DE1940816C3 - Verfahren und diagnostisches Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose - Google Patents

Description

auch die enzymatischen Reaktionen nicht.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzy- 60 Häufig ist es günstig, beim erfindungsgemäßen Vermatischen Bestimmung von Glucose, bei dem man in fahren auch einen oberflächenaktiven Stoff zuzusetzen, gepufferter Lösung die Glucose mittels Adenosin- vorzugsweise Digitonin oder ein Äthylenoxydaddukt. triphosphat und Hexokinase in Glucose-6-phosphat Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein diaüberführt, dieses mittels Nicotinamid-adenin-dinucleo- gnostisches Mittel zum enzymatischen Nachweis, von tidphosphat in Gegenwart von Glucose-6-phosphat- 65 Glucose, bestehend aus Hexokinase und Glucosedehydrogenase zu Gluconat-6-phosphat unter Bildung 6-phosphatdehydrogenase sowie Adenosintriphosphat, von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotidphos- Magnesiumsulfat, Nicotinamid-adenin-dinucleotidphat oxydiert und letzteres spektrophotometrisch phosphat und einem Puffer, der ein Azid enthält.

Vorzugsweise sind bei dem erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel Adenosintriphosphat, Magnesiumsulfat, Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat, Puffetsubstanz, Digitonin und Azid als homogenes Pulvergemisch abgepackt, während die Enzyme Hexokirase und Glucose-o-phosphatdehydrogenase gesondert in Form einer Suspension in Ammoniumsu!fatlösung vorliegen. Die Puffersubstanz besteht hierbei günstig aus Triäthanolamin-hydrochlorid und N-'iriumhydroxyd bzw. Natriumcarbonat, wobei in diesem Falle das Azid als Natriumsalz vorliegt. Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßeri ij'.ignostischen Mittels liegen Adenosintriphosphat, \Magnesiumsulfat, das Puffergemisch Digitonin und A/.id in Form einer wäßrigen Lösung, Nicotinamida:lenin-dinucleotidphosphat in fester Form (z. B. als 7 !bleue verpreßt) und die Enzyme Hexokinase und G i ucose-5-phosphatdehydrogenase wiederum gesondert als Suspension in Ammoniumsulfatlösung vor.

Zur Durchführung der Glucosebestimmung mit dem erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel wird dieses, falls es in Form eines Pulvergemisches vorliegt, vt.r Gebrauch einfach in der entsprechenden Menge destilliertem Wasser gelöst, wobei die unverbrauchte Menge gewünschtenfalls wochenlang ohne Qualitätseinbuße im Kühlschrank aufbewahrt werden kann. Anschließend wird in üblicherweise die glucosehaltige Probe (z. B. Vollblut) zugesetzt und die Extinktion bestimmt, worauf man das Enzymgemisch Hexokinase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase zufügt und erneut die Extinktion mißt. Die Enzymsuspension ist ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen, insbesondere bei kühler Lagerung, ebenfalls jahrelang haltbar. Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäöe diagnostische Mittel ermöglichen damit eine äußerst einfache Handhabung des Glucosebestimmungsverfahrens und beseitigen die Notwendigkeit, für jede einzelne Bestimmung zahlreiche Einzelreagenzien zu pipettieren und laufend neue Lösungen anzusetzen.

Die durch die Erfindung erzielte überlegene Stabilität von Adenosintriphosphat in wäßriger Lösung geht aus den nachstehend beschriebenen Vergleichsversuchen hervor. Hierbei wurde eine wäßrige Lösung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels, welche Adenosintriphosphat als Dinatriumsalz, Magnesiumsulfat, Triäthanolamin-hydrochlorid, Natriumcarbonat, Digitonin und Natriumazid enthielt, mit einer in gleicher Weise zusammengesetzten Lösung verglichen, die kein Natriumazid enthielt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Durch die Erfindung wird es möglich, die Glucosebestimmung auf höchst einfache Weise durchzuführen. Das bisher erforderliche häufige Pipettieren und ständige Neuansetzen von Einzeliösungen wird damit überflüssig. Gleichzeitig können die Reagenzien nunmehr voll aufgebraucht werden, was einer Verminderung des Reagenzienbedarfes entspricht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

	Konzentration	ohne	Abnahme der ATP*-	ohne
	ATP* in mg/ml	Azid	Konzentration in °/o	Azid
Zeit	mit	0,450	mit	_
	Azid	0,450	Azid	0
Beginn	0,425	0,170		-62
nach 10 Tagen	0,425	0,040	0	-91
nach 20 Tagen	0,420	0,000	-1,2	-100
nach 50 Tagen	0,418	-1,6
nach 90 Tagen	0,390	-8

* Adenosintriphosphat.

