FR2584418A1 - Anticorps monoclonaux contre le g-interferon, hybridomes produisant de tels anticorps, procede de preparation de tels anticorps et de tels hybridomes, leur utilisation pour differencier les gifs, et ensemble ou " kit " utilisant de tels anticorps - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DE NOUVEAUX ANTICORPS MONOCLONAUX CONTRE LE G-INTERFERON, DE NOUVEAUX HYBRIDOMES MONOCLONAUX PRODUISANT DE TELS ANTICORPS ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION. CES ANTICORPS MONOCLONAUX CONTRE LE G-INTERFERON SONT CARACTERISES EN CE QU'ILS NE SE LIENT PAS A L'INTERFERON A ET SONT DE LA SOUS-CLASSE IGG, K; IGG, K. CES NOUVEAUX ANTICORPS MONOCLONAUX PEUVENT ETRE UTILISES POUR TESTER, PURIFIER OU ISOLER LE G-INTERFERON OU POUR EVALUER, EN COMBINAISON, LA MOLECULE GIF DE LONGUEUR COMPLETE.

Description

L'invention concerne de nouveaux anticorps monoclonaux contre le Y-

interféron, des hybridomes produisant de tels corps, des procédés pour leur préparation, leur utilisation pour différencier les GIFs et un ensemble ou kit utilisant de tels anticorps, par

exemple pour tester ou détecter le Y -interféron.

Il est bien connu dans ce domaine qu'il est possible d'obtenir une lignée de cellules capables de

produire un anticorps homogène, c'est-à-dire, monoclonal.

La technique de base a été décrite initialement par Kohler et Milstein, Nature 256, 1975 et comprend la fusion de cellules de myélome de souris avec des cellules de rate et la sélection de clones capables de produire l'anticorps désiré. Cette procédure générale a aussi été décrite dans les brevets US no 4 364 932, 4 364 934, 4 364 935, 4 364

937 et 4 361 550.

Bien que la méthode générale soit connue depuis quelques années, la préparation à la sélection de chaque hybridome approprié présente ses propres difficultés. Il n'y a en effet aucune certitude de trouver un hybridome convenable et, également il n'y a pas de certitude que l'hybridome produise un anticorps ayant les propriétés désirées. Les anticorps monoclonaux ont une diversité d'emploi, en particulier pour l'isolation et la purification des protéines auxquels ils sont spécifiques pour leur titration, par exemple dans un nécessaire ou kit de diagnostic; voir par exemple la demande PCT/GB

/00239, publication n W082/01773.

Tandis que la famille des C\-interférons humains est codée par un nombre de gènes distincts et montrant ainsi des variations dans les séquences d'aminos acides, le Y -interféron humain est codé par seulement un gène unique. Cependant, le 'e-interféron humain est une protéine très labile et qui se dégrade en particulier par un raccourcissement de son extrémité carboxyle pour donner un nombre de Y -interférons plus petit. Ainsi, la séquence complète d'amino-acides du -interféron (GIF), telle que déduite de sa séquence d'ADNc est la suivante: Si SO10 met lys tyr thr ser tyr ile leu ala phe gln leu cys ile val

S20 1 10

leu gly ser leu gly CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU

ALA GLU ASN LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL

40

ALA ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP LYS

GLU GLU SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE

50 70

TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN

LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE PHE

100

ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASN

TYR SER VAL THR ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU

130

LEU ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY

140

LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG GLY ARG ARG ALA SER

GLN. La séquence signal représente les 20 amino-acides montrés en petite impression et probablement également les trois suivants. Les divers Y interférons utilisés dans la

présente description sont répertoriés dans le tableau

suivant: Type d'interféron Amino acides

-interféron A ou GIFA 1-146 -

-interféron A' ou GIFA' 1-142 -interféron B ou GIFB* 1-131 -interféron D ou GIFD 4-146

*GIFB est relativement inactif.

GIFA peut être rompu par CNBr au niveau des résidus méthionines (aminoacides 48, 80, 120 et 137). Le mélange résultant des cinq produits de clivage sera

référencé ci-après en tant que "CNBr-GIFA".

En outre, un peptide consistant des quinze aminos acides de l'extrémité carboxyle, 132-146, et identifiés ci-après en tant que "peptide 15AA", est utilisé dans les

procédures d'essai décrites ci-après.

Les ' -interférons (GIFs) ont prouvé dans divers essais qu'ils sont des substances pharmaceutiquement actives prometteuses utiles pour combattre diverses maladies, en particulier des maladies à virus et certaines formes de cancer. Le -interféron est largement décrit dans la littérature et peut être obtenu soit par une induction mitogène de lymphocytes ou par une technologie d'ADN recombinant, par exemple comme décrit dans les demandes de brevet européen publiées sous les n 77 760,

88 540 et 95 350.

Il est clair qu'il est hautement souhaitable d'avoir des anticorps qui sont spécifiques contre les GIFs

et qui ne se lient pas à des iQ-interférons ou 1-

-interférons et qui sont en fait capables de faire la

distinction entre GIFs.

Le but de l'invention par conséquent est d'isoler des hybridomes monoclonaux qui sont capables de produire

des anticorps monoclonaux se liant fortement aux GIFs.

Comme mentionné précédemment, ces anticorps sont hautement utiles dans divers buts, par exemple pour la titration des GIFs ou pour la purification des GIFs (par chromatographie d'affinité). C'est un objet de la présente invention de produire un nombre d'anticorps monoclonaux (Mabs) qui reconnaissent différents épitopes sur la molécule GIF et satisfont aux exigences suivantes: a) les Mabs peuvent être utilisés pour purifier des GIFs sur une colonne de chromatographie d'affinité; b) Des Mabs qui neutralisent l'activité biologique des GIFs et peuvent ainsi être utilisés pour tester des GIFs; c) Des Mabs qui peuvent distinguer le GIFA de longueur complète de GIFs plus courts (dégradés) et en particulier de GIFs moins actifs (tels que GIFB); b) Des Mabs différents qui peuvent être utilisés en paire dans un ELISA en sandwich (titration

immunoenzymatique en phase hétérogène).

