CN110872353A

CN110872353A - 特异性结合pcsk9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110872353A
Application number: CN201811022945.8A
Authority: CN
Inventors: 李新洋; 刘小盼; 张新华; 王媚娘; 黄谧; 杨乃波; 杨爽
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd; Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-09-03
Also published as: CN110872353B

Abstract

一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用。本发明的纳米抗体，包括重链可变区，其由框架区和互补决定区组成，其中互补决定区包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区或者SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所示的互补决定区。本发明的纳米抗体与PCSK9抗原的相互作用良好，能够用于制备抗PCSK9蛋白单抗类药物，还可用于免疫学检测PCSK9抗原。

Description

特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术

心血管疾病严重威胁着人类，是所有人口族群的首要死因。据国家心血管病中心发布的《中国心血管病报告2015》显示，我国心血管病(cardiovascular disease，CVD)现患人数已经高达2.9亿，每年约有350万人死于心血管疾病。目前市面上用于降低胆固醇的药物主要有他汀类(statins)、胆固醇吸收抑制剂、普罗布考等。尽管他汀类药物心血管疾病治疗上表现出色，但随着其广泛使用，可能产生的弊端也渐渐被发现。首先，他汀类治疗患者仍有较高心血管事件残余风险，在2年内发生的风险达22.4％；其次，有大量患者无法耐受他汀类药物，尤其是家族性高胆固醇血症患者，即使接受最大剂量的最有效的他汀类药物治疗，仍然不能达到降低低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoproteincholesterol，LDL-C)浓度的目的；最重要的是，他汀类药物存在多种副作用，如引起患者血糖异常、肌肉毒性、记忆和认知障碍等，副作用的发生率高达20％，严重的副作用会导致横纹肌溶解和急性肾功能衰竭，相当一部分患者因不能忍受副作用带来的肌肉疼痛而终止了治疗。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)，属于枯草蛋白酶亚家族的一种新的前蛋白转化酶，是常染色体显性家族性高胆固醇血症的重要影响因子之一。研究发现，PCSK9除了能影响血浆胆固醇水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前对于PCSK9的研究主要集中在对肝脏脂质代谢的调节功能。前期的研究显示，PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)的降解，调节肝脏脂质代谢，进而影响血浆中低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平。但PCSK9存在两种突变类型，功能获得型突变和功能缺失型突变。族群试验显示，若干PCSK9“获得功能”的突变常发生于体染色体显性高胆固醇血症的个体，而PCSK9“失去功能”的突变则与血浆胆固醇减少有，PCSK9功能缺失型突变个体患冠心病的风险明显降低。2005年，Hobbs等在Dallas Heart Study上报道了携带PCSK9无义突变基因的个体中LDL-C水平会比一般人低28％；在2006，Hobbs等又发表PCSK9基因突变对冠心病的作用，该结果基于一项动脉粥样硬化风险调查，他们对9523个白人和3363个非洲裔美国人进行了长达15年的跟踪观察，发现缺失1个或2个PCSK9功能基因的人群的冠心病的发病率显著低于普通人群。CopenhagenHeart Study发现PCSK9基因的功能性缺失会使LDL-C水平下降11-15％，冠心病患病率下降6-46％。Zimbabwe等报道了PCSK9的缺失突变可使非洲女性的LDL-C水平下降27％。PCSK9抑制剂提供了一种全新的治疗模式来对抗LDL-C，被视为他汀类之后降脂领域取得的最大进步。PCSK9抑制剂的出现，为那些服用他汀类药物时出现严重副作用的患者，及他汀类药物治疗无法达到LDL-C目标水平的患者，如遗传性高胆固醇血症患者带来了福音。

PCSK9抑制剂除了能阻止LDL-R回收，还可以抑制NF-κB通道，从而减少血栓、炎症、血管内皮细胞激活等急性冠状动脉综合症的风险。目前PCSK9抑制剂这个领域潜在的研究项目有抑制蛋白抗体、siRNA、反意寡核苷酸以及小分子抑制剂等。单克隆抗体药物因具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，是目前PCSK9抑制剂研究的主要领域。在动物水平的研究显示，加入中和抗PCSK9的抗体之后，小鼠肝脏中的LDL-R表达水平显著上升，血液中LDL-C浓度下降30％。对灵长类动物，PCSK9单克隆抗体也表现出显著的效果，LDL-C水平的下降效果可维持数周以上。到目前为止，还没有发现抗PCSK9蛋白单抗类药物有比较明显的毒副作用，只有报道称出现过局部注射反应、腹泻和头疼等较轻微的副作用。赛诺菲的Praluent(Alirocumab)和安进的Repatha(evolocumab)是目前全球市场仅有的二个获批的人源化的PCSK9抗体。根据汤森路透对2015年获批药物潜力销售排行榜，到2019年前者的销售规模将达到44.14亿美元，而后者的销售规模将会达到18.62亿美元。我国CVD患者众多，在2015年统计的结果显示，CVD患人数已经高达2.9亿，每年约有350万人死于心血管疾病，然而我国在PCSK9抑制剂领域的研究却严重滞后，完全不能满足CVD患者的需求。

