CN1302209A - 多元醇干扰素β偶联物 - Google Patents

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Abstract

用硫醇反应PEG化剂通过位点特异性PEG化过程产生了PEG－IFN－β偶联物(其中一个PEG分子和人IFN—β的Cys17共价结合)。还提供了用于治疗感染、肿瘤和自身免疫及炎症疾病的药物组合物和方法。本发明还涉及PEG分子连续分步结合到多肽,更具体为IFN—β上的方法。

Description

多元醇干扰素β偶联物
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求美国临时申请号60/083,339的优先权，其全部内容在此纳入以供参考。
发明领域
本发明涉及多元醇-IFN-β偶联物，其中多元醇单元和Cys17共价结合。本发明的另一个目的是其位点特异性产生的过程以及其在细菌感染、病毒感染、自身免疫疾病和炎症疾病中治疗、预后或诊断中的用途。本发明还涉及两个或多个PEG分子分步结合到多肽上的方法。
发明背景
人成纤维细胞干扰素(IFN-β)具有抗病毒活性而且也能刺激针对致瘤性细胞的自然杀伤细胞。它是由病毒和双链RNA诱导的约20,000Da的多肽。Derynk等(自然，285:542-547,1980)用重组DNA技术克隆的成纤维细胞基因的核苷酸序列推出了该蛋白质的完整氨基酸序列。它长166个氨基酸。
Shepard等(自然，294:536-565,1981)描述了842位的碱基突变能消除其抗病毒活性(位点141Cys→Tyr)，以及具有1119-1121核苷酸缺失的变异克隆。
Mark等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81(18):5662-5666,1984)通过用(A)置换469(T)碱基，导致在位点17从Cys→Ser的氨基酸转变，插入了一个人工突变。报道了得到的IFN-β与“天然”IFN-β活性相同，并且在长期储藏(-70℃)中保持稳定。
将亲水性多聚物聚乙二醇(PEG)(也称作聚环氧乙烷)与分子共价结合是生物技术和医学上的重要应用。PEG在其最常见形式下是在各末端具有羟基基团的线性多聚物：
HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH该分子式能简单的代表为HO-PEG-OH，其中指-PEG-代表没有末端基团的多聚物主链：
“-PEG-”指“-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-
PEG通常用作甲氧基-PEG-OH，其中一个末端是相对惰性的甲氧基基团，而另一个末端是要化学修饰的羟基基团。
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
也常用支链PEG。支链PEG可以表示成R(-PEG-OH)m，其中R代表例如季戊二醇或丙三醇的中央核心分子，而m代表支化臂的数目。支化臂的数目(m)能从三变化到100或更多。羟基基团要进行化学修饰。
其它如PCT专利申请WO 96/21469所述的支链形式具有要进行化学修饰的单个末端。这种PEG类型能表示成(CH3O-PEG-)pR-X，其中p等于2或3，R代表例如赖氨酸或丙三醇的中央核心，而X代表如能进行化学活化的羧基的功能性基团。而另一个支链形式，“侧基PEG”具有如羧基(其主要在PEG主链上而不是在PEG链末端)的反应性基团。
除了PEG的这些形式，也能用在主链中的弱键或可降解键来制备多聚物。例如，Harris已在美国专利申请06/026,716中显示能用多聚物主链中可进行水解的酯键来制备PEG。该水解(反应)导致多聚物被切成较小分子量的片段，根据反应流程：
根据本发明，术语聚乙二醇或PEG指包括所有上述衍生物。
环氧乙烷和环氧丙烷的共多聚物在其化学上和PEG密切相关，而且它们能用来代替PEG的许多应用。它们具有以下通式：HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH其中R是H或CH3。
PEG是具有高水溶性以及在许多有机溶剂中具有高溶解性的性质的有用的多聚物。PEG无毒性也无免疫原性。当PEG和水不溶性化合物化学结合(PEG化)时，得到的偶联物通常是水溶性的，以及在许多有机溶剂中是可溶的。
