JPS6026980B2 - フエノバルビタ−ル定量用試薬 - Google Patents
フエノバルビタ−ル定量用試薬Info
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- JPS6026980B2 JPS6026980B2 JP14187976A JP14187976A JPS6026980B2 JP S6026980 B2 JPS6026980 B2 JP S6026980B2 JP 14187976 A JP14187976 A JP 14187976A JP 14187976 A JP14187976 A JP 14187976A JP S6026980 B2 JPS6026980 B2 JP S6026980B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＥｍＭｍｅ ｌｍｍｕ肌Ａｓｓａｙ（以下ＥＩ
Ａと略す）法によってフェノバルビタール（以下ＰＢと
略す）を定量する際に用いる定量用試薬、定量法及び下
記式で表わされるｍーアミノフェノバルビタール（以下
「化合物１」という）のジアゾニゥム塩と蛋白との結合
物に関する。
Ａと略す）法によってフェノバルビタール（以下ＰＢと
略す）を定量する際に用いる定量用試薬、定量法及び下
記式で表わされるｍーアミノフェノバルビタール（以下
「化合物１」という）のジアゾニゥム塩と蛋白との結合
物に関する。
本明細書においてＥＩＡ法とは酵素標識抗原及び抗原（
定量されるべき物質）をこれらに対する抗体に競合的に
反応させ、次いで抗体と結合した酵素標識抗原（ｂｏ皿
ｄ：以下｛ｂ｝と略す）と遊離の酵素標識抗原（ｆｒｅ
ｅ：以下｛ｆ’と略す）とを分離し｛ｆ）又は‘ｂー中
の酵素活性を測定するすべての方法を含むものとする。
定量されるべき物質）をこれらに対する抗体に競合的に
反応させ、次いで抗体と結合した酵素標識抗原（ｂｏ皿
ｄ：以下｛ｂ｝と略す）と遊離の酵素標識抗原（ｆｒｅ
ｅ：以下｛ｆ’と略す）とを分離し｛ｆ）又は‘ｂー中
の酵素活性を測定するすべての方法を含むものとする。
薬理効果が発現する用量と中毒の如き副作用が発現する
用量とが接近しているＰＢの如き薬剤の体液中の濃度を
知ることは治療上極めて有用な情報であるが、極微量定
量法であるＥＩＡ法でＰＢを定量した例は知られていな
い。最近多くのＥＩＡに関する報告がなされているにも
かかわらず実用的なものが少ない主な理由は、抗原及び
酵素標識抗原とは反応するが、化学構造が抗原と類似す
る化合物とは反応しない・・・・・・・・・交差性がな
い・・・・・・・・・抗体を得にくいこと及び抗体に対
して抗糠と競合的に反応する酵素標識抗原の選出が困難
であるためと考えられる。
用量とが接近しているＰＢの如き薬剤の体液中の濃度を
知ることは治療上極めて有用な情報であるが、極微量定
量法であるＥＩＡ法でＰＢを定量した例は知られていな
い。最近多くのＥＩＡに関する報告がなされているにも
かかわらず実用的なものが少ない主な理由は、抗原及び
酵素標識抗原とは反応するが、化学構造が抗原と類似す
る化合物とは反応しない・・・・・・・・・交差性がな
い・・・・・・・・・抗体を得にくいこと及び抗体に対
して抗糠と競合的に反応する酵素標識抗原の選出が困難
であるためと考えられる。
本発明者らは、てんかん治療においてＰＢと併用される
プリミドン、トリメタジオン、カルバマゼピン、ジフエ
ニルヒダントインまたはジフエニルヒダントィンの代謝
産物であるｐ−ヒドロキシジフエニルヒダントインが、
ことにジフエニルヒダントイン、ｐ−ヒドロキシジフエ
ニルヒダントィンまたはプリミドンがＰＢと共存する検
体中のＰＢをＥＩＡ法によって定量する場合、ＰＢとの
交差性を危倶した。
プリミドン、トリメタジオン、カルバマゼピン、ジフエ
ニルヒダントインまたはジフエニルヒダントィンの代謝
産物であるｐ−ヒドロキシジフエニルヒダントインが、
ことにジフエニルヒダントイン、ｐ−ヒドロキシジフエ
ニルヒダントィンまたはプリミドンがＰＢと共存する検
体中のＰＢをＥＩＡ法によって定量する場合、ＰＢとの
交差性を危倶した。
しかし、化合物１のジアゾニウムクロラィドとアセチル
化した牛血清アルブミン（以下茂Ａと略す）を反応させ
て製した｛ＰＢ〕−〔欧Ａ〕結合物をハプテン抗原とし
、以下常法に従って製造した抗体を用いることによって
ＰＢ以外の上記抗てんかん剤との交差性を回避すること
ができた。しかし、この様な抗体に対してＰＢと競合的
に反応する適切な酵素標識フヱノバルビタールを調製す
るのは極めて困難な事であった。
化した牛血清アルブミン（以下茂Ａと略す）を反応させ
て製した｛ＰＢ〕−〔欧Ａ〕結合物をハプテン抗原とし
、以下常法に従って製造した抗体を用いることによって
ＰＢ以外の上記抗てんかん剤との交差性を回避すること
ができた。しかし、この様な抗体に対してＰＢと競合的
に反応する適切な酵素標識フヱノバルビタールを調製す
るのは極めて困難な事であった。
本発明者らは、体液中にほとんど存在せず、抗原（すな
わちＰＢ）との結合反応に於ても失活せず、その測定法
が簡便かつ高感度である酵素標識用の酵素として８一Ｄ
−ガラクトシダーゼ（以下８−ＧＡＬと略す）を選択し
、かつ、遊離の酵素や〔酵素〕−〔酵素〕結合物の生成
する可能性の低いと考えられる種々の結合様式で抗原で
あるＰＢと酵素である０−ＧＡＬとを結合させ、得られ
る種々の〔ＰＢ〕−〔８一ＧＡＬ〕結合物（酵素標識抗
原）と抗体との反応性を検討した結果、意外にも本発明
のＰＢと６−ＧＡＬを基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合した酵
素標識抗原以外のものは抗体との反応性が強すぎるかあ
るいは弱すぎて、抗体に対する反応が競合的に行なわれ
ず、全くＥＩＡに適用できないことを知った。
わちＰＢ）との結合反応に於ても失活せず、その測定法
が簡便かつ高感度である酵素標識用の酵素として８一Ｄ
−ガラクトシダーゼ（以下８−ＧＡＬと略す）を選択し
、かつ、遊離の酵素や〔酵素〕−〔酵素〕結合物の生成
