JP2020516322A - ホモシスチン尿症の治療のための酵素補充療法の最適化 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニン−シンターゼタンパク質（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）をＰＥＧ化する方法を提供する。ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ分子の１つによりＰＥＧ化した。ＰＥＧ化プロセスのインプロセスモニタリングを本方法において使用して未ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ及び不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのレベルを低減させた。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、ホモシスチン尿症のための治療の過程全体にわたり効力を有した。

Description

本発明は、古典的ホモシスチン尿症のための酵素補充療法としての、再現可能な製造及びさらなる臨床開発についての好適性を同定するためのＰＥＧ化ヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ｈｔＣＢＳ）コンジュゲートの特徴付けに関する。

ヒトシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ、ＫＥＧＧ酵素識別番号：ＥＣ４．２．１．２２）は硫黄アミノ酸代謝の重要な酵素であり、その活性はメチオニン（Ｍｅｔ）サイクルにおける硫黄の再循環又はトランススルフレーション経路を介するシステインの合成へのその転換のいずれかを決定する。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献１）参照。硫黄アミノ酸代謝の重要な中間体は非タンパク質構成アミノ酸ホモシステイン（Ｈｃｙ）であり、それはＭｅｔシンターゼ若しくはベタインホモシステインメチルトランスフェラーゼの作用によりＭｅｔに再変換され、又はＣＢＳによりトランススルフレーション経路を介するシステイン生合成に再指向され得る。ＣＢＳは、ピリドキサール５’−リン酸依存性ホモ四量体ヘムタンパク質であり、それは、シスタチオニン（Ｃｔｈ）及び水を形成するＨｃｙとセリンとの縮合を触媒する。続いて、Ｃｔｈは、シスタチオニンγ−リアーゼの作用によりシステイン（Ｃｙｓ）、α−ケト酪酸及びアンモニアに加水分解され、それが必須アミノ酸ＭｅｔのＣｙｓへの変換を完了させる。ＣＢＳの活性、及びしたがってトランススルフレーション経路を介する硫黄のフラックスは、酵素のＣ末端調節ドメインの自己阻害機能により減衰される。このドメインへのＳ−アデノシルメチオニンの結合は、調節ドメインの立体構造的再構成、後続の自己阻害ブロック放出及び酵素の４〜５倍の活性化をもたらす。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献２）参照。類似レベルのＣＢＳ活性化は、Ｃ末端調節ドメインの除去及び結果的な二量体の永久活性化ヒトトランケート酵素（ｈｔＣＢＳ）の形成により達成することができる。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献３）参照。

ＣＢＳ活性の欠落は、常染色体劣性遺伝性の希少代謝障害である古典的ホモシスチン尿症（ＨＣＵ）をもたらす。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献４）参照。ＣＢＳの不活性化は、主にミスセンス病原性突然変異の存在に起因し、ＨＣＵ患者の血漿試料におけるＨｃｙ、Ｍｅｔ、及びＳ−アデノシルホモシステインの重度の上昇並びに逆にＣｔｈの欠落及びＣｙｓの減少を生じさせる。これらの生化学的続発症は、結合組織障害、例えば、水晶体脱臼、細長い四肢及び骨粗鬆症、血栓塞栓症、認知機能障害並びに他の臨床症状を伴う。（非特許文献４）参照。ＨＣＵの現行の治療は、大部分が対症療法であり、Ｍｅｔ不含Ｌ−アミノ酸補給を有するタンパク質制限食により血漿及び組織におけるＨｃｙ濃度の低減を目的とする。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献５）参照。この食事介入は、ＨｃｙのＭｅｔに戻す再メチル化を促進するベタインと組み合わせられることが多い。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献６）参照。さらに、ピリドキサール５’−リン酸前駆体ピリドキシン（ビタミンＢ_６）の補給は、残留ＣＢＳ活性を刺激し、したがって臨床的顕在化を軽減し、食事療法を緩和することによりＨＣＵ患者のほぼ５０％において有効であると示された。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献７）参照。Ｍｅｔ制限は一般に血漿Ｈｃｙレベルの低下において有効であるが、ＨＣＵ患者の食事の順守がかなり不十分であり、結果的に症状の顕在化を招く。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献８）参照。したがって、厳密な食事を要求しないが、Ｈｃｙレベルの類似の低減を達成し、臨床症状の出現及び／又は深刻化を予防する代替療法が当分野において必要とされている。

ＨＣＵのための酵素補充療法（ＥＲＴ）は、近年、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳを使用して記載されている。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献９）及び（特許文献１）参照。ＰＥＧ化は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分又は分子への目的のタンパク質のコンジュゲーションであり、種々の薬物の薬物動態プロファイルを変更してそれらの治療潜在性を改善するために十分認識され、受け入れられている方針である。参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献１０）参照。非修飾ｈｔＣＢＳは、疾患のマウスモデルの循環からの急速なクリアランスを呈した（ＩＶ投与後の排出半減期は２．７時間であった）。ｈｔＣＢＳのＰＥＧ化は、ＩＶ投与後のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳの排出半減期を６〜１１倍だけ延長させ、「ヒューマンオンリー」（ＨＯ）マウスにおけるネズミホモシスチン尿症の血漿代謝プロファイルを改善し、肝損傷を予防することにより新生児致死からＣＢＳノックアウト（ＫＯ）マウスをレスキューすることが観察されている。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる（非特許文献９）参照。

高い再現性及び製造の間の制御を呈し、長期効力を有するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳコンジュゲートを設計し、特徴付けすることが当分野において長きにわたり必要とされている。従来の研究において、ｈｔＣＢＳへのＣ１５Ｓ点突然変異の導入は、タンパク質凝集物及びより高次のオリゴマーの形成を縮小させることが観察され、２０ｋＤａの直鎖マレイミド活性化ＰＥＧ分子についてのＰＥＧ化プロファイルを改善した。（非特許文献９）参照。マレイミド（ＭＡ）又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル活性化ＰＥＧ分子のいずれかによりＰＥＧ化された種々のｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲート（さらにＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと称する）が、単回投与又はウォッシュアウト期間により中断される複数回の反復投与ラウンド後にネズミホモシスチン尿症の代謝プロファイルを補正するそれらの効能について本明細書において特徴付けされる。ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートを、それらの薬力学に基づき格付けした。さらに、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ調製の再現性及び一貫性並びにＰＥＧ分子により修飾される部位の特徴付けについての見識が得られた。ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化の程度をモニタリングし、評価するためのアッセイを同定した。

国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書

フィンケルシュタイン，Ｊ．Ｄ．（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｄ．）著、ジャーナル・オブ・ヌトリショナル・バイオケミストリー（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９０年、第１巻、ｐ．２２８〜２３７ エレノ−オルベア（Ｅｒｅｎｏ−Ｏｒｂｅａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２０１４年、第１１１巻、第３７号、ｐ．３８４５〜５２ ケリー（Ｋｅｒｙ）ら著、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ）、１９９８年、第３５５巻、第２号、ｐ．２２２〜３２ マッド（Ｍｕｄｄ）ら著、「遺伝性疾患の代謝及び分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）」第８版における「トランススルフレーションの障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）」；スクリバー，Ｃ．Ｒ．（Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．）；ボーデ，Ａ．Ｌ．（Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．）；スライ，Ｗ．Ｓ．（Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．）；バレ，Ｄ．（Ｖａｌｌｅ，Ｄ．）；チャイルズ，Ｂ．（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．）；キンズラー，Ｋ．（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．）；フォーゲルシュタイン，Ｂ．（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．）編、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）：ニューヨーク、２００１年、ｐ．２００７〜２０５６ コムロワー（Ｋｏｍｒｏｗｅｒ）ら著、アーカイブス・オブ・ディジーズ・イン・チャイルドフッド（Ａｒｃｈ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ）、１９６６年、第４１巻、第２２０号、ｐ．６６６〜７１ スモリン（Ｓｍｏｌｉｎ）ら著、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ）、第９９巻、第３号、ｐ．４６７〜４７２（１９８１年） バーバ（Ｂａｒｂｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ）、第７５巻、第３号、ｐ．４６３〜７７８（１９６９年） ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．）、１９９８年、第１５７巻、補遺２、ｐ．７１〜７６ バブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４ フィッシュバーン（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ）、２００８年、第９７巻、第１０号、ｐ．４１６７〜８３

高い再現性及び製造の間の制御を呈し、長期効力を有するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳコンジュゲートを設計し、特徴付けすることが当分野において長きにわたり必要とされている。

本明細書における本発明の種々の実施形態は、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）をＰＥＧ化する方法であって、（ａ）ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子とを約４０倍までのモル過剰のＮＨＳエステルＰＥＧ分子の溶液中でコンジュゲートさせてバッチを作出すること（複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ分子である）；（ｂ）バッチのサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析からのクロマトグラフィープロファイルからの保持時間と、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラフィープロファイルからの保持時間とを比較して不十分なＰＥＧ化を同定すること（不十分なＰＥＧ化を有するバッチは、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの保持時間よりも長い保持時間を有する）；及び（ｃ）追加のＮＨＳエステルＰＥＧ分子をバッチに添加してバッチにおける不十分なＰＥＧ化の量を低減させ、それによりｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳをＰＥＧ化することを含む方法を提供する。

本明細書における本発明の種々の実施形態は、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）をＰＥＧ化する方法であって、（ａ）ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子とを約４０倍未満のモル過剰のＮＨＳエステルＰＥＧ分子の溶液中でコンジュゲートさせてバッチを作出すること（複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ分子である）；（ｂ）バッチの非還元キャピラリー電気泳動（ＮＲ−ＣＥ）分析からのクロマトグラフィープロファイルからの保持時間と、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＮＲ−ＣＥ分析からのクロマトグラフィープロファイルからの保持時間とを比較して不十分なＰＥＧ化を同定すること（不十分なＰＥＧ化を有するバッチは、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの保持時間よりも短い保持時間を有する）；（ｃ）追加のＮＨＳエステルＰＥＧ分子をバッチに添加してバッチにおける不十分なＰＥＧ化の量を低減させ、それによりｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳをＰＥＧ化することを含む方法を提供する。

ある実施形態において、ＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、約１０倍のモル過剰で存在する。ある実施形態において、ＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、約２０倍のモル過剰で存在する。或いは、ＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、２０倍未満、１０倍未満、５倍未満、又は２倍未満のモル過剰で存在する。ある実施形態は、複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子が約５ｋＤａのＮＨＳエステル（５ＮＨＳ）ＰＥＧ分子からなることを提供する。ある実施形態において、複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、約２０ｋＤａのＮＨＳエステル（２０ＮＨＳ）ＰＥＧ分子からなる。ある実施形態において、複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、約２０ｋＤａ未満である。例えば、複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、約１０ｋＤａのＮＨＳエステル（１０ＮＨＳ）ＰＥＧ分子からなる。ある実施形態において、不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、１５個未満、１０個未満、５つ未満、又は１つ未満のＰＥＧ化アミノ酸を含む。ある実施形態において、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、少なくとも１つのＰＥＧ化アミノ酸を含む。

ある実施形態において、不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのバッチの保持時間は、約９．５０分間、約９．７５分間、約１０．００分間、及び約１０．２５分間よりも長い。ある実施形態において、不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのバッチの保持時間は、約９．６０分間〜約９．７０分間である。ある実施形態において、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの保持時間は、約９．５０〜約９．６０分間の範囲内である。ある実施形態において、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの保持時間は、約９．５３分間よりも短い。例えば、不十分なＰＥＧ化を有するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、０個のＰＥＧ化アミノ酸を含む。

本明細書における本発明の種々の実施形態は、治療の継続期間全体にわたり対象におけるホモシスチン尿症のための治療の効力を維持する方法であって、上記の方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有する治療有効量のヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、治療の効力は、２週間まで、１ヵ月間まで、６ヵ月間まで、又は１年間まで維持される。或いは、治療の効力は、１年間よりも長く維持される。

本明細書における本発明の種々の実施形態は、ホモシスチン尿症を有する対象におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）のレベルを低減させる方法であって、上記方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有する治療有効量のヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を対象に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態において、Ｈｃｙのレベルは、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、及び約９０％〜約１００％から選択される範囲の群から選択される範囲で低減される。

本明細書における本発明の種々の実施形態は、ホモシスチン尿症を有する対象におけるシステイン（Ｃｙｓ）のレベルを増加させる方法であって、上記方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有する治療有効量のヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、バリアントは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有する。ある実施形態において、投与ステップから生じる治療効果は、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、又は少なくとも２４時間維持される。

本明細書における本発明の種々の実施形態は、上記方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）；及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態において、医薬組成物中のバリアントは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有する。

