NL8200786A

NL8200786A - Antilichamen tegen proteine.

Info

Publication number: NL8200786A
Application number: NL8200786A
Authority: NL
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1981-02-27
Filing date: 1982-02-26
Publication date: 1982-09-16
Also published as: AU6984487A; AU8077282A; FR2500754B1; DE3206743A1; AU590688B2; GB2160544B; NZ199833A; PH18323A; SE9000931D0; IT8219854A0; IT1150201B; GB8504271D0; SE9000931L; IE52269B1; ATA74082A; CA1213226A; GB2111527B; AU561649B2; FR2500754A1; GB2160544A

Description

I ί t N.0. 30771 1

Antilichamen tegen proteïne.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op antilichamen tegen proteïne en wel tegen natuurlijke en door de recombinatie DNS-techniek verkregen menselijke leukocyten-interferons (HLI), HLI is mogelijkerwijze een waardevol therapeuticum voor de behan-5 deling van neoplastische ziekten en virusziekten. De evaluatie van deze stof en de mogelijke ontwikkeling ervan tot een wijd verbreid geneesmiddel wordt door de moeilijkheid, de werkzame stof op de vereiste wijze te zuiveren en te karakteriseren, beïnvloed. Voor de gewenste zuivering en de vereiste karakterisering van HLI zou een proef, die in min-10 der dan 24 uren zou kunnen worden uitgevoerd, een waardevol hulpmiddel zijn.

In het kader van de onderhavige uitvinding werd nu gevonden, dat voor het zuiveren en bepalen van HLI op uitstekende wijze een verzameling van monoklonale antilichamen geschikt is, die tegen natuurlijke of 15 door recombinatie DNS-techniek verkregen leukocyten-interferons gericht zijn.

De onderhavige uitvinding heeft dientengevolge betrekking op een verzameling van monoklonale antilichamen, die daardoor gekenmerkt is, dat de leden ervan tegen natuurlijke of door recombinatie DNS-techniek 20 verkregen menselijke leukocyten-interferons (HLI) gericht zijn. Onder een verzameling dienen hierbij zowel het totaal van de antilichamen, als ook de afzonderlijke leden ervan verstaan te worden.

Volgens een bijzonder aspect van de onderhavige uitvinding worden de monoklonale antilichamen door verschillende hybridomen afgeschei-25 den.

In het kader van de onderhavige uitvinding is gebleken, dat afzonderlijke monoklonale antilichamen elkaar wederzijds niet remmen, d.w.z. gemeenschappelijk aan HLA binden, terwijl andere elkaar wederzijds remmen, d.w.z. niet gelijktijdig aan HLI binden. Voorts is gebleken, dat 30 de verzameling uit groepen van monoklonale antilichamen bestaat, waarvan de leden verschillende epitopen (antigene determinanten) van HLI herkennen.

Een bijzonderheid van de verzameling monoklonale antilichamen volgens de onderhavige uitvinding bestaat daarin, dat tenminste een anti-35 lichaam HLI^3 niet herkent.

In het kader van de onderhavige uitvinding is voorts gebleken, dat de hiervoor vermelde verzameling uit een groep antilichamen bestaat, die zich van elkaar in hun isotypen onderscheiden. 8 Antilichamen tonen 8200786 ï ï 2

IgG-struktuur, waar tegenover.een IgM-struktuur toont.Van de 8 antilic-hamen met IgG-struktuur hebben 7 een zware keten en een2¾ zware keten.

Een verdere bijzonderheid van de verzameling van monoklonale anti-5 lichamen volgens de onderhavige uitvinding bestaat daarin, dat een an-tilichaam (IgM) de antivirusactiviteit van menselijk leukoeyten-inter-feron niet neutraliseert.

Zoals reeds vermeld wordt de verzameling van deze monoklonale an-tilichamen o.a. daardoor gekenmerkt, dat zij uit groepen van antilicha-10 men bestaat, waarvan de leden verschillende epitopen van HLI herkennen. Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft dientengevolge betrekking op de toepassing van telkens een lid van deze groep van anti-lichamen voor een vaste fase-sandwichproef voor HLI. Bij de hiervoor vermelde sandwichproef wordt een antilichaam van een geschikt etiket 15 voorzien. Hiertoe komt elk hiervoor geschikt etiket in aanmerking, evenwel wordt aan een radio-actief of een enzymetiket de voorkeur gegeven.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op de toepassing van een antilichaam uit de hiervoor vermelde verzameling 20 voor de zuivering van HLI. De zuivering van HLI door middel van het monoklonale antilichaam heeft bij voorkeur plaats door affiniteitschroma-tografie. Hierbij moet voor een zuivering op commerciële maatstaf de affiniteit voldoende groot zijn, opdat het interferon ook bij grote volumina, die met niet te kleine snelheid door de kolom stromen, prak-25 tisch kwantitatief tegengehouden wordt. Met een enkel antilichaam is dit niet voor alle soorten (onderklassen) van interferon mogelijk. Hiertoe is bijzonder een verzameling van monoklonale antilichamen geschikt, waarvan de afzonderlijke leden tegen afzonderlijke onderklassen van interferon grote affiniteiten bezitten.

30 De bereiding van de monoclonale antilichamen heeft volgens een op zichzelf bekende celfusietechniek plaats, waarbij myeloomcellen met miltcellen van muizen, die met HLI geïmmuniseerd werden, samengesmolten worden. De verkregen hybridomen scheiden monoklonale antilichamen af tegen natuurlijke of door recombinatie DNS-techniek verkregen leukocy-35 ten-interferons.

De uitvoering van de vaste fase-sandwichproef voor de bepaling van HLI kan volgens op zichzelf bekende methoden plaats hebben, evenwel kon een aanzienlijke vereenvoudiging worden gevonden, doordat in tegenstelling tot de bekende vaste fase-sandwichmethode, niet gemerkte en ge-40 merkte antilichamen vanaf het begin gemeenschappelijk en slechts een 8200786 * i 3 maal geïncubeerd worden.

