DE60033455T2

DE60033455T2 - Menschlischer monoklonaler Antikörper gegen Ep-CAM und dessen Verwendung in Krebstherapie

Info

Publication number: DE60033455T2
Application number: DE60033455T
Authority: DE
Inventors: Dr. Ton Logtenberg
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: NZ531590A; WO2001048485A2; EP1273918B1; DE60038132D1; DE60033455D1; ATE386747T1; JP2003518391A; ATE366419T1; US20030096225A1; WO2001048485A3; DE60035434T2; US7777010B2; AU783148B2; EP1479696A1; CA2396029A1; ES2282797T3; ATE353920T1; DK1479696T3; US20030096226A1; EP1479696B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf das Gebiet der Antikörper und deren Verwendungen. Eine solche Verwendung bezieht sich auf medizinische Verwendungen von Antikörpern.
Die Einwirkung einer hochgradig vielfältigen und sich kontinuierlich ändernden Umwelt erfordert ein dynamisches Immunsystem, das sich schnell anpassen kann, um in geeigneter Weise auf potentiell schädliche Mikroorganismen zu reagieren. Höhere Organismen haben spezialisierte molekulare Mechanismen entwickelt, um die Ausführung von klonal verteilten, hochgradig vielfältigen Repertoires von Antigen-Rezeptor-Molekülen, die von Zellen des Immunsystems exprimiert werden, zu gewährleisten: Immunglobulin(Ig)-Moleküle auf B-Lymphocyten und T-Zell-Rezeptoren auf T-Lymphocyten. Für B-Lymphocyten wird ein primäres Repertoire von (im Allgemeinen niedrigaffinen) Ig-Rezeptoren während der B-Zell-Differenzierung im Knochenmark als Folge der Umlagerung von keimliniencodierten Gensegmenten etabliert. Eine weitere Verfeinerung der Ig-Rezeptor-Spezifität und -Affinität findet in peripheren Lymphorganen statt, wo antigenstimulierte B-Lymphocyten eine somatische Hypermutationsmaschinerie aktivieren, die spezifisch auf die variablen (v) Bereiche der Immunglobuline abzielt. Während dieses Verfahrens werden B-Zell-Klone mit mutanten Ig-Rezeptoren mit höherer Affinität für das anregende Antigen zu klonaler Vermehrung und Reifung zu antikörpersezernierenden Plasmazellen stimuliert (Übersicht in 1).
In den letzten Jahren wurde DNA-Rekombinationstechnik verwendet, um viele Aspekte der Vorgänge, die die Erzeugung und Selektion von natürlichen humanen Antikörperrepertoires beherrschen, nachzuahmen (Übersicht in 2, 3). Der Aufbau von großen Repertoires von Antikörperfragmenten, die auf der Oberfläche von filamentösen Phagenpartikeln exprimiert werden, und die Selektion von Phagen durch das Panning von Antigenen wurde als vielseitiges und schnelles Verfahren entwickelt, um Antikörper mit gewünschten Spezifitäten zu erhalten (Übersicht in 4, 5). Eine weitere Optimierung der Affinität von individuellen Phagenantikörpern wurde erreicht, indem man mutante Antikörperrepertoires schuf, die auf Bakteriophagenpartikeln exprimiert und durch Selektion bezüglich der Bindung an Antigen unter stringenten Bedingungen auf Mutanten mit höherer Affinität durchsucht werden (Übersicht in 6). Verschiedene Ansätze wurden verwendet, um mutierte Antikörperrepertoires zu schaffen, einschließlich Ketten-Shuffling (7, 8), fehlerbehaftete PCR (9), Verwendung von E.-coli-Mutatorstämmen (10) oder Ansätzen, die spezifischer auf die komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) des Antikörpermoleküls gerichtet sind, wie CDR Walking und karge Mutagenese (11–13).
Um Mutanten höherer Affinität aus einer Bibliothek von mutagenisierten Antikörperfragmenten im Phagen-Display zu selektieren, wurden Selektionen an gereinigtem immobilisiertem Antigen oder biotinyliertem Antigen in Lösung durchgeführt, und anschließend wurde der an Streptavidin-Magnetkügelchen gebundene Phage abgefangen (14–16). Es wurde bewiesen, dass die Selektion eines einzelkettigen Fv-Antikörperfragments mit höherer Affinität (scFv), das für das Antigen c-erb-2 spezifisch ist, aus Phagenbibliotheken von Mutanten dieses scFv von der Verfügbarkeit von gereinigtem Antigen in Lösung abhing. Auf einer festen Phase abgefangenes Antigen führte zur Isolierung von falsch positiven Ergebnissen mit höherer Avidität und nicht Affinität aufgrund der Dimerisierung und Oligomerisierung des scFv auf dem Phagen. Außerdem wurde gezeigt, dass es für die Isolierung von scFvs höherer Affinität entscheidend ist, sukzessive Runden von Phagenselektinen mit sorgfältig gesteuerten und immer niedrigeren Antigenkonzentrationen in Lösung durchzuführen (14). Obwohl mit diesen Ansätzen scFvs mit sehr hoher Affinität isoliert wurden, sind sie nicht leicht anwendbar, wenn das Zielantigen als rekombinantes Molekül schwierig zu exprimieren oder mühsam in ausreichenden Mengen zu reinigen ist, ohne seine native Konfiguration zu verlieren. Beispiele für diese Typen von Molekülen sind Proteine mit sieben Transmembrandomänen, unlösliche lipidmodifizierte Membranmoleküle und posttranslational modifizierte proteinartige Moleküle, die spezifisch für besondere Zelltypen oder Krankheitszustände sind. Ein Selektionsverfahren für mutante Antikörperfragmente höherer Affinität, ohne ein gereinigtes Antigen zu benötigen, würde also eine wichtige Erweiterung von Affinitätsreifungsstrategien für Antikörper im Phagen-Display darstellen.
Die Erfindung beruht auf der Selektion eines Vertreters aus einer Bibliothek von proteinartigen Molekülen, die das Versehen von Zellen und/oder eines funktionellen Äquivalents davon mit wenigstens einem Teil der Bibliothek unter Bedingungen, die das Binden irgendeines Vertreters an ein Epitop in und/oder an den Zellen und/oder dem funktionellen Äquivalent davon, das Entfernen von ungebundenen proteinartigen Molekülen und das Selektieren des Vertreters umfasst, wobei die Bibliothek wenigstens eine Mutante eines proteinartigen Moleküls, die an das Epitop binden kann, umfasst. Vorzugsweise umfasst eine Mutante eine oder mehrere Mutationen, die die Bindungsfähigkeit der Mutanten an das Epitop im Vergleich zu dem unmutierten proteinartigen Molekül positiv oder negativ beeinflussen. Die Fähigkeit kann durch eine veränderte Bindungsaffinität oder eine veränderte Dissoziationskonstante oder beides beeinflusst werden.
Ein Vertreter der Bibliothek ist ein in der Bibliothek vorhandenes proteinartiges Molekül und/oder ein aus der Bibliothek selektiertes proteinartiges Molekül. Ein selektierter Vertreter umfasst typischerweise die Fähigkeit, an das Epitop zu binden. Sobald er selektiert und charakterisiert ist, kann ein Vertreter auch auf andere Weise erzeugt werden, zum Beispiel künstlich, durch molekularbiologische Techniken, wie unter anderem Peptidsynthese oder die Expression einer Nucleinsäure, die das proteinartige Molekül codiert. Ein proteinartiges Molekül kann ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein sein. Peptide sind Ketten von Aminosäuren, die durch eine Peptidbindung miteinander verknüpft sind. Der Begriff "Peptide" ist zwar nicht genau definiert, doch enthalten Peptide typischerweise zwischen 2 und 50 Aminosäuren. Polypeptide sind längere Peptide, die bis zu Tausenden von über Peptidbindungen miteinander verknüpften Aminosäuren enthalten können. Die Wörter "Polypeptid" und "Protein" werden häufig in derselben Bedeutung verwendet, um einzelne, lange Polypeptidketten zu beschreiben. Außerdem können Proteine aus mehreren Polypeptidketten bestehen, die zusammen die Basis einer komplexen dreidimensionalen Struktur bilden. Ein Peptid, ein Polypeptid und/oder ein Protein können Modifikationen umfassen, wie solche, die durch eine zelluläre Proteinmodifikationsmaschinerie erzeugt werden. Eine Mutante eines proteinartigen Moleküls ist ein proteinartiges Molekül, das eine oder mehrere Veränderungen im Vergleich zu dem unmutierten proteinartigen Molekül umfasst. Eine Veränderung kann zum Beispiel einen Austausch, eine Deletion, eine Insertion oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren oder eine Kombination dieser Veränderungen umfassen. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, wird diese Mutation durch eine Veränderung in einer Nucleinsäure, die das proteinartige Molekül codiert, erzeugt.
Eine Bibliothek umfasst wenigstens eine Mutante eines proteinartigen Moleküls, das an ein Epitop binden kann. Typischerweise umfasst eine Bibliothek mehr als 100 verschiedene Mutanten des proteinartigen Moleküls. Eine solche Bibliothek kann für sich allein verwendet werden, oder sie kann mit einer oder mehreren anderen Bibliotheken kombiniert werden, die wenigstens eine Mutante eines anderen proteinartigen Moleküls umfassen, die an wenigstens einen Teil des Epitops binden kann. Ein Vorteil einer solchen Kombination besteht darin, dass sie die Komplexität von Mutanten erhöht und dadurch die Chance erhöht, eine besonders günstige Mutante zu finden. Eine Bibliothek kann selbstverständlich auch mit anderen Bibliotheken von proteinartigen Molekülen kombiniert werden. Eine solche Kombination kann aus dem Wunsch geboren sein, eine Bibliothek bereitzustellen, die eine Palette von Mutanten verschiedener proteinartiger Moleküle umfasst, die an verschiedene Epitope, die sich an einem bestimmten Zielmolekül befinden, binden können.
