DE3779519T2

DE3779519T2 - Analytisches element mit erhoehtem alkalischem phosphatase-isoenzym und verfahren zur bestimmung von theophyllin.

Info

Publication number: DE3779519T2
Application number: DE8787307498T
Authority: DE
Inventors: C O Eastman Kodak Comp Frickey; C O Eastman Kodak Compa Norton
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1986-08-25
Filing date: 1987-08-25
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2007-08-26
Also published as: EP0258035A2; JPH0698033B2; EP0258035A3; DE3779519D1; US4806470A; EP0258035B1; JPS6379600A; CA1290662C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die klinische Chemie und einen Test biologischer Flüssigkeiten auf Theophyllin. Insbesondere betrifft sie ein trockenes analytisches Element und ein Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin in menschlichen biologischen Flüssigkeiten.
Bei Theophyllin handelt es sich um ein Arzneimittel, das regelmäßig zur Behandlung von Asthma und Lungenerkrankungen verabreicht wird. Um das Arzneimittel erfolgreich ohne ernsthafte unerwünschte Wirkungen verwenden zu können, muß dieses regelmäßig und sorgfältig bei Patienten überwacht werden, da es in einem relativ schmalen therapeutischen Bereich von 1 bis 2 mg/dl eingesetzt wird.
Zahlreiche Verfahren wurden angewandt, um in menschlichem Serum die menge an Theophyllin zu bestimmen. Die meisten dieser Verfahren haben gravierende Nachteile. Zum Beispiele erfordern die spektrophotometrischen methoden große Probenvolumen, erhebliche Vorbehandlungen und unterliegen Interferenzen mit strukturell ähnlichen Xanthinen, wie Koffein und Theobromin. Bekannte gaschromatographische Methoden sind zwar spezifischer, erfordern aber eine Derivatisierung und sind zeitaufwendig.
Nicht-isotrope Immunotestverfahren werden häufig verwendet, weil sie schnell zu Ergebnissen führen und leicht einzusetzen
sind. Obwohl diese Immunoassaytechniken für gewöhnlich zufriedenstellende Empfindlichkeit habe, wurde nun gefunden, daß stark erhöhte Werte in Abhängigkeit von dem Zustand der Niere des Patienten und der Spezifität des in dem Test verwendeten Antikörpers erhalten werden. Darüberhinaus erfordern die Immunotests im allgemeinen teure Reagenzien mit begrenzter Stabilität.
Hochleistungs-Flüssigchromatographie(HPLC)-Verfahren sind ebenso bekannt. Diese Verfahren variieren in ihrer Spezifität in Abhängigkeit davon, ob eine Vorbehandlung der Testprobe durchgeführt wird. Organische Extraktionsschritte sind erforderlich, um die Zuverlässigkeit und Spezifität des Tests zu verbessern. Viele Chromatographiemethoden unterliegen Interferenzen durch eine Reihe von Substanzen einschließlich der häufig vorkommenden Antibiotika. Andere Nachteile schließen das Erfordernis teurer Instrumentierungen und eines spezialisierten technischen Personals zur Durchführung des Tests ein.
Es ist bekannt, daß Theophyllin durch messung der inhibitorischen Wirkung auf die alkalische Phophatase-Aktivität bestimmt werden kann. Es ist zudem bekannt, daß bei einem solchermaßen durchgeführten Test menschlicher biologischer Flüssigkeiten die endogene alkalische Phosphatase den Test beeinflußt und unzuverlässige Ergebnisse im höheren Bereich nach sich zieht. Endogene alkalische Phosphatase muß in diesem Fall vor dem Test in irgendeiner Weise zerstört oder entfernt werden, um Schwierigkeiten zu vermeiden.
Ein deutlicher Fortschritt des Standes der Technik wird in der EP-A-0 188 372 beschrieben. Das darin beschriebene und beanspruchte Element enthält jedoch von 10 bis 50 I.E./m² des alkalischen Phosphatase-Isoenzyms, das für den Test benötigt wird. Bevorzugte mengen werden mit 20 bis 40 I.E./m² angegeben.
Während das zuvor beschriebene Element einen einfachen und schnellen Test auf Theophyllin bereitstellt, wurde nun gefunden, daß weiterhin ein Bedürfnis besteht, den Effekt von endogener alkalischer Phosphatase und Hämoglobin in biologischen Testflüssigkeiten auf den Assay zu vermindern. Assays, die mit Elementen nach dem Stand der Technik durchgeführt werden, sind in Gegenwart der genannten Wirkstoffe in unerwünschter Weise vorbelastet.