する可能性の低いと考えられる種々の結合様式で抗原で
あるＰＢと酵素である０−ＧＡＬとを結合させ、得られ
る種々の〔ＰＢ〕−〔８一ＧＡＬ〕結合物（酵素標識抗
原）と抗体との反応性を検討した結果、意外にも本発明
のＰＢと６−ＧＡＬを基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合した酵
素標識抗原以外のものは抗体との反応性が強すぎるかあ
るいは弱すぎて、抗体に対する反応が競合的に行なわれ
ず、全くＥＩＡに適用できないことを知った。
以上の知見をもとにして、我々は本発明を完成した。
本発明は、少なくとも次の成分から構成されることを特
徴とする免疫化学的測定法によるＰＢ定量用試薬、ＰＢ
の定量法及び化合物１のジアゾニゥム塩と蛋白との結合
物に関する。
徴とする免疫化学的測定法によるＰＢ定量用試薬、ＰＢ
の定量法及び化合物１のジアゾニゥム塩と蛋白との結合
物に関する。
成分凶；化合物１のジアゾニウム塩と蛋白とを反応させ
ることにより製造され、かつ、１分子の蛋白に少なくと
も１分子のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［
フェノバルビタール］−［蛋白］結合物を動物に投与し
て生成せしめた抗体成分‘Ｂ’；化合物１のジアゾニウ
ム塩を８一Ｄ−ガラクトシダーゼで標識して得られ、か
つ、１分子の８−Ｄーガラクトシダーゼに少なくとも１
分子のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［フエ
ノバルビタール］一［８一Ｄ−ガラクトシダーゼ］結合
物本誌薬は成分の、皿以外に必要に応じて、検量線作成
用の標準ＰＢ含有溶液、酵素活性測定用試薬（例えば、
基質、基質溶解液、酵素反応停止液等）、第２抗体、緩
衝化剤等から構成される。
ることにより製造され、かつ、１分子の蛋白に少なくと
も１分子のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［
フェノバルビタール］−［蛋白］結合物を動物に投与し
て生成せしめた抗体成分‘Ｂ’；化合物１のジアゾニウ
ム塩を８一Ｄ−ガラクトシダーゼで標識して得られ、か
つ、１分子の８−Ｄーガラクトシダーゼに少なくとも１
分子のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［フエ
ノバルビタール］一［８一Ｄ−ガラクトシダーゼ］結合
物本誌薬は成分の、皿以外に必要に応じて、検量線作成
用の標準ＰＢ含有溶液、酵素活性測定用試薬（例えば、
基質、基質溶解液、酵素反応停止液等）、第２抗体、緩
衝化剤等から構成される。
成分凶における化合物１のジアゾニウム塩と蛋白との結
合体は、化合物１に、氷冷下、亜硝酸ナトリウム及び塩
酸を作用させてジアゾ化し、これに緩衝化剤に熔解した
蛋白を作用させることにより製造でき、１分子の蛋白に
少なくとも１分子のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合し
ている。適当な蛋白としては、アルブミン、グロプリン
、サイログロブリソ、貝へモシアニン、ヱデスチン等が
ある。このようにして作製した結合体を適当なアジュバ
ンドと混合してウサギ、モルモット、ャギ、羊等の動物
の皮下又は筋肉内に投与し、血清を採取し公知の処理を
なすことによって成分風の抗体が得られる。
合体は、化合物１に、氷冷下、亜硝酸ナトリウム及び塩
酸を作用させてジアゾ化し、これに緩衝化剤に熔解した
蛋白を作用させることにより製造でき、１分子の蛋白に
少なくとも１分子のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合し
ている。適当な蛋白としては、アルブミン、グロプリン
、サイログロブリソ、貝へモシアニン、ヱデスチン等が
ある。このようにして作製した結合体を適当なアジュバ
ンドと混合してウサギ、モルモット、ャギ、羊等の動物
の皮下又は筋肉内に投与し、血清を採取し公知の処理を
なすことによって成分風の抗体が得られる。
なお成分帆は後に説明するように‘ｆ｝、‘ｂー分離の
ために酵母又は細菌の細胞壁、天然の不溶性多糖類、化
学処理したデキストデンゲル、寒天ゲル、プラスチック
ビーズ、アクリルアミドゲル、ガラスビーズ、微細金属
粉末、合成ゴムチューブ等によって不落化しておくこと
ができる。
ために酵母又は細菌の細胞壁、天然の不溶性多糖類、化
学処理したデキストデンゲル、寒天ゲル、プラスチック
ビーズ、アクリルアミドゲル、ガラスビーズ、微細金属
粉末、合成ゴムチューブ等によって不落化しておくこと
ができる。
成分（Ｂ）の標識抗原は、化合物１に、氷冷下、亜硝酸
ナトリウムならびに塩酸を作用させてジアゾ化し、これ
に緩衝化剤に溶解したＢ−ＧＡＬを作用させることによ
り製造でき、１分子の３−ＧＡＬに少〈なくとも１分子
のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合している。
ナトリウムならびに塩酸を作用させてジアゾ化し、これ
に緩衝化剤に溶解したＢ−ＧＡＬを作用させることによ
り製造でき、１分子の３−ＧＡＬに少〈なくとも１分子
のＰＢが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合している。
この際、高価な酵素を効率よく利用するために、またＰ
Ｂと結合しない遊離の酵素が残存するのを防ぐために化
合物１を大過剰用いるのが好ましい。８一ＧＡＬとＰＢ
とは、８一ＧＡＬの構成アミノ酸である１４４分子のチ
ロシンと１４４分子のヒスチジン由釆のアミノ酸残基の
いづれかと化合物１のジアゾニウムクロラィドとが反応
して結合する。
Ｂと結合しない遊離の酵素が残存するのを防ぐために化
合物１を大過剰用いるのが好ましい。８一ＧＡＬとＰＢ
とは、８一ＧＡＬの構成アミノ酸である１４４分子のチ
ロシンと１４４分子のヒスチジン由釆のアミノ酸残基の
いづれかと化合物１のジアゾニウムクロラィドとが反応
して結合する。
