JPH0820364B2 - 分析物濃度の定量方法 - Google Patents

分析物濃度の定量方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、水性流体、特に全血液中の化学成分及び生
化学成分（分析物）の比色定量用試薬装置及び試験方法
に関する。好ましい一態様によれば、本発明は、全血液
中のグルコース濃度を比色的に測定する為の試験装置及
び試験方法に関する。
〔従来の技術及び発明が解決すべき問題点〕
着色水性流体中、特に全血液及び尿素などの着色生体
液並びに血清及び血漿などの着色生体液誘導体中の化学
成分及び生化学成分の定量比が、益々重要性を増してい
る。これについての重要な用途としては、医療における
診断及び治療、並びに治療用薬物、中毒物、危険化学薬
品等への暴露に関する定量化が挙げられる。ある場合に
は、測定物質の量が、１デシリットル当たり１マイクロ
グラム以下の範囲といったように非常に少量であるか、
あるいは正確に定量するのが困難な程度の量であり、従
って、用いられる装置が、複雑であり且つ熟練した研究
員のみしか用いることが出来ないことがある。この場合
には、一般に、試料採取後数時間ないしは数日間は、結
果を入手することができない。又、他の場合には、迅速
あるいは即時情報表示装置を据えつけてある実験室外
で、素人のオペレーターが、この試験を日常的に、迅速
に且つ再現性良く行う為の技量に重点が置かれることが
ある。医療において、一般的に行われる試験のひとつと
して、糖尿病患者による血中グルコース濃度の測定が挙
げられる。現在では、糖尿病患者が個々の場合に応じて
種類及び重度によって１日２〜７回血中グルコース濃度
を測定することを勧めている。このようにして得られた
グルコース濃度のパターンに基づいて、患者と医者が協
議のうえ、食事、運動及びインシュリン摂取量を調整し
て、糖尿病をよりよく治療する。このような場合には、
明らかに、患者が測定値についての情報を直ちに入手で
きるようでなくてはならない。
現在米国で広く用いられている方法では、1967年１月
17日発行されたマスト（Mast）による米国特許第3,298,
789号に記載されている種類の試験用品が用いられてい
る。この方法では、まず、採取したばかりの全血液の試
料（一般に20〜40ml）を、グルコースオキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼ活性を有する酵素系含有のエチルセル
ロースで被覆した試薬パッド上に置く。この酵素系をグ
ルコースと反応させ過酸化水素を放出させる。パッドに
は、指示薬も含有されており、ペルオキシダーゼの存在
下で過酸化水素と反応して、試料中のグルコース濃度に
比例した強度で発色する。
他の良く用いられている方法では、同様の化学反応を
利用しているが、エチルセルロースで被覆したパッドの
代わりに、酵素と指示薬を分散した耐水性フィルムを用
いている。この種の装置は、1971年12月28日発行された
レイ（Rey）等による米国特許第3,630,957号に記載され
ている。
上記の両方の場合において、試料は、特定の時間（一
般に１分間）、試薬パッドと接触状態に置かれる。その
後、前者の場合血液試料を水流で洗浄して落とし、一
方、後者の場合フィルムをぬぐい取る。次に、パッドあ
るいはフィルムを吸い取って乾燥し、評価する。評価
は、発生した色をカラーチャートと比較するか、パッド
あるいはフィルムを拡散反射率測定器中に入れ、色の強
度を読み取ることにより行う。
上述の方法は、長年グルコース濃度監視用に用いられ
てきたが、幾つかの限界がある。例えば、フィンガース
ティック（finger stick）試験の割りには、必要な試料
のかさがかなり大きく、毛細血管の血液が容易に出ない
ある人々の場合には、それだけの試料を採取することが
困難である。
更に、こられの方法では、結果が、試料と試験試薬と
の反応の絶対的な程度に関係する色の読み取りの絶対値
に基づいて出されるために、他の素人オペレータ用簡便
比色定量法と同様の限界事項がある。即ち、決められた
時間間隔で反応後、試料を洗い流すか、あるいは試薬パ
ッドを拭い取らねばならず、使用者は、決められた時間
間隔の終わりには待機して必要な時間に拭い取るか、あ
るいは水流をかけなければならない。又、試料を取り出
して反応を停止するために、得られる結果、特に家庭で
の使用者の手法に曖昧さが生ずる。つまり、洗浄し過ぎ
ると結果が低くなり、一方、洗浄が足りないと結果が高
くなる。
素人オペレータ用簡便比色定量法によくある他の問題
は、血液を試料パッドに塗布するときにタイミングシー
ケンースを行う必要があることである。使用者は、一般
に、フィンガースティック（finger stick）を行って血
液試料を得、指から得た血液を試薬パッドに塗布すると
同時に他の手でタイミングサーキット（timing circui
t）を始動する必要があり、従って、両方の手を同時に
使用する必要がある。血液を試薬パッドに塗布するちょ
うどそのときに、確実にタイミングサーキットの始動が
必要なこともあり、このことはとりわけ困難である。従
来の方法全てにおいて、測定結果を得るために付加的操
作あるいは付加的サーキットリーが必要である。従っ
て、反射率読み取り器をこの面において簡素化すること
が望ましい。
赤血球等の着色成分が存在すると絶対値の測定を妨害
することがあり、従って、最も広く実施されている上記
の二つの従来法においては、赤血球を排除する必要があ
る。米国特許第3,298,789号に記載されている装置で
は、エチルセルロース膜により、赤血球が試薬パッドに
入り込むのを防止している。同様に、米国特許第3,630,
957号では、耐水性フィルムにより、赤血球の侵入を防
止している。両方の場合において、洗浄あるいは拭い取
りの操作も、妨害の可能性のある赤血球を、測定前に除
去する働きをする。
従って、反射率の読み取りを行う反射率ストリップか
ら、液体の過剰分を除去する必要のない、血液等の着色
液中の分析物を検出するシステムの必要性が残されてい
る。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明によれば、シグナル生成系を有する親水性多孔
質マトリックスと流体マトリックスに浸透してマトリッ
クスの反射率が変化すると始動する反射率測定装置から
構成される、診断測定用の新規な方法、組成物及び装置
が提供される。本発明の方法は、試料、一般的には全血
液を、赤血球などの大きな粒子を濾去するマトリックス
に、一般的にはマトリックスを装置に存在させた状態で
添加することからなる。シグナル生成系は、試料中の分
析物の存在に関係するマトリックスの反射率をさらに変
化させる生成物を生じる。
本発明による診断測定システムの代表例としては、血
液に由来する妨害及び使用誤差を生じる複雑なプロトコ
ールなしに行うことができる全血液中のグルコースの定
量が挙げられる。
試薬要素 本発明により、特に酵素生成物として過酸化水素を生
成する酵素基質を含むグルコースなどの分析物の定量用
の信頼性があり且つ操作の容易な装置を用いる、迅速性
及び簡便性の面で改善された方法が提供される。本発明
の方法は、少量の全血液を多孔質のマトリックスに塗布
し、マトリックスを十分に浸す工程を包含する。マトリ
ックスには、マトリックスの反射率の最初の変化をもた
らす生成物を生じるシグナル生成系の一種又はそれ以上
の試薬が結合している。血液が塗布される時には、マト
リックスは一般的に反射率測定装置中に存在する。液体
試料がマトリックスに浸透し、測定表面で最初の反射率
の変化が生じる。最初の反射率の変化の後、一回又はそ
れ以上の回数読み取りを行い、反応生成物の生成の結果
起こる測定表面あるいはマトリックスにおける反射率の
更なる変化と試料中の分析物の量とを関連づける。血液
における測定、特にグルコースの測定の場合には、一般
的に、測定媒体として全血液を用いる。マトリックスに
は、過酸化水素を生成するオキシダーゼ酵素が含有され
ている。又、マトリックスには、更に第二酵素、特にペ
ルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼに結合した吸光
生成物を生じる色素系が含有されている。吸光生成物が
反射率シグナルを変化させる。全血液の場合、二つの波
長で読み取りを行うが、そのうちの一つは、ヘマトクリ
ット、血液の酸化や、他の結果に影響を及ぼす変数によ
って生じるバックグラウンドを差し引く為に用いられる
波長での読み取りである。
用いられる試薬要素は、マトリックスとマトリックス