非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓタンパク質と比較した複数の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓバッチの非還元キャピラリー電気泳動（ＮＲ−ＣＥ）プロファイルを示す。 緩やかな塩勾配（５％、１０〜１１０ｍＭのＮａＣｌ）を使用したＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）上の４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種のクロマトグラフィー分離を示す。直線は２８０ｎｍにおける吸光度を表す一方、ピークは移動相の伝導度の変化を示す。両方の線は、バイオ−ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）（登録商標）バイオロジックＬＰデータビューソフトウェア（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰ Ｄａｔａ Ｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）バージョン１．０３を有するバイオ−ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）（登録商標）バイオロジックＬＰ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰ）クロマトグラフィーシステムを使用して作成した。「Ｓ」は、ポンプの開始及びソフトウェアプログラムによる記録の時点を表し、「Ｅ」は、ポンプの作動終了及びソフトウェアプログラムによる記録の時点を表す。「Ｍ」は、図中の標識により示されるプール１及びプール２のモニタリングの開始の手作業により指定された時点を表す。 Ｌｙｓ−Ｃ消化を使用するマレイミドＰＥＧ化マッピングを示す。これらの図は、参照としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図３Ａ）、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ１）（図３Ｂ）、及びヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ２）（図３Ｃ）タンパク質のＬｙｓ−Ｃ消化後の還元アルキル化ＬＣ−ＭＳペプチドマップを示す。 Ｌｙｓ−Ｃ消化を使用するマレイミドＰＥＧ化マッピングを示す。これらの図は、参照としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図３Ａ）、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ１）（図３Ｂ）、及びヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ２）（図３Ｃ）タンパク質のＬｙｓ−Ｃ消化後の還元アルキル化ＬＣ−ＭＳペプチドマップを示す。 Ｌｙｓ−Ｃ消化を使用するマレイミドＰＥＧ化マッピングを示す。これらの図は、参照としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図３Ａ）、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ１）（図３Ｂ）、及びヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ２）（図３Ｃ）タンパク質のＬｙｓ−Ｃ消化後の還元アルキル化ＬＣ−ＭＳペプチドマップを示す。 ＮＴＣＢ消化を使用するマレイミドＰＥＧ化マッピングを示す。これらの図は、参照としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図４Ａ）、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ１）（図４Ｂ）、及びヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ２）（図４Ｃ）タンパク質試料のＮＴＣＢ処理後のＬＣ−ＭＳペプチドマップを示す。 ＮＴＣＢ消化を使用するマレイミドＰＥＧ化マッピングを示す。これらの図は、参照としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図４Ａ）、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ１）（図４Ｂ）、及びヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ２）（図４Ｃ）タンパク質試料のＮＴＣＢ処理後のＬＣ−ＭＳペプチドマップを示す。 ＮＴＣＢ消化を使用するマレイミドＰＥＧ化マッピングを示す。これらの図は、参照としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図４Ａ）、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ１）（図４Ｂ）、及びヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（Ｐ２）（図４Ｃ）タンパク質試料のＮＴＣＢ処理後のＬＣ−ＭＳペプチドマップを示す。 非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと比較した種々のＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳコンジュゲートのＣＢＳ比活性を示す。バーは３つの別個の計測からの平均を表し、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を指定する。 ウォッシュアウト実験における５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの評価を示す。ＨＯマウスにおける５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）の反復投与後のＨｃｙ（四角）、Ｃｔｈ（丸）及びＣｙｓ（菱形）の血漿レベル。点は個々のＨＯマウス（ｎ＝６）からの平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。 ＰＢＳ注射＋／−雄（実線及び四角）及び雌（点線及び四角）と比較した２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理ＣＢＳ ＫＯ雄（実線及び丸）及び雌（点線及び丸）マウスの体重（図７Ａ）及び重量増加（図７Ｂ）を示す。それぞれの群における対象数をプロット中に示す。マウスは、２日齢から７．５ｍｇ／ｋｇの皮下注射を週３回受けた。 ＰＢＳ注射＋／−雄（実線及び四角）及び雌（点線及び四角）と比較した２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理ＣＢＳ ＫＯ雄（実線及び丸）及び雌（点線及び丸）マウスの体重（図７Ａ）及び重量増加（図７Ｂ）を示す。それぞれの群における対象数をプロット中に示す。マウスは、２日齢から７．５ｍｇ／ｋｇの皮下注射を週３回受けた。 改善された血漿硫黄アミノ酸プロファイルを持続する２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳによるＩ２７８Ｔマウスの長期処理の効果を示す。図８Ａは、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）により約９ヵ月間、週３回処理された離乳（２１日目）Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）における代謝産物濃度を示す。２１日目は、処理開始前のＨｃｙ（実線及び四角）、Ｃｔｈ（点線及び円）、及びＣｙｓ（点線及び菱形）の血漿レベルを示す一方、２８及び６３日目は、それぞれ３回目及び１８回目の注射の７２時間後の血漿レベルを説明する（すなわち、週末ウォッシュアウト）。全ての後続の時点は、投薬の２４時間後の血漿硫黄アミノ酸を示す。 改善された血漿硫黄アミノ酸プロファイルを持続する２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳによるＩ２７８Ｔマウスの長期処理の効果を示す。図８Ｂは、２６週齢から２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）を約６ヵ月の期間、週３回注射された成体完全症候性Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝１０）についての結果を示す。１８２日目は処理前の初回レベルを示し、全ての後続の時点は投薬の２４時間後の血漿代謝産物を表す。記号は個々のマウスからの平均値を表し、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。 ２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの、スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットへの単回投与後及び反復投与後の薬物動態を示す。図９Ａは、８ｍｇ／ｋｇ（実線）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（点線）の単回ＳＣ投与後の雄（黒色四角、それぞれの群でｎ＝１１）及び雌ラット（灰色丸、それぞれの群でｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性の片対数プロットを示す。４ｍｇ／ｋｇ（図９Ｂ）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図９Ｃ）の反復ＳＣ注射後の雄（黒色、ｎ＝８）及び雌ラット（灰色、ｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性。灰色矢印は、２日毎に投与された合計９回の用量についての投薬時点を指定する。全てのプロットにおけるデータ点は平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。 ２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの、スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットへの単回投与後及び反復投与後の薬物動態を示す。図９Ａは、８ｍｇ／ｋｇ（実線）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（点線）の単回ＳＣ投与後の雄（黒色四角、それぞれの群でｎ＝１１）及び雌ラット（灰色丸、それぞれの群でｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性の片対数プロットを示す。４ｍｇ／ｋｇ（図９Ｂ）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図９Ｃ）の反復ＳＣ注射後の雄（黒色、ｎ＝８）及び雌ラット（灰色、ｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性。灰色矢印は、２日毎に投与された合計９回の用量についての投薬時点を指定する。全てのプロットにおけるデータ点は平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。 ２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの、スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットへの単回投与後及び反復投与後の薬物動態を示す。図９Ａは、８ｍｇ／ｋｇ（実線）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（点線）の単回ＳＣ投与後の雄（黒色四角、それぞれの群でｎ＝１１）及び雌ラット（灰色丸、それぞれの群でｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性の片対数プロットを示す。４ｍｇ／ｋｇ（図９Ｂ）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（図９Ｃ）の反復ＳＣ注射後の雄（黒色、ｎ＝８）及び雌ラット（灰色、ｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性。灰色矢印は、２日毎に投与された合計９回の用量についての投薬時点を指定する。全てのプロットにおけるデータ点は平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。

Ｉ．導入
ＣＢＳの損失に起因するホモシスチン尿症（ＨＣＵ）は、ホモシステイン（Ｈｃｙ）の蓄積及びシステイン（Ｃｙｓ）の枯渇を引き起こす。原因となる酵素欠損に対処する最適化された標的治療が当分野において長きにわたり必要とされており、したがって、ＰＥＧ化ヒトトランケートＣＢＳ（ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ）に基づく酵素補充療法の開発を本明細書において探索した。効能の減衰が観察され、これは、いくつかの異なるＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートのスクリーニングを保証した。ウォッシュアウトにより中断される反復投与後のネズミホモシスチン尿症の血漿代謝産物プロファイルを補正する効力に基づき、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートを格付けした。ＣＢＳは、マレイミドＰＥＧ分子と一貫性なくカップリングすることが観察された。対照的に、２０ｋＤａの直鎖ＮＨＳ−ＰＥＧを有するＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートは効能の極めてわずかな損失を示し、それはペプチド当たり平均５つのＰＥＧ化部位で修飾された種をもたらす再現可能なＰＥＧ化に起因する可能性が高かった。さらに、ＣＢＳ ＰＥＧ化の程度をモニタリングするためのアッセイを開発した。これらの結果は、製造及び臨床開発に最も好適な分析されたもののＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートを同定した。

任意の新規治療開発努力の不可欠な部分は、それが小分子薬物か生物剤かにかかわらず、臨床試験にエントリーするためのリード候補の選択、最適化及び特徴付けである。食事制限を介してメチオニン（Ｍｅｔ）取り込みを低減させるためのＨＣＵの治療は、有効であるが従うことが極めて困難であり、深刻な患者の順守問題をもたらす。参照により全体として本明細書に組み込まれるウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．）、１９９８年、第１５７巻、補遺２、ｐ．７１〜７６参照。現在利用可能なＨＣＵのための治療、すなわち、制限食、ピリドキシン、及び／又はベタイン補給の治療目的は、血漿Ｈｃｙレベルを低減させ、又は正常化することである。それというのも、Ｈｃｙの変動及び高レベルは、重度の合併症、特に血栓塞栓イベントを伴うことが多いためである。参照により全体として本明細書に組み込まれるモリス（Ｍｏｒｒｉｓ）ら著、「シスタチオニンβ−シンターゼ欠損の診断及び管理についての指針（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」、ジャーナル・オブ・インヘリテッド・メタボリック・ディジーズ（Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ）、２０１６年参照。代替治療、例えば、ＥＲＴの開発は、食事制限への依存を低減させ、又は排除し、それによりＨＣＵ患者及びその家族はより良好な生活の質に近づくことができる。この治療目的（すなわち、Ｈｃｙの血漿レベルの低減又は正常化）を達成するため、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓバリアントが２０ｋＤａの直鎖マレイミド活性化ＰＥＧ分子により既に修飾されており、概念実証はＨＣＵのネズミモデルを使用して提供された。参照により全体として本明細書に組み込まれるバブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４及び国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書参照。

治療巨大分子のＰＥＧ化においてコンジュゲート異性体の異種混合物から単一修飾形態に向かう傾向、例えば、産物の特徴付け／同定及び製造プロセスの再現性が存在する。参照により全体として本明細書に組み込まれるパスト（Ｐａｓｕｔ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロール・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）、２０１２年、第１６１巻、第２号、ｐ．４６１〜７２参照。マレイミドＰＥＧ分子を使用するアクセス可能なＣｙｓ残基の改変は、部位選択的ＰＥＧ化に最も一般的に使用されるアプローチの１つである。ｈｔＣＢＳ中の最もアクセス可能なシステイン残基１５のセリンへの突然変異誘発（Ｃ１５Ｓ）にもかかわらず、非修飾酵素の分画に加えて複数のＰＥＧ化種が観察された。参照により全体として本明細書に組み込まれるフランク（Ｆｒａｎｋ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００６年、第４５巻、第３６号、ｐ．１１０２１〜９参照。個々の種はクロマトグラフィーにより分離可能であるが、そのような操作はかなりの損失を確実にもたらし、及び／又はプロセスを経済的に存続し得なくする可能性が高い。Ｃ２７２及びＣ２７５残基を含有するペプチドにｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのマレイミドＰＥＧ化をマッピングし、前者の残基が修飾のための主な部位であった。いずれかのＣｙｓ残基の突然変異誘発がＰＥＧ化の再現性を増加させた可能性が最も高いが；しかしながら、ヘム飽和及び触媒活性のかなりの低減が予期された。参照により全体として本明細書に組み込まれるタオカ（Ｔａｏｋａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年、第４１巻、第３３号、ｐ．１０４５４〜６１参照。

ＰＥＧ化のための類似の方針が、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）に基づくフェニルケトン尿症のためのＥＲＴの開発において用いられた。本明細書に記載のＣＢＳとは異なり、ＰＡＬは、シアノバクテリア及び真菌種に由来する四量体非哺乳動物酵素である。参照により全体として本明細書に組み込まれるサルキシャン（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００８年、第１０５巻、第５２号、ｐ．２０８９４〜９参照。したがって、このような外来タンパク質の免疫原性はかなりの懸念を表し、ＰＡＬについて種々のＰＥＧ化プロトコルが試験された。参照により全体として本明細書に組み込まれるガメス（Ｇａｍｅｚ）ら著、「分子療法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ）」、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサエティ・オブ・ジーン・セラピー（ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００５年、第１１巻、第６号、ｐ．９８６〜９参照。ＰＡＬは、直鎖５ｋＤａから分枝鎖４０ｋＤａサイズまでの範囲のＮＨＳエステルＰＥＧとコンジュゲートされ、直鎖２０ｋＤａのＰＥＧ−ＰＡＬコンジュゲートが性能の増加を実証し、最良に免疫原性をマスクした。ＰＥＧ−ＰＡＬ免疫原性の低減は、ＰＡＬサブユニットに付着しているＰＥＧの数に正比例し、ゲルベース推定値のＰＡＬ単量体当たり６〜８つのＰＥＧが最も効率的に免疫応答を抑制した。ガメス（Ｇａｍｅｚ）ら参照。

ＰＥＧ−ＰＡＬがＰＫＵマウスモデルに投与された場合、血漿フェニルアラニンレベルは、短期試験において０に下がり、初回免疫応答の克服後、長期試験においても０に下がった。参照により全体として本明細書に組み込まれるサルキシャン（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００８年、第１０５巻、第５２号、ｐ．２０８９４〜９参照。Ｈｃｙ代謝及び病態生理学を考慮することが必要である。Ｈｃｙは、フェニルアラニンとは異なり、種々の化学形態（総Ｈｃｙプールの率として）：チオラクトン形態（＜１％）、遊離還元形態（約２％）、ジスルフィド形態（約１８％）、及びタンパク質結合形態（約８０％）で血漿中に存在する酸化還元活性チオール基含有分子である。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるレフサム（Ｒｅｆｓｕｍ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、１９８５年、第３１巻、ｐ．６２４〜６２８；ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら著、アヌルズ・オブ・クリニカル・バイオケミストリー（Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２０００年、第３７巻、第５部、ｐ．６２７〜４８；ジャクボウスキー，Ｈ．（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ，Ｈ．）著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２００２年、第３０８巻、第１号、ｐ．１１２〜９。

遊離Ｈｃｙは、ＨＣＵにおいて総血漿Ｈｃｙの１０〜２５％にかなり増加される。マンスール（Ｍａｎｓｏｏｒ）ら著、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、１９９３年、第４２巻、ｐ．１４８１〜１４８５参照。さらに、Ｈｃｙは、ホモシスチン尿症において、血漿アルブミンに結合しているＣｙｓとかなり置き換わり、それはＨＣＵに見出される血漿Ｃｙｓのレベルの減少に寄与し得る。参照により全体として本明細書に組み込まれるバーオ（Ｂａｒ−Ｏｒ）ら著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ）、２００４年、第３２５巻、第４号、ｐ．１４４９〜５３参照。アルブミンはもっぱら肝臓中で合成され、健常ヒトにおける３３〜５２ｇ／ｌのその血漿濃度は約４０％にのみ相当する一方、残りの約６０％のアルブミンは血管外空間中に留まる。参照により全体として本明細書に組み込まれるボルト（Ｂｏｌｄｔ）ら著、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・アネスセジア（Ｂｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ）、２０１０年、第１０４巻、第３号、ｐ．２７６〜８４参照。理論的には、遊離ＨｃｙのみがＣＢＳについての基質を表す。したがって、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの連続投与時のＨＯマウスにおける総Ｈｃｙの５０〜８０％の減少は、他の形態（ジスルフィド及びタンパク質結合）と比較して遊離Ｈｃｙを優先する代謝産物の均衡へのシフトにより説明することができる。参照により全体として本明細書に組み込まれるバブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４及び国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書参照。循環中の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、過剰のＨｃｙのための「シンク」として機能してＨｃｙ血漿レベルを改善する。レベルを正常化し得ない考えられる理由は、細胞内Ｈｃｙの継続的なフラックス（特に、新たに合成されたアルブミンに結合しているＨｃｙとして肝臓から）、血管内及び外Ｈｃｙプール間の動的均衡（大部分がアルブミンにより媒介される）、並びに総Ｈｃｙプールのジスルフィド及びタンパク質結合形態を優先するホモシスチン尿症誘導酸化促進性環境であり得た。それにもかかわらず、近年公開されたＨＣＵの診断及び管理についての指針は、重度の合併症の進行及び／又は発生を予防するために１００μＭ未満の血漿総Ｈｃｙの保持を推奨した。参照により全体として本明細書に組み込まれるモリス（Ｍｏｒｒｉｓ）ら著、「シスタチオニンβ−シンターゼ欠損の診断及び管理についての指針（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」、ジャーナル・オブ・インヘリテッド・メタボリック・ディジーズ（Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ）、２０１６年参照。値は、食餌１ｋｇ当たり４〜５ｇのＭｅｔ（タンパク質の１８〜１９％に対応する）を含有する標準的な未制限通常食を給餌されたホモシスチン尿症ＨＯマウスからの本明細書における結果から外挿される。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのヒトＨＣＵ患者への投与は、いかなる追加の治療もなしで指針により推奨される血漿における総Ｈｃｙレベルをもたらす。本明細書における結果に基づき、ＨＣＵのためのＥＲＴとして２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを使用するヒトにおけるＧＬＰ毒性（ＧＬＰ−ｔｏｘ）試験が開始された。

