JP2003518391A - エピトープに結合可能な蛋白質の変異体のライブラリーから発達した結合メンバーを選抜するために天然型エピトープを使用する方法 - Google Patents

エピトープに結合可能な蛋白質の変異体のライブラリーから発達した結合メンバーを選抜するために天然型エピトープを使用する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、蛋白性分子のライブラリーから少なくとも一つのメンバーを選抜する方法を提供するものであって、本方法は、少なくとも一つの細胞及び／又はその機能同等物に、その様な任意のメンバーが前記細胞及び／又は前記その機能同等物の中で及び／又はその上のエピトープへ結合することを許す条件下で、前記ライブラリーの少なくとも一部分を提供し、結合しない蛋白性分子を除去し、そして前記少なくとも一つのメンバーを選抜する過程からなる方法であって、前記ライブラリーは前記エピトープへ結合することが可能である蛋白性分子の少なくとも一つの変異体からなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、バイオテクノロジ−の分野に関する。より特異的には、本発明は抗
体とその使用方法の分野に関する。その様な使用方法の１つは、抗体の医学的使
用方法に関する。
【０００２】 多様性が高く、かつ継続的に変化している環境にさらされることは、潜在的に
有害な微生物に適切に反応するために、迅速に適応できる動的な免疫システムを
必要とする。高等生物は特殊化された分子機構を発展させて、クローン的に分散
して高度に多様化した、免疫システムの細胞によって発現された抗体−受容体分
子レパートリーの推進を保証し、それらにはBリンパ球上の免疫グロブリン（Ig
）分子およびＴリンパ球上のＴ細胞受容体がある。Bリンパ球のために、生殖細
胞系によりコードされた遺伝子断片の再配列（rearrangement）の結果として、
骨髄中におけるB細胞分化の間に、イムノグロブリン受容体の初期レパートリー
（一般的に低親和性）が確立される。免疫グロブリン受容体の特異性と親和性の
更なる改良は末梢のリンパ器官において起こり、そこで抗原によって刺激された
Bリンパ球は、免疫グロブリン可変（Ｖ）領域を特異的に標的とする身体の超変
異機構（somatic hypermutation machinery）を活性化する。この過程の間に、
抗原を刺激するための親和性が高くなった変異した免疫グロブリン受容体を有す
るB細胞クローンは刺激され、クローン性増殖及び抗体を分泌している形質細胞
への成熟を行う（１において総説されている）。
【０００３】 近年組み換えDNA技術は、天然のヒト抗体レパートリーの生成と選抜を支配し
ているプロセスの多くの観点を模倣するために使用されてきた（２、３において
総説されている）。線維状ファージ微粒子の表層上に発現した抗体断片の大きな
レパートリーの構築、及び抗原上でパニングすることによるファージの選抜は、
望みの特異性を有する抗体を得るための、用途が広くかつ迅速な方法として開発
されてきた（４、５において総説されている）。個々のファージ抗体の親和性を
更に最適化することは、変異抗体のレパートリーを作成することによって達成さ
れてきたが、そのレパートリーは、バクテリオファージ微粒子上に発現し、かつ
ストリンジェントな条件下で抗原に結合するための親和性がより高い変異体につ
いてサンプリングされた（６において総説されている）。変異した抗体レパート
リーを作成するために種々のアプローチが用いられており、それにはチェインシ
ャフリング（７、８）、エラープローンPCR（９）、大腸菌変異株の使用（１０
）、又はCDRウォーキング及び倹約的突然変異誘発（parsimonious mutagenesis
）の様な抗体分子の相補性決定領域（CDRs）に対してより特異的に指向したアプ
ローチが含まれる。
【０００４】 ファージに提示され、突然変異を起した抗体断片のライブラリーから、より親
和性が高い変異体を選抜するために、精製されて固定化された抗原上又はビオチ
ン化された抗原の溶液中で選抜が行われ、引き続いてストレプトアビジンの磁性
ビーズ上に結合したファージの捕獲を行った（１４−１６）。c-erb-2抗原に特
異的である、より高親和性の一本鎖Fv抗体断片（scFv）を、そのscFvの変異体ラ
イブラリーから選抜することは、溶液中において精製された抗原を入手できるか
という点に依存すると示されてきた。固相上に捕獲された抗原は、ファージ上で
scFvが二量体化及びオリゴマー体化することにより、親和性（affinity）という
よりむしろより高い結合活性（avidity）を有する、偽の陽性物を単離する結果
となる。加えて、親和性がより高いscFvを単離するためには、注意深く制御され
、かつ溶液中での抗原濃度をより低下させた中で、引き続いて数ラウンドのファ
ージ選抜を行うことがとても重要であるということが示された（１４）。非常に
高親和性のscFvがこれらのアプローチで単離されてきたけれども、標的抗原を組
み換え分子として発現することが困難であるか、又はその天然型のコンフィギュ
レーションを失うことなく十分な量を精製することが退屈な時には、それらを容
易に適用することはできない。この様な型の分子の例には、７回膜貫通型蛋白質
、不溶性の脂質修飾された膜分子、及び特定の細胞型又は病態に特異的に翻訳後
修飾された蛋白性分子がある。そこで、親和性がより高い変異体抗体断片の選抜
手法は、精製された抗原を必要とすることがない、ファージに提示された抗体の
ための、親和性を成熟させる戦略の重要な拡張を提唱するであろう。
【０００５】 一つの観点において本発明は今、蛋白性分子のライブラリーから少なくとも一
つのメンバーを選抜する方法を提供するものであって、本方法は、細胞及び／又
はその機能同等物に、任意のメンバーが前記細胞及び／又は前記その機能同等物
の中で及び／又はその上のエピトープへ結合することを許す条件下で、前記ライ
ブラリーの少なくとも一部分を提供し、結合しない蛋白性分子を除去し、そして
前記メンバーを選抜する過程からなる方法であって、前記ライブラリーは前記エ
ピトープへ結合することが可能である蛋白性分子の少なくとも一つの変異体から
なる。変異体は好ましくは、ポシティブ又はネガティブな方法において、変異し
ていない蛋白性分子と比較して、その変異体が前記エピトープに結合する能力に
影響する一つ又はそれ以上の変異を備える。その能力は変化した結合親和性又は
変化した解離定数、又はそれら両者によって影響されるかもしれない。
【０００６】 ライブラリーのメンバーは、前記ライブラリー中に存在している蛋白性の分子
及び／又は前記ライブラリーから選抜された蛋白性の分子である。選抜されたメ
ンバーは典型的には前記エピトープに結合する能力を備える。一度選抜及び特性
解析されたら、メンバーを他の方法によっても作成することもあり、これに限定
されるものではないが、例えばペプチド合成又は前記蛋白性分子をコードしてい
る核酸を発現させることにより、分子生物学的な技術を通じて人工的に作成する
ことができる。蛋白性分子はペプチド、ポリペプチド、又は蛋白質である。ペプ
チドは、ペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸の列である。正確に定義
されてはいないが、ペプチドは典型的には２から５０個の間のアミノ酸からなる
。ポリペプチドは数千ものペプチド結合で連結されたアミノ酸を含むことがある
、より長いペプチドである。ポリペプチド及び蛋白質の用語はしばしば、単一の
長いポリペプチド鎖を記述するものとして交互に使用される。加えて蛋白質は、
複雑な３次元構造の基礎を集合的に形成する複数のポリペプチド鎖からなること
がある。ペプチド、ポリペプチド、及び／又は蛋白質は、細胞の蛋白質修飾装置
によって生成される様な修飾を含むことがある。蛋白性分子の変異体は、変異し
ていない蛋白性分子と比較して、一つ又はそれ以上の変化を含んでいる蛋白性分
子である。変化というのは、例えば、一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠損
、挿入、又は付加、又はそれらの変化の組み合わせであることが可能である。必
然的にではないが、好ましくは、前記変異は、前記蛋白性分子をコードしている
核酸中における変化を通じて生成される。
【０００７】 ライブラリーは、エピトープに結合することができる蛋白性分子の少なくとも
一つの変異体からなる。ライブラリーは、典型的には前記蛋白性分子の１００個
以上の異なった変異体からなるであろう。その様なライブラリーはそれ自体で使