De zuivering van HLI door middel van een monoklonaal antilichaam kan volgens op zichzelf bekende wijzen plaats hebben, waarbij de affi-niteitschromatografie bijzonder geschikt gebleken is. Bij deze affini-5 teitschromatografie wordt bij voorkeur Affi-gel 10 (BioRad Laboratories, Richmond, Californië) als drager toegepast.

Verrassenderwijze is. gebleken, dat volgens de vaste fase-sandwich-methode volgens de onderhavige uitvinding menselijk leukocyten-interfe-ron tot een concentratie van 2 eenheden/ml in serum aantoonbaar is.

10 Anderzijds is gebleken, dat met een monoclonaal antilichaam vol gens de onderhavige uitvinding door recombinatie DNS-techniek verkregen menselijk leukocyten-interferon op eenvoudige wijze zodanig gezuiverd kan worden, dat het voor klinische proeven toepasbaar is.

De volgende voorbeelde lichten de uitvinding toe.

15 Voorbeeld 1.

Bereiding van de monoklonale antilichamen.

A) Interferonpreparaten.

Ten dele gezuiverd menselijk leukocyten-interferon (IFL) was in voldoende hoeveelheid voor het immuniseren van de muizen aanwezig. 5 20 IFL-preparaten worden toegepast: a) IFL (a) hoofdpiek van de fractie volgens trap 8 van tabel 3 van DOS nr. 2.247.134 met een benaderde zuiverheid van 10-15% (geschat door natriuradodecylsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese) en specifieke activiteit in de antivirusproef; 25 b) IFL «; c) IFL β; d) IFL jf; en e) IFL (f.

IFL a, 3 en J^frakties bestaan elk uit mengsels van de afzonderlijke (ccjj 82)» C0x» &2» &3^ en (ƒ!» (Ti» <T3» (f5) soorten. Dit zijn schouderfrakties van de overeenkomstig gezuiverde soorten, die van verschillende preparaten bijeen gebracht worden (ver-30 gelijk trap 9 van tabel 3 van het hiervoor vermelde DOS). De IFLtffrak-tie stelt de schouder voor van de (f-soort. Naast de soorten a, 3 en aan de lichosorb-diolkolom (vergelijk trap 8 van tabel 3 van het hiervoor vermelde DOS) laat zich zo nu en dan een (f-fraktie zien. Deze wordt zoals bij trap 9 volgens tabel 3 van het hiervoor vermelde DOS 35 gezuiverd, waarbij blijkt, dat de soort (f geen ondersoorten laat zien en homogeen is. De zuiverheid van b), c) en d) ligt tussen 20 en 40% volgens specifieke biologische activiteit en volgens natriumdodecylsul-faat-polyacrylamide-gelelektroforese. De zuiverheid van e) is ten hoogte 5%.

40 Bepaling van interferon-activiteit.

8200786 4

De interferon-activiteit wordt door middel van de "cytopathic-ef-fect-inhibition" (CPE) proef volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.241.174 bepaald.

B) Imminusering van de muizen.

5 3 acht weken oude vrouwelijke muizen van het type balb c/J worden eerst met IFL )^(a) in het volledige toevoegsel volgens Freund geïmmuniseerd. Elke muis ontvangst ongeveer 150/ug totaalprotelne, dat 20-25 /ug interferon in 0,25 ml op 5 verschillende plaatsen ontvangt (0,05 ml op elke plaats): subkutaan in de linker en rechter liesstreek en in 10 de linker en rechter schouderstreek alsmede een intraperitoneale injectie.

53 dagen later wordt een tweede immunisering als volgt uitgevoerd: interferon IFL ^(a) wordt door preparatieve natriumdodecylsulfaat-poly-acrylamide (15%) gel elektroforese in drie cylindervormige gelen van 15 0,6 x 11 cm gescheiden. Ongeveer 300 /ug totaalprotelne in 0,3 ml (gedialyseerd tegen monsterbuffer), dat ongeveer 40-50ƒug interferon bevat, worden per gel toegevoegd. [Deze zuivering heeft in hoofdzaak plaats volgens de methode van Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685]. Na de elektroforese worden de gelen in schijven met een dikte 20 van 2 mm gesneden. Deze worden gedurende 10 minuten in 0,5 ml van een met fosfaat gebufferde keukanzoutoplossing (0,01 mol kaliumfosfaatbuf-fer, pH 7,3; 0,14 mol natriumchloride), die 0,1% triton X-100 bevat in propeenbuisjes gedompeld. De buffer wordt in een verdunningsreeks volgens de CPE-remmingsproef op interferonactiviteit onderzocht. De schij-25 ven 6 en 7 (genummerd vanaf het onderste einde van elke gel) laten de hoogste interferonactiviteit zien (elk ongeveer 25% van de activiteit van de totale gel). Telkens een schijf met de hoogste activiteit wordt met een scheermesje op een glasplaat klein gesneden, in een injectiespuit van 1 ml, die 0,2 ml 0,15 molair natriumchloride bevat, overge-30 bracht en bij elke muis ingespoten. De gelsuspensie wordt intraperito-niaal geïnjecteerd, waarna 0,2 ml BCG (Bacillus Calmette-Guérin; Serum-instituut Bern) geïnjecteerd wordt.

Na 12 dagen wordt het serum van elke muis op intraferon-neutrali-satie activiteit onderzocht. Het serum van muis nr. 3 toont een 50%'s 35 neutralisatie van 10 eenheden/ml van IFG^a) bij een verdunning van 1:72000, neutraliseert echter dezelfde concentratie van onzuiver IFL ( 0,1% zuiverheid) zelfs bij een verdunning van 1:100 niet. De muizen nrs. 1 en 2 laten een neutraliseitstiter zien van minder dan 1:1000 tegen IFL^(a).

40 70 Dagen na de tweede immunisering ontvangt muis nr. 3 op drie op- 8200786 α « 5 eenvolgende dagen een intraperitoneale Booster-injectie met een mengsel van IFL α, β en dat ongeveer 50/ug interferon en 15/ul normaal muizenserum als dragerproteïne (in 0,2 ml 0,15 molair natriumchloride) bevat. 48 Uren na de laatste injectie wordt de muis gedood en wordt de 5 milt ter bereiding van de monoklonale antilichamen verwijderd.

