FR2560212A1 - Anticorps monoclonaux contre l'interferon a2 et hybridomes produisant de tels anticorps - Google Patents

Abstract

ANTICORPS MONOCLONAUX DE L'A-INTERFERON, DE LA SOUS-CLASSE IGG, POUVANT ETRE OBTENUS PAR CULTURE D'HYBRIDOMES MONOCLONAUX, CARACTERISES EN CE QU'ILS SE LIENT FORTEMENT A L'INTERFERON A ET NE SE LIENT PAS A L'INTERFERON A OU A. APPLICATION A LA TITRATION, A LA PURIFICATION OU A L'ISOLEMENT DES PROTEINES POUR LESQUELLES CES ANTICORPS MONOCLONAUX SONT SPECIFIQUES.

Description

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La présente invention est relative à de nouveaux anticorps monoclonaux à l'égard de l'interféron a 2 et aux

hybridomes produisant de tels anticorps.

Il est bien connu dans ce domaine, qu'il est possi-

ble d'obtenir une lignée de cellules capables de produire un anticorps homogène, c'est-à-dire, monoclonal. La technique

de base a été décrite initialement par Kohler et Milstein (Na-

ture 256, 1975) et comprend la fusion de cellules de myélome de souris avec des cellules de rate et la sélection de clones

capables de produire l'anticorps désiré. Cette procédure géné-

rale a aussi été décrite dans les Brevets US N 4 364 932,

4 364 934, 4 364 935, 4 364 937 et 4 361 550.

Bien que la méthode générale soit connue depuis quel-

ques années, il y a en fait de nombreuses difficultés à sur-

monter et diverses modifications spécifiques doivent être trou-

vées dans chaque cas. Il n'y a aucune certitude de trouver un hybridome convenable et, il n'y a, de même aucune certitude que l'hybridome produise un anticorps ayant les propriétés désirées.

Ainsi qu'il est bien connu, les anticorps ont diver-

ses utilités. Ainsi, des anticorps monoclonaux peuvent en par-

ticulier, être utiles pour la titration(nécessaire ou kit de

diagnostic) ou pour l'isolement et la purification des pro-

téines pour lesquelles ils sont spécifiques (voir par exemple

PCT/GB 81/00239, Publication No. WO82/01773).

La demande de brevet PCT N PCT/GB 8/00067 ainsi que

"J. gen. Virol. (1981) 53, 257-265" décrivent un anticorps mo-

noclonal NK2, qui est spécifique des a-interférons en géné-

ral et ne se lie pas à d'autres interférons, par exemple au -interféron, etc... Le terme d' a-interféron ou interféron

leucocytaire recouvre cependant un groupe de 15 entités molé-

culaires distinctisou plus, et les anticorps conformes à la présente invention sont nettement différents du NK2, en ce qu'ils font partie d'une sous-classe Ig différente et se lient

à des entités d' a-interféron différentes.

Une étude plus récente a permis l'isolement d'espè-

ces individuelles à partir du groupe des a-interférons, la pro-

duction de chaque espèce en plus grande quantité et la purifi-

cation de celles-ci en un composé homogène.

L'un de ces a-interférons dénommé interféron a2 (IFN 2) s'est avéré dans plusieurs tests être une substance

pharmaceutiquement active, particulièrement pleine de promes-

ses, utile pour combattre diverses maladies. L' IF est lar-

gement décrit dans la littérature et il peut être obtenu, soit

par isolement à partir d'échantillon de sang, soit par la tech-

nologie dite de recombinaison de DNA, par exemple telle que

décrite dans la demande de Brevet Européen publiée N 0 032 134.

Il est évident qu'il est extrêmement souhaitable de

disposer d'anticorps qui sont spécifiques de l'IFNa2 unique-

ment et ne se lient pas à d'autres a-interférons étroitement

apparentés ou au e-interféron, etc...

Le but de la présente invention est donc d'isoler des

hybridomes monoclonaux, qui sont capables de produire des anti-

corps monoclonaux se liant fortement à l'IFNa2 et pas du tout

ou seulement un peu aux autres a-interférons.

