DE3006118A1 - Verfahren zum nachweis von creatinkinase-isoenzymen - Google Patents

Verfahren zum nachweis von creatinkinase-isoenzymen

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Description

ALEXANDER R. HERZFELD " " β PrankFubta.m.3>0 O 6 1 1 8
RECHTSANWALT m ZEPPEUNALLEe 71
ΒΘ DEM LANDGERICHT FBANKF=UHTAM MAIN . O · ΤΒΒΌΝ 0Θ11/77912Β
Anmelderin: Oorning G-lass Works
Corning, N.Y., U S A
Verfahren zum Nachweis von Creatinkinase-Isoenzymen
Die Erfindiins: betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Greatinkinase-Isoenzvmen mit spezifischen Antikörtiern oder Antikorner-IsoenzymkoBrolexen.
Das G-ewebe des menschlichen Körpers enthält drei haunteächliche.Isoenzyme der Creatinkinase (abpcek. OK; E.G. 2.7.3.2, auch unter dem >Tamen Creatin-ATP-Transphosphorylase bekannt), die aus zwei Untereinheiten, M und B in verschiedenen Kombina.tionen aufgebaut sind, s. hierzu A. Burger u.a., 8:iochem, Z, 339, ?05 (1964); D.H. Deul und ,T.F.I.. van Hremen, ΟΙχτι.
Ohim. /Vota, 10, 276 (1964); und K. S.iovall und A. Voi^t, iTa.ture, 202, 701 (1964). Die^e Isoenzyme sind:
Mn im Gehirn rachv/eishares anodales Tsoen.p;ym (BB); ein Isoenzym (Wl) mit elektronhoretischer Mobilität entoprechend dem in Skolettmuskeln anwesender O-ammnrlohnl in;
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und ein Isoenzym (MB) mittlerer . elektrophoreti scher Mobilität in einigen Skelettmuskeln und im Trocar dium.
Diese Isoenzyme wurden elektrophoretisch, getrennt und quantifiziert, Bas MB Isoenzym soll sogar als Anzeichen eines akuten myocardialen Infarkts gelten, s. A.F. Smith, Clin. ChIw4 Acta, 39, 551 (1972)j H. Somer und A. Eonttinen, Clin. Chim. Acta, 36, 531 (1972); und- G.S, Wagner u.a., Circulation, 47, 2^3 (1973). Die Trennung der CK-Isoenzyme gelang auch Chromatograph!sch durch Ionenaustaiisch, D.W. Mercer, Clin. Ohem., 20, 36 (1974).
Versucht wurde a.uch bereits die Trennung durch Immuntitrierung oder Immunhemmung. Wach E. Jockers-Wretou und G-. Pfleiderer, Clin. Chim. Acta, 58,-223 (1975) konnten die kristallinen CK-Isoenzyme der menschlichen Skelettmuskeln (MM) und des Π-ehirns (BB) in Kaninchen erzeugt werden. Beide Isoenzyme konnten durch ihre homologen Antiseren ohne festzustellende Rückumsetzung ausgefüllt werden, während das hybride MB-Isoenzym des menschlichen Herzmuskels mit keinem dieser Antiseren vollständig ausfüllbar war. Die Konzentration der drei Isoenzyme in künstlichen Mischungen wurde auf Grund des Prozentsatzes nichtausfüllbarer Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit nach Umsetzung mit jedem der Antiseren bestimmt. Weil selbst bei hohem Antiserenüberschuß im Überstand stets etwa 10 % Restaktivität verbleibt, wurde diese Aktivität MB zugeschrieben. Auf dieser Annahme beruhen die Berechnungen der MB-Aktivität.
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Ein ähnliches Verfahren beschreiben D. Neumeier u.a., Klin. Woehenschr., 53, 329 (1975) und die US-PS 4,067,775, wonach MJVf und MB durch das MM-Anti serum und BB und MB durch das BB-Antiserum quantitativ ausgefüllt werden, während BB im Serum nicht anwesend sein soll. Bei diesem Verfahren muß daher zunächst die gesamte OK-Aktivität bestimmt werden. Anschließend wird die nach Ausfüllung mit BB-Serum im Überstand verbleibende Aktivität gemessen. Die Differenz awischen beiden Werten soll die MB-Aktivität in der Serumprobe ergeben.
