JP2648318B2 - ヒトモノクローナル抗体製造法、およびそのキット - Google Patents
ヒトモノクローナル抗体製造法、およびそのキットInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
- C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
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- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、インビトロ免疫（in vitro immunisatio
n）のための、ヒトリンパ球を含む細胞群から望ましく
ない細胞を除去する方法、ヒトモノクローナル抗体の生
産において使用されるリンパ球のインビトロ免疫におけ
る方法およびヒトモノクローナル抗体の生産において使
用されるリンパ球のインビトロ免疫のためのキットから
なる。
n）のための、ヒトリンパ球を含む細胞群から望ましく
ない細胞を除去する方法、ヒトモノクローナル抗体の生
産において使用されるリンパ球のインビトロ免疫におけ
る方法およびヒトモノクローナル抗体の生産において使
用されるリンパ球のインビトロ免疫のためのキットから
なる。
技術背景 モノクローナル抗体は、1975年にKoehlerおよびMilst
einによって紹介された。この概念は、免疫リンパ球
を、継続的株化細胞（cell line）、例えば骨髄腫細胞
（myeloma）、と融合させるものである。クローニング
および選択法によって、特異性抗体（specific antibod
y）を生産する細胞を選択して培養することが可能であ
る。この細胞クローンは、このように一つのオリジナル
の細胞に由来するものであって（「モノクローナ
ル」）、特異性抗体と完全に一致するコピーを生産す
る。これらのモノクローナル抗体は、多くの分子に対し
て調製されてきた。このタイプの抗体は、広範囲に使用
されてきたし、いまも使用されている。また、商業的発
展も考慮されて、今日、多数のモノクローナル抗体、と
りわけ診断を目的にしたもの、が市販されている。
einによって紹介された。この概念は、免疫リンパ球
を、継続的株化細胞（cell line）、例えば骨髄腫細胞
（myeloma）、と融合させるものである。クローニング
および選択法によって、特異性抗体（specific antibod
y）を生産する細胞を選択して培養することが可能であ
る。この細胞クローンは、このように一つのオリジナル
の細胞に由来するものであって（「モノクローナ
ル」）、特異性抗体と完全に一致するコピーを生産す
る。これらのモノクローナル抗体は、多くの分子に対し
て調製されてきた。このタイプの抗体は、広範囲に使用
されてきたし、いまも使用されている。また、商業的発
展も考慮されて、今日、多数のモノクローナル抗体、と
りわけ診断を目的にしたもの、が市販されている。
これらの抗体の治療的使用が広く予示されたにもかか
わらず、マウスのモノクローナル抗体（すなわち、免疫
マウスリンパ球によって調製されたもの）のこの発達
に、ヒトモノクローナル抗体に関しては追いついていな
い。これは、実用的な方法では、細胞ハイブリダイゼー
ションまたはトランスフェクション（transfection）に
よる不滅化（immortalisation）のための免疫ヒトリン
パ球を生産するに至ることがきわめて困難であるという
事実による。倫理的には、今日、それらに対してヒトモ
ノクローナル抗体の生産が望まれるような分子を用いて
患者、ボランティアなどに免疫を行うことはできない。
例えば腫瘍関連抗原、微生物およびウイルス抗原、トキ
シンなどである。現在もでのところでは、例えば感染や
腫瘍などの患者を発見して、これによって免疫リンパ球
（いわゆるインビボ感作リンパ球）を得るという方法が
ある。実際上は、この方法は受け入れられない。
わらず、マウスのモノクローナル抗体（すなわち、免疫
マウスリンパ球によって調製されたもの）のこの発達
に、ヒトモノクローナル抗体に関しては追いついていな
い。これは、実用的な方法では、細胞ハイブリダイゼー
ションまたはトランスフェクション（transfection）に
よる不滅化（immortalisation）のための免疫ヒトリン
パ球を生産するに至ることがきわめて困難であるという
事実による。倫理的には、今日、それらに対してヒトモ
ノクローナル抗体の生産が望まれるような分子を用いて
患者、ボランティアなどに免疫を行うことはできない。
例えば腫瘍関連抗原、微生物およびウイルス抗原、トキ
シンなどである。現在もでのところでは、例えば感染や
腫瘍などの患者を発見して、これによって免疫リンパ球
（いわゆるインビボ感作リンパ球）を得るという方法が
ある。実際上は、この方法は受け入れられない。
したがって、いわゆるインビトロ免疫が発達してき
た。すなわち、非免疫ヒト白血球を細胞培養環境下で免
疫し、これによってすべてのタイプの抗原が用いられる
かをどうかを確認する。これらのインビトロ免疫された
ヒトリンパ球を、次いで骨髄腫細胞またはリンパ芽球
（lymphoblastoid）細胞と融合させてヒトモノクローナ
ル抗体の継続的生産を行う。代わりに、免疫リンパ球を
適当なウイルスまたは細菌ゲノムでトランスフェクトさ
せて細胞を不滅化させることも可能である。
た。すなわち、非免疫ヒト白血球を細胞培養環境下で免
疫し、これによってすべてのタイプの抗原が用いられる
かをどうかを確認する。これらのインビトロ免疫された
ヒトリンパ球を、次いで骨髄腫細胞またはリンパ芽球
（lymphoblastoid）細胞と融合させてヒトモノクローナ
ル抗体の継続的生産を行う。代わりに、免疫リンパ球を
適当なウイルスまたは細菌ゲノムでトランスフェクトさ
せて細胞を不滅化させることも可能である。
換言すれば、インビトロ免疫は、ヒトモノクローナル
抗体を将来実用的にまた人道的に受け入れられる方法で
調製することを可能にする唯一の技術である。この技術
は、長年、ネズミの系で発達してきた。今日、マウス細
胞では、よく機能するインビトロ免疫法が存在する（Bo