Die zuvorbeschriebenen Probleme werden überwunden mit einem trockenen analytischen Element für die Bestimmung von Theophyllin mit einem adsorbierenden Trägermaterial, einem Puffer, der den pH-Wert während der Bestimmung bei 9 oder darunter hält, und im Flüssigkeitskontakt erste und zweite Zonen, von denen die erste Zone ein Isoenzym von alkalischer Phosphatase, das auf ein Substrat für das Isoenzym bei einem pH-Wert von 9 oder weniger einzuwirken vermag und die zweite Zone ein Substrat für das Isoenzym enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das alkalische Phosphatase-Isoenzym in einer Menge von mindestens 100 I.E./m² vorliegt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin mit den folgenden Schritten bereit:
A. Kontaktieren einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie Theophyllin enthält, bei einem pH-Wert von 9 oder darunter, mit dem trockenen analytischen Element, wie zuvor beschrieben und
B. Bestimmung der erkennbaren Veränderung, die sich aus dem Kontakt ergibt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen einfachen und schnellen Test auf Theophyllin bereit mit all den Vorteilen des Elementes und Tests wie beschrieben und beansprucht in der EP-A-0 188 372. Zusätzlich weist der Test der vorliegenden Erfindung weniger Interferenzen durch endogene alkalische Phosphatase und Hämoglobin in biologischen Testflüssigkeiten auf.
Diese Verbesserungen werden durch einen deutlichen Anstieg der Menge an alkalischer Phosphatase-Isoenzym in dem Element erreicht. Insbesondere ist das Isoenzym in einer Menge von wenigstens 100 I.E./m² vorhanden im Gegensatz zu 10-50 I.E./m², die Elemente des Standes der Technik einsetzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Theophyllin in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere menschliche biologische Flüssigkeiten. Bestimmung im hier vorliegenden Wortgebrauch bezieht sich auf entweder qualitative oder quantitative Messung der Menge von Theophyllin in einer Testprobe. Insbesondere kann die Erfindung dazu verwendet werden, Theophyllin in menschlichen biologischen Flüsssigkeiten zu bestimmen, die endogene alkalische Phosphatase (das ist ein natürlich vorkommendes Enzym) in irgendeiner seiner enzymatischen Formen (wie beispielsweise in Leber, Gedärmen, Placenta oder Knochen) enthält. Beispielsweise kann die Erfindung vorteilhaft dazu verwendet werden, Seren, Vollblut, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Auswurf, Galle, Speichel und andere biologische Flüssigkeiten zu testen. Es ist auch möglich die Erfindung dazu zu verwenden, flüssige Preparation von Gewebe wie menschliches Skelett, Muskel, Niere, Plazenta, Herz, Darm, Lunge und andere Gewebe zu testen. Die bei der Durchführung der Erfindung bevorzugten biologischen Flüssigkeiten sind menschliche Seren und Blut.
Bei der Durchführung der Erfindung ist Theophyllin bestimmbar durch Inhibierung der Aktivität von alkalischer Phosphatase, einem Enzym, das mit einer Reihe von Substraten ein meßbares Reaktionsprodukt hervorruft. Zum Beispiel zeigt die folgende Gleichung stellvertretend die Produktion eines meßbaren Farbstoffs durch den Einsatz alkalischer Phosphatase unter Verwendung eines typischen Substrats, -Nitrophenylphosphat:
-Nitrophenylphosphat + H&sub2;O Alkalische Phosphatase/Puffer
-Nitrophenol (Farbstoff) + Phosphat
Der Farbstoff kann dann colorimetrisch mit einer geeigneten spektrophotometrischen Meßapparatur gemessen werden. Die in der Probe vorhandene Menge an Theophyllin, die mit dem Substrat und dem Enzym in Kontakt gebracht wurde, ist umgekehrt proportional zu der gemessenen Menge des Farbstoffs.
