JPH01501200A - 抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体 本発明は抗体の新規な形態およびそのターゲット細胞用毒剤としての使用、就中 、腫瘍の治療への使用に関する。

非常に多くの細胞毒剤が腫瘍治療用に開発されているが、その治療には未だ処置 困難な問題が残っている。最近、腫瘍細胞を破壊するために有効細胞再ターゲッ ト化（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＥＣＲ）現象を 利用する研究がなされている。この研究では、抗Ｔ−細胞（ａｌｔｉ−Ｔ　ｃｅ ｌｌ）と抗腫瘍抗原活性を有する二重特異抗体（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎ ｔｉｂｏｄｙ）が示されている。この技術では最初二重特異抗体コンジュゲート が化学的手段により構成されたが（スタエルツら。

ネイチュアー、１９ｇ５，３１４，６２８およびペレツら、ネイチュアー、１９ ８５．３上見、３５４）、その後、ハイブリドーマ技術を用いて二重特異抗体分 子を製造している（スタエルツおよびベバン、グロシーディングズ・オブ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ、 １９８６．８３゜１４５３およびイムノロジー・トウディ、１９８６．７．２４ １）。

二重特異抗体は腫瘍細胞まＩ；は他の形態のターゲット細胞、例えばウィルス感 染細胞とＴ−細胞の両方に結合することにより、後者の作用により前者の破壊を 達成することによりその効果を発現する。

しかしながら、この文献に示されたごとき有効細胞珂ターゲット化の採用は、こ の研究の一つの重要な不利益を無視している。即ち、二重特異抗体は、それがな しかねない天然のＦｃ−リセブター介在細胞破壊機構の一つ、例えばに−細胞を 含む抗体依存細胞媒介細胞ＩＩ（ＡＤＣＣ）、好中球および大食球：大食球およ び細網内皮系の細胞による食作用；または補体活性化を介してそれが結合するＴ −細胞の破壊をひき起す可能性がある。この様なＴ−細胞の破壊は最善でも腫瘍 または他のターゲット細胞の破壊達成レベルが減少するにとどまり、最悪の場合 には全てのターゲット細胞毒性の完全な欠除をもたらす。

本発明は前述した全く未確認の問題を克服することを目的とする。

即ち、本発明は第一に破壊を促進し得るヒトＴ−細胞結合親和性および第二にタ ーゲット細胞親和性を有する二重特異抗体を含み、分子中のこの二種の重鎖（ｈ ｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）が該分子によるヒトＴ−細胞の破壊を緩和し、あるいは そのフラグメントが全分子の結合親和性を保持している点に特徴を有する。

本発明二重特異抗体分子は、二重特異性ではあるが、本発明抗体が２個の軽鎖と ２個の重鎮が存在する通常の形態の抗体分子である点で１９８５年のスタエルツ らおよびペレツらの轍叉の二重特異抗体とは異なる。１９８５年報文に記載され た二重特異性抗体においてはコンジュゲートは２個の通常の抗体を化学的に架橋 して製造され、４個の軽鎖と４個の重鎮とを含んでいる。１９８６年のスタユル ツとベパンの轍叉に記載されｊ；二重特異抗体はコンジュゲートよりもむしろ抗 体分子からなるが、著者はこれらの分子の使用に固有の問題を正しく理解してい ない。本発明は２個の重鎮は二重抗体分子によってヒトＴ−細胞の破壊を緩和す るように選択されねばならないと云う理解にもとづいている。さらに後述のごと く、本発明者らはこれらの分子中の２個の重鎮間のクローズ・インターアンジョ ン（コンジュゲートではない）がヒトＴ−細胞リセグターに対し親和性を有する 重鎮が、通常のＦｃリセプター介在細胞破壊メカニズムによってＴ−細胞を破壊 するタイプの場合でさえ、ターゲット細胞に対する親和性を有する２個の重鎮の 適当な選択によって、この破壊を妨害する可能性のあることを見出した。

本発明二重特異抗体分子はその毒性を方向づけるためにＴ−細胞と結合すること により機能し、この抗体分子のＴ−細胞結合親和性は破壊原因となる全てのＴ− 細胞リセプターに対して親和性であってよい。即ち、このリセプターは直接的に あるいは他の細胞型もしくは他の試剤の補佐により間接的に破壊するＴ−細胞の 能力と結びついていてもよい。即ちリセプターは直接的に破壊する細胞毒Ｔ−細 胞の能力、あるいはＢ−細胞による破壊を助ける補佐Ｔ−細胞（ｈｅｌｐｅｒ　 Ｔ−ｃｅｌｌ）の能力もしくは他の間接的な破壊モード（自然または人為的）と 結びついたものであってもよい。直接破壊を活性化し得るリセプターは特に重要 であるが、多くのりセプターは直接的および間接的な破壊モードと結びついてい る。

特に結合親和性はＴ−細胞抗原特異リセプタ−（Ｔｉと云う）を含み、かつＴ− 細胞の殆んどに存在するσおよびβ−鎖の一方または両方に向けられてもよく、 あるいは全体としてリセプター結合ＣＤ３ユニット（先にＴ３として同定）また はそれらの個々の鎖の一つに対して向けられてもよい。即ち、人の細胞に関する 研究では、Ｔ−細胞リセプターはイムノグロブリン遺伝子に対し類似する形態に 生体学的に再配列される遺伝子によりコードされるσ（Ｍｒ約５０，０００）お よびβ（Ｍｒ約４０．０００）として同定される２個の鎖のコンプレックスとし て存在することがわかった。各Ｔ−細胞は、従ってこれら２個の鎖に対してコー ドされる特有の再配列を有している。

これらの２個の鎖はＣＤ３コンプレツクスを含み、かつγ（Ｍｒ：約２５．００ ０）、δ（Ｍｒ：２０　、ＯＯＯ）およびε（Ｍｒ：約２０．０００）として同 定される少なくとも３個の他の鎖と結合して見出される。

Ｔ−細胞結合親和性を有する抗体は、公知のまたは新規のりセプターのいずれで あっても、我々の開発したアッセイ法により同定し得る。分泌抗体（ｓｅｃｒｅ ｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）同様殆んどの／１イブリドーマは少量の細胞表面 抗体（ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）を有している。即ち、例 えばラットＩｇＧ２ｂに対して抗体を作るマウスのハイブリドーマはその表面に あるラットＩｇＧ２ｂに対する少量の抗体によってラットＩｇＧ２ｂ抗体をトラ ップすることができる。もしハイブリドーマ細胞を放射活性物質、例えば＠ｌＣ ｒでラベルし、これをＴ−細胞とＴ−細胞に対するモノクローナル・ラットＩｇ Ｇ２ｂ抗体との混合物と共にインキュベートすると、ハイブリドーマ細胞は、Ｔ −細胞と結合するであろう抗体と結合し、それによってハイブリドーマの破壊お よびそれに続く放射活性物質の放出を導くであろう。従ってこの様な方法は適当 なＴ−細胞細合能（即ち、破壊を引きおこし得る能力）を備えたラットＩｇＧ２ ｂ抗体検出手段を提供するものである。適当な形態のハイブリドーマの選択によ って、上記のごときスクリーンは、全ての種（ｓｐｅｃｉｅｓ）　、クラスまた はサブクラスの抗体のうちから行なうことができる。この様なアッセイ法におい て検出される抗体を製造するハイブリドーマは後述のごとき方法で本発明二重特 異抗体を調製する際に使用してもよい。

抗−ヒ）Ｔ−細胞／抗−非ヒト・ターゲット細胞の二重特異抗体が重要であり、 特に研究分野、例えばラットとマウスの腫瘍のごとき動物の腫瘍と共に破壊する 細胞に必要な重要事項を検討するためのモデルシステムにおいて重要である。し かしながら、本発明の重要な領域は人間の薬であり、従ってヒトＴ−細胞に対す る第１の結合親和性（および人の体内にあるターゲット細胞に対する第２の親和 性）を有する二重特異抗体が特に好ましい。上述のごときアッセイ法を用いると 、ヒトＴ−細胞と結合し得る能力を有するモノクローナル抗体を製造するハイブ リドーマのうちから、Ｔ−細胞によって破壊を誘発し得るものを選択することが 可能である。この様な抗体の一例は後述する実施例３に記載されているハイブリ ドーマＹＴＨ１２，５，１４，２（および関連する全てのサブクローン（ｓｕｂ ｃ　１ｏｎｅｓ）によって製造されるラットＩｇＧ２ｂ抗体である。この抗体は Ｔ−細胞抗ｌＣＤ３と結合するが、異なった種（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の抗 体も同様に選択し得る。他の例はハイブリドーマＹＴＨ６５５（５）６およびＹ ＴＨ６１６，７，ｌ　Ｏ（ｒロイコサイト・ファンクション中に含まれる細胞表 面抗原に対するモノクローナル抗体」と題するＨ、Ｐ。

Ｔｉｇｈｅの博士論文、ケンブリッジ大学、１９８７）によって製造される抗− ヒトＣＤ２・ラットＩｇＧ２ｂ抗体、およびハイブリドーマ０ＫＴ３（米国特許 第４３６１５４９号明細書）によって製造される抗−ヒトＣＤ３−マウスＩｇＧ ２ａ抗体、ならびにＫｕｒｒｌｅら、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇｌｌ　 、　Ｖｏｌ、　ｌ　、　ヒトーＴ−リム７オサイト（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ　ｅｔ　 ａｌ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　ｌ　９８５　、第１３７頁）に記 載されている一群の抗−ＣＤ３マウスＩｇ抗体、およびｒＴｈｉｒｄＩ　ｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ａｎｄ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ 　ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎｔｉ ｇｅｎｓ、　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　ｍ。

Ｗｈｉｔｅ　ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ’ （？クマイケル（Ｍｃ−Ｍｉｃｈａｅｌ）著、オックス７オ一ド・ユニバージテ ィー・プレス、１９８７）に掲載されている種々の抗体、特にＣＤ３ユニツトに 対するこれらの抗体およびＴｉリセプターに対する抗体ならびにある種の抗−Ｃ Ｄ２抗体等がある。これらの全ての抗体を製造するハイブリドーマはもちろん誘 導体形（リフローン（ｒｅｃｌｏｎｅｓ）またはサブクローンとして）または類 似種の同族ハイブリドーマを用いてもよい。

さらに本発明はヒトＴ−細胞に対する第一の結合親和性および人体中に存在する ターゲット細胞に対する第二の結合親和性を有する二重特異抗体分子に関し、か つ該分子中の２個の重鎮が該分子によるヒトＴ−細胞の破壊を緩和するよう選択 されていることを特徴とする。

本発明の二重特異抗体分子の第二の結合親和性はターゲット細胞の表面上に存在 する全ての抗原に対するものであってよい。ターゲット細胞は体内から除去され るのが好ましいいかなる細胞であってもよい。具体的にはウィルス感染細胞（ウ ィルスそれ自体は通常Ｔ−細胞によって攻撃されない）、インフルエンザ、恐犬 病ウィルス等を含む種々のタイプのウィルス、マラリア、ハシセン病、トリパノ ソミアシス等に対応する寄生された細胞または寄生生物それ自体、および条虫お よび他の寄生生物、例えば蝿虫等がある。しかしながら好ましいターゲット細胞 は腫瘍細胞であり、第二の結合親和性は全ての腫瘍関連抗原に対するものである 。理想的状態は親和性が腫瘍特異性抗原、即ち、腫瘍細胞にのみ見出され、正常 な細胞には見出されない抗原に対するものである。しかしながら、ＢＣＬＬのご ときＢ−細胞マリグナンシーの治療に用いられて来たＢ−細胞１ｇイディオタイ プは現存するこの種抗原の非常に数少ない例の一つであり、実際に腫瘍結合抗原 は通常、正常な細胞中に存在する。好ましくは抗原はより高いレベルであるいは 適肖なレベルで腫瘍細胞上に異常に生産され、それによって腫瘍細胞に関する高 いレベルでの抗体−抗原反応が可能となる。しかしながらこのことは必らずしも 必要なことではない。即ち、例えば腫瘍細胞と正常な造血細胞間での相違がみら れない極端な場合においてさえ、正常細胞に及ぼす処置の毒作用が髄移植や処置 前の患者自身の骨髄の除去と手術後の返還により対処し得る。便宜的には腫瘍細 胞の除去のためにインビトロで骨髄の分離治療を行なう。特に重要な抗腫瘍抗体 の例はインターナショナル・ワークショップス・オン・ヒユーメイン・ロイコサ イト・ディフ７ランシエイション・アンティゲンズ（パリ　１９８０、ボストン 　１９８３．オックスフォード　１９８６）により標準化され、記載された一群 のモノクローナル抗体により認識された造血系の一群の区分（ＣＤ）をなす抗原 に対する抗体、および通常の急性リンパ芽球白血病関連抗原ＣＡ　Ｌ　Ｌ　Ａ、 ヒト・コロン・カルシノーマ上に生産される癌胎児性抗原およびヒト・メラノー マ関連ガングリオサイドＧＤ３に対する抗体等である。代表的な例は正常Ｂ−細 胞、多くの悪性Ｂ−ＭｉＰ１８よびＢ−セルライン上に生産されるヒトＢ−細胞 区分抗原ＣＤ１９である。

本明細書記載の二重抗体分子は２種の抗体、即ち、第一の結合活性と他の第２の 結合活性、の半分を化学結合によって製造してもよい（これは古典的方法または ハイブリドーマ技術によって製造してもよい）。しかしながら、本発明二重特異 抗体分子は、−重特異抗体よりむしろ、二重特異抗体の製造に対する必要性に応 じて変形されたハイブリドーマ技術により直接製造されたものである。一般に二 重特異抗体の調製技術はヨーロッパ特許出願第６８７６３号およびＰＣＴ出願第 ＷＯ３３／３６７９号に記載されており、これらはハイブリドーマ技術により製 造される二重特異抗体分子に広く関係している。骨髄腫出発物質の例はヨーロッ パ特許第１４５９号（ｃ。

Ｎ、Ｃ，Ｍ、Ｎｏ、ｌ−０７８）のＹ３−Ａｇｌ−２，３骨髄腫：ヨーロッパ特 許第４３７１８号のＹＢ２／３−０．Ａｇ、２０骨髄腫、骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３− Ａｇ８（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＣＲＬｌ　５９７）、骨ｆｊｌ　Ｉｌｉ　ＮＳ 　ｌ／１−Ａｇ４−１（Ａ−Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＴＩ　Ｂ　１８）おＪ：び骨髄 腫Ｐ３（スタエルツら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１９８５゜１３４． ３９９４−４０００）、ならびにヨーロッパ特許出願第６２４０９号および同第 １４８６４４号、英国特許第２０８６９３７号および米国特許第４５２９６９４ 号各明細書に記載されたごとき種々のヒト骨髄腫がある。各ハイブリドーマは、 軽鎖を生産しない骨髄腫から誘導されるが、骨髄腫軽鎖喪失腫、即ち、ＨＬＫよ りもむしろＨＬであるのが好ましい。本発明二重特異抗体の調製に用いられる技 術は英国特許出願第２，１４４．１４７Ａ号明細書に記載のものと密切に関連し 、これは、本発明の場合に応用してもよいが、もちろんその融合する相手の結合 親和性は異なっている。しかしながら、本発明者は格別の有用性を存する上記方 法の変力を開発した。

二重特異抗体分子の調製に対して記載した先の技術におけるごとく、本発明方法 では二種のハイブリドーマの融合を含むが、本発明の場合は、それらのうちの一 つがＴ−細胞に対し方向づけられた抗体を製造し、他の一つがターゲット細胞に 方向づけもれた抗体を製造する。二種のハイブリドーマを実施例に示すごとく、 通常の方法によって融合させ、各ハイブリドーマに由来の各特異性を有する／％ イブリドーマ分泌二重抗体分子を製造してもよい。しかながら、全てのハイブリ ドーマ製造融合工程の最も困難な工程の一つは最も好ましい型の二重特異ハイブ リドーマを溶融混合物から選択することであり、本発明者の開発した方法は特に この目的を意図した点に特徴がある。

本発明方法では用いられる第一の／＼イブリドーマは便宜上チミジンキナーゼ（ ＴＫ）まＩ；は特にヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェ ラーゼ（ＨＲＲＴ）等の酵素欠損であってよい薬品選択可能なマーカーを有する 。この様なハイブリドーマは５−プロモウラシル・デオキシリポース、２−アミ ノプリン（ＴＫに対して）、８−アザグアニンまｔ二は特に６−チオグアニン（ ＨＰ　ＲＴに対して）を含む培地から細胞を選択することによって得られる。適 当な薬剤を含む培地上で生育すべく選択された細胞は懸案の酵素を欠き、ＴＫと ＨＰＲＴの場合は、従ってヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（Ｈ ＡＴ）を含む培地で生育することは不可能である。何故ならアミノプテリンはプ リンとピリミジン合成経路を遮断し、ＨＰＲＴまたはＴＫの欠除はヒポキサンチ ンを利用してプリン類を製造し、チミジンを利用してピリミジン類を製造する正 常細胞の有する能力を取除くからである。

本発明方法に用いる第二のハイブリドーマは致死量の不可逆的生物化学的インヒ ビター、例えばジエチルピロカーボネートおよび特にヨードアセトアミドで被毒 させる。この様なインヒビターは細胞を殺すが、イムノグロブリン・表出（ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ）コードおよびＨＰＲＴ酵素用コードであるＤＮＡには損傷を 与えない。これらの細胞処置に続いて、細胞を洗浄して過剰のインヒビターを除 去し、続いて使用に供する。処置後数時間細胞の構造全体を損なわないよう維持 し、典型的には０．５〜１時間内に融合を行なう。

二種類のハイブリドーマの融合は、両者からＤＮＡを有する融合細胞系を産生じ 、その際、短時間で失なわれる被毒細胞からの酵素機能はもう一方のハイブリド ーマから誘導される酸素によって補償されるであろう。この２種のハイブリドー マの融合に続いて、この融合混合物を、インヒビターを含まない培地で培養する と被毒未融合ハイブリドーマの細胞は徐々に死滅し、他の未融合ハイブリドーマ の細胞と融合細胞とは生き残るであろう。次いで、選択を、例えばＨＡＴ−含有 培地を用いて開始する。その際、ＴＫまたはＨＰＲＴ欠乏未融合ハイブリドーマ の細胞は死滅するが融合細胞は酸素欠乏が他のハイブリドーマからのＤＮＡによ って補なわれるので生き残るであろう。ヨードアセトアミドは１〜２４時間以内 に細胞の死滅を引きおこすものと思われるが、もし選択を２．３日遅らせると通 常より高いハイブリッド化が達成されることがわかった。その理由は多分、被毒 細胞から誘導されるＨＰＲＴの表出を十分に生じさせるには、多少の時間を必要 とするためと思われる。さらに最善の結果は未処理細胞対ヨードアセトアミド処 理細胞の比率を等しいかより高くする、例えばｌ：ｌからｌＯ：１にすることに より得られた。

両タイプの未融合ハイブリッド細胞を除去した細胞混合物はそれから更に通常の 方法でハイブリドーマが分泌する前述の二重特異性を有するモノクローナル抗体 を単離する。この様なハイブリドーマはモノクローナル抗体を供給するために常 法によりインビトロまたはインビボいずれかで培養してもよい。

本発明の二重特異抗体によるＴ−細胞の破壊が緩和されもしくは望ましくは実質 上なくなる原因は、本発明二重特異抗体分子中の重鎮の適当な組合せによりこの 問題が克服されるためと理解される。

イムノグロブリンの全体構造は個々の鎖の様々な球状領域の相互作用によりきま る。これらの相互作用は分子内および分子間のジスルフィド架橋を含む共有結合 および蛋白質と炭水化物基両方を含む非共有結合相互作用からなる。破壊メカニ ズムを活性化するためには、補体成分とＦｃリセプターとは異なった抗体中に存 在する組織と結合しなければならないが、抗体の異なった種、インタイブおよび アロタイプは蛋白質配列の一部において多くの類似性を有してもよいが、一部に おいてはその配列に相違を有している。即ち、異なったイムノグロブリンは異な った補体成分およびＦｃリセプターと相互に作用し、加えてハイブリッド抗体分 子が製造されるとき、２種の重鎮はそれらの相互作用のための重要位置における 配列において異なっていてもよく、まＩ；、それが異なった組合せ生成物の性質 に影響を与えることもあろう。

抗体を構成するイムノグロブリンは数クラスに分けてもよい。それらの主要なも のはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして同定されており、特に ＩｇＡとＩｇＧはさらにサブクラスに分けることができる。本発明二重特異抗体 は好ましくは同じクラスの２種の重鎮を含むが、同じクラス内の異なったサブク ラスであっても、あるいは異なった種に関する同一または異なったサブクラスで あってもよい。ヒト、ラットおよびマウスが最も重要であるが、他の種、例えば うさぎのイムノグロブリンを用いてもよい。ラットとマウスおよびラットとラッ トのイムノグロブリンの組合せは相当するハイブリドーマの安定性がより高いと 云う点でマウスとマウスの組合せより好ましい。Ｆｃリセプター仲介破壊メカニ ズム、特にＡＤＣＣに関して、Ｔ−細胞結合親和性を提供する重鎮の性質は最も 重要であるが、ターゲットセル結合親和性を提供する重鎮の性質もまた重要であ る。即ち第一の種のイムノグロブリンのある種のサブクラスは第二の種の細胞仲 介イフエクター・メカニズムおよび同一種およびサブクラスの２個の重鎖がイム ノグロブリン中に存在するときは相互に作用するであろうこれらのサブクラスと は相互作用しないであろう。他の種またはサブクラスからの適当な選択によって ２個の重鎮の一つを置き換えることによりこの相互作用に影響を与えることは可 能である。補体活性化メカニズムに関しては、Ｔ−細胞結合活性を提供する重鎮 の性質は発生する補体活性のレベルの測定においてＡＤＣＣに関するよりもより 優性であってもよい。しかしながらターゲット細胞結合親和性を提供する重鎮の 性質はなお後述のごとき重要な作用を及ぼす。

本発明二重特異抗体分子に用いるだめの重鎮の適当な組合せを選択する上で、２ 個の重鎮が関連する種および抗体が投与される種が非常に重要である。即ち、マ ウスまたはラット中のＴ−細胞の破壊を生じない特別の重鎖種／サブクラスの組 合せは、例えばヒトの場合と同様に行なってもよく、これは二重特異抗体のＴ− 細胞結合親和性に関して選択された種である。前述したごとくヒトの重鎮は便宜 上、本発明の二重特異抗体分子中の重鎮の少なくとも１個に用いてもよい。同一 クラスであるが異なったサブクラスの２個の重鎮を選択して用いるのが好ましい 。しかしながらヒトの骨髄腫がマウスやラットの骨髄腫に比較して利用可能性を 欠き、問題を引きおこす可能性があり、従って実際上、これらの種はしばしば重 鎮のために選択された哺乳類の種を代表してもよい。

ヒトの場合はｒｇｃ、クラスはサブクラスＩｇＧ１，７ｇＧ２．１ｇＧ３および １ｇＧ４に分けられる（ＩｇＡはサブクラスＩｇＡＩおよび１ｇＡ２に分けられ る）。マウスとラットの場合はＩｇＧクラスのみがサブクラス、即ちマウスの場 合はＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびラットの場合はＩｇＧ１、ＩｇＧ ２ａ１　ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ２ａに分けられる（同様に命名されｔ；サブ クラスはマウスの場合とラットの場合とで類似した性質を有する必要はない）。

実際には各重鎮はマウスまｔこはラットのＩｇＡまｔ二はＩｇＥ、さらにＩｇＭ および特にＩｇＧが最も適当であり、ＩｇＧのサブクラスおよび特にマウスＩｇ Ｇ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂが最も一般的であり、１ｇＧ３またはラット ＩｇＧ］、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂはそれより一般的でなく、さらにＩｇ Ｇ２ａはそれより一般的でない。

Ｔ−細胞結合活性を有する重鎮を選択する際、最も簡単なコースは例えばラット またはマウスのクラスまたはサブクラスを使用することであり、これはＦｃリセ ブター仲介メカニズムを介して懸案種のＴ−細胞破壊をもたらさない。（語「イ ソタイプ」はこの分野では、ラット中の例えばＩｇＭ、ＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ２ａがそれぞれ別のイソタイプを構成するように特定 のクラスおよび／またはサブクラスを指定するために用いられる）。ヒトＴ−細 胞のＡＤＣＣ破壊を避けるために便利な選択は１ｇＭクラスの重鎮の選択である が、この様な重鎮はしばしば補体活性化を介する破壊を起させるときに重要であ る。従って活性および一般的な利用可能性の点でＩｇＧサブクラスの重鎮は通常 の選択であって、補体活性化を介して破壊を避けるための優先順位はマウスでは ＩｇＧ１＞１ｇＧ３＞ＩｇＧ２ａ−ＩｇＧ２ｂであり、ラットではＩｇＧ１＞Ｉ ｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ｂである。他のＦｃリセプター仲介破壊メカニ ズム、特にに−細胞を含むＡＤＣＣを介しての破壊の回避に関しては、好ましい 順序はマウスではＩｇＧ２ｂ％　１ｇＧ３およびＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ａおよびラ ットではＩｇＧ１および特にＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ｂである。

しかしながら前述したごとくこの様なメカニズムの場合には、Ｔ−細胞結合活性 の重鎖が破壊を促進するであろうマウスＩｇＧ２ａまたはラットＩｇＧ２ｂのご ときものであるとしても、ターゲット細胞結合活性を有する適当な形態の重鎮、 特に異なった種または異なったイソタイプまたはアロタイプのものを選択するこ とにより、破壊を避けることが可能である。他のラット１呂Ｇサブクラスのうち 、ラットＩｇＧ２ｂ重鎖を不活性化するための優位性はラットＩｇＧ２ａまたは 特にラットＩｇＧ２０重鎮である。

ラットＩｇＧ２ｂまｊ；はマウスＩｇＧ２ａのごとき活性な重鎮に関しては、ラ ットＩｇＧ２ｂ／ラットＩｇＧ２ｂまたはマウスＩｇＧ２ａ／マウスＩｇＧ２ａ とが一般にＡＤＣＣメカニズムおよび多分補体活性化メカニズムを通しての破壊 を促進するのに有効であると想定されるので、種（例えばラットＩｇＧ２ｂ／マ ウスＩ　ｇＧ　ｌ　）またはサブクラスのいずれかによる、これに代る形態の重 鎮と組合わせが示される。

抗Ｔ−細胞重鎮が破壊を生じさせる上で非実質レベルの効果しか示さず（即ち実 質上効果がなく）、ある種のマウスＩｇＧイソタイプ等におけるごとく、これら の２つのメカニズムのうち一つのみを介して低レベルで作用するとき、異なった アロタイプまたは特に異なった種またはイソタイプの重鎮の使用もまた有用であ る。この様なタイプの同様の組合せを用いてもよいが、異なった種類の種または イソタイプの使用は非実質的レベルの作用さえ緩やかにし、重鎮組合せに対し適 性のあることを明示する。一般にヒトＴ−細胞の破壊の緩和の達成度はターゲッ ト細胞に対する親和性を有する重鎮がヒトＴ−細胞に対する親和性を有するもの と同じ（種、インタイブおよび便宜的にはアロタイプ）である、この様な二重特 異抗体分子と比較することによって評価してもよい。

即ち、本発明はまた破壊を活性化することのできるヒトＴ−細胞リセプターに対 する第一の結合親和性とターゲット細胞、例えば人体に存在するターゲット細胞 に対する第二の結合親和性を含み、分子中の２種の重鎮が異なった種、イソタイ プまたはアロタイプから選択され、該分子によるヒトＴ−細胞の破壊を緩和する ことに特徴を有する。

前述した他、簡単な試験方法を用いて、本発明二重特異抗体分子に用いるための 重鎮の適当な組合せを決定してもよい。即ち、もしそれ自体Ｔ−細胞の破壊を引 きおこすことのできるＴ−細胞に対する特定のモノクローナル抗体の重鎖／軽鎖 組合せを二重特異抗体分子に用いることが提案されるなら、このモノクローナル 抗体を製造するハイプリドーマは全ての不適当な結合親和性を有するモノクロー ナル抗体の特定のイムノグロブリンタイプを製造するハイブリドーマと融合して もよい。得られＩ；二重特異抗体は次いで第１の重鎖／軽鎖が組合わされたＴ− 細胞破壊能が、問題のイムノグロブリンタイプの重鎖／軽鎖組合せと組合わせる ことにより無視し得るか否かを確認するＩ；めの試験に供してもよい。即ち、例 えばＴ−細胞に対するラットＩｇＧ２ｂ抗体を製造するハイブリドーマを不適当 なラット１ｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｃ抗体を製造するハイブリドーマと融合する ことによって、ＡＤＣＣメカニズムにより、および補体活性化メカニズムを介し て破壊を引き起すＩｇＧ２ｂ重鎖の能力が維持されるか否かを試験することがで きる。別の方法はクローン化イムノグロブリン・ゲンをハイブリドーマ中にトラ ンスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）し、クローン化ゲンをハイブリッド細胞中 に生産し、製造されたイムノグロブリン分子（これはＡＤＣＣ８よび補体ルート の両方によってＴ−細胞破壊における活性に対しアッセイされ得る）と混合され る。

この様な方法は特定の価値を有する重鎮の組合せを同定すると云う利点でもって 用いてもよいが、一般には全ての種の相違またはインタイブの相違（即ち、クラ スまたはサブクラスいずれか）が二重特異分子によるＴ−細胞の破壊を緩和する に十分であり、かつアロタイプの多くの相違はまたこの結果を達成するであろう ことを理解すべきである。重鎮の組合せの選択に関する基準を以下に記載する。

Ｔ−細胞の破壊に導かない重鎮の適当な組合せが二重特異抗体に存在している場 合であっても、その抗体の調製に利用し得る方法によっては、特にハイブリドー マ技術を用いるとき、抗体の複合混合物が得られ、そのある種のものは、二重特 異抗体はそうでないとしても、Ｔ−細胞毒性を示す場合がある。骨髄腫誘導軽鎖 を生産しない２種のハイブリドーマから二重特異抗体分子を製造する際得られる 混合物中に存在するであろう種々のタイプの異なった抗体を、明細書の末尾に示 す第１図において説明する。理論的には、２種類の異なった軽鎖と２種類の異な った重鎮の可能な組合せが生じ得るしく図中、Ｔ−細胞結合活性を有するものは 黒で、ターゲット細胞結合活性を有するものは白で示す）、実際には各タイプの ある種抗体が必らずしも等しい比率ではないが得られるものと考えられる。Ｔ− 細胞結合親和性を有する二重特異性抗体分子重鎮がＦｃリセブター介在破壊メカ ニズム、例えばＡＤＣＣまたは補体活性化によってＴ−細胞の破壊を引き起さな い場合においてのみ、どのタイプの抗体もＴ−細胞を破壊することができないで あろう。この重鎮がＦｃリセプター介在破壊メカニズムによってＴ−細胞の破壊 を引き起すであろう場合には、タイプ２と４はターゲット細胞結合重鎮の性質と は関係なく、このルートを介して毒性を示すであろうタイプ１および５のみが、 他の重鎮の活性を否定するような適当なターゲットと細胞結合重鎮の存在によっ て毒性から保護されている。従って二重特異タイブトモノクローナル抗体分子は 、分子の半分をしめる抗ターゲット細胞と抗Ｔ−細胞に対する重鎖の適当な組合 せを選択することにより、Ｔ−細胞の破壊を起さないが、タイプ２とタイプ４は 、それらが含む重鎮が本質的にＦｃリセプターの介在する破壊を引き起すことが できないものでない限りＴ−細胞を破壊する望ましくない性質を有するであろう 。しかしながらそれらのターゲット細胞結合重鎮がＦｃリセプター介在破壊メカ ニズムを引き起すタイプの場合にはタイプ３および７の抗体分子（タイプ６は通 常抗Ｔ−細胞重鎮によって不活性化されている）は別のモードのターゲット細胞 破壊を、タイプ１の二重特異抗体分子のＴ−細胞介在毒性に提供するものと理解 すべきである（タイプ８．９および１０の抗体分子はＴ−細胞とターゲット細胞 結合に関し、軽鎖および重鎮の不適合性の由に不活性である）。従ってタイプ３ と７が、ターゲット細胞の毒性の付加に寄与する好ましいケースにおいては、そ れらは便宜上保持しておいてよい。

従って、本発明の別の特徴について云えば、２個の融合ハイブリドーマまたは２ 個の融合パートナ−から誘導されるハイブリドーマ・システムにより製造される 本発明二重特異抗体分子を含む混合物を分画してその中の二重特異抗体分子の比 率を高め、好ましくはそれから二重特異抗体を実質上分離するか、少なくとも望 ましくない他の種、即ちタイプ１分子の稀釈剤として作用するか、Ｔ−細胞に対 する結合に関し競合する全てのタイプの分子および特にＦｃ介在リすプター・メ カニズムによりＴ−細胞に対し毒性を有する全ての種の比率を減少させるのが好 ましい。但しターゲット細胞に対し毒性である他の種については必ずしもそうす る必要はない。

この様な精製に用いる技術は英国特許出願第２．１４４．１４７Ａ号明細書に記 載の方法に準ずればよい。この方法では精製しようとする生成物はタイプ４の一 種である一価のモノクローナル抗体である。この方法は親和クロマトグラフィー （ａＨｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、イオン交換クロマトグラ フィーおよびクロマトフォ力ッリングの使用、特に高速蛋白液体クロマトグラフ ィー（ＦＰＬＣ−ファルマシア商標）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ ＬＣ）を含む。

親和クロマトグラフィーは特異性に対する重鎮および軽鎖の適正な組合せを有す るこれらの種の分子に対し選択する抗原含有カラム（例えばイムノグロブリン） を用いるか、あるいはこれに代えて抗−イソタイプまたはプロティンＡ・カラム を用いてイソタイプにもとづいて分離することができる。イオン交換クロマトグ ラフィーはｐＨが変ると別の側鎖がイオン化されるので蛋白質上の電荷が変り、 その結果、荷電カラムに対する蛋白質の結合力がイオン強度によって影響を受け ると云う事実にもとづいている。イオン交換クロマトグラフィーの有力な用法は 第１カラム上で第１のｐＨでフラクションを分離し、次いで第２のカラム上で第 ２のｐＨで分離する。その際カラムは通常反対の電荷であり、カチオン交換クロ マトグラフィーの次にはアニオン交換クロマトグラフィー（その逆でもよい）を 用いる。クロマトフォ力ッリング法は特定の選択されたｐＨにおいては蛋白質は ネット電荷を有さす、荷電カラムと結合せず、その結果類似の混合蛋白がそのｐ ｔにもとづいて分離されると云う事実にもとづいている。ＦＰＬＣおよびＨＰＬ Ｃにはしばしば別の利点があり組合わせ用いてもよい。

上述したごとく、Ｔ−細胞毒性を示さない抗ヒトＴ−ｍ胞重鎮の適当な選択によ って、あるいは毒性抗ヒトＴ−細胞重鎮または別の種またはイソタイプの抗ター ゲット細胞重鎮との組合せによって、一般ｊ二本発明の所望の目的を達成し、ヒ トＴ−細胞の破壊を実質上回避する二重特異抗体分子を供給することができる。

上述したごとき精製法の使用によってヒトＴ−細胞に対する毒性である他の成分 を除去することができ、さもなくばこの他の成分は二重特異抗体分子を含む組成 物にＴ−細胞毒性を発現（ｅｘｈｉｂｉｔ）させるであろう。

タイプｌからｌＯの抗体分子の混合物の所望の分画度について、ラットＩｇＧ２ 重鎖の異なった組合せを含む二重特異抗体の場合につき、添付具体例により検討 する。上述したごとく、ラットＩｇＧ２ｂＩＬ鎖はＦｃリセプター介在破壊メカ ニズムによるヒトＴ−細胞の破壊を引き起すのに有効であるが、ＩｇＧ２ａおよ びＩｇＧ２ｃ重鎖は有効でなく、さらに同じ二重特異抗体分子中で組合せたとき 、ｒｇＧ２ｂ重鎖の毒作用を無にするように働くであろう。従ってラットＩｇＧ ２ｂ抗Ｔ−細胞／ラッ）ＩｇＧ２ｂ抗ターゲツタ−ゲット細胞二重特異抗体体ヒ トＴ−細胞に対し毒性であると予想されるが、ラットＩｇＧ２ｂ抗Ｔ−細胞／ラ ットＩｇＧ２ａ（または２ｃ）抗ターゲット細胞二重特異抗体はそれ自体この様 な毒性を示さないと期待される。

しかしながら、後者のタイプの抗体はこの様な毒性を示し、除去することの望ま しいタイプ２と４の抗体との混合物として得られる。

ラットＩｇＧ２ａ（または２ｃ）抗Ｔ−細胞／ラットＩｇＧ２ａ（またはＩｇＧ ２ａ）抗ターゲット細胞二重特異抗体はヒトＴ−細胞それ自体に対して毒性がな く、その様な毒性を示すタイプ２および４抗体の混合物としても得られないので 、分画の利益は二重特異抗体に対する稀釈剤として作用する他の抗体の除去にの み存する。ラットＩｇＧ２ａ（または２ｃ）抗Ｔ−細胞／ラットＩｇＧ２ｂ抗− ターゲット細胞である第４のタイプの二重特異抗体は、二重特異抗体がヒトＴ− 細胞それ自体に対する毒性がなく、タイプ２および４抗体でなく、タイプ３およ び７抗体がＦｃリセプター介在破壊メカニズムを介して付加ターゲット細胞毒性 に寄与しくタイプ６はＩｇＧ２ａ（または２ｃ）抗Ｔ−細胞重鎖に対し活性化さ れないであろう）、および不活性化稀釈抗体を除去するためでない限り、分画を 必要としないと云う点で他のタイプに比べ特別の利点を有する。

人の治療におけるこの様なラットＩｇＧ２（抗Ｔ−細胞／抗ターゲット細胞組合 せ）に対する有用性の順序は：　Ｉ　ｇＧ　２ｂ／　Ｉ　ｇＧ　２ｂ＜　Ｉ　ｇ Ｇ　２ｂ／　Ｉ　ｇＧ　２ａ（まＩ；は２ｃＸＩｇＧ２ａ（または２　ｃ）／　 Ｉ　ｇＧ　２　ａ（または２　ｃ）＜　Ｉ　ｇＧ　２　ａ（または２ｃ）／Ｉｇ Ｇ２ｂである。人の病気の治療に特に有用な他のラットＩｇＧ組合せはＩｇＧ２ ｂ／ＩｇＧｌ（これは二重特異抗体としてのＴ−細胞に対し毒性でないが、毒性 のあるタイプ２および４分子を提供する）、および特にＩｇＧＩ／ＩｇＧ２ｂ（ これはタイプＬ　２．４および５と同様Ｔ−細胞に対し毒性でないが、ターゲッ ト細胞の毒性に寄与するタイプ３と７の分子を与える）である。これらに代えて ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ａの４種のあり得る異なった組合せを用い てもよく、これらの全ては上述のＩｇＧ２ａ（まＩ；は２ｃ）／　Ｔ　ｇＧ　２ ａ（または２ｃ）の組合せに類似した挙動をとるであろう。マウスに関しては類 似するイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ ｂ／ＩｇＧ２ｂの組合せは、可能な非類似のイソタイプの組合せＩｇＧ１％　Ｉ ｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂ（これらは最も好ましい）よりも一般に好ましくな い（特にＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ　２ａは上記のラットＩｇＧ２ｂ／ラットＩｇＧ２ ｂに関して述べたと同様の理由で好ましくない。これらの非類似のイソタイプの 組合せのあるものはもちろんラットの場合に述べたと同様の理由で他のものより より重要であり、例えば抗Ｔ−細胞結合がマウスＩｇＧ２ａによって提供される 組合せは毒性タイプ２８よび４の分子を与えると考えられ、抗ターゲット細胞結 合がマウスＩｇＧ２ａによって提供されるものでは毒性タイプ３および７分子を 有利に提供すると考えられる。ラットＩｇＧ／マウスＩｇＧとマウスＩｇＧ／ラ ットＩｇＧの全ての組合せもまた重要である。

前述したごとく二重特異抗体は一般に全分子の結合親和性を保持するフラグメン ト、特にＦ（ａｂ’）、フラグメントの形で使用してもよい。抗体分子のＦ　（ ａｂ’　）２部分の使用はある種の利点を有するが、同時に、小形であるので血 清中での半生存期間（ｈａｌｆ　１ｉｆｅ）が短く、特にタイプ３および７の抗 体分子はＦ（ａｂ’）２型では上述のＦｃ介在毒性に寄与しないと云った不利益 を有する。

抗体分子のＦ　（ａｂ″）２部分の調製は重鎮中の適当な位置で開裂させて、そ れにより重鎮のＦｃ領域を（または少なくともそれに代えて抗Ｔ−細胞重鎮のそ れを）除去し、一方でジスルフィド架橋を介して他の重鎮および軽鎖とそれぞれ 結合する２個の重鎮の保持部分を維持するため適当な酵素系の使用が必要である 。異なった種およびイソタイプはそのイムノグロブリンの開裂領域において異な ったアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列に対して特異的な酵素を用いること が必要である。さらに２種の重鎮が種またはイソタイプにおいて異なる場合には 、必ずしも全てではないが一個の鎖中のシスチン基は他の鎖のシスチン基との架 橋によって連結し、ある種モードの開裂にあってはＦ　（ａｂ’　）ｚフラグメ ントよりむしろＦａｂを生ずる可能性のあることを考慮しなければならない。従 って全抗体の２つの特異性を保持するＦ（ａｈ’）２フラグメント（または１個 のＦｃ領域のみを欠いた他の７ラグメント、特にＴ−細胞結合重鎮のそれ）を生 産するＩ；めに、問題の二重特異抗体系に適した使用のだめの酵素、例えばペプ シン、パパイン、ｖ８プロテアーゼ等、およびＩ）Ｈ％温度および時間等の条件 を選定する必要がある。上述の特性を有する生成物の製造によって同定しながら 適当な酸素と条件を選定した結果、本発明二重特異抗体のＦ　（ａｂ’　）２７ ラグメントの製法はモノ特異抗体のＦ（ａｂ’）、フラグメントの製造に関する 文献に記載されｔ；ものと広く類似している。

従って、本発明は（ａ）破壊を活性化し得るヒトＴ−細胞リセプターに対する第 １の結合親和性、およびターゲット細胞に対する第２の結合親和性を有し、かつ 分子中の２個の重鎮が該分子によるヒトＴ−細胞の破壊を緩和するように選択さ れていることを特徴とする抗体分子のＦ（ａｂ’）２フラグメント、および（ｂ ）該抗体分子を適当な酸素系で処理して開裂させ７ラグメントを得ることを特徴 とする上記７ラグメントの製造法を含む。

前述のごときタイプ１−１０の異なった抗体分子の分画は稀釈剤および／または Ｔ−細胞に結合する競合成分として作用する他の種を除去するためにＦ　（ａｂ ’　）、フラグメントを用いるところではなお有用である。分画はＦ　（ａｂ’ 　）、フラグメントの形成前または好ましくは後、いずれで行なってもよい。

従って、本発明はさらに（ａ）破壊を活性化し得るヒトＴ−細胞リセプターに対 する第１の結合親和性およびターゲット細胞Ｉこ対する第２の結合親和性を有し 、かつ分子中の２個の重鎮が、該分子または全分子の結合親和性を有するそのフ ラグメントによってヒトＴ−細胞の破壊を緩和するよう選択されている、手術、 治療または診断に使用するための抗体分子、および（ｂ）破壊を活性化し得るヒ トＴ−細胞リセプターに対する第１の結合親和性およびターゲット細胞に対する 第２の結合親和性を有し、分子中の２個の重鎮が該分子または全分子の結合親和 性を有するそのフラグメントによってヒトＴ−細胞の破壊を緩和するよう選択さ れている、腫瘍または他の病気の治療用医薬の製造用抗体分子の用法を含む。

本明細書記載の二重特異抗体分子とその７ラグメントは使用のため種々の方法で 調剤し得るが、通常殺菌され、好ましくは用途によってピロゲンを含まない生理 学的に許容し得る稀釈剤またはキャリアーが用いられる。これは種々の形態、例 えばリン酸塩緩衝生理食塩水、生理食塩水、平衡塩溶液およびデキストローズ溶 液をとり得る。

しかしながらりん酸塩緩衝生理食塩水が特に好ましい場合が多い。

この組成物は、所望ならば単位投与形態、即ち単位投与量を含む分離形態または マルチプルもしくはザブ・ユニット・ドーズの状態で供給してもよい。

二重特異抗体分子または７ラグメントは種々の方法で投与できる。

例えば静脈内に、腹膜内にあるいは多分脳内に投与してよく、投与方法は腫瘍ま たは他のターゲット細胞の位置や種類、臨床医にとっての投与し易さおよび患者 の安全性等に適するよう選択される。しかしながら一般に非経口投与、特に静脈 注射がしばしば採用されるであろう。二重特異抗体分子またはそのフラグメント の投与量については正確な投与量は試剤の効能、腫瘍または他の病気の重さおよ び患者の体重／表面積比によるであろう。しかしながら、抗体分子またはフラグ メントｌ〜２５Ｉ１１９の投与がしばしば適当であり、例えば各はｙ同量を１日 当り１回投与して７〜ｌＯ日間用いるのが適当である（即ち、ｌＯ日日間治療で の患者に対する抗体またはフラグメントの総投与量は１０〜２５０ｍｇである） 。しかしながら、適当な上記範囲外の投与量を用いてもよく、本発明の利点は多 くの場合に用いてもよい低い投与量、即ち、前記範囲の低限からなおそれ以下で さえ用い得ることであり、それによって二重特異抗体分子に対する免疫反応の発 生を避けることさえあり得、従って繰返し使用を可能にすることが理解されるで あろう。

本発明は、破壊を活性化し得るヒトＴ−細胞リセプターに対する第１の結合親和 性とターゲット細胞に対する第２の結合親和性を有し、分子中の２個の重鎮が該 分子によるヒトＴ−細胞の破壊を緩和するよう選択されている抗体分子、または その完全な分子の結合親和性を有する該分子のフラグメントを腫瘍まｔ；は他の 病気の治療に使用する方法を含む。特に治療の必要な患者に、病気の軽減または 緩和を達成する上で治療上有効な量の、ヒトＴ−細胞に対する第１の結合親和性 と腫瘍または他のターゲット細胞に対する第２の結合親和性を有し、かつ分子中 の２つの重鎮が該分子によるヒトＴ−細胞の破壊を緩和するように選択されてい る抗体分子または該分子全体の結合親和性を有するそれらの７ラグメントを投与 する、腫瘍または他の病気の軽減および緩和を助ける方法を含む。しかしながら これに代えて二重特異抗体をイン・ビトロで骨髄から腫瘍細胞除去に用い、それ によって自速性骨髄移植を悪性腫の治療に用いてもよい。

本発明を以下実施例を用いて説明する。

実施例１ ロウ・ラット・ミエローマ・セルラインＹ３−Ａｇ１．２．３（ＣＮＣＭ、！− ０７８）は、クラーク（Ｃ１ａｒｋ）とワルドマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）、メソ ッズ・イン・ヘマトロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、 １９８６、上３，１〜２０に記載された手順に従いヒトリンパ球で免疫されたＤ Ａクラットらの肺臓細胞と融合されており、その融合混合物は、すべてのヒト抹 消Ｔ−細胞との反応によるヒトＣＤ３抗原、ＵＣＨＴ−１（バーンセット（Ｂｕ ｒｎｓｅｔ）ら、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ 　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、　ｌ　９８２　、上２９．１４５１）や０ＫＴ− ３（アメリカ合衆国特許第４３６１５４９号）等のマウスモノクローナル抗体と の異種交配禁止および免疫析出に対する特異性を有するモノクローナル抗体製造 ハイブリドーマを選択して上記文献に記載されているように作り上げる。係る特 異性を有する抗体を製造する選択されたハイブリドーマは、ヒポキサチン−グア ニン　ホスホリボシル　トランス７エラーゼプラス（ＨＰＲＴ”）であり、１つ の肺臓細胞−誘導短鎖およびカッパー（ｋａｐｐａ）　１　ａアロタイプの第２ のミエローマ−誘導短鎖を表現する。

半固体寒天培養地上ａｔ胞クローニング（クラークとワルドマン、同書）し、そ して鋭敏な赤血球凝集反応分析を使用し、ラットカッ７＜−ＩＢ−アロタイプ表 現の損失分析（クラーク、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ＋、ｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　１９８６　、上ｌ上、５４８〜５５６） することにより、ミエローマ短鎖損失変体を選択する。選択された変体は、半固 体寒天培養地上でクロンを発生させ、１〜５％ｖ／ｖ胎児子牛血清（Ｆｅ２）を 追加し、そして、空気中５％ｃｏ、を使用し重炭酸塩で緩衝したドウルベツコの 媒体のイスコベス変性（Ｉ　５ｃｏｖｅｓ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｊｏｎ　ｏｆ　 Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉ　ＭＤＭ−ギブコヨーロツパ（Ｇ ｉｂｃｏ　Ｅｕｒｏｐｅ））培養物中で維持した。細胞を短期間で捕り扱うのな ら、重炭酸塩を過剰のＨＥＰＥＳ緩衝剤とＮａＣＱに代えてイオン強度を維持し てもよい。

（２）抗−”ｒｈｙ−１成分 コポルド（Ｃｏｂｂｏｌｄ）ら、モレキュラー・バイオロジー・アンド・メデイ シン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、 　１９８３　＋１．２８５〜３０４に記載の手順に従ってマウス”ｒｈｙ−１抗 原で免疫されたＤＡクラット肺臓細胞でロウ・ラット・ミエローマ・セルライン Ｙ３−Ａｇ１．２２−３ＣＣＮＣ，１−０７８）を融合し、該抗原への結合に基 づく分析を使用し上記文献に記載されているようにＴｈｙ−ｉ抗原特異性を有す るモノクローナル抗体製造ハイブリドーマを選択する。マウスＴｈｙ−１抗原特 異性を有するモノクローナル抗体を製造する選択されたハイブリドーマは、さら に、選択ドラッグ６−チオグアニンを含む媒体濃度を増加させて培養物を変化さ せて、ＨＰＲＴマイナスであるハイブリドーマの変体を選択する（クラークとワ ルドマン、同書）。該選択されたＨＰＲＴ−変体は、ハイブリドーマ（１）本と してクローンを発生し培養される。

＊該手順の第１の変体においては、ハイブリドーマ（１）は、６−チオ−グアニ ン抵抗性であり、ハイブリドーマ（２）は、ステップ（３）においてアイオドア セトアミドでだめになる（実施例５をみよ）、第２番目の変体においては、最初 すなわち第１の変体手順における６−チオグアニンの代わりに８−アザグアニン を使用し、そして、第３の変体、ハイブリドーマ（２）は、ハイブリドーマ（１ ）と同様の、またはその代わりのミエローマ短鎖損失変体であり、まｌニ一方ま たは両者のハイブリドーマは、短鎖を表現しないミエローマ−から誘導される。

（３）ハイブリドーマ−ハイブリドーマ融合融合前にＨＰＲＴ”ハイブリドーマ （ｌＸ５Ｘｌｏ’）の細胞を２００×ｇで遠心分離してリン酸塩緩衝塩水（ＰＢ Ｓ）中に入れ洗浄し、５ｍＭアイオドアセトアミドを含有する１０ｍ１２ＰＢＳ 中に再懸濁する。細胞を３０分間氷上で培養し、モしてＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭＤＭ 中で洗浄する。このアイオドアセトアミド−汚染（ｐｏ　１ｓｏｎｅｄ）細胞を ハイブリドーマ（２Ｘ５Ｘ１０’）細胞と混合し、その細胞混合物を一度ＨＥＰ ＥＳ緩衝ＩＭＤＭで洗浄し、その混合細胞を２００Ｘｇ−ル１５００の５０％ｖ ／ｖＰＢＳ溶液１ｍＱで２分間細胞ベレットを処理することにより誘導される（ クラーク、ワルドマン、同書）。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１−Ｄ洗浄し、 胎児子牛血清５％ｖ／ｖを含む重炭酸塩緩衝ＩＭＤＭ中再懸濁し、次に４３Ｘ２ ｍ（ｌ培養ウェル（ｗｅｌｌ）にプレートし、５％Ｃ０２下３７℃で培養する。

次の日、アイオドアセトアミド処理されているが融合していない細胞を含む対照 物は、一般的には総じて育ち得ないが、融合細胞の培養物中では大部分が育ちう ろことが観察される。

４８時間培養後、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ選択 媒体、クラークとワルドマン、同書）で選択を開始し、ＨＰＲＴ−ハイブリドー マ（２）細胞は該媒体中では、育ち得ない。

ＨＡＴ選択媒体中の培養物をさらに２週間以上培養し、次の分析を行ない二重特 異抗体を製造するハイブリトッドセルラインをスクリーンする。まず、一連のラ ット免疫グロブリン鎖特異性マウスモノクローナル抗体をラピッド赤血球結合凝 集反応においてアイソタイプ試薬として使用する（クラーク、同書）。係る抗体 の例としてはＭＡＲ１８，５（ラニエル（Ｌａｎｉｅｒ）ら、ハイブリドーマ（ Ｈｙｂｒ　ｉｄｏｍａ）、１９８２．１．１２５−１３１）（それはすべてのラ ット・カッパー短鎖特異性であるＬ　ＲＧＩＩ／１５．５（スプリンガー（Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ）ら、ハイブリドーマ、１９８２、上、２５７〜２７３）　（それ はラット・カッパー１ｂア四タイプ短鎖特異性である）、Ｎ０ＲＩＧ１．１．６ およびＮＯＲＩ’ｃ、７．１６．２（ハーレ（Ｈａｔｅ）ら、ジャーナル・オブ ・イミュノロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ　＋＋＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、 　１９８５　ｒ１３４．３０５６）（それはラッ）ＩｇＧ２ｂアイソタイプ特異 性である）およびＮＯＲＩＧ３１．１２．１４（ハーレら、同書）（それはラッ ト１ｇＧ２ｃアイソタイプ特異性である）が挙げられる。同一の試薬が以下に示 したようにサンドインチ（Ｓ　ａｎｄｗｉｃｈ）酵素−結合免疫分析においても 使用される。適切な抗−アイソタイプモノクローナル抗体を使用して、４℃で一 晩１つのウェル当り１００μＱで血清フリー培養物浮遊溶液を培養してプラスチ ック性マイクロチトレージョンプレートをコートする。未結合抗体をＰＢＳで洗 い出し、ウェルをブロッキング緩衝液（ＰＢＳプラス１％ｗ／ｖウシ血清アルブ ミンおよび０．１％Ｖ／Ｖナトリウムアジド）で満たし、コートプレートは必要 になるまで４℃で保存する。１００μＱの鬼理されるべき浮遊溶液を室温で１時 間ウェル中で培養し、未結合抗体を０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン含有ＰＢ Ｓで洗い出す。次に、結合抗体は、ビオチニルサクシンイミドエステルでラベル された第２の抗−アイソタイプモノクローナルを使用し、続いてストレプトアビ ジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）−ペルオキシダーゼ（アマ−ジャム（Ａ　 ｍｅｒｓｈａｍ））の層、そして最後に酵素基質オルト−フェニレンジアミンの 層を使用して検出し、反応の色変化が４９２ｎｍの所に決定される。再分析手順 においてプラスであるウェルからの細胞を、半固体培養地中で２倍クローン発生 させ、適当なりローンを選択し、これを七ノー特異性ハイブリドーマ（１）＊に 関する限り培養物中で維持する。

＊該手順の変体においては、抗−Ｔｈｙ−１ハイブリドーマ（２）がヒト体に存 在するターゲット細胞特に腫瘍細胞特異性ハイブリドーマにより代えられている 。さらなる変体、それには従来のように第１のもので結合されていてもよくハイ ブリドーマ（１）および／まＩ；はハイブリドーマ（２）をヒトミエローマ、例 えば、ヨーロッパ特許出願第００６２４０９および第０１４８６４４、イギリス 特許第２０８６９３７、およびアメリカ特許第４５２９６９４に記載されている ようなミエローマから誘導されるハイブリドーマに代えてもよい。

実施例２ 二重特異ハイブリドーマからモノクローナル抗体の製造と分別実施例１で製造さ れた二重特異ハイブリドーマは、空気中５％ＣＯ３を使用し３７℃４８時間低血 清培養物（１％ｖ／ｖＦＣ５含有ＩＭＤＭ）中維持され、その培養浮遊溶液はア ンモニウムスルフェートを５０％ｖ／ｖの濃度まで添加して析出させて濃縮され る。該析出物を最小量の水に再溶解し、セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ） 　Ｇ　２５によって、ｐＨ５，５で５０ｍＭマロネート緩衝液に入れ脱塩する。

該析出物は０．２ミクロンフィルターでろ過し、モノ・ニス（Ｍｏｎｏ　Ｓ）カ ラム（ファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）によってＦＰＬＣ（ファーマシア ）イオン交換クロマトグラフィーを施す。結合タンパクを直線塩勾配がＯないし ＩＭの塩化ナトリウムで溶出し、抗体含有ピークは、実施例１で記載したような 免疫グロブリンアイソタイプ特異性分析を使用して決定され、漏出および結合／ 溶出物質の貯留画分をそれぞれセファデックスＧ２５を通してゲルろ過でＰＢＳ 中に入れ脱塩し、必要となるまで４℃で貯蔵する。

実施例３ ラットＩｇＧ２ｂ抗−ヒトＣＤ３／ラットＩｇＧ２ｃ抗−マウスＴｈｙ−に２重 特異ハイブリドーマ５ＨＮ２０．１２の調製ハイブリドーマＹＴＨ１２，５，１ ４（これはコポルドとワルドマン、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８４，３ ０８．４６０−４６２に記載されているシスタークローンＹＴＨ１２，５，２２ と同じである）をハイブリドーマ（１）として、そしてハイブリドーマＹＢＭ２ ９．２゜１（コポルドら、同ｉ１）をハイブリドーマ（２）として使用し、実施 例１（３）の手順を行なった。ＹＴＨｌ　２．５．１４はラットＩｇＧ２ｂモノ クローナル抗体を製造し、ｌａアロタイプのミエローマ誘導カッパー短鎖を表現 する。ＹＴＨＩ　２．５．ｌ　４．ＹＴＨｌ２．５．１４．２のミエロニマ鎖損 失変体はすべての試験された抗−ラットカッパー試薬と反応性のない短鎖を分泌 し、それ故ラムダクラスの短鎖を表現すると考えてもよいかもしれない。ＹＢＭ ２９．２．１はＹＢＭ２９．２のミエローマ鎖損失変体であるＨＬハイブリドー マである。

それは、ラットＩｇＧ２ｃモノクローナル抗体を製造し、カッパーｌｂアロタイ プ短鎖を表現する。６−チオグアニン抵抗性変体はＹＢＭ２９．２．１ＴＧ６で あった。融合混合物を実施例１に記載したように適当なアイソタイピング試薬を 使用してスクリーンした。全部で４８のウェルのうち１つだけ生長が認められた 。このウェルは２つの親ハイブリドーマの融合から予期されるように、免疫グロ ブリン鎖を有し、抗原特異性をも有する抗体を含存し、さらｌこ、ＹＢＭ２９． ２．］−］誘導カッパー短とＩｇＧ２ｃ長鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）をＹＴ Ｈｌ２．５．１４−誘導１ｇＧ２ｂとの混合抗体分子に結合しているようなもの であるということを示すことが可能であった。培養物を半固体寒天培養地上でク ローン発生させ、すべての成長クローン（１２／１２）は、再分析時プラスであ り、鎖損失変体は全く検出されなかった。クローン５ＨＮ２０．ｌ　２を使用の ため選択した。

実施例４ ＳＨＮ２０．１２モノクローナル抗体の調製と分別実施例３のハイブリドーマ５ ＨＮ２０．１２からの低血清培養浮遊溶液を実施例２に記載されているように製 造し、次に実施例２に記載されている条件下にＦＰＬＣイオン交換クロマトグラ フィーした。この条件は親杭体タイプを分離する条件である。直線塩勾配Ｏない し１Ｍ塩化ナトリウムのファルマシア・モノ・ニス（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉａＭ ｏｎｏＳ）カラムを使用し、５０ｍＭマロレート緩衝溶液中ｐＨ５，５では、Ｙ ＴＨｌ　２．５．１４．２抗体は強く結合しているが、他の親杭体、ＹＢＭ２９ ．２．１は漏出留分中に生じることがわかった。二重特異性抗体調製５ＨＮ２０ ．１２を係る条件下にクロマトグラフィーにかけたところ、ハイブリドーマによ って製造された抗体混合物は、ウェル溶解新規ピークを全く生じなかった。その 代わりに、同調製物は、ＹＴＨｌ　２．５．１４．２の抽出位に対応するブロー ドなピークを示した。漏出留分および結合、抽出物質留分は別々に、プールし、 二７エクター・細胞・再ターゲット化・分析法に使用するためＰＢＳ中に透析し た。

実施例５ ラットＩ　ｇＧ２ｂ抗−ヒトＣＤ３／マウスＩｇＧ１抗−ヒトＣＤ１９二重特異 性ハイブリドーマＳＨＲ１，６，１の調製ハイブリドーマＹＴＨｌ　２．５．１ ４．２ＴＧＩ　Ｏｌをハイブリドーマ（１）として、抗−ヒトＣＤ１９ハイブリ ドーマ８ＥＢ　Ｉ　ＢＵ　１２をハイブリドーマ（２）として使用し、実施例Ｉ （３）の手順を行なった。しかし、この場合ハイブリドーマ（１）はＨＰＲＴ− であり、ハイブリドーマ（２）はアイオドアセトアミドでだめになる。従って、 ＹＴＨｌ　２．５．ｌ　４．２ＴＧＩ　Ｏ１は、実施例３に記載されているミエ ローマ鎖損失変体ＹＴＨ１２，５，１４，２の６−チオグアニン抵抗性変体であ る。５ＥＢＩＢＵ１２は、マウスＩｇＧ１抗体を製造し、それは実施例１の主な 方法で使用されているハイブリドーマ（２）のようなマウスＴｈｙ−１抗原特異 性というよりも、ヒトＣＤｌ９抗原特異性であり、正常Ｂ細胞と多数の悪性Ｂ− 細胞の両者に表現されているヒトＢ細胞変位抗原である（８ＥＢＩＢＵ１２ハイ ブリドーマ源はバーミンガム・ユニバージティー（Ｂ　ｉ　ｒｍｉｎｇｈａｍＵ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のリング（Ｌｉｎｇ）とマクレナン（Ｍｃｌｅｎｎａｎ） 、英国である）。成長を示すウェルは、フルオレセインイソチオシアネ−１−（ ＦＩＴＣ）ラベル化抗−マウス免疫グロブリンを使用し、ヒトＴ−細胞に結合し たＣＤ３およびヒトＢ−細胞に結合したＣＤ１９の検出により選択した（ハドソ ン（Ｈｕｄｓｏｎ）とヘイ（Ｈａｙ）　ｒプラクティカル・イミュノロジー（Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉ　ｍｍｔ＋ｎｏｌｏｇｙ）、ブラックウェルしサイエンテ ィフィック・パブリケーションズ（Ｂ　Ｉａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、　１９７６　、１１頁）。この選択を基本にし て、ウェル番号ｌにクローン発生させ、次に半固体寒天培養地上で再クローン発 生させ、クローン５ＨＲ１，６，１を使用のため選択する。

実施例５のハイブリドーマ１．６．１からの低血清培養浮遊溶液を実施例２に記 載されているように製造し、処理したが、精製にモノ−Ｓカラムを使用するかわ りに、ろ過試料をｐＨ５，８，５０ｍＭマロネート緩衝溶液および０ないし１Ｍ 塩化ナトリウム勾配で、ＨＰＬＣ下、ＴＳＫ−５ＰＷ（ＬＫＢ）カラム上でイオ ン交換クロマトグラフィーした。種々のピークをホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ ）中に透析し、次に示した物質の濃度を得た。

画分　旦二２　濃度（ｍｇ／ｍ４） プールチューブ２，３．４．５ および６（漏出）４．１ チューブ９　１　０．５７ プールチユーブ１０．１１および１２　２　１．４３チユーブ１３　３　１．０ ７ チユーブ１４　４　０．３６ チユーブ１５　５　０．３６ プールチユーブ１６．１７８よび１８　６　０．４３Ｂ−セルラインおよびＴ− セルラインに対する蛍光分析によると、漏出画分は抗−ＣＤ１９活性を示し、チ ューブ１３および１４両分はそれぞれ抗−ＣＤ３活性を示し、チューブ９および プールチューブ１Ｏ１１１，１２両分は、抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ３活性の 両方を示した。

実施例７ エフエクター細胞再ターゲット化におけるラットＩｇＧ２ｂ／ラッ）ｒｇＧ２ｃ 二重特異性５ＨＮ２０．］　２モノクローナル抗体の分析（１）ヒト細胞毒性エ フェクター細胞 静脈血液を健康な血液から捕集し、グラスビーズを使用し繊維素を除去した、単 核細胞を界面から単離し、フィコール−ハイパーキー（Ｆ　１ｃｏｌｌ　−Ｈｙ ｐａｑｕｅ）上で密度勾配遠心分離し、そして洗浄して重炭酸塩緩衝ＩＭＤＭ含 有５０％ｖ／ｖＦＣＳ中へ入れた。これらの細胞を、ＹＴＨ３６１，１等のミト ゲンのラットＩｇＧ２ｃモノクローナル抗体の１００μｇ／ｍＱを含有する同じ 培養物媒体中１ｍ１２当り５Ｘ１０’細胞でプレートした。培養３ないし５日後 、細胞ブラース）　（ｂｌａｓｔｓ）を洗浄し細胞毒性分析に使用した、細胞毒 性を仲介するこれらのエフェクターの効力は、″Ｃリリース分析におけるターゲ ットセルラインとして実施例３に記述されている抗−ＣＤ３分泌ハイブリドーマ ＹＴＨ１２，５，１４，２を使用することにより示すことができた。このように 製造されたブラースト細胞はまた１０〜１５％のＡＤＣＣを仲介できるＦＣレセ プタープラス細胞（Ｆｃロッセッティング（ｒｏｓｅｔｔ　ｉｎｇ）により検出 される）を含有する。確かな実験によるとＡＤＣＣエフェクターは、室温で１５ 分間抗−Ｆｃレセプター抗体ＣＬＢ−Ｆｃｒグラン（ｇｒａｎ）　Ｉ　（テテロ （Ｔｅｔｔｅｒｏｏ）ら、ロウコサイト・タイピング（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｔ ｙｐｉｎｇ）Ｉ［，１９８５、第３巻、２７頁−スプリンガー・フエルランガー （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｎｇｅｒ）、ニューヨーク）のｌｐｇ／ｒｎＱ により洗浄エフェクター細胞を前培養することにより抑制された。抗体は分析に おいて細胞をプレートする前に洗い流されなかった。

（２）エフェクター細胞再ターゲット化分析マウスＴｈｙ−１プラス胸線腫セル ラインＥ　Ｌ　−４（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

参照番号ＴＩＢ４０）をターゲットセルラインとして使用した。細胞は、分析に 必要になるまでＩＭＤＭ含有２％ｖ／ｖＦＣ３の指数相（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａ ｌ　ｐｈａｓｅ）に維持した。約５Ｘ１０’細胞を２００　Ｘｇで遠心脱水し、 ペレットを２００μ４１ＭＤＭ含有１５０μＣｉ”Ｃｒ−ナトリウムクロメート に再懸濁させた。細胞を４５分間３７℃で培養し、洗浄してＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ 緩衝１入Ｄた。エフェクター細胞再ターゲット化試験用抗体の適当な希釈液を丸 底ミクロ規定濃度ウェル中１００μＱ調製した。放射性同位体で識別したＥＬ− ４ターゲツトをＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１有Ｄ％ｖ／ｖ加熱不活性化ＦＣ５の５ ０μａ容積で１ウ工ル当９１０′細胞濃度で添加し、（１）のもとに調製された 洗浄細胞毒性エフェクター細胞ブラーストを、ＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１有Ｄ％ ｖ／ｖ加熱不活性ＦＣ３の５０７７１２容積で適当なエフェクター／ターゲット 比で添加した。細胞混合物は、４時間３７°Ｃで培養し、１００μＱの浮遊溶液 を取り入れて、フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ガンマカウンターモデルＰＷ ４８００を使用してガンマ放射の測定により、放たれた放射性を決定した（すべ ての分析は３または４の反復実験において実施される）。

実施例２において記載されているように調製された培養物の固定相細胞からの浮 遊溶液をＹＴＨｌ　２．５．１４．２．およびＹＢＭ２９゜２−１抗体、および それらのｌ：１混合物の研究のために使用し、一方、実施例４の結合／溶出試料 を５ＨＮ２０．ｌ　２抗体研究のために使用した。抗体の出発濃度を０．Ｏ１〜 Ｑ　、　ｌ　ｔｎｇ／ｍＱの範囲になるように抗体アイタイピング分析から見積 もった。それぞれ、上記（２）に記載したようにヒトブラーストを通してＥＬ− ４ターゲツトの破壊をもたらす能力ｌこついて抗体を分析した（抗体ＹＴＨ３６ １，１は上記（１）の手順で使用された）。ターゲットに対するエフェクターの 一定比（１５：１）で抗体をｌ／ｌ　Ｏ〜１／１０’範囲で滴定した結果を第２ 図に示した。図中、（ａ）は対照物として使用されるＹ３−Ａｇ１．２．３ミエ ローマ細胞の培養物からの浮遊溶液であり、（ｂ）はＹＴＨＩ　２．５．ｌ　４ ．２、（ｃ）はＹＢＭ２９．２．ｌ、（ｄ）はＹＴＨｌ　２．５．１４．２＋Ｙ ＢＭ２９．２．Ｌ　そして（ｅ）は５ＨＮ２０．１２である。ＹＢＭ２９．２． １抗体はエフェクター細胞が存在するとターゲット細胞の破壊を仲介しないが、 ＹＴＨｌ　２．５．１４．２抗体は、わずかではあるが、たぶん該抗体によるＴ −細胞活性化のパイスタンダ−（ｂｙｓｔａｒ＋ｄｅｒ）効果によるものであろ う意味のある仲介を示すことがわかる（ＹＴＨｌ　２．５．１４．２等うットＩ ｇＧ２ｂアインタイプ抗体は、ＡＤＣＣに効果的であり、ヒトブラースト細胞は １０〜１５％Ｆｃレセプタープラス細胞を含有する）。ＹＴＨｌ　２゜５．１４ ．２／ＹＢＭ２９．２．１混合物の働きは、ＹＴＨｌ２．５．１４．２単独だけ のそれとほとんど異ならない。親抗体の混合物で得られる破壊と比較すると、そ れから誘導された二重特異性抗体５ＨＮ２０．１２はターゲットを非常に効率よ く破壊する。それゆえ、ハイブリッド浮遊溶液は、二重特異性抗体と共に存在す る抗体混合物がターゲットまたはエフェクター細胞への結合を競うと予期される 組み合わせを包含する事実にかかわらず、親抗体の混合物に対する破壊の程度を 非常に改良する。

一定の抗体濃度でのターゲットに対するエフェクター滴定比の効果（１：１ｏｏ ｖ／ｖ希釈の浮遊溶液）を第３図に示した（指示は第１図と同様である。ここで もターゲット細胞破壊を指示する５ＨＮ２０゜１２抗体の能力は非常に高いと思 われ、効果的破壊が、比較的低いエフェクター／ターゲット比でしかも非常に低 い抗体濃度で達成される。

５ＨＮ２０．１２二重特異性抗体の存在下にエフェクターにょるＥＬ−４ターゲ ツト細胞の破壊は％ＦＣレセプター依存でないことを確かめるため、抗−Ｆｃレ セプターモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＦｃＲグランエで処理したエフェクターを 使用することにより実験をした。５ＨＮ２０．１２浮遊溶液により仲介され観察 される破壊は、全く代わらないことがわかった。

実施例８ ラットＩｇＧ２ｂ／ラットＩｇＧ２ｂ二重特異性５ＨＮ２０．Ｉ２モノクローナ ル抗体とラットＩｇＧ２ｂ／ラットＩｇＧ２ｂ二重特異性ＳＨＭ１５．３モノク ローナル抗体との活性比較（ラットＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｂ抗体は比較目的だけ のみに使用され、Ｔ−細胞毒性の緩和を示すものでなく、本発明の範囲に入らな い）（１）ラットＩｇＧ２ｂ抗−ヒトＣＤ３／ラットＩｇＧ２ｂ抗−マウスＴｈ ｙ−Ｉ　ＳＨＭＩ　５．３モノクローナル抗体の調製実施例３に記載されている ハイブリドーマＹＴＨ１２，５，１４＊ハイブリドーマ（１）として、ハイブリ ドーマＹＴＳ　ｌ　５４．７．７（コポルドら、同書）をハイブリドーマ（２） として使用し、実施例１（３）の手順を行なった。ＹＴＨｌ　２．５．１４は実 施例３に記載されているミエローマ鎖損失変体ＹＴＨＩ　２．５．１４．２を供 給する。ＹＴＳ１５４．７．７はラットＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を製造す る親ハイブリドーマＹＴＳ１５４．７のミエローマ短鎖損失変体であり、実施例 ３のハイブリドーマＹＢＭ２９．２．１のように、カッパーｌｂアロタイプ短鎖 を表現する。ＹＴＳ　ｌ　５４．７．７の６−チオグアニン抵抗性変体はＹＴＳ ｌ　５４．７．７．ＴＧ９．４帆であった。融合混合物は実施例１に記載の適当 なアイソタイピング試薬を使用してスクリーンした。４８のウェルのうち２４に 成長が観察され、すべての生長ウェルは、親抗体種から期待されるように免疫グ ロブリン鎖および抗厚特異性を有することがわかった。分析で最も強い結合を与 える培養物を半固体寒天培養地上でクローン発生させるために選択したところ、 すべてプラスであり、鎖損失変体は全く観察されなかった。クローンＳＨＭ１５ ．３を使用のために選択した。

ハイブリドーマＳＨＭ１５．３からの低血清培養浮遊溶液を実施例２に記載され ているように製造精製し、漏出および結合、流出物質のプール画分からなる生成 物を得た。そのことは、実施例４にハ実施例７に記載した分析手順を、上記（１ ）に記載したように調製されたＳＨＭ１５．３モノクローナル抗体、および単独 でおよびｌ：１混合物で使用される親杭体に適用した（すべての抗体は浮遊溶液 の形態で使用した）。分析によると、二重特異性抗体は、親杭体ＹＴＨ１２，５ ，１４，２およびＹＴＳ１５４．７の１＝１混合物よりもターゲット細胞の効果 的破壊を示し、二重特異性抗体は、単一特異性ＹＴＳ１５４．７抗体単独に対す ると同様の規定濃度を有していた。

エフェクターを抗−Ｆｃレセプターモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＦｃＲグランＩ で処理すると、ＳＨＭ１５．３抗体に仲介される破壊は影響されないと観察され た。このことは、５ＨＮ２Ｃｌｌ　２モノクローナルでの観察と同様であるが、 対照としてＹＴＳ１５４．７抗体により製造される破壊は、ＣＬＢ−ＦｃＲグラ ンＩ抗体の使用により除かれる。

（！２）実施例７の分析手順を使用したが、ＥＬ−４セルラインに代えてマウス Ｔｈｙ−ｔプラスＢＷ５　１４７セルライン（ＣＲＬ１５８８、ピーニッチエル ニス・ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｐ ＨＬＳ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ□ｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）、ボートン・ダウン（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ）、イング ランド）を使用した。３つの親杭体用培養物の固定相の細胞からの浮遊溶液を使 用し、そして２つの二重特異性抗体に対する各々のプールされた漏出、結合、溶 出画分を使用した。親ＣＤ３抗体ＹＴＨ１２，５および親１ｇＧ２ｃ抗−Ｔｈｙ −１抗体ＹＢＭ２９．２はターゲット細胞のいかなる破壊をも引き出さなかった が、親１ｇＧ２ｂ抗−Ｔｈｙ−１抗体ＹＴＳ１５４．７は、ターゲット細胞の実 質的破壊を誘導し、両二重特異性抗体のプールされた画分の両グループも同様で あった。しかし、第４図からもわかるように二重特異性抗体の間で相対的規定濃 度に差があり、パーセンテージ特定ターゲット細胞溶解を１０−’ないしｌ　Ｏ −’ｔｎｇ／ｒｎＱの範囲で滴定に対して示した。第４図において、（ａ）はＹ ＴＳ　１５４．７、（ｂ）はＹＢＭ２９．２．ｌ、（ｃ）はＹＴＨｌ　２．５． １４．２、（ｄ）は結合／溶出５ＨＮ２０．１２、（ｅ）は漏出５ＨＮ２０．１ ２、（４）は漏出ＳＨＭ１５．３、そして（ｇ）は結合／溶出ＳＨＭ１５．３で ある。漏出および５ＨＮ２０．１２の結合／溶出両画分は、ＹＴＳ１５４．７と 同様の規定濃度を与えた（　１０−５ｍｇ／ｍＱで比較）が、ＳＨＭ１５．３は 、漏出画分が１０倍低い規定濃度を示しくＹＴＳ１５４．７に対する１０−ａｍ ｇ／ｍＱと同様の１０−’＋ｘｇ／ｍの、結合／漏出画分が１００倍低い規定濃 度を示して（ＹＴＳ１５４．７に対する１　００−５ｒａ／ｒｎＱと同様の１０ −”ｍｇ／ｍのいることがわかる。

それ故、第４図は、ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ｂ５ＨＮ２０．１２の両分はエフェク ター細胞再ターゲット化においてＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｂＳＨＭ１５．３の画分 より実質的によいことがわかる。

良好なに一細胞供与者から新たに得られた休止期の末梢血液分子細胞を実施例５ の分析法におけるＴ−細胞ブラーストの代わりにエフェクターとして使用した。

ターゲット細胞破壊は、ＩｇＧ２ｂＹＴＳ１５４．７とＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｂ ＳＨＭ１５−３抗体のみに観察され、そのことはＣＬＢ−ＦｃＲグランＩ抗体を 使用した上記２（ａ）に報告された結果を寅証し、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｃＳＨ Ｎ２０．１２二重特異性抗体は、意味のあるＦｃレセプター仲介ターゲット細胞 破壊を全く誘発できないことを示唆しているとわかった。エフェクター細胞再タ ーゲット化分析における５ＨＮ２０．１２抗体で得られたターゲット細胞の破壊 は、エフェクターとしてＴ−細胞ブラーストの働きに帰することができ、ＡＤＣ Ｃからの意味のある寄与を全く伴なわないことは明らかである。

ヒトエフェクター細胞を実施例７（１）に記載されているように調製し、実施例 ７（２）のマウスターゲット細胞について記載されているように”Ｃｒでラベル 化した。マイクロ−規定濃度ウェル１００μｇの容積に、精製した抗体画分をＨ ＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１仁Ｄ釈しＩ：。ラベル化細胞を５０μｇの容積で１つの ウェル当り１０’細胞で添加し、最後に同厚のヒト血清（単核エフェクター細胞 の最初の提供者から）の５０μｇを相補性源として添加した。グレートを１時間 ３７°Ｃで培養し、浮遊溶液の１００μＱを放たれた放射性を決定するために取 り入れた。上記２（ｂ）における（Ｃ）ないしくｇ）として同定されたのと同様 の抗体試料に該方法を適用し、１０−１ないし５Ｘ　ｌ　Ｏ−”ｔｎｇ／μＱの 抗体濃度範囲でこれらの試料を滴定した。さらに、この方法はハイブリドーマ５ ＨＬ４５．６．１により二価で不活性な種と共に製造される一価の種のイオン交 換精製形態である抗体の調製に適用した。５ＨＬ４５．６．１はハイブリドーマ ＹＴＨ１２゜５．２２と同様に抗−ＣＤ３モノクローナル抗体製造ハイブリドー マである（コポルド、ワルドマン、同書参照）。５ＨＮ２０．１２と３８Ｍ１５ ．３の漏出および結合／溶出画分を（ｃ）によって与えられる対照とその当量の １価の試料を比較すると、両方の２重特異性抗体の漏出画分は、ＹＴＨｌ２．５ の破壊と同様の破壊の程度を示すが、結合および溶出画分は、ＹＴＨｌ　２．５ ．１４とその１価の当量の破壊の間の中間の破壊の程度より大きく示すことがわ かった。しかし、５ＨＮ２０．１２または３８Ｍ１５．３のどちらの両分も、Ａ ＤＣＣとエフェクター細胞再ターゲット化活性の効果的濃度が観察される濃度で ある４　Ｘ　１０−’ｒｎｇ／ｍｎ以下の濃度で検知可能な相補性溶解を示さな かった。

（ｂ）エフェクターによるエフェクター細胞破壊実施例７のエフェクター細胞再 ターゲット化分析し、ここでは実施例７（２）のマウスターゲット細胞について 記載したようにヒトＴ−細胞ブラースト混糸（２０％）を放射性クロムでラベル 化し、これらの細胞を抗体希釈液に添加して分析した。最終的にラベル化されて いないヒトブラーストエフェクター細胞を、ウェル当り最終細胞数が上述された エフェクター細胞再ターゲット化分析についてとなるように添加し、培養物を浮 遊溶液を取り入れる前３７℃で４時間培養し、放たれた放射性を決定した（エフ ェクター細胞はこの方法においてはＣＬＢ−ＦｃＲグランＩで処理しなかった） 。