G) Celkweken en celfusies.

De volgende materialen en media worden toegepast. Iscove's Modificatie van Dulbecco’s gemodificeerd Eagle-Medium (IMDMEM) is bij Gibco verkrijgbaar. Het wordt in verse toestand aangevuld met (natriumpyru-10 vaat (1 mmol), glutamine (1,5 mmol), 2-mercaptoethanol (5 x 10“^mol), penicilline (100 eenheden/ml) en streptomycine (100/ug/ml). Volledig HAT medium bestaat uit aldus aangevuld IMDMEM alsmede hypoxanthine (10”Vol), aminopterine (4 x 10“^mol), thymidine (1,5 x 10“^mol) en 15% foetaal kalfsserum. Een 50%Ts gew./vol. oplossing 15 van polyethyleenglycol 4000 (PEG 4000, Merck) wordt in IMDMEM bereid.

De fusie met een niet producerende tegen azaguanine resistente myeloomcellijn wordt met kleine modificaties volgens de methode van Stëhli c.s. in J. Immunol. Methods 32, 297-304 uitgevoerd. Bij deze fusie worden 48 x 10® kern bevattende miltcellen met 25 x 10® mye-20 loomcellen van de lijn F0 (Fazekas de St. Groth en Scheidegger in J.

Immunol. Mathods 35, 1-25 (1980)) verenigd. De miltcellen en myeloom-cellen worden in serumvrij IMDMEM gewassen. Zij worden vervolgens in hetzelfde milieu opnieuw gesuspendeerd, in de hiervoor vermelde verhouding voor de fusie gemengd en in 40 ml serumvrij IMDMEM in een konische 25 polypropeenbuis van 50 ml bij 200 x G gedurende 15 minuten gesedimen-teerd, gevolgd door volledig afzuigen van de bovenstaande laag. Aan het celsediment wordt onder krachtig roeren druppelsgewijze 0,5 ml 50%'s PEG 400Q toegevoegd om de cellen opnieuw te suspenderen en te verdelen.

Na ongeveer 90 seconden worden bij kamertemperatuur onder voortdurend 30 roeren gedurende 4-5 minuten 10 ml serumvrij IMDMEM druppelsgewijze toegevoegd. Na nog eens 15 minuten zonder roeren worden grote celklon-ten door voorzichtig pipetteren met een pipet van 10 ml afgescheiden.

Het fusiemengsel wordt met volledig HAT medium op 250 ml verdund en dan in de 240 "Costar cluster wells (1 ml/well)” gebracht, die reeds 1 ml 35 compleet HAT medium en 10^ peritoneale muiscellen als voedingslaag bevatten. De kweken worden In een 5%'s Οθ£/95% luchtatmosfeer bij een vochtigheid van 85% gelncubeerd. De kweken worden twee maal per week door vervanging van het halve medium (1 ml) met vers HAT medium gevoed.

40 D) Ontdekken van interferon specifieke hybridomen door een vaste 8200786 6 fasen-antilichaambindingsproef (SABA).

Deze methode is aangepast aan het door Catt en Tregear [Science 158 (1967) 1570-1572] beschreven principe en is geschikt voor het bepalen van hybridoom-antilichamen (zie ook Stahli c.s. in J. Immunol.Me-5 thods 32, (1980) 297-304 alsmede Kennet, R.H. in Current Topics in

Microbiology and Immunology, 81, (1978) 77-91. Interferonpreparaten van IFL a, 3, ^en ζworden individueel in polypropeenbuisjes met fosfaat gebufferde keukenzoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van ongeveer 0,2 tot 0,5 /ug interferon/ml (ongeveer 1-3 /ug totaalproteïne 10 per ml; uitgezonderd voor IFL , waarbij ongeveer 10-15/ug van het totale proteïne per ml aanwezig zijn) verdund, om daarmee polyvinylchloride microtiterplaten (Cooke Laboratory Products Division, Dynatech Laboratories, Ine.) zoals bij StShli c.s. loc.cit. te bekleden. 50/ul van de interferonoplossing wordt in elke verdieping gebracht en gedu-15 rende tenminste vier uren bij kamertemperatuur in een bevochtigde ruimte bewaard of gedurende enkele weken op 4°C gehouden. Voor het gebruik worden de verdiepingen met 3%’s runderserumalbumine (BSA) in PBS gevuld en gedurende 30 tot 60 minuten bewaard om alle proteïnebindingsplaatsen te blokkeren. De platen worden daarna vier maal met PBS gewassen.

20 50/ul van de bovenstaande laag van de hybridoomkweken worden in tel kens twee verdiepingen gedurende tenminste 4 uren bij kamertemperatuur geïncubeerd. Controleproeven (niet specifieke binding) worden bij platen uitgevoerd, die slechts-met 3%’s BSA bekleed zijn. Na vier maal wassen met PBS. wordt aan elke verdieping 50/ul schaap-anti-muis 25 Ig-antilichamen (door1 affiniteitschromatografie gezuiverd en met 125 j gemerkt; 500000 tot 100000 cpmper 20 tot 30 ng antilicha-men in PBS bevattend 1% BSA) gebracht en gedurende tenminste 4 uren bij kamertemperatuur geïncubeerd. De platen worden vier maal tot vijf maal met PBS gewassen.en daarna in de afzonderlijke verdiepingen gesneden, 30 die dan in een gamma-scintillatie-spectrometer op radioactiviteit worden onderzocht.

E) Resultaten.

a) Initieel vergelijkend onderzoek door antilichaambinding (SABA) tegen ten dele gezuiverde IFL fracties.

