DE2713369C2

DE2713369C2 - Nicht löslicher Antikörper, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung im Analysenbesteck für den Enzymimmunassay oder Radioimmunassay

Info

Publication number: DE2713369C2
Application number: DE2713369A
Authority: DE
Inventors: Shigeru Fujiidera Osaka Kurooka; Noriyuki Kyoto Sunahara
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-03-25
Filing date: 1977-03-25
Publication date: 1986-12-04
Also published as: GB1536396A; FR2345461A1; US4166767A; DE2713369A1; FR2345461B1

Description

Im Enzymimmunassay (EIA) oder Radioimmunassay (RIA) wird ein mit einem Enzym oder radioaktiven Isotop markiertes Antigen, ein unmarkiertes Antigen, d. h. die zu bestimmende Substanz, und ein Antikörper der kompetitiven Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Pufferlösung unterworfen. Sodann werden das an den Antikörper gebundene markierte Antigen und das freie markierte Antigen, d. h. das markierte Antigen, an das kein Antikörper gebunden ist, voneinander getrennt Hierauf wird die Menge des nicht markierten Antigens, d. h.

die zu bestimmende Substanz, bestimmt. Die Bestimmung des nicht markierten Antigens kann durch Messung der Enzymaktivität oder der Radioaktivität des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens oder des freien markierten Antigens erfolgen. Die Methode ist im einzelnen schon in verschiedenen Druckschriften beschrieben, beispielsweise in den US-PS 36 54 090,38 39 153 und 38 50 752 sowie in Clinical Chemistry, Bd. 19 (1973), S. 146 bis 186.

Die Genauigkeit des EIA oder RIA hängt im wesentlichen von der Trennung des an den Antikörper (B) gebundenen markierten Antigens vom freien markierten Antigen (F) nach der Antigen-Antikörper-Reaktion ab. Nachstehend wird diese als F/B-Trennungsmethode bezeichnet. Bisher sind folgende F/B-Trennungsmethoden bekanntgeworden:

1. Sekundäre Agglomeration des Antigen-Antikörper-Komplexes;

2. Der Antigen-Antikörper-Komplex wird durch Zugabe eines zweiten Antikörpers vollständig ausgefällt, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist (Doppelantikörper-Technik);

3. Bindung des Antikörpers an eine unlösliche Substanz.

Die Methode (1) ist anwendbar, wenn das Antigen eine hochmolekulare Verbindung darstellt. Dementsprechend ist dieses Verfahren nur für Spezialfälle anwendbar. Ferner hat es den Nachteil, daß die sekundäre Agglomeration verhältnismäßig langsam verläuft. Die Doppelantikörper-Methode (2) ist ebenfalls zeitraubend, weil die Antigen-Antikörper-Reaktion zweimal durchgeführt werden muß. Außerdem hat sie den Nachteil, daß bei der Zugabe des zweiten Antikörpers gelegentlich unerwünschte Nebenreaktionen auftreten.

Die Verwendung eines an eine unlösliche Substanz gebundenen Antikörper ist die beste Methode. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf diese Methode und liefert einen verbesserten unlöslich gemachten, d. h. nicht löslichen Antikörper.
Ein nicht löslicher Antikörper für den EIA oder RIA soll folgende Bedingungen erfüllen:

(a) Der nicht lösliche Antikörper soll die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht hemmen;

(b) Der nicht lösliche Antikörper soll ein geeignetes spezifisches Gewicht besitzen, so daß er eine gleichmäßige und stabile Suspension bildet und die Reaktionsfähigkeit des Antikörpers soll so groß wie möglich sein;

(c) der bei der Reaktion des nicht löslichen Antikörpers mit dem Antigen erzeugte Antigen-Antikörper-Komplex soll sich durch Zentrifugieren bei niedriger g-Zah\ oder durch Filtration leicht abtrennen lassen;

(d) der nicht lösliche Antikörper soll an den Wandungen von Laborgeräten, wie Pipetten, nicht haften.

Es gib: bereits eine Reihe von Antikörpern, die durch Bindung an eine feste Phase unlöslich gemacht wurden. Als feste Phase wurden Dextran- oder Cellulosederivate verwendet; vgl. US-PS 38 39 153 und 36 45 852. Diese bekannten nicht löslichen Antikörper befriedigen jedoch noch nicht in jeder Hinsicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen nicht löslichen Antikörper zu schaffen, der die vorstehend beschriebenen Bedingungen (a) bis (d) im EIA oder RIA erfüllt.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bei der chemischen Verankerung oder Bindung eines Antikörpers an die von kugelförmigen oder

stäbchenförmigen Bakterien oder Hefen gewonnene Zellwand ein nicht löslicher Antikörper entsteht, der sich vorzüglich in einem Enzymimmunassay oder Radioimmunassay zusammen mit einem markierten Antigen Vi einsetzen läßt

υ Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

ψ Zur Herstellung von nicht löslichen Antikörpern können erfindungsgemäß die von allen kugelförmigen oder

H stäbchenförmigen Bakterien oder Hef^n gewonnenen Zellwände eingesetzt werden, unabhängig von der Art If der Stoffwechselprodukte oder der Pathogenität der Mikroorganismen.

S Zur Herstellung der Zellwände können Bakterien der Ordnung Eubacteriales verwendet werden, beispiels-

ί; weise Microorganismen der Gattung Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Bacillus, ■:;ϊ Escherichia find Achromobacter. Besonders geeignete Bakterienarten sind Streptococcus faecalis, Streptococ- ^l cus salivarius, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Micrococcus lysodeiticus, Micrococcus roseus, If Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Escherichia coli und Achromobacter aquamarinus. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Lactobacillus plantarum.

If Beispiele für Hefen, die zur Herstellung der Zellwände verwendet werden können, sind Keime der Gattung

|^l Saccharomyces, wie Saccharomyces cerevisiae, der Gattung Pichia, wie Pichia polymorpha und der Gattung S¹ Schizosaccharomyces, wie Schizosaccharomyces pombe. Besonders bevorzugt ist auf Grund seiner leichten ¹ Ϊ Zugänglichkeit Saccharomyces cerevisiae.

* Die Zellwände der Bakterien oder Hefen können mit verschiedenen Methoden gewonnen werden, beispielsweise mit physikalischen Methoden, wie Behandlung in einem Homogenisator oder mit Ultraschall, durch enzymatischen Aufschluß, beispielsweise mit Trypsin, durch chemische Behandlung, beispielsweise Kochen in verdünnter alkalischer Lösung, oder einer Kombination dieser Verfahren.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Antikörper kann in an sich bekannter Weise durch Immunisierung von Tieren, wie Kaninchen, Pferden, Ziegen, Meerschweinchen oder Rindern, mit dem entsprechenden Antigen und einem Adjuvans hergestellt werden. Ferner können Antikörper gegen Haptene durch Adsorption oder Bindung des Haptens an einen hochmolekularen Träger, wie Albumin, und anschließende Immunisierung der Tiere mit dem Haptenkonjugat unter Zusatz von Adjuvans hergestellt werden.