Die vorliegende Erfindung wird bei einem pH von 9 oder weniger und vorzugsweise bei einem pH von 7 bis 9 durchgeführt. Wie in der EP-A-0 188 372 hervorgehoben wird, hat endogene alkalische Phosphatase in menschlichen Flüssigkeiten eine verminderte Aktivität bei einem pH von 9 oder weniger. Aus diesem Grunde hat die Anwesenheit des endogenen Isoenzyms der alkalischen Phosphatase in einer Testprobe weniger Auswirkungen auf den Test auf Theophyllin, wenn er bei einem pH von 9 oder weniger durchgeführt wird. Isoenzyme der alkalischen Phosphatase, die in einer Umgebung eines pHs von 9 oder weniger nicht inaktiviert werden, können wie auch immer in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Anwesenheit von Theophyllin anzuzeigen. Jegliches Isoenzym aus jeder geeigneten Quelle mit den gewünschten Eigenschaften, das ist eine meßbare Aktivität bei einem pH von 9 oder weniger, kann bei der Ausführung der Erfindung Verwendung finden. Besonders brauchbar sind Isoenzyme, die aus boviner Quelle gewonnen wurden, wie beispielsweise Gewebe und Organe (beispielsweise Leber) von Kälbern oder Rindern. Isoenzyme aus einer Reihe anderer Quellen (beispielsweise Mikroorganismen, vogelartige und nicht menschliche säugetierartige Quellen) können ebenso verwendet werden. Es liegt im Rahmen der Fähigkeit eines durchschnittlichen Fachmanns der klinischen Chemie, Isoenzyme aufzufinden, die bei der Ausübung der Erfindung eingesetzt werden können.
Bei der Durchführung der Erfindung kann eine oder eine Vielzahl alkalischer Phosphatasesubstrate verwendet werden. Diese Substrate müssen derart sein, daß sie aufgrund einer enzymatischen Reaktion mit dem Isoenzym zu einer direkt meßbaren Veränderung führen. Beispielsweise wird das Substrat in eines oder mehrere Reaktionsprodukte umgewandelt wie ein Chromogen, radioisotopisch markierte Spezies und andere geeignete feststellbare Produkte. Die feststellbare Änderung, die während des Tests gemessen wird, kann das Auftreten oder das Verschwinden eines solchen meßbaren Produktes sein, oder die Umwandlung eines meßbaren Produktes in ein anderes. Alternativ kann die meßbare Veränderung dadurch erreicht werden, daß eine Serie von Reaktionen durch Einwirkung des Isoenzyms auf das Substrat initiiert wird. Beispielsweise bewirkt das alkalische Phosphatase-Isoenzym bei dem Substrat, daß ein anderes Enzym oder Reagens freigesetzt wird, das dann in einer oder mehreren Reaktionen verwendet wird, um ein meßbares Produkt hervorzurufen. Das meßbare Produkt kann direkt meßbar sein oder einige physikalische Trennungen oder Handhabungen zur Messung erforderlich machen.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung stellt der Test ein Chromogen oder Fluorogen als meßbares Produkt der enzymatischen Reaktion bereit. Im allgemeinen haben die Substrate, die in solchen Reaktionen eingesetzt werden können, eine Phosphatgruppe, die während der enzymatischen Reaktion von dem Substratmolekül abgespalten wird. Solcherlei Substrate umfassen organische Mono- oder Di-Ester der Phosphorsäure oder Salze davon. Beispiele besonders brauchbarer Substrate umfassen -Nitrophenylphosphat, Phenolphthaleinmonophosphat, Phenolphthaleindiphosphat, Thymolphthaleinmonophosphat, Indoxylphosphat, Phenylphosphat, α-Naphtholphosphat, β-Naphtholphosphat, α-Glycerolphosphat, -Mehtylfluoresceinphosphat, -Carboxyphenylphosphat, Alkalimetallsalze davon und andere aus dem Stand der Technik bekannte, wie beispielsweise aus US-A-3 425 912 und EP-A-61 731 bekannt. Bevorzugte Substrate sind -Nitrophenylphosphat und 4-(4-Nitro-2-Methylsulfonylphenylazo)- Naphtol-1-Phosphat.
Isoenzym und Substrat müssen in verschiedenen Zonen des Elementes getrennt gehalten werden, bevor dieses mit der flüssigen Testprobe in Kontakt gebracht wird. Die Menge des Isoenzymes im Element ist wichtig, um die beschriebenen Vorteile zu erhalten. Das Element muß wenigstens etwa 100 I.E./m² des Isoenzymes enthalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Enzym mit einer Beschichtungsstärke von wenigstens 125 I.E./m² vorhanden. Im Zusammenhang mit dieser Offenbarung steht I.E. für internationale Einheiten der Isoenzymaktivität mit der Definition, daß ein I.E. der Menge an Isoenzymaktivität entspricht, die erforderlich ist, um die Umsetzung von einem Mikromol des Substrats pro Minute unter Standard-pH und Temperaturbedingungen für das Isoenzym zu katalysieren.
Die Menge des Substrats in dem Element kann in weiten Grenzen variieren. Im allgemeinen ist es in Mengen von 1 bis 5 und vorzugsweise von 2 bis 4 g/m² vorhanden. Weitere Zusatzstoffe (beispielsweise oberflächenaktive Substanzen, Bindemittel und Puffer) werden in solchen Mengen in das Element eingebracht, daß sie im Rahmen des Durchschnittskönnens eines Fachmanns in der klinischen Chemie liegen.
