CN116903757B - Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体 - Google Patents

Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体 Download PDF

Info

Publication number
CN116903757B
CN116903757B CN202310907278.6A CN202310907278A CN116903757B CN 116903757 B CN116903757 B CN 116903757B CN 202310907278 A CN202310907278 A CN 202310907278A CN 116903757 B CN116903757 B CN 116903757B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
region
binding molecule
chimeric antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310907278.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116903757A (zh
Inventor
叶倩
胡艳平
陈洁
陈杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Ronggu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Ronggu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Ronggu Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Ronggu Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310907278.6A priority Critical patent/CN116903757B/zh
Publication of CN116903757A publication Critical patent/CN116903757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116903757B publication Critical patent/CN116903757B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001112—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001129—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153 or CD154

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明涉及CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体。具体提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含作为第一识别区的含单域抗体的结合分子和作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段。

Description

CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体。
背景技术
近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CAR-T)疗法是国内外研究的热点。CAR是一种人为构建的嵌合分子，由抗原识别区、共刺激因子和效应区等几个元件共同组成，修饰表达在免疫细胞后可实现对靶细胞的识别、信号转导和杀伤。CAR-T疗法是将自体或异体来源的T细胞分离后，经过体外激活和导入编码CAR的基因后，扩增出足够量的CAR-T细胞再输给肿瘤患者，放大患者体内的免疫细胞抗肿瘤功能。不过，靶向CD19的CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤上虽然取得了巨大成功，但也存在肿瘤耐药的局限性。
在CAR-T疗法上，多靶向疗法的开发已进行了多种策略的实践，但类似的CAR-NK细胞疗法未见报道。
靶向双抗原的策略选择有四种做法，具体包括鸡尾酒疗法(两种CAR-T细胞序贯或者混合治疗)，两种CAR慢病毒载体共转导制备两种CAR-T细胞的混合物，基因共表达(Bicistronic)的载体设计可以同时表达两种独立的CAR分子(BiCAR)，以及两个scFv被串联(Tandem)设计成一个CAR分子(TanCAR)。鸡尾酒疗法是最直接的方法，但这种策略需要独立构建达到GMP标准的两种CAR-T细胞，大幅提高工艺难度和增加成本。而混合不同的CAR慢病毒载体对T细胞进行转导，获得的CAR-T混合物比例不可控，难以形成同质化的产品标准。BiCAR同时表达两种独立的CAR分子，赋予T细胞经典的“逻辑或”功能，即通过对其中一种抗原的识别即可激活CAR-T细胞。而TanCAR也可达到这种“逻辑或”的功能，与BiCAR相比，可以大幅减少慢病毒载体的编码量，且表达丰度更为均一。但值得注意的是，TanCAR分子的构建涉及双scFv以及VH和VL的排列组合，还需要考虑抗原表位的时空位置和间距以达到最优的效果。已有研究均凸显了TanCAR的抗原结合区进行优化的重要性。目前尚没有研究揭示scFv和纳米抗体组合的TanCAR优化设计。两者的排列组合也会引起T/NK细胞下游信号转导的差异，从而决定细胞不同的功能输出。
发明内容
本发明提供了一种传统抗体和纳米抗体双靶向的CAR及其免疫细胞疗法。
本发明首先提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含作为第一识别区的含单域抗体的结合分子和作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述第一识别区和第二识别区靶向相同或不同的抗原，例如肿瘤抗原。
在一个或多个实施方案中，所述第一识别区是单域抗体VHH。
在一个或多个实施方案中，所述第二识别区是第二抗体的scFv。
在一个或多个实施方案中，所述第一识别区位于第二抗体或其抗原结合片段的N端、C端、或VL和VH之间。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞外靶标识别区从N端到C端依次包含：
(1)第二抗体的VL、单域抗体VHH、和第二抗体的VH，
(2)第二抗体的VL、第二抗体的VH、和单域抗体VHH，
(3)单域抗体VHH、第二抗体的VL、和第二抗体的VH。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19和/或CD70。
本发明还提供一种CD70结合分子，包含抗CD70单域抗体(VHH)，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:4所示的VHH的FR区。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子是包含一条、两条或多条所述VHH的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体的抗原结合片段是VHH。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子、单域抗体或重链抗体为嵌合抗体或完全人抗体。
本发明还提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含本文任一实施方案所述的CD70结合分子。
在一个或多个实施方案中，所述胞外靶标识别区还包含靶向肿瘤抗原的第二抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述第二抗体或其抗原结合片段是第二抗体的scFv。
在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子位于第二抗体或其抗原结合片段的N端、C端、或VL和VH之间。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞外靶标识别区从N端到C端依次包含：
(1)第二抗体的VL、所述CD70结合分子、和第二抗体的VH，
