CN111304284A - 一种酶-高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法及其应用 - Google Patents

一种酶-高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶‑高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法及其应用。利用甲氧基聚乙二醇醛与葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶缩聚反应生成酶‑高分子共聚物，将其化学沉积到微芯片上制成酶‑高分子阵列涂层微芯片。在其微芯片上加入待测溶液后，根据溶液颜色变化可判断是否含有葡萄糖，根据吸光度值可定量判断葡萄糖的浓度，完成1次样品检测仅需30秒的时间。可以检测葡萄糖浓度≥0.05mmol·L‑1的样品，单次测量误差在8％以内。与现有的葡萄糖检测方法，本发明检测方法简便快捷、进样量少、稳定性强、专一性好、误差小、检测时间短，并且能完成较低浓度葡萄糖的检测。在医学、食品、药品和化学工业等领域具有良好应用前景。

Description

一种酶-高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法及其 应用
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种酶-高分子阵列涂层微芯片的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用。
背景技术
葡萄糖作为常用的食品、化工和医药原料以及人体的最基本元素，其作用和用途十分广泛。因此葡萄糖检测技术被广泛需要于食品安全、化学工业和临床医学等领域(见Jiang,L.C.，Biosensors and Bioelectronics,2010,(25):1402-1407[J]；见Fu,Y.，Materials Science&Engineering C,2019,105,110120[J])。目前常见的葡萄糖检测方法有葡萄糖检测试纸、传统仪器检测法和生物传感器法(见王晴晴，江苏大学，2018[D])。葡萄糖检测试纸是将天然酶溶液直接喷洒在试纸表面制得的，而酶脆弱的天然结构对环境变化比较敏感，使得使用天然酶构建的试纸在实际使用时，酶活力已下降许多，也对储存条件有更高的要求；传统的仪器检测也面临着设备昂贵，操作复杂，耗时较长，使用不便等困难。相比之下，生物传感器法因其稳定性好、检测速度较快、灵敏度较高、结果直观性好成为了日益兴起的新方法(见Demming,S.，Sensors,2014,14,15749-15759[J])。
目前市面上最常见的葡萄糖检测方法即血糖仪法就是一种生物传感器法，将新鲜血液滴加到血糖试纸上放入检测区即可简单快速的得到结果。大部分的血糖仪都是基于电化学原理，依据电子的转移来准确定量葡萄糖。然而这类血糖仪有着电化学传感器普遍存在的诸多问题，如制备步骤繁琐，装置复杂，对多组分的复杂样品检测专一性差，且误差较大(单次测量误差10～20％)，因此在实际应用中受到限制。而基于光学原理设计的血糖仪又存在显色试剂见光易分解的问题。并且市售血糖仪是专为血糖检测设计的仪器，符合人血糖浓度要求，较为贴近正常人的空腹血糖浓度范围(3～6mmol·L-1)，超过该范围就测不准，难以实现较低浓度的葡萄糖检测。由此可见，虽然血糖仪已经是成熟的商业产品，但在实际检测葡萄糖时，仍存在装置复杂、专一性差、试纸储存条件高、误差较大和检测限较高等问题。
随着芯片实验室(见Yager,P.，Nature,2006,442,412-418[J])概念的提出，更小的进样量、更快的检测速度、更简单的装置和便携等优点，使其非常适合用在检测领域。因此将葡萄糖检测与微芯片技术相结合的研究有着良好前景。目前，在某种便携纸制品上负载特异性酶构建的纸基微芯片被广泛研究。例如Sanghyo Kim等人，利用蜡印刷方法设计了一种带自校准功能的色谱纸，用于检测葡萄糖(见Sanghyo Kim，Analytica Chimica Acta,2019[J])；Changming Li等人，在纸基体上原位生长酶-无机杂化物以减少微芯片制备时酶的不必要浪费(见Changming Li，Biosensors and Bioelectronics,2018,99,603-611[J])；SiriwanTeepoo等人，设计了一种能同时检测多物质的纸基微芯片，借助图像分析仪器检测葡萄糖(见SiriwanTeepo，Talanta,2020,207,120302[J])。然而以上这些研究将酶固载在纸基上，样品溶液需浸湿纸基，通过毛细作用才能到达检测区，与酶和显色剂反应而后进行显色测量(见Ahmed,S.，Biosensors and Bioelectronics,2016,77,249-263[J])，此过程比较耗时，需5～10分钟显色时间。
