JPH01503754A - ヒトモノクローナル抗体製造法、およびそのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトモノクローナル抗体製造法、およびそのキット本発明は・インビトロ免疫（ ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｕｎａ＋ｕｎｉｓａｔｉｏｎ）のための、ヒトリンパ球を含 む細胞群から望ましくない細胞を除去する方法、ヒトモノクローナル抗体の生産 において使用されるリンパ球のインビｔ・口免疫における方法およびヒトモノク ローナル抗体の生産において使用されるリンパ球のインビトロ免疫のためのキッ トからなる。

技術背景 モノクローナル抗体は、１９７５年にＫｏｅｈｌｅｒおよびＭ＋１ｓｔｅｉｎに よって紹介された。この概念は、免疫リンパ球を、継続的株化細胞（ｅｅｌ　ｌ 　ｌ　１ｎｅ）、例えば骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ）、と融合させるものであ る。クローニングおよび選択法によって、特異性抗体（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎ ｔｉｂｏｄｙ）を生産する細胞を選択して培養することが可能である。

この細胞クローンは、このように二２９オリジナルの細胞に由来するものであっ て（「モノクローナル」）、特異性抗体と完全に一致するコピーを生産する。こ れらのモノクローナル抗体は、多くの分子に対して調製されてきた。このタイプ の抗体は、広範囲に使用されてきたし、いまも使用されている。また、商業的発 展も考慮されて、今日、多数のモノクローナル抗体、とりわけ診断を目的にした もの、が市販されている。

これらの抗体の治療的使用が広く予示されたにもかかわらず、マウスのモノクロ ーナル抗体（すなわち、免疫マウスリンパ球によって調製されたもの）のこの発 達に、ヒトモノクローナル抗体に間しては追いついていない。

これは、実用的な方法では、細胞ハイブリダイゼーションまたはトランスフェク ション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）　ｔこよろ不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓ ａｔｉｏｎ）のための免疫ヒトリンパ球を生産するに至ることがきわめて困難で あるという事実による。倫理的には、今日、それらに対してヒトモノクローナル 抗体の生産が望まれるような分子を用いて患者、ボランティアなどに免疫を行う ことはできない。例えば腫瘍関連抗原、微生物およびウィルス抗原、トキシンな とである。現在までのところでは、例えば怒染や腫瘍などの愚者を発見して、こ れによって免疫リンパ球（いわゆるインビボ感作リンパ球）を得るという方法が ある。

実際上は、この方法は受け入れられない。

したがって、いわゆるインビトロ免疫が発達してきた。

すなわち、非免疫ヒト白血球を細胞培養環境下で免疫し、うかを確認する。これ らのインビトロ免疫されたヒトリンパ球を、次いで骨髄腫細胞またはリンパ芽球 （１ｙｓｎｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞と融合させてヒトモノクローナル抗体 の継続的生産を行う。代わりに、免疫リンパ球を適当なウィルスまたは細菌ゲノ ムでトランスフェクトさせて細胞を不滅化させることも可能である。

換言すれば、インビトロ免疫は、ヒトモノクローナル抗体を将来実用的にまた人 道的に受け入れられる方法で調製することを可能にする唯一の技術である。この 技術は、長年、ネズミの系で発達してきた。今日、マウス細胞では、よく機能す るインビトロ免疫法が存在する（　Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ：　１９８６）。

インビトロ免疫を提供するためｔこかなりの資力が投入されてきたヒトの系にお いては、今日、マウスの系に相当するようなものは何もない。これは、ヒト細胞 の場合の活性化要求性が一部異なっているからであり、とりわけ、おそらく、よ り深い休止の状態にある（”ｉｎａ”ｄｅｅｐｅｒ”　５ｔａｔｅ　ｏｆ　ｒｅ ｓｔ）末梢血リンパ球を用いてきたからである。それでも、例えば、ボンベシン （ｂｏｍｂｅｓ　ｉ　ｎ）（Ｎｏら：　１９８５）およびＤＮＰ−Ｈ５Ａ　（Ｔ ｅｎ３ら：　１９８５）などの２．３０タイプのハブテン、および赤小体（ｒｅ ｄｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ）　（Ｓｔｒｉｋｅら：　１９８４、Ｂｏｆｆｍａｎ８ よＵＨｉｒｓｔ：１９８５）に対するヒトインビトロ免疫についての報告がいく つかある。これらのインビトロ免疫系は優劣つけがたいが、異なる技術を用いて 著しく異なる結果が得られており、しばしば特異性バイプリドーマの収率がきわ めて低い。加えて、現在、胸腺依存性抗原に対するインビトロでの充分な一次的 免疫応答を生じさせることができる系が、全くない。異なるタイプのＴ細胞由来 のリンホカインを使用することは、マウス細胞に間してはよく機能する技術の− っである（　ＢｏｒｒｅｂａｅｃｋおよびＭｏｅｌｌｅｒ：１９８６）が、それ だけでは、ヒトの系において充分ではない。ヒトモノクローナル抗体の生産のた めのヒトインビトロ免疫を支持するために試みられてきた他の攻略技術は、以下 を用いることからなる。