８−ＧＡＬとＰＢとの結合割合は、用いる化合物１の量
ならびに反応条件によって左右されるが、少くなくとも
１分子の８一ＧＡＬに１分子以上２斑扮子以下のＰＢが
結合し、その構造は次の様に推定される。
ならびに反応条件によって左右されるが、少くなくとも
１分子の８一ＧＡＬに１分子以上２斑扮子以下のＰＢが
結合し、その構造は次の様に推定される。
（式中〔ＧＡＬ〕一は８一ＧＡＬ残基を、ｎは１以上２
総以下の整数を意味する）このようにして得た成分凶、
成分‘Ｂ｝及び被検体の三者を緩衝液中で競合的に反応
させ、ついでｍ、【ｂー分離を行ない｛ｆはたは‘ｂ’
の酵素活性を測定することによりＰＢの定量ができる。
総以下の整数を意味する）このようにして得た成分凶、
成分‘Ｂ｝及び被検体の三者を緩衝液中で競合的に反応
させ、ついでｍ、【ｂー分離を行ない｛ｆはたは‘ｂ’
の酵素活性を測定することによりＰＢの定量ができる。
ＥＩＡ法の感度ないいま迅速性と関連する‘ｆ’【ｂ｝
分離は【ｂ｝の二次凝集を促進させる方法、第１抗体（
Ｐ母抗体）に対する第２抗体または不溶性にした第２抗
体を更に作用させる二重抗体法又は二重抗体固相法や不
溶化した第一抗体を用いる不落性抗体法等の公３敗の手
段によって行なえる。
分離は【ｂ｝の二次凝集を促進させる方法、第１抗体（
Ｐ母抗体）に対する第２抗体または不溶性にした第２抗
体を更に作用させる二重抗体法又は二重抗体固相法や不
溶化した第一抗体を用いる不落性抗体法等の公３敗の手
段によって行なえる。
しかし、‘ｆ｝｛ｂ｝分離の簡便さ、多数の試料を処理
できること、高価な第２抗体を用いない等の点において
不溶性抗体法が優れている。
できること、高価な第２抗体を用いない等の点において
不溶性抗体法が優れている。
不溶性抗体法の内でも、特に本発明者らが新らたに開発
した不落性抗体、すなわち抗体に球状ないし樟状の酵母
またはこの細胞肇を化学的に結合させた不溶性抗体を用
いる方法が最も優れている。従釆、ＥＩＡまたはラジオ
ィムノ アッセィで用いられている不落性抗体で実用
化されているのはデキストラン誘導体と抗体とを化学的
に結合させたものであるが、この不溶性抗体は試験管や
ピペットの壁に粘着する性質を有するため、定量的分注
および抗原抗体複合物の洗浄が難しいと云う欠点がある
。
した不落性抗体、すなわち抗体に球状ないし樟状の酵母
またはこの細胞肇を化学的に結合させた不溶性抗体を用
いる方法が最も優れている。従釆、ＥＩＡまたはラジオ
ィムノ アッセィで用いられている不落性抗体で実用
化されているのはデキストラン誘導体と抗体とを化学的
に結合させたものであるが、この不溶性抗体は試験管や
ピペットの壁に粘着する性質を有するため、定量的分注
および抗原抗体複合物の洗浄が難しいと云う欠点がある
。
また、凝集反応に応用することを目的とした中空ガラス
と抗体とを結合させた不溶性抗体が知られているが（特
関昭５０一助１１６）、本発明の不溶性抗体とはその目
的を異にしている。更に袴関昭５０一１１０磯５には糸
状菌または放線菌と酵素とを結合させた不落性酵素がブ
ドウ糖の製法において有用であるとの開示がなされてい
る。しかし、本発明者らはべニシリウム クリソゲニウ
ム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｍｍｃｈひｓｏ鉾ｎ印ｍ）やアス
ベルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇ川畑ｎｉｇｅｒ）の
如き糸状菌またはこれらの細胞壁を結合した抗体は均一
な懸濁状態にすることができず、ＥＩＡまたはラジオ
ィムノ アッセィに適用できないことも確認した。本発
明者らは、これらの先行技術を考慮しながら鋭意研究し
た結果、均一に懸濁可能で管壁に粘着せず、抗原抗体反
応を阻害せず、‘ｆ’｛ｂー分離が極めて容易な性質を
もつ本発明の不溶性抗体を開発した。
と抗体とを結合させた不溶性抗体が知られているが（特
関昭５０一助１１６）、本発明の不溶性抗体とはその目
的を異にしている。更に袴関昭５０一１１０磯５には糸
状菌または放線菌と酵素とを結合させた不落性酵素がブ
ドウ糖の製法において有用であるとの開示がなされてい
る。しかし、本発明者らはべニシリウム クリソゲニウ
ム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｍｍｃｈひｓｏ鉾ｎ印ｍ）やアス
ベルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇ川畑ｎｉｇｅｒ）の
如き糸状菌またはこれらの細胞壁を結合した抗体は均一
な懸濁状態にすることができず、ＥＩＡまたはラジオ
ィムノ アッセィに適用できないことも確認した。本発
明者らは、これらの先行技術を考慮しながら鋭意研究し
た結果、均一に懸濁可能で管壁に粘着せず、抗原抗体反
応を阻害せず、‘ｆ’｛ｂー分離が極めて容易な性質を
もつ本発明の不溶性抗体を開発した。
用いられる酵母の具体例としてはサッカロミセスセルビ
シェ（パン酵母）の如きサッカロミセス属、ピチア
ポリモルフア（Ｐｉｃｈｉａｐｏｌのｍｏｒｐｈａ）の
如きピチァ属、シゾサッカロミセス ポンべ（Ｓｃｈｉ
Ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｐ）の如きシ
ゾサッカロミセス屋等が挙られ、特に入手の容易なパン
酵母が好ましい。
シェ（パン酵母）の如きサッカロミセス属、ピチア
ポリモルフア（Ｐｉｃｈｉａｐｏｌのｍｏｒｐｈａ）の
如きピチァ属、シゾサッカロミセス ポンべ（Ｓｃｈｉ
Ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｐ）の如きシ
ゾサッカロミセス屋等が挙られ、特に入手の容易なパン
酵母が好ましい。
細胞壁は酵母をホモジナィザー等で機械的に破壊するか
、またはトリプシンで消化するか、または希アルカリ溶
液で煮沸するか、またはこれらの手段を組み合せた方法
により調製できる。
、またはトリプシンで消化するか、または希アルカリ溶
液で煮沸するか、またはこれらの手段を組み合せた方法
