FR2500754A1 - Anticorps monoclonaux - Google Patents

Abstract

LA COLLECTION SELON L'INVENTION, EST CARACTERISEE EN CE QUE SES ELEMENTS SONT DIRIGES CONTRE L'INTERFERON DE LEUCOCYTE HUMAIN ILH NATUREL OU OBTENU PAR LA TECHNOLOGIE DE L'ADN RECOMBINANT.

Description

La présente invention concerne des anticorps contre des protéines, à

savoir contre l'interféron de leucocyte humain

(ILH) naturel ou obtenu par la technologie de l'ADN recom-

binant. Il est possible que l'ILH représente une thérapeutique intéressante pour le traitement des maladies virales et

néoplasiques. L'évaluation de cette substance et son déve-

loppement possible en un médicament largement utilisé sont restreintes par la difficulté qu'il y a à purifier et à

caractériser la substance active de la manière appropriée.

Un test qui pourrait être réalisé en moins de 24 h serait une contribution importante à la purification recherchée

et à la caractérisation requise de 1'ILH.

Dans le cadre de l'invention, on a maintenant trouvé que pour purifier et déterminer l'ILH de manière parfaite on peut avoir recours à une collection d'anticorps monoclonaux qui sont dirigés contre l'interféron de leucocyte naturel

ou obtenu par la technologie de l'ADN recombinant.

L'invention concerne donc une collection d'anticorps

monoclonaux, caractérisée en ce que ses éléments sont diri-

gés contre l'interféron de leucocyte humain (ILH).naturel

ou obtenu par*la technologie de l'ADN recombinant.

Le mot de "collection" dénote sous ce rapport la totalité

des anticorps ainsi que chaque élément pris en particulier.

Selon un aspect particulier de l'invention, les anti-

corps monoclonaux sont sécrétés par différents hybridomes.

Dans le cadre de l'invention on a montré que les

divers anticorps monoclonaux ne sont pas mutuellement inhi-

bants, c'est-à-dire se lient ensemble à l'ILH, tandis que d'autres sont mutuellement inhibants, c'est-à-dire qu'ils ne se lient pas simultanément à 1'ILH. En outre, on a montré

que la collection se compose de groupes d'anticorps mono-

clonaux, dont les éléments reconnaissent différents

épitopes (déterminants antigéniques) d'ILH.

Une caractéristique de la collection d'anticorps mono-

clonaux selon l'invention tient à ce qu'au moins un anti-

corps ne reconnaît pas ILH y3.

Dans le cadre de l'invention,on a montré en outre que la collection mentionnée ci-dessus se compose d'un groupe

d'anticorps qui diffèrent l'un de l'autre dans leurs isotypes.

8 anticorps présentent une structure d'IgG, tandis qu'un

présente une structure d'IgM. Parmi les 8 anticorps à struc-

ture d'IgG, 7 ont une chaîne lourde y1 et-un a une chaîne

lourde Y2b.

Un autre caractère de la collection d'anticorps mono-

clonaux selon l'invention tient à ce qu'un anticorps (IgM) ne neutralise pas l'activité antivirale de l'interféron de

leucocyte humain.

Comme on l'a déjà mentionné, la collection de ces anti-

corps monoclonaux se caractérise en outre en ce qu'elle consis-

te en groupes d'anticorps, dont les éléments reconnaissent différents épitopes d'ILH. Un autre aspect de l'invention

concerne donc l'application d'un élément de ce groupe d'anti-

corps pour un test sandwich en phase solide d'ILH. Dans le cas du test sandwich mentionné ci-dessus, on munit un anticorps d'un marquage approprié. A cet effet on peut envisager n'importe quel marquage approprié dans ce but, mais on préfère un marquage radioactif ou un marquage

enzymatique.

Un autre aspect de l'invention concerne l'application

d'un anticorps provenant de la collection mentionnée ci-

dessus à la purification d'ILH. La purification d'ILH au moyen de l'anticorps monoclonal s'effectue de préférence par chromatographie d'affinité. Pour une purification à l'échelle commerciale l'affinité doit être suffisamment élevée pour que l'interféron soit retenu de façon pratiquement quantitative également avec de grands volumes qui passent dans la colonne avec une vitesse pas trop faible. Avec un seul anticorps ceci n'est pas possible pour toutes les sous-classes

d'interféron. Dans ce but une collection d'anticorps mono-

clonaux dont les différents membres présentent une affinité élevée pour des sous-classes particulières d'interféron est particulièrement appropriée. La préparation des anticorps monoclonaux s'effectue selon une technologie de fusion cellulaire classique, dans laquelle on fusionne des cellules de myélome avec des cellules de

rate de souris qui ont été immunisées avec ILH. Les hydri-

domes obtenus sécrètent des anticorps monoclonaux contre

l'interféron de leucocyte naturel ou obtenu par la technolo-

gie de l'ADN recombinant.

La réalisation du test sandwich en phase solide pour la

détermination d'ILH peut s'effectuer selon des procédés clas-

siques, mais on peut retrouver une simplification substantiel-

le, par opposition au procédé sandwich en phase solide classi-

que, en faisant incuber des anticorps non marqués et marqués

depuis le début ensemble et une fois seulement.

La purification de l'ILH au moyen d'un anticorps mono-

clonal peut s'effectuer selon des procédés classiques, grâce auxquels on a trouvé que la chromatographie d'affinité convient particulièrement. Dans cette chromatographie d'affinité on utilise de préférence comme support l'Affi-Gel

(Laboratoire BioRad, Richmond, Californie).

On a montré de façon surprenante que selon le procédé sandwich en phase solide selon l'invention, l'interférqn de leucocyte humain est détectable jusqu'à une concentration

de U/ml dans le sérum.

