DE2533779A1 - Methode zur bestimmung des enzyms kreatinphosphokinase - Google Patents

Methode zur bestimmung des enzyms kreatinphosphokinase

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DE2533779A1 DE19752533779 DE2533779A DE2533779A1 DE 2533779 A1 DE2533779 A1 DE 2533779A1 DE 19752533779 DE19752533779 DE 19752533779 DE 2533779 A DE2533779 A DE 2533779A DE 2533779 A1 DE2533779 A1 DE 2533779A1
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Description

Elk Grove Village, Illinois 6ooo7
Methode zur Bestimrauna des Enzvms Kreatinphosphokinase.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG.
3s handelt sich um eine Methode zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung des Enzyms Kreatinphosphokinase (CPK), einer Substanz, die in abnormalen Konzentrationen im Serum vorkommt bei vielen Fällen von Geisteskrankheiten und neuromuskulären Krankheiten,, und die für die Diagnose des Myokardinfarktes signifikant ist. Die Methode verwendet eine trockene, über lange Seit stabile Probe einer reinen oder gemischten Komponente, wie zum Beispiel eine mit Blut imprägnierte Trägersubstanz, wobei die Notwendigkeit für spezielle Trennverfahren (z.B., Abtrennung des Serums von den Blutkörperchen) oder spezielle Behandlungsmethoden (z.B., Einfrieren, Gefriertrocknung usw.) zur Erhaltung der Haltbarkeit der Probe vermieden wird. Das Prinzip der Bestimmung in Laboratorium ist wie folgt: Adenosindiphosphat (ADP) reagiert mit Kreatinphosphat in Gegenwart von Kreatinphosphokinase und Magnesium-Ionen unter Bildung von Adenosintriphosphat (ATP) und Kreatin. Das ATP reagiert seinerseits mit Luziferin und Luziferase des Systems aus dem Leuchtkörper von Glühwürmchen unter Erzeugung von Licht (Bioluminiszenz), dessen Intensität proportional der ursprünglich vorhandenen CPK-Konzentration ist. Ein Test-Reagenzsystem wird beschrieben, das es erlaubt, die Methode, welche Gegenstand der Erfindung ist, auszuführen.
GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG UND IHRE BEDEUTUNG.
Die Erfindung bezieht sich auf den Nachweis und die quantitative Bestimmung von Serumenzymen in lebenden Organismen. Der Ausdruck "Serumenzym" wird hier so verwendet, daß er solche Enzyme einschließt, die normalerweise in Serum vorkommen, deren Konzentration jedoch von manchen pathologischen Zuständen im Organismus abhängt oder von ihnen beeinflußt wird, sowie solche Enzyme, die im Serum eines normalen Organismus nicht nachgewiesen werden, deren Konzentration jedoch unter pathologischen Bedingungen ansteigt. Insbesonders bezieht sich die Erfindung auf den Nachweis und die quantitative Bestimmung des Serumenzyms Kreatinkinase (E.C. 2.7.32 International Union of Biochemistry), allgemein bekannt als Kreatinphosphokinase oder CPK (im nachfolgenden "CPK" genannt). Die Erfindung beschreibt den Nachweis
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dieses Enzyms in der getrockneten Probe, welche sich in einem porösen Träger wie z. B. Filterpapier befindet.
Die Probe wird vorteilhaft aus irgendeiner Flüssigkeit organischer Herkunft erhalten wie Blut, Plasma, Serum, Spinalflüssigkait, Organextrakten, Gewebeflüssigkaiten, Tränen, Körpersekrete, Gewebekulturen usw. Untersuchungen im Laboratorium des Erfinders und in anderen Laboratorien haben gezeigt, daß die substratgebundene getrocknete Probe unter normalen Umweltbedingungen mindestens ein Monat lang haltbar ist.
