WO2016013697A1 - 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체 - Google Patents

인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체 Download PDF

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WO2016013697A1
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mono
ifn
disease
variant
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신영기
김영덕
송경
나동희
정성훈
김대덕
윤인수
이희정
이세형
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에이비온 주식회사
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta

Definitions

  • the present invention relates to interferon-beta variants to which polystyrene glycol derivatives are bound.
  • Interferons are a type of cytokine that exhibit antiviral activity, inhibit cell proliferation, and spontaneously immunize. Has the function to control the reaction.
  • Dual interferon-beta (hereinafter, IFN- ⁇ ) when removing a sugar chain as a globular protein of 22 kDa with a 5 alpha helix is the 18 kDa (Arduini et al, Protein Science 8: 1867-1877 (1999).) ' .
  • IFN- ⁇ has anti-viral activity, cell growth inhibition or anti-growth activity, lymphocyte cytotoxic activity, immunomodulatory activity, target cell differentiation induction or inhibition activity, macrophage activation activity, cytokine production Immunity, autoimmune and viral infections, HIV-related diseases, hepatitis C and rheumatism, with various immunological activities such as increased activity, increased effects of cytotoxic T cells, increased activity of natural killing cells C (Pilling et al., European Journal of Immunology 29: 1041-1050 (1999), Young et al., Neurology 51: 682-689 (1998), Cirelli et al. Major therapeutic uses of interferons, CI in.I munother. 3: 27-87 (1995)).
  • the peptides in these blood and tissues are known to have very short half-lives in the body, such as several minutes.
  • the bioavailability of protein therapeutics is often limited by short plasma half-lives and susceptibility to protease degradation, making it difficult to achieve maximum clinical efficacy.
  • it is essential to improve stability in the body.
  • the present inventors have performed parallelization of the glycoprotein, human native IFN- ⁇ , inducing bisulfation, substitution of a specific amino acid, and ⁇ -terminal attachment of a polyethylene glycol of a specific length.
  • the present inventors have made intensive studies to develop IFN- ⁇ variants with greatly improved therapeutic effects against various diseases by further improving the immunomodulatory activity, cell proliferation inhibitory activity and anti-viral activity of IFN- ⁇ .
  • IFN—conjugated conjugates of N-terminal specific polyethylene glycolol derivatives to IFN— ⁇ variants that substituted specific amino acids or induced bisulfation were significantly improved compared to native IFN- ⁇ . It has been confirmed that there are viral efficacy, immune regulation function, and anti-proliferation, and it is improved by reducing IFN- ⁇ antigenicity (i ⁇ unogeni ci ty) and increasing the remaining time in the body while maximally reducing the decrease in biological activity.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating hyperproliferative disease, inflammatory disease, autoimmune disease or viral infection.
  • the present invention is mono-pegylated with a polyethylene glycol (PEG) derivative represented by the following Chemical Formula 1, and the 27th Arg residue in the U sequence of the sequence listing is a different amino acid.
  • PEG polyethylene glycol
  • IFN- ⁇ (interferon-beta) variant consisting of a substituted amino acid sequence:
  • R 1 is d— C 4 alkylene, dC 4 alkyleneoxy, Crd alkyleneoxy C ⁇ C 3 alkylene or d-Ci alkyleneamino
  • R 2 is hydrogen, hydrazine, 2,5′dioxo-1-pyridinyloxy or 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyloxy Cr “ C 4 alkylene”
  • n is an integer from 2-4000
  • polypeptide refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of human IFN- ⁇ .
  • IFN- ⁇ protein of the present invention is also interpreted to include an amino acid sequence showing a substantial identity (substantial identity) with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence.
  • the substantial identity is at least 80 when the amino acid sequence of the present invention and any other sequence are aligned to the maximum correspondence, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • the IFN- ⁇ protein used in the present invention is not only a protein having its native amino acid sequence, but also amino acid sequence variants thereof are also included in the scope of the present invention.
  • Variants of IFN- ⁇ protein refer to proteins in which the natural amino acid sequence of the IFN- ⁇ protein and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurode, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / I le, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • the IFN- ⁇ protein may be phosphorylation, sulfation, acrylication, glycosylat ion, methylation, or farnesylat ion. It may be modified.
  • the IFN- ⁇ protein or variant thereof may be extracted from nature or synthesized (Merri field, J. Amer. Chem. Soc .. 85: 2149—2156, 1963) or by recombinant methods based on the VIII sequence. (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001).
  • PEGylation refers to the conjugation of polyethylene glycol (PEG) to the protein of interest, ie IFN- ⁇ .
  • One feature of the present invention is the mono-pegylation of IFN— ⁇ .
  • the term “mono PEGylation” refers to the conjugation of a PEG single molecule at a specific position of IFN— ⁇ .
  • PEG polyethyleneglycol
  • n is an integer from 2 to 4000.
  • PEG molecules suitable for the present invention also include CH 2 CH 2 0 (CH 2 C3 ⁇ 40) nCH 2 CH 2 "and” (0CH 2 C3 ⁇ 4) n0 ".
  • PEG herein refers to various terminal groups and" terminals ". Capping " group. For example, the end capping group is Cr
  • alkylene refers to a bivalent radical derived from a straight or branched saturated hydrocarbon group, and includes, for example, methylene, ethylene, propylene, isopropylene and the like.
  • Cx-C 4 alkylene means a divalent radical having an alkylene unit having 1 to 4 carbon atoms, and when d-Ci alkylene is bonded, the carbon number of the substituent is not included.
  • alkyleneoxy refers to a bivalent radical formed by the removal of hydrogen bonded to oxygen and hydrogen bonded to carbon in an alcohol, and d—C 4 alkyleneoxy includes a carbon number of a substituent when bonded. It is not.
  • alkyleneamino refers to a bivalent entral radical formed by the removal of hydrogen bonded to nitrogen and hydrogen bonded to carbon in alkylamine, respectively, and the carbon number of the substituent includes dc 4 alkyleneoxy. It is not.
  • R 1 in formula 1 of the present invention is ethylene, ethyleneoxy, ethyleneoxymethylene or ethyleneamino;
  • R 2 is hydrogen, hydrazine, 2, 5-dioxo—1—pyridinyloxy or 2, 5-dioxo 1 1-pyridinyloxy ethylene.
  • the polyethylene glycol derivative used in the present invention is selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (2) to (5):
  • n is an integer of 2 to 4000.
  • PEG used for PEGylation in the present invention is not particularly limited in its molecular weight. More specifically, PEG is used to pegylated 2 eu 50 kDa, and more specifically, the more 'specific than 5-50 kDa, has a molecular weight of 10-40 kDa.
  • the IFN- ⁇ variant of the present invention consists of an amino acid sequence in which the 27th Arg residue of SEQ ID NO: 1 is replaced with Thr or Ser residue. More specifically, in the IFN- ⁇ variant of the present invention, the 27th Arg residue of SEQ ID NO: 1 is substituted with a Thr residue.
  • the present invention provides a method for the treatment of hyperproliferative disease, inflammatory disease, autoimmune disease or viral infection disease comprising the mono-pegylated IFN- ⁇ variant of the present invention as an active ingredient. Prophylactic or therapeutic compositions are provided.
  • Human IFN- ⁇ has been used mainly as a treatment for multiple sclerosis, but it is known that it can be used for the treatment of cancer, autoimmune disorders, viral infections, HIV-related diseases and hepatitis C (Pilling et al. European Journal of Immunology 29: pp 1041-1050, 1999), and its pharmacological effects have been reported continuously.
  • composition of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the mono PEGylated polypeptide molecules of the present invention.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the above-described prevention, alleviation or treatment efficacy or activity of arthritis of the present invention.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, dextrose, Sucrose, sorbitol, mantle, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydride Hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but not limited to the pharmaceutical compositions of the present invention, in addition to the above components, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers , May further include a suspending agent and a preservative. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington'
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, specifically parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, joint cavity administration, etc. Can be administered. More specifically, the composition of the present invention is administered intravenously, subcutaneously or intramuscularly. According to the present invention, the composition of the present invention has excellent pharmacokinetic properties during intravenous injection, subcutaneous injection, and intramuscular injection, and in particular, subcutaneous injection has about 13 times more AUC than Rebif®, which is more effective than conventional interferon preparation As the efficiency is greatly improved, it can be seen that the patient convenience is excellent (FIG. 10).
  • hyperproliferative disease encompasses a comprehensive pathologic condition caused by pathological proliferation of cells or excessive neovascularization.
  • hyperproliferative diseases include cancer , Diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, chronic inflammation, atherosclerosis, obesity, macular degeneration and cardiovascular disease. More specifically, the hyperproliferative disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is cancer.
  • the mono PEGylated IFN- ⁇ variants of the present invention significantly inhibit the growth and proliferation of cells (FIG. 9). Therefore, the composition of the present invention can be used as an effective therapeutic composition for various diseases caused by excessive proliferation of cells.