Ein Epitop gemäß der Erfindung befindet sich typischerweise in und/oder an einem Protein, das von einer Zelle produziert wird. Ein Epitop ist eine Bindungsstelle, die das proteinartige Molekül binden kann. Ein Epitop kann irgendeine Art von Molekül (oder ein Teil davon) sein. Typischerweise umfasst ein Epitop ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein und/oder eine Modifikation, wie sie von einer zellulären Proteinmodifikationsmaschinerie produziert wird.
Bei den Zellen, für die wenigstens ein Teil der Bibliothek bereitgestellt wird, kann es sich um lebende Zellen und/oder tote Zellen handeln. Typischerweise werden Zellen aus einer Kultur erhalten. Zellen können verarbeitet werden, bevor wenigstens ein Teil der Bibliothek bereitgestellt wird, zum Beispiel für Fixierungszwecke und/oder Permeabilisierungszwecke. Ein funktionelles Äquivalent von Zellen ist ein roher Zellextrakt. In einem solchen Extrakt ist die Struktur der Zellen gewöhnlich so aufgelöst, dass mit mikroskopischen Mitteln im Wesentlichen keine einzelnen Zellen erkannt werden können. Ein roher Extrakt kann mehrere Schritte durchlaufen haben, um eine oder mehrere unerwünschte Komponenten zu entfernen. Extrakte, die im Wesentlichen nur ein proteinartiges Molekül, das das Epitop umfasst, umfassen, werden jedoch nicht als Rohextrakte angesehen. Die Trennlinie zwischen dem, was als Rohextrakt gelten kann, und dem, was als gereinigter Extrakt gelten muss, ist schwierig anzugeben. Extrakte, die mehr oder weniger intakte Organellen umfassen, sind jedoch funktionell äquivalent zu Zellen. Ein funktionelles Äquivalent einer Zelle muss den größten Teil des Epitops in einer Form umfassen, die einer Form, die das Epitop hat, wenn es sich in und/oder an einer intakten, dieses Epitop umfassenden Zelle befindet, im Wesentlichen ähnlich ist.
Die Entfernung des Teils der Bibliothek, der nicht an die Zellen und/oder das funktionelle Äquivalent davon gebunden ist, kann durch Waschen der Zellen und/oder ihres funktionellen Äquivalents mit einer geeigneten Lösung, wie einer gepufferten isotonischen Lösung, erreicht werden. Zellen können leicht gewaschen werden, indem man die Zellen sedimentiert und die Zellen in einer geeigneten Lösung suspendiert. Für die Entfernung des Teils der Bibliothek, der nicht an ein funktionelles Äquivalent von Zellen, wie einen Extrakt von Zellen, gebunden ist, ist es vorteilhaft, das funktionelle Äquivalent davon an einen Träger zu binden und dadurch eine leichte Manipulation des funktionellen Äquivalents zu ermöglichen. Zellen können selbstverständlich ebenfalls an einen Träger gebunden werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Entfernung von ungebundenen proteinartigen Molekülen ist ein Verfahren mittels eines oder mehrerer Waschschritte. Es ist vorteilhaft, für einen oder mehrere stringente Waschschritte zu sorgen, um proteinartige Moleküle zu entfernen, die mit einer schließlich unerwünscht geringen Affinität binden. Für Zellen oder Teile davon, wie Organellen und/oder membranartige Teilchen, ist die Bindung an einen Träger nicht erforderlich, kann aber dennoch vorteilhaft sein. Ein Verfahren der Erfindung umfasst gewöhnlich mehr als 10 000 Zellen oder funktionelle Äquivalente davon. Geringere Mengen von Zellen oder deren Äquivalenten können jedoch ebenfalls verwendet werden. Die Erfindung kann sogar unter Verwendung von nur einer einzigen Zelle durchgeführt werden.
Ein proteinartiges Molekül kann ein proteinartiges Molekül sein, das an ein Epitop binden kann. Beispiele für ein solches proteinartiges Molekül sind ein Antikörper (künstlich oder natürlich), ein FAB-Fragment (künstlich oder natürlich), ein einzelkettiges Fv-Fragment, ein T-Zell-Rezeptor, ein Ligand, ein Rezeptor, ein Peptid, das vorzugsweise anhand seiner spezifischen Epitopbindungsfähigkeit aus einer Bibliothek selektiert ist, oder ein Matrixbindungsprotein. Selbstverständlich können auch funktionelle Äquivalente der proteinartigen Moleküle verwendet werden. Ein solches funktionelles Äquivalent umfasst dieselbe Art von Epitopbindungsaktivität, wenn auch nicht notwendigerweise in demselben Ausmaß. Ein funktionelles Äquivalent kann ein Teil, ein Derivat und/oder ein Analogon des proteinartigen Moleküls sein. Ein Derivat wird typischerweise durch Aminosäuresubstitution erhalten. Ein proteinartiges Molekül gilt als fähig, an ein Epitop zu binden, wenn sich zeigt, dass Zellen, die das Epitop umfassen, bei Einwirkung des proteinartigen Moleküls nach einem oder mehreren anschließenden Waschschritten das proteinartige Molekül in wesentlich höherem Ausmaß zurückhalten als andere Zellen, die das Epitop im Wesentlichen nicht umfassen.
Das proteinartige Molekül kann ein einzelkettiges Fv-Fragment (scFv) und/oder ein Fab-Fragment oder ein funktionelles Äquivalent davon umfassen. Ein funktionelles Äquivalent des scFv und/oder des Fab-Fragments ist ein Teil, Derivat und/oder Analogon des scFv und/oder des Fab, das im Wesentlichen dieselbe Art von Bindungsaktivität umfasst wie das scFv und/oder das Fab-Fragment, wenn auch nicht notwendigerweise in demselben Ausmaß.
Jede der Mutanten eines proteinartigen Moleküls kann physikalisch an einen Träger gebunden sein, der eine Nucleinsäure umfasst, die das mutante proteinartige Molekül umfasst. Dies hat den Vorteil, dass man dann, wenn der Vertreter aus den Zellen und/oder deren funktionellen Äquivalenten gewonnen wird, gleichzeitig auch Nucleinsäure gewinnt, die das proteinartige Molekül codiert. Diese Nucleinsäure steht dann für die Vermehrung, Analyse, Subklonierung und/oder Expression in einer Zelle zur Verfügung.
Vorzugsweise umfasst der Träger ein virusartiges Partikel, wie ein Phagenkapsid oder ein funktionelles Äquivalent davon. Ein virusartiges Partikel ist bevorzugt, da es Nucleinsäure zu einer handhabbaren Form verdichten kann. Ein virusartiges Partikel ist auch aus dem Grund bevorzugt, dass es verwendet werden kann, um die Nucleinsäure des selektierten Vertreters effizient in eine Zelle einzuführen. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Nucleinsäure, sobald sie in die Zelle eingeführt wurde, zur Vermehrung befähigt ist und damit zum Beispiel die leichte Isolierung großer Mengen der Nucleinsäure ermöglicht.
Das Epitop kann ein tumorassoziiertes Epitop umfassen. Ein tumorassoziiertes Epitop ist ein Epitop, das im Wesentlichen charakteristisch für Tumorzellen in einem Körper ist. Das Epitop kann auch in anderen Zellen vorhanden sein, solange es in diesen anderen Zellen nicht in derselben Weise wie in Tumorzellen vorhanden ist. Zum Beispiel ist ein Epitop ein tumorassoziiertes Epitop, wenn es auf der Oberfläche eines Tumorzelle vorhanden ist und auf der Oberfläche von Nichttumorzellen im Wesentlichen nicht vorhanden ist, zum Beispiel aufgrund unter anderem einer wesentlich geringeren Expression des Epitops in Nichttumorzellen. Das Epitop kann auch auf anderen Zellen vorhanden sein, solange diese Zellen normalerweise nicht mit Tumorzellen in demselben Körper coexistieren. Ein typisches Beispiel dafür ist ein tumorassoziiertes Epitop, das auf fetalen Zellen vorhanden ist, aber auf normalen adulten Zellen im Wesentlichen nicht vorhanden ist. Ein tumorassoziiertes Epitop kann individuell determiniert sein, d.h., es kann sein, dass ein tumorassoziiertes Epitop für ein Individuum bei einem anderen Individuum derselben Spezies kein tumorassoziiertes Epitop ist. Ein tumorassoziiertes Epitop kann auch Teil eines Proteins sein, das auf normalen Zellen vorhanden ist, wobei sich aber die Glycosylierung des Proteins in normalen Zellen von der Glycosylierung des Proteins auf Tumorzellen unterscheidet.