Ainsi qu'il est mentionné plus haut, de tels anticorps sont extrêmement utiles pour divers usages, par exemple, pour titrer ou purifier (chromotagraphie affirmative) l'IFNa2. Une autre utilisation possible consiste à isoler des molécules plus

courtes de protéine de type interféron-a2, par exemple des por-

tions d'IFNa2, qui, bien que plus petites que la molécule

d'IFNa2 originale,présentent encore des caractéristiques et ac-

tivités identiques ou similaires à celles de l'IFNa2 pour une

structure moléculaire particulière et, en conséquence, répon-

dent à des invasions de molécules étrangères à l'intérieur d'un

corps de mammifère.

Les hybridomes et les anticorps conformes à la pré-

sente invention peuvent être obtenus selon la procédure sui-

vante:

1) Des souris sont immunisées avec plusieurs injec-

tions d'IFN 2. Le type de souris utilisé n'est pas critique, mais de bons résultats sont obtenus avec des femelles Balb/c

L'antigène {IFNa2) peut être appliqué sous une quelconque for-

me convenable, par exemple dans de l'adjuvant complet de Freund (CFA) émulsifié avec une solution saline tamponnée au phospha- te (PBS), (rapport 1:1). Le nombre d'injections et la quantité d'antigène administrée doivent être tels que d'utiles quantités

titrés de splénocytes convenablement enrichies soient produi-

tes. De façon usuelle, l'immunisation comprend trois injections intrapéritonéales avec 10gg d'antigène à des intervalles de 2 semaines. Celles-ci sont suivies d'un rappel supplémentaire

àonsistant en 10 g d'antigène dans du PBS par voie intravei-

neuse et en 10 gg d'antigène dans du CFA/PBS par voie intra-

péritonéale. 2) Les rates des souris immunisées sont enlevées et des suspensions de rate sont préparées. Cette procédure suit

des techniques bien connues.

3) Les cellules des rates sont fusionnées avec des

cellules de myélome de souris. La technique utilisée pour fu-

sionner des cellules de myélome avec des cellules de rate est bien connue. De façon plus avantageuse, la fusion est réalisée

par chauffage d'un mélange des deux types de cellules avec cer-

tains ingrédients chimiques (promoteur de fusion), par exemple du polyéthylèneglycol (PEG) ayant un poids moléculaire moyen

d'environ 1000 à 4000 (PEG 1000). Plusieurs lignées de cellu-

les de myélome de souris sont connues et facilement disponi-

bles. On préfère des lignées de cellules manquant de HGPRT JHGPRT = Hypoxanthine Guanosyl Phosphoribosyl Transferase) et

qui ne survivent donc pas dans du HAT (milieu de culture com-

prenant hypoxynthine, aminoptérine et thymidine). De préférence la lignée de cellules de myélome utilisée, doit être du type qui ne sécrète pas, en ce qu'elle ne produit pas elle-même de quelconque anticorps. Une lignée de cellules convenables pour

le but de la présente invention est la lignée de cellules dénom-

mée NS 1. Ces cellules ont été dérivées des cellules de myélome

P3/X63-A8, par K5hler et Milstein.

4) Les cellules de rate fusionnées sont cultivées

dans plusieurs récipients distincts. Cette étape suit égale-

ment des procédures standards. Les cultures de cellules obte-

nues dans l'étape 3 sont des mélanges de cellules de rate fu- sionnées, de cellules de rate non-fusionnées et de cellules

de myélome non-fusionnées. De préférence, la culture est ef-

fectuée dans un milieu qui éliminera la lignée de cellules de

myélome non-fusionnées, par exemple un milieu HAT. Ces cellu-

les de rate non-fusionnées qui sont non-malignes, arrêteront normalement leur développement après une courte période de temps, tandis que les cellules fusionnées qui sont HGPRT+,

peuvent croître dans un milieu HAT.

) Dans les liquides surnageants des cellules d'hybri- dome de chaque récipient, on évalue la présence d'anticorps

d'IFNa2.Cet essai peut être commodément réalisé par applica-

tion du titrage avec un immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) Dans le cas présent, on choisit des anticorps liés à l'enzyme

phosphatase alcaline, mais d'autres procédures sont aussi con-

cevables.

6) Des hybridomes produisant les anticorps désirés sont choisis et clones. Le clonage est de préférence réalisé

selon la technique de dilution limite.