(2)第二抗体的VL、第二抗体的VH、和所述CD70结合分子，
(3)所述CD70结合分子、第二抗体的VL、和第二抗体的V。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19和/或CD70。
在一个或多个实施方案中，所述第二抗体的LCDR1如SEQ ID NO:6所示，LCDR2如SEQ ID NO:7所示，LCDR3如SEQ ID NO:8所示，HCDR1如SEQ ID NO:9所示，HCDR2如SEQ IDNO:10所示，HCDR3如SEQ ID NO:11所示。
在一个或多个实施方案中，所述第二抗体的VL如SEQ ID NO:12所示，VH如SEQ IDNO:13所示。
在一个或多个实施方案中，嵌合抗原受体的胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有所述胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，该嵌合抗原受体还在胞外靶标识别区的N端还包含信号肽。在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽。优选地，所述信号肽为CD8α信号肽。更优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第1-21位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自CD8α铰链区、CD28铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区和IgG4 Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区是CD8α铰链区；更优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第399-443位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8α跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD8α跨膜区；更优选地，所述CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第444-467位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激域为4-1BB的胞内结构域；优选地，所述4-1BB胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第468-509位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第510-622位氨基酸残基所述。
本发明还提供多核苷酸，包含选自以下的序列：
(1)本文任一实施方案所述CD70结合分子、或嵌合抗原受体的编码序列；
(2)(1)的互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:5或15所示的序列。
本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
本发明还提供包含本文任一实施方案所述CD70结合分子的噬菌体。
在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子展示于所述噬菌体表面。
本发明还提供一种宿主细胞，所述细胞：
(1)表达本文任一实施方案所述CD70结合分子、或嵌合抗原受体；
(2)包含本文所述的多核苷酸；和/或
(3)包含本文所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞，例如T细胞、肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞、自然杀伤(NK)细胞、或自然杀伤T(NKT)细胞。
本发明还提供一种产生CD70结合分子、或嵌合抗原受体的方法，包括：在适合产生CD70结合分子、或嵌合抗原受体的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述CD70结合分子、或嵌合抗原受体。
本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述CD70结合分子、嵌合抗原受体、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症或自身免疫疾病。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是CD19和/或CD70相关癌症。优选地，所述癌症包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、T细胞肿瘤、肾透明细胞癌、脑胶质瘤。
在一个或多个实施方案中，所述自身免疫疾病是系统性红斑狼疮。
本发明还提供本文任一实施方案所述CD70结合分子、嵌合抗原受体、或作为免疫细胞的宿主细胞在制备用于预防或治疗癌症或自身免疫疾病的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是CD19和/或CD70相关癌症。优选地，所述癌症包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、T细胞肿瘤、肾透明细胞癌、脑胶质瘤。
在一个或多个实施方案中，所述自身免疫疾病是系统性红斑狼疮。
本发明还提供一种治疗或预防癌症或自身免疫疾病的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的CD70结合分子、或嵌合抗原受体、作为免疫细胞的宿主细胞、或药物组合物。
本发明还提供一种检测CD70的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述CD70结合分子、编码所述CD70结合分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸构建物、包含所述CD70结合分子的噬菌体、或表达所述CD70结合分子的宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测CD70与CD70结合分子的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测结合试剂是能与CD70结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述CD70结合分子或分离地存在于试剂盒中。
本发明还提供一种检测样品中CD70存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述CD70结合分子与样品孵育，和检测CD70与CD70结合分子的结合，从而确定样品中CD70存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
本发明还提供本文任一实施方案所述CD70结合分子在制备用于检测样品中CD70、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
本文优势：
1.纳米抗体和scFv双靶向CAR分子结构；
2.使用双峰驼制备抗人CD70的纳米抗体，用以靶向CD70；
3.靶向CD19的scFv和靶向CD70的纳米抗体组合成新型的CAR分子结构；
4.构建CD19和CD70双靶向的CAR-NK细胞，克服CD19单靶点的耐药缺陷治疗B细胞恶性肿瘤；CAR-NK细胞来自异体，可开发成“现货型”的产品。
附图说明
图1显示免疫后提取骆驼淋巴细胞RNA。
图2显示骆驼VHH噬菌体展示库克隆数检测。
图3显示CD70抗原包被结合噬菌体Elisa结果。
图4显示抗体蛋白重组表达后与Raji细胞表面的结合。
图5显示候选抗体6A作为抗原结合区的CAR-NK细胞对CD70阳性细胞的特异性识别和杀伤。A分别以FMC63(靶向CD19)、41D12(靶向CD70)和6A(靶向CD70)为抗原识别区的CAR表达慢病毒载体的设计，B构建CD19或CD70敲除的Raji细胞，并进行流式细胞术验证，C针对野生型Raji细胞，图A中三种慢病毒载体制备的CAR-NK细胞的杀伤效果，D针对CD19敲除的Raji细胞，图A中三种慢病毒载体制备的CAR-NK细胞的杀伤效果，E针对CD70敲除的Raji细胞，图A中三种慢病毒载体制备的CAR-NK细胞的杀伤效果，F RTCA法检测以3T3细胞为靶细胞，三种CAR-NK细胞对抗原的特异性杀伤。