现在，PEG-蛋白质偶联物被用于蛋白质替代治疗和其它治疗性用途中。例如，PEG化腺苷脱氨酶(ADAGEN®)正将用于治疗重度联合免疫缺陷病(SCIDS)，PEG化L-天冬酰胺酶(ONCAPSPAR®)正将用于治疗急性淋巴母细胞白血病(ALL)，而PEG化干扰素-α(INTRON(R)A)正在进行治疗丙型肝炎的三期试验。
对于具有临床功效的PEG蛋白质偶联物的综述，可见N.L.Burnham,Am.J.Hosp.Pharm.,15:210-218,1994。
已经开发了得到PEG化蛋白质的不同方法。将PEG与蛋白质上发现的反应性基团结合通常是利用亲电活化PEG衍生物完成的。将PEG与赖氨酸残基和N末端上找到的α-和ε-氨基基团结合，得到组成产物混合物的偶联物。
通常，这些偶联物包括每个蛋白质分子结合的PEG分子数从0到蛋白质中氨基基团数变化的偶联物。对于已经单独修饰的蛋白质分子，PEG单元可以结合在许多不同的胺位点上。
非特异性PE固化的这种类型已经产生了许多变得几乎无活性的偶联物。活性减弱通常是由于如同在许多细胞因子和抗体中一样，屏蔽了蛋白质的活性结合功能域所致。例如，Katre等在美国专利4,766,106和美国专利4,917,888中描述了用超量许多的甲氧基-聚乙二醇基N-琥珀酰亚胺基戊二酸和甲氧基-聚乙二醇基N-琥珀酰亚胺基琥珀酸PEG化IFN-β和IL-2。两种蛋白质都是在微生物宿主细胞中产生的，其允许自由半胱氨酸位点特异性突变为丝氨酸。突变在IFN-β的微生物表达中是必需的，以促进蛋白折叠。具体的，这些实验中所用的IFN-β是商业产品Betaseron®，其中Cys17被丝氨酸替换。另外，无糖基化减弱了它在水溶液中的可溶性。非特异性PEG化导致可溶性提高，但主要问题是活性和产量的水平降低。
欧洲专利申请EP 593 868(题为PEG-干扰素结合物)，描述了PEG-IFN-α的制备。然而，PEG化反应不是位点特异性的，并因此获得了PEG-IFNα偶联物位置异构体的混合物(也见Monkarsh等，ACS.Symp.Ser.,680:207-216,1997)。
Kinstler等在欧洲专利申请EP 675 201中演示了用mPEG-丙醛对巨核细胞生长和发育因子(MGDF)的N-末端残基的选择性修饰。这考虑到批间可重复性PEG化和药物代谢动力学。Gilbert等在美国专利5,711,944中证明能产生具有最适水平活性的IFN-α的PEG化。在该例中需要费力的纯化步骤来获得最适偶联物。
大部分细胞因子，以及其它蛋白质没有特异性PEG结合位点，而且除上文提到的例子以外，很可能一些通过PEG化反应产生的异构体部分或完全无活性，从而导致最终混合物的活性丧失。
因此位点特异性单-PEG化是这些蛋白质偶联物制备中的理想目标。
Woghiren等在Biocon.jugate Chem.,4(5):314-318,1993中为这样的位点特异性PEG化合成了硫醇选择性PEG衍生物。显示了稳定的硫醇保护的PEG衍生物以二硫正吡啶反应基团的形式与蛋白质木瓜蛋白酶的自由半胱氨酸特异性偶联。木瓜蛋白酶和PEG酯键新形成的二硫键能在温和降解条件下被切开，以再生天然蛋白。
本文任何文件的引用并不承认这些文件是有关现有技术，或是本申请任何权利要求专利性的材料。任何对任一文件的内容和时间的陈述是基于在提交时对申请人可得的信息，不是对该陈述正确性的承认。
发明简述
在本发明中提供了多元醇-IFN-β偶联物，具体是PEG-IFN-β偶联物，其中多元醇单元与Cys17共价结合。通过使硫醇反应性多元醇剂和IFN-β中的Cys17残基反应获得特异性偶联物。希望这种偶联物在体内显示提高的作用。目标是获得在中等pH可溶性提高，稳定性提高(减少聚集)，免疫原性减弱，以及与“天然”IFN-β比较不损失活性。这种聚合反应的结果将减少达到所需效果的剂量，简化和稳定药物组合物的配制，以及可能提高长期功效。
本发明还提供了PEG分子连续分步结合到多肽上的方法。
附图简述
图1显示PEG-IFN-β纯化前毛细管电泳(CE)图。
图2A-2C显示通过分子排阻层析(Superose 12)进行的PEG-IFN-β偶联物纯化：图2A-首次通过；图2B-二次通过；图2C-第三次通过。
图3显示来自第三次通过层析的纯化PEG-IFN-β偶联物的SDS-PAGE层析。泳道1和4是蛋白质分子量标准，泳道2是“天然”IFN-β，而泳道3是PEG-IFN-β偶联物。
图4报道了纯化的PEG-IFN-β偶联物(其中IFN用mPEG-OPSS5kPEG化)的毛细管电泳(CE)图。
图5报道了纯化PEG-IFN-β偶联物的MALDI MS色谱。
图6显示了“天然：IFN-β和PEG-IFN-β偶联物的抗病毒活性酯键的比较。用指定浓度的IFN-β样品与WISH细胞在用水泡性口炎病毒的致细胞病变的剂量攻击前一起培养24小时。在另外48小时后用MTT法测定细胞病变作用。