（］）ムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）などのアジ ュバントペプチド （２）モノカイン（ｍｏｎｏｋ　ｉ　ｎｅ）添加培地（３）セファロース／セフ ァデックス、ゼラチン、プラスチック、ナイロンウール付着体（ａｄｈｅｒｅｎ ｃｅ）・抗体スバニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、補体融解（Ｉｙｓｉｓ）、アフ ィニティーカラム、を用いる細胞群の分離 （４）ポリクローナル活性化物質、例えは、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ）　 （ＬＰＳ）、レクチン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、ＣｏｎＡ）、スタフィロコッカス・ア ウレウス（Ｓｔ、ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　細胞、プロティ ンＡまたはＧ（５）ＡＢＯ，ＦＣＳ、ウサギ血清なとの特殊血清問題は、特に、 本来インビ）・口において、抗原特異性の免疫応答を抑制するか、さもなければ 、阻害する機能を有する細胞部分集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）　［お そらくは細胞毒性 （ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）のもの］の除去にあることが今や明らかになってきた。

本発明の開示 したがって、本発明の目的は、インビトロ免疫のための、ヒトリンパ球を含む細 胞群から望ましくない細胞を除去する方法を提供するものであって、これによっ て特異的に抗原に対してインビトロで活性化されたヒトリンパ球を充分量生産す ることが可能になる。これは、さらにヒトモノクローナル抗体の生産において、 融合またはトランスフェクションの相手として利用される。ヒト血ン夜、へん桃 腺、リンパ節、膵臓細胞、骨髄などから、特異的にインビトロ免疫されたヒトリ ンパ球の高収率をこれまで妨げてきた望ましくない細胞部分集団を除去するこの 方法は、いわゆる向リソシーム因子（Ｉｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎ ｔｓ）を用いることに特徴がある。

これらの因子は、すべてのりリゾームを含む細胞、例えば、単球（ｍｏｎｏｃｙ ｔｅ）　／マクロファージ、ＮＫ細胞および可能な他の現在才だ知られていない 細胞部分集団を３０〜４０分の短時間で殺す特異的能力を有する（Ｔｈｉｃｌｅ ら：　１９８３．１９８６）。

この方法は、したがって、大規模の■胞分離実験（現時点では、満足のゆく方法 はない。しかも、正確にとの細胞が目的の細胞であるかはわからない）をするこ となく、約３０あるいは４０分間でリンパ球集団を、ヒトモノクローナル抗体の 生産のためのインビトロ免疫実験に用いることができるように適応させることが 可能である。

これは、リンパ球集団のＢ細胞が、今や、リソシーム−陽性細胞からのいかなる 不利な影響をも受けることなく抗原−特異的に活性化される可能性を付与された ことから、可能である。このようにして、ヒトモノクローナル抗体の現在唯一の 生産源として使用が可能な免疫リンパ球集団が生産された。これは、また、ヒト モノクローナル抗体の生産をマウスモノクローナル抗体と同じ範囲で開始するこ とが可能であることを意味する。ヒ）・モノクローナル抗体は、インビボで、ｌ １ｆｆｉ瘍の治療、腫瘍の探知、毒殺（ｐｏ　ｉ　ｓｏｎ　ｉ　ｎ’ｓ）・移植 拒絶反応の防御などにおいて、広く用いられる可能性がある。

