JPS61271983A - 腫瘍会合抗原に対するヒト脾細胞の生体外免疫処置法 - Google Patents
腫瘍会合抗原に対するヒト脾細胞の生体外免疫処置法Info
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- JPS61271983A JPS61271983A JP61114971A JP11497186A JPS61271983A JP S61271983 A JPS61271983 A JP S61271983A JP 61114971 A JP61114971 A JP 61114971A JP 11497186 A JP11497186 A JP 11497186A JP S61271983 A JPS61271983 A JP S61271983A
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- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は広（腫瘍会合抗原、そしてより詳しくはボンベ
シンに対しヒト脾細胞を生体外免疫処置する方法に関す
る。
シンに対しヒト脾細胞を生体外免疫処置する方法に関す
る。
ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の製造技術は
よ（知られている。かかる技術すべては予め選択された
抗原に対しリンパ球を免に処置することを要する。特に
ヒト以外の起原のリンパ球を含む多（の場合、免疫処置
は免疫能のある宿主動物に抗原を古典的に注射し、続い
て終りに動物を殺しそして免疫リンパ球の豊富な源であ
る膵臓をとり出すことにより行われうろ。
よ（知られている。かかる技術すべては予め選択された
抗原に対しリンパ球を免に処置することを要する。特に
ヒト以外の起原のリンパ球を含む多（の場合、免疫処置
は免疫能のある宿主動物に抗原を古典的に注射し、続い
て終りに動物を殺しそして免疫リンパ球の豊富な源であ
る膵臓をとり出すことにより行われうろ。
ヒトモノクローナル抗体の重要性が増大するに伴い、ヒ
トリンパ球を生体外で免疫する方法を考案することが必
要となってきた。
トリンパ球を生体外で免疫する方法を考案することが必
要となってきた。
Ｈｏｆｆｍａｎｎ氏はヒ） Ｂ −リン／七球を抗原、
単球またはインターロイキン−１を含有する単球条件づ
け培地からなるヘルパーシグナル産生剤、ヘルパーニー
９フ２球またはヘルＡ−Ｔ−リンパ球置換因子、および
同攬ヒト血清の存在下に組織培地中で培養し、続いて培
地から抗体産生細胞を回収することからなるヒトＢ−リ
ン／９球の製法を開示している〔米国特許第４，４４４
，８８７号参照〕。
単球またはインターロイキン−１を含有する単球条件づ
け培地からなるヘルパーシグナル産生剤、ヘルパーニー
９フ２球またはヘルＡ−Ｔ−リンパ球置換因子、および
同攬ヒト血清の存在下に組織培地中で培養し、続いて培
地から抗体産生細胞を回収することからなるヒトＢ−リ
ン／９球の製法を開示している〔米国特許第４，４４４
，８８７号参照〕。
Ｃａｖａｇｎａｒｏおよび０ｓｂａｎｃ１氏（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。
１．３０〜３６ （１９８３） 〕はヒト末梢血液単核
細砲の生体外−次免疫処置法を開示している。この方法
は５種類の工程を必要とする。すなわち（１）オートロ
ガス血清の使用（培地とオートロガス）、（２）ヒト末
梢血液単球源からのＨ２ヒスタミン受体を担持するサブ
レツサーリンノ署球ノ消耗、および（３）免疫処置用培
養液中における非特異的なリンパ球活性剤の使用。
細砲の生体外−次免疫処置法を開示している。この方法
は５種類の工程を必要とする。すなわち（１）オートロ
ガス血清の使用（培地とオートロガス）、（２）ヒト末
梢血液単球源からのＨ２ヒスタミン受体を担持するサブ
レツサーリンノ署球ノ消耗、および（３）免疫処置用培
養液中における非特異的なリンパ球活性剤の使用。
ｇｒｉｓｍａｎ氏他はヌードマウス中に生育したヒト肺
小細胞酒中におけるボンベシンの存在を記載シている。
小細胞酒中におけるボンベシンの存在を記載シている。
ボンベシンは初めに蛙の皮膚から単離されたテトラデカ
ペプチドである（ Ｐ、Ｎ、Ａ、８゜（ＵＳＡ）７９．
２３７９〜２５８５ （１９８２））。
ペプチドである（ Ｐ、Ｎ、Ａ、８゜（ＵＳＡ）７９．
２３７９〜２５８５ （１９８２））。
Ｍｏｏｄｙ氏他は小細胞肺中においては、他の型のヒト
の癌におけると異なり、ボンベシンレベルが定例的に高
められていることを開示している（ Ｐｅｐｔｌｄｅｓ
４ 、６８５〜６８６ （１９８３） Ｊ。
の癌におけると異なり、ボンベシンレベルが定例的に高
められていることを開示している（ Ｐｅｐｔｌｄｅｓ
４ 、６８５〜６８６ （１９８３） Ｊ。
本発明は臨床的に関連する抗原に対する免疫能のあるヒ
トの脾細胞の生体外免疫処置法（およびそれにより生成
された生成物）に関する。
トの脾細胞の生体外免疫処置法（およびそれにより生成
された生成物）に関する。
より詳しくは、本発明方法は
（ａ） ヒト脾細胞集団を取得しく第１集団）、（１
）） 第１フラクションがＴ−細胞に富みそして第２
のフラクションがＢ−細胞に富むように第１集団を分別
し、 （ｃ） 第１および第２のフラクションからの細胞を
一緒に混合してＴ−ヘルパー細胞対Ｂ−細胞比少くとも
α４を有しそしてＴ−サプレッサー細胞の−が第１の集
団とは実質上変化してないような第２の集団を形成させ
、そして （ｄ） ヒト血清、免疫原、およびＴ−細胞とＢ−細
胞の増殖と分化を誘導しつるリンフ才力イン（７）を含
有する培地中で第２の集団を培養することからなる。
）） 第１フラクションがＴ−細胞に富みそして第２
のフラクションがＢ−細胞に富むように第１集団を分別
し、 （ｃ） 第１および第２のフラクションからの細胞を
一緒に混合してＴ−ヘルパー細胞対Ｂ−細胞比少くとも
α４を有しそしてＴ−サプレッサー細胞の−が第１の集
団とは実質上変化してないような第２の集団を形成させ
、そして （ｄ） ヒト血清、免疫原、およびＴ−細胞とＢ−細
胞の増殖と分化を誘導しつるリンフ才力イン（７）を含
有する培地中で第２の集団を培養することからなる。
本発明を実施するに際し用いられるヒト牌細砲は慣用の
方法により調製され、かかる技法の１種類は後記実施例
に記載されている。かくして得られた脾細胞集団を次に
分別して第１のフラクションがＴ−細胞に富み、そして
