JPS6270399A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｎ＝”Ｉ＝　ｌの利用分野 本発明は、抗ヒ【膵ヤｊα−アミーン−−［・（ツク１
−−Ｊル抗体（ＶＪ　＋−１Ｌ’＋：　ｌ’　−Ａ　ｍ
　ｙ　（−ツク１−−ｌルｌｉ”１、体という）に閏４
゛る。

本イと明の４ｉ’ｌ、ｐ−Ａｎｌ　Ｖモノク【Ｉ−リー
ルｌ’＋’ｌ、’体Ｃよヒト膵Ｊ（Ｉα−）′ミラー七
（以上、ｐ　　Ａ　ｍ　Ｖという）−二【二１呻戚４町
ｉ−型α−アミリ−ｇ＜ｔノ干、Ｓ−Ａｍｙという）と
の分別定ｉ１Ｆにイ１用である。血清の如きヒト体ｉ１
に中の＋１、−　Ａｎｌ　ＶとＳ−Ａｍｙを分別定量す
れば、仲々の疾患、特に膵疾患の診断ができる。

従来技術および本発明か解／Ｊ！　ｌんとする問題点血
清の如きヒト体液中のα−アミラーセの増減を知ること
は種々の疾患、特に膵疾し口の診断じず１１４１である
のてα−アミラー［の測定は高頻１！ｌｌテに実施され
る臨床検査ＪＣＩＩＩの・つとなっでいる。ヒトα−ア
ミつ一セには２神のアイソザイム、４゛なわちＩ’−Ａ
　ｍ　ｙとＳ　−Ａ　ｍ　ｙか知られでおり、総α−ア
ミラー１；話１メ１を測定するたけては１［硫な診ｍ１
かできないこともあるので１記２（Ｉｌｉのアイソザイ
ｌ、の分別定１，１か行われでいる６１η来の分別定１
１１法としては、例えば電気泳動７〕、や阻害性などが
ある。

電気体ｆｆ１ｌ＋　ｉＪ：　ｌよ、各仲の支ｌｌｆ体１
に検体をス、１′ツトして泳動を？ｉい、分離］７たア
イソザイム・を染色し７、そノＩｈ＆さからｌ’−Ａ　
＋ｎ　ｙとＳ−ΔＩｎ　Ｖの活Ｖ１を２月るＪ、法であ
る。（７か］７、このノノンノ、は、１）−八ｍｙ、Ｉ
：Ｓ−Δｍ　Ｖの分−１か′ゾ、二全でないのでｊＩ碑
な分別定ｈ１かできない。しかも、このｉＪ法は仝操４
１にＩ＼待時間要するので多数の検体庖処理するしは全
く不都合である。

−・ノＪ１ドＩｔ　：’；　’ｔノ、は、小麦由来のＳ
−Ａ口］ｙ　ｔｌｌｌ害剤を用い、その１１１１害率の
Ｚ“からＳ−Δｍ　Ｖと１）−Ａｍｙのｉ＋％　ＰＩ比
を、！ｌ　’Ｓ’）’−Ｊるｊノ７ノ、でアル。ｉ　ｈ
）Ｌ、この勾法Ｌｅｔ　Ｓ−Ａ　ｍ　ｙに対する特：Ａ
！的１！＋１害度か低いために厳密な定７．１法である
とはいえない。更にこの１ｊ法ではｐｉ　；’；剤のド
］ｌ害（ｌｊ：にＩＩソト間のＸ″かあるのでセ？ｆ　
１１”　＋ｌｂ腺をイ′１１戊りなければなら１、その
イ′１成ζご［間かかかる。

との３１うに従来ｆ）、（ｊ迅１８Ｉｉ　（ｉ：　、定
ｊ１１．　ｌｉ′：’ｉの要、ｌ’ｌりＩ角Ｊｉ！−Ｊ
るものではＩルい。

ところで、！’　−Ａ　ｍ　ｙとＳ　−Ａ　ｍ　ｙ　、
！−ＬＪ極めて再似したアミノ酸内１１列庖イＩ’−Ｊ
ることか）１１られており、その相同↑’ｌ’　（ｈ（
ｕ＋ｏｌｏ（Ｈｙ　）は）（４％　に達することか＋ｖ
　＜’、されでいる［シーン（Ｇｅｎｅ）　２８−２１
ｉ３−２７０（１４１８４＞］、、−！ｌなわち両名の
アミノ酸へ；列の１！古いは６％に１ぎない。従って、
このようなＰ−Ａ　ｍ　ｙまた（よＳ−ＡＩｎｙに対す
る［ツク１．’ｌ−リル（起体は、これら個々の抗■巾
のわずかな違いを区別しで；ｊｊ識し得るものでな目れ
ばならない。またＳ−Ａｍｙと特異的に結合する抗Ｓ　
−Ａ　ｍ　ｙモ７り［Ｉ−リル抗体か７．・イ１する場
合、抗１’　−Ａ　ｍ　ｙ七ツクＩ＋　−−１ルｉ’１
’、体か認識ｊべき−Ｌピ１−ブ（１＋ｉ−、除法−」
′括）は更に狭い［ｉ　Ｄｔｌから選択されなければな
らないこＪ−になる。このようにＰ−Ａｍｙと特異的に
Ｌ’ｉ合一４るＩＡ：　ｌ’　−Ａ　ｍ　ｙそツク■２
−リル（ん体を得ることば極めτ［ト１難である。