图6显示CD19和CD70双靶向TanCAR结构的筛选。A三种抗原识别区的设计，即19VL-19VH-6A(636A)、19VL-6A-19VH(L6AH)和6A-19VL-19VH(6A63)，B图A对应的慢病毒载体示意图，C通过CRISPR/Cas9技术在Jurkat细胞的Nur77表达框架插入Luc2GFP基因，构建Nur77-GFP细胞，D图B的三种慢病毒载体分别感染Nur77-GFP细胞，48小时后观察非抗原依赖的细胞活化，E三种Nur77-GFP细胞对抗原的特异性应答。
图7显示L6AH CAR-NK细胞的构建以及同时靶向CD19和CD70的鉴定。A靶向CD19(19CAR)和双靶向CD19和CD70(L6AH)的慢病毒载体设计，B流式细胞术检测CAR在NK细胞膜表面的表达，C CAR-NK细胞的体外扩增，D以Raji细胞为靶细胞，19CAR和L6AH细胞对抗原的特异性应答。
图8显示L6AH CAR-NK细胞对CD19和CD70的双靶向特异性杀伤。
A L6AH CAR-NK细胞对野生型和CD19敲除Raji细胞的杀伤能力，B L6AH CAR-NK细胞对野生型和CD19敲除JeKo-1细胞的杀伤能力，C CD107a脱颗粒法检测L6AH CAR-NK细胞对CD19和/或CD70阳性Raji细胞的特异性杀伤，D RTCA法检测L6AH CAR-NK细胞对CD19或CD70阳性3T3细胞的特异性杀伤。图9显示L6AH CAR-NK细胞应对双靶抗原的特异性细胞因子分泌。
A通过流式细胞术检测L6AH CAR-NK细胞应对野生型和CD19敲除的Raji的TNF-a分泌，B通过Luminex检测L6AH CAR-NK细胞应答野生型、CD19敲除和CD70敲除Raji细胞的多种细胞因子分泌，C通过Luminex检测L6AH CAR-NK细胞应答野生型、CD19敲除和CD70敲除JeKo-1细胞的多种细胞因子分泌。
图10显示L6AH-IL15 CAR-NK细胞在体内杀伤CD19阴性B-NHL细胞。
A小动物活体成像系统比较NK细胞、19CAR-IL15 CAR-NK细胞和L6AH-IL15CAR-NK对CD19阴性JeKo-1细胞的体内杀伤作用，B图A荧光值的统计图
具体实施方式
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明首先提供了一种传统抗体和纳米抗体双靶向的CAR及其免疫细胞疗法。此外，针对目前单靶点的CAR-T疗法缺陷，本发明提供了一种双靶向的细胞疗法。具体地，本发明是制备了抗CD70的纳米抗体，联合抗CD19的scFv提出了新型的CAR分子设计，公开了在此基础上的CAR编码基因、表达载体、CAR-免疫细胞及其应用。
嵌合抗原受体(CAR)是人工设计的蛋白片段，包括胞外片段、跨膜区和胞内片段三部分组成。胞外片段可以对肿瘤细胞特定的膜蛋白进行识别，胞内段可以提供共刺激和活化信号，增强细胞的杀伤能力。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
本发明的新型双靶向CAR分子包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含作为第一识别区的含单域抗体的结合分子和作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段。所述第一识别区和第二识别区靶向相同或不同的抗原，例如肿瘤抗原。第一识别区可以位于第二抗体或其抗原结合片段的N端、C端、或VL和VH之间。因此，所述嵌合抗原受体的胞外靶标识别区从N端到C端依次包含：(1)第二抗体的VL、单域抗体VHH、和第二抗体的VH，(2)第二抗体的VL、第二抗体的VH、和单域抗体VHH，或(3)单域抗体VHH、第二抗体的VL、和第二抗体的V。
本文中，“肿瘤抗原”指肿瘤细胞表面或细胞内表达的蛋白或多肽或其他类型的分子，肿瘤抗原通常是与正常组织细胞不同的抗原成分。示例性的肿瘤抗原是CD19、CD70。
本文中，CAR的铰链区可选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8α铰链区可以是本领域常用于CAR的各种CD8α铰链区序列。在某些实施方案中，所述CD8α铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:14第399-443氨基酸所示。
本文中，CAR的跨膜区选自CD28跨膜区、CD8α跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD28跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种CD28跨膜区序列。在某些实施方案中，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第444-467位氨基酸所示。
本文中，可以根据需要选择适合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域。适用于本发明的4-1BB共刺激域可以是本领域常用于CAR的各种4-1BB共刺激域序列。在某些实施方案中，所述CD28共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第468-509位氨基酸序列所示。
类似地，CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。适用于本发明的CD3ζ胞内信号域可以是本领域已知的各种用于CAR的CD3ζ胞内信号域。在某些实施方案中，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第510-622位氨基酸序列所示。
CAR可以任选具有信号肽，例如CD8α信号肽、IL-2信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。在某些实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:14第1-21位氨基酸所示。
本文中，形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、胞外区、铰链区、跨膜区、共刺激域、胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。
本文中，“结合分子”是特异性结合靶抗原的蛋白质，包括但不仅限于，抗体、抗体的抗原结合片段、重链抗体、纳米抗体、微型抗体、亲和体、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。
在本申请中，术语“分离的结合分子”通常指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的分子。该“分离的结合分子”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许结合分子采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。结合分子可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。结合分子的实例包括但不限于：人抗体；人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，Bs-Fv，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，dAb，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变结构域中的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。参见，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换地使用。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw编辑，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
本文所述“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比上述4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