CPK-3estimmungen sind äußerst wertvoll für den Nachweis von neuromuskulären Krankheiten (Munsat et al., Journal of the American Medical Association, 226-13, Seite 1536, 24. Dezember 1973). Die Messung der CPK hat auch signifikante Bedeutung für die Diagnose des Myokardinfarktes. Auch mehren sich die Hinweise auf abnorme Konzentrationen von CPK bei vielen Fällen von Geisteskrankheiten» Munsat hat außerdem gezeigt, daß abnorm hohe CPK-Konzentrationen in vielen Personen mit Duchenne-Muskeldystrophie (MD) vorkommen, wobei die Konzentrationen in der Kindheit höher sind als im Jugendalter»
Der Nachweis von präklinischen Stadien neuromuskulärer Krankheiten wird ein Programm zur Frühbehandlung erleichtern, wodurch eine verlängerte Mobilität erreicht wird (Demos, Frühdiagnose und Behandlung von Myopathien vom progressiven Duchenne-De-Boulogne-Typ (Typ DDB 1); Am. J1OUr. Phys. Med. 50-6, Seite 271, 1971). Demos hat gezeigt, daß die CPK in sehr großen Mengen bereits in Neugeborenen mit Duchenne-Muskeldystrophie vorhanden ist. Die Duchenne-Muskeldystrop&ie: kommt mit einer Frequenz von. 1 zu 3500 männlichen Geburten vor, das Verhältnis für übertragerinnen (Mädchen und Frauen) ist ähnlich (Morton und Chung, Formale Genetik der Muskeldystrophie, Am. Jour. Hum. Gen. 11-4, Seite? 360, Dezember 1959). Außerdem scheint es, d\aß die Xäfa&kheit eine Mutationsrate, von 35 % hat. Es konnte gezeigt werden, daß die Methode und die Reagenzien., die hier beschrieben werden, in der Lage sißd, die Dttchenne-Muskeldystrophie präklinisch aachzuweisea, und es konnte auch gezeigt werden, daß sie fähig sind, die■CPK-Erhöhungen nachzuweisen, die mit der Überträgereigenschaft dieser Krankheit in Zusammenhang stehen.
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•Ä.
-ί-Ο ie Methoden und Reagenzien der Erfindung sind auch wertvoll für den Nachweis von abnormalen CPK-Konzentrationen in Hamstern und Schweinen. Bei der Rasse 14:6 des Goldenen Syrischen Hamsters ist diese Methode beonders wichtig, weil es sich hier um kardiomyopathische Tiere handelt. Ein nicht-destruktiver CPK-Test (und dies ist der erste solcher Tests) ist äußerst wertvoll für Wirksamkeitskontrolle bei der Behandlung dieser Tiere wegen Herz- und Muskelkrankheiten mit verschiedenen chemischen Verbindungen. Bei Schweinen wurde gefunden, daß in Tieren mit Porcine-Stress-Syndrom die CPK-Konzentration signifikant erhöht ist. Diese Krankheit verursacht Schweinefleisch schlechter Qualität und Verluste von Schweinen durch Todesfälle während des Transportes zum Schlachthof.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG.
Der Anmelder ist seiner Meinung der erste, der eine praktisch durchzuführende Technik entwickelt hat zum Nachweis der Aktivität von CPK, oder von jedem anderen Serumenzym, in einem normal luftgetrockneten Zustand. Enzyme aus Erythrozyten, wie die Glucose-6-phosphatdehydrogenase, sind bereits in getrockneten Blutkörperchen bestimmt worden, Serumenzyme jedoch verlangten bisher eine Gefriertrocknung des Serums, um Langzeitstabilität zu erreichen. Unter allen gegenwärtig weitgehend verwendeten Enzymen wird die CPK als besonders unstabil und empfindlich gegenüber physikalischen Bedingungen angesehen (Dalai, F.R., et al., Clin. Chem. 18, Nr. 4, 1972). Gemäß den Vorschriften der vorliegenden Erfindung ist es jetzt möglich, unter Verwendung geeigneter Methoden sowohl die CPK als auch andere Serumenzyme aus einem luftgetrockne— ten Zustand zu bestimmen.