35 152 van de 240 kweken vertonen groei van hybridomen. De boven staande lagen worden op interferon specifieke antilichamen bij de SABA proef onderzocht, wanneer de kweken ongeveer voor 20-30% samenvloeiend zijn (12-29 dagen na de fusie). Antilichaambinding wordt parallel onderzocht met IFL a, IFL 3, IFL £ en IFL(f. Van de 152 kweken laten 13 40 bovenstaande lagen een grote antilichaambinding zien tegen alle vier 8200786 7 ten dele gezuiverde interferonpreparaten. Het medium van vier andere hybridomen laat een geringe bindingsactiviteit zien (3-4 maal groter dan de niet specifieke binding) tegen alle vier interferonpreparaten. Deze kweken worden verwijderd. De media van alle andere hybridomen (135 5 groeiende kweken) geven niet specifieke bindingen tegen alle' vier IFL preparaten. Van de 13 specifieke hybridomen worden voor de onderhavige uitvinding 9 representatieve gekenmerkt. Hun aanduiding is LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8, LI-9 en LI-12.

Zoals uit figuur 1 blijkt laat de antilichaambinding van de 9 spe- 10 cifieke hybridomen aan de vier ten dele gezuiverde interferonpreparaten een verschillend gedrag zien. LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 en LI-8 tonen een identiek kenmerk met de volgende bindingsreeksvolgorde: IFL α IFL cf IFL ^ £. IFL 0. Voor LI-9 is de bindingsvolgorde IFL IFL ^ IFL 0. LI-12 is verschillend van alle overige.

15 b) Antilichaambinding (SABA) tegen sterk gezuiverd leukocyten-in- terferon.

Zes gezuiverde (>80% zuiver) interferonsoorten (zie trap 9 van. tabel 3 van DOS 2.947.134) worden door adsorptie aan polyvinylchloride microtiterplaten geïmmobiliseerd. Het gaat daarbij om IFL a^, 02» 20 #2» yi en <j^3' alsmede om IFL-K van de cellijn KG-1 [Koeffler H.P. c.s. Science 200 (1978) 1153-1154, die in analogie aan de trappen 1 tot 9 van tabel C van het hiervoor vermelde DOS gezuiverd wordt. Omdat in de trappen 8 en 9 geen duidelijke scheiding in individuele soorten was waar te nemen, werd de hoofdfractie met de interferonactiviteit 25 verenigd. Deze stelt derhalve een mengsel van verschillende soorten voor. De adsorptie van interferon (50/ul/per verdieping) wordt een nacht bij ongeveer 0,5yug interferon en 2/ug BSA per ml PBS gevolgd door afweren van de protelnebindingsplaatsen met 3%’s BSA zoals hiervoor beschreven, uitgevoerd, 30 De antilichaambinding met cultuurmedium van de 9 specifieke hybri domen tegen de 6 verschillende, gezuiverde interferons wordt in figuur 2 getoond. Er kunnen wederom verschillende groepen van antilichamen met verschillend kenmerkend bindingsgedrag onderscheiden worden. De groep 1 omvat de antilichamen LI-1 en LI-2, die identieke bindingskenmerken

35 hebben, die echter IFL ^3 niet herkennen. De groep 2 omvat de antilichamen LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 en LI-8 met een mogelijk onderscheid van twee subgroepen. Subgroep 2a (LI-3, LI-5 en LI-6) laat overal een grotere binding zien (figuur 1 en figuur 2) dan subgroep 2b (LI-7 en LI-8), waarbij de laatste subgroep relatief sterker aan gezuiverd IFL

40 ctj en IFL-K bindt dan de eerste. Volgens het interferonbindingsgedrag 8200786 8 van de achterblijvende antilichamen volgens figuur 2 en figuur 3 heeft LI-9 de meeste kenmerken van de subgroep 2b. LI-12 lijkt wederom als zodanig uniek te zijn.

Met het oog op het feit van de sterke antilichaambinding aan ver-5 schillend gezuiverde interferonen is het zeer onwaarschijnlijk, dat een of ander van deze antilichamen niet tegen interferon, maar tegen conta-minanten gericht zou zijn. Dit wordt voor de meeste van deze antilichamen ook door het vermogen getoond, de biologische activiteit van interferon te neutraliseren. LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8 en 10 LI-9 heffen de door interferon teweeg gebrachte remming van de virale CPE aan MDBK-cellen op. De interferon neutralisatie wordt met ten dele gezuiverd IFL ^(a) en/of gezuiverd IFL-K, IFL ^j, IFL 03 en onzuiver leukocyten-interferon onderzocht. Geen van de antilichamen was in staat onzuiver leukocyten-interferon te neutraliseren. LI-12 neutra-15 liseert geen van de onderzochte interferons (vergelijk hiertoe tabel A). Het vermogen van de antilichamen volgens de uitvinding door recom-binatie DNS-techniek verkregen interferons met sterke affiniteit te binden, blijkt uit tabel F.

2) Isotypen van de zware en lichte ketens van de monoklonale in-20 terferon-antilichamen.;

Monoklonale antilichamen van hybridoom-cultuurmedium worden eerst aan met interferon beklede microtiterplaten gebonden, zoals dit hiervoor voor de SABA proef beschreven werd. Na het wassen worden zij met isotype-specifiek konijnen anti-muis Ig antiserum (Nordic) geïncubeerd. 25 Voor het aantonen wordt geiten anti-konijnen IgG toegepast, dat met mierikwortel-peroxidase gemerkt is. Als enzymsubstraten worden 2,2,-amino-di-(3-ethylbenzothiazo.linesulfaat) en waterstofperoxide toegepast. De resultaten zijn in tabel A, tweede kolom, samengevat. Zeven van de onderzochte antilichamen hebben' de immunoglobulineketen j/^/k, 30 een ^ 2^/k en een /u/k. Alle zeven j^/k antilichamen als ook het ^j^b/k neutraliseren interferon, waartegen het /u/k interferon niet neutraliseert, zoals eveneens uit tabel A blijkt.

3) KLoonvormingen en stabiliseren van de interferon specifieke hybridomen.

35 Voor de bereiding van stabiele hybridoomlijnen worden alle 9 spe cifieke hybridomen door beperkende verdunning in microtiterplaten met muis-peritoniale cellen als voedingslaag tot kloonvorming gebracht [Hengartner H. c.s. in Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, (1978) 92-99]. De kloonvorming werd op het tijdstip van de over-40 dracht van de oorspronkelijke kweken in flessen of kort daarna begon- 8200786 9 nen. De klonen, werden met de SABA proef tegen IFL (3 onderzocht. De resultaten van deze eerste kloonvorming van de 9 hybridomen wordt in tabel B getoond.

