酶，其中只有一种蛋白质被PEG修饰，即每个CBS二聚体有1个PEG(半PEG化二聚体)。分离单独的400MA PEG-htCBS C15S物质可以使用LC-MS鉴定马来酰亚胺PEG化位点。
对于阶段I，未修饰的htCBS C15S、P1和P2用Lys-C消化。LC-MS的结果示于图3A、图3B和图3C中。从还原/烷基化的LC-MS肽图中鉴定出的八种含半胱氨酸的肽中，七种这样的肽在所有三个样品中产生相似的相对丰度，表明这些肽不太可能被PEG化。只有包含两个半胱氨酸残基(C272和C275)的一种肽(272-322；SEQ ID NO：31)在两种400MA PEG-htCBSC15S物质(P1和P2)的每一种中均显著降低。
为了进一步区分C272和/或C275是否在阶段II中被修饰，这两个残基需要分离成不同的肽。试剂NTCB在N末端切割成一个游离的半胱氨酸残基。未修饰的参考、同PEG化和半PEG化的蛋白的LC-MS的结果示于图4A、图4B和图4C中。
与类似处理的未修饰的htCBS C15S相比，仅一种肽(244-271；SEQ ID NO：32)显示出400MA PEG-htCBS C15S形式的显著降低(P1中比P2中多)。在同PEG化的400MA PEG-htCBSC15S P1样品中，244-271肽的产率降低，而在半PEG化的400MA PEG-htCBS C15S P2样品中，产率更低。
肽回收率表明C272被阻断，因此400MAPEG-htCBS C15S形式中244-271肽的更低收率表明C272是马来酰亚胺PEG化的主要位点。半胱氨酸残基C272和C275都可能参与P1中低丰度的高分子量物质的PEG化。低NTCB消化效率导致回收肽的低丰度。
实施例3.NHS酯PEG分子与htCBS C15S的PEG化的可再现性
用马来酰亚胺PEG对htCBS C15S进行PEG化的可再现性的问题导致对其他PEG化化学的分析，特别是使用NHS酯活化的PEG。首先，用三种NHS酯PEG分子评估了htCBS C15S的修饰，以确定它们对酶活性的影响。在分别用5、10和20kDa线性NHS酯PEG分子进行PEG化中，分别测试了四种、三种和两种不同的PEG：CBS摩尔比。与定点选择的马来酰亚胺PEG化不同，NHS酯PEG分子产生了可再现的高度修饰异构体混合物，其实际上使用SDS-PAGE以及天然PAGE或SEC-HPLC不可分离。
例如，在SDS-PAGE(10％/>TGX凝胶)或天然PAGE(4-15％/>TGX凝胶)上分离了由三种直链5、10和20kDa NHS酯PEG分子(5NHS、10NHS和20NHS)修饰的htCBS C15S(相对于CBS蛋白不同摩尔过量)，并按照制造商的建议用Safe Stain(Invitrogen)染色。仅使用NR-CE(图1)实现了部分分离，其充作“指纹”化20NHS PEG-htCBS C15S生产批次的方法。
尽管PEG分子相对于CBS蛋白摩尔过量10-20倍产生了NHS PEG-htCBS C15S物质，其仅对CBS活性的有轻微影响，但更高的PEG过量(例如5kDa的NHS PEG的40和60倍和10kDa的NHS PEG的40倍)导致各自的NHS PEG-htCBS C15S缀合物的活性显著降低(图5)。因此，在不超过20倍的PEG：CBS摩尔过量的PEG化反应中，htCBS C15S与任一NHS PEG分子的缀合产生高度修饰的、庞大的NHS PEG-htCBS C15S缀合物，其具有基本上完全保留的活性。与htCBS C15S蛋白相比摩尔浓度最多20倍过量的赖氨酸靶向的5、10或20kDa NHS酯PEG对htCBS C15S进行PEG化处理不会显著影响酶的比活性(图5)，这是与马来酰亚胺PEG共有的性质(在Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84和国际申请PCT/2016/061050中显示的马来酰亚胺PEG化数据，其通过引用整体并入本文)。
htCBS C15S与20NHS酯PEG分子的PEG化显示出可再现性。类似地，如对马来酰亚胺PEG所做的那样，评估了htCBS C15S与20NHS PEG(10倍PEG：CBS摩尔过量)的PEG化的可再现性。初始批次具有高度可变的PEG化程度(数据未显示)。但是，变异的主要原因是未修饰的htCBS C15S中残留的硫酸铵。在色谱纯化结束时使用广泛的缓冲液交换方案(15-20个透析体积)，以将酶配制成预PEG化前的缓冲液，其产生可再现的PEG化模式。
将四批纯化的未修饰的htCBS C15S用20NHS PEG分子进行PEG化，得到四种20NHSPEG-htCBS C15S缀合物。分别将4对未修饰的酶(前)和20NHS PEG-htCBS C15S缀合物(后)指定为LAB、10L、TR1和TR2。蛋白质样品通过SDS-PAGE(10％TGX凝胶)或天然PAGE(4-15％/>TGX凝胶)进行解析，并按照制造商的建议用SafeStain(Invitrogen)染色或碘染色以检测PEG。还观测到未修饰的htCBS C15S和游离的未反应的PEG分子。
与所有先前的PEG-htCBS C15S缀合物相比，20NHS PEG-htCBS C15S显示出增加的粘度(数据未显示)，因此，人们担心在最终(PEG化后)缓冲液交换过程中，需要充分去除游离、未反应的PEG分子。实际上，对初始批次(例如LAB和10L)的处理产生大量未反应的PEG分子，这些PEG分子会转移到最终产品中。纠正措施包括从混合物中去除20％DMSO、用于TFF装置的更高MWCO膜滤芯(100vs 30kDa)、大3倍的表面积以及在缓冲液交换之前将PEG化混合物稀释2倍，这些都有助于降低粘度，并有助于在最终制剂(TR1和TR2)中更好地清除游离PEG分子。
实施例4.使用NHS酯PEG分子表征PEG化的程度