Beispiele für verwendbare Antigene zur Herstellung der Antikörper sind Hormone wie Angiotensin I, Insulin, Trijodthyronin (T₃), Tetrajodthyronin (T₄) oder humanes Chorion-Gonadotropin (HCG), Bakterien, Enzyme, Viren, virusspezifische Antigene, wie Virushepatitis B, Tumor-assoziierte Antigene, wie Alphafetoprotein (AFP) und Carcino-embryonales Antigen (CEA), Immunoglobuline, wie IgG und IgE, humanes Serum-Albumin (HSA) und Rinderserum-Albumin (BSA), oder Haptene, wie Diphenylhydantoin (DPH), Haloperidol, d. h. l-(3-p-Fluorbenzoylpropyl)-4-p-chlorphenyl-4-hydroxypiperidin, Testosteron und Phenobarbital. Als Haptene können auch einige Verbindungen verwendet werden, deren chemische Struktur teilweise mit der zu bestimmenden Substanz, d. h. dem nicht markierten Antigen, übereinstimmt Beispielsweise kann zur Bestimmung der Menge von Haloperidol als Hapten auch eine Verbindung verwendet werden, die sich in der 3-(p-Fluorbenzoyl)-propionylgruppe von Haloperidol unterscheidet. Der gegen diese Verbindung spezifische Antikörper reagiert mit Haloperidol unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes.

j Die chemische Verankerung des Antikörpers an die von Bakterien oder Hefen gewonnene Zellwand kann

unter Benützung eines Bindemittels durchgeführt werden. Beispiele für verwendbare Bindemittel sind in Methods of Enzymology, Bd. 11, S. 617 bis 641, Academic Press, New York, 1967, beschrieben. Spezielle Bindemittel 1' sind z. B. Glutardialdehyd, Epichlorhydrin, Toluylen-2,4-diisocyanat und Carbodiimid. Besonders geeignet ist Glutardialdehyd.

Die Bindung des Antikörpers an die von Bakterien oder Hefen gewonnene Zellwand kann auch dadurch f bewirkt werden, daß man die Zellwand mit einem Oxidationsmittel, wie Natriumperjodat, behandelt, sodann den

Antikörper mit der oxidierten Zellwand reagieren läßt und hierauf das erhaltene Produkt reduziert. Bei diesem _t j Oxidationsverfahren können die in der Zellwand vorhandenen Aminogruppen zunächst mit einem Schutzgrup- ^ penreagens, wie 2,4-Dinitrofluorbenzol, geschützt werden, um eine Polymerisation der Zellwand bei der Oxidation zu vermeiden.

Die Bindung des Antikörpers an die oxidierte Zellwand verläuft vermutlich folgendermaßen:
Die Zuckerbestandteile der Zellwand werden unter Bildung von Aldehydgruppen oxidiert, und diese reagieren mit den im Antikörpermolekül vorhandenen Aminogruppen unter Bildung einer Schiff-Base. Die dabei entstehenden Azomethinbindungen werden durch Reduktion stabilisiert. Bei diesem Verfahren kann der im Reaktionsgemisch verbleibende nicht-umgesetzte Antikörper durch Zusatz von frischen oxidierten Zellwänden zum Gemisch wiedergewonnen werden.

Der erfindungsgemäß hergestellte nicht lösliche Antikörper zeigt im ultraroten Spektralbereich charakteristisehe Absorptionsbanden bei etwa 1540 cm-¹ und 1640 cm-' (A), die der Gruppe —NHCO- zuzuordnen sind, sowie eine Absorption bei etwa 1040 cm-' (B), die der Gruppe

— C —OH so

zuzuordnen ist, die im Zucker vorliegt. Die Ultrarotabsorptionsspektren sind in F i g. 1 bis F i g. 4 wiedergegeben.

Das Verhältnis von A : B der Ultrarotabsorptionen (Durchlässigkeiten) des nicht löslichen Antikörpers ist immer größer als das der Zellwand vor ihrer Bindung mit dem Antikörper, d. h. der oxidierten Zellwand oder der mit Glutardialdehyd behandelten Zellwand. Das Verhältnis A : B wird auf der Basis der Grundlinie berechnet, wobei die Absorption bei etwa 1900 cm-' und bei etwa 850 bis 900 cm-' vereinigt wird.

Zur Durchführung des EIA oder RIA unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten nicht löslichen Antikörpers wird ein mit einem Enzym, wie /?-D-Galactosidase, Pankreaslipase, Peroxidase oder Glucoseoxidase, oder mit einem radioaktiven Isotop, wie ¹²⁵1,³H oder ¹⁴C, markiertes Antigen, ein nicht-markiertes Antigen (die zu bestimmende Substanz) und der nicht lösliche Antikörper einer kompetitiven Immunreaktion in einer Pufferlösung unterworfen. Sodann wird der entstehende Antigen-Antikörper-Komplex durch Zentrifugation abgetrennt Hierauf wird die Enzymaktivität oder die Radioaktivität des markierten Antigens in dem Präzipitat oder in der überstehenden Flüssigkeit in üblicher Weise bestimmt.
Zur Durchführung des EIA oder RIA sind im wesentlichen folgende Reagentien erforderlich:

ίο (a) Der erfindungsgemäß hergestellte nicht lösliche Antikörper und (b) ein markiertes Antigen für diesen Antikörper.

Außer den vorgenannten Reagentien können eine Standardsubstanz zur Herstellung einer Eichkurve sowie

im Falle des EIA ein chromogenes Substrat für das Enzym und/oder ein die Enzymreaktion abbrechendes

Reagens verwendet werden. H

Diese Reagentien können vorzugsweise in Form eines Analysenbesteckes (Kit) vorliegen. jpij

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Methoden und Beispiele erläutert. §!

In den Beispielen werden folgende Bakterien und Hefen zur Gewinnung des Zellwandmaterials verwendet: tjt

Streptococcus faecalis (St faecalis), j;

Staphylococcus aureus Terajima (Sta. aureus), _J( ' Micrococcus roseus (M. roseus),
Micrococcus lysodeiticus (M. lysodeiticus),
Lactobacillus plantarum (L plantarum),

Bacillus subtilis (B. subtilis), ' ς

Escherichia coli K-12 (E. coli), l·*

Achromobacter aquamarinus (A. aquamarinus), ffjj

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), ψ

Pichia polymorpha (P. polymorpha) und \ ι

Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). <f

Methode A '

Herstellung von Bakterienzellwandmaterial "

Zellen von L. plantarum werden mit Wasser und 0,9 prozentiger Kochsalzlösung gründlich gewaschen und sodann gefriergetrocknet. 15 g gefriergetrocknete Zellen und 30 g Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,17 bis 0,18 mm werden in 30 ml 0,9 prozentiger Kochsalzlösung suspendiert und unter Kühlung mit Trockeneis durch viermalige jeweils 30 Sekunden dauernde Behandlung mit einem Homogenisator mit 60 Hz aufgeschlos-

sen. Sodann werden die Glasperlen 30 Minuten bei 300 g abzentrifugiert Hierauf werden die Zelltrümmer 30 ^ Minuten bei 10 000 g abzentrifugiert, gründlich mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Zelltrümmer werden in 0,05 molarem Phosphatpuffer (1 g/50 ml) resuspendiert und 2 Stunden bei 40⁰C in Gegenwart von 0,001% Trypsin aufgeschlossen und sodann 30 Minuten bei 9000 g zentrifugiert. Das '

erhaltene Präzipitat wird erneut mit Trypsin behandelt, gründlich mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.