抗体药物是目前新药研发的主要方向，在传染病的诊断、防治和生物科学研究领域都已得到了广泛的应用。到2015年截止，已经有48个抗体药物成功上市，仅2014年4月至2015年3月期间就有7个抗体药物成功获批。2015年全球销售排名前10的药物中有6个都为抗体药物。自1993年Hamers等在骆驼血液中发现了天然缺失轻链和恒定区I(CH1)区的重链抗体后，重链抗体的可变区区段又称为纳米抗体(Nanobody,Nb)逐渐取代其他的小型抗体，成为新型抗体药物研发的热点。Nb通常只有15KDa左右，约传统抗体大小的十分之一，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH有较强的抵抗力；Nb缺乏Fc段和轻链的性质使其能够识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位，且避免了补体反应；此外，纳米抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选，和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。序列同源性分析显示，骆驼Nb的VHH胚系基因序列和人VH3高度同源，但CDR1和CDR3比人稍长，CDR3在三级结构中向外凸出，因而推测有更高的抗原结合的特异性和亲和力。鉴于以上优点，Nb正被逐步开发为疾病诊断和治疗方面的单抗药物，广泛的应用与酶的抑制剂，肿瘤、感染和炎症等生物抑制剂的开发上。然而，纳米抗体微小的体积虽为其治疗功能提供了很多的优势，但小分子蛋白在体内极容易被消除。通过基因工程将Nb改造成靶点酶、跨膜蛋白或者双价化能够有效的提高抗体活力和稳定性等，以达到研究目的。在对抑制病毒复制的研究中发现，双价纳米抗体的有效性至少是单价纳米抗体的60倍，并且在动物体内作用时间更长，有效的延迟了动物的死亡时间。抗体药物的前景巨大，但国内抗体药物仍然处于起步阶段。因此，开发国产化PCSK9抗体抑制剂，满足我国国民对于抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。

现有技术对于PCSK9纳米抗体的开发集中在鼠源传统抗体，传统抗体无论是大量表达，还是进行抗体人源化都比较困难，耗时长，花费高，并且有效抗体获得率低，严重限制了PCSK9抗体抑制剂的开发，特别是国内抗体药物刚刚处于起步阶段，完全不能满足CVD患者的需求。

发明内容

本发明提供一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用。

根据第一方面，一种实施例中提供一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，包括重链可变区(VHH)，上述重链可变区(VHH)由框架区(FR)和互补决定区(CDR)组成，其中上述互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为GYRGQKIC(SEQ ID NO：1)；互补决定区2(CDR2)，其序列为ILPRGPNT(SEQ ID NO：2)；互补决定区3(CDR3)，其序列为CAQGWGGASDWALQPRRYNY(SEQ ID NO：3)；或者

上述互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为RYTDRTRC(SEQ ID NO：4)；互补决定区2(CDR2)，其序列为LDRAGGQS(SEQ ID NO：5)；互补决定区3(CDR3)，其序列为AAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFAN(SEQ ID NO：6)。

优选地，上述重链可变区(VHH)的序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

根据第二方面，一种实施例中提供一种编码第一方面的纳米抗体的多核苷酸序列，包括编码上述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区的核苷酸序列；或者编码上述SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所示的互补决定区的核苷酸序列。

优选地，上述多核苷酸序列包括编码上述SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的重链可变区(VHH)的核苷酸序列。

优选地，上述多核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

根据第三方面，一种实施例中提供一种表达载体，含有第二方面的多核苷酸序列。

根据第四方面，一种实施例中提供一种宿主细胞，含有第三方面的表达载体，能够表达出特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体。

根据第五方面，一种实施例中提供一种药物组合物，包含第一方面的纳米抗体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

根据第六方面，一种实施例中提供一种制备第一方面的纳米抗体的方法，包括：将包含第二方面的多核苷酸序列的表达载体转化至表达宿主细胞中，培养，进行上述纳米抗体的大量表达和纯化；优选地，上述表达载体是pMECS质粒，上述宿主细胞是大肠杆菌HB2151菌株。