本発明の更なる目的は、ヒトモノクローナル抗体の生産において用いろリンパ球 のインビトロ免疫の方法を提供することここある。この方法では、向リソシーム 性因子、それらの誘導体、またはこれらの因子を基にして合成しに物質はインビ トロでヒトリンパ球を含む細胞群に作用し・で、インビトロ免疫に不利に影響す る細胞群を除去して、これによって、リンパ球はインビトロで抗原−特異的に免 疫されて不滅化される。不滅化は、ネズミまたはヒト骨髄腫細胞、リンパ芽球株 、リンパ腫細胞との融合、またはエプスタイン・バーウィルス感染（Ｅｐｓｔｅ ｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）によって、行うことができる 。さらに、不滅化は、免疫抗原−特異性細胞をウィルス、細菌または哺乳動物の ゲノムてトランスフェクトさせて行うことができる。

この方法に用いることができる向リソシーム性因子には、タイプＬ−ロイシンメ チルエステル（Ｌｅｕ−ＯＭｅ）、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルなとのア ミノ敢エステル（ＧｏｌｄｍａｎおよびＫａｐｌａｎ：　１９７３）がある。ま た、向リソシーム性アミノ酸の誘導体またはこれらの誘導体を基にしたペプチド も用いることができる。これらの因子は原形質膜（ｐｌａｓｍａ　ｃｅｌｌ　ｍ ｅｍｂｒａｎｅ）を貫通して、自由にリソシーム中に拡散し、ここで迅速に代謝 されて遊離のアミノ酸になる。これらのより極性の大きい遊離のアミノ酸は、メ チルエステルが拡散して侵入するほどに速くはりリゾームから拡散して出ること ができない。その結果、リソシーム内の浸透圧の上昇が起きて、続いてこれらの 細胞小器官（ｏｒ３ａｎｅｌｌｅｓ）の破裂が起きる。しかしながら、我々は、 向リソシーム性物質の挙動をいかなる特定の説とも結び付けることは望まない。

本発明は、また、インビトロ免疫のための、望ましくない細胞をヒトリンパ球を 含む細胞群から除去するためのキットからなる。そのように処理された細胞群は 、次いてモノクローナル抗体の生産に用いることができる。

キットは、リンフ才力インを含む容器および向リリゾーム性因子、それらの誘導 体、またはそれらの因子を基にして合成された物質を含む更なる容器を含む。さ らに、キットは、好ましくは、あるタイプの免疫応答修飾因子、いわゆるＢ　Ｒ Ｍ　（Ｂｉｏｌｏ８ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）および細 胞群への試薬の効果を高めるための種々の使い捨て材料、および使用指示書を含 む。

本発明は以下の諸例により詳細に記述される通りである。

例」− ヒト末梢リンパ球をフィコール（Ｆｉｃｏｌ　ｌ）勾配での密度遠心分離によっ て精製した。リンパ球（ＩＯＸＩＯ’細胞／１）を０．４５＋ｎｇ／ｍｌのＬ− ロイシンメチルエステルで２５℃で４０分間処理した。培地の血清レベルは低く なければならない、そのために、ＲＯ［０％胎児ウシ血清（Ｆｅ２）を含むＲＰ ｉ、’１１１６４０）を用いた。次いで、細胞をＲ２−５（２〜５％ＦＣＳを含 むＲＰＭ１１６４０１中で２回洗浄した。これらをヒトモノクローナル抗体の生 産のためのインビトロ免疫に加えた。インビトロ免疫の期間は６日で、用いた免 疫原は１μｇ／ｍｌのＫＬＨであった。土＠蚤には、また、リンフ才力イン、Ｔ ＲＦ、ＢＣＤＦ％　ＩＬ−１／２、を含ませた。第６８目に、何個の抗原−特異 性プラーク形成細胞が形成されたかを調べた。この数値によって、インビトロ免 疫がどの程度に良好に機能しているかを知ることができる。Ｌｅｕ−ＯＭｅで処 理しなかった細胞を対照に用いた。結果は表１に示される通りである。

表」− 細胞　プラーク形成細胞数／１０６Ｂ細胞ＫＬＨゼラチンネ Ｌｅｕ−ＯＭｅ処理細胞ｔネ　１１５６　１９未処理細胞　７　１１ ネゼラチンをプラーク試験において対照抗原として用いた。

＊本本例では、ヒト末梢血リンパ球を用いた。

髭ユ 例１の方法によってｌμｇ／ｍｌのＫ　Ｌ　Ｈで６日間インビトロ免疫しておい たヒト末梢リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞マタはＷＩ Ｌ２−ＵＣ７２９ＨＦ２リンパ芽球細胞とポリエチレングリコールを用いて融合 させて、不滅化させた。１４〜２１日後、増殖しているハイブリッドの抗原−特 異的抗体生産を試験した。結果は表２に示される通りである。