L'invention fournit par conséquent de nouveaux anticorps monoclonaux contre des g -interférons (GIFs) et en particulier une variété de tels anticorps monoclonaux

contre différents épitopes sur la molécule de GIFA.

L'invention fournit en outre de nouveaux hybridomes capables de produire, par culture, les anticorps monoclonaux contre les Y -interférons. L'invention fournit en outre des procédés de production d'anticorps monoclonaux contre les Y -interférons, qui comprend la

culture d'un tel hybridome.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention sont de préférence de la classe IgG1, k, mais

peuvent être d'autres classes, par exemple de IgG2a, k.

Les hybridomes et les anticorps de l'invention peuvent être produits par la procédure suivante: 1. Des souris sont immunisées avec plusieurs injections de GIFA. Le type de souris utilisé n'est pas critique et de bons résultats sont obtenus avec des femelles BALB/c. L'antigène peut être appliqué sous toute forme appropriée, par exemple dans de l'Adjuvant de Freund Complet (CFA) émulsifié avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (rapport I: 1) le nombre d'injections et la quantité d'antigènes administrée doivent être tels que le nombre de splénocytes spécifiques de l'antigène GIF soit suffisant. Habituellement, l'immunisation comprend trois injections intrapéritonéales avec 10 ug d'antigène à des intervalles d'environ 2 semaines. Celles-ci sont suivies par un rappel supplémentaire consistant de 10 ug d'antigène dans du PBS par voie intraveineuse et par 10 ug

d'antigène dans du CFA/PBS par voie intrapéritonéale.

2. Les rates des souris immunisées sont enlevées

et des suspensions cellulaires de rate sont préparées.

Cette procédure suit des techniques bien connus.

3. Les cellules des rates sont fusionnées avec des cellules de myélome de souris. La technique de fusion de cellules de myélome avec des cellules de rate est bien connue. De manière préférée, la fusion est réalisée par chauffage d'un mélange des deux types de cellule avec un agent promoteur de fusion approprié, par exemple du polyéthylène glycol (PEG) ayant un poids moléculaire moyen d'environ i 000 à environ 4 000 (PEG 1 000). Plusieurs lignées de cellules de myélome de souris sont connues et facilement disponibles. On préfère des lignées de cellule manquant de HGPRT (HGPRT = hypoxanthine Guanosyl Phosphoribosyl Transferase) et qui ne survivent donc pas dans du HAT (milieu de culture comprenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine). De préférence la lignée de cellules de myélome utilisée, devrait être du type qui ne sécrète pas, en ce qu'elle ne produit pas elle-même d'anticorps. Une lignée de cellules appropriée pour le but de l'invention est la lignée de cellules dénommée NS1. Ces cellules ont été dérivées des

cellules de myélome P3/X63-A8, par Kohler et Milstein.

4. Les cellules de rate fusionnées sont cultivées dans plusieurs flacons de culture distincts (par exemple dans des plaques à 24 puits) selon des procédures standards. Les cultures cellulaires obtenues à l'étape 3 sont des mélanges de cellules de rate fusionnées (cellules hybridomes), de cellules de rate non fusionnées et de cellules de myélome non fusionnées. De préférence la culture est réalisée dans un milieu qui éliminera la lignée de cellules de myélome non fusionnées, par exemple dans un milieu HAT. Les cellules de rate non fusionnées qui ne sont pas malignes arrêteront normalement leur développement après une courte période de temps tandis que les cellules fusionnées, qui sont HGPRT+, peuvent crottre dans un milieu HAT. 5. On teste les surnageants des cellules d'hybridome dans chaque flacon pour la présence d'anticorps anti-GIF. Cet essai peut être convenablement réalisé par un essai type ELISA. Dans le cas présent, on choisit des anticorps liés à l'enzyme phosphatase alcaline, bien que

d'autres procédures puissent être utilisées.

6. Les hybridomes produisant les anticorps désirés sont sélectionnés et sont ensuite clonés de

préférence par la technique de dilution limite.

7. Les anticorps désirés sont produits au moyen des hybridomes sélectionnés. Cette production peut être réalisée in vitro par la culture de 1' hybridome dans un milieu approprié suivi par l'isolement de l'anticorps, mais cette méthode peut ne pas produire des quantités suffisantes. Pour la production de quantités plus importantes de l'anticorps, on préfère utiliser une méthode in vivo. L'hybridome est injecté dans le péritoine d'une souris o il provoquera la production de fluides ascitiques contenant des quantités substantielles de l'anticorps désiré, qui est ensuite isolé selon des procédures standards. Plusieurs hybridomes produisant des anticorps contre GIFs sont décrits ci-après, et on considère que la présente invention englobe les anticorps monoclonaux

produits à partir de tels hybridomes.

La présente invention inclut en outre les procédés de préparation des anticorps monoclonaux décrits ci-dessus employant la technique d'hybridation décrite. Un nombre d'exemples d'hybridome sont donnés ciaprès, un spécialiste de l'art pourra suivre les méthodes d'immunisation, de fusion et de sélection décrites et obtenir d'autres hybridomes capables de produire des anticorps ayant les caractéristiques de réactivité décrites. Puisque les hybridomes individuels produits à partir d'une lignée de cellules de myélome de souris connues et de cellules de rate à partir d'une espèce connue de souris ne peuvent pas être davantage identifiés sauf en référence à l'anticorps produit par l'hybridome, tous les hybridomes produisant un anticorps ayant les caractéristiques de réactivité décrites ci-dessus sont inclus dans l'invention ainsi que les méthodes pour la

préparation de cet anticorps à partir de l'hybridome.

L'invention comprend également des procédés de traitement ou de diagnostic employant les anticorps

monoclonaux présentant le schéma de réactivité décrit.

EXEMPLE

1. Immunisation des souris Des souris femelles BALB/c sont immunisées par trois injections à 15 jours d'intervalle, de 10 ug de GIFA recombinant (non-glycosylé) dans une émulsion de CFA/PBS (1: 1). Un volume total de 0, 2 ml est injecté intrapéritonéalement à chaque souris. 15 jours après la troisième injection, on réalise un rappel en injectant 10 ug d'antigènes dans du CFA intrapéritonéalement et en

même temps 10log d'antigènes dans du PBS intraveineusement..