Die Methode dieser Erfindung beruht auf dem Prinzip, daß CPK in Gegenwart von Kreatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) (Inosindiphosphat (IDP), Cytidindiphosphat (CDP), Uridindiphosphat (UDP) und Guanosindiphosphat (GDP) können, mit abnehmender Aktivität, ADP ersetzen) ATP und Kreatin erzeugt (vergleiche Reaktion A in umgekehrter Richtung). Der Mechanismus ist schematisch als umkehrbare Gleichgewichtsreaktionen als Reaktion A und Reaktion B dargestellt:
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H-
REAKTION A:
CPK
ATP + Kreatin ADP + Kreattnphosphat Mg++
Magnesium ist notwendig, und die Reaktion wird durch eine Sulfhydrylgruppe stark beschleunigt. Magnesium kann durch andere Ionen ersetzt werden, Mangan, Mn++, ist eines dieser Ionen. Das ATP reagiert dann unter Lichterzeugung mit dem Luziferin und der Luziferase (Reaktion B) des Glühwürmchensystems oder in dem Glühwürmchenextrakt. Die Intensität des Lichtes ist der Konzentration der CPK im ersten Reaktionssystem proportional:
REAKTION B:
Mg++
ATP + Luziferin ■ ■ ——- Luziferyladenylat + Pyrophosphat
Luziferase
°2
Luziferyladenylat Oxy luziferyladenylat + Licht +
Luziferase
Nach einer kurzen Inkubationsperiode wird die Lichtintensität mit Hilfe eines Photometers oder einem äquivalenten Gerät gemessen. Je größer die ursprüngliche CPK-Konzentration, desto mehr Licht wird erzeugt.
Bioluminiszenz-Reaktionen der allgemeinen Art, die hier verwendet werden, nämlich zwischen Adenosintriphosphat (ATP) und Glühwürmchenextrakt, sind bekannt und sind auch bereits verwendet worden. Solch ein Lichtemiss ion sphänomen ist in den Patenten von Chapelle, US Patente Nr. 3.575.811 und Nr. 3.575.812, beschrieben, welche Methoden für die Messung von ATP in Gewebekulturen als Technik angeben zum Nachweis von krebsartigen Zellen und, bzw. oder, der Gegenwart oder Abwesenheit eines Virus in einer Wirtszelle. Chapelle gibt an, daß krebsartige Zellen eine geringere Lichtemission verursachen als es normale Zellen tun (Patent Nr. 3.575.811), und daß die ATP-Konzentration von Virus enthaltenden Zellen sich von der in normalen Zellen unterscheidet (Patent Nr. 3.575.812). Die Chapelle-Methoden werden jedoch unter Verwendung von konventionellen Gewebekulturen ausgeführt und beinhalten Laboratoriumstechniken, Reagenzien und Reaktionen, die sich material1 und wesentlich von denen der
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TYPISCHE LICHTWSRTK, äNTONIK CPK SCREEN
Krankheit
CPK-Vergleichsmethode Relative Lichteinhaiten Internationale Einhei- (i\minco Chem-Glowten (Rosalki-Methode) Photoraetar) Obere Grenze des Normal werts beim Menschen
50 mü/ml
1. Duchenne Muskeldystrophie (präklinisch) 4000
2. Duchenne Muskeldystrophie (klinisches
Anfangsstadium) 3200
3. Duchenne Muskeldystrophie (mittlere
Stadien) 2000
4. Duchenne Muskeldystrophie (fortgeschrittenes Stadium) 400
5. Duchenne Muskeldystrophie, Überträgerin 100
6. Gliedergürteldystrophie 180
7. Facio-Scapulo-humorale
Myopathie 120
8. Schizophrenie 180
9. Myokardinfarkt 400 lO.Myositis 3000 11;Porcin-Streß-Syndrom 3000
12.Kardiomyopathischer Go 1 dener Syrischer Hamster
Rasse 14:6 2800
13.Mensch, Normalwert . 25 14.Schwein, Normalwert 100 15.Hamster, Normalwert 12 1860 1500 1200
300 32 36
33 36 56 450 1450
1400
12
25
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vorliegenden Erfindung unterscheiden. Die Angaben der Patente von Chapelle werden in dieser Patentschrift insoweit mitverwendet als sie ihr nicht widersprechen.