根据第七方面，一种实施例中提供第一方面的纳米抗体在制备抗PCSK9蛋白单抗类药物中的用途，或在非疾病诊断治疗目的免疫学检测PCSK9中的用途。

本发明利用真核表达的PCSK9抗原免疫骆驼，通过流式分选亲和淋巴细胞，获得高质量的PCSK9免疫纳米抗体文库。将PCSK9抗原包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选PCSK9免疫纳米抗体文库，再将筛选出的纳米抗体转化至大肠杆菌表达系统中进行大量表达，从而能够在比较短的时间里获得具有高亲和力的PCSK9的单克隆纳米抗体株。

附图说明

图1为本发明实施例中ELISA验证纳米抗体与抗原的结合活性结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本发明首先利用CHO细胞(中华仓鼠卵巢细胞)表达的PCSK9抗原免疫骆驼，分离免疫后的骆驼外周血细胞(PBMC)，从中扩增出针对PCSK9抗原的重链可变区(VHH)文库，删除多余的背景干扰，大大的提高了有效抗体的获得效率。其次本发明结合使用了噬菌体展示技术，能够比较直观的获得抗体亲和信息，在较短时间内获得了高亲和力的PCSK9的纳米抗体基因。此外，本发明提供了上述PCSK9纳米抗体的制备方案，由于pMECS(噬菌体展示载体)在HA标签和M13GIII基因之间为琥珀终止子(TAG)，普通的表达系统如BL21大肠杆菌(pET载体)不能有效识别该终止子，因此不能有效表达纳米抗体蛋白。本发明使用的是HB2151大肠杆菌(pMECS载体)表达系统，可以能有效识别。我们使用这原核表达系统，对PCSK9纳米抗体进行了大量表达和纯化，该纳米抗体经ELISA和ProteOn系统验证具有靶向PCSK9的高特异性和高亲和性，表明本发明得到的PCSK9纳米抗体具有继续开发价值。

采用CHO细胞中表达的PCSK9抗原免疫骆驼，采集免疫后的骆驼的外周血细胞(PBMC)，从中分离PCSK9的亲和淋巴细胞，提取总RNA，采用Nest-PCR技术克隆骆驼重链抗体的可变区(V区)，将其插入到噬菌体质粒中，构建噬菌体表达文库，接着通过噬菌体展示技术对PCSK9抗原进行多轮筛选，最后将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量表达纯化，并经过ELISA和ProteOn对所获得的纳米抗体的亲和力和结合常数进行验证。

在本发明一个实施例中，特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体VHH01，其氨基酸序列为：DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCVVSGYRGQKICTGWFRQFPGMEREAVARILPRGPNTQYTDSVKGRFTISQDAAKNTVNLQMSSLKPKDTAMYYCAQGWGGASDWALQPRRYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：7)。其中，框架区1的序列为DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCVVS(SEQ ID NO：11)，框架区2的序列为TGWFRQFPGMEREAVAR(SEQ ID NO：12)，框架区3的序列为QYTDSVKGRFTISQDAAKNTVNLQMSSLKPKDTAMYY(SEQ ID NO：13)，框架区4的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：14)，互补决定区1的序列为GYRGQKIC(SEQ ID NO：1)，互补决定区2的序列为ILPRGPNT(SEQ ID NO：2)，互补决定区3的序列为CAQGWGGASDWALQPRRYNY(SEQ ID NO：3)。

众所周知，抗体的特异性结合特性由互补决定区决定。因此，本发明一个技术方案要求保护一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，其包括重链可变区(VHH)，上述重链可变区(VHH)由框架区(FR)和互补决定区(CDR)组成，其中上述互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为GYRGQKIC(SEQ ID NO：1)；互补决定区2(CDR2)，其序列为ILPRGPNT(SEQ ID NO：2)；互补决定区3(CDR3)，其序列为CAQGWGGASDWALQPRRYNY(SEQ ID NO：3)。在优选的技术方案中，一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，其重链可变区(VHH)的序列如SEQ ID NO：7所示。

在本发明一个实施例中，编码PCSK9纳米抗体VHH01的核苷酸序列为：

5’-GACGTGCAGCTGGTTGAGAGCGGTGGCGGTAGCGTGCAAGCGGGCGGTAGCCTGAC CCTGAGCTGCGTGGTTAGCGGCTACCGTGGTCAGAAGATCTGCACCGGCTGGTTCCGTCAATTTCCGGGTATGGAGCGTGAAGCGGTTGCGCGTATTCTGCCGCGTGGTCCGAACACCCAGTATACCGACAGCGTGAAGGGTCGTTTCACCATCAGCCAGGATGCGGCGAAAAACACCGTTAACCTGCAAATGAGCAGCCTGAAGCCGAAAGACACCGCGATGTACTATTGCGCGCAGGGTTGGGGCGGTGCGAGCGATTGGGCGCTGCAACCGCGTCGTTACAACTATTGGGGCCAGGGTACCCAAGTGACCGTTAGCAGCG-3’(SEQ ID NO：9)。