Auch Radioimmunanalysen wurden bereits auf die CK-Isoenzyrae angewendet. Nach D4 Neumeier, Olin. Ohim. Acta, 79, 107 (1977), wird die Untereinheit B in MB und BB durch eine mit *'I gekenn* zeichnetes BB~Antiserum verwendende Radioimmunanalyse quantifiziert. R. Roberts u.a., Olin. Chim. Acta, 83, 141 (1978) berichten die Radioimmunanalyse für MB, van Steirteghem u.a., Clin. Ohem. 24, 414- (1973), und M.H. Zweig u.a. Clin.Ohem. 24, 422 (1978) diese für MM und BB.
Nach einem immunadsorbierenden Verfahren von J. Perriard u,a,, irch. Biochem. Biophys., 191, 90 (1978) werden reine MM und BB Antiseren getrennt mit Oyanogenbroroid aktivierter Sepharose 4B gekoppelt. Anschließend wird die G-esamtaktivität der OK in der Probe bestimmt. Abschnitte der Probe v/erden über jede der immunadsorbierenden Säulen geleitet und nicht gebundenes Isoenzym abgewaschen, und dessen Aktivität gemessen. Die nicht gebundene Aktivität der Anti-MM Säule stellt die BB-Aktivität, die nicht
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gebundene Aktivität der Anti-BB Säule die MM-Aktivität dar. Sodann wird die MM und SB Aktivität von der Gesamtaktivität der CK in der Probe subtrahiert, woraus sich die MB-Aktivität ergibt.
Tn all diesen bekannten Verfahren wird entweder die y aktivität der Isoenzym-Antikörperkomplexe einfach i.mterTteilt, oder ihr Fichtvorhandensein steht von vornehereinfest. Dies steht.im Einklang mit der bekannten CK Isoenzym-Antikörper-Tnaktivierung, s. CA. Williams und M.W. Chase, "Editors, "wie+.hods in Immunology and Immuno chemist^", "Band IT, Academic Press, TTew York, 1977, S. 317," B. Oinader. Editor, "Antibodies to "Biologically Active Molecules", Band I, Proceedings of the 2nd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Vienna, 21-24. April 1965, Pergamon Press, Symposium Publications Division, Oxford, 1967, S. 87; B. Cinader, Ann. ϊΐ.ϊ. Acad. Sei., 103 (2), 500 (1965); ui,d M.2.J. S alt on, Editor, "Immunechemistry of Enzymes and Their Antibodies", John Wiley & Sons, New York, 1977, S. 104.
Es ist sonach bisher kein Verfahren zum Fachweis von CK-Isoenzymen durch Messung der CK-Isoenz-ymaktivität eines Antikörper-lsoensymkomplexes bekannt.
"Sin solches Verfahren, ist Aufgabe der Erfindung.
Oie Aufgabe wird durch das ■ Verfahren der Erfindung dadurch gelöst, daß ein für ein Isoenzym spezifisch immobilisierter
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Antikörper rait der Probe in Kontakt gebracht, der immobilisierte Antikörper oder Antikörper-Isoenzymkomplex oder eine Mischung beider isoliert, und das isoliert© Material.auf Isoenzymaktivitat geprüft wird.
Weitere günstige Ausbildungen ergeben sich aus der Beschreibung und den Unteransprüchen.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß für ein bestimmtes Creatinkinase-Isoenzym spezifische, immobilisierte Antikörper mit dem Isoenzym gebunden werden können und einen immobilisierten Antikörper-Isoenzymkomplex bilden, welcher eine meßbare Isoenzymaktivität behält, diese also nicht vollständig blockiert.
Besonders in Humanseren kann der qualitative und quantitative Nachweis verschiedener OK-Isoenzyme für die Diagnose wertvoll sein, z.B. von myocardialem Infarkt, Herztraumata, fortgeschrittener muskulöser Dystrophie, Dermatomysitis, pathologischen Abläufen mit Myoglobinuria, bösartiger Hyperthermie.