内に含有されるシグナル生成系部材からなっている。
又、この試薬要素には、個々の用途に応じて他の成分を
含有させてもよい。この方法では、一般的に、必要に応
じて行う抗凝固剤以外の前処理をしない少量の血液をマ
トリックスに塗布する必要がある。測定の時間的調節は
装置により行われ、液体がマトリックスに浸透すると、
自動的にマトリックスの反射率の変化を検出する。その
後、反応生成物の生成の結果生じる所定の時間にわたる
反射率の変化を、試料中の分析物の量と関連づける。
本発明において考慮すべき最初の成分は、好ましくは
パッドの形状をしている試薬要素である。この試薬要素
は、不活性の多孔質マトリックスと、分析物と反応して
吸光反応生成物を生成し、多孔質マトリックスの孔中に
浸透することのできるシグナル生成系からなる。このシ
グナル生成系は、マトリックスを通る液体の流れをあま
り妨げないものである。
容易に反射率の読み取りが出来るように、マトリック
スが実質的に滑らかで且つ平らな少なくとも一つの面を
有することが好ましい。一般的には、マトリックスは、
少なくとも一つの滑らかな平らな面を有する薄板状に成
形したものである。使用の際、分析すべき液体試料をこ
の薄板の一つの面に塗布すると、存在する測定物質が、
毛管作用、吸い上げ作用、重力流動作用及び／又は拡散
作用により試薬要素を通って進む。マトリックスに存在
するシグナル生成系が反応し、吸光反応生成物を生じ
る。入射光は、試薬要素の試料を塗布した以外の位置に
当たる。光は、試薬要素の表面から拡散反射光として反
射する。この拡散光を集め、例えば、反射率分光光度計
の検出器で測定する。次に、反射光の量を、通常試料中
の分析物の量の逆関数である試料中の分析物の量と関連
づける。
マトリックス 試薬要素を生成するのに必要な各成分について以下説
明する。まず最初に、マトリックス自体について説明す
る。
マトリックスは、場合により試薬が共有結合あるいは
非共有結合により結合する親水性マトリックスである。
このマトリックスは、水性媒体がそこを通って流れるこ
とのできるものである。又、マトリックスは、タンパク
質成分がタンパク質の生物学的活性、例えば、酵素の酵
素活性にあまり悪影響を与えることなく結合することの
できるものである。マトリックスは、タンパク質が共有
結合する程度に応じて、共有結合の活性部位を有する
か、あるいはこの分野において公知の手段で活性化して
もよい。このマトリックス組成物は、反射性であり、且
つマトリックスからの反射に十分影響を与えることので
きる吸光色素を、空隙部あるいは表面に生成させるに十
分な厚みを有するものである。又、マトリックスは、必
要とされる構造及び物性を与える均一組成物あるいは基
板上に形成した被膜の形態でもよい。
マトリックスは、通常ぬれても変形せず、従って、最
初の形状及び大きさを維持する。又、マトリックスは、
所定の吸収性を有し、吸収容量は適当な限度内に設定さ
れ、吸収容量の差は、通常約50％未満、好ましくは10％
以下に保たれる。このマトリックスは、通常の方法で製
造できる程度に十分な湿潤強度を有するものである。
又、マトリックスは、非共有的に結合した試薬がマトリ
ックス表面に比較的均一に分布できるものである。
マトリックス表面を構成するものの代表例としては、
特に全血液を含有する試料の場合には、ポリアミドが挙
げられる。ポリアミドは、好ましくは炭素数４〜８の単
量体の縮合重合体であり、この場合の単量体は、ラクタ
ム類、あるいはジアミンとカルボン酸の組み合わせから
なるものである。又、これらに匹敵する性質を有する他
の重合組成物も使用することができる。これらのポソア
ミド組成物は、変性して帯電構造を与える他の官能基を
導入し、マトリックス表面を中性、正、あるいは負に帯
電させたり中性、塩基性あるいは酸性状態にしてもよ
い。好ましいマトリックス表面は、正に帯電したもので
ある。
全血液を使用する場合には、好ましくは0.1〜2.0μ
ｍ、より好ましくは0.6〜1.0μｍの平均孔径を有する多
孔質マトリックスが好ましい。
このような多孔質マトリックスを製造する好ましい方
法としては、親水性ポタマーを不織布コアーにキャスト
する方法がある。このコアー繊維は、ポリエステル類及
びポリアミド類などの上記の結合性及び強度を生じる繊
維状物質であればよい。後で詳細に説明する吸光性反応
生成物を生成する試薬は、マトリックスの孔中に存在す
るが、マトリックスを封止せず、分析すべき血液などの
測定媒体の液状部分がマトリックスの孔を通って流れ、
一方、赤血球などの粒子は表面で保持される。
マトリックスは、実質的に反射性のものであり、反射
性基地を用いなくとも拡散反射を生ずる。好ましくは少
なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％のマトリ
ックスへの入射光が反射し、拡散反射として放出される
ものがよい。マトリックスの厚さは、通常約0.5mm未
満、好ましくは約0.01〜0.3mmである。0.1〜0.2mmの厚
さが、特にナイロン製マトリックスの場合には、最も好
ましい。
マトリックスは、必須条件ではないが、一般的に、物
理的形態と剛性を付与するためにホルダーに取りつけら
れる。第１図は、本発明の一態様であり、薄い親水性マ
トリックスパッド11を接着剤13によりプラスチック製ホ
ルダー12の一端に配置する。この接着剤により、試薬パ
ッドは直接且つ堅固にホルダーのハンドルにとりつけら
れる。試薬が試薬パッドの一つの面に塗布され、光が地
面から反射されるように、試薬パッド11が取りつけられ
るプラスチック製ホルダー12の部分に穴14が設けられ
る。
試験されるべき液体試料は、パット11に塗布される。
一般的に、試料が、本発明で用いられる代表例である血
液である場合には、試薬パッドの表面積は、５〜10μｌ
の試料が十分にしみ込む容積でり、約10mm2〜100mm2、
特に好ましくは10mm2〜50mm2のオーダーである。
従来技術では、拡散反射率測定を、反射性裏地をマト
リックスに取りつけるか、あるいはマトリックスの裏面
に配置して行ってきた。しかしながら、本発明の実施に
あたっては、試薬要素の一部分としてでも、そのような
裏地は必要とせず通常は配置しない。
第１図からわかるように、支持体に試薬パッド11が保
持され、試料が試薬パッドの一つの面に塗布され、ま
た、光の反射率が試薬を塗布した位置と逆の試薬パッド
の面から測定されるようになっている。
第２図は、裏のハンドルに穴がある面に試料を塗布
し、一方、試薬パッドの他面で光を反射させ測定するシ
ステムを示す。これに関連して、図に示したもの以外の
構造のものを用いてもよい。パッドは、図示したように
照らされる種々の形状及び形態のものであってもよい。
このパッドは、少なくとも一表面、通常は二表面上で近
接できる。
親水性層（試薬要素）は、従来のいずれの手段、例え
ば、ホルダー、クランプあるいは接着剤で支持体に取り
つけることができる。しかしながら、裏地に接着するが
好ましい。この接着は、非反応性接着剤を用いて、親水
性層に用いている材料の一部を取り込むに十分な程度に
裏地表面を融解させる熱的方法、あるいは同様に親水性
試料パッドを融解して裏地と一体にするマイクロ波又は
超音波接着法により行うことができる。これに関連し
て、読み取りを行う位置では接着剤の必要性がないので
このようなことが起こりそうにないが、上記の接着それ
自体が拡散反射率の測定あるいは測定すべき反応を実質
的に妨害しないように行うことが重要である。例えば、
接着剤13を裏地ストリップ12に塗布し、その後、まず穴
14をストリップと接着剤との結合体にあけ、その後、試
薬パッド11を、穴14に近接した接着剤に貼り付けて、試
薬パッドの周囲部分が裏地ストリップに結合するように
することができる。
化学試薬 シグナル生成系としては、試料中の分析物と反応し、
測定媒体が十分な吸収を示す波長以外の波長で特徴的な
吸収を示す化合物を直接的ないしは間接的に生成するこ
とのできるものであればいずれのものも用いることがで
きる。基質（分析物）が酸素を利用するオキシターゼ酵
素と反応するような反応方法を実施するには、ポリアミ
ドマトリックスが特に有効である。これらの反応におい
ては、生ずる生成物が、更に色素中間体と反応し所定の
範囲の波長を吸収する色素を、直接的あるいは間接的に
生成する。例えば、オキシターゼ酵素が基質を酸化し、
反応生成物として酸化水素を生ずる。次に、この過酸化
水素を触媒反応あるいは非触媒反応において、色素中間
体ないしは色素前駆体と反応させ、この中間体ないしは
前駆体の酸化体が着色生成物を生成したり、又は第２前