Van elk hybridoom worden twee tot vier sterk positieve klonen ver-5 edeld en zowel i.p. in muizen geïnjecteerd voor ascites produktie als ook ingevroren. In de meeste gevallen worden de uitgekozen klonen van een hybridoom ter vereenvoudiging en vermindering van het werk samengevoegd. Van alle 9 hybridomen verkrijgt men ascites vloeistof voor de produktie van antilichamen op grote schaal. Ascites-cellen worden even-10 eens in kweken overgebracht en ingevroren.

4) Groepering van de antilichamen volgens hun onderlinge inwerking met HLI.

De hoofdgroep van de zeven hybridomen, die J^i/k immunoglobuline voortbrengen, kan in twee. groepen worden onderverdeeld op grond van hun 15 antilichaam-wisselwerking met gezuiverde interferons. De eerste groep (LI-1 en LI-2) herkent gezuiverd IFL ^3 niet, waar tegenover de tweede groep (LI-3 en LI-5 tot LI-8) IFL ^3 herkent. De relatieve, kwantitatieve binding van de monoklonale antilichamen aan zes verschillende, gezuiverde interferons (vergelijk figuur 2) en het verschil tus-20 sen neutraliserende en niet neutraliserende antilichamen levert informatie voor het onderscheiden van verschillende epitopen (antigeenachtige determinanten) van HLI en voor het aantonen van strukturele verschillen tussen verschillend gezuiverde interferons. Uit het bindings-gedrag van de antilichamen (vergelijk figuur 2) is duidelijk, dat LI-1 25 en LI-2 een andere struktuur dan alle andere antilichamen herkennen en dat IFL struktureel verschilt van alle andere onderzochte interferons, omdat het het door LI-1 en LI-2 herkende epitoop niet bezit.

LI-12, een niet neutraliserend antilichaam, herkent met ongeveer dezelfde, hoewel misschien geringere affiniteit, een minder variabele de-30 terminant, die in alle onderzochte interferons aanwezig is. De resultaten met betrekking tot de antilichaambinding en de interferonneutrali-satie laten herkennen, dat tenminste drie verschillende epitopen van HLI door de verzameling van de monoklonale antilichamen herkent en gedefinieerd kunnen worden.

35 Voorbeeld 2.

Bepaling van interferon.

1) Keuze van een geschikt paar monoklonale antilichamen.

Ter onderscheiding van concurrerende binding van twee antilichamen aan hetzelfde epitoop en additieve binding aan verschillende epitopen 40 wordt de binding van de antilichamen alleen en in paren en in alle mo- 8200786 10 gelijke combinaties aan geïmmobiliseerd interferon onderzocht. Bovenstaande lagen van samen gevloeide hybridoomkweken worden zonder verdere zuivering als antilichaambron toegepast. Ten dele gezuiverd leukocyten-interferon (20-30% zuiver IFL 3) wordt in beperkte hoeveelheden (0,1 5 tot 0,2/ug interferon/ml) op polyvinylchloride microtiterplaten gebracht, zoals deze in voorbeeld 1 voor het SABA beschreven wordt. Daarna volgt het afweren van alle protelnebindingsplaaten met 3%’s BSA. 50/ul Antilichaamoplossing bestaande uit telkens 25/ul van twee bovenstaande kweeklagen of 2 x 25/ul van hetzelfde antilichaam worden 10 gedurende 7 uren bij kamertemperatuur gelncubeerd. De platen worden met PBS (0,01 mol kaliumfosfaat, pH 7,3; 0,14 mol natriumchloride) gewassen en gedurende 5 uren met een overmaat van *25 j gemerkt schaap-an-ti-muis-Ig immunoglobuline in een volume van 50/ul per verdieping gelncubeerd om de hoeveelheid monoklonale antilichamen, die aan interfe-15 ron gebonden zijn, te meten (tabel C). De binding van twee antilichamen wordt als additief beschouwd, wanneer de binding van deze antilichamen die met 50/ul van het' sterker bindende afzonderlijke antilichaam te boven gaat. Op grond van dit kriterium werd gevonden, dat LI-1 met bijna alle andere antilichamen additief bindt en dat LI-9 de beste addi-20 tieve binding met LI-1 geeft.

LI-1 en LI-9 van ascites vloeistof worden volgens standaard methoden, d.w.z. door ammoniumsulfaatprecipitatie (50%’s verzadiging) en chromatografie over DEAE-cellulose tot tenminste 90% gezuiverd, zoals dit door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese beoor-25 deeld wordt. 20/ug van elk antilichaam worden met 125 j volgens de chlooramine-T-methode tot een specifieke activiteit van ongeveer 20/uCi//ug gemerkt. Vrij jood wordt van gemerkt antilichaam door gelfiltratie aan Sephadex G-25 bij aanwezigheid van PBS en 1% BSA gescheiden.

30 Niet gemarkeerde antilichamen LI-1 en LI-9 worden tot ongeveer 20/ug per ml PBS een nacht aan PVC-microtiterplaten (Cooke Laboratory, Products Division, Dynatech Laboratories, Ine.) geabsorbeerd (100/ul/verdieping). Gedurende 30 tot 60 minuten worden alle proteï-nebindingsplaatsen met 3%’s BSA in PBS geblokkeerd. Gezuiverd leukocy-35 ten-interferon van de KG-1 myeloide cellijn worden bij een concentratie van 10 eenheden/100/ul PBS en 1%’s BSA tesamen met een van de 125 j gemarkeerde antilichamen (1,3 x 10^ cpm) in met antilichamen beklede verdiepingen gelncubeerd. Controleverdiepingen bevatten gemerkte antilichamen, evenwel geen interferon. Na incubatie gedurende 40 3 uren bij kamertemperatuur wordt de vloeistof verwijderd en worden de 8200786 11 verdiepingen van de platen vier maal met PBS gewassen en vervolgens in een gamma-scintillatie-spectrofotometer op radioactiviteit onderzocht. De resultaten zijn in tabel D vermeld. De combinatie van Li-1 met Li-9 geeft een van interferon afhankelijke sandwichachtige antilichaambin-5 ding. De betere combinatie is geïmmobiliseerd LI-9 met gemarkeerd LI-1 in oplossing. Op deze grond zijn de andere experimenten met geïmmobiliseerd LI-9 en gemarkeerd LI-1 uitgevoerd.

a) Eentraps incubatiemethode.