Es werden insgesamt 750 mg Zellwandmaterial erhalten. Die Ausbeute beträgt 10% d. Th., bezogen auf getrock- J₁ nete Zellen.

In gleicher Weise wird gefriergetrocknetes Zellwandmaterial von A. aquamarinus, Sta. aureus, St. faecalis. M. , > roseus, B. subtilis und E.coli hergestellt h'

Methode B

Herstellung von Zellwandmaterial aus Hefen ')

250 g Presshefe der Art S. cerevisiae werden in 500 ml Wasser suspendiert und mittels Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,25 bis 03 mm in einer Mühle bei einer Tourenzahl von 3000 U/min aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Zellen werden abwechselnd mit 1 molarer Kochsalzlösung und Wasser gründlich gewaschen , und sodann gefriergetrocknet Auf diese Weise werden etwa 13 g Zellwandmaterial erhalten.

In gleicher AVeise wird Zellwandmaterial von P. polymorpha und S. pombe hergestellt

Methode C

Herstellung eines enzymmarkierten Antigens

A) Glutardialdehyd-Methode

Eine Lösung von 100μg 33-Diphenylpropylamin und 1 mg gereinigter Schweinepankreaslipase in 0,25 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers wird unter Rühren mit 0,25 ml 1 prozentiger Glutardialdehydlösung versetzt und 2 Stunden gerührt Sodann wird das Reaktionsgemisch auf eine mit Sephadex G 200 gefüllte Säule mit den

Abmessungen 1 χ 54 cm aufgesetzt und mit 0,05 molarem Tris-HCl — 0,1 molarem KCl-Puffer (pH-Wert 8,0) eluiert. Es werden Fraktionen von 1,5 ml aufgefangen. Es wird ein [3,3-Diphenylpropylamin]-[schweinepankreaslipase]-Komplex (enzymmarkiertes Antigen) (7 ml) erhalten, der in der Nähe der Leerfraktionen eluiert wird. Das enzymmarkierte Antigen wird bei 5° C in Gegenwart von 0,1% BSA aufbewahrt.

In gleicher Weise wird ein enzymmarkiertes Antigen, nämlich ein [Schweineleberesterase]-[HSA] oder -[humanes Serum IgG]-Komplex aus gereinigter Schweineleberesterase (2 mg) und HSA (2,5 mg) oder der Esterase (5 mg) und humanem Serum IgG (3 mg) hergestellt.

B) Maleinimid-Methode

B-I D?-D-Galactosidase]-[T₃] oder -pYJ-Konjugat

50 μΐ einer 0,1 η Natronlauge mit 0,5 μΜοΙ T3 oder T4 werden mit 1 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 vermischt. Sodann wird die Lösung tropfenweise und unter Rühren mit einer Lösung von 0,5 μΜοΙ 6-Maleinimid-n-capronsäure-N-succinimidester in 25μ1 Tetrahydrofuran versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit 40 μΐ eines 0,2 molaren Citrat-Phosphat-Puffers vom pH-Wert 43 versetzt. Das entstandene Präzipitat wird durch lOminütiges Zentrifugieren bei 2000 g abgetrennt und mit 1 ml eines 0,05 molaren Citrat-Phosphat-Puffers durch Zentrifugieren gewaschen. Sodann wird das erhaltene Präzipitat mit 1 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 sowie unter Rühren mit 100 μg (0,19 nMol)/i-D-Galactosidase versetzt. Nach lOminütigem Rühren werden 5 ml eines 0,1 molaren GIykokoll-NaOH-Puffer vom pH-Wert 10,3 zugegeben. Das Gemisch wird zur Abtrennung des freien 6-Maleinimid-n-capronsäure-N-succinimidesters oder des freien T3 oder T4 durch eine Diaflo-Membran PM 30 filtriert Der erhaltene Rückstand wird zweimal mit jeweils 3 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen und hierauf in 1,5 ml eines 1 % BSA — 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst.

B-2[3,3-Diphenylpropylamin]-[>?-D-galactosidase]

Eine Lösung von 1 mg /?-D-Galactosidase in 2 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,0 wird tropfenweise und unter Rühren mit einer Lösung von 500 μg N-^.S-DiphenylpropylJ-aminocarbonylmethylmaleinimid in 25 μ! Tetrahydrofuran versetzt. Das Gemisch wird eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt, sodann durch eine Diaflo-Membran PM 30 filtriert und dreimal mit jeweils 4 ml eines 0,02 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Der Rückstand wird in 20 ml eines 0,2% BSA — 0,05 molaren Phosphatpuffers vom ρ H-Wert 7,0 gelöst

B-3[HCG]-D?-D-Galactosidase]

Eine Lösung von 100 μg/?■D-Galactosidase in 1 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,0 wird mit 600 Einheiten mit m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester acyliertem HCG versetzt Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, sodann durch eine Diaflo-Membran filtriert und wie in B-2 beschrieben gewaschen. Sodann wird der Rückstand in 1 ml eines 1% BSA — 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst.

B-4[RinderinsuIin]-[,#-D-Galactosidase]
Die Verbindung wird nach dem in J. Biochem, Bd. 79 (1976), S. 235 beschriebenen Verfahren hergestellt

C) Diazokupplungsmethode
[/?-D-Galactosidase]-[m-diazophenobarbital]

■ ■ .

Eine Lösung von 1,5 mg m-Aminophenobarbital, 170 μg Kaliumbromid und 2 μ] 36prozentige Salzsäure in 0,23 ml Wasser wird unter Eiskühlung mit einer Lösung von 570 μg Natriumnitrit in 80 μΐ Wasser versetzt und 1 Stunde stehengelassen. 80 μ! des Reaktionsgemisches werden mit 4 ml einer 0,01 molaren Natriumboratlösung versetzt und in eine Lösung von 500 μg /?-D-GaIactosidase in 2 ml eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers vom pH 7,0 eingetragen. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Eiskühlung gerührt Sodann wird das Reaktionsgemisch durch eine Diaflo-Membrane PM 30 filtriert Der erhaltene Rückstand wird dreimal mit jeweils 10 ml eines 0,9% NaCI — 0,02 M Tris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Hierauf wird der Rückstand in 20 ml eines 0,2% BSA — 0.9% NaCl — 0,1 % NaN₃ - 0,02 MTris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7 gelöst (400 Assays).