D'un autre côté, on a montré que l'on peut purifier l'interféron de leucocyte humain obtenu par la technologie de l'ADN recombinant avec un anticorps monoclonal selon l'invention de manière simple tel qu'il soit utilisable pour

les essais cliniques.

Les exemples suivants précisent l'invention.

2500754:

Exemple 1

Préparation des anticorps monoclonaux A) Préparation d'interféron L'interféron de leucocyte humain partiellement purifié (IFL) est disponible en quantité suffisante pour l'immuni- sation des souris. On utilise cinq préparations d'IFL: a) IFL T(a) principal pic de la fraction selon l'étape 8 du Tableau 3 de DOS n 29 47 134 avec une pureté approchée

de 10-15% (estimée par électrophorèse sur gel de polyacryla-

mide-dodécylsulfate de sodium) et une activité spécifique dans le test antiviral; b) IFL a; c) IFL B; d) IFL Y; et e) IFL 6 Les fractions IFL a, B et T consistent dans chaque cas en mélanges des diverses espèces ( a1, a2), ( 1, 02 ',B3)

et ( T1, y2, T3, y4, y5). Il s'agit de "fractions d'épau-

lement" de l'espèce purifiée correspondante, qui sont rassem-

blées à partir de différentes préparations (voir étape 9 du Tableau 3 de la DOS mentionnée ci-dessus). La fraction IFL 6 est l'épaulement de l'espèce 6. Outre les espèces a B, et Y sur la colonne de Lichosorb-diol (voir étape 8

du Tableau 3 de la DOS mentionnée ci-dessus) on voit occasion-

nellement une fraction 6. On la purifie comme dans l'étape 9 selon la Tableau 3 de la DOS ci-dessuS mentionnée, d'après

quoi il est évident que l'espèce 6 ne présente pas de sous-

espèce et est uniforme. La pureté de b), c) et d) est comprise entre 20 et 40% selon l'activité biologique spécifique et

selon l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécyl-

sulfate de sodium. La pureté de e) est au plus de 5%.

Détermination de l'activité d'interféron On détermine l'activité d'interféron au moyen du test d'inhibition de l'effet cytopathique" (CPE) selon la

demande de brevet américain n 4 241 174 (n d'ordre 963 256).

B) Immunisation des souris On immunise tout d'abord 3 souris femelles Balb c/J âgées de 8 semaines avec IFL Y(a) dans l'adjuvant complet de Freund. Chaque souris reçoit environ 150;'g de protéine totale contenant 20-25 Pg d'interféron dans 0,25 ml à 5 positions différentes (0,05 ml dans chaque position): par voie sous-cutanée dans les régions iliaques gauche et droite et dans les régions axillaires gauche et droite ainsi que

sous forme d'injection intrapéritonéale.

53 jours plus tard on procède à une seconde immunisation

comme suit: on sépare 1'IFL f(a) d'interféron par électropho-

rèse préparative sur gel de polyacrylamide (15%)-dodécyl-

sulfate de sodium dans 3 gels cylindriques de 0,6 x 11 cm.

On charge environ 300 Pg de protéine totale dans 0,3 ml (dialysé contre un tampon de dosage) contenant environ -50 Pg d'interféron. [Cette purification est effectuée essentiellement selon le procédé de Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-6851. Après l'électrophorèse, on découpe les

gels en disques de 2 mm d'épaisseur. On immerge ceux-ci pen-

dant 10 minutes dans 0,5 ml de solution de chlorure de sodium tamponné au phosphate (tampon au phosphate de potassium 0,01 M, pH 7,3; chlorure de sodium 0,14 M) contenant 0,1% de Triton X-100 dans des tubes à essai en propylène. On recherche dans le tampon l'activité d'interféron dans une dilution en série selon le test d'inhibition CPE. Les disques 6 et 7 (numérotés à partir de l'extrémité inférieure de chaque gel) présentent l'activité d'interféron la plus élevée (dans chaque cas environ 25% de l'activité du gel total). Dans chaque cas on découpe finement un disque présentant l'activité

la plus élevée avec une lame de rasoir sur une plaque de ver-

re, on le transfère dans une seringue d'l ml contenant 0,2 ml

de chlorure de sodium 0,15 M et onl'injecte à chaque souris.

On injecte la suspension de gel par voie intra-péritonéale,

après quoi on injecte 0,2 ml de BCG (Bacille Calmette-

Guérin; Serum Institut Berne).

Au bout de 12 jours, on recherche l'activité de neutra-

lisation d'interféron dans le sérum de chaque souris. Le -

sérum de la souris n 3 présente une neutralisation à 50% de 10 unités par ml d'IFL Y (a) à une dilution de 1:72 OOO, mais ne neutralise pas la même concentration d'IFL brut

(pureté inférieure à 0,1%) même à une dilution de 1:100.

Les souris n1 l et n 2 présentent des titres de neutralisation

de moins de 1:1000 contre IFL Y (a).

jours après la seconde immunisation, la souris ne 3

reçoit pendant 3 jours de suite une injection de rappel intra-

péritonéale avec un mélange d'IFL a, 1 et Y contenant environ 50 Pg de l'interféron et 15 P1 de sérum de souris normale comme protéine support (dans 0,2 ml de chlorure de sodium 0,15 M). 48 heures après la dernière injection on

sacrifie la souris et on prélève la rate pour la prépara-

tion des anticorps monoclonaux.