用されることがあり、又はそれは、前記エピトープの少なくとも一部分と結合す
ることが可能な他の蛋白性分子の少なくとも一つの変異体からなる、一つ又はそ
れ以上の他のライブラリーと組み合わせて使用されることがある。その様な組み
合わせの利点は、それは変異体の複雑性を増加して、それによって特に好ましい
変異体を見出すための可能性を増加するということである。当然に、ライブラリ
ーを他のライブラリー又は蛋白性分子と組み合わせることもまたできる。その様
な一つの組み合わせは、特定の標的分子上に存在する異なったエピトープに結合
することができる、異なった蛋白性分子の変異体のアレイからなるライブラリー
を提供するという望みをもたらす。
【０００８】 本発明のエピトープは、典型的には細胞によって生産された蛋白質の中に及び
／又はその上に存在している。エピトープは前記蛋白性分子に結合することが可
能な結合部位である。エピトープは任意の種類の分子（その一部分）であること
ができる。典型的には、エピトープはペプチド、ポリペプチド、蛋白質及び／又
は細胞の蛋白質修飾装置によって作成された様な修飾からなる。
【０００９】 ライブラリーの少なくとも一部分が提供される細胞は、生細胞及び／又は死ん
だ細胞であることが可能である。典型的には細胞は培養物から得られる。ライブ
ラリーの少なくとも一部分を提供する前に、細胞はプロセスを受けることがある
。例えば、固定化の目的及び／又は透過の目的のためであってもよい。細胞と同
等の機能を有する物は、粗い細胞抽出物である。その様な抽出物の中では、本質
的には個々の細胞が顕微鏡的な手段を通じて認識されないような手段で通常は細
胞の構造が破壊されている。粗い抽出物は一つ又はそれ以上の望まれない成分を
除くためのいくつかの段階を受けるかもしれない。しかし、前記エピトープから
なる一つの蛋白性分子のみを本質的に含んでいる抽出物は、粗い抽出物とは見な
されない。何を粗い抽出物であると見なすことができるのか、そして何を精製さ
れた抽出物と見なさなければならないか、という間の分岐線を与えることは難し
い。しかし、無傷オルガネラ以上又はそれ以下からなる抽出物は細胞と同等の機
能を有する。細胞と同等の機能を有する物は、エピトープを含んでいる無傷細胞
の中及び／又はその上に存在している時に、そのエピトープが有している形態と
本質的に類似の形でエピトープの大部分を含まなければならない。
【００１０】 細胞及び／又はその機能同等物に結合していない、ライブラリーの一部分を除
去することは、その細胞及び／又はその機能同等物を、例えば緩衝された等張溶
液の様な適切な溶液で洗浄することを通じて達成することができる。細胞をペレ
ット化し、そしてその細胞を適切な溶液中に懸濁することによって、細胞を容易
に洗浄することができる。細胞の抽出物の様な細胞と同等の機能を有する物に結
合していない、ライブラリーの一部分を除去するために、その同等の機能を有す
る物を担体に付着させることは有利であり、それによってその同等の機能を有す
る物を容易に操作することができる。細胞もまたもちろん、担体に付着させるこ
とができる。結合していない蛋白性分子を除去する好ましい方法は、一つ又はそ
れ以上の洗浄工程の手段である。最終的には望ましくない低親和性で結合の蛋白
性分子を除去するために、一つ又はそれ以上のストリンジェントな洗浄工程を備
えることは有利である。細胞又はオルガネラ及び／又は膜性の粒子状の様なその
一部分については、担体への付着は必要ではないが、しかしなお有利である。本
発明の方法は、通常は10,000個以上の細胞又はその機能同等物を備える。しかし
、もっと低い量の細胞又はその機能同等物もまた使用される。本発明は、たった
一つの細胞を使用して達成することもまたできる。
【００１１】 蛋白性の分子は、エピトープに結合することが可能な任意の蛋白性分子である
。その様な蛋白性の分子の例には、限定するものではないが、特異的なエピトー
プ結合能又は基質付着蛋白質のためのライブラリーから好ましくは選択された、
抗体（人工的又は天然のもの）、FAB断片（人工的又は天然のもの）、一本鎖Fv
断片、Ｔ細胞受容体、リガンド、受容体、ペプチドがある。もちろん、前記蛋白
性分子と同等の機能を有する物もまた使用することができる。その様な同等の機
能を有する物は、同様の性質のエピトープ結合活性を備えるが、必ずしも量で同
じであるわけではない。同等の機能を有する物は、前記蛋白性分子の一部分、誘
導体及び／又は類似物であることができる。典型的には誘導体はアミノ酸置換を
通じて得られる。前記エピトープを備えている細胞に、前記蛋白性分子を作用さ
せた後に一つ又はそれ以上の洗浄過程を行うことにより、本質的に前記エピトー
プを備えない他の細胞と比較して有意に高い前記蛋白性分子を保持することが見
出された時、ある蛋白性分子はエピトープに結合することができると言われる。
【００１２】 本発明の好ましい態様において、前記蛋白性分子は一本鎖Fv断片（scFv）及び
／又はFAB断片、又はその機能同等物からなる。前記scFv及び／又は前記FAB断片
と同等の機能を有する物とは、前記scFv及び／又は前記FABの一部分、誘導体及
び／又は類似物であり、前記scFv及び／又は前記FAB断片と性質において同様の
結合活性を有するが、必ずしも量においては同じではない。
【００１３】 好ましい態様において、蛋白性分子の前記変異体の前記各々は、前記変異体蛋
白性分子をコードしている核酸からなるベヒクルと物質的（physically）に連結
している。これは、前記メンバーが前記細胞及び/又はその機能同等物から回収
される時に、前記蛋白性分子をコードする核酸が同時に回収されるという利点を
有する。そこで前記核酸は、細胞中での増殖、解析、サブクローニング及び/又
は発現のために利用することができる。
【００１４】 好ましくは、前記ベヒクルは、例えばファージカプシドの様なウイルス様微粒
子又はその機能同等物からなる。核酸を処理しやすい形態に濃縮することができ
るため、ウイルス様微粒子は好ましい。ウイルス様微粒子は、選抜されたメンバ
ーの核酸を細胞内へ効率的に導入するために使用できる、という理由のためにも
好ましい。一度細胞中に導入されたならばその核酸を増幅することができる時に
はこれは特に有利であり、そのために、例えば前記核酸をかなり大量に容易に単
離することができるようになる。
【００１５】 本発明の他の好ましい観点において、前記エピトープは癌関連エピトープであ
る。癌関連エピトープは、生体内の癌細胞に本質的に特徴的であるエピトープで
ある。前記エピトープは、癌細胞中と同様の様式で他の細胞中で存在しない限り
において、他の細胞中に存在することがある。例えば、エピトープが癌関連エピ
トープであるのは、そのエピトープが癌細胞の表面上に存在し、かつ、それに限
定されるわけではないが、例えば非癌細胞の中では前記エピトープの発現は本質
的により低いために、非癌細胞の表面上には本質的に存在していない時である。
前記細胞が同じ体内において正常に癌細胞と共存しない限り、前記エピトープは
他の細胞上において存在することもある。典型的な例は、胎児細胞（foetal cel
ls）上に存在するが、正常な大人の細胞（adult cell）上には本質的には存在し
ていない癌関連エピトープである。癌関連エピトープは個々に決定され、即ち、
一つの個体にとっての癌関連エピトープは同種の他の個体において癌関連エピト
ープではないかもしれない。癌関連エピトープは正常細胞上に存在している蛋白
質の一部分でもあるかもしれないが、しかしそこで、正常細胞中におけるその蛋
白質のグリコシル化は、癌細胞上におけるその蛋白質のグリコシル化とは異なっ
ている。
【００１６】 他の観点において、本発明の方法によって得られるメンバーの少なくとも一部
分からなる、前記エピトープと結合することが可能な分子を、本発明は提供する
。一つの態様において、前記一部分は、前記メンバー又はその機能同等物のエピ
トープ結合部位の一部分からなる。他の態様において、前記一部分はエピトープ
結合には直接関与していない一部分である。エピトープ結合に直接関与していな
いその様な一部分の一例は、補体因子との連結に関与している一部分である。他
の例は、前記蛋白性分子の組織浸透に関与している一部分である。これはエピト
ープ結合能の変化又は他の変異に依っているかもしれない。当然に、ある一部分
は一つ以上の性質を備えることができる。例えば、一部分はエピトープ結合部位
及び補体因子との連結に関連している一部分を備えることがある。好ましくは、
前記分子は抗体又はその機能同等物である。前記抗体は好ましくは人工的に合成
される。好ましくは、インビトロで培養された細胞内において合成される。一つ
の態様において、前記抗体はヒト抗体、ヒト化抗体及び/又はヒト様の抗体、又