B e i s ρ i e 1 1

Herstellung von nicht löslichem Antikörper

125 mg gemäß Methode A hergestelltes Zellwandmaterial von L plantarum werden in 2,5 ml Wasser suspendiert Die Suspension wird mit 2,5 ml einer anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper-Lösung [IgG-Fraktion; Protein IOmg/0,05 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) 1 ml], 2,5 ml Wasser und 2£ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gemischt Sodann wird das Gemisch tropfenweise und unter Rühren mit 2.5 ml einer Z5prozentigen wäßrigen Glutardialdehydlösung versetzt Nach 1 stündigem Rühren wird das Ge-

misch 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wird dreimal mit jeweils 5 ml eines 0,9% NaCl-0,02 M Tris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Man erhält [L. plantarum Zellwand]-[Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper]. Ein Teil des erhaltenen nicht löslichen Antikörpers wird gefriergetrocknet und das IR-Absorptionsspektrum aufgenommen. Das Spektrum ist in F i g. 1 wiedergegeben. Der nicht lösliche Antikörper wird in einem 0,1% BSA —0,9% NaCl- 0,02 M Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,0 zu einer lprozentigen Zellwand — 0,1% BSA-Lösung resuspendiert, die 30 Sekunden bei 20 kHz (kc/s) mit Ultraschall behandelt und sodann für den EIA oder RIA verwendet wird.

In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wird Zellwandmaterial von L. plantarum, jedoch ohne Antikörper, mit Glutardialdehyd behandelt. Das IR-Absorptionsspektrum des Zellwandmaterials ist in F i g. 2 wiederge-

Aus Fig. 1 und Fig.2 ist ersichtlich, daß das A/B-Verhältnis von L plantarum Zellwandmaterial, das mit Glutardialdehyd behandelt wurde, den Wert 1,24 hat, während der Wert für [L plantarum Zellwand]-[Anti-Dephenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper] 1,64 beträgt. Dies beweist die Bildung eines Zellwand-Antikörper-Komplexes.

Beim Vermischen von unbehandeltem L. plantarum Zellwandmaterial mit dem Antikörper und anschließendem Waschen wird weder eine Zunahme des A/B-Verhältnisses noch eine Zunahme der Antikörperkapazität beobachtet.
In gleicher Weise werden folgende nicht lösliche Antikörper hergestellt:

L. plantarum-Zellwand'
L. plantarum-Zellwand
L. plantarum-Zellwand'
L. plantarum-Zellwand
L. plantarum-Zellwand

Anti-HCG-Kaninchenantikörper];
Anti-humanes IgG-Kaninchenantikörper]; Anti-HSA-Kaninchenantikörper (ohne BSA)]; Anti-TrBSA-Kaninchenantikörper];
Anti-Rinder-Thyreoglobulin-Meerschweinchenantikörper], [S. cerevisiae-Zellwand]-[ Anti-Rinderinsulin-Meerschweinchenantikörper];

B. subtilis-ZellwandJ-fAnti-HCG-Kaninchenantikörper];

E. coli-Zellwand]-[Anti-humanes IgG-Kaninchenantikörper];

M. roseus-Zellwand]-[Anti-HSA-Kaninchenantikörper (ohne BSA)]; St. faecalis-Zellwand]-[Anti-T3-BSA-Kaninchenantikörper] und [A. aquamarinus-Zellwand]-[Anti-Diphenylacetyl- BSA-Kaninchenantikörper].

Beispiel 2
Herstellung von nicht löslichem Antikörper

20 mg gemäß Versuch B hergestelltes Zellwandmaterial von S. cerevisiae werden in ein Gemisch von 2 ml einer 0,3 molaren NaHCCh-Lösung und 0,2 ml einer lprozentigen Lösung von 2,4-Dinitrofluorbenzol in Äthanol eingetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zusatz von 2 ml einer 0,1 molaren Natriumperjodatlösung wird das Gemisch 48 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß stehengelassen. Sodann wird das oxidierte Zellwandmaterial mit Wasser gewaschen. Das IR-Absorptionsspektrum des oxidierten Zellwandmaterials ist in F i g. 3 wiedergegeben.

Das oxidierte Zellwandmaterial wird mit 0,1 ml eines 1 molaren Na2CC>3-Puffers vom pH-Wert 9,0 und 0.2 ml

Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper [IgG-Fraktion; Protein 10 mg/0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) 1 ml] sowie mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml versetzt Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4° C gerührt und sodann 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert Das erhaltene Präzipitat wird abwechselnd mit einem 0,02 M Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,0 und 0,9prozentiger wäßriger Kochsalzlösung gründlich gewaschen.

Sodann wird das Präzipitat in 1 ml einer lprozentigen wäßrigen NaBH4-Lösung resuspendiert, 15 Minuten stehengelassen und mit Wasser gewaschen. Es wird der nicht lösliche Antikörper [S. cerevisiae-Zellwand]-[Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper] erhalten. Das IR-Absorptionsspektrum dieses Produkts ist in F i g. 4 wiedergegeben.

Der nicht lösliche Antikörper wird in einem 0,9% NaCl —.0,l%BSA — 0,02 M Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,0 zu einer 1% Zellwand — 0,1% Albumin-Lösung suspendiert, die für den EIA oder RIA benutzt wird In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben, werden folgende nicht lösliche Antikörper hergestellt:

[S.cerevisiae-ZellwandJ-fAnti-Rinderinsolin-Meerschweinchenantikörper];

[S.cerevisiae-Zellwandi-fAnti-Testosteron-S-oxim-BSA-Kaninchenantikörper];

[S.cerevisiae-Zellwandj-fAmi-S-ip-FluorbenzoylJ-propionyl-BSA-Meerschweinchenantikörper]; [Lplantarum-Zellwand]-[Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper]; [B.subtilis-Zellwand^Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper],· [Sta. aureus-ZellwandJ^Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper] und [Ecoli-ZellwandXAnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper].

Beispiel 3
I lcrstellung eines nicht löslichen Anti-I'hcnobarbilul-Anlikörpers

Anti-Phenobarbital-Kaninchenscrum wird nach der von II. Salon u. Mitarb, ). Biochenu Bd. 73(1973), S. 1115, beschriebenen Methode hergestellt, jedoch wird als llaplcn ßSA-m-Diazophcnobarbilal verwendet.

Aus dem Antiserum wird durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung (0 bis 48%) und Dialyse gegen einen 0.05 molaren Phosphatpuffer der Anti-Phenobarbital-Kaninchenantikörper hergestellt.

23 mg Anti-Phenobarbital-Kaninchenantikörper und 25 mg gemäß Versuch B hergestelltes Zellwandmaterial von S. cerevisiae werden in 3 ml eines 0.05 molaren Natriurnacetatpuffers vom pH-Wert 4,9 suspendiert und tropfenweise und unter Rühren mit 70 μΐ einer 25prozentigen Glutardialdehydlösung versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat zweimal mit jeweils 10 ml eines 0,9% NaCl — 0,02 M Tris-HCI-Puffers vom pH-Wert 7,0 durch Zentrifugieren gründlich gewaschen. Der erhaltene [S. cerevisiae-Zellwand]-[Anti-Phenobarbital-Kaninchenantikörper] wird in 5,2 ml eines 0,2% BSA — 0,9% NaCl — 0,1% NaN₃ - 0,02 M Tris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 resuspendiert, 30 Sekunden bei 19 kHz (kc/s) mit Ultraschall behandelt und für den EIA von Serum Phenobarbital verwendet.