C) Cultures cellulaires et fusions cellulaires On utilise les matières et les milieux suivants. On peut obtenir chez Gibco la modification d'Iscove du milieu Eaggle modifié de Dulbecco (IMDMEM). On complète fraîchement avec du pyruvate de sodium (1 mM), de la glutamine (1,5 mM), du 2mercapto-éthanol (5 x 10-5 M), de la pénicilline (100 unités/ml) et de la streptomycine (100 Pg/ml). Le milieu HAT complet se compose d'IMDMEM ainsi complété ainsi que d'hypoxanthine (10-4M), d'aminoptérine (4 x 10- 7M), de thymidine (1,5.x 10-5 M) et de sérum de foetus de veau à

%. On prépare une solution à 50% (p/v) de polyéthylène-

glycol 4000 (PEG 4000, Merck) dans IMDMEM.

La fusion avec une lignée cellulaire de myélome résistan-

te à l'azaguanine non productive est réalisée, avec de

faibles modifications, selon le procédé de Stahli et coll.

dans J. Immunol. Methods 32, 297-304. Dans cette fusion on fusionne 48 x 106 cellules de rate nucléées avec 25 x 106 cellules de myélome de la lignée FO (Fazekas de St. Groth et Scheidegger dans J. Immunol. Methods 35, 1-25 (1980). On lave les cellules de rate et les cellules de myélome dans de 1'IMDMEM dépourvu de sérum. On les remet alors en suspension dans le même milieu, on mélange dans le rapport mentionné ci-dessus pour la fusion et on sédimente dans 40 ml d'IMDMEM dépourvu de sérum dans un tube à essais en polypropylène conique de 50 ml à 200 g pendant 15 minutes, puis on élimine complètement par aspiration le surnageant. Au sédiment cellulaire on ajoute goutte à goutte en agitant constamment 0,5 ml de PEG 4000 à 50% afin de remettre en suspension et de disperser les cellules. Au bout d'environ 90 secondes, on ajoute goutte à goutte 10 ml d'IMDMEM dépourvu de sérum à la température ambiante en agitant constamment pendant 4 à minutes. Après avoir attendu encore 15 minutes sans agiter, on sépare de gros amas cellulaires en prélevant avec soin avec une pipette de 10 ml. On dilue le mélange de fusion à 250 ml avec du milieu HAT complet puis on le dispose dans des réservoirs "Costar cluster wells" (1 ml/réservoir), qui contiennent déjà 1 ml de milieu HAT complet et 105 cellules

péritonéales de souris comme couche nutritive. On fait incu-

ber les cultures dans une atmosphère à 5% de CO2/95% d'air à 85% d'humidité. On alimente les cultures deux fois par semaine en remplaçant la moitié du milieu (1 ml) par du

milieu HAT frais.

D) Détection des hybridomes spécifiques d'interféron par un test de liaison phase solide-anticorps (SABA) Ce procédé est adapté d'après le principe décrit dans Catt et Tregear [Science 158, 1570-1572 (1967)] et convient pour la détection des anticorps d'hydridome (voir également Stahli et coll. dans J. Immunol. Methods 32, 297-304 (1980) ainsi que Kennet, R.H. dans Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81, p 77-91 (1978). Les préparations

d'interféron d'IFL a, B, Y et 6 sont diluées individuelle-

ment dans des tubes à essais en polypropylène avec une solu-

tion de chlorure de sodium tamponnée au phosphate (STP)

à une concentration finale d'environ 0,2 à 0,5 pg d'inter-

féron/ml (environ 1-3 Pg de protéine totale par ml; sauf pour IFL ô o l'on a environ 10-15 pg de protéine totale par mi), pour en revêtir des plaques de microtitrage en chlorure de polyvinyle (Cooke Laboratory Products Division, Dynatech Laboratories, Inc.) comme dans le cas de Stâhli et

coll. loc. cit. On dispose 50111 de la solution d'interfé-

ron dans chaque réservoir et on laisse reposer pendant au moins 4 h à la température ambiante dans une chambre humide

ou on maintient à (sic) 4 C pendant plusieurs semaines.

Avant l'emploi on remplit les réservoirs avec de la sérum-

albumine de boeuf (SAB) à 3% dans le STP et on laisse reposer pendant 30 à 60 minutes afin de bloquer toutes les positions de liaison protéiques. On lave alors les plaques 4 fois avec du STP. On fait incuber 50P 1 de surnageant des cultures d'hybridome dans à chaque fois 2 réservoirs pendant au moins 4 h à la température ambiante. On procède à des expériences témoin (liaison non spécifique) sur des plaques qui ne sont revêtues que de SAB à 3%. Après avoir lavé 4 fois avec du

STP, on ajoute à chaque réservoir 50 P1 d'anticorps Ig anti-

souris de mouton (purifié par chromatographie d'affinité et marqué avec 125I; 50 000 à 100 000 cpm pour 20 à 30 ng d'anticorps dans STP contenant SAB à 1%) et on fait incuber à la température ambiante pendant au moins 4 h. On lave les plaques 4 à 5 fois avec du STP puis on répartit entre les divers réservoirs, dont on mesure alors la radio-activité

dans un spectromètre à scintillation gamma.

E) Résultats a) Tri initial par liaison anticorps (SABA) contre des fractions d'IFL partiellement purifiées 152 des 240 cultures présentent une croissance des hybridomes. On recherche dans les surnageants les anticorps spécifiques de l'interféron dans le test SABA, lorsque les cultures sont confluentes à environ 20-30% (12-29 jours après la fusion). On teste parallèlement la liaison anticorps avec IFL a, IFL 8, IFL Y et IFL 6. Sur les 152 cultures, 13 surnageants présentent une liaison anticorps élevée contre toutes les quatre préparations d'interféron partiellement purifiées. Le milieu de 4 autres hybridomes présente une activité de liaison plus faible (3 à 4 fois plus forte

que la liaison non-spécifique) contre toutes les quatre pré-

parations d'interféron. On jette ces cultures. Les milieux de tous les autres hybridomes (135 cultures en croissance) donnent des liaisons non spécifiques contre toutes les quatre préparations d'IFL. Sur les 13 hybridomes spécifiques,

9 sont caractérisés comme représentatifs de l'invention.