4 Jours après la dernière injection, les souris sont

sacrifiées et leur rate est excisée pour la fusion.

2. Fusion cellulaire La rate est mise en suspension dans du PBS (dépourvue de Ca++ et de Mg++) et un comptage des cellules est réalisé (une rate comprend approximativement 108 cellules). Après la filtration à travers une gaze stérile, les cellules sont lavées deux fois dans du PBS froid dépourvu de Ca++ et Mg++ (GIBCO CAT 420). Les cellules de myélome de souris (NS1) sont lavées (3 fois avec le même type de PBS) et les types de cellules sont mélangés et centrifugés ensemble. Le mélange comprend environ 108 cellules de rate et environ 107 cellules de NS1. Environ 0,2 ml de liquide surnageant est laissé sur les cellules. On brise le culot en agitant doucement le tube, puis on aJoute goutte à goutte pendant une minute sous agitation constante à 37 C lml de PEG 1000 (Merck Art. 9729), à 50 % dans le PBS sans Ca++ et Mg++. Après 30 secondes d'agitation à 370C, le tube est rempli lentement avec du PBS chaud sans Ca++ et Mg++ puis centrifugé. Les cellules sont ensuite directement remises en suspension dans du milieu HAT et distribuées dans des plaques à 24 puits (1 ml par puits avec environ 2 x 106 cellules par puits). A ce stade, des splénocytes non traités (1: 10 de chaque rate) sont ajoutés en tant que

cellules nourricières.

3. Culture des cellules d'hybridome 24 heures après la fusion, 1 ml de milieu HAT est ajouté à chaque puits. Du milieu frais est aJouté 3 fois par semaine à tous les puits. On réalise la sélection par la culture des hybridomes dans du milieu HAT pendant 3 semaines suivie par la culture des cellules pendant 3 semaines ultérieures dans du milieu HT (même milieu mais sans aminoptérine). Finalement les cellules sont maintenues dans un milieu de culture normal (RPMI 1640 avec 10 % de FCS). Dès que possible, les cellules d'hybridome sont congelées en utilisant des techniques standards. Le liquide surnageant est conservé et testé pour la

détermination de la présence d'anticorps anti-GIFA.

4. Essai (Criblage) pour la présence d'anticorps Anti-GIF A. ELISA direct La présence d'anticorps anti-GIFA dans le liquide surnageant des cultures des cellules d'hybridome

est testée par un essai anti-immunoenzymatique (ELISA).

L'emploi d'anticorps lié à l'enzyme phosphatase alcaline selon une technique classique (voir "Enzyme Linked Immunosorbant Assay"; A. Voller, D. Bidwell and A. Bartlette; Manual of Clinical Immunology, chapter 45, p. 359) est choisi et adapté pour la détection d'anticorps monoclonaux antiGIFA. L'essai utilisé comprend les étapes suivantes: 1. Enduction de la plaque avec 30 nM de GIFA par puits (dilution 0,5 ug/ml dans du tampon d'enduction; 0,2 ml par puits) et maintien à 4 C toute la nuit avant élimination du liquide et lavage de la plaque avec du PBS-Tween. 2. Ajout de 0,2 ml de RPMI 1640 et 10 % de FCS par puits et l'incubation une heure à la température

ambiante; ensuite 4 lavages avec du PBS-Tween.

3. AJout de 0,2 ml de liquide surnageant d'hybridome par puits et incubation 2 heures à la

température ambiante; ensuite 4 lavages avec du PBS-Tween.

4. AJout de 0,2 ml d'anticorps de mouton anti-Ig de souris, couplé à de la phosphatase alcaline dilué à i: 500 dans du RPMI 1640 à 10 % de FCS et incubation 2 heures à la température ambiante; ensuite 4 lavages avec du PBS-Tween. 5. AJout de 0,2 ml de PNPP dans un tampon de diéthanolamine. Les densités optiques sont mesurées après minutes, 30 minutes, 45 minutes et 1 heure avec un

appareil approprié.

L'absorption de GIFA au fond des plaques (des plaques à 96 puits; plaque Immune NUNC I CAT n 2-39454) est réalisée dans du tampon d'enduction (tempon de carbonate-bicarbonate) et contenant 1.59 g de Na2C03,

2,93 g de NaHC03, et 0,2 g NaN3 par litre d'eau distillée.

Après une nuit à 4 C, les puits sont saturés de protéines par l'incubation d'une heure à la température ambiante avec des milieux de culture contenant du RPMI 1640 et 10 % de

FCS (0,2 ml par puits).

La plaque est ensuite lavée 4 fois avec du PBS-Tween contenant 8 g de NaCl, 0,2 g de KH2P04, 2,9g de Na2HPO4.12H20, 0,2 g de KCL et 0,5 ml de Tween 20 dans un

litre d'eau distillée (pH 7,4).

Après incubation de la plaque avec des liquides surnageants d'hybridome, la présence d'anticorps anti-GIFA de souris est révélée par des anticorps de mouton anti-immunoglobulines de souris conjugués avec une

phosphatase alcaline (par exemple NEI-500 de NEN).

Après une incubation de 2 heures avec le conJugué et 4 lavages consécutifs, 0,2 ml de solution de substrat est aJouté. Le substrat (paranitrophényl phosphate; substrat de phosphatase PNPP Sigma 104 réf.: 104-105) est dissout (un comprimé de 5 mg pour 5 ml de tampon) dans un tampon contenant 100 mg de MgCl2.6H20, 0,2 g de NaN3 et 97 ml de diéthanolamine dans un litre d'eau distillée (pH 9,8 ajusté averc HC1). La densité optique à 405 nm est

2 5 8 4 4 18

il lue à des intervalles de temps différents après l'addition de substrat (auto-lecteur MR580 de Dynatech). Les

hybridomes fortement positifs sont choisis pour le clonage.

B. Inhibition de l'activité biologique de GIFA On mesure l'activité de GIFA par l'augmentation de l'expression des antigènes HLA Classe I sur la lignée de cellules U937. L'activité neutralisante des liquides surnageants d'hybridomes et de clones est

testée après incubation avec du GIFA.