未观测到SDS和天然PAGE足以分辨单个20NHS PEG-htCBS C15S物质。开发了两种其他方法来表征htCBS C15S被20NHS PEG分子修饰的程度，从而可以快速评估生产中的PEG化程度，并定义产物的可接受标准(图1)。
如表1所示，一种方法依赖于将单独20NHS PEG-htCBS C15S批次的SEC-HPLC色谱图与未修饰的htCBS C15S进行比较。
表1.不同批次的UV 225nm吸光度[AU]值
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SEC-HPLC分析的优势在于，PEG化不足的批次，例如每个htCBS C15S蛋白含有少于5个PEG化位点和/或含有任何未修饰的htCBS C15S，其特征在于保留时间比所需保留时间长，并且可以通过向反应混合物中添加更多PEG分子来快速鉴定以进行挽救(过程中监测PEG化)。观测到未修饰的htCBS C15S样品的保留时间为11.97分钟。观测到来自6-70和8-23批次的样品的保留时间为9.67分钟。观测到来自6-89批次的样品的保留时间为9.88分钟。观测到来自8-22批次的样品的保留时间为9.95分钟。因此，确定保留时间大于9.67分钟指明PEG化不足。
观测到来自8-14批次的样品的保留时间为9.57分钟。观测到来自8-15批次的样品的保留时间为9.53分钟。观测到来自8-16批次的样品的保留时间为9.55分钟。观测到来自8-24批次的样品的保留时间为9.55分钟。观测到来自8-25批次的样品的保留时间为9.58分钟。因此，确定保留时间小于9.53分钟指明可接受的PEG化。
另一种方法基于非还原毛细管电泳，其允许解析和定量多种20NHS PEG-htCBSC15S物质(图1)。该批次的PEG化不足的特征在于未修饰的酶的存在和低分子量20NHS PEG-htCBS C15S物质的发生增加。因此，发现该方法适合于定义20NHS PEG-htCBS C15S最终产品的严格接受标准。
htCBS C15S的蛋白序列包含30个赖氨酸残基，它们全部代表NHS酯PEG化的潜在位点。为了鉴定参与PEG化的赖氨酸残基，对LC-UV-MS进行了三批20NHS PEG-htCBS C15S处理。去PEG化后，先前PEG化的赖氨酸留有一个接头，其使得它们能够与未修饰的赖氨酸区分开，并在用Asp-N内肽酶切割后通过肽定位进行定量，并与类似加工的未修饰的htCBS C15S进行比较。在作为参考蛋白的未修饰的htCBS C15S(对照)的Asp-N消化后进行LC-MS分析。
表2显示了肽的相对丰度，并用于计算参考酶(一种通过LC/MS/MS鉴定的烷基化的未修饰htCBS C15S)中每种肽的PEG数量。(RT＝保留时间)。
表2.参考酶的NHS酯PEG化定位
理论分子质量(单同位素)使用MassHunter BioConfirm软件(Agilent,SantaClara,CA)计算。观测质量(单同位素)在其理论值的5ppm之内。使用MassHunter软件(Agilent,Santa Clara,CA)确定丰度。观测到肽120-128具有1*氧化的修饰。观测到肽179-197具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽249-269具有1*氧化的修饰。观测到肽388-400具有1*氧化的修饰。
在Asp-N消化还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#1)之后进行LC-MS分析。表3显示了肽的相对丰度，并用于计算经LC/MS/MS鉴定的还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#1)的Asp-N消化的每条肽的PEG数量。
表3.还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#1)的Asp-N消化的NHS酯PEG化定位
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此外，鉴定出5个带有2个赖氨酸的肽和1个带有4个赖氨酸的肽，其中发现一个赖氨酸残基不一致地被PEG化：K36/39、K72/75、K82/83、K94/97/98/102、K322/325和K394/398。PEG/肽的估计数使用以下公式计算：估计的(PEG/肽)比＝(丰度(1*接头)+2*丰度(2*接头))/((丰度(无接头)+丰度(1*接头)+丰度(2*接头))。由于本领域已知PEG由于明显的溶剂化包膜并因此增加流体动力学半径而不会根据其在凝胶或色谱应用中的分子量迁移，PEG化的程度估计在每CBS单体5.0±0.5PEG的范围内。具体而言，PEG分子数/肽估计如下：2-34为1.29、9-34为1.30、35-46为0.22、47-78为0.37、79-85和198-220为0.03、86-106为0.63、245-248为0.49、270-301为0.39、321-327为0.31以及388-400为0.05。
观测到肽2-34具有1*接头的修饰。观测到肽2-34具有2*接头的修饰。观测到肽9-34具有1*接头的修饰。观测到肽9-34具有2*接头的修饰。观测到肽35-46具有1*接头的修饰。观测到肽47-78具有1*接头的修饰。观测到肽79-85具有1*接头的修饰。观测到肽86-106具有1*接头的修饰。观测到肽86-106具有1*接头的修饰。观测到肽120-128具有1*氧化的修饰。观测到肽179-197具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*接头的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽245-248具有1*接头的修饰。观测到肽249-269具有1*氧化的修饰。观测到肽270-301具有1*接头的修饰。观测到肽321-327具有1*接头的修饰。观测到肽388-400具有1*氧化的修饰。观测到肽388-400具有1*接头的修饰。观测到肽401-413具有1*接头的修饰。观测到肽401-413具有2*接头的修饰。
