DE3779517T2

DE3779517T2 - Analytisches element und verfahren zur bestimmung von theophyllin mit verwendung eines puffers in der verteilerschicht.

Info

Publication number: DE3779517T2
Application number: DE8787307497T
Authority: DE
Inventors: C O Eastman Kodak Comp Frickey; C O Eastman Kodak Compa Norton
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1986-08-25
Filing date: 1987-08-25
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2007-08-26
Also published as: DE3779517D1; JPS6371198A; EP0258034B1; US4782017A; CA1290663C; JPH0698034B2; EP0258034A3; EP0258034A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die klinische Chemie und die Untersuchung biologischer Flüssigkeiten auf Theophyllin. Ganz speziell betrifft die Erfindung ein trockenes analytisches Element und ein Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin in menschlichen biologischen Flüssigkeiten.
Theophyllin ist ein Arzneimittel, das häufig für die Behandlung von Asthma und Lungenkrankheiten verordnet wird. Damit das Arzneimittel erfolgreich ohne Auftreten von schwerwiegenden unerwünschten Nebeneffekten verwendet werden kann, muß es im Falle eines patienten häufig und sorgfältig verabfolgt werden, da es einen relativ engen therapeutischen Wirkungsbereich, d.h. von 1-2 mg/dl, aufweist.
Es sind zahlreiche Methoden angewandt worden, Um die Menge an Theophyllin in menschlichem Serum zu bestimmen. Die meisten dieser Methoden weisen schwerwiegende Nachteile auf. Die bekannten spektrophotometrischen Methoden beispielsweise fordern große Probenvolumina, eine ausgedehnte Vorbehandlung und leiden unter Störungen durch Verbindungen ähnlicher Struktur wie Xanthinen, beispielsweise Coffein und Theobromin. Bekannte gaschromatographische Methoden sind spezieller, fordern jedoch eine Derivatisierung und sind zeitaufwendig.
Am häufigsten werden nichtisotrope Immunoassay-Techniken angewandt, da sie zu schnellen Ergebnissen führen und leicht durchführbar sind. Obgleich ganz allgemein eine zufriedenstellende Empfindlichkeit bei der Anwendung von Immunoessay- Techniken erreicht wird, wurde doch neuerdings gefunden, daß sie zu stark erhöhten Ergebnissen führen können, in Abhängigkeit von dem Nierenzustand eines patienten sowie der Spezifität des in der Methode verwendeten Antikörpers.
Überdies erfordern Immunoessay-Techniken die Verwendung von im allgemeinen teuren Reagenzien, die eine nur begrenzte Stabilität aufweisen.
Weiterhin sind hochwirksame Flüssigkeits-Chromatographie- Techniken bekannt. Diese Techniken unterscheiden sich in ihrer Spezifität, je nachdem, ob eine Vorbehandlung der Testprobe durchgeführt wird. Organische Extraktionsstufen sind erforderlich, um die Genauigkeit und Spezifität des Bestimmungsverfahrens zu verbessern. Viele chromatographische Verfahren sind störanfällig aufgrund einer Anzahl von Substanzen, einschließlich einiger üblicher Antibiotika. Zu anderen Nachteilen gehört die Notwendigkeit einer teuren Instrumentation und eines spezialisierten technischen Personals, um die Bestimmungen durchführen zu können.
Es ist bekannt, daß Theophyllin bestimmt werden kann durch Ermittlung seines inhibierenden Effektes auf die Aktivität alkalischer Phosphatase. Werden jedoch menschliche biologische Flüssigkeiten in dieser Weise untersucht, ist es bekannt, daß endogene alkalische Phosphatase das Bestimmungsverfahren beeinträchtigen und zu ungenauen Ergebnissen, d.h. erhöhten Ergebnissen, führen kann. Endogene alkalische Phosphatase muß dann zerstört oder entfernt werden, bevor die Untersuchung durchgeführt wird, um dieses Problem auszuschalten.
Ein bedeutender Fortschritt auf dem Gebiet wird in der EP-A-0 188 372 beschrieben. Das hier beschriebene und beanspruchte Element weist jedoch ein Isoenzym für alkalische Phosphatase und einen Puffer für die Aufrechterhaltung des pH-Wertes bei 9 oder darunter während der Bestimmungsmethode auf, die in der Registrierschicht untergebracht sind. Diese Schicht befindet sich benachbart zum Träger. Es wird kein Puffer in der Ausbreitschicht des Elementes beschrieben.