さらに、Ｓ　−Ａ　ｍ　ｙ　１．ｊ市１しされているか
１）−八ｍ　ｙ　ｌよ山１股されていないため■）　Ａ
ｎｌｙの人工はＳ−Ａｍｙの’１！　Ａ　Ｊ、りも容易
でな（、シ、ｈ）０本発明者らの研究にＪ、れげフロイ
ツト完全アジ１ノ１ントＪ：　：ｊ（にヒｌ膵ｉｔｋそ
のものを動物に投！）しても−１分免疫されないととか
見い出された。以１のことは抗１’　−Ａ　ｍ　ｙモノ
ク１１−づル１！１、体の製ｉｊ’ｉをより−・層困難
なものにしている。

問題を解決−４るための■゛段 本発明はｌ・記の１７１竹庖イ１する抗１’　−Ａ　ｍ
　ｙモ／り１１−づル抗体に閏する゛ ＯＰ　−Ａ　ｍ　ｙを認識する、 ■　実質的に５−ＡＩｎｙを認識しない、＠　　ｆ、’
Ａ’、Ｉ！ｉｉたる１）−Δｒｎ　ｙとの免役反応後に
わいても該酵素か失活しない。

本発明のモ７りＩ＋−リル（６１体１１　、細胞融合技
７）、にＪ、り製造できる。史に詳細には、本発明のモ
ノクｒ＋　−−）ル抗体は次ノ（１）　〜（４）　ノＴ
ｌ’ｊ　１す／、ｑわら、０）　抗ハ２ならびにＢ細胞
コ、＋１製丁稈、（２）　　融合・スクリー二／グ・り
ｕ　−、＝、７り［稈、（Ｈ（）　　・１イブリド〜マ
培養「稈、よｊよび（・１）　　心霊にＷ・じて？ｉわ
れる精製Ｉ稈、を実施覆ることにより得られる。以ト、
各１稈について説明する。

（１）　　抗原ならびにＢ細胞コ、′Ｊ製Ｉ゛程１３細
胞は坑外たるＩ”　−Ａｎｌｙで１分免疫した動物のｌ
ｌ’ｌ’臓より採取できる。

抗ハ；ミたるｌ’　−Ａ　ｍ　ｙ　ｌｊ高純度のものを
人１．」に用いるのか最も好ま［７い。しかし、Ｐ−Ａ
ｍｙの純度＋、１それ稈旨いものでなく？−も１分に［
Ｉ的は］仝成できる。例えば、ヒト膵液の部分精製物か
抗１１；１として用いられる。ヒ１膵液からのＰ　−Ａ
　ｍ　ｙの部分精製は、例えば、硫安分画法にｔ）−Ｆ
）行える。

免疫は、抗１ｊｉｉたるｆ’　−Ａ　ｍ　ｙをマウスや
ラソ］の如き哺乳動物に投！Ｊすることにより？■える
。免疫条イノ１、例えばｔｊｉ’、　ｂ’、ｊたるｐ　
−Ａ　ｎｌ　Ｖの使用ｌｉｔ　ｓ捺り部位、アジュ・凡
／トの種類やその使月目ｊ）　”６の条（’ｌは、ＧＹ
来の抗血ｌ−１を得る場合の条イ′１か採用される。通
常、免疫は、）１１イツト完全アゾユ／１ノト、”：　
Ｉ”　−Ａ口］ｙり八む乳濁ｌ（釜をマウスの如きｌｌ
ｌ１ｉテ１．動物にＪｌｌｆＹＩＩ投すし、同様に１２
て約１週間の間ｈ′Ａをわいて追加免疫をするととによ
り７■わねる。この１１１加免疫は、１〜７同行われる
。７．４柊免疫後１１−５１１に１分ｑ・疫した吐乳動
物の胛＆、Ｙから１３細胞を採取する。

（２）　　融合・スクリーニング・り「１−、：ツク−
１″稈融合（ｊ１融合促進剤の７１貞１・、Ｌ、　Ｒｉ
’、　１１細胞／ｊらびに公知のｉ′１髄１１１１′１
細胞（以十ミーｒ、　＋＋−マ細ポリという）を公知の
融合用無面清培１１１！にワそ濁し、これを〆１を合す
ることによりｊ１λる。

一般的にミニｒ、　ＴＩ−マ細胞は、−１稈（１）で用
いた被免疫動物と同秤の動物１１１来のものであ−うて
ハイブリトーマ選択培地でノ１：　？＋できず、かつ、
それ自！′［か（ｉｌ、体を分ｔｊつしないものか好」
１．い。このようなミーＴ−ｒ＋−マ細胞としてζＪ１
例えば市販されているマウスミニｒ、　ｒ＋−マ細胞１
署ト×６３−八ｇ８−旧あるいはこれ４１−同等物か挙
げられる。

両細胞のｉｋｊ合比は、通７：ｆ　、　　ミニｒ、　＋
１−マ細胞１に対［７１１細胞１〜：）０である。細胞
融合＜＋ｒ１准剤Ｊｌ、ては、例えばポリエヂレノクリ
：１−ルか用いられ、分（１＋ｆ　１，０００〜７．５
（１００Ｊ）　０　（Ｄｂ”）ｆ　１−Ｌ　イ。

融合細胞、すなわちハイブリトーマの培養は、融合イ１
１准剤を洗１１ｉ除去しミコーローマ細胞用培地に９！
濁したハイブリドーマの０．１〜０．２　ｍｌ−Ｊ’っ
を≦）６穴培養冊（以下穴というこ吉もある）にまき、
約７（７°Ｃにおいて５％炭酸ガス−空気中でｔＡ置す
るととによりｔｌえる。　培養中、ＩＩＡＴ　ｔΔ地の
如き公知のハイシリトーマ選択培地を添加し、その割合
を徐々に高める。このような培地交換に、Ｌリハイブリ
ト−マ以外の細胞は死滅する。Ａｉｌ？的には同様に【
７て、再びハイブリトーマ選択培地をミニ１−マ細胞用
培地、すなわちハイプリトーマ用培地と交換する。