Leur désignation est LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7,

LI-8, LI-9 et LI-12.

Comme il est clair d'après la figure 1, la liaison anticorps des 9 hybridomes spécifiques présente un

comportement différent envers les 4 préparations d'interfé-

ron partiellement purifiées. LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 et LI-8 présentent une caractérisation identique avec

la séquence de liaison suivante: IFLa< IFL6 < IFL- < IFL.

Pour LI-9 l'ordre de liaison est IFL6 < IFLy < IFLI3

LI-12 est différent de tous les autres.

b) Liaison anticorps (SABA) contre l'interféron de leucocyte hautement purifié On immobilise six espèces d'interféron purifiées (pures à > 80%) (cf étape 9 du tableau 3 de la DOS 29 47 134) par adsorption sur des plaques de microtitrage en chlorure de polyvinyle. Dans ce cas il s'agit d'IFLa 1, a2 '2 ' 2 et y3 ainsi que d'IFL-K de la lignée cellulaire KG-1 [Koeffler, H.P. et coll. Science 200, 1153-1154 (1978)3, qui est purifié par analogie avec les étapes 1 à 9 du tableau 3 de la DOS mentionnée. Comme on n'observe aucune séparation claire entre les différentes espèces dans les étapes 8 et 9, on rassemble la principale fraction avec l'activité d'inter-

féron. Elle représente donc un mélange de différentes espèces.

L'adsorption de l'interféron ( 50 Pl par dépression) s'effec-

tue pendant la nuit avec environ 0,5 ig d'interféron 'et 2 P g de SAB par ml de STP puis par un blocage des positions de

liaison protéique avec du STP à 3% comme il est dit ci-dessus.

La figure 2 montre l'anticorps qui se lie avec le milieu de culture des 9 hybridomes spécifiques contre

les 6 interférons différents purifiés. On peut encore diffé-

rencier divers groupes d'anticorps avec différents comporte-

ments de liaison caractéristiques. Le groupe 1 comprend les anticorps LI1 et LI-2, qui ont des caractéristiques de liaison identiques, mais qui ne reconnaissent pas IFLY 3 Le groupe 2 comprend les anticorps LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 et

LI-8 avec une différenciation possible de deux sous-groupes.

Le sous-groupe 2a (LI-3, LI-5--et LI-6) présente une liaison globale plus forte (figure 1 et figure 2) que le sous-groupe 2b (LI-7 et LI-8), grâce à quoi ce dernier sous-groupe se lie relativement plus fortement à 1'IFL a1 purifié et à 1'IFL-K purifié que le premier. Selon le comportement de liaison à l'interféron des anticorps restants selon la

figure 2 et la figure 3, LI-9 possède la plupart des caracté-

ristiques du sous-groupe 2b. LI-12 apparait à son tour

comme unique.

Si l'on considère le fait de la forte liaison anticorps à différents interférons purifiés, il est très peu probable que l'un quelconque de ces anticorps ne soit pas

dirigé contre l'interféron, mais contre des contaminants.

Ceci est également indiqué pour la plupart de ces anticorps par la capacité de neutraliser l'activité biologique de l'interféron. LI-l, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8 et LI-9 annulent l'inhibition de la CPE virale sur les cellules MDBK induites par l'interféron. On teste la neutralisation de l'interféron avec de 1'IFL (a) partiellement purifié

et/ou de 1'IFL-K, IFL l1, IFL a2 purifié et de l'interfé-

ron de leucocyte brut. Aucun des anticorps n'est en position de neutraliser l'interféron de leucocyte brut. LI-12 ne neutralise aucun des interférons testés (voir tableau 1 à ce

propos).

2) Isotypes des chaînes lourdes et légères des anticorps d'interférons monoclonaux Les anticorps monoclonaux du milieu de culture

d'hybridome sont tout d'abord liés à des plaques de micro-

titrage revêtues d'interféron comme il est dit ci-dessus pour le test SABA. Après lavage, on les fait incuber avec

de l'antisérum Ig anti-souris de lapin spécifique d'un iso-

type (Nordic). Pour la détection on utilise de l'IgG anti-

lapin de chèvre, que l'on marque avec de la peroxydase de

moringa. Comme substrat enzymatique, on utilise du 2,2'-

azino-di-(3-éthyl-benzothiazoline-sulfate) et du peroxyde d'hydrogène. Les résultats sont rassemblés au tableau 1, seconde colonne. Sept des anticorps testés ont les chaînes

immunoglobuliniques Yl/k, une a Y2b/k et une a P /k.

Tous les sept anticorps Yl/k ainsi que le Y2b/k neutrali-

sent l'interféron, tandis que le i/k ne neutralise pas l'interféron, comme il est de même évident d'après le tableau 1. L'aptitude des anticorps selon l'invention à se lier avec une affinité élevée aux interférons obtenus par la technologie de l'ADN recombinant est évidente d'après le

tableau 6.

3) Clonage et stabilisation des hybridomes spécifiques d'interférons Pour la préparation de lignées d'hybridome stables, on clone tous les 9 hybridomes spécifiques en limitant la dilution dans des plaques de microtitrage avec des cellules péritonéales de souris comme couche nutritive [Hengartner H. et coll. in Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81, 92-99 (1978)]. On commence le clonage au moment du transfert des cultures d'origine dans des flacons ou peu après. On teste les clones contre IFL S avec le test SABA. Les résultats de ce premier clonage des

9 hybridomes sont donnés au tableau 2.