はその機能同等物である。
【００１７】 他の観点において本発明は、発達したエピトープ結合分子を得るためにエピト
ープを提示している細胞及び/又はその機能同等物を使用する方法を提供し、前
記発達したエピトープ結合分子の少なくとも一部分が由来するエピトープ結合分
子と比較して、前記発達したエピトープ結合分子は促進された性質を有する。一
つの態様において、前記エピトープ結合分子は、抗体又はその機能同等物の相補
性決定領域の一部分からなる。他の態様において、前記性質は促進されたエピト
ープ結合能からなる。更なる他の態様において、前記性質は促進された組織浸透
能及び/又は促進された補体活性化能からなる。
【００１８】 本発明の一実施態様においては、親の抗-Ep-Cam scFv UBS-54に由来する変異
体scFv抗体フラグメントの、小さなファージ提示ライブラリーを構成することで
、腫瘍関連抗原Ep-CAMに結合する親和性の高いhuMabを得た。引き続き、無傷Ep-
Cam-陽性腫瘍細胞上で、これらのライブラリーを、より分けた。ファージの選択
中の厳しい洗浄工程が、scFv C52の単離をもたらし、該scFv C52は、親和性が15
倍改善され、且つKD=4*10-10Mで無傷IgG1 huMabに転化されていた。親和性の改
善は、より低いkoff（又は解離定数）に主に起因した。軽鎖シャッフリング及び
ＤＮＡシャフリングを用いて、突然変異を抗体のＶ領域に引き起こした。これら
の突然変異誘発手法の夫々により達成された親和性は、他の突然変異誘発及びフ
ァージ提示選択技術を用いた抗体親和性成熟により達成された結果に比べて、約
4倍増加した（１１、１４、３３）。本発明では、固定化された無傷細胞上で親
和性の選択を実施できること、精製又は組換え分子として目的の抗原を発現する
必要を除外できることが明らかにされた。
【００１９】 ファージ提示ライブラリーから親和性のより高い抗体変異体を単離するための
これまでの選択手法は、ファージの選択のために標的として固相上に固定化され
た溶解性で精製された抗原又は抗体を使用している。固相境界の抗原の選択が、
アビディティのため、一量体scFvに対する二量体scFvの優先的選択をもたらし、
これにより真に親和性がより高いscFvの選択を妨害することは注目に値する（１
４）。溶液中の選択は、アビディティの影響を軽減するが、それに続く選択ラウ
ンドでの標的抗原濃度の慎重で且つ段階的な減少を必要とする（１４）。他のsc
Fvに注目するので、溶液中のscFv UBS-54は、二量体(30%)と単量体(70%)の混合
物である。この比は、変異体A37、B43、及びC52において維持されており、無傷
細胞の選択が、（データは示さないが）二量体の片寄った選択をもたらさないこ
とを示していた。選択されたファージのプールからの、親和性がより高いバイン
ダーのスクリーニングを、表面プラスモン共鳴によって決定されるより低いkoff に従って、変異体scFvを格付けすることにより実行した（６）。我々は、我々の
選択されたscFvをこの方法に従って格付けを試みたが、我々は、単量体、二量体
及び集合体の混合物に起因して、天然のペリプラスムscFvの調製を伴う実験デー
タが、親和性のプロット（RU対時間）の複雑さが原因となり評価するのが難しい
ことを見出した。そのため、我々は、３ラウンドの選択の後、ファージのプール
を支配しているクローンを追跡することを決心した。注目すべきことに、選択に
おけるファージのクローンの優性は、親和性によって完全に決定されるだけでな
く、効率と大腸菌(E.Coli)に対する毒性のレベルとを組み合わせたscFvの発現レ
ベルによっても影響を受ける。我々の分析では、優性のクローンの存在は親和性
がより高いscFvと相関があったが、我々は、選択されたファージのプール中に他
の親和性がより高く且つ優性の低いクローンが存在することを未だ排除できてい
ない。
【００２０】 軽鎖シャッフリングが、変異体A37中でのVk3軽鎖によるオリジナルのVk2軽鎖
の置換をもたらした。構造分析が、A37中のVk3軽鎖の基準となる構造が、かなり
短いループからなり、より広い相互作用表面を作っていることを明らかにした。
熱力学的には、より多くの水分子が排除される（溶媒中のエントロピーの獲得）
ために、抗原-抗体相互作用が大きく緊密な相互作用表面を有することは魅力的
であり、より重要なことには、多くの同時の相互作用（水素結合、ファンデルワ
ールス及び双極子-双極子相互作用）がエピトープとパラトープの間に生じ得る
（結合エンタルピーに寄与する）ことである（２３）。構造的には、このことは
、大きく相互作用するタンパク質上の等しい広さのエピトープに対して補完的で
ある抗体の広い面結合サイトをもたらす。反対に、抗原をぴったりと囲む深い裂
け目からなる結合サイトは、ペプチド及び低分子量有機分子等の小さな配位子と
一般に結合する（２３）。
【００２１】 VH領域でないVL領域のＤＮＡシャッフリングは、より高い親和性を有する抗体
の単離をもたらした。高い親和性を有するhuMab C52のモデル化された構造は、V
L領域内の７つの突然変異のたった一つ、即ちAsnL30A→Serが、最も適当で且つ
直接にEp-CAMとの相互作用に影響することを示していた。その他の突然変異は、
突然変異した抗体残基の一つと抗原Ep-Camの間の特異的な相互作用の改善よりむ
しろ、従前に報告されたように（２１）、付加的な水素結合と改善されたパッキ
ング相互作用とを通して抗体の結合サイトのより微妙な最適化をもたらし得る。
確かに、SerL31の突然変異は、LCDR1ループを安定化するValL29との付加的な水
素結合をもたらす。親和性の主な獲得が、CDR1中の抗原の結合サイトの周囲に位
置する突然変異によって起こるようであり、生体内の身体的に突然変異させられ
たV領域において見つかった突然変異の分布と共通点がある（３４）。
【００２２】 生体内の固体腫瘍の抗体仲介死滅は、免疫システムのFc受容体-耐性エフェク
ター細胞と、補体因子と、抗体とその標的との間の相互作用に起因する信号事象
とを含む複雑なプロセスである。親和性及びアイソタイプ等の抗体関連の特性に
よるこのプロセスへの関連する重要性及び寄与は、抗体研究の焦点となりつつあ
り、臨床における最近の人工抗体の成功によって駆り立てられている。我々は、
抗体の親和性依存プロセスの二つの様相、即ち腫瘍細胞の死滅と微小癌組織の転
移を模倣する腫瘍細胞のクラスター中への抗原の侵入とを研究するために、人工
の高い親和性を有する抗-Ep-CAM huMab及びより低い親和性を有する抗-Ep-CAM h
uMabを利用した。
【００２３】 我々は、親和性がより低いUBS-54が多細胞スフェロイドの中心の中により速く
侵入し、huMabの均質な分布をもたらすことを見出した。この観察は、抗体の非
常に高い親和性(>109M-1)が腫瘍の端での抗体の捕捉の原因となり、腫瘍内部の
中へのそれらの侵入を遅くすることを示す他の研究を支持する（３１、３２、３
５、３６）。
【００２４】 驚いたことに、より低い親和性を有するhuMab UBS-54は、より高い親和性を有
する変異体C52に比べて、永続的に特異性のより高い腫瘍細胞の、エフェクター
源としてのPBMCでの溶菌を仲介する。同じ結果が、細胞尾を欠いたEp-CAM cDNA
構造体でトランスフェクトされた標的細胞で得られ、Ep-CAMを介した発信が腫瘍
細胞の死滅において役割を果たさないことを示唆していた。多くのFcγRがADCC
を誘発し得るものの、高い親和性を有するFcγRIが最も効果的な誘発分子である
ようである（３７、３８）。我々は、高い親和性を有するFcγRIへの抗体の結合
を介して仲介されたエフェクター細胞の活性化における量的な違いが、ADCC中の
それらの死滅能力に影響し得るということを提案する。FcγRIに対する機構は解
明されていないが、FcεRでの最近の実験、即ちもう一つの高い親和性を有する
メンバーである多鎖免疫認識受容体族は、親和性の低い配位子の余りによる受容
体の凝集が、キナーゼLynに対応する受容体の封鎖の原因となることを示した（
３９）。結論として、親和性がより高い配位子によって同時に誘起された集合体
のより小さなメンバーはLynを奪うようになり、このため発信カスケード(cascad
e)を始めることができない（３８）。このモデルでは、キナーゼに対応する受容
体の欠乏は、親和性の低い相互作用が完全な発信カスケードの活性化を阻止する
（４０、４１）。我々の生体外での腫瘍細胞の死滅データを基に、我々は、非常
に高い親和性を有する抗体による広範囲に渡るFcγRI受容体のトリガもまた、キ
ナーゼに対応する受容体の封鎖をもたらす可能性があり、結果として事象のカス
