CN101140258B - 一种以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜及其制备方法，属于电化学生物传感器及其制备技术领域。葡萄糖氧化酶膜是由硝酸基纤维素膜基体、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物质戊二醛组成。该葡萄糖氧化酶膜的制备方法是：将硝酸基纤维素基体膜经过磷酸缓冲溶液浸泡处理，然后与戊二醛反应，再通过戊二醛交联固定葡萄糖氧化酶制成酶膜，酶膜用纯度≥99.99％的氮气吹干后，粘贴上O形橡胶圈，即制备成葡萄糖传感器敏感膜。由于硝酸基纤维素膜具有较大的孔隙率、孔径均匀以及良好的生物相容性等优势，可以有效地将酶固定在基体膜上并保持酶的活性。酶膜可广泛应用于发酵工业在线分析等方面。

Description

一种以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜及其制备方法

技术领域

本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别是涉及一种以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜及其制备方法。

背景技术

电化学生物传感器由于其操作简便、性能稳定、价格低廉、易于微型化等优点，在生物、医学、环境监测、食品、医药及军事等领域都有着重要的应用价值。葡萄糖电化学生物传感器在临床诊断、食品检测、发酵控制等方面都具有重要应用，一直是传感器领域的研究热点。

葡萄糖氧化酶是葡萄糖电化学生物传感器中的生物活性物质。将葡萄糖氧化酶固定在基体膜上可实现其与电极的分离，测量时可以省略电极处理步骤，使操作更加简便；此外由于生物活性物质的寿命有限，将酶固定在基体膜上与电极分离后，可在使用时随时更换酶膜，使传感器成本降低，便于工业应用。改进酶的固定化方法和筛选适宜的固定基体材料以保持酶的活性及提高酶的重复利用率是葡萄糖电化学生物传感器研究的重要内容，目前被用于葡萄糖氧化酶固定的膜基体材料包括醋酸纤维素及其衍生物膜、动植物膜、分子筛、尼龙膜等。

在文献(1)Analyst，1997，122：821中，Baohong Liu等人将葡萄糖氧化酶固定于修饰分子筛基体上，并组装成葡萄糖生物传感器。研究表明分子筛的亲水性和中孔结构在酶的固定中发挥了重要作用，同时由于分子筛比表面积较大，因此获得了较高的酶载量，并有效地保持了酶的活性。该传感器具有较好的重现性和操作稳定性，线性响应范围为1.0×10^-2～5.0mmol/L，检测限为2.0×10^-3mmol/L。但该方法研制的葡萄糖生物传感器米氏常数(20.22mmol/L)较大，表明酶与底物的亲和能力较差，另外该体系制备过程较繁琐。

在文献(2)Talanta，2004，64：546中，Baoli Wu等人用戊二醛作为交联剂将葡萄糖氧化酶固定在蛋壳膜上，并与氧电极构成了葡萄糖生物传感器，研究结果表明葡萄糖氧化酶能够很好地固定在蛋壳膜基体上，所制得的传感器的线性响应范围为0.01～1.3mmol/L，响应时间为100s，贮存4个月后可保持酶膜活性85.2％。但该方法制备的葡萄糖生物传感器线性响应范围较窄，并且采用蛋壳膜在规模化制备上具有较大难度。

在文献(3)生物工程学报，1995，11：260中，王顺光等人采用戊二醛为交联剂将葡萄糖氧化酶固定在醋酸纤维素膜基质上制备了葡萄糖氧化酶膜，并分别与氧电极和过氧化氢电极组装成测定葡萄糖的生物传感器。研究结果表明，与氧电极组成的葡萄糖传感器的线性响应范围为50～800mg/dL；与过氧化氢电极组成的葡萄糖传感器的线性响应范围为10～200mg/dL。测试结果与酶试剂盒测试结果具有良好的相关性，但该方法研制的葡萄糖生物传感器的线性响应范围较窄。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜及其制备方法，利用硝酸基纤维素膜良好的化学稳定性及热稳定性、较大的孔隙率、较均匀的孔径分布以及良好的生物相容性等性能优势，有效地保持葡萄糖氧化酶的活性，提高生物传感器的灵敏度、线性响应范围及稳定性等，从而提高生物传感器的综合性能指标。

本发明的硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜采用硝酸基纤维素微孔滤膜为基体，使用交联剂将葡萄糖氧化酶固定于基体膜上。由硝酸基纤维素膜基体、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物质戊二醛组成。其中葡萄糖氧化酶含量为10～400活力单位(U)/cm²。所述硝酸基纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜、硝酸/醋酸混合纤维素微孔滤膜中的任意一种，其平均孔径为0.20～1.20μm，厚度为50～150μm。

本发明以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜的制备方法是：

将硝酸基纤维素膜基体浸入pH值为5.5～7.5的磷酸缓冲溶液中处理6～12小时，然后取出浸入体积百分比浓度为1.0～5.0％的戊二醛溶液中交联处理0.5～3小时，再经二次蒸馏水洗涤、磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入浓度为5～15g/L葡萄糖氧化酶溶液中反应1～3小时，然后将酶膜取出用磷酸缓冲溶液充分洗涤以洗掉结合不牢固的酶。最后用纯度≥99.99％的氮气将酶膜吹干，并粘在O形橡胶圈上，即形成以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶敏感膜，保存在0～4℃的冰箱中备用。