7) Les anticorps choisis sont produits au moyen des hybridomes sélectionnés. Cette production peut être obtenue

par la culture in vitro de l'hybridome dans un milieu conve-

nable, suivie par l'isolement de l'anticorps, cependant cette

méthode peut ne pas fournir des quantités suffisantes.

Une méthode préférée de production de plus grandes

quantités d'anticorps, utilise une approche in vivo. L'hybri-

dome est réinjecté à des souris, chez lesquelles il provoque la production de fluides ascitiques contenant d'importantes quantités d'anticorps désiré, qui est alors isolé selon des

procédures classiques.

EXEMPLE

1. Immunisation des souris.

Des souris femelles (Balb/c sont immunisées par trois injections à quinze jours d'intervalles, de 10 pg de IFNa2 (Schering-Plough Corporation) dans une émulsion de CFA/PBS,

1:1. Un volume total de 0,2 ml est injecté par voie intrapé-

ritonéale à chaque souris. Quinze jours après la troisième in-

jection, un rappel est fait par injection de 10 pg d'antigène dans du CFA par voie intrapéritonéale et en même temps, 10 pg d'antigène dans du PBS par voie intraveineuse. Quatre jours après les dernières injections, les souris sont saignées et leur

-rate prélevée pour la fusion.

2. Fusion cellulaire.

La rate est mise en suspension dans du PBS (dépourvu

+4 ++

de Ca++ et Mg ++) et un dénombrement des cellules est réalisé

(une rate comprend environ 108 cellules).

Après filtration à travers une gaze stérile, les cel-

lules sont lavées deux fois dans du PBS froid dépourvu de Ca++ et de Mg++ (GIBCO CAT 420). Les cellules de myélome de souris (NSI) sont lavées (3 fois avec du PBS de même type) et les deux types de cellules sont mélangés et centrifugés ensemble. Le

mélange comprend 108 cellules de rate et 107 cellules de NSI.

On laisse environ 0,2 ml de liquide surnageant sur

les cellules. On brise la boulette en agitant doucement le tu-

be, puis on ajoute goutte-à-goutte 1 ml de PEG 1000 (Merck Art.

9729), à 50 % dans du PBS sans Ca++ et Mg ++, en 1 minute en agitant constamment à 37 C. Après trente secondes d'agitation à 37 C, le tube est lentement rempli avec du PBS chaud sans

Ca + et Mg++ et centrifugé. Les cellules sont alors directe-

ment remises en suspension dans un milieu HAT et réparties dans

des plaques à 24 puits (1 ml par puits, avec environ 2x106 cel-

lules par puits). A cette étape, des splénocytes non-traités

(1:10 de chaque rate) sont ajoutés en tant que cellules nutri-

tives.

3. Culture des cellules d'hybridome.

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24 heures après la fusion, 1 ml de milieu HAT est ajouté à chaque puits. Du milieu frais est ajouté trois fois par semaine à tous les puits. La sélection est obtenue par culture des hybridomes dans un milieu HAT pendant 3 semaines, suivie d'une culture de cellules pendant trois semaines consé-

cutives dans un milieu HT (le même milieu, mais sans aminopté-

rine) et ensuite maintien dans un milieu de culture normal

(RPMi 1640 avec 10 % de FCS).

Dès que possible, les cellules d'hybridomes sont con-

gelées selon des techniques standard. Le liquide surnageant est

conservé et testé pour la détermination de la présence d'anti-

corps anti IFN 2' 4. Test (screening) pour la présence d'anticorps antiIFN La présence d'anticorps anti-IFNa2 dans les liquides surnageants des cultures de cellules d'hybridome est testée

par un titrage avec un immunosorbant lié à une enzyme (ELISA).

L'utilisation d'anticorps liés à l'enzyme phosphatase alcaline,

selon des techniques classiques (voir "Enzyme Linked Immunor-

sorbant Assay"; A. Voller, D. Bidwelland, A. Bartlett; Manual of Clinical Immunology,chapitre 45, p. 359) est choisie et adaptée pour la détection d'anticorps monoclonaux anti-IFNla2 Le test utilisé comprend les étapes suivantes: 1) Enduction de la plaque avec 100 mg d'IFNa2 par puits (dilution 0,5 ug/ml dans du tampon d'enduction; 0,2 ml

par puits).