ケードの低効率FcγRI仲介導入がエフェクター細胞の活性化の原因となるという
仮説を立てる。
【００２５】 CDCC実験は、huMab UBS-54に比べて、huMab C52で著しく特異性のより高い腫
瘍細胞の溶菌を示し、補体系の活性化における親和性がより高い抗体の有利さを
示した。補体系の活性化における親和性のより高い変異体の改善された能力は、
生体外では明白であるが、幾つかの研究は、CDCCが腫瘍細胞の死滅において生体
内で僅かに役割を果たし得ることを示す。大抵の腫瘍細胞は、自系の補体による
溶菌から細胞を保護する補体阻害調整体を発現する（４２−４６）。更に、腫瘍
細胞特異的モノクロナール抗体は、コントロールマウスとして補体因子C5を欠い
たマウス中で腫瘍を絶滅させることにおいて同等に効果的であることが分かって
いる（４７）。従って、ADCCは腫瘍細胞を死滅させるための支配的免疫機構とな
り得、ADCC中でより高い死滅能力を有する親和性のより低いUBS-54が受動免疫療
法には好ましい可能性があることを示唆している。
【００２６】実施例 （材料と方法） 親和性成熟の突然変異誘発： 半合成のファージ抗体提示ライブラリーから単離したscFv UBS-54を、VH1及び
Vk2の重及び軽鎖の種々の領域の遺伝子族のメンバーでコードした（１７、４８
）。軽鎖シャッフリングのために、１５のドナーのプールの末梢のB血液細胞か
ら完全なＲＮＡを単離し、オリゴ(dT)プライミングによりcDNAに転化し、Nco-I
及びXho-I制限サイトを有するVk2遺伝子族特異的プライマーを用いてPCRにより
増やした：Vk2-NCO-I（5'-' GCCTCCACCTCCATGGGATATTGTGATGACTCAGTCT-3'）及び
Vk2-XHO-I（5'-GCCTCCACCTCTCGAGCTGCTGACAGTAATAAGTTGCAAAATC-3'）。増やした
生成物を精製し、適当な制限酵素で消化し、オリジナルのUBS-54重鎖を含むベク
ターpPVの中にクローン化し、XL-1青バクテリアの中に形質転換し、説明されて
いるように2TYプレートを含むアンピシリン上に塗布した（４８）。得られたシ
ャッフルされたライブラリーは、2*107個のクローンを含んでいた。
【００２７】 ファージの選択のために、LS174T結腸癌細胞をPBS中で洗浄し、1%のパラホル
ムアルデヒド中、4℃で15分間固定化した。親和性のより高い変異体の選択のた
めに、106の固定化された細胞とシャッフルされたライブラリーとを4℃で2時間
培養し、細胞を50mlの氷冷媒体中で3回洗浄した。厳しい洗浄手法は、0.5%のト
ゥイーン(tween) 80を含む1%のBSA/PBS中、37℃で、固体化された細胞を培養す
ることからなる。15分ごとに細胞を洗浄し新しいエッペンドルフ(eppendorf)チ
ューブに移し、この手法を16回繰り返した。最後に、細胞をPBS中で2回洗浄し、
500μlの100mM HCl中で５分間、最後の細胞ペレットを再懸濁することによって
ファージを抽出し、次に250μlの1Mトリス/HCl pH7.4で中和した。ファージを増
殖させ、洗浄サイクルの数を総てのラウンドで3に増やす以外は同じ手法を用い
て、2回追加の選択ラウンドを実施した。選択の最後のラウンドの後、70のコロ
ニーを無作為に採取し、ヌクレオチド配列の分析に使用した。
【００２８】 他の所で詳細に記載された手法に従い、VH遺伝子のＤＮＡシャッフリングを実
施した（１８、１９）。端的にいえば、末梢血液B細胞からのcDNAを、VH1遺伝子
族に対して特異的であるプライマーを利用して増やした：NCO-I- VH1：5'GCCTCC
ACCTCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG3'及びpan VH XHO-I：5'GCCTCCACCTCTCGA
GTCTCGCACAGTAATACACGGCCG3'。精製の後、DNA'se I（シグマ、セントルイス、Ｍ
Ｏ）で2μgのPCR生成物を処理し、50〜100塩基対の間のサイズのＤＮＡフラグメ
ントを作った。これらのフラグメントを、800μMのdNTP'sを有する100μlの容積
中、即ちプライマーのない製造業者の薦めるバッファ中、Taqポリメラーゼ（Sup
ertaq、ＨＴバイオテクノロジーＬｔｄ．ケンブリッジ、英国）が0.2ユニットあ
るものの中で、再組み立てした。再組み立てPCRは、94℃で30ｓ、50℃で30ｓ及
び72℃で2分のサイクル40回からなる。再組み立てされたPCR生成物を、プライマ
ーNCO-VH1及び薬を加えたプライマーXHO-HCDR3-UBS-54で引き続きPCR中（20サイ
クル）、1/30の希釈率で使用した：5' GCCTCCACCTCTCGAGACGGTGACCAGGG TACCTTG
GCCCCA[ATA(CAT/AGG/ACC)][GTG(AAA/CTT/GGC)][AAG(CTA/AGT/ACC)][AAA(CTT/AGG
/ACC)][CGG(AAA/CTT/CCC)][GTA(AAT/CGG/GCC)]TCTTGCACAGTAATACACGGCCGTGTC3'
。円形ブラケット間のヌクレオチドは10%の混合物を含む。HCDR3の薬を加えたオ
リゴプライマーは、UBS-54のオリジナルのHCDR3中で6アミノ酸に対し平均2の置
換を導入した。PCR生成物をNco1及びXho1で消化し、A37軽鎖を含むpPVベクター
中でクローン化した。これは、4*107クローンのライブラリーをもたらした。該
ライブラリーを固定化されたLS174T細胞で、室温で2時間培養し、厳しい洗浄手
法を行った。３ラウンドの選択の後、64クローンのヌクレオチド配列を分析した
。
【００２９】 軽鎖のＤＮＡシャッフリングのために、次のプライマーを用いた：NCO Vk2及
びVk2-XHO。DNA'se I処理及び再組み立てPCRの後、再び組み立てられた生成物を
同じプライマーを用いて増やし、Sac1及びNot 1で消化し、クローンB43のVH遺伝
子を含むpPVベクター中でクローン化した。洗浄サイクルの数を増加させる以外
は、1*107クローンのこのライブラリーでのファージ選択は、上記と同様である
。３ラウンドの選択の後、70クローンをヌクレオチド配列の分析のために採取し
、クローンC52と呼ばれる単一の支配的クローン（31/70クローン）を同定した。
【００３０】 無傷huMabの構成と評価 scFv A37、B43及びC52をコードするVH及びVL領域を抽出し、他で詳細に記載さ
れたようにして完全なヒトIgG1/K分子の合成のために、発現ベクターの中に再ク
ローン化した（１７、４９）。2工程のクローニング手法において、scFvのもの
をコードするVH及びVL領域を、最初にベクターpLEADER中に挿入し、T-細胞受容
体α-鎖HAVTリーダーのペプチド配列及び接続ドナーサイトを添えた。第２のク
ローニング工程では、リーダー及び接続ドナーサイトを含むVH又はVL領域を、適
当な制限サイトを用いてpNUT-Cγl又はpNUT-Ck発現ベクター中でサブクローン化
した。続いて、構成体をしっかりとBHK細胞中でトランスフェクトした。端的に
いうと、10%のFCS、2mMのグルタミン及び10μg/mlのゲンタマイシン(gentamicin
e)を含むイスコブが(Iscove's)変形したジュルベッコの(Dulbecco's)培地（完全
培地）中で、5%CO2の湿った培養器中37℃に、細胞を保持した。細胞を、37℃で4
時間リン酸カルシウムプラスミドＤＮＡ沈殿を用いた70〜80%の集合(confluency
)密度でトランスフェクトし、次に1分間15%のグリセロールショックを行った。8
0μMのメトトレクセート(methotrexate)（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を加え
ることにより、選択を始めた。2週間後、耐性細胞のコロニーを採取し、メトト
レクセートを含有する培地中で培養した。huMabの生成物を、量的ELISAにより上
澄み中で測定した。タンパク質-Aを精製した組替えhuMabの全体を、SDS/PAGE及
びゲルのクーマジー(Coomassie)明青色染色により決定した。精製したhuMabの濃
度を、l 280nmでの分光測光法により測定した。免疫蛍光染色のために、10μl/m
lの濃度の精製huMab IgG1 10μlを用いた。huMabをFITC複合ヤギ抗-ヒトIgG（南
バイオテクノロジー協会、バーミンガム、ＡＬ）により測定した。L929繊維芽細
胞系列及びヒトEp-CAM cDNA (LME-6)でトランスフェクトされたL929細胞は、S.