B e i s ρ i e 1 4

Allgemeine Methode des ElA oder RIA unter Verwendung nicht löslicher Antikörper

A) Reagentien

a) 0,9% NaCI - 0,02 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0).

b) Standard-Antigen Das Standard-Antigen wird durch Verdünnen des Antigens in 2er Potenzen mit dem Puffer a) hergestellt.

c) Enzym-oder isotopen-markiertes Antigen: Eine bestimmte Menge.

Die bestimmte Menge des enzymmarkierten Antigens wird durch die Änderung der optischen Dichte (OD) während einer bestimmten Zeit bei der Messung nach der nachstehend in C beschriebenen Methode wiedergegeben, wobei die Enzymaktivität des markierten Antigens, die den nicht löslichen Antikörper binden kann, bestimmt wird.

d) Unlöslich gemachter Antikörper: Eine bestimmte Menge.

Die bestimmte Menge an Antikörper bedeutet diejenige Menge des an Zellwandmaterial gebundenen Antikörpers, von der 50 bis 70% an eine bestimmte Menge des markierten Antigens gebunden werden kann. Für einen Test werden vorzugsweise 500 μg Zellwandmaterial verwendet.

B) Durchführung der Tests

In Zentrifugenröhrchen aus Glas (1,3 χ 10 cm) X\...X_n für die Standard-Antigen-Eichkurve und Y\ ...Y_n, für die Proben werden 1 ml der Pufferlösung a) gegeben. Bestimmte Mengen (hergestellt durch eine Verdünnungsreihe in 2er Potenzen) des Standard-Antigens b) werden in die Röhrchen X\ -X_n und die Proben (50 μΐ) werden in die anderen Röhrchen Y\ — Y_m gegeben. Sodann wird die bestimmte Menge des markierten Antigens c) und des nicht löslichen Antikörpers d) (jeweils 50 μΐ) in sämtliche Röhrchen gegeben. Die Röhrchen werden eine bestimmte Zeit bei 5^CC aufbewahrt und sodann 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert Die Enzymaktivität oder Radioaktivität des markierten Antigens im Überstand oder Präzipitat wird bestimmt Aus den Werten wird eine Standard-Eichkurve angefertigt, aus der die Menge an Antigen in den Proben Y\ — Y_n, berechnet wird.

C) Bestimmung der Enzymaktivität oder Radioaktivität

Die Aktivität von Schweinepankreaslipase oder Schweineleberesterase wird colorimetrisch mit 3-Butyroyloxy-1.2-bis-(butyroylthio)-propan als Substrat bestimmt; vgl. US-PS 39 86 930. Die Aktivität von /2-D-Galactosidase wird fluorometrisch mit 4-Methylumbelliferyl-_/#-D-gaJactopyranosid als Substrat (vgl. J. Biochem., Bd. 78 (1975), S. 235) oder colorimetrisch mit o-Nitrophenyl-/?-D-galactopyranosid als Substrat (vgl. Biochem. Biophys. Acta, Bd. 403 (1975), S. 13 i) bestimmt

Die Radioaktivität von¹²⁵I wird mit einem automatischen Szintillationszähler AL 201 (Dainabat-Shimazu Co.) gemessen. Die Radioaktivität von ³H wird mit einem Tri-Carb-Flüssigkeits-Szintillations-Spektrophotometer Typ 3380 (Packard Instument Co.) gemessen.

Beispiel 5

55 Bestimmung von DPH

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA und RIA unter folgenden Bedingungen durchgeführt Aus den erhaltenen Werten wird die Eichkurve angefertigt die in F i g. 5 wiedergegeben ist

Nicht löslicher Antikörper:

[S. cerevisiae-Zellwand]-[A nti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 2.

Markiertes Antigen:

[33-Diphenylpropylamin]-[Schweinepankreaslipase], hergestellt gemäß Versuch C, (A):

ODJ,f/30 min = 0,6,

[33-Diphenylpropylamin]-[/?-D-Galactosidase], hergestellt gemäß Versuch C, (B-2):ODJ^"/20 min = 1,1,

³H - DPH: 100 pg(10 000 cpm).

10

Unmarkiertes Antigen:

Standard DPH: O bis 100 ng,

Zeit der Antigen-Antikörper-Reaktion: 30 Minuten

Aus F i g. 5 ist ersicütlich, daß sowohl der EIA als auch der RIA für die Bestimmung von DPH (0,4 bis 100 ng) innerhalb von 90 Minuten beendet werden kann. Nach der Doppelantikörper-Methode erfordert die Bestimmung etwa 2 Tage.

Beispiel 6
• Bestimmung von DPH

Gemäß Beispiel 5 wurde DPH in Seren (jeweils 10 μΐ) von normalen Personen und von Patienten bestimmt, denen DPH oral gegeben wurde.

Das DPH in den gleichen Proben wurde durch Gaschromatographie (G.C) bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt

Tabelle I

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Probe

ElA*)
(Mg/ml)

RIA

G.C

Serum von normalen	0
Personen (10 Personen)
Serum von Patient
A	3,3
B	2,8
C	1.2
D	1.5
E	1,5
F	2,6
G	1,7
H	1,2
I	2,4
J	0,3

3,4 2,3 1,3 1,8 1,5 2,8 1,8 1,6 2,6 0,1

3,1 2,7 1,0 1,6 1,6 2,5 1,6 1,4 2,4 0

") Als markiertes Antigen wird [3,3-Diphenylpropylamin]-[^-D-GaIactosidase] verwendet

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die nach den drei Methoden erhaltenen quantitativen Werte gut miteinander übereinstimmen.

Beispiel 7
Bestimmung von DPH

Der RIA wird gemäß Beispiel 5 durchgeführt, jedoch werden folgende, gemäß Beispiel 2 hergestellte nicht lösliche Antikörper verwendet:

Lplantarurn-ZellwandHAnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikorper],
B.subtilis-Zellwandj-fAnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper],
Sta.aureus-Zellwand]-[Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper]und
E-coli-ZellwandJ-fAnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikorper].

Es konnte die gleiche Eichkurve für DPH wie in F i g. 5 errechnet werden

Beispiel 8
Bestimmung von HCG

Der ElA wird gemäß Beispiel 4 unter den nachstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die in F i g. 6 wiedergegebene Eichkurve für HCG angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

[L plantarum-ZellwandJ-fAnti-HCG-Kaninchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

[HCGH^-D-Galactosidase], hergestellt gemäß Versuch C,<B-3):
ODJS-/90 min = 0,6.

Unmarkiertes Antigen: 5

Standard HCG: 0 bis 10IU,
Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 30 Minuten.

Aus Fig.6 ist ersichtlich, daß die Bestimmung von HCG (0,25 bis 24IU) innerhalb 90 Minuten beendet
werden kann, während die Doppelantikörper-Methode etwa 2 Tage erfordert io

Beispiel 9
Bestimmung von HSA

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt Aus den 15 erhaltenen Ergebnissen wird die in F i g. 7 wiedergegebene Eichkurve für HSA angefertigt

Nicht löslicher Antikörper:

[L päantarum-ZellwandJ-IAnti-HSA-lCaninchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

[HSA]-[Schweineleberesterase], hergestellt gemäß Versuch C, (A):
ODlß"/15min = 0.9.

Unmarkiertes Antigen: 25

Standard HSA: 0 bis 10 u,g.
Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 30 Minuten.