Obgleich dieses Element eine einfache und rasche Bestimmung von Theophyllin ermöglicht, wobei endogene alkalische Phosphatase einen verminderten Effekt ausübt, besteht doch ein Bedürfnis nach einer weiteren Verbesserung der Bestimmungsmethode. Das oben beschriebene Element weist einen beschränkten Arbeitsbereich auf. Weiterhin weist das oben beschriebene Element eine beschränkte Haltbarkeit auf, was bedeutet, daß es bezüglich Umgebungsbedingungen empfindlich ist.
Die oben erwähnten Probleme werden durch eine trockenes analytisches Element für die Bestimmung von Theophyllin überwunden, das in Flüssigkeitskontakt eine poröse Ausbreitzone und mindestens eine zusätzliche Zone aufweist, wobei das Element ein Isoenzym von alkalischer Phosphatase aufweist, das in der Lage ist, auf ein Substrat für das Isoenzym bei einem pH-Wert von 9 oder darunter einzuwirken, und ein Substrat für das Isoenzym, wobei gilt, daß die Phosphatase und das Substrat in verschiedenen Zonen des Elementes vorhanden sind, wobei
das Element gekennzeichnet ist, dadurch, daß es weiterhin einen Puffer enthält, der dazu in der Lage ist, den pH-Wert bei 9 oder darunter während der Bestimmung zu halten, wobei mindestens 80% des puffers in der porösen Ausbreitzone untergebracht sind.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für die Bestimmung von Theophyllin bereit, das die Stufen aufweist,
A. In Kontakt bringen einer probe einer biologischen Flüssigkeit, von der erwartet wird, daß sie Theophyllin enthält bei einem pH-Wert von 9 oder weniger mit dem oben beschriebenen trockenen analytischen Element und
B. Bestimmung einer bestimmbaren Veränderung, die sich aus dem Kontakt ergibt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches und rasch durchzuführendes Bestimmungsverfahren für Theophyllin bereite, das alle die Vorteile des Elements und des Bestimmungsverfahrens aufweist, die in der EP-A-0 188 372 beschrieben und beansprucht werden. Weiterhin weist das Element der vorliegenden Erfindung beträchtlich verbesserte Haltbarkeitseigenschaften auf. Infolgedessen spricht es weniger auf die Umgebung an, und die Aufbewahrungskonditionen sind weniger restriktiv. Die Bestimmung weist ferner einen beträchtlich erhöhten Arbeitsbereich auf. Weiterhin wurde festgestellt, daß die Quellung von bestimmten Schichten im Element der Erfindung beträchtlich vermindert wird.
Diese Verbesserungen werden in unerwarteter Weise erreicht dadurch, daß praktisch sämtlicher Puffer, der dazu verwendet wird, um den Bestimmungs-pH-Wert bei 9 oder darunter zu halten, in der Ausbreitzone des Elementes untergebracht wird. Relativ wenig Puffer befindet sich in anderen Zonen des Elementes.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Theophyllin in biologischen Flüssigkeiten und insbesondere menschlichen biologischen Flüssigkeiten. Die Bestimmung bezieht sich dabei entweder auf qualitative oder quantitative Messungen der Menge des Theophyllins in einer Testprobe. Im besonderen kann die Erfindung dazu verwendet werden, um Theophyllin in menschlichen biologischen Flüssigkeiten festzustellen, die endogene alkalische Phosphatase enthalten, (d.h. natürlich vorkommendes Enzym) in jeder ihrer enzymatischen Formen (z.B. Leber, Darm, Placenta oder Knochen). Beispielsweise kann diese Erfindung in vorteilhafter Weise zur Untersuchung von Seren, ganzem Blut, Plasma, spinalen Flüssigkeiten, Sputum, Galle, Speichel und anderen biologischen Flüssigkeiten angewandt werden. Es ist ferner möglich, die Erfindung zur Untersuchung von flüssigen Gewebepreparationen anzuwenden, beispielsweise zur Untersuchung von Preparationen des menschlichen Skelettmuskels, der Nieren, Placenta, des Herzens, des Darmes, der Lunge oder anderer Gewebe. Die bevorzugten biologischen Flüssigkeiten, die in der Praxis der Erfindung angewandt werden, sind menschliche Seren und vollständiges Blut.
In der Praxis dieser Erfindung ist Theophyllin bestimmbar durch Inhibierung der Aktivität von alkalischer Phosphatase, einem Enzym, das auf einer Anzahl von Substraten einzuwirken vermag unter Erzeugung eines bestimmbaren Reaktionsproduktes. Beispielsweise veranschaulicht die folgende repräsentative Gleichung die Erzeugung eines bestimmbaren Farbstoffes durch Einwirkung von alkalischer Phosphatase unter Verwendung eines typischen Substrats, p-Nitrophenylphosphat:
p-Nitrophenylphosphat + H&sub2;O alkalische Phosphatase/ Puffer
p-Nitrophenol (Farbstoff) + phosphat
Der Farbstoff kann dann kolorimetrisch unter Verwendung einer geeigneten spektrophotometrischen Bestimmungsvorrichtung bestimmt werden. Die Menge an Theophyllin, das in der Testprobe vorhanden ist, die mit dem Substrat und dem Enzym in Kontakt gebracht wird, ist umgekehrt proportional der Menge an gemessenem Farbstoff.
Die vorliegende Erfindung wird bei einem pH-Wert von 9 oder weniger durchgeführt, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 9. Wie in der EP-A-0 188 372 festgestellt, weist endogene alkalische Phosphatase in menschlichen Flüssigkeiten eine geringere Aktivität bei einem pH-Wert von 9 oder weniger auf. Jedoch können Isoenzyme von alkalischer Phosphatase, die in einer Umgebung eines pH-Werts von 9 oder weniger nicht aktiviert werden, zur Bestimmung verwendet werden, um das Vorhandensein von Theophyllin anzuzeigen. Jedes Isoenzym von irgendeiner geeigneten Quelle, das die gewünschte Eigenschaft hat, d.h. eine Aktivität, meßbar bei einem pH-Wert von 9 oder weniger, ist zur Durchführung der Erfindung geeignet. Besonders geeignete Isoenzyme sind solche, die vom Rind stammen, beispielsweise Gewebe und Organe (z.B. Leber) vom Rind oder Kälbern. Geeignet sind ferner Isoenzyme von verschiedenen anderen Lieferanten (z.B. Mikroorganismen, Avian und nichtmenschlichen Mammalian- Quellen). Es liegt im Rahmen des fachlichen Könnens eines auf dem Gebiet der klinischen Chemie tätigen Fachmanns, Isoenzyme aufzufinden, die im Rahmen dieser Erfindung verwendbar sind.
Im Rahmen dieser Erfindung kann ein alkalisches Phosphatasesubstrat oder können mehrere einer Vielzahl von alkalischen Phosphatasesubstrate verwendet werden. Das Substrat muß derart beschaffen sein, daß bei enzymatischer Reaktion mit dem Isoenzym eine direkt bestimmbare Veränderung auftritt. Beispielsweise wird das Substrat in ein oder mehrere bestimmbare Reaktionsprodukte überführt, z.B. ein Chromogen, Fluorogen, radioisotropisch markierte Species und andere in geeigneter Weise bestimmbare Produkte. Die bestimmbare Veränderung, die bei dem Bestimmungsverfahren gemessen wird, kann in dem Auftreten oder dem verschwinden eines solchen bestimmbaren Produktes bestehen oder der Veränderung von einem bestimmbaren Produkt in ein anderes. Alternativ kann diese bestimmbare Veränderung auch durch eine Reihe von Reaktionen erfolgen, die durch die Einwirkung des Isoenzyms auf das Substrat eingeleitet werden. Beispielsweise kann das alkalische Phosphatase-Isoenzym auf das Substrat einwirken unter Freisetzen eines anderen Enzyms oder Reagens, das dann dazu verwendet wird, um in einer oder mehreren Reaktionen ein bestimmbares Produkt zu erzeugen. Das bestimmbare Produkt kann direkt bestimmt werden oder kann eine physikalische Abtrennung oder Handhabung vor der Bestimmung erfordern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, liefert die Bestimmung ein Chromogen oder Fluorogen als bestimmbares Produkt der enzymatischen Reaktion. Im allgemeinen weisen die Substrate, die bei derartigen Reaktionen verwendet werden können, eine Phosphatgruppe auf, die von dem Substratmolekül während der enzymatischen Reaktion abgespalten wird. Zu derartigen Substraten gehören organische Mono- oder Diester der Phosphorsäure oder ihrer Salze. Beispiele von besonders geeigneten Substraten sind beispielsweise p-Nitrolphenylphosphat, Phenolphthaleinmonophosphat, Indoxylphosphat, Phenylphosphat, α-Naphtholphosphat, β-Naphtolphosphat, α-Glycerinphosphat, o-Methylfluorescinphosphat, o-Carboxyphenylphosphat, alkalische Metallsalze hiervon und andere im stand der Technik bekannte Substrate, beispielsweise jene, die in der US-Patentschrift 3 425 912 und in der Europäischen Patentpublikation 61 731 beschrieben werden. Besonders bevorzugte Substrate sind p-Nitrophenylphosphat und 4-(4-Nitro-2-methylsulfonylphenylazo)naphthol- 1-phosphat.
