JP2023539654A - 抗ox40抗体、その医薬組成物および応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は抗OX40抗体、その医薬組成物および応用に関する。本発明に係る抗OX40抗体の配列は明細書に記載される。本発明に係る抗OX40抗体又はその抗原結合断片及びその医薬組成物はT細胞関連疾患の治療に利用される。【選択図】なし
Description
本発明は抗OX40抗体、その医薬組成物および応用に関する。
腫瘍免疫治療の突破と開発発展は、腫瘍治療分野の大きな進展であり、「サイエンス」誌により2013年の「今年のブレークスルー」に選ばれた。現在、免疫システムの力を利用して腫瘍と戦う手段は主に4つあり、1)腫瘍抗原に対する抗体を腫瘍患者の体内に注射して腫瘍細胞を殺し、その一部のメカニズムは、腫瘍細胞が抗体に結合してから、Fc受容体を発現する免疫細胞に殺されることである;2)腫瘍患者から分離された抗腫瘍免疫細胞をインビトロで増殖させ、それから患者に再注入して抗腫瘍効果を発揮する;3)T細胞を遺伝子操作して、腫瘍抗原を発現・認識するキメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)を腫瘍患者の体内に注射する;4)免疫細胞の活性を制限する免疫抑制シグナル経路の標的(「免疫チェックポイント」と言われる)に対するモノクローナル抗体(例えば抗CTLA-4や抗PD-1/PD-L1)は、免疫抑制シグナルを遮断することによって免疫システムが腫瘍細胞に対して生成されたキラーT細胞の応答を強化し腫瘍を殺傷する。
上記の方法はすでに臨床的に使用されているが、腫瘍免疫治療の分野において、さまざまなメカニズムを介して機能する新しい免疫療法への要望は依然として大きい。原因として、1)すべての腫瘍種類が既存の腫瘍免疫治療手段に反応するわけではない;2)既存の免疫療法に反応する腫瘍種類であっても、これらの腫瘍種類のすべての患者がこれらの免疫治療に反応するわけではない;3)併用療法はより強い治療効果があると予測される;4)腫瘍は、これらの治療手段を免れる突然変異を発症する可能性が高い。
免疫共刺激分子に対するアゴニスト抗体は、免疫細胞の表面に結合することで免疫活性化シグナルの標的分子を伝達し、それらによって制御される免疫活性化シグナル伝達経路を活性化し、さらに抗腫瘍免疫応答を強化して腫瘍細胞を殺すことができ、幅広い活用用途がある治療法である。多くの免疫共刺激分子の中で、OX40は、一番最初に抗腫瘍応答に介入できることが発見され、検証された分子の1つである
OX40はTNF受容体スーパーファミリーのメンバーであり、主に活性化T細胞の表面に発現され、活性化CD4およびCD8 T細胞機能サブセットを含み、例えばTh1、Th2、TFH、Th17、および制御性T細胞(Treg)などがある。OX40は、好中球、NKおよびNKT細胞でわずかに発現することも報告されている。OX40はナイーブT細胞では発現しないが、活性化T細胞で特異的に発現する特性があることによって、OX40を標的とすることは一定の選択性があり、無差別にすべてのT細胞を活性化することはない(例えばより広く発現するCD28を標的とするなど)。OX40L/CD252はOX40の天然リガンドであり、主にB細胞、樹状細胞(DCs)およびマクロファージなどの抗原提示細胞で発現する。OX40LとOX40はどちらも抗原誘導性であり、OX40Lの発現はCD40-OX40Lシグナル、Toll様受容(TLR)、および炎症性サイトカインによって誘導される。OX40の発現は、抗原提示細胞がT細胞に抗原を提示して活性化したT細胞受容体の下流シグナルによって活性化され、CD28-B7.1/2シグナルによって正に制御され、発現レベルのピークはT細胞活性化後の12時間~6日間に達する。OX40/OX40Lの構造分析は、OX40がOX40Lと相互作用して三量体化することを支持し、OX40/OX40Lの組み合わせは細胞相互作用に直接関与する可能性がある。Ox40の三量体化により、その細胞内ドメインはTRAF2/3/5を動員し、NF-kBシグナルを活性化し、Bcl-2やBcl-xLなどの抗アポトーシス分子の発現をアップレギュレートし、それによってアポトーシスを阻害し、細胞生存を促進する。OX40は、TCRシグナルと連携して、PI3K/Aktを介してT細胞の生存と増殖に影響を与え、NFATを介してIL-2、IL-4、IL-5およびIFN-gなどのサイトカインの発現を調節することも発見されている。したがって、OX40の活性化は、活性化T細胞のアポトーシスを阻害し、その増殖を促進し、サイトカインを産生することができる。これらはいずれも、OX40シグナルを活性化できるアゴニスト抗OX40の機能である。
OX40はTNF受容体スーパーファミリーのメンバーであり、主に活性化T細胞の表面に発現され、活性化CD4およびCD8 T細胞機能サブセットを含み、例えばTh1、Th2、TFH、Th17、および制御性T細胞(Treg)などがある。OX40は、好中球、NKおよびNKT細胞でわずかに発現することも報告されている。OX40はナイーブT細胞では発現しないが、活性化T細胞で特異的に発現する特性があることによって、OX40を標的とすることは一定の選択性があり、無差別にすべてのT細胞を活性化することはない(例えばより広く発現するCD28を標的とするなど)。OX40L/CD252はOX40の天然リガンドであり、主にB細胞、樹状細胞(DCs)およびマクロファージなどの抗原提示細胞で発現する。OX40LとOX40はどちらも抗原誘導性であり、OX40Lの発現はCD40-OX40Lシグナル、Toll様受容(TLR)、および炎症性サイトカインによって誘導される。OX40の発現は、抗原提示細胞がT細胞に抗原を提示して活性化したT細胞受容体の下流シグナルによって活性化され、CD28-B7.1/2シグナルによって正に制御され、発現レベルのピークはT細胞活性化後の12時間~6日間に達する。OX40/OX40Lの構造分析は、OX40がOX40Lと相互作用して三量体化することを支持し、OX40/OX40Lの組み合わせは細胞相互作用に直接関与する可能性がある。Ox40の三量体化により、その細胞内ドメインはTRAF2/3/5を動員し、NF-kBシグナルを活性化し、Bcl-2やBcl-xLなどの抗アポトーシス分子の発現をアップレギュレートし、それによってアポトーシスを阻害し、細胞生存を促進する。OX40は、TCRシグナルと連携して、PI3K/Aktを介してT細胞の生存と増殖に影響を与え、NFATを介してIL-2、IL-4、IL-5およびIFN-gなどのサイトカインの発現を調節することも発見されている。したがって、OX40の活性化は、活性化T細胞のアポトーシスを阻害し、その増殖を促進し、サイトカインを産生することができる。これらはいずれも、OX40シグナルを活性化できるアゴニスト抗OX40の機能である。
抗OX40(およびOX40L-Fc融合タンパク質)は、一部のマウスに腫瘍に対する抵抗力を作り上げることを含め、黒色腫、直腸がん、線維肉腫、B細胞およびT細胞リンパ腫および白血病などさまざまな腫瘍モデルにおいて、腫瘍の増殖を阻害できることが報告されている。これに基づいて、ファイザーのPF04518600、ブリストル・マイヤーズ スクイブのBMS-986178、MedImmuneの複数の抗OX40抗体など、複数の抗ヒトOX40モノクローナル抗体が臨床研究に入った。しかし、抗腫瘍薬としての抗OX40の研究開発は順調に進まず、2013年に最初の臨床試験が報告されて以来、多くの企業の薬物が停滞しており、臨床研究のフェーズ3に入った抗体はまだなく、抗腫瘍抗体の免疫エフェクタ経路と設計原理についてはさらなる研究が必要であることが示唆されている。
本発明は、下記配列、即ち、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から選ばれるCDRを少なくとも1つ含む抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体は、配列番号1に示されるHCDR1、配列番号2に示されるHCDR2、および配列番号3に示されるHCDR3、および/または配列番号4に示されるLCDR1、配列番号5に示されるLCDR2、および配列番号6に示されるLCDR3を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体は、配列番号7-38のいずれか1つに示されるHCDR1、配列番号39-65のいずれか1つに示されるHCDR2、および配列番号66-114のいずれか1つに示されるHCDR3、および/または配列番号115-145のいずれか1つに示されるLCDR1、配列番号146-159のいずれか1つに示されるLCDR2および配列番号160-199のいずれか1つに示されるLCDR3を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体は、配列番号1に示されるHCDR1、配列番号2に示されるHCDR2、および配列番号3に示されるHCDR3、および/または配列番号4に示されるLCDR1、配列番号5に示されるLCDR2、および配列番号6に示されるLCDR3を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体は、配列番号7-38のいずれか1つに示されるHCDR1、配列番号39-65のいずれか1つに示されるHCDR2、および配列番号66-114のいずれか1つに示されるHCDR3、および/または配列番号115-145のいずれか1つに示されるLCDR1、配列番号146-159のいずれか1つに示されるLCDR2および配列番号160-199のいずれか1つに示されるLCDR3を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体は、以下の群a1~群a71のいずれか1群に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む:
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体VHのFR1は、表4の各抗体番号のVHのFR1から選ばれることができ、VHのFR2は、表4の各抗体番号のVHのFR2から選ばれることができ、VHのFR3は、表4の各抗体番号のVHのFR3から選ばれることができ、VHのFR4は、表4の各抗体番号のVHのFR4から選ばれることができ、および/またはVLのFR1は表4の各抗体番号のVLのFR1から選ばれることができ、VLのFR2は、表4の各抗体番号のVLのFR2から選ばれることができ、VLのFR3は、表4の各抗体番号のVLのFR3から選ばれることができ、VLのFR4は、表4の各抗体番号のVLのFR4から選ばれることができる。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体のVHのFR領域は、抗体配列番号200-270から選ばれるのいずれか1つのVHのFR領域であり、VLのFR領域は、抗体配列番号271-341から選ばれるいずれか1つのVLのFR領域である。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列は、配列番号200-270のいずれか1つに示され、および/またはVLのアミノ酸配列は配列番号271-341のいずれか1つに示される。好ましくは、抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列およびVLのアミノ酸配列は、表4のいずれか1つの行に示される通りである。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号342-345のいずれか1つに示され、および/または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号346または347に示される。
1つまたは複数の実施形態において、本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体は、キメラ抗体または完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体のVHのFR領域は、抗体配列番号200-270から選ばれるのいずれか1つのVHのFR領域であり、VLのFR領域は、抗体配列番号271-341から選ばれるいずれか1つのVLのFR領域である。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列は、配列番号200-270のいずれか1つに示され、および/またはVLのアミノ酸配列は配列番号271-341のいずれか1つに示される。好ましくは、抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列およびVLのアミノ酸配列は、表4のいずれか1つの行に示される通りである。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号342-345のいずれか1つに示され、および/または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号346または347に示される。
1つまたは複数の実施形態において、本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体は、キメラ抗体または完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である。
本発明はまた、本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する医薬組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体またはその抗原結合断片の、T細胞関連疾患の治療および薬物の製造における応用を提供し、好ましくは、前記T細胞関連疾患はT細胞関連腫瘍またはOX40媒介性障害である。
1つまたは複数の実施形態において、前記OX40媒介性障害は、OX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
本発明はまた、本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体またはその抗原結合断片の、T細胞関連疾患の治療および薬物の製造における応用を提供し、好ましくは、前記T細胞関連疾患はT細胞関連腫瘍またはOX40媒介性障害である。
1つまたは複数の実施形態において、前記OX40媒介性障害は、OX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
本発明はまた、T細胞関連疾患を治療または予防するための方法を提供し、前記方法は、必要な患者に治療有効量の本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体またはその抗原結合断片、または本発明の何れか1つの実施形態による抗OX40抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む。好ましくは、前記T細胞関連疾患は、T細胞関連腫瘍または自己免疫疾患である。
別段の定義がない限り、本発明の実施は、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の通常技術を使用し、これらはいずれも当分野の技術範囲内である。これら技術は文献において十分に解釈されており、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrookら,1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaitが編集,1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshneyが編集,1987);Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelらが編集,1987版および定期更新されたバージョン);PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullisが編集,1994);A Practical Guide to Molecular Cloning(Perbal Bernard V.,1988);Phage Display:A Laboratory Manual(Barbasら,2001)がある。
OX40は、OX40L(CD252、TNFSF4)と結合する細胞表面受容体、またはOX40を含む受容体複合体である。ヒトOX40(hOX40)のアミノ酸配列のNCBI登録番号は(NP_003318)である。Ox40タンパク質は、変異体および断片を含んでもよい。前記断片は、完全に又は部分的に膜を貫通する細胞外ドメイン、及び/又は細胞内ドメイン並びに細胞外ドメインを有さない断片を含む。可溶タイプのhOX40は、BAFF及び/又はAPRILとの結合能力を持つ細胞外ドメイン又は細胞外ドメインの断片を含む。「OX40」は、OX40のアミノ酸配列の翻訳後修飾も含む。翻訳後修飾は、N-及びO-結合型グリコシル化を含むが、これらに限定されない。
OX40は、主に活性化効果T細胞(Teffs)と制御性T細胞(Treg)に発現し、NKT細胞、NK細胞、好中球にも発現する。がんでは、OX40を発現する活性化T細胞が腫瘍浸潤リンパ球に見られる。OX40およびそのリガンドOX40Lは、T細胞応答の誘導と維持において重要な役割を果たしている。抗腫瘍T細胞機能の増強は、がんおよびその他のOX40媒介性障害に利用でき、例えば媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患などがある。
OX40は、主に活性化効果T細胞(Teffs)と制御性T細胞(Treg)に発現し、NKT細胞、NK細胞、好中球にも発現する。がんでは、OX40を発現する活性化T細胞が腫瘍浸潤リンパ球に見られる。OX40およびそのリガンドOX40Lは、T細胞応答の誘導と維持において重要な役割を果たしている。抗腫瘍T細胞機能の増強は、がんおよびその他のOX40媒介性障害に利用でき、例えば媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患などがある。
抗OX40抗体
本発明は、OX40に特異的に結合する抗体を提供する。
本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む)、マルチエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ダイアボディ、一本鎖分子、及び抗体断片(特に、抗原結合断片、例えば、Fab、F(ab’)2及びFv)を含む。本明細書において、用語「免疫グロブリン」(Ig)と「抗体」は互いに代用できる。
基本的な4本鎖抗体ユニットは2本の同じ軽鎖(L)と2本の同じ重鎖(H)により構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgM抗体は5個の基本的なヘテロ四量体ユニット及びJ鎖と呼ばれるその他のポリペプチドからなり、10個の抗原結合部位を含む。IgA抗体は2~5個の基本的な4本鎖ユニットを含み、J鎖と重合して、多価集合体が形成できる。IgGの場合、4本鎖ユニットは通常約150,000ダルトンである。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合により重鎖と連結され、2本の重鎖は1つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されるが、ジスルフィド結合の数が重鎖のアイソタイプによって決定される。各重鎖と軽鎖との間は規則的な間隔の鎖間ジスルフィド架橋を更に有する。各重鎖はN-末端に可変ドメイン(VH)を有し、更に3つ(各α及びγ鎖に対する)及び4つ(μ及びεアイソタイプに対する)の定常ドメイン(CH)を有する。各軽鎖はN-末端に可変ドメイン(VL)を有し、更にその他端の定常ドメインを有する。VLはVHと整列し、CLは重鎖の第1定常ドメイン(CH1)と整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面が形成されると考えられる。対となるVHとVLは一緒に1つの抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、Basic and Clinical Immunology、第8版、Daniel P. Sties、Abba I. Terr及びTristram G. Parsolw編集、Appleton & Lange、Norwalk、CT、1994、71ページ及び第6章を参照する。任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる異なる2種のうちの1種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列によって、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの5つのクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、CH配列及び機能の比較的に小さい相違によって、更に、例えば、ヒトに発現されるIgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2のサブクラスに分けられる。
本発明は、OX40に特異的に結合する抗体を提供する。
本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む)、マルチエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ダイアボディ、一本鎖分子、及び抗体断片(特に、抗原結合断片、例えば、Fab、F(ab’)2及びFv)を含む。本明細書において、用語「免疫グロブリン」(Ig)と「抗体」は互いに代用できる。
