DE2301999C2

DE2301999C2 - Träger für eine instabile Reagenzsubstanz

Info

Publication number: DE2301999C2
Application number: DE19732301999
Authority: DE
Inventors: Harald Dr. Arlesheim Gallati
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1972-01-25
Filing date: 1973-01-16
Publication date: 1986-06-12
Also published as: JPS5638907B2; GB1407873A; JPS4884693A; DE2301999A1; NL174166C; NL174166B; NL7300128A; FR2169639A5; CH583422A5

Description

Die Erfindung betrifft einen Träger für eine instabile Reagenzsubstanz gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1.

Quantitative Bestimmungen von Bestandteilen in biologischen oder anderen Flüssigkeiten eignen sich vor allem zur Untersuchung von Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin, um eine Krankheitsdiagnose zu ermöglichen sowie den Verlauf der Therapie zu verfolgen. Weiter können sie auch für Flüssigkeitskontrollen bei industriellen Verfahren verwendet werden. In diesem Zusammenhang haben sich Tests bewährt, bei denen man das zu untersuchende Material mit speziellen Testreagenzien, welche oft aus instabilen Reagenzsubstanzen, wie z. B. ein für den zu messenden Bestandteil spezifisches Enzym und/oder Coenzym, einem entsprechenden Substrat und gegebenenfalls einem Farbindikator bestehen, zusammenmischt und die Reaktion quantitativ erfaßt, indem bei Anwesenheit des zu messenden Bestandteils die Konzentrationsveränderung des Coenzyms oder des Farbindikators quantitativ bestimmt und daraus die Menge des Bestandteils berechnet wird.

Gemäß dem Stande der Technik werden die für die Tests notwendigen Reagenzien in getrennten Ampullen stabilisiert aufbewahrt und erst vor oder bei der Testdurchführung in genau vorgeschriebenen Mengenverhältnissen zusammengegeben (Testkonibinationen) oder die gebrauchsfertige Reagenzienmischung wird stabilisiert und lyophilisiert in Ampullen angeboten, wobei durch Zugabe von Wasser oder einer mitgelieferten Substratpufferlösung die Testlösung entsteht, die allerdings instabil ist und sogleich aufgebraucht werden muß.

Für halbquantitative Messungen gibt es die Schnellstreifentests, bei denen das Untersuchungsgut mit den für den betreffenden Test notwendigen Reagenzien auf dem Träger in Verbindung gebracht wird und die Menge des zu untersuchenden Bestandteils durch den entstehenden Farbton abgeschätzt wird.

In »Die Pharmazie« 2 (1947), 348-350 wird ein vollständig mit Urease imprägniertes Filterpapier, welches natürlicherweise nicht zum Mischen verwendet werden kann, beschrieben, welches mit einer recht großen Menge an Urease vollständig imprägniert und dann vollständig in das Testsystem eingegeben wird. Wieviel Urease aus dem Filterpapier abgegeben wird, häng¹ dann davon ab, wieviel von diesem Filterpapier in das Testsystem eingebracht wird.

In der DD-PS 37 582 wird ein Teststäbchen beschrieben, welches am unteren Ende mit einer für die Nachweisreaktion notwendigen Menge eines Chemikaliengemisches präpariert ist Dieses Chemikaliengemisch wird mittels eines Bindemittels direkt auf das Teststäbchen aufgebracht, wobei die Reaktion dann nicht in der Probe, sondern auf dem Teststäbchen stattfindet

Diese bekannten Bestimmungsmethoden haben den Nachteil, daß sie für den Analytiker oder für den Produzenten zeitraubend sind (Testkombination) oder daß sie nur halbquantitative Aussagen gestatten (Teststreifen).

Das aus der DE-OS 20 15 271 bekannte Prüfmittel besteht in seinem wesentlichen Teil aus einem saugfähigen Papier, imprägniert mit einem Reagenz, und einer dieses Papier mit Ausnahme eines kleinen Ausschnitts umgebenden Hülle. Durch das Umschließen des imprägnierten Papiers mittels der Hülle wird das mit dem Reagenz imprägnierte Papier in 2 Teile unterschiedlicher Funktion aufgeteilt, nämlich einerseits den Docht und andererseits den eigentlichen Reaktionsteil. Wie ausdrücklich aus der DE-OS zu ersehen ist, läßt sich mittels des imprägnierten Papiers ohne Verwendung einer Hülle der Nachweis einer gesuchten Substanz häufig nur bei verhältnismäßig hoher Konzentration ausführen, d. h. unterhalb einer bestimmten Konzentrationsgrenze gelingt kein entsprechender Nachweis, obwohl die gesuchte Substanz vorhanden ist. Ist dagegen das imprägnierte Papier mit der vergesehenen Hülle ausgestattet, so gelingt der Nachweis auch bei sehr viel geringerer Konzentration. Zurückzuführen ist dies offensichtlich auf die Umschließung des als Docht bezeichneten Teils des imprägnierten Papiers durch die Hülle mit der Folge der Ausbildung einer Verstärkung der Kapillarwirkung. Es wird nämlich dann unter der Kapillarwirkung durch den vor dem Ausschnitt der Hül-Ie gelegenen Teil des imprägnierten Papiers mehr von der zu untersuchende Flüssigkeit hindurchgezogen, weshalb ein Nachweis auch bei geringerem Konzentrationen möglich ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Träger, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er die Form eines zum Rühren geeigneten Mischstabes besitzt, an dessen Teil ein saugfähiges Material angebracht ist, auf welchem die Reagenzsubstanz in durch Imprägnieren und Trocknen stabilisierter Form aufgetragen ist.