  • the inflammatory disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is chronic obstructive pulmonary disease (chronic obstructive pulmonary disease), septic shock (glomerulonephritis, Crohn's disease (Crohn's) disease), ulcerative colitis, atherosclerosis, diabetes and stroke.
  • chronic obstructive pulmonary disease chronic obstructive pulmonary disease
  • septic shock glomerulonephritis, Crohn's disease (Crohn's) disease
  • ulcerative colitis atherosclerosis
  • diabetes and stroke chronic obstructive pulmonary disease
  • the autoimmune disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, psoriasis, allergic dermatitis, multiple sclerosis and asthma.
  • the mono PEGylated IFN- ⁇ variant of the present invention was found to efficiently regulate immune activity as a result of an I ⁇ une modulation assay through flow cytometry (Fig. 8). It can be used as an effective therapeutic composition for autoimmune diseases.
  • the composition of the present invention was confirmed that the CPE assay (Cytopathic effect assay) has superior anti-viral activity than the native IFN— ⁇ (Fig. 7), for viral infections such as HIV-related diseases and hepatitis C It can also be used as an effective therapeutic composition.
  • Appropriate dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response to response of the patient. Can be.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0001-100 mg / kg per day. '
  • the pharmaceutical composition of the present invention belongs to the present invention. It can be prepared in unit dose form or formulated into a multi-dose container by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. have.
  • the formulations may further comprise dispersants or stabilizers, which may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of mono-pegylated IFN— ⁇ variant and hyperproliferative disease, inflammatory disease, autoimmune disease or viral infection disease comprising the same as an active ingredient. to provide.
  • the mono-pegylated IFN- ⁇ variants of the present invention have superior antiviral efficacy, immunomodulatory function and anti-growth function as compared to the native type IFN- ⁇ , resulting in a variety of dysplastic diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases and viruses. It can be usefully used for infectious diseases.
  • the present invention has an excellent pharmacological activity effect in various administration methods, the blood half-life is significantly increased and the route of administration is greatly expanded and improved than the existing interferon preparations, and thus the patient convenience is very excellent.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a process of synthesizing an mPEG-R27T conjugate by selectively conjugating PEG to the ⁇ -terminal end of the IFN- ⁇ variant (R27T).
  • Figure 2 is a diagram showing the results confirmed by the SDS-PAGE mPEG—R27T conjugates of various sizes produced.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of analyzing the produced mPEG_R27T conjugate by size exclusion chromatogram (s i ze- exc l us i on chroinatogranis) and calculating the production rate of the mono—mPEG ⁇ R27T conjugate.
  • FIG. 4 is a diagram showing the result of analyzing the mPEG-R27T conjugate produced by the separation of mono-mPEG-R27T through microchip electrophoresis analysis.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of the reversed phase high performance liquid chromatogram quantitatively analyzed by the concentration of the produced mPEG-R27T conjugate.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of a reversed phase high performance liquid chromatogram of quantitative analysis of R27T and mPEG-R27T conjugate prepared by size at a concentration of 400 y g / ml.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the anti-viral activity of the prepared mPEG_R27T conjugate.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of analysis of the immunomodulatory function of the prepared mono-mPEG- 20K- R27T conjugate.
  • Figure 9 is a diagram showing the results of the analysis of the cell growth inhibition function of the prepared mono- mPEG-20K-R27T conjugate.
  • 10 is a diagram showing the results of pharmacokinetic analysis of the prepared mono-mPEG- 20K-R27T and mono- mPEG- 40K-R27T conjugates and control drugs administered intravenously to rats.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating the results of pharmacokinetic analysis of the prepared mcmo-mPEG- ⁇ K ⁇ R27T and mono-mPEG- 40K-R27T conjugates and a control drug administered to the rat subcutaneously.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of pharmacokinetic analysis of the prepared mono-iTiPEG-20K ⁇ R27T and mono-mPEG-40K-R27T conjugates and the control drug administered to the mice by intramuscular injection.
  • FIG. 13 is a diagram showing the structure of various PEG derivatives used in the present invention.
  • FIG. 14 shows HPLC profiles of mPEG-20K-SC-R27T conjugates separated and purified by Superdex-200 size exclusion chromatography.
  • FIG. 15A is a diagram showing the HPLC profile of the inono-mPEG-20K-SC-R27T conjugate secondary separated by Zorbax-250 chromatography.
  • FIG. 15B is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis on the mPEG—20K—SC—R27T conjugate separated and purified in FIG. 14.
  • Figure 16a is a diagram showing the HPLC profile of mPEG-20K-Hz-R27T conjugate separated and purified by Superdex—200 size exclusion chromatography.
  • FIG. 16B is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis on the mPEG—20K—Hz—R27T conjugate separated and purified in FIG. 16A.
  • Fig. 7 is a figure showing the HPLC profile of the mono-mPEG-20K-ALD7-R27T (pH 7.0) conjugate.
  • Figure 18a is a diagram showing the results of separation and purification of mPEG-20K—ALD7-R27T conjugate (pH 7.0) using an ion exchange column.
  • FIG. 18B is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis on the mPEG—20K—ALD7-R27T conjugate separated and purified in FIG. 18A.
  • FIG. 19 shows the HPLC profile of the mono—mPEG—20K-ALD6-R27T conjugate (pH 6.0).
  • FIG. 20A is a diagram showing the results of separation and purification of 20K-ALD6—R27T (pH 6.0) using an ion exchange column.
  • FIG. 20B shows mPEGK 20K ⁇ purified separately from FIG. 20A.
  • Figure 21 shows the HPLC profile of the mono—mPEG-30K-ALD4.4-R27n3 (pH 4.4) conjugate.
  • FIG. 22a is a diagram showing the results of separation and purification of H1PEG-30K-ALD4.4—R27T conjugate (pH 4.4) using a silver exchange column.
  • Figure 22b is a diagram showing an SDS-PAGE analysis of the mPEG-30K-ALD4.4-R27T ⁇ conjugate (pH 4.4).
  • FIG. 23 is an illustration showing a mono-mPEG- 30K eu HPLC profile of ALD6 R27T-conjugate (pH 6.0) '.
  • FIG. 24a is a diagram showing the results of separation and purification of mPEG-30K-ALD6-R27T conjugate (pH 6.0) using an ion exchange column.
  • FIG. 24B is purified separately from FIG. 24A. SDS S PAGE analysis of mPEG-30K-ALD6—R27T conjugate (pH 6.0).
  • 25 is a diagram showing an HPLC profile of mPEG-30K-ALD7-R27T conjugate (pH 7.0) in mon
  • Figure 26a shows the mPEG-30K-ALD7-R27T conjugate (pH using an ion exchange column)
  • FIG. 26B is a diagram showing the results of SDS ⁇ PAGE analysis of the mPEG—30K—ALD7—R27T conjugate (pH 7.0) separated and purified in FIG. 26A.
  • Figure 27a is a diagram showing the results of separation and purification of mPEG_20K-Ma 1 -R27T conjugate by Zorbax-250 chromatography.
  • FIG. 27B is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis on the mPEG-20-Ma l-R27T conjugate separated and purified in FIG. 27A.
  • 29 is a diagram showing the results of biological activity analysis of the mono-mPEG-20K-SC-R27T conjugate.
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of biological activity analysis of niono-mPEG-20K ⁇ HZ-R27T conjugate.
  • Fig. 31 shows the results of the biological activity analysis of the R27T conjugate of mono-mPEG-20K-ALD.
  • 32 is a diagram showing the results of biological activity analysis of the mono—mPEG_30K—ALD4.4-R27T conjugate.
  • 33 is a biological representation of the mono-mPEGPE 20K-Ma l -R27T conjugate.
  • the m-PEG-ALDs used were mPEG-10K— ALD, mPEG-20K-ALD, mPEG— 30K- ALD and mPEG-40K— AL! XNOF Corp. with average molecular weights of 10, 20, 30 and 40 kDa, respectively. , Japan), and R27T was expressed in CH0 cell line, and the analyzed protein (Abion Co., Ltd., Korea) was used. The experiment was performed by adding PEG solution so that R27T: PEG) became a molar ratio. After mixing R27T and PEG, sodium cyanoborohydride (Wako, Japan) was added so that the final concentration was 20 mM, the mixture was mixed well for 5 seconds, and then reacted at 4 ° C. for 12 hours.
  • mPEG_R27T was separated by mon using Exclusion Chromatography (SEC) Super Column was used with Superose 6 10/300 GL (GE Heal thcare, USA) and mobile phase was 20 mM phosphate buffer (pH 5.0) was flowed at a flow rate of 0.5 mL / min and the protein eluting at UV 215 nm was detected.