A partir de chaque hybridome on cultive de façon inten-

sive deux à quatre clones fortement positifs et on ne se contente pas de les injecter i.p. à des souris pour la production d'ascite, mais on les congèle également. Dans la

plupart des cas on rassemble les clones choisis d'un hybrido-

me pour simplifier et réduire le travail. A partir de tous

les 9 hybridomes on obtient du liquide d'ascite pour la pro-

duction d'anticorps sur une grande échelle. Les cellules d'ascite sont de même transférées dans des cultures et congelées. 4) Groupement des anticorps selon leurs interactions avec ILH Le principal groupe des sept hybridomes, qui produit de l'immunoglobuline Y1/k, peut être divisé en deux groupes

sur la base de leur interaction d'anticorps avec les inter-

férons purifiés. Le premier groupe (LI-1 et LI-2) ne recon-

naît pas 1'IFL T3 purifié, tandis que le second groupe

(LI-3 et LI-5 à LI-8) reconnaît IFL Y3. La liaison quanti-

tative relative des anticorps monoclonaux à six interférons purifiés différents (voir-figure 2) et la différence entre anticorps neutralisants et non neutralisants donnent une information pour la différenciation de différents épitopes (déterminants antigéniques) d'ILH et pour la démonstration de différences de structure entre différents interférons purifiés. D'après le comportement de liaison des anticorps (voir figure 2) il est clair que LI-1 et LI-2 reconnaissent une structure différente de tous les autres anticorps et que IFL y3 est structuralement différent de tous les autres interférons testés, car il ne présente pas l'épitope reconnu par LI-1 et LI-2. LI-12, anticorps non neutralisant,

reconnaît avec à peu près la même affinité, bien quepeut-

être plus faible, un déterminant moins variable qui est pré-

sent chez tous les interférons testés. Les résultats quant

à la liaison anticorps et quant à la neutralisation d'inter-

féron indiquent qu'au moins trois épitopes différents d'ILH

peuvent être reconnus et définis par la collection des anti-

corps monoclonaux.

Exemple 2

Détermination de l'interféron 1) Sélection d'une paire appropriée d'anticorps monoclonaux Pour la différenciation entre la liaison spécifique de deux anticorps au même épitope et la liaison additive à divers épitopes, on teste la liaison des anticorps seuls et par paires et dans toutes les combinaisons possibles à

l'interféron immobilisé. On utilise des surnageants de cul-

tures d'hybridome confluentes sans autre purification comme source d'anticorps. On ajoute de l'interféron de leucocyte partiellement purifié (IFL $ pur à 20-30%) en quantités définies (0,1 à 0,2 pg d'interféron/ml) à des plaques de microtitrage en chlorure de polyvinyle comme il est dit dans l'exemple 1 pour le SABA. Le blocage de toutes les positions de liaison protéique avec du SAB à 3% suit. On fait incuber à la température ambiante pendant 7 h 50 pl de solution d'anticorps composée dans chaque cas de 25 pl de deux surnageants de culture ou de 2 x 25 p1 du même anticorps. On lave les plaques avec du STP-(phosphate de potassium 0,01 M, pH 7,3; chlorure de sodium 0,14 M) et on fait incuber pendant 5 h avec un excès d'immunoglobuline Ig anti-souris de mouton marqué avec 125 I dans un volume

de 50 1P par réservoir afin de mesurer la quantité d'anti-

corps monoclonaux qui sont liés à l'interféron (Tableau 3).

La liaison de deux anticorps est considérée comme additive

lorsque la liaison de ces anticorps excède celle qui se pro-

duit avec 50 P1 de l'anticorps individuel à liaison la plus forte. Sur la base de ce critère on trouve que LI-1 se lie de façon additive avec presque tous les autres anticorps et

que LI-9 donne la meilleure liaison additive avec LI-1.

On purifie LI-1 et LI-9 provenant du liquide d'ascite

selon des procédés classiques, c'est-à-dire par précipita-

tion au sulfate de sodium (saturation à 50%) et chromatogra-

phie sur DEAE-cellulose, jusqu'à au moins 90%, comme on l'évalue par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de

sodium-polyacrylamide. On marque 20 p g de chaque anti-

corps avec 125I selon le procédé de la chloramine-T à une activité spécifique d'environ 20 P Ci/ P g. On sépare l'iode libre de l'anticorps marqué par filtration sur gel

sur Sephadex G-25 en présence de STP et de SAB à 1%.

On adsorbe pendant la nuit des anticorps non marqués LI-1 et LI-9 à environ 20 g par ml de STP sur des plaques de microtitrage en PVC (Cooke Laboratory, Products Division, Dynatech Laboratories, Inc.) (100 p 1/dépression). Pendant 30 à 60 minutes on bloque toutes les positions de liaison protéique avec du SAB à 3% dans STP. On fait incuber de l'inr. terféron de leucocyte purifié de la lignée cellulaire myéloide KG-1 à une concentration de 10 unités/100 p 1 de STP et du SAB à 1% avec un des anticorps marqué avec

I (1,3 x 105cpm) dans des réservoirs revêtus d'anti-

corps. Des réservoirs témoin contiennent de l'anticorps marqué, mais pas d'interféron. Après incubation pendant 3 h à la température ambiante, on retire le liquide et on lave 4 fois lesréservoirs des plaques avec du STP puis on en déterminela radioactivité dans un spectromètre à scintillation

gamma. Les résultats sont donnés au Tableau 4. La combinai-

son de LI-1 avec LI-9 donne une liaison anticorps du type sandwich dépendant de l'interféron. La meilleure combinaison est LI-9 avec LI-1 marqué en solution. Poux cette raison

les autres expériences ont été effectuées avec Li-9 immobi-

lisé et Li-l marqué.

a) Procédé d'incubation en une étape On revêt chaque réservoir d'une plaque de microtitrage en PVC avec 100 Pl de Li-9 (15 Pg/ml dans STP) à la température ambiante pendant la nuit ou à 40C pendant des jours ou dessemaines dans une chambre humide. Avant l'emploi on retire la solution de LI-9 et on remplit les réservoirs avec du SAB à 3% pendant 30 à 60 minutes puis on lave 4 fois avec du STP. On ajoute à chaque réservoir environ 140 000 cpm de LI-1 marqué à 125I (environ 4 ng, activité spécifique environ 20 pCi/ pg) dans 0,1 ml de STP contenant du SAB a 1% et 100 à 150 mg d'IgG humaine par ml. On ajoute au

réservoir des solutions d'interféron diluées de façon corres-

pondante (1-20 pl) et on mélange en agitant brièvement.