Die Erfindung stellt humane monoklonale Antikörper mit höherer Affinität bereit, die an das tumorassoziierte Antigen Ep-CAM binden und durch Aufbau von kleinen Phagen-Display-Bibliotheken von mutanten scFv-Antikörperfragmenten, die von dem parentalen Anti-Ep-CAM-scFv UBS-54 abgeleitet sind, erhalten werden. Diese Bibliotheken wurden anschließend in einem Panning intakten Ep-CAM-positiven Tumorzellen ausgesetzt. Stringente Waschschritte während der Phagenselektionen führten zur Isolierung von scFv-C52, das in einen intakten humanen monoklonalen IgG1-Antikörper mit einer 15-fachen Affinitätsverbesserung und einem KD = 4·10^–10 M umgewandelt wurde. Die Affinitätsverbesserung resultierte hauptsächlich aus einem niedrigeren k_off (oder Dissoziationskonstante). Light-Chain-Shuffling und DNA-Shuffling wurden eingesetzt, um Mutationen in die Antikörper-V-Bereiche einzuführen. Die ungefähr vierfache Erhöhung der Affinität, die mit jedem dieser Mutageneseansätze erreicht wurde, war vergleichbar mit Ergebnissen, die durch Antikörperaffinitätsreifung unter Verwendung von anderen Mutagenese- und Phagen-Display-Selektionstechniken erreicht werden (11, 14, 33). In der vorliegenden Erfindung wird nachgewiesen, dass eine Affinitätsselektion mit intakten fixierten Zellen durchgeführt werden kann, so dass es nicht notwendig ist, das Zielantigen als rekombinantes Molekül zu reinigen oder zu exprimieren. Bei früheren Selektionsverfahren zur Isolierung von Antikörpervarianten höherer Affinität aus Phagen-Display-Bibliotheken wurde gereinigtes lösliches Antigen oder auf einer festen Phase immobilisiertes Antigen als Targets für Phagenselektionen verwendet. Es wurde angemerkt, dass die Selektion an festphasengebundenem Antigen aufgrund von Avidität zu einer präferentiellen Selektion von dimeren gegenüber monomeren scFv führt, was die Selektion von scFv mit wirklich höherer Affinität stört (14). Eine Selektion in Lösung reduziert den Aviditätseffekt, erfordert aber die sorgfältige und schritt weise erfolgende Reduktion der Konzentration des Zielantigens in anschließenden Selektionsrunden (14). Wie für andere scFv angemerkt wurde, ist das scFv UBS-54 in Lösung ein Gemisch von Dimeren (30%) und Monomeren (70%). Dieses Verhältnis wurde in den Mutanten A37, B43 und C52 beibehalten, was zeigt, dass die Selektion an intakten Zellen nicht zu einer systematisch verfälschten Selektion von Dimeren führt (Daten nicht gezeigt). Die Suche nach Bindemolekülen höherer Affinität aus einem selektierten Phagenpool wurde anhand einer Rangfolge von mutanten scFv gemäß einem niedrigeren k_off, wie es durch Oberflächenplasmonenresonanz bestimmt wurde, durchgeführt (6). Obwohl wir versuchten, unsere selektierten scFc nach diesem Verfahren in eine Rangfolge zu bringen, zeigte sich, dass die experimentellen Daten mit rohen periplasmatischen scFv-Präparaten aufgrund der Komplexität der Affinitätsauftragungen (RU gegen die Zeit), die aus den Gemischen von Monomer, Dimeren und Aggregaten resultierten, schwierig zu bewerten waren. Wir beschlossen daher, Klone weiterzuverfolgen, die die Phagenpools nach drei Selektionsrunden dominierten. Es sei angemerkt, dass die Dominanz von Phagenklonen bei Selektionen nicht vollständig durch die Affinität bestimmt ist, sondern auch vom scFv-Expressionsniveau, der Faltungseffizienz und dem Toxizitätsniveau gegenüber E. coli beeinflusst wird. Obwohl in unserer Analyse die Anwesenheit von dominanten Klonen mit scFv höherer Affinität korrelierte, können wir nicht ausschließen, dass andere Klone mit höherer Affinität, die jedoch weniger dominant waren, in den selektierten Phagenpools vorhanden waren.
Light-Chain-Shuffling führte zum Ersatz der ursprünglichen leichten Vk2-Kette durch eine leichte Vk3-Kette in mutantem A37. Eine Strukturanalyse zeigte, dass die kanonische Struktur der leichten Vk3-Kette in A37 aus einer viel kürzeren Schleife bestand, wodurch eine breitere Wechselwirkungsoberfläche entsteht. Thermodynamisch gesehen ist es für Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen attraktiv, eine große und enge Wechselwirkungsoberfläche zu haben, weil dann mehr Wassermoleküle ausgeschlossen werden (Gewinn an Lösungsmittelentropie) und, was wichtiger ist, viele gleichzeitige Wechselwirkungen (Wasserstoffbrücken, van-der-Waals- und Dipol-Dipol-Wechselwirkungen) zwischen Epitop und Paratop auftreten können (was zur Bindungsenthalpie beiträgt) (23).
Strukturell führt dies zu einer breitflächigen Bindungsstelle des Antikörpers, die komplementär zu einem genauso breiten Epitop auf einem großen wechselwirkenden Protein ist. Dagegen sind Bindungsstellen, die aus tiefen Spalten bestehen, die das Antigen eng umgeben, im Allgemeinen mit kleinen Liganden, wie Peptiden und organischen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, assoziiert (23).
DNA-Shuffling des VL-Bereichs, aber nicht des VH-Bereichs, führte zur Isolierung von Antikörpern mit höherer Affinität. Die modellierte Struktur des humanen monoklonalen Antikörpers mit hoher Affinität C52 zeigte an, dass nur eine der sieben Mutationen innerhalb des VL-Bereichs, Asn^L30A→Ser, höchstwahrscheinlich die Wechselwirkung mit Ep-CAM direkt beeinflusst. Die anderen Mutationen können zu einer subtileren Optimierung der Antikörperbindungsstelle durch zusätzliche Wasserstoffbrücken und verbesserte Packungswechselwirkungen, wie es schon früher berichtet wurde (21), und nicht durch eine spezifische verbesserte Wechselwirkung zwischen einem der Reste des mutierten Antikörpers und dem Antigen Ep-CAM führen. Tatsächlich führt die Mutation Ser^L31 zu einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke mit Val^L29, die die LCDR1-Schleife stabilisiert. Der hauptsächliche Affinitätsgewinn wird anscheinend von Mutationen verursacht, die sich am Rand der Antigenkombinationsstelle in CDR1 befinden, was der Verteilung von Mutationen ähnelt, die man bei in vivo somatisch mutierten V-Bereichen findet (34).
Das antikörpervermittelte Abtöten von festen Tumoren in vivo ist ein komplexer Vorgang, der Fc-Rezeptor-tragende Effektorzellen des Immunsystems, Komplementfaktoren und Signalereignisse, die aus der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und seinem Angriffspunkt resultieren, beinhaltet. Die relative Wichtigkeit und der relative Beitrag zu diesem Vorgang durch Merkmale, die mit dem Antikörper zusammenhängen, wie Affinität und Isotyp, geraten in den Brennpunkt der Antikörperforschung, was durch die neueren Erfolge von gezielt entworfenen Antikörpern in der Klinik angespornt ist. Wir verwerteten die gezielt entworfenen humanen monoklonalen Anti-Ep-CAM-Antikörper mit hoher und niedrigerer Affinität, um zwei Aspekte von antikörperaffinitätsabhängigen Vor gängen zu untersuchen: das Abtöten von Tumorzellen und das Eindringen von Antikörpern in Haufen von Tumorzellen als Nachbildung von Mikrometastasen.
Wir fanden heraus, dass die UBS-54 mit niedrigerer Affinität schneller in den Mittelpunkt des mehrzelligen Sphäroids eindrangen, was zu einer homogenen Verteilung der humanen monoklonalen Antikörper führt. Diese Beobachtung unterstützt andere Studien, die zeigten, dass sehr hohe Affinitäten von Antikörpern (> 10⁹ M^–1) zum Abfangen des Antikörpers am Tumorrand führen und das Eindringen in das Innere des Tumors verlangsamen (31, 32, 35, 36).
Zu unserer Überraschung vermittelte der humane monoklonale Antikörper UBS-54 mit geringerer Affinität eine durchweg höhere spezifische Tumorzellenlyse mit PBMC als Effektorquelle als die mutante C52 mit höherer Affinität. Dieselben Ergebnisse wurden mit Zielzellen erhalten, die mit einem Ep-CAM-cDNA-Konstrukt, dem ein cytoplasmatischer Schwanz fehlt, transfiziert wurden, was vermuten lässt, dass die Signalgebung über Ep-CAM beim Abtöten der Tumorzellen keine Rolle spielte. Obwohl viele FcγR in der Lage sind, ADCC auszulösen, scheint FcγRI mit hoher Affinität das effektivste Auslösermolekül zu sein (37, 38). Wir schlagen vor, dass quantitative Unterschiede in der Aktivierung von Effektorzellen, die über die Bindung von Antikörpern an FcγRI mit hoher Affinität vermittelt wird, deren Tötungsfähigkeit bei der ADCC beeinflussen können. Obwohl der Mechanismus für FcγRI nicht aufgeklärt wurde, haben neuere Experimente mit FcεR, einem anderen Vertreter der Multiketten-Immunerkennungs-Rezeptorfamilie hoher Affinität, gezeigt, dass die Aggregation dieses Rezeptors durch einen Überschuss an Ligand niedriger Affinität zur Sequestrierung der rezeptorassoziierten Kinase Lyn führt (39). In der Folge erfährt eine kleinere Zahl von Aggregaten, die gleichzeitig von einem Liganden höherer Affinität induziert werden, einen Mangel an Lyn und ist daher nicht in der Lage, die Signalkaskade einzuleiten (38). In diesem Modell verhindert die Knappheit einer rezeptorassoziierten Kinase, dass Wechselwirkungen niedriger Affinität die vollständige Signalkaskade aktivieren (40, 41). Auf der Grundlage unserer in-vitro-Tumorzell-Abtötungsdaten stellen wir die Hypothese auf, dass eine extensive FcγRI-Rezeptorauslösung durch Antikörper mit sehr hoher Affinität auch zur Sequestrierung von rezeptorassoziierten Kinasen führen kann und in der Folge zu einer weniger effizienten FcγRI-vermittelten Induktion der Kaskade von Ereignissen führt, die zur Aktivierung von Effektorzellen führen.
Die CDCC-Experimente zeigten mit dem humanen molekularen Antikörper C52 eine signifikant höhere spezifische Tumorzelllyse als mit dem humanen molekularen Antikörper UBS-54, was auf einen Vorteil von Antikörpern mit höherer Affinität bei der Aktivierung des Komplementsystems hinweist. Obwohl die verbesserte Kapazität der Mutante mit höherer Affinität bei der Aktivierung des Komplementsystems in vitro offensichtlich ist, weisen mehrere Studien darauf hin, dass CDCC bei der Abtötung von Tumorzellen in vivo möglicherweise nur eine Nebenrolle spielt. Die meisten Tumorzellen exprimieren komplementhemmende Regulatoren, die die Zellen durch autologes Komplement schützen (42–46). Weiterhin zeigte sich, dass tumorzellspezifische monoklonale Antikörper bei der Ausrottung von Tumoren bei Mäusen, die defizient in Bezug auf den Komplementfaktor C5 sind, gleichermaßen effektiv sind wie bei Kontrollmäusen (47). Die ADCC kann also der dominante immunologische Mechanismus zur Abtötung von Tumorzellen sein, was vermuten lässt, dass UBS-54 mit der niedrigeren Affinität und der höheren Abtötungskapazität in ADCC für die passive Immuntherapie günstig sein können.