ＩＩ．ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを特徴付けする方法
Ａ．ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化（ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）の程度
ある実施形態において、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化の程度を使用して個々のＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓについての判定基準を定義することができる。一部の実施形態において、ＰＥＧ分子は、ＭＥ−２００ＧＳ（２０ＮＨＳとしても公知）である。

ある実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、処理の間のＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのバッチを非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと比較する。不十分にＰＥＧ化されたｈｔＣＢＳバッチは、許容可能なＰＥＧ化についての保持時間よりも長い保持時間により同定される。ある実施形態において、約９．５分間、約９．７５分間、約１０分間、及び約１０．２５分間よりも長い保持時間は、不十分なＰＥＧ化（＜１つのＰＥＧ／タンパク質又は＜５つのＰＥＧ／タンパク質）を示す。例えば、９．６〜９．７分間、例えば、９．６７分間の保持時間は、不十分なＰＥＧ化を示し得る。

ある実施形態において、約９．６分間、約９．４分間、約９．２分間、及び約９分間よりも短い保持時間は、許容可能なＰＥＧ化（少なくとも１つのＰＥＧ／タンパク質）を示すことが決定された。例えば、９．５〜９．６分間、例えば、９．５３分間の保持時間は、許容可能なＰＥＧ化を示し得る。

一部の実施形態において、追加のＰＥＧ分子を不十分なＰＥＧ化バッチについて反応混合物に添加してＰＥＧ化の程度を潜在的にレスキューすることができる。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる比較は、ＰＥＧ化プロセスの間に複数回実施することができる。或いは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる比較は、ＰＥＧ化プロセスの間に１回実施することができる。

ある実施形態において、非キャピラリー電気泳動を使用して複数のＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種を定量する。ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの不十分にＰＥＧ化されたバッチを、非修飾酵素の存在及び低分子量ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種の発生の増加により同定した。ある実施形態において、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用してペプチド当たりのＰＥＧ分子数を推定する。ある実施形態において、少なくとも７つのＰＥＧ化リジンが、許容可能なＰＥＧ化を有するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ中で修飾されていると観察される。例えば、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＫ２５、Ｋ３０、Ｋ２１１、Ｋ２４７、Ｋ２７１、Ｋ４０５、及びＫ４０６をＰＥＧ化することができる。リジンは、変動するＰＥＧ化の程度を有し得る。より具体的には、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＫ２５及びＫ３０を完全な程度にＰＥＧ化することができる一方、他のリジンを部分的にＰＥＧ化することができる。

ある実施形態において、許容可能なＰＥＧ化は、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓタンパク質当たり約５つのＰＥＧ化部位と定義される。或いは、許容可能なＰＥＧ化は、ｈｔＣＢＳ ＣＢＳタンパク質当たり１〜５つのＰＥＧ化部位、３〜７つのＰＥＧ化部位、及び５〜９つのＰＥＧ化部位の少なくとも１つの範囲から選択することができる。例えば、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの許容可能なＰＥＧ化は、タンパク質当たり１つのＰＥＧ化リジンを含み得る。或いは、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの許容可能なＰＥＧ化は、タンパク質当たり約５つのＰＥＧ化リジンを含み得る。

Ｂ．ＰＥＧコンジュゲーションの最適化
種々のアプローチ、例えば、修飾酵素の収量を向上させるためのＰＥＧ化前のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によるアクセス可能なシステインの還元又はプロセスにおける一貫性を得るための複数のＰＥＧ化スキームが、ＰＥＧ化の一貫性を部分的に改善することが既に観察されている。

ｈｔＣＢＳのマレイミドＰＥＧ化は、部位特異的であり得る。ある実施形態において、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、マレイミドＰＥＧ化の間に最初にＣ２７２においてＰＥＧ化される。或いは、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、マレイミドＰＥＧ化の間にＣ２７２及びＣ２７５においてＰＥＧ化される。

或いは、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、５、１０、又は２０ｋＤａの直鎖ＮＨＳエステルＰＥＧ分子の少なくとも１つによりＰＥＧ化することができる。ある実施形態において、ＮＨＳエステルＰＥＧ分子によるｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、再現可能なパターンをもたらす。ある実施形態において、ＰＥＧ化は、ＣＢＳタンパク質に対して２０倍過剰までのＰＥＧ分子により実施される。例えば、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、約１０倍〜２０倍過剰の５ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（５ＮＨＳ）、１０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（１０ＮＨＳ）、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（２０ＮＨＳ）分子により実施される。

或いは、ＰＥＧ化は、ＣＢＳタンパク質に対して約４０倍〜約６０倍過剰のＰＥＧ分子により実施される。一態様において、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、約４０倍過剰の５ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（５ＮＨＳ）、１０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（１０ＮＨＳ）、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（２０ＮＨＳ）分子により実施される。或いは、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、約４０倍過剰未満の５ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（５ＮＨＳ）、１０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（１０ＮＨＳ）、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ（２０ＮＨＳ）分子により実施される。

ある実施形態において、クロマトグラフィー精製からの残留硫酸アンモニウムをＣＢＳタンパク質の非修飾バッチ、例えば、非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓから除去し、残留硫酸アンモニウムを含有する混合物におけるｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化パターンの再現性と比較してＰＥＧ化パターンの再現性を増加させる。例えば、硫酸アンモニウムは、緩衝液交換技術を使用して除去することができる。

ＰＥＧ化後、透析濾過膜の表面積を増加させることにより未反応ＰＥＧ分子をＰＥＧ化混合物から除去してその粘度を低減させる。例えば、表面積は、約２倍、約３倍、又は約４倍だけ増加される。或いは、粘度は、ＰＥＧ化混合物を希釈することにより低減させることができる。例えば、ＰＥＧ化混合物を約２倍だけ希釈する。ある実施形態において、未反応ＰＥＧ分子又は非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを混合物から除去して免疫原性を低減させる。

ＩＩＩ．ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓによる処理
ある実施形態において、哺乳動物に、５ｋＤａのエステルＮＨＳ ＰＥＧ分子又は２０ｋＤａのエステルＮＨＳ ＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されたｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを投与することができる。例えば、５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ又は２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ。５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ又は２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、血漿中又は腎臓、肝臓、若しくは脳組織中のＨｃｙのレベルを少なくとも４０％だけ低減させる。例えば、Ｈｃｙレベルは、４０％超、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％だけ低減される。５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ又は２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、血漿中又は腎臓、肝臓、若しくは脳組織中のＣｔｈのレベルを少なくとも７０％だけ増加させる。例えば、Ｃｔｈレベルは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％だけ増加される。５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ又は２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、血漿中又は腎臓、肝臓、若しくは脳組織中のＣｙｓのレベルを少なくとも３０％だけ増加させる。例えば、Ｃｙｓレベルは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％だけ増加される。

２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、血漿中又は腎臓、肝臓、若しくは脳組織中のホモランチオニン（Ｈｌｔｈ）のレベルを少なくとも５０％だけ低減させ得る。例えば、Ｈｌｔｈレベルは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％だけ低減される。

２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与の治療効果は、少なくとも２４時間の少なくとも１２時間、少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間継続し得る。具体的には、治療効果は、約２４時間継続し得る。

Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）及びＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）は、メチオニンサイクルの隣接部分の間でメチオニンのホモシステインへの変換に関与する代謝産物である。本明細書における参照により全体として本明細書に組み込まれるクリジト（Ｋｒｉｊｔ）ら著、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー Ｂ アナリティカル・テクノロジーズ・イン・ザ・バイオメディカル・アンド・ライフサイエンシズ（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．）、２００９年、７月１５日、第８７７巻、第２２−３号、ｐ．２０６１〜２０６６参照。ある実施形態において、ホモシスチン尿症は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）とＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）との比（ＳＡＭ／ＳＡＨ）の低減をもたらし、それはメチル化能の減少を示す。ある実施形態において、ＳＡＭ／ＳＡＨ比は、対象へのＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与により増加させ、又は正常化することができる。例えば、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートの投与は、ＳＡＨ蓄積を低減させ、したがって、ＳＡＭ／ＳＡＨ比を増加させ、それにより対象における代謝産物の均衡を正常化する。

ＩＶ．投薬及び投与
ある実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、非経口投与により対象に投与することができる。

ある実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）又は腹腔内（ＩＰ）注射により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、皮下投与により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、静脈内投与により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、腹腔内投与により対象に投与することができる。

ある実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２０回超、対象に投与することができる。

ある実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１年間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、又は１８ヵ月間ごとに反復することができる。

ある実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、数分間、数時間、数日間又は数週間空けた投与系列であり得る。投与系列の回数は、２、３、４、５又は６回であり得る。非限定的な例として、対象は、２４時間空けて３回投与で投与される。別の非限定的な例として、対象は、１２時間空けて５回投与で投与される。

ある実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、第１の投与系列及び第２の投与系列間の間隔を有する投与系列の投薬スケジュールに従い得る。投与間の間隔は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、又は１８ヵ月であり得る。投与系列の回数は、２、３、４、５又は６回であり得る。非限定的な例として、対象に、５回の第１投与系列を１２時間空けて投与することができ、次いで第１投与の１４日後、対象に５回の第２投与系列を１２時間空けて投与する。別の非限定的な例として、対象に、２つの投与系列を８週間の期間にわたり投与し、第１の系列は、２週間、週２回、１回の投与であり、第２の投与系列は、６週間、週３回である。

一実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、対象にベタインを投与した後に少なくとも１回投与することができる。ベタイン投与及びＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ間の時間は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１２ヵ月間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、又は１８ヵ月間であり得る。非限定的な例として、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、対象にベタインを投与して１４日後に投与することができる。別の非限定的な例として、対象にベタインを投与した後に２回投与で対象に投与することができる。ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ突然変異体は、ベタイン投与の１４及び１５日後に投与することができる。

一実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ突然変異体は、ベタインとの組合せで対象に投与することができる。組合せは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回又は１５回超投与することができる。

一実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ突然変異体は、対象が最初にベタインを受けた後にベタインとの組合せで対象に投与することができる。組合せ治療及び最初のベタイン投与間の時間は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１２ヵ月間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、又は１８ヵ月間であり得る。非限定的な例として、組合せは、対象に最初にベタインを投与して１４日後に投与することができる。別の非限定的な例として、対象に最初にベタインを投与した後に２回投与で対象に投与することができる。組合せは、ベタイン投与の１４及び１５日後に投与することができる。

一実施形態において、対象に投与されるＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ突然変異体の用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ若しくは１ｍｇ／ｋｇ、又は５〜８ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ若しくは８ｍｇ／ｋｇであり得る。或いは、対象に投与されるＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ突然変異体の用量は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１６ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜２４ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、用量は、約２４ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇである。

一実施形態において、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、ＣＢＳＤＨを治療するための別の治療薬と同時投与することができる。本明細書において使用される「同時投与する」は、２つ以上の構成成分の投与を意味する。同時投与のための構成成分としては、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ、ベタイン又はビタミンＢ６が挙げられる。同時投与は、同時又は投与間の時間差、例えば、１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間、２０分間、２１分間、２２分間、２３分間、２４分間、２５分間、２６分間、２７分間、２８分間、２９分間、３０分間、３１分間、３２分間、３３分間、３４分間、３５分間、３６分間、３７分間、３８分間、３９分間、４０分間、４１分間、４２分間、４３分間、４４分間、４５分間、４６分間、４７分間、４８分間、４９分間、５０分間、５１分間、５２分間、５３分間、５４分間、５５分間、５６分間、５７分間、５８分間、５９分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、１．５日間、２日間又は３日間超の時間差での２つ以上の構成成分の投与を指す。

Ｖ．定義
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、単一ポリマー及び同一又は異なるポリマーの２つ以上を含み、又は「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤及び同一又は異なる賦形剤の２つ以上などを含む。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限及び下限間のそれぞれの介在値並びにその記述範囲内の任意の他の記述又は介在値が本開示内に包含され、具体的に開示されることが意図される。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が記述される場合、１μｍ以上の値の範囲及び８μｍ以下の値の範囲だけでなく、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、及び７μｍも明示的に開示されることが意図される。

「組換え体」は、例えば、細胞、核酸、ポリペプチド、発現カセット又はベクターに関して使用される場合、新たな部分の導入若しくは既存の部分の変更により改変されており、若しくはそれらと同一であるが、合成材料から産生され、若しくはそれに由来する材料、又はその材料の天然若しくは天然形態に対応する材料を指す。例えば、組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え）含む形態内で見出されない遺伝子（すなわち、「外因性核酸」）を発現し、又は他では異なるレベルにおいて発現され、典型的には、過少発現され、若しくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。

組換え技術としては、例えば、発現系、例えば、発現ベクター中への挿入のためのタンパク質又はアンチセンス配列をコードする組換え核酸、例えば、ｃＤＮＡの使用を挙げることができ；得られる構築物を細胞中に導入し、細胞は、適宜、核酸、及びタンパク質を発現する。組換え技術は、融合タンパク質の発現、タンパク質の構成的発現、又はタンパク質の誘導性発現のための１つの発現カセット又はベクター中への異なる資源からのコード又はプロモータ配列への核酸のライゲーションも包含する。