rrehaeck:1986）。
抗体を将来実用的にまた人道的に受け入れられる方法で
調製することを可能にする唯一の技術である。この技術
は、長年、ネズミの系で発達してきた。今日、マウス細
胞では、よく機能するインビトロ免疫法が存在する（Bo
rrehaeck:1986）。
インビトロ免疫を提供するためにかなりの資力が投入
されてきたヒトの系においては、今日、マウスの系に早
退するようなものは何もない。これは、ヒト細胞の場合
の活性化要求性が一部異なっているからであり、とりわ
け、おそらく、より深い休止の状態にある（"in a“dee
per"state of rest）末梢血リンパ球を用いてきたから
である。それでも、例えば、ボンベシン（bombesin）
（Hoら:1985）およびDNP−HSA（Tengら:1985）などの
２、３のタイプのハプテン、および赤小体（red corpus
cles）（Strikeら:1984、HoffmanおよびHirst:1985）に
対するヒトインビトロ免疫についての報告がいくつかあ
る。これらのインビトロ免疫系は優劣つけがたいが、異
なる技術を用いて著しく異なる結果が得られており、し
ばしば特異性ハイブリドーマの収率がきわめて低い。加
えて、現在、胸腺依存性抗原に対するインビトロでの充
分な一次的免疫応答を生じさせることができる系が、全
くない。異なるタイプのＴ細胞由来のリンホカインを使
用することは、マウス細胞に関してはよく機能する技術
の一つである（BorrebaeckおよびMoeller:1986）が、そ
れだけでは、ヒトの系において充分ではない。ヒトモノ
クローナル抗体の生産のためのヒトインビトロ免疫を支
持するために試みられてきた他の攻略技術は、以下を用
いることからなる。
されてきたヒトの系においては、今日、マウスの系に早
退するようなものは何もない。これは、ヒト細胞の場合
の活性化要求性が一部異なっているからであり、とりわ
け、おそらく、より深い休止の状態にある（"in a“dee
per"state of rest）末梢血リンパ球を用いてきたから
である。それでも、例えば、ボンベシン（bombesin）
（Hoら:1985）およびDNP−HSA（Tengら:1985）などの
２、３のタイプのハプテン、および赤小体（red corpus
cles）（Strikeら:1984、HoffmanおよびHirst:1985）に
対するヒトインビトロ免疫についての報告がいくつかあ
る。これらのインビトロ免疫系は優劣つけがたいが、異
なる技術を用いて著しく異なる結果が得られており、し
ばしば特異性ハイブリドーマの収率がきわめて低い。加
えて、現在、胸腺依存性抗原に対するインビトロでの充
分な一次的免疫応答を生じさせることができる系が、全
くない。異なるタイプのＴ細胞由来のリンホカインを使
用することは、マウス細胞に関してはよく機能する技術
の一つである（BorrebaeckおよびMoeller:1986）が、そ
れだけでは、ヒトの系において充分ではない。ヒトモノ
クローナル抗体の生産のためのヒトインビトロ免疫を支
持するために試みられてきた他の攻略技術は、以下を用
いることからなる。
（１） ムラミルジペプチド（muramyl dipeptide）な
どのアジュバントペプチド （２） モノカイン（monokine）添加培地 （３） セファロール／セファデックス、ゼラチン、プ
ラスチック、ナイロンウール付着体（adherence）、抗
体スパニング（spanning）、補体融解（lysis）、アフ
ィニティーカラム、を用いる細胞群の分離 （４） ポリクローナル活性化物質、例えば、内毒素
（endotoxins）（LPS）、レクチン（PHA、PWM、Con
A）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcu
s aureus）細胞、プロテインＡまたはＧ （５） ABO、FCS、ウサギ血清などの特殊血清問題は、
特に、本来インビトロにおいて、抗原特異性の免疫応答
を抑制するか、さもなければ、阻害する機能を有する細
胞部分集団（subpopulations）［おそらくは細胞毒性
（cytotoxic）のもの］の除去にあることが今や明らか
になってきた。
どのアジュバントペプチド （２） モノカイン（monokine）添加培地 （３） セファロール／セファデックス、ゼラチン、プ
ラスチック、ナイロンウール付着体（adherence）、抗
体スパニング（spanning）、補体融解（lysis）、アフ
ィニティーカラム、を用いる細胞群の分離 （４） ポリクローナル活性化物質、例えば、内毒素
（endotoxins）（LPS）、レクチン（PHA、PWM、Con
A）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcu
s aureus）細胞、プロテインＡまたはＧ （５） ABO、FCS、ウサギ血清などの特殊血清問題は、
特に、本来インビトロにおいて、抗原特異性の免疫応答
を抑制するか、さもなければ、阻害する機能を有する細
胞部分集団（subpopulations）［おそらくは細胞毒性
（cytotoxic）のもの］の除去にあることが今や明らか
になってきた。
本発明の開示 したがって、本発明の目的は、インビトロ免疫のため
の、ヒトリンパ球を含む細胞群から望ましくない細胞を
除去する方法を提供するものであって、これによって特
異的に抗原に対してインビトロで活性化されたヒトリン
パ球を充分量生産することが可能になる。これは、さら
にヒトモノクローナル抗体の生産において、融合または
トランスフェクションの相手として利用される。ヒト血
液、へん桃腺、リンパ節、脾臓細胞、骨髄などから、特
異的にインビトロ免疫されたヒトリンパ球の高収率をこ
れまで妨げてきた望ましくない細胞部分集団を除去する
この方法は、いわゆる向リソゾーム因子（lysosomotrop
ic agents）を用いることに特徴がある。これらの因子
は、すべてのリソゾームを含む細胞、例えば、単球（mo
nocyte）／マクロファージ、NK細胞および可能な他の現
在まだ知られていない細胞部分集団を30〜40分の短時間