在Asp-N消化还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#2)之后进行LC-MS分析。表4显示了肽的相对丰度以及估计的经LC/MS/MS鉴定的还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#2)的Asp-N消化的每条肽的PEG数量。
表4.还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#2)的Asp-N消化的NHS酯PEG化定位
/>
PEG分子数/肽估计如下：2-24为1.06、9-34为0.84、35-46为0.17、47-78为0.26、79-85和198-220为0.02、86-106为0.54、245-248为0.39、270-301为0.27、321-327为0.21、388-400为0.04以及401-413为0.59。观测到肽2-34具有1*接头的修饰。观测到肽2-34具有2*接头的修饰。观测到肽9-34具有1*接头的修饰。观测到肽9-34具有2*接头的修饰。观测到肽35-46具有1*接头的修饰。观测到肽47-78具有1*接头的修饰。观测到肽79-85具有1*接头的修饰。观测到肽86-106具有1*接头的修饰。观测到肽86-106具有1*接头的修饰。观测到肽120-128具有1*氧化的修饰。观测到肽179-197具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*接头的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽245-248具有1*接头的修饰。观测到肽249-269具有1*氧化的修饰。观测到肽270-301具有1*接头的修饰。观测到肽321-327具有1*接头的修饰。观测到肽388-400具有1*氧化的修饰。观测到肽388-400具有1*接头的修饰。观测到肽401-413具有1*接头的修饰。观测到肽401-413具有2*接头的修饰。
在Asp-N消化还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#3)之后进行LC-MS分析。表5显示了批次#3的通过LC/MS/MS鉴定的肽的相对丰度和每个肽的PEG估计数量。
表5.还原的、烷基化的、PEG化的20NHS PEG-htCBS C15S(批次#3)的Asp-N消化的NHS酯PEG化定位
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PEG分子数/肽估计如下：2-34为1.24、9-34为0.98、35-46为0.18、47-78为0.31、79-85和198-220为0.03、86-106为0.61、245-248为0.48、270-301为0.29、321-327为0.21、388-400为0.05以及401-413为0.71。
观测到肽2-34具有1*接头的修饰。观测到肽2-34具有2*接头的修饰。观测到肽9-34具有1*接头的修饰。观测到肽9-34具有2*接头的修饰。观测到肽35-46具有1*接头的修饰。观测到肽47-78具有1*接头的修饰。观测到肽79-85具有1*接头的修饰。观测到肽86-106具有1*接头的修饰。观测到肽86-106具有1*接头的修饰。观测到肽120-128具有1*氧化的修饰。观测到肽179-197具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽198-220具有1*接头的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽221-233具有1*脱酰胺的修饰。观测到肽245-248具有1*接头的修饰。观测到肽249-269具有1*氧化的修饰。观测到肽270-301具有1*接头的修饰。观测到肽321-327具有1*接头的修饰。观测到肽388-400具有1*氧化的修饰。观测到肽388-400具有1*接头的修饰。观测到肽401-413具有1*接头的修饰。观测到肽401-413具有2*接头的修饰。
七个赖氨酸(K25、K30、K211、K247、K271、K405和K406)明确地被确定在一定程度上被PEG化，其中K25和K30残基似乎是唯一在三个批次中始终被完全修饰的残基。
与所有先前的PEG-htCBS C15S缀合物相比，20NHS PEG-htCBS C15S显示出增加的粘度(数据未显示)，因此，担心在最终(PEG化后)缓冲液交换过程中，需要充分去除游离、未反应的PEG。实际上，对初始批次(例如LAB和10L)的处理会产生大量未反应的PEG，这些PEG会转移到最终产品中。纠正措施包括从混合物中去除20％DMSO、用于TFF装置的更高MWCO膜滤芯(100vs 30kDa)、大3倍的表面积以及在缓冲液交换之前将PEG化混合物稀释2倍，这些都有助于降低粘度，并有助于在最终制剂(TR1和TR2)中更好地清除游离PEG。
实施例5.HO小鼠中200MA PEG-htCBS C15S功效减弱
在HO小鼠中重复给药的定义是在第一个剂量周内连续5天皮下注射7.5mg/kg的200MA PEG-htCBS C15S。中断给药10天，并在第二个剂量周再次开始另外5次连续注射。在用于基线值的首次剂量前，在两个剂量周的第二、第四和第五次注射后的24小时后，收集血浆样品，以追踪酶的功效，在清除期间则跟踪基线值的恢复(在剂量周2的第一个剂量之前的两个剂量周中的最后一个剂量后一周，以及在最后一个剂量之后的两周)。该研究表明，与剂量周1相比，剂量周2中200MA PEG-htCBS C15S功效明显减弱(参见表7)。