Der Assay wird bei einem pH von 9 oder weniger, vorzugsweise von 7 bis 9 durchgeführt. Irgendein geeigneter Puffer oder Mischung von Puffern kann bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden, solange der pH-Wert während des Tests auf 9 oder darunter gehalten wird. Ganz besonders brauchbar sind stickstoffhaltige organische Puffer, von denen viele Standard für den Stand der Technik sind (beispielsweise, siehe Good et al, Biochem, 5(2), 1966, Seiten 467 bis 477).
Repräsentative Puffer umfassen die Gruppe bestehend aus Tris(hydroxymethyl)aminoethan HCL, Glycylglycin, N-Tris(Hydroxymethyl)-Methyl-2-Aminoethansulfonsäure und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure, sind aber hierauf nicht beschränkt. Der zuerst genannte Puffer ist der am meisten bevorzugte.
Der Puffer kann in jeder Zone des Elementes zugegen sein. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist jedoch im wesentlichen der gesamte Puffer in der Ausbreitzone (weiter unten beschrieben) des erfindungsgemäßen Elementes vorhanden. Das bedeutet, daß im wesentlichen wenig Puffer in anderen Zonen des Elementes vorhanden ist. In einem besonderen Fall ist wenigstens 80% des Puffers in der Ausbreitzone angeordnet. Der Puffer ist darin in geeigneten Mengen vorhanden abhängig von dem jeweiligen Puffer, der den pH der Reaktionsmischung auf den gewünschten ph von 9 oder weniger hält. Diese puffernden Mengen können leicht durch einen Fachmann der klinischen Chemie bestimmt werden, sind aber in der Regel wenigstens 1 g/m².
Weitere optionale Reagenzien können dem Element, falls gewünscht, hinzugefügt werden. Beispielsweise können Metallionen-Aktivatoren zur Aktivierung des Isoenzyms hinzugefügt werden. Solcherlei Aktivatoren umfassen zweiwertige Kationen wie Mg&spplus;&spplus;, Co&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;, Zn&spplus;&spplus;, Sr&spplus;&spplus; und Fe&spplus;&spplus;, handhabbar in freier oder Salzform. (beispielsweise Aspartat, Acetat, Chlorid oder Sulfat)
Alternativ können Inhibitoren der Enzymaktivität verwendet werden, wenn das Level der endogenen alkalischen Phosphatase in den Testproben anormal hoch ist.
Brauchbare Inhibitoren umfassen Phenylalanin und Tetramisol. Solcherlei Inhibitoren haben vorteilhafterweise keinen Einfluß auf die Aktivität von einigen nicht menschlichen alkalischen Phosphatase-Isoenzymen.
Zusätzlich werden vorzugsweise eine oder mehrere Phosphatakzeptoren in das Element eingebracht, um die Geschwindigkeit der Enzymreaktion, falls Phosphatsubstrate verwendet werden, zu erhöhen. Brauchbare Phosphatakzeptoren umfassen Aminoalkohole oder Derivate davon oder aliphatische Amine, von denen die Aminoalkohole besonders geeignet sind. Beispiele für solche Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt.
Glycerin und andere Befeuchtungsmittel können einer oder mehreren Zonen des Elementes hinzugefügt werden, um ein Aufwellen des Elementes zu vermindern.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit einem trockenen analytischen Element durchgeführt, welches umfaßt ein adsorbierendes Trägermaterial, zum Beispiel ein dünnes Blatt eines selbsttragenden oder saugfähigen Materials, so wie Filterpapier oder Streifen, die die oben beschriebenen Puffer, Isoenzyme und Substrate enthalten. Das Element ist wenigstens in zwei Zonen unterteilt und das Isoenzym und das Substrat in individuellen Zonen untergebracht. Solche Elemente sind im Stand der Technik als Teststreifen, Eintauchstäbchen oder diagnostische Agenzien bekannt.
Die Reagenzien können in ein geeignetes adsorbierendes Trägermaterial durch Einsaug-, Imprägnierungs-, Beschichtungs- oder andere geeignete Techniken, eingebracht werden. Brauchbare adsorbierende Materialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität, wenn sie Wasser oder biologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Serum ausgesetzt werden. Verwendbare Elemente können aus Papier, porösen partikulären Strukturen, porösen Polymeren, Zellulose, Glasfasern, gewobenen und nicht-gewobenen Stoffen (synthetisch und nicht synthetisch) und anderen geeigneten Materialien hergestellt werden. Brauchbare Materialien und Verfahren zur Herstellung solcher Elemente sind im Stand der Technik wohl bekannt.