で殺す特異的能力を有する（Thicleら:1983、1986）。
の、ヒトリンパ球を含む細胞群から望ましくない細胞を
除去する方法を提供するものであって、これによって特
異的に抗原に対してインビトロで活性化されたヒトリン
パ球を充分量生産することが可能になる。これは、さら
にヒトモノクローナル抗体の生産において、融合または
トランスフェクションの相手として利用される。ヒト血
液、へん桃腺、リンパ節、脾臓細胞、骨髄などから、特
異的にインビトロ免疫されたヒトリンパ球の高収率をこ
れまで妨げてきた望ましくない細胞部分集団を除去する
この方法は、いわゆる向リソゾーム因子（lysosomotrop
ic agents）を用いることに特徴がある。これらの因子
は、すべてのリソゾームを含む細胞、例えば、単球（mo
nocyte）／マクロファージ、NK細胞および可能な他の現
在まだ知られていない細胞部分集団を30〜40分の短時間
で殺す特異的能力を有する（Thicleら:1983、1986）。
この方法は、したがって、大規模の細胞分離実験（現
時点では、満足のゆく方法はない。しかも、正確にどの
細胞が目的の細胞であるかはわからない）をすることな
く、約30あるいは40分間でリンパ球集団を、ヒトモノク
ローナル抗体の生産のためのインビトロ免疫実験に用い
ることができるように適応させることが可能である。こ
れは、リンパ球集団のＢ細胞が、今や、リソゾーム−陽
性細胞からのいかなる不利な影響をも受けることなく抗
原−特異的に活性化される可能性を付与されたことか
ら、可能である。このようにして、ヒトモノクローナル
抗体の現在唯一の生産源として使用が可能な免疫リンパ
球集団が生産された。これは、また、ヒトモノクローナ
ル抗体の生産をマウスモノクローナル抗体と同じ範囲で
開始することが可能であることを意味する。ヒトモノク
ローナル抗体は、インビボで、腫瘍の治療、腫瘍の探
知、毒殺（poisonings）、移植拒絶反応防御などにおい
て、広く用いられる可能性がある。
時点では、満足のゆく方法はない。しかも、正確にどの
細胞が目的の細胞であるかはわからない）をすることな
く、約30あるいは40分間でリンパ球集団を、ヒトモノク
ローナル抗体の生産のためのインビトロ免疫実験に用い
ることができるように適応させることが可能である。こ
れは、リンパ球集団のＢ細胞が、今や、リソゾーム−陽
性細胞からのいかなる不利な影響をも受けることなく抗
原−特異的に活性化される可能性を付与されたことか
ら、可能である。このようにして、ヒトモノクローナル
抗体の現在唯一の生産源として使用が可能な免疫リンパ
球集団が生産された。これは、また、ヒトモノクローナ
ル抗体の生産をマウスモノクローナル抗体と同じ範囲で
開始することが可能であることを意味する。ヒトモノク
ローナル抗体は、インビボで、腫瘍の治療、腫瘍の探
知、毒殺（poisonings）、移植拒絶反応防御などにおい
て、広く用いられる可能性がある。
本発明の更なる目的は、ヒトモノクローナル抗体の生
産において用いるリンパ球のインビトロ免疫の方法を提
供することにある。この方法では、向リソゾーム性因
子、それらの誘導体、またはこれらの因子を基にして合
成した物質はインビトロでヒトリンパ球を含む細胞群に
作用して、インビトロ免疫に不利に影響する細胞群を除
去して、これによって、リンパ球はインビトロで抗原−
特異的に免疫されて不滅化される。不滅化は、ネズミま
たはヒト骨髄腫細胞、リンパ芽球株、リンパ腫細胞との
融合、またはエプスタイン・バーウイルス感染（Epstei
n−Barr viral infection）によって、行うことができ
る。さらに、不滅化は、免疫抗原−特異性細胞をウイル
ス、細菌または哺乳動物のゲノムでトランスフェクトさ
せて行うことができる。
産において用いるリンパ球のインビトロ免疫の方法を提
供することにある。この方法では、向リソゾーム性因
子、それらの誘導体、またはこれらの因子を基にして合
成した物質はインビトロでヒトリンパ球を含む細胞群に
作用して、インビトロ免疫に不利に影響する細胞群を除
去して、これによって、リンパ球はインビトロで抗原−
特異的に免疫されて不滅化される。不滅化は、ネズミま
たはヒト骨髄腫細胞、リンパ芽球株、リンパ腫細胞との
融合、またはエプスタイン・バーウイルス感染（Epstei
n−Barr viral infection）によって、行うことができ
る。さらに、不滅化は、免疫抗原−特異性細胞をウイル
ス、細菌または哺乳動物のゲノムでトランスフェクトさ
せて行うことができる。
この方法に用いることができる向リソゾーム性因子に
は、タイプＬ−ロイシンメチルエステル（Leu−OMe）、
Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルなどのアミノ酸エス
テル（GoldmanおよびKaplan:1973）がある。また、向リ
ソゾーム性アミノ酸の誘導体またはこれらの誘導体を基
にしたペプチドも用いることができる。これらの因子は
原形質膜（plasma cell membrane）を貫通して、自由に
リソゾーム中に拡散し、ここで迅速に代謝されて遊離の
アミノ酸になる。これらのより極性の大きい遊離のアミ
ノ酸は、メチルエステルが拡散して侵入するほどに速く
はリソゾームから拡散して出ることができない。その結
果、リソゾーム内の浸透圧の上昇が起きて、続いてこれ
らの細胞小器官（organelles）の破裂が起きる。しかし
ながら、我々は、向リソゾーム性物質の挙動をいかなる
特定の説とも結び付けることは望まない。
は、タイプＬ−ロイシンメチルエステル（Leu−OMe）、
Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルなどのアミノ酸エス
テル（GoldmanおよびKaplan:1973）がある。また、向リ
ソゾーム性アミノ酸の誘導体またはこれらの誘導体を基
にしたペプチドも用いることができる。これらの因子は
原形質膜（plasma cell membrane）を貫通して、自由に
リソゾーム中に拡散し、ここで迅速に代謝されて遊離の
アミノ酸になる。これらのより極性の大きい遊離のアミ