Au bout de 2 à 3 heures d'incubation à la température ambian-

te, on verse la liqueur sur du papier d'absorption. On lave

la plaque 4 à 5 fois avec du STP et on mesurela radioacti-

vité des différents réservoirs dans un spectromètre à scin-

tillation gamma. Dans le cas de concentrations élevées d'in-

terféron (supérieures à environ 5000-6000 U/ml) une inhi-

bition partielle se produit. Les résultats obtenus sont

reproduits dans la figure 3 et le Tableau 5.

b) Procédé d'incubation à deux étapes On prépare des plaques de microtitrage en PVC revêtues

de LI-9 et saturées avec SAB comme il est dit ci-dessuS.

On fait incuber à la température ambiante pendant 30 minutes 50 P1 par réservoir d'une solution d'interféron dans le STP contenant du SAB à 1%, puis on lave les plaques 4 fois avec du STP. On ajoute alors à chaque réservoir 50 P1 de I LI-1 (environ 150 000 cpm/4 ng) PBS contenant du SAB à 1% et 150 Pg d'IgG humaine par ml, puis on maintient les plaques à la température ambiante pendant 2 h et on lave 4 fois avec du STP et on mesure la radioactivité comme il est dit ci-dessus. Les résultats obtenus sont reproduits dans la figure 4. Par opposition avec le procédé en une étape, on

n'observe pas d'inhibition partielle à une concentration éle-

vée d'interféron.

c) Détermination de l'interféron inactivé antiviral

Inactivation thermique de l'interféron.

On dilue une solution d'interféron A (Goeddel et coll., Nature vol. 290, mars 1981) dans le milieu essentiel minimum d'Eagle contenant 10% de sérum de foetus de veau au 1:480 dans du sel physiologique tamponné au phosphate (NaCl 0,14 M, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1,5 mM, KC1 3 mM, CaC12 0,9 mM, MgC12 0,5 mM) contenant 1 mg/ml de sérumalbumine de boeuf. La solution diluée contient l'interféron A à une concentration de 5 ng/ml. Après avoir chauffé à 65 C pendant les durées notées, on dispose des échantillons de 0,14 ml dans un bain glacé jusqu'à ce qu'on les dose. Les dosages antiviraux et

immunologiques sont effectués le même jour. Sur chaque échan-

tillon de 0,14 ml, on utilise 0,10 ml pour le radio-immuno-

dosage et 10 p 1 pour le dosage antiviral en double.

On procède au radio-immuno-dosage selon le procédé d'incubation en deux étapes mentionné en b). La détermination de l'activité antivirale s'effectue selon le test d'inhibition CPE. Les résultats sont donnés dans la figure 6. D'après cet exemple on peut inférer que la paire d'anticorps LI-l/LI-9 peut

distinguer entre l'interféron actif contre les virus et l'in-

tèrféron inactif contre les virus. D'après la figure 6 il est en outre évident que l'activité antivirale et l'activité

* immunitaire décroissent simultanément.

d) Détermination très sensible de l'interféron dans le plasma ou le sérum humain (procédé radioimmunologique) On procède à une seule incubation de 0,1 ml de plasma ou de sérum humain à 40% (pH neutre) contenant environ 250 000 cpm (1,5 ng) de 125I LI-1 (activité spécifique

à 110 PCi/ Pg de Li-l) à la température ambiante pen-

dant 14 à 16 h dans des plaques de microtitrage en PVC, qui sont revêtues de LI-9 comme il est dit ci-dessus. Après avoir lavé 4 fois avec du STP, on numérote les réservoirs comme il

est dit ci-dessus. On procède à une expérience avec l'inter-

féron, que l'on ajoute à du plasma au citrate d'un volontaire

en bonne santé. Chaque volume de 0,1 ml de mélange expérimen-

tal de STP contient 40 1l de plasma, 1,3 ng de 125 LI-1

(256 000 cpm) et différentes quantités d'interféron de leuco-

cyte humain brut (pur à environ 0,1%) à partir de cellules

de leucémie myéloïde chronique. Les résultats sont repro-

duits dans la figure 5, o la quantité d'interféron est notée en abcisse. Le milieu d'incubation selon l'étape 1

du Tableau 3 de la DOS ne 29 47 134 est utilisé comme inter-

féron de leucocyte brut.

