LU83978A1 - Antikoerper gegen proteine - Google Patents

Description

» « F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz) RAN 4090/131

Antikörper gegen Proteine

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Proteine, und zwar,gegen natürliche oder durch re-kombinierte DNS-Technik erhaltene humane Leukozyten-Interferone (HLI).

5 HLI ist möglicherweise ein wertvolles Therapeutikum zur Behandlung von neoplastischen und viralen Krankheiten. Die Evaluation dieser Substanz und ihre mögliche Entwicklung zu einem weitverbreiteten Medikament wird durch die Schwierigkeit, den Wirkstoff in der erforderlichen Weise 10 zu reinigen und zu charakterisieren, beeinträchtigt. Für die gewünschte Reinigung und die erforderliche Charakterisierung von HLI wäre ein Test, der sich in weniger als 24 Stunden durchführen lässt, eine wertvolle Hilfe.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun ge-15 funden, dass sich zum Reinigen und Bestimmen von HLI in vorzüglicher Weise eine Kollektion von monoklonalen Antikörpern eignet, die gegen natürliche oder durch re-kombinierte DNS-Technik erhaltene Leukozyten-Interferone gerichtet sind.

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| Die vorliegende Erfindung betrifft demnach eine ; Kollektion von monoklonalen Antikörpern, die dadurch ge- I kennzeichnet ist, dass ihre Glieder gegen natürliche oder | durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene humane Leukozyten- j 5 Interferone (HLI) gerichtet sind.j Unter einer Kollektion sind hierbei sowohl die Gesamtheit der Antikörper, sowie auch deren einzelne Glieder zu verstehen.

Nach einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper von verschiedenen 10 Hybridomen sezerniert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich gezeigt* dass sich einzelne monoklonale Antikörper gegenseitig nicht inhibieren, d.h. gemeinsam an HLI binden, während sich andere gegenseitig inhibieren, d.h. nicht gleichzeitig an 15 HLI binden. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Kollektion aus Gruppen von monoklonalen Antikörpern besteht, deren Glieder verschiedene Epitope (antigenische Determinanten) von HLI erkennen.

Eine Eigenheit der Kollektion von monoklonalen Anti-20 körpern gemäss vorliegender Erfindung besteht darin, dass mindestens ein Antikörper HLI γ3 nicht erkennt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich weiter gezeigt, dass die vorerwähnte Kollektion aus einer Gruppe von Antikörpern besteht, welche sich voneinander in ihren 25 Isotypen unterscheiden. 8 Antikörper zeigen IgG-Struktur, I wogegen einer IgM-Struktur zeigt. Von den 8 Antikörpern mit IgG-Struktur haben 7 eine γ1 schwere Kette und einer eine schwere Kette.

! jj Eine weitere Besonderheit der Kollektion von mono- | 30 klonalen Antikörpern gemäss vorliegender Erfindung besteht i darin, dass ein Antikörper (IgM) die antivirale Aktivität M von humanem Leukozyten-Interferon nicht neutralisiert. * s λ i • * t - 3 -

Wie bereits erwähnt,ist die Kollektion dieser monoklonalen Antikörper u.a. dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Gruppen von Antikörpern besteht, deren Glieder verschiedene Epitope von HLI erkennen. Ein weiterer Aspekt 5 der vorliegenden Erfindung betrifft demnach die Verwendung von je einem Glied dieser Gruppe von Antikörpern für einen Festphasen-Sandwich-Test für HLI. Beim vorerwähnten Sandwich-Test wird ein Antikörper mit einem geeigneten Label versehen. Hierzu kommt jeder hierfür geeignete Label in 10 Betracht, doch wird ein radioaktiver oder ein Enzym-Label bevorzugt. . ·

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von einem Antikörper aus der oben 15 erwähnten Kollektion zur Reinigung von HLI. Die Reinigung von HLI mittels des monoklonalen Antikörpers erfolgt vorzugsweise durch Affinitätschromatographie. Hierbei muss für eine Reinigung in kommerziellem Mass-stab die Affinität genügend hoch sein, damit das Interferon 20 auch bei grossen Volumina, die mit nicht zu kleiner Geschwindigkeit durch die Säulen fliessen, praktisch quantitativ zurückgehalten wird. Mit einem einzigen Antikörper ist dies nicht für alle Arten (Subklassen) von Interferon möglich. Hierzu eignet sich besonders eine 25 Kollektion von monoklonalen Antikörpern, deren einzelne Glieder gegen einzelne Subklassen von Interferon hohe Affinitäten aufweisen.

Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt 30 nach der an sich bekannten Zellfusionstechnik, bei der Myelomzellen mit Milz-Zellen von Mausen, die mit HLI immunisiert wurden, fusioniert werden. Die erhaltenen Hybridome sezernieren monoklonale Antikörper gegen = natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene 35 Leukozyten-Interferone.

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Die Durchführung des Festphasen-Sandwich-Tests zur Bestimmung von HLI kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, doch konnte eine wesentliche Vereinfachung gefunden werden, indem im Gegensatz zu den bekannten Fest-5 phasen-Sandwich-Verfahren,unmarkierter und markierter ; Antikörper von Anfang an gemeinsam und nur einmal inkubiert i werden.

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Die Reinigung von HLI mittels eines monoklonalen 10 Antikörpers kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, | wobei sich die Affinitätschromatographie als besonders ; geeignet erwiesen hat. Bei dieser Affinitätschromatographie ! | wird vorzugsweise Affi-Gel 10 (BioRad Laboratories,

Richmond, California) als Träger verwendet.

15 | Es hat sich überraschenderweise-gezeigt, dass nach dem

Festphasen-Sandwich-Verfahren gemäss vorliegender Erfindung \ humanes Leukozyten-Interferon bis zu einer Konzentration i von 2 U/ml im Serum nachweisbar ist.