Erfindungsgemäß sind also die für den betreffenden Test notwendigen, instabilen oder mit den anderen Testsubstanzen auf die Dauer unverträglichen Reagenzien auf einem Träger appliziert, der bei der Durchführung des Tests zugleich als Mischstäbchen dienen kann, wobei die Reaktion nicht am Träger sondern in der Gesamtprobe erfolgt.

Die quantitative Ablösung des Reagens vom erfindungsgemäßen Träger bzw. Lösung des Reagens im Testsystem war in keiner Weise zu erwarten.

Andererseits war es überraschend, daß die durch Imprägnieren und Trocknen erzielte rein adsorptive Bindung des Reagens an den Träger ausreichend ist. Es war nämlich zu erwarten, daß insbesondere gefriergetrocknete Reagenzien sich vom Träger abschälen würden.

Der erfindungsgemäße Träger hat die Form eines Mischstäbchens wie z. B. eines genügend stabilen Streifens oder Stäbchens, an dessen unterem Teil die stabilisierte Reagenzsubstanz z. B. ein Enzym oder ein Coenzym, und gegebenenfalls weitere für die Messung notwendige Substanzen auf einem saugfähigen Material wie z. B. Papier oder Kunststoff aufgetragen sind. Auf diese Weise kann die Gesamtmenge der instabilen Reagenzsubstanzen auf einfache Art in die Test-Probe ein

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getragen werden und darin gleichmäßig verteilt werden. Der erfindungsgemäße Träger kann dadurch hergestellt werden, daß man saugfähiges Material bekannter Dimensionen wie z. B. Kunststoff- oder Papierplättchen mit einer Reagenzlösung auf irgendeine Weise imprägniert, trocknet oder gefriertrocknet. Diese Plättchen, welche das Testreagenz in stabilisierter Form enthalten, werden z. B. durch Kleben am Ende eines Rührstäbchens angebracht.

Der erfindungsgemäße Träger eignet sich für die quantitative Bestimmung von Enzymen, Coenzymen und anderen Komponenten in z. B. Serum, Urin oder anderen Flüssigkeiten. Als Beispiel für Enzyme können Transaminasen, wie Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Dehydrogenasen, wie Lactat-Dehydrogenase, Glutamat-Dehydrogenase, Λ-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase genannt werden. Als Coenzyme eignen sich z. B. Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat. Andere Komponenten, die im zu untersuchenden Material vorhanden sein können, sind z. B. Lactat, Pyruvat, Harnstoff, Harnsäure, Glukose.

Beispiel 1
Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase im Serum

In einer Meßküvette von 10 mm Schichtdicke wird ein Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid Mischstab (NADH-Mischstab) hineingestellt, welcher aus einem etwa 6—7 cm langen Kunststoffstil, an dessen unterem Ende festes, nichtfaserndes Filterpapier in der Größe 7-14 mm angeklebt ist, besteht. Dieses Filterpapier enthält 0,6 mg NADH zusammen mit einem Stabilisator (Glutathion) in lyophilisierter Form.

Es wird 3,0 ml Substrat-Puffer welcher bei Raumtemperatur einige Monate haltbar ist und 51,6 mmol Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), 0,62 mmol Natrium-Pyruvat und 0,5 mg/ml Natriumazid (Stabilisator des Substrat-Puffers) enthält, zugegeben.

Dann wird 0,1 ml frisches, hämolysefreies Serum zupipettiert, das Lösungsgemisch mit dem schon eingetauchten »NADH-Mischstab« gut gemischt, dieser entfernt und die Aktivitäten der Lactat-Dehydrogenase photometrisch bei 344 nm, 340 nm oder 366 nm durch kontinuierliche Registrierung oder Extinktionsablesungen nach bestimmten Zeitintervallen (z. B. jede Minute) gemessen.

Beispiel 2

Bestimmung der Λ-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase im Serum

Es wird wie in Beispiel 1 vorgegangen, außer, daß als Substrat-Puffer eine Lösung enthaltend 51,6 mmol Natriumphosphatpuffer (pH 7,5)3,1 mmol Natrium-2-Oxobutyrat und 0,5 mg/ml Natriumazid (Stabilisator des Substrat-Puffers) verwendet wird. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur einige Monate haltbar.