Litvinov博士（Leiden大学、オランダ）の優しい贈り物である（５０）。
【００３１】 親和性測定 分離されたBIAcoreフロー細胞において、10mMのアセテートバッファー(pH 4.0
)中、昆虫の細胞中で生産された精製組替えEp-CAM（D. Herlyn博士により親切に
も提供されたもの、Wistar協会、フィラデルフィア、ＰＡ）約160、1565及び415
4リーゾナンス(reasonance)ユニット(25μg/ml)を、NHS/EDC結合相性を用いてCM
5センサーチップに結合した。100〜1nMの範囲の濃度を用いた30ml/分の連続的な
流れの下で、結合と解離とを測定した。
【００３２】 構造分析 マーティン(Martin)及びトロントン(Thornton)によって記載された自動クラス
分けを用いた最初の連続及び構造配置の後（５１）、タンパク質データバンク（
５３）に預けられた構造1GCl（５２）を、全モデルの重鎖のための骨格(scaffol
d)として選んだ。非標準的なCDR H3用の骨格を作るために、1GClの残基Gly94及
びPhe100yの間で、プログラムSYBYL v.6.5（Tripos Inc., セントルイス、ミズ
ーリ、米国）により、ループサーチを実施した。ねじれ角で比較的少しだけ外れ
ている位置（26）が、CDR H3のより可変の部分よりも重要である。加えて、領域
92-94及び100y-104は、1GClと高い連続類似性を示す。1JRH（５５）のCDR L3ル
ープを有する構造体1NQB（５４）を、抗体UBS-54の軽鎖のための骨格として用い
た。構造体1FIG（５６）を、モデルA37及びC52の軽鎖のための骨格として用いた
。実際のモデリングを、WHAT IF v.19970813-1517（５７）のBLDPIRモジュール
で実施した。PROCHECK v.3.3（５８）及びWHAT IFのWHATCHECKモジュールで、質
をチェックした。モデルの原子座標を、http://wwwcmc.pharm.uu.nl/moret/pub/
で見つけることができる。知識の基本を、タンパク質データバンクから選択した
次の抗原-抗体錯体の分析によって創出した：1BAF, 1CBV, 2GCR, 1CLZ, 1DBB, 1
EAP, 1FIG, 1FLR, 1GAF, 1HYX, 1IBG, 1IGJ, 1IND, 1KEL, 1KNO, 2MCP, 1MFA, 1
MRD, 1MPA（ハプテンクラス）、1ACY, 1TET, 1FPT, 1FRG, 1GGI, 2IGF（ペプチ
ドクラス）、1AFV, 1DVF, 1FBI, 1VFB, 3HFL, 3HFM, 1LAI, 1IKF, 1JEL, 1JHL,
1MLC, 1NCD, 1NMB, 1OSP（タンパク質クラス）。分析に用いたプログラムは：HB
PLUS（５９）''AS INTEGRATED IN LIGPLOT'' v.3.0（６０）、NACCESS v.2.1.1
（Hubbard, S.J., 及びThoronton, J.M. 1993. ''NACCES'', コンピュータープ
ログラム、生化学及び分子生物学部、ロンドン大学(University College London
)）、DISCOVER v.97.0（Molecular Simulations Inc., サンディエゴ、CA、米国
）及びSYBYLである。タンパク質配列分析を、プログラムBLAST v.2.0（６１）で
実行した。
【００３３】 抗体及び補体依存細胞の細胞毒性 ヒト末梢血液多形核細胞(PMN)及び単核細胞(PBMC)の細胞毒活性を、標準的な5 1 Cr解放アッセイで評価した（６２）。端的にいうと、37℃で2時間、150μCiの5 1 Cr（Amersham, Buckinghamshire、英国）で、標的の腫瘍細胞にラベルを付けた
。高度に洗浄した後、5*103細胞/ウェルの濃度でU底マイクロタイタープレート
中で、標的の細胞を塗布した。単離されたヒトPMN及びPBMCを各ウェルに、80：1
のエフェクター：標的比で加えた。様々な濃度の精製抗体の存在下、最終的な容
積200μl中、細胞を37℃で培養した。全体の血液ADCCアッセイのために、50μl/
ウェルのヘパリン添加末梢血液を、エフェクター細胞の源として加えた。補体仲
介溶菌を50μlの血清で行った。4時間後、51Cr解放を3度測定した。細胞の細胞
毒性の割合は、式：% 特異的溶菌=（[実験cpm基礎cpm]／[最大cpm基礎cpm]）＊1
00% に従い、標的細胞を10%ザポグロビン(Zapoglobin)（クールター、ピッツバ
ーグ、ＰＡ）で溶菌した後測定した最大51Cr解放、及び培地だけで標的細胞を培
養した後測定した基礎解放と共に計算した。ヘパリン添加末梢血液を、健康なバ
ランティアから集めた。従前に記載された様にして（６３）、フィコル-ヒスト
パクエ(Ficoll-Histopaque)不連続勾配遠心分離でPMN及びPBMCを単離した。汚染
する赤血球を、0.2%のNaClで低張ショックにより取り除いた。エフェクター細胞
の純度は、シトスピン(cytospin)調製で決定すると95%以上であり、トリパンブ
ルー排除により見積もると95%以上が生存していた。ADCC及びCDCC実験のために
、何れもメタロチオネインプロモーターの転写コントロールの下にあるヒトEp-C
AM(HCE)又は細胞尾欠損ヒトEp-CAM(HCM)でトランスフェクトされたLS174T腫瘍細
胞及びHCA細胞を、標的細胞として用いた（６４）。HCE及びHCM細胞は、S. Litv
inov博士（病理学部、ライデン(Leiden)大学、オランダ）によって親切にも提供
されたものであった。
【００３４】 多細胞スフェロイド中の抗体の侵入 標準的な手法に従い、精製された抗体UBS-54及び変異体C52にFITCでラベルを
付けた。Ep-CAM + GLC-8癌細胞系列の天然多細胞スフェロイドを、FITCでラベル
付けされたhuMabで様々な時間培養し、Bio-Rad MRC-1000 CLSM（BioRad、Hercul
es、ＣＡ）を用いて分析した。記載するようにして、多細胞スフェロイドの中心
で10〜15分培養の後、共焦点の像を記録した（６５）。
【００３５】 結果 突然変異体ライブラリーの発生および選択 最近、腫瘍関連Ｅｐ−ＣＡＭ分子に抗するｓｃＦｖの単離およびその無傷細胞、
すなわち、５ｎＭ（１９）の親和性を有する機能的ヒトＩｇＧ１抗体への転換に
ついて記載した。この抗体の生殖系列Ｖｋ２軽鎖を、１５の健康な個人からプー
ルした血液白血球から抽出したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により得たＶｋ軽鎖で置換
した。２×１０７クローンのファージ表示ライブラリーを発生させ、次に、パラ
ホルムアルデヒド固定Ｅｐ−Ｃａｍ＋ＬＳ１７４Ｔクローン癌腫上でパンした。
非選択のライブラリーからランダムにピックアップした２４のクローンは、フロ
ーサイトメトリー分析における親Ｌ９２９細胞系ではなく、全てＥｐ−ＣＡＭト
ランスフェクトＬＭＥ−６細胞系に結合しており、Ｅｐ−ＣＡＭ特異性を決定す
る場合にＶＨ遺伝子の主要な役割を示す。結合ファージを有する細胞を３７℃で
インキュベートし、各１５分間ＰＢＳ／トゥイーン（０．５％）で１６サイクル
洗浄した。予備的な実験で、ＵＢＳ−５４ｓｃＦｖを発現するファージは、フロ
ーサイトメトリーにおいてＬＳ１７４クローン癌腫細胞上で、緊縮洗浄工程の後
検出できないことが決定された。約１０７ファージが、各回毎に洗浄サイクルの
回数は３回増加したが、選択の第１、第２および第３ラウンドの後に回収された
。選択の第３ラウンドからランダムにピックアップしたクローンのヌクレオチド
配列分析により、クローンの約５０％における同一的Ｖｋ配列が明らかになった