Die zwei Zonen können getrennte Schichten oder begrenzte Gebiete innerhalb einer einzigen Schicht sein. Sie können aus den gleichen oder unterschiedlichen Materialien zusammengesetzt und durch Lamenierung oder andere Standardtechniken miteinander verbunden werden. Vorzugsweise ist wenigstens eine der beiden Zonen eine poröse Ausbreitzone (weiter unten beschrieben).
Die beiden Zonen des Elementes können selbsttragend sein, also aus Materialien bestehen, welche stark genug sind, die Integrität aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise sind die Zonen auf einem Träger angebracht. Dieser Träger kann aus irgendeinem geeigneten dimensionsstabilen und vorzugsweise transparentem (das bedeutet strahlungsdurchlässigem) Material sein, welches elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge von 200 bis 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein bestimmtes Element sollte mit der beabsichtigten Bestimmungsart (Reflektions- oder Transmissionsspektroskopie) verträglich sein. Brauchbare Trägermaterialien umfassen Papier, Metallfolie, Polystyren, Polyester, Polycarbonate, Cellulose-Ester und andere aus dem Stand der Technik bekannte.
Die poröse Ausbreitzone kann aus jeglichem geeigneten faserigen oder nichtfaserigen Material oder Mischungen des einen und/oder anderen sein. Das freie Volumen oder die durchschnittliche Porengröße dieser Zone kann entsprechend der beabsichtigten Verwendung variiert werden. Wenn beispielsweise Blut oder andere flüssige Proben mit Materialien von hohem Molekulargewicht getestet werden sollen, ist das freie Volumen oder die durchschnittliche Porengröße im allgemeinen größer als im Falle eines Tests von Serum oder Urin.
Brauchbare Ausbreitzonen können dadurch hergestellt werden, daß faserige Materialien entweder vermischt mit einem geeigneten Bindemittel oder verwoben zu einem Stoff verwendet werden, wie es die US-A-4 292 272 beschreibt. Alternativ und vorzugsweise wird die Ausbreitzone aus polymeren Zusammensetzungen (beispielsweise Blush-Polymer) oder partikulären Materialien, wie beschrieben in US-A-3 992 158, US-A-4 258 001, US-A-4 430 436 und der Japanischen Patentpublikation 57(1982)-101760, hergestellt. Es ist erwünscht, daß die Ausbreitzone isotrop porös ist, was bedeutet, daß die Porösität die gleiche in jeder Richtung innerhalb der Zone ist, wie sie durch untereinander verbundene Räume oder Poren zwischen Partikeln, Fasern oder polymeren Strängen bestimmt wird.
Besonders bevorzugt wird die poröse Ausbreitzone als Blush-Polymerschicht, hergestellt wie es die zuvor genannte US-A-3 992 158 beschreibt.
Die Elemente haben zwei wesentliche Zonen, von denen wenigstens eine eine poröse Ausbreitzone sein kann. Die andere wesentliche Zone kann eine Reagenzzone oder eine Feststellungszone sein, wie jene Zonen, die im Stand der Technik bekannt sind. Das Element kann weitere Zonen einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein, wie zusätzliche Ausbreitzonen, Strahlungssperr- oder Strahlungsfilterzonen, Unterlage- oder Grenzzonen. Vorzugsweise ist eine Unterlagezone (Grundierung) zwischen den beiden wesentlichen Zonen angeordnet. Die Unterlagezone sorgt für eine Haftung zwischen den Zonen und trägt dazu bei, daß das Isoenzym nicht mit dem Substrat vor dem Assay interagiert. Alle Zonen des Elementes sind im allgemeinen in Flüssigkeitskontakt miteinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und Reaktionsprodukte (beispielsweise Farbstoffe) zwischen übereinander befindlichen Regionen angrenzender Zonen hindurchtreten und transportiert werden können. Vorzugsweise sind die Zonen getrennt voneinander beschichtete Schichten, obwohl zwei oder mehr Zonen eine einzelne Schicht ausmachen können. Neben den bereits genannten Fundstellen sind geeignete Elemente beispielsweise in US-A-4 042 335, US-A-4 132 828 und US-A-4 144 306 beschrieben.
Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Erfindung ist ein Element mit einem Träger, auf dem in dieser Reihenfolge und in Flüssigkeitskontakt eine Schicht mit dem zuvor beschriebenen Isoenzym, eine Strahlungs-Sperrschicht, eine Unterlageschicht und eine poröse Ausbreitschicht, welche Substrate für das Isoenzym und den zuvor beschriebenen Puffer enthält, angeordnet sind. Die Isoenzymschicht kann ebenso eine poröse Ausbreitschicht sein, aber vorzugsweise ist sie eine Reagenz- oder Feststellungsschicht, enthaltend eine oder mehrere hydrophile Bindemittel (beispielsweise Gelatine, Vinyl, Pyrrolidonpolymere oder Acrylamidpolymere), oberflächenaktive Substanzen, Beizmittel und andere Zusatzstoffe. Die Unterlageschicht (Grundierung) kann eine oder mehrere Grundierungsmaterialien umfassen, die im Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise Pyrrolidonpolymere oder Acrylamidpolymere. Die Strahlungssperrschicht enthält im allgemeinen ein oder mehrere Bindemittel, oberflächenaktive Substanzen und reflektive Materialien, die im Stand der Technik bekannt sind.
Gegebenenfalls kann dieses bevorzugte Element eine zweite poröse Ausbreitschicht umfassen, welche die äußerste Schicht des Elementes ist und welche im allgemeinen an die erste poröse Ausbreitschicht angrenzt. Die zweite poröse Ausbreitschicht kann aus gleichem oder anderem Material hergestellt werden als jenem der ersten porösen Ausbreitschicht, welche das Isoenzymsubstrat enthält. Beispielsweise kann die erste Ausbreitungsschicht mit dem Puffer Blush-Polymere, die gemäß der erwähnten US-A-3 992 158 hergestellt wurden, umfassen und die zweite Schicht kann sich dann aus den zuvor beschriebenen partikulären Materialien zusammensetzen. Diese zweite Ausbreitschicht kann, falls erwünscht, Puffer enthalten.
Eine Vielzahl unterschiedlichster Elemente, abhängig von der Testmethode, können erfindungsgemäß hergestellt werden. Die Elemente können eine Vielzahl von Formen annehmen, einschließlich ausgedehnter Bänder von jeder gewünschten Breite, Blätter, "slides" oder "chips". Der erfindungsgemäße Test kann manuell oder automatisiert sein. Im allgemeinen wird die Theophyllin-Bestimmung unter Verwendung der trockenen Elemente durchgeführt, indem das Element von einer Zufuhrrolle einer "chip"-Packung oder anderen Quelle entnommen wird und in physikalischen Kontakt mit der Probe (beispielsweise weniger als 200ul) der zu testenden Probe gebracht wird. Dieser Kontakt kann in irgendeiner geeigneten Weise erreicht werden, beispielsweise durch Eintauchen oder Einbringen des Elementes in eine Probe oder vorzugsweise durch Betupfen des Elementes von Hand oder durch eine Maschine mit einem Tropfen der Probe oder mit einem geeigneten Spender.
Nach dem Aufbringen der Probe wird das Element irgendeiner Bedingung unterzogen, die erwünscht ist, um den Erhalt des Testergebnisses zu beschleunigen oder auf andere Weise zu erleichtern (so beispielsweise Inkubation oder Erhitzung).
Die in den Elementen vorhandene alkalische Phophatase katalysiert dann die Reaktion des Substrats mit einer Rate, die sich aus der anwesenden Menge alkalischer Phosphatase ergibt, die nicht durch Theophyllin in der Probe inhibiert wird. Die Rate der meßbaren Änderung (beispielsweise Farbstoffbildung) entsprechend einer Bildung des Reaktionsproduktes kann mittels geeigneter Apparaturen für die Reflektions- oder Transmissionsspektrophotometrie mengenmäßig bestimmt werden. Geeignete spektrophotometrische Apparaturen und Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. Andere geeignete Meßmethoden umfassen die Verwendung der Fluoreszensspektrophotometrie, Radiometrie oder Enzymmarkierung. Die Menge an Theophyllin ist umgekehrt proportional zu der gemessenen Reaktionsrate.
Wenn beispielsweise -Nitrophenylphosphat als Substrat verwendet wird, wird durch die nicht inhibierte enzymatische Reaktion -Nitrophenol erhalten, welches mittels eines Standardspektrophotometers bei 400 Nanometer meßbar ist. Die Rate der quantifizierbaren Farbveränderung kann dann direkt auf die Rate der Substratreaktion bezogen werden, welche wiederum in einer indirekten Beziehung mit der Konzentration des Theophyllins in der Probe steht.