16 heures à 4 C petit coup s r l'évier 2) + 0,2 ml RPM - FCS par puits 1 h d'incubation à température ambiante 4 lavages avec PBS - Tween 3) 0,2 ml de liquide surnageant d'hybridome par puits 2 h d'incubation à température ambiante 4 lavages avec PBS - Tween 4) 0,2 ml d'anti Ig-AP de souris 1:500 dans RPMi-FCS 2 h d'incubation à température ambiante

' 4

4 lavages avec PBS - Tween ) 0,2 ml de PNPP dans un tampon diéthanolamine

lectures après 15, 30, 45 minutes, 1 heure.

L'absorption d'IFNc2 au fond des plaques (des plaques

à 96 puits;.plaque Immune NUNC I CAT N 2-39454) est réali-

sée dans du tampon d'enduction (tampon de carbonate - carbonate acide) contenant 1,59 g de Na2CO3, 2,93 g de NaHCO3, 0,2 g de

NaN3 par litre d'eau distillée. Apres une nuit à 4 C, les puits.

sont saturés de protéine par une incubation d'une heure à la température ambiante, avec le milieu de culture contenant du

RPMi - 10 % de FCS (0,2 ml par puits).

La plaque est alors lavée à quatre reprises avec du PBS - Tween contenant 8 g de NaCl, 0,2 g de KHPO4, 2,9 g de

NaHPO4 (12 H20), 0,2 g de KC1, 0,5 ml de Tween 20 dans un li-

tre d'eau distillée (pH = 7,4).

Après incubation de la plaque avec les liquides sur-

nageants d'hybridome, la présence d'anticorps anti-IFN 2 de souris est révélée par des anti-immunoglobulines de souris de mouton conjuguées avec une phosphatase alcaline (par exemple

NEI - 500 provenant de NEN).

Après deux heures d'incubation avec le conjugué-et quatre lavages consécutifs, 0,2 ml de solution de substrat est ajouté. Le substrat (phosphate de paranitrophényle; substrat phosphatase PNPP Sigma 104-ref.: 104 - 105) est dissous (1 comprimé de 5 mg pour 5 ml de tampon) dans un tampon contenant

mg de MgCl2.(6H20); 0,2 g de NaN3, 97 ml de diéthanol-

amine dans un litre d'eau distillée (pH = 9,8 ajusté avec HCl).

La densité optique à 405 nm est lue à différents intervalles

de temps après addition du substrat (autolecteur MR 580 de Dy-

natech). Des hybridomes fortement positifs sont choisis pour

le clonage. Ils sont désignés par 6N5, 7N2 et 7N4.

5. Clonage

Le clonage des cellules d'hybridome est réalisé se-

lon la technique de-dilution limite.

Des cellules hybrides sont diluées dans le milieu de culture et réparties dans des plaques à 96 puits (linbro 76003-05 à fond plat) de façon à avoir 60 cellules par plaque (0,2 ml par puits). Des macrophages péritonéaux de souris

Balb/c sont utilisés comme cellules nutritives; ils sont col-

lectés par lavage de la cavité péritonéale de souris avec du

HBSS (GIBCO Cat. No. 406) contenant 1 % d'antibiotiques (Pé-

nicilline-Streptomycine) à 4 C. De façon usuelle, les macro-

phages péritonéaux récupérés chez une souris sont-suffisants pour une plaque à 96 puits (environ 2 à 4-x 105 cellules par puits;

Après environ trois semaines, les clones sont visi-

bles à l'oeil. Ils sont alors transférés sur des plaques à

24 puits. A cette étape, les clones sont gelés le plus rapi-

dement possible. Les liquides surnageants sont alors conser-

vés et évalués pour déterminer l'activité-anti-IFN 2 L'hybridome 6N5 fournit un clone actif, qui est

dénommé 6N5-2-I- L'hybridome 7N2 donne un clone actif dé-

nommé 7N2-4. L'hybridome 7N4 fournit deux clones actifs dénom-

més 7N4-1 et 7N4-6 respectivement. Les anticorps monoclonaux produits par les hybridomes actifs sont dénommés A6N5-2-I, A7N2-4, A7N4-1 et A7N4-6; ces anticorps monoclonaux ont été

déposés dans la Collection Nationale de Culture de Micro-

organismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR en date du 22 FEVRIER 1984, l'anticorps monoclonal dénommé A6N5-2-I portant le numéro de dépôt 1-279, l'anticorps monoclonal dénommé A7N2-4 portant le numéro de dépôt 1-278 et l'anticorps monoclonal dénommé

A7N4-1 portant le numéro de dépôt 1-277.