Das Isoenzym und das Substrat müssen getrennt voneinander in verschiedenen Zonen des Elementes gehalten werden, bis sie mit der flüssigen Testprobe in Kontakt gebracht werden. Die Menge des Isoenzyms und des Substrats in dem Element kann sehr verschieden sein. Im allgemeinen enthält das Element mindestens 10 I.E./m² Isoenzym. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Isoenzym in einer Beschichtungsstärke von mindestens 100 I.E./m² und ganz besondere in einer Beschichtungsstärke von 125 bis 200 I.E./m² vor. Im Rahmen dieser Erfindung steht I.E. für die Internationale Einheit für Isoenzymaktivität, definiert als eine I.E. entsprechend der Menge von Isoenzymaktivität, die erforderlich ist, um die Umwandlung von Micromol Substrat pro Minute unter Standard-pH- und Temperaturbedingungen für das Isoenzym zu katalysieren.
Das Substrat für das Enzym liegt im allgemeinen in einer Menge von 1 bis 5, vorzugsweise von 2 bis 4 g/m², vor. Andere Zusätze liegen im Element in Mengen vor, die im Rahmen des fachlichen Könnens eines normalen Fachmannes auf dein Gebiet der klinischen Chemie liegen.
Das Bestimmungsverfahren wird bei einem pH-Wert von 9 oder weniger, vorzugsweise von 7 bis 9, durchgeführt. Jeder geeignete Puffer oder jede geeignete Mischung von Puffern kann bzw. können im Rahmen der Erfindung verwendet werden, solange der Puffer bzw. die puffermischung geeignet ist, um den pH-Wert während der Bestimmung bei 9 oder darunter zu halten. Besonders geeignete Puffer sind stickstoffenthaltende organische Puffer, von denen viele Standard-Puffer sind [z.B. wird verwiesen auf Good u.a., Biochem, 5(2), 1966, S. 467-477]. Zu repräsentativen Puffern, auf deren Verwendung die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, gehört die Gruppe von Puffern bestehend aus Tris(hydroxymethyl) aminoethan.HCl, Glycylglycin, N-Tris(hydroxymethyl)-methyl- 2-aminoethansulfonsäure und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure. Der zuerst genannte Puffer ist der am meisten bevorzugte Puffer.
Praktisch der gesamte Puffer befindet sich in der Ausbreitzone (wie unten beschrieben) des Elementes dieser Erfindung. Dies bedeutet, daß sich praktisch nur wenig Puffer in anderen Zonen des Elementes befindet. Genauer gesagt befinden sich mindestens etwa 80% des Puffers in der Ausbreitzone. Der Puffer ist in dieser Zone in einer geeigneten Menge vorhanden, in Abhängigkeit von dem speziell verwendeten Puffer, um den pH-Wert der Reaktionsmischung bei dem gewünschten pH-Wert von 9 oder weniger zu halten. Diese puffernden Mengen lassen sich von einem auf dem Gebiet der klinischen Chemie tätigen Fachmann leicht bestimmen, sie liegen jedoch im allgemeinen bei mindestens 1 g/m², vorzugsweise bei mindestens 2,5 g/m².
Gegebenenfalls können andere Reagenzien dem Element einverleibt werden, falls dies erwünscht ist. Beispielsweise können Metallionen-Aktivatoren zugesetzt werden, um die Isoenzyme zu aktivieren. Zu derartigen Aktivatoren gehören divalente Kationen, z.B. Mg++, Co++, Mn++, Ca++, Zn++, Sr++ und Fe++, die in freier Form oder in Salzform vorliegen können, (z.B. in Form von Aspartat, Acetat, Chlorid oder Sulfat). Alternativ können, wenn die Konzentrationen an endogener alkalischer Phosphatase in der Festprobe abnorm hoch sind, Inhibitoren der Enzymaktivität verwendet werden. Zu geeigneten Inhibitoren gehören Phenylalanin und Tetramisol. Derartige Inhibitoren beeinflussen in vorteilhafter Weise die Aktivität von einigen nichtmenschlichen alkalischen Phosphatase-Isoenzymen nicht.
Zusätzlich können dem Element ein oder mehrere Phosphat- Akzeptoren zugesetzt werden, um die Geschwindigkeit der Enzymreaktion zu erhöhen, wenn Phosphat-Substrate verwendet werden. Zu geeigneten Phosphat-Akzeptoren gehören Aminoalkohole oder Derivate hiervon oder aliphatische Amine, wobei Aminoalkohole besonders bevorzugt sind. Beispiele für derartige Verbindungen sind gut bekannt.
Um die Tendenz eines Elementes zum Aufrollen zu vermindern, können einer oder mehreren Zonen des Elementes Glycerin oder andere Feuchthaltemittel zugesetzt werden.