第２のフラクションがＢ−細胞に富むようにする。「富
む」なる用語は特定の細胞型の濃度かもとの集団におけ
るよりも分別された集団においてより高い、好ましくは
少（とも２０９＆高いことを意味する。
方法により調製され、かかる技法の１種類は後記実施例
に記載されている。かくして得られた脾細胞集団を次に
分別して第１のフラクションがＴ−細胞に富み、そして
第２のフラクションがＢ−細胞に富むようにする。「富
む」なる用語は特定の細胞型の濃度かもとの集団におけ
るよりも分別された集団においてより高い、好ましくは
少（とも２０９＆高いことを意味する。
脾細胞集団の他の成分（例えばマクロファージ、顆粒球
、血小板）がＴ−細胞フラクションまたはＢ−細胞フラ
クション中に含有されつる。
、血小板）がＴ−細胞フラクションまたはＢ−細胞フラ
クション中に含有されつる。
脾細胞集団の分別に影響を与えるための方法は当業者に
は明白であろう。例をあげれば羊赤血球を用いるロゼツ
ト形成、抗−Ｔまたは抗−Ｂ細胞抗体で被覆された赤血
球を用いるロゼツト形成、修飾されてない抗体または標
識（例えばビオチン）と接合した抗体で被栓された固形
マトリックス上の細胞の選別または分離、蛍光活性化さ
れた細胞選別体（５ｏｒｔｅｒ ）による蛍光色素と接
合した抗体で標識された細胞の分離、適当な抗体で被覆
された細胞の補体により仲介された溶解、勾配分ｌｌＩ
！（例えばｒ−ｇ沈降）、電気泳動でありそして本発明
の目的にとって好ましい方法は脾細胞集団を表面積対容
量比が高いナイロンウール分離カラムに通すことである
（後記実施例により詳細に記載されろ）。
は明白であろう。例をあげれば羊赤血球を用いるロゼツ
ト形成、抗−Ｔまたは抗−Ｂ細胞抗体で被覆された赤血
球を用いるロゼツト形成、修飾されてない抗体または標
識（例えばビオチン）と接合した抗体で被栓された固形
マトリックス上の細胞の選別または分離、蛍光活性化さ
れた細胞選別体（５ｏｒｔｅｒ ）による蛍光色素と接
合した抗体で標識された細胞の分離、適当な抗体で被覆
された細胞の補体により仲介された溶解、勾配分ｌｌＩ
！（例えばｒ−ｇ沈降）、電気泳動でありそして本発明
の目的にとって好ましい方法は脾細胞集団を表面積対容
量比が高いナイロンウール分離カラムに通すことである
（後記実施例により詳細に記載されろ）。
脾細胞集団を分別したのち、Ｔ−ａｉフラクション（８
１フラクション）お！びＢ−ｍ胞フラクション（第２フ
ラクション）をＴ−ヘルパー細胸対Ｂ−細胞比が少（と
も０．４でありしかも一方ではＴ−サプレッサー細胞の
慢がもとの脾細胞集団のそれとおよそ同じに保持される
第２の集団が形成される様式で再び組み合わせる。
１フラクション）お！びＢ−ｍ胞フラクション（第２フ
ラクション）をＴ−ヘルパー細胸対Ｂ−細胞比が少（と
も０．４でありしかも一方ではＴ−サプレッサー細胞の
慢がもとの脾細胞集団のそれとおよそ同じに保持される
第２の集団が形成される様式で再び組み合わせる。
下記実施例で記載されるナイロンウール分別操作を用い
ることにより、かかるＴ−ヘルパー細ａ／Ｂ−細胞比、
およびＴ−サプレッサー細胞チが得られる。もし分別が
前記の列記された他の方法の１種類により実施される場
合は、Ｔ−ヘルパー細胞対Ｂ−細胞の比、およびＴ−サ
プレッサー細胞−は当業者に明白であろうような方法に
より、かかる方法に適当なヘルパーチー細胞に対する抗
体を用いて制御される。
ることにより、かかるＴ−ヘルパー細ａ／Ｂ−細胞比、
およびＴ−サプレッサー細胞チが得られる。もし分別が
前記の列記された他の方法の１種類により実施される場
合は、Ｔ−ヘルパー細胞対Ｂ−細胞の比、およびＴ−サ
プレッサー細胞−は当業者に明白であろうような方法に
より、かかる方法に適当なヘルパーチー細胞に対する抗
体を用いて制御される。
分別および再組合せ工程に続ど、第２の集団をヒト血清
（オートロガスが用いられつるが同種が好ましい）、Ｔ
およびＢ細胞の増殖と分化を誘導しつるリンフ才力イン
（類）、場合により卓球活性剤、および臨床的に関連す
る免疫原の存在下に培養する（ ＲＰＭＩ−１６４０、
ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ）氏の変性されたイー
グル培地、またはイスコープ（ｌ５ｃｏｖｅ ）の変性
されたダルベツコ培地のような適当な組織培養用培地中
）。
（オートロガスが用いられつるが同種が好ましい）、Ｔ
およびＢ細胞の増殖と分化を誘導しつるリンフ才力イン
（類）、場合により卓球活性剤、および臨床的に関連す
る免疫原の存在下に培養する（ ＲＰＭＩ−１６４０、
ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ）氏の変性されたイー
グル培地、またはイスコープ（ｌ５ｃｏｖｅ ）の変性
されたダルベツコ培地のような適当な組織培養用培地中
）。
本発明の実施において有用なリンフ才力インは当業者に
は明白であろうしそしてそれらにはＩＬ−１およびＩＬ
−２、Ｂ−細胞生長因子、Ｂ−細胞分化因子、インター
フェロン、コロニー刺激因子、胸腺ホルモン、成熟因子
および表皮生長因子が包含される。本発明の実施におい
て有用な単球活性剤にはホルボール（ｐｈｏｒｂｏｌ）
エステル、ムラミルジにプチド、補体成分、微生物成分
（例えば内毒素）、インターフェロンおよびインターフ
ェロン誘導物質（例えばポリアニオンおよびウィルス）
、マイトジェン、セファロ−スピードおよび原生動物が
包含される。
は明白であろうしそしてそれらにはＩＬ−１およびＩＬ
−２、Ｂ−細胞生長因子、Ｂ−細胞分化因子、インター
フェロン、コロニー刺激因子、胸腺ホルモン、成熟因子
および表皮生長因子が包含される。本発明の実施におい
て有用な単球活性剤にはホルボール（ｐｈｏｒｂｏｌ）
エステル、ムラミルジにプチド、補体成分、微生物成分
（例えば内毒素）、インターフェロンおよびインターフ
ェロン誘導物質（例えばポリアニオンおよびウィルス）
、マイトジェン、セファロ−スピードおよび原生動物が
包含される。
それに対して抗体が生成される免疫原の選択は勿論、臨
床上の重要性の如何によるであろう。
床上の重要性の如何によるであろう。
臨床的に重要な免疫原のい（つかは細菌性抗原、ウィル
ス抗原、毒素、血液梨抗原、リンパ様細胞上の抗原、ミ
オシン、および腫瘍抗原例えば細胞会合抗原および職瘍
細胞分泌生成物（例えば、ボンベシン、ＣＥＡ、 ＡＦ
Ｐ、 ＨＣＧ、カルシトニン、ＡＣＴＨ，ＡＶＰおよび
ニューロテンシン）カ包含される。当業上よく知られて