  • SEC Exclusion Chromatography
  • the unmodified R27T is 41 .8 minutes
  • mono- PEG- 10K- R27T is 32.6 minutes
  • mono-mPEG-30K- R27T is 27
  • mono-mPEG—40K-R27T was eluted at 25.5 minutes, respectively, by molecular size.
  • mono-mPEG—40K-R27T was eluted at 25.5 minutes, respectively, by molecular size.
  • mono-mPEG—40K-R27T was eluted at 25.5 minutes, respectively, by molecular size.
  • mono-mPEG—40K-R27T was eluted at 25.5 minutes, respectively, by molecular size.
  • Only fractions corresponding to mono—mPEG ⁇ R27T of each molecular weight were separated and concentrated using Ami con Ul tra-4 (Mi 1 ipore, USA). Based on the SEC results, it was confirmed that mon produced mP
  • Microchip Electrophoresis Analysis of mPEG-R27T The microchip electrophoresis analysis of the prepared mPEG-R27T was performed using a Bioanalyzer 2100 (Agient, USA). 4 is R27T and each molecular weight Microchip electrophoresis of the reacted PEGylated reactant and SEC-separated mono-mPEG-R27T was performed.
  • Mono—RP-HPLC method was developed to quantify the concentration of mPEG-R27T.
  • HPLC was used the Ultimate 3000 HPLC system (Dionex, Germany) and the column was Gemini C18 (4.6 x 250 mm, 5 ⁇ , Phenomenex).
  • the mobile phase was deionized water containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and acetonitrile at a flow rate of 1 mL / min.
  • the mobile phase used a gradient elution method over 20 minutes from 40% to 60% in acetonitrile ratio, with column temperature of 25 ° C., injection volume of 20 ⁇ and detection at UV 215 nm. was carried out.
  • Figure 6 shows the RP- of R27T and mono-mPEG-R27T adjusted to a final concentration of 400 yg / mL.
  • the medium of the 96 well-plate was removed, and EMCV diluted to 1000 TCID 50 / ml was added to OOuL / well, and further incubated for 22 hours on 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium of the plate was removed, 50yL / well of the dye solution (Crystal Vial Solution) was added, incubated at room temperature for about 1 hour, the remaining solution was removed by running water and completely dried. 100 ml of chlorite solution was added, and after culturing for about 1 hour at room temperature, absorbance was measured for 570 nm, and the activity of the test sample was calculated according to a predetermined formula (SoftMax Pro) (FIG. 7).
  • Daudi eel K Cell Bank of Korea, Korea was inoculated with each lxlO 4 cells in a 6-well plate and RPMI1640, 2 mM glutamine, 10% FBS medium, and then each plate (R27T (12103DS01), R27T (12104DS01) ), R27T (12014DS02), Rebif ® and mono—mPEG-201 ( ⁇ PEG) were treated at concentrations of 0.61, 2.44, 9.77, 39.06, 156.25, 625, 2500, 10000 pg / ml for 48 hours at 37 ° C.
  • Mono- PEG-R27T ⁇ Formulation Injectable formulations were prepared for animal experiments on mono—mPEG-R27T synthesized, purified and analyzed in the above examples Phosphate (or acetate) buffer at pH 2.9 of 0.01M. 22.5 mg manny, 0.25 mg plasmamer -188, 0.06 g methionine, 2.5 mg In a solution containing benzyl alcohol, mono-mPEG-R27T having various molecular weights of desired concentration was prepared at a concentration of OOOIU / ml.
  • Figure 10 shows the pharmacokinetic relationship between time and drug efficacy for intravenous infusion.
  • 11 shows the inverse pharmacokinetic relationship between time and drug efficacy for subcutaneous injection.
  • Figure 12 shows the inverse pharmacokinetic relationship between time and drug efficacy for intramuscular injection.
  • the drug efficacy is maintained compared to Rebif ®, and in particular, the subcutaneous injection has an AUC of about 13 times higher than that of Rebif ® , which is sufficient, which is more effective than conventional IFN preparations. Improved, the patient's convenience is excellent.
  • R27T was diafiltered with buffer using an UF membrane (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWCO), and then mPEG-Aldehyde (20K, N0F, Japan) was added to the prepared R27T solution and the final concentration was 20 mM sodium 4 ° C by adding to RBL-IFN ⁇ complex solution to become cyanoborohydride The reaction was carried out for 12-14 hours in the refrigerated state. Detailed reaction conditions are shown in Table 2 below.
  • mPEG-20K-ALD6-R27T conjugate (pH 6.0) analysis As shown in FIG. 19, it was observed that di-mPEG-R27T and mono-mPEG-RBL-R27T were eluted at 7.5 and 8.2 minutes in HPLC using Zorbax-250, the size exclusion column.
  • the prepared mPEG-20K-ALD6—R27T conjugate (pH 6.0) was separated from mono—mPEG-20K-ALD6—R27T (pH 6.0) using an ion exchange column as shown in FIG. 20, and each fragment was separated into an UF membrane (Amicor] Ultra ⁇ . 2, Milipore, 10K MWC0) and concentrated using SDS-PAGE to identify each section.
  • R27T was diafiltered into complete solution using IF membrane (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWC0), and then mPEG-Aldehyde (30K, NOF, Japan) was added to the prepared R27T solution and the final concentration was 20 mM. It was added to the R27T mixture solution to be a fine cyanoborohydride and reacted for 12-14 hours at 4 ° C refrigerated. Detailed reaction conditions are shown in Table 3 below.
  • mPEG-30K-ALD4.4-R27T (pH 4.4) Conjugate Analysis As shown in FIG. 21, di-mPEG-R27T and mono-mPEG-R27T were analyzed in HPLC using Zorbax-250, the size exclusion column. It was observed to elute at 7.5 and 8.2 minutes respectively.
  • the prepared mPEG-30K-ALD4.4-R27T conjugate (pH 4.4) was used to separate mPEG-30K-ALD4.4-R27T (pH 4.4) from mon using an ion exchange column, and each fragment was separated into an UF membrane (Amicon® Ultra). -2, Milipore, 10 MWCO) and each section was confirmed by SDS-PAGE (Fig. 22).
  • A549 cells were counted with a hemocytometer and suspended at 3 10 5 cells / concentration with 10% FBS / MEM.
  • Brain myocarditis virus (Encephaloinyocarditis virus: EMCV, PANGEN) was diluted to a concentration of 1000TCID50 / ml, and then added to each 100, followed by incubation for 22 hours in an incubator. After removing the 96-well plate myocarditis virus (EMCV, PANGEN) medium solution, add 0.05% crystal violet stain solution at 50 ⁇ per well and measure the OD for each well at wavelength 570 tin of the microplate reader (FIG. 27). ) To calculate the activity of the standard IFN ⁇ , R27T, and mono-mPEG-R27T conjugate prepared in 1) to 4) of the above (Table 4).

Abstract

본 발명은 모노-페길화(mono-PEgylated)된 IFN-β(interferon-beta) 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환 (hyperproliferative disease), 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 모노-페길화된 IFN-β 변이체는 천연형의 IFN-β에 비하여 뛰어난 항바이러스 효능, 면역 조절기능 및 항 성장기능을 가져 다양한 이상증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 바이러스 감염 질환에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명은 다양한 투여방법에서 뛰어난 약리활성 효과를 가져 기존 인터페론 제제보다 혈중 반감기가 유의하게 증가하고 투여경로가 크게 확대, 개선되어 환자 편이성이 매우 우수하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
인터페론 -베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체 【기술 분야】
본 발명은 폴리에렌 글리콜 유도체가 결합된 인터페론 -베타 변이체에 관한 것이다. -
【배경 기술】
인터페론 (IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항 바이러스 활성을 나타내고， 세포 증식을 억제하며， 자연 면역. 반웅을 조절하는 기능을 갖는다. 이중 인터페론—베타 (이하， IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지는 22 kDa의 구형 단백질로서 당쇄를 제거하면 18 kDa이 된다 (Arduini et al. , Protein Science 8: 1867-1877(1999))'.
IFN— β의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고 , 특히 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화， 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있다 (Goodkin et al., Multiple sclerosis: Treatment opt ions for patients with relapsing—remitting and secondary progressive multiple sclerosis, 1999). 다발성 경화증 이외에도 IFN-β는 항-바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항 -성장 활성， 림프구 세포독성 증대 활성， 면역 조절 활성, 표적세포의 분화 유도 또는 억제 활성， 대식세포의 활성화 활성 , 사이토카인 생성의 증가 활성， 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포 (natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 임-, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염， HIV와 관련된 질병， C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다고 보고쾨 c (Pilling et al., European Journal of Immunology 29： 1041- 1050 (1999), Young et al. , Neurology 51: 682-689 (1998), Cirelli et al .， Major therapeutic uses of interferons , CI in. I munother . 3： 27- 87(1995)).