ノ酸は、メチルエステルが拡散して侵入するほどに速く
はリソゾームから拡散して出ることができない。その結
果、リソゾーム内の浸透圧の上昇が起きて、続いてこれ
らの細胞小器官（organelles）の破裂が起きる。しかし
ながら、我々は、向リソゾーム性物質の挙動をいかなる
特定の説とも結び付けることは望まない。
本発明は、また、インビトロ免疫のための、望ましく
ない細胞をヒトリンパ球を含む細胞群から除去するため
のキットからなる。そのように処理された細胞群は、次
いでモノクローナル抗体の生産に用いることができる。
キットは、リンフォカインを含む容器および向リソゾー
ム性因子、それらの誘導体、またはそれらの因子を基に
して合成された物質を含む更なる容器を含む。さらに、
キットは、好ましくは、あるタイプの免疫応答修飾因
子、いわゆるBRM（Biological Response Modifier）お
よび細胞群への試薬の効果を高めるための種々の使い捨
て材料、および使用指示書を含む。
ない細胞をヒトリンパ球を含む細胞群から除去するため
のキットからなる。そのように処理された細胞群は、次
いでモノクローナル抗体の生産に用いることができる。
キットは、リンフォカインを含む容器および向リソゾー
ム性因子、それらの誘導体、またはそれらの因子を基に
して合成された物質を含む更なる容器を含む。さらに、
キットは、好ましくは、あるタイプの免疫応答修飾因
子、いわゆるBRM（Biological Response Modifier）お
よび細胞群への試薬の効果を高めるための種々の使い捨
て材料、および使用指示書を含む。
本発明は以下の諸例により詳細に記述される通りであ
る。
る。
例１ ヒト末梢リンパ球をフィコール（Ficoll）勾配での密
度遠心分離によって精製した。リンパ球（10×106細胞/
ml）を0.45mg/mlのＬ−ロイシンメチルエステルで25℃
で40分間処理した。培地の血清レベルは低くなければな
らない。そのために、R0［０％胎児ウシ血清（FCS）を
含むRPMI1640）を用いた。次いで、細胞をR2−５（２〜
５％FCSを含むRPMI1640］中で２回洗浄した。これらを
ヒトモノクローナル抗体の生産のためのインビトロ免疫
に加えた。インビトロ免疫の期間は６日で、用いた免疫
原は１μg/mlのKLHであった。培養には、また、リンフ
ォカイン、TRF、BCDF、IL−1/2、を含ませた。第６日目
に、何個の抗原−特異性プラーク形成細胞が形成された
かを調べた。この数値によって、インビトロ免疫がどの
程度に良好に機能しているかを知ることができる。Leu
−OMeで処理しなかった細胞を対照に用いた。結果は表
１に示される通りである。
度遠心分離によって精製した。リンパ球（10×106細胞/
ml）を0.45mg/mlのＬ−ロイシンメチルエステルで25℃
で40分間処理した。培地の血清レベルは低くなければな
らない。そのために、R0［０％胎児ウシ血清（FCS）を
含むRPMI1640）を用いた。次いで、細胞をR2−５（２〜
５％FCSを含むRPMI1640］中で２回洗浄した。これらを
ヒトモノクローナル抗体の生産のためのインビトロ免疫
に加えた。インビトロ免疫の期間は６日で、用いた免疫
原は１μg/mlのKLHであった。培養には、また、リンフ
ォカイン、TRF、BCDF、IL−1/2、を含ませた。第６日目
に、何個の抗原−特異性プラーク形成細胞が形成された
かを調べた。この数値によって、インビトロ免疫がどの
程度に良好に機能しているかを知ることができる。Leu
−OMeで処理しなかった細胞を対照に用いた。結果は表
１に示される通りである。
例２ 例１の方法によって１μg/mlのKLHで６日間インビト
ロ免疫しておいたヒト末梢リンパ球（PBL）を、Sp2/0−
Ag14骨髄腫細胞またはWIL2−UC729HF2リンパ芽球細胞と
ポリエチレングリコールを用いて融合させて、不滅化さ
せた。14〜21日後、増殖しているハイブリッドの抗原−
特異的抗体生産を試験した。結果は表２に示される通り
である。
ロ免疫しておいたヒト末梢リンパ球（PBL）を、Sp2/0−
Ag14骨髄腫細胞またはWIL2−UC729HF2リンパ芽球細胞と
ポリエチレングリコールを用いて融合させて、不滅化さ
せた。14〜21日後、増殖しているハイブリッドの抗原−
特異的抗体生産を試験した。結果は表２に示される通り
である。
例３ 健康な供血者からのヒト末梢血リンパ球（PBL）を密
度遠心分離によって分離して、さらに近年記述された方
法（Danielsson,L.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck,C.
A.K.:lmmunology 61、51−55、1987）にて、Ｂ、Ｔおよ
びアクセサリー（Ａ）細胞に分離した。PBLを２−アミ
ノエチル（イソチオウロニウムブロミド）で処理したヒ
ツジ赤小体とのロゼット（rosetting）によって、Ｔお
よび非Ｔ細胞に分画して、後者の細胞群をフィブロネク
チン（fibronectin）または自己融解血漿でコートした
ペトリ皿上でインキュベートした。非−吸着細胞（Ｂ細
胞）を静かに移して、吸着した細胞（アクセサリー細
胞）を10mM EDTAで除去した。Ｂ細胞を50μg/mlのスタ
フィロコッカス・アウレウスCowanおよび照射（2000R）
Ｔ細胞によって10μg/mlのPWMとともに一晩刺激した。
アクセサリー細胞を5IU/mlのγインターフェロンおよび
10μｍのインドメサシン（indomthacin）によって刺激
した。細胞群を2:1:0.4（T:B:A）の細胞比で10％ヒトAB
血清を含む添加RPMI1640の中で全６日間培養した。抗原
量は１μg/mlであった。培養物に、記述された方法（Da
nielsson,I.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck,C.A.K:Im
munlogy 61、51−55,1987）にて生産された組換えIL−
２（5U/ml）およびsPWM−Ｔ（25容量％）を加えた。無
血清RPMI1640に懸濁させたＴ細胞（107細胞/ml）を、2.