駆体と反応して最終色素を形成する場合もある。
分析物及び代表的試薬の例としては、次に示す物質を
挙げることができるが、本発明は、これらのものに限定
されるものではない。
備考：下記に示す文献に記載のものが用いられる。
（１） クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemist
ry）、リヒテリヒ及びコロンボ（Lichterich and Colum
bo）、第367頁に記載のもの及びそこに引用されている
文献に記載のもの （２） アナリスト（Analyst）、97（1972）142−５ （３） アナル・バイオケム（Anal.Biochem）、105（1
980）389-397 （４） アナル・バイオケム（Anal.Biochem）、79（19
77）597-601 （５） クリニカ・ケミカ・アクタ（Clinica Chemica
Acta）、75（1977）387-391 分析方法 本発明の分析方法は、拡散反射率により測定したとき
の吸光度の変化に基づくものであり、この変化は、測定
すべき試料中に存在する分析物の量に依存する。又、こ
の変化は、時間をおいて２回以上測定した場合の分析試
料の吸光度の変化を測定することにより定量することが
できる。
測定において考慮すべき最初の工程は、マトリックス
への試料の塗布である。実施に当たっては、分析を次の
ように行うことができる。まず、分析物を含有する水性
流体の試料を得る。血液の場合には、例えば、フィンガ
ー・スティック（finger stick）により得ることができ
る。マトリックスの反射率を測定する部分を浸潤するに
必要な量以上のこの流体（即ち、約５〜10μｌ）を試料
要素あるいは試験装置の要素に塗布する。この際、下記
より明らかなように、従来技術において一般的に必要と
されているような、同時にタイマーを始動することは必
要ない。流体の過剰分は、軽く吸い取って除去すること
ができるが、このような除去も必ずしも必要ない。試験
装置は、一般に、試料の塗布に先立ち、吸光度、例え
ば、反射率による発色強度読み取り用機器の中に取りつ
けられる。試料の塗布後ある時点で吸光度を測定する。
本明細書において「吸光度」とは、単に可視波長範囲内
の光のみではてく、赤外線や紫外線などの可視波長範囲
外の光にも当てはまる。これらの吸光度測定値から、発
色率を検定して分析物濃度を求めることが出来る。
測定機器 適当なソフトウェアを搭載した拡散反射率吸光光度計
などの好ましい機器では、ある所定の時間に反射率を読
み取り、反射率の変化率を計算し、アッセイ要因を用い
て、水性流体中の分析物の濃度を自動的に出力する。こ
のような装置の略図を第２図に示す。第２図には、裏地
12とそこに貼られている試薬パッド11から構成される本
発明の試験装置を示す。光源14、例えば、高強度発光ダ
イオード（LED）により試薬パッド上に光線が投射され
る。この光のかなりの部分が反応生成物の不存在下にお
いて（少なくとも25％、好ましくは少なくとも35％、よ
り好ましくは少なくとも50％）試薬パッドから拡散して
反射され、光検出器15、例えば、受ける光に比例した出
力電流を生じるホトトランジスタにより検出される。必
要に応じて、光源14及び／又は検出器15が特定の波長光
を発生したり、それに応答したりするようにすることが
できる。検出器15の出力が、増幅器16、例えば、ホトト
ランジスタ電流を電圧に変換するリニアICへ供給され
る。増幅器16の出力が軌道・保持回路17に供給される。
この回路は、増幅器16からのアナログ電圧を追跡し、マ
イクロプロセッサ20からの指令を受けると、その時のレ
ベルで電圧を固定し保持する。アナログ・ディジタル変
換器19は、軌道保持回路17からのアナログ電圧を捕ら
え、マイクロプロセッサ20の指令を受けるとそれを、例
えば、12ビットの２進ディジタル数に変換する。マイク
ロプロセッサ20は、ディジタル集積回路でよい。これ
は、次のような制御機能を行う:1）システム全体の時間
調節;2）アナログ／ディジタル変換器19の出力の読み取
り;3）プログラム・アンド・データメモリ21とともに、
所定の時間間隔で測定される反射率に対応するデータを
記憶する;4）記憶した反射率から分析物濃度を計算す
る；及び５）分析物濃度のデータを表示装置22に出力す
る。メモリ21は、データ及びマイクロプロセッサ操作プ
ログラムを記憶するディジタル集積回路でよい。報告装
置22は、種々の形態のハードコピー及びソフトコピーを
とることができる。通常は、この装置は液晶あるいは発
光ダイオード表示装置などの視覚的表示装置であるが、
テーププリンター、可聴信号などあってもよい。又、こ
の機器に、必要に応じて、始動・停止スイッチをつけた
り、試料塗布、読み取りなどの時間を示す可聴あるいは
可視時間出力を出すようにしてもよい。
反射率切り換え装置 本発明において、試薬パッドに塗布した懸濁液の水性
部分（例えば、血液）が反射率を測定するパッド表面に
移動した時に生ずる反射率の降下を測定することによ
り、反射率回路自体を、計時を開始するのに使用するこ
とができる。一般的には、測定 装置は「レディ」モー
ドで始動し、一般的にオフホワイトの実質的に乾燥状態
にある未反応試薬ストリップからの反射率を近接した時
間間隔（一般的に約0.2秒）で自動的に読み取る。最初
の測定は、通常、分析すべき流体がマトリックスに浸透
する前であって、且つ流体を試薬要素の反射率を測定す
る以外の位置に塗布した後に行われる。得られる反射率
の値は、マイクロプロセッサで評価される。この際、一
般に、連続したデータをメモリに記憶し、その後各値を
最初の未反応の値と比較して評価が行われる。水溶液が
試薬マトリックスに浸透すると、反射率の降下により測
定時間間隔の開始の信号が送られる。５〜50％、一般に
は約10％の反射率の降下により計時が開始されるように
なっている。このような簡便な方法により、使用者が何
ら操作を行わなくても、測定媒体が反射率測定が行われ
る表面への到達時と一連の読み取りの開始時との正確な
同調がなされる。
本明細書に述べられているシステムが、特にポリアミド
マトリックスを使用した物と、このようなマトリックス
をグルコース及び他の生物由来物質などの種々の糖の濃
度の定量に使用したものに向けられているが、本発明の
反射率切り換え装置はこれらのものに何ら限定されるも
のではない。例えば、反射率切り換え装置で用いられる
マトリックスは、水不溶性の親水性物質のいずれから形
成してもよく、又、このシステムを他の反射率アッセイ
に用いてもよい。
グルコースアッセイへの特定の利用 赤血球の存在下におけるグルコースの検出に関する特
定な一例を以下に示し、本発明を詳細に説明するととも
に、その特有の利点について説明する。以下の例は、本
発明の好ましい一態様であるが、本発明は、血中のグル
コースの検出に限定されるものではない。
試薬要素の形成にポリアミド表面を用いると、本発明
における多数の好ましい特性が得られる。即ち、試薬が
親水性あり（つまり、試薬及び試料を容易に吸収す
る）、ぬれても変形せず（従って、反射率読み取りに適
した平らな表面である）、酵素と相溶性があり（良好な
保存性を付与するのに必要である）、膜の単位容積当た
りの試料吸収容量が限定されており（大きなダイナミッ
クレンジで測定値を表すのに必要である）、及び通常の
方法で製造できるに十分な湿潤強度を示す。
一般的な構成では、この方法は、プラスチック製ホル
ダー及び試薬要素（シグナル生成系を含浸させたマトリ
ックス）からなる装置を用いて行われる。試薬要素を製
造用として好ましく用いられるマトリックスとしては、
ナイロン製精密濾過膜、特に、ポリエステルの不織布繊
維のコアーにナイロン66をキャストして製造した膜を挙
げることが出来る。この種のナイロン製精密濾過膜で平
均孔径が0.1〜3.0μｍのものが非常に数多くポール・ウ
ルトラファイン・フィルトレーション・コーポレーショ
ン（Pall Ultrafine Filtration Corporation）から市
販されている。これらの材料は、高強度を示し、且つ水
に暴露したり、急速にぬらしても良好な柔軟性及び寸法
安定性を示す。
ナイロンの特定の化学構造を変えた種々のものも使用
可能である。これらのものとしては、例えば、帯電した
末端基を有する非官能性ナイロン66〔ポール・ウルトラ
ファイン・フィルトレーション・コーポレーション（以
下「ポール社」と称する）によりアルチポーア（Ultipo
re）の商標で販売されている〕が挙げられる。正の電荷
ではpH6未満となり、一方負の電荷ではpH6以上となる。
他の膜の場合、膜生成に先立ち、ナイロンに官能基を導