Beispiele
Materialien und Verfahren
Mutagenese und Affinitätsreifung:
Das scFv UBS-54, das aus einer halbsynthetischen Phagenantikörper-Display-Bibliothek isoliert wurde, wird von Vertretern der Genfamilien VH1 und Vk2 des variablen Bereichs der schweren und leichten Kette codiert (17, 48). Für das Light-Chain-Shuffling wurde Gesamt-RNA aus B-Zellen des peripheren Bluts aus einem Pool von 15 Spendern isoliert, durch Oligo(dT)-Priming in cDNA umgewandelt und durch PCR amplifiziert, wobei spezifische Primer der Vk2-Genfamilie mit NcoI- und XhoI-Restriktionsstellen verwendet wurden: Vk2-NCO-I (5'-GCCTCCACCTCCATGGGATATTGTGATGACTCAGTCT-3') (SEQ ID Nr. 1) und Vk2-XHO-I (5'-GCCTCCACCTCTCGAGCTGCTGACAGTAATAAGTTGCAAAATC-3') (SEQ ID Nr. 2). Amplifizierte Produkte wurden gereinigt, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, in den Vektor pPV, der die ursprüngliche schwere Kette von UBS-54 enthält, kloniert, in XL-1blue-Bakterien transformiert und auf ampicillinhaltigen 2TY-Platten ausgestrichen, wie es beschrieben ist (48). Die resultierende Shuffled-Bibliothek enthielt 2·10⁷ individuelle Klone.
Für Phagenselektionen wurden LS174T-Kolonkarzinomzellen in PBS gewaschen und 15 min lang bei 4°C in 1% Paraformaldehyd fixiert. Für die Selektion von Mutanten mit höherer Affinität wurden 10⁶ fixierte Zellen und die Shuffled-Bibliothek 2 Stunden lang bei 4°C inkubiert, und die Zellen wurden dreimal in 50 ml eiskaltem Medium gewaschen. Das stringente Waschverfahren bestand aus einer Inkubation von fixierten Zellen in 1% BSA/PBS, das 0,5% Tween 80 enthielt, bei 37°C. Alle 15 Minuten wurden Zellen gewaschen und in ein neues Eppendorf-Röhrchen übergeführt, und dieses Verfahren wurde 16-mal wiederholt. Schließlich wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen, und Phagen wurden eluiert, indem man das endgültige Zellsediment 5 Minuten lang in 500 μl 100 mM HCl resuspendierte und anschließend mit 250 μl 1 M Tris/HCl, pH 7,4, neutralisierte. Die Phagen wurden vermehrt, und 2 zusätzliche Selektionsrunden wurden durchgeführt, wobei man dasselbe Verfahren verwendete, außer dass die Zahl der Waschzyklen in jeder anschließenden Runde um 3 zunahm. Nach der letzten Selektionsrunde wurden 70 Kolonien zufällig herausgesucht und für die Nucleotidsequenzanalyse verwendet.
Ein DNA-Shuffling des VH-Gens wurde nach einem Verfahren durchgeführt, das an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist (18, 19). Kurz gesagt, cDNA aus B-Zellen des peripheren Bluts wurde amplifiziert, wobei Primer verwendet wurden, die spezifisch für die VH1-Genfamilie waren: NCO-I-VH1: 5'-GCCTCCACCTCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3' (SEQ ID Nr. 3) und pan VH XHO-I: 5'-GCCTCCACCTCTCGAGTCTCGCACAGTAATACACGGCCG-3' (SEQ ID Nr. 4). Nach der Reinigung wurden 2 μg PCR-Produkt mit DNase I (Sigma, St. Louis, MO) behandelt, um DNA-Fragmente im Größenbereich zwischen 50 und 100 Basenpaaren zu erzeugen. Diese Fragmente wurden in einem Volumen von 100 μl mit 800 μM nNTPs, 0,2 Einheiten Taq-Polymerase (Supertaq, HT Biotechnology Ltd. Cambridge, UK) in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer in Abwesenheit von Primern wieder zusammengesetzt. Die Wiederzusammensetzungs-PCR bestand aus 40 Zyklen von 30 s bei 94°C, 30 s bei 50°C und 2 min bei 72°C. Das wiederzusammengesetzte PCR-Produkt wurde in einer anschließenden PCR (20 Zyklen) in einer Verdünnung von 1/30 mit dem Primer NCO-VH1 und einem Spiked-Primer XHO-HCDR3-UBS-54:5' GCCTCCACCTCTCGAGACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCA[ATA(CAT/AGG/ACC)][GTG(AAA/CTT/GGC)][AAG(CTA/AGT/ACC)][AAA(CTT/AGG/ACC)][CGG(AAA/CTT/CCC)][GTA(AAT/CGG/GCC)]TCTTGCACAGTAATACACGGCCGTGTC3' (SEQ ID Nr. 5) verwendet. Die Nucleotide in runden Klammern umfassen 10% des Gemischs. Der Spiked-Oligoprimer von HCDR3 führte eine mittlere Ersetzung von 2 der 6 Aminosäuren im ursprünglichen HCDR3 von UBS-54 ein. Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und XhoI verdaut und in pPV-Vektor, der die leichte Kette von A37 enthielt, kloniert. Dies führte zu einer Bibliothek von 4·10⁷ Klonen. Die Bibliothek wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit fixierten LS174T-Zellen inkubiert und dem stringenten Waschverfahren unterzogen. Nach 3 Selektionsrunden wurde die Nucleotidsequenz von 64 Konen analysiert. Für das DNA-Shuffling der leichten Kette wurden die folgenden Primer verwendet: NCO Vk2 und Vk2-XHO. Nach DNase-I-Behandlung und Wiederzusammensetzungs-PCR wurde das wieder zusammengesetzte Produkt unter Verwendung derselben Primer amplifiziert, mit SacI und NotI verdaut und in den pPV-Vektor, der das VH-Gen des Klons B43 enthielt, kloniert. Außer einer erhöhten Zahl von Waschzyklen waren die Phagenselektionen bei dieser Bibliothek von 1·10⁷ Klonen mit den oben beschriebenen identisch. Nach 3 Selektionsrunden wurden 70 Klone für die Nucleotidsequenzanalyse herausgesucht, was zur Identifizierung eines einzigen dominanten Klons (31/70 Klonen) führte, der Klon C52 genannt wurde.
Konstruktion und Bewertung von intakten humanen monoklonalen Antikörpern Die VH- und VL-Bereiche, die die scFv A37, B43 und C52 codierten, wurden herausgeschnitten und für die Synthese von vollständigen humanen IgG1/K-Molekülen in Expressionsvektoren rekloniert, wie es an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist (17, 49). In einem zweistufigen Klonierungsverfahren wurden die VH- und VL-Bereiche, die die scFvs codieren, zuerst in den Vektor pLEADER eingesetzt, so dass die T-Zell-Rezeptor-α-Kette-HAVT-Leaderpeptidsequenz und eine Spleißdonorstelle angehängt wurden. Im zweiten Klonierungsschritt wurden die VH- und VL-Bereiche, die Leader- und Spleißdonorstellen enthalten, in die pNUT-Cγ1- oder pNUT-Ck-Expressionsvektoren subkloniert, wobei geeignete Restriktionsstellen verwendet wurden. Anschließend wurden die Konstrukte stabil in BHK-Zellen transfiziert. Kurz gesagt, die Zellen wurden bei 37°C in einem feuchtgehaltenen Inkubator mit 5% CO₂ in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium, das 10% FCS, 2 mM Glutamin und 10 μg/ml Gentamicin enthielt (vollständiges Medium), aufrechterhalten. Zellen wurden in einer Dichte von 70–80% Konfluenz transfiziert, wobei man Calciumphosphat-Plasmid-DNA-Fällung während 4 h bei 37°C verwendete, die von einem Schock in 15% Glycerin während 1 min gefolgt wurde. Die Selektion wurde eingeleitet, indem man 80 μM Methotrexat (Sigma, St. Louis, MO) hinzufügte. Nach 2 Wochen wurden Kolonien von resistenten Zellen herausgesucht und in methotrexathaltigem Medium kultiviert. Die Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern im Überstand wurde durch quantitatives ELISA bestimmt. Die Integrität von Protein-A-gereinigten rekombinanten humanen monoklonalen Antikörpern wurde durch SDS/PAGE und durch Coomassie-Brillantblau-Färbung der Gele bestimmt. Die Konzentration der gereinigten humanen monoklonalen Antikörper wurden durch Spektrophotometrie bei 1280 nm bestimmt. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden 10 μl gereinigter humaner monoklonaler Antikörper IgG1 in einer Konzentration von 10 μl/ml verwendet. Humane monoklonale Antikörper wurden durch FITC-konjugierte Ziegen-Anti-Human-IgG (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) nachgewiesen. Die L929-Fibroblastenzelllinie und L929-Zellen, die mit humaner Ep-CAM-cDNA transfiziert waren (LME-6), waren eine freundliche Spende von Dr. S. Litvinov (Universiteit Leiden, Niederlande) (50).
Affinitätsmessungen
In getrennten BIAcore-Durchflusszellen wurden ungefähr 160, 1565 und 4154 Resonanzeinheiten von gereinigtem rekombinantem Ep-CAM, das in Insektenzellen produziert wurde (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. D. Herlyn, Wistar Institute, Philadelphia, PA) (25 μg/ml), in 10 mM Acetatpuffer (pH 4,0) mit Hilfe von NHS/EDC-Kopplungschemie mit einem CM5-Sensor-Chip gekoppelt. Assoziation und Dissoziation wurden unter kontinuierlichem Durchfluss von 30 ml/min unter Verwendung eines Konzentrationsbereichs von 100 bis 1 nM gemessen.