］−１的とするハイブリｔ′−■のスクリーニングは、
’Ｆ’ｆ　６　’ｄｋ中の抗体価および交差１０゛を調
べることにより行Ａる。ずなわち、培谷液の一部に１’
　−Ａ　ｍ　ｙまたはＳ−Ａｍｙおよび後述の不溶化第
゛抗体を加え−Ｃ装置し、遠心し、得られるベレット中
の酵）；活Ｍを後述の定ｈ１法て測定することに、１−
りその抗体価および１）−八〇］ｙとＳ−Ａｍｙに対す
る交差の程度を知ことかできる。

スクリーニングしたハ・イゾリｔ−マについて限界孔部
１ノ、を適用することによりＩＩ的、ｌする実り１的に
１’　−Ａ　ｍ　ｙのみを認識するハイブリｌ−マが創
製できる。、：のハイブリ１−マは継代培養または律等
−１により丁永久的ζご保７／てきる。

（３３）・入イブリトーマの培養ｒ’、１１前ｌ稈て？
１またバイアｆリトーマをｉｎＶ己ｒＯまたは１０日Ｖ
（ｌて培養ずれば［Ｉ的のモノク１−リル抗体か’ＩＰ
ｒできる。

ｉｌｌν１ｔｒｏでの培養は、数個のハイ／すｉ・−マ
の９１ｉ穴培養皿中での培養から始め、徐）Ｚにスリー
ルアノブすることにより７Ｉえる。またｉｎ　ＶｉＶＯ
での培Δは、融合細胞の増殖を容易にさせるためのブリ
スタ７　（ｐｒｉｓｔａｎｅ）処理をしたマウスにハイ
ブリｌ−マを蝮腔内に接種することにＪ、り実施でき、
１０〜２０［１後にはモノクＩＩ−づル（４１体を含む
腹水か諮積される。

一般に、＋ｎ　ｖ＋ｔｒｏでの培養は高純度の千７り１
−リル抗体を得たいときに行われ、ｉ　ＩＩ　Ｖ　ｉ　
Ｖ　（＋での”Ｍ　ａはモノク１ｚ−リル抗体を人けに
？１．またいときに９Ｉわれる。通常ｉｎ　ＶｉＶ（ｌ
での培養により、マウス１匹あたり１０−１００ｍｇの
抗１’　−Ａ　ｍ　ｙ　モノク１−リル（４１体か得ら
れる。免疫分掛にはｉＩＩ　　ＶｉＶ（ｌでの培養で県
債された腹水をそのまま利用することもてきるが、必要
に応じ更に精製してもよい。

（１）　　精製【稈 必要に応じで行われるリー枦１υ門での培養物または目
ＩＶｉＶ（１の培養τ諮積された腹水からの千７り「１
−リル抗体の分１１１！Ｅ精製は、通常の物理化ぐｉ的
丁段、例Ａば山折、遠心分Ｆ１１ｔ　、透析、不溶ｔ’
ｌ担体表結合しているブ１ティンＡを用いるアフィニｉ
イーク【Ｊマドクラフィーの如き各種カラムラ１１フ１
グシフイー等の１段を合理的に絹み合（することにより
行える。

かくして得られる本発明の抗ｒ’　−Ａ　ｒｎ　ｙモノ
ク「オーリル抗体は、Ｉ）−Ａ　ｍ　ｙとＳ−Ａｍｙと
を確実に識別できる。また、Ｐ−Ａｍｙは、本発明のモ
ノク１１−リル抗体との免疫反応後においても、（氏分
子のｌ）−二）　ＩＩ　７−ｒニルマル）・＼ブタ詞ン
１（以１−’　ｌ’ＮＩ’という）（ベーリンガー　マ
ノハイ１８ＩＪＩ旧１）や、！シ１分子の不溶ｔ’ｌ　
Ｉ’ｊ色デ／プンボリマ−（第−化学薬品株式会ンりの
如き仲々の分子（，１の基質を分解することかできる。

本発明のモノク１１−リール（１°Ｌ体はｌ”　−Ａ　
ｍ　ｙとＳ−Ａ　ｍ　ｙの分別定１．ｆ川試檗と第２て
６用である。

１’　−Ａ　ｍ　ｙの定；、１は、 （Ｄ　検体に本発明のモ７りＩＩ−リールＩ；Ｃ（＋を
加天で装置する「稈（免１才反Ｌ１′、−１ｔ′ｌり、
■　ＩＩ成する抗１ｊ；ｉ抗体沖合物とそ１１以外のも
のを分離（コ１１１′畠工・ｋ心分離）−４る１Ｆ′−
（ＩＡ□１（；」抗体？Ｖ合物分田１１７）、および ■　分＃ｔ　したＩ＋’＋’、　Ｉ！；！抗体複合物（
Ｊ！Ｉｔ常沈殿）中のα−アミシーセ’ｂ”＋　Ｍを測
定する１稈（α−ア　　ミ　　シ　　−し　＋１１１１
　　定　　１　　（“ｌり　　　、を実施することにＪ
、す１１λる。このよ＾に本Ｊｊ法では的（と１）−Ａ
ｍｙの活Ｉノ１夜知るこ↓−かできる。