5mMに新たに調製したLeu−OMeと室温で40分間インキュ
ベートした。次いで、細胞を２％ヒトAB血清を含むRPMI
1640中で３回洗浄した。
度遠心分離によって分離して、さらに近年記述された方
法（Danielsson,L.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck,C.
A.K.:lmmunology 61、51−55、1987）にて、Ｂ、Ｔおよ
びアクセサリー（Ａ）細胞に分離した。PBLを２−アミ
ノエチル（イソチオウロニウムブロミド）で処理したヒ
ツジ赤小体とのロゼット（rosetting）によって、Ｔお
よび非Ｔ細胞に分画して、後者の細胞群をフィブロネク
チン（fibronectin）または自己融解血漿でコートした
ペトリ皿上でインキュベートした。非−吸着細胞（Ｂ細
胞）を静かに移して、吸着した細胞（アクセサリー細
胞）を10mM EDTAで除去した。Ｂ細胞を50μg/mlのスタ
フィロコッカス・アウレウスCowanおよび照射（2000R）
Ｔ細胞によって10μg/mlのPWMとともに一晩刺激した。
アクセサリー細胞を5IU/mlのγインターフェロンおよび
10μｍのインドメサシン（indomthacin）によって刺激
した。細胞群を2:1:0.4（T:B:A）の細胞比で10％ヒトAB
血清を含む添加RPMI1640の中で全６日間培養した。抗原
量は１μg/mlであった。培養物に、記述された方法（Da
nielsson,I.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck,C.A.K:Im
munlogy 61、51−55,1987）にて生産された組換えIL−
２（5U/ml）およびsPWM−Ｔ（25容量％）を加えた。無
血清RPMI1640に懸濁させたＴ細胞（107細胞/ml）を、2.
5mMに新たに調製したLeu−OMeと室温で40分間インキュ
ベートした。次いで、細胞を２％ヒトAB血清を含むRPMI
1640中で３回洗浄した。
インビトロ免疫した細胞を、免疫原KLH、非関連性抗
原（ゼラチン）および抗Ig（Ig分泌細胞の総数を知るた
めに）に対して、フィルターイムノ−プラークアッセイ
（Danielsson,I.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck C.A.
K.:Immunology 61、51−55,1987、Moeller、S.A.および
Borrebaeck、C.A.K.:J.Immunol.Methods 79、195−20
4、1985）を用いて試験した。プラーク数は３回の分析
の平均値である。結果は、表３に示される通りである。
原（ゼラチン）および抗Ig（Ig分泌細胞の総数を知るた
めに）に対して、フィルターイムノ−プラークアッセイ
（Danielsson,I.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck C.A.
K.:Immunology 61、51−55,1987、Moeller、S.A.および
Borrebaeck、C.A.K.:J.Immunol.Methods 79、195−20
4、1985）を用いて試験した。プラーク数は３回の分析
の平均値である。結果は、表３に示される通りである。
このように、Leu−OMe感受性のＴ細胞群を除去する
と、また、残ったＴ細胞を単離されたＢおよびＡ細胞と
共に同じインビトロ免疫系で試験してみると、プラーク
形成細胞の数が10倍に増加した。
と、また、残ったＴ細胞を単離されたＢおよびＡ細胞と
共に同じインビトロ免疫系で試験してみると、プラーク
形成細胞の数が10倍に増加した。
例４ 健康な供血者からのPBLを密度遠心分離を用いて分離
して、例３に記述したようにして2.5mMのLeu−OMeで処
理した。Leu−OMe処理の後に回収された平均細胞数は、
70（ｎ＝22）であった。Leu−OMe処理したPBLを、１容
量％の非必須アミノ酸、5mM L−グルタミン、ストレプ
トマイシン（50μg/ml）ペニシリン（50IU/ml）、50μ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび10％ヒトABO血清
を添加したRPMI1640中に懸濁された。血清を健康な血液
ドナーから集めた。サイトキン（cytokines）（IL−
２、sPWM−Ｔ、γインターフェロン、IL−１、BCDF）お
よび１μg/mlのKLHを次いで培養物に加えた。最終細胞
濃度は3.5×106細胞/mlであり、4ml（６ウェルプレー
ト）または30ml（75m2フラスコ）の培養物を用いた。細
胞を６日間培養して、３〜４日目にさらに培地（元の培
地量の20％）を新たに加えた。sPWM−Ｔは、γ−インタ
ーフェロン（400U/ml）、IL−２（20U/ml）およびＢ細
胞増殖および分化活性を含んだ。インビトロ免疫を試験
した時、sPWM−Ｔのバッチ間で有意な相違は認められな
かった。結果は、表４に示される通りである。
して、例３に記述したようにして2.5mMのLeu−OMeで処
理した。Leu−OMe処理の後に回収された平均細胞数は、
70（ｎ＝22）であった。Leu−OMe処理したPBLを、１容
量％の非必須アミノ酸、5mM L−グルタミン、ストレプ
トマイシン（50μg/ml）ペニシリン（50IU/ml）、50μ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび10％ヒトABO血清
を添加したRPMI1640中に懸濁された。血清を健康な血液
ドナーから集めた。サイトキン（cytokines）（IL−
２、sPWM−Ｔ、γインターフェロン、IL−１、BCDF）お
よび１μg/mlのKLHを次いで培養物に加えた。最終細胞
濃度は3.5×106細胞/mlであり、4ml（６ウェルプレー
ト）または30ml（75m2フラスコ）の培養物を用いた。細
胞を６日間培養して、３〜４日目にさらに培地（元の培
地量の20％）を新たに加えた。sPWM−Ｔは、γ−インタ
ーフェロン（400U/ml）、IL−２（20U/ml）およびＢ細
胞増殖および分化活性を含んだ。インビトロ免疫を試験