Das Element ist in mindestens zwei Zonen unterteilt, von denen eine die poröse Ausbreitzone (wie unten beschrieben) ist, und das Isoenzym und das Substrat sind in individuellen Zonen untergebracht. Die beiden Zonen können aus separaten Schichten bestehen oder begrenzten Bereichen innerhalb einer einzigen Schicht. Sie können aus den gleichen oder verschiedenen Materialien aufgebaut sein und durch Laminierung oder andere übliche Techniken miteinander verbunden sein.
Die beiden Zonen des Elementes können selbsttragend sein, d.h. aus Materialien aufgebaut sein, die fest genug sind, um die Integrität des Materials zu gewährleisten. Vorzugsweise befinden sich die Zonen auf einem Träger. Ein solcher Träger kann aus irgendeinem geeigneten dimensionsstabilen Material bestehen, und ist vorzugsweise transparent (d.h. für Strahlungen durchlässig), d.h. aus einem Material bestehen, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element sollte dem beabsichtigten Bestimmungsverfahren angepaßt sein (Reflexions- oder Transmissions-Spektroskopie). Geeignete Trägermaterialien sind beispielsweise Papier, Metallfolien, Polysterol, Polyester, Polycarbonate, Celluloseester und andere zum Stand der Technik gehörende Materialien.
Die poröse Ausbreitzone kann aus irgendeinem geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Material oder Mischungen hiervon oder von beiden hergestellt werden. Das Porenvolumen und die durchschnittliche Porengröße dieser Zone kann verschieden sein, je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck. Werden beispielsweise Blut oder andere Flüssigkeitsproben verwendet, die Materialien von hohem Molekulargewicht enthalten, so ist das Porenvolumen und die durchschnittliche Porengröße im allgemeinen größer als wenn Serum oder Urin zur Untersuchung verwendet werden.
Geeignete Ausbreitzonen lassen sich ausgehend von fasrigen Materialien, entweder in Mischung mit einem geeigneten Bindemittel oder in ein Gewebe einverleibt, herstellen, wie es in der US-Patentschrift 4 292 272 beschrieben wird.
Alternativ und vorzugsweise wird die Ausbreitzone hergestellt aus polymeren Zusammensetzungen (z.B. aus Blush- Polymeren) oder teilchenförmigen Materialien, wie sie in den US-Patentschriften 3 992 158, 4 258 001 und 4 430 436 und in der Japanischen Patentpublikation 57(1982)-101760 beschrieben werden. Es ist wünschenswert, daß die Ausbreitzone isotrop-porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Zone gleich ist, was bewirkt wird durch verbindende Räume oder Poren zwischen Teilchen, Fasern oder polymeren Strähnen.
In besonders vorteilhafter Weise wird die poröse Ausbreitzone als Blush-Polymerschicht hergestellt, wie es aus der vorerwähnten US-Patentschrift 3 992 158 bekannt ist.
Die Elemente weisen zwei wesentliche Zonen auf, wobei mindestens eine hiervon eine poröse Ausbreitzone ist. Die andere wesentliche Zone kann eine Reagenszone sein oder eine Registrierzone entsprechend den Zonen, die bekannt sind. Das Element kann ferner andere Zonen aufweisen, einschließlich, jedoch nicht hierauf begrenzt, zusätzliche Ausbreitzonen, wie Strahlung-blockierende Zonen oder Strahlung-filternde Zonen, Haftzonen oder Trägerzonen. Vorzugsweise befindet sich eine Haftzone zwischen den beiden wesentlichen Zonen. Die Haftzone hilft dabei sicherzustellen, daß das Isoenzym und das Substrat nicht vor dem Untersuchungsverfahren miteinander reagieren. Sämtliche Zonen im Element stehen im allgemeinen im Flüssigkeitskontakt miteinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und Reaktionsprodukte (z.B. Farbstoffe) übereinander befindliche Bereiche von benachbarten Zonen passieren können oder zwischen diesen Zonen transportiert werden können. Vorzugsweise sind die Zonen separat voneinander aufgetragene Schichten, obgleich zwei oder mehrere Zonen eine einzelne Schicht bilden können. Abgesehen von den erwähnten Literaturstellen, werden geeignete Elementkomponenten beispielsweise in den US-Patentschriften 4 042 335, 4 132 528 und 4 144 306 beschrieben.