在清除实验中，较大的马来酰亚胺PEG分子不能解决PEG-htCBS C15S功效的减弱。由于已知专门针对可用巯基残基的马来酰亚胺PEG的使用产生了明确定义的物质，减少清除实验中200MA PEG-htCBS C15S功效损失的最初方法是用更大的马来酰亚胺PEG增加htCBS C15S蛋白的覆盖性。先前发表的数据表明，使用较大的马来酰亚胺PEG分子PEG化htCBS不影响体外催化活性，并且与200MA PEG-htCBS C15S相比，单次注射后40kDa直链(ME-400MA)或支链(GL4-400MA)马来酰亚胺PEG分子在HO小鼠中具有相似的药代动力学和药效学。参见Bublil等,J Clin Invest 2016,126,(6),2372-84和国际申请PCT/2016/061050，其全部内容通过引用并入本文。表6显示htCBS C15S的PEG化基本上不影响酶的催化活性，与PEG部分的大小和靶基团无关。
表6.未修饰的htCBS C15S和PEG-htCBS C15S缀合物的CBS比活性
PEG部分 大小和结构 活性部分(靶基团) CBS比活性(U/mg蛋白±SD)
无 N/A N/A 1233±201
ME-020MA 2kDa直链 马来酰亚胺(-SH) 1184±95
ME-200MA0B 20kDa直链 马来酰亚胺(-SH) 1339±226
ME-400MA 40kDa直链 马来酰亚胺(-SH) 1242±158
GL4-400MA 40kDa 4臂支链 马来酰亚胺(-SH) 1288±221
GL2-800MA 80kDa 2臂支链 马来酰亚胺(-SH) 1168±134
ME-050GS 5kDa直链 NHS酯(-NH2) 1250±52
ME-100GS 10kDa直链 NHS酯(-NH2) 1233±173
ME-200GS 20kDa直链 NHS酯(-NH2) 1339±242
给药方案经过专门设计，可基于其免疫原性引发免疫应答，从而对缀合物进行排序。先前已证明对同型半胱氨酸尿HO小鼠重复不间断地给予200MA PEG-htCBS C15S可以保持疗效并在注射后24小时持续2个月显著降低血浆Hcy水平，尽管血浆Hcy的两个基线水平(注射后72小时)和200MA PEG-htCBS C15S(注射后24小时)的峰值效应随着时间的推移逐渐降低。这种活性减弱的最合理的解释是宿主的免疫应答，其可能会对功效和安全性均产生不利影响，并且在批准的治疗性酶中相对常见。参见Baldo等,BioDrugs:clinicalimmunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy 2015,29,(1),31-55，其全部内容通过引用并入本文。
免疫原性可能源于痕量的未修饰酶或具有位点选择性马来酰亚胺PEG分子缀合的不充分掩蔽的htCBS C15S。因此，预期通过增加的PEG化完全不存在未修饰的酶和更大量的从免疫系统掩蔽PEG-htCBS C15S缀合物的潜在免疫原性表位可以防止功效降低。
实施例6.20NHS PEG-htCBS在HO小鼠中的保留效力
在清除实验中分析了用ME-050GS(5NHS PEG-htCBS C15S)和ME-200GS(20NHSPEG-htCBS C15S)修饰的NHS酯PEG-htCBS C15S缀合物，并将结果与马来酰亚胺PEG化缀合物的类似分析结果进行了比较。表7提供了在3周内施用不同PEG-htCBS C15S缀合物产生的代谢物的百分比变化。(W1＝1周、W2＝2周和W3＝3周)
表7.用PEG化的htCBS C15S缀合物治疗后HO小鼠中血浆硫氨基酸水平的最大变化
5NHS PEG-htCBS C15S在首批注射后显示出出色的药效学应答，但在随后的剂量周中观察到Hcy功效显著下降。Hcy水平降至48/80/111μM(基线水平：192/175/201μM)，同时Cth水平上升至43/35/37μM(基线水平：4/4/4μM)，同时在剂量周1/2/3内，Cys水平上升至219/225/174μM(基线水平：129/137/146μM)(图6和表7)。
20NHS PEG-CBS在所有三个剂量周内均显示出平衡的应答：血浆Hcy浓度从基线水平164/165/143μM降至38/49/56μM，随后Cth水平升高至40/30/27μM(基线水平：5/4/4μM)，并在剂量周1/2/3中将Cys水平同时提高至234/237/222μM(基线水平：147/149/148μM)。作为对照实验，在清除实验中分析了另外两批200MA PEG-htCBS C15S，并在随后的剂量周内再次观察到功效减弱：在剂量周1/2/3中，血浆Hcy降至44/88/112μM(基线水平：224/215/224μM)，从而使Cth水平增加到40/31/43μM(基线水平：4/3/4μM)，同时Cys水平增加到219/219/196μM(基线水平：124/118/144μM)。在向HO小鼠重复施用PEG化酶后，20NHS PEG-CBS对血浆代谢物的药效学作用减弱最小(表7)。
实施例7.通过20NHS CBS-PEG处理拯救KO小鼠的表型
评估20NHS PEG-htCBS C15S处理对KO小鼠整体健康和长膘的潜在有益作用。
从断奶(第21天)到第35日龄，每隔一天测定20NHS PEG-htCBS C15S处理的小鼠(n-16M+11F)的体重和体重增加，并与性别和年龄相匹配的PBS-处理的杂合+/-小鼠(n-14M+13F)进行比较。从第二日龄开始，小鼠每周3次接受7.5mg/kg的皮下注射。与注射了PBS的+/-雄性小鼠(黑实线和正方形)和雌性小鼠(黑虚线和正方形)比较了20NHS PEG-htCBSC15S处理的CBS KO雄性小鼠(灰实线和圆圈)和雌性小鼠(灰虚线和圆圈)的体重(图7A)和体重增加(图7B)。