入し、膜に異なった特性を付与する場合もある。カルボ
キシ基により官能性を付与したナイロン〔ポール社によ
り「カルボキシジオン（Carboxydyne）」として販売さ
れている〕の場合、広いpH範囲にわたって負に帯電す
る。又、ナイロンの表面を高密度の正に帯電した基、一
般的には第４級アミン基により官能性を付与することも
でき〔ポール社により「ポシジン（Posidyne）」として
販売されている〕、その場合、広いpH範囲にわたってほ
とんど電荷の変化を示さない。このような材料は、本発
明を実施するのに特に適している。又、タンパク質を共
有的に固定出来るように設計された反応性官能基を有す
る膜〔ポール社によりバイオジン・イムノ・アフィニテ
ィ・メンブレン（Biodyne Immuno Affinity membrane）
として販売されている〕を使用することもできる。この
ような材料は、試薬として使用するタンパク質、例え
ば、酵素を共有結合するのに用いることができる。これ
らの材料は全て使用可能であるが、正に帯電した高密度
の基を表面に有するナイロンを使用すると、乾燥試薬パ
ッドに形成した時に最も優れた安定性が得られる。非官
能性ナイロンが次に安定性に優れ、カルボキシ化ナイロ
ンがその次に安定性に優れている。
全血液の分析に用いる場合には、約0.2〜2.0μｍの範
囲、好ましくは約0.5〜1.2μｍの範囲、最も好ましくは
約0.8μｍの孔径を有するものから所望の結果が得られ
る。
試薬要素を取り付けるハンドルの形状については、あ
まり重要ではなく、試料が試薬要素の一面にアクセスで
き、又、反射率を測定する入射光が試薬要素の他面のア
クセスできればよい。又、ハンドルは、試薬要素を光学
系と位置合わせして吸光度測定装置に挿入するのに役立
つ。好ましいハンドルの一例として3M465あるいはY9460
転写接着剤などの転写接着剤を塗布したマイラーあるい
は他のプラスチックストリップが挙げられる。転写接着
剤を介してプラスチックに穴をあける。次に、一般的に
薄いパッドの形状をしており、試薬を含有しているか、
あるいは後で試薬を添加する試薬要素を転写接着剤によ
り貼り付ける。この際試薬要素は、ハンドルにおけるハ
ンドルと転写接着剤を貫通して形成した穴の周囲の部分
にしっかりと取りつける。このような装置を第１図に示
す。第１図は、接着剤13によりマイラー製ハンドル12に
取り付けた試薬パッド11を示す。穴14により、試料ある
いは入射光が試薬パッドの一面にアクセスできるととも
に、試薬パッドの他面へのアクセスも自由である。試薬
パッド及びハンドルに関する全ての寸法は、試薬パッド
が、反射率読み取り機器の光源及び反射光検出器に近接
した位置にしっかりとはめ込めるように選択する。
ナイロンマトリックスが試薬パッドを形成するのに用
いられ、上記した厚さで使用する場合には、試薬パッド
をホルダーで支持する際、試料を塗布し光の反射率を測
定する位置において、ホルダーによって支持されていな
い部分がいずれの方向でも6mm以下であることが好まし
い。支持されていない部分が、それ以上であると、膜の
寸法安定性が不十分となり、膜表面での反射率測定に悪
影響を及ぼす傾向がある。第１図に示すような試薬スト
リップにおいて、穴14の直径が5mmの場合、非常によい
結果が得られる。このような穴の最小直径については特
に限定はないが、製造、試料塗布及び光の反射率の読み
取りの容易性の面で、直径が少なくとも2mm以上である
ことが好ましい。
種々の色素がインジケータとして使用することができ
るが、その選択は、試料の性質による。アッセイ媒体と
して全血液を用いたり、あるいは他のアッセイ媒体を用
いて溶液中の不純物を分析するような場合には、赤血球
が光を吸収する波長とは異なる波長で吸収性を有する色
素を選択するのが好ましい。MBTH-DMAB色素カップル
（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸
塩と３−ジメチルアミノ安息香酸）は、酵素イムノアッ
セイにおけるペルオキシダーゼ標識用の発色に適してい
ることが以前に記載されたことがあるが、商業的なグル
コース測定試薬においては使用されていなかった。しか
しながら、この色素カップルは、従来グルコース測定に
用いられていたベンジジン誘導体などの色素に比較し
て、ダイナミックレンジが大きいだけでなく酵素安定性
の面でも優れている。更に、MBTH-DMAB色素カップル
が、ベンジジン誘導体のほとんどに特有の発がん性がな
い。
グルコースの測定に用いることのできる他の色素カッ
プルとしては、AAP-CTA（４−アミノアンチピリンとク
ロモトロープ酸）カップルがある。このカップルは、MB
TH-DMABほどダイナミックレンジは広くないが、安定で
あり、グルコースを測定する場合における本発明の実施
に用いるのに適している。更に、AAP-CTA色素カップル
は、より広く用いられているベンジジン色素よりもダイ
ナミックレンジが大きく且つ酵素活性の安定性に優れて
いる。
MBTH-DMABカップルを使用すると、血液のヘマトクリ
ット及び酵素化度についての補正がただひとつの補正率
で可能となる。より一般的に用いられているベンジジン
色素の場合には、そのような補正はできない。上記色素
は、約635nmで吸収を示すが、700nmでは大きな吸収を示
さない発色団を生成する。測定波長がわずかに変化（±
約10nm）してもかまわない。700nmで血液の色を測定す
ることで、ヘマトクリット及び酸素化度の両方が、測定
できる。更に、635nm及び700nm両方での測定用の発光ダ
イオード（LED）が市販されており、簡単に装置の量産
ができる。上述した好ましい孔径を有する膜を用い、且
つ必要な試薬配合を行うことにより、ヘマトクリット及
び酸素化の作用の両方が、700nmの単一波長で測定する
ことにより補正できる。
次に示す更に２つの条件により、ポリアミドマトリッ
クスについてのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダ
ーゼ配合物の安定性及び保存性の面で特に向上が見られ
ることが判明した。これらの条件とは、ひとつは、pH値
を3.8〜5.0、好ましくは3.8〜4.3最も好ましくは4.0と
することであり、もうひとつは、試薬をマトリックスに
塗布する際、高濃度緩衝液を用いることである。これに
関して、10重量％クエン酸塩緩衝液が最も効果があり、
５〜15％の濃度で有効であることがわかった。これら
は、試薬がマトリックスに塗布される際の緩衝液の重量
／容積百分率である。他の緩衝液の重量／容積百分率で
ある。他の緩衝液も上記と同様の重量／容積百分率基準
で用いることができる。低いpH、好ましくは約pH4でMBT
H-DMAB色素系を用い、且つ塗布溶液1ml当たり約500〜10
00単位（Ｕ）の高酵素濃度の場合に最も優れた安定性が
得られる。
MBTH-DMAB試薬及びシグナル生成系の残部である酵素
系を調製する際、下記に示す容積及び比率により良好な
結果が得られるけれども、正確にそれらの値を維持する
必要はない。グルコースオキシダーゼが溶液中に約27〜
54容積％で存在し、ペルオキシダーゼが約2.7〜5.4mg/m
lの濃度で存在し、MBTHが約４〜8mg/mlの濃度で存在
し、且つDMABが約８〜16mg/mlの濃度で存在するときに
は、試薬は容易にマトリックスパッドにより吸収され
る。DMAB-MBTHの重量比は、好ましくは（１〜４）:1、
好ましくは約（1.5〜2.5）:1、最も好ましくは約2:1に
維持される。
試薬要素の基本的な製造方法は、一度確立されると、
容易である。膜自体は丈夫で安定であり、好ましい態様
であるナイロン膜を用いた場合には、特にそのことが言
える。試薬塗布には二種の溶液が必要なだけであり、こ
れらの溶液は、両方とも容易に配合され、且つ安定であ
る。第一の溶液には一般に色素成分が含有され、一方、
第二溶液には一般に酵素が含有される。MBTH-DMAB色素
カップルを用いる場合、例えば、個々の色素を有機溶媒
水溶液、一般に、アセトニトリルと水との1:1混合物に
溶解する。マトリックスを溶液に浸漬し、液体の過剰分
を吸い取って除去し、その後マトリックスを一般に50〜
60℃で10〜20分間乾燥する。次に色素含有マトリックス
を酵素を含有する水溶液に浸漬する。配合物の一般的な
ものとしては、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシ
ダーゼ酵素の他に所望の緩衝液、防腐剤、安定剤等を含
有したものが挙げられる。マトリックスから液体の過剰