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Element mit einem Schichtträger, auf dem in folgender Reihenfolge und in Flüssigkeitskontakt aufgetragen sind eine Schicht mit dem hier beschriebenen Isoenzym, eine Strahlungblockierende Schicht, eine Haftschicht und eine poröse Ausbreitschicht, die ein Substrat für das Isoenzym und den beschriebenen Puffer enthält. Die Isoenzymschicht kann auch eine poröse Ausbreitschicht sein, ist jedoch vorzugsweise eine Reagens- oder Registrierschicht, die ein oder mehrere hydrophile Bindemittel enthält (z.B. Gelatine, Vinylpyrrolidonpolymere oder Acrylamidpolymere), oberflächenaktive Mittel, Beizmittel und andere Zusätze. Die Haftschicht kann ein oder mehrere Haftmaterialien aufweisen, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. Vinylpyrrolidonpolymere, Acrylamidpolymere und andere bekannte Materialien. Die Strahlungblockierende Schicht enthält im allgemeinen ein oder mehrere Bindemittel, oberflächenaktive Stoffe und reflektierende Materialien, die bekannt sind.
Gegebenenfalls kann dies bevorzugte Element weiterhin eine zweite poröse Ausbreitschicht aufweisen, die die äußerste Schicht des Elementes darstellt und die im allgemeinen an die erste poröse Ausbreitschicht angrenzt. Die zweite poröse Ausbreitschicht kann aufgebaut sein aus Materialien gleich oder verschieden von den Materialien der ersten porösen Ausbreitschicht, die das Isoenzymsubstrat enthält. Beispielsweise kann die erste Ausbreitschicht, die den Puffer enthält, aus einem Blush-Polymeren aufgebaut sein, das gemäß US-Patentschrift 3 992 158, wie oben erwähnt, hergestellt worden ist, und die zweite Ausbreitschicht kann aufgebaut sein aus teilchenförmigen Materialien, wie oben beschrieben. Die zweite Ausbreitschicht kann ferner, sofern erwünscht, Puffer enthalten.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung läßt sich eine Vielzahl von verschiedenen Elementen, je nach der angewandten Bestimmungsmethode herstellen. Die Elemente können in eine Vielzahl von Formen überführt werden, einschließlich verlängerten Bändern jeder gewünschten Breite, in Blätter, Slides oder Chips.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann manuell oder automatisch durchgeführt werden. Im allgemeinen erfolgt bei Verwendung der trockenen Elemente eine Theophyllinbestimmung dadurch, daß das Element einer Vorratsrolle entnommen wird, einem Chip-Paket oder einem anderen Lieferanten oder Spender, worauf es physikalisch in Kontakt gebracht wird mit einer Probe (beispielsweise weniger als 200 µl) der Flüssigkeit, die zu untersuchen ist. Ein solcher Kontakt kann in jeder geeigneten Weise herbeigeführt werden, beispielsweise durch Eindippen oder Eintauchen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise durch Betröpfeln des Elementes per Hand oder mittels einer Maschine mit einem Tropfen der Probe mittels eines geeigneten Gebermittels.
Nach der Probenaufbringung wird das Element irgendeiner Konditionierung unterworfen, beispielsweise einer Inkubierung oder Erhitzung, die wünschenswert sein kann, um die Herbeiführung des Testergebnisses zu beschleunigen oder in anderer Weise zu erleichtern.
Die alkalische Phosphatase, die im Element vorhanden ist, katalysiert dann die Reaktion des Substrates mit einer Geschwindigkeit bezogen auf die Menge an alkalischer Phosphatase, die vorhanden ist, und die nicht inhibiert wird durch Theophyllin in der Probe. Der Grad der bestimmbaren Veränderung (beispielsweise Farbstoffbildung) aufgrund der Bildung des Reaktionsproduktes ist quantifizierbar unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung für die Durchführung einer Reflexions- oder Transmissionsspectrophotometrie. Geeignete spectrophotometrische Vorrichtungen und Verfahren sind bekannt. Zu anderen geeigneten Bestimmungsmitteln gehören die Anwendung der Fluoreszenzspectrophotometrie, der Radiometrie oder der Enzymmarkierung. Die Menge an Theophyllin ist umgekehrt proportional der gemessenen Reaktionsrate.
Wird beispielsweise p-Nitrophenylphosphat als Substrat verwendet, so erzeugt die uninhibierte enzymatische Reaktion ein p-Nitrophenol, das bei 400 nm unter Verwendung eines Standard-Spectrophotometers meßbar ist. Der Grad der Farbveränderung kann dann direkt in Relation gesetzt werden zum Grad der Substratreaktion, die wiederum in indirekter Beziehung steht zur Konzentration des Theophyllins in der Probe.