した時、sPWM−Ｔのバッチ間で有意な相違は認められな
かった。結果は、表４に示される通りである。
これらの結果は、ヒト末梢リンパ球は、分離してLeu
−OMe処理した細胞と同等の効率でインビトロ免疫され
ることを示す。その結果、多くの複雑な細胞分離工程を
省くことができる。
−OMe処理した細胞と同等の効率でインビトロ免疫され
ることを示す。その結果、多くの複雑な細胞分離工程を
省くことができる。
例５ インビトロ免疫されたPBL（KLH1μg/ml）および悪性
（malign）融合相手を2:1の比で混合して30％（HF2）ま
たは45％（NS−1/SP2/g）のポリエチレングリコール
（分子量1540）および７％ジメチルスルホキシド（sulp
hoxide）を用いて融合させた（Borrebaeck,C.A.K.:Scan
d.J.Immunol.18、９−12、1983）。ヒト×ヒト−ハイブ
リッドを、添加（supplemented）RPMI1640（10％胎児ウ
シ血清、1mMプルビン酸ナトリウム、132μg/mlオギザロ
酢酸、100μＭヒポキサンチン、0.4μＭアミノプレリ
ン、16μＭチミジンおよび15容量％HF2調整培地を含
む）中に懸濁された。マウス骨髄腫細胞を、フィーダー
（feeder）細胞を省略して融合させてクローニングし
た。ヒト×ヒト−ハイブリッドおよびヒト×ヒトマウス
−ハイブリッドを24ウェルプレートにプレーティングし
た（0.7〜1.0×106細胞／ウェル）。酵素イムノアッセ
イを用いて、特異性抗体の生産についてハイブリドーマ
をスクリーニングした。すなわち、96個のマイクロタイ
ターウェルをウェル中の抗原溶液を乾燥させることによ
って各々0.3μｇのKLHでコートした。次いでゼラチン
（0.1％）を用いて37℃で30分間ウェルを塞いだ。ハイ
ブリドーマ上清液（100μl/ウェル）を洗浄したウェル
に加えて、37℃で30分間反応させた。10％胎児ウシ血清
を含む燐酸緩衝生理食塩水溶液で希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗ヒトIg抗体（100μl/ウェル）を最終的に60
分間インキュベートして、酵素基質（ABTS）を加えてイ
ムノアッセイを行った。結果は表５に示される通りであ
る。
（malign）融合相手を2:1の比で混合して30％（HF2）ま
たは45％（NS−1/SP2/g）のポリエチレングリコール
（分子量1540）および７％ジメチルスルホキシド（sulp
hoxide）を用いて融合させた（Borrebaeck,C.A.K.:Scan
d.J.Immunol.18、９−12、1983）。ヒト×ヒト−ハイブ
リッドを、添加（supplemented）RPMI1640（10％胎児ウ
シ血清、1mMプルビン酸ナトリウム、132μg/mlオギザロ
酢酸、100μＭヒポキサンチン、0.4μＭアミノプレリ
ン、16μＭチミジンおよび15容量％HF2調整培地を含
む）中に懸濁された。マウス骨髄腫細胞を、フィーダー
（feeder）細胞を省略して融合させてクローニングし
た。ヒト×ヒト−ハイブリッドおよびヒト×ヒトマウス
−ハイブリッドを24ウェルプレートにプレーティングし
た（0.7〜1.0×106細胞／ウェル）。酵素イムノアッセ
イを用いて、特異性抗体の生産についてハイブリドーマ
をスクリーニングした。すなわち、96個のマイクロタイ
ターウェルをウェル中の抗原溶液を乾燥させることによ
って各々0.3μｇのKLHでコートした。次いでゼラチン
（0.1％）を用いて37℃で30分間ウェルを塞いだ。ハイ
ブリドーマ上清液（100μl/ウェル）を洗浄したウェル
に加えて、37℃で30分間反応させた。10％胎児ウシ血清
を含む燐酸緩衝生理食塩水溶液で希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗ヒトIg抗体（100μl/ウェル）を最終的に60
分間インキュベートして、酵素基質（ABTS）を加えてイ
ムノアッセイを行った。結果は表５に示される通りであ
る。
ヘモシアニン（hemocyanin）に特異的な抗体を分泌す
るヒト×ヒト−ハイブリドーマは、表５の結果より明ら
かなように、簡単に検出することができた。特異効率
（specific efficiency）（細胞増殖を示しているウェ
ルの数に対する特異性抗体を生産しているウェルの数×
100）は、３〜15％の範囲であった。ヒト×マウス−ハ
イブリドーマは、陽性値はより安定している（３〜５
％）がやや低い特異効率を示した。
るヒト×ヒト−ハイブリドーマは、表５の結果より明ら
かなように、簡単に検出することができた。特異効率
（specific efficiency）（細胞増殖を示しているウェ
ルの数に対する特異性抗体を生産しているウェルの数×
100）は、３〜15％の範囲であった。ヒト×マウス−ハ
イブリドーマは、陽性値はより安定している（３〜５
％）がやや低い特異効率を示した。
また、抗ヘモシアニン抗体を、コートしないマイクロ
タイターウェルまたは0.5μg/ウェルのウシ血清アルブ
ミンまたは0.1％ゼラチンでコートしたウェルに対して
酵素イムノアッセイで試験をして、反応性が非特異的な
結合によるものではないことを確認した（Haskard,D.
O.、Gul,V.およびArcher,J.R.:J.Immunol.Methods 77、
291−295、1985）。
タイターウェルまたは0.5μg/ウェルのウシ血清アルブ
ミンまたは0.1％ゼラチンでコートしたウェルに対して
酵素イムノアッセイで試験をして、反応性が非特異的な
結合によるものではないことを確認した（Haskard,D.
O.、Gul,V.およびArcher,J.R.:J.Immunol.Methods 77、
291−295、1985）。
例６ インビトロ免疫された細胞の融合および酵素イムノア
ッセイは、表５の脚注（例５）および表６の脚注に記載
されたようにして行った。ただし、酵素イムノアッセイ
におけるゼラチン塞ぎ（blocking）工程を省略した。ジ
ゴキシン（digoxin）をトランスフェリンと結合させて
（Butler,V.P.およびChen,J.P.:Proc.Natl.Acad.Sci.