20

Andererseits hat sich gezeigt, dass mit einem monoklonalen Antikörper gemäss vorliegender Erfindung durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenes humanes Leukozyteninterferon auf einfache Art und Weise derart gereinigt werden 25 kann, dass es für klinische Versuche verwendbar ist.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Herstellung der monoklonalen Antikörper A) Interferon-Präparate

Teilweise gereinigtes humanes Leukozyten-Interferon 5 (IFL) war in genügender Menge zur Immunisierung der Mäuse vorhanden. 5 IFL-Präparate werden verwendet: a) IFL y(a) Hauptpeak.der Fraktion gemäss Stufe 8 von Tabelle 3 der DOS No. 29 47 134 mit einer ungefähren Reinheit von 10-15% (abgeschätzt durch Natriumdodecyl- 1° sulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese)und spezifischer Aktivität im antiviralen Test; b) IFL a; c) IFL ß; d) IFL γ; und é) IFL 6.

Die IFL a, ß und γ Fraktionen bestehen je aus Gemischen der individuellen (o^, a2) , (ß^ ß2, ß^) und (γ^ γ2# γ3, 15 y^r Ύ^) Spezies. Dies sind Schulterfraktionen der entsprechend gereinigten Spezies, welche von verschiedenen Präparaten gepoolt werden (vgl. Stufe 9 von Tabelle 3 der vorerwähnten DOS). Die IFL δ Fraktion stellt die Schulter der δ-Spezies dar. Neben den Spezies a, ß und γ an der 20 Lichosorb-Diolsäule (vgl. Stufe 8 von Tabelle 3 der vorerwähnten DOS) zeigt sich gelegentlich eine δ-Fraktion.

Diese wird wie in Stufe 9 gemäss Tabelle -3 der vorerwähnten 2 DOS gereinigt, wobei sich zeigt, dass die Spezies δ keine

Unterspecies zeigt und einheitlich ist. Die Reinheit von 25 b), c) und d) ist zwischen 20 und 40% gemäss spezifischer biologischer Aktivität und gemäss Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Die Reinheit von e) ist höchstens 5%.

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Bestimmungvon Interferon-Aktivität t S Die Interferon-Aktivität wird mittels des "cytopathic- effect-inhibition”(CPE) Test gemäss ü.S. Patentschrift No.

4 241 174 (Serial No. 963,256) bestimmt.

5 b)· Immunisierung der Mäuse 3 Acht Wochen alte Balb c/J weibliche Mäuse werden zuerst mit IFL l(a) in Freund's vollständigem Adjuvans immunisiert. Jede Maus erhält ungefähr 150 .pg Gesamtprotein enthaltend 20-25 pg von Interferon in 0,25 ml 10 an 5 verschiedenen Stellen (0,05 ml in jede Stelle):

Subkutan in die linke und rechte Leistengegend und in die linke und rechte Achselgegend sowie eine intraperitoneale Injektion.

53 Tage später wird eine Zweitimmunisierung wie folgt 15 durchgeführt: Interferon IFL Y(a) wird durch präparative

Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid (15%) Gel-Elektrophorese in drei 0,6x11 cm zylindrischen Gelen aufgetrennt.

Ungefähr 300 pg Gesamtprotein in 0,3 ml (dialysiert gegen | Probenpuffer) enthaltend ungefähr 40-50 pg von Interferon ! 20 werden pro Gel geladen. [Diese Reinigung erfolgt im wesentlichen nach der Methode von Laemmli, U.K. (1970) » Nature 227, 680-685]. Nach der Elektrophorese werden die Gele in 2 mm dicke Scheiben geschnitten. Diese werden während 10 Minuten in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,01 M 25 Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3; 0,14 M Natriuxnchlorid) jj enthaltend 0,1% Triton X-100 in Propylen-Röhrchen ein- | getaucht. Der Puffer wird in serienmässiger Verdünnung | nach dem CPE-Inhibitionstest nach Interferon-Aktivität 1 untersucht. Die Scheiben 6 und 7 (numeriert vom unteren Ende \ 30 jedes Gels) zeigen die höchste Interferon-Aktivität (je ’l : ungefähr 25% der Aktivität des gesamten Gels). Je eine Scheibe / mit Höchstaktivität wird mit einer Rasierklinge auf einer ! /7 .

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Glasplatte kleingeschnitten, in eine 1 ml Spritze enthaltend 0,2 ml 0,15 M Natriumchlorid transferiert und in jede Maus eingespritzt. Die Gelsuspension wird intraperitoneal injiziert, worauf 0,2 ml BCG (Bacillus Calmette-Guérin; 5 Serum Institut Bern) injiziert werden.

Nach 12 Tagen wird das Serum jeder Maus auf Interferon-Neutralisationsaktivität untersucht.Das Serum von Maus Nr. 3 zeigt eine 50%ige Neutralisation von 10 Einheiten/ml von IFL Y(a) bei einer Verdünnung von 1:72 000, neutrali-.

10 siert jedoch dieselbe Konzentration, von rohem IFL [< 0,1% Reinheit) sogar bei einer Verdünnung von 1:100 nicht. Die Mäuse Nr. 1 und Nr. 2 zeigen Neutralisationstiter von weniger als 1:1000 gegen IFL γ(a).

70 Tage nach der zweiten Immunisierung erhält Maus Nr. 3 an drei nacheinanderfolgenden Tagen eine intraperitoneale Booster-Injektion mit einem Gemisch von IFL a, ß und γ enthaltend ungefähr 50 μg Interferon und 15 μΐ normales Mausserum als Trägerprotein (in 0,2 ml 0,15 M Natriumchlorid). 48 Stunden nach der letzten Injektion 20 wird die Maus getötet und die Milz zur Herstellung der monoklonalen Antikörper entfernt.