然而，考虑到编码基因的简并性，并同时考虑到抗体的特异性结合特性由互补决定区决定。因此，本发明一个技术方案要求保护一种编码PCSK9纳米抗体VHH01的多核苷酸序列，包括编码上述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区的核苷酸序列。这样的多核苷酸序列，由于编码基因的简并性，碱基序列可以变化，只要是能够编码SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区即可。在优选的技术方案中，多核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在本发明一个实施例中，特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体VHH3A5，其氨基酸序列为：PGAAAGVGGGSVQAGGSLRLSCAASRYTDRTRCIAWFRQVPGKEREGVACLDRAGGQSAYADSAKGRFTVSQDNAGNTVYLQMDNLIPEDSAMYYCAAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFANWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：8)。其中，框架区1的序列为PGAAAGVGGGSVQAGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：15)，框架区2的序列为IAWFRQVPGKEREGVAC(SEQ ID NO：16)，框架区3的序列为AYADSAKGRFTVSQDNAGNTVYLQMDNLIPEDSAMYYC(SEQ ID NO：17)，框架区4的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：18)，互补决定区1的序列为RYTDRTRC(SEQ ID NO：4)，互补决定区2的序列为LDRAGGQS(SEQ ID NO：5)，互补决定区3的序列为AAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFAN(SEQ ID NO：6)。

众所周知，抗体的特异性结合特性由互补决定区决定。因此，本发明一个技术方案要求保护一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，其包括重链可变区(VHH)，上述重链可变区(VHH)由框架区(FR)和互补决定区(CDR)组成，其中互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为RYTDRTRC(SEQ ID NO：4)；互补决定区2(CDR2)，其序列为LDRAGGQS(SEQID NO：5)；互补决定区3(CDR3)，其序列为AAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFAN(SEQ ID NO：6)。在优选的技术方案中，一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，其重链可变区(VHH)的序列如SEQID NO：8所示。

在本发明一个实施例中，编码PCSK9纳米抗体VHH3A5的核苷酸序列为：

5’-CCAGGTGCAGCTGCAGGAGTTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTAGATACACCGACAGGACCCGTTGCATAGCCTGGTTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGTGTTTAGATCGTGCTGGCGGTCAATCCGCTTATGCCGACTCCGCGAAGGGCCGATTCACTGTTTCCCAAGACAACGCCGGAAACACGGTGTATCTGCAAATGGACAACCTGATACCCGAGGACAGCGCCATGTACTACTGTGCGGCAGCGGGGGTTGGCCAGTGGTATACTTGTCTTCAGAAATTTATCCGTGACAAGCGATCGTTCGCCAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAG-3’(SEQ ID NO：10)。

然而，考虑到编码基因的简并性，并同时考虑到抗体的特异性结合特性由互补决定区决定。因此，本发明一个技术方案要求保护一种编码PCSK9纳米抗体VHH3A5的多核苷酸序列，包括编码SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所示的互补决定区的核苷酸序列。这样的多核苷酸序列，由于编码基因的简并性，碱基序列可以变化，只要是能够编码SEQ ID NO：4至SEQID NO：6所示的互补决定区即可。在优选的技术方案中，多核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在本发明一个实施例中，提供一种表达载体，含有本发明的多核苷酸序列。本领域技术人员知晓，在本发明的思想下，pCYT或pMG36e、pPICZα或pCDNA系列等载体等均可作为本发明的多核苷酸序列的表达载体。在一个优选实施例中，表达载体是噬菌体展示载体pMECS。

在本发明一个实施例中，提供一种宿主细胞，含有本发明的表达载体，能够表达出特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体。本领域技术人员知晓，在本发明的思想下，众多细胞如乳酸菌、酵母菌、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物动物细胞HEK293F等均可作为本发明的表达载体的宿主细胞。在一个优选实施例中，宿主细胞是大肠杆菌HB2151菌株。

在本发明一个实施例中，提供一种药物组合物，包含本发明的纳米抗体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的方法来制备(例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,19th ed.(1995),A.Gennaro等人,Mack PublishingCo.)，且包含如本发明所公开的纳米抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在本发明一个实施例中，提供一种制备本发明的纳米抗体的方法，包括：将包含本发明的多核苷酸序列的表达载体转化至表达宿主细胞中，培养，进行上述纳米抗体的大量表达和纯化。在一个优选实施例中，表达载体是噬菌体展示载体pMECS质粒，宿主细胞是大肠杆菌HB2151菌株。