그러나 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 펩타이드의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며， IFN— β와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 플라즈마 반감기 및 프로테아제 열화에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 이루기가 어렵다ᅳ 따라서， IFN— β의 의학적 용도를 더욱 효과적으로 개발하기 위해서는 알려진 면역조절， 항바이러스 효과 및 항 -성장 /증식 효과를 더욱 향상시키는 것 외에도 체내에서의 안정성이 개선되는 것이 필수적이다. 이에， 본 발명자들은 종래기술의 이러한 문제점을 해결하기 위하여 당단백질인 인간 천연형 IFN- β에 초당화 유도, 특정 아미노산의 치환 및 특정 길이의 폴리에틸렌 글리콜의 Ν—말단 부착을 병행하였으며， 최적의 IFN- β변이체 및 PEG 간의 조합을 통해 천연형의 IFN- β에서는 예상할 수 없었던 뛰어난 항바이러스 효능， 면역 조절기능, 항 성장기능 및 우수한 약리활성효과를 이루고자 하였다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 IFN- β의 면역조절 활성， 세포증식 억제활성 및 항- 바이러스 활성 등을 더욱 향상시킴으로써 다양한 질병에 대한 치료효과가 크게 개선된 IFN- β 변이체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 특정 아미노산을 치환하거나 초당화를 유도한 IFN— β 변이체들에 Ν- 말단 특이적 폴리에틸렌 글리콜올 유도체를 결합시킨 배합체 (conj ugate)가 천연형의 IFN- β에 비해 월등히 향상된 항―바이러스 효능， 면역 조절기능 및 항 -증식 등이 있음을ᅳ 확인하였으며， 아울러 IFN- β의 항원유발성 ( i隱 unogeni ci ty)을 감소시키고 생리활성 저하를 최대한 감소시키면서 체내 잔존 시간을 증가시켜 향상된 약동학 프로필 (pharmacoki net i c prof He)과 약리적 성질을 가지게 됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다ᅳ 따라서 본 발명의 목적은 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 유도체로 모노- 페길화(1110110시 0 1 601)된 IFN-β변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 과대증식성 질환 (hyperproliferative disease), 염증성 질환， 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 유도체로 모노—페길화 (mono— PEGylated)되고， 서열목록 거 U서열의 27번째 Arg 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 IFN-β (interferon-beta) 변이체를 제공한다: 화학식 1
Figure imgf000005_0001
상기 화학식에서， R1은 d— C4 알킬렌, d-C4 알킬렌옥시， Crd 알킬렌옥시 C厂 C3 알킬렌 또는 d-Ci 알킬렌아미노이고; R2는 수소， 하이드라진， 2, 5ᅳ디옥소 -1-피를리디닐옥시 또는 2, 5-디옥소 -1- 피롤리디닐옥시 Cr" C4 알킬렌이며; n은 2-4000의 정수이다. 본 발명자들은 IFN-β의 면역조절 활성， 세포증식 억제활성 및 항一 바이러스 활성 등을 더욱 향상시킴으로써 다양한 질병에 대한 치료효과가 크게 개선된 IFN-β 변이체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 특정 아미노산을 치환하거나 초당화를 유도한 IFN-β 변이체의 폴리펩타이드에 N-말단 특이적 폴리에틸렌 글리콜을 유도체를 결합시킨 배합체가 천연형의 IFN-β에 비해 월등히 향상된 항―바이러스 효능， 면역 조절기능 및 항 -증식 등이 있음을 확인하였으며， 아울러 IFN-β의 항원유발성을 감소시키고 생리활성 저하를 최대한 감소시킬 뿐만 아니라 체내 잔존 시간을 증가시켜 향상된 약동학 프로필과 약리적 성질을 가지게 됨을 발견하였다. 본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다ᅳ 본 발명에 따르면 , 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열은 인간의 IFN-β의 아미노산 서열이다ᅳ
본 발명의 IFN-β 단백질은 서열목록 게 1서열의 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 80 >의 상동성， 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성， 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다 .
또한， 본 발명에서 이용되는 IFN-β 단백질은 이의 천연형 아미노산- 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. IFN-β 단백질의 변이체란 IFN-β 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입， 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979) . 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val , Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/I le, Leu/Val , Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 IFN-β 단백질은 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation)， 아크릴화 (acrylat ion)， 당화 (glycosylat ion), 메틸화 (methylation) 또는 파네실화 (farnesylat ion) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.
상기 IFN-β 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merri field, J. Amer . chem. Soc.. 85:2149—2156， 1963) 또는 纖 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001).
본 명세서에서 용어 "페길화 (PEGylation)" 는 목적의 단백질， 즉 IFN-β에 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 컨쥬게이션시키는 것을 의미한다.
본 발명의 특징 중 하나는 IFN— β의 모노-페길화이다. 용어 "모노一 페길화" 는 IFN— β의 특정 위치에 PEG 단일 분자를 컨쥬게이션 시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "폴리에틸렌글리콜 (PEG)"는 수용성 폴리 (에틸렌 옥사이드)를 의미한다. 전형적으로， 본 발명에 적합한 PEG는 다음의 구조식으로 표현된다: (0C¾C¾)n(n은 2 내지 4000의 정수). 또한， 본 발명에 적합한 PEG 분자는 CH2CH20(CH2C¾0)nCH2CH2" 및 "(0CH2C¾)n0" 를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 PEG는 다양한 말단기 및 "말단 캡핑" 그룹을 갖는 구조를 포함한다. 예를 들어 , 상기 말단 캡핑 그룹은 Cr
C20 알콕시기 (예컨대， 메특시)를 포함한다.
구체적으로는， 단백질의 특성을 가장 안정하게 유지하면서 N—말단 특이적 부착을 유도하기 위하여 단백질의 N-말단에 선택적으로 반웅하는 것으로 알려진 다양한 크기의 모노메톡시 PEGᅳ알데하이드 (이하， mono-mPEG- ALD)를 반웅물로 하여 N—말단에 모노 페길화된 IFN-β를 수득할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "알킬렌" 은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기로부터 유래한 이가 (bivalent) 라디칼을 의미하며, 예를 들어 메틸렌， 에틸렌， 프로필렌， 이소프로필렌 등을 포함한다. Cx-C4 알킬렌은 탄소수 1 내지 4의 알킬렌 유니트를 가지는 이가 라디칼을 의미하며 , d-Ci 알킬렌이 결합된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 용어 "알킬렌옥시" 는 알코올에서 산소에 결합한 수소 및 탄소에 결합한 수소가 각각 제거되어 형성된 이가 (bivalent) 라디칼을 의미하며， d— C4 알킬렌옥시가 결합한 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 명세서에서 용어 "알킬렌아미노" 는 알킬아민에서 질소에 결합한 수소 및 탄소에 결합한 수소가 각각 제거되어 형성된 이가 (bival ent ) 라디칼을 의미하며, d-C4 알킬렌옥시가 결합한 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1의 R1은 에틸렌, 에틸렌옥시， 에틸렌옥시메틸렌 또는 에틸렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라진, 2 , 5-디옥소—1—피를리디닐옥시 또는 2 , 5-디옥소一 1- 피를리디닐옥시 에틸렌이다. 보다 구체적으로는， 본 발명에서 이용되는 폴리에틸렌글리콜 유도체는 하기의 화학식 2 내지 5로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다:
Figure imgf000008_0001
화학식 3
C¾0(CH H ,0)ttCHX H,OC¾CXHXH,
화학식 4
O II
CH¾0(C¾CH 0¼CH^CH.CH 화학식 5
Figure imgf000009_0001
상기 화학식 2 내지 5에서， n은 2— 4000의 정수이다 본 발명에서 페길화에 이용되는 PEG는 그 분자량에 특별한 제한은 없다. 구체적으로는, 페길화에 이용되는 PEG는 2ᅳ 50 kDa, 보다 구체적으로는 5—50 kDa, 보다 더' 구체적으로는 10-40 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 IFN-β 변이체는 서열목록 게 1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 또는 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열로 이루어진다. 보다 구체적으로는， 본 발명의 IFN-β 변이체는 서열목록 제 1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 잔기로 치환된다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 모노—페길화된 IFN-β 변이체를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환 (hyper proliferative disease), 염증성 질환， 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 인간 IFN-β는 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 왔지만， 암， 자가 면역 장애, 바이러스 감염 HIV와 관련된 질병 및 C형 간염 등의 치료에도 이용될 수 있음이 알려져 있으며 (Pilling 등 European Journal of Immunology 29： pp 1041-1050， 1999), 그 약리 효과는 계속하여 보고되어지고 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 모노 페길화된 폴리펩타이드 분자의 약제학적 유효량이 포함된 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 본 발명의 관절염 예방， 경감 또는 치료 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 덱스트로스, 수크로스， 솔비를, 만니틀， 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀롤로스， 물, 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다ᅳ 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제， 현탁제ᅳ 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구， 구체적으로는 비경구로 투여할 수 있고， 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 국소 투여， 경피 투여， 관절강 투여 등으로 투여할 수 있다. 보다 구체적으로는， 본 발명의 조성물은 정맥주사， 피하주사 또는 근육주사로 투여된다. 본 발명에 따르면， 본 발명의 조성물은 정맥주사， 피하주사 및 근육주사 시에 우수한 약동학적 특성을 가지며， 특히 피하주사의 경우 Rebif®에 비해 약 13배의 AUC를 가지고 있어 기존의 인터페론 제제보다 투여효율이 크게 개선됨으로써 환자 편이성이 월등히 우수함을 알 수 있다 (도 10).