基本的な4本鎖抗体ユニットは2本の同じ軽鎖(L)と2本の同じ重鎖(H)により構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgM抗体は5個の基本的なヘテロ四量体ユニット及びJ鎖と呼ばれるその他のポリペプチドからなり、10個の抗原結合部位を含む。IgA抗体は2~5個の基本的な4本鎖ユニットを含み、J鎖と重合して、多価集合体が形成できる。IgGの場合、4本鎖ユニットは通常約150,000ダルトンである。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合により重鎖と連結され、2本の重鎖は1つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されるが、ジスルフィド結合の数が重鎖のアイソタイプによって決定される。各重鎖と軽鎖との間は規則的な間隔の鎖間ジスルフィド架橋を更に有する。各重鎖はN-末端に可変ドメイン(VH)を有し、更に3つ(各α及びγ鎖に対する)及び4つ(μ及びεアイソタイプに対する)の定常ドメイン(CH)を有する。各軽鎖はN-末端に可変ドメイン(VL)を有し、更にその他端の定常ドメインを有する。VLはVHと整列し、CLは重鎖の第1定常ドメイン(CH1)と整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面が形成されると考えられる。対となるVHとVLは一緒に1つの抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、Basic and Clinical Immunology、第8版、Daniel P. Sties、Abba I. Terr及びTristram G. Parsolw編集、Appleton & Lange、Norwalk、CT、1994、71ページ及び第6章を参照する。任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる異なる2種のうちの1種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列によって、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの5つのクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、CH配列及び機能の比較的に小さい相違によって、更に、例えば、ヒトに発現されるIgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2のサブクラスに分けられる。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ基末端ドメインである。重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ「VH」及び「VL」と呼ばれる。これらのドメインは通常、抗体の最も可変できる部分(同じタイプのその他の抗体)であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」は、可変ドメインにおける特定のセグメントが抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。可変ドメインは、抗原結合を媒介して、特定抗体の、その特定抗原に対する特異性を限定する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全てのアミノ酸スパンにわたって均一に分布しているわけではない。代わりにに、超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメント(軽鎖及び重鎖可変ドメインのどちらにもある)に集中し、即ち、それぞれ重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2、HCDR3及び軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2、LCDR3である。可変ドメインにおけるより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ4つのFR領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)を含み、通常、βプリーツシート構造を採用するが、環状連結を形成すると共に場合によってβプリーツシート構造の一部を形成する3つのHVRにより連結される。各鎖におけるHVRは、FR領域により非常に近い距離で保持されており、且つ他方の鎖におけるHVRと一緒に抗体の抗原結合部位の形成を促進する(Kabatら、Sequences of Immunological Interest、第5版、国立衛生研究所、Bethesda、MD、1991を参照する)。通常、軽鎖可変領域の構造はFR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4であり、重鎖可変領域の構造はFR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4である。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的に関与しないが、例えば、抗体依存性細胞に仲介される細胞毒性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示している。
用語「可変」は、可変ドメインにおける特定のセグメントが抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。可変ドメインは、抗原結合を媒介して、特定抗体の、その特定抗原に対する特異性を限定する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全てのアミノ酸スパンにわたって均一に分布しているわけではない。代わりにに、超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメント(軽鎖及び重鎖可変ドメインのどちらにもある)に集中し、即ち、それぞれ重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2、HCDR3及び軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2、LCDR3である。可変ドメインにおけるより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ4つのFR領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)を含み、通常、βプリーツシート構造を採用するが、環状連結を形成すると共に場合によってβプリーツシート構造の一部を形成する3つのHVRにより連結される。各鎖におけるHVRは、FR領域により非常に近い距離で保持されており、且つ他方の鎖におけるHVRと一緒に抗体の抗原結合部位の形成を促進する(Kabatら、Sequences of Immunological Interest、第5版、国立衛生研究所、Bethesda、MD、1991を参照する)。通常、軽鎖可変領域の構造はFR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4であり、重鎖可変領域の構造はFR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4である。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的に関与しないが、例えば、抗体依存性細胞に仲介される細胞毒性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示している。
本発明において、一部の抗体はアゴニスト抗体であり、一部の抗体は非アゴニスト抗体である。好ましくは、本発明に係るアゴニスト抗体の各CDRは、任意に組み合わせて、アゴニスト抗体のCDR群を構成する、またはアゴニスト抗体可変領域を形成するために使用することができ、本発明に係る非アゴニスト抗体の各CDRは、任意に組み合わせて有効なCDR群を形成し、それによって非アゴニスト抗体CDR群を構成する、または非アゴニスト抗体可変領域を形成するために使用することができる。
本明細書において、「アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態で抗原に対してOX40アゴニスト抗体可変領域またはアゴニストOX40抗体可変領域のようなアゴニスト活性を有する可変領域を指し;「非アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態でOX40非アゴニスト抗体可変領域または非アゴニストOX40抗体可変領域のようなアゴニスト活性を持たない抗体可変領域を指す。
本明細書において、「アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態で抗原に対してOX40アゴニスト抗体可変領域またはアゴニストOX40抗体可変領域のようなアゴニスト活性を有する可変領域を指し;「非アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態でOX40非アゴニスト抗体可変領域または非アゴニストOX40抗体可変領域のようなアゴニスト活性を持たない抗体可変領域を指す。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団により得られた抗体であり、即ち、天然に発生できる少量で存在可能な突然変異及び/又は翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除き、集団を構成する各抗体が同様である。モノクローナル抗体は高度的な特異性を持ち、単一の抗原部位に対応するものである。ポリクローナル抗体製剤(異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を代表的に含む)に対して、各モノクローナル抗体は抗原における単一の決定基に対応する。これらの特異性の他に、モノクローナル抗体の優位性は、ハイブリドーマの培養によって合成されるため、その他の免疫グロブリンに汚染されていないことである。修飾語「モノクローナル」は、抗体が実質的に均質な抗体の集団により得られた特徴を示し、任意の特定方法による抗体の産生を要請すると解釈するものではない。例えば、本発明に利用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler及びMilstein、Nature、256:495-97(1975)や、Hongoら、Hybridoma、14(3):253-260(1995)、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版.1988や、Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、563-681、Elsevier、N.Y.、1981)、組換えDNA法(例えば、US 4,816,567)、ファージ提示技術(例えば、Clacksonら、Nature、352:624-628(1991)や、Marksら、J. Mol. Biol.、222:581-597(1992)や、Sidhuら、J. Mol. Biol.、338(2):299-310(2004)や、Leeら、J. Mol. Biol.,340(5):1073-1093(2004)や、Fellouse、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、101(34):12467-12472(2004)や、LeeらJ. Immunol. Methods、284(1-2):119-132(2004))、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物によりヒト又はヒト様抗体を産生するための技術(例えば、WO1998/24893や、WO1996/34096や、WO1996/33735や、WO1991/10741や、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551(1993)や、Jakobovitsら、Nature、362:255-258(1993)や、Bruggemannら、Year in Immunol.、7:33(1993)や、US 5,545,807や、US 5,545,806や、US 5,569,825や、US 5,625,126や、US 5,633,425や、US 5,661,016や、Marksら、Bio/Technology、10:779-783(1992)や、Lonbergら、Nature、368:856-859(1994)や、Morrison、Nature、368:812-813(1994)や、Fishwildら、Nature Biotechnol.、14:845-851(1996)や、Neuberger、Nature Biotechnol.、14:826(1996)や、Lonberg及びHuszar、Intern. Rev. Immunol.、13:65-93(1995))、単細胞シーケンシング法(Nat Biotechnol. 2013 Feb;31(2):166-9.)を含む様々な技術により産生できる。
用語「完全長抗体」、「無傷抗体」又は「全抗体」は互いに代用できるが、(抗体断片に対して)実質的に完全な形式の抗体であることを意味する。具体的に、全抗体は、Fc領域を含む重鎖および軽鎖を伴うものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。幾つかの様態において、無傷抗体は、1種又は複数種のエフェクター機能を有してもよい。
「抗体断片」は無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域及び/又は可変領域を含む。抗体断片は抗体の抗原結合断片が好ましい。抗体断片の例として、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片や、ダイアボディや、線状抗体(アメリカ特許5,641,870、実施例2や、Zapataら、Protein Eng.、8(10):1057-1062、1995を参照)や、一本鎖抗体分子や、scFv-Fc断片や、抗体断片により形成される多重特異性抗体や、化学的修飾又はリポソームに組込まれることにより半減期が増加可能な任意の断片が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、ならびに残余「Fc」断片(この名称は容易に結晶化する能力を反映している)を産生した。Fab断片は完全な軽鎖及び重鎖可変ドメイン(VH)と1本の重鎖第1定常ドメイン(CH1)により構成される。各Fab断片は抗原結合に関して1価であり、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、1つの大型F(ab’)2断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する2つのジスルフィド結合Fab断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Fab’断片は、CH1ドメインのカルボキシ基末端に幾つかのその他の残基(抗体ヒンジ領域に由来する1つ又は複数のシステインを含む)が付加されているため、Fab断片と異なる。F(ab’)2抗体断片は、元来対となるFab’断片として産生され、Fab’断片の間にヒンジシステインがある。抗体断片のその他の化学カップリングは既に知られている。Fc断片はジスルフィド結合により一体に保持されている2本の重鎖のカルボキシ基末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はFc領域における配列によって決定されるが、該領域は幾つかの種類の細胞に発見されたFc受容体(FcR)により認識された領域でもある。
「抗体断片」は無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域及び/又は可変領域を含む。抗体断片は抗体の抗原結合断片が好ましい。抗体断片の例として、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片や、ダイアボディや、線状抗体(アメリカ特許5,641,870、実施例2や、Zapataら、Protein Eng.、8(10):1057-1062、1995を参照)や、一本鎖抗体分子や、scFv-Fc断片や、抗体断片により形成される多重特異性抗体や、化学的修飾又はリポソームに組込まれることにより半減期が増加可能な任意の断片が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、ならびに残余「Fc」断片(この名称は容易に結晶化する能力を反映している)を産生した。Fab断片は完全な軽鎖及び重鎖可変ドメイン(VH)と1本の重鎖第1定常ドメイン(CH1)により構成される。各Fab断片は抗原結合に関して1価であり、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、1つの大型F(ab’)2断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する2つのジスルフィド結合Fab断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Fab’断片は、CH1ドメインのカルボキシ基末端に幾つかのその他の残基(抗体ヒンジ領域に由来する1つ又は複数のシステインを含む)が付加されているため、Fab断片と異なる。F(ab’)2抗体断片は、元来対となるFab’断片として産生され、Fab’断片の間にヒンジシステインがある。抗体断片のその他の化学カップリングは既に知られている。Fc断片はジスルフィド結合により一体に保持されている2本の重鎖のカルボキシ基末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はFc領域における配列によって決定されるが、該領域は幾つかの種類の細胞に発見されたFc受容体(FcR)により認識された領域でもある。
「Fv」は完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。該断片は、強く非共有結合的に会合している1本の重鎖可変ドメイン及び1本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。これら2つのドメインが折り畳まれると、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を与える6つの超可変ループ(重鎖及び軽鎖にそれぞれ3つのループ)が突出されるしかしながら、結合部位全体よりも親和性は低いものの、単一可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのみのHVRからなる半分のFv)であっても抗原を認識し、結合能力を有する。
「一本鎖Fv」は「sFv」又は「scFv」と略され、抗体VH及びVLドメインを含むと共に1本のポリペプチド鎖に連結される抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドはVHとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、sFvを所望の抗原結合構造に形成させる。sFvの概説について、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenburg及びMoore編集、Springer-Verlag、New York、pp.269-315(1994)を参照する。
前記断片の「化学修飾」は、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリ(アルキレン)グリコールの付加(「ポリエチレングリコール化、PEG化」)を含み、Fv、scFv、Fab、F(ab’)2及びFab’のポリエチレングリコール化断片、即ち、Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG及びFab’-PEGを含む。これらの断片はEGFR結合活性を有する。
好ましくは、前記抗体断片、特に抗原結合断片は、その由来抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の一部の配列により構成され、或いはこれらを含む。前記一部の配列は、その由来抗体と同じ結合特異性及び十分な親和力を十分に保持している。OX40に対して、好ましくは少なくともその由来抗体の親和力の1/100に相当する。より好ましい様態において、少なくとも1/10に相当する。このような抗体断片は、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくはその由来抗体の配列の10、15、25、50及び100個の連続アミノ酸を含む。
「一本鎖Fv」は「sFv」又は「scFv」と略され、抗体VH及びVLドメインを含むと共に1本のポリペプチド鎖に連結される抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドはVHとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、sFvを所望の抗原結合構造に形成させる。sFvの概説について、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenburg及びMoore編集、Springer-Verlag、New York、pp.269-315(1994)を参照する。
前記断片の「化学修飾」は、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリ(アルキレン)グリコールの付加(「ポリエチレングリコール化、PEG化」)を含み、Fv、scFv、Fab、F(ab’)2及びFab’のポリエチレングリコール化断片、即ち、Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG及びFab’-PEGを含む。これらの断片はEGFR結合活性を有する。
好ましくは、前記抗体断片、特に抗原結合断片は、その由来抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の一部の配列により構成され、或いはこれらを含む。前記一部の配列は、その由来抗体と同じ結合特異性及び十分な親和力を十分に保持している。OX40に対して、好ましくは少なくともその由来抗体の親和力の1/100に相当する。より好ましい様態において、少なくとも1/10に相当する。このような抗体断片は、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくはその由来抗体の配列の10、15、25、50及び100個の連続アミノ酸を含む。