ｐ−−ＡＩｌｌ　ＶとＳ　　ｒへＩｎ　Ｖとの分別定１
．１は、＋ｊｉｔ記■のＩ稈で分離したト１゜１９卜１
１体複合物およびそれ以外の０の（通′；：ζは１清）
のα−アミン　Ｉ；話ｔ’ｌを測定するたか、別に求め
た化α−アミー１−ゼ活Ｐ１から一１記のｊＪ′１１．
により求めたＩ’　−Ａ　ｍ　ｙ　ｖ）活ｔ４’　４差
し引くことにＪ、り実施できる。

１”　−Ａ　ｍ　ｙの定ｆｉｔ　１’、’稈（Ｄ〜■は
、４′へて約３’７″Ｃ゛前後て？１われる。１稈■に
おける抗１’　−Ａｍ　ｙモノク【Ｉ−リル抗体は般に
、検体中の１）−Ａｍｙに対応するｔｊｔ　Ｊ、す０過
剰に用いられる。、１１′ＩＩＣ）は、１−ンザイム　
イ！、７　アノ−トイ１大におけるＩＩ　／　１１分−
１の（ｋ術を応１１１するととにＪ、り行える。例λば
ｒ　Ｉｌ：■において抗■）−Ａロ１ｙモノクｕ　−−
）ル１ｆｉ１体０）代わり１ご不溶化抗１’　−Ａ　ｍ
　ｙモノ）ｌｌ＋　−“ｌルｌ’（’、体を用い免疫反
応後にＩＪ′Ｌｌｉ、’−Ｈ抗体袢合物を遠心性ｙ１］
するたか、抗ｌ１１１抗体楔ｉ″７物に対する抗体を不
溶化しまたもの、Ｊなわち不ｌｉＩ化第゛、抗体をＩ稈
Ｑ）においで更に反Ｉ？、（ｌしめ生ずる捏合物を遠心
性ｌ＋ｔｌｔ−Ｊるこ４）−にＪ、り行える。ここにお
ける抗体の・イ・溶化は、畠゛法により不溶Ｍ：　ｌｉ
体と抗１’　−Ａ口１ｙ、Ｆツク１−）フレ（；１０体
もＬ　＜は第′１ｈ１体とを結合さ１１るこ髭にＪ、す
１１λる。不溶（１１：　ｉｎ体としては公り１１のも
のかいずれも使えルカ、木ＩＦＩ　特７Ｆ　ｍ　４．　
ｌ６ｆｌ、７１＋７　’６　記ＪＪｉ　〕５ｌｌｌ菌細
胞壁四１か好よ１．＜用いられる。−１″稈■おＪ、び
総α−アミシー１２活ｖ１の測定は公知のプｉ　７Ｊ：
　、例えば市叫されているα−アミシーゼ定ＩＩ！用１
ソｔを用いるこきζご上り実施できる。そのような４〜
ツ１の例きしてはベーリンガーマ／ハイムー山之内株式
会月から発売されている詞−ｌバックα−アミラーセ４
−ットか挙げら第１る。この１ソトではＰ　Ｎ　１１お
よびα−グル丁ｌシダー１！を含む１８ｉｆｆｌ（以ト
　１’　Ｎ　＋１試薬という）を基質として用いている
。

１’　−Ａ　ｍ　ｙとｓ−Ａ　ｍ　ｙを分−１する試ｉ
・は市販されている総てのα−アミラーセ定１□」用土
ノド、と１丁、へに８１１み合わせる乙とができる。Ｐ
　−Ａ　ｍ　ｙとＳ−Ａｍｙとを９絹ｔ−Ｊるための試
檗は、少くとも（１）　　不ｉＦＮ’Ｎｉｔ体ト結合り
、りｔｉ’＋：ｌ”　−Ａ　ｍ　ｙ　（−ツク「１−づ
ル抗体、または （２）　　■抗Ｐ　−Ａ　ｍ　ｙモノク［トリル抗体お
よび０不溶１’目１’ｊ体と結合１７た第一」に体（不
溶化第−抗体） を含むものである。この拭清には史にぼ衝剤、ＦＩＪ腐
剤、安定化剤、賦形剤等がａまれ得る。ｔ：　Ｓｉ’、
、　（：’、）の場合には＋−２トの形にするのが好ま
しい。

具体例 次に実施例を挙げて史に詳細に説明する。

なお、以ｌ・では次の培地をＩＩＩいた。

■　細胞融合用無血清培地、ＪなわちＲＰＭＩ　　Ｉｆ
１４０培地（４！　／：ｒ　　ラボフｌリ−）■　主１
１１畳細胞（またはハイフリＦｌ）用培地１記■培地に
以Ｆのものを添加した培地。

１０％０％ラン血清（ＩＩｃｓ）、 ４■Ｍグルタミノ、 ５０／１Ｍβ−メルカゾトエタノール、１００１Ｊ／ｉ
１ペニシリンＧ１および１００μｇ／ＩＩｌストレプト
マイン／。

■　１１＾７培１１１！（ハイ／リト−マ選択培地）Ｉ
４記■ｊετ地に以Ｆのものを添加した培地。

０、ＩｍＭヒボキ→Ｊノヂノ、 ０．４μＭアミノプテリン、および １（ｉ７ｚＭデミジン。

また、以ドではリン酸双衝液はＰ　１１４；と、ｌ　＋
ｆｕ清アル、／ミノは＋＋　！；　Ａと略称する。

実施例１　１Ａ、’Ｐ−Ａ車ｙモノク１−リールｉ’ｌ
’、体の製１ｉ１ｉ（１）　　　ハイ／す１−マの創製 抗１！；Ｉならびに細胞のｒＪ−Ｊ製 ４℃にｊｉいτヒト肝戚づ≧−ｐ１ごＭ１安５５４Ｂを
Ｊ川え＜　＋＋：・＋和１１４５％）、０°Ｃで３１３
．’ｉ　ｌｆｌ　１１’（以後、１１するベレットを１
重心分Ｉｌｌ　（１ｉ（１（ｌｉｌｘ　ｌｒ　、　：Ｊ
Ｑ分）］１、このべ１ノツｌをノＩ理食１４ａ水０．５
ＩＩ（’にｌｌＩ解Ａる。