分を吸い取り、前記のようにして乾燥する。グルコース
試薬の代表的配合例を下記に示す。
色素の浸漬 下記の試薬を混合する。
MBTH 40mg DMAB 80mg アセトニトリル 5ml 水 5ml 全ての固体が溶解するまで攪拌し、ガラス板あるいは他
の平らな表面にそそぐ。ポシジン（Posidyne）膜（ポー
ル社製）の一片を浸漬し、液体の過剰分を吸い取り、そ
の後56℃で15分間乾燥する。
酵素の浸漬 下記の試薬を混合する。
水 6ml EDTAの二ナトリウム塩 10mg 低粘性ポリペプ（PolyPep）（シグマ社製） 200mg クエン酸ナトリウム 0.668g クエン酸 0.523g ６重量％ガントレッツ（Gantrez）AN-139水溶液〔ジー
・エイ・エフ（GAF）社製〕 2.0ml セイヨウワサビペルオキシターゼ（100単位/ml） 3.0ml グルコースオキシダーゼ（2000単位/ml） 3.0ml 全ての固体が溶解するまで攪拌し、ガラス板あるいは他
の平らな表面にそそぐ。上記において色素で浸漬した膜
を浸漬し、液体の過剰分を吸い取り、その後56℃で15分
間乾燥する。
反射率の読み取りを行うのに使用する電子装置には、少
なくとも、光源、反射率検出器、増幅器、アナログ・デ
ィジタル変換器、メモリ、及びプログラムを搭載したマ
イクロプロセッサ及び表示装置が内蔵されている。
光源は、一般には、発光ダイオード（LED）から構成
されている。多色光源、及び二つの異なる波長で測定す
ることのできる光検出器を使用することは可能である
が、装置が、二つのLED源あるいは二つの異なる波長の
光を放出することのできる一個のダイオードを内蔵して
いることが好ましい。本明細書において、好ましい波長
として記載されている波長を生ずる市販のLEDとして
は、例えば、最大発光波長が635nmであるヒューレット
パッカード（Hewlet Packard）HLMP-1340及び最大強帯
域発光波長が700nmであるヒューレットパッカードQEMT-
1045が挙げられる。好ましい市販の光検出器としては、
例えば、浜松（Hammamatsu）5874-18K及びリトロニクス
（Litronix）BPX-65が挙げられる。
他の方法でも測定可能であるが、下記の方法により好
ましい結果が得られる。即ち、計時開始後、所定の時間
間隔で光検出器により読み取りを行う。635nmLEDは、反
射率切り換え装置により示される開始時間約20秒後に始
まる短い測定時間スパンの間だけ作動させる。もしこの
読み取りにおいて、試料中に高濃度のグルコースが存在
することが示された場合には、30秒の読み取りを行い、
その結果を最終の計算に用いて精度を向上させる。一般
的には、約250mg/dl以上の場合に高濃度であるとみな
す。測定時間の開始約15秒後に700nmで読み取りを行
い、バックグラウンドの補正を行う。適当なLEDを通常
１秒未満作動させながら、光検出器からの読み取り値を
その間隔で記録する。信号が増幅され、ディジタル信号
に変換した後、反射率の生の読み取り値をマイクロプロ
セッサによる計算に用いる。多くのマイクロプロセッサ
をこの計算に用いることができるが、ロックウェルイン
ターナショナル社製のシングルボードマイクロコンピュ
ータAIM 65が満足のいくものであることがわかった。本
発明の方法及び装置により、手順を非常に簡単にするこ
とが出来るとともに、使用者側の操作工程を最少にする
ことができる。使用に際して、試薬ストリップを、スト
リップの穴と検出系の光学素子とを位置合わせするよう
にして検出器中に配置する。取り外し可能なキャップな
どのカバーを、光学素子及びストリップにかぶせ、組立
品を周囲光から遮蔽する。その後、測定装置上のボタン
を押して測定シーケンスを開始し、マイクロコンピュー
タを作動させて、Rdry読み取りと称する未反応試薬パッ
ドからの反射光の測定を行う。次に、キャップを外し、
一滴の血液を試薬パッドに塗布するとともに、一般に、
試薬パッドを光学素子及び読み取り装置と位置合わせす
る。この際、試薬ストリップを光学素子と正確に重ね合
わせておくことが、操作を最少にする上で好ましい。血
液などの試料が塗布されたことは、試料が、マトリック
スを通過し、反射光を反対側で測定したときの反射率が
減少するので、測定器により検知されることができる。
反射率の減少があったときは、本明細書の他の部分にお
いて詳細に説明してあるタイムシーケンスを開始する。
測定すべき試料の種類にもよるが、カバーは、試料塗布
後15秒以内に置かなければならない。血液試料中のグル
コース濃度の測定の場合、一般に、血液を塗布してから
約30秒後の結果が表示される。これに関して、試料中の
グルコース濃度が250mg/dl未満の場合には、20秒の反応
であってもよい。測定試料が、他のものである場合に
は、結果を表示する時点は、それぞれ異なってもよく、
選択される試薬／試料の組み合わせの特性から容易に決
定することができる。
バックグラウンド電流、即ち、作動しているが試薬パ
ッドからの反射光がない状態ので光検出器からの電流を
用いて、バックグラウンドの補正を行い、グルコース濃
度（あるいは他の測定すべき分析物）の特に正確な評価
を行うことができる。本発明の好ましい態様に準じて製
造した特定の測定器の場合には、２〜３ヵ月の期間にお
いても、この値は変化せず、従って、このバックグラウ
ンドの読み取り値を定数としてコンピュータメモリにプ
ログラムすることが可能であることがわかった。しかし
ながら、この方法をわずかに変更することにより、各分
析でこの値を測定し、より正確な結果を得ることができ
る。変法では、試料ストリップを所定の位置に置く前
に、蓋を閉めた状態で測定器のスイッチを入れ、バック
グラウンド電流を測定する。その後、カバーを閉めた状
態で試料ストリップを測定器中に挿入し、Rdry測定を行
い、その後、前記の操作を継続する。この変法では、バ
ックグラウンド電流は、測定器の寿命を通して安定であ
る必要はなく、従って、より正確な結果が得られる。グ
ルコースアッセイの結果を計算するのに必要な生データ
は、前記のバックグラウンド反射率として報告されるバ
ックグラウンド電流、Rb、前記の未反応試験ストリップ
の読み取り値、Rdry、及び終点の測定値である。本明細
書に記載の好ましい態様を用いた場合、終点はあまり安
定ではなく、最初の血液塗布から正確に計時しなければ
ならない。しかしながら、ここに述べる測定器では、こ
の計時を自動的に行う。250mg/dl未満のグルコース濃度
の場合、20秒以内で十分に安定な終点に達し、最終反射
率、R20、が測定される。又、450mg/dl以下のグルコー
ス濃度の場合には、30秒での反射率の読み取り、R30、
が適している。ここに述べるシステムでは、最大800mg/
dl迄のグルコース濃度では、明瞭な表示が可能である
が、450mg/dlを越える濃度では、重大な問題を生じるほ
どではないが、いくらかノイズが多くなり不正確にな
る。このようにグルコース濃度が高い場合には、反応時
間を長くすることで、読み取り値の精度が良くなる。二
波長測定用の700nmでの反射率の読み取りは、一般に、1
5秒（R15）で行われる。この時までに、血液は、完全に
試薬パッドにしみ込む。15秒以上の間色素反応は継続
し、少しだけ700nmでの読み取りで検知される。従っ
て、700nmでの色素の吸収信号は、悪影響を及ぼすの
で、15秒を越える場合の読み取り値は、計算では無視さ
れる。
前記の生データは、反射率測定値よりも容易に視覚化
できる、グルコース濃度に比例するパラメータを計算す
るのに用いられる。必要に応じて、透過率分光分析法
（ベールの法則）における吸光係数と分析物濃度との関
係に類似した、反射率の対数変換を用いることができ
る。即ち、反射率分光分析法に関して具体的に導き出し
たクベルカ・モンクの式の簡略化したものが、特に有効
であることが判明した。式１により定義される導関数K/
Sが、分析物濃度に関連する。
K/S−ｔ＝（１−Ｒ＊ｔ）2／（2xR＊ｔ） （１） 但し、Ｒ＊ｔは、特定の終点時、ｔ、に測定された反
射能であり、式２に述べる入射光線の吸収率である。
Ｒ＊ｔ＝（Rt−Rb）／（Rdry−Rb） （２） 但し、Rtは終点時の反射率、R20又はR30である。
Ｒ＊ｔは、反射光が無い場合のゼロ（Rb）から全反射
光の場合の１（Rdry）の範囲で変化する。計算に反射能
を用いると、高度に安定な光源及び検出回路が不必要と
なるので、測定器の設計が非常に簡単になる。この理由
は、これらの成分は、Rdry及びRbの測定により制御でき
るからである。
単一波長読み取り値K/Sは、20秒（K/S-20）又は30秒