L'augmentation de l'expression HLA Classe I est testée comme suit: 1. Conditions de culture: des cellules U937 (une lignée de cellules promonocytaires) sont incubées pendant 3 jours avec du GIFA (1 à 4 unités/ml), certaines

en présence et certaines en l'absence de Mab.

2. Quantification de l'expression HLA: les cellules sont incubées avec le Mab W6/32 dirigé contre les antigènes HLA ClasseI. Les cellules sont ensuite marquées avec un anticorps anti-Ig de souris conjugué au FITC

(fragments F(AB')2).

3. L'intensité de l'expression de l'antigène

HLA Classe I est déterminée par cytométrie de flux.

C. Immunoprécipitation de 125I-GIFA Le GIFA, iodé avec I, est incubé avec des liquides surnageants. Un anti-Ig de souris polyclonal est ajouté pour précipiter le Mab. La radioactivité du précipité est mesurée avec un compteur de rayons gamma et

les culots sont analysés par SDS-PAGE.

L'essai d'immunoprécipitation est réalisé comme suit: 1. Marquage de l'interféron: GIFA est iodé (125I) avec le réactif de Bolton-Hunter. L'excès de réactif de marquage est séparé de l'interféron iodé par

chromatographie sur Sephadex G25M.

2. Essai: 2A. Le 125I-GIFA est incubé avec du Mab pendant une heure à 20 C; 2B. Le complexe est précipité avec un anticorps anti-Ig de souris toute la nuit à 4 C; 2C. Les culots sont lavés deux fois et ensuite transférés dans un autre tube; 2D. On contr8le la radioactivité dans un compteur à rayons gamma; 2E. Les culots solubilisés sont analysés par

SDS-PAGE et autoradiographiés.

5. Clonage Les cellules d'hybridomes sont clonées par la technique de dilution limite. Des cellules hybrides sont diluées dans le milieu de culture et distribuées dans des plaques à 96 puits (linbro 76003-05 à fond plat) de façon à avoir 60 cellules par plaque (0,2 ml par puits). Des macrophages péritonéaux de souris BALB/c sont utilisés comme cellules nourricières; celles-ci sont recueillies par lavage de la cavité péritonéale de souris avec du HBSS (GIBCO Cat. n 406) contenant i % d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine) à 4 C. De façon usuelle, les macrophages péritonéaux récupérés d'une souris sont suffisants pour une plaque à 96 puits (environ (2 à 4 x 105

cellules par puits).

Après environ 3 semaines, les clones sont visibles à l'oeil. Ils sont ensuite transférés sur des plaques à 24 puits. A ce stade les clones sont congelés le plus rapidement possible. Les liquides surnageants sont

conservés et évalués pour déterminer l'activité anti-GIFA.

Un grand nombre de clones appropriés sont identifiés; leur dénomination, le numéro de dépôt à la collection nationale de culture de microorganismes (C.N.C.M.) à l'Institut Pasteur à Paris, FRANCE, déposés le 3 Juillet 1985 et la dénomination des Mabs (anticorps monoclonaux) produits, à partir de ceux-ci, sont donnés ci-après: Dénomination du clone dépôt n Mab

30N47-1 1-463 47-1

47N3-6 1-466 3-6

47N30A32 1-464 32

47N30A35 1-465 35

47N38B27 1-468 27

47N48B22 1-469 22

47N9-11 1-467 9-11

6. Production de fluides ascitiques De façon à obtenir d'importantes quantités d'anticorps monoclonaux, du fluide ascitique est induit chez des souris BALB/c en injectant des cellules d'hybridome. jours avant l'injection des cellules, les souris sont traitées intrapéritonéalement avec 0,5 ml de pristane (2,6,10,14-tétraméthyle-pentadécane, Aldrich T22802). Après trois lavages des cellules hybridomes avec du PBS Dulbeco (GIBC0 041.4040), la suspension de cellules est ajustée à 2,5 x 107 par ml et 0,2 ml sont injectés à chaque souris (5 x 106 cellules par souris). Après une période de dix à vingt jours, le fluide ascitique peut être collecté. Après une période de quelques jours de repos, il est possible de recueillir à nouveau du fluide ascitique à partir des mêmes souris. Au moins 2 ou 3 échantillons de

fluide ascitique sont collectés chez chaque souris.

7. Isolement et purification des anticorps monoclonaux à partir des fluides ascitiques Précipitation au sulfate d'ammonium: 27 ml de fluide ascitique sont dilués 4 fois dans du PBS froid et

placés sur de la glace. Un Volume égal d'une solution satu-

rée de (NH4)2S04 (40C) est aJouté lentement sous agitation sur une période de plusieurs minutes: la concentration finale en (NH4)2S04 est à une saturation de 50%. La solution est laissée sur de la glace pendant 30 minutes et ensuite centrifugée à 5 000 x g pendant 10-15 minutes. Le culot est recueilli et dissous dans 15 ml de tampon contenant 40 mM de NaCl et 20 mM de Tris-HCl, pH 7,8 (tampon A). Le culot remis en suspension est dialysé contre volumes de tampon contenant 20 mN de NaCl et 20 mM de Tris-HCl, pH 7,8 (tampon B). Avant la chromatographie d'échange d'ions, la protéine dénaturée est enlevée par

centrifugation à 15 000 x g pendant 10 minutes.

Chromatographie sur DEAE cellulose: du DE 52 (Whatman), qui a été équilibré dans du tampon B, est versé dans une colonne (2,5 cm x 27 cm) en donnant un volume de lit garni de 132 ml. Le garnissage est réalisé avec un débit pompé de 45 ml/heure. La chromatographie est réalisée à la température ambiante. Immédiatement avant le chargement, l'échantillon dialysé est ajusté aux conditions ioniques du tampon B. L'échantillon est chargé à un débit d'écoulement de 50 ml/heure. Après lavage du tampon B (1/10 du volume du lit), la colonne est éluée avec un gradient linéaire de NaCl (40 mM-200 mM). Le volume total de gradient est de 1 litre et le débit d'élution est de 50

ml/heure; on receuille des fractions de 10 ml d'éluat.