により調製できる。
酵母またはこの細胞壁と抗体を化学的に結合させるには
、これらを結合剤と共に反応させることにより行なえる
。
、これらを結合剤と共に反応させることにより行なえる
。
結合剤としては、例えばグルタールアルデヒド、エピク
ロルヒドリン、トルエンー２・４−ジィソシアネート、
カルボジイミド類等が挙られ、特に化学反応が緩和に進
行するグルタールアルデヒドが好ましい。以上から明ら
かなように本発明のＥＩＡ法の好ましい実施態様は本発
明の酵素標識抗原（〔ＰＢ〕−〔８−Ｄ−ＧＡＬ〕結合
物）、未標識抗原（ＰＢ）ならびにこれらの抗体とを競
合的に反応させ、次いで‘ｆ｝｛ｂ’分離を公知の手段
よって行ない、｛ｆ’または‘ｂーの３−ＧＡＬ活性を
測定することである。
ロルヒドリン、トルエンー２・４−ジィソシアネート、
カルボジイミド類等が挙られ、特に化学反応が緩和に進
行するグルタールアルデヒドが好ましい。以上から明ら
かなように本発明のＥＩＡ法の好ましい実施態様は本発
明の酵素標識抗原（〔ＰＢ〕−〔８−Ｄ−ＧＡＬ〕結合
物）、未標識抗原（ＰＢ）ならびにこれらの抗体とを競
合的に反応させ、次いで‘ｆ｝｛ｂ’分離を公知の手段
よって行ない、｛ｆ’または‘ｂーの３−ＧＡＬ活性を
測定することである。
更に好ましい本発明のＥＩＡ法の実施態様は酵素標識抗
原として本発明の〔ＰＢ〕−〔８一ＧＡＬ〕結合物を用
い、抗体として球状ないし棒状の酵母またはこの細胞壁
を結合させた不溶性抗体を用いることである。特に好ま
しい本発明の実施態様は酵素標識抗原として本発明の
びＢ〕−〔８一ＧＡＬ〕結合物を用い、抗体としてパン
酵母の細胞壁を結合させた不落性抗体を用いることであ
る。
原として本発明の〔ＰＢ〕−〔８一ＧＡＬ〕結合物を用
い、抗体として球状ないし棒状の酵母またはこの細胞壁
を結合させた不溶性抗体を用いることである。特に好ま
しい本発明の実施態様は酵素標識抗原として本発明の
びＢ〕−〔８一ＧＡＬ〕結合物を用い、抗体としてパン
酵母の細胞壁を結合させた不落性抗体を用いることであ
る。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例 １
酵素標識抗原（〔ＰＢ〕−〔ムーＧＡＬ〕結合物）の調
製ｍーアミノフヱノバルビタール１．５雌、臭化カリウ
ム１７肋９、３６％塩酸２メタを含む０．２３０の‘の
水溶液に、氷冷下に亜硝酸ナトリウム５７０ムタを含む
水溶液８０ムクを加え１時間反応させる。
製ｍーアミノフヱノバルビタール１．５雌、臭化カリウ
ム１７肋９、３６％塩酸２メタを含む０．２３０の‘の
水溶液に、氷冷下に亜硝酸ナトリウム５７０ムタを含む
水溶液８０ムクを加え１時間反応させる。
この反応液８０仏〆を０．０１Ｍホウ酸ナトリウム溶液
４の‘に加えたものを、大腸菌由来の８−ＧＡＬ５００
ムタを含む０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）２の‘に加え１時間氷冷下に渡洋する。この反応液
をダイアフロー限外炉過膜びＭ３０（アミコン社）で炉
過後、さらに残査を０．９％ＮａＣＩ−０．０２ＭＴｒ
ｉｓ・Ｈｃｌ（ｐＨ７．０）１０の‘で３回炉過洗膝し
、最後に残査に０．２％斑Ａ‐０．９％ＮａＣＩ−０．
０２ＭＴｒｉｓＩＨｃｌ（ＰＨ７．０）−０．１％Ｎａ
Ｎ３を加えて最終容量２０の‘とする（４０の副測定用
）。実施例 ２ 抗Ｐ母抗体の調製 ＢＳＡ５０仮ｏを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）２５の‘に溶解し、無水酢酸１００のｏを含む
テトラヒドロフラン溶液０．５の‘を加え、縄拝しなが
ら室温で１時間放置後、０．０１Ｍホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．３）５のこ対して１夜透析し、同緩衝液
を加えて最終容量５０泌とし１％アセチル化ＢＳＡ溶液
とする。
４の‘に加えたものを、大腸菌由来の８−ＧＡＬ５００
ムタを含む０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）２の‘に加え１時間氷冷下に渡洋する。この反応液
をダイアフロー限外炉過膜びＭ３０（アミコン社）で炉
過後、さらに残査を０．９％ＮａＣＩ−０．０２ＭＴｒ
ｉｓ・Ｈｃｌ（ｐＨ７．０）１０の‘で３回炉過洗膝し
、最後に残査に０．２％斑Ａ‐０．９％ＮａＣＩ−０．
０２ＭＴｒｉｓＩＨｃｌ（ＰＨ７．０）−０．１％Ｎａ
Ｎ３を加えて最終容量２０の‘とする（４０の副測定用
）。実施例 ２ 抗Ｐ母抗体の調製 ＢＳＡ５０仮ｏを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）２５の‘に溶解し、無水酢酸１００のｏを含む
テトラヒドロフラン溶液０．５の‘を加え、縄拝しなが
ら室温で１時間放置後、０．０１Ｍホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．３）５のこ対して１夜透析し、同緩衝液
を加えて最終容量５０泌とし１％アセチル化ＢＳＡ溶液
とする。
亜硝酸ナトリウム２５雌を含む水溶液３．５の‘を、ｍ
−アミノフェノバルビタール８６．５の９、３６％塩酸
８５ム〆および臭化カリウム７．５の９を含む水溶液１
０の‘に氷冷下に添加し、１時間燈梓後、さらに水を加
えて４０の‘とする（ジアゾ化ｍ−フヱノバルビタール
）。
−アミノフェノバルビタール８６．５の９、３６％塩酸
８５ム〆および臭化カリウム７．５の９を含む水溶液１
０の‘に氷冷下に添加し、１時間燈梓後、さらに水を加
えて４０の‘とする（ジアゾ化ｍ−フヱノバルビタール
）。
このジアゾ化ｍーフェノバルビタール溶液４０の‘を、
前記１％ァセチルイ雌ＳＡ溶液（ＰＨ９．３）５０の‘
に氷冷下に燈拝しながら添加し、さらに３時間縄拝する
。
前記１％ァセチルイ雌ＳＡ溶液（ＰＨ９．３）５０の‘
に氷冷下に燈拝しながら添加し、さらに３時間縄拝する
。
この反応液を水道水で一夜透析してから（９５の‘）、
凍結乾燥し、〔ＰＢ〕−〔ＢＳＡ〕結合物を得た（収量