２ヨ２ 細胞ネ　ハイブリッド数＊＊／　特異効率ネネネ試ｗＡ細胞Ｐｉ、（％） 未処理ＰＢＬ　Ｏ／９６　０ Ｌｅｕ−ＯＭｅ処理ＰＢＬ　１７／９６　１８本　Ｓｐ２１０−Ａｇ１４と融合 させたヒトリンパ球ＷＩＬ２−ＵＣ７２９ＨＦ２と融合させたものの結果も同じ であった。絶対値は、約３０％低かった。

零零　試験によって抗原−特異的抗体を産生ずることが示されたハイブリッド数 零零＊　（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）且ユ 健康な供血者からのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を密度遠心分離によって分離 して、さらに近年記述された方法（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ、　Ｌ、、Ｍｏｅｌｌ ｅｒ、　Ｓ、　Ａ、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ、　Ｃ−Ａ、に、：　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ　Ｂ１．５１−５５、＋９８７）にてＢ、Ｔおよびアクセサリ−（ Ａ）細胞に分離した。

ＰＢＬを２−アミノエチル（イソチオウロニウムブロミド）で処理したヒツジ赤 小体とのロゼッ）　（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）によって、Ｔおよび非Ｔ細胞に分画 して、後者の細胞群をフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）または自己 融解血漿でコートしたベトリ皿上でインキュベートした。非−吸着細胞（Ｂ細胞 ）を静かに移して、吸着した細胞（アクセサリ−細胞）をｌＯｍＭＥＤＴＡで除 去した。Ｂ細胞を５０μ８／１のスタフィロコッカス・アウレウスＣｏｗａｎお よび照射（２００ＯＲ）Ｔ細胞によッテ１０　μｇ／ｍｌ（ＤＰＷＭとともに一 晩刺激した。アクセサリ−細胞を５１Ｕ／ｍｌのγインターフェロンおよび１０ μｍのインドメサシン（ｉｎｄｏｍｅｔ、ｈａｃｉｎ）によって刺激した。細胞 群を２：１：０．４　（Ｔ：　Ｂ：　Ａ’）（７）細胞比で１０％ヒトＡＢ血清 を含む添加ＲＰＭ１１６４０の中で全６日間培養した。抗原量は１７１ｇ／ｍｌ であった。培養物に、記述された方法（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ、　ｌ　、、Ｍｏ ｅｌｌｅｒ、　Ｓ、Ａ、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ。

Ｃ，、Ａ、に：　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｕ、５１−５５．１９８７）にて生産 された絹換えＩ　Ｌ−２（５Ｕ／ｍｌ）およびｓ　Ｐ　ＷＭ−Ｔ　（２５容量％ ）を加えた。無血清ＲＰＭＩ　］　６４０に懸濁させたＴ細胞（１０７細胞／Ｆ １）を、２．５１１ＩＭの新たに調製したＬｅｕ−ＯＭｅと室温で４０分間イン キュベートした。次いで、細胞を２％ヒ）ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ　１６４０中 で３回洗浄した。

インビトロ免疫した細胞を、免疫原ＫＬＨ１非間連性抗原（ゼラチン）および抗 １ｇ（Ｉｇ分泌細胞の総数を知るために）に対して、フィルターイムノ−プラー クアッセイ（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ、　ｌ　、、Ｍｏｅｌｌｅｒ、　Ｓ、Ａ、お よびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ　Ｃ，Ａ、に、：　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｕ、５１ −５５．１９８７、Ｍｏｅｌ　ｌｅｒ、Ｓ、Ａ、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ、 　Ｃ，Ａ、に、：　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１３．１９５−２０４．１９８５）を用い て試験した。プラーク数は３回の分析の平均値である。結果ぼ、表３に示される 通りである。

１旦 ヒト末梢Ｂリンパ球のインビトロ免疫へのＯ−メチル−ロイシンの影響ＰＦＣ数 ネ／１０６Ｂ細胞 ＫＬ）ｌ　Ｌｅｕ−ＯＭｅ　ｓＰＷＭ−Ｔ　１１−２　Ａ−細胞　Ｔ−細胞　Ｋ ＬＨｔ−ラチン　抗−１８１、−−＋　＋　６　０　１１９０ ２、４　−　＋　＋　５　０　１４００３、＋　−＋　＋　＋　＋　１１２　３ 　９５００４、−　−　＋　＋　＋　＋１４０’７９５０５、　＋　十　＋　＋ 　＋　＋１０２１　０１５３６０６、−　＋　＋　＋　＋　＋２５４１３５００ このように、Ｌ　ｅ　ｕ　−ＯＭ、ｅ感受性のＴ細胞群を除去すると、また、残 ったＴ細胞を単離されたＢおよびＡ細胞と共ここ同じインビトロ免疫系で試験し てみると、プラーク形成細胞の数が１０倍に増加した。