（K/S-30）で計算できる。これらのパラメータをYSI
〔イエロー・スプリングス・インストルメンツ（Yellow
Spring Instruments）〕グルコース測定値と関連づけ
る検量線は、式３の３次多項式によって明確に表すこと
ができる。
YSI=a0+a1(K/S)+a2(K/S)2+a3(K/S)3 （３） これらの多項式の係数を表１に示す。
表１ 単一波長検量線の３次多項式適合係数 K/S-20 K/S-30 a0 −55.75 −55.25 a1 ０・1632 ０・1334 a2 −5.765×10-5 −2.241×10-5 a3 2.58×10-8 1.20×10-8 好ましい態様において測定される単一化学種は、MBTH
-DMABインダミン色素であり、分析されるマトリックス
複合体は、0.8μｍのポシジン（Posidyne membrane）に
分布した全血液である。
シーアールシー・クリティカル・レビューズ・イン・フ
ード・サイエンス・アンド・ニュートリション（CRC Cr
itical Reviews in Food Science and Nutrition）、18
（３）203-30（1983）に記載されている「アプリケーシ
ョン・オブ・ニア・インフラ・レッド・スペクトロフォ
トメトリー・トゥ・ザ・ノンデストラクティブ・アナリ
シス・オブ・フーズ（Application of Near Infra Red
Spectrophotometry to the Nondestructive Analysis o
f Foods）：ア．レビュー・オブエクスペリメンタル・
リザルス（A Review of Experimental Results）」と題
した報告では、光学密度差Δ0D（λa−λb）の測定を基
盤とした測定器の使用についての記録がある。ここで、
0Dλaは、測定すべき成分の最大吸収に相当する波長の
光学密度であり、0Dλbは、該成分があまり吸収を示さ
ない波長の光学密度である。
二波長測定の場合の計算法は、当然のことながら、単
一波長測定の場合よりも複雑であるが、はるかに効果的
である。700nmの読み取りによっておこなう第１次補正
により、血液に起因するバックグラウンド色を差し引
く。この補正を行ために、血液の色に起因する635nmと7
00nmでの吸光度の間の関係が、広範囲の血液の色にわた
って、グルコースを含まない血液試料を測定して求め
た。この色の範囲は、ヘマトクリットを変化させて作り
出したところ、かなりの直線関係が観察された。これら
の直線より、700nmのK/S-15を標準化して、635nmのK/S-
30と等価にした。この関係を式４に示すが、ここでK/S-
15nは標準化した700nmのK/S-15である。
K/S-15n＝（K/S-15×1.54）−0.133 （４） これに関連して、標準化した700nmの信号と635nmの信
号の等価性は、グルコース濃度がゼロの時のみにあては
まることに留意しなければまらない。検量線を作成する
ための式が式５及び式６により示される。
K/S-20/15＝（K/S-20）−（K/S-15n） （５） K/S-30/15＝（K/S-30）−（K/S-15n） （６） これらの曲線は第４次多項式に最もよく適合しており、
K/Sにおける第４次項を式３に追加したものに類似して
いる。これらの式に関する、コンピュータに適合した係
数を表２に示す。
表２ 二波長検量線の第４次多項式適合用係数 K/S-20/15 K/S-30/15 a0 −0.1388 1.099 a1 0.1064 0.05235 a2 6.259×10-5 1.229×10-4 a3 −6.12×10-8 −5.83×10-8 a4 3.21×10-11 1.30×10-11 クロマトグラフィー効果に起因する誤差を排除するた
めの第２次補正の方法も開発された。ヘマトクリットの
低い試料は、同様の635nmの読み取り値を有するヘマト
クリットの高い試料に比較して、700nmの読み取り値が
低い特徴を有している。（K/S-30）／（K/S-15）の比
を、広範囲のヘマトクリット及びグルコース濃度にわた
って、K/S-30に対してプロットすると、得られるグラフ
の線が、クロマトグラフィー効果を示す試料（曲線より
上）と示さない試料（曲線より下）との間の境界を示し
ている。曲線より上の試料の場合のK/S-30は、同様の
（K/S-30）／（K/S-15）比を有する曲線上の点に一致す
るまで読み取り値を上昇させて補正する。
上記の補正率は、ひとつの測定器を種々の配合物に適
合させるようにしたものであった。この計算方法は、個
々の測定器及び試薬ごとに、上記と同様の方法により最
適化することができる。
要するに、本発明のシステムにより、オペレータの動
作をできる限り少なくでき、従来の反射率読み取り法に
対して多数の利点がある。例えば、血中のグルコースを
定量する場合について、従来法と比較した場合、次のよ
うな明らかな利点がいくつかある。まず、薄い試薬パッ
ドにしみ込ますために必要な試料の量が少なくてすむ
（一般に５〜10μｌ）。第２に、オペレータに必要な時
間は、試料を薄い親水性層に塗布するのに要する時間と
ふたを閉めるのに要する時間だけである（一般に４〜７
秒）。第３に、同時に計時する必要がない。第４に、全
血を使用することができる。すなわち、本発明の方法で
は、赤血球の分離あるいは赤血球を含まない試料を使用
する必要がなく、更に、他の着色の程度の大きい試料も
使用できる。
又、全血液について本発明を実施すると、いくつかの
予期できない利点が生じる。即ち、通常、水溶液（血液
のような）は、親水性膜に浸透し、膜の反対側に液層を
生じ、従って、表面が反射率測定には適さないものとな
る。しかしながら、血中の赤血球及びタンパク質とマト
リックスとの明らかな相互作用により、血液はポリアミ
ドマトリックスを湿潤させるが、過剰の液体が多孔質マ
トリックスに浸透せず、従って、このマトリックスの反
対側での反射率の読み取りを防害しないことを見い出し
た。
更に、本発明において使用される薄膜は、湿潤すると
光を透過し、反射率測定装置に反射するのは弱い信号の
みであると考えられる。一方、従来、光を十分に反射さ
せるために、マトリックスの裏面に反射層を設けること
が必要であると一般に考えられていた。他の場合には、
測色に先立ち、試薬パッドの裏面に白色パッドを配置し
ていた。本発明においては、反射層も白色パッドを必要
としない。実際上、本発明は、一般的には、入射光がマ
トリックスに衝突する時には試薬要素の裏面に吸光性表
面が存在する状態で実施される。試薬要素の裏面の吸光
性表面と二つの異なる波長での反射率の測定との組み合
わせの採用により、マトリックスから液体の過剰分を除
去しなくとも満足のいく反射率の測定がなされ、従っ
て、従来の方法では必要とされていた工程をなくするこ
とができる。
〔実施例〕
本発明を一般的な観点から説明したが、本発明は、以
下に示す具体的な実施例により、更によく理解できるで
あろう。しかしながら、以下に示す実施例は、本発明を
説明する目的のみで述べるものであり、特記のない限
り、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ 再現性 一人の男性の血液試料（JG、ヘマトクリット＝45）を
用いて、表３〜５に示す再現性に関するデータを得た。
血液をアリコートに分けて、グルコースが25〜800mg/dl
の範囲で含有するようにした。500個のストリップ試料
（ロットNo.FJ4-49B）からランダムに取ったストリップ
での各グルコースレベルで、測定を20回づつ行った。こ
の試験の結果、次のような理論が得られた。
1.単一波長と二波長の比較：二波長の場合 30秒でC.V.値は3.7％であったのに対し、単一波長の場
合は30秒でC.V.値は48％であり、25〜810mg/dlのグルコ
ース濃度範囲で23％の向上が見られた。又、25〜326mg/
dlのグルコース濃度範囲では、C.V.値が33％向上した。
この時、C.V.値が5.4％から3.6％に減少し、使用したグ
ルコース濃度範囲において、顕著な向上が見られた。二
波長20秒の場合も、25〜325mg/dlの範囲における単一波
長測定に比較して、C.V.値において同様の向上が見られ
た（表３及び表４参照）。
2.二波長における20秒と30秒との比較:25〜100mg/dlの
範囲において得られた20秒の場合の平均C.V.値は4.2％
であり、30秒の場合の読み取り値4.1％とほぼ同じであ
った。しかしながら、326mg/dlにおいて、30秒の読み取
り値が2.1％のC.V.であったのに対し、20秒の場合C.V.