いるように比較的小さな抗原（分子量約５０００以下）
は免疫原に対する有効な免疫応答を刺激するためにキャ
リアーに結合される必要がありうる。好ましくは、この
キャリアーはそれに対してヒトのリンパ球が予め免疫さ
れた存在、例えば破傷風トキソイドである。有用なキャ
リアーの例は午−ホールリンベットヘモシアニン、テロ
グロブリン、アルブミン、ムラミルジペプチド、赤血球
、固形マトリックス例えばセファロ−スピード、アルカ
リホスファターゼ、グロブリン、合成共重合体、フイプ
リノゲン等である。い（つかの比較的小さな抗原はまた
重合されて免疫原性を増大されうる。比較的小さな抗原
のキャリアーへの結合に有用な連結剤にはカルボジイミ
ド、グルタルアルデヒド、Ｎ、Ｎ−カルボニルジイミダ
ゾール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−水和物、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−トリフルオロアセ
チルイミダゾール、臭化シアンおよびビス−ジアゾ化ベ
ンジジンが包含される。本発明の目的にとって必要な抗
原の濃度は抗原の寸法の如何によるであろうしそして一
般にα１〜１００．０００ｎｆ／−好ましくは１〜１０
，０００ｎｐ／−の範囲であろう。
ス抗原、毒素、血液梨抗原、リンパ様細胞上の抗原、ミ
オシン、および腫瘍抗原例えば細胞会合抗原および職瘍
細胞分泌生成物（例えば、ボンベシン、ＣＥＡ、 ＡＦ
Ｐ、 ＨＣＧ、カルシトニン、ＡＣＴＨ，ＡＶＰおよび
ニューロテンシン）カ包含される。当業上よく知られて
いるように比較的小さな抗原（分子量約５０００以下）
は免疫原に対する有効な免疫応答を刺激するためにキャ
リアーに結合される必要がありうる。好ましくは、この
キャリアーはそれに対してヒトのリンパ球が予め免疫さ
れた存在、例えば破傷風トキソイドである。有用なキャ
リアーの例は午−ホールリンベットヘモシアニン、テロ
グロブリン、アルブミン、ムラミルジペプチド、赤血球
、固形マトリックス例えばセファロ−スピード、アルカ
リホスファターゼ、グロブリン、合成共重合体、フイプ
リノゲン等である。い（つかの比較的小さな抗原はまた
重合されて免疫原性を増大されうる。比較的小さな抗原
のキャリアーへの結合に有用な連結剤にはカルボジイミ
ド、グルタルアルデヒド、Ｎ、Ｎ−カルボニルジイミダ
ゾール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−水和物、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−トリフルオロアセ
チルイミダゾール、臭化シアンおよびビス−ジアゾ化ベ
ンジジンが包含される。本発明の目的にとって必要な抗
原の濃度は抗原の寸法の如何によるであろうしそして一
般にα１〜１００．０００ｎｆ／−好ましくは１〜１０
，０００ｎｐ／−の範囲であろう。
脾細胞を培養したのち、細胞を適当な融合相手細胞系統
（例えばＮ５−１．８ＨＭＤ３３．８ＢＣＨ２Ｏ、Ｐ３
Ａｇ８−６５３、ＳＰ２１０ＸＨＭｙ−２、ＷＩ−Ｌ２
７２９ＨＦ２．０Ｍ４６７２およびＵＣ７２９−６）と
融合させそしてハイブリドーマ上澄みを抗体産生につい
て検査する。あるいはまた、細胞なＥＢ■、発癌性ＤＮ
Ａ等を用いる形質転換技法により無限生存化させる。
（例えばＮ５−１．８ＨＭＤ３３．８ＢＣＨ２Ｏ、Ｐ３
Ａｇ８−６５３、ＳＰ２１０ＸＨＭｙ−２、ＷＩ−Ｌ２
７２９ＨＦ２．０Ｍ４６７２およびＵＣ７２９−６）と
融合させそしてハイブリドーマ上澄みを抗体産生につい
て検査する。あるいはまた、細胞なＥＢ■、発癌性ＤＮ
Ａ等を用いる形質転換技法により無限生存化させる。
本発明の免疫処置方法手順に従い産生される抗体は現在
モノクローナル抗体を用いる任意のよ（知られた診断ま
たは治療技術において有用である。抗体は種々の酵素連
結免疫検定法において使用される酵素や放射線免疫検定
法または生体内診断または治療において使用される放射
性標識で標識でき、モして徨々の拮抗的結合分析および
治療上の適用においては標識なしで使用されうる。
モノクローナル抗体を用いる任意のよ（知られた診断ま
たは治療技術において有用である。抗体は種々の酵素連
結免疫検定法において使用される酵素や放射線免疫検定
法または生体内診断または治療において使用される放射
性標識で標識でき、モして徨々の拮抗的結合分析および
治療上の適用においては標識なしで使用されうる。
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明するが、
本発明はそれらに限定きれるものではない。
本発明はそれらに限定きれるものではない。
実施例
■、材料および方法
破傷風トキソイドの精製
破傷風トキソイド濃縮物をマサチューセッツ州Ｐｕｂｌ
ｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購
入しそして高速蛋白液体クロマトグラフィー（以下ＦＰ
ＬＣと略記する）により精製した。代表的には−８，０
の５０ｍＭビス／トリスを用いて予め平衡となしたα５
Ｘ５３のモノＱ樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ米国ニューシャーシー州）に濃縮
物５−（￥ｆ定の蛋白質１０ｍ９を含有）を適用した。
ｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購
入しそして高速蛋白液体クロマトグラフィー（以下ＦＰ
ＬＣと略記する）により精製した。代表的には−８，０
の５０ｍＭビス／トリスを用いて予め平衡となしたα５
Ｘ５３のモノＱ樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ米国ニューシャーシー州）に濃縮
物５−（￥ｆ定の蛋白質１０ｍ９を含有）を適用した。
限界緩衝液として１ＭＮａＣ２を含有する≠８．０の５
０ｍＭビス／トリスを用い段階的勾配をつけて溶離を行
つ九。９５チ以上の破傷風トキソイドが限界緩衝液の４
０−で回収され、そしてα１５ＭＮａＣ２で透析された
。破傷風トキソイドの純度をドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ
）および破傷風トキソイド（Ｈｅｐｅｒｔｅｔ 、 Ｃ
ｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 。
０ｍＭビス／トリスを用い段階的勾配をつけて溶離を行