Strukturanalyse
Nach anfänglicher Sequenz- und Strukturausrichtung unter Verwendung der von Martin und Thornton beschriebenen automatischen Klassifikation (51) wurde die Struktur 1GC1 (52), die bei der Protein Data Bank hinterlegt wurde (53), als Gerüst für die schwere Kette aller Modelle ausgewählt. Um ein Gerüst für das nichtkanonische CDR H3 zu schaffen, wurde eine Loop-Recherche mit dem Programm SYBYL v. 6.5 (Tripos Inc., St. Louis, Missouri, USA) zwischen den Resten Gly⁹⁴ und Phe^100y von 1GC1 durchgeführt. Diese Positionen, die in den Torsionswinkeln relativ wenig abweichen (26), liegen vor einem variableren Teil des CDR H3. Außerdem zeigen die Bereiche 92–94 und 100y–104 eine hohe Sequenzähnlichkeit mit 1GC1. Die Struktur 1NQB (54) mit der CDR-L3-Schleife von 1JRH (55) wurde als Gerüst für die leichte Kette des Antikörpers UBS-54 verwendet. Die Struktur 1FIG (56) wurde als Gerüst für die leichten Ketten der Modelle A37 und C52 verwendet. Die tatsächliche Modellierung wurde mit dem BLDPIR-Modul von WHAT IF v. 19970813-1517 durchgeführt (57). Die Qualität wurde mit PROCHECK v. 3.3 (58) und dem WHATCHECK-Modul von WHAT IF überprüft. Die Atomkoordinaten der Modelle sind zu finden auf http://wwwcmc.pharm.uu.nl/moret/pub/. Eine Wissensdatenbank wurde durch die Analyse der folgenden Antigen-Antikörper-Komplexe geschaffen, die aus der Protein Data Bank ausgewählt wurden: 1BAF, 1CBV, 2GCR, 1CLZ, 1DBB, 1EAP, 1FIG, 1FLR, 1GAF, 1HYX, 1IBG, 1IGJ, 1IND, 1KEL, 1KNO, 2MCP, 1MFA, 1MRD, 1MPA (Hapten-Klasse), 1ACY, 1TET, 1FPT, 1FRG, 1GGI, 2IGF (Peptid-Klasse), 1AFV, 1DVF, 1FBI, 1VFB, 3HFL, 3HFM, 1LAI, 1IKF, 1JEL, 1JHL, 1MLC, 1NCD, 1NMB, 10SP (Protein-Klasse). Die für die Analyse verwendeten Programme sind: HBPLUS (59) "AS INTEGRATED IN LIGPLOT" v. 3.0 (60), NACCESS v. 2.1.1 (Hubbard, S. J. und Thornton, J. M. 1993. "NACCES", Computer Program, Department of Biochemistry and Molecular Biology, University College London), DISCOVER v. 97.0 (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, USA) und SYBYL. Die Proteinsequenzanalyse wurde mit dem Programm BLAST v. 2.0 durchgeführt (61).
Antikörper- und komplementabhängige zelluläre Cytotoxizität
Die cytolytische Aktivität von humanen polymorphonukleären Zellen (PMN) und mononukleären Zellen (PBMC) des peripheren Bluts wurde in einem Standard-⁵¹Cr-Freisetzungsassay bewertet (62). Kurz gesagt, Zieltumorzellen wurden 2 h lang bei 37°C mit 150 μCi ⁵¹Cr (Amersham, Buckinghamshire, UK) markiert. Nach extensivem Waschen wurden Zielzellen in einer Konzentration von 5103 Zellen/Napf in U-Boden-Mikrotiterplatten ausgestrichen. Isolierte humane PMN und PBMC wurden in einem Effektor:Target-Verhältnis von 80:1 in jeden Napf gegeben. Die Zellen wurden bei 37°C in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von gereinigten Antikörpern in einem endgültigen Volumen von 200 μl inkubiert. Für Vollblut-ADCC-Assays wurden 50 μl/Napf heparinisiertes peripheres Blut als Quelle von Effektorzellen hinzugefügt. Eine komplementvermittelte Lyse wurde mit 50 μl Serum durchgeführt. Nach 4 h wurde die ⁵¹Cr-Freisetzung in dreifachen Parallelversuchen bestimmt. Der Prozentsatz der zellulären Cytotoxizität wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: % spezifische Lyse = ([experimentelle cpm – basale cpm]/[maximale cpm – basale cpm])·100%, wobei die maximale ⁵¹Cr-Freisetzung nach dem Lysieren von Zielzellen mit 10% Zapoglobin (Coulter, Pittsburgh, PA) bestimmt wurde, und die basale Freisetzung nach dem Inkubieren der Zielzellen mit Medium allein gemessen wurde. Heparinisiertes peripheres Blut wurde von gesunden Freiwilligen gesammelt. PMN und PBMC wurden durch diskontinuierliche Ficoll-Histopaque-Gradienten-Zentrifugation isoliert, wie es schon früher beschrieben wurde (63). Kontaminierende Erythrocyten wurden durch hypotonischen Schock mit 0,2% NaCl entfernt. Die Effektorzellen waren zu mehr als 95% rein, was durch Cytospin-Präparate bestimmt wurde, und zu mehr als 95% lebensfähig, was durch Trypanblau-Ausschluss bewertet wurde. Für ADCC- und CDCC-Experimente wurden LS174T-Tumorzellen und HCA-Zellen, die mit humanem Ep-CAM (HCE) oder mit humanem Ep-CAM mit deletiertem cytoplasmatischem Schwanz (HCM) transfiziert waren, beide unter der Transcriptionskontrolle eines Metallothionin-Promotors, als Zielzellen verwendet (64). HCE- und HCM-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. S. Litvinov (Abteilung für Pathologie, Universiteit Leiden, Niederlande) zur Verfügung gestellt.
Eindringen von Antikörpern in mehrzellige Sphäroide
Gereinigte Antikörper UBS-54 und mutante C52 wurden nach Standardverfahren mit FITC markiert. Natürlich vorkommende mehrzellige Sphäroide der Ep-CAM+GLC-8-Karzinomzelllinie wurden unterschiedlich lange mit FITC-markierten humanen monoklonalen Antikörpern inkubiert und unter Verwendung eines BioRad MRC-1000 CLSM (BioRad, Hercules, CA) analysiert. Die konfokalen Bilder wurden nach 10–15 Minuten Inkubation im Mittelpunkt des mehrzelligen Sphäroids aufgenommen, wie es beschrieben ist (65).
Ergebnisse
Erzeugung und Selektion von mutanten Bibliotheken
Vor kurzem haben wir die Isolierung eines scFv, der gegen das tumorassoziierte Ep-CAM-Molekül gerichtet ist, und seine Umwandlung in einen intakten, funktionellen humanen IgG1-Antikörper mit einer Affinität von 5 nM beschrieben (19). Die leichte Keimlinien-Vk2-Kette dieses Antikörpers wurde durch leichte Vk-Ketten ersetzt, die durch PCR-Amplifikation von cDNA erhalten wurden, die aus gepoolten Blutlymphocyten von 15 gesunden Individuen extrahiert wurde. Eine Phagen-Display-Bibliothek von 2 × 10⁷ Klonen wurde erzeugt und anschließend einem Panning mit Paraformaldehyd-fixierten Ep-CAM-positiven LS174T-Kolon karzinomzellen unterzogen. Es sei angemerkt, dass 24 zufällig herausgesuchte Klone aus der unselektierten Bibliothek bei der durchflusscytometrischen Analyse alle an die Ep-CAM-transfizierte LME-6-Zelllinie, aber nicht an die parentale L929-Zelllinie banden, was die dominante Rolle des VH-Gens bei der Bestimmung der Ep-CAM-Spezifität zeigt. Die Zellen mit gebundenen Phagen wurden bei 37°C inkubiert und über 16 Zyklen alle 15 Minuten mit PBS/Tween (0,5%) gewaschen. In vorbereitenden Experimenten wurde bestimmt, dass Phagen, die das scFv UBS-54 exprimieren, bei der Durchflusscytometrie an LS174-Kolonkarzinomzellen nach diesen stringenten Waschverfahren nicht nachgewiesen werden konnten. Nach der ersten, zweiten und dritten Selektionsrunde konnten ungefähr 10⁷ Phagen gewonnen werden, während die Zahl der Waschzyklen in jeder anschließenden Runde um 3 zunahm. Eine Nucleotidsequenzanalyse von zufällig herausgesuchten Klonen ab der dritten Selektionsrunde zeigte bei ungefähr 50% der Klone eine identische Vk-Sequenz. Dieser Klon wurde A37 genannt.
Kristallographische Studien und CDR-Pfropfstudien haben überzeugend gezeigt, dass beide Mutationen im CDR und Gerüstbereich von V-Bereichen zu einer Affinitätsverbesserung von Antikörpern beitragen können (20, 21). Wir wählten daher DNA-Shuffling als zweite Mutagenesestrategie, da es zur Einführung von Mutationen sowohl in CDR als auch in Gerüstbereiche führt. Beim DNA-Shuffling werden Punktmutationen und ein Austausch von DNA-Sequenzen zwischen homologen Genen eingeführt, wodurch die natürliche Proteinevolution nachgeahmt wird (18, 19). Außerdem werden bei dieser Mutationsstrategie potentiell CDR-Blöcke eingeführt, die bereits in Bezug auf günstige Aminosäuren wie Tyr, Trp, Ser und Asp selektiert wurden. Die Aminosäuren Tyr, Trp, Ser und Asp sind für die Antigenbindung günstig, da sie einen geringen Konformationsfreiheitsgrad haben (weniger Entropie zu verlieren) und sie an einer Vielzahl von molekularen Wechselwirkungen, wie Wasserstoffbrücken, van-der-Waals-Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und aromatischer π-Stapelung (Tyr und Trp), beteiligt sind (22, 23). Das VH1-Gen, das das scFv UBS-54 codiert, wurde mit amplifizierten VH1-Gensegmenten aus dem Pool von gesunden Spendern gemischt. Fragmente mit 50–100 Basenpaaren, die nach Verdau mit DNase I erhalten wurden, wurden in einer Wiederzusammensetzungs-PCR verwendet und anschließend mit einem VH1-spezifischen 5'-Primer und einem "Spiked"-CDR3-Primer amplifiziert. Der "Spiked"-Oligonucleotidprimer wurde so gestaltet, dass eine niedrige Mutationsrate in den CDR3-Bereich der VH1-Gensegmente eingeführt wurde. Eine kleine Bibliothek von 4·10⁷ mutagenisierten VH1-Klonen wurde aufgebaut, indem man PCR-amplifiziertes Material in dem Konstrukt, das die leichte Kette A37 enthielt, ligierte. Diese Bibliothek wurde anschließend an intakten fixierten Zellen selektiert. Eine Sequenzanalyse von 24 Klonen, die zufällig aus der unselektierten DNA-Shuffling-Bibliothek herausgesucht wurden, zeigte im Durchschnitt ungefähr 18 Mutationen im gesamten VH-Gen mit im Durchschnitt 2,6 Mutationen im CDR3-Bereich. Diese Zahl von Mutationen fiel nach drei Selektionsrunden auf ungefähr 4 Mutationen in jedem VH-Gen. Es sei angemerkt, dass alle Klone, die nach drei Selektionsrunden analysiert wurden, den ursprünglichen UBS-54-CDR3-Bereich enthielten. Da nach drei Selektionsrunden in Bezug auf die Bindung an LST174-Karzinomzellen kein einziger dominanter Klon nachgewiesen werden konnte, wurde der Klon B43 zufällig für die weitere Analyse ausgewählt. Diese Wahl beruhte auf der Beobachtung, dass er mehrere Mutationen enthielt, die häufig in anderen Klonen in dieser Sammlung beobachtet wurden. Anschließend wurde ein DNA-Shuffling mit der leichten Kette durchgeführt, wobei die Sammlung von Vk-Gensegmenten verwendet wurde, die auch für den Aufbau der Shuffling-Bibliothek der leichten Ketten verwendet wurde. Die resultierende Bibliothek umfasste 1·10⁷ Klone und wurde in Bezug auf die Bindung der intakten Zellen unter stringenten Bedingungen selektiert. Nach drei Selektionsrunden wurde eine Sequenzanalyse durchgeführt und zeigte einen einzigen dominanten Klon (31 von 70 Sequenzen), nämlich den Klon C52.