例」２ 健康な供血者からのＰＢＬを密度遠心分離を用いて分離して、例３に記述したよ うにして２．５ｍＭのＬｅｕ−ＯＭ　ｅで処理した。Ｌ　ｅ　ｕ　−ＯＭ　ｅ処 理の後に回収された平均細胞数は、７０％（ｎ＝２２）であった。Ｌｅｕ−○Ｍ ｅ処理したＰＢＬを、１容量％の非必須アミノ酸、５ｍＭＬ−グルタミン、スト レプトマイシン（５０μ８／１Ｔｌｔ）ペニシリン（５０ＩＬＩ／ｍｌ）、５０ μ門の２−メルカプトエタノールおよびｌＯ％ヒトＡＢＯ血清を添加したＲＰＭ Ｉ　１６４０中に懸濁させた。血清を健康な血液ドナーから集めた。サイドキン （ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）　（Ｉ　Ｌ　−２、ｓＰＷＭ−Ｔ、γインターフェロン 、Ｉ　Ｌ−１、Ｂ　ＣＤ　Ｆ）および１ｇ８７ｍ１０ＫＬＨを次いて培養物に加 えた。最終細胞濃度は３．．５Ｘ１０６細胞／ｍｌであり、４ｍ１（６ウエルプ レート）または３０ｍｌ（７５ｍフラスコ）の培養物を用いた。珊胞を６日間培 養して、３〜４日目にさらに培地（元の培地量の２０％）を新たに加えた。ｓＰ ＷＭ−Ｔは、γインターフェロン（４００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｌｌ １ｔ）およびＢ細胞増殖および分化活性を含んだ。インビトロ免疫を試験した時 、ｓＰＷＭ−Ｔのバッチ間で有意な相違は認められなかった。結果は、表４に示 される通りである。

１庄 非分離のヒト末梢リンパ球のインビトロ免疫へ００−メチル−ロイシン、ＩＬ− ２およびγ−インターフェロンの影響ＰＦＣ数＊／１０６Ｂ細胞ネｔ ＩＨＬｅｕ−ＯＭｅ　ＩＬ−２１ＦＮ　ｓＰＷＭ−Ｔ　ＫＬＨ４ｃｍラチシ　抗 −１ｇ１、＋　ＯＯ１７５ ２、＋　５＄ｔ　２．５＃　＋　１２　３　１５３０＋　５　＋　５４８２６５ ４０ ４、＋　＋　４　１２２５　３８　３３４５０５、＋　＋　ｌ　＋　１１５０　 ８３６７８０６、＋　＋　：２．５　＋　１４１５　１２　３４９００７、＋　 ４　５　＋　１４４５　１２　３４０００８、＋　＋　１０　＋　１１９０　０ 　３２４５０９．４　＋　５０　＋　９４５’０３６８００１０、＋　＋　５０ ０　＋　７８０　１２　１８８３０１１、＋　＋　５　１００　＋　１４００　 １６　２８０００１２、＋　＋　５　５００　＋　１３４０　０　２０４００１ ３、＋　＋　５　２０００　＋　１３７０　０　２］６００ネ　プラークアッセ イは例３に記述の方法にて行った。

プラーク数は３回のアッセイの平均値である。

廿　Ｂ細胞数は、表面結合１ｇを表す染色によって決定した。

＄Ｉ　Ｕ／ｍｌ これらの結果は、ヒト末梢リンパ球は、分離してＬｅｕ−ＯＭｅ処理した細胞と 同等の効率でインビトロ免疫されることを示す。その結果、多くの複雑な細胞分 離工程を省くことができる。