値は4.5％であった。K/S-20応答曲線から明らかなよう
に、250mg/dlを越えると勾配が急激に減少し始める。こ
のため、20秒の場合、300mg/dlを越えるグルコース濃度
での再現性が悪い。この再現性のデータから、20秒の場
合のカットオフ（cutoff）値が100mg/dlと326mg/dlの間
にあることがわかる。後述する実施例２における回復性
についての検討の結果から、カットオフ値が250mg/dlで
あることがわかった。
3.口径の大きさ：上述したように、3.0mm（５−0min.）
の小口径光学素子について検討した。10回反復して手動
浸漬した円板状試料を用いて行った最初の実験では、3.
0mmの口径の場合、C.V.値の向上が見られた。これは明
らかに、光学系との位置合わせが容易であることによる
ものである。しかしながら、機械で作製したロール膜を
使用した時、4.7mmの大きな口径の場合の平均C.V.値
（表５）は、上述したように3.9％であり、一方、口径
3.0mmの場合の平均C.V.値は5.1％であった。このC.V.値
における30％の増加は、下記において述べるように、ロ
ール膜の表面がでこぼこしていたためと思われる。
実施例２ 回復性：本発明の方法（MPX）とイエロー・スプリング
ス・インストルメント社（Yellow Springs Instrument
Co.）（オハイオ州イエロースプリングス）製のイエロ
ー・スプリングス・インストルメント23A型グルコース
アナライザーを用いる代表的な従来方法とを比較するた
めに、36人の献血者の血液を試験した。献血者の人数は
男性と女性が同数であり、又、血液のヘマトクリット値
は35〜55％の範囲であった。血液試料は採血後30時間以
内に、抗凝血剤としてのリチウムヘパリンとともに使用
した。各血液試料をアルコートに分け、グルコース濃度
０−700mg/dlの範囲となるようにして152の分析試料を
調製した。各試料２回づつ試験を行い、合計で304のデ
ータを得た。
これらのデータから応答曲線を作製し、その後、適当
な式を用いて計算した（表１及び表２）。これらのMPX
のグルコース値をYSI値に対してプロットし、散点図を
作製した。
MPX系の比較:20秒及び30秒の測定時間の両方の場合にお
いて、単一波長散点図の方が二波長散点図よりも目で見
たところではバラツキが大きかった。20秒での読み取り
値は、250mg/dlを越えると大きなバラツキを示したが、
30秒での測定の場合には、グルコース濃度が500mg/dl以
上となるまでは大きなバラツキを示さなかった。これら
の散点図は、種々のグルコース濃度範囲で、YSIからの
偏差を求めて定量化した。結果を表６に示す。
備考：これらの値はインター法（Inter method）による
C.V.値である。
（イ） 二波長系のC.V.値は単一波長系よりも30％低か
った。
（ロ） ０〜50mg/dlにおいて、単一波長系は、±６〜7
mg/dlのS.D.値を示したが、二波長系のS.D.値は±2.2mg
/dlにすぎなかった。
（ハ） 30秒MPX測定の場合、カットオフ値は250mg/dl
であった。50〜250の範囲では、20秒及び30秒測定のイ
ンター法C.V.値は近似していた（単一波長の場合約７
％、二波長の場合5.5％）。しかしながら、250〜450mg/
dlの範囲において、20秒測定の読み取りが２倍を超える
インター法C.V.値を示し、単一波長では14.5％。二波長
では12.8％であった。
（ニ） 30秒測定の読み取り値は、450mg/dlを越える濃
度では、単一波長及び二波長測定の両方（C.V.値:10.2
％及び8.4％）において使用不可能であった。
上記から明らかなように、上記の２つのMPX系におい
て、０〜450mg/dlの濃度範囲で最適な定量化を示した。
1.MPX30二波長：この二波長系では、測定時間30秒で95
％の信頼限界（YSIのSD値の２倍以内の測定値の確率）
であり、50〜450mg/dlの範囲で11.3％のC.V.値を示し、
0.5〜50mg/dl（表７）の範囲で±4.4mg/dlのS.D.値を示
した。
2.MPX30/20二波長：この二波長系では、測定時間20秒で
のグルコース濃度範囲が０〜250mg/dlであり、測定時間
30秒では250〜450mg/dlの範囲であった。この場合の95
％信頼限度はほぼMPX30二波長とほぼ同じであり（表
７）、50〜450mg/dlの濃度範囲で11％のC.V.値を示し、
０〜50mg/dlの濃度範囲において、±4.6mg/dlのS.D.値
を示した。
備考：＊MPXに関する信頼限界はYSIから求めた。グルコ
スキャン・プラス（Gluco Scan Plus）及びアク・チェ
ク（Acc-Chek）bGに関する信頼限界は、検量線作成にお
ける小さな差異によるかたよりを排除するために、回帰
方程式とYSIとの対比から求めた。
実施例３ 安定性の最適化についてのベンチスケール実験のほと
んどを、手動浸漬した0.8μｍの円板状ポシジン膜（Pos
idyne membrane）を用いて行った。上記した特定の色素
／酵素配合を用いた。
1.室温安定性：この実験は、0.8μｍのポシジン膜試薬
を18〜20℃でシリカゲル乾燥剤で乾燥しながら貯蔵した
場合の変化を図表化するためのものである。2.5ヵ月後
に、室温試料を５℃で貯蔵した試料を対比して測定した
結果、何ら顕著な変化を示さなかった。作成した散点図
から、０〜450mg/dlのグルコース濃度範囲が得られた。
2.37℃での安定性:37℃での安定性の実験を室温（RT）
安定性試験と同様の試薬を用いて行った。接着剤を使用
した場合と使用しない場合それぞれについてのストリッ
プについて、37℃で応力をかけた試薬のグルコース値と
室温で応力をかけた試薬のグルコース値の差を時間に対
してプロットした。その結果、手製のストリップのため
たに再現性が悪いことから、データにばらつきが見られ
たが、接着剤を使用して応力をかけたものも接着剤を使
用しなかったものも両方とも優れた安定性を示した。
3.56℃での安定性：円板状膜について、同様の銘柄であ
るが配合の異なる８種のものを用いて（表８）、５〜６
日間の安定性試験を行った。グルコース濃度が低い場合
（80〜100mg/dl）、応力をかけると、平均グルコース値
は3.4％低下し、最大低下率は9.55％であった。一方、
グルコース濃度が高い場合（280〜320mg/dl）、グルコ
ース値は平均で3.4％低下し、このときの最大低下率は1
0.0％であった。
備考：＊これらの２つの試料の酵素及び色素の濃度は、
通常のものの２倍である。
この膜を56℃で19日間応力をかけたところ、接着剤の
使用、不使用にかかわらず大きな差がなかった。両方の
場合において、19日間におけるグルコース値の減少は低
濃度（80〜100mg/dl）及び300mg/dlで15％未満であっ
た。
別に、通常の２倍の酵素及び色素濃度を有する手動浸
績した0.8μｍポシジン膜を用いて56℃での実験を行っ
た。同じ銘柄であるが異なる配合のものを作製し、14日
間にわたって安定性を測定した。これら２つの実験の結
果の平均値をプロットした。14日間における変化は、高
濃度及び低濃度グルコースの両方について、±10％以内
であった。これらのデータからこの銘柄のものが特に安
定であることがわかる。
実施例４ 試料の大きさ MPXに関する試料サイズの要件を表９に示す。
上記の表に示した容積の試料を第１図に示す試薬パッ
ドにマイクロピペットで移した。フィガースティックで
血液をストリップに塗布したときは、試料の全量を移す
ことはできない。従って、ここに示した容積は、分析の
ために指から絞り出す必要のある試料サイズの合計量を
表わすものではない。試料パッドの円周を完全におおう
に必要な試料の最少量３μｌである。この程度の量で
は、試薬パッドを完全に飽和させることができず、MPX
測定では低い値となる。４μｌの試料量でようやく試料
パッドを飽和させることができ、５μｌの試料量が飽和
に十分な量である。10μｌの試料量はぬれてひかる程度
の液滴であり、20μｌの試料量は非常に大きな液滴であ
り、ピペットで血液をサンプリングする時にのみ用い
る。
単一波長の場合、低グルコース濃度では、得られる結
果はいくぶん試料サイズに依存するが、二波長特定では
このようなことは全くない。単一波長の場合のこのよう
な依存性は許容できる程度のものと考えられるが、好ま
しくないことは明らかである。
実施例５ 再現性 上記の測定実験を、一点のデータ当り通常2,3又は４
回測定をくり返した。これらの一連のデータは、例え
ば、ヘマトクリットあるいは酸素濃度が極端に高い場合
においてさえ、よく近似していた。又、C.V.値は５％を
はるかに下まわっていた。従って。再現性が非常に良好
であると思われる。
〔発明の効果〕
本発明は、現在市販されているシステムや文献に記載
されているシステムに対して数多くの利点を有してい
る。即ち、プロトコールが簡単であり、ほとんど技術的
熟練を要せず、且つオレペータにより発生する誤差が比
較的ない。又、このアッセイは、家庭において使用する
物質について考慮すべき重要な事柄を満足しており、迅
速に行うことができるばかりでなく、使用する試薬は、
安価で且つ比較的無害のものである。得られる結果は使
用者にとって理解可能なものであり、使用者はその結果
を継続治療に併せて利用することができる。更に、試薬