如本文所用，术语“单域抗体”、“抗间皮素单域抗体”、“重链抗体的重链可变区结构域”、“VHH”、“纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于间皮素的单域抗体。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR和四个FR。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
本文中，包含两条或多条单域抗体的结合分子是多价单域抗体；包含两条或多条不同特异性单域抗体的结合分子是多特异性单域抗体。多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子通常由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
本文中，重链抗体和抗体旨在区分抗体的不同组合方式。由于二者的结构具有相似性，本文中针对抗体的结构描述除涉及轻链外也均适用于重链抗体。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
在本申请中，术语“VHH”通常涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。如本文所使用的，Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成期望的抗原结合结构。
本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如羊驼抗体、鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。本发明中，抗体、单域抗体、重链抗体等均包括各所述抗体的经人源化的变体。
术语“人抗体”通常指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成人抗体。可用于制造抗体的示例性技术在美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技术，如使用文库，是本领域已知的。
在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何单域抗体或抗体结合相同表位的单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段，即能够与本发明的任何单域抗体交叉竞争与抗原的结合的单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段。
本发明提供一种CD70结合分子，用于嵌合抗原能受体的胞外靶标识别区中作为第一识别区的含单域抗体的结合分子，其包含抗CD70单域抗体(VHH)，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ IDNO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:4所示的VHH的FR区。在一个或多个实施方案中，所述单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列，其编码序列如SEQ ID NO:5所示。
因此，本发明还提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含本文所述的CD70结合分子和靶向肿瘤抗原的第二抗体或其抗原结合片段。在某些情况中，所述嵌合抗原受体的胞外靶标识别区从N端到C端依次包含：(1)第二抗体的VL、所述CD70结合分子、和第二抗体的VH，(2)第二抗体的VL、第二抗体的VH、和所述CD70结合分子，(3)所述CD70结合分子、第二抗体的VL、和第二抗体的VH。在示例性实施方案中，所述第二抗体的LCDR1如SEQ ID NO:6所示，LCDR2如SEQ IDNO:7所示，LCDR3如SEQ ID NO:8所示，HCDR1如SEQ ID NO:9所示，HCDR2如SEQ ID NO:10所示，HCDR3如SEQ ID NO:11所示。优选地，所述第二抗体的VL如SEQ ID NO:12所示，VH如SEQID NO:13所示。嵌合抗原受体的其他部分如本文他处所述。
在示例性实施方案中，本文的CAR从N端到C端依次含有信号肽、第二抗体的VL、所述CD70结合分子、第二抗体的VH、CD8α铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域、CD3ζ胞内信号域。在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第22-622位氨基酸所示或如SEQ ID NO:14所示。其编码序列如SEQ ID NO:15所示。
为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括任一实施方案所述的结合分子或CAR的突变体。这些突变体包括：与该结合分子或CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该结合分子或CAR的生物学活性(如结合抗原或活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括：在任一实施方案所述的结合分子或CAR的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该结合分子或CAR的生物学活性的氨基酸序列。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。
本发明还提供了编码上述结合分子或嵌合抗原受体的多核苷酸。本文还提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的抗体或其抗原结合片段。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以通过以下方法产生或合成：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
所以，本发明还涉及包含上述核酸序列以及适当启动子或者控制序列的核酸构建物，例如克隆载体、表达载体和重组载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。
所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的核酸构建物例如挨载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)、低等真核细胞(如酵母细胞)、或高等真核细胞(如昆虫细胞、哺乳动物细胞)。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；酵母细胞；果蝇S2或Sf9细胞；COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
在某些实施方案中，宿主细胞可以是本领域周知的各种功能细胞，例如各种杀伤性细胞，包括但不限于细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、CD3AK细胞(抗CD3单抗的杀伤细胞)和CAR-T/TCR-T细胞。在某些实施方案中，所述杀伤性细胞为T细胞或NK细胞。示例性的NK细胞包括但不限于原代NK细胞、NK细胞株(如NK92)和NKT细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞为原代NK细胞。示例性的T细胞包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等；生物学方法包括使用DNA和RNA载体；化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠，和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本文的结合分子或CAR或表达CAR的免疫细胞的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病优选是与表达肿瘤抗原的细胞相关的疾病或病况，所述肿瘤抗原是所述结合分子的靶标或者是CAR的胞外区域(包括作为第一识别区的含单域抗体的结合分子或作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段)的靶标。在一些实施方案中，所述病况和疾病是癌症，例如表达CD19和/或CD70的肿瘤，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、T细胞肿瘤、肾透明细胞癌、脑胶质瘤等。