Beispiele 1-2: Vergleichsbeispiele von Elementen

Diese Beispiele sind Vergleiche von erfindungsgemäßen Tests und Elementen mit Tests und Elementen nach der EP-A-0 188 372. Wie sich aus den angegebenen Daten ergibt, zeigt sich bei dem erfindungsgemäßen Test eine verminderte Interferenz durch endogene alkalische Phophatase und Hämoglobin im Vergleich zu den Kontrolltesten.
Es wurde ein erfindungsgemäßes Element mit folgendem Format und Komponenten hergestellt: Beschichtungsstärken Ausbreitschicht Titandioxid Celluloseacetat Polyurethan Harz (ESTANETM) TRITONTM x-405 (Oberflächen-aktive-Substanz) -Nitrophenyl Phosphat BRIJTM 78 (Oberflächen-aktive-Substanz) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan x HCl Puffer (pH 8) Grundierungsschicht Strahlungs-Sperrschicht Feststellungsschicht Poly(N-isopropyl)acrylamid TRITONTMX-100 (Oberflächen-aktive-Substanz) Gelatine (gehärtet) TRITON TMX-200E (Oberflächen-aktive-Substanz) Titan dioxid DAXADTM30S Oberflächen-aktive-Substanz Tris(hydroxymethyl)-aminomethan x HCl Puffer (pH 8) Glycerin Piperazin-N,N'-bis-(2-hydroxypropan-sulfonsäure Alkalische Phosphatase Rinderleber Isoenzym (siehe Tabelle I unten) Magnesiumchlorid Poly(styrol-co-N-vinyl-benzyl-N-benzyl-N,N-dimethylammonium chlorid-co-divinyl-benzol) Glycerin gefriergetrocknetes Eiweiß Polyethylenterephthalat-Träger
Kontrollelemente wurden entsprechend hergestellt mit der Ausnahme, daß die Menge an alkalischem Phosphatase Isoenzym in der Feststellungsschicht geringer als 100 I.E./m² war (siehe Tabelle I unten).
Die Elemente wurden zur Bestimmung von Theophyllin auf die folgende Weise verwendet. Es wurden zwei Testflüssigkeiten hergestellt, jedes enthielt 18,5 ug/ml an Theophyllin. Einer dieser Flüssigkeiten wurden 1000 I.E. an menschlicher alkalischer Phosphatase zugefügt. Die Theophyllinkonzentration jeder Testflüssigkeit wurde dadurch bestimmt, daß ein Volumen von 10 ul einer Probe der Flüssigkeit auf die poröse Ausbreitschicht von jedem Element aufgetropft wurde. Während der Inkubation bei 37ºC wurde die Rate der Enzymaktivität durch Aufzeichnung der Adsorption des sich ergebenden Farbstoffes bei 410 nm unter Verwendung eines Standardanalysators für die klinische Chemie bestimmt.
Die Ergebnisse werden in der Tabelle I unten gezeigt. Eine Vorlage (ug/ml) wurde dadurch bestimmt, daß die vorhergesagte Konzentration von gepaarten menschlichen Seren mit Theophyllin mit und ohne 1000 I.E. an menschlicher alkalischer Phosphatase verglichen wurden. Eine annehmbare Vorlage ist geringer als 3 ug/ml. Es ist offensichtlich, daß die Kontrollelemente eine nicht akzeptierbare Vorlage durch die endogene alkalische Phosphatase hatten. Die Elemente der vorliegenden Erfindung wiesen demgegenüber deutlich geringere Vorlagen auf. Tabelle I Alkalische Phosphatase Element Isoenzym Konzentration Vorlage Kontrolle Beispiel
Es wurde weiterhin beobachtet, daß diese Verbesserung bei der Vorlage erreicht wurde, nachdem die erfindungsgemäßen Elemente bei 25ºC und 15% relativer Feuchtigkeit über eine Woche gelagert wurden. Die Elemente der Erfindung haben offensichtlich verbesserte Lagereigenschaften. Alle zuvor beschriebenen Elemente wurden nach einer Lagerung dadurch bewertet, daß Testflüssigkeiten mit unterschiedlichen Mengen an Theophyllin (0,9-37,5 ug/ml) auf die Ausbreitschicht aufgebracht und der gebildete Farbstoff, wie zuvor beschrieben, gemessen wurde. Tabelle II unten zeigt die Resultate dieser Teste. Die Vorlage ist akzeptierbar niedrig bei allen Theophyllinkonzentrationen mit den Elementen der vorliegenden Erfindung. Die Kontrollelemente zeigten keinerlei akzeptierbare Vorlage (3 ug/ml oder weniger) bei allen Konzentrationen. Tabelle II Vorlage Element Theophyllin Konzentration Kontrolle Beispiel
Zusätzlich zeigten die erfindungsgemäßen Elemente eine Verbesserung des Meßbereichs bis zu 80 % gegenüber den Kontrollelementen.