本发明的纳米抗体能够用于制备抗PCSK9蛋白单抗类药物，还可用于免疫学检测PCSK9。因此，在本发明一个实施例中，提供本发明的纳米抗体在制备抗PCSK9蛋白单抗类药物中的用途，或在非疾病诊断治疗目的免疫学检测PCSK9中的用途。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1 PCSK9纳米抗体噬菌体展示文库构建

(1)PCSK9免疫骆驼

将1mg的PCSK9与等体积的弗氏佐剂混合至5ml，注射于骆驼颈部皮下3-5点，免疫前从骆驼的耳缘静脉采血。每月免疫一次，共免疫注射4次；每次免疫时，采取骆驼外周血10ml。采血时将骆驼头向一侧固定，对动物采血部位的皮肤先剃毛(拔毛)，75％酒精消毒，待干燥后采血，用手指压迫颈静脉沟处，待血管怒张后，于采血部位消毒进针采血，采集血液10ml于15ml EDTA抗凝管中，立即连续、缓慢摇动，充分混合，置于冰上，运回实验室。

(2)血液淋巴细胞样品分离

对免疫前和每次免疫后采集的血液样本分离淋巴细胞，分离方法如下：

i.在15ml离心管中加入7ml淋巴细胞分离液Ficoll；

ii.在已加入抗凝剂(EDTA)的新鲜全血中加入等体积PBS(1×)或生理盐水，充分混匀；

iii.取加淋巴细胞分离液的15ml离心管，小心地缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的15ml离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上(即两种液体不要混合，保留清晰的界面)，3000g离心20min；

iv.用1ml移液枪将上清(血浆样品)小心转移到1.5ml细胞冻存管中，写上动物编号和血浆字样，放入带绳小布袋中，置液氮罐保存；

v.用1ml移液枪小心分离出白细胞层到一个15ml离心管中；加满PBS(1×)到15ml；用PBS(1×)清洗白细胞，离心(3000g离心20min)，小心倾倒掉上清，不要搅动管底的细胞团块，回收白细胞在剩余0.1-0.2ml PBS中；

vi.加5倍体积的RNA later，轻轻混溶细胞团块，分成2份到1.5ml细胞冻存管中，置液氮罐保存。

(3)总RNA提取及cDNA合成

取一份冻存的淋巴细胞，加入1ml Trizol，室温静置10min后，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，室温静置，待溶液分层(约10min)，12,000rpm离心后，收集上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，待核酸沉淀，高速离心去上清，RNA沉淀加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)进行洗涤，高速离心去上清，控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μl用于浓度和纯度测定；

取1μg RNA，采用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)试剂盒进行cDNA合成，逆转录引物用Oligo dT，合成cDNA在-20℃冻存。

(4)噬菌体展示文库构建

PCR扩增：以上述合成的cDNA为模板，采用Nest-PCR扩增骆驼重链抗体的V区(VHH)，表1为Nest-PCR引物的名称及序列。

表1骆驼VHH片段扩增使用的引物信息

PCR反应体系如下：

第一轮：cDNA 2μL；2*Master Mix(QIAGEN公司)12.5μL；CALL001 0.5μL；CALL0020.5μL；CALL005 0.5μL；CALL006 0.5μL；水补足至25μL。

反应条件：95℃5min；94℃1min；57℃1min；72℃1min每个循环；72℃7min；扩增35个循环。

第二轮：模板(第一轮产物)40ng；2*Master Mix 25μL；VHH-For(10μM)1μL；VHH-Back(10μM)1μL；水补足至50μL。

反应条件：95℃5min；94℃45s；60℃45s；72℃45s每个循环；72℃7min扩增25个循环。

PCR反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，切胶回收目的条带，进行第二轮PCR，目的基因片段在500bp处，切胶回收目的条带，即VHH片段。

用NEB的限制性内切酶NotI和PstI分别对VHH片段和载体(pMECS质粒，比利时布鲁塞尔自由大学Serge Muyldermans教授馈赠)进行双酶切，反应体系如下：

载体酶切体系：载体20μg；PstI 10μl；NotI 20μl；Cutsmart(buffer，NEB公司)50μl；加H₂O至500μl。

片段酶切体系：VHH片段5μg；PstI 7μl；NotI 14μl；Cutsmart(buffer)50μl；加H₂O至500μl。

37℃，酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收；将载体和VHH片段的酶切产物混合，用NEB的连接酶在16℃连接过夜。

(5)噬菌体展示库的构建

连接产物经PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化后，取1μl转化TG感受态细胞，37℃复苏2h，梯度稀释至10¹，10²，10³，分别取300μl涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数，约10⁵个克隆/平板。

采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到10⁷以上。将所有克隆用LB洗脱下，5,000g，离心5min，沉淀用2ml LB悬浮，加入等体积的30％甘油，-80冻存。

(6)文库多样性检测

随机挑取步骤(5)的克隆30个，作为模板，进行克隆PCR反应，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证构建的PCSK9纳米抗体文库的重组率。然后对其测序，分析PCSK9纳米抗体文库的多样性，测序结果显示，15个单克隆有13种氨基酸序列，表明构建的文库有较好的多样性。

(7)噬菌体扩增和拯救

采用辅助噬菌体对PCSK9纳米抗体的噬菌体库进行扩增和拯救。将步骤(5)保存的单克隆文库接入100ml培养基中培养至对数生长期，加入MOI(multiplicity ofinfection，感染复数)为20的辅助噬菌体M13(比利时布鲁塞尔自由大学SergeMuyldermans教授馈赠)，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300ml培养基中，培养过夜。次日，3,000离心30min，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置30min，3,000离心30min，沉淀为PCSK9纳米抗体噬菌体库，用PBS悬浮沉淀后，测定其滴度为2.9X10¹²pfu/ml。

实施例2用噬菌体展示技术淘洗PCSK9纳米抗体

(1)亲和PCSK9纳米抗体噬菌体库淘洗

取100ng PCSK9抗原包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，加入拯救出的PCSK9纳米抗体噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗孔10次，加入100μl三乙胺，室温，孵育30min，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的PCSK9纳米抗体噬菌体库；取10μl感染TG细胞涂布平板，用于测定筛选后的克隆数测定，剩余筛选后的噬菌体的用于扩增。

(2)筛选后噬菌体的扩增和拯救

扩增和拯救方法同实施例1中步骤(7)，获得的PBS悬浮液即扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选；按上述相同筛选步骤，逐次递减抗原量，筛选3-4轮。

(3)ELISA评价特异性抗体的富集程度

ELISA板包被100ng的PCSK9抗原，4℃，过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；实验组分别加入每轮淘洗后扩增的噬菌体，对照组加入等量野生型的噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗10次，以去除没有结合的噬菌体；加入HRP标记的抗M13抗体，室温孵育1h；加入显色液，避光反应10-30min，测吸光值，吸光值随着淘洗次数逐渐上升，并在第三轮到第四轮淘洗时趋于稳定，表明特异性的抗体得到了富集。

(4)鉴定PCSK9特异性的纳米抗体阳性克隆

ELISA板包被100ng的PCSK9抗原，4℃孵育过夜；取最后一轮筛选获得的噬菌体涂布的平板，随机挑取38个单克隆于1ml培养基中，37℃，培养至对数期，加入1mM IPTG诱导过夜；次日，离心收集菌沉，破碎后，5,000g离心15min，收集上清；同时取ELISA板，加2％的BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆破碎上清，对照组加入空白TG破碎上清，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值；当吸光值与对照孔比值大于2.1(Base line)时，判定为阳性克隆。

(5)阳性克隆序列分析

提取步骤(4)中获得的30个阳性克隆的DNA对插入片段进行PCR验证，经PCR验证为阳性的克隆进行测序分析。测序结果显示，获得两种核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中一种序列具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这2株纳米抗体单克隆的核苷酸和氨基酸序列如下：

PCSK9纳米抗体蛋白VHH01，其氨基酸序列为：DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCVVSGYRGQKICTGWFRQFPGMEREAVARILPRGPNTQYTDSVKGRFTISQDAAKNTVNLQMSSLKPKDTAMYYCAQGWGGASDWALQPRRYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：7)。其中，框架区1的序列为DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCVVS(SEQ ID NO：11)，框架区2的序列为TGWFRQFPGMEREAVAR(SEQID NO：12)，框架区3的序列为QYTDSVKGRFTISQDAAKNTVNLQMSSLKPKDTAMYY(SEQ ID NO：13)，框架区4的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：14)，互补决定区1的序列为GYRGQKIC(SEQ IDNO：1)，互补决定区2的序列为ILPRGPNT(SEQ ID NO：2)，互补决定区3的序列为CAQGWGGASDWALQPRRYNY(SEQ ID NO：3)。