Rekonstruktion von intakten humane monoklonalen Antikörpern
Die V-Bereiche der mutanten scFv A37, B43 und C52 wurden in eukaryontischen Expressionsvektoren für die Produktion von humanen monoklonalen IgG1-Antikörpern in BHK-Zellen rekloniert (17). Immunglobulin wurde aus dem Überstand von stabil transfizierten Zelllinien gereinigt, wobei Protein-A-Affinitäts chromatographie verwendet wurde, wie es beschrieben ist (17). Obwohl intakte und funktionelle humane monoklonale Antikörper aus dem Überstand von Klon B43 isoliert werden konnten (Daten nicht gezeigt), zeigten sie in der BiaCore-Analyse keine signifikante Verbesserung der Affinität zu rekombinantem Ep-CAM (siehe nächsten Abschnitt). Daher konzentrierten wir uns auf das ursprüngliche UBS-54 und die A37- und C52-Mutanten. Die Integrität der humanen monoklonalen IgG1/K-Antikörper A37 und C52 wurde durch Coomassie-Färbung von SDS/PAGE-Gelen bestätigt, die unter denaturierenden und nichtdenaturierenden Bedingungen laufen gelassen wurden (1). Gereinigte humane monoklonale Antikörper A37 und C52 behielten ihre Spezifität bei, was bestimmt wurde, da sie an die Ep-CAM-transfizierte LME-6-Zelllinie, aber nicht an die untransfizierte L929-Parentalzelllinie banden (1).
Biacore-Analyse
Die kinetischen Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten der ursprünglichen humanen monoklonalen Antikörper UBS-54 und der mutanten humanen monoklonalen Antikörper A37 und C52 wurden durch Oberflächenplasmonenresonanz bestimmt (Tabelle 1). Der ursprüngliche humane monoklonale Antikörper UBS-54 und der murine Anti-Ep-CAM-Antikörper 323/A3 wurden als Kontrollen verwendet und zeigten ein mittleres KD von 6 nM bzw. 0,5 nM. Der humane monoklonale Antikörper A37 mit der leichten Shuffled-Vk-Kette zeigte eine Affinität von 1,6 nM (ca. vierfache Erhöhung). Die Bindungsaffinität des humanen monoklonalen Antikörpers C52, der die leichte DNA-Shuffled-Vk-Kette enthält, war im Vergleich zu dem ursprünglichen humanen monoklonalen Antikörper UBS-54 15-fach verbessert, was einen humanen monoklonalen Antikörper mit einem KD = 4·10^–10 nM ergab. Die Verbesserung war hauptsächlich das Ergebnis einer niedrigeren Dissoziationskonstante.
Strukturanalyse
Eine Sequenzanalyse zeigt, dass die in mutantem A37 selektierte leichte Kette nur 54% Sequenzhomologie mit der ursprünglichen leichten Kette in UBS-54 aufweist und eine kürzere CDR1-Sequenz besitzt (2). Die leichte A37-Kette ist ein Vertreter der Vk3-genfamilie mit dem höchsten Grad der Homologie mit dem DPK22/A27-Keimliniengensegment (24). Obwohl der Vk-Primer vorzugsweise an Vk2-Gene assoziiert, stellten wir fest, dass Vk3-Gene auch in unserer Shuffling-Bibliothek vorhanden sind. Die kürzere CDR1-Schleife in C52 scheint in geringerem Ausmaß in die Antigenbindungsstelle vorzuragen, was bei Anti-Protein-Antikörpern eine flache Kontaktfläche schafft, die energetisch günstig ist (23; 3).
Die affinitätsgereifte Mutante C52 unterscheidet sich von A37 durch drei Aminosäureänderungen in der schweren Kette (die Mutationen des VH B43, die durch DNA-Shuffling von VH eingeführt wurden) und durch acht zusätzliche Mutationen in der leichten Kette (die Mutationen des VL C52, die durch DNA-Shuffling von VL eingeführt wurden) (2 und 3). Die Mutationen Ser^H16→Ala, Arg^H19→Lys, Arg^L40→Pro, Ser^L65→Thr und Glu^L105→Asp befinden sich innerhalb des Gerüsts, weit weg von der Kombinationsstelle, und sind wahrscheinlich nicht an der Stabilisierung der Konformation der CDR-Schleifen beteiligt. Die Mutation Ile^H52→Val im CDR H2 kann zu einer Beseitigung einer abstoßenden sterischen Wechselwirkung des Cd-Atoms von Ile^H52 führen. Da das mutante B43 mit denselben Mutationen jedoch keine signifikante Erhöhung der Antigenbindungsaffinität zeigt (Daten nicht gezeigt), scheint die Gesamtwirkung dieser Mutation gering zu sein. Der Rest L50 (Mutation Ala^L50→Gly) ist gemäß der Wissensdatenbank häufig am Antigenkontakt beteiligt. Eine Änderung der Gerüstkonformation des CDR L2 aufgrund der höheren Konformationsfreiheit von Gly ist nicht wahrscheinlich, da der CDR L2 eine konservierte kanonische Struktur hat (25). Vermutlich wegen des relativ großen Abstands zwischen der Oberseite des CDR L2 und der Oberfläche des Antikörpers, die die Antigenbindungsstelle beinhaltet, scheinen die energiereichen Wechselwirkungen für Aminosäuren mit großen Seitenketten reserviert zu sein.
Vier Mutationen befinden sich im CDR L1, Thr^L28→Ser, Ile^L29→Val, Asn^L30A→Ser und Asn^L31→Ser (2 und 3). Die Wissensdatenbank zeigt, dass die Antikörperpositionen L28, L29 und L31 in Protein-Antikörper-Komplexen sehr selten wechselwirken, im Gegensatz zur Position L30A. Im Falle der Position L28 (Mutation Thr^L28→Ser) ist dies wahrscheinlich auf ihre periphere Lokalisierung zurückzuführen. Die Seitenkette von A37 Ile^L29 ist innerhalb des CDR L1 vergraben, was die Schleife durch Packungswechselwirkungen, die von C52 Val^L29 nachgeahmt werden, stabilisiert. Die Seitenkette von A37 Asn^L31 scheint von der Bindungsstelle weggewandt zu sein. Die Mutation C52 Ser L31 erlaubt eine zusätzliche Wasserstoffbrücke zwischen der Hydroxygruppe und der Hauptkettencarbonylgruppe von Val^L29, die die CDR-L1-Schleife weiter stabilisiert. Die Hotspot-Mutation Asn^L30A→Ser beeinflusst höchstwahrscheinlich die Wechselwirkung mit Ep-CAM direkt.
Funktionelle Analyse
Die Verfügbarkeit von zwei humane monoklonalen Anti-Tumor-Antikörpern mit derselben Epitopspezifität, aber unterschiedlichen Affinitäten erlaubte es uns, den Einfluss der Affinität auf die in-vitro-Tumorzellen-Abtötungskapazität in Assays der antikörper- und komplementabhängigen zellulären Cytotoxizität (ADCC bzw. CDCC) zu bewerten. ADCC mit LS174T-Tumorzielzellen und PBMC als Quelle für Effektorzellen führten durchweg zu einer ca. 10% niedrigeren Tumorzelllyse bei dem humanen monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität C52 im Vergleich zu dem ursprünglichen humanen monoklonalen Antikörper UBS54 (4). Die fortwährend niedrigere Tumorzelllyse, die über den humanen monoklonalen Antikörper C52 vermittelt wird, erfolgt mit sättigenden Antikörperkonzentrationen, was durch die Plateauform in der Kurve angezeigt wird (4). Auf der Basis von Tierversuchen und der verbesserten Leistungsfähigkeit von chimärischen monoklonalen Human/Maus-Antikörpern bei Patienten wird ADCC als wichtiger immunologischer Mechanismus beider Abtötung von Tumorzellen angesehen (26, 28). Eine direkte inhibitorische Wirkung von therapeutischen Antikörpern auf das Tumorzellwachstum oder die Induktion der Tumorzellapoptose, die über die Bindung von Antikörpern an ihren Zielrezeptor vermittelt wird, kann ebenfalls zu klinischer Effizienz beitragen (29, 30). Um zu bewerten, ob die weniger effiziente Tumorzelllyse, die über C52 vermittelt wird, von der Signaltransduktion über Ep-CAM unabhängig ist, wurde eine ADCC mit HMA-Zelllinien, die mit Ep-CAM-cDNA der vollen Länge transfiziert waren, oder mit einer mutanten Ep-CAM-cDNA, der der cytoplasmatische Schwanz fehlt, durchgeführt. Bei beiden Transfektanten beobachteten wir reproduzierbar dieselbe geringere Effizient des Abtötens von Tumorzellen bei dem mutanten humanen monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität C52, was vermuten lässt, dass der beobachtete Unterschied in der Abtötungskapazität zwischen UBS54 und C52 nicht durch Variationen in der Signaltransduktion über Ep-CAM beeinflusst wird (Daten nicht gezeigt).