Bei der Anwendung der Methode dieser Erfindung werden signifikante Erhöhungen der Konzentration eines Serumenzyms in jeder Serie von pathologischen Bedingungen ohne weiteres nachgewiesen. In der voranstehenden Tabelle werden typische Daten, die metabolische Defekte anzeigen, aufgeführt für verschiedene Geistesund neuromuskuläre Krankheitstypen, die mit Hilfe der Techniken der vorliegenden Erfindung ohne weiteres nachgewiesen werden können. In der Tabelle steht die "Krankheit" in der ersten Spalte. Die zweite Spalte zeigt die Konzentrationen der CPK in Internationalen Einheiten, wobei 50 Einheiten die obere Grenze des Nonnalbereichs eines normalen Menschen darstellt. Die relativen Lichteinheiten (unter Verwendung eines Aminco Chent-Glow-Photometers) erscheinen in der dritten Spalte, wobei 18 Einheiten etwa die obere Grenze des Normalbereichs eines normalen Menschen darstellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER METHODE.
10+2 Gramm gefriergetrockneter Leuchtorgane von Glühwürmchen (gefriergetrocknete Leuchtorgane von Glühwürmchen sind im Handel erhältlich) werden pro 1000 ml Vorratsreagenz und pro 30OO ml Arbeitslösung verwendet. Die Glühwürracben-Leuchtorgane werden mit Mörser und Pistill oder einem anderen Mahlgerät zu einem feinen Pulver zermahlen. Ein "Azetonpulver" kann auch verwendet werden (ein solches Pulver wird hergestellt, indem man Glühwürmchen-Leuchtorganpulver mit Azeton wäscht, dann filtert und trocknet). Das Material wird dann mit 10OO ml (1 Liter) eines 0,1 M Morpholinpropansulfonsäure-Puffers (MOPS-Puffer) extrahiert, der mit NaOH (Natriumhydroxid) auf pH 7,3 eingestellt ist. Die Konzentration des Puffers kann zumindest zwischen 0,01 und 0,5 M variieren, und eine Reihe von anderen Puffern kann ebenfalls verwendet werden, wie sum Beispiel tris-Hydroxymethylaminomethan und Kaliumarsenat. Selbst Wasser, das mit NaOH auf einen pH von 7,4 eingestellt ist, kann benutzt werden. Der pH-Wert kann im Bereich von etwa 6,8 bis 7,8 variieren.
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Eina komplexierende Substanz wie fithylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) mit einer Konzentration von etwa 0,001 M kann verwendet werden, ist aber nicht notwendig. Die Lösung (Glühwürmchenpulver, Puffer, Wasser und Komplexmittel) wird dann bei 10.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Die Geschwindigkeit und die Zeit kann variieren, und andere Trennmethoden können ebenfalls angewendet werden.
Andere Herstellungsmethoden für die Liiziferase-Luz if er inLösung schließen die folgenden ein:
1. Verwendung von kristallisierter Luziferase wie bei Green und McElroy beschrieben (Green, A.A. und McElroy, W.D., Biochem. Biophys. Acta. 20, 170 (1956)).
2. Verwendung von synthetischem Luziferin, welches im Handel erhältlich ist.
3. Verwendung von teilweise gereinigten Luziferin-Luziferase-Lösungen, welche nach verschiedenen Methoden, z. B., durch Säulenchromatographie, hergestellt wurden.