编码PCSK9纳米抗体蛋白VHH01的核苷酸序列为：

PCSK9纳米抗体蛋白VHH3A5，其氨基酸序列为：PGAAAGVGGGSVQAGGSLRLSCAASRYTDRTRCIAWFRQVPGKEREGVACLDRAGGQSAYADSAKGRFTVSQDNAGNTVYLQMDNLIPEDSAMYYCAAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFANWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：8)。其中，框架区1的序列为PGAAAGVGGGSVQAGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：15)，框架区2的序列为IAWFRQVPGKEREGVAC(SEQID NO：16)，框架区3的序列为AYADSAKGRFTVSQDNAGNTVYLQMDNLIPEDSAMYYC(SEQ ID NO：17)，框架区4的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：18)，互补决定区1的序列为RYTDRTRC(SEQID NO：4)，互补决定区2的序列为LDRAGGQS(SEQ ID NO：5)，互补决定区3的序列为AAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFAN(SEQ ID NO：6)。

编码PCSK9纳米抗体蛋白VHH3A5的核苷酸序列为：

实施例3 PCSK9纳米抗体的诱导表达和纯化

(1)PCSK9纳米抗体表达菌构建

首先将PCSK9纳米抗体单克隆转接培养基，37℃，过夜培养；次日，用

Plasmid Mini Kit I(OMEGA)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳并测定浓度后，将含有PCSK9纳米抗体序列的质粒转化入表达菌HB2151中，涂布平板，37℃，培养过夜。

(2)PCSK9纳米抗体的诱导表达

次日，从平板挑取5个克隆进行克隆PCR验证质粒是否转入表达菌株；挑取阳性克隆37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG进行诱导表达。离心菌液，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体，离心收集破碎后的菌体上清。

(3)PCSK9纳米抗体的纯化

通过Ni柱亲和纯化获得PCSK9纳米抗体。Ni柱先用超纯水清洗，然后用裂解液清洗；将上述PCSK9纳米抗体表达菌的破碎上清以1ml/min的流速加入Ni柱；用5倍柱体积的亲和A液(20mM咪唑)洗去杂蛋白，再用等体积的亲和B液(250mM咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液；最后15％的SDS-PAGE监测PCSK9纳米抗体的表达和纯化情况。

实施例4 PCSK9纳米抗体的亲和力测定

(1)ELISA法分析PCSK9纳米抗体的亲和力

实验组以100ng的PCSK9蛋白，对照组用未诱导的质粒表达的蛋白和BSA包被酶标板，4℃孵育过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；取纯化的PCSK9纳米抗体分别加入对照组和实验组，空白组加入PBS，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值。ELISA检测结果(图1)显示，两种纳米抗体对PCSK9具有较好的亲和力，结合活性远远高于对照组。

(2)ProteOn分析PCSK9纳米抗体的结合常数

活化芯片后，加入500nM的PCSK9抗原进行反应；加入150μl的1M乙醇胺盐酸洗掉残留的活性羧基基团；将PCSK9纳米抗体进行梯度稀释后加入360μl，速率为25μl/min，结合120s，解离400s；获得数据后，进行结果处理，结果显示，纳米抗体VHH01与抗原PCSK9相互作用的参数分别是，K_a(1/Ms)为5.89E+03，K_d(1/s)为1.71E-03，R_max(RU)为311.86，表示抗体的结合位点被抗原占领时的信号强度，K_D(M)为2.90E-07为抗原抗体相互作用的解离常数；纳米抗体VHH3A5与抗原PCSK9相互作用的参数分别是，K_a(1/Ms)为2.19E+04，K_d(1/s)为1.49E-03，R_max(RU)为85.30，表示抗体的结合位点被抗原占领时的信号强度，K_D(M)为6.81E-08为抗原抗体相互作用的解离常数，表明这两个纳米抗体与PCSK9抗原的相互作用良好，具有继续开发的价值。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因科技有限公司，深圳华大生命科学研究院

<120> 特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用

<130> 18I26795

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 1

Gly Tyr Arg Gly Gln Lys Ile Cys

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 2

Ile Leu Pro Arg Gly Pro Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 3

Cys Ala Gln Gly Trp Gly Gly Ala Ser Asp Trp Ala Leu Gln Pro Arg

1 5 10 15

Arg Tyr Asn Tyr

20

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 4

Arg Tyr Thr Asp Arg Thr Arg Cys

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 5

Leu Asp Arg Ala Gly Gly Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 6

Ala Ala Ala Gly Val Gly Gln Trp Tyr Thr Cys Leu Gln Lys Phe Ile

1 5 10 15

Arg Asp Lys Arg Ser Phe Ala Asn

20

<210> 7

<211> 126

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 7

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Arg Gly Gln Lys Ile

20 25 30

Cys Thr Gly Trp Phe Arg Gln Phe Pro Gly Met Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Arg Ile Leu Pro Arg Gly Pro Asn Thr Gln Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ala Ala Lys Asn Thr Val Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Lys Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Gly Trp Gly Gly Ala Ser Asp Trp Ala Leu Gln Pro Arg Arg

100 105 110

Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 131

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 8

Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Thr Asp Arg Thr Arg

20 25 30

Cys Ile Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Leu Asp Arg Ala Gly Gly Gln Ser Ala Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Gln Asp Asn Ala Gly Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Asn Leu Ile Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Gly Val Gly Gln Trp Tyr Thr Cys Leu Gln Lys Phe Ile

100 105 110

Arg Asp Lys Arg Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 9

<211> 379

<212> DNA

<213> 骆驼

<400> 9

gacgtgcagc tggttgagag cggtggcggt agcgtgcaag cgggcggtag cctgaccctg 60

agctgcgtgg ttagcggcta ccgtggtcag aagatctgca ccggctggtt ccgtcaattt 120

ccgggtatgg agcgtgaagc ggttgcgcgt attctgccgc gtggtccgaa cacccagtat 180

accgacagcg tgaagggtcg tttcaccatc agccaggatg cggcgaaaaa caccgttaac 240

ctgcaaatga gcagcctgaa gccgaaagac accgcgatgt actattgcgc gcagggttgg 300

ggcggtgcga gcgattgggc gctgcaaccg cgtcgttaca actattgggg ccagggtacc 360

caagtgaccg ttagcagcg 379

<210> 10

<211> 394

<212> DNA

<213> 骆驼

<400> 10

ccaggtgcag ctgcaggagt tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctagata caccgacagg acccgttgca tagcctggtt ccgccaagtt 120

ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcgtgt ttagatcgtg ctggcggtca atccgcttat 180

gccgactccg cgaagggccg attcactgtt tcccaagaca acgccggaaa cacggtgtat 240

ctgcaaatgg acaacctgat acccgaggac agcgccatgt actactgtgc ggcagcgggg 300

gttggccagt ggtatacttg tcttcagaaa tttatccgtg acaagcgatc gttcgccaac 360

tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tcag 394

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 11

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser

20 25

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 12

Thr Gly Trp Phe Arg Gln Phe Pro Gly Met Glu Arg Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Arg

<210> 13

<211> 37

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 13

Gln Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ala

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Asn Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr

35

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 15

Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 16

Ile Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Cys

<210> 17

<211> 38

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 17

Ala Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Gly Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Ile Pro Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 骆驼

<400> 18

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 19

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 20

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 21

tggtggcagg tccccaaggt 20

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 22

ttcttggtgg cagtagccgc agt 23

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 23

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 24

ctagtgcggc cgctggagac ggtgacctgg gt 32

Claims

1. 一种特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括重链可变区（VHH），所述重链可变区（VHH）由框架区（FR）和互补决定区（CDR）组成，其中所述互补决定区（CDR）包括互补决定区1（CDR1），其序列为GYRGQKIC（SEQ ID NO：1）；互补决定区2（CDR2），其序列为ILPRGPNT（SEQ ID NO：2）；互补决定区3（CDR3），其序列为CAQGWGGASDWALQPRRYNY（SEQ ID NO：3）；或者

所述互补决定区（CDR）包括互补决定区1（CDR1），其序列为RYTDRTRC（SEQ ID NO：4）；互补决定区2（CDR2），其序列为LDRAGGQS（SEQ ID NO：5）；互补决定区3（CDR3），其序列为AAAGVGQWYTCLQKFIRDKRSFAN（SEQ ID NO：6）。

2. 根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述重链可变区（VHH）的序列如SEQID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

3. 一种编码权利要求1或2所述的纳米抗体的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列包括编码所述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区的核苷酸序列；或者编码所述SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所示的互补决定区的核苷酸序列。

4. 根据权利要求3所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列包括编码所述SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的重链可变区（VHH）的核苷酸序列。

5. 根据权利要求3或4所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3-5任一项所述的多核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，能够表达出特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的纳米抗体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.一种制备权利要求1或2所述的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：将包含权利要求3-5任一项所述的多核苷酸序列的表达载体转化至表达宿主细胞中，培养，进行所述纳米抗体的大量表达和纯化；

优选地，所述表达载体是pMECS质粒，所述宿主细胞是大肠杆菌HB2151菌株。

10.权利要求1或2所述的纳米抗体在制备抗PCSK9蛋白单抗类药物中的用途，或在非疾病诊断治疗目的免疫学检测PCSK9中的用途。