。このクローンをＡ３７という。
【００３６】 結晶学的およびＣＤＲグラフト研究は、ＣＤＲの突然変異およびＶｒ領域のフ
レームワーク領域の両方が抗体（２０、２１）の親和性改良に貢献できることを
示した。したがって、われわれは、第２の突然変異誘発法としてＤＮＡシャッフ
ルを選択した。その理由はＣＤＲおよびフレームワーク領域の両方において突然
変異の導入をもたらすからである。ＤＮＡシャフルはポイント突然変異および同
一遺伝子間のＤＮＡのストレッチ交換をもたらす。これにより、自然の蛋白質進
化（１８、１９）が起こる。さらに、この突然変異法は、Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅ
ｒ，およびＡｓｐ等の好ましいアミノ酸に対してすでに選択されたＣＤＲブロッ
クをもたらす可能性がある。Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，およびＡｓｐ等のアミノ
酸は抗原結合に対して好ましい。その理由は、形状の自由度が低く（低エントロ
ピー）、水素結合、ファンデルワースル相互作用、双極子−双極子相互作用、お
よび芳香族ｐ−スタッキング（Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）（２２、２３）等の種々の分子
相互作用に加わるからである。ＶＨ１遺伝子コード化ｓｃＦｖ ＵＢＳ−５４を
健康なドナーのプールからの増幅ＶＨ１遺伝子セグメントと混合した。ＤＮＡ
ｓｅＩ消化後５０〜１００塩基対のフラグメントを再アッセンブリＰＣＲにおい
て使用し、次にＶＨ１−特異的５’プライマーおよび「スパイク」ＣＤＲ３プラ
イマーとともに増幅した。スパイクオリゴヌクレオチドプライマーを消化して、
ＶＨ１セグメントのＣＤＲ領域に低率の突然変異をもたらした。４＊１０７ＶＨ
１突然変異化クローンの小ライブラリーをＡ３７軽鎖含有構成物においてＰＣＲ
増幅材料を結合することにより構築した。次にこのライブラリーを無傷固定細胞
上で選択した。非選択ＤＮＡシャッフルライブラリーからランダムに取り上げた
２４クローンの配列分析を、ＣＤＲ３領域における２．６突然変異の平均を有す
る完全なＶＨ遺伝子における平均約１８の突然変異を示した。突然変異の数は全
３ラウンドの選択後各ＶＨ遺伝子における約４の突然変異に低下した。３ラウン
ドの選択の後分析した全クローンはオリジナルのＵＢＳ−５４ＣＤＲ３領域を含
んだ。ＬＳＴ１７４癌腫細胞に結合するための３ラウンドの選択後、単一の優勢
クローンは検出されなかったからである。この選択は、このコレクションにおけ
る他のクローンにおいて頻繁に観察された突然変異の数を含むことが観察された
ことによる。次に、軽鎖を有するシャッフルを、軽鎖シャッフルライブラリーの
構築に対して使用したＶｋ遺伝子セグメントのコレクションを使用して行った。
得られたライブラリーは１＊１０７クローンから構成され、緊縮条件下で無傷細
胞に結合するために選択された。３ラウンドの選択後、配列分析を行い、クロー
ンＣ５２という、シングル優勢クローン（７０配列からの３１）を明らかにした
。
【００３７】 無傷ｈｕＭａｂｓの再構築 突然変異体ｓｃＦｖ Ａ３７，Ｂ４３およびＣ５２のＶ領域を、ＢＨＫ細胞（１
７）におけるＩｇＧＩ ｈｕＭａｂｓの生成に対する真核性発現ベクターにおい
て再クローン化した。免疫グロブリンを、記載（１７）の蛋白質Ａ親和性クロマ
トグラフィーを使用して安定トランスフェクト細胞系の上澄みから精製した。無
傷および機能的ｈｕＭａｂｓをクローンＢ４３の上澄みから単離することができ
たが（データ示さず）、バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）分析における再組み換え
Ｅｐ−ＣＡＭに対する親和性の高い改良を明らかにした（次のパラグラフを参照
）。したがって、われわれはオリジナルＵＢＳ−５４およびＡ３７およびＣ５２
突然変異体に注目した。ｉｇＧ１／Ｋ ｈｕＭａｂｓ Ａ３７およびＣ５２を、
変性および非変性条件下でのＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色により完全
に確認した（図１）。精製したｈｕＭａｂｓ Ａ３７およびＣ５２はそれらの特
異性を、非トランスフェクトＬ９２９親細胞系ではなく、Ｅｐ−ＣＡＭトランス
フェクトＬＭＥ−６細胞系に結合することにより決定したように保持した。
【００３８】 バイアコア分析 オリジナルｈｕＭａｂｓ ＵＢＳ−５４および突然変異体ｈｕＭａｂｓ Ａ３７
およびＣ５２の速度論的会合および解離速度を表面プラスモン共鳴により決定し
た（表１）。オリジナルｈｕＭａｂｓ ＵＢＳ−５４およびネズミ抗ＥＰ−ＣＡ
Ｍ抗体３２３／Ａ３をコントロールとして使用し、６ｎＭおよび０．５ｎＭの平
均ＫＤをそれぞれ明らかにした。シャッフルＶｋ軽鎖を有するｈｕＭａｂ Ａ３
７は１．６ｎＭ（〜４倍増）の親和性を明らか示した。ＤＮＡシャッフルＶｋ軽
鎖含有ｈｕＭａｂ Ｃ５２の結合親和性を、オリジナルＵＢＳ−５４ ｈｕＭａ
ｂ対比１５倍改良し、ＫＤ＝４＊１０−１０ｎＭを有するｈｕＭａｂを得た。こ
の改良は主に低解離定数による。
【００３９】 構造分析 配列分析は、突然変異体Ａ３７において選択した軽鎖が、ＵＢＳ−５４における
オリジナル軽鎖とほんの５４％の配列同一性を示し、より短いＣＤＲ１配列を有
することを示す（図２）。Ａ３７軽鎖は、ＤＰＫ２２／Ａ２７生殖系列遺伝子セ
グメントに高同一性を有するＶｋ３遺伝子のメンバーである（２４）。Ｖｋプラ
マーはＶｋ２遺伝子に対して好ましくはアニールするが、Ｖｋ３遺伝子はわれわ
れのシャッフルライブラリーにも存在することに留意すべきである。Ｃ５２にお
けるより短いＣＤＲ１ループは明らかに抗原結合部位において少しだけはみ出し
、抗蛋白質抗体において好ましいフラットな接触界面を作る（２３、図３）。 親和性成熟突然変異Ｃ５２はＡ３７と、重鎖における３つのアミノ酸変化につい
て（ＶＨのＤＮＡシャッフルによりもたらされるＶＨＢ４３の突然変異）および
軽鎖における８つの付加的な突然変異において（ＶＨのＤＮＡシャッフルにより
もたらされるＶＬ Ｃ５２の突然変異）異なる（図２および図３）。突然変異Ｓ
ｅｒＨ１６→Ａｌａ、ＡｒｇＨ１９→Ｌｙｓ、ＡｒｇＬ４０→Ｐｒｏ、ＳｅｒＬ ６５ →Ｔｈｒ、ＧｌｕＬ１０５→Ａｓｐはフレームワーク内に結合部位から離れ
て位置し、ＣＤＲループの形態安定化には伴われそうもない。ＣＤＲ Ｈ２にお
ける突然変異ＩｌｅＨ５２→Ｖａｌにより、ＩｌｅＨ５２のＣｄ原子の反発的な
立体作用を除去できる。しかし、同じ突然変異を有する突然変異体Ｂ４３は抗原
結合親和性の大きな増加を示さないので（データ示さず）、この突然変異の全体
の効果は小さいと思われる。残渣Ｌ５０（突然変異ＡｌａＬ５０→Ｇｌｙ）はし
ばしば抗原接触に伴われる。ＣＤＲ Ｌ２の主鎖形態における変化は、ＣＤＲ
Ｌ２が規範的な構造を有するので、Ｇｌｙの形態の自由度がより高いために、あ
りそうもない。ＣＤＲ Ｌ２の頂部および抗原結合部位を有する抗体の表面間の
比較的大きな距離のために、高エネルギーの相互作用が大きい側鎖を有するアミ
ノ酸に対してもたらされることが明らかである。
【００４０】 ４つの突然変異はＣＤＲ Ｌ１に位置する。すなわち、ＴｈｒＬ２８→Ｓｅｒ，
ＩｌｅＬ２９→Ｖａｌ，ＡｓｎＬ３０Ａ→Ｓｅｒ、ＡｓｎＬ３１→Ｓｅｒである
（図２および図３）。この知識のベースから、抗体位置Ｌ２８、Ｌ２９，および
Ｌ３１は、位置Ｌ３０Ａ対比、非常にまれに蛋白質抗体錯体において相互作用す
ることが明らかである。位置Ｌ２８の場合（突然変異ＴｈｒＬ２８→Ｓｅｒ）、
おそらく周囲に位置するためである。Ａ３７ ＩｌｅＬ２９の側鎖をＣＤＲ Ｌ
１内にいれて、パッキング相互作用からループを安定化し、Ｃ５２ ＶａｌＬ２