Als "flüssige Proben" werden hier von Natur aus in flüssiger Phase vorliegende Proben, oder nach Entnahme verflüssigte Proben bezeichnet, wie z.B. ein G-ewebe extrakt vom menschlichen Körper, Hiimanserum, Pleuralflüssigkeit, Urin, Rückemnarksflüssigkeit, Semen usw. In der Praxis besteht die Probe meist aus Humanserum,
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Mitunter soll auch die G-esamtaktirität des Creatinkinaseenasnns ■bestimmt werden. Dies kann nach einem weiter unten erläuterten Torschlag oder nach bekannten Methoden, und zwar in jedem Falle vor, während oder nach dem erfindungsgemäßen Fachweisverfahren geschehen.
Als erster Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeitsprobe oder ein Abschnitt derselben mit einem für das jeweilige GK-Isoenzym spezifischen, immobilisierten Antikörper versetzt, der nicht in bekannter Weise hergestellt wird, in einfacher Weise z.B. unmittelbar aus dem Antiserum. Er enthält dann durchweg für das Verfahren unerhebliche, Immobilisierte Proteine wie z.B. Globuline verschiedenster Art. Ein besonderer Reinheitsgrad wird für den immobilisierten Antikörper nicht gefordert,- obwohl bei unmittelbarer Herstellung aus dem Antiserum ungereinigten Zustande größere Antikörpermengen, pro Einheit Enzymaktivität benötigt werden.
Der Antikörper kann in bekannter Weise immobilisiert werden. Weder der Träger noch die Immobilisierungsmethode sind kritisch, sofern erhebliche, schädliche Einflüsse vermieden werden. Geeignet sind so z.B. organische oder anorganische poröse oder unporöse Träger ganz beliebiger Form und Gestalt. Er kann fein- oder grobkörnig sein, oder als Formkörper flacher oder gekrümmter Ausbildung, als Tafel, Tablette, rechteckige oder zylindrische Röhre oder komplexer Gestalt verwendet werden. Haiifig ist eine einfache Einsetzform die feinteiliger, etwa 20-100 mesh
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großer Partikel. Beispiele organischer Träger sind u.a. Polyester wie Polyethylenterephthalat, Polyamide, wie Nylon 6 oder Nylon 6,6, Polyacrylate, Polymethacrylate, Agargele, Dextrangele, Polyolefine wie Polyäthylen, Polypropylen, Polybutylen, Polybutadien, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenchlorid usf.
Die anorganischen Träger lassen sich in Kieselsäurehaltig© und kieselsäurefreie Metalloxide einteilen, wofür Glas, Kieselsäure, Wollastonit, Bentonit, Oordierit und dergleichen.Beispiele für die erste Gruppe, Aluminiumoxid, Spinell, Apatit., Nickeloxid, Titanoxid, Zirkonaxid und dergleichen Beispiele für die zweite Gruppe sind. Bevorzugt werden anorganische Trüger, "besonders Glas und Kieselsäure. Günstig sind poröse Träger, die mehr Antikörper pro Volumen oder Masseneinheit aufnehmen können.
Zur Immobilisierung sind beliebige bekannte Methoden, von der einfachen Adsorption bis zur chemischen Kopplung geeignet. Zur Adsorption wird eine wässerige Lösung des Antikörpers (Antiserums) mit dem Träger solange in Kontakt gebracht, bis die gewünschte oder maximale Adsorption erreicht ist. Zur chemischen Kopplung wird der Träger meistenteils mit einer oder mehreren chemischen Verbindungen behandelt und dann mit einer wässerigen Lösung des Antikörpers in Kontakt gebracht, iür die Vorbehandlung des Trägers, insbesondere anorganischer Träger, eignen eich beispielsweise nach TJS -PS 3,983,000 0-Dianisidin, polymere Isocyanate nach US-PS 4,071,409, Silane gem. ÜS-PS 3,519,528 und 5,652,761 und dergleichen, s. auch die US-PS 3,930,951 und 3,933,589.
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b ww
Als zweiter Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die nach dem ersten Schritt anfallende Mischung inkubiert, im Regelfall bei etwa 4 - 400C, wobei 370C besonders günstig ist. Die Inkubationsdauer ist an sich nicht kritisch, meist liegt sie bei 1/2 - 3 Std., jedoch werden in der Praxis mehr als 1 Std. meist nicht benötigt.