8. Lyophilisation Des fractions d'éluat sont dialysées contre 1 % (w/v) de NH4HC03 pendant 48 heures. Le volume final après dialyse est de 168 ml. L'ensemble est stérilisé par filtration à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètres (Falcon). Des aliquotes de 10 ml de filtration sont transférées dans des bouteilles stériles et lyophilisées. Des conditions stériles sont maintenues après lyophilisation en utilisant un dispositif automatique

d'encapsulage.

Caracterisation des anticorps ANTI-GIFA, SELON L'INVENTION La caractérisation de l'anticorps monoclonal doit fournir l'information suivante: i) la détermination de la spécificité, c'est-à-dire à quel type de Y -interféron l'anticorps se liera, incluant les peptides dérivés;; ii) la détermination de la sous-classe Ig; iii) la détermination de l'effet exercé par l'anticorps sur des fonctions biologiques de la molécule

(dans ce cas, du e -interféron).

1. Spécificité des anticorps monoclonaux La spécificité est déterminée en utilisant l'essai ELISA décrit dans la partie 4A, l'inhibition de l'activité biologique décrite dans la partie 4B, et l'essai d'immunoprécipitation décrit dans la partie 4C, de

l'exemple ci-dessus.

2. Détermination de la sous-classe Ig L'isotype des anticorps monoclonaux purifié à

partir des ascites est testé par un essai ELISA indirect.

Les plaques sont enduites de 30 nM de GIFA par puits et traité avec du RPMI 1640 à 10 % de FCS comme décrit plus haut. Les anticorps monoclonaux dilués dans du RPMI 1640 et % de FCS sont fixés à l'antigène déposé au fond pendant 2 heures d'incubation. Les puits sont ensuite remplis d'une solution d'anticorps dirigés contre diverses sous-classes Ig de souris (dilution 1: i 000). Tous les anti-isotypes utilisés ici sont produits chez des lapins (IgM;-IgG1; IgG2a; IgG2b; IgG3 et IGA; X. et/k). La présence d'anticorps anti-isotype est détectée par de l'anti-Ig de lapin conjugué à de la phosphatase alcaline. Les conditions d'incubation et la lecture des résultats sont telles que

décrites pour l'essai ELISA ci-dessus.

Criblage et résultat (Le criblage fait partie intégrante de l'invention) I - Criblage pour définir les anticorps reconnaissant différents épitopes sur GIFA Les clones hybrides obtenus par fusion de cellules de rate de souris inJectée au GIFA sont criblés dans les quatre essais suivants: a) ELISA direct: différents GIFs (GIFA, GIFA', GIFB, GIFD, GIF naturel, GIFA clivé avec CNBr (=CNBr-GIFA), un peptide représentant les 15 aminos acides de la terminaison COOH = peptide 15 AA, et ce peptide étant couplé à BSA (=BSA-peptide) sont enduits sur des plaques ELISA à 30

nM/puits.

L'ELISA direct est réalisé comme suit: 1) 30 nM des différents GIFs et des fragments de ceux-ci sont appliqués à chaque puits de la plaque de microtitration et laissés toute la nuit pour s'y fixer; 2) Après lavage, le Mab est incubé une heure; 3) Après lavage, l'incubation est poursuivie avec un anticorps anti-Ig de souris conjugué avec la phosphatase alcaline (AP) pendant une heure; 4) Après lavage, l'incubation est poursuivie avec du substrat de AP (PNPP) pendant une heure; ) On procède à la lecture de la densité optique. b) Essai de neutralisation Cet essai est réalisé comme dans la partie 4B de l'exemple, sauf que GIFA', GIFB, GIFD et une préparation pure commerciale de t-interféron naturel sont utilisés en

plus du GIFA.

c) Essai d'immunoprécipitation: divers GIFs (GIFA', GIFB, GIFD, le peptide 15 AA et un GIF naturel voir Tableau i dans la partie "RESULTATS" sont iodés, incubés et testés comme décrit pour le GIFA dans le paragraphe 4C de

l'exemple.

d) ELISA sandwich: Les Mabs purifiés qui sont sélectionnés à partir des résultats obtenus dans les essais a) à c) sont utilisés pour réaliser un sandwich indirect

ELISA pour quantifier les GIFs.

1) Essai de sandwich triple: Pour cette étude on utilise comme deuxième

anticorps un anti-GIF polyclonal de lapin.

Le Mab, par exemple 22 ou 3-6, est enduit sur des plaques. Des concentrations croissantes de GIFA (ou autres GIFs) sont ajoutées. L'antiGIFA BEA III polyclonal est ensuite ajouté. La réaction est développée avec un

anti-Ig de lapin conjugué à la phosphatase alkaline (AP).

Le Mab 22 permet la quantification de GIFA, GIFA', GIFB et GIFD. IFN-Q2 (excès de 500 fois) n'est pas reconnu. Les surnageants de clones decellules T, connu, à partir d'un essai anti-viral pour contenir un GIF naturel, montrent dans un tel essai sandwich approximativement les

mêmes niveaux en GIF.

Mab 3-6 ne permet pas la quantification de GIFB. Les surnageants de clones de cellules T sont positifs. 2) Essai de sandwich double On enduit des plaques de l'anticorps anti-GIFA polyclonal. Des concentrations croissantes de GIFB, GIFA, GIFD et de -IFN naturel et des dilutions croissantes des surnageants de clones de cellules T sont ajoutées. Mab 22, couplé à la phosphatase alcaline(AP), est finalement ajouté. Ce type d'essai est approprié pour la quantification de t-IFN. L'anticorps de lapin peut être remplacé par un Mab différent de Mab 22. Le criblage pour

un tel anticorps est décrit ci-dessous.

e) Etude de l'épitope - compétition entre Mabs pour la liaison au GIFA 1) Utilisation d'un ELISA Des plaques sont enduites avec l'anticorps de lapin. On ajoute 2 ng/ml de GIFA. Le conjugué de Mab 22 est ajouté en présence d'un autre anticorps monoclonal. Les Mabs reconnaissant des épitopes différents de celui reconnu

par Mab 22 ne doivent pas inhiber la fixation du conJugué.