Dieselben Experimente, die mit Vollblut anstelle von gereinigten PBMC als Quelle von Effektorzellen durchgeführt wurden, zeigten mit dem mutanten humanen monoklonalen Antikörper hoher Affinität C52 eine signifikant effizientere Tumorzelllyse (4). Wir stellten wir die Hypothese auf, dass die verbesserte Leistungsfähigkeit des humanen monoklonalen Antikörpers hoher Affinität C52 durch eine effizientere CDCC verursacht war. Tatsächlich vermittelte der humane monoklonale Antikörper C52 das Abtöten von Tumorzellen in Abwesenheit von Effektorzellen und mit Serum als Komplementquelle effizienter (4). Anscheinend führt die geringere Dissoziationsgeschwindigkeit von mutantem humanem monoklonalem Antikörper C52 zu einer effizienteren Vernetzung des Komplementfragments Clq.
Einfluss der Antikörperaffinität auf das Eindringen in mehrzellige Sphäroide von Tumorzellen
Die tiefe Perkolation und gleichmäßige Verteilung über den Tumor bei monoklonalen Antikörpern, die in der Immuntherapie von festen Tumoren angewendet werden, gilt als wichtig für eine optimale therapeutische Wirkung. In-vitro- und in-vivo-Studien ließen vermuten, dass der Transport von Antikörpern durch das Tumorinterstitium durch die spezifische Bindung an das Tumorantigen verzögert wird. Diese sogenannte Bindungsstellenbarriere ist eine Funktion der Bindungsaffinität, der Antigenkonzentration und der Antikörpertransportkoeffizienten (31, 32). Um die relative Bindungsstellenbarrierenwirkung der humanen monoklonalen Anti-Tumor-Antikörper mit hoher und niedrigerer Affinität zu bestimmen, verwendeten wir ein in-vitro-Modellsystem eines mehrzelligen Sphäroids. Die kleinzellige Lungenkarzinom-Zelllinie Glc-8, die große Mengen an Ep-CAM exprimiert und in mehrzelligen Sphäroiden von etwa 100 Zellen wächst, wurde mit 10 mg FITC-konjugiertem UBS54 oder C52 inkubiert. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie der Sphäroide nach 10–15 Minuten Inkubation zeigte eine Bindungsstellenbarriere bei dem humanen monoklonalen Antikörper mit höherer Affinität. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine gleichmäßige Bindung des humanen monoklonalen Antikörpers UBS-54 an Zellen in den Sphäroiden beobachtet, während die Bindung der Mutante C52 mit höherer Affinität fast auf die äußere Zellschicht beschränkt war (5). Nach einer Stunde Inkubation wurde eine gleichmäßige Bindung an alle Zellen in dem Sphäroid für beide Antikörper beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1: SDS/PAGE-Analyse von gereinigten humanen monoklonalen Antikörpern unter reduzierenden (A) und nichtreduzierenden (B) Bedingungen (UBS-54, Spur 1 und 4; A37, Spur 2 und 5; C52, Spur 3 und 6). MW: Molekulargewichtmarker in Kilodalton. Bild C: Anfärbung der Ep-CAM-negativen parentalen L929-Zelllinie (dünne Linie) und der stabil transfizierten Ep-CAM-positiven Zellen (dicke Linie) mit den humanen monoklonalen Antikörpern UBS-54, A37 und C52.
2: Sequenzvergleich des ursprünglichen UBS-54 und der mutanten höherer Affinität A37 und C52. Man beachte die kürzere CDR1-Sequenz in der leichten Shuffled-Vk3-Kette. Die Nummerierung erfolgt gemäß Chothia (25).
3: Modellierung des ursprünglichen UBS-54 (A) und der mutagenisierten Antikörper-V-Bereiche von C52 (B) zeigt die kürzere kanonische Struktur von LCDR1 (Pfeil). Die Vergrößerung (C) zeigt die Positionen der mutierten Reste in LCDR1 (Thr^L28→Ser, Ile^L29→Val, Asn^L30A→Ser und Asn^L31→Ser). Die Position Ser^L30 beeinflusst höchstwahrscheinlich direkt die Wechselwirkung mit Ep-CAM. Eine Wasserstoffbrücke zwischen Ser^L31 und Val^L29 führt zu einer Stabilisierung der LCDR1-Schleife.
4: Antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC) und komplementabhängige zelluläre Cytotoxizität (CDCC) unter Verwendung der humanen monoklonalen Antikörper UBS-54
und C52 (☐). Die gezeigten Experimente sind repräsentativ für wenigstens 6 Experimente, die mit Effektorzellen verschiedener Spender durchgeführt wurden.
5: Konfokale Scanning-Laser-Mikroskop-Bilder, die innerhalb des Zentrums von mehrzelligen Glc-8-Sphäroiden mit FITC-markiertem humanem monoklonalem Antikörper UBS54 (A) und FITC-markiertem humanem monoklonalem Antikörper C52 (B) aufgezeichnet wurden.
Tabelle 1: Affinitäten und Bindungskinetik der humanen monoklonalen Antikörper UBS-54, A37 und C52. Der Standardfehler des Mittelwerts ist in Klammern angegeben.
Literatur

1 Berek, C., & Milstein, C. 1987. Mutation drift and repertoire shift in the maturation of the immune response. Immunol. Rev. 96: 23.
2 Winter, G. & Milstein, C. 1991. Man-made antibodies. Nature. 349: 293.
3 Vaughan, T. J., Osbourn, J. K., & Tempest, P. R. 1998. Human antibodies by design. Nat. Biotechnol. 16, 535.
4 Winter, G., Griffiths, A. D., Hawkins, R. E., & Hoogenboom, H. R. 1994. Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol. 12: 433.
5 Burton, D. R., & Barbas, C. F. 1994. Human antibodies from combinatorial libraries. Adv. Immunol. 57: 191.
6 Hoogenboom, H. R. 1994. Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies. Trends in Biotechnol. 15: 62.
7 Marks, J. D., Griffiths, A. D., Malmqvist, M., Clackson, T., Bye, J. M., & Winter, G. 1992. Bypassing immunisation: high affinity human antibodies by chain shuffling. Bio/Technology. 10: 779.
8 Clackson, T., Hoogenboom, H. R., Griffiths, A. D., & Winter, G. 1991. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature. 352: 624.
9 Hawkins, R. E., Russel, S. J., & Winter. G. 1992. Selection of phage antibodies by binding affinity: mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol. 226: 889.
10 Low, N. M., Holliger, P. H., & Winter, G. 1996. Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J. Mol. Biol. 260, 359.
11 Barbas, C. F., Hu, D., Dunlop, N., Sawyer, L., Cababa, D., Hendry, R. M., Nara, P. L., & Burton, D. R. 1994. In vitro evolution of a neutralizing human antibody to human immunodeficiency virus type 1 to enhance affinity and broaden strain cross-reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 3809.
12 Yang, W.-P., Green, K., Pinz-Sweeney, S., Briones, A. T., Burton, D. R., & Barbas, C. F. 1995. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human ant-HIV-1 antibody into the picomolar range. J. Mol. Biol. 254: 392.
13 Balint, R. F., & Larrick, J. W. 1993. Antibody engineering by parsimonious mutagenesis. Gene. 137: 109.
19 Schier, R., Bye, J., Apell, G., McCall, A., Adams, G. P., Malmqvist, M., Weiner, L. M., & Marks, J. D. 1996. Isolation of high-affinity monomeric human anti-c-erbB-2 single chain Fv using affinity-driven selection. J. Mol. Biol. 255: 28.
15 Chowdhury PS, Pastan I. 1999. Improving antibody affinity by mimicking somatic hypermutation in vitro. Nat Biotethnol 17: 568.
16 Neri D, Carnemolla B, Nissim A, Leprini A, Querze G, Balza E, Pini A, Tarli L, Halin C, Neri P, Zardi L, Winter G. 1997. Targeting by affinity-matured recombinant antibody fragments of an angiogenesis associated fibronectin isoform. Nat Biotechnol 12: 1271.
17 Huls, G. A., et al. 1999. A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments. Nat Biotechnol. 17: 276.
18 Stemmer, W. P. C. 1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 10747.
19 Stemmer, W. P. C. 1994. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature. 370: 389.
20 Foote, J., & Winter, G. 1992. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J. Mol. Biol. 224: 487.
21 Wedemayer, G. J., Patten, P. A., Wang, L. H., Schultz, P. G., & Stevens, R. C. 1997. Structural insights into the evolution of an antibody combining site. Science 276: 1665.
22 Mian, I. S., Bradwell, A. R., & Olson, A. J. 1991. Structure, function and properties of antibody binding sites. J. Mol. Biol. 217: 133.
23 Davies, D. R., Padlan, E. A., & Sheriff, S. 1990. Antigen-antibody interactions. Annu. Rev. Biochem. 59: 439.
24 www.mrc-cpe.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html Tomlinson, I. M., Williams, S. C., Corbett, S. J., Cox, J. P. L., & Winter, G. V 1997. Base: the dadabase of human antibody genes. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK.
25 Al-Lazikani, B., Lesk, A. M, & Chothia, C. 1997. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 273: 927.
26 Surfus, J. E., Hank, J. A., Oosterwijk, E., Welt, S., Lindstrom, M. J., Albertini, M. R., Schiller, H. J. H., & Sondel, P. M. 1996. Anti-renal-cell carcinoma chimeric antibody G250 facilitates antibody-dependent cellular cytotoxicity with in vitro and in vivo interleukin-2-activated effectors J. Immunother. 3: 184.
27 Denkers, E. Y., Badger, C. C., Ledbetter, J. A., & Bernstein, I. D. 1985. Influence of antibody isotype on passive serotherapy of lymphoma: J. Immunol. 135: 2183.