6. Production du fluide ascitique

Pour obtenir de grandes quantités d'anticorps mono-

clonaux, du fluide ascitique est induit chez des souris Balb/c

par injection de cellules d'hybridome.

Quatre jours avant injection des cellules, les sou-

ris sont traitées par voie intrapéritonéale avec 0,5 ml de

pristane (2,6,10,14-Tétraméthyl-penta-décane Aldrich T22802).

Après trois lavages des cellules d'hybridome avec du PBS Dul-

beco (GIBCO 041.4040), la suspension de cellules est ajustée à 2,5 x 10 cellules/ml et 0,2 ml est injecté à chaque souris (5 x 106 cellules par souris). Apres une période allant de dix à vingt jours, le fluide ascitique peut être collecté. Après

une période de quelques jours de repos, il est possible de re-

cueillir à nouveau du fluide ascitique à partir des mêmes sou-

ris. Au moins deux ou trois échantillons de fluide ascitique

sont collectés chez chaque souris.

7. Isolement et purification des clones à partir des fluides ascitiques. Précipitation au sulfate d'ammonium: 27 ml de fluide ascitique sont dilués quatre fois dans du PBS froid et placés sur de la glace. Un volume égal d'une solution saturée de (NH4)2SO4 à 4 C est ajouté lentement sous agitation, en une période de plusieurs minutes: la concentration finale en (NH4)2SO4 est une saturation à 50 %. La solution est laissée sur de la glace pendant 30 minutes. La centrifugation est faite à 5000 g pendant 10 à 15 minutes. La boulette est recueillie et dissoute dans 15 ml de tampon contenant 40 mM de NaCl, 20mM

de Tris/HC1, pH 7,8 (tampon A). La boulette remise en suspen-

sion est dialysée contre 100 volumes de tampon contenant 20 mM

de NaCl, 20 mM de Tris/HCl, pH 7,8 (tampon B). Avant chromato-

graphie avec échange d'ions,la protéine dénaturée est éliminée

par centrifugation.à 15.000 g pendant 10 minutes.

Chromatographie sur DEAE cellulose: du DE 52 (What-

man) équilibré dans le tampon B, est tassé dans une colonne

(2,5 cm x 27 cm) en un volume de lit garni de 132 ml. Le gar-

nissage est réalisé avec un débit pompé de 45 mg/h/cm. La chro-

matographie est effectuée à la température ambiante. Immédiate-

ment avant le chargement, l'échantillon dialysé est ajusté de façon à reconstituer les conditions ioniques du tampon B. L'échantillon est chargé avec un débit de 2 ml/minute. Apres lavage avec le tampon B (1/10 du volume du lit), la colonne

est éluée avec un gradient linéaire de NaCl (40 mM à 200 mM).

Le volume total de gradient est de 1 litre. Le débit d'élu-

tion est de 50 ml/heure. On recueille des fractions de 10 ml d'éluat, 8. Lyophilisation Des fractions d'éluat sont dialysées contre 1 %

(p/v) de NH4HCO3 pendant 48 heures. Le volume final après dia-

lyse est de 168 ml. L'ensemble est stérilisé par filtration à travers un filtre (Falcon) à membrane de 0,22 micron. Des

aliquots de 10 ml du filtrat sont transférés dans des bouteil-

les stériles et lyophilisés. Des conditions stériles sont main-

tenues après lyophilisation à l'aide d'un dispositif automati-

que de capsulage.

CARACTERISATION DES 3 ANTICORPS ANTI-INTERFE-

RONc2 A6N5-2-I, A712-4 et A7N4-1 La caractérisation d'un anticorps monoclonal doit fournir les informations suivantes: (i) Détermination de la spécificité, c'est-à-dire

du type d'interférons auquel se lie l'anticorps.

(ii) Détermination de la sous-classe Ig.

(iii) Détermination de l'effet exercé par l'anticorps sur des fonctions biologiques de la molécule

(dans ce cas, des interférons).

1. Spécificité des anticorps monoclonaux.

La spécificité est déterminée par l'utilisation du

test ELISA décrit dans la partie 4 de l'Exemple ci-dessus.