Les Mabs équivalents à Mab 22 doivent inhiber la fixation

du conJugué.

Mab 21 ainsi que le Mab 22 non-conJugué entrent en compétition avec le conjugué Mab 22. Mabs 3-6,

32 et 9-11 n'entrent pas en compétition avec le conjugué.

Ceux-ci peuvent être utilisés dans un essai sandwich à deux-Mabs. Cet essai est plus précisément réalisé comme suit: 1. Un anticorps polyclonal anti-GIFA de lapin est enduit sur des puits de microtitration; 2. Après lavage on incube avec du GIFA pendant une heure; 3. Après lavage, on incube avec un mélange d'un Mab à tester et du Mab 22 couplé à AP pendant une heure; 4. Après lavage on ajoute le PNPP; ) Après une heure d'attente, on procède à la

lecture de la densité optique.

2) Utilisation de l'essai d'immunoprécipitation pour mettre en évidence la compétition entre GIFA et

CNBr-GIFA pour la fixation de Mab.

Une des approches pour localiser l'épitope des anticorps neutralisants sur la molécule de GIFA est d'observer si des fragments connus de cette molécule inhibent la précipitation de la molécule complète. Comme modèle d'essai on utilise tout d'abord Mab 3-6 qui précipite GIFA mais pas GIFB. La précipitation de GIFA peut

être inhibée par le peptide 15 AA et également CNBr-GIFA.

Ensuite on teste les fragments CNBr-GIFA contre Mabs 22 et

pour voir si la précipitation de GIFA peut être inhibée.

L'activité de Mab 22 n'est pas inhibée tandis que celle de

Mab 35 l'est.

Cet essai est réalisé comme suit:

1. Des peptides CNBr sont mélangés avec 125I-

GIFA et incubés avec le Mab à tester; 2. L'anticorps est précipité avec un anticorps de lapin anti-(Ig de souris); 3. La radioactivité du culot est mesurée dans le

compteur à rayons gamma.

II) Résultats (voir Tableau 1 page 22)

Description des anticorps -

Mab 47-1, classe IgG2a, k; produit à partir de l'hybridome 30N47-1 = Institut Pasteur n0 I-463: Dans l'ELISA direct, il se fixe à GIFA, GIFA',

GIFB, GIFD et CNBr-GIFA mais ne se fixe pas au peptide BSA.

Il ne précipite pas les différents GIFs ou leurs fragments.

Il ne neutralise l'activité biologique d'aucun des GIFs testés. Il reconnaît les GIFs seulement lorsque ceux-ci sont enduits sur des feuilles de plastique ou de nitrocellulose. Mab 9-11, classe IgG1, k; produit à partir de l'hybridome 47N9-11 = Institut Pasteur no 1-467: Dans l'ELISA direct il se fixe à GIFA, GIFA', GIFB, GIFD, mais ne se fixe pas au peptide BSA ni à CNBr-GIFA. Il ne précipite pas GIFA, GIFA', GIFB, GIFD ou le peptide 15 AA. Il ne neutralise l'activité biologique

d'aucun des GIFs testés.

Mab 3-6, classe IgG1, k; produit à partir de l'hybridome 47N3-6 = Institut Pasteur n 1-466: Dans l'ELISA direct il se fixe à GIFA, GIFD, le peptide-BSA et CNBr-GIFA mais pas à GIFA' et GIFB. Il précipite GIFA et GIFD et le peptide 15 AA mais pas GIFA' et GIFB. Il ne neutralise l'activité biologique d'aucun des GIFs testés. Il reconnaît probablement un épitope dans les

9 derniers aminos acides (138-146) de la molécule de GIFA.

Lorsqu'il est couplé à une matrice insoluble il est capable de retenir les GIFs naturels et recombinants, qui peuvent

être ensuite élués, par exemple avec de l'acide acétique.

Mab 32, classe IgG1, k; produit à partir de l'hybridome 47N30A32 = Institut Pasteur no 1-464: Dans l'ELISA direct il se fixe GIFA, GIFD et le peptide-BSA mais pas GIFA', GIFB et CNBr-GIFA. Il précipite GIFA, GIFD et le peptide 15 AA mais pas GIFA et GIFB. Il ne neutralise l'activité biologique d'aucun des GIFs testés. Il reconnatt un épitope dans les 15 derniers aminos acides (132-146) de la molécule de GIFA et est

différent de Mab 3-6.

Mab 35, classe IgG1, k; produit à partir de l'hybridome 47N3035 = Institut Pasteur n 1-465 Dans l'ELISA direct il se fixe à GIFA, GIFD et le peptide-BSA et faiblement à GIFA', GIFB mais pas à CNBr-GIFA. Il précipite GIFA, GIFA', GIFB, GIFD et le peptide 15 AA. Il neutralise l'activite biologique de GIFB mais pas celle des autres GIFs testés. I1 diffère de Mab 22 en ce que CNBr-GIFA peut inhiber la précipitation de GIFA

par Mab 35 mais pas par Mab 22 (tableau 2).

Mab 27, classe IgG1, k; produit à partir de l'hybridome 47N38B27 = Institut Pasteur n 1-468: Dans 1'ELISA direct il se fixe à GIFA,

GIFA', GIFB et GIFD mais pas au peptide-BSA ni CNBr-GIFA.

Il précipite GIFA, GIFA', GIFB et GIFD mais pas le peptide AA. Il neutralise l'activité biologique de tous les GIFs

testés.

Mab 22, classe IgG1, k; produit à partir de l'hybridome 47N48B22 = Institut Pasteur n 1-469: Dans l'ELISA direct il se fixe à GIFA,

GIFA', GIFB et GIFD mais pas au peptide BSA ni à CNBr-GIFA.

Il précipite GIFA, GIFA', GIFB et GIFD mais pas le peptide AA. Il neutralise l'activité biologique de tous les GIFs testés. Lorsqu'il est couplé à une matrice insoluble il est capable de retenir les GIFs naturels et recombinants qui peuvent ensuite être élués par exemple avec l'acide

acétique à pH 2,5.

Etant donné qu'il y a seulement une faible compétition entre cet anticorps et Mab 27 dans l'essai (tableau 3), ils reconnaissent probablement un

épitope différent.