본 명세서에서 용어 "과대증식성 질환 (hyperproliferative disease)" 은 세포의 병적인 증식 또는 과도한 혈관의 신생에 의해 유발되는 종합적인 병적상태 (pathologic condition)를 망라한다ᅳ 과대증식성 질환의 구체적인 예는 암， 당뇨성 망막증, 류마티스 관절염， 건선， 만성염증, 죽상경화증, 비만, 황반변성 및 심혈관 질환을 포함한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 과대증식성 질환은 암이다.
후술하는 실시예에서 보는 바와 같이， 본 발명의 모노 페길화된 IFN- β 변이체는 세포의 성장 및 증식을 유의하게 억제한다 (도 9). 따라서, 본 발명의 조성물은 세포의 과도한 증식으로 유발되는 다양한 질환에 대한 효율적인 치료제 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 폐혈성 쇼크 (septic shock) , 사구체 신염， 크론병 (Crohn's disease), 궤양잘록창자염 (ulcerative colitis), 아테롬성 동맥경화증， 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 자가면역 질환은 류마티스 관절염， 건선， 알러지성 피부염， 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면， 본 발명의 모노 페길화된 IFN-β 변이체는 유세포 분석을 통한 면역조절 분석 (I隱 une modulation assay) 결과 효율적으로 면역활성을 조절함이 확인되어 (도 8) 다양한 염증성 질환 또는 자가면역 질환에 대한 효율적인 치료제 조성물로 이용될 수 있다. 아울러， 본 발명의 조성물은 CPE 분석 (Cytopathic effect assay) 결과 천연형의 IFN— β보다 우수한 항―바이러스 활성을 가짐이 확인되어 (도 7)， HIV 관련질환 및 C형 간염 등 바이러스 감염질환에 대한 효율적인 치료제 조성물로도 이용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식， 환자의 연령， 체중, 성， 병적 상태, 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 으 0001-100 mg/kg이다. '
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는. 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으몌 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 모노 페길화된 IFN— β 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환 (hyperproliferative disease), 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
( b) 본 발명의 모노 페길화된 IFN- β 변이체는 천연형의 IFN— β에 비하여 뛰어난 항바이러스 효능， 면역 조절기능 및 항 성장기능을 가져 다양한 이상증식성 질환， 염증성 질환， 자가면역 질환 및 바이러스 감염 질환에 유용하게 이용될 수 있다.
( C ) 본 발명은 다양한 투여방법에서 뛰어난 약리활성 효과를 가져 기존 인터페론 제제보다 혈중 반감기가 유의하게 증가하고 투여경로가 크게 확대， 개선되어 환자 편이성이 매우 우수하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 IFN- β 변이체 (R27T)의 Ν—말단에 선별적으로 PEG를 접합하여 mPEG-R27T 접합체를 합성하는 공정의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 제작된 다양한 크기의 mPEG— R27T 접합체를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 제작된 mPEG_R27T 접합체를 크기별 배제 크로마토그램 ( s i ze- exc l us i on chroinatogranis )으로 분석하여 크기별로 분석하고 mono—mPEGᅳ R27T 접합체의 생성율을 계산한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 제작된 mPEG-R27T 접합체를 mono-mPEG-R27T로 분리한 뒤 마이크로칩 전기영동분석을 통하 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 제작된 mPEG-R27T 접합체를 농도별로 정량 분석한 역상 고성능 액체크로마토그램의 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 R27T과 크기별로 제작된 mPEG-R27T 접합체를 400 y g/m l 농도로 정량 분석한 역상 고성능 액체크로마토그램의 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 제작된 mPEG_R27T 접합체의 항-바이러스 활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 제작된 mono-mPEG— 20K— R27T 접합체의 면역조절기능에 대해 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 제작된 mono— mPEG-20K-R27T 접합체의 세포 성장 억제기능에 대해 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 도 10은 제작된 mono-mPEG— 20K-R27T 및 mono— mPEG— 40K-R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 정맥주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 그림이다ᅳ
도 11은 제작된 mcmo-mPEG-^Kᅳ R27T 및 mono—mPEG— 40K— R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 피하주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 제작된 mono-iTiPEG-20Kᅳ R27T 및 mono-mPEG— 40K— R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 근육주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 13은 본 발명에서 이용되는 다양한 PEG 유도체들의 구조를 나타낸 그림이다.
도 14는 Superdex-200 크기배제 크로마토그래피로 분리 정제된 mPEG- 20K-SC-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다.
도 15a는 Zorbax-250 크로마토그래피로 2차 분리된 inono-mPEG-20K- SC-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다. 도 15b는 도 14에서 분리 정제된 mPEG— 20K— SC— R27T 접합체에 대한 SDS— PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 16a는 Superdex— 200 크기배제 크로마토그래피로 분리 정제된 mPEG-20K-Hz-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다. 도 16b는 도 16a에서 분리 정제된 mPEG— 20K— Hz— R27T 접합체에 대한 SDS— PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 Γ7은 mono-mPEG-20K-ALD7-R27T ( pH 7.0) 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다.
도 18a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-20K— ALD7-R27T 접합체 (pH 7 .0)의 분리 정제 결과를 나타낸 그림이다. 도 18b는 도 18a에서 분리 정제된 mPEG— 20K— ALD7-R27T 접합체에 대한 SDS— PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 19는 mono— mPEG— 20K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다.
. 도 20a는 이온교환칼럼을 이용한 20K-ALD6— R27T (pH 6.0 )의 분리 정제 결과를 나타낸 그림이다. 도 20b는 도 20a에서 분리 정제된 mPEGᅳ 20K- ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)에 대한 SDSᅳ PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다. 도 21은 mono—mPEG-30K-ALD4.4-R27n3 (pH 4.4)접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다.
도 22a는 이은교환칼럼을 이용한 H1PEG-30K-ALD4.4— R27T 접합체 (pH 4.4)의 분리 정제 결과를 나타낸 그림이다. 도 22b는 mPEG-30K-ALD4.4-R27T ■접합체 (pH 4.4)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 23은 mono-mPEG— 30Kᅳ ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)의 HPLC 프로파일을 ' 나타낸 그림이다.
도 24a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG— 30K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)의 분리 정제 결과를 나타낸 그림이다. 도 24b는 도 24a에서 분리 정제된 . mPEG-30K-ALD6— R27T 접합체 (pH 6.0 )에 대한 SDSᅳ PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 25는 mon으 mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체 (pH 7.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸 그림이다
도 26a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체 (pH
7.0 )의 분리 정제 결과를 나타낸 그림이다. 도 26b는 도 26a에서 분리 정제된 mPEG— 30K— ALD7— R27T 접합체 (pH 7.0)에 대한 SDSᅳ PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 27a는 Zorbax-250 크로마토그래피로 mPEG_20K-Ma 1 -R27T 접합체의 분리 정제 결과를 나타낸 그림이다. 도 27b는 도 27a에서 분리 정제된 mPEG-20 -Ma l -R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 그림이다
도 28은 표준 IFN β 및 R27T의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 29는 mono-mPEG-20K-SC-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 30은 niono-mPEG-20Kᅳ HZ-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 31은 mono-mPEG-20K-ALD그 R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 32는 mono— mPEG_30K— ALD4.4-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸 그림이다. 도 33은 mono-mPEGᅳ 20K-Ma l -R27T 접합체의 생물학적 나타낸 그림이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 '따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 인간 IFN-β변이체 (R27T)의 Nᅳ말단 특이적 페길화 인간 IFN- β 변이체 (R27T)의 N-말단에 선택적으로 PEG를 결합시키기 위해 약산성 조건에서 모노메특시 PEG—알데하이드 (monomethoxy PEG- a l dehyde , ιη-PEG— ALD)를 이용하여 부착실험을 실시하였으며， 도 1에 개략적인 합성과정을 나타내었다. 사용한 m-PEG-ALD는 평균분자량이 각각 10 , 20， 30 및 40 kDa에 해당하는 mPEG-10K— ALD , mPEG-20K-ALD , mPEG— 30K- ALD 및 mPEG-40K— AL!XNOF Corp . , Japan)를 사용하였으며 , R27T는 CH0 세포주에서 발현하여 분석완료한 단백질 (에이비온 (주) , 한국)을 사용하였으며, 0 .864 iTig/mL의 농도로 측정한 R27T 1 mL에 1 : 2 (R27T : PEG)이 몰비가 되도록 PEG 용액을 가하여 실험을 하였다. R27T와 PEG를 흔합 후 최종농도가 20 mM이 되도록 소듐 시아노보로하이드라이드 (와코， 일본)를 가하고， 5초 간 잘 섞어준 다음, 4 °C에서 12시간 동안 반웅시켰다.