100 ml einer Pufferlösung wird nach der gleichen Vorschrift wie für die Primärextraktion hergestellt. Dieser Lösung werden Magnesium-Ionen in der Form von Magnesiumacetat zugefügt, obgleich auch andere organische und anorganische Magnesiumsalze verwendet werden können. Die optimale Konzentration für Mg++ ist 0,02 M, doch der Konzentrationsbereich kann zwischen 0,002 M und 0,1 M variieren. Chlorid- und Phosphat-Ionen werden vermieden, da sie einen Hemmeffekt auf die Gesamtreaktion ausüben.
Zu der obigen Lösung wird eine SuIfhydry!verbindung, wie Dithiothreit (DTT), Dithioerythrit oder andere solcher Verbindungen wie Glutathion zugefügt in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis 8 mM, wobei 1 mM vorgezogen wird. Die SuIfhydrylverbindung wird benutzt, um sowohl die CPK zu aktivieren als auch die Luzif erase zu stabilisieren. Diese Pufferlösung wird zum Primärextrakt zugefügt, und die daraus resultierende Lösung (Luziferin-Luziferase-Extrakt, Puffer, Magnesium-Ionen, und Sulfhydrylverbindung) stellt die Vorratslösung dar, die in angemessenen Mengen gefriergetrocknet v/erden kann. Das resultierende Produkt wird als Reagenz I
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bezeichnet. Um das Arbeitsreagenz herzustellen, wird ein Volumen des Vorratsreagenzes mit 2 Volumina destilliertem Wasser verdünnt.
Ein zweites Reagenz wird im gleichen Puffer wie oben und beim gleichen pH-Wert hergestellt, indem 0,1 M Kreatinphosphat zugefügt wird. Ein Teil dieses Reagenzes II wird zu 4 Teilen von Reagenz I gegeben, um eine 0,02 M Konzentration von Kreatinphosphat in der Endlösung zu erhalten. Dieses, zweite Reagenz (Reagenz II) kann in kleine Portionen aufgeteilt und gefriergetrocknet werden.
TESTMETHODEN.
Die Probe für den Test kann Plasma, Serum, Vollblut usw. sein. Sie wird auf ein poröses Material wie z. B. Filterpapier getropft oder aufgegeben. Danach läßt man die Probe an der Luft trocknen. Sie wird dann vorschriftsmäßig gekennzeichnet und kann dann auf gewöhnlichem Postweg von jeder Stelle der Erde an ein zentrales Testlaboratorium gesandt werden.
A.) VOLLBLUT-METHODE (oder für andere Proben, die bereits ATP enthalten): .
Das folgende Beispiel ist in Bezug auf Volumina, Abmessungen, Zeit und Temperatur in keiner Weise begrenzend:
1. Eine Lochzange für 1/8-Zoll—Löcher (etwa 3 mm) wird verwendet, um ein Scheibchen von 1/8 Zoll (etwa 3 mm) Durchmesser aus dem Probenmaterial auszustanzen. Das Scheibchen wird in ein Reagenzrohr aus Glas mit den Dimensionen 6 χ 50 mm gebracht,
2. 0,2 ml des Arbeitsreagenzes I werden zugefügt.
3. wahrend der ersten Stunde wird das Reagenzglas geschüttelt, um die Elution der Probe vom Trägermaterial zu erleichtern.
4. Das Röhrchen läßt man dann während 20 Stunden nach Zugabe von Reagenz I zur Probe bei 22 Grad Celsius inkubieren. Während dieser Zeit wird Ädenosintriphosphat (ATP) von der überschüssigen Luziferase in andere Produkte umge-
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wandelt, wobei durch den Verbrauch des ATP zuerst ein Anstieg und dann ein Abfall der Lichtintensität auftritt.
5. Mach 2O Stunden erreicht die Lichtintensität einen Basiswert. Dann werden 0,05 ml Reagenz II zugefügt und die Lösung geschüttelt, um eine gleichmäßige 2-lischung zu gewährleisten.
6. Dreißig Minuten nach Zugabe von Reagenz II wird das Reagenzröhrchen in ein Photometer gestellt (z.B., CHEM-GLOW Photometer, hergestellt von der American Instrument Company), und danach die Lichtintensität gemessen.