在断奶时(第21天)，杂合子或KO小鼠与接受PBS或20NHS PEG-htCBS C15S的雄性或雌性小鼠之间的体重无显著差异，除了在20NHS PEG-htCBS C15S注射中雄性对雌性之间(p<0.01)。两天后(第23天)，研究小鼠间的体重没有显著差异。从第25天起，+/-雄性体重明显增加(p<0.001)，因此其体重增加超过+/-雌性以及20NHS PEG-htCBS C15S处理的KO雄性或雌性小鼠。在KO小鼠中，断奶导致短暂的生长缓慢(第23天和第25天)，其特征是体重增加较小，实际上保持了体重，然后体重稳定增加。用20NHS PEG-htCBS C15S处理的KO雄性和雌性的体重增加基本相同，在第33和35天时，处理的KO雌性小鼠的体重增加和体重赶上了注射PBS的杂合雌性小鼠的体重，而KO雄性落后于它们相应的杂合小鼠一点点。总体而言，在5周处理期结束时，用20NHS PEG-htCBS C15S处理的KO小鼠的体重稳定增长，雌性比雄性要多，赶上了PBS处理的雄性杂合小鼠的增加。
实施例8.通过用20NHS PEG-htCBS C15S处理来维持改善的血浆水平I278T小鼠的临床症状(例如面部脱发或骨质疏松症)，需要时间来发展，并且需要通过处理而得到纠正。在该实施例中，显示出用20NHS PEG-htCBS C15S处理I278T小鼠显著改善或正常化潜在的代谢失衡并维持其更长的时间。图8A和图8B显示了20NHS PEG-htCBS C15S在I278T小鼠模型中对血浆硫氨基酸的持续效力。图8A显示了，处理的3周龄无症状断奶I278T小鼠(n＝3)的血浆Hcy、Cth和Cys水平持续改善，此后每周3次SC注射(7.5mg/kg)，约9个月。在第21天首次给药之前记录的初始水平显示出大大升高的Hcy(288μM)、约为一半的正常Cys水平(129μM)和低血浆Cth(1.4μM)。分别在第3次给药(第28天)和第18次给药(第63天)后72小时测定的血浆代谢物表明，除了20NHS PEG-htCBS C15S活性的标志物Cth(这最可能由于其缓慢的肾脏清除而持续升高血浆浓度)之外，周末缺乏给药导致与初始水平多少相似的情况。
相反，给予20NHS PEG-htCBS C15S后24小时测定的血浆水平(例如，在第64天并应用于所有后续时间点)证实与初始值相比，Hcy水平实质性显著降低(105μM，p<0.001)、正常化了血浆Cys(209μM，p<0.001)和升高了Cth(43μM，p<0.001)。类似地，图8B例证了26周龄的显示该疾病多种临床征兆的I278T小鼠(n＝10)在处理6个月的时间段(每周3次，SC，7.5mg/kg)内血浆硫氨基酸的持续校正。在第182天首次给药之前记录的初始水平显示出高度升高的Hcy(321μM)、正常Cys水平的约一半(127μM)和低血浆Cth(0.3μM)。与处理前的值相比，首次给予20NHS PEG-htCBS C15S(第184天)后的24小时导致血浆Hcy明显和显著下降(143μM，p<0.001)、血浆Cys正常化(246μM，p<0.001)和血浆Cth升高(54μM，p<0.001)。定期ERT给药可维持改善的血浆代谢物特征约6个月。综上所述，常规SC注射20NHS PEG-htCBS C15S在I278T小鼠中产生了持续改善的血浆代谢物特征，因此允许进行需要长期给药的功效研究。
实施例9.正常化组织代谢物水平并改善代谢物平衡
观察到给予20NHS PEG-htCBS C15S可导致组织代谢物的校正，这与成年I278T小鼠中血浆代谢物平衡的改善有关。测量了用20NHS PEG-htCBS C15S(SC，7.5mg/kg)处理约2月龄的I278T小鼠(n＝3)与年龄匹配的健康杂合小鼠(n＝3)以及未处理的I278T小鼠(n＝3)相比的肝脏、肾脏和脑匀浆中的含硫代谢物浓度和相应血浆水平3周。含硫代谢物包括同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)、胱硫醚(Cth)、高羊毛氨酸(Hlth)和羊毛硫氨酸(Lth)。测定了血浆中总同型半胱氨酸和半胱氨酸，而测量了组织匀浆中这些硫醇的非蛋白结合部分。将I278T未成年小鼠(n＝3)用20NHS PEG-htCBS C15S(每周3次，SC，7.5mg/kg)处理3周，并与年龄匹配的未处理I278T小鼠(n＝3)和未处理的健康杂合对照(n＝3)进行比较。使用ANOVA和Tukey事后检验对数据进行比较，以确定显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns–无显著性。结果以μM(nmol/g组织)或nM(pmol/g组织)表示。
与杂合对照(血浆中为12μM，肝/肾/脑中为8/6/4μM(nmol/g))和20NHS PEG-htCBSC15S处理的I278T小鼠(血浆中为54μM，肝/肾/脑中为8/4/1μM(nmol/g)，血浆p<0.001，组织p<0.01)相比，未处理的I278T小鼠中血浆和肝/肾/脑匀浆中的总Hcy和非蛋白结合的Hcy分别大大升高(血浆中为310μM，肝/肾/脑中为29/21/12μM(nmol/g))。在处理的I278T小鼠血浆中总Hcy和组织中非蛋白结合的Hcy升高了4.5倍，与健康杂合子小鼠中的水平没有显著差异。