５２０のｏ）。その３雌をアミノ酸分析することにより
、ＢＳＡＩＭｏｌあたり２仇ｈｏｌのフエノバルビター
ルが導入されたことが認められた。この〔ＰＢ〕−〔Ｂ
ＳＡ〕結合物を４雌／地の割合に生理食塩水に溶解し、
等容量のフロィンドの完全アジュバントを加え、ワーリ
ングブレンダーで十分乳化したものを２．５〜３．５ｋ
９の成熟ウサギ１、０、ｍに初回は足隣に０．５ｍｏを
２ケ所ならびに８ケ所の背部皮内に０．２５奴づつを注
射し、以降２週間おきに１０ケ所の皮内に０．２〜０．
４のｏづつを注射し、注射後１週間毎に耳静脈より採血
し玩びＢ力価を測定した（第１図参照）。
凍結乾燥し、〔ＰＢ〕−〔ＢＳＡ〕結合物を得た（収量
５２０のｏ）。その３雌をアミノ酸分析することにより
、ＢＳＡＩＭｏｌあたり２仇ｈｏｌのフエノバルビター
ルが導入されたことが認められた。この〔ＰＢ〕−〔Ｂ
ＳＡ〕結合物を４雌／地の割合に生理食塩水に溶解し、
等容量のフロィンドの完全アジュバントを加え、ワーリ
ングブレンダーで十分乳化したものを２．５〜３．５ｋ
９の成熟ウサギ１、０、ｍに初回は足隣に０．５ｍｏを
２ケ所ならびに８ケ所の背部皮内に０．２５奴づつを注
射し、以降２週間おきに１０ケ所の皮内に０．２〜０．
４のｏづつを注射し、注射後１週間毎に耳静脈より採血
し玩びＢ力価を測定した（第１図参照）。
抗体力価の上昇が箸じるしく、かつ、力価が一定になっ
た１００日目のウサギｍに５％ウレタン水溶液を１夕／
ｋｇの割合で腹腔内注射して麻酔し、頚動脈より放血採
血し、室温で２〜３時間放置後遺心分離（３００爪ｐｍ
、２０分）し約７０の‘の血清を得た。
た１００日目のウサギｍに５％ウレタン水溶液を１夕／
ｋｇの割合で腹腔内注射して麻酔し、頚動脈より放血採
血し、室温で２〜３時間放置後遺心分離（３００爪ｐｍ
、２０分）し約７０の‘の血清を得た。
抗血清の力価はガンマベニン緩衝液でウサギの血清を２
００倍に稀釈し、その０．２の‘に粗−ＰＢ（比放射能
１０．３山Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）２０蛇夕／１０一そエタ
ノールを加えて約１時間５℃で放置後飽和硫安０．２の
‘を加えて２０分後に遠心分離し、上清０．２地中の遊
離細−ＰＢを測定し、対照の正常ウサギのカウントＡお
よび免疫ウサギのカウントＢを測定し、三三ｘｌｏｏ％
を算出し、便宜上の力価とした。上記の抗ウサギ血清５
．０の‘を０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０
）１３Ｍに加えて、氷冷下に燈拝しながら飽和硫安液１
８の‘を少しずつ加え（５分間）、さらに燭梓（２０分
）後、遠心分離（１０００比ｐｍ、２０分）する。
００倍に稀釈し、その０．２の‘に粗−ＰＢ（比放射能
１０．３山Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）２０蛇夕／１０一そエタ
ノールを加えて約１時間５℃で放置後飽和硫安０．２の
‘を加えて２０分後に遠心分離し、上清０．２地中の遊
離細−ＰＢを測定し、対照の正常ウサギのカウントＡお
よび免疫ウサギのカウントＢを測定し、三三ｘｌｏｏ％
を算出し、便宜上の力価とした。上記の抗ウサギ血清５
．０の‘を０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０
）１３Ｍに加えて、氷冷下に燈拝しながら飽和硫安液１
８の‘を少しずつ加え（５分間）、さらに燭梓（２０分
）後、遠心分離（１０００比ｐｍ、２０分）する。
上清を除去し、沈殿に０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７．０）８地を加え溶解し、さらに冷却下に飽和硫
安液５．５の‘を少しずつ添加（５分）後、２０分間燈
拝し、再び遠心（１０００仇ｐｍ、２０分）し、上清を
除去し、沈殿を０．０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
５の‘に溶解し、セロフアン透析膜チューブに入れて、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３のこ対して一
夜透析し、抗ＰＢ抗体を得る（総液量９．４私、総タン
パク量１払の。）。実施例 ３抗ＰＢ不・溶性抗体の調
製 市販の圧窄パン酵母２５０夕を５００の‘の水に懸濁し
、ダイノミル（マシンフアブリック社）で破砕（３００
仇ｐｍ、ガラスビーズの直径０．２５〜０．５風）し、
ＩＭ−Ｎａｃｌと水で交互に充分洗浄後凍結乾燥し、１
３夕の細胞壁を得る。
ｐＨ７．０）８地を加え溶解し、さらに冷却下に飽和硫
安液５．５の‘を少しずつ添加（５分）後、２０分間燈
拝し、再び遠心（１０００仇ｐｍ、２０分）し、上清を
除去し、沈殿を０．０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
５の‘に溶解し、セロフアン透析膜チューブに入れて、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３のこ対して一
夜透析し、抗ＰＢ抗体を得る（総液量９．４私、総タン
パク量１払の。）。実施例 ３抗ＰＢ不・溶性抗体の調
製 市販の圧窄パン酵母２５０夕を５００の‘の水に懸濁し
、ダイノミル（マシンフアブリック社）で破砕（３００
仇ｐｍ、ガラスビーズの直径０．２５〜０．５風）し、
ＩＭ−Ｎａｃｌと水で交互に充分洗浄後凍結乾燥し、１
３夕の細胞壁を得る。
得られる酵母細胞壁の水懸濁液５咳３／の【の０．５の
‘と実施例２で得た抗ＰＢ抗体の１．３７Ｍとを混和し
、さらに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．９）１．７７の
‘を加えて、澄梓下に２５％グルタールアルデヒド溶液
７０山Ｚを少量ずつ滴下して、室温で２時間縄拝する。
‘と実施例２で得た抗ＰＢ抗体の１．３７Ｍとを混和し
、さらに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．９）１．７７の