本文的药物组合物含有本文所述结合分子或CAR-免疫细胞，以及药学上可接受的辅料，包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。这类辅料包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知，例如可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
当指出“治疗有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。例如，包括本文描述的免疫细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。药物组合物也可以以这些剂量多次施用。含抗体或细胞的药物组合物可通过公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
药物组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的药物组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。
在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。
本发明的结合分子因其与CD70的高亲合力可用于测定，例如结合测定来检测和/或定量在组织或细胞中表达的CD70。结合分子例如单域抗体可用在进一步研究CD70在疾病中的作用的研究中。检测间皮素的方法大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测样本中CD70的水平。
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合CD70的测试分子的存在的方法。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量CD70的溶液中的游离抗体的量。游离抗体的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合CD70。
本发明还提供了用于检测CD70水平的检测试剂盒，该试剂盒包括：本文所述的识别CD70的结合分子，用于溶解样本的裂解介质，和/或检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例
实施例1
以CD70蛋白(百普赛斯，货号CDL-H5266)作为抗原，选择健康的2头双峰骆驼进行免疫，总共免疫5次后，采全血200ml，使用percoll将淋巴细胞分离，采用TRIZOL裂解淋巴细胞并收集RNA，取少量样品跑电泳检测(如图1)
将图1中的RNA通过逆转录为cDNA，采用巢式PCR的方法进项两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段后链接到pADL-23C噬菌体展示载体中，再电转至TG1感受态细胞中，将感受态细胞涂布平板并计数，库容约为2*10^8。随后对该噬菌体库进行淘筛，具体步骤为：
1)从-80℃冰箱中取出筛选抗原，冰上放置解冻；
2)将抗原包被免疫管，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被5％脱脂奶粉作对照；
3)将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2ml PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
4)加入2ml 5％脱脂奶粉，室温旋转封闭2h；
5)将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入1ml PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
6)弃掉免疫管中的清洗液，加入2ml PBS缓冲液，加入制备的噬菌体文库1ml，室温旋转孵育1h：
7)将免疫管内液体弃掉，加入2ml PBST(1×PBS加0.1％ Tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管9次；
8)将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入500μL Gly-HCl洗脱液，室温旋转洗脱8min；
9)加入500μL Tris-HCl中和缓冲液中和，将免疫管中的溶液转移至新的1.5ml离心管中。即为第一轮筛选噬菌体洗脱液；
10)取第一轮噬菌体洗脱液侵染TG1菌株，在1.5ml离心管中进行105及106两个梯度稀释(如表1)，进行平板计数。统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量。通过克隆计数计算淘筛效率；
11)重复1-10步骤进行第二轮淘筛，通过克隆计数计算出第二轮淘筛效率(如图2)
实施例2
CD70抗原包被结合噬菌体Elisa
1)将图2中单克隆进行挑取并培养，当OD达到0.5时加入M13KO7辅助噬菌体，25℃培养过夜,离心收集上清。
2)将CD70抗原包被酶标板(1ng/μl，100μl/孔)，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭1h；
3)PBST洗涤3次，每孔加入100μL噬菌体培养菌液上清，孵育1h；
4)PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用PBS按1:10000稀释)，100μL/孔，孵育1h；
5)PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，7min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度
结果如图3所示。
实施例3
挑选1条抗体序列进行体外重组表达，然后检测其与Raji细胞的结合能力，具体的：
1)胰酶消化Raji细胞(人Burkitt’s淋巴瘤细胞)，计数，重悬细胞，使之密度为1*105/50μl；
2)50μl的细胞悬液中加入不同浓度的7种hCD70nb蛋白(50μl)，4℃下共孵育30min；
3)加入Myc-Tag(9B11)Mouse mAb(1：400)，4℃下共孵育30min；
4)加入2ml PBS，400g离心5min；
5)100μl PBS重悬细胞，流式上机。以不加hCD70nb为阴性对照。
结果如图4所示。
实施例4
用生物分子相互作用检测平台Octet对几种蛋白进行快速的亲和力检测，抗CD70抗体41D12(来自参考文献Riether,C.,et al.,Targeting CD70 with cusatuzumabeliminates acute myeloid leukemia stem cells in patients treated withhypomethylating agents.Nat Med,2020.26(9):p.1459-1467)的scFv作为对照。
Octet平台(Octet R8，Startorius BioAnalytical Instru ments inc)是基于生物膜干涉技术对生物分子相互作用进行检测分析，具体如下：
1)将CD70蛋白通过PBST稀释至5ug/ml，固化600s
2)将蛋白41D12和抗CD70抗体纳米抗体用PBST稀释，稀释至50nM。
3)将以上样品和试剂加入96孔板中。
4)检测获得数据如下表1和表2所示：
表1
样品名称 KD(M) KD Error kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error
蛋白41D12 scFv 1.16E-08 1.84E-10 1.59E+05 2.02E+03 1.85E-03 1.76E-05
抗CD70纳米抗体 6.26E-09 5.44E-10 4.90E+04 2.03E+03 3.07E-04 2.35E-05
表2
实施例5
将抗体命名为6A，进行后续的细胞治疗产品研发。首先，我们构建了6A作为抗原结合区的CAR慢病毒载体，FMC63为靶向CD19的CAR载体，而41D12的scFv作为抗原结合区的CAR载体作为对照(图5，A)。为检测6A抗体对CD70抗原识别的特异性，我们使用CRISPR/Cas9平台构建了CD19和CD70分别敲除的Raji细胞(图5，B)。通过不同效靶比的杀伤实验对比，6ACAR-NK细胞可以特异性的识别和杀伤CD70阳性的肿瘤细胞(图5，C、D、E)，效能与41D12CAR-NK细胞相近。我们还构建了3T3的工具细胞，分别表达CD19、CD70和NGFR，通过RTCA法进一步验证了6A CAR-NK对CD70阳性细胞的特异性杀伤(图5，F)。