图7显示了Daudi细胞中IFN-β和PEG-IFN的结合。
图8显示了静脉施药后小鼠中IFN-β和PEG-IFN的药物代谢动力学。虚线表明各标准曲线的LOQ测定。
图9显示了皮下施药后小鼠中IFN-β和PEG-IFN的药物代谢动力学。虚线表明各标准曲线的LOQ测定。
发明详述
本发明基于多元醇分子，具体是PEG分子，与人IFN-β的Cys17残基的结合出乎意料的比天然人干扰素-β提高了(或至少保持了并不导致减弱了)IFN-β生物学活性的发现。因此，具有多元醇分子与Cys17残基结合的IFN-β不仅展示了相同或提高的IFN-β活性，而且该多元醇-IFN-β偶联物也提供了多元醇分子授予的理想性质，例如提高的可溶性。
“IFN-β”，如本文所用，指如从生物液分离获得的，或用DNA重组技术从原核或真核宿主细胞获得的人成纤维细胞干扰素，以及其盐、功能性衍生物、前体和活性片段，规定其含有在天然存在形式的位点17出现的半胱氨酸残基。
根据本发明，多元醇-IFN-β偶联物中的多元醇分子可能是任何具有线性或支链的水溶性单-或双功能性聚(环氧烷基)。通常，多元醇是聚(乙二醇)(PEG)。然而，本领域技术人员将认识到也能合适的使用其它多元醇，例如聚(丙三醇)和聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
如本文所用的术语“PEG分子”指包括但不限于，线性或分支PEG，甲氧基PEG，可水解或酶解PEG，侧基(pendant)PEG，树枝聚物(dendrimer)PEG,PEG和一或多个多元醇的共聚物，以及PEG和PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))共聚物。
本文使用的定义“盐”同时指羧基基团的盐和可用已知方法获得的化合物氨基官能团的盐。羧基的盐包含无机盐，如钠、钾、钙盐和例如用胺如三羟乙基胺、精氨酸或赖氨酸形成的有机碱的盐。氨基的盐包含与无机酸，如盐酸的盐，和与有机酸，例如乙酸的盐。
本文所用的定义“功能性衍生物”指能从存在于氨基酸分子侧链或末端N-C-基团的官能团根据已知方法制备的，并当其是药物学可接受时，亦即，当其不毁坏蛋白质活性或不授予含有它们的药物组合物毒性时包括在本发明中的衍生物。这种衍生物包含羧基的酯或脂肪酸，和自由氨基的N-酰基衍生物，或自由羟基的O-酰基衍生物，并通过酰基如链酰基-或芳酰基-基团形成。
“前体”是在人或动物体内转化为IFN-β的化合物。
对于蛋白质的“活性片段”，本发明指当这种片段或前体显示和药物相同的IFN-β活性时，单独或和与其结合的相关分子或残基，例如蔗糖或磷酸残基，或多肽分子的聚合物联合的化合物本身多肽链的任何片段或前体。
本发明的偶联物能用任何本领域已知的方法制备。根据本发明的一个实施例，将IFN-β和PEG化剂在合适溶剂中反应，分离并纯化所要的偶联物，例如，通过进行一或多次层析方法。
“层析方法”指任何用它们与溶剂(流动相)流过的载体(固定相)连接来分离混合物组分的方法。层析的分离原理是根据固定相和流动相的不同物理性质。
一些层析方法文献中熟知的具体类型包含：液相，高效液相，离子交换，吸收，亲和，分离，疏水，反相，凝胶过滤，超滤或薄层层析。
如本申请所用的“硫醇反应性PEG化剂”指任何能与半胱氨酸残基的硫醇基团反应的PEG衍生物。它可能是，含有例如二硫正吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰胺及其它官能团的PEG。根据本发明的优选例，硫醇反应性PEG化剂是PEG的二硫吡啶(OPSS)衍生物。
以其单-甲氧基化形式使用PEG化剂，其中仅一个末端能被偶联，或以双功能形式使用，其中两个末端都能偶联，例如以两个IFN-β与一个PEG分子共价连接形成偶联物。分子量优选在500和100,000之间。
本发明偶联物制备的典型反应流程如下：
Figure A9980549600101
上述流程的第二行报道了一种切开PEG-蛋白键的方法。mPEG-OPSS衍生物对于自由巯基高选择性，并且在IFN-β稳定的酸性pH条件下迅速反应。能从与TFN-β和PEG的天然形式偶联的减少证明高选择性。
已显示蛋白质和PEG分子之间产生的二硫键在循环中是稳定的，但它在进入细胞环境后会被还原。因此希望该偶联物不进入细胞，在循环中都保持稳定，直到被清除。
需要注意的是，上述反应是位点特异性的，因为在人IFN-β天然存在形式中的位点31和141处的其它两个Cys残基由于形成二硫桥，不和硫醇反应性PEG化剂反应。