つ九。９５チ以上の破傷風トキソイドが限界緩衝液の４
０−で回収され、そしてα１５ＭＮａＣ２で透析された
。破傷風トキソイドの純度をドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ
）および破傷風トキソイド（Ｈｅｐｅｒｔｅｔ 、 Ｃ
ｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 。
バークレイ、米国カリフォルニア州）Ｋ対するヒト抗体
との反応性により監視した。
との反応性により監視した。
蛋白質キャリアーへの（Ｌｙｓ’〕−ボンベシンの接合
（Ｌｙｓ５〕−ボンベシン（分子量１５９２ ） （Ｂ
ａｃｈａｍＢｕｒｌｉｎｇａｍｅ 、米国カリフォルニ
ア州）をＧｏｏｄｆｒｉｅｎｄ氏他の５ｃｉｅｎｃｅ
１４４．１３４４ （１９６４）の修正された方法に従
い１−エチル３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩（以下ＥＣＤＩと略記する） （ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、サンジエゴ、米国カリフォル
ニア州）によりＦＰＬＣ精製された破傷風トキソイド（
分子量１８０，０００）に接合させた。ボンベシン：キ
ャリアー： ＥＣＤＩのモル比は一般に５０〜６０：１
：６９００であった。簡潔に言えば、（Ｌｙｅ３）−ボ
ンベシンな２ ｍＶ−で０．１５ＭＮａＣｔ中の破傷風
トキソイドに滴下し続いてＫＣＤＩ２００／！ＬＬをか
きまぜながら滴下した。
（Ｌｙｓ５〕−ボンベシン（分子量１５９２ ） （Ｂ
ａｃｈａｍＢｕｒｌｉｎｇａｍｅ 、米国カリフォルニ
ア州）をＧｏｏｄｆｒｉｅｎｄ氏他の５ｃｉｅｎｃｅ
１４４．１３４４ （１９６４）の修正された方法に従
い１−エチル３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩（以下ＥＣＤＩと略記する） （ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、サンジエゴ、米国カリフォル
ニア州）によりＦＰＬＣ精製された破傷風トキソイド（
分子量１８０，０００）に接合させた。ボンベシン：キ
ャリアー： ＥＣＤＩのモル比は一般に５０〜６０：１
：６９００であった。簡潔に言えば、（Ｌｙｅ３）−ボ
ンベシンな２ ｍＶ−で０．１５ＭＮａＣｔ中の破傷風
トキソイドに滴下し続いてＫＣＤＩ２００／！ＬＬをか
きまぜながら滴下した。
室温で１５〜５０分間培養したのち、この混合物をセフ
ァデックスＧ７５０カラムに適用して未接合のボンベシ
ンを除去した。ボンベシン−蛋白質接合体を含有するフ
ラクションを集めそして一２０℃で保存した。接合の度
合いはＥＬＩ８Ａにおけるウサギ抗ボンベシ：、ｙ （
Ｄｒ、 Ｌ、Ｈ，Ｌａｚａｒｕａ氏の贈与物、Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＆１ｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈ ５ｃｉｅｎｃｅｓ ）との
免疫反応性によりおよびアミノ酸分析により監視された
。
ァデックスＧ７５０カラムに適用して未接合のボンベシ
ンを除去した。ボンベシン−蛋白質接合体を含有するフ
ラクションを集めそして一２０℃で保存した。接合の度
合いはＥＬＩ８Ａにおけるウサギ抗ボンベシ：、ｙ （
Ｄｒ、 Ｌ、Ｈ，Ｌａｚａｒｕａ氏の贈与物、Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＆１ｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈ ５ｃｉｅｎｃｅｓ ）との
免疫反応性によりおよびアミノ酸分析により監視された
。
リンパ球培養上澄み液（以下ＬＣ８と略記する）ＬＣ’
３はＤｒ、 Ｊａｍｅｓ Ｗｏｏｄｙ （Ｎａｖａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒベセスダ、米国メリー
ランド州）の好意により提供された。簡単に言えば、こ
れらは下記のようにして調製された。選別された供血者
からの末梢血液リン・ぞ球を０．１−の精製植物凝集素
−Ｐ （ＰＨＡ−Ｐ ） （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ社製＼デトロイト、米国ミシガン州）およ
び５％のヒ）ＡＢ血清を補給されたＲＰＭＩ −１６４
０培地中ｌＸ１０６／ｍで４８時間培養した。培養上澄
み液を収穫し、０．２２戸フィルターで濾過し、そして
インターロイキン−２（ＩＬ−２）依存性ヒトＴ−細胞
クローンに対するＩＬ−２活性について検定した。ＩＩ
、−２０，８Ｕ／ｍ以上を有するロットを集めそして使
用まで４℃で保存した。ヒ）Ｂ−細胞生長因子（ＢＣＧ
Ｆ）活性モまたスタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔ
ａ−ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕａ ）共刺激
物質検定を用いることによりこれらの上澄み液中におい
て検出された。
３はＤｒ、 Ｊａｍｅｓ Ｗｏｏｄｙ （Ｎａｖａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒベセスダ、米国メリー
ランド州）の好意により提供された。簡単に言えば、こ
れらは下記のようにして調製された。選別された供血者
からの末梢血液リン・ぞ球を０．１−の精製植物凝集素
−Ｐ （ＰＨＡ−Ｐ ） （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ社製＼デトロイト、米国ミシガン州）およ
び５％のヒ）ＡＢ血清を補給されたＲＰＭＩ −１６４
０培地中ｌＸ１０６／ｍで４８時間培養した。培養上澄
み液を収穫し、０．２２戸フィルターで濾過し、そして
インターロイキン−２（ＩＬ−２）依存性ヒトＴ−細胞
クローンに対するＩＬ−２活性について検定した。ＩＩ
、−２０，８Ｕ／ｍ以上を有するロットを集めそして使
用まで４℃で保存した。ヒ）Ｂ−細胞生長因子（ＢＣＧ
Ｆ）活性モまたスタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔ
ａ−ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕａ ）共刺激