1、分离脐带血来源的NK细胞
从脐带血中分离获得NK细胞，去除CD3阳性T细胞，步骤如下：
1)准备新鲜脐带血：拿到的新鲜脐带血后，用50ml注射器将脐带血从采血袋中转移到密封的T75中，计量脐带血的体积。
2)脐带血稀释：将脐带血按照脐带血：生理盐水＝1：3稀释混匀。
3)Ficoll分离：50ml离心管中加入20ml的Ficoll分离液，将25ml稀释后的脐带血缓慢加入Ficoll分离液上层，保持界面清晰，800g，20min(离心机升2，降2)
4)收集脐带血单核细胞：离心结束后可看到明显的白膜层细胞，弃掉血浆，将白膜层细胞转移至新的离心管中。
5)洗涤：将得到的脐带血单核细胞洗涤两遍(400g，5min)，计数；按照1×10^7细胞加80ul Buffer。
6)加入20ul CD3 MicroBeads(Miltenyi，货号130-050-101)至1×10^7总细胞中，混匀后4-8℃，15min。
7)洗涤：按照每1×10^7个细胞加入1-2ml流式洗液洗涤细胞，300g，10min，细胞洗涤两遍。
8)用500ul的Buffer重悬细胞(最大细胞标记数＜1×10^8)，用以磁珠分选。
9)将LS柱置于分离架上，3ml Buffer润湿柱子，待液体流尽后，加入细胞悬液，收集缓慢流过LS柱的细胞悬液。
10)3ml的Buffer洗涤LS柱，收集的细胞悬液与步骤6细胞悬液合并，洗涤两遍
细胞悬液离心，计数，取部分细胞流式检测CD56/CD3，其余所得NK细胞冷冻保存。
2、慢病毒载体的制备
制备用于感染NK表达CAR分子的慢病毒载体，步骤如下：
1)293T细胞汇合度为80-90％时进行转染，转染前2小时更换包装病毒用培养基(10％FBS Opti-MEM+1X丙酮酸钠+1X谷氨酰胺+1X HEPES)；
2)利用常规的四质粒包装系统制备慢病毒，包括三个辅助质粒及目的质粒(比如19CAR)加入Lipo2000等转染试剂，准备转染质粒混合物；
3)混匀后室温孵育15-25min，沿侧壁加入293T细胞中；
4)48小时后收集病毒上清；
5)将上清液过滤后使用4000g离心过夜的方法进行浓缩
6)用NK-92MI细胞株进行病毒滴度检测，测得功能滴度结果在0.5-1E8 TU/mL范围内，可见获得可有效转染细胞的慢病毒。
3、CAR-NK细胞的制备
在前述“分离脐带血来源的NK细胞”的基础上，制备CAR-NK细胞，步骤如下：
1)第0天，脐带血的单个核细胞复苏后计数；
2)按单个核细胞：滋养细胞数量2:1的比例，加入滋养细胞(Cat：#ZY-NKZ-0104，购自中赢生物，表达膜IL-21和4-1BBL，主要用于体外扩增NK细胞)
3)培养5天，按以下公式计算加入慢病毒的量：(细胞数*MOI)/病毒滴度；
4)按总体积1:5000的比例加入助转剂鱼精蛋白(储存浓度：50mg/mL)；
5)将NK细胞，前述制备的慢病毒和助转剂混匀后，按每孔0.1-0.3M/200uL的体系加入96孔平底板中，1200g，37℃离心90min；
6)离心结束后放入培养箱中培养4-6min后给细胞换液，弃去病毒液，换新鲜的NK细胞培养基。
7)上述过程后，获得CAR-NK细胞。
4、荧光素酶标记的细胞杀伤实验：
1)靶细胞准备：Raji(购自ATCC)，分布进行CD19和CD70的敲除后筛选出单克隆细胞株，用流式细胞术鉴定CD19和CD70的表达(图5，B所示)。不同的细胞株，通过慢病毒载体感染荧光素酶CBR，用于细胞杀伤实验。
2)收集靶细胞，吹匀计数，靶细胞铺板数量固定不变(一般为1E4或1E5细胞)；
3)将靶细胞洗涤两次；
4)用新鲜预热全培AIM-V+10％ FBS轻柔重悬细胞，并将体积调至100uL/well；
5)收集各效应细胞，即CAR-NK细胞，吹匀计数，流式测CAR％，用新鲜预热AIM-V+10％ FBS轻柔重悬细胞将各CAR-NK细胞用CT细胞将CAR的比例及T细胞的总数调整到一致；
6)计算铺板所需的CAR-NK细胞数，并按最高效靶比(CAR-NK/Tumor cell)所需的CAR-NK细胞浓度重悬(每孔100uL)，铺板，剩余细胞进行倍比稀释铺剩余效靶比孔；
7)总体系为200uL，每孔铺完细胞后轻轻混匀；放入培养箱中孵育4-6h，提前30min预热Luciferin底物；将细胞用FACS Buffer洗两遍后加100uL底物(0.5mM或15mg/mL)重悬，37℃避光孵育10min，在此期间打开酶标仪；酶标仪选择化学发光，黑板，读取数据。
8)计算杀伤效率％＝(Kmin-K)/(Kmin-Kmax)x100％。
注：阳性对照(Kmax)和阴性对照(Kmin)分别使用Triton 100和培养基，同时设置NK细胞的杀伤对照组；
5、RTCA杀伤方法
利用小鼠成纤维细胞株3T3构建3T3-hCD19-GFP、3T3-hCD70-GFP和3T3-NGFR-GFP稳转株，利用此稳转株作为靶细胞，验证CAR-NK细胞能够通过特异性识别抗原呈现杀伤能力。
1)3T3稳转株的建立：构建共表达人CD19/CD70/NGFR和GFP的慢病毒载体，感染3T3细胞后筛选出稳定表达的克隆株
2)取出E-plate 16板(Agilent,Cat:#5469830001)，每孔加入50uL 37℃温育的培养基，测定基线值，确定各孔的背景本底OD值一致；
3)按每孔铺10000cells的数量计算出所需的细胞数，离心后用37℃温育的培养基重悬，计数后调整细胞密度至0.0667M/mL；
4)在E-plate 16板中每孔加入150uL细胞悬液，将板子放置在室温静置30min；
5)将E-plate 16板放入培养箱中的xCELLigence RTCA仪中，检测细胞OD值；实时无标记细胞分析(RTCA)是将微电子细胞传感器芯片整合到细胞检测板的底部，以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感系统。
6)当OD值长到1.0左右时，将CAR-NK细胞离心后用37℃温育的培养基重悬，计数后调整至0.01M/mL的密度；
7)暂停RTCA实验，取出E-plate 16板，弃掉原有的培养基，按分组每孔加入200uL调整好密度的CAR-NK细胞，注意留好阴性对照(仅有靶细胞)；
8)将E-plate 16板放回RTCA仪器上，继续检测OD值，以评估CAR-NK细胞对靶细胞的杀伤功能。
实施例6
基于TanCAR的双靶构建策略同时靶向CD19和CD70，我们进行FMC63(缩写为63)和6A组合的CAR结构开发。共有3种排列结构为636A、6A63和L6AH(图6，A)，我们分别构建了CAR载体(图6，B)，使用BFP标签用以CAR表达的检测。我们应用CRISPR/Cas9的定点插入技术，在T细胞活化标志性转录因子Nur77的表达框架末端插入Luc2GFP标签，构建T细胞活化的报告细胞系Nur77-GFP(图6，C)。上述3种结构的CAR慢病毒感染Nur77-GFP后，我们发现在没有抗原刺激的情况下，636A和6A63具有强烈的自我活化信号，而L6AH没有明显的GFP表达(图6，D)。在接触肿瘤抗原后，L6AH的GFP表达最高，对特异性抗原的响应要高于636A和6A63(图6，E)。
实施例7
我们选择L6AH作为双靶载体进行后续的开发，主要与19CAR做比较(图7，A)。通过流式细胞术检测荧光标记的CD70蛋白和抗FMC63抗体，可以验证L6AH CAR-NK细胞表达TanCAR结构(图7，B)。脐带血来源的NK细胞在体外纯化、分化及增殖后可较好得去除CD3+T细胞，并14天内NK细胞体外扩增达千倍作用(图7，C)。19CAR和L6AH感染Nur77-GFP细胞后，和各种Raji工具细胞共孵育，检测GFP进一步验证了L6AH对CD19和CD70特异性双靶向识别(图7，D)
实施例8
我们将制备的CAR-NK分别与野生型的Raji和CD19敲除的Raji孵育，发现L6AHCAR-NK细胞可以在CD19缺失情况下有效杀伤Raji细胞(图8，A)。另外一种B-NHL细胞系JeKo-1，L6AH CAR-NK细胞重复了相似结果(图8，B)。我们还进行了CD107a的脱颗粒实验和RTCA实验，进一步验证L6AH CAR-NK细胞对CD19和CD70的双靶向特异性杀伤(图8，C、D)。
实施例9
我们通过流式细胞术检测了L6AH对双抗原的特异性的TNF-a分泌(图9，A)。收集共培养24小时后的培养基上清，通过Luminex多因子的检测，进一步验证了L6AH对CD19和CD70特异性响应，同时我们发现CAR-NK几乎不分泌介导细胞因子风暴的IL-6和IL-1(图9，B)。
实施例10
我们构建了共表达IL-15的L6AH CAR-NK细胞，基于CD19敲除的Raji移植NSG小鼠体内动物实验显示，L6AH-IL15对CD19阴性的肿瘤细胞有明显杀伤作用，可以持续降低肿瘤负荷(图10，A、B)。