この溶イｋに等１．ｆの）ＩＩイ：’　ｌ′ｉ’ｊ令ア
ゾ９．ハント（Ｔ）１化パγ檗品（１、弐会ネ１）庖加
λて乳化したもの０．５ｉｐヲＩＩＡＬＩ＋／　（１’
Ｑ’　＋７　Ｘ　（静岡実験％！ｌ　Ｑ’Ａ　協同用、
′１）の腹ｒ・内に投Ｉノ、　（、、］　ｉ１７．ｊ間
後に同様に１．τ免疫する。史に１週間後に＋１１加免
；う、（静１１）Ｌ、以後同様に（＋　ＩＩりのＪＬ１
加免疫をｊｌい：Ｚ＋Ｖに胛１）１ｖを１１’／り出し
τＢ細胞を（）で取する。

スクリー二／ヅ暢り１−二／り 対数増殖間にあるマウスミコー１−マ細胞Ｐ　：］　−
Ｘ　ｊ’＋　：１−へｇ８−１目　（ＡＴＣＣカ　タ　
１　グ番５．；Ｃ旧、　　　ＩＩｉ９７　　）　　の　
１　×１０′個と胛臓細胞のｌＸｌ０’個を混ｉ′１シ
、■ｋ”、　１１ハで遠心（４０１１Ｘ　ｇ、　１０分
）洗浄後、丁（７°Ｃに保７＋、Ａ　した５０％ポリ：
ｒテレ／グリ；Ｊ−ル１５００　（和尤純古ｌ業株式会
？ｔ）　１　　ｍｌ（！を１分間かけて加メ、ゆ−１く
り撹（１゛する。１分後、；１７℃に保温した１１ｊｐ
のＣＤ培地を同様にして加える。史シご２０ｓｌ！の０
）Ｉ８地を；１０秒毎に１ｍｌずつ加えた後、遠心（４
００Ｘ　　ｌｒ、　１０分）Ｌｌ、１１＋’ｉを除去す
る。得られるぺ１ノツトに１２ｗ＋１の■培地を徐々に
加λる。この０．１　ｍｌずつを１（０穴培養皿にまき
、３７℃において５％炭酸ガス−空気中て培養する。２
０時間後、■培Ｊｌ！ＩＱ、Ｉ　　ｍｐずつを穴に加え
る。２［１、？）１１．５　ｒ”Ｉ　、８１’ｌ、１１
［（，１３［１お、Ｌび１５］１後の５１°７回にわた
ってＯ１■ｐの培地を捨で新しい■培地０．１ｍｊ！を
加える。この培地交換によりハイ／リト−マ以外の細胞
は死滅する。Ｉ　［ｉ　ＩＩ以降は内び■培地に交換し
１培養する。

培養開始後７１−１１’ｌにバイブリド　マの牛ｆＩか
始り、＋５１１１１には８０％の穴に生育か認められる
。

抗体価および交Ｚ′度の検定 培養１５［１後の培養ｄｉ　０）抗体価および交Ｘ′一
度を次のようにして調べた。

検定用試薬 （ＩＩＰ−Ａ口］ｙ溶Ｉ（紮 ＨＡ斧２りＯＩｌ／（９２，０（１０１ＬＩ／／）　　
イ　１・記緩衝戚へτ布釈【７、全ｊｉｌを５０ｍ　１
と４１シたもの。

ｆ２）　　　Ｓ　　−Ａ　ｍ　　Ｖ　Ｉｌｌ　１ｎｋ１
峠のＳ−Ａｍｙ（ソグマ／／ミヵ／ｌ／Ｃ（＋、）をＩ
・ｔｆｌ’、　ＩＷ衝ＨＡ　でＩＮ解・石状ｊ全１１１
ヲ５（ｌ　ｍ　Ｎ　、’：　すＬ　タもの。

＋３１　　ｒＪ衝ｔ（釜Ａ　（ｒ）　１１７．（１）０
．１％ＢＳ、へ−０，）１％Ｎ、Ｃ１−（＋、ｆ１４Ｍ
−ＰＩＩｓ（Ｐ　ＩＩ　７．０　）からなる緩衝＋１し
。

（４）　　不溶化第二抗体の門濁戚 米ＩＩ’ｌ特１１第４．Ｉｌ’１Ｊ７（ｉ’／弓１１１
０Ｉｌｌ　ｉ’ｉの実施例１のＩＩ法にＪ、り調製した
もの。Ｊなわち、；）クトハヂルスゾうンタルｌ、ＡＴ
ＣＣＩ’１（１１４の細胞壁１’＋’１２５−ｇを水２
．５ｍ　ｌ！に懸濁し、これ（こフィルス−イー１ダ　
１．ｔｄ。