R27T의 N-말단 특이적 페길화 확인
R27T의 N-말단 페길화를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 도 2와 같이 레인 2는 R27T이고, 레인 3은 대조약물인 천연형 IFN- β， 레인 4- 7이 R27T와 각 크기별 mPEG-ALD 간의 반웅물들이다. 네 반웅물 모두 mono- mPEG-R27T가 생성되었음을 확인할 수 있었다.
Mono-mPEG-R27T 분리 페길화 반응 후, mon으 mPEG_R27T를 크기배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 분리하였다ᅳ 컬럼은 Superose 6 10/300 GL (GE Heal thcare , 미국)를 사용하였고, 이동상은 20 mM 포스페이트 완충액 (pH 5.0)을 0.5 mL/mi n의 유속으로 흘렸으며， UV 215 nm에서 용출되는 단백질을 검출하였다. 도 3에서 보는 바와 같이， 비변형 R27T은 41 .8분에， mono— PEG— 10K— R27T는 32.6분， mon()-PEGᅳ 20K—R27T는 29.4분， mono-mPEG-30K— R27T는 27. 1분, mono- mPEG— 40K-R27T는 25.5분에 각각 분자 크기별로 용출되는 것을 관찰할 수 있었다. 추가 분석을 위하여 각 분자량의 mono— mPEGᅳ R27T에 해당되는 분획만을 분리하여 Ami con Ul tra-4(Mi 1 ipore , 미국)를 이용하여 농축하였다. SEC 결과를 토대로 각 페길화 반응에서 생성되는 mon으 mPEG-R27T는 66- 75%에 해당함을 확인하였다 (표 1) .
【표 II
RP一 HPLC로 측정한 IFN— R27T)와 inono-PEG— IFN— β (mPEG— R27T)의 농도
Figure imgf000016_0001
mPEG- R27T의 마이크로칩 전기영동 분석 제조한 mPEG— R27T를 Bi oanalyzer 2100(Agi l ent , 미국)을 이용하여 마이크로칩 전기영동 분석을 시도하였다. 도 4는 R27T와 각 분자량별로 반웅시킨 페길화 반응물 및 SEC로 분리한 mono-mPEG-R27T을 마이크로칩 전기영동으로 분석한 결과이다. 각각의 레인별로 (A) R27T와 mPEG— 10K- ALD의 반웅물， (B) SEC로 정제한 mono— mPEGᅳ 10K-R27T, (C) R27T와 mPEG一 20K— ALD의 반응물， (D) SEC로 정제한 mPEG-20K— R27T， (E) R27T와 mPEG-30K— ALD의 반응물, (F) SEC로 정제한 mono-mPEG-30Kᅳ R27T, (G) R27T와 mPEG- 40K-ALD의 반응물, (H) SEC로 정제한 mono-mPEG-40K— R27의 그림이다. 또한 LM은 저분자량에 대한 분자량 마커이며, S는 시스템의 피크， 그리고 HM은 고분자량의 마커이다. 실험결과로 미루어 mono-mPEG-R27T는 정제가 원활히 진행된 것을 알 수 있었다.
Mono-mPEG—R27T의 정량 분석
Mono— mPEG-R27T의 농도를 정량하기 위해 RP-HPLC 방법을 개발하였다. HPLC는 Ultimate 3000 HPLC system(Dionex, Germany)을 사용하였고， 컬럼은 Gemini C18 (4.6 x 250 mm, 5 μιτι, Phenomenex)을 사용하였다. 이동상은 0.1% TFA (trifluoroacetic acid)가 함유된 탈이온수 (deionized water)와 아세토니트릴을 유속 1 mL/min로 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴 비율로 40%에서 60%로 20분에 걸친 기울기 용리법 (gradient elution method)을 사용하였고， 이때 컬럼 온도는 25°C로 하고， 주입 부피는 20 μί, 검출은 UV 215 nm에서 실시하였다. 표준시료로서 변형되지 않은 IFN-β를 순차적으로 희석하여 농도별로 215 nm에서 피크 면적을 기준으로 작성된 검량선을 토대로 mono-mPEG-R27T의 농도를 결정했다. 도 5는 R27T의 농도별로 측정된 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. (retention time: 8.4 min, regression of standard curve (R2=0.9998)
도 6은 최종농도 400 yg/mL로 조정된 R27T와 mono-mPEG-R27T의 RP-
HPLC 크로마토그램이다. 항바이러스 실험을 -§-tt mono-mPEG-R27T^ 활성도 측정 합성한 mono— mPEG-R27T의 활성을 측정하기 위해 바이러스의 감염을 억제하는 능력을 조사함으로서 IFN-β의 효능을 간접적으로 측정하는 CPE 어세이를 수행하였다. 분석에 사용된 시료는 인간 R27T의 각기 다른 세 번의 생산 배치 (batch)와 구매한 Rebif® (머크， 미국)， 그리고 상기 실시예에서 합성 및 정제한 각 분자량별 mono-mPEG-R27T를 사용하였다.
준비된 시료들을 (R27T(12103DS01), R27T( 12104DS01) , R27T (12014DS02), Rebif®, ιτιοηο-mPEG— 10K-R27T, mono-mPEG-20K-PEG , mono-mPEG- 30K- 27T 및 mono— mPEGᅳ 40— R27T)를 5번 반복으로 96-웰 플레이트에 분주하고， 미리 배양하여 준비한 A549 세포주를 3.0xl05 cells/mL 농도로 첨가하고 , 37 °C , 5% C02 상에서 약 1일간 배양하였다. 22시간 후 96 웰- 플레이트의 배지를 제거하고， 1000TCID 50/ml로 희석한 EMCV를 lOOuL/well을 첨가하고, 37°C， 5% C02 상에서 추가적으로 22시간 배양하였다. 22시간 후 플레이트의 배지를 제거하고 염색 용액 (크리스탈 바이을렛 용액)을 50yL/well 첨가한 뒤 상온에서 약 1시간 가량 배양하고, 흐르는 물에 잔여 용액을 제거하여 완전히 건조시킨 후 탈색 용액으로 1¾ 하이포아염소산염 용액을 lOOyL/well 첨가하고 상온에서 약 1시간 가량 배양 후 570nm 흡광도를 측정하여 정해진 계산식 (SoftMax Pro)에 의하여 시험시료의 활성을 계산하였다 (도 7). 면역조절가능의 분석을 mono-mPEG'R27T^ 활성도 측정 상기 실시예에서 합성， 정체하고 분석한 mono— mPEG_R27T의 활성을 측정하기 위해 면역조절 분석 (I醒 une modulation assay)을 수행하였다. 이 분석은 유세포 분석기법을 기반으로 면역의 활성을 억제하는 능력을 측정함으로서 IFN— β의 효능을 측정하는 간접적인 방법이다. 분석에 사용된 시료는 R27T의 각기 다른 세 번의 생산 배치와 구매한 Rebif®, 그리고 상기 실시예에서 합성 및 정제한 mono— mPEG-20K-R27T를 사용하였다.