９も同様にする。Ａ３７ ＡｓｎＬ３１の側鎖は、結合部位から明らかに離れて
いる。突然変異Ｃ５２ ＳｅｒＬ３１により、水酸基とＶａｌＬ２９の主鎖カル
ボニル基間の付加的な水素結合が可能となる。さらに、ＣＤＲ Ｌ１ループを安
定化する。ホットスポット突然変異 ＡｓｎＬ３０Ａ→ＳｅｒはＥｐ−ＣＡＭと
の相互作用に直接的に最も影響を与えると考えられる。
【００４１】 機能的分析 ２つの抗腫瘍ｈｕＭａｂの、親和性は異なるが、同じエピトープ特異性について
の利用性は、インビトロでの抗体における腫瘍細胞殺能力および補体依存細胞障
害アッセイに関する親和性の影響を正確に検証可能とした（ＡＤＣＣおよびＣＤ
ＣＣ）。エフェクター細胞としてのＬＳ１７４Ｔ腫瘍目標細胞を有するＡＤＣＣ
およびＰＢＭＣは、オリジナルｈｕＭａｂ ＵＢＳ５４対比、高親和性ｈｕＭａ
ｂ Ｃ５２について〜１０％低い腫瘍細胞溶菌を示す（図４）。ｈｕＭａｂ Ｃ
５２介在低腫瘍細胞溶菌が、飽和抗体濃度に関して生じ、曲線のプラトー形状に
より示される（図４）。動物研究および患者におけるキメラヒト／マウスモノク
ローナル抗体への改良された実施に基づき、ＡＤＣＣは腫瘍細胞殺における重要
な免疫機構であると考えられる（２６、２８）。腫瘍細胞成長または腫瘍細胞ア
ポトーシスの導入についての治療的抗体の直接的な阻害効果は、それらの目標レ
セプターへの抗体結合を介して、臨床的効率に貢献できる（２９、３０）。Ｃ５
２を介する腫瘍溶菌の低効率がＥｐ−Ｃａｍを介するシグナル形質転換に影響し
ないことを調べるために、ＡＤＣＣを全長Ｅｐ−ＣＡＭ ｃＤＮＡまたは細胞質
テイルの無い突然変異Ｅｐ−ＣＡＭ ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトしたＨ
ＭＡ細胞系について行った。両方の形質転換体について、われわれは、高親和性
突然変異ｈｕｍａｂ Ｃ５２の腫瘍細胞殺効率が低いことが再現的に観察され、
ＵＢＳ５４およびＣ５２間の殺能力における観察された相違は、Ｅｐ−ＣＡＭを
介するシグナル形質導入における変種によって影響されないことを示す（データ
は示さず）。 エフェクター細胞源として精製ＰＢＭＣの代わりに全血について行った同様の実
験により、高親和性突然変異体ｈｕＭａｂ Ｃ５２についてのより高効率の腫瘍
細胞溶菌が示された（図４）。高親和性ｈｕＭａｂ Ｃ５２についての改良され
た実施は、より効率的なＣＤＣＣにより引き起こされることを仮説立てた。ｈｕ
ＭａｂＣ５２はエフェクター細胞の非存在下で補体源として血清を有してより高
効率に腫瘍細胞殺に介在する（図４）。明らかに、突然変異体ｈｕＭａｂ Ｃ５
２の低解離速度により、補体フラグメントＣｌｑのより高効率の架橋をもたらさ
れる。
【００４２】 腫瘍細胞の多重細胞スフェロイドにおける貫入に対する抗体親和性の影響 固体腫瘍の免疫治療において適用されたモノクローナル抗体の腫瘍を介する深い
浸透および均一な分配が最適な治療効果に重要であることが考えられる。インビ
トロおよびインビボの研究で、腫瘍間質を介する抗体の移動がその腫瘍抗原への
特異的結合により遅れることを示唆した。いわゆる結合部位障害が結合親和性、
抗原濃度、および抗体移動係数の機能である（３１、３２）。高および低親和性
抗腫瘍ｈｕＭａｂの相対的結合部位障害効果を決定するために、われわれはイン
ビトロ多重細胞スフェロイドモデルシステムを使用した。小さい細胞塊癌種細胞
系Ｇｌｃ−８は、高レベルのＥｐ−ＣＡＭを発現し、約１００細胞の多重細胞ス
フェロイドにおいて成長するが、１０ｍｇのＦＩＴＣ結合ＵＢＳ５４またはＣ５
２でインキュベートした。１０〜１５分のインキュベーション後、スフェロイド
の共焦レーザー走査顕微鏡により、高親和性ｈｕＭａｂを有する結合部位障害が
明らかになった。この時点で、ｈｕＭａｂ ＵＢＳ−５４のスフェロイドにおけ
る細胞への均一な結合を観察したが、より高い親和性突然変異体Ｃ５２の結合は
殆ど外側の細胞層に対して制限された（図５）。１時間のインキュベーション後
、スフェロイドの全細胞への均一な結合を両抗体において観察した（データを示
さず）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 還元（Ａ）および非還元（Ｂ）条件下での精製ｈｕＭａｂのＳＤＳ／
ＰＡＧＥ分析（ＵＢＳ−５４，レーン１および４；Ａ３７，レーン２および５；
Ｃ５２，レーン３および６）。ＭＷ：キロダルトンにおける分子量マーカー。パ
ネルＣ：ＵＢＳ−５４，ｈｕＭａｂ Ａ３７，およびｈｕＭａｂ Ｃ５２につい
ての、Ｅｐ−ＣＡＭネガティブ親Ｌ９２９細胞系（細線）および安定的形質転換
Ｅｐ−ＣＡＭポジティブ細胞（太線）の染色。
【図２】 オリジナルＵＢＳ−５４およびより高親和性突然変異体Ａ３７および
Ｃ５２の配列比較。シャッフルＶｋ３軽鎖におけるより短いＣＤＲ１配列に注意
。番号は、Ｃｈｏｔｈｉａに準拠する。
【図３】 オリジナルＵＢＳ−５４（Ａ）およびＣ５２の突然変異化抗体Ｖ領域
（Ｂ）は、ＬＣＤＲ１のより短い規範的構造（矢印）を示す。拡大（Ｃ）はＬＣ
ＤＲ１における変化残滓の位置を示す（ＴｈｒＬ２８→Ｓｅｒ，ＩｌｅＬ２９→
Ｖａｌ，ＡｓｎＬ３０Ａ→Ｓｅｒ、およびＡｓｎＬ３１→Ｓｅｒ）。ＳｅｒＬ３ ０ の位置は，Ｅｐ−ＣＡＭとの相互作用に直接影響すると考えられる。ＳｅｒＬ ３１ およびＶａｌＬ２９間の水素結合により、ＬＣＤＲ１ループが安定化する。
【図４】 ｈｕＭａｂ ＵＢＳ−５４（黒四角）およびｈｕＭａｂ Ｃ５２（白
四角）抗体依存細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体依存細胞障害（ＣＤＣＣ）。示
された実験は異なるドナーのエフェクター細胞について行った少なくとも６つの
実験に関して表している。
【図５】 ＦＩＴＣラベル化ｈｕＭａｂ ＵＢＳ５４（Ａ）およびＦＩＴＣラベ
ル化ｈｕＭａｂ Ｃ５２（Ｂ）を用いたＧｌｃ−８多重細胞スフェロイドの中心
内で記録した共焦走査レーザー顕微鏡画像。 表１ ｈｕＭａｂ ＵＢＳ−５４、Ａ３７、およびＣ５２の親和性および結合力学。平
均標準誤差を括弧内に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｈ ４Ｈ０４５ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｎ 39/395 Ｖ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 CA01 DA02 EA03 FA02 GA11 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ13 QQ79 QR08 QR33 QR42 QR59 QR62 QR77 QR80 QS05 QS12 QS33 QS36 QX02 4B064 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 DA39 NA14 ZB262 4C085 AA14 AA33 BB36 CC03 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 蛋白性分子のライブラリーから少なくとも一つのメンバーを選抜
    する方法であって、 少なくとも一つの細胞及び／又はその機能同等物に、その様な任意のメンバーが
    前記細胞及び／又は前記その機能同等物の中の及び／又はその上のエピトープへ
    結合することを許す条件下で、前記ライブラリーの少なくとも一部分を提供し、
    結合しない蛋白性分子を除去し、そして 前記少なくとも一つのメンバーを選抜する過程からなる方法であって、 前記ライブラリーは前記エピトープへ結合することが可能である蛋白性分子の少
    なくとも一つの変異体からなる、上記方法。