Aus F i g. 7 ist ersichtlich, daß die Bestimmung von HSA (0,6 bis 10 μg) innerhalb 90 Minuten beendet werden
kann. 30

Beispiel 10

Bestimmung von T3

Gemäß Beispiel 4 wird der ElA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den
erhaltenen Werten wird die in F i g. 8 wiedergegebene Eichkurve für T₃ angefertigt

Nicht löslicher Antikörper:

[L plantarum-ZellwandHAnti-Ts-BSA-Kanmchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 1. 40

Markiertes Antigen:

[T3]-[y?-D-Galactosidase], hergestellt gemäß Versuch C (B-I): ODJ^/20 Minuten = 1,4,

[¹²⁵I]-[T₃]: 3500 cpm.

45 Unmarkiertes Antigen:

Standard T₃:0 bis 50 ng,

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion, 30 Minuten.

Aus F i g. 8 ist ersichtlich, daß sowohl im EIA als auch im RIA die Bestimmung von T₃ (0,1 bis 50 ng) innerhalb 50 90 Minuten beendet werden kann. Nach der Doppelantikörper-Methode erfordert die Bestimmung etwa 2 Tage.

Beispiel 11
Bestimmung von Insulin 55

Gemäß Beispiel 4 wird der RIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den
erhaltenen Werten wird die in F i g. 9 wiedergegebene Eichkurve für Rinderinsulin angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper: 60

Markiertes Antigen:

[' "l]-[Sch weineinsulin]: etwa 10 000 cpm.

Unmarkiertes Antigen:

Standard-Schweineinsulin: 0 bis 32 μΐυ,

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 15 Stunden.

Aus Fig.9 ist ersichtlich, daß die Bestimmung von Schweineinsulin (0,5 bis 32μΐυ) innerhalb 24 Stunden beendet werden kann. Nach der Doppelantikörper-Methode erfordert die Antigen-Antikörper-Reaktion 48 Stunden (die erste Reaktion 24 Stunden und die zweite Reaktion 24 Stunden).

5 Beispiel 12

Bestimmung von Insulin

Beispiel 11 wird wiederholt, jedoch wird [S. cerevisiae-Zellwandj-fAnti-Rinderinsulin-Meerschweinchenanti-10 körper], hergestellt gemäß Beispiel 2, verwendet Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel 11 erhalten.

Beispiel 13
Bestimmung von Insulin

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA unter den nachstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt Aus den erhaltenen Werten wird die in F i g. 10 wiedergegebene Eichkurve für Insulin angefertigt

Nicht löslicher Antikörper:
20 [S. cerevisiae-Zellwand]-[Anti-Rinderinsulin-Meerschweinchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 2.

M arkiertes Antigen:

[Rinderinsulin]-|/-D-Galactosidase], hergestellt gemäß Versuch C, (B-4): ODJä^m/30 Minuten = 0,016. Anmerkung: Dieses markierte Antigen wird colorimetrisch bestimmt, und die Bestimmung der Enzymakti-25 vität im EIA wird fluorophotometrisch durchgeführt

Unmarkiertes Antigen:

Standard-Rinderinsulin:Oist 160 μΐυ.

Die Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 15 Stunden.

Beispiel 14
Bestimmung von Testosteron

35 Gemäß Beispiel 4 wird der RIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die in F i g. 11 wiedergegebene Eichkurve für Testosteron angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

[S. cerevisiae-ZellwandJ-fAnti-Testosteron-S-oxim-BSA-Kaninchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel

Markiertes Antigen:

[³H]-[Testosteron]:8,8 pg(1700 cpm).

45 Unmarkiertes Antigen:

Standard-Testosteron: 0 bis 1,3 ng,

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 3 Stunden.

Beispiel 15

Bestimmung von Haloperidol

Gemäß Beispiel 4 wird der RIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die in F i g. 12 wiedergegebene Eichkurve für Haloperidol angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

[S. cerevisiae-Zellwandj-fAnti-S-ip-FluorbenzoylJ-propionyl-BSA-Meerschweinchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 2.

60 Markiertes Antigen:

[³H]-[Haloperidol]:356 pg(7300 cpm).

Unmarkiertes Antigen:

Standard-Haloperidol: 0 bis 10 ng,
65 Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 30 Minuten.

Beispiel 16 Bestimmung von humanem IgG

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt Aus den 5 erhaltenen Werten wird die in Fig. 13 wiedergegebene Eichkurve für humanes IgG angefertigt, aus der die Menge IgG in humanem Serum berechnet wird. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 11 zusammengefaßt

Nicht löslicher Antikörper:

[L plantarum-Zellwand]-[Anti-humanes IgG-Kaninchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 1. 10

Markiertes Antigen:

[humanes IgG]-[Schweineleberesterase], hergestellt gemäß Versuch C(A): ODJff /40 Minuten *= 0,4.

Unmarkiertes Antigen: 15

Standard-humanes IgG: 0 bis 50 μg,

humanes Serum 400-fach verdünnt mit 0,9prozentiger Kochsalzlösung: 20 μΐ, Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 30 Minuten.

30 Bestimmung von Serum-T₄

50 μΙ Standard-T4-Serum mit 0 bis 20 ng T₄ werden mit 0,2 ml eines Gemisches von 20prozentiger Trichloressigsäure und 0.5 η Natronlauge (1 :3) versetzt Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelas- 35 sen und sodann mit 0,1 ml eines 1 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 neutralisiert Die erhaltene Lösung wird mit 0,2 ml eines 0,4 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 versetzt, der 0,1 % BSA, [T₄]-[)?-D-Galactosidase] (enzymmarkiertes Antigen) (0,1 ml), hergestellt gemäß Versuch C, (B-I), und 0,1 ml [L plantarum-Zellwand]-[Anti-Rinderthyreoglobulin-Meerschweinchenantikörper], hergestellt gemäß Beispiel 1, enthält Nach 90minütiger Inkubation des Gemisches bei 37° C wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert 40 Das Präzipitat wird mit 2 ml 0,9prozentiger Kochsalzlösung gründlich gewaschen. Hierauf wird das Präzipitat mit 0.8 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 versetzt, der 1 μΜοΙ MgCb und 0,2 ml einer 0,7% 2-Mercaptoäthanol — 0,4% o-Nitrophenyl-^-D-galactopyranosid-Losung enthält. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 45° C inkubiert. Sodann wird die Reaktion durch Zusatz von 2,5 ml eines 0,2 M K₂HPO₄-NaOH-Puffers vom pH-Wert 11,0 abgebrochen. Hierauf wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert und 45 sodann die optische Dichte (OD) des Überstandes bei 410 nm gemessen. Die auf diese Weise für den Serum-T₄-TeSt nach der El Α-Methode erhaltene Eichkurve ist in F i g. 14 wiedergegeben.