(1)将自行构建的表达荧光素酶的CD19敲除淋巴瘤细胞株JeKo-1-CBR-GFP尾静脉注射至重度免疫缺陷小鼠(NSG)体内：
(a)收集对数生长期的JeKo-1-CBR-GFP离心去上清；
(b)用不带血清的生理盐水洗涤两遍，确保无血清残留；
(c)计数，用生理盐水将密度调至0.0333M/mL,准备注射；
(d)按每只小鼠300uL体积(即每只小鼠注射10000cells)尾静脉注射肿瘤细胞建模，留2只小鼠不作处理作为空白对照；
(2)4小时后进行小动物活体成像，根据成像结果评估成瘤情况并进行分组，具体分组如下：
(a)NT-NK组：注射未转CAR的普通NK细胞(5只动物)；
(b)19CAR-IL15组：注射靶向CD19并表达IL15的CAR-NK细胞(5只动物)；
(c)L6AH-IL15组：注射CD19和CD70双靶向并表达IL15的CAR-NK细胞(5只动物)；
(d)Blank组：未经任何处理(2只动物)；
以上分组中，注射的效应细胞量与靶细胞比值均为10:1；
(3)成瘤第3天注射NK细胞：
(a)收集生长对数期的NK细胞，流式染CAR％，将CAR-NK细胞的CAR％均调成一致；
(b)用不带血清的生理盐水洗涤两遍，确保无血清残留；
(c)计数，用生理盐水将密度调至0.0333M/mL，准备注射；
(d)按照(2)中的分组，按每只小鼠300uL体积尾静脉注射对应的NT-NK/CAR-NK细胞；
(4)注射NK/CAR-NK细胞成瘤的第一周进行两次活体成像，评估肿瘤进展情况；以后每周一次成像，评估肿瘤进展情况；
随着荷瘤时间的增加，NT-NK组在较早的时间出现动物死亡(“X”表示死亡)；检测小鼠体内肿瘤荧光值的结果如图10，A、B所示，可见随着荷瘤时间的增加，NT-NK组荧光值提升很快；19CAR-IL15组其次；而L6AH-IL15组抑瘤作用最佳，动物体内荧光值最低。

Claims (34)

1.一种CD70结合分子，包含抗CD70单域抗体VHH，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1如SEQ ID NO:1所示、CDR2如SEQ ID NO:2所示、和CDR3如SEQID NO:3所示，所述CD70结合分子是包含一条、两条或多条所述VHH的单价或多价单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段。
2. 如权利要求1所述的CD70结合分子，其特征在于，
所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO: 4所示的VHH的FR区，或
所述单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列。
3.如权利要求1所述的CD70结合分子，其特征在于，所述CD70结合分子、单域抗体或重链抗体为嵌合抗体或完全人抗体。
4.一种嵌合抗原受体，其从N端到C端由胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区组成，所述胞外靶标识别区：
（1）由权利要求1-3任一项所述的CD70结合分子组成，或
（2）从N端到C端由以下组成：靶向肿瘤抗原CD19的第二抗体或其抗原结合片段的VL、权利要求1-3任一项所述的CD70结合分子和所述第二抗体或其抗原结合片段的VH，其中，CD70结合分子是重链抗体或其抗原片段，所述第二抗体的LCDR1如SEQ ID NO:6所示，LCDR2如SEQ ID NO:7所示，LCDR3如SEQ ID NO:8所示，HCDR1如SEQ ID NO:9所示，HCDR2如SEQ IDNO:10所示，HCDR3如SEQ ID NO:11所示。
5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述第二抗体或其抗原结合片段是第二抗体的scFv。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述第二抗体的VL如SEQ ID NO:12所示，VH如SEQ ID NO:13所示。
7.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
8.一种嵌合抗原受体，其从N端到C端由信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区组成，所述胞外靶标识别区：
（1）由权利要求1-3任一项所述的CD70结合分子组成，或
（2）从N端到C端由以下组成：靶向肿瘤抗原CD19的第二抗体或其抗原结合片段的VL、权利要求1-3任一项所述的CD70结合分子和所述第二抗体或其抗原结合片段的VH，其中，CD70结合分子是重链抗体或其抗原片段，所述第二抗体的LCDR1如SEQ ID NO:6所示，LCDR2如SEQ ID NO:7所示，LCDR3如SEQ ID NO:8所示，HCDR1如SEQ ID NO:9所示，HCDR2如SEQ IDNO:10所示，HCDR3如SEQ ID NO:11所示，或所述第二抗体的VL如SEQ ID NO:12所示，VH如SEQ ID NO:13所示。
9.如权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
10.如权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽。
11. 如权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:14第1-21位氨基酸残基所示。
12. 如权利要求4或8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区选自CD8α铰链区、CD28铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区和IgG4 Fc CH2CH3铰链区。
13. 如权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQID NO:14第399-443位氨基酸残基所示。
14.如权利要求4或8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8α跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种。
15. 如权利要求14所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQID NO:14第444-467位氨基酸残基所示。
16.如权利要求7或9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域。
17. 如权利要求16所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第468-509位氨基酸残基所示。
18.如权利要求7或9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。
19. 如权利要求18所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第510-622位氨基酸残基所述。
20. 一种多核苷酸，其序列选自：
（1）权利要求1-3任一项所述CD70结合分子、或权利要求4-19中任一项所述嵌合抗原受体的编码序列；或
（2）（1）的互补序列。
21. 如权利要求20所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:5或15所示。
22.一种核酸构建物，包含权利要求20-21所述的多核苷酸。
23.如权利要求22所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是载体。
24.包含权利要求1-3任一项所述CD70结合分子的噬菌体。
25.如权利要求24所述的噬菌体，其特征在于，所述CD70结合分子展示于所述噬菌体表面。
26.一种宿主细胞，所述细胞：
（1）表达权利要求1-3任一项所述CD70结合分子、或权利要求4-19中任一项所述的嵌合抗原受体；
（2）包含权利要求20-21所述的多核苷酸；和/或
（3）包含权利要求22-23所述的核酸构建物。
27.如权利要求26所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是免疫细胞。
28.如权利要求27所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是NK细胞。