28 Kaminski, M. S., Kitamura, K., Maloney, D. G., Campbell, M. J., & Levy, R. 1986. Importance of antibody isotype in monoclonal anti-idiotype therapy of a murine B cell lymphoma: a study of hybridoma class switch variants. J. Immunol. 136: 1123.
29 Ghetie, M. A., Podar, E. M., Ilgen, A., Gordon, B. E., Uhr, J. W., & Vitetta, E. S. 1997. Homodimerization of tumor-reactive monoclonal antibodies markedly increases their ability to induce growth arrest or apoptosis of tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 7509.
30 Tutt, A. L., et al. 1998. Monoclonal antibody therapy of B cell lymphoma: signalling activity on tumor cells apears more important that recruitment of effectors. J. Immunol. 161: 3176.
31 Osdol, W., Fujimori, K., & Weinstein, J. N. 1991. An analysis of monoclonal antibody distribution in microscopic tumour nodules: Consequences of a "Binding Site Barrier". Cancer Res. 51: 4778.
32 Langmuir, V. K., Mendonca, H. L., & Woo, D. V. 1992. Comparisons between two monoclonal antibodies that bind to the same antigen but have differing affinities: uptake kinetics and 125I-antibody therapy efficacy in multicell spheroids. Cancer Res. 52: 4728.
33 Hawkins, R. E., Russel, S. J., Baier, M., & Winnter, G. 1993. The contribution of contact and non-contact residues of antibody in the affinity of binding to antigen. J. Mol. Biol. 234: 958.
34 Tomlinson, I. M. T., Walter, G., Jones, P. T., Dear, P. H., Sonhammer, E. L-L., & Winter, G. 1996. The imprint of somatic hypermutation on the repertoire of human germline V genes. J. Mol. Biol. 256: 813.
35 Fujimori, K., Covell, D. C., Fletcher, J. B., & Weinstein, J. N. 1989. Modeling analysis of the global and microscopic distribution of IgG, F(ab')₂ and Fab in tumors. Cancer Res. 49: 5656.
36 Sung, C., Shockley, T. R., Morrison, P. F., Dvorak, H. F., Yarmush, M. L., & Dedrick, R. L. 1992. Predicted and observed effects of antibody affinity and antigen density on monoclonal antibody uptake in solid tumors. Cancer Res. 52: 377.
37 Van de Winkel, J. G. J., & Capel, P. J. A. 1993. Human IgG Fc receptor heterogeneity: molecular aspects and clinical implications. Immunol. Today. 14: 215.
38 Van de Winkel, J. G. J., Boonen, G. J. J. C., Janssen, P. L. W., Vlug, A., Hogg, N., & Tax, W. J. M. 1989. Activity of two types of Fc receptors, FcγRI and FcγRII, in human monocyte cytotoxicity to sensitized erythrocytes. Scand. J. Immunol. 29: 23.
39 Torigoe, C., Inman, J., & Metzger, H. 1998. An unusual mechanism for ligand antagonism. Science. 281: 568.
40 McKeithan, T. W. 1995. Kinetic proofreading in T-cell receptor signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5092.
41 Torigoe, C., Goldstein, B., Wofsy, C., & Metzger, H. 1997. Shuttling of initiating kinase between discrete aggregates of the high affinity receptor for IgE regulates the cellular response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 1372.
42 Seya, T., Hara, T., Matsumoto, M., & Akedo, H. 1990. Quantitative analysis of membrane cofactor protein (MCP) of complement. J. Immunol. 145: 238.
43 Panneerselvam, M., Welt, S., Old, L. J., & Vogel, C-W. 1986. A molecular mechanism of complement resistance of human melanoma cells. J. Immunol. 136: 2534.
44 Cheung, N-K, V., Walter, E. I., Smith-Mensah, W. H., Ratnoff, W. D., Tykocinski, M. L., & Medof, M. E. 1988. Decayaccelerating factor protects human tumor cells from complement-mediated cytotoxicity in vitro. J. Clin. Invest. 81: 1122.
45 Kumar, S., Vinci, J. M., Pytel, B. A., & Baglioni, C. 1993. Expression of messenger RNAs for complement inhibitors in human tissues and tumors. Cancer Res. 53: 348.
46 Gorter, A., Block, V. T., Haasnoot, W. H. B., Ensink, N. G., Daha, M. R., & Fleuren, G. J. 1996. Expression of CD46, CD55, and CD59 on renal tumor cell lines and their role in preventing complement-mediated tumor cell lysis. Lab. Invest. 74: 1039.
47 Berends, D., van der Kwast, T. H., de Both, N. J., & Mulder, P. G. 1989. Factors influencing antibody-mediated cytotoxicity during the immunotherapy of Rauscher-virusinduced myeloid leukemic cells. Cancer Immunol. Immunother. 28: 123.
48 De Kruif, J., Boel, E., & Logtenberg, T. 1995. Selection and application of human single chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J. Mol. Biol. 248: 97.
49 Boel, E. PhD. Thesis. 1998. University of Utrecht, The Netherlands.
50 Balzar, M., Bakker, H. A., Briaire-de-Bruijn, I. H., Fleuren, G. J., Warnaar, S. O., & Litvinov, S. V. 1998. Cytoplasmic tail regulates the intercellular adhesion function of the epithelial cell adhesion molecule. Mol. Cell. Biol. 18: 4833.
51 Martin, A. C. R. & Thornton, J. M. 1996. Structural families in loops of homologus proteins: automatic classification, modelling and application of antibodies. J. Mol. Biol. 263: 800.
52 Kwong, P. D., Wyatt, R., Robinson, J., Sweet, R. W., Sodroski, J., & Hendrickson, W. A. 1998. Structure of an HIV Gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody: Nature. 393: 648.
53 Sussman, J. L., et al. 1998. Database of Three-Dimensional Structure Information of Biological Macromolecules. Acta Cryst. D54: 1078.
54 Pei, X. Y., Holliger, P., Murzin, A. G., & Williams, R. L. 1997. The 2.0-A resolution crystal structure of a trimeric antibody fragment with noncognate VH-VL domain pairs shows a rearrangement of VH CDR3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 9637.
55 Willliams, G., et al. 199. Dissection of the extracellular human interferon gamma receptor alpha-chain into two immunoglobulin-like domains. Production in an Escherichia coli thioredoxin gen fusion expression system and recognition by neutralizing antibodies. Biochemistry 34: 1787.
56 Haynes, M. R., Stura, E. A., Hilvert, D., & Wilson, I. A. 1994. Routes to catalysis: structure of a catalytic antibody and comparison with its natural counterpart. Science. 263: 646.
57 Vriend, G. 1990. WHAT IF: A molecular modeling and drug design program. J. Mol. Graph. 8: 52.
58 Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S., & Thornton, J. M. 1993. PROCHECK: A program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 265: 283.
59 McDonald, I. K., & Thorntan, J. M. 1994. Satisfying hydrogen bonding potential in proteins. J. Mol. Biol. 238: 577.
60 Wallace, A. C., Laskowski, R. A. & Thornton, J. M. 1995. LIGPLOT: A program to generate schematic diagrams of proteinligand interactions. Protein Eng. 8: 127.
61 Altschul, S. E., et al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389.
62 Valerius, T., et al: 1993. Involvement of the high affinity receptor for IgG (FcγRI:CD64) in enhanced tumor cell cytotoxicity of neutrophils during G-CSF therapy. Blood. 82: 931.
63 Van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M., van der Tol, M. E., & Verhoef, J. 1989. Complement-mediated phagocytosis of herpes simplex virus by human granulocytes: binding or ingestion. J. Clin. Invest. 84: 107.
64 Velders, M. P., van Rhijn, C. M., Oskam, E., Fleuren, G. J., Warnaar, S. O., & Litvinov, S. V. 1998. The impact of antigen density and antibody affinity on antibody-dependent cellular cytotoxicity: relevance for immunotherapy of carcinomas. Br. J. Cancer. 74: 478.
65 Hjelstuen, M. H., Rasch-Halvorsen, K., Bruland, O., & De L Davies, C. 1998. Uptake, penetration, and binding of monoclonal antibodies with increasing affinity in human osteosarcoma multicell spheroids. Anticancer Res. 18: 153.

Sequenzprotokoll

Claims

Humaner monoklonaler Antikörper, der an humanes Ep-CAM binden kann, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper Folgendes umfasst: a) einen schwere-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz GGTFSSY, einen schwere-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz IPIFGT, einen schwere-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz DPFLHY, einen leichte-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz RSSQSLLHSNGYNYLD, einen leichte-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz LGSNRAS und einen leichte-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz MQALQTFTF; b) einen schwere-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz GGTFSSY, einen schwere-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz IPIFGT, einen schwere-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz DPFLHY, einen leichte-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz RASQTISNNYLA, einen leichte-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz AASSRAT und einen leichte-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz AQGELYPRQF; oder c) einen schwere-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz GGTFSSY, einen schwere-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz VPIFGT, einen schwere-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz DPFLHY, einen leichte-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz RASQSVSSSYLA, einen leichte-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz GASSRAT und einen leichte-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz AQGELYPRQF.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper einen schwere-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz GGTFSSY, einen schwere-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz IPIFGT, einen schwere-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz DPFLHY, einen leichte-Kette-CDR1-Bereich mit der Aminosäuresequenz RSSQSLLHSNGYNYLD, einen leichte-Kette-CDR2-Bereich mit der Aminosäuresequenz LGSNRAS und einen leichte-Kette-CDR3-Bereich mit der Aminosäuresequenz MQALQTFTF umfasst.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine variable schwere Kette mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 10 umfasst.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine variable leichte Kette mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 11 umfasst.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine Affinitätskonstante zu humanem Ep-CAM von 6 nM hat.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizitätsaktivität hat, die höher ist als die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizitätsaktivität eines humanen monoklonalen Antikörpers, der an humanes Ep-CAM binden kann und eine Affinitätskonstante zu humanem Ep-CAM hat, die niedriger als 6 nM ist.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein IgG1-Molekül ist.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper fluoreszenzmarkiert ist.
Humaner monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines humanen monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors.
Verwendung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein fester Tumor ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Kolonkarzinom ist.