上述硝酸基纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜或硝酸/醋酸混合纤维素微孔滤膜中的任意一种，其平均孔径为0.20～1.20μm，厚度为50～150μm；葡萄糖氧化酶溶液的溶剂为磷酸缓冲溶液；戊二醛溶液、磷酸缓冲溶液的溶剂为二次蒸馏水。

葡萄糖氧化酶通过戊二醛以共价键交联形式固定于硝酸基纤维素膜基体上；葡萄糖氧化酶溶液的溶剂为磷酸缓冲溶液；戊二醛溶液、磷酸缓冲溶液的溶剂为二次蒸馏水

本发明的效果可以从使用本发明以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜制作的电化学生物传感器看出。将本发明的葡萄糖氧化酶膜套在铂电极顶端作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成安培型葡萄糖生物传感器。将传感器的三电极体系置于pH值为5.5～7.5的磷酸缓冲溶液中，用CHI660B电化学工作站对该葡萄糖电化学生物传感器进行电化学表征。采用i-t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流(如图1所示)，本发明葡萄糖电化学生物传感器对β-D-葡萄糖的响应灵敏度为1.1μA·L/mmol，响应时间小于80s；由图2可以看出，以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜对β-D-葡萄糖的线性响应范围为0.05～4.0mmol/L，大于文献(2)及文献(3)中葡萄糖电化学生物传感器的线性响应范围；由图3可以计算出本发明葡萄糖氧化酶膜的米氏常数为7.2mmol/L，与文献(1)相比较低，这说明本发明的葡萄糖氧化酶膜对葡萄糖表现出良好的亲和性；对本发明的葡萄糖氧化酶膜进行连续500次的测试(如图4所示)，其响应信号未见明显下降，在前50次测试中响应信号大小波动在4％以内，500次的测试中响应信号大小波动在8％以内，这说明本发明以纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜具有良好的操作稳定性。

本发明的优点在于：在基体选择方面，本发明选用的硝酸基纤维素微孔滤膜材料具有良好的生物相容性，能够较好地保持酶的活性，且价格低廉；在制备方法方面，本发明的葡萄糖氧化酶膜制备方法简便易行、工序较少、耗时较短、制备过程成本较低，易于推广应用；在性能方面，本发明葡萄糖氧化酶膜具有较宽的线性响应范围和较好的操作稳定性，适合在发酵工业生产中广泛使用。

附图说明

图1.以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜对1mmol/L的β-D-葡萄糖的i-t响应曲线。其中，

横坐标-时间t(单位：秒，s)

纵坐标-响应电流i(单位：微安，μA)

图2.β-D-葡萄糖浓度与本发明以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜的响应电流的关系曲线。其中，

横坐标-β-D-葡萄糖的浓度(单位：毫摩尔/升，mmol/L)

纵坐标-响应电流i(单位：微安，μA)

图3.β-D-葡萄糖浓度的倒数与本发明以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜响应电流的倒数的关系曲线。其中，

横坐标-β-D-葡萄糖的浓度的倒数(单位：升/毫摩尔，L/mmol)

纵坐标-响应电流i的倒数(单位：1/微安，1/μA)

图4.以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜操作稳定性测试图。其中，

横坐标-测试次数(单位：次)

纵坐标-相对响应(单位：％)

插图为以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜稳定性测试前50次响应情况。其中，

横坐标-测试次数(单位：次)

纵坐标-相对响应(单位：％)

具体实施方式：

实施例1

将平均孔径为0.45μm，厚度为100μm的硝酸纤维素微孔滤膜浸入到pH值为6.5的磷酸缓冲溶液中处理6小时，然后取出浸入体积百分比浓度为2.5％的戊二醛溶液中进行交联处理1小时，取出经二次蒸馏水洗涤、磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入以磷酸缓冲溶液为溶剂的浓度为10g/L的葡萄糖氧化酶溶液中反应2小时，然后将酶膜取出用磷酸缓冲溶液充分洗涤，最后用纯度≥99.99％的氮气将酶膜吹干，并粘在O形橡胶圈上，置于磷酸缓冲溶液中，在4℃冰箱中保存。

将以硝酸纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜套在铂电极顶端作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试体系为pH＝6.5的磷酸缓冲溶液，采用CHI660B电化学工作站对以硝酸纤维素膜为基体的安培型葡萄糖生物传感器进行电化学表征。采用i-t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流(如图1所示)，得出其响应灵敏度为1.1μA·L/mmol，响应时间小于80s；传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.05～4.0mmol/L(如图2所示)；计算出其米氏常数为7.2mmol/L(如图3所示)；敏感膜连续使用500次其响应信号未见明显下降(如图4所示)，在前50次测试中响应信号大小波动在4％以内，500次的测试中响应信号大小波动在8％以内；该葡萄糖氧化酶膜稳定性保持3个月以上。