C) Zellkulturen und Zellfusionen

Die folgenden Materialien und Medien werden verwendet. Iscove's Modifikation von Dulbecco's modifiziertem 25 Eagle-Medium (IMDMEM) ist von Gibco erhältlich. Es wird frisch ergänzt mit Natriumpyruvat (1 mM), Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoäthanol (5 x 10 ^M), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 ug/ml). Vollständiges HAT Medium besteht aus so vervollständigtem IMDMEM sowie Hypoxanthin 30 (10 4M), Aminopterin (4 x 10-7M), Thymidin (1,5 x 10~5M) und 15% foetales Kälberserum. Eine 50%ige (w/v) Lösung von f\ ' « - 8 -

Polyäthylenglykol 4000 (PEG 4000, Merck) wird in IMDMEM hergestellt.

Die Fusion mit einer nicht-produzierenden Azaguar. resistenten Myelomzell-Linie wird unter kleinen Modifik 5 tionen nach der Methode von Stähli et al. in J. Immunol

Methods 32^ 297-304 durchgeführt. In dieser Fusion werc 6 6 48 x 10 kernhaltige Milzzellen mit 25 x 10 Myelomzell | " der Linie FO (Fazekas de St. Groth und Scheidegger in : J. Immunol. Methods 3j>, 1-25 (1980)) fusioniert. Die Mil r- ! 10 zellen und Myelomzellen werden in serumfreien IMDMEM gs waschen. Sie werden dann im selben Medium resuspendiert i oben erwähnten Verhältnis für die Fusion gemischt und 1 i 40 ml serumfreien IMDMEM in einem 50 ml konischen Poly propylen-Röhrchen bei 200 x g während 15 Minuten sedime j 15 gefolgt durch vollständiges Absaugen des Ueberstandes.

i Zellsediment werden unter ständigem Rühren tropfweise C

I 50%iges PEG 4000 zugesetzt, um die Zellen zu resuspend; und zu verteilen. Nach ungefähr 90 Sekunden werden bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren während 4-5 Minut 20 10 ml serumfreies IMDMEM tropfenweise zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten ohne Rühren werden grosse Zellklur i durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 10 ml Pipette

i getrennt. Das Fusionsgemisch wird mit vollständigem HAT

Medium auf 250 ml verdünnt und dann in 240 "Costar dus j 25 wells (1 ml/well)" gegeben, die bereits 1 ml komplettes !. HAT Medium und 10^ peritoneale Maus-Zellen als Nährschi I enthalten. Die Kulturen werden in einer 5%igen C02/95%

Atmosphäre bei 85% Feuchtigkeit inkubiert. Die Kulturer I werden zweimal in der Woche durch Ersetzen des halben f ! s 30 Mediums (1 ml) mit frischem HAT Medium gefüttert.

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- 9 - D) Auffinden von Interferon-spezifischen Hybridomen durch einen Festphasen-AntiKörperbindungstest (SABA) *

Diese Methode ist adaptiert von dem von Catt and Tregear [Science 158/ 1570-1572 (1967)] beschriebenen 5 Prinzip und ist geeignet für das Auffinden von Hybridom-Antikörpern (vgl. auch Stähli et al in J. Immunol.Methods 32, 297-304 (1980) sowie Kennet, R.H. in Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81, S. 77-91 (1978)).Interferonpräparate von IFL α, ß, γ und δ werden individuell 10 in Polypropylen-Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu einer Endkonzentration von ungefähr 0,2 bis 0,5 pg Interferon/ml (ungefähr 1-3 pg Gesamtprotein per ml; ausgenommen für IFL δ, wo ungefähr 10-15 pg von Gesamtprotein per ml enthalten sind) verdünnt, um damit Poly-15 vinyl-Chlorid Mikrotiter Platten (Cooke Laboratory Products Division, Dynatech Laboratories, Inc.) wie bei Stähli et al. loc.cit. zu beschichten. 50 μΐ der Interferonlösung wird in jede Vertiefung gegeben und während mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer 20 gelassen oder während 4°C während mehreren Wochen gehalten. Vor dem Gebrauch werden die Vertiefungen mit 3%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS gefüllt und während 30 bis 60 Minuten so belassen, um 'alle Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die Platten werden dann viermal mit PBS ge-25 waschen. 50 μΐ Ueberstand der Hybridomkulturen werden in je zwei Vertiefungen während mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Kontrollversuche (unspezifische . Bindung) werden an Platten durchgeführt, die nur mit 3%igem

BSA beschichtet sind. Nach viermaligem Waschen mit PBS

30 wird zu jeder Vertiefung 50 μΐ Schaf-Anti-Maus Ig-Antikörper 125 (durch Affinitätschromatographie gereinigt und mit I markiert; 50 000 bis 100 000 cpm pro 20 bis 30 ng Antikörper in PBS enthaltend 1% BSA) gegeben und während mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden 35 vier« bis fünfmal mit PBS gewaschen und dann in die einzelnen Vertiefungen geschnitten, welche dann in einem

Gamma-Scintillations-Spektrometer auf Radioaktivi tät getestet werden.

- 10 - E) Ergebnisse 5 a) Initialscreening durch Antikörperbindunq (SABA) gegen teilweise gereinigte IFL Fraktionen 152 der 240 Kulturen zeigen Wachstum von Hybridomen. Die Ueberstände werden auf Interferon-spezifische Antikörper im SABA Test geprüft, wenn die Kulturen ungefähr 10 20-30% konfluent sind (12-29 Tage nach der Fusion). Anti

körperbindung wird parallel geprüft mit IFL a, IFL ß, IFL und IFL δ. Von den 152 Kulturen zeigen 13 Ueberstände hohe Antikörperbindung gegen alle vier teilweise gereinigten Interferonpräparate. Das Medium von vier weiteren 15 Hybridomen zeigt niedrige Bindungsaktivität (3-4 mal grÖSi als unspezifische Bindung) gegen alle vier Interferonpräparate. Diese Kulturen werden verworfen. Die Medien aller anderen Hybridome (135 wachsende Kulturen) liefern unspezifische Bindungen gegen alle vier IFL Präparate. Vor 20 den 13 spezifischen Hybridomen werden für die vorliegende Erfindung 9 repräsentative charakterisiert. Ihre Bezeichn; ist LI—1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8, LI-9 und LI

Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, zeigt die Antikörp' bindung der 9 spezifischen Hybridome zu den 4 teilweise j - 25 gereinigten Interferonpräparaten ein unterschiedliches j „ Verhalten. LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 und LI-8 j zeigen eine identische Charakteristik mit der folgenden

Bindungsreihenfolge: IFL α < IFL δ < IFL γ < IFL ß. Für I LI-9 ist die Bindungsordnung IFL δ < IFL γ < IFL ß. LI-12 i 30 ist verschieden von allen übrigen.