因此，开发出检测限低、灵敏度高、稳定性好、专一性高且能快速检测的便携式葡萄糖检测微芯片将是一项持续的有意义的课题。
发明内容
基于上述技术的不足，本发明提供了一种酶-高分子阵列涂层微芯片的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用；基于芯片的概念取之于集成与载体平台，构造了一种阵列涂层微芯片，在微芯片反应池中沉积由甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-ALD)与葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)共价交联而成的酶-高分子共聚物阵列涂层。旨在利用聚乙二醇化保护酶脆弱的天然结构，并使GOx和HRP共混在一起，使得第一步GOx反应的产物过氧化氢能迅速地被第二步反应的HRP获取，从而实现快速检测葡萄糖。初步构建了检测限低、灵敏度高、稳定性好、专一性高且能够便携式的葡萄糖检测微芯片
实现本发明的目的的技术措施如下：
一种用于快速检测葡萄糖的阵列涂层微芯片，包括配有至少有10个以上反应池的微芯片中沉积有酶-高分子阵列涂层，该阵列涂层由直径400～600nm的酶-高分子共聚物组成；所述酶-高分子阵列涂层的制备是：取甲氧基聚乙二醇醛mPEG-ALD(分子量5kDa)，葡萄糖氧化酶GOx(来源于黑曲霉，分子量160kDa)冻干粉，辣根过氧化物酶HRP(来源于辣根，分子量44kDa)冻干粉，以质量比＝10:10:1混合后，溶于pH＝5～6的盐酸水溶液中，其中mPEG-ALD:盐酸水溶液的质量比＝5:1，充分搅拌直至完全溶解后备用；取10μL上述共聚物溶液滴加到微芯片每个反应池中，密闭静置于37°C下充分反应24h后，经37°C鼓风干燥3～5h，风速保持0.5～1ms-1后制得阵列涂层微芯片。具体制备步骤如下；
第一步骤：涂层微芯片的制备
(1)将市售的10μL移液枪头的尖端用刀片切除，仅留末端3mm的空心柱状体，共制备10个大小均一的锥台柱状体用作构建检测反应池；
(2)用全透明环氧树脂AB胶将锥台柱状体固定在玻璃片上，玻璃片规格25mm×76mm×1mm，排列成5×2的形式，即得涂层微芯片。
第二步骤：mPEG-GOx-HRP共聚物溶液的配置：
(1)配制pH＝5～6的盐酸溶液；
(2)电子天平称取mPEG-ALD(甲氧基聚乙二醇醛)粉末5mg，GOX冻干粉5mg和辣根过氧化物酶HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解；其中葡萄糖氧化酶GOx，来源于黑曲霉，分子量160kDa；辣根过氧化物酶HRP，来源于辣根，分子量44kDa。
第三步骤：酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片的制备：
(1)取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到微芯片每个反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
一种酶-高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法，其步骤是，
(1)配置2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐即ABTS和葡萄糖混溶的水溶液作为待测样品溶液，其中ATBS浓度为10mmol·L-1；