■ Die Werte der obigen Tabelle zeigen die ausgeprägte Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens bxw. diagnostischen Mittels. Folgende Komponenten werden, zu einem homogenen Pulver vermischt:

11,0 g Triäthanolamin-hydrochlorid, 3,5 g Natriumcarbonat,

0,2 g Magnesiumsulfat-heptahydrat,

0,1 g Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat,

0,1 g Adenosin-5'-triphosphat, Dinatriumsalz,

Trihydrat,

^ao 0,3 g Natriumazid,
0,02 g Digitonin.

Je 150 mg dieses Gemisches werden in luftdicht verschließbare Flaschen eingewogen. Der Inhalt der Flaschen wird vor dem Gebrauch durch Zugabe von 2,0 ml V/asser unter kurzem Umschütteln in Lösung gebracht und mit 0,005 bis 0,2 ml der zu untersuchenden Probe (Harn, Blut, Serum usw.) versetzt. Die Extinktion E_a wird bei 366 bzw. 340 nm mit einem geeigneten Photometer gemessen. Danach gibt man 1 Tropfen einer Enzymgemischsuspension zu, die etwa 150 Einheiten Hexokinase und 75 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase pro Milliliter 3molarer Ammoniumsulfatlösung enthält.

Man wartet etwa 5 bis 10 Minuten, bis sich ein konstanter Extinktionswert E₁ eingestellt hat. Die Extinktionsdifferenz AE-E₁-E₀ wird mit einem Berechnungsfaktor multipliziert und ergibt unmittelbar die Konzentration an Glucose in der Probe. Die unverbrauchte Lösung ist monatelang haltbar und kann jederzeit ohne Änderung im Verfahrensgang wieder verwendet werden.

Durch die Verwendung der digitoninhaltigen Reagenzlösung ist es möglich, Blut direkt in den Test- +5 ansatz einzusetzen, ohne eine vorhergehende Enteiweißung bzw. Entfernung der die optische Messung störenden roten Blutkörperchen durchzuführen. In diesem Fall ist eine Blutmenge von nur 0,005 bis 0,01 ml erforderlich.

Beispiel 2

2,5 ml einer Lösung, enthaltend: 0,140 g Triäthanolamin-hydrochlorid, 0,020 g Adenosin-5'-triphosphat, 0,00:1 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,016 g Natriumcarbonat,
0,0025 g Natriumazid,
0,00025 g Digitonin,

werden in eine Meßküvette pipettiert, eine NADP-Tabletiie wird darin ^gelöst und 0,01 ml Vollblut zugegeben. Die durch das vorhandene Digitonin bei wirkte Haemolyse ist praktisch sofort beendet. Dann wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, Extinktion E₀

65 abgelesen und die Reaktion mit dem Enzymgemisch wie im Beispiel 1 gestartet. Messung und Auswertung erfolgen wie im Beispiel 1.

Claims (8)

1 2 bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man eier gePatentansprüche: pufferten Lösung ein Azid zusetzt Nach einem bekannten Verfahren kann man

1. Verfahren zur enr-matischen Bestimmung Glucose enzymatisch bestimmen indem man sie von Glucose, bei dem man in gepufferter Lösung 5 mittels Adenosintriphosphat und HexoKina« _m. die Glucose mittels Adenosintriphosphat und Glucose-6-phosphat überführt Das entstehende-t,|u-Hexokinase in Glucorf-6-phosphat überführt, die- cose-6-phosphat wird mittels Nicotinamid-aocninsps mittels Nicotinamid-adenin-dinucleotidphos- dicnucleotidphosphat (NADP) in Gegenwart von phat in Gegenwart von Glucose-6-phosphat- Glucose-o-pi.osphatdehydrogenase(G-6-PDHJim GIudehydrogenase zu Gluconat-6-phosphat unter BiI- io conat-6-phosphat überführt. Dabei entsteht eine dem dung von reduziertem Nicotinamid-adenin-di- Glucose-6-phosphat äquivalente Menge an redunucleotidphosphat oxydiert und letzteres spektro- ziertem Nicotinamid - adenin - dinucleotidpnespnat photometrisch bestimmt, dadurch gekenn- (NADPH). Letzteres kann sehr leicht photometrisch zeichnet, daß man der gepufferten Lösung bestimmt werden. Dieses Verfahren ist sehr zuein Azid zusetzt. · 15 verlässig, spezifisch und praktisch wenig storaniaihg