! / l h - 11 - b) Antikörperbindunq (SABA) gegen hoch gereinigtes Leukozyten-Inter feron

Sechs gereinigte 80% rein) Interferonspezies (vlg. Stufe 9 von Tabelle 3 der DOS 29 47 134) werden durch 5 Adsorption an Polyvinylchlorid Mikrotiterplatten immobilisiert. Es handelt sich dabei um IFL a^, o^, Ύ2 und Ύ3 sowie um IFL—K der Zell-Linie KG-1 [Koeffler, H.P. et al. Science 200, 1153-1154 (1978)], welches in Analogie zu den Stufen 1 bis 9 von Tabelle 3 der erwähnten DOS gereinigt 10 wird. Da in den Stufen 8 und 9 keine klare Trennung in individuelle Spezies zu beobachten war, wurde die Hauptfraktion mit der Interferonaktivität gepoolt. Sie stellt deshalb ein Gemisch verschiedener Spezies dar. Die Adsorption von Interferon (50 μΐ/pro Vertiefung) wird über Nacht bei 15 ungefähr 0,5 pg Interferon und 2 pg BSA pro ml PBS gefolgt durch Abblocken der Proteinbindungsstellen mit 3%igem BSA wie vorhergehend beschrieben, durchgeführt.

Die Antikörperbindung mit Kulturmedium der 9 spezifischen Hybridome gegen die 6 verschiedenen, 20 gereinigten Interferone wird in Figur 2 gezeigt. Es können wiederum verschiedene Gruppen von Antikörpern mit unterschiedlichem charakteristischem Bindungsverhalten unterschieden werden. Die Gruppe 1 umfasst die Antikörper LI-1 und LI-2, die identische Bindungscharakteristik haben, die 25 jedoch IFL nicht erkennen. Die Gruppe 2 umfasst die

Antikörper Ll-3,LI-5,LI-6,LI-7 und LI-8 mit einer möglichen Unterscheidung von zwei Subgruppen. Subgruppe 2a (LI-3,LI-5 und LI-6) zeigt überall höhere Bindung (Figur 1 und Figur 2) , als Subgruppe 2 b (LI-7 und LI-8), wobei die letztere Sub-30 gruppe relativ stärker an gereinigtes IFL und IFL-K bindet als die erstere. Nach dem Interferonbindungsverhalten der verbleibenden Antikörper gemäss Figur 2 und Figur 3 hat LI-9 die meisten Charakteristika der Subgruppe 2b.

, LI-12 scheint wiederum für sich einzigartig zu sein.

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Ilm Hinblick auf die Tatsache der hohen Antike·.

bindung zu unterschiedlich gereinigten Interferoner. sehr unwahrscheinlich, dass irgendeiner dieser Ant" 3.1 J-θ » nicht gegen Interferon, sondern gegen Kontaminanter ^ 5 richtet wäre. Dies wird für die meisten dieser Ant: r* — - auch durch die Fähigkeit gezeigt, die biologische

Aktivität von Interferon zu neutralisieren. LI-1, I ä LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8 und LI-9 heben die dur

Interferon induzierte Inhibition des viralen CPE ar \ - 10 Zellen auf. Die Interferonneutralisierung wird mit î L» ·

*: weise gereinigtem IFL y(a) und/oder gereinigtem IFI

0 j IFL γ^, IFL a2 und rohem Leukozyten-Interferon gete | Keiner der Antikörper war in der Lage, rohes Leukor 1 Interferon zu neutralisieren. LI-12 neutralisiert k . .

sitive 15 der getesteten Interferone (vgl. hierzu Tabelle 1).

I ..... fur 1 Fähigkeit der erfindungsgemässen Antikörper, durch ’ällen J kombinierte DNS-Technik erhaltene Interferone mit h j xn- 1 Affinität zu binden, geht aus der Tabelle 6 hervor.

] 2) Isotypen der schweren und leichten Ketten uktion Ι 20 monoklonalen Interferon-Antikörper den il

Monoklonale Antikörper von Hybridom-Kulturmec werden zuerst an Interferon-beschichtete Mikrotiter gebunden, wie dies vorgängig für den SABA Test besc JrlPB wurde. Hach dem Waschen werden sie mit Isotyp-spez: ' i 25 Kaninchen Anti-Maus lg Antiserum (Nordic) inkubiert j| .

h Nachweis wird Ziegen Antikaninchen IgG verwendet, v mit Meerrettich-Peroxidase markiert ist. Als Enzyms er_ I werden 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzothiazolin-sulfar ' i ^ 11 Wasserstoffperoxid verwendet. Die Ergebnisse sind : --“2) j| 30 Tabelle 1, zweite Kolonne, zusammengefasst. Sieben ^ruppe Π geprüften Antikörper haben die Immunglobulinketten einer Y2t)/k und einer μ/h* Alle sieben γ^/k Antikö: “hs wie auch der γ2^Α neutralisieren Interferon, wogeç ί*1 μ/k Interferon nicht neutralisiert, wie ebenfalls c.

\i i1 35 Tabelle 1 ersichtlich.