Beispiel 3: Vergleich von Elementen und Tests auf Hämoglobinvorlage

Ein Element der Erfindung gemäß Beispiel 2 oben wurde mit einem Element gemäß Kontrolle A oben in einem Test auf Theophyllin (20 ug/ml) verglichen und die Vorlage entsprechend dem Hämoglobin (150 mg/dl) bestimmt.
Die Elemente wurden, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, getestet unter Verwendung einer Testflüssigkeit, die die angezeigten Mengen an Theophyllin und Hämoglobin enthielten. Die Vorlage wurde bestimmt durch einen Vergleich der vorhergesagten Konzentration in der Flüssigkeit mit und ohne Hämoglobin bei gleichem Theophyllinlevel.
Tabelle III unten zeigt die Ergebnisse dieser Tests. Die Elemente der Erfindung zeigten deutlich geringere Vorlagen durch das Hämoglobin im Vergleich zu denen der Kontrollelemente. Eine Vorlage von weniger als 2 ug/ml ist akzeptabel. Tabelle III Element Vorlage Kontrolle Beispiel

Claims

1. Trockenes analytisches Element für die Bestimmung von Theophyllin mit einem absorbierenden Trägermaterial, einem Puffer, der den pH-Wert während der Bestimmung bei 9 oder darunter hält, und in Flüssigkeitskontakt erste und zweite Zonen, von denen die erste Zone ein Isoenzym von alkalischer Phosphatase, das auf ein Substrat für das Isoenzym bei einem Ph-Wert von 9 oder weniger einzuwirken vermag, und die zweite Zone ein Substrat für das Isoenzym enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das alkalische Phosphatase- Isoenzym in einer Menge von mindestens 100 I.E./m² vorliegt.

2. Element nach Anspruch 1, in dem das Isoenzym in einer Menge von mindestens 125 I.E./m² vorliegt.

3. Element nach einem der Ansprüche 1 und 2, in dem das Substrat ein organischer Mono- oder Diester der Phosphorsäure ist.

4. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem das Substrat p-Nitrophenylphosphat oder 4-(4-Nitro-2 methylsulfonyl- phenylazo)naphthol-1-phosphat ist.

5. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das Isoenzym alkalische Rinderleber-Phosphatase ist.

6. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die zweite Zone eine poröse Ausbreitzone ist.

7. Element nach Anspruch 6, in dem die poröse Ausbreitzone eine Blush-Polymer-Ausbreitzone ist.

8. Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin mit den Stufen:

A. Kontaktieren einer Probe einer biologischen Flüssigkeit. von der angenommen wird, daß sie Theophyllin enthält, bei einem pH-Wert von 9 oder darunter, mit dem trockenen analytischen Element nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und

B. Bestimmung der erkennbaren Veränderung, die sich aus dem Kontakt ergibt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, das bei einem pH-Wert von 7 bis 9 durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 und 9, bei dem als biologische Flüssigkeit menschliches Blutserum oder Blut verwendet wird.