Beispiel 18

Bestimmung von humanem Serum-T₄

Die T₄-Werte von humanen Serum-Prober:, bestimmt nach dem EIA gemäß Beispiel 17 werden mit denen verglichen, die mit einem T₄-RIΑ-Kit erhalten w erden. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Tabelle II	elektrophoretische Analyse, mg/ml	EIA, mg/ml
humanes Serum	12,8 22,4 23,6 12,0 Beispiel 17	12,5 274 22,8 11,7
A B C D

humane Serumproben T₄-RlA-KU, ElA,

\Lg/d\

A 26 ^a °

E 19,0 23,0 65

6,8	8,4
9,7	10,3
12,3	16,0
19,0	23,0

Beispiel 19

Reagentien und Methodik zur Bestimmung von Serum

Phenobarbital
5

Reagentien

(A) Pufferlösung 0,2 M Tris-HCl - 0,9% NaCl (pH 7,0).

(B) Standard-Phenobarbitallösung: Lösung von 1 μg Phenobarbital in 1 ml (A).
ίο (C) Enzymmarkiertes Antigen:

Eine 0,02 M Tris-HCl - 0,9% NaCl - 0,2% BSA - 0,1% NaN₃-Lösung (pH jt
Galactosidase], hergestellt gemäß Methode C (C), enthält (25 μg/ml /f-D-Galactosidase).

(D) Anti-Phenobarbital — nicht löslicher Antikörper:

Eine 0,02 M Tris-HCl - 0,9% NaCl - 0,2% BSA - 0,1% NaN₃-Lösung (pH 7,0), die gemäß Beispiel 3 hergestellten Anti-Phenobarbital — nicht löslichen Antikörper (10 μΐ Zellwand) enthält.

(E) Substratlösung:

Eine 0,16% o-Nitrophenyl-yi'-D-galactopyranosid — 0,2 mMol MgCl₂ — 0,3%^-Mercaptoäthanol — 0,06 M Kaliumphosphat-Lösung (pH 7,0).

(F) Reagens zum Abbruch der Enzymreaktion:
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 10,3).

Methodik

In Zentrifugenröhrchen aus Glas (2 χ 10cm) X\...X„ für die Standard-Phenobarbital-Eichkurche und Y\ ...Y_n, für die Proben werden jeweils 1 ml der Pufferlösung (A) gegeben.

Eine bestimmte Menge (0 bis 500 ng) der Standard-Phenobarbitallösung (B), die mit der Pufferlösung (A) in 2^er Potenzen verdünnt wurde, wird in die Röhrchen X\ — X_n gegeben, und eine entsprechende Menge der Probe (beispielsweise im Fall von humanem Serum 50 μΐ nach 50-facher Verdünnung der Probe mit der Pufferlösung (A)), wird in die Röhrchen Y\ ...Y_n, gegeben. In sämtliche Röhrchen werden 50 μΐ des enzymmarkierten Antigens (C) und 50 μΙ des Anti-Phenobarbital — nicht löslichen Antikörpers (D) gegeben. Sofern die Probe von einem Patienten stammt, werden 100μ1 humanes Normalserum ohne Phenobarbital zugegeben, das 10-fach verdünnt wurde. Nach gründlichem Mischen wird das Gemisch 30 Minuten bei 5° C inkubiert, sodann 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert und der Überstand abgetrennt. Das Präzipitat wird zweimal mit jeweils 1 ml der Pufferlösung (A) durch Zentrifugieren gewaschen.

Das erhaltene Präzipitat wird mit 0,5 ml der Substratlösung (E) versetzt und das Gemisch 15 oder 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Sodann werden 2 ml des Reagens (F) zum Abbruch der Enzymreaktion zugegeben, und das Gemisch wird zentrifugiert Die Absorption des Überstandes wird bei 412 nm gemessen. Aus den erhaltenen Werten wird eine Standard-Eichkurve angefertigt und sodann die Menge an Phenobarbital in der Probe berechnet

Beispiel 20
Einfluß anderer antiepileptischer Arzneistoffe auf den EIA zur Bestimmung von Phenobarbital

In Gegenwart unterschiedlicher Mengen Phenobarbital (PB), DPH, p-Hydroxydiphenylhydantoin (HO-DPH), Tnmetadion (TM), Carbamazepin (CM) und Primidon (PM) wird die Antigen-Antikörper-Reaktion gemäß Beispiel 19 durchgeführt Es wird die Enzymaktivität des enzymmarkierten Antigens, gebunden an den nicht löslichen Antikörper, bestimmt Die Ergebnisse sind in Fig. 15 wiedergegeben. Aus Fi g. 15 ist ersichtlich, daß die Standardkurve für den Phenobarbital-Test durch Mengen von 0,4 bis 10 μg der vorgenannten Antiepileptika und ihrer Metaboliten nicht beeinträchtigt wird.

Beispiel 21
Empfindlichkeit des EIA

Die Phenobarbitalwerte in drei humanen Serumproben werden lOmal mit dem EIA nach den in Beispiel 19 beschriebenen Bedingungen bestimmt, und es wird die Variationskonstante (CV) berechnet Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt Außerdem werden die Phenobarbitalmengen in drei anderen humanen Serumproben einmal täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen nach dem EIA gemäß Beispiel 19 bestimmt und es wird die Variation innerhalb eines Tages oder zwischen den Tagen bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die Variationskonstante (CV) im EIA innerhalb 10% liegt.

Tabelle IV

Probe CC. ElA

^g/ml) X±SD*)^g/ml) CV(%)

a 10,4 9,2 ± 0,4 4.3

b 22,4 21,0 ± 0,9 4.2

c 32,0 36,8 ± 2,0 5,4

*) X bedeutet Mittelwert, SD bedeutet Standardabweichung. Tabelle V

Probe	*CC.*	EIA	5,1	2	5,5	3	5,3	4	5,6	5	5,0	X ±SD	CV(o/o)
	(Hg/ml)	Tage	15,4	16,3	15,0	16,0	18,5	(MfM)
		1	27,0	26,0	28,5	29,0	25,1	5,3 ± 0,2	3,7
d	5,5						16,2 ± 1,2	7,0
e	15,1					27,0 ± 1,5	5,0
f	27,2

25,1 27,0 ± 1,5 5,0

Beispiel 22
Bestimmung von Phenobarbital in humanem Serum

In 77 humanen Serumproben von Patienten, die oral drei antiepileptische Arzneistoffe eingenommen hatten, nämlich Phenobarbital (PB), DPH Und Primidon (PM), wird Phenobarbital sowohl nach dem EIA als auch durch Gaschromatographie bestimmt. Die nach den beiden Methoden erhaltenen Phenobarbitalwerte stimmen gut überein, wie aus F i g. 16 hervorgeht

Beispiel 23

Herstellung eines EIA-Bestecks zur Bestimmung von Phenobarbital

(A) Pufferlösung

In 100 Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von 30 ml werden jeweils 25 ml eines 0,2 M Tris-HCl — 9% NaCI-Puffers, (pH 7,0) abgefüllt. Beim Gebrauch wird der Inhalt der Glasflaschen mit Wasser auf ein Volumen von 250 ml aufgefüllt. Diese Lösung wird als Pufferlösung (A) wie in Beispiel 19 verwendet

(B) Standard- Phenobarbital-Äthanollösung

100 Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von 6 ml werden jeweils mit 5 ml einer Lösung von 500 μg Phenobarbital in Äthanol gefüllt Zur Verwendung wird die Lösung in 2^er Potenzen mit der Pufferlösung (A) verdünnt.