鮭且 インビトロ免疫されたＰ　Ｂ　Ｌ　（Ｋ　Ｌ　Ｈ１７）３／ｍｌ）および悪性（ ｍａｌｉｇｎ）　融合相手を２：１の比で混合して３０％（ＨＦ２）または４５ ％（ＮＳ−１／５ｐ２１０）のポリエチレングリコール（分子ｉｌｌ　５４０） および７％ジメチルスルホキシド（ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）を用いて融合させた （Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、　Ｃ，Ａ、に、：　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、’　３Ｊｌ、９−１２、＋９８３）。ヒト×ヒトーハイブリッドを、添加 （ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）　ＲＰＭ　Ｉ　ｌ　６４０　（１０％胎児ウシ血 清、１ｍＭピルビン酸すトリウム、１３２１）３／ｍｌオギザロ酢酸、１００μ 門ヒボキサンチン、０．４７１Ｍアミノブレリン、１６７ｚＭチミジンおよび１ ５容量％ＨＦ２調整培地を含む）中ζこ懸濁させた。マウス骨髄腫細胞を、フィ ーダー　（ｆｅｅｄｅｒ）　！Ｂ胞を省略して融合させてクローニングした。ヒ ト×ヒトーハイブリッドおよびヒトＸマウス−ハイブリッドを２４ウエルプレー トにブレーティングした（０．７〜１　、ＯＸ　１０６ｍ胞／ウェル）。酵素イ ムノアッセイを用いて、特異性抗体の生産についてハイブリドーマをスクリーニ ングした。すなわち、９６個のマイクロタイターウェルをウェル中の抗原溶液を 乾燥させることによって各々０．３μ８のＫＬＨでコートした。次いでゼラチン （０，１％）を用いて３７℃で３０分間ウェルを塞いだ、ハイブリドーマ上清液 （１００μｍ／ウェル）を洗浄したウェルに加えて、３７℃で３０分間反応させ た。

１０％胎児ウシ血清を含む燐酸緩衝生理食塩水溶液で希釈したペルオキシダーゼ 結合抗ヒトＩｇ抗体（１００μｍ／ウェル）を最終的に６０分間インキュベート して、酵素基質（ＡＢＴＳ）を加えてイムノアッセイを行った。

結果は表５に示される通りである。

ヘモシアニン（ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に特異的な抗体を分泌するヒト×ヒトー ハイブリドーマは、表５の結果より明らかなように、簡単に検出することができ た。特異効率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）　（細胞増殖を示し ているウェルの数に対する特異性抗体を生産しているウェルの数×１００）は、 ３〜１５％の範囲であった。ヒトＸマウス−ハイブリドーマは、陽性値はより安 定している（３〜５％）がやや低い特異効率を示した。

また、抗Ｊ＼モジアニン抗体を、コートしないマイクロタイターウェルまたは０ ．５μ８／ウエルのウシ血清アルブミンまたは０．１％ゼラチンでコートしたウ ェルに対して酵素イムノアッセイで試験をして、反応性が非特異的な結合による ものではないことを確認した（　）ｌａｓｋａｒｄ。

Ｄ、００、Ｇｕｌ、　Ｖ、およびＡｒｃｈｅｒ、　Ｊ、Ｒ，：　Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｌｊ、２９１−２９５．１９８５）。

Ｌｉ ＫＬＨでインビトロ免疫されたヒト末梢リンパ球を用いて生産したヒト×ヒト− およびヒト×マウスーハイブリドーマ１、　ＨＦ２９４／９６　３／９４　３． ２２、　ＨＦ２９６／９６　５／９６　５．２３、　ＨＦ２９６／９６　７／９ ６　７．３５、ＨＦ２９６／９６　１４／９６　、　１４．６６、　Ｓρ２１０ 　９６／９６　０／９６　０？、５ｐ２１０　９６／９６　４／９６　４．２８ 、　Ｎ５−１　９６／９６　３／９６　３．１９、　Ｎ５−１　７２７７２　４ ／７２　５．５ネ　増殖陽性ウェル数／接種ウェル総数＃　抗体−陽性ウエル数 ／増殖−陽性つエル数。酵素イムノアッセイによって決定された抗体−陽性値＝ 〉４×バックグラウンド値作１ インビトロ免疫された細胞の融合および酵素イムノアッセイは、表５の脚注（例 ５）および表６の脚注に記載されたようにして行った。ただし、酵素イムノアッ セイにおけるゼラチン塞ぎ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）工程を省略した。ジゴキシン（ ｄｉｇｏｘｉｎ）をトランスフェリンと結合させて（Ｂｕｔｌｅｒ、　Ｖ、Ｐ、 およびＣｈｅｎ、　ｊ、Ｐ−：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）　、Ｌ７．７１−７８．１９６７）、１１１８／ １のジゴキシン−トランスフェリンをインビトロ免疫に用いた。ジゴキシンとト ランスフェリンのモル比は、約５＝１であった。ウシ血清アルブミンと結合させ たジゴキシン（０，５μ８／ウエル）を酵素イムノアッセイに用いた。