Als dritter Verfahrensschritt wird von der inkubierten Mischung der immobilisierte Antikörper oder Antikörper-Isoenzymkomplex oder eine Mischung von beiden, abgetrennt. Das kann in beliebiger bekannter Weise geschehen, z.B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren, wobei Zentrifugieren meist wirkungsvoller ist.
Als vierter Verfahrensschritt wird das nach dem vorhergehenden Schritt erhaltene Material in beliebiger bekannter Weise qualitativ oder quantitativ analysiert. .
Die katalytische Umsetzung der CK-Isoenzyme ist bekanntlich
CK
Great inphosphat + ADP *" Oreatin + ATP
wobei ADP die Abkürzung für Adenosin 5'-Diphosphat, und ATP die Abkürzung für Adenosin 5'-Triphosphat- ist.
Bekanntlich gilt auch
HK
ATP + Glucose <- iDp + Glucose-6-Phosphat
Glucpse-6-Phosphat + IAD
6-Phosphö3?gluconat + FADFI + H+
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wobei-HK Hexokinase, FAD+ und NADH Nicotinamidadenindinueleotid in oxidierter "bzw. reduzierter Form, und G-6-PDH G-lucose-6-Phos~ phatdehydrogenase bezeichnet. Bin Beispiel für ein günstiges Substrat für den Nachweis von GIC-I so enzymen enthält Creatinphosphat, ADP, Glucose, NAD+, Hexokinase, und G-lucose-6-Phosphatdehydrogenase. Es ermöglicht rasch den Nachweis oder die Messung von NADH, sei es spektralphotometriseh bei 340 nm, oder fluorometrisch. Das NAD+ und G-6-PDH kann auch durch NADP+ und ein dafür spezifisches Enzym ersetzt werden.
Geeignet sind auch andere Substrate, oder es können andere Stoffe als NADH nachgewiesen werden, oder der NADH Nachweis erfolgt in anderer Weise. So kann die Substratiösung einen durch NADH reduzierbaren Farbstoff enthalten, wobei die Auswertung colorimetrisch mit einem Spektralphotoraeter vorgenommen wird. Beispiele solcher Farbstoffe sind NADH-verkettete Farbstoffe wie P-Iodnitrotetrazolium violett, nitroblaues Tetrazoliumchlorid, oder andere Tetrazoliumsalze in Verbindung mit Phenazinmethosulfat, Durch Verwendung von Stoffen, welche mit einem Produkt der duroh OK katalysierten Umsetzung wie Greatin gekoppelt werden können, können die G-6-PDH und HK-verketteten Umsetzungen auch umgangen werden. So kann die Kombination von a-Naphthol und Diacetyl in Gegenwart von Creatin einen rosafarbenen Komplex erzeugen.
In jedem Falle werden die erhaltenen Werte mit einer in bekannter Weise erstellten Standardkurve verglichen. Man erhält sodann einen quantitativen Nachweis von GK-Isoenzymen.
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• A-
Zur Bestimmung der gesamten OK-Isoenzymaktivität nach einer erfindungsgemäßen Ausbildung des Verfahrens wird das Grundverfahren mit immobilisierten Antikörpern sowohl für MM als auch für BB Isoenzyme mit der flüssigen Probe durchgeführt. Entweder wird zunächst mit der MM Form, dann mit der BB Form, dann mit der BB Form oder umgekehrt vorgegangen, oder immobilisierte Antikörper für beide Formen werden gleichzeitig kombiniert, und die entstehende Mischung zur Durchführung des Verfahrens verwendet.
Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung ohne Beschränkung. Alle Temperaturangaben sind in 0C.