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- 13 - 3) Klonieren und Stabilisieren der Interferonspezifischen Hybridome

Zur Herstellung stabiler.Hybridom-Linien werden alle 9 spezifischen Hybridome durch limitierende Verdünnung in 5 Mikrotiterplatten mit Maus-peritonealen Zellen als Nährschicht kloniert [Hengartner H. et al. in Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81, 92-99 (1978)].

Das Klonieren wurde zum Zeitpunkt des Transfers der Originalkulturen in Flaschen oder kurz danach begonnen.

10 Die Klone wurden mit dem SABA Test gegen IFL ß getestet.

Die Ergebnisse dieses ersten Klonierens· der 9 Hybridome wird in Tabelle 2 gezeigt.

Von jedem Hybridom werden zwei bis vier stark positive Klone hochgezüchtet und sowohl i.p. in Mäuse injiziert für 15 Ascites Produktion als auch gefroren. In den meisten Fällen werden die ausgewählten Klone eines Hybridoms zur Vereinfachung und Reduktion der Arbeit gepoolt. Von allen 9 Hybridomen erhält man Ascites Flüssigkeit für die Produktion von Antikörpern im grossen Masstab. Ascites-Zellen werden 20 ebenfalls in Kulturen transferiert und gefroren.

4) Gruppierung der Antikörper nach ihrer Interaktion mit HLI

Die Hauptgruppe der sieben Hybridome, die γ^/k Immunglobuline produzieren, kann in zwei Gruppen unter-25 teilt werden aufgrund ihrer Antikörper-Interaktion mit gereinigten Interferonen. Die erste Gruppe (LI-1 und LI-2) erkennt gereinigtes IFL nicht, wogegen die zweite Gruppe . (LI-3 und LI-5 bis LI-8) IFL -γ^ erkennt. Die relative, quantitative Bindung der monoklonalen Antikörper an sechs if\ I - 14 - h 1 '* J unterschiedliche, gereinigte Interferone (vgl. Figur 2) und die Unterscheidung zwischen neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Antikörpern liefert Information zur Unterscheidung unterschiedlicher Epitope (antigenische 5 Determinanten) von HLI und zur Aufzeigung von strukturellen Unterschieden zwischen unterschiedlich gereinigten Interferonen. Vom Bindungsverhalten

Ider Antikörper (vgl. Figur 2) ist klar, dass LI-1 und LI-2 eine andere Struktur als alle anderen Antikörper 10 erkennen und dass IFL strukturell verschieden ist von allen anderen getesteten Interferonen, da es das von LI-1 und LI-2 erkannte Epitop nicht aufweist. LI-12, ein nicht-neutralisierender Antikörper, erkennt mit ungefähr gleicher, obwohl vielleicht geringerer Affinität, eine weniger 15 variable Determinante, welche in allen getesteten Inter-| feronen vorhanden ist. Die Ergebnisse hinsichtlich der

Antikörperbindung und der Interferonneutralisation lassen erkennen, dass mindestens drei verschiedene Epitope von HLI durch die Kollektion der monoklonalen Antikörper 20 erkannt und definiert werden können.

Beispiel 2

Bestimmung von Interferon | 1) Auswahl eines geeigneten Paars von monoklonalen | Antikörpern 125 Zur Unterscheidung zwischen kompetitiver Bindung von zwei Antikörpern an dasselbe Epitop und additiver Bindung an verschiedene Epitope wird die Bindung der Antikörper allein und in Paaren und in allen möglichen Kombinationen 1 an immobilisiertem Interferon getestet. Ueberstände von Î* 30 konfluenten Hybridom-Kulturen werden ohne weitere Reinigung ^ als Antikörperquelle verwendet. Teilweise gereinigtes i //Λ - - - - 15 -

Leukozyten-Interferon (20-30% reines IFL ß) wird in begrenzten Mengen (0,1 bis 0,2 pg Interferon/ml) auf Polyvinylchlorid Mikrotiterplatten gegeben, wie dies in Beispiel 1 für den SABA beschrieben wird. Es folgt das 4» - - 5 Abblocken aller Proteinbindungsstellen mit 3%igem BSA.

50 μΐ Antikörperlösung bestehend aus je 25 μΐ zweier

Kulturüberstände oder 2x25 μΐ desselben Antikörpers werden während 7 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten

werden mit PBS (0,01 M Kaliumphosphat, pH 7,3; 0,14 M

10 Natriumchlorid) gewaschen und während 5 Stunden mit einem 125

Ueberschuss von I markiertem Schaf-Anti-Maus-Ig Immunglobulin in einem Volumen von 50 μΐ pro Vertiefung inkubiert, um die Menge von monoklonalen Antikörpern, die an Interferon gebunden sind, zu messen (Tabelle 3). Die Bindung zweier 15 Antikörper wird als additiv betrachtet, wenn die Bindung dieser. Antikörper diejenige mit 50 μΐ des höher bindenden einzelnen Antikörpers übersteigt. Aufgrund dieses Kriteriums wurde gefunden, dass LI-1 mit fast allen anderen Antikörpern additiv bindet und dass LI-9 die beste additive Bindung 20 mit LI-1 gibt.

LI-1 und LI-9 von Ascites-Flüssigkeit werden nach

Standardmethoden, d.h. durch Ammoniumsulfatfällung (50%ige Sättigung) und DEAE-Zellulosechromatographie bis mindestens zu 90% gereinigt, wie dies durch Natrium- 25 dodecylsulfat-polyacrylamid Gel Elektrophorese beurteilt • · 125 wird. 20 pg jedes Antikörpers werden mit I nach der Chloramin-T-Methode zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 20 pCi/pg markiert. Freies Jod wird von markiertem Antikörper durch Gelfiltration an Sephadex G-25 30 in Gegenwart von PBS und 1% BSA getrennt.