Exemple 3

Détermination très sensible de l'interféron dans le sérum des malades (procédé immuno-enzymatique) Dans le nombre correspondant de tubes à essais (10 x 75 mm) on introduit dans chaque caS avec une pipette 0,05 ml de solution expérimentale (0,1 mole/litre de phosphate de sodium, pH 6,5 avec 10 g/litre de SAB et 0,5 Pg/ml de conjugué LI-1 monoclonal antiinterféron-peroxydase dans du sérum humain dépourvu d'interféron), 0,2 ml de plasma du malade à analyser ou du standard d'interféron (0 U/ml, 12,5 U/ml, 25 U/ml et 50 U/ml d'interféron) et du sérum témoin d'interféron (p. ex. 30 U/ml d'interféron) y sont mélangés, dans chaque cas on ajoute une perle de polystyrène (0 = 6,5 mm) revêtue d'anti-interféron LI-9 monoclonal

et que l'on fait incuber à la température ambiante (18-

C) pendant 16 heures. Ensuite, on lave la perle de

polystyrène 3 fois avec à chaque fois 2 à 5 ml d'eau distil-

lée, on la transfère dans à chaque fois 0,5 ml de tampon substrat pour la détermination de l'activité de la peroxydase (0,1 mole/litre de tampon au citrate de potassium à pH 5,0

avec 6 mmoles/litre de H202 et 20 mmoles/litre de o-phénylène-

diamine) et on fait incuber à la température ambiante

(18-26 C) pendant 30 minutes. Afin d'arrêter l'activité peroxy-

dante ainsi que pour intensifier l'absorption de lumière, on mélange 0,5 ml de HC1 4 N et pendant 30 minutes on mesure

l'extinction par photométrie à une longueur d'onde de 492 nm.

Le Tableau présente les valeurs d'une détermination d'inter-

féron comparées avec les valeurs qui ont été obtenues avec

le standard d'interféron. On utilise comme standard d'inter-

féron l'interféron de leucocyte brut (milieu d'incubation

selon l'étape 1 du Tableau 3 de la DOS 29 47 134).

Table au

Matière échantillon &E492 nm/RT/30 min. Standard d'interféron 0 U/ml d'interféron 0O065 / 0,070 12,5 U/ml " 0245 / 0,235 U/ml " 0425 / 03430 U/ml " 0X775 0,790 Sérum témoin (30 U/mldinterferon 0>505 / 0O490 Plasma du malade No 8327 O U/ml'interféron No 8328 O U/ml'interféron No 8336 9 U/ml interferon No 8338 O U/ml'interferon No 8339 5 U/ml'interféron No 8363 O U/m 'interféron No 8341 2 U/mÈ'interféron No 8344 16 U/me'interferon i

Exemple 4

Purification de l'interféron de leucocyte obtenu par la technologie de l'ADN recombinant (Interféron A, cf Goeddel

et coll., Nature vol. 20, mars 1981).

a) Pré-purification de l'interféron de leucocyte humain obtenu par la technologie de i'ADN recombinant Toutes les étapes s'effectuent à 4 C. On fait éclater

des cellules bactériennes congelées (1 kg) en les désinté-

grant par pression. On traite l'extrait selon le procédé

classique, c'est-à-dire par précipitation à la polyéthylèn-

imine (polymine P) et au sulfate d'ammonium, suivie par une dialyse du précipité de sulfate d'ammonium à 65% contre Tris HC1 25 mM, pH 7,8; thiodiglycol 0,01%; Triton X-100 0,1%; fluorure de phényle 10 p M. Une centrifugation suit

pour retirer les constituants insolubles.

b) Préparation de l'immunoadsorbant Par analogie avec l'exemple 2, on dialyse une solution d'anticorps purifiée contenant LI-8 à la température ambiante contre un tampon carbonate de sodium 0,2 M/chlorure de sodium 0, 3 M. On centrifuge la solution dialysée à 20 OOO g pendant minutes afin de retirer la matièr insoluble. On ajuste la concentration protéique à environ 25 mg/ml avec le tampon mentionné ci-dessus. On lave 3 fois l'Affi-gel 10

(Laboratoires BioRad, Richmond, Californie) avec de lliso-

propanol glacé sur un filtre en verre fritté puis on lave 3 fois avec de l'eau distillée glacée. On transfère le gel dans des tubes à essais en plastique et on sédimente par une brève centrifugation. On aspire le surnageant. On mélange le gel avec un volume égal de solution d'anticorps purifiée et on renverse à 4 C pendant 5 h. Après la réaction, on centrifuge le gel puis on le lave 2 fois avec un tampon (NaHCO3 0,1 M/NaCl 0,15 M) afin de retirer l'anticorps non lié. La détermination protéique de l'eau de lavage combinée

montre qu'environ 24 mg d'anticorps sont liés par ml de gel.

c) Purification par chromatographie d'affinité de l'inter-

féron de leucocyte prépurifié obtenu par la technologie de l'ADN recombinant On introduit la solution obtenue dans l'étape a) (700 ml contenant 37 g de protéine) à raison de 50 ml/h sur la colonne

immuno-absorbante (2,5 x 3,5 cm; 17 ml de volume de lit conte-

nant environ 400 mg d'anticorps monoclonal purifié Li-8) équilibrée avec STP. On lave la colonne avec 20 volumes de colonne de tampon (NaCl 0,5 M; Tris.HCl 0,02 M, pH 7, 5; Triton X-100 0,2%), puis on lave la colonne avec 5 volumes de colonne de NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% puis on élue avec de l'acide acétique 0,2 M, NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% (pH 2,5). On élue l'activité d'interféron dans environ ml à une concentration moyenne d'environ 1 mg de protéine par ml. On ajuste cette solution à pH 4,5 avec une base Tris

1 M et on dilue 4 fois avec de l'eau. On introduit l'échantil-

lon dans une colonne de carboxyméthylcellulose (CM 52 Whatman) (1,3 x 3 cm), que l'on équilibre avec de l'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 5,0). On lave la colonne avec 20 ml d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 5,0) et on élue l'interféron avec 20 ml

d'acétate d'ammonium 0,5 M (pH 5,0). Le résultat de la puri-

fication est reproduit au Tableau 7.