血浆中总Cys显著降低(91μM)，但未处理的I278T小鼠的肝/肾/脑匀浆中非蛋白结合的Cys(肝/肾/脑中为21/432/44μM(nmol/g))与用20NHS PEG-htCBS C15S处理的I278T小鼠相比没有观察到不同(血浆中为224μM，肝/肾/脑中为36/265/51μM(nmol/g)，血浆p<0.01，组织没有观察到显著性)。处理的I278T小鼠的Cys水平与健康杂合子对照相似(血浆中为255μM，肝/肾/脑中为81/322/44μM(nmol/g)，p＝不显著)。
如预期的那样，未处理的I278T小鼠血浆和组织中的Cth水平均降低：血浆中为0.3μM，肝/肾/脑中为0.4/1.2/0.8μM(nmol/g)。与未处理的I278T小鼠相比，用20NHS PEG-htCBS C15S处理显著提高了血浆(39μM)和肾脏匀浆中(36μM(nmol/g组织))的Cth，肝和脑匀浆的Cth升高较小(5和3μM(nmol/g组织))(血浆和组织匀浆均p<0.05)。尽管与健康杂合子对照(血浆中为1μM，p<0.01，肾脏中为1.2μM(nmol/g)，p<0.01)相比，处理的I278T小鼠血浆和肾脏中Cth的水平实质性更高，这可能归因于循环中的20NHS PEG-htCBS C15S的活性，其尚未完全正常化至肝脏(20μM(nmol/g组织)，无显著性)和脑匀浆(8μM(nmol/g组织)，p<0.05)的健康水平。
在未处理的I278T小鼠、20NHS PEG-htCBS C15S处理的I278T小鼠和健康杂合子对照之间，血浆和组织中Met或GSH的水平没有显著差异。
血浆和组织匀浆中的硫醚高羊毛氨酸(Hlth)和羊毛硫氨酸(Lth)的水平也已被确定为H2S生物发生的新兴替代标志物。未处理的I278T小鼠的血浆(143nM)和肝/肾/脑匀浆(6351/3324/1065nM(pmol/g组织))中的Hlth水平显著升高，并且20NHS PEG-htCBS C15S处理导致显著纠正这些水平至血浆中的45nM(不显著)和肝/肾/脑组织中的170/1317/520nM(pmol/g)(p<0.05/0.05/0.01)。有趣的是，尽管与处理的I278T小鼠相比，健康杂合子小鼠的肝脏Hlth明显更高(996nM(pmol/g组织)，p<0.01)，但与在杂合子小鼠中发现的相比，该处理仅导致剩余隔室中Hlth水平的部分降低：血浆中为8nM(p<0.05)，肾/脑组织中为247/22nM(pmol/g)(p<0.01/0.001)。
关于第二个硫醚Lth，与未处理的I278T相比，处理的I278T中只有血浆水平显著升高(75vs 17nM，p<0.01)，而组织匀浆中的Lth水平仍然相似(21/113/110vs 14/92/104nM(pmol/g肝/肾/脑组织)，这归因于组织通透性低或缺乏Lth特异性转运蛋白。与在处理的I278T小鼠中观察到的水平相比，健康杂合子小鼠中血浆Lth显著更低(32nM，p<0.01)，而其肝脏(122nM(pmol/g组织)，p<0.05)和脑组织(304nM(pmol/g组织)，p<0.001)的组织水平要么升高要么在肾脏中保持相似(145nM(pmol/g组织))。因此，给予20NHS PEG-htCBS C15S改善或恢复了处理的I278T小鼠的血浆和组织中的代谢平衡。
实施例10.比较用20NHS PEG-htCBS CBS处理的KO、HO和I278T小鼠之间的甲基化 能力
将I278T和KO小鼠中血浆和组织SAM/SAH水平比与健康杂合子对照小鼠和未处理小鼠中的该比进行比较。将I278T未成年小鼠(n＝3)用PEG-htCBS C15S处理(每周3次，SC，7.5mg/kg)3周，并与年龄匹配的未处理I278T小鼠(n＝3)和未处理的健康杂合子对照(n＝3)进行比较。从第二日龄起，每周3次给予处理的KO小鼠7.5mg/kg剂量。每组由至少三只18日龄的小鼠组成。使用多变量ANOVA和Tukey事后检验对所有数据进行比较，以确定显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns–无显著性。
基于血浆(0.4)和肝/肾/脑匀浆(0.3/0.4/0.2)中SAM/SAH比，未处理的I278T小鼠的甲基化能力显著降低，并且处理组中血浆中的SAM/SAH比显著改善至3(p<0.001)并且肝/肾/脑匀浆中至0.7/2.1/1.5(肝脏不显著；但肾脏和脑组织均p<0.01)。经20NHS PEG-htCBSC15S处理的I278T小鼠提高的甲基化能力接近或甚至正常化至在健康杂合子小鼠血浆(5，p<0.01)和肝/肾/脑匀浆(1.3/3.9/2.0，肝和脑不显著，但肾脏p<0.05)中所测量的甲基化能力。
与未处理的小鼠相比，也观察到给予20NHS PEG-htCBS C15S显著改善了处理的KO小鼠血浆和组织中的SAM/SAH比，但未使其正常化至健康杂合子对照中的水平。与血浆和其他组织水平相比，WT对照肝脏中的SAM/SAH比非常小，并且更重要的是，与KO小鼠中发现的水平相当(对照组健康杂合子和KO中为0.78和0.94，p＝ns)。另外，与未处理的KO小鼠相比，20NHS PEG-htCBS C15S处理进一步降低了处理的KO小鼠的SAM/SAH比(0.28，p<0.01)。因此，给予20NHS PEG-htCBS C15S改善或恢复了处理的KO小鼠的血浆和组织中的代谢平衡。
实施例11.20NHS PEG-htCBS C15S在大鼠中的药代动力学
还在野生型Sprague Dawley大鼠中测定了20NHS PEG-htCBS C15S的药代动力学特性。图9A示出了在单次SC施用8mg/kg(实线)或24mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S(虚线)后，雄性(黑色，每组n＝11)和雌性大鼠(灰色，每组n＝8)的血浆中对数形式的CBS比活性。