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Unmarkierte Antikörper LI-1 und LI-9 zu ungefähr 20 pg pro ml PBS werden über Nacht an PVC-Mikrotiterpla- . (Cooke Laboratory, Products Division, Dynatech Laboratc. r Inc.) adsorbiert (100 μΙ/Vertiefung). Während 30 bis 5 60 Minuten werden alle Proteinbindungsstellen mit 3%ige BSA in PBS blockiert. Gereinigtes Leukozyten-Interferor. der KG-1 myeloiden Zell-Linie bei einer Konzentration v 10 Einheiten/100 μΐ PBS und l%iges BSA werden zusammen 125 5 einem der I markierten Antikörper (1,3 x 10 cpm) ir 10 Antikörper-beschichteten Vertiefungen inkubiert. Kontrc

Vertiefungen enthalten markierten Antikörper, aber kein -Interferon. Nach Inkubation während 3 Stunden bei Raum- .1 temperatur wird die Flüssigkeit entfernt und die Vertiefungen der Platten viermal mit PBS gewaschen und dar.

15 in einem Gamma-Scintillations-Spektrometer auf Radioak* tät getestet..'Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Kombination von LI-1 mit LI-9 gibt Interferon-abhängige sandwich-artige Antikörperbindung. Die bessere Kombinat ist immobilisierter LI-9 mit markiertem LI-1 in Lösung.

20 Aus diesem Grunde sind die weiteren Experimente mit J immobilisiertem LI-9 und markiertem LI-1 durchgeführt \ ! j a) Einstufeninkubationsverfahren | . Jede Vertiefung einer PVC-Mikrotiterplatte wird 100 μΐ LI-9 (15 μg/ml in PBS) bei Raumtemperatur über : 25 oder bei 4°C während Tagen oder Wochen in einer befeucr

Kammer beschichtet. Vor Gebrauch wird die Lösung von LZ

entfernt und die Vertiefungen werden mit 3%igem BSA war I 30 bis 60 Minuten gefüllt und dann viermal mit PBS ge- ; s . 125 ! waschen. Ungefähr 140 OOO cpm I markierter LI-1 (unr | 30 fähr 4 ng, spezifische Aktivität ungefähr 20 pCi/^g) ir: ; 0,1 ml PBS enthaltend l%iges BSA und 100 bis 150 μg hu:

IgG pro ml werden in jede Vertiefung gegeben. Entsprec: ; verdünnte Interferonlösungen (1-20 μΐ) werden in die V-.

| tiefungen gegeben und durch kurzes Schütteln gemischt.

j 35 bis 3 ständiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die - 17 - keit auf Absorptionspapier abgegossen. Die Platte wird vier- bis fünfmal mit PBS gewaschen und die einzelnen Vertiefungen werden in einem Gamma-Scintillaitons-Spektrometer auf Radioaktivität getestet. Bei höheren Interferonkonzen-5 trationen (> ca. 5000-6000 U/ml) tritt eine partielle Inhibition auf. Die erhaltenen Resultate sind in Figur 3 und Tabelle 5 wiedergegeben.

b) Zweistufeninkubationsverfahren LI-9 beschichtete und BSA-gesättigte PVC-Mikrotiter- 10 platten werden wie vorgehend beschrieben hergestellt. 50 μΐ pro Vertiefung einer Interferonlösung in PBS enthaltend l%iges BSA werden während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, worauf die Platten viermal mit PBS gewaschen 125 werden. Darauf werden 50 μΐ I LI-1 (ungefähr 150 000 15 cpm/4 ng) PBS enthaltend l%iges BSA und 150 pg humanes IgG per ml in jede Vertiefung gegeben, worauf die Platten während 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten werden und dann viermal mit PBS gewaschen und wie oben erwähnt auf Radioaktivität getestet werden. Die erhaltenen Resultate 20 sind in Figur 4 wiedergegeben. Im Gegensatz zum Einstufenverfahren zeigt sich keine partielle Inhibition bei hoher Interferonkonzentration.

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j ' ‘ - 18 - c) Bestimmung von antiviral inaktiviertem Interferon

Hitzeinaktivierung von Interferon

Eine Lösung (2,4 ^jg/ml) von Interferon A (Goeddel et al., | Nature Vol. 290, März 1981) in "Eagle1s minimal essential f| medium" enthaltend 10% foetales Rinderserum und 1 mg/ml ! Rinderserumalbumin wird mit phosphatgepufferter Kochsalz- H lösung (0,14 M NaCl, 8 mM Na2HP04, 1,5 mM KH2P04, 3 mM KCl, ! . 0,9 mM CaCl2 und 0,5 mM MgCl2) 1:480 verdünnt. Die ver- ! dünnte Lösung enthält Interferon A in einer Konzentration von 5 ng/ml. Nach Erhitzen auf 65°C während einer bestimmten Zeit werden 0,14 ml Proben bis zur Bestimmung in einem ; Eisbad gehalten. Sowohl die antivirale wie die immunologische

Bestimmung werden am selben Tag durchgeführt. Von den 0,14 ml | Proben werden 0,1 ml für das Radioimmunverfahren und 10 ^j1 ‘ für die antivirale Bestimmung (im Doppel) verwendet. Das

Radioimmunverfahren erfolgt nach dem unter B. beschriebenen 2-Stufen-Inkubationsverfahren. Die antivirale Bestimmung erfolgt nach dem CPE-Inhibitionstest. Die erhaltenen Resultate sind in Figur 6 wiedergegeben. Aus diesem lj Beispiel geht hervor, dass das Antikörperpaar Li 1/Li 9 ; antiviral aktives und antiviral inaktives Interferon unterscheiden kann. Aus der Figur geht weiterhin hervor, ;j dass die antivirale Aktivität und die Immunreaktivität ijj | gleichzeitig abnehmen.