(C) Enzymmarkiertes Antigen

100 Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von 6 ml werden jeweils mit 5,2 ml des in Beispiel 19 beschriebenen enzymmarkierten Antigens (C) gefüllt

(D) Anti-Phenobarbital — nicht löslicher Antikörper

100 Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von 6 ml werden jeweils mit 5,2 ml des in Beispiel 19 beschriebenen Anti-Phenobarbital — nicht löslichen Antikörpers (D) gefüllt

(E) Substratlösung

100 Glasflaschen mit einem Fassungsvermögen von 2 ml werden mit jeweils 88 mg o-Nitrophenyl-^-D-galactopyranosidpulver gefüllt Die Flaschen werden verschlossen. Zum Gebrauch wird der Inhalt der Flaschen in 52 ml eines 0,2 mMol MgCI₂ — 03% /9-Mercaptoäthanol — 0,06 M Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) zur Substratlösung(E),wiein Beispiel 19 beschrieben, gelöst

(F) Reagens zum Abbruch der Enzymreaktion

100 Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 25 ml werden mit jeweils 22 ml eines IM Kaliumphosphatpuffers (pH 103) gefüllt Zum Gebrauch wird der Inhalt mit Wasser auf 220 ml verdünnt Diese Lösung wird als Reagens (F) zum Abbruch der Enzymreaktion, wie in Beispiel 19 beschrieben, verwendet Es werden 1Ö0 Analysenbestecke hergestellt, die jeweils eine Flasche der Reagentien (A) bis (F) enthalten.

Diese werden für 100 Phenobarbital-Tests gemäß Beispiel 19 verwendet.

Beispiel 24
Herstellung eines EIA-Bestecks zur Bestimmung von DPH

(1) Nicht löslicher Antikörper

Gemäß Beispiel 1 wird ein [L. plantarum-Zellwandj-fAnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikorper] — ίο 0,1 % BSA - 0,9% NaCI - 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0; 11 ml) hergestellt. Jeweils 2,5 ml der erhaltenen nicht löslichen Antikörpersuspension werden unter Stickstoff in vier braune Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von 10 ml abgefüllt, gefriergetrocknet und verschlossen. Auch nach 2monatiger Lagerung bei 50⁰C wird keine Abnahme im Antikörpertiter beobachtet. Beim Verdünnen des Inhalts einer Flasche mit 5,0 ml Wasser entsprechen 50 μΐ der Lösung einem nicht löslichen Antikörper mit etwa 500 μg Zellwandmaterial.

(2) Enzymmarkiertes Antigen

Gemäß Versuch (C), (B-2) werden 9 ml einer 0,2% BSA — 0,1% NaN₃ — 0,05 M Phosphatpufferlösung mit [3,3-Diphenylpropylamin]-[y?-D-Galactosidase] einer 00^/2O Minuten = 810 hergestellt. Jeweils 2,0 ml der Lösung werden in vier braune Glasschliffflaschen mit einem Fassungsvermögen von 10 ml abgefüllt. 20 μΐ dieser Lösung entsprechen einem enzymmarkierten Antigen mit ODl/₈ ^m/20 Minuten = 1,8.

Ein EIA-Besteck zur Bestimmung von DPH besteht aus jeweils einer Flasche von (1) und (2), das für etwa 100 DPA-Tests gemäß Beispiel 5 verwendet wird.

Beispiel 25

Herstellung eines nicht-löslichen Antikörpers

20 mg gemäß Methode A hergestelltes Bakterienzellwandmaterial von L plantarum werden in 2 ml reinem Wasser suspendiert und homogenisiert Die erhaltene Suspension wird unter Rühren mit 40 μΐ 1M Acetat-HCl-Puffer (pH4), 50 μΐ Anti-DPH-3-acetyl-BSA-K.aninchenserum und 60 μΐ 1 -Äthyl-S-ß-dimethylaminopropyO-carbodiimid-hydrochlorid (nachstehend als wasserlösliches Carbodiimid bezeichnet) versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde bei Raumtemperatur (25° C) gerührt. Danach wird das Gemisch zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die Fällung wird zweimal mit jeweils 10 ml 0,1% BSA — 0,9% NaCl - 0,04 M Phosphat-Pufferlösung (pH7) gewaschen und schließlich in 5 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert.

Beispiel 26
Herstellung eines nicht-löslichen Antikörpers

20 mg gemäß Methode A hergestelltes Bakterienzellwandmaterial von L plantarum werden in 2 ml reinem Wasser suspendiert und homogenisiert. Die erhaltene Suspension wird unter Rühren mit 30 μΐ einer 1M Acetat-HCl-Pufferlösung (pH4), 50 μΐ Anti-T3-BSA-Kaninchenserum, 60 μΐ einer 50 mg/ml enthaltenden Lösung des wasserlöslichen Carbodiimids und 10 μΐ einer 25% Glutardialdehydlösung versetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt Danach wird das Gemisch zentrifugiert und die Fällung zweimal mit jeweils 10 ml einer 0,1% BSA — 0,9% NaCl — 0,04 M-Phosphat-Pufferlösung gewaschen und schließlich in 5 ml des gleichen Puffers suspendiert

Beispiel 27
Bestimmung von DPH

Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch werden die Sacharomyces cervisiae-Zellwandmaterial-anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchen-Antikörper durch den in Beispiel 25 hergestellten L plantarum-Zellwandmaterial-anti-DPH-3-acetyl-BSA-Kaninchen-Antikörper ersetzt Der EIA wird gemäß Beispiel 5 durchgeführt. Es wird eine ähnliche Eichkurve angefertigt, wie sie in F i g. 5 für DPH gezeigt ist

Beispiel 28
Bestimmung von T3

Der in Beispiel 1 hergestellte L plantarum-Zellwandmaterial-anti^-Kaninchen-Antikörper wird durch den gemäß Beispiel 26 hergestellten L. plantarum-Zellwandmaterial-anti-Tä-BSA-Kaninchen-Antikörper ersetzt Der EIA wird gemäß Beispiel 10 durchgeführt Es wird eine ähnliche Eichkurve für T3 angefertigt wie sie in F i g. 8 gezeigt ist

Hierzu 13 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Nicht löslicher Antikörper mit charakteristischer IR-Absorption bei etwa 1040, 1540 und 1640 cm-¹. hergestellt durch chemische Bindung eines Antikörpers an die von kugelförmigen oder stäbchenförmigen Bakterien oder Hefen gewonnene Zellwand

2. Verfahren zur Herstellung des nicht löslichen Antikörpers nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper chemisch an die von kugelförmigen oder stäbchenförmigen Batcterien oder Hefen gewonnene Zellwand bindet

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper mittels eines Bindemittels an die Zellwand verankert

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bindemittel Glutardialdehyd verwendet

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand mit einem Oxidationsmittel behandelt und das erhaltene Produkt mit dem Antikörper zur Reaktion bringt

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel Natriumperjodat verwendet

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsprodukt des Antikörpers mit der oxidierten Zellwand reduziert

8. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 zusammen mit einem -markierten Antigen im Enzymimmunassay oder Radioimmunassay.