Beispiele 1-2: Vergleichsbeispiele von Elementen

Diese Beispiele sind Vergleichsbeispiele des Bestimmungsverfahrens und der Elemente der vorliegenden Erfindung einerseits und einem Bestimmungsverfahren und Elementen entsprechen denen, wie sie in der EP-A-0 188 372 beschrieben werden. Aus den im folgenden angegebenen Daten ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung zu mehreren verbesserten Eigenschaften führt.
Es wurde ein Element gemäß der Erfindung mit dem folgenden Aufbau und den folgenden Komponenten hergestellt: Bereich Ausbreitschicht Haftschicht Strahlung blockeriende Schicht Titandioxid Celluloseacetat Polyurethanharz (ESTANE ) TRITON X-405 oberflächenaktives Mittel p-Nitrophenylphosphat BRIJ 78 oberflächenaktives Mittel Tris (hydroxymethyl)-aminomethan HCl-Puffer (pH 8) Poly(N-isopropylacrylamid TRlTON X-100 oberflächenaktives Mittel Gelatine (gehärtet) TRlTON X-200E oberflächenaktives Mittel DAXAD 30S oberflächenaktives Mittel Glycerin Piperazin-N, N-bis-(2-hydroxypropansulfonsäure) alkalisches Phosphatase-Rinderleber-Isoenzym Registrierschicht Puffer (pH 8) Magnesiumchlorid TRITON X-100 oberflächenaktives Mittel Poly(styrol-co-N-vinyl-benzyl-N-benzyl-N,N-dimethylammonium chlorid-co-divinyl-benzol) Glycerin Lyophilisiertes Albumin Poly(ehtylineterephthalat) Träger
Ein Vergleichselement (entsprechend dem, das in der EP-A-0 188 327 beschrieben ist, mit der Ausnahme der Konzentrationen an Puffer und alkalischem Phosphatase-Isoenzym) wurde wie das Element der vorliegenden Erfindung hergestellt, mit der Ausnahme, daß Puffer aus der Ausbreitschicht fortgelassen wurde.
Der Arbeitsbereich des Bestimmungsverfahrens wurde ermittelt durch Auftröpfeln von Serum, das verschiedene Mengen an Theophyllin enthält (bis zu 40 µg/ml) auf die Elemente und Messung der Reflexionsschichten über eine sieben Minuten währende Periode unter Anwendung eines Rate-Analyzers. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt. Ein großer Rate-Bereich zeigt eine größere Sensitivität der Theophyllin-Bestimmung an. Die Elemente dieser Erfindung zeigen eine statistisch signifikante Erhöhung des Arbeitsbereiches gegenüber dem Vergleichselement an. Tabelle I Element * (I.E./m²) ** (g/m²) Bereich Vergleich Beispiel * Menge an alkalischen Phosphatase-Isoenzym im Element. ** Menge an Puffer in der Ausbreitschicht.
Die gleichen Elemente wurden dann auf ihre Aufbewahrungseigenschaften hin untersucht durch Messung der prozentualen Veränderung, ausgehend von einem Referenzwert bei zwei Theophyllin-Konzentrationen. Die prozentuale Veränderung wurde unter Anwendung der folgenden Berechnungsgrundlage ermittelt:
%-Veränderung= Rate (Freezer*)-Rate (25 ºC, 15% relative Feuchtigkeit) / Rate (Freezer*) X 100 *-20ºC, 15% relative Feuchtigkeit
Die Elemente wurden verwendet zur Bestimmung von Theophyllin bei 1 und 40 µg/ml-Konzentrationen durch Auftröpfeln einer 10 µl-Probe der Calibratorflüssigkeit auf die poröse Ausbreitschicht der Elemente. Während der Inkubation bei 37ºC wurde der Grad der Enzymaktivität gemessen durch Überwachung der Absorptionsfähigkeit der erhaltenen Farbstoffes bei 410 nm unter Verwendung eines Rate-Analysators.
Tabelle II unten zeigt die erhaltenen Aufbewahrungsdaten. Die Elemente dieser Erfindung zeigten beträchtlich verbesserte Aufbewahrungsqualitäten bei beiden Theophyllin-Konzentrationen. Tabelle II %-Änderung Element Theophyllin Konzentration (µg/ml) Vergleich Beispiel