は保存性に優れているので、長期間にわたって信頼性の
ある結果を得ることができる。又、装置が簡単であり、
信頼性に優れ且つ実質的に自動である。
本明細書において具体的に言及した全ての特許及び文
献は、本発明の属する分野における当業者の技術水準を
示すものであり、そこに記載されている事項は必要に応
じて本発明に利用できる。
ここに詳述した本発明は、特許請求の範囲に記載した
発明の精神及びその範囲から逸脱することなく、数多く
の変形と変更を行うことができることは、当業者の当然
とするところである。
【図面の簡単な説明】
第１図は分析すべき流体を塗布した反応パッドを含む試
験装置の一態様の斜視図であり、第２図は本発明の実施
に用いることのできる装置の概略を示すブロック図であ
り、第３図は本発明の実施に用いることのできる他の装
置の概略を示すブロック図である。 11……試薬パッド、12……ハンドル、13……接着剤、14
……穴、15……光検出器、16……増幅器、17……軌道・
保持回路、19……アナログ・ディジタル変換器、20……
マイクロプロセッサー、21……プログラム・アンド・デ
ータメモリ、22……表示装置。
フロントページの続き (72)発明者 フランク ジュリク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94402, サンマテオ，シックスティーンス アベニ ュ 142 (72)発明者 レイ アンダーウッド アメリカ合衆国，カリフォルニア 96080, レッドブラフ，ペインズ クリーク ロー ド 146005 (56)参考文献 特開 昭61−96466（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−11395（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−91265（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−164941（ＪＰ，Ａ)

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】膜と、吸光性色素生成物を生成するように
    グルコースと反応するシグナル生成系とを用いて血液試
    料中のグルコースを定量する方法であって、該シグナル
    生成系が該膜に結合しており、且つ該色素生成物の量を
    該膜の表面での反射率測定により定量する方法におい
    て、 未測定の全血液試料を、赤血球を排除するのに十分な大
    きさの孔を有し、且つ該シグナル生成系を含む単層の実
    質的に反射性、多孔質、親水性の膜の第一表面に塗布
    し、 該膜の、該試料を塗布した表面以外の第二表面で、過剰
    な試料又は赤血球を該第一表面から除去することなく、
    該反射率測定を行い； ここで、該シグナル系は、該赤血球が吸収する波長とは
    異なる波長での光を吸収する色素生成物を生成し、且つ
    該反射率測定は二つの異なる波長で行われ、一方は赤血
    球に基づくバックグランド吸収を補正するための吸収波
    長反射率測定であり、そして他方は該色素生成物の吸収
    波長での反射率測定であり、そして； 該反射率測定から該試料中のグルコースの濃度を決定す
    ることを含んで成る、 血液試料中のグルコースの定量方法。
  2. 【請求項２】該二つの波長が、それぞれ約635nm及び700
    nmである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】該シグナル生成系が、グルコースオキシダ
    ーゼ、ペルオキシダーゼ、インジケーターとしての約1:
    1〜約4:1の重量比における３−メチル−２−ベンゾチア
    ゾリノンヒドラゾン/3−（ジメチルアミノ）安息香酸、
    及び3.8〜5.0のpHを供する緩衝剤を含んで成る、特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】該緩衝剤が、該膜の中で乾燥した５〜15重
    量％のクエン酸緩衝剤を含んで成る、特許請求の範囲第
    ３項記載の方法。
  5. 【請求項５】該膜がポリアミドを含んで成り、そして該
    シグナル生成系がグルコースオキシダーゼ、ペルオキシ
    ダーゼ及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
    ゾン/3−（ジメチルアミノ）安息香酸を含んで成る、特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】該孔が約0.1〜約3.0μｍの平均径を有す
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】該膜がポリアミドより本質的に構成されて
    おり、そして約0.01〜約0.5mmの厚みを有する、特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記膜がポリアミドより本質的に構成され
    ており、そして該第二表面において10μｌ未満の孔容積
    を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  9. 【請求項９】マトリックスを含んで成る試薬試験ストリ
    ップと、該マトリックス中に配置しており、吸光性色素
    生成物を生成するようにグルコースと反応するシグナル
    生成系とを用いて全血液試料中のグルコースを定量する
    方法であって、該色素生成物の量を該マトリックスの表
    面のイルミネーションの結果として反射した光の反射率
    測定により定量する方法において： 未測定の全血液試料を、ヘモグロビン含有液の流れがこ
    のマトリックスの中へと移動して試料受容表面から試験
    表面へと向うことを可能とするのに十分な大きさの孔を
    有する実質的に反射性の多孔質、親水性マトリックスの
    この試料受容表面に塗布し、ここで該シグナル生成系は
    光学的に可視のヘモグロビンの存在下で該全血液試料中
    のグルコースの濃度を指標する色素生成物を生成するも
    のであり； 該試料受容表面から過剰な試料又は赤血球を除去するこ
    となく、該マトリックスの該試験表面のイルミネーショ
    ンの結果として反射した二つの異なる波長の光を測定
    し、ここで該試験表面は該試料表面とは反対側にあり；
    そして 該反射率測定から該試料中のグルコースの濃度を決定す
    ることを含んで成る、 全血液試料中のグルコースの定量方法。
  10. 【請求項１０】該シグナル生成系が、約635nmで光を吸
    収するが、約700nmでは光を有意な程度で吸収しない色
    素生成物を生成し、そして該二つの反射率測定のうちの
    第一の測定は約635nmで行われ、そして該二つの反射率
    測定のうちの第二の測定はヘマトクリットに基づく吸収
    を補正するために約700nmで行われる、特許請求の範囲
    第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】該シグナル生成系がグルコースオキシダ
    ーゼ、ペルオキシダーゼ及び３−メチル−２−ベンゾチ
    アゾリノンヒドラゾン/3−（ジメチルアミノ）安息香酸
    を含んで成る、特許請求の範囲第９項記載の方法。
  12. 【請求項１２】該シグナル生成系がグルコースオキシダ
    ーゼ、ペルオキシダーゼ及び約1:1〜約4:1の重量比にお
    ける３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン/3
    −（ジメチルアミノ）安息香酸を含んで成る、特許請求
    の範囲第９項記載の方法。
  13. 【請求項１３】該シグナル生成系が、グルコースオキシ
    ダーゼ、ペルオキシダーゼ、３−メチル−２−ベンゾチ
    アゾリノンヒドラゾン/3−（ジメチルアミノ）安息香
    酸、及び3.8〜5.0のpHを供する緩衝剤を含んで成る、特
    許請求の範囲第９項記載の方法。
  14. 【請求項１４】該緩衝剤が、５〜15重量％のクエン酸緩
    衝剤を含んで成る、特許請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】該膜がポリアミドを含んで成る、特許請
    求の範囲第９項記載の方法。
  16. 【請求項１６】該孔が約0.1〜約3.0μｍの平均径を有す
    る、特許請求の範囲第９項記載の方法。
  17. 【請求項１７】該膜がポリアミドより本質的に構成され
    ており、そして約0.01〜約0.5mmの厚みを有する、特許
    請求の範囲第９項記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記膜がポリアミドより本質的に構成さ
    れており、そして該試験表面において10μｌ未満の孔容
    積を有する、特許請求の範囲第９項記載の方法。
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