‘を加えて、澄梓下に２５％グルタールアルデヒド溶液
７０山Ｚを少量ずつ滴下して、室温で２時間縄拝する。
この反応混液を遠心分離（７００びｐｍ、２０分）し、
上清を除去して、さらに０．０２ＭＴｒｉｓＨＣＩ−０
．９％ＮａＣ１（ｐＨ７．０）１０の【で２回遠心洗糠
する。最後に沈殿に０．２％ＢＳＡ−０．０２Ｍ Ｔｎ
ｓＨＣＩ−０．９％ＮａＣ１（冊７．０）−０．１％Ｎ
ａＮ３を加えて５．２の‘とし、超音波処理（１眺ｃｙ
ｃｌｅ、３町皆）したものを抗ＰＢ不落性抗体として用
いる（１０ｑ団ぶｓａｙ分）。実施例 ４定量用試薬お
よび定量方法 定量用試薬 〔Ａ〕緩衝液 ０．２ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ−０．９％Ｎ
ａＣ１（ｐＨ７‐〇）〔Ｂ〕Ｂ標準液 〔Ａ〕液１泌中
にＰＢＩ山夕を含有する。
上清を除去して、さらに０．０２ＭＴｒｉｓＨＣＩ−０
．９％ＮａＣ１（ｐＨ７．０）１０の【で２回遠心洗糠
する。最後に沈殿に０．２％ＢＳＡ−０．０２Ｍ Ｔｎ
ｓＨＣＩ−０．９％ＮａＣ１（冊７．０）−０．１％Ｎ
ａＮ３を加えて５．２の‘とし、超音波処理（１眺ｃｙ
ｃｌｅ、３町皆）したものを抗ＰＢ不落性抗体として用
いる（１０ｑ団ぶｓａｙ分）。実施例 ４定量用試薬お
よび定量方法 定量用試薬 〔Ａ〕緩衝液 ０．２ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ−０．９％Ｎ
ａＣ１（ｐＨ７‐〇）〔Ｂ〕Ｂ標準液 〔Ａ〕液１泌中
にＰＢＩ山夕を含有する。
〔Ｃ〕酵素標識抗原 ０．０２ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ−０
．９％ＮａＣＩ−０．２％茂Ａ−０．１％ＮａＮ３溶液
（ＰＨ７．０）中に実施例１で調製した〔ＰＢ〕−〔８
−ＧＡＬ〕結合物を８一ＧＡＬとして２５仏夕／叫の割
合で含有する。
．９％ＮａＣＩ−０．２％茂Ａ−０．１％ＮａＮ３溶液
（ＰＨ７．０）中に実施例１で調製した〔ＰＢ〕−〔８
−ＧＡＬ〕結合物を８一ＧＡＬとして２５仏夕／叫の割
合で含有する。
〔Ｄ〕抗ＰＢ不溶性抗体 ０．０２ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ
−０．９％ＮａＣＩ−０．２％斑Ａ−０．１％ＮａＮ３
溶液（ＰＨ７．０）中に実施例３で得た抗ＰＢ不溶性抗
体を細胞壁として１０雌／の‘の割合で含有する。
−０．９％ＮａＣＩ−０．２％斑Ａ−０．１％ＮａＮ３
溶液（ＰＨ７．０）中に実施例３で得た抗ＰＢ不溶性抗
体を細胞壁として１０雌／の‘の割合で含有する。
〔Ｅ〕基質溶液 ０．１６％○−ニトロフェニルーＢ一
Ｄーガラクトシドー０．２ｍＭ Ｍｇｃ１２一０．３％
８ーメルカプトェタノールー０．０８Ｍリン酸カリウム
溶液（ｐＨ７．０）。
Ｄーガラクトシドー０．２ｍＭ Ｍｇｃ１２一０．３％
８ーメルカプトェタノールー０．０８Ｍリン酸カリウム
溶液（ｐＨ７．０）。
〔Ｆ〕酵素反応停止液 ０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨＩＯ．３）。
（ｐＨＩＯ．３）。
定量法
標準検量線作用にＸ．・・・・・・Ｘｎ本の、被検体用
にＹ．・・・・・・Ｙｍ本のガラス製遠沈管（２×１０
仇）を用意し、全遼沈管に〔Ａ〕１．０の‘を加え、次
に×系の遠心管には倍数希釈した既知濃度（０〜５０仇
夕）の〔Ｂ〕を加え、Ｙ系の遠沈管には適量の検体（ヒ
ト患者血清の場合には、例えば５び音希釈したものを５
０仏夕）を添加する。
にＹ．・・・・・・Ｙｍ本のガラス製遠沈管（２×１０
仇）を用意し、全遼沈管に〔Ａ〕１．０の‘を加え、次
に×系の遠心管には倍数希釈した既知濃度（０〜５０仇
夕）の〔Ｂ〕を加え、Ｙ系の遠沈管には適量の検体（ヒ
ト患者血清の場合には、例えば５び音希釈したものを５
０仏夕）を添加する。
全遠沈管に〔Ｃ〕５０ｒそおよび〔Ｄ〕５０″そを添加
し（ヒト患者血清を検体とする場合には１坊苦希釈した
ＰＢ不含正常人血清１００ムそ添加し）、よく混合し、
５℃で３０分間放置後遠心分離（３００仇ｐｍ、１ぴ分
）し、沈殿に〔Ａ〕１．０の‘を加え２回遠心洗浴する
。次に沈殿に〔Ｅ〕０．５机を加え、３７ｑ０で温層し
、１５または３０分後〔Ｆ〕２．０の‘を加え途枕し、
上清の４１加川の吸光度を測定する。作成した標準検量
線から検体中のＰＢ濃度を算出する。実施例 ５他の抗
てんかん剤との交差性 ＰＢ、ジフエニルヒダントイン（ＤＰＨ）、ｐーヒドロ
キシジフエニルヒダントイン（Ｈ○一ＤＰＨ）、トリメ
タジオン（ＴＭ）、カルバマゼピン（ＣＭ）、プリミド
ン（ＰＭ）の種々濃度存在下に、実施例４の方法で抗原
抗体反応を行ない、不溶性抗体と結合した酵素標識抗原
の酵素活性を測定すると第２図に示たように、これら抗
てんかん剤との交差は６〜２０仇夕の範囲では認められ
なかつた。
し（ヒト患者血清を検体とする場合には１坊苦希釈した
ＰＢ不含正常人血清１００ムそ添加し）、よく混合し、
５℃で３０分間放置後遠心分離（３００仇ｐｍ、１ぴ分
）し、沈殿に〔Ａ〕１．０の‘を加え２回遠心洗浴する
。次に沈殿に〔Ｅ〕０．５机を加え、３７ｑ０で温層し
、１５または３０分後〔Ｆ〕２．０の‘を加え途枕し、
上清の４１加川の吸光度を測定する。作成した標準検量
線から検体中のＰＢ濃度を算出する。実施例 ５他の抗
てんかん剤との交差性 ＰＢ、ジフエニルヒダントイン（ＤＰＨ）、ｐーヒドロ
キシジフエニルヒダントイン（Ｈ○一ＤＰＨ）、トリメ
タジオン（ＴＭ）、カルバマゼピン（ＣＭ）、プリミド
ン（ＰＭ）の種々濃度存在下に、実施例４の方法で抗原
抗体反応を行ない、不溶性抗体と結合した酵素標識抗原
の酵素活性を測定すると第２図に示たように、これら抗
てんかん剤との交差は６〜２０仇夕の範囲では認められ
なかつた。
実施例 ６
本ＥＩＡの定量誤差
ガラスクロマトグラフィー法で定量した場合１０．４ム
タ／の‘（試料ａ）、松．４メタ／の【（試料ｂ）およ
び３２．０ムタ／の【（試料ｃ）のＰＢを含有する試料