本发明还指出了两个或多个PEG分子连续分步结合到多肽的方法。该方法是根据低分子量的活化PEG比高分子量的活化PEG能更完整的和蛋白质上的空间位阻反应位点反应的认识。昂贵的治疗用蛋白质的PEG修饰为了使PEG偶联物能实践生产，必须是花费有效的。另外，为了减少肾小球滤过和优化PEG-蛋白质偶联物的药理学性质，偶联物必须具有和分子量为70kDa的蛋白质相当的有效尺寸。这意味着对于将结合一个PEG的位点特异性修饰，优选结合一个具有20kDa以上分子量的PEG衍生物。如果修饰位点是空间拥挤的，大PEG分子上的反应基团可能难于达到修饰位点从而因此将导致低产量。根据本发明PEG化多肽的优选方法通过首先结合由于其相对较小的尺寸能和空间拥挤的位点反应的小异双功能或同双功能性PEG分子来提高位点特异性PEG化的产量。大分子量PEG衍生物随后和该小PEG的结合得到高产量的所要的PEG化蛋白质。
根据本发明，两个或多个PEG分子连续分步与多肽结合的方法包含：首先将低分子量异双功能性或同双功能性PEG分子与多肽结合，然后将单功能性或双功能性PEG分子和结合于多肽的低分子量PEG分子末端结合。在两个或多个PEG分子连续分步与多肽结合(其中多肽优选是IFN-β，而且其中位于空间拥挤位点的Cys17是PEG结合的优选位点)后，能用一或多种纯化技术例如离子交换层析、分子排阻层析、疏水反应层析、亲和层析和反相层析来纯化PEG-多肽偶联物。
低分子量PEG分子具有分子式：W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X，其中W和X是分别和胺、巯基、羧基或羟基官能团反应，来将低分子量PEG分子和多肽结合的基团。W和X优选分别选自二硫正吡啶、马来酰亚胺、乙烯砜、碘乙酰胺、胺、硫醇、羧基、活性酯、苯并三唑碳酸、p-硝基苯碳酸、异氰酸盐和生物素。低分子量PEG分子优选具有范围在大约100到5,000道尔顿的分子量。
用来与结合于多肽的低分子量PEG自由末端结合的单功能性或双功能性PEG分子优选具有范围大约100道尔顿到200kDa的分子量，而且优选是甲氧基PEG，分支PEG，可水解或酶解PEG，侧基PEG，或树枝聚物PEG。但功能性或双功能性PEG还具有分子式：Y-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z，其中Y和结合于多肽上的低分子量PEG分子的自由末端基团反应，而Z是-OCH3或一个与其反应来形成双功能性偶联物的基团。
为了两个或多个PEG分子连续分步与多肽结合的方法产生的PEG-多肽偶联物能用来产生用于治疗疾病或失常的医学或药物组合物，其中多肽作为活性成分是有效的。
本发明的另一个目的是提供充分纯化形式的偶联物，来使它们适合用作药物组合物，细菌和病毒感染以及自身免疫、炎症疾病和肿瘤的治疗、诊断或预后的活性成分。这种药物组合物代表了本发明的另一个目的。
上述疾病的非限制性例子包含：感染性休克、AIDS、类风湿性关节炎、红斑狼疮和多发性硬化症。
本发明的其它实施例和优点将在下列描述中被证明。
本发明的一个实施例是将本发明偶联物的药理活性量施用给受到上面报道的疾病之一发生的威胁的人或已经显示这种病理状态的人。
能使用任何与活性要素兼容的施药途径。肠道外施药，例如皮下、肌肉内或静脉注射都是优选的。要施用的活性成分剂量由参照病人年龄、体重和个人反应的医学处方的基础而定。
对于75公斤平均体重，剂量可能是每日10微克和1毫克之间，而优选的每日剂量是20微克和200微克之间。
能够用含有活性要素和合适载体的可注射形式制备胃肠外施药的药物组合物。用于胃肠外施药的载体是本领域熟知的，并且包含例如水、盐溶液、Ringer溶液和/或葡萄糖。载体能含有小量赋形剂来保持药物学制备物的稳定性和等渗性。溶液制备能参照常规形式进行。
本发明已经根据具体实施例描述，但描述内容包括所有本领域技术人员可提出的变体和替换物，不超过权利要求的意图和目的。
现在本发明将通过下列实施例来详述，它们不意图以任何方式限制本发明。
实施例1：PEG-IFN-β偶联物的制备
IFN-β用mPEG5k-OPSS的修饰