29.一种产生CD70结合分子或嵌合抗原受体的方法，包括：在适合产生CD70结合分子或嵌合抗原受体的条件下培养权利要求26-28任一项所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述CD70结合分子或嵌合抗原受体。
30.一种药物组合物，包含权利要求4-19中任一项所述的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸构建物和/或表达所述嵌合抗原受体、包含所述多核苷酸或包含所述核酸构建物的宿主细胞，和药学上可接受的辅料。
31.权利要求4-19中任一项所述的嵌合抗原受体、或作为免疫细胞的权利要求30中所述的宿主细胞在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。
32.一种检测CD70的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含权利要求1-3任一项所述CD70结合分子、编码所述CD70结合分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸构建物、包含所述CD70结合分子的噬菌体、或表达所述CD70结合分子的宿主细胞。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测CD70与CD70结合分子的结合的试剂。
34.权利要求1-3任一项所述CD70结合分子在制备用于检测样品中CD70或诊断癌症的试剂盒中的用途，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。
CN202310907278.6A 2023-07-21 2023-07-21 Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体 Active CN116903757B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310907278.6A CN116903757B (zh) 2023-07-21 2023-07-21 Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310907278.6A CN116903757B (zh) 2023-07-21 2023-07-21 Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116903757A CN116903757A (zh) 2023-10-20
CN116903757B true CN116903757B (zh) 2024-09-24

Family

ID=88362674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310907278.6A Active CN116903757B (zh) 2023-07-21 2023-07-21 Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116903757B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114478803A (zh) * 2022-02-11 2022-05-13 北京大学深圳研究生院 一种新型双特异性嵌合抗原受体的构建及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108250301A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 天津天锐生物科技有限公司 一种多靶点嵌合抗原受体
CN109880802B (zh) * 2018-11-30 2022-12-13 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和cd70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CN109485734B (zh) * 2018-12-30 2020-05-12 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma和cd19的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN112592927B (zh) * 2020-12-22 2024-06-11 上海科棋药业科技有限公司 一种同时靶向cd19和bcma的双靶点嵌合抗原受体及其应用
TW202328444A (zh) * 2021-07-26 2023-07-16 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司 用於製造基因工程化ｃａｒ－ｔ細胞之方法
CN116063524B (zh) * 2022-11-21 2023-07-21 杭州荣谷生物科技有限公司 一种cd70纳米抗体的制备方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114478803A (zh) * 2022-02-11 2022-05-13 北京大学深圳研究生院 一种新型双特异性嵌合抗原受体的构建及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116903757A (zh) 2023-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110950953B (zh) 抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用
TWI845767B (zh) 抗人Claudin18.2抗體及其應用
US20220002408A1 (en) Bispecific antibody, preparation method thereof and application thereof
CN112703013B (zh) Cd3抗原结合片段及其应用
CN112500485B (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
CN110396129A (zh) 人源化cd19抗原结合单链抗体及其嵌合抗原受体、免疫细胞和应用
CN114805582B (zh) 抗Trop2纳米抗体及其用途
CN116457463B (zh) 抗ox40抗体、其药物组合物及应用
CN116396389B (zh) 一种靶向bcma的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN117164712B (zh) 一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
WO2023109976A2 (zh) Ox40抗体及其医药用途
CN116419970B (zh) 低毒性抗ox40抗体、其药物组合物及应用
CN116284389A (zh) 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途
KR102393776B1 (ko) Cd22에 특이적인 인간화 항체 및 이를 이용한 키메라 항원 수용체
CN116903757B (zh) Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体
WO2024103251A1 (zh) 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途
CN117843793B (zh) 抗间皮素抗体、抗原结合片段及其用途
TWI855236B (zh) 抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用
WO2023041065A1 (zh) 一种靶向人ceacam5/6的抗体、制备方法和应用
WO2024094159A1 (zh) 靶向人源ror1的单域抗体
CN117343177A (zh) 一种驼源重链抗体或抗原结合片段及应用
CN117886936A (zh) Cd47抗体及其医药用途
CN118496368A (zh) Trop2抗体或其抗原结合片段及其应用
IL304096A (en) PD-1 binding molecule and its application
CN118715243A (zh) Cd39抗原结合蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant