CN1298020A - 抗cd3单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因,由所述基因编码的多肽,含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备诊断和治疗肿瘤的药物及在器官移植中抑制免疫排斥反应的药物中的应用。
Description
本发明涉及抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备诊断和治疗肿瘤的药物及在器官移植中抑制免疫排斥反应的药物中的应用。
CD3为T细胞表面重要分子，参与T细胞受体识别抗原后的信号传递、T细胞激活增长过程及免疫细胞间相互作用等一系列重要的免疫应答反应。近年来，抗CD3单克隆抗体不仅是免疫学研究的有用工具，而且已成为临床上主要免疫抑制剂之一。作为免疫调节分子的抗CD3单抗，在防治移植排斥上的作用已经得到世界公认。1986年FDA正式批准Ortho公司的OKT3(一种抗CD3的鼠源性单抗)用于临床试验。1989-1993年期间，美国急性肾移植的Ⅱ期临床结果显示，应用含OKT3单抗的免疫抑制组方的疗效要比其它组方好(移植后巩固治疗的4年存活率为100％)且花费要少(移植后的前5年含OKT3的组方花费30,474美元/年，用环胞菌素A组方的为32,687美元/年)。目前，OKT3单抗已准备上Ⅲ期临床试验，同时，OKT3单抗也已应用与其它实体器官移植(如心脏移植、胰腺移植等)的Ⅰ、Ⅱ期临床试验。据1995年我国统计资料表明，全国仅肾移植就达2,382例次，这表明抗CD3单抗在国内用于防治免疫排斥方面，具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。抗CD3单抗除了可用于防治移植物免疫排斥，还用于体内外激活T淋巴细胞，并在其它细胞因子(如IL-2)的协同下，可杀伤肿瘤细胞，这也是人体内免疫系统控制和杀灭肿瘤细胞的主要机制之一。但由于鼠源性的抗CD3单抗具有分子量较大，穿透能力差，免疫原性强等缺点，这将直接限制该类抗体用于肿瘤的体内免疫显像和治疗的效果，为此，英美德等国积极投资研制和开发基因工程抗体，以克服鼠源性抗体上述诸多缺点。
本发明人在这种国际大环境下，采用国际上90年代较为先进的抗体库技术，成功地克隆到抗CD3抗体的轻重链可变区基因，并通过免疫筛选技术得到几株生物活性较高的重组抗体克隆株，并且基于上述已克隆到的抗CD3抗体的轻重链可变区基因，采用基因操作方法，构建和表达多种小分子工程抗体，如单链抗体片段，Fab抗体片段，单特异性双价小抗体等，以便用于不同肿瘤的诊断和治疗目的。与此同时，我们还研制了一种双功能抗体(Diabody)，它是将抗CD3抗体/抗肿瘤抗体结合在一起的双特异性工程抗体，可以介导细胞在体内外对肿瘤细胞的杀伤作用，今后有望能解决“药物在体内的定向输送”这一医学难题。
因此，本发明的一个目的在于提供一种抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因，两者重组后可表达出特异性识别和结合CD3的抗体活性片段，并克服了鼠源性抗体上述诸多缺点。
本发明的另一目的在于提供由所述抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因编码的多肽产物。
本发明的再一目的在于提供含有所述基因的载体。
本发明的又一目的在于所述的基因和多肽在制备诊断和治疗肿瘤的药物中的应用以及在器官移植中抑制免疫排斥反应中的应用。根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因，其中所述的重链可变区基因全长为357bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述的轻链可变区基因全长为321bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。两个基因重组后可表达出特异性识别和结合CD3的抗体活性片段，并克服了鼠源性抗体的诸多缺点。本发明的抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因是能分泌活性较高的鼠源性抗CD3抗体的杂交瘤细胞株HIT3a中克隆的，该细胞株的建立见中国医学科学院学报第15卷第3期(1993)。
根据本发明的另一方面，本发明提供了含有所述抗CD3抗体重链和轻链可变区基因的载体，在本发明的一个实施方案中，所述的载体例如为实施例中所述的表达载体pCANTABC3scFv。
本发明还涉及所述的基因和多肽在制备诊断和治疗肿瘤的药物中的应用以及在器官移植中抑制免疫排斥反应中的应用。
以下参照附图，以实施例详细描述本发明，其中：
图1为RT-PCR扩增的抗CD3抗体可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道1为DNA标记物φⅩ174RFDNA/HaeⅢ，泳道2为抗CD3单克隆抗体重链可变区基因，泳道3为抗CD3单克隆抗体轻链可变区基因。
图2示出含有本发明的抗CD3单克隆抗体重链和轻链可变区基因的表达载体pCANTABC3scFv的构建过程。
图3示出E-标记亲和层析纯化的抗CD3scFv抗体片段(FPLC)，图中，泳道4为菌体的外周质裂解液；在分子量约为30KD处有一深的蛋白带(箭头处)；泳道3为裂解液经E-标记亲和柱后流出液，对应上述深带处的蛋白带消失，表明该蛋白带已与亲和柱结合；泳道2和1分别为洗脱液的第4、5级分收集液(含抗scFv抗体片段，大小为30KD左右)。
图4为E-标记亲和层析纯化的抗CD3scFv抗体片段的结合活性分析(FACS)，其中靶细胞为CD3+的Jurkat细胞；阴性对照为PBS；抗CD3 scFv抗体片段的反应浓度为50μg/ml。
实施例1重链及轻链可变区基因的克隆及含有其表达载体的构建
1、所用细胞和鼠源性抗CD3抗体
HIT3a是由中国医学科学院血液学研究所免疫室采用传统的细胞融合方法得到的一株能分泌活性较高的鼠源性抗CD3抗体(HIT3a)的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体的分子亚型为IgG2a(中国医学科学院学报第15卷第3期(1993))。Jarkat是一种Tac缺陷的人T细胞株，由中国医学科学院血液学研究所免疫室提供。上述细胞常规培养在10％胎牛血清(Gibco)的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。纯化的HIT3a抗体可通过将常规制备的腹水抗体经蛋白A(Gibco)亲和层析柱纯化制备。
2、抗CD3抗体可变区基因的克隆
取状态良好的HIT3a杂交瘤细胞(5×106个)，经异硫氰酸胍一步法提取总RNA，随后以Oligo(dT)15(Promega)为随机引物，逆转录生成cDNA。尔后，采用通用的兼并性引物特异性地分别扩增抗体轻链、重链可变区基因(VL和VH)。扩增产物VH基因(360bp左右)和VL基因(325bp左右)，经琼脂糖(1.5％)电泳后，切胶分离靶片段，再将含上述两基因的胶块分别经Microspin柱(PharmaciaBiotech)离心(2444rpm,2分钟)分离，得到纯化的DNA片段，凝胶电泳定量，见图1。
以Oligo(dT)15(Promega)为随机引物进行逆转录方案如下：40μl反应体系中依次加入2μg总RNA，100ng随机引物(Oligo(dT)15)，1μl 10mM4×dNTP，8μ15×缓冲液，1μl 0.1M DTT，适量的水，混匀，65℃水浴5分钟，冰浴3分钟，加入Rnasin 40U，200U M-MLV逆转录酶，混匀，37℃孵育1小时，然后置于95℃水浴10分钟。反应产物保存于-20℃备用。PCR扩增体系如下：
轻链PCR扩增体系 重链PCR扩增体系逆转录产物 5μl 逆转录产物 5μlLight Primer Mix 2μl Heavy Primer Mix 2μl灭菌去离子水 42μl 灭菌去离子水 42μlVent DNA聚合酶 1μl(2U)Vent DNA聚合酶 1μl(2U)反应程序：94℃ 5分钟，1个循环；94℃ 1分钟，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
3、VH和VL基因的拼接和单链抗体基因表达载体的构建
将VH基因和VL基因用一编码(GGGGS)3短肽的DNA片段连接成5’VH-接头-VL3’片段，接着采用PCR扩增该片段(约800bp)，并在5’端加上SfiI酶切位点，在3’端加上NotI酶切位点。扩增产物走1.5％琼脂糖凝胶电泳，切取含靶片段凝胶，纯化。纯化的scFv DNA片段经SfiI和NotI酶切后，经苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提后，上清经Microspin柱离心(2444rpm，2分钟)分离，得到纯化的scFv片段，尔后将此片段连接到一噬菌体表达载体pCANTAB 5E(Pharmacia Biotech)上，组装成含scFv抗体片段基因的表达载体pCANTABC3scFv，如图2所示。
具体地，用于VH和VL基因的拼接的50μl反应体系如下：轻链PCR扩增产物 1μl(50ng)重链PCR扩增产物 2μl(50ng)接头一引物混合物 4μl10×PCR缓冲液(含Mg2+)5μldNTP(10nM) 1μl灭菌去离子水 42μlVent DNA聚合酶 1μl(2U)拼接程序：每个循环包括94℃ 1分钟，63℃ 4分钟，共15个循环。
PCR扩增单链抗体(scFv)基因具体过程是向上述拼接反应产物中加入等体积的如下扩增反应溶液(50μl)：
10×PCR缓冲液(含Mg2+) 5μl
dNTP(10nM) 1μl
RS引物混合物 4μl
灭菌去离子水 39μl
Vent DNA聚合酶 1μl(2U)扩增程序：每个循环包括94℃ 1分钟，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟，共30个循环。
实施例2抗CD3 ScFv抗体库的建立和淘选法筛选特异性抗CD3噬菌体抗体克隆
采用电穿孔方法将实施例1的pCANTABC3scFv质粒转入TG1细菌中，获得抗CD3 ScFv抗体库，库的大小为1微克DNA转化后获得106个克隆。将抗体文库中细菌在2YTAG培养基(100μg/ml氨苄青霉素，2％葡萄糖)中常规培养至OD值为0.8时加入M13K07辅助噬菌体(4×109pfu/ml培养液)，继续培养1小时后，离心(4000rpm，10分钟)，弃上清，再经适当体积的2YTAK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml的卡那霉素)溶解沉淀，30℃培养过夜，尔后，常规提取噬菌体。将提取的噬菌体与已用含10％胎牛血清的PBS(PH7.4)封闭过1小时的Jukat细胞(107个)孵育(4℃，振荡2小时)，然后离心，弃上清，再用PBS(含0.1％TritonX-100)洗10次，最后用0.1N甘氨酸(PH2.2，含0.1％BSA)洗脱噬菌体，离心，弃沉淀，上清中加入适量PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心(8000rpm)，弃上清，沉淀用PBS洗2次后，再溶于适量TE(PH8.0)中，该噬菌体再去感染适量的对数生长期的TG1菌体后，涂布于2YTAG平板(1％琼脂，100μg/ml氨苄青霉素，2％葡萄糖)，30℃培养过夜。获得第一次淘选后的文库(106)，如上步骤，共进行5轮淘选法活性筛选后，获得一均一和稳定的文库(107)。
采用BstNI酶切噬菌体中ScFv基因，比较电泳后的酶切指纹图谱的均一性。随后采用Sanger双脱氧链终止法测序(见分子克隆实验手册)和基因序列分析。应用同源氨基酸比较法进行抗体可变区鉴定，结果表明所克隆的基因是目的基因。
实施例3抗体的活性鉴定
采用免疫组织化学法(ApAAp法)和ELISA方法对实施例2获得的重组噬菌体抗体进行活性鉴定。
重组噬菌体抗体的提取：按1/5的比例向重组噬菌体抗体上清中加入PEG/Nacl(2.5M NaCl中含20％PEG6000)，冰上放置30-60分钟，10000rpm，4℃，离心20分钟，弃上清，立即用适量的2xYT或PBS溶解沉淀，尔后，过0.45μm滤膜，备用或保存。
ApAAp法：见《现代实验血液学研究方法与技术》，郑德先等主编，北京，北京医科大学和协和医科大学联合出版社，1999，475页
ELISA法：(用于颗粒性抗原)具体步骤如下：1)靶细胞抗原的固定：在已用多聚L型赖氨酸预先处理(室温40分钟)的96孔板中加入靶细胞(5-3×105/孔)，室温放置45分钟或4℃过夜，去掉上清后加入0.1％戊二醛室温固定3分钟，PBS洗2次。2)抗体与靶细胞的反应：将待测的标本与靶细胞孵育至少30分钟，接着用含有0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗5次，然后，如上所述过程依次向反应体系中加入二抗、三抗进行反应。3)显色反应：当接有HR的三抗反应完毕后，用PBST洗5次后。流尽残液后加入新鲜配制的显色剂(6 mg DAB于10ml 0.01MTris-HCl(PH7.6)中，使用前加入10μl30％双氧水/10ml)，37℃显色。显色至合适强度时，记录结果。
结果表明次级文库与靶抗原的反应强度呈递增现象。第5轮淘选后随机挑选8个克隆均能与靶抗原有反应。
实施例4抗CD3 scFv抗体片段可溶性表达
取已被证明含有阳性重组噬菌体抗体的噬菌体去感染对数期的大肠杆菌HB2151，并在含有100μg/mlAmp，2％葡萄糖，100μg/ml萘啶酮酸的2xYT平板(1％琼脂)筛选转化子。挑单克隆接种到5ml2xYT-AG培养基中，30℃、250rpm，过夜培养，尔后，将上述5ml培养基加入到50ml新鲜配置的2xYT-AG中，30℃、250rpm，培养1小时，然后离心(4,000rpm,10分钟，室温)，收集沉淀，接着换用50ml新鲜的2xYT-AI悬浮沉淀，诱导培养8-24小时(30℃、250rpm)。离心(7,000rpm,4℃,10分钟)收集沉淀，置于-20℃速冻1小时后，取出，加入裂解缓冲液，4℃，轻轻振荡至少1小时，再离心(12,000rpm,10分钟,4℃)，收集上清(含重组抗体)，过0.45μM膜，最后放置-20℃保存。
接着，采用抗E-tag亲和层析柱纯化抗CD3 scFv抗体片段，具体地，将抗E-tag亲和层析柱连接到FPLC上，用15ml洗脱液洗一次柱，尔后用25ml结合缓冲液洗一次，流速为5ml/min。用上样器进样，流速为0.5-5ml/min。之后再用25ml结合缓冲液洗一次柱，以去除大量未结合的细菌蛋白。接着用15ml洗脱液洗将结合到柱上的抗CD3 scFv抗体片段洗脱下来，流速为5ml/min，收集出峰时的组分2ml/管，并立即向其中加入200μl中和缓冲液，调PH值至7.0-7.4。最后，用25ml结合缓冲液冲、平衡亲和柱，密封，置于4C保存。
采用Amicon公司的Centricon-10(截流分子量为10KD)离心浓缩器，浓缩条件为4,000rpm、4℃、30分钟。浓缩后的样品可用于SDS-PAGE电泳和生物学活性分析。
随后用12％的SDS-PAGE鉴定表达产物。具体地，所得到的样品中加入等体积2xSDS上样缓冲液，加样缓冲液的量为所诱导表达后菌体体积的0.1倍。其它样品则调整为同一蛋白浓度后，加入等体积加样缓冲液。煮沸5分钟后离心，上样。样品在浓缩胶中的电压为8V/cm，进入分离胶后电压调至15V/cm。电泳完毕用考马斯亮蓝R-250染色，10％乙酸，30％甲醇溶液中脱色，凝胶保存于含20％甘油的蒸馏水中。
表达产物经SDS-PAGE电泳分析，结果表明，所挑选的克隆株能表达可溶性的抗CD3 scFv抗体片段。见图3。实施例5抗CD3 scFv抗体片段的生物学活性测定
采用间接免疫荧光法(FACS)测定抗CD3 scFv抗体片段的生物学活性，方法详见《现代实验血液学研究方法与技术》，郑德先等主编，北京，北医大和协和医大联合出版社，1999。所用靶细胞为CD3+的Jurkat细胞；阴性对照为PBS；抗CD3 scFv抗体片段的反应浓度为50μg/ml，结果见图4。
序列表SEQ ID NO：1的信息序列长度：357bp序列类型：核酸分子类型：cDNA序列描述：SEQ ID NO：11 CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC TGGGGCTGAA CTGGCAAGAC CTGGGGCCTC AGTAAAGATG61 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CACCTTTACT AGGTACACGA TGCACTGGGT AAAACAGAGG121 CCTGGACAGG GTCTGGAATG GATTGGATAC ATTAATCCTA GCCGTGGTTA TACTAATTAC181 AATCAGAAGT TCAAGGACAA GGCCACATTG ACTACAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT241 ATGGAGCTCA CTAGGCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATATTAC301 GATGATCATT ACTGCCTTGA CTACTGGGGC CAAGGCACCA CGGTCACCGT CTCCTCASEQ ID NO：2的信息序列长度：321bp序列类型：核酸分子类型：cDNA序列描述：SEQ ID NO：21 GACATCGAGC TCACTCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACC61 ATGACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTGTAAGT TACATGAACT GGTACCAGCA GAAGTCAGGC121 ACCTCCCCCA AAAGATGGAT TTATGACACA TCCAAACTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC181 TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCGGCAT GGAGGCTGAA241 GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTAACC CATTCACGTT CGGCTCGGGG301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GSEQ ID NO：3的信息序列长度：119个氨基酸残基序列类型：氨基酸分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：31 Q V Q L Q E S G A E L A R P G A S V K M S C K A S G Y T F T31 R Y T M H W V K Q R P G Q G L E W I G Y I N P S R G Y T N Y61 N Q K F K D K A T L T T D K S S S T A Y M E L T R L T S E D91 S A V Y Y C A R Y Y D D H Y C L D Y W G Q G T T V T V S SSEQ ID NO：4的信息序列长度：107个氨基酸残基序列类型：氨基酸分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：41 D I E L T Q S P A I M S A S P G E K V T M T C S A S S S V S31 Y M N W Y Q Q K S G T S P K R W I Y D T S K L A S G V P A R61 F S G S G S G T S Y S L T I S G M E A E D A A T Y Y C Q Q W91 S S N P F T F G S G T K L E L K R
Claims (9)
1、一种抗CD3抗体的重链可变区基因，其具有SEQ ID NO：1的序列。
2、由权利要求1的基因编码的多肽产物，其具有SEQ ID NO：3的序列。
3、一种抗CD3抗体的轻链可变区基因，其具有SEQ ID NO：2的序列。
4、由权利要求3的基因编码的多肽产物，其具有SEQ ID NO：4的序列。
5、一种表达载体，其含有权利要求1的抗CD3抗体的重链可变区基因及权利要求3的抗CD3抗体的轻链可变区基因。
6、如权利要求5的表达载体，其为pCANTABC3scFv。
7、如权利要求5或6的表达载体所表达的多肽产物。
8、权利要求1或3所述的基因在制备诊断和治疗肿瘤的药物中的应用。
9、权利要求1或3所述的基因在制备在器官移植中抑制免疫排斥反应的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20041006 Termination date: 20101130 |