2.- Détermination de la sous-classe Ig.

L'isotype des anticorps monoclonaux purifiés à partir des ascites est testé par un test ELISA indirect. Les plaques sont enduites de 100 mg d'IFNM2 par puits et traitées avec du RPMI - 10 % de FCS décrit plus haut. Les anticorps monoclonaux dilués dans du RPMI - 10 % de FCS sont fixés sur l'antigène déposé au fond pendant 2 h d'incubation. Les puits sont alors remplis d'une solution d'anticorps dirigés contre diverses sous- classes Ig de souris (dilution 1:1000). Tous les anti-isotypes utilisés ici sont produits chez des lapins

(IgM; IgG!; IgG 2a; IgG 2b; IgG 3; IGA, 1 et K). La pré-

sence d'anticorps anti-isotype est détectée par de l'anti-Ig de lapin conjugué à une phosphatase alcaline. Les conditions

d'incubation et la lecture des résultats sont tels que décri-

tes pour le test ELISA ci-dessus.

3. Tests fonctionnels.

A. Inhibition de la 2'-5' oligo (A) synthétase.

Le traitement des cellules avec l'IFNa2 se traduit par l'induction de 2'5'-oligo (A) synthétase. Cette activité est utilisée comme test fonctionnel pour l'IFNa, c'est-à-dire que l'on détermine si les anticorps inhibent ou non l'induction

de la 2'-5' oligo (A) synthétase par IFNa2.

En plus de ses actions anti-virales, le traitement des cellules par l'IFNa2 s'est révêlé induire divers mRNA et protéines. Parmi les protéines induites, se trouve un certain

nombre d'enzymes, comprenant la 2'-5' oligo (A) synthétase.

Celle-ci est activée par du dsRNA/ par exemple poly(I).(C)7 et produit une famille hétérogène d'oligoadénylates à liaison 2'-5' dans laquelle les di-, tri- et tétra-adénylates sont les plus abondants. L'induction de la 2'-5' oligo (A) synthétase

peut être utilisée comme un marqueur sûr pour l'activité bio-

logique des interférons. La lignée cellulaire Hela S3 est uti-

lisée pour étudier les effets des preparations d'interféron sur l'induction de 2'-5' oligo (A) synthétase. L'effet est mesuré

* par la détermination des quantités de 2'-5' oligo (A) produites.

Ce test de 2'-5' oligo (A) synthétase comprend les

étapes suivantes -

(a) prétraitement d'IFNa2 avec un anticorps monoclonal; (b) addition du complexe immun obtenu à des cultures de cellules Hela S3; et (c) titrage des extraits de cellules HelaS3 à partir des cultures (b), pour déterminer l'activité de la 2'-5'

oligo (A) synthétase.

Etape (a): On ajoute 100 ng d'INFo2 par ml à 5 ml de surna-

geant de culture monoclonale. Le mélange est sou-

mis à une heure d'incubation à 37 C. -

Etape (b): 2,5 ml du milieu obtenu selon l'étape (a) sont

ajoutés à des cultures de cellules Hela S conte-

nant 7,5 ml de milieu frais (RPMI + 10 % CFS), mé-

langés par secousses et incubés pendant 20 heures

à 37 C dans un incubateur humidifié, à CO2.

Etape (c): Apres lavage dans du PBS, des cellules Hela adhé-

rentes sont grattées des plaques et mises dans 2 ml de PBS (tampon du phosphate 0,01 M, pH 7,2, 0,15 M de NaCl). Les plaques sont lavées avec 1 ml supplémentaire de PBS. Les cellules sont réunies

à 500xg pendant 5 minutes à la température ambian-

te. Le liquide surnageant est soigneusement éliminé

avec une pipette Pasteur. La boulette est alors re-

mise en suspension dans un tampon de lyse contenant mM de KC1, 1,5 mM d'acétate de magnésium, 0,5 %

de Triton X - 100 et 20 mM de Hepes/KOH, pH = 7,5.

Des cellules sont lysées par traitement à 4 C pen-

dant 10 minutes. Le lysat est immédiatement centri-

fugé à 30.000xg pendant 15 minutes. Le surnageant est recueilli et dénommé extrait de cellules Hela S3. On évalue ensuite l'activité de la 2'-5' oligo

(A) synthétase de ces extraits.