（U.S.A.）57、71−78、1967）、１μg/mlのジゴキシン
−トランスフェリンをインビトロ免疫に用いた。ジゴキ
シンとトランスフェリンのモル比は、約5:1であった。
ウシ血清アルブミンと結合させたジゴキシン（0.5μg/
ウェル）を酵素イムノアッセイに用いた。結果は表６に
示される通りである。
ッセイは、表５の脚注（例５）および表６の脚注に記載
されたようにして行った。ただし、酵素イムノアッセイ
におけるゼラチン塞ぎ（blocking）工程を省略した。ジ
ゴキシン（digoxin）をトランスフェリンと結合させて
（Butler,V.P.およびChen,J.P.:Proc.Natl.Acad.Sci.
（U.S.A.）57、71−78、1967）、１μg/mlのジゴキシン
−トランスフェリンをインビトロ免疫に用いた。ジゴキ
シンとトランスフェリンのモル比は、約5:1であった。
ウシ血清アルブミンと結合させたジゴキシン（0.5μg/
ウェル）を酵素イムノアッセイに用いた。結果は表６に
示される通りである。
結果から明らかなように、特異効率は免疫原としてヘ
モシアニンを用いた場合に較べて幾らか低いが、免疫原
性ハプテンに特異的なヒト×ヒト−ハイブリドーマを生
産することができた。しかしながら、免疫原を培養物か
ら除くと、抗ジゴキシン抗体は検出されなかった。ま
た、悪性融合相手としてNS−１を用いることによって、
ジゴキシンに特異的なヒト×マウス−ヘテロハイブリド
ーマも生産された。特異効率は高く、いくつかのハイブ
リドーマは、酵素イムノアッセイで強く反応することが
証明される抗体を生産した（＞７〜８×バックグラウン
ドOD値）。抗ヘモシアニン抗体の場合と同様にして特異
性を調べた（Haskard,D.O.、Gul,V.およびArcher,J.R.:
J.Immunol.Methods 77、291−295、1985）。次いで、抗
ジゴキシン特異性ハイブリドーマを10週間の培養期間中
に限定希釈によって３回クローニングした。この時期の
後、オリジナルのハイブリドーマの約35％がジゴキシン
に特異的な抗体をまだ生産していた。
モシアニンを用いた場合に較べて幾らか低いが、免疫原
性ハプテンに特異的なヒト×ヒト−ハイブリドーマを生
産することができた。しかしながら、免疫原を培養物か
ら除くと、抗ジゴキシン抗体は検出されなかった。ま
た、悪性融合相手としてNS−１を用いることによって、
ジゴキシンに特異的なヒト×マウス−ヘテロハイブリド
ーマも生産された。特異効率は高く、いくつかのハイブ
リドーマは、酵素イムノアッセイで強く反応することが
証明される抗体を生産した（＞７〜８×バックグラウン
ドOD値）。抗ヘモシアニン抗体の場合と同様にして特異
性を調べた（Haskard,D.O.、Gul,V.およびArcher,J.R.:
J.Immunol.Methods 77、291−295、1985）。次いで、抗
ジゴキシン特異性ハイブリドーマを10週間の培養期間中
に限定希釈によって３回クローニングした。この時期の
後、オリジナルのハイブリドーマの約35％がジゴキシン
に特異的な抗体をまだ生産していた。
参考文献： Borrebaeck,C.A.K.（1986）TIBTECH.4、147 Borrebaeck,C.A.K.およびMoeller,S.A.（1986）J.Imm
unol.136、3710 Danielsson,L.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck,C.A.
K.（1986）Immunology 61、51 Goldman,R.およびKaplan,A.（1973）Biochim.Biophy
s.Acta 318、205 Ho,M.K.、Rand,N.、Murray,J.、Kato,K.およびRabin,
H.（1985）J.Immunol.135、3831 Hoffman,M.K.およびHirst,J.A.（1985）、HUMAN HYBR
IDOMAS AND MONOCLONAL ANTIBODIES（編集:Engleman,Fo
ung,LarrickおよびRaubitschek）、pp.277−289、Plenu
m Press Strike,L.E.、Devans,B.H.およびLundak,R.L.:（198
4）J.Immunol.132、1798 Teng,N.N.H.、Reyes,G.R.、Bieber,M.、Fry,K.E.、La
m,K.S.およびHobert,J.M.:（1985）HUMAN HYBRIDOMAS A
ND MONOCLONAL ANTIBODIES（編集:Englemanら）、pp、7
1−91、Plenum Press Thiele,D.L.、Kurosaka,M.およびLipsky,P.E.:（198
3）J.Immunol.131、2282 Thiele,D.L.およびLipsky,P.E.:（1986）J.Immunol.1
36、1038
unol.136、3710 Danielsson,L.、Moeller,S.A.およびBorrebaeck,C.A.