社製の抗マウスＩｇＧウーリギ抗体Ｍｉｌ＆［タ、／バ
タ２５ｍｇ　／　０．０５Ｍ　−Ｐ　ＩＩ　Ｓ　（Ｐ　
１１７．１１）　２．５＋ｊ！　］　、水２．５ｍ　ｌ
および０．Ｉ　Ｍ　−Ｐ　１１　Ｓ　（Ｐ　１１７．０
　）　２．５ｍｐを加えでよく混和する。これ２ごに！
ｌ↑ド、２．５％の時間段（１゛後、遠心（２，０００
Ｘ　ｇ、　ｌｒ１分）し、沈殿を５■ｐの　０９％Ｎａ
Ｃ］　−０，０２Ｍ　）リス緩衝液（ｐ　１１７．０　
）で３回洗浄し７、［Ｉ的とする不溶化第二（起体を得
る。　これを５２ＩＩνの０．２％Ｉ　ＳＡ　−０，９
％ＮａＣｌ０．１％ＮａＮａ）　リス緩衝液（ｒ）　１
１７．０　）に！！！濁し、さらに超ｆ１波処Ｉ’ｌｌ
をする。

検定操作 １４１体価は次のようにして検定した。

すなわち、ハイプリトーマ培養液５０　ｔｔ７！、　　
Ｐ−Ａｍｙ溶液２５Ｉｌｐ、不溶化第−゛、抗体！＃：
濁４５０１１ｐを混合し、３７°にで：（０分間温置後
、４ｍｌの牛理食ＩＩＩ水を加え遠心（：］ＩＩ１Ｉｎ
　Ｘ　ｇ、　５分）して十清をすてる。ペレットにｌ’
　Ｎ　１１試薬１ｍｌを加え撹（↑後３７°Ｃて’／Ａ
Ａ　ＩＩ’！、する６３０分後、２１ｐの反応停＋ｌ−
ｉｔ葵［０，１Ｍ−Ｐ　１１　Ｓ　Ｃｐ　ＩＩ１　）］
を加えて遠心し、１清の吸光度（４０５ｎ■）をｊｌｌ
ｌｌ定する。吸光度か高い穴に高抗体価をイー［するｆ
Ａ’、　Ｐ　−Ａ　ｍ　ｙモノク１．１−づル抗体か含
まれていると判定した。

交差度は抗体価か高い培養液でついて検ａ、ｆ　シた。

すなわち、Ｉ’　−Ａ　ｍ　ｙ溶液の代わりにＳ−Ａｍ
ｙ溶、（ｋを用いるほかは（４、体価倹定の場合と同Ｕ
、操イ′１により交差度を検定【７た。４０５　ｎｍｉ
、ておける吸光度か低い検体はど交Ｍｊ　１．Ｅ＝か低
いと判）ｊ±Ｌまた。

特に抗体価か高く、かつ、交？：’　ＩＱ’か低い抗１
’　−Ａ　ｍ　ｙ−Ｅツク１１−リＪｌ／　１５；体ｉ
’？ノＩ株を選び、；１１ｉ穴培養１１１１に１個ノ穴
になるようにハイブリトーマを■培地で石状【７、培養
する。このような限界希釈培養をくりかえずこきにＪ、
リクｌ’１〜ニングを行い、ＩＩ的のハイ／すｌ−マを
１する。

このハイプリトーマは凍１．′、または継代培養により
保ｒｆできる。

（２）　　　モノク１’＋−リルＩＡ１体の製逓予めシ
リスタ７　（ｐｒｔｓｌａｎＬり　　ｆｌ、５　ｍｌを
ｌ１ｊｊ腔内ｌｑ　！）した　１１八１．　ＩＩ　／　
ｃ　マウスのｌ１１ＪＩｆ！内に、前項で得たハイブリ
トーマ　ｌＸｌ０′個を接（小する。１５１−１１’１
に］１的とするモノク【１−リル抗体を含むＩｔ！ｊ水
３■ｐ／マウスを得る。次に４℃において、肋木に”Ｉ
　Ｍの飽和硫安病ｉ１ｋを加え３０分間撹ＩＴ後、遠心
（５１１０１１Ｘ　１．１：１０分）し１清をずτる。

ベレットを０　、０　！ｉ　Ｍ−Ｐｌ（Ｓ（ｐ１１７．
４）−（１，１４Ｍ塩化−１トリウノ、１古Ａｋ　ｒ、
−、溶解後、４°Ｃで−・仕透析し、３０分１・）ｒ心
（５０００Ｘ　ｆ：　）　Ｌ、１１−１ろ一凍結乾燥し
て目的の１１１］−ツク【１−リル抗体を得る。

免疫拡散法に３する検定によれば、このモノクローリル
抗体は＋にＧｉ！Ｉブクζノスに屈ｌ２、その１．鎖は
カッパーに属するものであ−、た。

実施例２　　　　分別室（ｉｊ Ｐ　−Ａ　ｍ　ｙとＳ−Ａ　ｍ　ｙを等ｆ１を含む溶液
をＧ’ｆ　Ｉ’１界釈孔部たものを検体と【２、以Ｉ・
の）ｊ　？Ｌ　ｌご、１、り分別定Ｉ誹を行う。

総α−アミラーセ活ｉｌｌの定１１」 検体２５ｕ／！にＰ　Ｎ　ｌ’試１１ｍ１を加え：（７
°Ｃて１．Ｌ置Ｕ７３０分後、２１Ｎ／のｆｌ、＋　　
Ｍ−ＰＩＦ　Ｓ　　（ρ１１１１）（反応停＋ｌ　ｉ＆
　）を加え４０５１■における吸光度を測定する。