該分析方法は、上記２（ｂ）で（ａ）ないしくｇ）として同定したと同じように 抗体試料に適用し、結果を第５３とｂ図に示した。試料（ｇ）、（ｆ）および（ ａ）のプロットをはっきり示すために、試料（Ｃ）のプロットは第５ｂ図に示さ ずに第５ａ図のみに示している。抗体は、マウスターゲット細胞溶解をおこす同 じ濃度範囲の温度でヒトエフェクター細胞の溶解を引きおこした（第４図と比較 ）。しかし同じ抗体濃度については、ＹＴＨｌ　２−５．１４．２親杭体は、二 価抗体ＳＨＭ１５゜３の漏出および結合／溶出画分の約３０倍（ｌ　Ｏ−’ｒａ ９／ｍＱ値と比較）、漏出画分の約１０倍、二価抗体５ＨＮ２０．１２の結合／ 溶出画分の約１００倍（それぞれ、３ＸｌＯ−’および２　Ｘ　１０−５ｍｇ／ ｒＩＩＱ値と比較）である規定濃度（３Ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｍｇ／ｒｎＱ、　１５％ 特定細胞毒を与える濃度と見積られる）を示すことに注意すべきである。さらに 、抗体ＹＴＨは、試験全範囲にわたって目立った前置体（ｐｒｏｚｏｎｅ）を示 す。

５ＨＮ２０．Ｉ　２および３８Ｍ１５．３の４つの試料の中で、マウスターゲッ ト細胞に対する最も高い細胞毒規定濃度を与える画分てもある５ＨＮ２０．１２ 結合／溶出画分が最も低い溶解濃度であることがわかる。（ＳＨＮ２０．１２の 漏出および結合／溶出画分に対する（ａ）と（ｂ）の両者に観察される細胞毒は 、二重特異性抗体分子よりはむしろ第１図に示したように汚染物に帰することが できると信じられている。） 実施例９ ヒトターゲット細胞およびヒトＴ−細胞に対するラットＩｇＧ２ｂ／マウスＩｇ Ｇに重特異性５ＨＲ１，６，１モノクローナル抗体の該分析方法は、実施例７（ ２）に記載された方法を基にしているが、マウスＴｈｙ−１プラス胸腺腫セルラ インＥＬ−４のかわりに、エプスタイン−パービールス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　−Ｂ ａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）でヒトＢ−細胞の形質転換で製造されたヒトＣＤ１９、Ｈ ＬＡ−クラス■プラスセルラインＨＷＬＣＬを使用した。ヒトエフェクター細胞 をＨＷＬＣＬターゲットセルに対する比ｌＯ：１で使用し、テスト用抗体は培養 浮遊溶液に対しては１：１０ないし１：１０’の希釈範囲でモしてカラム画分に 対しては１：１０”ないし１：１０’の希釈範囲で使用しｊ；。次の抗体試料を 分析した：（ａ）親ハイブリドーマＹＴＨ１２，５゜１４．２および８ＥＢＩＢ Ｕ１２（その浮遊溶液のｌ　：　ｌ　ｖ／ｖ混合物）、と（ｂ）実施例５のハイ ブリドーマ５ＨＲ１，６，，１から実施例２に記載されているように調製された 培養物の固定相における細胞からの浮遊溶液；および（ｃ）チューブ２〜６（漏 出）、（ｄ）チューブ９、（ｅ）チューブ１０〜１２、（ｆ）チューブ１３、お よび（ｇ）チューブ１４に対応して実施例６に記載されているように５ＨＲ１， ６，１を精製することにより製造されたカラム画分。

結果を第６図に示す。図から、５ＨＲ１，６，１抗体は、エフェクターニー細胞 によるヒトＣ１９−プラス細胞の破壊を仲介するが、親杭体は、実質的に仲介せ ず、しかも画分９およびｌＯ〜１２（ビークｌと２）は、Ｔ−細胞によるＢ−細 胞のＥＣＲを仲介する二重特異性抗体活性の大部分を含むことがわかる。

（２）エフェクター細胞破壊分析 該分析は、上記（１）に記載されているカラム画分（ｄ）、（ｅ）および（ｆ） 、（ｈ）実施例８　（４Ｘａ）において言及されているノ・イブリドーマ５ＨＬ ４５．６．１について実施例２に記載されているように調製される固定相の細胞 からの浮遊溶液および（ｉ）実施例８　（４Ｘａ）において言及されているハイ ブリドーマ５ＨＬ４５．６．１からの一価試料を実施例８　（４Ｘａ）に記載さ れている方法を基本にした。各試料は次の抗体濃度で始めて、６回　１　：　３ 　ｖ／ｖを基本に希釈され、ｌ：３ｖ／ｖに最初に希釈したウェルを最初の決定 のために使用す。：（ｄ）ｌ　Ｏ，Ｏｐｇ、　（ｅ）２３．８　μｇ、　（０１ ７，８ｐｇ、　（ｈ）ｌ　６．７　ｐｇおよび（ｉ）１３．２μｇ０ 得られた結果を第７図に示す。それから相補性仲介溶解の最低濃度は試料（ｄ） （画分９）から生じることがわかる。試料（ｄ）は、また画分の中でＥＣＲの最 も高い濃度を与えることも価値ある。ラツ）１ｇＧ２ｂ長鎖はＴ−細胞に対して 毒性があるものであるので、得られた結果は、マウスＩｇＧ１長鎖は、ラット１ ｇＧ２ｂ長鎖の毒性を打消すことを示唆している。しかし、モノ特異性抗−ＣＤ ３ラットＩｇＧ２ｂ／ラッ）ＩｇＧ２ｂ抗体は明らかに毒性があり、試料（ｄ） （画分９）は実質的に純粋な二重特異性抗体を含むが、試料（ｅ）（画分１０〜 １２）においては、二重特異性抗体はモノ特異性抗−ＣＤ３抗体で汚染されてい るようであり、それは該試料の実質的に増加したＴ−細胞毒性を説明する。

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Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．破壊を活性化できるヒトＴ−細胞レセプターに対する第１の結合親和力およ びターゲット細胞に対する第２の結合親和力を有する２重特異性抗体分子におい て、該分子中の２つの長鎖が該分子によりヒトＴ−細胞の破壊を緩和するために 選択されることを特徴とする抗体分子、またはその全分子の結合親和力を保持す る上記抗体分子のフラグメント。
2. ２．ターゲット細胞が腫瘍細胞である第１項記載の抗体分子またはそのフラグメ ント。
3. ３．２つの長鎖がそれぞれ別々にヒト、ラットまたはマウスから誘導され、免疫 グロブリンのＩｇＧクラスである請求項１または２記載の抗体分子またはそのフ ラグメント。
4. ４．Ｔ−細胞破壊がＦｃレセプター仲介破壊機構を通じて実質的に破壊を促進す る効果がないＴ−細胞結合親和力を有する第１の長鎖を使用することにより緩和 される請求項１、２または３記載の抗体分子またはそのフラグメント。
5. ５．長鎖がラットから誘導され、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃまたはＩｇＧ１サプク ラスである請求項４記載の抗体またはそのフラグメント。
6. ６．２つの長鎖がアイソタイプであり、それぞれ抗−Ｔ−細胞／抗−ターゲット 細胞特異性として、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ ２ｃ／ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂまたはＩ ｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ｂである請求項５記載の抗体分子またはそのフラグメント。
7. ７．長鎖がマウスから誘導され、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サプクラ スである請求項４記載の抗体分子またはそのフラグメント。
8. ８．Ｔ−細胞結合親和力を有する第１の長鎖が、Ｆｃレセプター仲介破壊機構を 通じての破壊促進に効果的であるが、Ｔ−細胞破壊が第１の長鎖の効果を小さく するターゲット細胞待合親和力を有する第２の長鎖の存在により緩和されている 請求項１、２または３記載の抗体分子またはそのフラグメント。
9. ９．第１および第２の長鎖が、異なった種、アイソタイプまたはアロタイプであ る請求項８記載の抗体分子またはそのフラグメント。
10. １０．第１の長鎖がラットＩｇＧ２ｂまたはマウスＩｇＧ２ａである請求項９記 載の抗体分子またはそのフラグメント。
11. １１．第１および第２の長鎖が同じクラスである請求項９または１０記載の抗体 分子。
12. １２．長鎖がラットから誘導され、アイソタイプであり、それぞれ第１鎖／第２ 鎖として、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｃであるか、ま たは、マウスから誘導され、アイソタイプであり、それぞれ第１鎖／第２鎖とし て、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂである請求項１１記載 の抗体分子またはそのフラグメント。
13. １３．破壊を活性化できるヒトＴ−細胞レセプターに対する第１の結合親和力お よびターゲット細胞に対する第２の結合親和力を有する二重特異性抗体分子にお いて、該分子中の２つの長鎖が異なった種またはアイソタイプであることを特徴 とする抗体分子、またはその全分子の結合親和力を保持する上記抗体分子のフラ グメント。
14. １４．ターゲットがヒト腫瘍細胞である請求項１３記載の抗体分子またはそのフ ラグメント。
15. １５．２つの長鎖がヒト、マウスおよびラットの中の異なった種から誘導される 請求項１３または１４記載の抗体分子またはそのフラグメント。
16. １６．２つの長鎖が、一つはラットから、他の１つはマウスから誘導されるか、 または異なったラットまたは異なったマウスアイソタイプである請求項１３また は１４記載の抗体分子またはそのフラグメント。
17. １７．２つの長鎖が同じクラスである請求項１３ないし１６いずれかに記載の抗 体分子。
18. １８．長鎖が両者ともラットから誘導され、アイソタイプであり、それぞれ抗Ｔ −細胞／抗ターゲット細胞特異性として、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｃ ／ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ｂであるか 、または両者ともマウスから誘導され、アイソタイプであり、それぞれの抗Ｔ− 細胞および抗ターゲット細胞特異性として、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｂ ／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ａである請求項 １６記載の抗体分子またはそのフラグメント。
19. １９．２つの第１の長鎖、該長鎖の少なくとも１つはその対応する短鎖と共同し ている、を有する抗体分子、およびその全分子の結合親和力を保持する抗体分子 のフラグメントが実質的にない請求項８ないし１２いずれかに記載の抗体分子ま たはそのフラグメント。
20. ２０．第１の結合親和力をもつ２つの長鎖、該長鎖の少なくとも１つはその対応 する短鎖と共同している、を有する抗体分子、およびその全分子の結合親和力を 保持する抗体分子のフラグメントが実質的にない請求項１３ないし１８いずれか に記載の抗体分子またはそのフラグメント。
21. ２１．ターゲット細胞に対する結合親和力をもつ長鎖がＦｃレセプター仲介破壊 機構を通じて破壊の促進に効果的であり、抗体分子またはそのフラグメントが、 ２つの係る長鎖、この長鎖の少なくとも１つは、その対応する短鎖と、またはそ の全分子の結合親和力を保持する抗体のフラグメントと共同している、を有する 抗体分子との混和物である請求項１ないし２０いずれかに記載の抗体分子または そのフラグメント。
22. ２２．全分子のＦ（ａｂ′）２フラグメント、または、Ｔ−細胞結合親和力をも つ長鎖のフラグメントであるＦｃ領域のみ欠如しただけの全分子のフラグメント のいずれかである請求項１ないし２１いずれかに記載の抗体分子のフラグメント 。
23. ２３．生理学的に受容できる希釈剤またはキャリアとともに請求項１ないし２２ のいずれかに記載の抗体分子またはそのフラグメントからなる組成物。
24. ２４．手術、治療または診断に使用する請求項１ないし２２いずれかに記載の抗 体分子またはそのフラグメント。
25. ２５．腫瘍性、ウイルス性または寄生性の病気の処理に使用する医薬を製造する ための請求項１ないし２２いずれかに記載の抗体分子またはそのフラグメントの 使用。
26. ２６．請求項１ないし２２のいずれかの抗体分子またはそのフラグメントを腫瘍 性、ウイルス性または寄生性の病気の退行および一時緩和を達成するに治療的に 効果のある量をそのような病気で困っている患者に投与することを特徴とする腫 瘍性、ウイルス性または寄生性病気の退行および一時的緩和を助ける方法。
27. ２７．二重特異性抗体分子を製造するためその抗体分子を表現するハイプリドー マを培養し、その後適当なところでこれを処理してそのフラグメントを製造する ことを特徴とする請求項１ないし２２の二重特異抗体分子の調製法。
28. ２８．請求項２７の方法に従い製造される二重特異抗体分子、またはそれの明ら かな同等物。