Beispiel
fach dem Verfahren von H.J. leutel u.a. in Arch. Biochem, Biophys., 150, 648 (1972) wurde das Oreatinkinase-Isoenzym IW von Rindermuskeln isoliert und gereinigt. Nach bekannter Methode wurden in Kaninchen die Antikörper hierzu gezüchtet. Nach der Methode von ¥eetall und Filbert (s. B-. Jakoby und M. Wilchek, »Methods of Enzymology», Bd. 34Bf S. 59-72, (19?2) wurde immobilisiertes Antiserum (immobilisierter Antikörper, IMA) bereitet. Hierzu wurde Glas geregelter Porengröße mit einer durchschnittlichen Porenweite von 550 $. und einer durchschnittlichen Teilchengröße von 1/um verwendet. Das Glas wurde mit 5 % Salpetersäure gereinigt, gewaschen und mit einer 10 %-igen Lösung von •y-Aminopropyltriäthoxysilan in destilliertem Wasser bei pH 5,45 behandelt. Das silanisierte Glas wurde mit O-Nitrobenzoylchlorid
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in Chloroform und 10 Vol.-# Triäthylamin als HCl Reiniger umgesetzt. Durch Behandlung des g-Mtrobenzoylaminoalkyl-Glasderivats mit 10 % Fatriumdithionit im Wasser wurde die Nitrogruppe reduziert. Das entstehende p_-Aminobenzoylami;aoalkyl-Glasderivat wurde mit in situ aus Salzsäure und Natriumnitrat erzeugter salpetriger Säure diazotisiert, das Produkt gewaschen und dem Antiserum bei pH 8 - 9 zugesetzt. Der so immobilisierte Antikörper wurde durch Zentrifugieren isoliert, gewaschen, in Salzlösung, pH 7,4, gepuffert mit 0,01 M Phosphat (pH 7,4 Salzlösung), bei 10 mg IMA pro ml gepufferte Salzlösung, suspendiert. Der so behandelte immobilisierte Antikörper enthält 32 mg Protein pro 100 mg Glas.
0,5 ml einer eine bekannte Menge gereinigtes Einder-MM-Isoenzym enthaltender Lösung wurden 0,5 ml der IMA-Suspension zugesetzt. Die Mischung wurde bei 370C 30 Min. lang inkubiert. Durch Zentrifugieren wurden Tablettenkörper des IMA und IMA-MM Komplexes hergestellt, diese in Salzlösung, auf pH 7,4 gepuffert, erneut suspendiert und durch Zentrifugieren niedergeschlagen, um das Glas von unspezifisch gebundenem Enzym oder anderen Proteinen freizuwaschen, Die gewaschenen Tablettenkörper wurden in 1 ml STATZtKB CPK n-1 gewaschen und bei Zimmertemperatur (250C) inkubiert. Gesonderte Proben wurden 2, 5, 10 und 20 Min. inkubiert. Sodann, wurde die Mischung zentrifugiert und die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit mit einem Spektrolphotometer bei 340 nm gemessen. Die Meßwerte wurden in Durchschnittswerte zu ÄO.D. pro Min. für jede Konzentration umgerechnet. In allen Fällen wurden Tergleichsversuche mit unbehandelten Körpern vorgenommen und von den
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Meßwerten subtrahiert, sodaß die korrigierten ¥erte der folgenden Tabelle erhalten wurden.
MM Konz IU/Tj .
korrigierte Werte
1000 500 250 125
6?
0,099
0,076
0,048
0,028
0,016
0,011
0,002
BB Konz. ΙΠ/1 korrigierte Werte 40.P./Min.
660
0,008 0,006 0
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Claims (8)

  1. Patentansprüche
    1.jVerfahren zum Nachweis von Greatinkinase-Isoenzymen in
    x—' flüssigen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß ein für ein Isoenzym spezifisch, .immobilisierter Antikörper mit der
    Probe in Kontakt gebracht, der immobilisierte Antikörper oder Antikorper-Isoenzyrnkomplex oder eine Mischung beider isoliert, und das isolierte Material auf Isoenzymaktivität geprüft wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus flüssiger Probe oder einem Teil derselben und dem spezifischen, immobilisierten Antikörper vor Isolierung inkubiert wird.
  3. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf anorganischen Trägerpartikeln immobilisiert ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Kieselsäure oder Glas geregelter Porengröße besteht.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Isoenzym die BB Form oder die MM Form ist.
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  6. 6. Verfahren nach, einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß auch die Gesamtaktivität der Creatinkinase-Isoenzymaktivität der flüssigen Pro"be "bestimmt wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst immolDilisierte Antikörper spezifisch für die MM !Form des Isoenzyme, und dann solche spezifisch für die BB Form verwendet werden, oder umgekehrt, oder
    .gleichzeitig Antikörper spezifisch für "beide Isoenzymformen verwendet werden.
  8. 8. Verfahren nach einem der AnsOrüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Prohe aus Humanserum besteht.
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