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- und bewährte sich besonders bei der Bestimmung von zeichnet, daß als Puffer eine Mischung von Tri- Glucose in biologischen Flüssigkeiten sowie in äthanolaminhydrochlorid. Natronlauge bzw. Na- Lebensmitteln. Ein Nachteil des Verfahrens hegt triumcarbonat und Natriumazid verwendet wird. jedoch darin, daß die Lösungen der Einzelreagenzien

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ao Puffer, ATP, NADP sowie Magnesiumsulfat einzeln gekennzeichnet, daß man alle für die Reaktion pipettiert werden müssen, weil Lösungen von ATP benötigten Reagenzien außer den Enzymen zu- in den bisher verwendeten Mischungen von Trisammen in Lösung bringt' und in dieser Form äthanolamin-hydrochlorid, Natronlauge und Magneeinsetzt. siumsulfat nicht stabil sind und nach einiger Zeit

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- 25 starke Trübungen aufweisen.

zeichnet, daß man eine geringe Menge Digitonin, Es wurde nun gefunden, daß man ATP, Tnäthanol-

vorzugsweise 10 mg/100 ml Reagenslösung ge- aminhydrochlorid, Natronlauge und Magnesiumsulfat

meinsam mit den Reagenzien in Lösung bringt. gemeinsam in Lösung halten kann, wenn man der

5. Diagnostisches Mittel zum enzymatischen Lösung ein Azid zusetzt. Eine Trübung tritt dann Nachweis von Glucose, bestehend aus Hexokir.ase 30 nicht auf.

und Glucose-6-phosphatdehydrogenase sowie Ade- Das bekannte Verfahren zur enzymatischen Be-

nosintriphosphat, Magnesiumsulfat, Nicotinamid- Stimmung von Glucose kann somit erfindungsgemäß

adenin-dinucleotidphosphat und einem Puffer, dadurch verbessert werden, daß man der gepufferten

dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Azid Lösung ein Azid zusetzt. Vorzugsweise besteht der

enthält. ?5 Puffer aus einer Mischung von Triäthanolamin-hydro-

6. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 5, da- chlorid, Natriumhydroxyd bzw. Natriumcarbonat und durch gekennzeichnet, daß Adenosintriphosphat, ■ Natriumazid.

Magnesiumsulfat, Nicotinamid-adenin-dinucleotid- Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es

phosphat, Puffersubstanz und Azid als homogenes möglich, die für die Reaktion benötigten Reagenzien —

Pulvergemisch und die Enzyme Hexokinase und 40 außer den Enzymen und NADP — zusammen in

Glucose-o-phosphat-dehydrogenase gesondert in Lösung zu bringen und in dieser Form einzusetzen.

Form einer Suspension in Ammoniumsulfatlösung Lösungen, die ATP, Magnesiumsulfat, NaOH bzw.

vorliegen. Na₂CO₃, Triäthanolaminhydrochlorid und Natrium-

7. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 5 oder 6, azid enthalten, weisen auch nach über 3monatiger dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanz 45 Lagerung bei 33° C noch keine Trübung sowie keinen aus Triäthanolamin-hydrochlorid und Natrium- Abfall des ATP-Gehaltes auf, während die bisher hydroxyd bzw. Natriumcarbonat besteht und üblichen Lösungen, die kein Natriumazid enthalten, das Azid als Natriumsalz vorliegt. im Höchstfall nur bis zu 14 Tagen im Kühlschrank

8. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 5 oder 7, gelagert werden können. Bei längerem Lagern dieser dadurch gekennzeichnet, daß Adenosintriphosphat, 50 bekannten Lösungen nimmt die Konzentration an Magnesiumsulfat, das Puffergemisch, Digitonin ATP so stark ab, daß bei Verwendung derartiger und Natriumazid in Form einer wäßrigen Lösung, Präparate fehlerhafte Resultate erhalten werden.
Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat in fester Die durch die Erfindung ermöglichten neuen Re-Form und die Enzyme Hexokinase und Glucose- aktionsgemische können auch in fester Form als 6-phosphat-dehydrogenase gesondert in Form einer 55 homogene Pulvergemische in luft- und feuchtigkeits-* Suspension in Ammoniumsulfatlösung vorliegen. dicht verschlossenen Flaschen bei Raumtemperatur

gelagert werden, so daß man sie in dieser Form verschicken kann. Überraschenderweise stört das Azid