On peut purifier l'interféron A de manière analogue et avec un rendement comparable avec les anticorps Li-3, LI-5,

LI-6, LI-7 et LI-9.

Tableau 1

- 23 -

Table 2

Culture Cellules pour Clones testés Nombre Nombre Culture Nombre N mr 96 "réservoir ou "réservoirs" positifs négatifs

LI-1 100 6 6 O

LI-2 100 11 6 5

LI-3 100 7 7 O

LI-5 100 13 13 O

LI-6 100 12 12 O

LI-7 100 10 8 2

LI-8 100 9 8 1

LI-9 100 10 8 2

] LI-12 100 4 O 4

LI-12 300 48 6 42

Tablgu, 3 r.,I-! LI-2 LI-3 LI-5 LI-6 LI-7 I-O LI-9 LI-12

LI-1 15800 14980 17620 17730 15950 17670.17970 19550 18260

LI-2 11080 15120 16750 14570 16440 163.50 16250 3.54rO

LI-3 1160ô 13440 10320 11900 13270 9710 15490

*,.. _ I 1,... ',

LI-5 13640 11690 13230, 14720 11820 16710

_...,,,..... ,._ _!..

LI-6.., 7300 10290 10060 6540 122,10

LI-7 j.. 12090 1.3480 8630 146130

_1_..._ , _,,

LI-8 14700 10270 1768 0

i.-- ___________________________L."--

L1-9..4900 10870

LI-12: 99,10

_, _,,,. ,, ,,.

4' tn oN I lm,, LA Tableau 4 cm.. Combinaison d'anticorps Liaison anticorps marquée à 125I (cpm) Anticorps en Anticorps marqué avec nterfron sans liaison avecinterferon sans, liaison phase solide à 125I (10 U) interferon spécifique specifique

LI-1 LI-9 922 440 482

LI-9 LI-1 2465 251 2208

uLn eN

- 26 -

TableaU 5

Espèce d' Unités d' l iaif Interféron Interféron CPM[ I]LI-1 par détermination a1 100 2 202 a2 100 1633

I3â 100 822

02 100 8 135

Yi 100 7 036

Y2 100 4 804

Y3 100 101

4 O100 198

T5 100 121

6 - 100 5 498

Tableau 6

Anticorps Interféron A B

LI-1 LI-3 LI-5 LI-6 LI-7 LI-8 LI-9

+ + + + + + + + D + + + F + + + _ Légende:

Les interférons désignés par A-F sont ceux qui sont obte-

nus par la technologie de l'ADN recombinant et décrits dans la publication de-David. V. Goeddel et coll. dans Nature vol. 290, mars 1981. Un + signifie qu'un interféron donné est complètement absorbé, un + partiellement absorbé et un - non absorbé par les colonnes chargées avec l'anticorps respectif.

Tableau 7

lActivité Actvité Facteur de Rendemen Volume Protéine totale totale Specifhue Purification Etape (ml) (mg) (unités) (unités/mg) (%) /mg) Précipitation de 700 37 100 7X4 x 109 2 X 105 1,0 100 sulfate d'ammonium Lot. de la colonne 30 30 7 x 10 2,3 x.108 1150 95 d 'anticorps CM-52 20 20 6 x 10 3 x 10 1500 81

On détermine l'activité spécifique selon le procédé d'inhibition CPE mentionné ci-

dessus. Selon l'électrophorèse sur gel dodécylsulfate de sodiumpolyacrylamide l'interféron après l'étape d'immunoadsorption est pur à plus de 90%. Selon la

colonne CM-52 il apparaît pratiquement homogène.

r C r' uti LM 4N

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Collection d'anticorps monoclonaux, caractérisée en ce que ses éléments sont dirigés contre l'interféron de

leucocyte humain (ILH) naturel ou obtenu par la technolo-

gie de l'ADN recombinant. 2. Collection selon la revendication 1, caractérisée en ce que les anticorps monoclonaux sont sécrétés par différents hybridomes. 3. Cqllection selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'elle consiste en groupes d'anticorps, qui diffèrent l'un

de l'autre dans leurs isotypes.

4. Collection selon la revendication 2, caractérisée en ce que 8 anticorps sont d'isotype IgG et un anticorps est

d'isotype IgM.

5.Collection selon la revendication 3, caractérisée en ce que sur les 8 anticorps de type IgG 7 ont une chaîne lourde T1 et une a une chaîne lourde Y 2b 6 Collection selon la revendication 1, caractérisée en ce que les divers anticorps monoclonaux ne sont pas mutuellement inhibants, c'est-à-dire se lient ensemble à l'ILH, tandis que d'autres sont mutuellement inhibants, c'est-à-dire ne se

lient pas ensemble à 1'ILH.

7. Collection selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle consiste en groupes d'anticorps, dont les éléments reconnaissent différents épitcpes (déterminants antigéniques d'ILH). 8. Collection selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un anticorps de la collection ne reconnaît

pas ILH y3.

9. Collection selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'un anticorps (IGM) ne neutralise-pas l'activité

antivirale d'ILH.

10. Application d'un élément de différents groupes d'anticorps selon la revendication 7 pour un test

sandwich en phase solide pour ILH.

11. Application selon la revendication 10, caractérisée en que l'anticorps non immobilisé est marqué par radioactivité

ou avec une enzyme.

12. Application d'un anticorps selon la collection de la revendication 1 à la purification d'ILH naturel ou obtenu

par la technologie de l'ADN recombinant.

13. Procédé de purification de l'ILH naturel ou de l'ILH obtenu par la technologie de 1'ADN recombinant, caractérisé en ce qu'on purifie une matière première contenant ILH par

chromatographie d'affinité en utilisant un anticorps mono-

clonal de la collection selon l'une quelconque des revendi-

cations 1-9.