１’　−Ａ　ｍ　ｙの定１１」 検体２５１１１１抗Ｐ　−Ａ　ｍ　ｙモノク「オーリル
抗体［実施例１のｆ２）　：ＩＪ″ｊで得た股木をｔｖ
衝戚７へで１０００倍苗釈したもの］５０ｔｔｌおよび
不溶化第−′抗体懸濁液５０ｕ１を混合し　３７°Ｃで
渦置し、３０分後に牛理食Ｉｉ！水４　璽Ｉを加え−ｃ
　４心（’：１Ｏ（ｌｏｘ　ＩＨ１５分）　−Ｊる。得
られるペレットにｌ’　Ｎ　Ｉ’試拭清ｍｐを加え３７
°Ｃで温間し、３０分後、２ｍｌ！の反応停止ｌ’、　
ｌｌｋを加え不ｌＩｇ化第二抗体を遠心性ＩＱＩｔ　（
３ｏｏｎｘ　ｌｒｓ　５分）　ｌ、、その上清について
４０５ｎ−における吸光度を光路１ｃ’ｓのキュベツト
中でｉ’ｌＰｌ定する。

Ｓ−Ａｍｙのｑ出 総α−アミリーゼ活性からＩ’　−Ａ　ｍ　ｙ活ｔ１１
を差し引いたものをｓ−Ａｍｙ活Ｖ１とした。

定量結果 第１表に定量結果を示す。

（以下、余白） 第１表 昂釈倍数　　　ｔゝ−Ａｍｙ話ｔ’ｌ　（ａ、）　　Ｓ
−Ａｍｙ活Ｍ（１））　　ｂ／ａ（０１１／ｍ　ｅ　）
　　　　　　　　　（ＯＤ／ｍ　１　）１　　　　　　
　　　　（１，８０００，８（１１１、ｎＯ２０，４１
５０，４０１（１，９７ ４０，２０００，２０３１，０２ Ｂ　　　　　　　　　　　０．１００　　　　　　　　
　　　０．＋０１　　　　　　１゜０１１１１　　　　
　　　　　　Ｏ，（１５１０，０４８０≦］４：（２（
１，０２↓　　　　　　　　　　０．０２５　　　　　
　　Ｉ　、０４ｆ１４　　　　　　　　　０．０１１　
　　　　　　　　　１１．（’１１２　　　　　　１　
、ｆｌ！＋第１表に示すように１’　−Ａ　ｍ　ｙとＳ
−Ａｍｙとの比、すなわちｂ　／　ａは常にほぼ１．０
０であり、本Ｉ］、は両者の分別室ｆｉｔ　ｙＴ：とし
て極めて優れている。

実施例３　　　　　　分別定ＩＨｊ ｒ’−Ａｍｙ中独、Ｓ−Ａｍｙ単独および両者の混合物
（混合比は後記第２表に示す）を検体とし以下の方法に
より分別室Ｌ１を行い第２表に小ず結果を得た。

総α−アミラーゼ活性の定量 ４０ｔｔｌの検体に緩衝ｅ：ＡのＩＦｉＯｕｌを加え３
７°Ｃで１０分間ｄ１Δ置４る。そθ）２５１１１をと
り、とれにＩ’　Ｎ　＋１試’ｊ−１ｍ　ｌ　’ａ、・
加λ３７°Ｃテｉｆ、装置し、：（０分後、２ｉｐの反
応（Ｖ　１．　ｉｌｋを加ｆｉ、　４０５ｎａ　ニオ＋
ｔ　ル吸毘ＩＣＬ’　ヲ、ｔ　路１　ｔ：ｍの一１ユベ
ソト中でｉ’１ｌｌｌ定゛４゛る。

Ｓ−Ａｍｙの定１．（ ４ｎ　ｔｔ　ｉの検体に、（４１体価検定のＪｆｆ　＝
′述べたのと同じｊｊ法てコ−Ｊ製し７たイ・溶化（１
゛１゜Ｉ’　−Ａ　ｍ　ｙ　Ｔ：７りｕ−−）ル’ｒ；
Ｌ＜４’！！、ｈ’３ｄｌ！Ｉりｎｔｉｌ　ヲ＋Ｉｌｌ
工：１７℃テ゛ｌｏ分間渦置後遠心（３０００Ｘ　）、
、　５分）する。ｌ清の２５／７１？をキリ、ｅ　ＪＬ
　Ｉ’ｍ　Ｉ’Ｎｌ’　試Ｍ　Ｉ　ｍ　／！　ヲ加工１
７°Ｃ−（’　ｉ’ｉ’１Ａ　ｉＩ’？　Ｌ　３０分後
、２１１１の反応停＋ｌ　ｉｌｋを加え４１１５　ｎｍ
における吸光度を電路＋　ｃ＋＋のトユベソｌ中で測定
する。