Les produits soumis au titrage contiennent, dans un volume final de 50 pl: 30 jal d'extrait cellulaire, 5 mM d'ATP, mM de Mg (OAc)2, 4 mM de fructose 1,6 diphosphate, 1 mM de DTT, 100 mM de KOAC, 20 mM de Hepes/KOH, pH = 7,6, 10 % de glycérol et 100 pg/ml de poly(I).(C)(Miles Laboratories). Des incubations sont faites à 30 C pendant une heure et terminées par un chauffage à 100 C pendant 3 minutes. La 2'-5' oligo (A) produite est isolée par chromatographie avec échange d'ionssur de la DEAE- cellulose. Les échantillons sont dilués avec 1 ml de tampon contenant 90 mM de KCl, 20 mM de Tris/ECl, pH = 7,6 (tampon de départ). Des échantillons dilués sont envoyés à

trois reprises sur une colonne contenant 0,5 ml de DE 52 (What-

man) tassé, équilibré avec le tampon de départ. Les colonnes sont lavées avec 10 ml de tampon de départ, puis éluées avec 1 ml de tampon d'élution (350 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl,

pH = 7,6).

La production de 2'-5' oligo (A) est mesurée par

spectrophotométrie à 259 nm.

B - Antiprolifération.

Une autre caractéristique des anticorps concerne leur aptitude à inhiber ou non l'effet antiprolifératif de l'IFNa2 Le test est effectué avec la lignée cellulaire Daudi (obtenue chez l'American Type Culture Collection), qui est extrêmement

sensible à l'action antiproliférative des interférons.

L'IFNE2 est incubé avec l'anticorps monoclonal pen-

dant 30 minutes à 370C, dans un volume final de 50 pl. Ceci est réalisé dans des plaques de culture pour microtitrage. On

ajoute alors dans chaque puits, 100 il de suspension cellulai-

re contenant 104 cellules. Apres 3 jours d'incubation dans un incubateur à CO2, la prolifération est mesurée par un rapide

titrage colorimétrique quantitatif.

Trois heures avant la fin du titrage, on ajoute du MTT (bromure de (3-Z 4, 5-Diméthylthiazol-2-yl/-2,5-diphényl

tétrazolium; 10 pl de solution à 5 mg/ml) dans chaque puits.

La plaque de culture pour microtitrage est alors incubée pen-

dant 3 heures supplémentaires. Les plaques sont retirées de l'incubateur et 200 pi de HCl 0,04N dans de l'isopropanol sont ajoutés dans chaque puits. Après mélange, les plaques sont lues sur un autolecteur Dynatech MR 580 avec une longueur d'onde de

référence de 630 nm et une longueur d'onde d'essai de 570 nm.

Le produit de réaction bleu de formazan est une mesure quanti-

tative du nombre de cellules vivantes.

Le test de spécificité ainsi que les résultats des

tests A et B ci-dessus en ce qui concerne les anticorps mono-

clonaux conformes à la présente invention et le NK-2, sont

fournis dans le Tableau I ci-après.

w w tk> F> U1 0 no 17 n On

TABLEAU I

Anticorps Tests de spécificité Tests fonctionnels

_.aI X a a 30-G 30-E 30-U 2'-5' Anti-

Monoclonal Sous-classe Ig 2 1 7 ________________ _____oligo(A) proliferation 6 iN5-2 -I I ri -- - NUD 7UN2-4 IgGl i _ non non 7 N4-1 1!gG1 - ê1 oui oui K - 2 I g G 2 b +' Oui oui ND: non déterminé ++: fortement positif +: positif -:négatif La séquence d'amino acide de l'interféron a 2