7. Der CPK-Gehalt wird mit Hilfe einer Eichkurve erhalten, die man sich durch Analysen von Blut mit bekannten CPK-Werten konstruiert, welche man wiederum durch Bestimmung der CPK mit Standard-CPK-Methoden im Plasmaanteil der Vergleichsblutproben erhalten hat.
B.) SERUM- UITD PLASMA-METHODE (oder für Proben, die keine oder vernachlässigbare Mengen an ATP enthalten) :
Das folgende Beispiel ist in Bezug auf Volumina, Abmessungen, Zeit und Temperatur in keiner Weise begrenzend:
1. Eine Lochzange für 1/8-Zoll-Löcher (etwa 3 mm) wird verwendet, um ein Scheibchen von 1/8 Zoll (etwa 3 nur.) Durchmesser aus dem Probenmaterial auszustanzen. Das Scheibchen wird in ein Reagenzrohr aus Glas mit den Dimensionen 6 χ 50 mm gebracht.
2. 0,2 ml des Arbeitsreagenzes I und 0,05 ml des Reagenzes II werden in das Röhrchen gegeben. Danach wird geschüttelt, um eine gleichmäßige Vermischung zu gewährleisten.
3. Man läßt das Röhrchen 15 Minuten lang bei 22 Grad Celsius inkubieren und mist dann die Lichtintensität in einem Photometer (z.B. in dem oben erwähnten CHSM-GLOW-Instrument).
4. Der CPK-Gehalt wird mit Hilfe einer Lichteintensitäts-Eichkurve erhalten, die man sich
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durch Analysen von Serum oder Plasma mit bekannten CPK-Werten konstruiert, welche man wiederum' mit Standard-CPK-Methoden erhalten hat.
Obgleich die Vorliegende Erfindung in Bezug auf bevorzugte Äasfuhxungsformen und Methoden beschrieben wurde, ist sie 'selbstsrerstandlich damit nicht darauf beschränkt. Weitere Modifikationen der beschriebenen Methoden und Produkte, die unter die folgenden Ansprüche fallen, werden Fachleute« auf diesem Gebiet zugänglich sein. Solange", cilese iiBdemingen und Modifikationen unter die folgendem i^asp>rü<äie fallen, sind sie als Teil der vorliegenden Erfiadhoög' anzusehen.

Claims (1)

  1. ANSPRÜCHE:
    / 1. jEine Methode zum Hactsweis der Gegenwart und eines /Anstiegs der lEomzeEttration eines Serumenzyms in einem
    wobei die Methode darin besteht, daß
    eine Probe.,vcai Körpjexgeweber Körperflüssigkeit, eines Extraktes voaa BEferpergewebe und ähnlichem dem OrgaiodLsests ea-feEKjeraen wird, wobei eine quantitativ sfispisiüolle Testflössigkeit erhalten wird.
    die geaaamfce Testflüssigkeit auf ein Träger subs trat gebracht w&xä.g
    die genaimtö Testflüssigkeit auf dem genannten Trägersiafosfcrat. getxEKitaet, wird, um eine Testprobe zu erhaltenρ die tmter normalen Umweltbedingungen haltbar isfc rasd eise praktische Haltbarkeitsperiode zeigt,
    die genaantte Testprobe in eine Testlösung überführt wird, weJLelsa ein Beagemz:system enthalt, das mit dem in der geaasaBa&teia. Probe enthaltenen Serumenzym reagieren kann, ώ
    das Auft»ateBt einer positiven Reaktion bestimmt wird, welche ai&f die Gfigemrart eines. Serumenzyms in der genanntem Brdfoe
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    2. Die Methode nach Anspruch 1 zum Kachweis und zur quantitativen Bestimmung der Gegenwart des Enzyms Kreatinphosphokinase in einem Organismus,
    wobei das genannte Reagenzsystem in der genannten Testlösung Glühwürmchen-Leuchtkörperextrakt und Kreatinphosphat enthält, und
    wobei das Auftreten einer positiven Reaktion dadurch bestimmt wird, daß die Intensität von Biolumineszenz-Licht, welches in dar Testlösung erzeugt und von ihr ausgestrahlt wird, nachgewiesen und gemessen wird, und
    in der das von der Testlösung ausgestrahlte Licht quantitativ mit dem Licht verglichen wird, welches von einer Vergleichsstandardlösung produziert wird, die mit Hilfe von bekannten Kreatinphospkinasakonzentrationen vorgeeicht wurde.