用語「対象」、「個体」又は「患者」は、本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ヒトが挙げられる。

「関連する」は、疾患、病態又は表現型の発生又は顕在化との一致を指す。関連は、限定されるものではないが、変更が種々の疾患及び病態についての下地を提供し得るハウスキーピング機能を担う遺伝子、特定の疾患、病態又は表現型に関与する経路の一部であるもの及び疾患、病態又は表現型の顕在化に間接的に寄与するものに起因し得る。

「生理学的条件」又は「生理学的溶液」は、インタクトな哺乳動物細胞中の、又は生存哺乳動物の組織空間若しくは器官中の条件に実質的に類似するイオン強度、ｐＨ、及び温度を有する水性環境を指す。典型的には、生理学的条件は、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５〜７．６、及び約２２〜３７℃の温度を有する水溶液を含む。一般に、生理学的条件は、生物学的巨大分子の分子間会合に好適な結合条件である。例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３７℃の生理学的条件が一般に好適である。

「薬学的に許容可能な賦形剤又は担体」は、場合により、本発明の組成物中に含めることができ、患者に対する顕著な有害毒性効果を引き起こさない賦形剤を指す。この用語は、活性化合物（たとえば、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）と会合させて哺乳動物対象の体内に取り込むことができ、対象に対する顕著な有害毒性効果を示さない賦形剤を指す。

本明細書において使用される用語「賦形剤」又は「ビヒクル」は、それ自体は治療剤でなく、治療剤の送達のための担体として使用され、対象、例えば、哺乳動物への投与に好適であり、又は取扱若しくは貯蔵特性を改善するため、若しくは経口投与に好適な個別の製品、例えば、カプセル剤又は錠剤への組成物の投与単位の形成を許容若しくは容易にするために医薬組成物に添加される任意の物質を意味する。賦形剤及びビヒクルは、非毒性であり、組成物の他の構成成分との有害的な相互作用を示さない当分野において公知の任意のそのような材料、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などを含む。投与は、経口投与、吸入、腸内投与、摂食又は静脈内注射による摂取を意味し得る。賦形剤としては、標準的な医薬賦形剤を挙げることができ、ヒト及び／又は動物消費用の食料及び飲料、飼料又は餌配合物又は他の食材を調製するために使用することができる任意の構成成分を挙げることもできる。

「浸透剤」、「薬物」、及び「薬理学的に活性な薬剤」又は任意の他の類似用語は、限定されるものではないが、（１）生物に対する予防効果を有すること及び不所望な生物学的効果を予防すること、例えば、感染の予防、（２）疾患により引き起こされる病態を軽減すること、例えば、疾患の結果として引き起こされる疼痛若しくは炎症を軽減すること、並びに／又は（３）生物から疾患を軽減、低減、若しくは完全に排除することのいずれかを例として挙げることができる所望の生物学的又は薬理学的効果を誘導する当分野において既に公知の方法による、並びに／又は本開示において教示される方法による投与に好適な任意の化学又は生物学的材料又は化合物、例として、ペプチドを意味する。効果は局所的であり得、例えば、局所麻酔効果の提供、又は全身性であり得る。本開示は、新規浸透剤に関するものでも、新たなクラスの活性剤に関するものでもない。むしろ、本開示は、技術水準に存在し、又は活性剤として後に確立され得、本開示による送達に好適な薬剤又は浸透剤の送達の方式に限定される。

用語「約」は、特に、所与の量に関して、５パーセントの範囲のずれを包含することを意味する。
「任意選択」又は「場合により」は、続いて記載される状況が、存在してもしなくてもよく、生じても生じなくてもよく、その結果、記載がその状況が存在し、又は生じる場合及びその状況が存在もせず、生じもしない場合を含むことを意味する。

ある特徴部又は実体の「実質的に不存在」又は「実質的に有さない」は、特徴部又は実体のほぼ完全に又は完全に不存在であることを意味する。例えば、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが投与された対象について、観察可能な副作用の実質的な不存在は、このような副作用が検出不能であり、又は無視可能な程度、例えば、未治療患者において観察される同一の副作用の頻度又は強度のいずれかと比較して約５０％以上だけ低減する程度又は頻度でのみ生じることを意味する。

本組成物に関する用語「薬理学的有効量」又は「治療有効量」は、治療すべき対象における血流中又は作用部位（例えば、細胞内）における所望レベルを提供するため、及び／又は所望の生理学的、生物物理学的、生化学的、薬理学的又は治療応答、例えば、ホモシスチン尿症の顕在化の改善を提供するための活性剤（又は活性剤を含有する組成物）の非毒性であるが十分な量を指す。要求される正確な量は対象ごとに変動し、多数の因子、例えば、活性剤、組成物の活性、用いられる送達デバイス、組成物の物理的特徴、意図される患者使用（すなわち、１日当たりの投与用量の回数）、並びに患者の検討事項、例えば、対象の種、年齢、及び全身状態、治療される病態の重症度、対象により摂取される追加の薬物、投与方式などに依存する。これらの因子及び検討事項は、本明細書において提供される情報に基づき当業者により容易に決定することができる。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、本明細書において提供される情報に基づき定型的な実験を使用して当業者により決定することができる。

用語「生物学的活性」は、当業者により典型的に核酸又はタンパク質に帰属される任意の生物学的活性を指す。生物学的活性の例は、酵素活性、二量体化、フォールド又は別のタンパク質若しくは核酸分子に結合する能力などである。

用語「核酸」は、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得、それとしては、メッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡ及びＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス、相補）鎖であり得る。

本明細書において使用される「バリアント」は、公的配列データベース、例えば、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）における配列により例示される野生型核酸又はアミノ酸配列と同一でないが、その全長にわたり顕著な相同性（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性）を有する核酸、タンパク質又はポリペプチドである。本明細書において使用される「タンパク質、ポリペプチド又はそれらのペプチド断片」は、全長タンパク質又は通常、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するその一部を意味するが、ジペプチド、トリペプチド及びテトラペプチドも本開示により企図及び包含される。

本明細書において使用される「突然変異体」は、グリコシル化、タンパク質安定化及び／又はリガンド結合に関する特性又は機能を変更するように設計又は遺伝子操作される突然変異タンパク質である。

所与の細胞、ポリペプチド、核酸、形質又は表現型に関する本明細書において使用される用語「天然」又は「野生型」は、天然において典型的に見出される形態を指す。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ペプチド」は、それらの慣習的な意味を有し、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合により共有結合している少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために互換的に使用される。さらに、本明細書に記載のポリペプチドは規定の長さに限定されない。この定義内に、Ｄ−及びＬ−アミノ酸、並びにＤ−及びＬ−アミノ酸の混合物が含まれる。この用語はまた、天然存在及び非天然存在の両方のポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、並びに当分野において公知の他の修飾を指さず、排除もしない。ポリペプチドは、タンパク質全体、又はその下位配列であり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、免疫応答を誘発し得るエピトープ、すなわち、抗原決定基を含むアミノ酸下位配列も指し得る。

「に対応する位置」は、別の参照核酸分子又はタンパク質中の位置に対する核酸分子又はタンパク質中の目的の位置（すなわち、塩基番号又は残基番号）を指す。対応する位置は、例えば、配列間の同一性が９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超になるように、配列を比較及びアラインしてマッチするヌクレオチド又は残基の数を最大化することにより決定することができる。次いで、目的の位置に、参照核酸分子において割り当てられる番号を付与する。例えば、遺伝子Ｘの特定の多型が配列番号Ｘのヌクレオチド２０７３において生じる場合、別のアレル又は単離株中の対応するヌクレオチドを同定するため、配列をアラインし、次いで２０７３と一致する位置を同定する。種々のアレルが異なる長さであり得るため、２０７３と命名される位置は、ヌクレオチド２０７３であるとは限らないが、その代わり、参照配列中の位置に「対応する」位置である。

「配列同一性の割合」及び「相同性の割合」は、ポリヌクレオチド間及びポリペプチド間の比較を指すために本明細書において互換的に使用され、２つの最適にアラインされた配列を比較窓にわたり比較することにより決定され、比較窓中のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、同一核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、マッチ位置の数を比較窓中の位置の総数により割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算することができる。或いは、割合は、同一の核酸塩基若しくはアミノ酸残基が両方の配列中で生じ、又は核酸塩基若しくはアミノ酸残基がギャップを用いてアラインされる位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、マッチ位置の数を比較窓中の位置の総数により割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認識する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）著、アドバンシズ・イン・アプライド・マスマティクス（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．）、第２巻、ｐ．４８２、１９８１年のローカルホモロジーアルゴリズムにより、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第４８巻、４４３、１９７０年のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）及びリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８５巻、ｐ．２４４４、１９８８年の類似性検索方法により、それらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視調査（一般に、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．オースベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、カレント・プロトコルズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ有限会社（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）及びジョン・ウィリー・アンド・サンズ有限会社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）のジョイントベンチャー（１９９５年、補遺）（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ））参照）により実施することができる。配列同一性パーセント及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３〜４１０及びアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９７７年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、ｐ．３３８９〜３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターのウェブサイトを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同一長さのワードとアラインした場合にある程度の正の値の閾値スコア「Ｔ」にマッチし、又はそれを満たすクエリー配列中の長さ「Ｗ」の短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、上記を参照）。これらの最初の隣接ワードヒットはそれらを含有する、より長いＨＳＰを見出す探索を開始するための「シード」として作用する。次いで、累積的アラインメントスコアを増加させることができる限り、それぞれの配列に沿って両方向へ文字ヒットを延長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基対のためのリワードスコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチの残基のためのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを使用する。ワードヒットのそれぞれの方向への延長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少した場合；１以上の負のスコアの残基のアラインメントの蓄積に起因してその累積スコアがゼロ以下になった場合；又はいずれかの配列が終わりに達した場合に停止する。ブラスト（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ブラストＮ（ＢＬＡＳＴＮ）プログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ブラストＰ（ＢＬＡＳＴＰ）プログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３及び期待値（Ｅ）１０、並びにブロサム６２（ＢＬＯＳＵＭ６２）スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）及びヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８９巻、ｐ．１０９１５、１９８９年を参照）を使用する。

上記アルゴリズム及びプログラムの全てが配列アラインメント及び％配列同一性の決定に好適である一方、本明細書における開示の目的のため、％配列同一性の決定は、典型的には、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ）中のベストフィット（ＢＥＳＴＦＩＴ）又はギャップ（ＧＡＰ）プログラム（アクセルリス（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）（登録商標）、マディソン、ウィスコンシン）を使用して、提供されるデフォルトパラメータを使用して実施する。

用語「Ｌ又はＤ型アミノ酸」は、本明細書に記載のペプチドに関連して使用することができる。当業者により認識されるとおり、本発明の化合物を構成する種々のＸ^ｎ残基は、それらのＣ_α炭素についてのＬ−又はＤ−立体配座のいずれかであり得る。一実施形態において、特定の化合物のＣ_α炭素の全ては、同一の立体配座である。本発明の一部の実施形態において、化合物は、１つ以上のＣ_α炭素についての規定のキラリティを含み、及び／又は化合物に規定の特性を付与するよう規定の位置における非ペプチド結合を含む。例えば、全部又は一部がＤ−アミノ酸により構成されるペプチドがそれらの対応するＬ−ペプチド相当物よりもプロテアーゼに耐性であることは周知である。したがって、一実施形態において、化合物は、全部又は一部がＤ−アミノ酸により構成されるペプチドである。或いは、プロテアーゼに対する良好な安定性を有する化合物としては、規定の位置における逆極性のペプチド結合を含むペプチドアナログを挙げることができる。例えば、トリプシン様プロテアーゼに対する安定性を有する化合物としては、それぞれのＬ−Ａｒｇ又はＬ−Ｌｙｓ残基前の逆極性のペプチド結合を有するペプチドアナログが挙げられ；キモトリプシン様プロテアーゼに対する安定性を有する化合物としては、それぞれの小及び中サイズのＬ−脂肪族残基又はＬ−非極性残基前の逆極性のペプチド結合を有するペプチドアナログが挙げられる。別の実施形態において、プロテアーゼに対する安定性を有する化合物としては、全部が逆極性のペプチド結合から構成されるペプチドアナログが挙げられる。プロテアーゼに対する安定性を有する他の実施形態は、当業者に明らかである。化合物の追加の具体的な実施形態は、本明細書において記載される。

ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓタンパク質の設計、調製、製造及び／又は配合のための組成物、方法、プロセス、キット及び装置が本明細書に記載される。本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の詳細な説明に記載される。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の材料及び方法を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい材料及び方法を目下記載する。本発明の他の特徴部、目的及び利点は、詳細な説明から明らかである。詳細な説明において、単数形は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り複数形も含む。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。矛盾する場合、本詳細な説明が優先される。

本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
（実施例）
実施例１
実験手順
Ａ．化学薬品
特に記述のない限り、全ての材料はシグマ−アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）（登録商標）又はフィッシャー・サイエンティフィック（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）（商標）から購入した。Ｌ−［^１４Ｃ］−セリンはパーキン・エルマー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）（登録商標）ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手した。

Ｂ．動物
全ての動物手順は、ＡＡＡＬＡＣインターナショナル（ＡＡＡＬＡＣ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）（登録商標）認可（番号００２３５）、公衆衛生局保証（番号Ａ３２６９−０１）及びＵＳＤＡライセンス許諾（番号８４−Ｒ−００５９）機関である、コロラド大学デンバー校動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ））（ＩＡＣＵＣ）による動物プロトコル番号Ｂ−４９４１４（０３）１Ｅのもと承認された。「ヒューマンオンリー」（ＨＯ）マウスを事前に生成し、参照により全体として本明細書に組み込まれるマクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、２０１０年、第１０１巻、第２−３部、ｐ．１５３〜６２；バブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４；及び国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書に記載のとおり繁殖させ、ゲノタイピングした。動物をテクラッド・グローバル・ロデント・ダイエッツ（ＴＥＫＬＡＤ ＧＬＯＢＡＬ ＲＯＤＥＮＴ ＤＩＥＴＳ）（登録商標）（ハーラン（Ｈａｒｌａｎ）、リバーモア、カリフォルニア、米国）製の押出成形標準食２９１８、２９１９、又は２９２０Ｘ上で維持した。ゲルを有するキャピジェクト（ＣＡＰＩＪＥＣＴ）（登録商標）Ｔ−ＭＬＨＧリチウムヘパリン（１２．５ＩＵ）チューブ（テルモ・メディカル・コーポーレーション（Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージ、米国）中への血液回収に顎下線採血用の使い捨てランセットを使用した。次いで、チューブを１，２００×ｇにおいて１０分間遠心分離し、次いで血漿を１．５ｍｌチューブに移し、−８０℃において貯蔵した。