本明細書において、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、これは、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、重鎖及び/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残部は、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、並びに、このような抗体の断片である(US 4,816,567や、Morrisonら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、81:6851-6855、1984を参照)。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。従って、「ヒト化抗体」は、通常、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に発見された配列と交換した非ヒト抗体である。通常、ヒト化抗体において、抗体全体(CDRを除く)は、ヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされ、又はこのような抗体(CDRを除く)と同じである。CDR(その一部又は全部が非ヒト生体に由来する核酸によりコードされる)がヒト抗体可変領域のβ-プリーツシート骨格に移植されて抗体が産生されるが、その特異性は移植されるCDRによって決定される。このような抗体の産生は、例えば、WO92/11018や、Jones、1986、Nature、321:522~525や、Verhoeyenら、1988、Science、239:1534-1536などに記載されている。ヒト化抗体は遺伝子工学免疫系を有するマウスを利用して産生してもよい(Roqueら、2004、Biotechnol. Prog.、20:639-654を参照)。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。従って、「ヒト化抗体」は、通常、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に発見された配列と交換した非ヒト抗体である。通常、ヒト化抗体において、抗体全体(CDRを除く)は、ヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされ、又はこのような抗体(CDRを除く)と同じである。CDR(その一部又は全部が非ヒト生体に由来する核酸によりコードされる)がヒト抗体可変領域のβ-プリーツシート骨格に移植されて抗体が産生されるが、その特異性は移植されるCDRによって決定される。このような抗体の産生は、例えば、WO92/11018や、Jones、1986、Nature、321:522~525や、Verhoeyenら、1988、Science、239:1534-1536などに記載されている。ヒト化抗体は遺伝子工学免疫系を有するマウスを利用して産生してもよい(Roqueら、2004、Biotechnol. Prog.、20:639-654を参照)。
「ヒト抗体」は、ヒトから産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び/又は本願に開示されたヒト抗体を産生するための任意の技術を利用して産生されるような抗体である。このヒト抗体の定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明らかに排除した。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリーを含む、本分野における様々な既存技術を利用して産生してもよい。このような技術は、Hoogenboom及びWinter、分子生物学誌、227:381(1991)や、Marksら、分子生物学誌、222:581(1991)を参照する。得られたヒトモノクローナル抗体の製造方法は、Coleら、モノクローナル抗体及びがん治療、Alan R. Liss、p.77(1985)や、Boernerら、免疫学誌、147(1):86-95(1991)に記載されている。van Dijk及びvan de Winkel、現代薬学評論、5:368-74(2001)を更に参照する。ヒト抗体は、下記の方法により製造されてもよい。即ち、抗原を例えば、免疫異種移植マウス(xenomice)などの遺伝子組換え動物に投与して、修飾により抗原に応答し、このような抗体を活性化させて産生するが、その内因性遺伝子座が既に能力を失った(例えば、US 6,075,181及び6,150,584、XENOMOUSETM技術に関してを参照)。例えば、Liら、アメリカ国家科学院学報、103:3557-3562(2006)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術により産生されたヒト抗体に関してを更に参照する。
本発明の抗OX40抗体は、マイクロ抗体であってもよい。マイクロ抗体は、CH3ドメインと連結されたscFvを含む最小化抗体様タンパク質である(Huら、1996、Cancer Res.、56:3055-3061)。本発明の抗OX40抗体はドメイン抗体であってもよいが、例えば、US 6,248,516を参照する。ドメイン抗体(dAb)は抗体の機能的結合ドメインであり、ヒト抗体dABの重鎖(VH)又は軽鎖(VL)の可変領域に対応するが、約13kDaの分子量又は無傷抗体の10分の1のサイズ未満である。dABは細菌、酵母及び哺乳動物細胞系を含む様々な宿主に十分に発現される。また、例えば、冷凍乾燥又は熱変性後などの苛酷条件においても、dAbは依然として高度的に安定であり、且つ活性を保持している。例えば、US 6,291,158、US 6,582,915、US 6,593,081、US 6,172,197、US 2004/0110941、EP 0368684、US 6,696,245、WO04/058821、WO04/003019及びWO03/002609を参照する。
本発明の抗OX40抗体は、マイクロ抗体であってもよい。マイクロ抗体は、CH3ドメインと連結されたscFvを含む最小化抗体様タンパク質である(Huら、1996、Cancer Res.、56:3055-3061)。本発明の抗OX40抗体はドメイン抗体であってもよいが、例えば、US 6,248,516を参照する。ドメイン抗体(dAb)は抗体の機能的結合ドメインであり、ヒト抗体dABの重鎖(VH)又は軽鎖(VL)の可変領域に対応するが、約13kDaの分子量又は無傷抗体の10分の1のサイズ未満である。dABは細菌、酵母及び哺乳動物細胞系を含む様々な宿主に十分に発現される。また、例えば、冷凍乾燥又は熱変性後などの苛酷条件においても、dAbは依然として高度的に安定であり、且つ活性を保持している。例えば、US 6,291,158、US 6,582,915、US 6,593,081、US 6,172,197、US 2004/0110941、EP 0368684、US 6,696,245、WO04/058821、WO04/003019及びWO03/002609を参照する。
本発明による抗OX40抗体のHCDR1は、X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(配列番号1)を含んでもよく、そのうち、X1はGまたはSであり、X2はA、D、F、G、VまたはYであり、X3はS、TまたはIであり、X4はI、L、またはFであり、X5はI、S、D、N、T、またはAであり、X6はN、S、T、D、R、またはGであり、X7はN、S、T、Y、A、GまたはFであり、X8はN、Y、A、G、W、S、I、K、F、TまたはDであり、X9はW、Vまたはなしであり、X10はN、Gまたはなしである。例示的に、HCDR1のアミノ酸配列は、配列番号7-38のいずれか1つに示される。1つまたは複数の実施形態において、X1はGまたはSであり、X2はD、F、GまたはYであり、X3はSまたはTであり、X4はI、LまたはFであり、X5はS、DまたはTであり、X6はN、S、TまたはDであり、X7はS、TまたはYであり、X8はN、Y、A、G、またはIであり、X9はW、Vまたはなしであり、X10はNまたはなしである。好ましくは、HCDR1のアミノ酸配列は配列番号 9、10、12、13、19、21、23、33、34、38のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のHCDR2は、X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(配列番号2)を含んでもよく、X1はMまたはIであり;X2はN、Y、S、K、HまたはFであり;X3はP、W、Q、H、S、G、AまたはRであり;X4はN、S、G、Y、KまたはDであり;X5はS、D、G、N、AまたはTであり;X6はT、N、S、DまたはGであり;X7はN、K、T、S、D、Y、H、G、A、またはEであり;X8はT、I、K、Gまたはなしであり;X9はTまたはなしであり;X10はT、Iまたはなしである。1つまたは複数の実施形態において、X1はIであり;X2はN、Y、S、HまたはFであり;X3はW、H、SまたはAであり;X4はN、S、GまたはYであり;X5はS、D、GまたはNであり;X6はT、N、S、DまたはGであり;X7はN、K、T、SまたはDであり;X8はT、I、Kまたはなしであり;X9およびX10はなしである。例示的にHCDR2のアミノ酸配列は、配列番号39-65のいずれか1つに示される。好ましくは、HCDR2のアミノ酸配列は配列番号 42、43、46、47、50、58、59、63、64のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のHCDR2は、X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(配列番号2)を含んでもよく、X1はMまたはIであり;X2はN、Y、S、K、HまたはFであり;X3はP、W、Q、H、S、G、AまたはRであり;X4はN、S、G、Y、KまたはDであり;X5はS、D、G、N、AまたはTであり;X6はT、N、S、DまたはGであり;X7はN、K、T、S、D、Y、H、G、A、またはEであり;X8はT、I、K、Gまたはなしであり;X9はTまたはなしであり;X10はT、Iまたはなしである。1つまたは複数の実施形態において、X1はIであり;X2はN、Y、S、HまたはFであり;X3はW、H、SまたはAであり;X4はN、S、GまたはYであり;X5はS、D、GまたはNであり;X6はT、N、S、DまたはGであり;X7はN、K、T、SまたはDであり;X8はT、I、Kまたはなしであり;X9およびX10はなしである。例示的にHCDR2のアミノ酸配列は、配列番号39-65のいずれか1つに示される。好ましくは、HCDR2のアミノ酸配列は配列番号 42、43、46、47、50、58、59、63、64のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のHCDR3は、CX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18(配列番号3)を含んでもよく、そのうち、X1はV、T、SまたはAであり、X2はR、K、I、G、A、T、S、H、Q、NまたはEであり、X3はS、D、W、G、Y、A、E、R、L、V、T、MまたはKであり、X4はG、Y、F、V、L、A、P、D、S、W、R、Q、E、NまたはKであり、X5はD、Y、G、S、R、F、T、V、A、P、L、I、E、WまたはNであり、X6はW、G、E、D、S、R、P、Y、N、L、A、T、IまたはVであり、X7はH、S、L、A、T、Y、G、F、W、V、E、DまたはMであり、X8はC、G、L、F、Y、S、W、D、M、T、N、R、H、VまたはPであり、X9はF、S、D、Y、W、G、T、E、P、L、R、Nまたはなしであり、X10はD、Y、F、I、N、W、V、P、E、L、G、S、Qまたはなしであり、X11はY、G、D、W、F、A、I、Q、S、Nまたはなしであり、X12はW、D、Y、F、N、G、R、Pまたはなしであり、X13はI、W、Y、D、S、F、G、Lまたはなしであり、X14はQ、W、I、Y、F、D、V、Hまたはなしであり、X15はH、W、M、D、Y、Fまたはなしであり、X16はW、D、S、Yまたはなしであり、X17はV、W、Yまたはなしであり、X18はWまたはなしである。1つまたは複数の実施形態において、X1はVまたはAであり、X2はR、K、SまたはQであり、X3はS、D、G、Y、AまたはEであり、X4はG、Y、D、S、WまたはNであり、X5はY、S、F、T、A、L、IまたはWであり、X6はG、D、P、Y、N、LまたはTであり、X7はS、L、T、Y、F、W、EまたはDであり、X8はG、F、Y、S、W、M、TまたはHであり、X9はF、S、D、Y、E、Lまたはなしであり、X10はD、Y、V、L、Gまたはなしであり、X11はY、G、W、F、Q、Nまたはなしであり、X12-X18はなしである。例示的にLCDR1のアミノ酸配列は、配列番号 66-114のいずれか1つに示される。好ましくは、HCDR3のアミノ酸配列は配列番号 67、78、79、80、86、93、96、99、100、107、108のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のHCDR1は、X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号4)を含んでもよく、そのうち、X1はHまたはQであり、X2はG、D、SまたはTであり、X3はS、I、L、TまたはVであり、X4はS、N、R、W、L、VまたはFであり、X5はT、D、N、S、H、YまたはGであり、X6はY、D、W、S、R、N、GまたはTであり、X7はN、D、S、Yまたはなしであり、X8はG、Nまたはなしであり、X9はY、N、D、H、Sまたはなしであり、X10はN、T、R、Kまたはなしであり、X11はY、F、S、Nまたはなしであり、X12はYまたはなしである。1つまたは複数の実施形態において、X1はHまたはQであり、X2はG、DまたはSであり、X3はS、I、LまたはVであり、X4はS、N、W、LまたはFであり、X5はT、N、S、H、YまたはGであり、X6はY、D、S、RまたはNであり、X7はN、D、Yまたはなしであり、X8はGまたはなしであり、X9はY、N、Dまたはなしであり、X10はN、Tまたはなしであり、X11はYまたはなしであり、X12はなしである。例示的にLCDR1のアミノ酸配列は、配列番号115-145のいずれか1つに示される。好ましくは、LCDR1のアミノ酸配列は配列番号 115、116、120、122、124、126、130、134、135、140、141のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のLCDR2はX1X2X3(配列番号5)を含んでもよく、そのうち、X1はT、K、G、W、E、M、L、D、AまたはQであり;X2はV、A、TまたはGであり;X3はSまたはAである。1つまたは複数の実施形態において、X1はK、G、L、DまたはAであり;X2はV、AまたはGであり;X3はSである。例示的にLCDR2のアミノ酸配列は、配列番号 146-159のいずれか1つに示される。好ましくは、LCDR2のアミノ酸配列は配列番号 147、148、153、154、155のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のLCDR2はX1X2X3(配列番号5)を含んでもよく、そのうち、X1はT、K、G、W、E、M、L、D、AまたはQであり;X2はV、A、TまたはGであり;X3はSまたはAである。1つまたは複数の実施形態において、X1はK、G、L、DまたはAであり;X2はV、AまたはGであり;X3はSである。例示的にLCDR2のアミノ酸配列は、配列番号 146-159のいずれか1つに示される。好ましくは、LCDR2のアミノ酸配列は配列番号 147、148、153、154、155のいずれか1つに示される。
本発明による抗OX40抗体のLCDR3は、CX1QX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(配列番号6)を含んでもよく、そのうち、X1はM、Q、LまたはHであり、X2はG、Y、A、V、H、T、FまたはSであり、X3はT、G、Y、N、L、DまたはSであり、X4はH、S、T、Q、D、N、G、IまたはRであり、X5はW、S、T、Y、L、IまたはNであり、X6はP、S、M、I、WまたはTであり、X7はW、F、L、P、I、Y、RまたはTであり、X8はT、L、A、FまたはWであり、X9はF、L、Tまたはなしであり、X10はT、Fまたはなしであり、X11はFまたはなしである。1つまたは複数の実施形態において、X1はM、QまたはLであり、X2はG、Y、AまたはSであり、X3はT、G、Y、N、LまたはDであり、X4はH、S、QまたはNであり、X5はW、S、T、Y、L、IまたはNであり、X6はPまたはIであり、X7はW、F、L、I、Y、RまたはTであり、X8はTまたはFであり、X9はFまたはなしであり、X10およびX11はなしである。例示的にLCDR3のアミノ酸配列は、配列番号 160-199のいずれか1つに示される。好ましくは、LCDR3のアミノ酸配列は配列番号 160、161、166、168、172、182、192、193、195、198のいずれか1つに示される。
幾つかの実施形態において、本発明による抗OX40抗体は、配列番号1に示されるHCDR1、配列番号2に示されるHCDR2、および配列番号3に示されるHCDR3、および/または配列番号4に示されるLCDR1、配列番号5に示されるLCDR2、および配列番号6に示されるLCDR3を含む。好ましくは、本発明による抗OX40抗体は、配列番号7-38のいずれか1つに示されるHCDR1、配列番号39-65のいずれか1つに示されるHCDR2、および配列番号66-114のいずれか1つに示されるHCDR3、および/または配列番号115-145のいずれか1つに示されるLCDR1、配列番号146-159のいずれか1つに示されるLCDR2および配列番号160-199のいずれか1つに示されるLCDR3を含む。
より好ましくは、本発明による抗OX40抗体は配列番号 9、10、12、13、19、21、23、33、34、38のいずれか1つ示されるHCDR1、配列番号 42、43、46、47、50、58、59、63、64のいずれか1つ示されるHCDR2、および配列番号 67、78、79、80、86、93、96、99、100、107、108のいずれか1つに示されるHCDR3、および/または配列番号 115、116、120、122、124、126、130、134、135、140、141のいずれか1つ示されるLCDR1、配列番号 147、148、153、154、155のいずれか1つ示されるLCDR2および配列番号 160、161、166、168、172、182、192、193、195、198のいずれか1つ示されるLCDR3を含む。
より好ましくは、本発明による抗OX40抗体は配列番号 9、10、12、13、19、21、23、33、34、38のいずれか1つ示されるHCDR1、配列番号 42、43、46、47、50、58、59、63、64のいずれか1つ示されるHCDR2、および配列番号 67、78、79、80、86、93、96、99、100、107、108のいずれか1つに示されるHCDR3、および/または配列番号 115、116、120、122、124、126、130、134、135、140、141のいずれか1つ示されるLCDR1、配列番号 147、148、153、154、155のいずれか1つ示されるLCDR2および配列番号 160、161、166、168、172、182、192、193、195、198のいずれか1つ示されるLCDR3を含む。
さらに好ましくは、本発明の抗OX40抗体は、以下の群a1~群a71のいずれか1群に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む:
および/または以下の群b1~群b71のいずれか1群に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む:
より好ましくは、本発明による抗OX40抗体は、表3の群c1~群c71のいずれか1群のHCDRおよびLCDRを含む:
本発明による抗OX40抗体VHのFR1は、表4の各抗体番号のVHのFR1から選ばれることができ、FR2は、表4の各抗体番号のVHのFR2から選ばれることができ、FR3は、表4の各抗体番号のVHのFR3から選ばれることができ、FR4は、表4の各抗体番号のVHのFR4から選ばれることができ、および/またはVLのFR1は表4の各抗体番号のVLのFR1から選ばれることができ、FR2は、表4の各抗体番号のVLのFR2から選ばれることができ、FR3は、表4の各抗体番号のVLのFR3から選ばれることができ、FR4は、表4の各抗体番号のVLのFR4から選ばれることができる。
幾つかの実施形態において、本発明による抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列は配列番号 200-270のいずれか1つに示され、および/またはVLのアミノ酸配列は配列番号 271-341のいずれか1つに示される。好ましくは、本発明による抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列およびVLのアミノ酸配列は、表3のいずれか1つの行に示される通りである。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号342-345のいずれか1つに示され、および/または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号346または347に示される。幾つかの実施形態において、表4の群d1-d40の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号345に示され、および/または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号347に示される。他の実施形態において、表4の群d41-d71の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号342-345のいずれか1つに示され、および/または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号346または347に示される。ここで、各抗体の重鎖および軽鎖定常領域は、抗体の抗原への結合能力に影響を与えることなく、当分野で任意の他の重鎖および軽鎖定常領域を使用することができる。
抗体活性に実質的な影響を与えない前提で、当業者は本発明の配列に対して1個以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上)のアミノ酸を置換、付加及び/又は欠失して、前記抗体又はその機能性断片配列の変異体を得ることができる。これらは本発明により請求される範囲内に含まれると見なされる。例えば、可変領域のFR及び/又はCDR領域で類似する特性を有するアミノ酸を置換する。置換は保存的な置換が好ましい。保存的な置換できるアミノ酸残基は本分野で周知されている。幾つかの実施形態において、本発明に係る変異体の配列はその由来配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有してもよい。本発明に係る配列同一性は配列分析ソフトウエアを利用して測定できる。例えば、デフォルト引数を使用するコンピュータプログラムBLAST、特にBLASTP又はTBLASTNが挙げられる。
本発明の抗OX40抗体は機能が影響されるように修飾されてもよい。本発明は修飾を有するグリコシル化様態の抗OX40抗体を含む。修飾により望まないグリコシル化部位を除去してもよく、或いはオリゴ糖鎖にフコース部分を存在させないことで抗体の依存性細胞傷害(ADCC)機能を強化してもよく、或いはガラクトシル化修飾により補体依存性細胞傷害(CDC)を改変してもよい。
本発明の抗OX40抗体は、通常、約10-9~約10-13Mの親和力定数を有してもよい。
本発明の抗OX40抗体は機能が影響されるように修飾されてもよい。本発明は修飾を有するグリコシル化様態の抗OX40抗体を含む。修飾により望まないグリコシル化部位を除去してもよく、或いはオリゴ糖鎖にフコース部分を存在させないことで抗体の依存性細胞傷害(ADCC)機能を強化してもよく、或いはガラクトシル化修飾により補体依存性細胞傷害(CDC)を改変してもよい。
本発明の抗OX40抗体は、通常、約10-9~約10-13Mの親和力定数を有してもよい。
例えば、本分野でよく知られているハイブリドーマ技術など、本分野の常用方法により本発明の抗OX40抗体を製造してもよい。或いは、本発明の抗OX40抗体はハイブリドーマ細胞系を除く細胞系に発現してもよい。本発明の抗体をコードする配列で適切な哺乳動物宿主細胞を変換してもよい。変換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス(又はウイルスベクター)にパッケージングしてウイルス(又はベクター)で宿主細胞に対して形質導入を行うことなどを含む、任意の既知方法を採用してもよい。使用される変換工程は変換する宿主によって決定される。ヘテロポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は本分野においてよく知られており、デキストランにより仲介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンにより仲介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、及びDNAの細胞核への直接マイクロインジェクションなどを含む。発現するための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は本分野においてよく知られており、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手できる様々な不死化細胞系を含むが、これらに限定されず、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えば、HepG2)などを含むが、これらに限定されない。特に好ましい細胞系は、高発現レベルを有するとともに、基本的なOX40結合特性を有する抗体を産生細胞系を特定することで選定する。
抗OX40抗体をコードするポリヌクレオチド配列
本発明は、本発明に係る抗OX40抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本明細書は重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖及び各CDRをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明の核酸分子は一本鎖及び二本鎖形態のDNAとRNA、及び対応する相補配列を含む。DNAは、例えば、cDNA、ゲノムDNA、化学合成によるDNA、PCR増幅によるDNA及びこれらの組合せを含む。本発明の核酸分子は全長遺伝子又はcDNA分子及びその断片の組合せを含む。本発明の核酸はヒト由来が好ましいが、本発明において非ヒト由来の核酸も含む。
本発明において、分離された核酸分子は単独断片の形態又は大きい核酸コンストラクトの成分とする核酸分子である。好ましい一実施形態において、核酸には汚染性を持つ内因性物質が殆ど含まない。好ましくは、核酸分子は、ほぼ純粋な形態で少なくとも1回単離され、且つ標準的な生化学方法によりその成分であるヌクレオチド配列を認識、操作及び回収できるような量又は濃度を有するDNA又はRNAに由来する。好ましくは、前記配列は、内部非翻訳配列又はイントロン(代表的に真核遺伝子に存在)による中断を受けていないオープンリーディングフレーム形態で提供及び/又は構築される。非翻訳DNAの配列はオープンリーディングフレームの5’又は3’部位に存在してもよく、同様にコード領域の操作又は発現に影響しない。
本発明は、本発明に係る抗OX40抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本明細書は重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖及び各CDRをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明の核酸分子は一本鎖及び二本鎖形態のDNAとRNA、及び対応する相補配列を含む。DNAは、例えば、cDNA、ゲノムDNA、化学合成によるDNA、PCR増幅によるDNA及びこれらの組合せを含む。本発明の核酸分子は全長遺伝子又はcDNA分子及びその断片の組合せを含む。本発明の核酸はヒト由来が好ましいが、本発明において非ヒト由来の核酸も含む。
本発明において、分離された核酸分子は単独断片の形態又は大きい核酸コンストラクトの成分とする核酸分子である。好ましい一実施形態において、核酸には汚染性を持つ内因性物質が殆ど含まない。好ましくは、核酸分子は、ほぼ純粋な形態で少なくとも1回単離され、且つ標準的な生化学方法によりその成分であるヌクレオチド配列を認識、操作及び回収できるような量又は濃度を有するDNA又はRNAに由来する。好ましくは、前記配列は、内部非翻訳配列又はイントロン(代表的に真核遺伝子に存在)による中断を受けていないオープンリーディングフレーム形態で提供及び/又は構築される。非翻訳DNAの配列はオープンリーディングフレームの5’又は3’部位に存在してもよく、同様にコード領域の操作又は発現に影響しない。
本発明は、適切な苛酷条件、好ましくは高度な苛酷条件で本明細書に係る抗OX40抗体をコードする核酸とハイブリダイゼーションを行う核酸を更に含む。ハイブリダイゼーション条件の選定に影響する基本パラメータ及び設計の適切条件に関する指導は、Sambrook、Fritsch及びManiatis(1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、第9章及び第11章、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology、1995、Ausubelら編集、John Wiley & Sons, Inc.、2.10節及び6.3-6.4節)を参照する。
本明細書に記載される通り、通常、カセット変異導入法又はPCR変異導入法又は本分野でよく知られているその他の技術を利用して、抗OX40抗体をコードするDNAでヌクレオチドの部位特異的変異導入により変異体をコードするDNAを産生し、その後細胞培養物で組換えDNAを発現して、本発明に係る変異体を製造した。しかしながら、確定された技術を利用してインビトロで合成することで、約100~150個にも達する残基を含む抗原結合断片を製造してもよい。
当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重により大量の核酸を製造できるが、このような核酸の全ては本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードする。従って、特定のアミノ酸配列が既に同定された場合、当業者はタンパク質をコードするアミノ酸配列を改変しない方式で1つ又は複数のコドンを簡単に修飾する配列により、任意数の異なる核酸を製造できる。
本明細書に記載される通り、通常、カセット変異導入法又はPCR変異導入法又は本分野でよく知られているその他の技術を利用して、抗OX40抗体をコードするDNAでヌクレオチドの部位特異的変異導入により変異体をコードするDNAを産生し、その後細胞培養物で組換えDNAを発現して、本発明に係る変異体を製造した。しかしながら、確定された技術を利用してインビトロで合成することで、約100~150個にも達する残基を含む抗原結合断片を製造してもよい。
当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重により大量の核酸を製造できるが、このような核酸の全ては本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードする。従って、特定のアミノ酸配列が既に同定された場合、当業者はタンパク質をコードするアミノ酸配列を改変しない方式で1つ又は複数のコドンを簡単に修飾する配列により、任意数の異なる核酸を製造できる。
本発明は、上記のようなポリヌクレオチドを少なくとも1つ含むプラスミド、発現ベクター、転写カセット又は発現カセット方式の発現系及びコンストラクトを更に提供する。また、本発明は、前記発現系又はコンストラクトを含む宿主細胞を提供する。
任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、通常、プラスミドの維持及び外因性ヌクレオチド配列のクローンと発現に使用される配列を含む。前記配列(幾つかの実施形態において「隣接配列」と総称される)は通常、1つ又は複数の下記ヌクレオチド配列、即ち、プロモーター、1つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与体及び受容体スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌に利用されるリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとする抗体をコードする核酸を挿入するためのマルチコネクソン領域及び任意の標識エレメントを含む。下記によりこれらの配列をそれぞれ記述する。
ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、抗OX40抗体コード配列の5’又は3’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を任意に含む。オリゴヌクレオチド配列はポリヒスチジン(例えば、6His)又は別の「タグ」、例えば、FLAG、HA(インフルエンザウイルス血球凝集素)又はmyc((これらについては、市販の抗体に存在する))などをコードする。このタグは、ポリペプチドが発現するときに典型的にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのアフィニティ精製または抗OX40抗体の検出の手段として使用できる。アフィニティ精製は、例えば、これらのタグに対応する抗体をアフィニティーマトリックスとして利用するカラムクロマトグラフィーにより実施される。タグは、その後、任意に、例えば、切断のために特定のペプチダーゼを利用する様々な方式により、精製されたOX40抗OX40抗体から除去されてもよい。
任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、通常、プラスミドの維持及び外因性ヌクレオチド配列のクローンと発現に使用される配列を含む。前記配列(幾つかの実施形態において「隣接配列」と総称される)は通常、1つ又は複数の下記ヌクレオチド配列、即ち、プロモーター、1つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与体及び受容体スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌に利用されるリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとする抗体をコードする核酸を挿入するためのマルチコネクソン領域及び任意の標識エレメントを含む。下記によりこれらの配列をそれぞれ記述する。
ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、抗OX40抗体コード配列の5’又は3’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を任意に含む。オリゴヌクレオチド配列はポリヒスチジン(例えば、6His)又は別の「タグ」、例えば、FLAG、HA(インフルエンザウイルス血球凝集素)又はmyc((これらについては、市販の抗体に存在する))などをコードする。このタグは、ポリペプチドが発現するときに典型的にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのアフィニティ精製または抗OX40抗体の検出の手段として使用できる。アフィニティ精製は、例えば、これらのタグに対応する抗体をアフィニティーマトリックスとして利用するカラムクロマトグラフィーにより実施される。タグは、その後、任意に、例えば、切断のために特定のペプチダーゼを利用する様々な方式により、精製されたOX40抗OX40抗体から除去されてもよい。
隣接配列は、相同(即ち、宿主細胞と同じ種及び/又は株由来)、異種(即ち、宿主細胞種又は株以外の種由来)、ハイブリッド(即ち、2つ以上の供給源由来の隣接配列の組合せ)、合成又は天然であってもよい。同様に、隣接配列の供給源が、この隣接配列が宿主細胞のメカニズムで機能すると共に宿主細胞のメカニズムにより活性化される前提で、任意の原核又は真核生体、任意の脊椎動物又は無脊椎動物生体又は任意の植物であってもよい。
複製起点は代表的には、市販される原核発現ベクターの一部であり、このような起点はベクターの宿主細胞における増幅に繋がる。選定されるベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成によりベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドpBR322(New England Biolabs、Beverly、MA)に由来する複製起点は、ほとんどグラム陰性菌に適し、様々なウイルス起点(例えば、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)又は例えば、HPV又はBPVなどのパピローマウイルス)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。哺乳動物発現ベクターは通常、複製起点の成分を必要としない(例えば、ウイルス初期プロモーターをも含むことから、一般的にSV40起点は単独で用いられる)。
転写終結配列は代表的にポリペプチドコード領域の3’末端に位置して、転写を終結させる。原核細胞における転写終結配列は、通常、G-Cリッチ断片であり、ポリT配列が続く。
複製起点は代表的には、市販される原核発現ベクターの一部であり、このような起点はベクターの宿主細胞における増幅に繋がる。選定されるベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成によりベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドpBR322(New England Biolabs、Beverly、MA)に由来する複製起点は、ほとんどグラム陰性菌に適し、様々なウイルス起点(例えば、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)又は例えば、HPV又はBPVなどのパピローマウイルス)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。哺乳動物発現ベクターは通常、複製起点の成分を必要としない(例えば、ウイルス初期プロモーターをも含むことから、一般的にSV40起点は単独で用いられる)。
転写終結配列は代表的にポリペプチドコード領域の3’末端に位置して、転写を終結させる。原核細胞における転写終結配列は、通常、G-Cリッチ断片であり、ポリT配列が続く。
選択マーカー遺伝子は、選択性の培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、(a)抗生物質又はその他の毒素(例えば、原核宿主細胞については、アンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン)に対する耐性を付与する、(b)細胞の栄養要求性欠損を補完する、或いは(c)複合物又は決定された培地により得られない重要栄養素を供給する、タンパク質をコードする。特異性の任意の標識はカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子も原核及び真核宿主細胞における選択に用いることができる。
リボソーム結合部位は、通常mRNAの翻訳開始に必要とされ、且つShine-Dalgarno配列(原核生物)又はKozak配列(真核生物)により特徴付けられる。このエレメントは代表的にプロモーターの3’部位及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の5’部位に位置する。
本発明の発現及びクローニングベクターは代表的に、宿主生体により認識されると共に抗OX40抗体をコードする分子と操作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子(通常、約100~1000bp以内)の開始コドン上流に位置する非転写配列である。
リボソーム結合部位は、通常mRNAの翻訳開始に必要とされ、且つShine-Dalgarno配列(原核生物)又はKozak配列(真核生物)により特徴付けられる。このエレメントは代表的にプロモーターの3’部位及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の5’部位に位置する。
本発明の発現及びクローニングベクターは代表的に、宿主生体により認識されると共に抗OX40抗体をコードする分子と操作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子(通常、約100~1000bp以内)の開始コドン上流に位置する非転写配列である。
本分野において、酵母宿主と一緒に使用される適切なプロモーターもよく知られている。酵母エンハンサーは酵母プロモーターとともに有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞と一緒に使用される適切なプロモーターはよく知られており、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、牛パピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス及び最も好ましいシミアンウイルス40(SV40)などのウイルスゲノムにより得られたプロモーターを含むが、これらに限定されない。その他の適切な哺乳動物プロモーターは、例えば、熱ショックプロモーター、アクチンプロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターを含む。
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物により本発明の抗OX40抗体を構成する軽鎖又は重鎖をコードするDNAの転写を増加させる。エンハンサーはプロモーターに作用して転写を増加させるDNAのシス作用エレメントであり、長さが通常約10~300bpである。エンハンサーは相対的な方向及びロケーションの独立性を有し、既に転写ユニットの5’及び3’部位に見出されている。哺乳動物遺伝子から得られる幾つかのエンハンサー配列は公知であり、例えば、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトプロテイン及びインスリンのエンハンサー配列である。しかしながら、代表的にウイルス由来のエンハンサーを使用する。本分野においてよく知られているSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモーターを活性化させる例示的なエンハンサーエレメントである。
本発明の発現ベクターは開始ベクター(例えば、市販ベクター)により構築されてもよい。このようなベクターは所望の全ての隣接配列を含んでも含まなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の1つ又は複数はベクターに存在していない場合、個々に入手してベクターと連結してもよい。隣接配列の各々を得るために用いた方法は、当業者に周知である。
ベクターを構築して、抗OX40抗体を含む軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成されたベクターを適切な宿主細胞に挿入して、増幅及び/又はポリペプチド発現に利用する。選択された宿主細胞への抗OX40抗体についての発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション又はその他の既知技術を含む周知の方法によって達成され得る。選定された方法の一部は使用される宿主細胞のタイプに依存する。
宿主細胞は適切な条件で培養された場合、抗OX40抗体を合成して、その後、抗OX40抗体は培地から(宿主細胞がこの抗体を培地に分泌した場合)収集され、又は(分泌しない場合)この抗体を産生する宿主細胞から直接的に収集される。適切な宿主細胞は上記に記載される通りである。
ベクターを構築して、抗OX40抗体を含む軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成されたベクターを適切な宿主細胞に挿入して、増幅及び/又はポリペプチド発現に利用する。選択された宿主細胞への抗OX40抗体についての発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション又はその他の既知技術を含む周知の方法によって達成され得る。選定された方法の一部は使用される宿主細胞のタイプに依存する。
宿主細胞は適切な条件で培養された場合、抗OX40抗体を合成して、その後、抗OX40抗体は培地から(宿主細胞がこの抗体を培地に分泌した場合)収集され、又は(分泌しない場合)この抗体を産生する宿主細胞から直接的に収集される。適切な宿主細胞は上記に記載される通りである。
治療目的に利用される抗OX40抗体の用途