    3. Die Methode nach Anspruch 2 mit dem Zusatz, daß die vorhandene Kreatinphosphokinase in der genannten Testprobe als Funktion der Lichtproduktion in der Testlösung berechnet wird.
    4. Die Methode zur Diagnose von Muskeldystrophie, dadurch gekennzeichnet, daß
    ein Körpergewebeextrakt oder ähnliches aus einem Organismus entnommen wird, wodurch eine quantitativ sinnvolle Testflüssigkeit erhalten wird,
    die genannte Testflüssigkeit auf ein Trägersubstrat gebracht wird,
    die genannte Testflüssigkeit auf dem genannten Trägersubstrat getrocknet wird, um eine Testprobe zu erhalten, die unter normalen ümweltbedingungen haltbar ist und eine praktische Haltbarkeitsperiode besitzt,
    die genannte Testprobe in eine Testlösung überführt wird, welche ein Reagenzsystem enthält, das mit der Testprobe reagieren kann, und
    das Auftreten einer positiven Reaktion bestimmt wird, welches auf das Vorliegen von Muskeldystrophie im genannten Organismus hinweist.
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    5. Eine Methode zusätzlich zur Methode nach Anspruch 2, die der Analyse der genannten Testprobe auf Kreatinphosphokinase vorgeschaltet wird, wobei die genannte zusätzliche Methode vor der Zugabe von Kreatinphosphat zur genannten Testprobe angewendet wird und dadurch gekennzeichnet ist, daß
    die genannte Testprobe in eine Lösung gebracht wird, welche Glühwürmchen-Leuchtkörperextrakt enthält, zu welchem jedoch kein Kreatinphosphat zugefügt wurde,
    abgewartet wird, bis das erzeugte Bioluminiszenz-Licht abgeklungen ist, und danach Kreatinphosphat zur Lösung zugegeben wird, und
    das darin erzeugte Licht gemessen wird als tatsächliches MaS für die Kreatinphosphokinase, die in der Testprobe enthalten ist.
    6. Eine Kombination von Testreagenzien, die zur quantitativen Bestimmung des Enzyms Kreatinphosphokinase in einem Organismus verwendbar ist, womit die Gegenwart von normalen und pathologisch signifikant erhöhten Konzentrationsspiegeln des Enzyms im Organismus festgestellt werden kann, wobei die genannte Reagenzkombination besteht aus
    a.) Glühwürmchen-Leuchtkörperextrakt und b.) Kreatinphosphat,
    wobei der Glühwürmchen-Leuchtkörperextrakt und das Kreatinphosphat zugesetzt wird zur Reaktion mit der auf Kreatinphosphokinase zu analysierenden Testprobe.
    7. Das Testreagenz nach Anspruch 6, welches zusätzlich, noch eine Verbindung mit einer Sulfhydrylgruppe als Aktivator enthält, um die Aktivität des Enzyms Kreatinphosphokinase zu vergrößern.