を実施例４の方法でそれぞれｌｑ団定量し、その定量誤
差を求め第１表の結果を得た。
タ／の‘（試料ａ）、松．４メタ／の【（試料ｂ）およ
び３２．０ムタ／の【（試料ｃ）のＰＢを含有する試料
を実施例４の方法でそれぞれｌｑ団定量し、その定量誤
差を求め第１表の結果を得た。
また、ガラスクロマトグラフィー法で定量した場合５．
５ムタ′の‘（試料ｄ）、１５．１ｒ夕／地（試料ｅ）
および２７．２山夕／机【（試料ｆ）のＰＢを含有する
試料を実施例４の方法で日に１回５日間にわたってその
日差変動をみ、第２表の結果を得た。
５ムタ′の‘（試料ｄ）、１５．１ｒ夕／地（試料ｅ）
および２７．２山夕／机【（試料ｆ）のＰＢを含有する
試料を実施例４の方法で日に１回５日間にわたってその
日差変動をみ、第２表の結果を得た。
その結果、本ＥＩＡ法の定量誤差は１０％以内である。
第１表第２表 ※〃タイ勿必 Ｘ±ＳＤ：平均値士標準偏差 ＣＶ ：変動係数 実施例 ７ ヒト血清中のＰＢの定量 ジフエニルヒダントイン、プリミドンおよびＰＢを内服
した７７例の患者の血清中のＰＢを実施例４の方法なら
びにガラスク。
第１表第２表 ※〃タイ勿必 Ｘ±ＳＤ：平均値士標準偏差 ＣＶ ：変動係数 実施例 ７ ヒト血清中のＰＢの定量 ジフエニルヒダントイン、プリミドンおよびＰＢを内服
した７７例の患者の血清中のＰＢを実施例４の方法なら
びにガラスク。
マトグラフィ一法で定量し、両者の相関性を求めた結果
、第３図に示す様に両者はよく相関した。実施例 ８ ＰＢ定量用ＥＩＡキット ‘ａ’ 緩衝液−蓋付３０の【ガラス試薬ビンに０．２
ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ−９％ＮａＣ１（ｐＨ７．０）を２
５の【含んだもの１００本を調製する。
、第３図に示す様に両者はよく相関した。実施例 ８ ＰＢ定量用ＥＩＡキット ‘ａ’ 緩衝液−蓋付３０の【ガラス試薬ビンに０．２
ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ−９％ＮａＣ１（ｐＨ７．０）を２
５の【含んだもの１００本を調製する。
用時、水を加えて２５０泌とすると実施例４の試薬〔Ａ
〕となる。
〕となる。
｛ｂー 標準ＰＢエタノール−蓋付６Ｍガラス試薬ビン
にＰＢ５００ムタ／５の【エタノールを含有したもの。
にＰＢ５００ムタ／５の【エタノールを含有したもの。
１００本を調製する。用時、試薬〔Ａ〕で倍数希釈する
。
。
‘ｃ’酵素標識抗原−蓋付６泌ガラス試薬ビンに実施例
４の試薬〔ｃ〕を５．２の【含有するもの１００本を調
製する。
４の試薬〔ｃ〕を５．２の【含有するもの１００本を調
製する。
‘ｄ’抗ＰＢ不溶性抗体−蓋付６机【ガラス試薬ビンに
実施例４の試薬〔Ｄ〕を５．２ｍ‘含有するもの１００
本を調製する。
実施例４の試薬〔Ｄ〕を５．２ｍ‘含有するもの１００
本を調製する。
‘ｄ 基質溶液−８＆ｏの○ーニト。
フェニル−８−Ｄーガラクトシド粉末を２の‘のガラス
試薬ビン中に密閉したもの。１０止本を調製する。
試薬ビン中に密閉したもの。１０止本を調製する。
用時、０．３％８ーメルカプトェタノールー０．８ＭＩ
′ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を５物‘を加えて
溶解すれば実施例４の試薬〔Ｅ〕となる。
′ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を５物‘を加えて
溶解すれば実施例４の試薬〔Ｅ〕となる。
｛ｆ｝ 酵素反応停止液−蓋付２５の‘ガラス試薬ビン
にＩＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨＩＯ．３）２２の‘
を含有したもの。
にＩＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨＩＯ．３）２２の‘
を含有したもの。
１００本を調製する。
用時、水を加えて松０の‘とすれば実施例４の試薬〔Ｆ
〕となる。
〕となる。
上記【ａ｝〜【ｆ’の試薬ビン各１本づつを一対とする
キットが１００セット調製でき、実施例４と同様の一方
法により１キツトにつき１００回のＰＢの定量ができる
。
キットが１００セット調製でき、実施例４と同様の一方
法により１キツトにつき１００回のＰＢの定量ができる
。
第１図は〔ＰＢ〕−〔ＢＳＡ〕結合物をウサギに投与し
た場合の抗体力価の経日変化を、第２図は種々の抗てん
かん剤とＰＢとの抗ＰＢ抗体に対する交差性を、第３図
は本ＥＩＡ法とガスクロマトグラフィ一法の相関関係を
それぞれ表わす。 第３図 図 船 図 Ｎ 球
た場合の抗体力価の経日変化を、第２図は種々の抗てん
かん剤とＰＢとの抗ＰＢ抗体に対する交差性を、第３図
は本ＥＩＡ法とガスクロマトグラフィ一法の相関関係を
それぞれ表わす。 第３図 図 船 図 Ｎ 球
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記の成分から構成されることを特徴と
するエンザイムイムノアツセイ法によるフエノバルビタ
ール定量用試薬成分（Ａ）；下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるｍ−アミノフエノバルビタールのジアゾニ
ウム塩と蛋白とを反応させることにより製造され、かつ
、１分子の蛋白に少なくとも１分子のフエノバルビター
ルが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［フエノバルビ
タール］−［蛋白］結合物を動物に投与して生成せしめ
た抗体成分（Ｂ）；ｍ−アミノフエノバルビタールのジ
アゾニウム塩とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとを反応させ
ることにより製造され、かつ、１分子のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼに少なくとも１分子のフエノバルビタールが