結果は表６に示される通りである。

結果から明らかなように、特異効率は免疫原としてヘモシアニンを用いた場合に 較べて幾らか低いが、免疫原性ハブテンに特異的なヒ）Ｘヒト−ハイブリドーマ を生産することができた。しかしながら、免疫原を培養物Ｄ）ら除くと、抗ジゴ キシン抗体は検出されなかった。また、悪性融合相手としてＮ５−１を用いるこ とによって、ジゴキシンに特異的なヒトＸマウス−ヘテロハイブリドーマも生産 された。特異効率は高く、いくつかのハイブリドーマは、酵素イムノアッセイで 強く反応することが証明される抗体を生産した（〉７〜８×バツクグラウンドＯ Ｄ値）、抗ヘモシアニン抗体の場合と同様にして特異性を調べた（　Ｈａｓｋａ ｒｄ、　Ｄ、帆、Ｇｕｌ、　Ｖ、およびＡｒｃｈｅｒ。

Ｊ、Ｒ，：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｕ、　２９１−２９５ ．１９８５）　、次いで、抗ジゴキシン特異性ハイブリドーマを１０週間の培養 期間中に限定希釈によって３回クローニングした。この時期の後、オリジナルの ハイブリドーマの約３５％がジゴキシンに特異的な抗体をまだ生産していた。

１旦 ジゴキシンでインビトロ免疫されたヒト末梢リンパ球を用いて生産したヒト×ヒ ト−およびヒト×マウスーハイブリドーマ融合相手　生存ハイアリット−数本　 特異的ハイフ゛リッド数ネ　特異効率（％）１、　ＨＦ２１１Ｂ／１２０　２／ １１８　１．７２、　ＨＦ２１４４／１４４　５／１４４　３．５３、　Ｎ５− １　１４４／１４４　１３／１４４　９．０４、　Ｎ５−１　１４４／１４４　 １２／１４４　８．３５、　Ｎ５−１　１４４／１４４　１３／１４４　９．０ ６、　Ｎ５−１　１４４／１４４　８／１４４　５．５ネ　増Ｍ陽性つェル数／ 接種ウェル総数＃　抗体−陽性ウエル数／増殖−陽性つエル数。酵素イムノアッ セイによって決定された抗原−陽性値＝〉３〜４×（ヒト×ヒトーハイブリドー マの場合）または〉４×（ヒトＸマウス−ハイブリドーマの場合）バックグラウ ンド値（０００，１００〜０．１１０）　。

衾」【文ｊ九二 Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ，ＡＪ、（１９８６，）ＴＩＢＴＥＣ）！、４．１４ ７Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、　Ｃ，Ａ、に、およびＭｏｅｌｌｅｒ、　Ｓ、Ａ、　 （１９８６）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３（ｉ、３７１０Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ、 　Ｌ、、！Ｉｏｅｌ　Ｉｅｒ、　Ｓ−Ａ、およびＢｏｒ　ｒｅｂａｅｃｋ　ｊＣ −Ａ、に、（１９８６）１ｍｍｕｎｏｌｏ３ｙ　６１．５１Ｇｏｌｄｍａｎ、　 Ｒ，およびＫａｐｌａｎ、　Ａ−（１９７３）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　３１８．２０５Ｈａ、　Ｍ、）ｆ、、Ｒａｎｄ、　 Ｎ、、Ｍｕｒｒａｙ、　、１．、Ｋａｔｏ、　Ｋ、およびＲａｂｉｎ、Ｈ−（１ ９８５）ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５．３８３１）１ｏｆｆｍａｎ、　Ｍ、に、 および旧ｒｓｔ、　Ｊ、　Ａ、　（１！Ｊ８５）、ＨＵＭＡＮ）ＩＹＢＲＩＤＯ Ｍ八Ｓ　ＡＮＤへ　閂０ＮＯＣ仁０ＮＡＬ　ＡＮＴｌ１３ｏｏ１εＳ　（編集： Ｅｎｇｌｅｍａｎ、　Ｆｏｕｎｄ、　ＬａｒｒｉｃｋおよびＲａｕｂｉｔｓｃｈ ｅｋ）、ｐｐ、２７７−２８９、　Ｐｌｅｎｕｍ　ＰｒｅｓｓＳｔｒｉｋｅ、　 Ｌ、Ｅ、、Ｄｅｖａｎｓ、　Ｂ、）１．およびＬｕｎｄａｋ、　Ｒ，Ｌ、：（１ ９８４）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２．１７９８Ｔｅｎｇ、Ｎ、Ｎ、）１．、Ｒ ｅｙｅｓ、Ｇ、Ｒ，、Ｂｉｅｂｅｒ、Ｍ、、Ｆｒｙ。