本明細書に記載される抗OX40抗体の全ての様態は本明細書に記載される様々な病状及び疾患を治療するための薬物の製造に利用できるが、前記病状及び疾患、特に病状はOX40を発現するB細胞(特にT細胞、NK細胞及び好中球細胞)に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、前記病状及び疾患は、T細胞関連がんであり、膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、泌尿生殖器がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、胃腺がん、非小細胞肺がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、胃食道接合部腺がん、黒色腫、肉腫、およびウイルス関連のがんを含むが、それらに限定されるものではない。幾つかの実施形態において、癌は、転移性癌、難治性癌、または再発性癌である。前記病状及び疾患は、例えば、OX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む、他のOX40により媒介される疾患であり得る。
本明細書に記載される抗OX40抗体の全ての様態は本明細書に記載される様々な病状及び疾患を治療するための薬物の製造に利用できるが、前記病状及び疾患、特に病状はOX40を発現するB細胞(特にT細胞、NK細胞及び好中球細胞)に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、前記病状及び疾患は、T細胞関連がんであり、膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、泌尿生殖器がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、胃腺がん、非小細胞肺がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、胃食道接合部腺がん、黒色腫、肉腫、およびウイルス関連のがんを含むが、それらに限定されるものではない。幾つかの実施形態において、癌は、転移性癌、難治性癌、または再発性癌である。前記病状及び疾患は、例えば、OX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む、他のOX40により媒介される疾患であり得る。
診断用途、測定及び試薬キット
本発明の抗OX40抗体は診断測定に利用でき、例えば、測定と合わせて組織(例えば、骨髄)又は細胞(例えば、形質細胞)に発現するOX40を検出及び/又は定量する。抗OX40抗体はOX40の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。抗OX40抗体はOX40の単独重合及び/又はヘテロ重合受容体複合物の形成における作用、及び前記OX40受容体複合物の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。
OX40の血清含有量は、予後のものであってよい。本発明の実施形態は、可溶性OX40が腫瘍細胞における膜結合OX40の潜在的な代用品であるかを測定するために、診断測定及び試薬キットを含む。
本発明の抗OX40抗体はOX40に関連する疾患及び/又は病状を検出、診断又は監視するための診断目的に利用できる。本発明は当業者によく知られている代表的な免疫組織学方法によりサンプルにおけるOX40の存在を検出することを提供するインビボ又はインビトロでOX40を検出できる。OX40の存在検出に適する方法の実例はELISA、FACS、RIAなどを含む。
本発明の抗OX40抗体は診断測定に利用でき、例えば、測定と合わせて組織(例えば、骨髄)又は細胞(例えば、形質細胞)に発現するOX40を検出及び/又は定量する。抗OX40抗体はOX40の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。抗OX40抗体はOX40の単独重合及び/又はヘテロ重合受容体複合物の形成における作用、及び前記OX40受容体複合物の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。
OX40の血清含有量は、予後のものであってよい。本発明の実施形態は、可溶性OX40が腫瘍細胞における膜結合OX40の潜在的な代用品であるかを測定するために、診断測定及び試薬キットを含む。
本発明の抗OX40抗体はOX40に関連する疾患及び/又は病状を検出、診断又は監視するための診断目的に利用できる。本発明は当業者によく知られている代表的な免疫組織学方法によりサンプルにおけるOX40の存在を検出することを提供するインビボ又はインビトロでOX40を検出できる。OX40の存在検出に適する方法の実例はELISA、FACS、RIAなどを含む。
診断応用について、通常、検出できる標識基により抗OX40抗体を標識する。適切な標識基は、下記のもの、即ち、放射性同位体又は放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、発蛍光団(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光剤)、酵素団(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光団、ビオチン団又は二次レポーターにより認識された予定ポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー配列、二次抗体に利用される結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、標識基は各長さのサブスペーサーにより抗OX40抗体とカップリングして、潜在的な立体障害を低減させる。タンパク質を標識するための各方法は本分野においてよく知られていると共に、本発明を実施できる。
本発明の一様態はOX40を認識又は発現する細胞を提供する。具体的な一実施形態において、標識基で抗体を標識すると共に、標識された抗体とOX40との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、インビボで抗体とOX40との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、本分野においてよく知られている技術により抗体-OX40を分離及び測定する。
本発明の別の様態は本発明の抗体に対してOX40と競合的に結合する試験分子の存在の検出を提供する。前記測定の実例は、試験分子が存在する、又は存在しない場合の、OX40を一定量で含む溶液における遊離抗体の量の検出に関する。遊離抗体(即ち、OX40と結合していない抗体)の量の増加は、該抗体に対して試験分子がOX40と競合的に結合できることを示す。一実施形態において、標識基で抗体を標識する。或いは、試験分子を標識すると共に、抗体が存在する、又は存在しない場合に遊離試験分子の量を監視する。
本発明の一様態はOX40を認識又は発現する細胞を提供する。具体的な一実施形態において、標識基で抗体を標識すると共に、標識された抗体とOX40との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、インビボで抗体とOX40との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、本分野においてよく知られている技術により抗体-OX40を分離及び測定する。
本発明の別の様態は本発明の抗体に対してOX40と競合的に結合する試験分子の存在の検出を提供する。前記測定の実例は、試験分子が存在する、又は存在しない場合の、OX40を一定量で含む溶液における遊離抗体の量の検出に関する。遊離抗体(即ち、OX40と結合していない抗体)の量の増加は、該抗体に対して試験分子がOX40と競合的に結合できることを示す。一実施形態において、標識基で抗体を標識する。或いは、試験分子を標識すると共に、抗体が存在する、又は存在しない場合に遊離試験分子の量を監視する。
医薬組成物、投与経路
本発明は、治療有効量の1種又は複数種の本発明の抗OX40抗体と、薬学的に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び/又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、医薬組成物に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び/又はアジュバントなどは、好ましくは、採用される用量及び濃度で受験者に対して無毒である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のpH値、浸透性、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を改善、維持又は保留するための物質を含んでもよい。これらの物質は既存技術でよく知られており、例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、第18版、A. R. Genrmo編集、1990、Mack Publishing Companyを参照する。所望の投与経路、送達方式及び必要とされる用量によって最適な医薬組成物を決定する。
本発明の医薬組成物は非経口送達で使用してもよい。或いは、組成物は吸入又は消化器(例えば、経口)送達で使用してもよい。前記薬学的に許容される組成物は本分野の技術により製造する。
その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的に又は制御的に放出される送達調製物に抗OX40抗体が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的又は制御可能な送達方式を提供するための技術(例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポ注射)も当業者によく知られている。
本発明は、治療有効量の1種又は複数種の本発明の抗OX40抗体と、薬学的に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び/又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、医薬組成物に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び/又はアジュバントなどは、好ましくは、採用される用量及び濃度で受験者に対して無毒である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のpH値、浸透性、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を改善、維持又は保留するための物質を含んでもよい。これらの物質は既存技術でよく知られており、例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、第18版、A. R. Genrmo編集、1990、Mack Publishing Companyを参照する。所望の投与経路、送達方式及び必要とされる用量によって最適な医薬組成物を決定する。
本発明の医薬組成物は非経口送達で使用してもよい。或いは、組成物は吸入又は消化器(例えば、経口)送達で使用してもよい。前記薬学的に許容される組成物は本分野の技術により製造する。
その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的に又は制御的に放出される送達調製物に抗OX40抗体が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的又は制御可能な送達方式を提供するための技術(例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポ注射)も当業者によく知られている。
インビボで投与する医薬組成物は、通常、無菌製剤の形態で提供する。無菌ろ過膜によりろ過することで殺菌を実現する。組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥及び再構成の前に又はその後にこの方法により殺菌する。非経口投与に利用される組成物は凍結乾燥の形態又は溶液で保存できる。非経口組成物は、通常、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ、またはバイアルに入れられる。
医薬組成物は、調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、或いは脱水又は凍結乾燥粉末の形態で無菌バイアルに保存される。前記調製物はレディー・ツー・ユースの形態又は投与直前再構成の形態(例えば、凍結乾燥)のいずれで保存できる。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは乾燥タンパク質を有する第1容器と含水調製物を有する第2容器をそれぞれ含む。本発明の幾つかの実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ(例えば、液体用シリンジ及び凍結乾燥用シリンジ)を含む試薬キットを提供する。
本発明は、本発明の何れか1つの実施形態に係る抗OX40抗体又はその抗原結合断片又はその医薬組成物を投与することで、患者(特に患者のT細胞関連疾患、例えば、T細胞関連がん及び自己免疫疾患)を治療する方法を提供する。
医薬組成物は、調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、或いは脱水又は凍結乾燥粉末の形態で無菌バイアルに保存される。前記調製物はレディー・ツー・ユースの形態又は投与直前再構成の形態(例えば、凍結乾燥)のいずれで保存できる。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは乾燥タンパク質を有する第1容器と含水調製物を有する第2容器をそれぞれ含む。本発明の幾つかの実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ(例えば、液体用シリンジ及び凍結乾燥用シリンジ)を含む試薬キットを提供する。
本発明は、本発明の何れか1つの実施形態に係る抗OX40抗体又はその抗原結合断片又はその医薬組成物を投与することで、患者(特に患者のT細胞関連疾患、例えば、T細胞関連がん及び自己免疫疾患)を治療する方法を提供する。
本明細書において、用語「患者」、「被験者」、「個体」、「対象」は互いに交換して使用できるが、任意の生体を含み、好ましくは動物であり、より好ましくは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギなど)であり、最も好ましくはヒトである。「治療」は、被験者に対して本明細書に記載される治療方案を採用して、少なくとも1つの陽性治療効果(例えば、がん細胞数減少、腫瘍体積減少、がん細胞の周辺器官への浸潤速度低下又は腫瘍転移又は腫瘍成長の速度低下)を得ることである。患者を有効的に治療する治療方案は様々な要素(例えば、患者の疾患状態、年齢、体重及び療法の被験者の抗がん反応を活性化させる能力)によって変更する。
採用しようとする本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療程度及び目標によって決定される。当業者に理解されるように、治療に使用される適切な用量レベルは部分的に送達される分子、適応症、投与経路及び患者の大きさ(体重、体表又は器官の大きさ)及び/又は状況(年齢及び一般健康状況)によって変化する。幾つかの実施形態において、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。
投与頻度は使用される調製物における特定の抗OX40抗体の薬物動態パラメータに依存する。代表的には、臨床医は組成物を所望の効果を実現する投薬量まで投与する。従って、組成物は1回用量として投与してもよく、或いは2回以上の用量(必要とされる分子を同じ量で含んでもよく又は含まなくてもよい)として経時的に、または移植デバイス又はカテーテルを介して連続注入として投与してもよい。
医薬組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、例えば、経口、静脈内、腹膜内、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈又は病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。
採用しようとする本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療程度及び目標によって決定される。当業者に理解されるように、治療に使用される適切な用量レベルは部分的に送達される分子、適応症、投与経路及び患者の大きさ(体重、体表又は器官の大きさ)及び/又は状況(年齢及び一般健康状況)によって変化する。幾つかの実施形態において、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。
投与頻度は使用される調製物における特定の抗OX40抗体の薬物動態パラメータに依存する。代表的には、臨床医は組成物を所望の効果を実現する投薬量まで投与する。従って、組成物は1回用量として投与してもよく、或いは2回以上の用量(必要とされる分子を同じ量で含んでもよく又は含まなくてもよい)として経時的に、または移植デバイス又はカテーテルを介して連続注入として投与してもよい。
医薬組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、例えば、経口、静脈内、腹膜内、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈又は病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。
本明細書の実施形態
1、配列番号1に示されるHCDR1、配列番号2に示されるHCDR2、及び配列番号3に示されるHCDR3を含み、及び/又は配列番号4に示されるLCDR1、配列番号5に示されるLCDR2及び配列番号6に示されるLCDR3を含むことを特徴とする、抗OX40抗体又はその抗原結合断片。
2、上記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は、配列番号7-38のいずれか1つに示されるHCDR1、配列番号39-65のいずれか1つに示されるHCDR2、及び配列番号66-114のいずれか1つに示されるHCDR3を含み、及び/又は配列番号115-145のいずれか1つに示されるLCDR1、配列番号146-159のいずれか1つに示されるLCDR2、及び配列番号160-199のいずれか1つに示されるLCDR3を含むことを特徴とする。
3、上記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は表1の群a1~群a7の何れか1群に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3、および/または表2の群b1~群b7の何れか1群に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むことを特徴とする。
4、前記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は表3の群c1~群c71の何れか1群に示されるHCDR及びLCDRを含むことを特徴とする。
5、前記1~4の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体VHの各FR領域は配列番号200-270に示されるVHのいずれか1つのVHのFR領域であり、VLの各FR領域は配列番号271-341に示されるVLのいずれか1つのVLのFR領域であり;より好ましくは、前記抗OX40抗体VHおよびVLの各FR領域は表4から選ばれるいずれか1つの抗体のVHおよびVLのFR領域であることを特徴とする。
6、前記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列は配列番号200-270の何れか1つに示され、および/またはVLのアミノ酸配列は配列番号271-341のいずれか1つに示され、好ましくは、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列およびVLのアミノ酸配列は表4から選ばれるいずれか1つの抗体番号に示されることを特徴とする。
7、前記1~6の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体であることを特徴とする。
8、前記1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤又はベクターと、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
9、核酸分子または当該核酸分子を含む担体であって、
(1)前記1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
(2)(1)に記載されるポリヌクレオチド配列の相補配列、から選ばれる。
10、前記1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片の、T細胞関連疾患を治療するためのものの製造における応用において、好ましくは、前記T細胞関連疾患はT細胞に関連する腫瘍又はOX40媒介性疾患であり、より好ましくは、前記OX40媒介性疾患はOX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
1、配列番号1に示されるHCDR1、配列番号2に示されるHCDR2、及び配列番号3に示されるHCDR3を含み、及び/又は配列番号4に示されるLCDR1、配列番号5に示されるLCDR2及び配列番号6に示されるLCDR3を含むことを特徴とする、抗OX40抗体又はその抗原結合断片。
2、上記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は、配列番号7-38のいずれか1つに示されるHCDR1、配列番号39-65のいずれか1つに示されるHCDR2、及び配列番号66-114のいずれか1つに示されるHCDR3を含み、及び/又は配列番号115-145のいずれか1つに示されるLCDR1、配列番号146-159のいずれか1つに示されるLCDR2、及び配列番号160-199のいずれか1つに示されるLCDR3を含むことを特徴とする。
3、上記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は表1の群a1~群a7の何れか1群に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3、および/または表2の群b1~群b7の何れか1群に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むことを特徴とする。