基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［フエノバルビター
ル］−［β−Ｄ−ガラクトシダーゼ］結合物２ 酵素標
識フエノバルビタール及び未標識フエノバルビタールを
これらに対する抗体に競合的に反応させ、次いで抗体と
結合した酵素標識フエノバルビタールと遊離の酵素標識
フエノバルビタールとを分離し、いずれかの酵素活性を
測定することからなるエンザイムイムノアツセイ法に基
づくフエノバルビタールの定量法において、抗体として
、下記式▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるｍ−アミノフエノバルビタールのジアゾニ
ウム塩と蛋白とを反応させることにより製造され、かつ
、１分子の蛋白に少なくとも１分子のフエノバルビター
ルが基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［フエノバルビ
タール］−［蛋白］結合物を動物に投与して生成せしめ
た抗体を用い、酵素標識フエノバルビタールとして該ジ
アゾニウム塩とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとを反応させ
ることにより製造され、かつ、１分子のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼに少なくとも１分子のフエノバルビタールが
基−Ｎ＝Ｎ−を介して結合してなる［フエノバルビター
ル］−［β−Ｄ−ガラクトシダーゼ］結合物を用いるこ
とを特徴とする方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14187976A JPS6026980B2 (ja) | 1976-11-25 | 1976-11-25 | フエノバルビタ−ル定量用試薬 |
| US05/778,244 US4166767A (en) | 1976-03-25 | 1977-03-16 | Insolubilized antibody |
| GB12486/77A GB1536396A (en) | 1976-03-25 | 1977-03-24 | Insolubilized antibody useful for an enzyme immuno assay or radio immuno assay |
| DE2713369A DE2713369C2 (de) | 1976-03-25 | 1977-03-25 | Nicht löslicher Antikörper, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung im Analysenbesteck für den Enzymimmunassay oder Radioimmunassay |
| FR7709023A FR2345461A1 (fr) | 1976-03-25 | 1977-03-25 | Anticorps insolubilise convenant a l'analyse radio-immunologique ou enzymo-immunologique et son procede d'utilisation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14187976A JPS6026980B2 (ja) | 1976-11-25 | 1976-11-25 | フエノバルビタ−ル定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5365886A JPS5365886A (en) | 1978-06-12 |
| JPS6026980B2 true JPS6026980B2 (ja) | 1985-06-26 |
Family
ID=15302277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14187976A Expired JPS6026980B2 (ja) | 1976-03-25 | 1976-11-25 | フエノバルビタ−ル定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6026980B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61241242A (ja) * | 1985-04-17 | 1986-10-27 | Fujitaro Shimizu | キツトカ−の再利用法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2662070C1 (ru) * | 2017-06-29 | 2018-07-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Трейдсервис" | Способ количественного определения фенобарбитала в таблетках "Корвалол" способом УФ-спектрофотометрии с использованием удельного показателя поглощения |
-
1976
- 1976-11-25 JP JP14187976A patent/JPS6026980B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61241242A (ja) * | 1985-04-17 | 1986-10-27 | Fujitaro Shimizu | キツトカ−の再利用法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5365886A (en) | 1978-06-12 |
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