Ｃ．代謝産物濃度の測定
既に記載されている安定同位体希釈ガスクロマトグラフィー質量分析により、血漿代謝産物を測定した。アレン（Ａｌｌｅｎ）ら著、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、１９９３年、第４２巻、ｐ．１４４８〜１４６０参照。分析は、動物ゲノタイプ及び／又は治療レジメンを不明にする盲検様式で実施した。

Ｄ．サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
バイオＳＥＣ（ＢｉｏＳＥＣ）−５ ７．８×３００ｍｍ、１０００Åポアサイズカラム（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、カリフォルニア、米国）上でＣＢＳ及びＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ調製物を分離した。カラムを１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化し、１ｍｌ／分の流速において室温において操作した。１０μｌの試料ループを介して、移動相中で２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈されたタンパク質試料をカラム上でロードし、ＵＶ検出器を２２５ｎｍの波長において使用して検出した。クロマトグラムを記録し、３２カラット（３２ｋａｒａｔ）ソフトウェア（ベックマン・コールタ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）（登録商標）、カリフォルニア、米国）を使用して分析した。

Ｅ．非還元キャピラリー電気泳動（ＮＲ−ＣＥ）
３０ｃｍの長さ、５０μｍのＩＤの裸溶融シリカキャピラリーを備えたＰＡ８００キャピラリー電気泳動システム（ベックマン・コールタ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）（登録商標）、カリフォルニア、米国）上でＣＢＳ及びＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ調製物を分析した。キャピラリーを切断して試料導入インレットから検出窓まで約２０ｃｍの距離で全長３０ｃｍを提供し、１００×８００μｍの開口部を有するカートリッジ中に設置した。キャピラリーを、０．１ＭのＮａＯＨ洗浄液とそれに続く０．１ＭのＨＣｌ洗浄液によりプレコンディショニングしてからそれを水によりリンスし、ＳＤＳ ＭＷ試料緩衝液により最終平衡化した。１０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度の、及び高濃度塩を含有する配合物中のタンパク質試料を水中で２回緩衝液交換して（毎回約７倍希釈）マトリックス干渉を除去し、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、８０℃において５分間加熱することにより変性させた。２０秒間の継続時間で電気的注入（５ｋＶ）を使用する高分解方法により試料をロードし、１５ｋＶの電圧下で５０分間分離した。電気泳動図を２２０ｎｍのＵＶ波長において記録し、３２カラット（３２ｋａｒａｔ）ソフトウェア（ベックマン・コールタ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）（登録商標）、カリフォルニア、米国）を使用して分析した。

Ｆ．タンパク質精製及びＰＥＧ化
参照により全体として本明細書に組み込まれるバブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４、国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書に記載のとおり、Ｃ１５Ｓ突然変異を担持するヒトトランケートＣＢＳ（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を発現させ、精製した。精製酵素を配合し、ペリコン（ＰＥＬＬＩＣＯＮ）（登録商標）ＸＬ５０ウルトラセル（ＵＬＴＲＡｃｅｌ）３０カートリッジ（再生セルロース３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜）を備えたラブスケール（ＬＡＢＳＣＡＬＥ）（商標）タンジェンシャルフローフィルタ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｅｒ）（ＴＦＦ）システム（ＥＭＤミリポア（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ、米国）を使用して２００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５又は１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２中に濃縮した。マレイミド又はＮＨＳエステルカップリング基のいずれかを有する活性化ＰＥＧ分子をＮＯＦコーポーレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（日本）から購入した。マレイミド及びＮＨＳエステルＰＥＧ分子によるｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、所望のモル比（典型的にはＣＢＳタンパク質：ＰＥＧ＝１：１０）で５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にミリＱ（ＭＩＬＬＩＱ）（登録商標）精製水中で溶解させたＰＥＧ分子を添加することにより、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５及び５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２中でそれぞれ実施した。反応を４℃において一晩実施した。続いて、反応混合物をミリＱ（ＭＩＬＬＩＱ）（登録商標）精製水により２回希釈し、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）１×ＰＢＳ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、マサチューセッツ、米国）中に緩衝液交換し、ペリコン（ＰＥＬＬＩＣＯＮ）（登録商標）ＸＬ５０バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）１００カートリッジ（ポリエーテルスルホン１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜）を有するラブスケール（ＬＡＢＳＣＡＬＥ）（商標）ＴＦＦシステムを使用して濃縮した。最終ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートを濾過滅菌し（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製０．２μｍＰＶＤＦ膜フィルタ）、アリコート化し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃において貯蔵した。

Ｇ．タンパク質ゲル電気泳動
ブラッドフォードアッセイ（サーモ・ピアース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ）、マサチューセッツ、米国）により製造業者の推奨に従ってウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用してタンパク質濃度を測定した。１０％ミニ−プロティアン（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）トリス−グリシン拡大（Ｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ）（ＴＧＸ）ゲル（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）（登録商標）、カリフォルニア、米国）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより変性タンパク質を分離した一方、ネイティブ試料を４−１５％ミニ−プロティアン（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）ＴＧＸゲル中でネイティブＰＡＧＥにより分離した。可視化のため、ゲルをシンプルブルー（Ｓｉｍｐｌｅ Ｂｌｕｅ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア、米国）により染色した。参照により全体として本明細書に組み込まれるクルフルスト（Ｋｕｒｆｕｒｓｔ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ）１９９２年、第２００巻、第２号、ｐ．２４４〜８に記載のとおり、ヨウ化バリウム染色を使用して遊離ＰＥＧ分子及びＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを可視化した。

Ｈ．ＣＢＳ活性アッセイ
標識基質としてＬ−［^１４Ｃ］−セリンを使用する既に記載されている放射性同位体アッセイにより以下の改変でＣＢＳ活性を測定した。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるクラウス（Ｋｒａｕｓ）ら著、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ）、１９８７年、第１４３巻、ｐ．３８８〜９４；バブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４参照。４又は５μｌの未希釈血漿を、１００μｌの総容量で３０分間アッセイした。２０μｌの反応混合物を５μＬの冷過ギ酸（３０％のＨ_２Ｏ_２：１００％のギ酸＝１：９）と混合することにより反応を終了させ、元のプロトコルに記載のとおりさらに処理した。

Ｉ．ＰＥＧ化マッピング
ＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析器モデル６５３８（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、カリフォルニア、米国）を使用してｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのマレイミド及びＮＨＳエステルＰＥＧ化のマッピングを実施した。対照としての非修飾酵素及びＰＥＧ化ＣＢＳをそのまま使用し（非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ、２０ＮＨＳ ＰＥＧ ｈｔＣＢＳ−Ｃ１５Ｓ、及び４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）、又は試料をｐＨ １１．５で３７℃において２２時間インキュベートすることにより脱ＰＥＧ化した（２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）。全ての試料を消化前に緩衝液交換し、変性させ、１０ｍＭのＤＴＴにより還元し、３０ｍＭのヨードアセトアミドによりアルキル化した。４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ及び２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを、それぞれＬｙｓ−Ｃ及びＡｓｐ−Ｎ（１：５０（ｗ／ｗ）比、３７℃）により一晩消化した。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートはさらに２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）を使用して化学消化してどのシステイン残基が修飾されたかをさらに区別した。ＵＶ検出を有するＲＰ−ＨＰＬＣを使用するＣ１８カラム（Ｘブリッジ（Ｘｂｒｉｄｇｅ）ＢＥＨ１３０ ３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））上でペプチドを分離し、マスハンター（ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ）ソフトウェア（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、カリフォルニア、米国）を使用してＬＣ／ＵＶ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを分析した。ペプチドマッピング及び配列マッチングは、バイオコンファーム（ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍ）パッケージ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、カリフォルニア、米国）を使用し、正確なアサインメントを確保するように手作業で検証して実施した。

Ｊ．統計的分析
全てのデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。２つの群の統計的比較は、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。３つ以上の因子レベルの統計的分析は、ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキの多重比較検定により実施して有意性を決定した。０．０５未満のｐ値を、統計的有意性に対応すると決定した。

実施例２
ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化の最適化
ＰＥＧ化パターンを理解するため、及びより均一な修飾を生じさせるようにコンジュゲーション反応を最適化するため、個々のＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種を分離し、ＭＥ−４００ＭＡマレイミドＰＥＧ分子により標的化された残基を後に同定した（図２）。第１に、低い伝導度及びより高ｐＨを有する緩衝液（１０ｍＭのトリス．ＨＣｌ ｐＨ８．５）中で平衡化されたＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上にＰＥＧ化反応物をロードして全ての４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種の結合を向上させ、緩やかな塩勾配（５％、１０〜１１０ｍＭのＮａＣｌ）上でランさせてタンパク質を溶出させた。図２は、このようなラン及び２つのプールの回収のクロマトグラムを示し、続いてそれらを非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ及び４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ反応混合物とともにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びネイティブＰＡＧＥ上で分析した。プールのゲル分析は、４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが少なくとも３つの異なるＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種からなるという証拠を提供した。

プール１（Ｐ１）は、プール２（Ｐ２）において回収されたものよりも弱い負電荷（図２）及びそれよりも多い付着ＰＥＧ部分を有する形態で濃縮された。Ｐ１中の優勢な４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートは、それぞれのタンパク質が同一程度にＭＥ−４００ＭＡにより修飾された二量体ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓからなるものであり、ＣＢＳ二量体当たり２つのＰＥＧである可能性が最も高かった（ホモＰＥＧ化二量体）。さらに、Ｐ１は、追加の１又は２つのＰＥＧ分子を有する微量の４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種を含有した。他方、Ｐ２の主要な４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ形態は、タンパク質の一方のみがＰＥＧにより修飾された、すなわち、ＣＢＳ二量体当たり１つのＰＥＧの二量体酵素（ヘミＰＥＧ化二量体）を含有した。個々の４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種の分離により、ＬＣ−ＭＳを使用するマレイミドＰＥＧ化の部位の同定が可能となった。

第Ｉ相について、非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ、Ｐ１及びＰ２をＬｙｓ−Ｃにより消化した。ＬＣ−ＭＳの結果を図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃに示す。還元／アルキル化ＬＣ−ＭＳペプチドマップから同定された８つのシステイン含有ペプチドのうち、７つのそのようなペプチドが３つ全ての試料における類似の相対存在量を生じさせ、それらのペプチドがＰＥＧ化された可能性が低いことを示した。２つのシステイン残基（Ｃ２７２及びＣ２７５）を含有する１つのペプチドのみ（２７２−３２２；配列番号３１）は、２つの４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種（Ｐ１及びＰ２）のそれぞれにおいて有意な減少を示した。

第ＩＩ相においてＣ２７２及び／又はＣ２７５のいずれが修飾されたかをさらに区別するため、この２つの残基を異なるペプチド中に分離する必要がある。試薬ＮＴＣＢは、Ｎ末端で遊離システイン残基に開裂させる。非修飾参照、ホモＰＥＧ化、及びヘミＰＥＧ化タンパク質のＬＣ−ＭＳの結果を図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示す。

１つのペプチドのみ（２４４−２７１；配列番号３２）が、同様に処理された非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと比較して４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ形態において（Ｐ２についてよりもＰ１において）有意な減少を示した。２４４−２７１ペプチドについての収量は、ホモＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ Ｐ１試料において低下し、ヘミＰＥＧ化４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ Ｐ２においてより小さい程度で低下した。

ペプチド回収はＣ２７２が遮断されていることを特定し、したがって、４００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ形態中の２４４−２７１ペプチドのより低い収量は、Ｃ２７２がマレイミドＰＥＧ化のための主な部位であることを特定する。システイン残基Ｃ２７２及びＣ２７５の両方が、Ｐ１中で低い存在量で存在するより高分子量の種のＰＥＧ化に関与することが考えられる。低いＮＴＣＢ消化効率は、回収されたペプチドの低い存在量をもたらした。

実施例３
ＮＨＳエステルＰＥＧ分子を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化の再現性
マレイミドＰＥＧによるｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳＰＥＧ化の再現性についての課題は、他のＰＥＧ化化学反応、特にＮＨＳエステル活性化ＰＥＧの使用の分析をもたらした。最初に、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの修飾を、３つのＮＨＳエステルＰＥＧ分子により評価して酵素活性に対するそれらの影響を決定した。４、３及び２つの異なるＰＥＧ：ＣＢＳモル比を、それぞれ５、１０及び２０ｋＤａの直鎖ＮＨＳエステルＰＥＧ分子によるＰＥＧ化において試験した。ＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、部位選択的マレイミドＰＥＧ化とは異なり、ネイティブＰＡＧＥ又はＳＥＣ−ＨＰＬＣによってだけではなくＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して実質的に分離不能な高度に修飾された異性体の再現可能な混合物を生じさせた。

例えば、３つの直鎖５、１０、及び２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ分子（５ＮＨＳ、１０ＮＨＳ、及び２０ＮＨＳ）によりＣＢＳタンパク質に対して異なるモル過剰のＰＥＧ分子で修飾されたｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）（登録商標）１０％ミニ−プロティアン（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）ＴＧＸゲル）又はネイティブＰＡＧＥ（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）（登録商標）４−１５％ミニ−プロティアン（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）ＴＧＸゲル）上で分離し、セーフ・ステイン（Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により製造業者の推奨に従って染色した。ＮＲ−ＣＥを使用してのみ、部分的な分離を達成し（図１）、それは２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ生成バッチを「フィンガープリントする」方法として機能した。

ＣＢＳタンパク質に対して１０〜２０倍モル過剰のＰＥＧ分子は、ＣＢＳ活性に対してわずかの影響しか有さないＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種を生じさせた一方、より過剰のＰＥＧ、例えば、４０及び６０倍の５ｋＤａのＮＨＳ ＰＥＧ並びに４０倍の１０ｋＤａのＮＨＳ ＰＥＧは、それぞれのＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートの顕著に低減した活性をもたらした（図５）。したがって、２０倍以下のＰＥＧ：ＣＢＳのモル過剰でのＰＥＧ化反応におけるＮＨＳ ＰＥＧ分子のいずれかによるｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのコンジュゲーションは、本質的に完全に保持された活性を有する高度に修飾されたバルキーなＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートを生じさせた。ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓタンパク質に対して２０倍モル過剰まで使用されるリジンを標的化する５、１０又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧによるｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、酵素の比活性に有意に影響せず（図５）、マレイミドＰＥＧと特性を共有した（参照により全体として本明細書に組み込まれるバブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、第６号、ｐ．２３７２〜８４及び国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書に示されるマレイミドＰＥＧ化データ）。

２０ＮＨＳエステルＰＥＧ分子によるｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、再現性を示した。同様に、マレイミドＰＥＧについて行ったとおり、２０ＮＨＳ ＰＥＧ（１０倍のＰＥＧ：ＣＢＳのモル過剰）によるｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ ＰＥＧ化の再現性を評価した。初回バッチは、高度に変動するＰＥＧ化の程度を有した（データ示さず）。しかしながら、変動の主な原因は、非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ中の残留硫酸アンモニウムと同定された。広範な緩衝液交換スキームをクロマトグラフィー精製（１５〜２０透析濾過容量）の終了時に用いて酵素をＰＥＧ化前緩衝液中に配合し、それは再現可能なＰＥＧ化パターンをもたらした。

精製非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの４つのバッチを２０ＮＨＳ ＰＥＧ分子によりＰＥＧ化し、４つの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートを生じさせた。非修飾酵素（前）及び２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲート（後）のそれぞれの４つのペアを、ＬＡＢ、１０Ｌ、ＴＲ１及びＴＲ２と命名した。タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）（登録商標）１０％ミニ−プロティアン（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）ＴＧＸゲル）又はネイティブＰＡＧＥ（バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）（登録商標）４−１５％ミニ−プロティアン（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）ＴＧＸゲル）中で分離し、セーフ・ステイン（Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により製造業者の推奨に従って染色し、又はヨウ素染色してＰＥＧを検出した。非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ及び遊離未反応ＰＥＧ分子も観察した。

全ての従来のＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートと比較すると、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは粘度の増加を示し（データ示さず）、したがって、最終（ＰＥＧ化後）緩衝液交換の間の十分な遊離未反応ＰＥＧ分子の除去が懸念された。実際、初回バッチ（例えば、ＬＡＢ及び１０Ｌ）の処理は、最終産物にキャリーオーバーされる大量の未反応ＰＥＧ分子を生じさせた。補正措置は、混合物からの２０％のＤＭＳＯの除去、ＴＦＦユニットについてのより高度なＭＷＣＯ膜カートリッジ（１００対３０ｋＤａ）、緩衝液交換前の３倍大きな表面積及びＰＥＧ化混合物の２倍希釈を含み、全て、粘度を低減させるのに役立ち、最終配合の間の遊離ＰＥＧ分子のより良好なクリアランスを支援した（ＴＲ１及びＴＲ２）。

実施例４
ＮＨＳエステルＰＥＧ分子を使用するＰＥＧ化の程度の特徴付け
ＳＤＳ及びネイティブＰＡＧＥは、個々の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種を十分に分離することが観察されなかった。生成におけるＰＥＧ化の迅速な評価を可能とし、産物についての判定基準の定義を提供する、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが２０ＮＨＳ ＰＥＧ分子により修飾される程度の特徴付けのための２つの追加の方法を開発した（図１）。

一方の方法は、表１に示される、非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのものと比較した個々の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳバッチのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィープロファイルの比較に依存した。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の利点は、例えば、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓタンパク質当たり５つ未満のＰＥＧ化部位を含有する、及び／又は任意の非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを含有する不十分にＰＥＧ化されたバッチが所望のものよりも長い保持時間により特徴付けされ、さらなるＰＥＧ分子を反応混合物に添加することによるレスキューのために迅速に同定されることであった（ＰＥＧ化のインプロセスモニタリング）。非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ試料は、１１．９７分間の保持時間を有することが観察された。６−７０及び８−２３バッチからの試料は、９．６７分間の保持時間を有することが観察された。６−８９バッチからの試料は、９．８８分間の保持時間を有することが観察された。８−２２バッチからの試料は、９．９５分間の保持時間を有することが観察された。したがって、９．６７分間よりも長い保持時間が、不十分なＰＥＧ化を示すことが決定された。

８−１４バッチからの試料は、９．５７分間の保持時間を有することが観察された。８−１５バッチからの試料は、９．５３分間の保持時間を有することが観察された。８−１６バッチからの試料は、９．５５分間の保持時間を有することが観察された。８−２４バッチからの試料は、９．５５分間の保持時間を有することが観察された。８−２５バッチからの試料は、９．５８分間の保持時間を有することが観察された。したがって、９．５３分間よりも短い保持時間が、許容可能なＰＥＧ化を示すことが決定された。

別の方法は、複数の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種の分離及び定量を可能とする非還元キャピラリー電気泳動に基づいた（図１）。バッチの不十分なＰＥＧ化は、非修飾酵素の存在及び低分子量２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ種の発生増加により特徴付けされた。したがって、この方法は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ最終産物についての厳密な判定基準を定義するのに好適であることが見出された。

ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのタンパク質配列は３０個のリジン残基を含有し、それらは全てＮＨＳエステルＰＥＧ化のための潜在的部位を表す。ＰＥＧ化に関与するリジン残基を同定するため、ＬＣ−ＵＶ−ＭＳを３つの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓバッチについて実施した。脱ＰＥＧ化後、事前にＰＥＧ化されたリジンは、非修飾リジンからのそれらの区別及びＡｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼによる開裂後のペプチドマッピングを介する定量及び同様に処理された非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓとの比較を可能とするリンカーとともに残った。ＬＣ−ＭＳ分析は、参照タンパク質（対照）としての非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＡｓｐ−Ｎ消化後に実施した。

表２は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチドの相対存在量を示し、それを使用して参照酵素、アルキル化、非修飾ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓについてのペプチド当たりのＰＥＧ数を計算した（ＲＴ＝保持時間）。

理論分子質量（モノアイソトピック）は、マスハンター・バイオコンファーム（ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍ）ソフトウェア（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、サンタクララ、カリフォルニア）を使用して計算した。観察質量（モノアイソトピック）は、それらの理論値の５ｐｐｍ以内であった。存在量は、マスハンター（ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ）ソフトウェア（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、サンタクララ、カリフォルニア）を使用して測定した。ペプチド１２０−１２８は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド１７９−１９７は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。２４９−２６９は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。

ＬＣ−ＭＳ分析は、還元、アルキル化、ＰＥＧ化２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（バッチ番号１）のＡｓｐ−Ｎ消化後に実施した。表３は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチドの相対存在量を示し、それを使用して還元、アルキル化、ＰＥＧ化２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（バッチ番号１）のＡｓｐ−Ｎ消化についてのペプチド当たりのＰＥＧ数を計算した。

さらに、１つのリジン残基が一貫性なくＰＥＧ化されていることが見出された、２つのリジンを有する５つのペプチド及び４つのリジンを有する１つのペプチドが同定された：Ｋ３６／３９、Ｋ７２／７５、Ｋ８２／８３、Ｋ９４／９７／９８／１０２、Ｋ３２２／３２５及びＫ３９４／３９８。ＰＥＧの推定数／ペプチドは、以下の式を使用して計算した：推定（ＰＥＧ／ペプチド）比＝（存在量（１^＊リンカー）＋２^＊存在量（２^＊リンカー））／（（存在量（リンカーなし）＋存在量（１^＊リンカー）＋存在量（２^＊リンカー））。ＰＥＧは、顕著な溶媒和エンベロープ及びしたがって流体力学半径の増加に起因してゲルにおいてもクロマトグラフィー適用においてもそれらの分子量に従って移動しないことが当分野において公知であるため、ＰＥＧ化の程度は、ＣＢＳ単量体当たり５．０±０．５個のＰＥＧの範囲であることが推定された。具体的には、ペプチド当たりのＰＥＧ分子数は、２−３４について１．２９個、９−３４について１．３０個、３５−４６について０．２２個、４７−７８について０．３７個、７９−８５及び１９８−２２０について０．０３個、８６−１０６について０．６３個、２４５−２４８について０．４９個、２７０−３０１について０．３９個、３２１−３２７について０．３１個、並びに３８８−４００について０．０５個であることが推定された。

ペプチド２−３４は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２−３４は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド９−３４は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド９−３４は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３５−４６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４７−７８は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド７９−８５は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド８６−１０６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド８６−１０６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド１２０−１２８は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド１７９−１９７は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２４５−２４８は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２４９−２６９は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド２７０−３０１は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３２１−３２７は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４０１−４１３は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４０１−４１３は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。

ＬＣ−ＭＳ分析は、還元、アルキル化、ＰＥＧ化２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（バッチ番号２）のＡｓｐ−Ｎ消化後に実施した。表４は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチドの相対存在量及び還元、アルキル化、ＰＥＧ化２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（バッチ番号２）のＡｓｐ−Ｎ消化についてのペプチド当たりのＰＥＧの推定数を示す。

ペプチド当たりのＰＥＧ分子数は、２−２４について１．０６個、９−３４について０．８４個、３５−４６について０．１７個、４７−７８について０．２６個、７９−８５及び１９８−２２０について０．０２個、８６−１０６について０．５４個、２４５−２４８について０．３９個、２７０−３０１について０．２７個、３２１−３２７について０．２１個、３８８−４００について０．０４個、並びに４０１−４１３について０．５９個であることが推定された。ペプチド２−３４は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２−３４は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド９−３４は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド９−３４は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３５−４６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４７−７８は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド７９−８５は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド８６−１０６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド８６−１０６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド１２０−１２８は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド１７９−１９７は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２４５−２４８は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２４９−２６９は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド２７０−３０１は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３２１−３２７は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４０１−４１３は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４０１−４１３は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。

ＬＣ−ＭＳ分析は、還元、アルキル化、ＰＥＧ化２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（バッチ番号３）のＡｓｐ−Ｎ消化後に実施した。表５は、バッチ番号３についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定された、ペプチドの相対存在量及びペプチド当たりのＰＥＧの推定数を示す。

ペプチド当たりのＰＥＧ分子数は、２−３４について１．２４個、９−３４について０．９８個、３５−４６について０．１８個、４７−７８について０．３１個、７９−８５及び１９８−２２０について０．０３個、８６−１０６について０．６１個、２４５−２４８について０．４８個、２７０−３０１について０．２９個、３２１−３２７について０．２１個、３８８−４００について０．０５個、並びに４０１−４１３について０．７１個であると推定された。

ペプチド２−３４は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２−３４は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド９−３４は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド９−３４は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３５−４６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４７−７８は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド７９−８５は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド８６−１０６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド８６−１０６は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド１２０−１２８は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド１７９−１９７は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド１９８−２２０は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２２１−２３３は、１^＊脱アミド化の修飾を有することが観察された。ペプチド２４５−２４８は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド２４９−２６９は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド２７０−３０１は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３２１−３２７は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊酸化の修飾を有することが観察された。ペプチド３８８−４００は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４０１−４１３は、１^＊リンカーの修飾を有することが観察された。ペプチド４０１−４１３は、２^＊リンカーの修飾を有することが観察された。

７つのリジン（Ｋ２５、Ｋ３０、Ｋ２１１、Ｋ２４７、Ｋ２７１、Ｋ４０５及びＫ４０６）が、ある程度にＰＥＧ化されることが明らかに同定され、そのうち、Ｋ２５及びＫ３０残基は、３つのバッチのうち完全な程度に常に修飾される唯一の残基と考えられた。

全ての従来のＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートと比較すると、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは粘度の増加を示し（データ示さず）、したがって、最終（ＰＥＧ化後）緩衝液交換の間の十分な遊離未反応ＰＥＧ分子除去が懸念された。実際、初回バッチ（例えば、ＬＡＢ及び１０Ｌ）の処理は、最終産物にキャリーオーバーされる大量の未反応ＰＥＧを生じさせた。補正措置は、混合物からの２０％のＤＭＳＯの除去、ＴＦＦユニットについてのより高度なＭＷＣＯ膜カートリッジ（１００対３０ｋＤａ）、緩衝液交換前の３倍大きな表面積及びＰＥＧ化混合物の２倍希釈を含み、全て、粘度を低減させるのに役立ち、最終配合の間の遊離ＰＥＧのより良好なクリアランスを支援した（ＴＲ１及びＴＲ２）。

実施例５
ＨＯマウスにおける２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ効力の減衰
ＨＯマウスにおける反復投与は、第１の投薬週の間の５日間連続の７．５ｍｇ／ｋｇの２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの皮下注射と定義した。投薬は１０日間の期間中断し、第２の投薬週において追加の５回連続注射を再開した。血漿試料を、ベースライン値について最初の投薬前、両方の投薬週における２回目、４回目、及び５回目の注射の２４時間後に回収して酵素の効力を追跡し、ウォッシュアウト期間の間に回収してベースライン値の回復を把握した（両方の投薬週における最後の投薬の１週間後、第２の投薬週の１回目の投薬前及び最後の投薬の２週間後）。この試験は、第１の投薬週と比較して第２の投薬週における２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ効力の明らかな減衰を示した（表７参照）。

よりバルキーなマレイミドＰＥＧ分子は、ウォッシュアウト実験におけるＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ効力の減衰を解消しなかった。利用可能なスルフヒドリル残基を特異的に標的化するマレイミドＰＥＧの使用は十分に定義された種を生じさせることが公知であったため、ウォッシュアウト実験における２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ効力の損失を低減させるための初期のアプローチは、よりバルキーなマレイミドＰＥＧによるｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓタンパク質の被覆を増加させることであった。既に公開されているデータは、より大きなマレイミドＰＥＧ分子によるｈｔＣＢＳのＰＥＧ化がインビトロで触媒活性に影響しないこと並びに４０ｋＤａの直鎖（ＭＥ−４００ＭＡ）又は分枝鎖（ＧＬ４−４００ＭＡ）マレイミドＰＥＧ分子が２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと比較してＨＯマウスにおける単回注射後に類似の薬物動態及び薬力学を有することを示した。参照により全体として本明細書に組み込まれるバブリル（Ｂｕｂｌｉｌ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１６年、第１２６巻、（６）、ｐ．２３７２〜８４及び国際出願第ＰＣＴ／２０１６／０６１０５０号明細書参照。表６は、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化がＰＥＧ部分サイズ及び標的基にかかわらず酵素の触媒活性に実質的に影響しないことを示す。

免疫応答を誘発するように投薬レジメンを特別に設計してコンジュゲートをそれらの免疫原性特性に基づき格付けした。ホモシスチン尿症ＨＯマウスへの２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの反復非中断投薬は、効力の保持及び２ヵ月の間の注射の２４時間後の血漿Ｈｃｙレベルの有意な減少をもたらすことが既に示されているが、血漿Ｈｃｙのベースラインレベル（注射の７２時間後）及び２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのピーク効果（注射の２４時間後）の両方は経時的に減少していた。このような活性の減衰についての最も妥当な説明は、効力及び安全性の両方に悪影響を与え得、承認治療酵素のうち比較的共通する宿主の免疫応答である。参照により全体として本明細書に組み込まれるバルド（Ｂａｌｄｏ）ら著、バイオドラッグス（ＢｉｏＤｒｕｇｓ）、「臨床免疫治療薬、生物医薬及び遺伝子療法（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年、第２９巻、第１号、ｐ．３１〜５５参照。

免疫原性は、微量の非修飾酵素又は部位選択的マレイミドＰＥＧ分子コンジュゲーションにより不十分にマスクされたｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓに由来し得る。したがって、非修飾酵素の完全な不存在及びＰＥＧ化の増加による免疫系からのＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートの潜在的な免疫原性エピトープのより広範なマスクは、効力の減少を予防することが予測される。

実施例６
ＨＯマウスにおける２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの効力の保持
ＭＥ−０５０ＧＳ（５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）及びＭＥ−２００ＧＳ（２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）により修飾されたＮＨＳエステルＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートをウォッシュアウト実験において分析し、結果をマレイミドＰＥＧ化コンジュゲートの同様の分析からの結果と比較した。表７は、３週間にわたる異なるＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓコンジュゲートの投与から生じた代謝産物の変化パーセントを提供する（Ｗ１＝１週間、Ｗ２＝２週間、及びＷ３＝３週間）。

５ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、１回目の一連の注射後に優れた薬力学的応答を示したが、後続の投薬週においてＨｃｙについて効力の有意な損失が観察された。Ｈｃｙレベルは、投薬週１／２／３において４８／８０／１１１μＭ（ベースラインレベル：１９２／１７５／２０１μＭ）に降下し、同時にＣｔｈレベルが４３／３５／３７μＭ（ベースラインレベル：４／４／４μＭ）に増加し、並行してＣｙｓレベルが２１９／２２５／１７４μＭ（ベースラインレベル：１２９／１３７／１４６μＭ）に増加した（図６及び表７）。

２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ＣＢＳは、３つ全ての投薬週において均衡応答を示した：血漿Ｈｃｙ濃度は、投薬週１／２／３においてベースラインレベル１６４／１６５／１４３μＭから３８／４９／５６μＭに降下し、続いてＣｔｈレベルが４０／３０／２７μＭ（ベースラインレベル：５／４／４μＭ）に増加し、並行してＣｙｓレベルが２３４／２３７／２２２μＭ（ベースラインレベル：１４７／１４９／１４８μＭ）に増加した。対照実験として、２００ＭＡ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの２つの追加のバッチをウォッシュアウト実験において分析し、後続の投薬週における効力の減衰がここでも観察された：投薬週１／２／３において、血漿Ｈｃｙは４４／８８／１１２μＭ（ベースラインレベル：２２４／２１５／２２４μＭ）に降下し、結果的にＣｔｈレベルが４０／３１／４３μＭ（ベースラインレベル：４／３／４μＭ）に増加し、並行してＣｙｓレベルが２１９／２１９／１９６μＭ（ベースラインレベル：１２４／１１８／１４４μＭ）に増加した。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ＣＢＳは、ＨＯマウスへのＰＥＧ化酵素の反復投与後の血漿代謝産物に対する薬力学的効果の最小減衰を示した（表７）。

実施例７
２０ＮＨＳ ＣＢＳ−ＰＥＧによる処理によるＫＯマウスの表現型のレスキュー
ＫＯマウスの全身健康及び発育に対する２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理の潜在的に有益な効果を評価するため。

２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理マウス（ｎ−１６Ｍ＋１１Ｆ）の体重及び重量増加を離乳（２１日目）から３５日齢まで１日おきに決定し、性別及び日齢一致ＰＢＳ処理ヘテロ接合性＋／−マウス（ｎ−１４Ｍ＋１３Ｆ）と比較した。マウスは、２日齢から７．５ｍｇ／ｋｇの皮下注射を週３回受けた。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理ＣＢＳ ＫＯ雄（灰色実線及び丸）及び雌（灰色点線及び丸）マウスの体重（図７Ａ）及び重量増加（図７Ｂ）を、ＰＢＳ注射＋／−雄（黒色実線及び四角）及び雌（黒色点線及び四角）と比較する。

離乳時（２１日目）、ＰＢＳ又は２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのいずれかを受けたヘテロ接合性又はＫＯマウス間及び雄又は雌間の両方で、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ注射の雌に対する雄（ｐ＜０．０１）を除き体重の有意差は見出されなかった。２日後（２３日目）、試験マウスのうち体重の有意差は見出されなかった。２５日目以降、＋／−雄は、＋／−雌及び２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理ＫＯ雄又は雌よりも体重が有意に増加し（ｐ＜０．００１）、したがって、それらよりも多く体重を増加させる。ＫＯマウスにおいて、離乳は、より小さな重量増加により特徴付けされる短時間のより緩慢な成長をもたらし（２３及び２５日目）、体重を事実上維持し、続いて着実に重量増加させた。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓにより処理されたＫＯ雄及び雌の重量増加は本質的に同一であり、３３及び３５日目にそれらの体重は増加し、処理ＫＯ雌の体重はＰＢＳ注射ヘテロ接合性雌のものと同等であった一方、ＫＯマウスはそれらのヘテロ接合性相当マウスよりもわずかに下がった。まとめると、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスは雄よりも雌について着実に体重が増加し、５週間の処理期間の終了時において体重に関してＰＢＳ処理ヘテロ接合性マウスと同等であった。

実施例８
２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓによる処理による改善された血漿レベルの持続
Ｉ２７８Ｔマウスの臨床症状、例えば、顔面脱毛症又は骨粗鬆症は、発症及び治療による補正に時間を要する。本実施例において、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳによるＩ２７８Ｔマウスの処理は、根本的な代謝不均衡を有意に改善し、又は正常化し、それを長期間にわたり持続することが示された。図８Ａ及び図８Ｂは、Ｉ２７８Ｔマウスモデルにおける血漿硫黄アミノ酸に対する２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの効力の持続を示す。図８Ａは、約９ヵ月間の期間、３回の週１回ＳＣ注射（７．５ｍｇ／ｋｇ）により３週齢以降処理された３週齢の非症候性離乳Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）における血漿Ｈｃｙ、Ｃｔｈ、及びＣｙｓレベルの改善の持続を示した。２１日目における１回目の投薬前に記録された初回レベルは高度に上昇したＨｃｙ（２８８μＭ）、正常Ｃｙｓレベルのほぼ半分（１２９μＭ）及び低い血漿Ｃｔｈ（１．４μＭ）を示した。３回目（２８日目）及び１８回目（６３日目）の投薬の７２時間後に測定された血漿代謝産物はそれぞれ、週末の間の投薬の欠落が初回レベルと比較していくらかの類似のプロファイルをもたらし、但し２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ活性のマーカのＣｔｈを除き、それはその緩慢な腎クリアランスに起因して血漿濃度の上昇が持続する可能性が最も高いことを説明した。

逆に、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ投与の２４時間後に測定された血漿レベル（例えば、６４日目において、及び全ての後続の時点に当てはまる）は、初回値と比較して実質的に及び有意に減少したＨｃｙレベル（１０５μＭ、ｐ＜０．００１）、正常化された血漿Ｃｙｓ（２０９μＭ、ｐ＜０．００１）及び上昇したＣｔｈ（４３μＭ、ｐ＜０．００１）を実証する。同様に、図８Ｂは、疾患の複数の臨床徴候を示し、約６ヵ月間の期間、２６週齢以降処理された（週３回、ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）２６週齢Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝１０）における血漿硫黄アミノ酸の持続的な補正を例示する。１８２日目における１回目の投薬前に記録された初回レベルは、高度に上昇したＨｃｙ（３２１μＭ）、正常Ｃｙｓレベルのほぼ半分（１２７μＭ）及び低い血漿Ｃｔｈ（０．３μＭ）を示した。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの初回投与の２４時間後（１８４日目）、処理前値と比較した血漿Ｈｃｙの顕著で有意な減少（１４３μＭ、ｐ＜０．００１）、血漿Ｃｙｓの正常化（２４６μＭ、ｐ＜０．００１）及びＣｔｈの上昇（５４μＭ、ｐ＜０．００１）をもたらした。改善された血漿代謝産物プロファイルは、約６ヵ月間の期間の定期的なＥＲＴ施与により維持された。まとめると、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの定期的なＳＣ注射は、Ｉ２７８Ｔマウスにおける改善された血漿代謝産物プロファイルの持続を生じさせ、したがって長期投与を要求する効力試験を許容した。

実施例９
組織代謝産物レベルの正常化及び代謝産物の均衡の改善
２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は組織代謝産物の補正をもたらすことが観察され、それは成体Ｉ２７８Ｔマウスにおける血漿代謝産物均衡の改善と相関した。３週間の期間、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）により処理された約２ヵ月齢Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）の肝臓、腎臓及び脳ホモジネート中の硫黄含有代謝産物の濃度及び対応する血漿レベルを、月齢一致健常ヘテロ接合性マウス（ｎ＝３）及び未処理Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）と比較して計測した。硫黄含有代謝産物は、ホモシステイン（Ｈｃｙ）、システイン（Ｃｙｓ）、シスタチオニン（Ｃｔｈ）、ホモランチオニン（Ｈｌｔｈ）、及びランチオニン（Ｌｔｈ）を含んだ。総ホモシステイン及びシステインを血漿中で測定した一方、それらのチオールの非タンパク質結合分画を組織ホモジネート中で計測した。Ｉ２７８Ｔ若齢マウス（ｎ＝３）を３週間の期間、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（週３回、ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）により処理し、齢一致未処理Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）及び未処理健常ヘテロ接合性対照（ｎ＝３）と比較した。ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキの事後検定を使用してデータを比較して有意性を決定した：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ−非有意。結果を、ｎｍｏｌ／ｇ組織におけるμＭ又はｐｍｏｌ／ｇ組織におけるｎＭにより記載する。

総Ｈｃｙ及び非タンパク質結合Ｈｃｙは、ヘテロ接合性対照（血漿における１２μＭ及びｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における８／６／４μＭ）及び２０ＮＨＳのＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウス（血漿における５４μＭ及びｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における８／４／１μＭ、血漿についてｐ＜０．００１及び組織について＜０．０１）の両方と比較して未処理Ｉ２７８Ｔマウス（血漿における３１０μＭ及びｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における２９／２１／１２μＭ）においてそれぞれ血漿及び肝臓／腎臓／脳ホモジネート中で大幅に上昇した。処理Ｉ２７８Ｔマウスの血漿中の総Ｈｃｙの４．５倍の上昇、組織中の非タンパク質結合Ｈｃｙは、健常ヘテロ接合性マウスにおけるレベルと有意に異なるものではなかった。

総Ｃｙｓは、血漿中でかなり減少した（９１μＭ）が、未処理Ｉ２７８Ｔマウスの肝臓／腎臓／脳ホモジネート中の非タンパク質結合Ｃｙｓ（ｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における２１／４３２／４４μＭ）は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウス（血漿における２２４μＭ及びｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における３６／２６５／５１μＭ、血漿についてｐ＜０．０１及び組織について非有意）と比較して異なるとは観察されなかった。処理Ｉ２７８ＴマウスにおけるＣｙｓレベルは、健常ヘテロ接合性対照のものと類似した（血漿における２５５μＭ及びｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における８１／３２２／４４μＭ、ｐ＝非有意）。

予測のとおり、未処理Ｉ２７８Ｔマウスの血漿及び組織の両方におけるＣｔｈレベルは縮小した：血漿における０．３μＭ及びｎｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳における０．４／１．２／０．８μＭ。２０ＮＨＳのＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓによる処理は、未処理Ｉ２７８Ｔマウスと比較して血漿（３９μＭ）及び腎臓ホモジネート（ｎｍｏｌ／ｇ組織における３６μＭ）中のＣｔｈの有意な上昇並びに肝臓及び脳ホモジネート（ｎｍｏｌ／ｇ組織における５及び３μＭ）中のより低い増加をもたらした（血漿及び組織ホモジネートの両方についてｐ＜０．０５）。Ｃｔｈの血漿及び腎臓レベルは、健常ヘテロ接合性対照（血漿における１μＭ、ｐ＜０．０１及びｎｍｏｌ／ｇ腎臓における１．２μＭ、ｐ＜０．０１）と比較して処理Ｉ２７８Ｔマウスにおいてかなり高く、これは循環中の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの活性に起因する可能性が高かったが、それらは、肝臓（ｎｍｏｌ／ｇ組織における２０μＭ、非有意）及び脳ホモジネート（ｎｍｏｌ／ｇ組織における８μＭ、ｐ＜０．０５）における健常レベルに完全に正常化されなかった。

未処理Ｉ２７８Ｔマウス、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウス及び健常ヘテロ接合性対照のうちＭｅｔもＧＳＨもその血漿及び組織レベルにおいて有意差は観察されなかった。

血漿及び組織ホモジネート中のチオエーテルのホモラチオニン（ｈｏｍｏｌａｔｈｉｏｎｉｎｅ）（Ｈｌｔｈ）及びランチオニン（Ｌｔｈ）のレベルも、Ｈ_２Ｓ生合成の新たな代理マーカとして同定されている。Ｈｌｔｈのレベルは、未処理Ｉ２７８Ｔマウスの血漿（１４３ｎＭ）及び肝臓／腎臓／脳ホモジネート（ｐｍｏｌ／ｇ組織における６３５１／３３２４／１０６５ｎＭ）において顕著に上昇し、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理は、血漿における４５ｎＭ（非有意）及びｐｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳組織における１７０／１３１７／５２０ｎＭ（ｐ＜０．０５／０．０５／０．０１）へのそれらのレベルのかなりの補正をもたらした。興味深いことに、健常ヘテロ接合性マウスにおける肝臓Ｈｌｔｈは処理Ｉ２７８Ｔマウスと比較して有意に高かった（ｐｍｏｌ／ｇ組織における９９６ｎＭ、ｐ＜０．０１）一方、処理は、ヘテロ接合性マウスにおいて見出されたものと比較して残りのコンパートメントにおけるＨｌｔｈレベルの部分的低減をもたらしたにすぎなかった：血漿における８ｎＭ（ｐ＜０．０５）及びｐｍｏｌ／ｇ腎臓／脳組織における２４７／２２ｎＭ（ｐ＜０．０１／０．００１）。

第２のチオエーテルＬｔｈに関して、処理Ｉ２７８Ｔにおいて血漿レベルのみが非処理のものと比較して有意に上昇した（７５対１７ｎＭ、ｐ＜０．０１）一方、組織ホモジネートにおけるＬｔｈのレベルは、Ｌｔｈについての低い組織浸透性又は特異的トランスポーターの欠落に起因して類似のままであった（ｐｍｏｌ／ｇ肝臓／腎臓／脳組織における２１／１１３／１１０対１４／９２／１０４ｎＭ）。健常ヘテロ接合性マウスにおける血漿Ｌｔｈは、処理Ｉ２７８Ｔマウスにおいて観察されたレベルと比較して有意に低かった（３２ｎＭ、ｐ＜０．０１）一方、その組織レベルは、肝臓（ｐｍｏｌ／ｇ組織における１２２ｎＭ、ｐ＜０．０５）及び脳（ｐｍｏｌ／ｇ組織における３０４ｎＭ、ｐ＜０．００１）中で上昇し、又は腎臓（ｐｍｏｌ／ｇ組織における１４５ｎＭ）中で類似のままであった。したがって、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、処理Ｉ２７８Ｔマウスの血漿及び組織における代謝均衡を改善し、又は復帰させた。

実施例１０
２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ ＣＢＳにより処理されたＫＯ、ＨＯ、及びＩ２７８Ｔマウスのうちのメチル化能の比較
Ｉ２７８Ｔ及びＫＯにおけるマウスにおけるＳＡＭ／ＳＡＨ比の血漿及び組織レベルを、健常ヘテロ接合性対照マウス及び未処理マウスにおける比と比較した。Ｉ２７８Ｔ若齢マウス（ｎ＝３）を３週間の期間、ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（週３回、ＳＣ、７．５ｍｇ／ｋｇ）により処理し、日齢一致未処理Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）及び未処理健常ヘテロ接合性対照（ｎ＝３）と比較した。処理ＫＯマウスに２日齢から７．５ｍｇ／ｋｇを週３回投与した。それぞれの群は、少なくとも３匹の１８日齢マウスからなるものであった。多変量ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキの事後検定を使用して全てのデータを比較して有意性を決定した：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ−非有意。

未処理Ｉ２７８Ｔマウスのメチル化能は、血漿（０．４）及び肝臓／腎臓／脳ホモジネート（０．３／０．４／０．２）におけるＳＡＭ／ＳＡＨ比に基づきかなり減少し、処理群において血漿における３（ｐ＜０．００１）及び肝臓／腎臓／脳ホモジネートにおける０．７／２．１／１．５（肝臓については非有意；しかし、腎臓及び脳組織の両方についてはｐ＜０．０１）の比にかなり改善された。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウスの改善されたメチル化能は、健常ヘテロ接合性マウス血漿（５、ｐ＜０．０１）及び肝臓／腎臓／脳ホモジネート（１．３／３．９／２．０、肝臓及び脳については非有意、しかし、腎臓についてはｐ＜０．０５）において決定されたものに近づき、又はさらにはそれを正常化した。

２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、処理ＫＯマウスの血漿及び組織におけるＳＡＭ／ＳＡＨ比を未処理ＫＯマウスと比較して有意に改善するが、それを健常ヘテロ接合性対照において見られたレベルに正常化しないことも観察された。ＳＡＭ／ＳＡＨ比は、血漿及び他の組織レベルと比較してＷＴ対照の肝臓において完全に小さく、より重要なことに、ＫＯマウスにおいて見出されたレベルと同等であった（対照健常ヘテロ接合性及びＫＯにおいて０．７８及び０．９４、ｐ＝ｎｓ）。さらに、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ処理は、処理ＫＯマウスにおいてＳＡＭ／ＳＡＨ比を未処理ＫＯマウスと比較してさらに有意に減少させた（０．２８、ｐ＜０．０１）。したがって、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与は、処理ＫＯマウスの血漿及び組織における代謝均衡を改善し、又は復帰させた。

実施例１１
ラットにおける２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの薬物動態
２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの薬物動態特性も、野生型スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおいて決定した。８ｍｇ／ｋｇ（実線）又は２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（点線）の単回ＳＣ投与後の雄（黒色、それぞれの群でｎ＝１１）及び雌ラット（灰色、それぞれの群でｎ＝８）の血漿におけるＣＢＳ比活性を、図９Ａに対数スケールで示す。

２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのバイオアベイラビリティは、異なる用量（８及び２４ｍｇ／ｋｇ）においてほぼ同一であることが観察され、それは観察されたラットにおける吸収差が性的二型性に起因する可能性が高いことを示唆した。２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの排出期は、全てのコホートにおいて対数線形であり、一次キネティクスに一致し、それは２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ活性の濃度の半分が血漿からクリアランスされるのに要求される時間が一定であることを意味した。群にわたる排出半減期の平均値は、４２±２時間であった。雄及び雌ラット間の差にかかわらず、ＳＣ投薬後の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５活性の血漿レベルから推定されるＰＫパラメータは、２４ｍｇ／ｋｇに用量比例的であった。

ラットにおける性的二型性に起因する差は、ラットが４、８、及び２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの４８時間空ける合計９回の注射を受ける反復投薬試験においても観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ）。一般に、血漿における２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ活性の初期及び定常状態レベルは、同一用量レベルにおいて雄ラットよりも雌において高く、それは単回投薬試験についての観察と相関した。反復投薬後の２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの血漿レベルは、たとえ半分をわずかに超える２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓのみが血漿からクリアランスされた場合に用量を投与しても、いかなる用量レベルにおいても蓄積をほとんど又は全く実証しなかった（４８時間の投薬間隔対平均ｔ_{１／２−Ｅ}＝４２時間）。これらの予測されない観察の理解を支援するため、定常状態及び予測定常状態血漿レベルへの接近は、ＰＫソフトウェアにおけるシミュレーション関数を使用して仮定反復投薬後に計算した。複数回投薬後、２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ活性の観察血漿レベルは、表８に示されるとおり、定常状態におけるピーク及びトラフについての予測値の１５〜５２％及び０〜３５％であった（Ｎ／Ａ＝適用せず）。

観察ｃ_ｍａｘ及びｃ_ｍｉｎは、２回目の投薬後に血漿中で観察された２０ＮＨＳ ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの最高及び最低濃度に対応する。予測値は、単回投薬ＰＫ試験からの時間−濃度曲線を使用するシミュレーションからのものである。反復投薬後の血漿レベルは、両方の性において８ｍｇ／ｋｇ用量よりも２４ｍｇ／ｋｇ用量においてそれらの予測値に近いことが観察された。

均等物及び範囲
当業者は、定型以下の実験を使用して本明細書に記載の本発明による具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、又は確認することができる。本発明の範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるものである。

特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、そうでないことが示されない限り、又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、１つ又は２つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「又は」を含む特許請求の範囲又は詳細な説明は、そうでないことが示されない限り、又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、１つ、２つ以上、又は全ての群メンバーが所与の産物又はプロセス中で存在し、用いられ、又はそうでなければそれに関連する場合、充足されるとみなされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の産物又はプロセス中で存在し、用いられ、又はそうでなければそれに関連する実施形態を含む。本発明は、２つ以上、又は群メンバー全体が所与の産物又はプロセス中で存在し、用いられ、又はそうでなければそれに関連する実施形態を含む。

用語「含む」は、開放的であるものとし、追加の要素又はステップの包含を許容するが要求はしないことも留意される。用語「含む」が本明細書において使用される場合、用語「〜からなる」も包含され、開示される。

範囲が挙げられる場合、終点が含まれる。さらに、そうでないことが示されない限り、又は文脈及び当業者の理解からそうでないことが明らかでない限り、範囲として表現される値は、本発明の異なる実施形態における任意の規定値又は記述値内の下位範囲を、文脈がそうでないことを明示しない限り、その範囲の下限値の単位の１０分の１まで想定し得ることを理解すべきである。

さらに、従来技術の範囲内に収まる本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つ以上から明示的に除外され得ることを理解すべきである。このような実施形態は当業者に公知であると考えられるため、その除外が本明細書に明示的に記載されていない場合であっても、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療又は活性成分；任意の生成方法；任意の使用方法など）は、従来技術の存在に関連するか否かを問わず、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外され得る。

使用された語は、限定的なものではなく説明的な語であること、及び添付の特許請求の範囲の範囲内で、より広い態様において本発明の真性の範囲及び主旨から逸脱せずに変更を行うことができることを理解すべきである。

本発明をある長さにおいて、及びいくつかの記載される実施形態に関してある特定性で記載してきた一方、任意のそのような特定物にも実施形態にも任意の特定の実施形態にも限定すべきものではないが、添付の特許請求の範囲を参照して従来技術に照らしてそのような特許請求の範囲の最も広く考えられる解釈を提供し、したがって、本発明の目的とする範囲を有効に包含するように解釈すべきである。

Claims (25)

1. 配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）をＰＥＧ化する方法であって、
   （ａ）ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子とを約４０倍までのモル過剰の前記ＮＨＳエステルＰＥＧ分子の溶液中でコンジュゲートさせてバッチを作出することであって、前記複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ分子である、作出すること；
   （ｂ）前記バッチのサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析からのクロマトグラフィープロファイルからの保持時間と、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラフィープロファイルからの保持時間とを比較して不十分なＰＥＧ化を同定することであって、不十分なＰＥＧ化を有する前記バッチは、許容可能なＰＥＧ化を有する前記ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの保持時間よりも長い保持時間を有する、同定すること；及び
   （ｃ）追加のＮＨＳエステルＰＥＧ分子を前記バッチに添加して前記バッチにおける不十分なＰＥＧ化の量を低減させ、それにより前記ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳをＰＥＧ化すること
   を含む方法。
2. 配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）をＰＥＧ化する方法であって、
   （ａ）ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓと１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子とを約４０倍未満のモル過剰の前記ＮＨＳエステルＰＥＧ分子の溶液中でコンジュゲートさせてバッチを作出することであって、前記複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は２０ｋＤａのＮＨＳエステルＰＥＧ分子である、作出すること；
   （ｂ）前記バッチの非還元キャピラリー電気泳動（ＮＲ−ＣＥ）分析からの保持時間と、許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＮＲ−ＣＥ分析からの保持時間とを比較して不十分なＰＥＧ化を同定することであって、不十分なＰＥＧ化を有する前記バッチは、許容可能なＰＥＧ化を有する前記ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの保持時間よりも短い保持時間を有する、同定すること；及び
   （ｃ）追加のＮＨＳエステルＰＥＧ分子を前記バッチに添加して前記バッチにおける不十分なＰＥＧ化の量を低減させ、それにより前記ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳをＰＥＧ化すること
   を含む方法。
3. 前記ＮＨＳエステルＰＥＧ分子が、約１０倍のモル過剰で存在する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＮＨＳエステルＰＥＧ分子が、約２０倍のモル過剰で存在する、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記ＮＨＳエステルＰＥＧ分子が、２０倍未満、１０倍未満、５倍未満、又は２倍未満のモル過剰で存在する、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子が、５ｋＤａのＮＨＳエステル（５ＮＨＳ）ＰＥＧ分子からなる、請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子が、１０ｋＤａのＮＨＳエステル（１０ＮＨＳ）ＰＥＧ分子からなる、請求項１又は２に記載の方法。
8. 前記１つ又は複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子が、２０ｋＤａのＮＨＳエステル（２０ＮＨＳ）ＰＥＧ分子からなる、請求項１又は２に記載の方法。
9. 前記複数のＮＨＳエステルＰＥＧ分子のそれぞれが、約２０ｋＤａ未満である、請求項１又は２に記載の方法。
10. 不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが、１５個未満、１０個未満、５つ未満、又は１つ未満のＰＥＧ化アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。
11. 許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが、少なくとも１つのＰＥＧ化アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。
12. 不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの前記バッチの前記保持時間が、約９．５０分間、約９．７５分間、約１０．００分間、及び約１０．２５分間よりも長い、請求項１に記載の方法。
13. 不十分なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの前記バッチの前記保持時間が、約９．６０分間〜約９．７０分間である、請求項１２に記載の方法。
14. 許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの前記保持時間が、約９．５０〜約９．６０分間の範囲内である、請求項１４に記載の方法。
15. 許容可能なＰＥＧ化を有するｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの前記保持時間が、約９．５３分間よりも短い、請求項１４に記載の方法。
16. 治療の継続期間全体にわたり対象におけるホモシスチン尿症のための治療の効力を維持する方法であって、
    （ａ）請求項１又は２に記載の方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有する治療有効量のヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を対象に投与すること
    を含む方法。
17. 前記治療の前記効力が、２週間まで、１ヵ月間まで、６ヵ月間まで、又は１年間まで維持される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記治療の前記効力が、１年間よりも長く維持される、請求項１６に記載の方法。
19. ホモシスチン尿症を有する対象におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）のレベルを低減させる方法であって、
    （ａ）請求項１若しくは２に記載の方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位のシステインのセリンへの突然変異を含有する治療有効量のヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を対象に投与すること
    を含む方法。
20. Ｈｃｙの前記レベルが、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、及び約９０％〜約１００％から選択される範囲の群から選択される範囲で低減される、請求項１９に記載の方法。
21. ホモシスチン尿症を有する対象におけるシステイン（Ｃｙｓ）のレベルを増加させる方法であって、
    （ａ）請求項１又は２に記載の方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位のシステインのセリンへの突然変異を含有する治療有効量のヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）を対象に投与すること
    を含む方法。
22. 前記バリアントが、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有する、請求項１、２、又は１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記投与ステップから生じる治療効果が、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、又は少なくとも２４時間維持される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
24. 請求項１又は２に記載の方法を使用してＰＥＧ化された、配列番号１のアミノ酸１５位におけるシステインのセリンへの突然変異を含有するヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質又はそのバリアント（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）；及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物。
25. 前記バリアントが、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有する、請求項２４に記載の医薬組成物。