TABLEAU 1: CLASSIFICATION DES ANTICORPS

ELISA DIRECT IMMUNOPRECIPITATION INHIBITION ou NON INHIBITION (I ou NI) de l'activité biologique Clones Mab et GIF GIF GIF GIF BSA GIF GIF GIF Nat GIFA GIFA' GIFB GIFD Nat Classe A A' B D pep- (a) IF GIF pep GIF GIF Ig tide A A' B D (b) (c) (c) 47-1 3ON47-1 IgG2aik + + + + - + - - NI NI NI NI NI 9-11 47N9-11 IgG1,k + + + + - - NI NI NI.NI NI 3-6 47N3-6 IgG1,k + - + + + + +++ NI NI NI NI NI 47N30A32IgG1 k + - - + + - + + + + NI NI NI NI NI 47N30A35 IgG1, k + i t + + - + + + + + + NI NI I NI NI 47N48B22 IgG1, k + + + + _ _ + ++ + -.+ I I I I I 47N38B27 IgG1, k + + + + - -.+ I I I I I (a): CNBr-GIFA (b) peptide 15 AA (c) Y -interféron naturel Ui 0o ro Note sur le tableau 1 Le GIF naturel est préparé à partir de cellules mononucléées de sang humain comme suit: Des résidus de cytaphérèse sont dilués dans du PBS et déposés sur du Ficoll-Hypaque. Après centrifugation, les cellules à l'interface sont récupérées eti9lavées trois fois avec du PBS. Elles sont ensuite cultivées pendant trois jours dans du milieu RPMI 1640 en présence de i % de phytohémaglutinine et de 10 ng/ml de phorbol myristate acétate. Le liquide surnageant est récupéré et passé au travers d'une colonne de Affigel (Biorad Co.) auquel est fixé un Mab entre GIFA, par exemple Mab 22, de façon à le purifier. Le GIF naturel est élué avec de l'acide acétique dilué à pH 2,5; l'éluat est immédiatement neutralisé avec un tampon Tris. Le GIF naturel est ensuite iodé (125 I avec

du réactif de Bolton-Hunter (voir précédemment).

Tableau 2 - Résultats de l'essai de compétition pour la fixation de GIFA et de CNBr-GIFA aux Mabs 22 et 35 (voir pages 18-19) Mab Testé CNBr-GIFA Comptage/minute

22 - 3017

22 + 3106

- 4368

+ 412

Tableau 3 - Résultats de l'ELISA Sandwich Essai de compétition entre Mabs pour la fixation de GIFA Mab testé conjugué Densité Optique

0 22 AP 0,939

22 22 AP 0,423

27 22 AP 0,744

Description d'un kit pour la quantification du

gamma interféron L'invention fournit en outre un kit basé sur au moins l'un des anticorps monoclonaux décrits et en particulier sur la base de deux de ceux-ci. Un kit préféré contiendra deux anticorps monoclonaux différents (reconnaissant des épitopes différents sur la molécule GIF), une préparation standard de GIFA et de préférence un récipient de réaction pour réaliser l'essai; ce flacon par exemple peut être un tube d'hémolyse (12 x 75 mm) ou un puits dans une plaque appropriée, par exemple une plaque de microtitration 96 puits. Le premier anticorps peut, si désiré, être déjà enduit à l'intérieur du récipient réactionnel mais de préférence est fourni sous forme d'un réactif séparé. Une solution standard de GIFA(qui peut être diluée à divers degrés pour réaliser les essais) sera nécessaire. Elle sera fournie sous forme de lyophilisat à partir duquel une solution standard de GIFA peut être préparée. Ce lyophilisat sera stocké dans une fiole scellée de préférence sous azote ou un autre gaz inerte. Le second anticorps monoclonal sera conjgué à une fraction capable de générer une réponse détectable, par exemple un enzyme capable de provoquer une réaction colorée. Cette fraction peut être la phosphatase alcaline (AP), qui peut dégrader le paranitrophenylphosphate (PNPP) en paranitrophénol, qui est détecté par sa couleur jaune. La lecture peut être réalisée automatiquement; par exemple, des essais réalisés dans une plaque à 96 puits peuvent être lus dans un autolecteur Dynatech qui peut être couplé à un ordinateur

pour donner une impression immédiate des résultats.

Alternativement, si les essais sont réalisés dans les tubes à hémolyse, le liquide surnageant peut être transféré dans

des cellules pour la lecture par un spectrophotomètre.

Un essai plus sensible peut être réalisé en couplant de la biotine au second Mab en ajoutant dans une troisième étape de l'avidine couplée à de la phosphatase alcaline. L'avidine se fixe à la biotine. Ensuite on ajoute le PNPP et on procède à la lecture du paranitrophénol

libéré comme mentionné précédemment.

Les anticorps monoclonaux 3-6 et 32 peuvent être utilisés en conjonction avec un Mab choisi parmi 35, 27, 22 et 9-11 pour évaluer la molécule GIFA complète, de sorte que le GIFA intact peut être distingué de ses formes plus

courtes (dégradées), qui sont moins actives.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1.- Anticorps monoclonaux contre le -interféron, caractérisés en ce qu'ils ne se lient pas & l'interféron { 2 et sont de la sous classe IgG1, k; IgG2a', k. 2.- Anticorps monoclonaux contre le y -interféron, caractérisés en ce qu'ils sont identiques ou similaires aux anticorps monoclonaux produits à partir d'hybridomes préparés par les étapes successives suivantes: a) la culture dans divers flacons de culture d'hybridomes préparés par fusion de cellules de myélome de souris avec des cellules de rate de souris immunisées par des injections de GIFA, de préférence dans un milieu éliminant les cellules de myélome non fusionnées et les cellules de rate non fusionnées, par exemple un milieu HAT; b) on teste les surnageants de cellules d'hybridomes de chaque récipient relativement à la présence d'anticorps anti-GIF; c) on sélectionne les hybridomes produisant les anticorps anti-GIF; d) on réalise un clonage de ces hybridomes sélectionnés de préférence par la technique de dilution limite, ces clones étant ainsi choisis pour préparer les

anticorps monoclonaux par culture de ceux-ci.