在不同剂量(8和24mg/kg)下观察到20NHS PEG-htCBS C15S的生物利用度几乎相同，这表明观察到的大鼠吸收差异可能归因于性二态性。在所有队列中，20NHS PEG-htCBSC15S的消除阶段是对数线性的，并且符合一级动力学，这意味着从血浆中清除20NHS PEG-htCBS C15S活性的一半浓度所需的时间是恒定的。组间消除半衰期的平均值为42±2小时。尽管雌雄大鼠之间存在差异，但根据SC给药后20NHS PEG-htCBS C15S活性的血浆水平估计的PK参数与24mg/kg成剂量比例。
在重复的剂量研究中还观察到了由于大鼠性二态性引起的差异，其中大鼠间隔48小时接受了4、8和24mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S共9次注射(图9B和图9C)。通常，在相同剂量水平下，雌性大鼠血浆中20NHS PEG-htCBS C15S活性的初始以及稳态水平要高于雄性大鼠，这与单剂量研究的观察结果有关。重复给药后20NHS PEG-htCBS C15S的血浆水平证实在任何剂量水平下几乎没有或没有积累，即使仅从血浆中清除了略多于一半的20NHSPEG-htCBS C15S时给予剂量(48小时给药间隔相对于平均t1/2-E＝42小时)。为了帮助理解这些意外的观察结果，在使用PK软件中的模拟功能假设重复加药后，计算了达到稳态的方式和预测的稳态血浆水平。多次给药后，观察到的血浆20NHS PEG-htCBS C15S活性水平为稳态下峰和谷预测值的15-52％和0-35％，如表8所示。(N/A＝不适用)
表8.预测和观测的cmax-SS和cmin-SS
观测的cmax和cmin对应于第二剂后在血浆中观察到的20NHS PEG-htCBS C15S的最高和最低浓度。预测值来自使用单剂量PK研究的时间浓度曲线进行的模拟。在两种性别中，观察到重复给药后的血浆水平在24mg/kg剂量下均比在8mg/kg剂量下更接近其预测值。
等价物和范围
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价物。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。
在权利要求中，诸如“一”、“一个”和“该”的冠词可以表示一个或多于一个，除非相反地指出或以其他方式从上下文中显而易见。如果组中的一个、多于一个或所有组成员在给定产品或过程中存在、在其中使用或以其他方式相关，则认为包括组中一个或多个成员之间的“或”的声明或描述是满足的，除非相反地指出或以其他方式从上下文中显而易见。本发明包括这样的实施方案，其中该组的恰好一个成员存在于给定产品或过程中存在、在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关。本发明包括其中多于一个或所有组成员存在、在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在是开放的并且允许但不是必须包含额外的元素或步骤。当在本文中使用术语“包含”时，术语“由......组成”因此也被涵盖和公开。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解的是，除非另外指出或从本领域普通技术人员的上下文和理解中显而易见，否则表示为范围的值可以假设在本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确规定，否则至该范围下限单位的十分之一。
另外，应当理解的是，落入现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为这些实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在此未明确阐述排除，也可以排除它们。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等等)都可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除而不管与现有技术的存在是否有关。
应当理解的是，已经使用的词语是描述性的词语而不是限制性的词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而在其更广泛的方面不脱离本发明的真实范围和精神。
尽管已经相对于几个所描述的实施方案以某种长度描述了本发明，但是本发明并不限于任何这样的细节或实施方案或任何特定的实施方案，而应鉴于现有技术以引用的方式进行解释，以对所附权利要求书的保护以提供对这些权利要求的最广泛可能的解释，从而有效地涵盖本发明的预期范围。

Claims (25)

1.一种PEG化在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)的方法，所述方法包括：
(a)将htCBS C15S与溶液中的一个或多个NHS酯PEG分子以摩尔比过量至约40倍的NHS酯PEG分子缀合以产生一个批次，其中多个NHS酯PEG分子为5kDa、10kDa或20kDa NHS酯PEG分子；
(b)将该批次的尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)分析的色谱图的保留时间与具有可接受的PEG化的htCBS C15S的SEC-HPLC分析的色谱图的保留时间进行比较以鉴定PEG化不足，其中PEG化不足的批次的保留时间大于具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间；和
(c)向该批次中添加另外的NHS酯PEG分子，以减少该批次中的PEG化不足的量，从而使htCBS C15S PEG化。
2.一种PEG化在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)的方法，所述方法包括：