(2)取10μL待测样品溶液滴加到微芯片每个反应池中，秒表计时30s，观察显色现象。将反应完成后的溶液吸出放入酶标仪(型号：SYNERGYH1 microplate reader(BioTeK1)，产地：美国)中，在λ＝410nm条件下可得吸光度值。连续测定5个标准葡萄糖浓度的检测吸光度值，绘制出标准曲线。本发明中标准曲线公式为y＝0.2496x+0.1715，其中x值为葡萄糖浓度，单位为mmol·L-1，y值为吸光度值。将测得的吸光度值代入公式中可计算出实测葡萄糖浓度。
其原理是将葡萄糖与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐即ABTS互溶后，得到待测样品混合溶液，取少量混合溶液将其滴在微芯片反应池里，涂层中GOx与混合液中的葡萄糖产生过氧化氢，过氧化氢与ABTS在HRP的催化下产生绿色物质ABTS+，根据溶液颜色变化可定性判断是否含有葡萄糖，再根据410nm波长下的吸光度值可定量判断葡萄糖的浓度。混合时，待测溶液仅取5～10μL；ABTS溶液取5～10μL，ABTS的浓度为10mmol·L-1。
本发明所述阵列涂层微芯片检测葡萄糖具有专一性，可以检测葡萄糖浓度≥0.05mmol·L-1的样品，完成一个葡萄糖样品检测耗时30秒左右，单个待测样品的进样量仅需5～10μL。
本发明与现有的葡萄糖检测技术相比，具有如下优点：
(1)本发明所述的酶-高分子阵列涂层，利用了酶蛋白质的聚乙二醇化技术，该技术能有效保护酶的活性，使制备的阵列涂层在长时间放置后酶活力稳定，且对恶劣环境变化有一定的抗性，弥补了市售血糖试纸储存困难的不足。
(2)本发明所述的酶-高分子阵列涂层，利用mPEG-ALD作为交联剂，将GOx和HRP大量交联在一起，使得单位面积内的酶高度富集，加快酶促反应。
(3)本发明所述的检测方法，利用ABTS作为反应的显色指示剂，在这一酶级联反应中，若加入葡萄糖，ABTS会被转换为绿色物质ABTS+，葡萄糖浓度越高，溶液绿色越深，结果直观，可视性强。
(4)本发明所述的微芯片装置，制备简单，成本低廉，小巧便携，能完成低浓度的葡萄糖检测，弥补了市售血糖仪检测时最低检测浓度较高的不足。
附图说明
图1为本发明微芯片立体结构示意图。
图2a为本发明微芯片结构俯视示意图，图2b为侧视示意图。
图3为本发明微芯片的实物尺寸比较照片图。
图4为本发明快速检测流程示意图。
图5a、图5b、图5c、图5d为本发明所述酶-高分子阵列涂层扫描电镜图。
图6为本发明所述酶-高分子阵列涂层粒径分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种酶-高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法及其应用，包括微芯片的构建、涂层的组份配制、快速检测葡萄糖的应用方法。
如图1所示，构建的微芯片在实验室由玻璃片和经刀片切割的移液枪头组成，产业化后可以开模具按设计批量制造；图2a为本发明所述微芯片的俯视图，玻璃片长76mm，宽25mm，玻璃片上有10个均匀排布的反应池，本发明所述微芯片的侧视图如图2b所示，反应池为上直径3mm，下直径5mm的空芯锥台柱状体，玻璃片的厚度为1mm。如图3所示的微芯片。
其葡萄糖快速检测流程如图4所示，在酶-高分子阵列涂层微芯片的反应池中滴加待测溶液与ABTS的混合溶液，反应30秒后，放入酶标仪中得出吸光度值，根据标准曲线公式计算出实测葡萄糖浓度。
图5a所示，扫描电镜5000倍下可见上述酶-高分子阵列涂层是由大量的酶高分子共聚物紧密排列组成，如图5b和图5c所示，扫描电镜下将视野调至10000倍和20000倍可见上述酶-高分子阵列涂层主要由不规则球型颗粒构成，将图5c中单个酶-高分子共聚物放大至200000倍观察，如图5d所示，可见其为一均匀球型颗粒，直径在550nm左右。因此扫描电镜下可见酶-高分子阵列涂层是由直径400～600nm的酶高分子共聚物组成，排列紧密。如图6所示，经数理统计酶-高分子阵列涂层的平均粒径为560nm。
下表1展示实施例中不同葡萄糖浓度下，所述微芯片颜色变化情况和吸光度值。(含空白组)表1：
Figure BDA0002402174550000051
Figure BDA0002402174550000061
实施例1
(1)酶-高分子阵列涂层微芯片的制备：电子天平称取mPEG-ALD粉末5mg，GOx冻干粉5mg和HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解。取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到如图3所示微芯片每个反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