定ｊ；ｌ、Ｌ−宋 第２表に定ｊｉｉ結果を示す。

（以トー１余白） 第５４表 検　　　　　体　　　　　総α−γミンーｔｉ＋’＋！
牛　（ａ　）　　　　Ｌｔ／１１＋も（’Ｉ（Ｉ］）本
ｈ：　　　ｔ、＋／ａ（Ｏｆ）７ｍ　Ｉ？　）　　　　
　　　（叩／ｌｌ（り（１１Ｐ−Ａｍｙ　　　１１．＋
６５　　　　　０　　　０．００（２）Ｓ−ＡｍｙＯ，
：１７：２０．３７５１．０１（８１Ｓ　　　＋　　　
Ｐ本　　　　　０．５５０　　　　　　　　　　　　０
．：１−１０　　　　　０．ｌｉ７［：Ｖ　（Ｉ’　＋
Ｓ）　　二〇、７］（４）　Ｉ’−Ａｍｙ　　　Ｏ，：
［４４００，（ＩＱ（５ｔ　Ｓ　−Ａ　ｍ　ｙ　　　Ｏ
，：ｌ：ｔｏ　　　　　　０．３：１２　　１．０１（
１”＋ｌ　Ｓ　＋　Ｐ　　　Ｏ，ｆ；ｆｉｌｌ　　　　
　　Ｏ，：’１３７　　０．５１［Ｓ／（Ｉｌ＋５）＝
０．５］ （７）　ｌ）−Ａｍｙ　　　Ｏ，４１３００，００（８
）Ｓ−ＡｍｙＯ，１７！］０、＋７３０．９７（９１Ｓ
　＋　Ｐ　　　Ｏ，１ｉｌｆｌ　　　　　　Ｏ，Ｉ８ｎ
　　　Ｏ，２９［Ｓ／（１”　＋５）＝０．：１］ ＊Ｐ−ＡｍｙとＳ−Ａ　ｍ　ｙのｉＱ合物。この場合、
総α−ア三ラード（Ｐ＋Ｓ）とＳ−Ａｍｙの比［Ｓ／（
Ｐ＋ｓ月か０．ｌなるように混合［７た。以■・同様。

＊　（Ｓ　−Ａ　ｍ　ｙ　ｔ＋’；　ｔ’ｌに相当。

検体中のＰ　−Ａ　ｔｎ　ｙは不溶化抗Ｐ　−Ａ　ｍ　
ｙモノク１」−リール抗体によ−、て系から沈殿−二し
て除かれている。従って第２表に示すようにＰ−Ａ　ｍ
　ｙのみを含有する検体（１）、（４）および（７）の
（＋１）値（！３−　Ａ　ｍ　ｙ話１！１に相当）は総
て（Ｊぼセｌ−１である。・力、Ｓ−Ａ口１ｙは系から
除かれないのでＳ−Ａｍｙのみを含ｒ＋’−Ｊる検体（
す）、（５）よｉＪ、び（８）の（ｂ）イー°１（Ｓ　
−Ａ　ｍ　ｙ活ｔ’ｌに相当）は、（ａ）イｎ’ｆ　（
総α−アミリーｐ話↑ｔ１）とほぼ等ｊ７い。また第５
２表に小Ｊよう（ご、ｌ’　−Ａ　ｍ　ｙとＳ　−Ａ　
ｍ　ｙのｊｌｌｊ　’ｉ’７比［Ｐ／（１”　＋ｓ　）
１とｂ　／　ｉｌのｆ！’ｉはほは　・致Ｌτいる。

このように本法の分別定１，１７１、は極めて佼ねτい
る。

実施例４　　　　　ヒト血清の分別定１１１膵１、ジ１
々名および健后人の血１＋’ｉを検体とし、実施例２と
同様にしでＰ−Ａ　ｍ　ｙの定１７．）を１１い第３表
の結果を得た。

（以ド、余白） 第３表 ＋２　　　　　　　体　　　　総α　−γミンーｆ＋＋
’ｉＰｃ　　（ａ　）　　　　Ｐ　　　　Ａ　ｍ　ｙ　
ｉｔちｔ’Ｉ（ｂ　）　　　ｂ　／　；１（ＯＤ／ｍ　
（！　）　　　　　（００／ｍ　ｅ　）出質面漬 ＮＯ（膵炎）０．：１１５　　　　　　　　０．２５１
　　　　　０．ＦｌＯＧｏ（膵炎）　　　　　０．９Ｇ
Ｏ０，８０：ｌ　　　　　　Ｏ，Ｆ１４Ｎｌ（膵炎）　
　　　　０．１７５　　　　　　　　０．１２１　　　
　　０．（ｉ９ＳＮ（唾ｄｋ腺炎）（１，８７００，１
１ニジｌ　　　　　（＋、０：１健常人 Ｉ・’　ＯＯ，１７５０，０５５０，３１０Ｎ　　　　
　　　　　Ｏ，Ｉ４１ｉ　　　　　　　　　０．ｆｌｆ
ｉｌ　　　　　　０．４２Ｔ　ＩＩ　　　　　　　　　
Ｏ，ＨＩＯ１１，Ｉ１４１　　　　　０．：［シ第？（
人に示すように、総α−アミシーゼに対するＰ　−Ａ　
ｍ　ｙの割合（ｂ　／　ａ　）は、膵炎患名面清（Ｎｏ
、Ｇｏ、Ｎ　Ｉ）のｊノが健常人よりも高く、また唾液
腺炎声者（ＳＮ　）では逆に低い成績が得られた。

特ｊ出願人　　人目本製薬株式会ン１ 白ノ１松υ「薬株式会１１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の性質を有することを特徴とする抗ヒト膵型
   α−アミラーゼモノクローナル抗体： ［ａ］ヒト膵型α−アミラーゼを認識する、［ｂ］実質
   的にヒト唾液型α−アミラーゼを認識しない、 ［ｃ］抗原たるヒト膵型α−アミラーゼとの免疫反応後
   においても該酵素が失活しない、
2. （２）不溶性担体が結合した特許請求の範囲第１項記載
   の抗ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル抗体。
3. （３）不溶性担体が細菌細胞壁片である特許請求の範囲
   第２項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル
   抗体。
4. （４）不溶性担体がラクトバチルスプランタラムの細菌
   細胞壁片である特許請求の範囲第２または３項記載の抗
   ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル抗体。
5. （５）細胞融合技法によって製造された特許請求の範囲
   第１項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル
   抗体。