Elke verdieping van een PVC-microtiterplaat wordt met 100/ul 10 LI-9 (15/ug/ml in PBS) bij kamertemperatuur een nacht of bij 4°C enkele dagen of weken in een bevochtigde ruimte bekleed. Voor het gebruik wordt de oplossing van LI-9 verwijderd en worden de verdiepingen met 3%’s BSA gedurende 30 tot 60 minuten gevuld en daarna vier maal met PBS gewassen. Ongeveer 140000 cpm 125 j gemerkt LI-1 (ongeveer 4 ng, 15 specifieke activiteit ongeveer 20/uCi//ug) in 0,1 ml PBS, dat 1%'s BSA bevat en 100 tot 150/ug menselijk IgG per ml worden in elke verdieping gebracht. Overeenkomstig verdunde interferonoplossingen (1-20/ul) worden in de verdiepingen gebracht en door kort schudden gemengd. Na een incubatie van 2 tot 3 uren bij kamertemperatuur wordt 20 de vloeistof op absorptiepapier gegoten. De plaat wordt vier tot vijf maal met PBS gewassen en de afzonderlijke verdiepingen worden in een gamma-scintillatie-spectrometer op radioactiviteit onderzocht. Bij hogere interferonconcentraties (_>ca. 5000-6000ü/ml) treedt een partiële remming op. De verkregen resultaten zijn in figuur 3 en tabel E weerge-25 geven.

b) Tweetraps incubatiemethode.

Met LI-9 beklede en met BSA verzadigde PVC-microtiterplaten worden zoals hiervoor beschreven bereid. 50/ul per verdieping van een inter-feronoplossing in PBS, dat 1%’s BSA bevat, worden gedurende 30 minuten 30 bij kamertemperatuur geïncubeerd, waarna de platen vier maal met PBS gewassen worden. Daarna worden 50/ul 125 j LI-1 (ongeveer 150000 cpm/4 ng PBS dat 1%’s BSA bevat en 150/ug menselijk IgG per ml in elke verdieping gebracht, waarna de platen gedurende 2 uren op kamertemperatuur worden gehouden en daarna vier maal met PBS worden ge-35 wassen en zoals hiervoor vermeld op radioactiviteit worden onderzocht.

De verkregen resultaten zijn in figuur 4 weergegeven. In tegenstelling tot de eentraps methode ontstaat geen partiële remming bij hogere inter f er onconcentrat ie .

c) Bepaling van geïnactiveerd antivirus interferon.

40 Inactivering met warmte van Interferon.

8200786 12

Een oplossing (2,4/ug/ml) van Interferon A (Goeddel c.s., Nature 290, maart 1881) in "Eagle’s minimal essential medium", dat 10% foetaal runderserum en 1/ug/l runderserumalbumine bevat, wordt met een met fosfaat gebufferde keukenzoutoplossing (0,14 mol NaCl, 8 mmol Na2HP04, 5 1,5 mmol KH2PO4, 3 mmol KC1, 0,9 mmol CaCl2 en 0,5 mmol MgC^) 1:480 verdund. De verdunde oplossing bevat interferon A in een concentratie van 5 ng/ml. Na verwarming op 65°C gedurende een bepaalde tijd worden monsters van 0,14 ml totdat bepaling plaats heeft in een Ijsbad gehouden. Zowel de antivirale als de immunologische bepaling worden op 10 dezelfde dag uitgevoerd. Van de monsters van 0,14 ml worden 0,1 ml voor de radio immunomethode en 10/ul voor de antivirusbepaling (in duplo) toegepast. De radio immunomethode heeft plaats volgens de onder B. beschreven tweetraps incubatiemethode. De antivirale bepaling heeft plaats volgens de CPE-remmingsproef. De verkregen resultaten zijn in 15 figuur 6 weergegeven. Uit dit voorbeeld blijkt, dat het antilichaampaar LI-l/LI-9 antiviraal actief en antiviraal inactief interferon kan onderscheiden. Uit de figuur blijkt voorts, dat de antivirale activiteit en de immunoreactiviteit gelijktijdig afnemen.

d) Zeer gevoelige interferonbepaling in menselijk plasma of serum 20 (radio immunomethode).'

Er wordt een enkele incubatie van 0,1 ml 40%’s menselijk plasma of serum (neutrale pH),, die ongeveer 250000 cpm (1,5 ng) 125 j u-i (specifieke activiteit 100 tot 110/uCi//ug LI-1) bevat bij kamertemperatuur gedurende 14 tot 16 uren in PVC-microtiterplaten uitge-25 voerd, die zoals hiervoor beschreven met LI-9 bekleed zijn. Na vier maal wassen met PBS worden de verdiepingen, zoals hiervoor vermeld, geteld, Er wordt een experiment met interferon uitgevoerd, dat aan het citraatplasma van een gezonde proefpersoon wordt toegevoegd. Elke 0,1 ml PBS-proefmengsel bevat 40ƒul plasma, 1,3 ng 125 j χ,Ι-1 30 (256000 cpm). en verschillende hoeveelheden onzuiver menselijk leukocy- ten-interferon (ongeveer 0,1% zuiver) van chronisch myologene leukemie-cellen. De resultaten zijn in figuur 5 weergegeven, waarin het gehalte aan interferon als abscis is aangegeven. Als onzuiver leukocyten-inter-feron wordt het incubatiemilieu volgens trap 1 van tabel 3 van DOS 35 2.947.134 toegepast.

Voorbeeld 3.

Zeer gevoelige bepaling van interferon in serum van patiënten (enzym-emmunomethode).