(2)待测样品溶液配置：配置1mL的ABTS和葡萄糖混合溶液，其中ABTS浓度为10mmol·L-1，葡萄糖浓度为0.05mmol·L-1。在实践中可预先前处理后，避光4°C密封待用。
(3)移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片反应池中，秒表计时30s，观察显色现象。将反应液吸出放入酶标仪中，在λ＝410nm条件下测吸光度值为0.185，将其带入标准曲线公式y＝0.2496x+0.1715计算得实测葡萄糖浓度为0.054，结果如表1所示。
实施例2
(1)酶-高分子阵列涂层微芯片的制备：电子天平称取mPEG-ALD粉末5mg，GOx冻干粉5mg和HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解。取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到如图3所示微芯片反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
(2)待测样品溶液配置：配置1mL的ABTS和葡萄糖混合溶液，其中ABTS浓度为10mmol·L-1，葡萄糖浓度为0.25mmol·L-1。在实践中可预先前处理后，避光4°C密封待用。
(3)移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片反应池中，秒表计时30s，观察显色现象。将反应液吸出放入酶标仪中，在λ＝410nm条件下测吸光度值为0.239，将其带入标准曲线公式y＝0.2496x+0.1715计算得实测葡萄糖浓度为0.27，结果如表1所示。
实施例3
(1)酶-高分子阵列涂层微芯片的制备：电子天平称取mPEG-ALD粉末5mg，GOx冻干粉5mg和HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解。取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到如图3所示微芯片反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
(2)待测样品溶液配置：配置1mL的ABTS和葡萄糖混合溶液，其中ABTS浓度为10mmol·L-1，葡萄糖浓度为0.5mmol·L-1。在实践中可预先前处理后，避光4°C密封待用。
(3)移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片反应池中，秒表计时30s，观察显色现象。将反应液吸出放入酶标仪中，在λ＝410nm条件下测吸光度值为0.296，将其带入标准曲线公式y＝0.2496x+0.1715计算得实测葡萄糖浓度为0.498，结果如表1所示。
实施例4
(1)酶-高分子阵列涂层微芯片的制备：电子天平称取mPEG-ALD粉末5mg，GOx冻干粉5mg和HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解。取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到如图3所示微芯片反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
(2)待测样品溶液配置：配置1mL的ABTS和葡萄糖混合溶液，其中ABTS浓度为10mmol·L-1，葡萄糖浓度为1.5mmol·L-1。在实践中可预先前处理后，避光4°C密封待用。
(3)移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片反应池中，秒表计时30s，观察显色现象。将反应完成后溶液吸出放入酶标仪中，在λ＝410nm条件下测吸光度值为0.533，将其带入标准曲线公式y＝0.2496x+0.1715计算得实测葡萄糖浓度为1.45，结果如表1所示。
实施例5