(a)将htCBS C15S与溶液中的一个或多个NHS酯PEG分子以摩尔比过量小于约40倍的NHS酯PEG分子缀合以产生一个批次，其中多个NHS酯PEG分子为5kDa、10kDa或20kDa NHS酯PEG分子；
(b)将该批次的非还原毛细管电泳(NR-CE)分析的保留时间与具有可接受的PEG化的htCBS C15S的NR-CE分析的保留时间进行比较以鉴定PEG化不足，其中PEG化不足的批次的保留时间小于具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间；和
(c)向该批次中添加另外的NHS酯PEG分子，以减少该批次中的PEG化不足的量，从而使htCBS C15S PEG化。
3.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中NHS酯PEG分子以约10倍的摩尔过量存在。
4.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中NHS酯PEG分子以约20倍的摩尔过量存在。
5.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中NHS酯PEG分子以小于20倍、小于10倍、小于5倍或小于2倍的摩尔过量存在。
6.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中一个或多个NHS酯PEG分子由5kDa NHS酯(5NHS)PEG分子组成。
7.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中一个或多个NHS酯PEG分子由10kDa NHS酯(10NHS)PEG分子组成。
8.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中一个或多个NHS酯PEG分子由20kDa NHS酯(20NHS)PEG分子组成。
9.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中多个NHS酯PEG分子中的每一个均由小于约20kDa的PEG分子组成。
10.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中PEG化不足的htCBS C15S包含少于15个、少于10个、少于5个或少于1个PEG化的氨基酸。
11.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的方法，其中具有可接受的PEG化的htCBS C15S包含至少1个PEG化的氨基酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中PEG化不足的htCBS C15S批次的保留时间大于约9.50分钟、约9.75分钟、约10.00分钟和约10.25分钟。
13.根据权利要求12所述的方法，其中PEG化不足的htCBS C15S批次的保留时间介于约9.60分钟至约9.70分钟间。
14.根据权利要求14所述的方法，其中具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间在约9.50至约9.60分钟的范围内。
15.根据权利要求14所述的方法，其中具有可接受的PEG化的htCBS C15S的保留时间小于约9.53分钟。
16.一种在整个治疗过程中维持治疗受试者同型半胱氨酸尿症功效的方法，该方法包括：
(a)向受试者施用治疗有效量的使用根据权利要求1或权利要求2所述的方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中治疗功效维持长达2周、长达1个月、长达6个月或长达1年。
18.根据权利要求16所述的方法，其中治疗功效维持长于1年。
19.一种降低同型半胱氨酸尿症患者中同型半胱氨酸(Hcy)水平的方法，该方法包括：
(a)向受试者施用治疗有效量的使用根据权利要求1或权利要求2所述的方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中Hcy水平降低了选自以下的范围：约5％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％以及约90％至约100％。
21.一种提高同型半胱氨酸尿症患者中半胱氨酸(Cys)水平的方法，该方法包括：
(a)向受试者施用治疗有效量的使用根据权利要求1或权利要求2所述的方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)。
22.根据权利要求1、2或12-21中任一项所述的方法，其中变体与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
23.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中由给药步骤产生的治疗效果维持至少6小时、至少12小时、至少18小时或至少24小时。
24.一种药物组合物，其包含使用根据权利要求1或权利要求2所述的方法PEG化的在SEQ ID NO:1氨基酸位置15处具有半胱氨酸至丝氨酸的突变的人截短的胱硫醚β合酶(CBS)蛋白或其变体(htCBS C15S)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中变体与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
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