' 100mm 배양접시에 각 시료들 (R27T(12103DS01), R27T(12104DS01) , R27T(12014DS02), Rebif® 및 mono-niPEG-20i(-PEG)을 1 pg/ml， lOpg/ml , lOOpg/ml , lng/ml , 10 ng/ml , lOOng/ml , lug/ml의 농도로 처리한 배지에 세포주 (A549)를 9.0xl05 cells/dish 씩 접종하여 48시간 배양하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 트립신 용액 0.5-1.0ml으로 처리하여 세포를 떨어뜨린 뒤, 4°C, 5min, 1500rpm으로 원심분리하여 세포를 회수하였다ᅳ 회수한 세포를 FACS 완충액 (A)으로 세척 후 lxlO6 세포 /ΙΟΟμΙ의 농도로 분주하였다. 1차 항체 lyg/5xl04 세포와 이소타입 대조군 Ιμ ΐ/Total를 e-tube (항체)에 더하고， 수회 교반 후 4°C에서， 30분간 보관하였다. 30분뒤 1ml FACS 완층액 (B)으로 3회 세척하고 세포를 모았다. 100:1로 희석한 2차 항체 (lOOul)를 가한 뒤 수회 교반 후 41：에서 추가적으로 30분간 배양을 하였다. 30분 뒤 다시 한번 1ml의 FACS 완충액 (B)으로 세척을 하고 수회 교반하여 세포를 흔합하여 시료를 준비한 후 FACS 분석하였다ᅳ 면역조절에 대한 효능의 유지 결과는 도 8에 기재하였다. 항성장효과의 분석을 mono-mPEG-R27T^ 활성도 측정 상기 실시예에서 합성， 정제하고 분석한 mono— mPEG-R27T의 활성을 측정하기 위해 세포독성을 측정하는 MTT Assay(Ez-Cytox, WST assay)를 수행하였다. Daudi eel K한국세포주은행 , 한국)을 6—웰 플레이트에 각 lxlO4 세포씩 접종하고 RPMI1640, 2mM 글루타민， 10% FBS 배지를 투여한 뒤에 각각의 플레이트에 시료들 (R27T(12103DS01), R27T( 12104DS01) , R27T(12014DS02), Rebif® 및 mono— mPEG-201 (ᅳ PEG)을 0.61, 2.44， 9.77, 39.06, 156.25, 625， 2500, 10000 pg/ml의 농도로 처리 후 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 ΙΟμ Ι의 WST (EZ-cytox)/웰 시약을 첨가하여 다시 37 X에서 3시간 동안 배양 후에 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 성장억제능력에 대한 결과는 도 9에 표시하였다. mono- PEG-R27T^ 제형 상기 실시예에서 합성， 정제하고 분석한 mono— mPEG-R27T에 대한 동물실험을 위해 주사용 제형을 제작하였다. 0.01M의 pH 2.9의 포스페이트 (또는 아세테이트) 완충액)에 22.5mg의 만니를, 0.25mg의 플락사머 -188， 0.06g의 메치오닌， 2.5mg의 벤질알콜을 포함한 용액에 원하는 농도의 다양한 분자량의 mono-mPEG-R27T를 OOOIU/ml의 농도로 제작하였다. mono-mPEG-R27T의 흰쥐에서의 약동학적 실험 마우스를 일주일간 안정기를 거친 뒤 실험 전 대퇴부에 카테카를 설치하였다. Rebif®의 구매제형과 상기 실시예 1 에서 제조한 다양한 분자량의 inon으 mPEG-R27T를 2,000,000 IU/Kg의 투여량으로 동맥주사, '피하주사 및 근육주사하였다. 투여 후 0분， 15분， 30분, 45분， 60분， 120분 180분, 240분, 360분, 480분， 720분 및 1440 분에 각 흰쥐의 대퇴 동맥에서 채혈한 뒤 즉시 혈장을 분리하였다 ·. 혈장 중 IFN-β의 농도를 상술한 방법으로 CPE 분석을 실시하여, 시간 /농도 프로파일의 약동학적 분석을 시도하였다. 도 10은 정맥주사에 대한 시간과 약효사이의 약물 약동학적인 연관관계를 나타낸다. 도 11은 피하주사에 대한 시간과 약효사이의 역물 약동학적인 연관관계를 나타낸다. 도 12는 근육주사에 대한 시간과 약효사이의 역물 약동학적인 연관관계를 나타낸다. 3가지 투여 방법을 비교할 때 Rebif®와 비교하여 약효가 유지되고 있으며, 특히 피하주사의 경우 Rebif®에 비해 약 13배의 AUC를 가지고 있어 약효가 충분하여， 이는 기존의 IFN 제제보다 투여방법이 크게 개선되어 환자 편이성이 월등히 우수함을 말해준다. mono-mPEG-20KSC-R27T 접합체의 제조
1 nig의 R27T (0.00005讓 oles)을 UF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWC0)을 사용하여 pH 7.0의 50mM 인산나트륨 완충용액으로 투석여과하여 1 mg/mi의 최종농도를 만든 후 2.1 mg의 PEG-SC (20 , 2 moral excess, 0.00이隱 oles, IDB)를 준비된 R27T 용액에 첨가하여 25°C 에서 1시간 동안 교반하였다.
반응이 종료된 후 SDS-PAGE (4-12% Gradient, Invitrogen, USA)) 와 크기배제 컬럼 (super dex-200, PBS buffer, 0.6 ml/min 유속， 220nm, GE healthcare, USA)을 부착시킨 HPLC로 페길화 반웅 정도를 분석하였다. 도 14에서 보는 바와 같이 tri—및 higher PEG-R27T는 13.8 분， di— PEG-R27T는 16.3 분， mono-PEG— R27T 는 18.8 분， 그리고 반응하지 않은 R27T가 26.9 분에 각각 용출되었으며 각 절편을 UF 막 (Amicon® Ultra— 2， Milipore, 10 MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다. 도 14에서 분리 정제된 mono-PEG-R27T 절편을 도 15과 같이 2차로 Zorbax GF-250(PBS buffer, lml/min 유속， 220删， Agilent, USA) 컬럼으로 재분리하였다. mono~mPEG'20K-Hz-R27T접합체의 제조
1 mg의 R27T(0.00005 画 oles)을 UF 막 (Ainicon® Ultra— 2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 50 πιΜ MES 완층액 (pH 4.0)으로 투석여과하여 농도를 5 mg/ml로 유지시켰다. 여기에 mPEG ( 20K ) -0-CH2CH2C0-Hz 10 mg( 0.0005 mmole 10배)을 가하였다. 2 mg의 EDAC를 50 mM MES 완충액 (pH 4.0) 에 용해시킨 후 (0.005 醒 ol , 100배)를 가한 후 실온에서 1시간 동안 교반 하에 반응을 진행시켰다.
반웅이 종료된 후 SDS-PAGE (4-12% Gradient , Invitrogen, USA)) 와 크기배제컬럼 (superdex— 200, PBS buffer, 0.6 ml/min유속, 220誦， GE healthcare, USA)을 부착시킨 HPLC로 페길화 반응 정도를 분석하였으며 각각 절편을 받았다. 도 16과 같이 tri-및 higher PEG-R27T(F1)는 13.8 분, £(—12^^2)는 16.3 분， mono— PEG-R27KF3)는 18.8 분， 그리고 반응하지 않은 R27T(F4)가 26.9 분에 각각 용출 되었으며 각 절편을 UF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS- PAGE로 각 절편을 확인하였다. 참고로 30분 이후 용출되는 절편은 과량으로 첨가한 시약이라고 추측할 수 있다. iJiono-mPEG—ALD—R27T접합체의 제조
1) mono-mPEG-20K-ALD- 27T 접합체의 제조
R27T 를 UF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 완충액으로 투석여과 한 후 mPEG-Aldehyde (20K, N0F, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 최종농도가 20mM 소듐 시아노보로하이드라이드가 되도록 RBL-IFN β 흔합물 용액에 첨가하여 4°C 냉장상태에서 12-14시간 반응시켰다. 자세한 반응 조건은 하기의 표 2와 같다. 반웅이 종료된 후 50mM 소듐 아세테이트 pH -4.4 완충액으로 lmg/ml이 되게 희석한 후 PEGylation 반응정도를 SDS-PAGE(4-12 Gradient, Invitrogen, USA))와 크기배제 크로마토그래피 (Zorbax GF-250, PBS buffer, lml/niin유속， 220訓， Agilent, USA)로 분석하였으며 제조된 mPEG-R27T 접합체의 niono-mPEG-R27T, di— mPEG_R27T는 크기배제 칼럼 (Super dex 250, Pharmacia, USA) 또는 이온 교환 칼럼을 사용하여 선형 또는 단계적 구배로 분리 정제하였다.
【표 2】
mPEG(20K)-ALD-RBL-IFN β 접합체의 제조를 위한 반웅조건
Figure imgf000022_0001
1-1) mPEG-20K-ALD7-R27T (pH 7.0) 접합체 분석
도 17에서 보는 것처럼 반응 결과 di_mPEG-R27T와 mono— mPEG— R27T는 크기배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분， 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-20K-ALD그 R27T 접합체 (pH 7.0) 는 도 18에서 보는 바와 같이 이온교환 컬럼을 이용하여 mono— mPEG-20K- ALD7-R27T(pH 7.0)를 분리하였고 각 절편을 UF 막 (Amicon® Ultraᅳ 2, Milipore, 10K MWC0)을 사용하여 농축한 후 SDS—PAGE로 각 절편을 확인하였다. 1-2) mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0) 분석 도 19에서 보는 것처럼 반응결과 di-mPEG— R27T와 mono—mPEG— RBL- R27T는 크기배제 컬럼인 Zorbax— 250을 사용하는 HPLC에서 7.5분， 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-20K-ALD6— R27T 접합체 (pH 6.0)는 도 20에서처럼 이온교환 컬럼을 이용하여 mono— mPEG-20K-ALD6— R27T (pH 6.0)를 분리하였고 각 절편을 UF 막 (Amicor ] Ultraᅳ 2， Milipore, 10K MWC0)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다.