4、前記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は表3の群c1~群c71の何れか1群に示されるHCDR及びLCDRを含むことを特徴とする。
5、前記1~4の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体VHの各FR領域は配列番号200-270に示されるVHのいずれか1つのVHのFR領域であり、VLの各FR領域は配列番号271-341に示されるVLのいずれか1つのVLのFR領域であり;より好ましくは、前記抗OX40抗体VHおよびVLの各FR領域は表4から選ばれるいずれか1つの抗体のVHおよびVLのFR領域であることを特徴とする。
6、前記1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列は配列番号200-270の何れか1つに示され、および/またはVLのアミノ酸配列は配列番号271-341のいずれか1つに示され、好ましくは、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列およびVLのアミノ酸配列は表4から選ばれるいずれか1つの抗体番号に示されることを特徴とする。
7、前記1~6の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体であることを特徴とする。
8、前記1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤又はベクターと、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
9、核酸分子または当該核酸分子を含む担体であって、
(1)前記1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
(2)(1)に記載されるポリヌクレオチド配列の相補配列、から選ばれる。
10、前記1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片の、T細胞関連疾患を治療するためのものの製造における応用において、好ましくは、前記T細胞関連疾患はT細胞に関連する腫瘍又はOX40媒介性疾患であり、より好ましくは、前記OX40媒介性疾患はOX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
下記は具体的な実施例により本発明を説明する。これらの実施例は説明するためのものであり、意図的に本発明の範囲を限定するものではない。実施例に使用される方法及び材料は別途で断りのない限り、本分野でよく知られている材料及び方法である。
材料及び方法
1)免疫グロブリン可変領域遺伝子ヒト化マウスであるAceMouseGBTMは、湖南華康恒健生物技術有限公司から提供されている。マウスはすべて湖南華康恒健生物技術有限公司で飼育され、関連する動物実験はすべて中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、湖南華康恒健生物技術有限公司の動物管理および使用委員会によって承認された。
2)OX40ヒト化マウス(hOX40Tgマウス):ヒト-マウスキメラTnfrsf4(OX40)cDNA -wpre-polyA(ただし、OX40遺伝子の細胞外領域(約2.3kb)および膜貫通領域の前半部分がヒト由来であり、Exon1-5とExon6の前半を含み、膜貫通領域の後半と細胞内領域はマウス由来であり、Exon7とExon6の後半を含む。)この系統のマウスは、上海南方モデル動物バイオテクノロジー(株)がCRISPR/Cas9技術よって取得されたものである。この遺伝子型のマウスは、マウス抗ヒトOX40抗体の研究に適している。
3) human FCGRTgマウスは、Fc 受容体ヒト化マウス (マウス FcγRs ノックアウト (FcγRα-/-) マウスに、ヒトのFcγRs (hFcγRI+/hFcγRIIAR131+/hFcγRIIB+/hFcγRIIIAF158+/hFcγRIIIB+)が導入された)である (当該マウスは、Nat Commun. 2019 Sep 27;10(1):4206. doi: 10.1038/s41467-019-12097-6.に記載されている)。この遺伝子型のマウスは、ヒトFc受容体を発現する。
4)FcγRヒト化OX40ヒト化マウスhFCGRTghOX40Tgマウス):上記のFc受容体ヒト化マウスとOX40ヒト化マウス(hOX40Tgマウス)を交配して得られ、この遺伝子型のマウスは同時にヒトFc受容体とヒトOX40分子を発現し、ヒト抗ヒトOX40抗体の研究に適している。
5)hOX40Tg OT1マウス:OT1マウスとOX40ヒト化マウス(hOX40Tgマウス)を交配してえられ、この遺伝子型マウスのCD8+T細胞はOVA特異性を持ちながら、ヒトOX40分子を発現し、ヒト抗ヒトOX40抗体の研究に適している。
すべてのマウスは、上海交通大学医学部の動物科学実験センターで飼育され、すべての動物実験は、中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、上海交通大学医学部の動物管理および使用委員会によって承認された。
1)免疫グロブリン可変領域遺伝子ヒト化マウスであるAceMouseGBTMは、湖南華康恒健生物技術有限公司から提供されている。マウスはすべて湖南華康恒健生物技術有限公司で飼育され、関連する動物実験はすべて中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、湖南華康恒健生物技術有限公司の動物管理および使用委員会によって承認された。
2)OX40ヒト化マウス(hOX40Tgマウス):ヒト-マウスキメラTnfrsf4(OX40)cDNA -wpre-polyA(ただし、OX40遺伝子の細胞外領域(約2.3kb)および膜貫通領域の前半部分がヒト由来であり、Exon1-5とExon6の前半を含み、膜貫通領域の後半と細胞内領域はマウス由来であり、Exon7とExon6の後半を含む。)この系統のマウスは、上海南方モデル動物バイオテクノロジー(株)がCRISPR/Cas9技術よって取得されたものである。この遺伝子型のマウスは、マウス抗ヒトOX40抗体の研究に適している。
3) human FCGRTgマウスは、Fc 受容体ヒト化マウス (マウス FcγRs ノックアウト (FcγRα-/-) マウスに、ヒトのFcγRs (hFcγRI+/hFcγRIIAR131+/hFcγRIIB+/hFcγRIIIAF158+/hFcγRIIIB+)が導入された)である (当該マウスは、Nat Commun. 2019 Sep 27;10(1):4206. doi: 10.1038/s41467-019-12097-6.に記載されている)。この遺伝子型のマウスは、ヒトFc受容体を発現する。
4)FcγRヒト化OX40ヒト化マウスhFCGRTghOX40Tgマウス):上記のFc受容体ヒト化マウスとOX40ヒト化マウス(hOX40Tgマウス)を交配して得られ、この遺伝子型のマウスは同時にヒトFc受容体とヒトOX40分子を発現し、ヒト抗ヒトOX40抗体の研究に適している。
5)hOX40Tg OT1マウス:OT1マウスとOX40ヒト化マウス(hOX40Tgマウス)を交配してえられ、この遺伝子型マウスのCD8+T細胞はOVA特異性を持ちながら、ヒトOX40分子を発現し、ヒト抗ヒトOX40抗体の研究に適している。
すべてのマウスは、上海交通大学医学部の動物科学実験センターで飼育され、すべての動物実験は、中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、上海交通大学医学部の動物管理および使用委員会によって承認された。
実施例1:マウスに抗ヒトOX40のモノクローナル抗体を産生させる免疫化
最初の免疫化は、商品化の組換えヒトOX40抗原タンパク質(6Hisタグ、製品番号CK60、仕入先Novoprotein)及び標準完全フロイントアジュバントを利用して40μgヒト組換えOX40タンパク質抗原/20gマウス体重の用量で行った。2回目から4回目の免疫化では、ヒトOX40全長タンパク質(配列はNCBIデータボトムを参照、番号NM_003327.2)を利用して、6週齢のマウスに対して免疫化を行った。5回目免疫化は商品化の組換えヒトOX40抗原タンパク質(6Hisタグ、製品番号CK60、仕入先Novoprotein)及びPBSを利用して25μgヒト組換えOX40タンパク質抗原/マウスの用量で行った。
最初の免疫化は、商品化の組換えヒトOX40抗原タンパク質(6Hisタグ、製品番号CK60、仕入先Novoprotein)及び標準完全フロイントアジュバントを利用して40μgヒト組換えOX40タンパク質抗原/20gマウス体重の用量で行った。2回目から4回目の免疫化では、ヒトOX40全長タンパク質(配列はNCBIデータボトムを参照、番号NM_003327.2)を利用して、6週齢のマウスに対して免疫化を行った。5回目免疫化は商品化の組換えヒトOX40抗原タンパク質(6Hisタグ、製品番号CK60、仕入先Novoprotein)及びPBSを利用して25μgヒト組換えOX40タンパク質抗原/マウスの用量で行った。
実施例2、酵素結合免疫吸着測定法により免疫後のマウス血清に対する検出
PBSでヒト組換えOX40抗原タンパク質(Novoprotein、製品番号CK60)を0.5ng/μLとなるように希釈させ、Maxisorpの96ウェルフラットボトムELISA用プレートに抗原を100μL/ウェルで入れて、ラップで密封してから、4℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、PBS(200μL/ウェル)で1回洗浄し、更にPBSを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに200μLブロッキング液(10%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れて、室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。50μL希釈液(5%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れ、血清を濃度勾配希釈させて96ウェルプレートに入れ、室温で1時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液(0.05% Tween-20を含むPBS)で3回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。50μL希釈液(5%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れ、HRPのヤギ抗マウスIgG二次抗体(最終濃度0.4μg/mL、メーカーBiolegend、製品番号405306)を希釈させて、室温で1時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液(0.05% Tween-20を含むPBS)で5回洗浄し(200μL/ウェル)、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。TMB-過酸化水素尿素溶液(メーカーThermo Scientific(商標)、製品番号34029)基質溶液を50μL/ウェルで入れ、室温で遮光で3~5分間置き、0.25M硫酸を50μL/ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより450nm波長における吸光度を検出した。
PBSでヒト組換えOX40抗原タンパク質(Novoprotein、製品番号CK60)を0.5ng/μLとなるように希釈させ、Maxisorpの96ウェルフラットボトムELISA用プレートに抗原を100μL/ウェルで入れて、ラップで密封してから、4℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、PBS(200μL/ウェル)で1回洗浄し、更にPBSを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに200μLブロッキング液(10%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れて、室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。50μL希釈液(5%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れ、血清を濃度勾配希釈させて96ウェルプレートに入れ、室温で1時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液(0.05% Tween-20を含むPBS)で3回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。50μL希釈液(5%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れ、HRPのヤギ抗マウスIgG二次抗体(最終濃度0.4μg/mL、メーカーBiolegend、製品番号405306)を希釈させて、室温で1時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液(0.05% Tween-20を含むPBS)で5回洗浄し(200μL/ウェル)、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。TMB-過酸化水素尿素溶液(メーカーThermo Scientific(商標)、製品番号34029)基質溶液を50μL/ウェルで入れ、室温で遮光で3~5分間置き、0.25M硫酸を50μL/ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより450nm波長における吸光度を検出した。
IgG可変領域ヒト化マウスをHisタグ付きヒトOX40細胞外ドメインタンパク質(hOX40-EC-His,Novoprotein,Cat. No. CK60,Lot. No. 0331348)で免疫化してから、マウスの脾臓、鼠径部、および膝窩リンパ節細胞をフローサイトメトリーにより選別し、得られたIgD陰性B系統細胞について単細胞シーケンシング(10x Genomics)を行った。免疫後の抗原特異的なB細胞クローン増殖の特徴により、標的配列(軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列)を多くの配列から選択し、定常領域(軽鎖はCκ(配列番号347)、重鎖定常領域はIgG定常領域配列番号345)を有する完全組換え抗体に作製する。抗体配列を発現ベクターに挿入し、コトランスフェクションの形で懸濁液293細胞に移し、上清を回収し、プロテインGビーズでアフィニティー精製を行った。精製抗体をモレキュラーシーブ(Size-Exclusion Chromatography、SEC)によりポリマーを除去し、得られたモノクローナル抗体を4℃または-20℃の冷蔵庫に保存し、使用に備えた。
実施例4、ELISA測定により単細胞シーケンシング抗体がhOX40-ECに結合する能力の検出
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)に100μl hOX40-EC-His(Novoprotein)を2μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(0.05% Tween 20を含むPBS)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)精製された単細胞シーケンシング抗体、陰性対照抗体Ctrl hIgG、および陽性対照抗体IBI101、Pogalizumabを適切に希釈し(3.16μg/ml-1ng/ml)、それぞれ100μl取り、上記ブロックウェルに入れ(PBSで3回洗浄し、液体を廃棄)、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトIgG Fc HRP(1:100000、Bethyl)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、10-30分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
図1および図6A-Bに示すように、単細胞シーケンシング組換え抗体はOX40結合能力を持っている。
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)に100μl hOX40-EC-His(Novoprotein)を2μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(0.05% Tween 20を含むPBS)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)精製された単細胞シーケンシング抗体、陰性対照抗体Ctrl hIgG、および陽性対照抗体IBI101、Pogalizumabを適切に希釈し(3.16μg/ml-1ng/ml)、それぞれ100μl取り、上記ブロックウェルに入れ(PBSで3回洗浄し、液体を廃棄)、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトIgG Fc HRP(1:100000、Bethyl)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、10-30分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
図1および図6A-Bに示すように、単細胞シーケンシング組換え抗体はOX40結合能力を持っている。
実施例5:免疫後のマウス脾臓細胞から電気融合技術によりハイブリドーマ細胞の取得
事前にSP2/0マウス骨髄腫細胞を蘇生させた。融合当日、SP2/0マウス骨髄腫細胞を取って計数した。免疫が正確に行われたOX40マウス脾臓を輸送培地HB培地(1%のP/Sを含む)に置き、すぐに脾臓の細胞を抽出して分離し、計数して使用に備える。1.5x108個脾臓細胞と1x108個SP2/0マウス骨髄腫の比率で混合させた。混合してから、200Gで5分間遠心分離し、上清を捨て、20mLの融合液で2回洗浄して、使用に備える。200G及び室温で5分間遠心分離し、上清を捨て、6.4mL電気融合緩衝液を入れて、沈殿物を再懸濁させた。50mL遠心管を用意して、予熱された13mLHB培地を入れた。混合細胞懸濁液を75%アルコールで消毒され且つ乾燥されたCUY497X10電極に入れ、ECFG21電気融合マシン(メーカーNEPAGENE、型番ECFG21)の標準操作フローにより細胞電気融合を行った。融合終了後、細胞を吸出して、インキュベーターで事前に予熱された13mLHB培地に入れた。HAT培地で細胞を再懸濁させ、5×105細胞/ウェルで96ウェルフラットボトムプレートにプレーティングした。96ウェルプレートを37℃インキュベーターに静置して培養し、毎日細胞を観察し、10日間目に上清を取り、ELISA予備スクリーニングを行った。
事前にSP2/0マウス骨髄腫細胞を蘇生させた。融合当日、SP2/0マウス骨髄腫細胞を取って計数した。免疫が正確に行われたOX40マウス脾臓を輸送培地HB培地(1%のP/Sを含む)に置き、すぐに脾臓の細胞を抽出して分離し、計数して使用に備える。1.5x108個脾臓細胞と1x108個SP2/0マウス骨髄腫の比率で混合させた。混合してから、200Gで5分間遠心分離し、上清を捨て、20mLの融合液で2回洗浄して、使用に備える。200G及び室温で5分間遠心分離し、上清を捨て、6.4mL電気融合緩衝液を入れて、沈殿物を再懸濁させた。50mL遠心管を用意して、予熱された13mLHB培地を入れた。混合細胞懸濁液を75%アルコールで消毒され且つ乾燥されたCUY497X10電極に入れ、ECFG21電気融合マシン(メーカーNEPAGENE、型番ECFG21)の標準操作フローにより細胞電気融合を行った。融合終了後、細胞を吸出して、インキュベーターで事前に予熱された13mLHB培地に入れた。HAT培地で細胞を再懸濁させ、5×105細胞/ウェルで96ウェルフラットボトムプレートにプレーティングした。96ウェルプレートを37℃インキュベーターに静置して培養し、毎日細胞を観察し、10日間目に上清を取り、ELISA予備スクリーニングを行った。
実施例6:酵素結合免疫吸着測定法によりハイブリドーマ抗ヒトOX40モノクローナル抗体のスクリーニング
PBSでOX40抗原(Novoprotein cat:CS79CK60)を0.5ng/μLとなるように希釈させた。Maxisorpの96ウェルフラットボトムELISA用プレートに抗原を100μL/ウェルで入れて、ラップで密封してから、4℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、PBS(200μL/ウェル)で1回洗浄し、更にPBSを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに200μLブロッキング液を入れて、室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。50μLサンプル(実施例5で得られたOX40ハイブリドーマ細胞の培養上清)を入れ、室温で1時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液で3回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。50μL希釈液(5%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れ、HRPのヤギ抗マウスIgG二次抗体を希釈させて、室温で1時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液で5回洗浄し(200μL/ウェル)、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。TMB-過酸化水素尿素溶液基質溶液を50μL/ウェルで入れ、室温で遮光で3~5分間置き、0.25M硫酸を50μL/ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより450nm波長における吸光度を検出した。結果を下表に示す:
PBSでOX40抗原(Novoprotein cat:CS79CK60)を0.5ng/μLとなるように希釈させた。Maxisorpの96ウェルフラットボトムELISA用プレートに抗原を100μL/ウェルで入れて、ラップで密封してから、4℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、PBS(200μL/ウェル)で1回洗浄し、更にPBSを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに200μLブロッキング液を入れて、室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。50μLサンプル(実施例5で得られたOX40ハイブリドーマ細胞の培養上清)を入れ、室温で1時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液で3回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。50μL希釈液(5%ウシ胎児血清を含むPBS)を入れ、HRPのヤギ抗マウスIgG二次抗体を希釈させて、室温で1時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液で5回洗浄し(200μL/ウェル)、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。TMB-過酸化水素尿素溶液基質溶液を50μL/ウェルで入れ、室温で遮光で3~5分間置き、0.25M硫酸を50μL/ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより450nm波長における吸光度を検出した。結果を下表に示す:
実施例7:フローサイトメータにより抗ヒトOX40抗体とOX40過剰発現細胞表面OX40との結合分析
200GでOX40過剰表現細胞を遠心分離して収集し、3%FCSを含むPBSで1回洗浄してから、3%FCSを含むPBS2.5mLに再懸濁させ、細胞を各ウエル25μL細胞(2.5×105)で96ウェルプレートに入れ、それぞれ75μLサンプル(実施例5で得られたOX40ハイブリドーマ細胞の培養上清)を入れ、陽性対照ウエルを設けて、75μL抗-OX40抗体(クローンACT35、メーカーBiolegend、最終濃度1μg/mL)を入れた。陰性対照ウエル1に75μLIgG2aアイソタイプ対照(クローンMG2a-53、メーカーBiolegend、最終濃度1μg/mL)を入れた。陰性対照ウエル2に3%FCSを含むPBS75μLを入れ、4℃冷蔵庫で1時間インキュベートしてから、3%FCSを含むPBSで2回洗浄した。上清を捨ててから、サンプルウエル、陽性対照ウエル、陰性対照ウエル1及び陰性対照ウエル2に500 ng/mL濃度の二次抗体50μL(メーカー商Ebioscience、ヤギ抗マウスIgG-PE、製品番号12-4010-82)を入れた。それからプレートを4℃冷蔵庫に置き、遮光で30分間インキュベートしてから、3%FCSを含むPBSで2回洗浄し、最後に細胞を3%FCSを含むPBS50μLに再懸濁させ、フローサイトメータにより検出した。結果を下記表および図2A-Cに示す。
200GでOX40過剰表現細胞を遠心分離して収集し、3%FCSを含むPBSで1回洗浄してから、3%FCSを含むPBS2.5mLに再懸濁させ、細胞を各ウエル25μL細胞(2.5×105)で96ウェルプレートに入れ、それぞれ75μLサンプル(実施例5で得られたOX40ハイブリドーマ細胞の培養上清)を入れ、陽性対照ウエルを設けて、75μL抗-OX40抗体(クローンACT35、メーカーBiolegend、最終濃度1μg/mL)を入れた。陰性対照ウエル1に75μLIgG2aアイソタイプ対照(クローンMG2a-53、メーカーBiolegend、最終濃度1μg/mL)を入れた。陰性対照ウエル2に3%FCSを含むPBS75μLを入れ、4℃冷蔵庫で1時間インキュベートしてから、3%FCSを含むPBSで2回洗浄した。上清を捨ててから、サンプルウエル、陽性対照ウエル、陰性対照ウエル1及び陰性対照ウエル2に500 ng/mL濃度の二次抗体50μL(メーカー商Ebioscience、ヤギ抗マウスIgG-PE、製品番号12-4010-82)を入れた。それからプレートを4℃冷蔵庫に置き、遮光で30分間インキュベートしてから、3%FCSを含むPBSで2回洗浄し、最後に細胞を3%FCSを含むPBS50μLに再懸濁させ、フローサイトメータにより検出した。結果を下記表および図2A-Cに示す。
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)に100μl hOX40-EC-His(Novoprotein)を1μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(0.05% Tween 20を含むPBS)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)ハイブリドーマ上清を勾配希釈し(1:10/1:100/1:1000/1:10000)、それぞれ100μl上記のブロックウェルに取り(PBSTで2回洗浄し、液体を廃棄))、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗マウスIgG Fc HRP(1:5000,Jackson ImmunoResearch)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、しばらくしてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
6)結果統計のためにサンプルを1:100に希釈したときのシグナル値を選択した。
結果を下表、図3および図6A-Bに示され、同じ可変領域を有するハイブリドーマ抗体または組換え抗体クローンがOX40に結合する能力を有することを示している。
1)PBMC懸濁液の調製:-80℃の冷蔵庫から凍結した正常献血者由来のPBMC(Ficoll分離で健常人末梢血単核細胞を取得)を取り出し、素早く37℃の水浴で蘇生・解凍した。予熱したPBSで2回洗浄した後、適量なPBSで細胞を再懸濁し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
2)CFSE標識PBMC:実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が(2-4)*10^7/ml、体積が5ml未満になるようにPBSで希釈し、CFSEを加え、最終濃度を5μMにした。混合後、37℃のインキュベーターに入れ、15分間インキュベートした。次いで、細胞を9mlの5%FBSを含有する洗浄液で2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。適量な初代細胞培養培地(RPMI + 10% FBS + 1% Pen/Strep + 1% HEPES + 1%ピルビン酸ナトリウム + 0.1% 2ME(最終濃度50uM))を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
3)対照(未処理、CD3のみ、CD3+CD28)を除き、0.2μg/mlの抗ヒトCD3(クローン:H001、Sino Biological)を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のCFSE標識細胞を再懸濁し細胞密度を2*10^6/mlにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が2*10^5になるように、100μlの上記細胞を96ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはCFSEで標識していない細胞を加え、抗ヒトCD3などの抗体を加えなかった。CD3群のみにCFSE標識細胞と抗ヒトCD3を加え、他の抗体は加えなかった。CD3+CD28群にCFSE標識細胞と抗ヒトCD3を加え、2μg/mlの濃度の抗ヒトCD28抗体も加えた(クローン: H001、Sino Biological)(ステップ4で等体積希釈した後、抗マウスCD3およびCD28の最終濃度はそれぞれ0.1μg/mlおよび1μg/mlであった)。
4)ハイブリドーマ上清を初代培養培地で希釈し(1:5)、1μg/mlのctrl hIgGおよびIBI101をそれぞれ抗体の陰性対照および陽性対照とした。それぞれ100μl取り、上記抗ヒトCD3抗体とCFSE標識PBMCを含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ100μlの培養液を加えた。
5)上記細胞を37℃のインキュベーターで3日間培養した。
6)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:上記培養細胞を96ウェルUプレートに移し、PBSで2回洗浄し、500gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE-Cy7抗ヒトCD4(クローン:SK3、1:500、BD Pharmingen(商標))およびAPC抗ヒトCD8(クローン:RPA-T8(RUO)、1:500、BD Pharmingen(商標))を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄しし、DAPI(0.5μg/ml,Invitrogen)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図4に示すように、ハイブリドーマ抗体クローンはインビトロ免疫活性化活性(PBMCシステム)を持っている。
実施例10、ハイブリドーマ上清中の抗ヒトOX40抗体のインビトロ免疫活性化活性分析(脾臓細胞法)
1)hOX40Tgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製:無菌条件下でhOX40Tgマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlのPBSで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、1:100に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
2)CFSE標識脾臓細胞:実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が(2-4)*10^7/ml、体積が5ml未満になるようにPBSで希釈し、CFSEを加え、最終濃度を5μMにした。混合後、37℃のインキュベーターに入れ、15分間インキュベートした。次いで、細胞を9mlの5%FBSを含有する洗浄液で2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。2mlの初代細胞培養培地(RPMI + 10% FBS + 1% Pen/Strep + 1% HEPES + 1%ピルビン酸ナトリウム + 0.1% 2ME(最終濃度50uM))を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
3)対照(未処理、CD3のみ、CD3+CD28)を除き、0.2μg/mlの抗マウスCD3を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のCFSE標識細胞を再懸濁し細胞密度を2*10^6/mlにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が2*10^5になるように、100μlの上記細胞を96ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはCFSEで標識していない細胞を加え、抗マウスCD3などの抗体を加えなかった。CD3群のみにCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、他の抗体は加えなかった。CD3+CD28群にCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、2μg/mlの濃度の抗マウスCD28抗体も加えた(ステップ4で等体積希釈した後、抗マウスCD3およびCD28の最終濃度はそれぞれ0.1μg/mlおよび1μg/mlであった)。
4)ハイブリドーマ上清を初代培養培地で希釈し(1:4)、1μg/mlのctrl hIgGおよびIBI101をそれぞれ抗体の陰性対照および陽性対照とした。それぞれ100μl取り、上記抗マウスCD3抗体とCFSE標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ100μlの培養液を加えた。
5)上記細胞を37℃のインキュベーターで3日間培養した。
6)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:上記培養細胞を96ウェルUプレートに移し、PBSで2回洗浄し、500gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE抗マウスCD4(クローン:GK1.5,1:500,BD)およびAPC抗マウスCD8a(クローン:53-6.7,1:500,BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml、Invitrogen)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図5に示すように、ハイブリドーマ抗体クローンはインビトロ免疫活性化活性を持っている。
1)hOX40Tgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製:無菌条件下でhOX40Tgマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlのPBSで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、1:100に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
2)CFSE標識脾臓細胞:実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が(2-4)*10^7/ml、体積が5ml未満になるようにPBSで希釈し、CFSEを加え、最終濃度を5μMにした。混合後、37℃のインキュベーターに入れ、15分間インキュベートした。次いで、細胞を9mlの5%FBSを含有する洗浄液で2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。2mlの初代細胞培養培地(RPMI + 10% FBS + 1% Pen/Strep + 1% HEPES + 1%ピルビン酸ナトリウム + 0.1% 2ME(最終濃度50uM))を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
3)対照(未処理、CD3のみ、CD3+CD28)を除き、0.2μg/mlの抗マウスCD3を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のCFSE標識細胞を再懸濁し細胞密度を2*10^6/mlにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が2*10^5になるように、100μlの上記細胞を96ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはCFSEで標識していない細胞を加え、抗マウスCD3などの抗体を加えなかった。CD3群のみにCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、他の抗体は加えなかった。CD3+CD28群にCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、2μg/mlの濃度の抗マウスCD28抗体も加えた(ステップ4で等体積希釈した後、抗マウスCD3およびCD28の最終濃度はそれぞれ0.1μg/mlおよび1μg/mlであった)。
4)ハイブリドーマ上清を初代培養培地で希釈し(1:4)、1μg/mlのctrl hIgGおよびIBI101をそれぞれ抗体の陰性対照および陽性対照とした。それぞれ100μl取り、上記抗マウスCD3抗体とCFSE標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ100μlの培養液を加えた。
5)上記細胞を37℃のインキュベーターで3日間培養した。
6)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:上記培養細胞を96ウェルUプレートに移し、PBSで2回洗浄し、500gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE抗マウスCD4(クローン:GK1.5,1:500,BD)およびAPC抗マウスCD8a(クローン:53-6.7,1:500,BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml、Invitrogen)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図5に示すように、ハイブリドーマ抗体クローンはインビトロ免疫活性化活性を持っている。
実施例11、ELISA測定により抗ヒトOX40抗体がhOX40-ECに競合的に結合する能力の検出
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)に100μl hOX40-EC-His(Novoprotein, CK60)を2μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(PBS with 0.05% Tween 20)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)精製された抗ヒトOX40抗体、陰性対照抗体Ctrl hIgG human OX40-L-6His(Novoprotein,CJ45)を0.2μg/ml human OX40-L-mFc(Novoprotein,CW25)を含む溶液で2μg/mlに希釈し(抗体とリガンドの比例は10:1)、それぞれ100μlを取り、上記ブロックウェルに入れ(PBSで3回洗浄し、液体を廃棄)、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗マウスIgG1 HRP(1:5000,Jackson ImmunoResearch Laboratories,115-035-205)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、10-30分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
図9に示すように、一部の抗ヒトOX40抗体は、リガンドの結合エピトープを競合する能力を持っている。
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)に100μl hOX40-EC-His(Novoprotein, CK60)を2μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(PBS with 0.05% Tween 20)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)精製された抗ヒトOX40抗体、陰性対照抗体Ctrl hIgG human OX40-L-6His(Novoprotein,CJ45)を0.2μg/ml human OX40-L-mFc(Novoprotein,CW25)を含む溶液で2μg/mlに希釈し(抗体とリガンドの比例は10:1)、それぞれ100μlを取り、上記ブロックウェルに入れ(PBSで3回洗浄し、液体を廃棄)、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗マウスIgG1 HRP(1:5000,Jackson ImmunoResearch Laboratories,115-035-205)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、10-30分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
図9に示すように、一部の抗ヒトOX40抗体は、リガンドの結合エピトープを競合する能力を持っている。
実施例12、抗ヒトOX40抗体がhOX40安定トランスフェクト293T細胞に結合する能力
1)hOX40安定トランスフェクト293T細胞は、ヒトOX40細胞外ドメインタンパク質を構成的に発現する。実験計画に従って、ウェルあたりの細胞数が1*10^6になるように、100μlのhOX40安定トランスフェクト293T細胞またはOX40を発現しない293T細胞(PBSで調製)を96ウェルUプレートに加え、400gで5分間遠心分離させ、上清を捨てた。
2)抗体の希釈:抗ヒトOX40組換え抗体、Ctrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)および抗マウスOX40抗体OX86(hIgG1)をPBSで1μg/mlに希釈した。
3)上記の各抗体をそれぞれ50μl 吸引し、上記細胞を再懸濁し、氷上で15分間インキュベートした。
4)PBSで2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を捨てた。
5)フローサイトメトリーによる細胞結合の検出:抗ヒトIgG Fab-PE(クローン:M1310G05、1:200、BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5%のFBS、2 mMのEDTAを含むPBS)に細胞を再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml,Invitrogen)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図7に示すように、抗ヒトOX40抗体は、安定トランスフェクト細胞のOX40に結合する能力を持っている。
1)hOX40安定トランスフェクト293T細胞は、ヒトOX40細胞外ドメインタンパク質を構成的に発現する。実験計画に従って、ウェルあたりの細胞数が1*10^6になるように、100μlのhOX40安定トランスフェクト293T細胞またはOX40を発現しない293T細胞(PBSで調製)を96ウェルUプレートに加え、400gで5分間遠心分離させ、上清を捨てた。