CYS-ASP-LEU-PRO-GLN-THR-HIS-SER-LEU-GLY-SER-ARG-ARG-THR-

LEU-MET-LEU-LEU-

ALA-GLN-MET-ARG-ARG-ILE-SER-LEU-PHE-SER-CYS-LEU- LYS-ASP-

ARG-HIS-ASP-PHE-

GLY-PHE-PRO-GLN-GLU-GLU-PHE-GLY-ASN-GLN-PHE-GLN-LYS-ALA-

GLU-THR-ILE-PRO-

VAL-LEU-HIS-GLU-MET-ILE-GLN-GLN-ILE-PHE-ASN-LEU-PHE-SER-

THR-LY-S-ASP-SER-

SER-ALA-ALA-TRP-ASP-GLU-THR-LEU-LEU-ASP-LYS-PHE-TYR-THR-

GLU-LEU-TYR-GLN. -

GLN-LEU-ASN-ASP-LEU-GLU-ALA-CAS-VAL-ILE-GLN-GLY-VAL-GLY-

VAL-THR-GLU-THR-

PRO-LEU-MET- L-YS-GLU-ASP-SER-ILE-LEU-ALA-'VAL-ARG-LYS-TYR-

PHE-GLN-ARG-ILE-

THR-LEU-TYR-LEU-LYS-GLU-LYS-LYS-TYR-SER-PRO-CYS-ALA-TRP-

GLU-VAL-VAL-ARG

ALA-GLU-ILE-MET-ARG-SER-PHE-SER-LEU-SER-THR-ASN-LEU-GLN-

GLU-SER-LEU-ARG-

SER-LYS-GLU

Amino acides des fragments d'interféron a2 30-G; 30-E et 30-D Fragment | Amino acides

1 15

-G Cys.Leu -Hser9 8 110

!l...Cys....Leu -Hser -E Arg22.... Cys29.... Glu58-Hser

I

Ls112 Cys138 lel47-Hser Lys...Cys... le ser -D Arg 149 Glu 65 Ainsi qu'on peut le constater, les anticorps conformes à la présente invention appartiennent tous à la

sous-classe Ig IgG1, tandis que NK2 est de la sous-classe IgG2a.

Les anticorps A6N5-2-1 et A7N2-4 ne se lient pas à a1 et a7.

Tous les anticorps se lient fortement à a2. NK2 se lie à a2 et a7'. Les substances utilisées dans les tests ci-dessus sont connues, ou bien leur structure est donnée ci-après. Les

séquences de al et a7 sont publiées, par exemple dans Weiss-

man et al (1982): "Structure and expression of Human AlplaIn-

terferon Genes" (Interferons, pp 295, Academic Press);

Scientific American, Vol.

249 N.2, pp 28-36, (S. Pestka).

Claims (7)

REVENDICATIONS

1.- Anticorps monoclonaux de 1' a-interféron pouvant

être obtenus par culture d'hybridomes monoclonaux, caractéri-

sés en ce que les anticorps se lient fortement à l'interféron O2' 2.Anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisés en ce que les anticorps sont de la sous-classe

IgGl d'immunoglobuline.

3.- Anticorps selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils: (a) se lient fortement à l'interféron a2; (b) ne se lient pas à l'interféron a ou a

1 7'

4.- Anticorps selon la revendication 3, caractérisé

- en ce qu'il est l'anticorps dénommé A6N5-2-I.

5.- Anticorps selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils: (a) se lient fortement à l'interféron a2; (b) ne se lient pas à l'interféron al ou a7;

(c) n'inhibent pas l'induction de la 2'-5' oligo (A) syn-

thétase pas l'interféron a2; et (d) n'inhibent pas l'effet antiprolifératif de l'interféron a 2- 6.- Anticorçs selon la revendication 5, caractérisé en

ce qu'il s'agit de l'anticorps dénommé A7N2-4.

7.- Anticorps selon la revendication 2, caractérisés

en ce qu'ils -

(a) se lient fortement à l'interférona2; (b) ne se lient pas à l'interféron a1; (c) inhibent l'induction de la 2'-5' oligo (A) synthétase par l'interférona2; et

(d) inhibent l'effet antiprolifératif de l'interférona 2.

8.- Anticorps selon la revendication 7, caractérisé

en ce qu'il s'agit de l'anticorps dénommé A7N4-1.

9.-Hybridomes monoclonaux caractérisés en ce qu'il s'agit des hybridomes monoclonaux 6 N 5 - 2 - I, 7 N 2 - 4, 7 N 4 - 1, 7 N 4 - 6. Les anticorps monoclonaux produits par ces hybridomes sont déposés dans la Collection Nationale de Cultures de microorganismes de l'INSTITUT PASTEUR, en date du 22 FEVRIER 1984, sous les numéros de dépÈt: 1-279 pour l'ANTICORPS A6N5-1-I 1-278 pour l'ANTICORPS A7N2-4 1-277 pour l'ANTICORPS A7N4-1