In het geschikte aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 40 0,05 ml proefoplossing (0,1 mol/1 natriumfosfaat, pH 6,5 met 10 g/1 BSA

8200786 13 en 0,5/ug/ml monoklonaal LI-1 anti-interferon-peroxidase-konjugaat in interferon vrij menselijk serum) gepipetteerd, 0,2 ml van de te analyseren plasma's van patiënten respectievelijk de standaards van interferon (0 U/ml, 12,5 U/ml, 25 U/ml en 50 U/ml interferon en het interferon 5 controleserum (bijvoorbeeld 30 ü/ml interferon) wordt onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonaal LI-9 anti-interferon beklede poly-styreenkogel (0 6,5 mm) wordt toegevoegd en er wordt bij kamertemperatuur (18-26°C) gedurende 16 uren gelncubeerd. Vervolgens worden de polys tyreenkogels drie maal met telkens 2 tot 5 ml gedestilleerd water 10 gewassen* in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/1 kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/1 H2O2 en 20 mmol/1 o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-26eC) gelncubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase activiteit, alsmede voor het intensiveren 15 van de lichtabsorptie wordt 0,5 ml 4 N HC1 onder mengen toegevoegd en wordt in 30 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In de tabel zijn de waarden van een interferonbepaling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de interferonstandaards verkregen werden. Als interferonstamdaard wordt onzuiver leukocyten-in-20 terferon (incubatiemilieu volgens trap 1 van tabel 3 van DOS 2.947.134) toegepast.

8200786 14

Tabel

Monstermateriaal £ E492 nm/RT/30 min .interferon-standaard 0 U/ml interferon 0,065 / 0,070 5 12,5 U/ml interferon 0,245 / 0,235 25 U/ml interferon 0,425 / 0,430 50 U/ml interferon 0,775 0,790 controleserum (30 U/ml interferon) 0,505 / 0,490 10 patiëntenplasma's nr. 8327 0 U/ml interferon nr. 8328 0 U/ml interferon nr. 8336 9 U/ml interferon 15 nr. 8338 0 U/ml interferon nr. 8339 5 U/ml interferon nr. 8363 0 U/ml interferon nr. 8341 2 U/ml interferon nr. 8344 16 U/ml interferon 20

Voorbeeld 4.

Zuivering van door recombinatie DNS-techniek verkregen leukocy-ten-interferon (Interferon A; zie Goeddel c.s. Nature, 290, maart 1981).

25 a) Zuivering vooraf van het door recombinatie DNS-techniek ver kregen menselijk leukoeyten-interferon.

Alle trappen worden bij 4°C uitgevoerd. Bevroren bacteriëncellen (1 kg) worden door verbrijzeling onder druk vernietigd. Het extract wordt volgens een standaardmethode opgewerkt, d.w.z. door polyethyleen-30 imine CPolymin P)- en ammoniumsulfaatprecipitatie, gevolgd door een dialyse van het 25%'s ammoniumsulfaatneerslag tegen 25 mmol Tris HC1, pH 7,8; 0,01Z thiodiglycol; 0,1% Triton X-100; 10/uM fenylfluoride. Er volgt een centrifigering voor de verwijdering van onoplosbare bestanddelen.

35 b) Bereiding van het immunoadsorptiemiddel.

In analogie aan voorbeeld 2 wordt gezuiverde antilichaamoplossing, die LI-8 bevat, tegen 0,2 mol natriumcarbonaat/0,3 mol natriumchloride-buffer bij kamertemperatuur gedialyseerd. De gedialyseerde oplossing wordt bij 20000 x G gedurende 15 minuten gecentrifugeerd om onoplosbaar 40 produkt te verwijderen. De proteïneconcentratie wordt op ongeveer 25 8200786 15 mg/ml met de hiervoor vermelde buffer ingesteld. Affi-gel 10 (BioRad Laboratories, Richmond, Califoria) wordt drie maal met ijskoude isopro-panol op een gesinterd glasfilter gewassen en vervolgens drie maal met ijskoud gedestilleerd water gewassen. De gel wordt in kunststof buisjes 5 gebracht en door kort centrifugeren gesedimenteerd. De bovenstaande laag wordt afgezogen. De gel wordt met eenzelfde volume gezuiverde an-tilichaamoplossing gemengd en gedurende 5 uren bij 4°C geroteerd. Na de reactie wordt de gel gefiltreerd en vervolgens twee maal met een buffer (0,1 mol NaHC03/0,15 mol NaCl) gewassen, om niet gebonden antilichaam 10 te verwijderen. De proteïnebepaling van het verenigde waswater laat zien, dat ongeveer 24 mg aan antilichaam per ml gel gebonden werd.

c) Affiniteitschromatograflsche zuivering van het vooraf gezuiverde, door recombinatie DNS-techniek verkregen leukocyten-interferon.

De bij trap a) verkregen oplossing (700 ml, die 37 g proteïne be-15 vat) wordt met 50 ml/h op de met PBS in evenwicht gebrachte immuno-ad-sorptiemiddelkoïom (2,5 x 3,5 cm; 17 ml. bedvolume, dat ongeveer 400 mg gezuiverd monoklonaal antilichaam LI-8 bevat) gebracht. Men wast met 20 kolomvolumina buffer (0,5 mol NaCl;. 0,02 mol Tris.HCl, pH 7,5; 0,2% Triton X-100), daarna wordt de kolom met 5 kolomvolumina 0,15 mol NaCl, 20 0,1%,Triton X-100 gewassen.'en daarna met 0,2 mol azijnzuur, 0,15 mol NaCl, 0,1% Triton X-100 (pH 2,5) geëlueerd. De interferonactiviteit wordt in ongeveer 30 ml in een gemiddelde concentratie van ongeveer 1 mg proteïne/ml geëlueerd. Deze oplossing wordt met 1 mol Trisbase op een pH van 4,5 ingesteld en viervoudig met water verdund. Het monster 25 wordt op een carboxymethylcellulose (CM 52 Whatman) kolom (1,3 x 3 cm) gebracht, die met 0,1 mol ammoniumacetaat (pH 5,0) in evenwicht is gebracht. De kolom wordt met 20 ml 0,1 mol ammoniumacetaat (pH 5,0) gewassen en het interferon wordt met 20 ml 0,5 mol ammoniumacetaat (pH

5,0) geëlueerd. Het resultaat van de zuivering is in tabel G vermeld.