实施例2

将平均孔径为0.80μm，厚度为80μm的硝酸/醋酸混合纤维素微孔滤膜浸入到pH值为6.5的磷酸缓冲溶液中处理12小时，然后取出浸入体积百分比浓度为5.0％的戊二醛溶液中进行交联处理0.5小时，取出经二次蒸馏水洗涤、磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入以磷酸缓冲溶液为溶剂的浓度为5g/L的葡萄糖氧化酶溶液中反应3小时，然后将酶膜取出用磷酸缓冲溶液充分洗涤，最后用纯度≥99.99％的氮气将酶膜吹干，并粘在O形橡胶圈上，置于磷酸缓冲溶液中，在2℃冰箱中保存。

将以硝酸/醋酸混合纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜套在铂电极顶端作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试体系为pH＝6.5的磷酸缓冲溶液，采用CHI660B电化学工作站对以硝酸/醋酸混合纤维素膜为基体的安培型葡萄糖生物传感器进行电化学表征。采用i-t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，得出其响应灵敏度为1.0μA·L/mmol，响应时间小于110s；传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.05～4.0mmol/L；该葡萄糖氧化酶膜稳定性保持3个月以上。

实施例3

将平均孔径为0.22μm，厚度为50μm的硝酸纤维素微孔滤膜浸入pH值为5.5的磷酸缓冲溶液中处理6小时，然后取出浸入体积百分比浓度为1.0％的戊二醛溶液中进行交联处理3小时，取出经二次蒸馏水洗涤、磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入以磷酸缓冲溶液为溶剂的浓度为15g/L的葡萄糖氧化酶溶液中反应1小时，然后将酶膜取出用磷酸缓冲溶液充分洗涤，最后用纯度≥99.99％的氮气将酶膜吹干，并粘在O形橡胶圈上，置于磷酸缓冲溶液中，在3℃冰箱中保存。

将以硝酸纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜套在铂电极顶端作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试体系为pH＝5.5的磷酸缓冲溶液，采用CHI660B电化学工作站对以硝酸纤维素膜为基体的安培型葡萄糖生物传感器进行电化学表征。采用i-t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，得出其响应灵敏度为1.0μA·L/mmol，响应时间小于120s；传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.05～4.0mmol/L；该葡萄糖氧化酶膜稳定性保持3个月以上。

实施例4

将平均孔径为1.20μm，厚度为150μm的硝酸/醋酸混合纤维素微孔滤膜浸入pH值为7.5的磷酸缓冲溶液中处理8小时，然后取出浸入体积百分比浓度为2.5％的戊二醛溶液中进行交联处理2小时，取出经二次蒸馏水洗涤、磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入以磷酸缓冲溶液为溶剂的浓度为10g/L的葡萄糖氧化酶溶液中反应2小时，然后将酶膜取出用磷酸缓冲溶液充分洗涤，最后用纯度≥99.99％的氮气将酶膜吹干，并粘在O形橡胶圈上，置于磷酸缓冲溶液中，在1℃冰箱中保存。

将以硝酸/醋酸混合纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜套在铂电极顶端作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试体系为pH＝7.5的磷酸缓冲溶液，采用CHI660B电化学工作站对以硝酸/醋酸混合纤维素膜为基体的安培型葡萄糖生物传感器进行电化学表征。采用i-t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，得出其响应灵敏度为1.0μA·L/mmol，响应时间小于120s；传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.05～4.0mmol/L；该葡萄糖氧化酶敏感膜稳定性保持3个月以上。

Claims (3)

1.一种以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜，其特征是由硝酸基纤维素膜基体、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物质戊二醛组成，其中葡萄糖氧化酶含量为10～400活力单位(U)/cm²；所述硝酸基纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜、硝酸/醋酸混合纤维素微孔滤膜中的任意一种，其平均孔径为0.20～1.20μm，厚度为50～150μm。

2.一种制备权利要求1所述的以硝酸基纤维素膜为基体的葡萄糖氧化酶膜的方法，其特征在于，工艺步骤为：

将硝酸基纤维素膜基体浸入pH值为5.5～7.5的磷酸缓冲溶液中处理6～12小时，然后取出浸入体积百分比浓度为1.0～5.0％的戊二醛溶液中进行交联处理0.5～3小时，再经二次蒸馏水洗涤、磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入浓度为5～15g/L的葡萄糖氧化酶溶液中反应1～3小时，然后将酶膜取出用磷酸缓冲溶液充分洗涤，最后用纯度≥99.99％的氮气将酶膜吹干，并粘在O形橡胶圈上，形成葡萄糖氧化酶膜，保存在0～4℃冰箱中备用；

所述硝酸基纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜或硝酸/醋酸混合纤维素微孔滤膜中的任意一种，其平均孔径为0.20～1.20μm，厚度为50～150μm；葡萄糖氧化酶溶液的溶剂为磷酸缓冲溶液；戊二醛溶液、磷酸缓冲溶液的溶剂为二次蒸馏水。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，葡萄糖氧化酶通过戊二醛以共价键交联形式固定于硝酸基纤维素膜基体上。

Images