    8. Eine Methode als Suchtest in Organismen auf die Gegenwart von pathologischen Defekten und ihrer Verlaufskontrolle unter Einschluß von Geisteskrankheiten, neuromuskulären Krankheiten und ähnlichen Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß man hauptsächlich Proben von Körperflüssigkeiten, -extrakten und -geweben solcher Organismen auf ein Serumenzym analysiert, um die Gegenwart von
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    abnormalen Konsentrationen dieses Enzyms nachzuweisen,
    wobei die genannte Methode darin besteht, daß
    eine Probe von Körpergewebe, Körperflüssigkeit, eines Extraktes von Körpergewebe und ähnlichem dem Organismus entnommen wird, wobei eine quantitativ sinnvolle Testflüssigkeit erhalten wird,
    die genannte Testflüssigkeit auf ein Trägersubstrat gebracht wird,
    die genannte Testflüssigkeit auf dem genannten Trägersubstrat getrocknet wird, um eine Testprobe zu erhalten, die unter normalen Umweltbedingungen haltbar ist und eine praktische Haltbarkeitsperiode besitzt,
    die genannte Testprobe in eine Testlösung überführt wird, welche ein Reagenzsystem enthält, das mit dem in der genannten Probe enthaltenen Seruntenzyrn reagieren kann, und
    das Auftreten einer positiven Reaktion bestimmt wird, welche auf die Gegenwart eines Serumenzyms in der genannten Probe hinweist.
    Die Methode nach Anspruch 8 zum Nachweis und zur Bestimmung des Serumenzyms Kreatinphosphokinase, welches in der genannten Testprobe enthalten ist, und
    wobei das genannte Reagenzsystem in der genannten Testlösung Glühwürmchen-Leuchtkörperextrakt und Kreatinphosphat enthält, und
    wobei das Auftreten einer positiven Reaktion dadurch bestimmt wird, daß die Intensität von Biolurainiszenz-Licht, welches in der Testlösung erzeugt und von ihr ausgestrahlt wird, nachgewiesen und gemessen wird, und
    in der das von der Testlösung ausgestrahlte Licht quantitativ mit dem Licht verglichen wird, welches von einer Vergleichsstandardlösung produziert wird, die mit Hilfe von bekannten Kreatinphosphokxnasekon— zentrationen vorgeeicht wurde.
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    10. Dia Methode nach Anspruch 9 mit dem Zusatz, daß die vorhandene Kreatinphosphokinase in der genannten Testprobe als Funktion der Lichtproduktion in der Testlösung berechnet wird.
    11. Eine Methode als Suchtest in Schweinen für Porcine Stress Syndrom, zur Messung der Konzentration des Enzyms Kreatinphosphokinase, welches im Körpergewebe von Schweinen vorkommt, wobei signifikant erhöhte Konzentrationsspiegel des Enzyms darauf hinweisen, daß die Schweine von Porcine Stress Syndrom befallen sind,
    wobei die genannte Methode darin besteht, daß
    eine Probe von Körpergewebe, Körperflüssigkeit, eines Extraktes von Körpergewebe und ähnlichem dem Organismus entnommen wird, wobei eine quantitativ sinnvolle Testflüssigkeit erhalten wird,
    die genannte Testflüssigkeit auf ein Trägersubstrat gebracht wird,
    die genannte Testflüssigkeit auf dem genannten Trägersubstrat getrocknet wird, um eine Testprobe zu erhalten, die unter normalen Umweltbedingungen haltbar ist und eine praktische Haltbarkeitsperiode besitzt,
    die genannte Testprobe in eine Testlösung überführt wird, welche Gluhwürmchen-Leuchtkörperextrakt und Kreatinphosphat enthält,
    die Intensität von Bioluminiszenz-Licht, welches in der Testlösung erzeugt und von ihr ausgestrahlt wird, nachgewiesen und gemessen wird,
    das von der Testlösung ausgestrahlte Licht quantitativ mit dem Licht verglichen wird, welches von einer Vergleichsstandardlösung produziert wird, die mit Hilfe von bekannten Kreatinphosphokinasekonzentrationen vorgeeicht wurde, und
    die vorhandene Kreatinphosphokinase in der genannten Testprobe als Funktion der Lichtproduktion in der Testlösung berechnet wird.
    itentanwal (W. Maucher) Patentanwalt
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DE19752533779 1974-08-02 1975-07-29 Methode zur bestimmung des enzyms kreatinphosphokinase Withdrawn DE2533779A1 (de)

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