Ｋ、Ｅ、、Ｌａｍ、　Ｋ、Ｓ、およびＨｏｂｅｒｔ、　ＪｏＭ−：　（１９８５ ）　ＨＵＭＡＮ）ＩＹＢＲＩＤＯＭＡｓ　１０門０ＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩ ＢＯＤＩＥＳ　（編集：Ｅｎｇｌｅｍａｎら）、ｐｐ、７１°９１、Ｐｌｅｎｕ ｍ　ＰｒｅｓｓＴｈｉｅｌｅ、　Ｄ、Ｌ、、Ｋｕｒｏｓａｋａ、　Ｍ、およびい ｐｓｋｙ、　Ｐ、Ｅ、：（１９８３）ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、］３］、２２８２Ｔ ｈｉｅｉｅ、　Ｄ、Ｌ、およびＬｉｐｓｋｙ、　Ｐ、Ｅ−：　（１９８６）　Ｊ 。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６、１０３８

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．向リソゾーム性因子（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃａｇｅｎｔｓ）、それ らの誘導体、またはそれらの因子を基にして合成された物質をインビトロでヒト リンパ球を含む細胞群に作用させることを特徴とする、インビトロ免疫のための 、ヒトリンパ球を含む細胞群から望ましくない細胞を除去する方法。
2. ２．用いられる向リソゾーム性因子が向リソゾーム住アミノ酸誘導体またはそれ らの誘導体を基にしたベブチドからなることを特徴とする、請求の範囲第１項に 記載の方法。
3. ３．用いられる向リソゾーム性因子がＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエステル、また はＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエステルを基にしたベブチドからなることを特徴と する、請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．向リソゾーム性因子、それらの誘導体、またはそれらの因子を基にして合成 した物質をインビトロ免疫において不利益な影響を有する細胞部分集団（ｓｕｂ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）の除去のために、ヒトリンパ球を含む細胞群にインビ トロで作用させることからなり、これによってリンパ球を抗原−特異的にインビ トロ免疫し、かつ不滅化させる（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓｅｄ）ことを特徴とする 、ヒトモノクローナル抗体の生産において用いるリンパ球のインビトロ免疫法。
5. ５．用いられる向リソゾーム性因子が向リソゾーム性アミノ酸誘導体またはそれ らの誘導体を基にしたベブチドからなることを特徴とする、請求の範囲第４項に 記載の方法。
6. ６．用いられる向リソゾーム性因子がＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエステル、また はＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエステルを基にしたベブチドからなることを特徴と する、請求の範囲第４項に記載の方法。
7. ７．免疫抗原−特異的細胞を、ネズミまたはヒトの骨髄腫細胞、リンパ芽球細胞 株（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）、リンパ腫細胞、またはエブスタイン−バ−ウイルス感 染（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）によって融合さ せることによって不滅化させることを特徴とする、請求の範囲第４〜６項のいず れか１項に記載の方法。
8. ８．免疫抗体−特異的細胞を、ウイルス、細菌または哺乳動物のゲノムによって トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることによって不滅化 させることを特徴とする、請求の範囲第４〜６項のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．活性の構成成分としてリンフォカインを含む容器、および向リソゾーム性因 子、それらの誘導体、またはそれらの因子を基にして合成した物質を含む容器か らなることを特徴とする、ヒトモノクローナル抗体の生産のためのリンパ球のイ ンビトロ免疫のためのキット。
10. １０．向リソゾーム性因子が向リソゾーム性アミノ酸誘導体またはそれらの誘導 体を基にしたベブチドであることを特徴とする、訴求の範囲第９項に記載のキッ ト。
11. １１．向リソゾーム性因子がＬ−ロイシン−Ｏ−メチルエステル、またはＬ−ロ イシン−Ｏ−メチルエステルを基にしたベブチドであることを特徴とする、請求 の範囲第９項に記載のキット。