30 Op soortgelijke wijze en met vergelijkbare opbrengst kan interfe ron ook met de antilichamen LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 en LI-9 gezuiverd worden.

8200786 16

Tabel A

epitoap monoklonale isotypen keten neutralisatie antilichamen _ fll-l A χ/k ja 5 I | LI-2 χ/k ja 7LI-3 χ/k ja LI-5 χ/k ja J LI-6 χ/k ja II LI-7 IgG χ/k ja 10 LI-8 χ/k ja VLI-9 2b/fc ja III ^LI-12 IgM /u/k neen 15

Tabel B

kweek cellen per onderzochte aantal aantal 96 "wells" klonen of positieven negatieven "wells" 20 LI-1 100 6 6 0 LI-2 100 11 6 5 LI-3 100 7 7 0 LI-5 100 13 13 0 LI-6 100 12 12 0 25 LI-7 100 10 8 2 LI-8 100 9 8 1 LI-9 100 10 8 .2 LI-12 100 4 0 4 LI-12 300 48 6 42 8200786

A

17

Tabel C

LI-1 LI-2 LI-3 LI-5 LI-6 LI-7 LI-8 LI-9 LI-12 LI-1 15800 14980 17620 17730 15950 17670 17970 19550 18260 LI-2 11880 15120 16750 14570 16440 16150 16250 15460 5 LI-3 11600 13440 10320 11900 13270 9710 15490 LI-5 13640 11690 13230 14720 11820 16710 h LI-6 7300 10290 10860 6540 12240 ^ LI-7 12090 13480 8630 14610 g, LI-8 14700 10270 17630 ° 10 LI-9 4900 10870 LI-12 9940

15 Tabel D

125 antilichamen j gemerkte antilichaam- combinatie__binding (cpm)_ 125 vaste fasen J gemerkte met zonder speci- 20 antilichamen antilichamen interferon interferon fieke bin ding LI-1 LI-9 922 440 482 LI-9 LI-1 2465 251 2208 25

Tabel E

125 interferonsoorten interferoneenheden CPM[ j]LI-l binding per bepaling 30 100 2* 202 a2 100 1*633 100 822 &2 100 8'135 03 100 70 35 Xi 100 7*036

Xl 100 4*804 ^3 100 101 /4 100 198 /5 100 121 40 100 5*498 8200786 18

Tabel F antilichamen interferon Li-1 Li-3 Li-5 U-6 Li-7 Li-8 Li-9 A + + + + + + + 5 B + ------ D - + + + + + + F ----- + - 10 Legende;

De met A tot F gekenmerkte interferons zijn de door recombinatie DNS-techniek verkregen en in het werk van David V. Goeddel c.s. in Nature 290, maart 1981, beschreven interferons. Een + betekent, dat het overeenkomstige interferon door een met het betreffende antilichaam gevulde 15 kolom volledig geadsorbeerd wordt, waartegenover een - geen adsorptie betekent. Een + betekent partiële adsorptie.

Tabel G

trap volume totaal totale specifieke zuive- rende- 20 (ml) proteïne activiteit activiteit rings- ment (mg) (eenheden) (eenheden/mg) factor (%) ammonium- sulfaat precipitatie 700 37.100 7,4xl09 2xl05 1.0 100 25 antilichaam-kolom samenvoeging 30 30 7xl09 2,3x10** 1150 95 CM-52 20 20 6xl09 3xl08 1500 81 30 De specifieke activiteit werd volgens het eerder vermelde CPE-remmings-proces bepaald. Volgens natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elek-troforese is het interferon volgens de immunoadsorptietrap voor meer dan 90% zuiver. Volgens de CM-52 kolom leek het praktisch homogeen, 8200786 19 CONCLUSIES.

1. Verzameling van monoklonale antilichamen, met het kenmerk, dat hun leden tegen natuurlijke of door recombinatie DNS-techniek verkregen menselijke leukocyten-interferons (HLI) gericht zijn.

5 2. Verzameling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de mono klonale antilichamen van verschillende hybridomen afgescheiden worden.

3. Verzameling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat zij uit groepen antilichamen bestaat, die zich van elkaar in hun isotypen onderscheiden.

10 4. Verzameling volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat 8 anti lichamen van het IgG en één antilichaam van het IgM isotype zijn.

5. Verzameling volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat van de 8 antilichamen met het IgG type 7 een zware en één een ^ 2b zware keten .bezit.

15 6. Verzameling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat afzonder lijke monoklonale antilichamen elkaar niet wederzijds remmen, d.w.z. gezamelijk aan HLI binden, andere elkaar wederzijds remmen, d.w.z. niet gezamelijk een HLI binden.

7. Verzameling volgens conclkusie 6, met het kenmerk, dat zij uit 20 groepen antilichamen bestaat, waarvan leden verschillende epitopen (an- tigene determinanten) van HLI herkennen.

8. Verzameling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat tenminste één antilichaam uit de· verzameling HLI ^3 niet herkent.

9. Verzameling volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat een anti- 25 lichaam (.IgM) de antivirale activiteit van HLI niet neutraliseert.

10. Toepassing van telkens een lid van verschillende groepen van antilichamen volgens conclusie 7 voor een vaste fasen-sandwichproef voor HLI.

11. Toepassing volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het niet 30 geïmmobiliseerde antilichaam met radioactiviteit of een enzym gemerkt is.

12. Toepassing van een antilichaam volgens de verzameling van conclusie 1 voor de zuivering van natuurlijk of door recombinatie DNS-techniek verkregen HLI.

35 13. Werkwijze voor de zuivering van natuurlijk of door recombina tie DNS-techniek verkregen HLI, met het kenmerk, dat men een HLI bevattend onzuiver produkt door affiniteitschromatografie onder toepassing van een monoklonaal antilichaam van de verzameling volgens een van de conclusies 1-9 zuivert.

40 *************** 8200786