Beispiel 3: Element mit verminderter Quellung

Dieses Beispiel veranschaulicht die verminderte Quellung, die mit dem Element dieser Erfindung beobachtet wird (Beispiel 2 oben) im Vergleich zu einem entsprechenden Vergleichselement mit keinem Puffer in der Ausbreitschicht.
Die Quellung in der Strahlung-blockierenden Schicht der Elemente wurde gemessen durch Vergleich von Dickenmessungen der Schicht in sowohl trockenem, wie auch mit einer Salzlösung befeuchteten Zuständen. Der unterschied in den Dickenwerten entspricht dem Grad der Quellung und ist identifiziert in Form von X in Mikrometern in der Tabelle III unten.
Die Tabelle III zeigt die erhaltenen Daten. Es ist offensichtlich, daß das Element der Erfindung eine beträchtlich verminderte Quellung im Vergleich zu dem Vergleichselement aufweist. Tabelle III Element X (Micrometer) Vergleich Beispiel

Claims

1. Trockenes analytisches Element für die Bestimmung von Theophyllin mit einer porösen Ausbreitzone und mindestens einer zusätzlichen Zone in Flüssigkeitskontakt miteinander, enthaltend ein Isoenzym von alkalischer Phosphatase, das auf ein Subtrat für das Isoenzym bei einem pH-Wert von 9 oder weniger einzuwirken vermag, sowie ein Substrat für das Isoenzym, wobei gilt, daß sich die Phosphatase und das Substrat in verschiedenen Zonen des Elementes befinden, dadurch gekennzeichnet, daß das Element ferner einen Puffer enthält, der den pH-Wert während der Bestimmung auf 9 oder darunter zu halten vermag, und daß sich mindestens 80 % des Puffers in der porösen Ausbreitzone befinden.

2. Element nach Anspruch 1, in dem der Puffer ein Stickstoff enthaltender organischer Puffer ist.

3. Element nach einem der Ansprüche 1 und 2, in dem der Puffer besteht aus: Tris(hydroxymethyl)aminomethan.HCl; Glycylglycin; N-Tris(hydroxymethyl-methyl-2-aminoethansulfonsäure oder N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure.

4. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem sich das Phosphatasesubstrat in der Ausbreitzone befindet.

5. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das Substrat ein organischer Mono- oder Diester der Phosphorsäure ist und das Phosphatase-Isoenzym alkalische Rinderleber-Phosphatase.

6. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiter dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen der zusätzlichen Zone und der porösen Ausbreitzone eine Strahlungen blockierende Zone aufweist.

7. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die poröse Ausbreitzone eine Blush-Polymer-Ausbreitschicht ist.

8. Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin mit den Stufen:

A. Kontaktieren einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie Theophyllin enthält, bei einem pH-Wert von 9 oder darunter mit dem trockenen analytischen Element nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und

B. Bestimmung einer feststellbaren Veränderung, die sich aus dem Kontakt ergibt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, das bei einem pH-Wert von 7 bis 9 durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 und 9, in dem als biologische Flüssigkeit menschliches Blutserum oder Blut eingesetzt wird.