物質検定を用いることによりこれらの上澄み液中におい
て検出された。
免疫蛍光染色
ヒトリンパ球２００万個を２−のウシ胎児血清（以下Ｆ
Ｃ８と略記する）および０．１％のナトリウムアジドを
補給されたノ１ンクス（Ｈａｎｋｓ）の平衡塩溶液（Ｇ
ＩＢＣＯ、グランドアイランド、米国ニューヨーク州）
１００μを中でマウスのモノクローナル抗体６４．１（
抗−１Ｍ胞）、２Ｈ７（抗−Ｂ細胞）、６６．１（抗−
ヘルバー／インデューサーＴ−細胞）、または５１．１
（抗−細胞毒／サプレッサー Ｔ−細胞） （ＤｕＰｏ
ｎｔ−ＮＥＮ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ボストン、米国
マサチューセッツ州）１μｔと４℃で３０分間培養した
。次に細胞を６回洗浄しモして１：１００に希釈され九
ＦＩＴＣ−接合された羊Ｆ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ
（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ） １００μｔを添加した。４
℃で５０分間もう一回培養したのち、細胞を６回洗浄し
、１慢のホルマリンを含有する燐酸塩緩衝された食塩水
（以下ＰＢＳと略記する）中に再懸濁しそしてＥＰＩＣ
８Ｖ流動細胞計測計（ｃｏｕｌｔｅｒ、 Ｈｌａｌｅａ
ｈ、米国フロリダ州）で分析した。
Ｃ８と略記する）および０．１％のナトリウムアジドを
補給されたノ１ンクス（Ｈａｎｋｓ）の平衡塩溶液（Ｇ
ＩＢＣＯ、グランドアイランド、米国ニューヨーク州）
１００μを中でマウスのモノクローナル抗体６４．１（
抗−１Ｍ胞）、２Ｈ７（抗−Ｂ細胞）、６６．１（抗−
ヘルバー／インデューサーＴ−細胞）、または５１．１
（抗−細胞毒／サプレッサー Ｔ−細胞） （ＤｕＰｏ
ｎｔ−ＮＥＮ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ボストン、米国
マサチューセッツ州）１μｔと４℃で３０分間培養した
。次に細胞を６回洗浄しモして１：１００に希釈され九
ＦＩＴＣ−接合された羊Ｆ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ
（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ） １００μｔを添加した。４
℃で５０分間もう一回培養したのち、細胞を６回洗浄し
、１慢のホルマリンを含有する燐酸塩緩衝された食塩水
（以下ＰＢＳと略記する）中に再懸濁しそしてＥＰＩＣ
８Ｖ流動細胞計測計（ｃｏｕｌｔｅｒ、 Ｈｌａｌｅａ
ｈ、米国フロリダ州）で分析した。
酵素連結免疫検定（ｇＬｘｓＡ）
９６個のウェルを有するイムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）■
プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ
、 米国バージニア州）に−１９，６の炭酸塩緩衝
液中に希釈した蛋白質キャリアーまたは遊離蛋白質キャ
リアーに接合したボンベシンを１ウェル当り４００ｎｙ
を用い４℃で１８時間被覆した。これらプレートを−７
，２のＰＢＳで３回洗い、そしてＰＢＳ −１チ牛血清
アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）を用い３７℃で１
時間遮断した。続いて、プレートをＰＢＳで３回洗いそ
してハイブリッド上澄み液体５０μｔずつを各ウェルに
加えた。６７℃で１時間培養後、プレートを再びＰＢＳ
で３回洗いそしてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（以
下ＨＲＰ ）と接合したヤギの抗ヒトＩｇ （ｃｏｏｐ
ｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、 Ｍａｌｖｅｒｎ 、
米国ハンシルベニア州）５０μｔを各ウェルに加えた。
プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ
、 米国バージニア州）に−１９，６の炭酸塩緩衝
液中に希釈した蛋白質キャリアーまたは遊離蛋白質キャ
リアーに接合したボンベシンを１ウェル当り４００ｎｙ
を用い４℃で１８時間被覆した。これらプレートを−７
，２のＰＢＳで３回洗い、そしてＰＢＳ −１チ牛血清
アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）を用い３７℃で１
時間遮断した。続いて、プレートをＰＢＳで３回洗いそ
してハイブリッド上澄み液体５０μｔずつを各ウェルに
加えた。６７℃で１時間培養後、プレートを再びＰＢＳ
で３回洗いそしてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（以
下ＨＲＰ ）と接合したヤギの抗ヒトＩｇ （ｃｏｏｐ
ｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、 Ｍａｌｖｅｒｎ 、
米国ハンシルベニア州）５０μｔを各ウェルに加えた。
次にこのプレートを３７℃で１時間培養し、ＰＢＳで３
回洗い、そしてｏ−フェニレンジアミン１００μｔおよ
び０．１５チの過酸化水素を添加することにより酵素を
検出した。すべての抗体を０．０５％のトウイーン２０
を含有するＰＢＳ中に希釈した。いくつかの実験では、
！（ＲＰヤギ抗ヒトエｇはヤギ抗ヒ） ＩｇＭまたはヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ （ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌ ） Ｋより置換して特異的な抗体についてアイソタ
イプ測定した。
回洗い、そしてｏ−フェニレンジアミン１００μｔおよ
び０．１５チの過酸化水素を添加することにより酵素を
検出した。すべての抗体を０．０５％のトウイーン２０
を含有するＰＢＳ中に希釈した。いくつかの実験では、
！（ＲＰヤギ抗ヒトエｇはヤギ抗ヒ） ＩｇＭまたはヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ （ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌ ） Ｋより置換して特異的な抗体についてアイソタ
イプ測定した。
拮抗的抑制研究
拮抗的抑制研究に用いられる抗体を最大値の半分の結合
を生ずる抗体の濃度を測定するためにボンベシン−破傷
風トキソイド接合体（以下ＢＴＴと略記する）で被覆さ
れたプレート上ではじめに滴定した。抗体のこの最大半
分濃度物を種々の濃度の可溶性阻害剤と３７℃で６時間
予備培養し九。これら阻害剤にはＥＣＤＩを介して破傷
風トキソイドまたはチログロブリンに接合したボンベシ
ン、破傷風トキソイド、テログロブリン、グルタルアル
デヒドによりテログロブリンに結合したボンベシンおよ
び遊離の（Ｌｙｓ’） −ボンベシンが包含される。予
備培養後、ＢＴＴで被覆されたプレートに抗体を加えそ
して３７℃で１５分間予備培養した。次にプレートを常
用のＥＬＩＳＡ法に記載されるようにして処理し九。
を生ずる抗体の濃度を測定するためにボンベシン−破傷
風トキソイド接合体（以下ＢＴＴと略記する）で被覆さ
れたプレート上ではじめに滴定した。抗体のこの最大半
分濃度物を種々の濃度の可溶性阻害剤と３７℃で６時間
予備培養し九。これら阻害剤にはＥＣＤＩを介して破傷
風トキソイドまたはチログロブリンに接合したボンベシ
ン、破傷風トキソイド、テログロブリン、グルタルアル
デヒドによりテログロブリンに結合したボンベシンおよ
び遊離の（Ｌｙｓ’） −ボンベシンが包含される。予
備培養後、ＢＴＴで被覆されたプレートに抗体を加えそ
して３７℃で１５分間予備培養した。次にプレートを常
用のＥＬＩＳＡ法に記載されるようにして処理し九。
生体外免疫処置
膵臓組織を細断することによりＲＰＭＩ−１６４０培地
（Ｍ、 Ａ、 Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ベセスダ
、米国メリーランド州）中に脾細胞の単一細胞懸濁液を
調製した。リンパ球分離培地（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ。
（Ｍ、 Ａ、 Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ベセスダ
、米国メリーランド州）中に脾細胞の単一細胞懸濁液を
調製した。リンパ球分離培地（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ。
Ｒｏｃｋｖ第１ｌｅ、 米国メリーランド州）の勾配
上１４００Ｘｒで２０分間遠心分離することにより赤血
球を分離した。界面から回収された細胞をＲＰＭＩ−１
６４０中で３回洗いそして４０チのＦＣ８および１０％
のジメチルスルホキシドを補給された氷冷されたＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中に細胞１０７個／ｄで再懸濁した。
上１４００Ｘｒで２０分間遠心分離することにより赤血
球を分離した。界面から回収された細胞をＲＰＭＩ−１
６４０中で３回洗いそして４０チのＦＣ８および１０％
のジメチルスルホキシドを補給された氷冷されたＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中に細胞１０７個／ｄで再懸濁した。
続いて、細胞を速度制御フリーザー（ｃｒｙｏＭｅｄ、
Ｓ’；、 Ｃｌｅｍｅｎｓ、米国ミシガン州）中で冷
凍させた。
Ｓ’；、 Ｃｌｅｍｅｎｓ、米国ミシガン州）中で冷
凍させた。
感作させるために細胞を５７℃で速やかに解凍させそし
てＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗った。膵臓細胞（１
，５〜２Ｘ１０７）個を２０ｍの注射器胴中の０．９ｆ
のナイロンウールで作られ九カラムに装填した。付着し
なかった細胞は溶離により集めるが、一方付着した細胞
はナイロンウールを注射器プランジャーで交互に洗浄お
よびしぼり出すことにより収穫した。分離した細胞をＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で２回洗浄した。各集団の細胞
１００万個を抗原、１０−ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏｂｅｅ
。
てＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗った。膵臓細胞（１
，５〜２Ｘ１０７）個を２０ｍの注射器胴中の０．９ｆ
のナイロンウールで作られ九カラムに装填した。付着し
なかった細胞は溶離により集めるが、一方付着した細胞
はナイロンウールを注射器プランジャーで交互に洗浄お
よびしぼり出すことにより収穫した。分離した細胞をＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で２回洗浄した。各集団の細胞
１００万個を抗原、１０−ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏｂｅｅ
。
ボストン、米国マサチューセッツ州）、ス５μ？／−の
大腸菌リボ多糖類（Ｄｉｒｃｏ 、デトロイト。
大腸菌リボ多糖類（Ｄｉｒｃｏ 、デトロイト。
米国ミシガン州）、および２０チのプールされた植物凝
集素（ＰＨＡ ）活性化されたリン、ｏ球場養液上澄み
液（ＬＣ８）を含有する１６１ＤＩの各培養ウェルに添
加した。最終容量２ｄ中の細胞を１０％のｃｏ２中３中
上７℃〜６日間培養した。抗原は破傷風トキソイドに結
合した可溶性（Ｌｙａ’〕−ボンベシンであった。代表
的には抗原の５種類またはそれ以上の濃度物を各実験に
おいて用いそして各濃度につき８〜１０個のウェルな用
いた。
集素（ＰＨＡ ）活性化されたリン、ｏ球場養液上澄み
液（ＬＣ８）を含有する１６１ＤＩの各培養ウェルに添
加した。最終容量２ｄ中の細胞を１０％のｃｏ２中３中
上７℃〜６日間培養した。抗原は破傷風トキソイドに結
合した可溶性（Ｌｙａ’〕−ボンベシンであった。代表
的には抗原の５種類またはそれ以上の濃度物を各実験に
おいて用いそして各濃度につき８〜１０個のウェルな用
いた。
感作期間の終りに、同じウェルからの細胞を集めそして
ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗った。次にこれらを慣
用の実験方法手順に従い５０Ｉｓのポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ、分子量１０００） ｔたは４５−のｐｇ
ｏ （分子量４０００）を使用して同数のＮ５−１細胞
と融合させた。融合した細胞を２０％のＦｅ２ 、 ２
ｍＭのグルタミン、１ ｍＭのピルヒン酸ナトリウム
、５ ％ ｏ ＮＣＴＣ−１０９（登ｅ＋ｗ標ＧＩＢＣ
Ｏ製、Ｇｌａｎｄ Ｉｓ １ａｎｄ 、米国ニューヨー
ク州）、１０μｔｔ／ｖｄのゲンタマイシン、１０−４
Ｍのヒポキサンチン、４Ｘ１０−７Ｍのアミノプテリ
ン、および１．＜ＳＸ１０−５Ｍのチミジンを補給され
たＲＰＭＩ−１６４０培地中１ウェル当りリンパ球１０
５個で培養した。同種の照射（２００ＯＲ）された末梢
血液リンパ球を供給細胞として１ウェル当９１．５×１
０４個加えた。・・イブリッドが２〜３週で現われ、そ
してＫＬＩＳＡ Ｋより抗−ボンベシン抗体について検
査した。
ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗った。次にこれらを慣
用の実験方法手順に従い５０Ｉｓのポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ、分子量１０００） ｔたは４５−のｐｇ
ｏ （分子量４０００）を使用して同数のＮ５−１細胞
と融合させた。融合した細胞を２０％のＦｅ２ 、 ２
ｍＭのグルタミン、１ ｍＭのピルヒン酸ナトリウム
、５ ％ ｏ ＮＣＴＣ−１０９（登ｅ＋ｗ標ＧＩＢＣ
Ｏ製、Ｇｌａｎｄ Ｉｓ １ａｎｄ 、米国ニューヨー
ク州）、１０μｔｔ／ｖｄのゲンタマイシン、１０−４
Ｍのヒポキサンチン、４Ｘ１０−７Ｍのアミノプテリ
ン、および１．＜ＳＸ１０−５Ｍのチミジンを補給され
たＲＰＭＩ−１６４０培地中１ウェル当りリンパ球１０
５個で培養した。同種の照射（２００ＯＲ）された末梢
血液リンパ球を供給細胞として１ウェル当９１．５×１
０４個加えた。・・イブリッドが２〜３週で現われ、そ
してＫＬＩＳＡ Ｋより抗−ボンベシン抗体について検
査した。
■、結果
ナイロンウール上で分離された２種類の細胞集団に関す
る免疫蛍光研究では非付着フラクションはＴ −ＩＪン
パ球が富化されている（非付着フラクション中７７一対
もとの集団中５７ｅｓ）のに対し付着フラクションでは
Ｂ −ＩＪンパ球が富化されている（付着７２２７３７
９８３％対もとの集団中６４チ）ことが示された。
る免疫蛍光研究では非付着フラクションはＴ −ＩＪン
パ球が富化されている（非付着フラクション中７７一対
もとの集団中５７ｅｓ）のに対し付着フラクションでは
Ｂ −ＩＪンパ球が富化されている（付着７２２７３７
９８３％対もとの集団中６４チ）ことが示された。
２種類の集団を同数で混合すると、Ｔ−ヘルパー細胞対
Ｂ−細胞比約６３−を有しそしてＴ−サプレッサー細胞
含量かもとの集団のそれとほぼ等しい第２の集団が得ら
れた。この第２の集団を２０−のＬＣ８，１０−ヒトＡ
Ｂ血清、７．５μｍ省のリボ多糖類（ＬＰＳ ）および
可溶性ＢＴＴと培養した。至適刺激を与える抗原の濃度
が供血者中で変動するゆえ、各実験において０．６ｎｙ
〜〜６μＶ／−の範囲のＢＴＴ０６〜４種類の量が試験
された。６日間培養後、感作された細胞をＮ８−１細胞
と融合させそしてハイブリッドを融合３〜４週ｆｆ１Ｋ
ＢＴＴ、ボンベシン−チログロブリン（ＢＴＧ ） 、
破傷風トキソイド（ＴＴ ）またはチログロブリン（Ｔ
Ｇ ）との反応性について検定した。
Ｂ−細胞比約６３−を有しそしてＴ−サプレッサー細胞
含量かもとの集団のそれとほぼ等しい第２の集団が得ら
れた。この第２の集団を２０−のＬＣ８，１０−ヒトＡ
Ｂ血清、７．５μｍ省のリボ多糖類（ＬＰＳ ）および
可溶性ＢＴＴと培養した。至適刺激を与える抗原の濃度
が供血者中で変動するゆえ、各実験において０．６ｎｙ
〜〜６μＶ／−の範囲のＢＴＴ０６〜４種類の量が試験
された。６日間培養後、感作された細胞をＮ８−１細胞
と融合させそしてハイブリッドを融合３〜４週ｆｆ１Ｋ
ＢＴＴ、ボンベシン−チログロブリン（ＢＴＧ ） 、
破傷風トキソイド（ＴＴ ）またはチログロブリン（Ｔ
Ｇ ）との反応性について検定した。
ＢＴＴおよびＢＴＧ Ｋ結合するがしかしＴＴにもＴＧ
にも結合しない抗体を産生ずるハイブリッド（ＢＭ−１
）を選択し喪。この反応パターンはボンベシンに対する
抗体の存在を強く示唆している。
にも結合しない抗体を産生ずるハイブリッド（ＢＭ−１
）を選択し喪。この反応パターンはボンベシンに対する
抗体の存在を強く示唆している。
ＥＬＩｓＡにおけるアイソタイプ特異的なＨＲＰ接合し
た抗体の使用により特異的抗体がＩｇＭであることが示
された。このハイブリッドを限界希釈によりクローンし
そしてその特異性をＥＬＩＳＡにおいて滴定することに
より確認した。
た抗体の使用により特異的抗体がＩｇＭであることが示
された。このハイブリッドを限界希釈によりクローンし
そしてその特異性をＥＬＩＳＡにおいて滴定することに
より確認した。
抗体ＢＭ−１０Ｂ’ｌ”ｒおよびＢＴＧへの、しかしＴ
ＴまえはＴＧへではない結合はそれが抗−ボンベシンで
あることを強く示唆している。しかしながら推定される
抗−ボンベシン抗体の特異性をさらＫ１１ｌ査するため
には、予めＢ’ｒＴへの半最大結合を生ずることが判明
している抗体の希釈物を用いる拮抗的阻害が行われた。
ＴまえはＴＧへではない結合はそれが抗−ボンベシンで
あることを強く示唆している。しかしながら推定される
抗−ボンベシン抗体の特異性をさらＫ１１ｌ査するため
には、予めＢ’ｒＴへの半最大結合を生ずることが判明
している抗体の希釈物を用いる拮抗的阻害が行われた。
ＢＭ−１抗体のＢＴＴへの結合はＥＣＤＩ ＫよりＴ’
ＴまたはＴＧＫ接合したボンベシンとハイブリッド上澄
み液とを予備培養することにより阻害された。これと対
照的に、未接合ＴＴまたはＴＧは阻害的でなかった。こ
の反応性パターンにより最初のＥＣＬＩＳＡにおいて観
察されたことが確認された。抗体がカップリング剤ＥＣ
ＤＩ上の決定基を識別する可能性を除外するために非接
合（Ｌｙｓ’〕−ボンベシンおよびグルタルアルデヒド
による接合により調製されたＢＴＧが阻害剤として包含
された。いずれの試薬も阻害性であり、このことはＢＭ
−１が真正の抗−ボンベシン抗体を産生ずることを示し
ていた。
ＴまたはＴＧＫ接合したボンベシンとハイブリッド上澄
み液とを予備培養することにより阻害された。これと対
照的に、未接合ＴＴまたはＴＧは阻害的でなかった。こ
の反応性パターンにより最初のＥＣＬＩＳＡにおいて観
察されたことが確認された。抗体がカップリング剤ＥＣ
ＤＩ上の決定基を識別する可能性を除外するために非接
合（Ｌｙｓ’〕−ボンベシンおよびグルタルアルデヒド
による接合により調製されたＢＴＧが阻害剤として包含
された。いずれの試薬も阻害性であり、このことはＢＭ
−１が真正の抗−ボンベシン抗体を産生ずることを示し
ていた。
特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コン／ミニ− 外２名
・アンド・コン／ミニ− 外２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）（ａ）ヒト脾細胞集団を取得し（第１集団）（ｂ）
第１フラクションがＴ−細胞に富みそして第２のフラク
ションがＢ−細胞に富むように第１集団を分別し （ｃ）第１および第２のフラクションからの細胞を一緒
に混合してＴ−ヘルパー細胞対Ｂ−細胞比少くとも０．
４を有しそしてＴ−サプレッサー細胞の％が第１の集団
とは実質上変化してないような第２の集団を形成させ、
そして （ｄ）ヒト血清、免疫原、およびＴ−細胞とＢ−細胞の
増殖と分化を誘導しうるリンフォカインの存在下に第２
の集団を培養する ことからなる免疫原に対する免疫能のあるヒト脾細胞の
生体外免疫処置法。 ２）工程（ｂ）が第１の集団をナイロンウールと接触さ
せることにより行われ、それにより第２のフラクション
がナイロンウールに吸着されそして第１のフラクション
が遊離状態で残り、第２のフラクションは続いて工程（
ｃ）で使用するために脱着されるものである前記特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３）工程（ｄ）の培地がさらに単球活性剤を含有する前
記特許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ４）ヒト血清が同種である前記特許請求の範囲第１また
は２項記載の方法。 ５）ヒト血清が同種である前記特許請求の範囲第３項記
載の方法。 ６）免疫原が細胞抗原、ウィルス抗原、毒素、血液型抗
原、リンパ系細胞抗原、ミオシンおよび腫瘍抗原から選
択される前記特許請求の範囲第１または２項記載の方法
。 ７）免疫原が腫瘍細胞から分泌された生成物である前記
特許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ８）工程（ｄ）の培地がさらに単球活性剤を含有する前
記特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９）ヒト血清が同種である前記特許請求の範囲第６項記
載の方法。 １０）腫瘍抗原に対して生体外免疫された免疫能のある
ヒト脾細胞。 １１）前記特許請求の範囲第１０項記載の脾細胞と不死
細胞との融合により形成されるハイブリドーマ。 １２）前記特許請求の範囲第１１項記載のハイブリドー
マの生産物であるヒトモノクローナル抗体。 １３）前記特許請求の範囲第１０項記載の脾細胞の形質
転換により形成された不死細胞系統。 １４）形質転換がＥＢＶまたは発癌性ＤＮＡを用いて行
われる前記特許請求の範囲第１２項記載の細胞系統。 １５）前記特許請求の範囲第１３または１４項記載の無
限生存細胞系統の生産物であるヒトモノクローナル抗体
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/736,660 US5106746A (en) | 1985-05-22 | 1985-05-22 | Process for the in vitro immunization of human splenocytes against tumor associated antigens |
| US736660 | 1992-02-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61271983A true JPS61271983A (ja) | 1986-12-02 |
Family
ID=24960774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61114971A Pending JPS61271983A (ja) | 1985-05-22 | 1986-05-21 | 腫瘍会合抗原に対するヒト脾細胞の生体外免疫処置法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5106746A (ja) |
| EP (1) | EP0202642A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61271983A (ja) |
| AU (1) | AU591901B2 (ja) |
| DK (1) | DK237186A (ja) |
| GR (1) | GR861342B (ja) |
| IL (1) | IL78869A (ja) |
| NZ (1) | NZ216249A (ja) |
| ZA (1) | ZA863789B (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341552C (en) * | 1988-09-23 | 2007-10-02 | Kenneth Alonso | Method of producing human-human hybridomas, the production of monoclonal and polyclonal antibodies therefrom, and therapeutic use thereof |
| DE4422020A1 (de) * | 1993-07-29 | 1995-02-02 | Bernhard Heising | Pharmazeutische Zusammensetzung |
| AU7386094A (en) * | 1993-07-29 | 1995-02-28 | Bernhard Heising | T-lymphocyte-containing pharmaceutical composition for treating infections |
| US6713250B1 (en) * | 1997-08-08 | 2004-03-30 | The Research Foundation Of State University Of New York | Identification of human allergens and T-lymphocyte antigens in vitro |
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