将在50mM醋酸钠缓冲液浓度为0.37mg/ml，pH3.6中是稳定的重组人IFN-β用于PEG-IFN-β的制备。将大约1.Oml的6M尿素以浓度为0.37mg/ml(0.74mg,3.7×1-8摩尔)加到2毫升IFN-β中。以50M对1M IFN-β摩尔剩余量加入mPEG5K-OPSS，两者在聚丙烯瓶中37℃反应2小时或50℃反应1小时。在任何纯化步骤之前，用毛细管电泳(CE)图分析反应混合物来测定通过PEG化反应PEG-IFN-β偶联物形成的程度(图1)。该反应的通常产量为50％PEG-IFN-β。将反应产物从反应混合物中用0.22mm针筒式滤器过滤出来，然后将滤出液加到分子排阻层析柱(Superose 12或Suoerdex 75,Pharmacia)上，用50mM磷酸钠，150mM NaCl,pH7.5缓冲液洗脱。图2A显示了PEG-IFN-β偶联物在Superose 12分子排阻层析柱上纯化的洗脱图谱。收集峰并用SDS-PAGE分析(图3)。由于“天然”IFN-β峰靠得很近(图2B)，将含有PEG-IFN-β偶联物的组分合并在一起，然后将浓缩液重新加到同一分子排阻层析柱上，来再次纯化PEG-IFN-β偶联物。再次重复该程序(第三次通过)来确保纯度(图2C)。图4和图5分别显示了纯化PEG-IFN-β偶联物的毛细管电泳图和MALDI MS色谱。
IFN-β用mPEG30K-OPSS的修饰
提供了以0.36mg/ml溶于50mM醋酸钠缓冲液，pH3.6中是稳定的重组人IFN-β。将溶于3ml去离子H2O的约36毫克mPEG30K-OPSS加到浓度为0.36mg/ml(1.08mg,4.9×10-8摩尔)的3毫升IFN-β中。使两者在聚丙烯试管中50℃反应2小时。用毛细管电泳分析反应混合物的修饰程度。该反应的通常产量低于30％。然后将溶液加到分子排阻层析柱(Superose12,Pharmacia)上，用50mM磷酸钠，150mM NaCl,pH7.0缓冲液洗脱。收集峰并用SDS-PAGE分析其内容。
实施例2：PEG-IFN-β偶联物的生物学活性
为了评价PEG化对人重组IFN-β抗病毒活性的作用，将人WISH羊膜细胞和新制备IFN-β(用于PEG化的同一批)或PEG-IFN-β偶联物一起预培养。根据基于Novick等，免疫学杂志，129:2244-2247(1982)的方案开发的抗病毒WISH生物试验，如同用WISH-VSV细胞病变试验测试的那样来测定IFN-β介导的抗病毒活性。该WISH试验中使用的材料如下：
WISH细胞(ATCC CCL 25)
水泡性口角炎病毒原种(ATCC V-520-001-522)，贮藏在-70℃
IFN-β，人重组，InterPharm Laboratories LTD(32,075-种，Batch＃205035),82×106IU/ml，比活性：222×106IU/mg
如实施例1制备的PEG-IFN-β偶联物，保存在PBS,pH7.4
WISH生长培养基(MEM高葡萄糖和Earls盐+10％FBS+1。0％L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素(100U/ml,100微克/ml))
WISH试验培养基(MEM高葡萄糖和Earls盐+5％FBS+1.0％L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素(100U/ml,100微克/ml))
PBS中的5mg/mlMTT，储藏在-70℃。
WISH试验的方案如下：
将IFN-β样品稀释到2XWlSH试验培养基中的起始浓度。
将3倍稀释度的WISH测定培养基中的IFN-β样品置于平底96孔板中，从而使各孔含有50微升稀释的IFN-β样品(一些对照孔只加入了50微升WISH试验培养基)
用胰蛋白酶/EDTA溶液收集对数生长期的WISH细胞，用WISH试验培养液洗涤，并得到最终浓度为0.8×106细胞/ml。
将50微升WISH细胞悬液(4×104细胞/孔)加到各孔中。接触细胞的IFN-β最终浓度是1X。
在5％CO2加湿培养箱中培养24小时后，将50微升1∶10稀释(于WISH试验培养液)的VSV原种(预定在48小时中裂解100％WISH细胞的剂量)加到除了无病毒对照孔(这些只加入等体积的试验培养液)之外的所有孔中。
经过另外48小时后，将25微升MTT溶液加到所有的孔中，然后将板在培养箱中再培养2小时。
通过倒置板除去孔的内容物，将200微升100％乙醇加到孔中。
1小时后，用Soft max Pro软件包和Spectramax分光光度计系统(MolecularDevices)在595nm处对板读数。
表1.PEG化和模拟-PEG化IFN-β样品的抗病毒活性
    IFN-β样品*     EC50**
    PEG-IFN-β偶联物     3.9+/-0.7pg/ml
    IFN-β     16.4+/-1.0pg/ml
*用氨基酸分析测定的样品中IFN-β的原种浓度**用软件程序Microcal Origin 4.1测定的EC50(+/-S.D.)
如上文图6和表1所示，PEG-IFN-β偶联物维持了高于新制备的IFN-β母本批的抗病毒活性水平。
观察到PEG-IFN-β偶联物具有比新制备IFN-β大约高4倍的生物活性，这也可能是与“天然”IFN-β比较，在加入WISH细胞试验培养基后PEG-IFN-β偶联物稳定性较高的结果。
实施例3：PEG-IFN样品相对活性的体外试验
用实施例2(表2)中所述的标准方案通过WISH试验测定了PEG[30kD]-IFN-β和PEG[2X20kD]-IFN-β的相对生物活性。通过三个不同的人在不同时间进行了三次独立试验。
表2.PEG-IFN-β的相对抗病毒活性
    相对干扰素活性*(来自三次研究)
    样品   试验1   试验2   试验3   平均(S.D.)
  PEG[30kD]-IFN-β   3.2X更高   3.1X更高   1.8X更高 3.0X(0.78)更高
PEG[2x20kD]-IFN-β  4.2X更高   1.3X更高   0.85X更高 2.1X(1.8)更高
*EC50剂量和各试验中包含的标准IFN-β进行比较
**比较基于330微克/mlIFN-β浓度。用AAA测定PEG[30kD]-IFN-β(5.41微克/ml)和PEG[2x20kD]-IFN-β(6.86微克/ml)的原种浓度。
在固定量125I-IFN-α2a的存在下评估了PEG-IFN-β和细胞上其受体的结合。用氯胺T方法使用125I放射性标记IFN-α2a。使反应物通过Sephadex G25柱并合并含有组分的蛋白(Pharmacia)来从125I结合的IFNα2a中除去自由碘。用IFN-α2a ELISA试验(Biosource,USA)定量125I-IFN-α2a并测定比活性。收集对数期的Daudi细胞，在不同浓度的稀释于含有2％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的RPMI 1640测定缓冲液中的PEG-IFN-β或IFN-α2a存在下，将2×106细胞和0.5nM 125I-IFN-α2a在室温下培养3小时。在培养终点，将细胞离心通过一层邻苯二甲酸盐油，并用γ计数器来对细胞结合放射性进行计数。另外，PEG[30kD]-IFN-β和PEG[2×20kD]-IFN-β和受体的结合与如图7所示的结合活性非常相似或接近。
另外，在Daudi细胞(人B细胞淋巴瘤)抗增殖试验中测定了相对活性(表3)。以200ng/ml的2X浓度制备了所有IFN。将样品延着板长度3倍稀释到最终体积为100微升。将1×105细胞/孔(100微升)加到各孔中，并在CO2加湿培养箱中37℃共培养72小时。48小时后，以20微升中1μCi/孔加入含氚(3H)胸苷。在72小时培养的终点，用Tomtek Plate Harvester收集板。显示于表3的结果表明从PEG化未观察到可检测的IFN损失。实际上，发现活性比自由IFN-β稍微高一些。这可能是由于自由IFN中无活性聚集物的形成或由于定量方法之间的差异(对于PEG-IFN样品的氨基酸分析和对于IFN-β的RP-HPLC)。
表3.Daudi抗增殖试验
    IC50剂量*   对于IFN增加的倍数
    IFN-β(板1)     1153.  1     -
  PEG[30kD]-IFN(71A)     695.6     1.6X
    IFN-β(板2)     1005.8     -
  PEG[40kD]-IFN(71B)     629.4     1.7X
*pg/ml
实施例4：小鼠静脉施药的药物动力学研究
用100纳克IFN-β，PEG[30kD]-IFN-β或PEG[2X20kD]-IFN-β注射小鼠，之后在指定时间采血。用IFN-β特异性ELIAS(Toray Industries)测定IFN-β的血清浓度，结果显示于图8。将28只雌性B6D2F1株小鼠(6-8周)(大约各重20克)分成如下4组：组1含有9只用200微升500ng/ml人IFN-β(最终剂量为100ng/鼠)弹丸注射的小鼠；组2(9鼠)接受了200微升等量的PEG30kD-IFN-β；而组3接受了200微升等量的PEG(2×20kD)-IFN-β；而组4是3只作为阴性对照的未注射小鼠组。于9个指定时间通过用毛细管眼眶静脉丛来收集血样(大约200微升/样品)。使血样在室温下凝结1小时，并微量离心。将血清储藏在-70℃直到收集所有血清。用Toray试验测定血清中生物活性的人IFN-β的存在。结果表明曲线下区域(AUC)在PEG-IFN样品中比自由IFN-β显著增加，而PEG[2X20kD]-IFN-β比PEG[30kD]-IFN-β更高。
皮下施药
用IFN-β和PEG-IFN(100ng/鼠)皮下注射小鼠。图9显示与自由IFN-β比较，PEG-IFN样品总曲线下面积(AUC)显著增加。药物代谢动力学研究与具有较长半衰期及增加曲线下面积的PEG-IFN样品一致。
实施例5：低分子量PEG分子和多肽的结合
IFN-β和OPSS-PEG2K-酰肼连接
重组人IFN-β以0.33mg/ml溶于50mM醋酸钠缓冲液，pH3.8的溶液。将大约3.6mg(比蛋白质摩尔多40摩尔)异双功能PEG试剂，OPSS-PEG2K-酰肼(溶于2ml去离子水)加到3毫升O.33mg/ml(0.99mg)的IFN-β中，使二者在聚丙烯试管中45℃反应1小时。然后用毛细管电泳分析反应混合物，来测定修饰程度。通常产量由IFN-β和PEG试剂的纯度而定，从90-97％变化。然后将溶液加到分子排阻层析柱(Superdex 75,Pharmacia)上，用5mM磷酸钠，150mMNaCl,pH7.0缓冲液洗脱。收集峰，用SDS-PAGE分析。将单PEG化IFN-β组分合并在一起，然后在用高分子量PEG进一步修饰步骤中使用。
IFN-β和(0PSS)2-PEG3400连接
Figure A9980549600172
重组人IFN-β以0.33mg/ml溶于50mM醋酸钠缓冲液，pH3.8的溶液。将大约6.1mg(比蛋白质摩尔多40摩尔)同双功能PEG试剂，(OPSS)2-PEG3400(溶于2ml去离子水)加到3毫升0.33mg/ml(0.99mg)的IFN-β中，使二者在聚丙烯试管中50℃反应2小时。用无降解SDS-PAGE监测反应，用毛细管电泳分析最终反应混合物，来测定修饰程度。和IFN-β的该反应典型修饰量大于95％。然后将溶液加到分子排阻层析柱(Superdex 75,Pharmacia)上，用5mM磷酸钠，150mM NaCl,pH7.0缓冲液洗脱。收集峰，用SDS-PAGE分析其内容物。单PEG化IFN-β组分被合并在一起。
实施例6：第二个PEG分子和低分子量PEG化多肽的结合
用mPEG30k-乙醛(ALD)对IFN-S-S-PEG2k-酰肼的修饰
Figure A9980549600181
将比蛋白质多20摩尔的mPEG30k-ALD加到实施例5中的IFN-S-S-PEG2k-酰肼合并组分中。使反应在室温(25℃)下进行4小时，将样品加到分子排阻层析柱(Superose 6,Pharmacia)上来测定修饰量。本反应的修饰量由PEG试剂和反应条件而定，通常大于80％。
现在已完整描述了本发明，可以理解本领域技术人员在相当的参数、浓度和条件的广阔范围内，不违背本发明的精神和范围，不进行不适当的实验，能进行同样的(实践)。
由于本发明已经与其特定实施例一起被描述，可以理解的是还能进行其它修饰。本申请将要覆盖任何本发明的变体、用途、或改变，它们是根据本发明的一般原理，并包含对本公开的违背(例如将其作为本发明涉及领域的已知或通常实践，和例如应用本文上文列出的如在所附权利要求范围内的基本特征)。
本文所引用的全部参考文献，包含杂志文章或摘要、出版或未出版的美国或外国专利申请、授权的美国或外国专利、或任何其它参考文献，都通过在本文中参考被全部引入，包含全部引用文献中的数据、表格、图、和文字、另外，本文引用的参考文献也被全部引入以供参考。
已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的参考在任何方面都不是承认本发明的任何方面、描述或实施例在相关领域中被公开、传授或提出。
前面对特定实施例的描述将完全揭示本发明的一般特点，因此其它人能通过使用本领域技术人员的知识(包含本文引用的参考文献的内容)不进行不合适的实验，不违背本发明的一般观点，容易的修改和/或改变这些特定实施例的不同应用。因此，这些改变和修改应在公开实施例的等效例的意义和范围内，基于本文的传授和指导。也可理解，本文的措词和术语是为了描述而不是限制，因此本说明书的术语或措词可以被技术人员根据本文的传授和指导，结合本领域一般技术人员的知识被解释。

Claims (25)

1．一种多元醇-干扰素-β偶联物，其特征在于，该偶联物具有与人干扰素-β的Cys17共价结合的多元醇分子。
2．如权利要求1所述的多元醇-干扰素-β偶联物，其特征在于，所述多元醇分子是聚亚烷基二醇分子。
3．如权利要求2所述的多元醇-干扰素-β偶联物，其特征在于，所述聚亚烷基二醇分子是聚乙二醇分子。
4．如权利要求1-3任一所述的多元醇-干扰素-β偶联物，其特征在于，多元醇-干扰素-β偶联物具有和天然人干扰素-β相同或更高的干扰素-β活性。
5．一种产生权利要求1所述的多元醇-干扰素-β偶联物的方法，其特征在于，该过程包括以下步骤：
用硫醇反应性多元醇剂和干扰素-β反应，来使多元醇分子和人干扰素-β位点特异性共价结合，从而产生多元醇-干扰素-β偶联物；以及
回收产生的多元醇-干扰素-β偶联物。
6．如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硫醇反应性多元醇是硫醇反应性PEG化剂。
7．如权利要求5或权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反应性多元醇剂是单甲氧基化的。
8．如权利要求5或权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反应性多元醇剂是双功能性的。
9．如权利要求5或权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反应性多元醇剂是具有选自二硫正吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺和碘乙酰胺的官能团的多元醇衍生物。
10．如权利要求5或权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫醇反应性多元醇剂是单甲氧基化多元醇的二硫正吡啶衍生物。
11．如权利要求5所述的方法，其特征在于，该反应步骤在干扰素-β稳定的酸性pH下进行。
12．一种药物组合物，其特征在于，该组合物包括作为活性成分的、根据权利要求1-3任一所述的多元醇-干扰素-β偶联物，和药物学可接受的载体、赋形剂或辅助剂。
13．一种治疗感染、肿瘤和自身免疫及炎症疾病的方法，其特征在于，该方法包括对需要治疗的病人施用有效量的权利要求12所述的药物组合物。
14．一种分步连续将聚乙二醇和多肽结合的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
将多肽和低分子量异双功能性或同双功能性聚乙二醇分子反应，所述聚乙二醇分子具有下列分子式：
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X其中W和X是分别和胺、巯基、羧基或羟基官能团反应，使低分子量聚乙二醇分子和多肽结合的基团；以及
将结合在多肽上的低分子量聚乙二醇分子和单功能性或双功能性聚乙二醇分子反应，使单功能性或双功能性聚乙二醇分子与低分子量聚乙二醇分子的自由末端结合，形成聚乙二醇-多肽偶联物。
15．如权利要求14所述的方法，其特征在于，单功能性或双功能性聚乙二醇分子具有下列分子式：
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z，其中Y和结合于多肽上的低分子量聚乙二醇分子的自由末端基团反应，而Z是-OCH3或一个与X反应来形成双功能性偶联物的基团。
16．如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述单功能性或双功能性聚乙二醇分子是甲氧基聚乙二醇，分支聚乙二醇，可水解或酶解聚乙二醇，侧基聚乙二醇，或树枝聚物聚乙二醇。
17．如权利要求14所述的方法，其特征在于，W和X分别选自二硫正吡啶、马来酰亚胺、乙烯砜、碘乙酰胺、酰肼、乙醛、琥珀酰酯、环氧化物、胺、硫醇、羧基、活性酯、苯并三唑碳酸、p-硝基苯碳酸、异氰酸盐和生物素。
18．如权利要求14所述的方法，其特征在于，低分子量聚乙二醇分子具有范围在大约100到5,000道尔顿的分子量。
19．如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述单功能性或双功能性聚乙二醇分子具有范围大约100道尔顿到200kDa的分子量。
20．如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述低分子量聚乙二醇分子和/或单功能性或双功能性聚乙二醇分子是聚乙二醇的共聚物。
21．如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的共聚物选自聚乙二醇/聚丙二醇共聚物和聚乙二醇/聚(乳酸/乙醇酸)共聚物。
22．如权利要求14所述的方法，其特征在于，该方法还包括在两个聚乙二醇分子分步连续结合到多肽上后，纯化聚乙二醇-多肽偶联物的步骤。
23．如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤还包括一或多种纯化技术，选自：离子交换层析、分子排阻层析、疏水反应层析、亲和层析和反相层析。
24．如权利要求14-23任一所述的方法，其特征在于，所述多肽是干扰素-β。
25．用权利要求14-23任一所述的方法产生的聚乙二醇-多肽偶联物用作药物的用途。
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