K.（1986）Immunology 61、51 Goldman,R.およびKaplan,A.（1973）Biochim.Biophy
s.Acta 318、205 Ho,M.K.、Rand,N.、Murray,J.、Kato,K.およびRabin,
H.（1985）J.Immunol.135、3831 Hoffman,M.K.およびHirst,J.A.（1985）、HUMAN HYBR
IDOMAS AND MONOCLONAL ANTIBODIES（編集:Engleman,Fo
ung,LarrickおよびRaubitschek）、pp.277−289、Plenu
m Press Strike,L.E.、Devans,B.H.およびLundak,R.L.:（198
4）J.Immunol.132、1798 Teng,N.N.H.、Reyes,G.R.、Bieber,M.、Fry,K.E.、La
m,K.S.およびHobert,J.M.:（1985）HUMAN HYBRIDOMAS A
ND MONOCLONAL ANTIBODIES（編集:Englemanら）、pp、7
1−91、Plenum Press Thiele,D.L.、Kurosaka,M.およびLipsky,P.E.:（198
3）J.Immunol.131、2282 Thiele,D.L.およびLipsky,P.E.:（1986）J.Immunol.1
36、1038
Claims (11)
- 【請求項１】インビトロ免疫する方法において、向リソ
ゾーム性因子をインビトロでヒトリンパ球を含む細胞群
に作用させ、ヒトリンパ球を含む細胞群からインビトロ
免疫にとって望ましくない細胞を除去することを特徴と
する方法。 - 【請求項２】用いられる向リソゾーム性因子が向リソゾ
ーム性アミノ酸誘導体またはそれらの誘導体を基にした
ペプチドからなることを特徴とする、請求項の範囲第１
項に記載の方法。 - 【請求項３】用いられる向リソゾーム性因子がＬ−ロイ
シン−Ｏ−メチルエステル、またはＬ−ロイシン−Ｏ−
メチルエステルを基にしたペプチドであることを特徴と
する、請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】向リソゾーム性因子をインビトロ免疫にお
いて不利益な影響を有する細胞部分集団（subpopulatio
ns）の除去のために、ヒトリンパ球を含む細胞群にイン
ビトロで作用させることからなり、これによってリンパ
球を抗原−特異的にインビトロ免疫し、かつ不滅化させ
る（immortalised）ことを特徴とする、ヒトモノクロー
ナル抗体の生産において用いるためのリンパ球のインビ
トロ免疫法。 - 【請求項５】用いられる向リソゾーム性因子が向リソゾ
ーム性アミノ酸誘導体またはそれらの誘導体を基にした
ペプチドからなることを特徴とする、請求の範囲第４項
に記載の方法。 - 【請求項６】用いられる向リソゾーム性因子がＬ−ロイ
シン−Ｏ−メチルエステル、またはＬ−ロイシン−Ｏ−
メチルエステルを基にしたペプチドであることを特徴と
する、請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項７】抗原−特異的にインビトロ免疫したリンパ
球を、ネズミまたはヒトの骨髄腫細胞、リンパ芽球細胞
系（cell line）、リンパ腫細胞、またはエプスタイン
−バールウイルス感染（Epstein−Barr viral infectio
n）によって融合させることによって不滅化させること
を特徴とする、請求の範囲第４〜６項のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項８】抗原−特異的にインビトロ免疫したリンパ
球を、ウイルスまたは哺乳動物のゲノムによってトラン
スフェクション（transfection）させることによって不
滅化させることを特徴とする、請求の範囲第４〜６項の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】活性の構成成分としてリンフォカインを含
む容器、および向リソゾーム性因子を含む容器を含んで
なることを特徴とする、ヒトモノクローナル抗体の生産
のためのリンパ球のインビトロ免疫のためのキット。 - 【請求項１０】向リソゾーム性因子が向リソゾーム性ア
ミノ酸誘導体またはそれらの誘導体を基にしたペプチド
であることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載のキ
ット。 - 【請求項１１】向リソゾーム性因子がＬ−ロイシン−Ｏ
−メチルエステル、またはＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエ
ステルを基にしたペプチドであることを特徴とする、請
求の範囲第９項に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8603711A SE459008B (sv) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | Saett att framsstaella humana monoklonala antikroppar |
| SE8603711-6 | 1987-02-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01503754A JPH01503754A (ja) | 1989-12-21 |
| JP2648318B2 true JP2648318B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=20365487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50538487A Expired - Fee Related JP2648318B2 (ja) | 1986-09-04 | 1987-09-01 | ヒトモノクローナル抗体製造法、およびそのキット |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2648318B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1340099C (ja) |
| DE (1) | DE3786673T2 (ja) |
| SE (1) | SE459008B (ja) |
| WO (1) | WO1988001642A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| SE461985B (sv) * | 1988-09-13 | 1990-04-23 | Bioinvent Int Ab | In vitro immunisering av lymfocytinnehaallande cellpopulationer och materialsats daerfoer |
| EP0460065B1 (en) * | 1989-02-21 | 1994-08-31 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | A process for the generation of proliferating cd4 lymphocytes |
| US6143508A (en) * | 1989-06-29 | 2000-11-07 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Device and process for cell capture and recovery |
| CA1340565C (en) | 1989-06-29 | 1999-05-25 | Thomas B. Okarma | Device and process for cell capture and recovery |
| WO1991001369A1 (en) * | 1989-07-21 | 1991-02-07 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Preparation of human adherent lymphokine-activated killer (a-lak) cells |
| HUT62803A (en) * | 1990-05-22 | 1993-06-28 | Univ California | Process for producing antigen-specific, high affinity human monoclonal antibody |
| MX2012001882A (es) | 2009-08-13 | 2012-04-11 | Crucell Holland Bv | Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio (rsv) humano y metodos de uso. |
| SG186985A1 (en) | 2010-07-09 | 2013-02-28 | Crucell Holland Bv | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
| FR2998579B1 (fr) | 2012-11-27 | 2015-06-19 | Commissariat Energie Atomique | Methode pour obtenir des anticorps humains specifiques d'un antigene par immunisation in vitro |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849329A (en) * | 1986-05-30 | 1989-07-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing lymphokine activated killer cells |
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1986
- 1986-09-04 SE SE8603711A patent/SE459008B/sv not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-09-01 JP JP50538487A patent/JP2648318B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-01 EP EP87906018A patent/EP0342188B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1987-09-01 DE DE19873786673 patent/DE3786673T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1987-09-03 CA CA000546024A patent/CA1340099C/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| J.IMMUNOL.=1983 * |
| J.IMMUNOL.=1986 * |
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|---|---|
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| EP0342188A1 (en) | 1989-09-13 |
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| CA1340099C (en) | 1998-10-27 |
| JPH01503754A (ja) | 1989-12-21 |
| SE8603711D0 (sv) | 1986-09-04 |
| SE459008B (sv) | 1989-05-29 |
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| AU7913887A (en) | 1988-03-24 |
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