e) de préférence, on effectue un criblage de ces clones pour déterminer leur réactivité vis-à-vis de molécules GIF de différentes longueurs et/ou vis-à-vis de peptides obtenus par dégradation de la molécule GIF par CNBr. 3.- Anticorps monoclonaux contre le -interféron, caractérisés en ce qu'il s'agit des anticorps suivants:

2 5 8 4 4 18

a) anticorps monoclonai 47-1 produit par l'hybridrome 30N47-1 = Institut Pasteur 1-463, b) anticorps monoclonal 3-6 produit par l'hybridome 47N3-6 déposé à l'Institut Pasteur sous le n 1-466; c) anticorps monoclonal 32 produit par l'hybridome 47N30A32 déposé à l'Institut Pasteur sous le n 1464; d) anticorps monoclonal 35 produit par l'hybridome 47N30A35 déposé à l'Institut Pasteur sous le n 1-465; e) anticorps monclonal 27 produit par l'hybridome 47N38B27 déposé à l'Institut Pasteur sous le n 1-468; f) anticorps monoclonal 22 produit par l'hybridome 47N48B22 déposé à l'Institut Pasteur sous le n 1-469; g) anticorps monoclonal 9-11 produit par l'hybridome 47N9-11 déposé à l'Institut Pasteur sous le n 1-467 4.Hybridomes monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont capables de produire les anticorps monoclonaux contre le Y -interféron tels que définis à la

revendication 1, 2 ou 3.

5.- Hybridomes monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont préparés par le procédé comprenant les étapes successives suivantes-: a) la culture dans divers flacons de culture d'hybridomes préparés par fusion de cellules de myélome de souris avec des cellules de rate de souris immunisées par des injections de GIFA, et de préférence dans un milieu éliminant les cellules de myélome non fusionnées et les cellules de rate non fusionnées, par exemple un milieu HAT;

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b) on teste les surnageants de cellules d'hybridomes de chaque récipient relativement à la présence d'anticorps anti-GIF; c) on sélectionne les hybridomes produisant les anticorps anti-GIF; d) on réalise un clonage de ces hybridomes sélectionnés de préférence par la technique de dilution limite et ces clones constituent les nouveaux hybridomes

monoclonaux recherchés.

e) de préférence, on effectue un criblage de ces clones pour déterminer leur réactivité vis-à-vis de molécules GIF de différentes longueurs et/ou vis-à-vis de peptides obtenus par dégradation de la molécule GIF par CNBr. 6.- Nouveaux hybridomes monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi le groupe consistant de: a) hybridome Pasteur n 1-463; b) hybridome Pasteur no 1-466 c) Hybridome Pasteur n 1-464 d) hybridome Pasteur n 1-465; e) hybridome Pasteur n 1-468; f) hybridome Pasteur n 1-469; g) hybridome Pasteur n 1-467 monoclonal 30N47-1 = Institut monoclonal 47N3-6 = Institut monoclonal 47N30A32 = Institut monoclonal 47N30A35 = Institut monoclonal 47N38B27 = Institut monoclonal 47N48B22 = Institut monoclonal 47N9-11 = Institut 7.- Utilisation de l'anticorps monoclonal tel

que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3,

pour tester, purifier ou isoler le -interféron et différencier les molécules GIF incomplètes de la molécule

GIF complète.

29 2584418

8.- Utilisation de l'anticorps monoclonal 3-6 produit par l'hybridome 47N3-6 (Institut Pasteur n 1-466) ou 32 produit par l'hybridome 47N30A32 (Institut Pasteur n 1-464) pour évaluer, en combinaison avec un anticorps monoclonal choisi parmi les anticorps monoclonaux 35 produit par l'hybridome 47N30A35 (Institut Pasteur n 1-465), 27 produit par l'hybridome 47N38B27 (Institut Pasteur 1-468), 22 produit par l'hybridome 47N48B22 (Institut Pasteur no 1-469) et 9-11 produit par l'hybridome 47N911 (Institut Pasteur n0 1-467), la

molécule GIF de longueur complète.

9.- Procédé de préparation de nouveaux hybridomes monoclonaux, caractérisé en ce qu'il comprend: a) la culture dans divers flacons de culture d'hybridomes préparés par fusion de cellule de myélome de souris avec des cellules de rate de souris immunisées par

des injections de GIFA, de préférence dans un milieu éli-

minant les cellules de myélome non fusionnées et les cel-

lules de rate non fusionnées, par exemple un milieu HAT; b) on teste les surnageants des cellules d'hybridomes de chaque récipient relativement à la présence d'anticorps anti-GIF; c) on sélectionne les hybridomes produisant les anticorps anti-GIF; et d) on réalise un clonage de ces hybridomes sélectionnés de préférence par la technique de dilution limite et ces clones constituent les nouveaux hybridomes monoclonaux. e) de préférence, on effectue un criblage de ces clones pour déterminer leur réactivité vis-à-vis de molécules GIF de différentes longueurs et/ou visà-vis de peptides obtenus par dégradation de la molécule GIF par CNBr. 10. - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les clones obtenus par clonage sont les suivants:

N47-1 (I-463); 47N3-6 (I-466); 47N30A32

(I-464); 47N30A35 (I-465); 47N38B27 (I-468); 47N48B22

(I-469) et 47N9-11 (I-467).

11.- Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux, caractérisé en ce qu'on prépare lesdits anticorps à partir des hybridomes préparés par le procédé tel que défini à la revendication 9 ou à la revendication 10. 12.Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on produit les anticorps monoclonaux par injection des cellules d'hybridomes monoclonaux à des souris, en recueillant le fluide ascitique produit et en isolant

lesdits anticorps monoclonaux dudit fluide ascitique.

13.- Ensemble ou "kit" pour détecter un GIF, spécialement GIFA, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux anticorps monoclonaux tels que définis selon

l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou tels que

produits par le procédé selon les revendications 11 ou 12,

lesdits anticorps monoclonaux reconnaissant différents épitopes sur la molécule GIFA, une préparation GIFA standard et, fixée à un anticorps monoclonal, une fraction

capable de générer une réponse détectable.