1 j d) Hochempfindliche Interferonbestimmung m Humanplasr I oder Serum (Radioimmunverfahren) ^ Es wird eine einzige Inkubation von 0,1 ml 40%igem | Humanplasma oder Serum (neutraler pH) enthaltend ungefähr ^ 250 000 cpm (1,5 ng) ^2^I LI-1 (spezifische Aktivität 100 bis 110 pCi/yg LI-1) bei Raumtemperatur während 14 bis j| 16 Stunden in PVC-Mikrotiterplatten durchgeführt, welche J! wie vorgehend beschrieben mit LI-9 beschichtet sind. Nach viermaligem Waschen mit PBS werden die Vertiefungen wie ' / vorhergehend erwähnt gezählt. Es wird ein Experiment mit « - 19 -

Interferon durchgeführt, das zu Citratplasma eines gesunden

Probanden zugegeben wird. Jede 0,1 ml PBS-Testmischung ent- 125 halt 40 μΐ Plasma, 1,3 ng I LI-1 (256 000 cpm) und verschiedene Mengen, von rohem humanem Leukozyten-Interferon 5 (ungefähr. 0,1% rein) von chronisch myologenen Leukämiezellen. Die Resultate sind in Figur 5 wiedergegeben, wo der Anteil an Interferon als Abszisse aufgetragen ist. Als rohes Leukozyten-Interferon wird Inkubationsmedium gemäss Stufe 1 von Tabelle 3 der DOS No. 29 47 134 verwendet.

10 Beispiel 3 t

Hochempfindliche Bestimmung von Interferon in Pati.enten-serum (Enzym-Immunverfahren)

In die entsprechende Anzahl Teströhrchen (10 x '75 mm) werden je 0,05 ml Testlösung (0,1 mol/1 Natriumphosphat, 15 pH 6,5 mit 10 g/1 BSA und 0,5 pg/ml monoklonales LI-1 Anti-

Interferon-Peroxidase-Konjugat'in Interferon-freiem Humanserum) pipettiert, 0,2 ml der zu analysierenden Patientenplasmen respektive der Interferon-Standards (0 U/ml, 12,5 U/ml, 25 U/ml und 50 U/ml Interferon) und des Interferon-20 Kontrollserums (z.B. 30 U/ml Interferon) zugemischt, je eine mit monoklonalem LI-9 Anti-Interferon-beschichtete Polystyrolkugel (0 ='6,5 mm) zugefügt und bei Raumtemperatur (18-26°C) während 16 Stunden inkubiert. Anschliessend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2 bis 5 ml destilliertem 25 Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/1 Kaliumcitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/1 un^ o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 26°C) inkubiert. Zum Abstoppen der 30 peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Lichtabsorption werden 0,5 ml 4 N HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle sind die Werte einer Interferon-Bestimmung aufgeführt und mit den / 35 Werten verglichen, wie sie mit den Interferon-Standards . i I* \ K J 20 _ erhalten wurden. Als Interferon-Standard wird rohes Leuko-zyten-Interferon (Inkubationsmedium gemäss Stufe 1 von Tabelle 3 der DOS 29 47 134) verwendet.

Tabelle 5 Probematerial ΔΕΛ92 nm/RT/30 Min.

i ' -:-;-: - i i Interferon-Standard 3 ! 0 U/ml Interferon 0,065 / 0,070 \ 12,5 U/ml ” 0,24-5 / 0,235 i 25 U/ml " 0,4-25 / 0,4-30 i 10 50 U/ml w 0,775 0,790 i \ Kontrollserum ( 30 U/ml Interferon) 0,505 / 0,490 j I Patientenplasmen j; |i No 8327 o U/ml Interferon jj ‘ No 8328 0 U/ml Interferon

II

15 No 8336 9 U/ml Interferon [i No 8333 0 U/ml Interferon

No 8339 5 U/ml Interferon !' “ No 8363 0 U/mL Interferon j; No 8341 2 U/ml Interferon 20 No 8344 16 U/nl Interferon 1 !a - 21 -Beispiel 4

Reinigung von durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenem Leukozyten-Interferon (Interferon A; vgl. Goeddel et al. Nature, vol. 290, März 1981) a) Vorreinigung des durch rekombinierte DNS-Technik 5 erhaltenen Human-Leukozyten-Interferons

Alle Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Gefrorene Bakterien-Zellen (1 kg) werden durcfi Druckzertrümmerung zerstört. Der Extrakt wird nach Standardverfahren aufgearbeitet, d.h. durch Polyäthylenimin (Polymin P)- und 10 Ammoniumsulfatfällung,' gefolgt von einer Dialyse des 65%igen Ammoniumsulfatniederschlages gegen 25 mM Tris HCl, pH 7,8; 0,01% Thiodiglykol; 0,1% Triton X-100; 10 μΜ Phenylfluorid.

Es folgt eine Zentrifugation zur Entfernung unlöslicher Anteile.

15 b) Herstellung des Immunoadsorbens .

In Analogie zu Beispiel 2 gereinigte Antikörperlösung enthaltend LI-8 wird gegen 0,2 M Natriumcarbonat/0,3 M Natriumchlorid Puffer bei Raumtemperatur dialysiert. Die dialysierte Lösung wird bei 20 000 x g während 15 Minuten 20 zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Die Proteinkonzentration wird auf ca. 25 mg/ml mit dem obenerwähnten Puffer eingestellt. Affi-gel 10 (BioRad

Laboratories, Richmond, California) wird dreimal mit eiskaltem Isopropanol an einem gesinterten Glasfilter gewaschen 25 und dann dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel wird in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurze Zentrifugation sedimentiert. Der üeberstand wird abgesaugt. Das Gel wird mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und Kopf über Fuss 30 wahrend 5 Stunden bei 4°C rotiert. Nach der Reaktion wird / rr\ ' - 22 - I · ( î . · I ‘ das Gel zentrifugiert und dann zweimal· mit Puffer (0,1 M NaHCO^/OjlS M NaCl) gewaschen, um ungebundenen Antikörper I zu entfernen. Proteinbestimmung der vereinigten Wasch- I wasser zeigt, dass ca. 24 mg an Antikörper pro ml Gel 5 gebunden wurde.