  2. 【請求項２】 少なくとも一つの前記蛋白性分子が、一本鎖抗体及び／又はFAB
    断片、又はその機能同等物からなる、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記蛋白性分子の少なくとも一つの変異体が、前記少なくとも一
    つの変異体蛋白性分子をコードしている核酸と連結(associated)している、請求
    項１又は請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記連結が、前記少なくとも一つの変異体蛋白性分子と物質的（
    physically）に連結しているベヒクルを介して達成されている、請求項３記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 前記ベヒクルが、例えばファージカプシドの様なウイルス様微粒
    子又はその機能同等物である、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記エピトープが癌関連エピトープである、請求項１−５のいず
    れか１つの請求項記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１−６記載のいずれか一つの請求項記載の方法によって得
    ることができる、蛋白性分子。
  8. 【請求項８】 請求項１−６記載のいずれか一つの請求項記載の方法によって得
    られるメンバーの少なくとも一部分からなる、エピトープに結合することができ
    る分子。
  9. 【請求項９】 前記分子が抗体又はそれと同等の機能を有する部分からなる、請
    求項７又は請求項８記載の分子。
  10. 【請求項１０】 前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体及び／又はヒト様抗体、又は
    その機能同等物である、請求項９記載の分子。
  11. 【請求項１１】 発達した（evolved）エピトープ結合分子を得るための、エピ
    トープを提示している細胞及び/又はその機能同等物の使用方法であって、前記
    発達したエピトープ結合分子の少なくとも一部分が由来するエピトープ結合分子
    と比較して、前記発達したエピトープ結合分子は促進された性質を有する、上記
    使用方法。
  12. 【請求項１２】 前記エピトープ結合分子は、抗体の相補性決定領域の一部分又
    はその機能同等物である、請求項１１記載の使用方法。
  13. 【請求項１３】 前記性質が促進されたエピトープ結合能である、請求項１１又
    は請求項１２記載の使用方法。
  14. 【請求項１４】 前記性質が促進された組織浸透性である、請求項１１−１３の
    いずれか１つの請求項記載の使用方法。
  15. 【請求項１５】 前記性質が促進された補体活性化能である、請求項１１−１４
    のいずれか１つの請求項記載の使用方法。
  16. 【請求項１６】 Ep-CAMへ結合可能な、半合成的な抗体提示ライブラリーから獲
    得することが可能である、ヒトモノクローナル抗体又はその機能同等物。
  17. 【請求項１７】 前記結合が、Ep-CAMに対する親和定数（KD）が6nM以下である
    ことにより特徴づけられる、請求項１６記載のヒトモノクロナーナル抗体又はそ
    の機能同等物。
  18. 【請求項１８】 前記親和定数が1.6nM以下である、請求項１７記載のヒトモノ
    クロナーナル抗体又はその機能同等物。
  19. 【請求項１９】 前記親和定数が6nMから0.4nMの範囲内の値を有する、請求項１
    ７記載のヒトモノクロナーナル抗体又はその機能同等物。
  20. 【請求項２０】 前記親和定数が1.6nMから0.4nMの範囲内の値を有する、請求項
    １９記載のヒトモノクロナーナル抗体又はその機能同等物。
  21. 【請求項２１】 前記モノクロナーナル抗体又はその機能同等物が、DPFLHYのア
    ミノ酸配列を有するCDR3領域からなる、請求項１６から２０記載のいずれか一つ
    の請求項記載のヒトモノクロナーナル抗体又はその機能同等物。
  22. 【請求項２２】 前記蛋白性分子がDPFLHYのアミノ酸配列からなるCDR3領域を備
    える、Ep-CAMに結合可能な蛋白性分子。
  23. 【請求項２３】 前記蛋白性分子が、Ep-CAMに対して6nM以下の親和定数（KD）
    を有する、請求項２２記載の蛋白性分子。
  24. 【請求項２４】 前記蛋白性分子がヒトIgG1である、請求項２２又は２３記載の
    蛋白性分子。
  25. 【請求項２５】 請求項１６から２１のいずれか一つの請求項記載のヒトモノク
    ローナル抗体又はその機能同等物、又は請求項２２−２４のいずれか一つの請求
    項記載の蛋白性分子をコードしている核酸。
  26. 【請求項２６】 蛋白性の分子を選抜するための方法であって、前記蛋白性の分
    子は、通常の手段によって得られるEp-CAMエピトープ結合ペプチドの結合部分と
    少なくとも一つの結合能において異なっており、 i) 前記Ep-CAM結合ペプチドの少なくとも一つの変異体からなる蛋白性分子のラ
    イブラリーを提供し、 ii) 前記Ep-CAMエピトープを備える少なくとも一つの細胞及び／又はその機能同
    等物を、前記Ep-CAMエピトープへの特異的な結合を許す条件下で、前記のライブ
    ラリーの少なくとも一部分と接触させ、 iii) 結合していない蛋白性分子を除去し、そして iv) 少なくとも前記結合能において異なっている前記Ep-CAMエピトープに特異
    的に結合することが可能である、前記蛋白性分子を選抜する、 上記過程からなる、蛋白性の分子を選抜するための方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６記載の蛋白性分子を選抜するための方法であって、
    更に、 i) 請求項２６記載の方法により得られた蛋白性分子のライブラリーを、前記選
    抜された蛋白性分子の少なくとも一つの変異体に提供し、 ii) 前記Ep-CAMエピトープを備える少なくとも一つの細胞及び／又はその機能同
    等物を、前記Ep-CAMエピトープへの特異的な結合を許す条件下で、前記ライブラ
    リーの少なくとも一部分と接触させ、 iii) 結合していない蛋白性分子を除去し、そして iv) 少なくとも前記結合能において異なっている前記Ep-CAMエピトープに特異
    的に結合することが可能である、前記蛋白性分子を選抜する、 上記過程からなる、請求項２６記載の蛋白性分子を選抜するための方法。
  28. 【請求項２８】 前記結合能が結合親和性である、請求項２６又は２７記載の蛋
    白性分子を選抜するための方法。
  29. 【請求項２９】 前記結合親和性が増加している、請求項２８記載の蛋白性分子
    を選抜するための方法。
  30. 【請求項３０】 前記結合能が解離定数からなる、請求項２６又は２７記載の蛋
    白性分子を選抜するための方法。
  31. 【請求項３１】 前記解離定数が低下している、請求項３０記載の蛋白性分子を
    選抜するための方法。
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JP2007505132A (ja) * 2003-09-08 2007-03-08 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 毛髪、皮膚、および爪のためのペプチドベースの質改良剤および着色剤

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