2) mono-mPEG— 30K— ALD-R27T 접합체의 제조
R27T를 IF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWC0)을 사용하여 완층액으로 투석여과 한 후 mPEG-Aldehyde(30K, NOF, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 최종농도가 20mM 소듬 시아노보로하이드라이드가 되도록 R27T 흔합물 용액에 첨가하여 4°C 냉장상태에서 12- 14시간 반응시켰다. 자세한 반응 조건은 하기의 표 3과 같다.
반응이 종료된 후 50mM 소듬 아세테이트, pH 4.4 완충액으로 lmg/ml이 되게 희석한 후 PEGylation 반웅정도를 SDS— PAGE (4-12% 구배 , Invitrogen, USA)) 와 크기배제 크로마토그래피 (Zorbax GF— 250， PBS buffer lml/min유속， 220誦， Agilent, USA)로 분석하였으며 제조된 mPEG-R27T 접합체의 mono-mPEG— R27T 및 d i -mPEG-R27T는 크기배제칼럼 (Superdex 250， Pharmacia, USA) 또는 이온 교환 칼럼을 사용하여 선형 또는 단계적 구배로 분리 정제하였다.
【표 3】
mPEG-30K— ALD— R27T접합체의 제조를 위한 반웅조건
Figure imgf000023_0001
3 (5 molar excess) 7.0
2-1) mPEG-30K-ALD4.4-R27T (pH 4.4) 접합체 분석 도 21에서 보는 것처럼 반웅 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-30K-ALD4.4-R27T 접합체 (pH 4.4)는 이온교환 컬럼을 이용하여 mon으 mPEG-30K-ALD4.4-R27T(pH 4.4)를 분리하였고 각 절편을 UF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10 MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다 (도 22).
2-2) mPEG-30K-ALD6-R27T (pH 6.0) 접합체 분석
도 23에서 보는 것처럼 반응 결과 di-mPEGᅳ R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분， 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 iiiPEG-30K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)는 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-30K-ALD6-R27T(pH 6.0)를 분리하였고 각 절편을 IF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다 (도 24). 2-3) mPEG-30 -ALD-R27T (pH 7.0) 접합체 분석
도 25에서 보는 것처럼 반웅 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기배제 컬럼인 Zorbax-250올 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEGᅳ 30K-ALD7-R27T 접합체 (pH 7.0)는 도 26에서와 같이 이온교환 컬럼을 이용하여 mono— mPEG-30K-ALD7-R27T(pH 7.0)를 분리하였고 각 절편을 UF 막 (Amicon® UUra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다. morwᅳ mPEG-20K-MAL-R27T접합체의 제조 R27T를 UF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 pH 8.0의 인산완충액으로 투석여과 한 후 20배 몰비의 mPEG-MAL (20K, N0F, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한. 후 25°C에서 한 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후 PEGylation 반웅 정도를 SDS- PAGE(4-12 구배， Invitrogen, USA)와 크기배제 컬럼 (Zorbax— 250， PBS buffer, 1ml /in in 유속， 220nm)을 부착시킨 HPLC로 PEGylation 반응 정도를 분석하였으며 각각 절편을 분리 정제하였다. 도 27에서 보는 것처럼 반웅 결과 di/mon으 mPEG— MAL— R27T와 mPEG— MAL이 HPLC에서 6.5~7.5분， 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 각 절편을 IF 막 (Amicon® Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS— PAGE로 각 절편을 확인하였다. mono-mPEG-R27T 생물학적 활성 시험 및 결과
. A549 세포를 해모사이토미터 (hemocytometer)로 계수하여 10% FBS/MEM으로 3 105 세포 / 농도로 희석하여 현탁시켰다. 상기 1의 1)~3)에서 제조 정제된 mono— mPEGᅳ R27T 접합체를 각각 50 IU ~ 0.39 IU (1 mg/ml = 1.6 X 108 IU)의 농도로 회석하여 각각의 웰에 100 씩을 넣었다. 이어서， 각각의 웰에 세포 현탁액을 100 ^씩 넣고 배양기에서 22시간 동안 배양시켰다.
뇌심근염 바이러스 (Encephaloinyocarditis virus ： EMCV, PANGEN)를 1000TCID50/ml의 농도로 희석시켜 100 씩 가한 후， 다시 배양기에서 22시간 동안 배양시켰다. 96—웰 플레이트의 뇌심근염 바이러스 (EMCV, PANGEN) 배지 용액을 제거한 후, 0.05% 크리스탈 바이올렛 염색액을 웰 당 50 ^씩 넣고 마이크로플레이트 판독기의 파장 570 tin에서 각 웰에 대한 O.D.를 측정 (도 27)하여 표준 IFN β , R27T, 그리고 상기 1의 1)~4)에서 제조된 mono-mPEG-R27T 접합체의 활성을 계산하였다 (표 4).
【표 4】 A549 세포를 이용한 mono— mPEG— R27T의 생물학적 활성 A549를 이용한 ᄆ ≡. 반응 pH 반응조건
생물학적 활성 (%)
R27T - 一 100 mono-mPEG-20K-SC-R27T 7 .0 1 ) 21 .2 mono-mPEG-20K-Hz-R27T 4.0 2) 27.7 mono— mPEG— 20K-ALD7 7.0 3-1 ) 18.5 mono-mPEG-20K-ALD6-R27T 6.0 3-2 ) <5 mono-mPEG-30 -ALD4.4-R27T 4.4 4-1 ) 15.0 mono-mPEG— 30K— ALD6-R27T 6.0 4—2) <5 mono-mPEG-30K-ALD7-R27T 7.0 4—3 ) <5 mono-mPEG-20K-MAL-R27T 8 .0 5) 19. 2
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는- 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 11
하기의 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 유도체로 모노- 페길화 (mono— PEgyl ated)되고， 서열목록 제 1서열의 27번째 Arg 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 IFN- β ( inter feron— beta) 변이체:
화학식 1
CH3우 0 R1 \C/R2
II
0
상기 화학식에서， R1은 d-C4 알킬렌， d- 알킬렌옥시， d-C4 알킬렌옥시 d— C3 .알킬렌 또는 C厂 C4 알킬렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라진, 2 , 5—디옥소 -1—피롤리디닐옥시 또는 2 , 5-디옥소—1- 피롤리디닐옥시 Ct- 알킬렌이며; n은 2— 4000의 정수이다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 화학식 1의 R1은 에틸렌 , 에틸렌옥시， 에틸렌옥시메틸렌 또는 에틸렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라진, 2 , 5- 디옥소—1—피를리디닐옥시 또는 2 , 5-디옥소 -1—피를리디닐옥시 에틸렌인 것을 특징으로 하는 IFN- β변이체.
【청구항 3】 '
제 2 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 유도체는 하기의 화학식 2 내지 5로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IFN— β변이체 : 화학식 2
Figure imgf000027_0001
화학식 3
Figure imgf000028_0001
화학식 4
Figure imgf000028_0002
화학식 5
Figure imgf000028_0003
상기 화학식 2 내지 5에서, n은 2— 4000의 정수이다
【청구항 4】 .
제 1 항에 있어서， 상기 IFNᅳ β 변이체는 서열목록 제 1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 또는 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 IFN- β 변이체.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 모노-페길화된 IFN- 변이체는 5ᅳ 50 kDa의
PEG (po lyethyl ene g 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 IFN- β 변이체.
【청구항 6]
제 5 항에 있어서 , 상기 모노—페길화된 IFN- β 변이체는 10—40 kDa의 PEG(polyethyl ene glycol )가 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 IFN一 β 변이체.
【청구항 7】
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 모노-페길화된 IFN-β 변이체를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환 (hyperproliferative disease), 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 과대증식성 질환은 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 7 항에 있어서ᅳ 상기 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) , 폐혈성 쇼크 (septic shock) , 사구체 신염 크론병 (Crohn's disease), 궤양잘록창자염 (ulcerat ive colitis), 아테롬성 동맥경화증， 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10】
제 -7 항에 있어서， 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 건선， 알러지성 피부염， 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 111
제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥주사， 피하주사 또는 근육주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】
제 1 항 내지 제 6 항 증 어느 한 항의 모노—페길화된 IFN-β 변이체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 과대증식성 질환 (hyperproliferative disease), 염증성 질환， 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법 .
【청구항 13]
제 12 항에 있어서, 상기 과대증식성 질환은 암인 것을 특징으로 하는 방법ᅵ.
【청구항 14】
제 12 항에 있어서， 상기 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) , 폐혈성 쇼크 (septic shock) , 사구체 신염 크론병 (Crohn's disease), 궤양잘록창자염 (ulcerat ive colitis), 아테름성 동맥경화증， 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15】
제 12 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 건선， 알러지성 피부염， 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 16】
제 12 항에 있어서， 상기 조성물의 투여는 정맥주사， 피하주사 또는 근육주사인 것을 특징으로 하는 방법 .
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