(1)酶-高分子阵列涂层微芯片的制备：电子天平称取mPEG-ALD粉末5mg，GOx冻干粉5mg和HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解。取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到如图3所示微芯片反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
(2)待测样品溶液配置：配置1mL的ABTS和葡萄糖混合溶液，其中ABTS浓度为10mmol·L-1，葡萄糖浓度为2.5mmol·L-1。在实践中可预先前处理后，避光4°C密封待用。
(3)移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片反应池中，秒表计时30s，观察显色现象。将反应完成后溶液吸出放入酶标仪中，在λ＝410nm条件下测吸光度值为0.803，将其带入标准曲线公式y＝0.2496x+0.1715计算得实测葡萄糖浓度为2.53，结果如表1所示。
实施例6
(1)酶-高分子阵列涂层微芯片的制备：电子天平称取mPEG-ALD粉末5mg，GOx冻干粉5mg和HRP冻干粉0.5mg溶于1mL配置好的盐酸溶液中，充分搅拌直至完全溶解。取10μL配置好的mPEG-GOx-HRP共聚物溶液滴加到如图3所示微芯片反应池中，将微芯片密闭平放静置24h后，放入电热恒温鼓风干燥箱37°C鼓风干燥3-5h，即得酶-高分子阵列涂层葡萄糖检测微芯片。
(2)待测样品溶液配置：配置1mL的ABTS和淀粉混合溶液，其中ABTS浓度为10mmol·L-1，淀粉浓度为1mmol·L-1。在实践中可预先前处理后，避光4°C密封待用。
(3)移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片反应池中，秒表计时30s，观察显色现象，结果无显色现象。将反应完成后溶液吸出放入酶标仪中，在λ＝410nm条件下测吸光度值为0.006，结果如表1所示。

Claims (6)

1.一种用于快速检测葡萄糖的阵列涂层微芯片，其特征在于，包括配有至少10个以上反应池的微芯片中沉积有酶-高分子阵列涂层，该阵列涂层由直径400～600nm的酶-高分子共聚物组成；所述酶-高分子阵列涂层的制备如下：取甲氧基聚乙二醇醛mPEG-ALD、葡萄糖氧化酶GOx冻干粉和辣根过氧化物酶HRP冻干粉，以质量比＝10:10:1混合后，溶于pH＝5～6的盐酸水溶液中，其中mPEG-ALD盐酸水溶液的质量比＝5:1，充分搅拌直至完全溶解后备用；微芯片中每个反应池滴加10μL上述共聚物溶液，密闭静置于37℃下充分反应24h后，经37℃鼓风干燥3～5h，风速保持0.5～1ms-1后制得阵列涂层微芯片。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测葡萄糖的阵列涂层微芯片，其特征在于，所述微芯片中反应池为空芯锥台柱状体，固定在25mm×76mm×1mm玻璃片上，成5×2的排列形式。
3.一种酶-高分子阵列涂层微芯片快速检测葡萄糖的方法，其步骤是，将待测样品溶液与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐即ABTS互溶后，滴在微芯片反应池里，涂层中GOx与葡萄糖产生过氧化氢，过氧化氢与ABTS在HRP的催化下产生绿色物质ABTS+，根据溶液颜色变化可定性判断是否含有葡萄糖，再根据410nm波长下的吸光度值可定量判断葡萄糖的浓度。
4.根据权利要求3所述的酶-高分子阵列涂层快速检测葡萄糖的方法的应用，其特征在于，应用混合时待测溶液仅取5～10μL；ABTS溶液取5～10μL，ABTS的浓度为10mmol·L-1
5.根据权利要求1所的一种用于快速检测葡萄糖的阵列涂层微芯片的应用，其特征在于，所述阵列涂层微芯片检测葡萄糖具有专一性，可以检测葡萄糖浓度≥0.05mmol·L-1的样品，完成一个样品检测耗时30秒左右，单个待测样品的进样量仅需5～10μL。
6.根据权利要求1所的一种用于快速检测葡萄糖的阵列涂层微芯片的应用，其特征在于，用移液枪吸取10μL待测样品溶液滴加到微芯片每个反应池中，秒表计时30s，观察显色现象；
将反应完成后的溶液吸出放入酶标仪中，用λ＝410nm条件下测吸光度值并根据标准曲线计算出葡萄糖浓度。
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