Beispiel 3
Bestimmung der Glutamat-Dehydrogenase im Serum

In einer Meßküvette von 10 mm Schichtdicke wird ein (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid)-(Adenin-diphosphat)-Mischstab (NADH-ADP-Mischstab) hineingestellt, welcher gleichartig wie in Beispiel 1 ist, außer daß das Filterpapier neben den 0,6 mg NADH und dem Stabilsator noch 1,2 mg ADP in lyophilisierter Form enthält.

Es wird 2,5 mi Substrat-Puffer welcher bei Raumtemperatur einige Monate stabil ist und 60 mmol Triäthanolaminpuffer (pH 8,0), 120 mmol NH⁺^NH₄J₂SO₄)],

3 mmol Äthylendiamin-Tetraessigsäure und 1 mg/ml Natriumazid (Stabilisator des Substrat-Puffers) enthält, zugegeben.

Dann wird 0,5 ml Serum zupipettiert, das Lösungsgemisch mit dem schon eingetauchten »NADH-ADP-Mischstab« gut gemischt und bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten stehen gelassen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,05 ml Λ-Natrium-ketoglutarat (420 mmol) und nochmaligem Mischen der Lösung mit dem Mischstab gestartet. Weiter wird wie in Beispiel 1 vorgegangen.

B e i s ρ i e 1 4

Bestimmung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) im Serum

In einer Meßküvette von 10 mm Schichtdicke wird ein (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid)-(Lactat-Dehydrogenase)-(Maiat-Dehydrogenase)-Mischstab
(NADH-LDH-MDH-Mischstab) hineingestellt, welcher gleichartig wie in Beispiel 1 ist, außer daß das Filterpapier neben 0,6 mg NADH und dem Stabilisator noch

4 Einheiten Lactat-Dehydrogenase und 2 Einheiten Malat-Dehydrogenase in lyophilisierter Form enthält.

Es wird 2,5 ml Substrat-Puffer welcher bei Raumtemperatur einige Monate haltbar ist und 96 mmol Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), 240 mmol Natrium-L-Asparat, 1,0 ml/L Merfen Tinktur (0,66 Teile C₆H₅HgOB(OH)₂ in 500 Teilen Wasser und 500 Teile Isopropylalkohol) als Stabilisator der Lösung enthält, zugegeben.

Dann wird 0,5 ml Serum zupipettiert, das Lösungsgemisch mit dem schon eingetauchten »NADH-LDH-MDH-Mischstab« gut gemischt und bei Raumtemperatur etwa 2 Minuten stehen gelassen.
Die GOT-Enzymreaktion wird durch Zugabe von 0,05 ml Λ-Natriumketoglutarat (720 mmol) und nochmaligem Mischen der Lösung mit dem Mischstab, gestartet. Weiter wird wie in Beispiel 1 vorgegangen.

Beispiel 5

Bestimmung der Glutamat-Pyruvat-Transaminase
(GPT) im Serum

In eine Meßküvette von 10 mm Schichtdicke wird ein (Nicotinamid-Adenin-DinucleotidJ^Lactat-Dehydrogenase)-Mischstab (NADH-LDH-Mischstab) hineingestellt, welcher gleichartig wie in Beispiel 1 ist, außer daß auf dem Filterpapier neben 0,6 mg NADH und dem Stabilisator noch 4 Einheiten Lactat-Dehydrogenase in Iyophilisierter Form aufgetragen sind.

Es wird 2,5 ml Substrat-Puffer, welcher einige Monate haltbar ist und 96 mmol Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), 960 mmol L-Alanin und 1 ml/L Merfen-Tinktur (Stabilisator der Lösung) enthält, zugegeben.
Dann wird 0,5 ml Serum zupipettiert, das Lösungsgemisch mit dem schon eingetauchten »NADH-LDH-Mischstab« gut gemischt und bei Raumtemperatur etwa 2 Minuten stehen gelassen.

Ol

wird die GPT-Enzymreaktion durch Zugabe
ml Ä-Natriumketoglutarat (1,08 mmol) und
gern Mischen der Lösung mit dem Mischstab
Weiter wird wie in Beispiel 1 vorgegangen.

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Claims

23 Ol 999 Patentansprüche:

1. Träger für eine instabile Reagenzsubstanz zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in biologischen oder anderen Flüssigkeiten, wobei die Reagenzsubstanz in die biologische oder andere Flüssigkeit abgegeben wird, dadurch gekennzeichnet, daß er die Form eines zum Rühren geeigneten Mischstabes besitzt, an dessen unterem Teil ein saugfähiges Material angebracht ist, auf welches die Reagenzsubstanz in durch Imprägnieren und Lyophilisieren stabiiiserter Form aufgetragen ist.

2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material Papier oder Kunststoff ist.