c) Affinitätschromatographisehe Reinigung des vorgereinigten, durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenen Leukozyten-Interferons

Die in Schritt a) erhaltene Lösung (700 ml enthaltend 10 37 g Protein) wird mit 50 ml/h auf die mit PBS äquilibrierte

Immunoadsorbens Säule (2,5 x 3,5 cm; 17 ml Bettvolumen enthaltend ca. 400 mg gereinigter monoklonaler Antikörper ύ LI-8); aufgetragen. Man wäscht mit 20 Säulen-Volumen an Puffer 1 (0,5 M NaCl; 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,2% Triton X-100), i 115 dann wird die Säule mit 5 Säulen-Volumen von 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 gewaschen und dann mit 0,2 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 (pH 2,5) eluiert. Die Interferon-Aktivität wird in ca. 30 ml in einer durchschnittlichen Konzentration von ungefähr 1 mg Protein/ml 20 eluiert. Diese Lösung wird mit 1 M Tris Base auf pH 4,5 1 eingestellt und vierfach mit Wasser verdünnt. Die Probe (wird auf eine Carboxymethylcellulose (CM 52 Whatman) Säule (1,3 x 3 cm) geladen, die mit 0,1 M Ammoniumacetat (pH 5,0) I äquilibriert ist. Die Säule wird mit 20 ml 0,1 M Ammonium- 25 acetat (pH 5,0) gewaschen und das Interferon mit 20 ml 0,5 M Ammoniumacetat (pH 5,0) eluiert. Das Ergebnis der Reinigung ist in Tabelle 7 wiedergegeben.

:) ij * I In ähnlicher Weise und mit vergleichbarer Ausbeute B lässt sich Interferon A auch mit den Antikörpern LI-3, i 30 LI-5, LI-6, LI-7 und LI-9 reinigen.

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Tabelle 1

Epitop Monoklonale Isotypen Ketten ^Neutralisation Antikörper I J T V Λ C LI-2 Yx/k Ja !LI“3 Y-j/k Ja LI-5 Yx/k Ja LI"6 Vk Ja LI-7 I9G Y-j/k Ja 1,1-8 Y-j/k Ja LI 9 ‘ Y2b//k Ja III £ LI-12 IgM μ/k Nein

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Tabelle 2 i - i.

I __________________________ i'.--1----1 i- [ Kultur Zellen pro geprüfte Klone Anzahl Anzahl | 96 "wells" oder "wells" Positive Negative LI-1 100 6 6 0 LI-2 100 11 6 5 LI-3 100 7 70 1 LI-5 100 13 13 0 ._____]_I___ ]j LI-6 100 12 12 0 i' —:--:-----:-- i| jj LI-7 100 10 8 2 !|__________ i LI-8 100 9 81 LI-9 100 10 8 2 |j i ————— LI-12 100 4 04 i - fl LI-12 300 48 6 42 i __:____ i; . / ί n i I1 !" i ! i ji I - ' ί li ! - 25 - i - *

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Tabelle 5 1125 iterferon Einheiten CPM[ I]LI-1 ro Bestimmung Bindung 100 2'202 100 1*633 -:-j--— 100 822 100 8'135 100 70 100 7'036 100 4'804 100 101 100 198 100 121 100 5'498 / h\ - 28 -

Tabelle 6

Antikörper

Interferon Lï-1 Li-3 Ll-5 Li-6 Li-7 Li-S Li-9 A + + + + + + + B + ·- - -»-_» - D . + + + + + +

F

I Legende:

Die mit A bis F gekennzeichneten Interferone sind die durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenen und in der Arbeit von David V. Goeddel et al. in Nature Vol. 290, März 1981, beschriebenen Interferone. Ein + bedeutet, dass das entsprechende Interferon durch eine mit dem jeweiligen Antikörper beladenen Säule vollständig | adsorpiert wird, wogegen ein - keine Adsorption bedeutet.

I Ein + bedeutet partielle Adsorption.

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Claims (13)

1. Kollektion von monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Glieder gegen natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene humane Leukozyten-

2. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die monoklonalen Antikörper von verschiedenen Hybridomen sezerniert werden. i

3. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Gruppen von Antikörpern besteht, welche sich voneinander in ihren Isotypen unterscheiden.

4. Kollektion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ff. Antikörper vom IgG und ein Antikörper von IgM Isotyp sind.

5. Kollektion nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass von den 8 Antikörpern mit IgG Typ 7 eine schwere ! und einer eine schwere Kette aufweist. ZD

5 Interferone (HLI) gerichtet sind.

6. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, | dass sich einzelne monoklonale Antikörper gegenseitig nicht | v 20 inhibieren, d.h. gemeinsam an HLI binden, andere sich ] gegenseitig inhibieren, d.h. nicht gemeinsam an HLI binden. "I j

7. Kollektion nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, | \ __ dass sie aus Gruppen von Antikörpern besteht, deren Glieder ! verschiedene Epitope (antigenische Determinanten) von

25 HLI erkennen. | h . »' - 31 -

8. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Antikörper aus der Kollektion HLI γ3 nicht erkennt.

9. Kollektion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, 5 dass ein Antikörper (IgM) die antivirale Aktivität von HLI nicht neutralisiert.

10. Verwendung von je einem Glied von verschiedenen Gruppen von Antikörpern gemäss Anspruch 7 für einen Festphasen-Sar.dwich-Test für. HLI.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht immobilisierte Antikörper mit Radioaktivität oder einem Enzym markiert ist.

12. Verwendung von einem Antikörper gemäss Kollektion von Anspruch 1 zur Reinigung von natürlichem oder durch 15 rekombinierte DNS-Technik erhaltenem HLI.

13· verfahren zur Reinigung von natürlichem oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenem HLI, dadurch gekennzeichnet, dass man ein HLI enthaltendes Rohprodukt durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der Kollektion gemäss einem der Ansprüche 1-9 reinigt. *** Oj, ) w}