2)抗体の希釈:抗ヒトOX40組換え抗体、Ctrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)および抗マウスOX40抗体OX86(hIgG1)をPBSで1μg/mlに希釈した。
3)上記の各抗体をそれぞれ50μl 吸引し、上記細胞を再懸濁し、氷上で15分間インキュベートした。
4)PBSで2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を捨てた。
5)フローサイトメトリーによる細胞結合の検出:抗ヒトIgG Fab-PE(クローン:M1310G05、1:200、BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5%のFBS、2 mMのEDTAを含むPBS)に細胞を再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml,Invitrogen)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図7に示すように、抗ヒトOX40抗体は、安定トランスフェクト細胞のOX40に結合する能力を持っている。
実施例13、ELISA測定により抗ヒトOX40抗体がヒト、マウス、サルOX40-ECたんぱく質に結合する能力の検出
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)にそれぞれ100μlのhOX40-EC-His(Novoprotein,CK60)、マウス(mouse) OX40-EC(CK52)、アカゲザル(Rhesus) OX40-EC(sinobiological,90846-C08H)、カニクイザル(Cynomolgus) OX40-EC(Novoprotein,CB17)を2μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(PBS with 0.05% Tween 20)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)精製された抗ヒトOX40抗体および陰性対照抗体Ctrl hIgGを適切に希釈し(3.16μg/ml)、それぞれ100μlを取り、上記ブロックウェルに入れ(PBSで3回洗浄し、液体を廃棄)、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトIgG Fc HRP(1:50000,Bethyl,A80-104p)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、10-30分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
図8に示されるように、抗ヒトOX40組換え抗体は、ヒトおよびサルOX40タンパク質に特異的に結合する能力を有するが、一般にマウスOX40には結合しない。
1)96ウェル高吸着ELISAプレート(nunc)にそれぞれ100μlのhOX40-EC-His(Novoprotein,CK60)、マウス(mouse) OX40-EC(CK52)、アカゲザル(Rhesus) OX40-EC(sinobiological,90846-C08H)、カニクイザル(Cynomolgus) OX40-EC(Novoprotein,CB17)を2μg/mlの濃度でコーティングし、4度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
2)プレート内の液体を廃棄し、プレートをPBST(PBS with 0.05% Tween 20)で2回洗浄し、200μlの1% BSA(PBSで調製)を加え、室温で2時間ブロッキングした。
3)精製された抗ヒトOX40抗体および陰性対照抗体Ctrl hIgGを適切に希釈し(3.16μg/ml)、それぞれ100μlを取り、上記ブロックウェルに入れ(PBSで3回洗浄し、液体を廃棄)、室温で1時間インキュベートした。
4)プレートをPBSTで4回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトIgG Fc HRP(1:50000,Bethyl,A80-104p)を100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。
5)プレートをPBSTで5回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにHRP基質であるTMB(A液とB液を等体積で混合、KPL)を100μl加え、10-30分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでOD650のシグナル値を読み取った。
図8に示されるように、抗ヒトOX40組換え抗体は、ヒトおよびサルOX40タンパク質に特異的に結合する能力を有するが、一般にマウスOX40には結合しない。
実施例14、OX40/NF-κBレポーター細胞による抗ヒトOX40抗体のインビトロ活性の検出
1)OX40/NF-κB Reporter-HEK293は、ヒトOX40たんぱく質を構成的に発現し、活性化されるとNF-κBシグナル経路を活性化する一方、NF-κB応答要素はホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する。つまり、ホタルルシフェラーゼの活性を検出することによってOX40の活性化を間接的に指示することができる。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が8*10^5になるように、90μlのOX40/NF-κB Reporter-HEK293細胞を96ウェル透明底白色細胞培養フラットボトムプレートに加え、37℃のインキュベーターに入れ、一晩インキュベートした。
2)human FCGRTgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製:無菌条件下でhuman FCGRTgマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlの細胞培養培地(DMEM+10% FBS+1%非必須アミノ酸+1 mMピルビン酸ナトリウム+1% Pen/Strep)で再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、1:100に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
3)抗体の希釈:細胞培養培地(DMEM+10% FBS+1%非必須アミノ酸+1mMピルビン酸ナトリウム+1% Pen/Strep)で抗ヒトOX40抗体、Ctrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)およびヒトOX40-L-mFc(Novoprotein、CW25)を0.1μg/mlに希釈した。
4)50μlのOX40/NF-κB Reporter-HEK293細胞上清を捨て、20μlのhuman FCGRTgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液(2*10^7/ml)および30μlの上記抗体溶液をウェルの壁に沿って加え、37℃のインキュベーターで6時間インキュベートした。
5)100μlのOne-step Luciferase reagent(Promega E6120)を各ウェルに加え、室温で30分間振盪し、化学発光検出計で発光強度を検出した。
図10に示すように、抗ヒトOX40抗体はインビトロ活性を持っている(OX40/NF-κBレポーター細胞系)。
1)OX40/NF-κB Reporter-HEK293は、ヒトOX40たんぱく質を構成的に発現し、活性化されるとNF-κBシグナル経路を活性化する一方、NF-κB応答要素はホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する。つまり、ホタルルシフェラーゼの活性を検出することによってOX40の活性化を間接的に指示することができる。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が8*10^5になるように、90μlのOX40/NF-κB Reporter-HEK293細胞を96ウェル透明底白色細胞培養フラットボトムプレートに加え、37℃のインキュベーターに入れ、一晩インキュベートした。
2)human FCGRTgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製:無菌条件下でhuman FCGRTgマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlの細胞培養培地(DMEM+10% FBS+1%非必須アミノ酸+1 mMピルビン酸ナトリウム+1% Pen/Strep)で再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、1:100に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
3)抗体の希釈:細胞培養培地(DMEM+10% FBS+1%非必須アミノ酸+1mMピルビン酸ナトリウム+1% Pen/Strep)で抗ヒトOX40抗体、Ctrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)およびヒトOX40-L-mFc(Novoprotein、CW25)を0.1μg/mlに希釈した。
4)50μlのOX40/NF-κB Reporter-HEK293細胞上清を捨て、20μlのhuman FCGRTgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液(2*10^7/ml)および30μlの上記抗体溶液をウェルの壁に沿って加え、37℃のインキュベーターで6時間インキュベートした。
5)100μlのOne-step Luciferase reagent(Promega E6120)を各ウェルに加え、室温で30分間振盪し、化学発光検出計で発光強度を検出した。
図10に示すように、抗ヒトOX40抗体はインビトロ活性を持っている(OX40/NF-κBレポーター細胞系)。
実施例15、抗ヒトOX40抗体のインビトロ免疫活性化活性分析
1)hFCGRTghOX40Tgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製:無菌条件下でhFCGRTghOX40Tgマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlのPBSで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、1:100に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
2)CFSE標識脾臓細胞:実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が(2-4)*10^7/ml、体積が5ml未満になるようにPBSで希釈し、CFSEを加え、最終濃度を5μMにした。混合後、37℃のインキュベーターに入れ、15分間インキュベートした。次いで、細胞を9mlの5%FBSを含有する洗浄液で2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。2mlの初代細胞培養培地(RPMI + 10% FBS + 1% Pen/Strep + 1% HEPES + 1%ピルビン酸ナトリウム + 0.1% 2Me(最終濃度50uM)+ 1% L-グルタミン+ 1%非必須アミノ酸))を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
3)対照(未処理、CFSEのみ、CD3のみ、CD3+CD28)を除き、0.2μg/mlの抗マウスCD3e(クローン:145-2C11,BD Pharmingen(商標))を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のCFSE標識細胞を再懸濁し細胞密度を2*10^6/mlにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が2*10^5になるように、100μlの上記細胞を96ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはCFSEで標識していない細胞を加え、抗マウスCD3などの抗体を加えなかった。CFSEのみ群にCFSE標識細胞を加え、抗マウスCD3などの抗体を加えなかった。CD3群のみにCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、他の抗体は加えなかった。CD3+CD28群にCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、2μg/mlの濃度の抗マウスCD28抗体(クローン37.51(RUO),BD Pharmingen(商標))も加えた(ステップ4で等体積希釈した後、抗マウスCD3およびCD28の最終濃度はそれぞれ0.1μg/mlおよび1μg/mlであった)。
4)異なる濃度の抗体を調製:初代培養培地で抗ヒトOX40抗体およびCtrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)を最終濃度の2倍に希釈し、それぞれ100μl取り、上記抗マウスCD3抗体とCFSE標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ100μlの培養液を加えた。
5)上記細胞を37℃のインキュベーターで3日間培養した。
6)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:上記培養細胞をU底の96ウェルプレートに移し、PBSで2回回洗浄し、500gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE抗マウスCD4(クローン:GK1.5,1:500,BD)およびAPC抗マウスCD8a(クローン:53-6.7,1:500,BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml、Invitrogen)とCountBright(商標) Absolute Counting Beads(Life Technologies,2μl/サンプル)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図11A-Dに示すように、抗ヒトOX40抗体はインビトロ免疫活性化活性を持っている
実施例16、抗ヒトOX40抗体のインビボ免疫活性化活性分析
OVA特異的CD8+T細胞増殖モデルを使用してで、抗ヒトOX40組換え抗体のインビボ免疫活性化活性を検出した。具体的な手順は、以下のとおりである。
1)day-1にhFCGRTghOX40TgマウスにOT-IhOX40Tgマウス由来の脾臓細胞を尾静脈から注射した(いずれも1*10^6/匹)。
2)day0に、5μg/匹のDEC-OVAタンパク質、一定用量の抗ヒトOX40抗体およびCtrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)を腹腔内注射する方式により、hFCGRTghOX40Tgマウスを免疫化した。各群の状況と抗体用量は以下の通りである:
群1:Ctrl hIgG, 50μg/匹 n=5
群2:PN116*, 50μg/匹 n=3
群3:PN121*, 50μg/匹 n=3
群4:PN125*, 50μg/匹 n=3
3)day6にマウスを犠牲にし、無菌条件下でマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlのPBSで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。
4)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:200μlの上記脾臓細胞をU底の96ウェルプレートに移し、500gでで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE抗マウスCD4(クローン:GK1.5,1:500,BD)およびAPC抗マウスCD8a(クローン:53-6.7,1:500,BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml、Invitrogen)とCountBright(商標) Absolute Counting Beads(Life Technologies,2μl/サンプル)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図12に示すように、抗ヒトOX40抗体はインビボ免疫活性化活性を持っている。
1)hFCGRTghOX40Tgマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製:無菌条件下でhFCGRTghOX40Tgマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlのPBSで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、1:100に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
2)CFSE標識脾臓細胞:実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が(2-4)*10^7/ml、体積が5ml未満になるようにPBSで希釈し、CFSEを加え、最終濃度を5μMにした。混合後、37℃のインキュベーターに入れ、15分間インキュベートした。次いで、細胞を9mlの5%FBSを含有する洗浄液で2回洗浄し、400gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。2mlの初代細胞培養培地(RPMI + 10% FBS + 1% Pen/Strep + 1% HEPES + 1%ピルビン酸ナトリウム + 0.1% 2Me(最終濃度50uM)+ 1% L-グルタミン+ 1%非必須アミノ酸))を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
3)対照(未処理、CFSEのみ、CD3のみ、CD3+CD28)を除き、0.2μg/mlの抗マウスCD3e(クローン:145-2C11,BD Pharmingen(商標))を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のCFSE標識細胞を再懸濁し細胞密度を2*10^6/mlにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が2*10^5になるように、100μlの上記細胞を96ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはCFSEで標識していない細胞を加え、抗マウスCD3などの抗体を加えなかった。CFSEのみ群にCFSE標識細胞を加え、抗マウスCD3などの抗体を加えなかった。CD3群のみにCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、他の抗体は加えなかった。CD3+CD28群にCFSE標識細胞と抗マウスCD3を加え、2μg/mlの濃度の抗マウスCD28抗体(クローン37.51(RUO),BD Pharmingen(商標))も加えた(ステップ4で等体積希釈した後、抗マウスCD3およびCD28の最終濃度はそれぞれ0.1μg/mlおよび1μg/mlであった)。
4)異なる濃度の抗体を調製:初代培養培地で抗ヒトOX40抗体およびCtrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)を最終濃度の2倍に希釈し、それぞれ100μl取り、上記抗マウスCD3抗体とCFSE標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ100μlの培養液を加えた。
5)上記細胞を37℃のインキュベーターで3日間培養した。
6)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:上記培養細胞をU底の96ウェルプレートに移し、PBSで2回回洗浄し、500gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE抗マウスCD4(クローン:GK1.5,1:500,BD)およびAPC抗マウスCD8a(クローン:53-6.7,1:500,BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml、Invitrogen)とCountBright(商標) Absolute Counting Beads(Life Technologies,2μl/サンプル)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図11A-Dに示すように、抗ヒトOX40抗体はインビトロ免疫活性化活性を持っている
実施例16、抗ヒトOX40抗体のインビボ免疫活性化活性分析
OVA特異的CD8+T細胞増殖モデルを使用してで、抗ヒトOX40組換え抗体のインビボ免疫活性化活性を検出した。具体的な手順は、以下のとおりである。
1)day-1にhFCGRTghOX40TgマウスにOT-IhOX40Tgマウス由来の脾臓細胞を尾静脈から注射した(いずれも1*10^6/匹)。
2)day0に、5μg/匹のDEC-OVAタンパク質、一定用量の抗ヒトOX40抗体およびCtrl hIgG(Jackson ImmunoResearch)を腹腔内注射する方式により、hFCGRTghOX40Tgマウスを免疫化した。各群の状況と抗体用量は以下の通りである:
群1:Ctrl hIgG, 50μg/匹 n=5
群2:PN116*, 50μg/匹 n=3
群3:PN121*, 50μg/匹 n=3
群4:PN125*, 50μg/匹 n=3
3)day6にマウスを犠牲にし、無菌条件下でマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で5mlの赤血球溶解液ACKで5分間溶解し、9mlのPBSを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、400gで5min遠心し、脾臓細胞を2mlのPBSで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。
4)フローサイトメトリーによるT細胞増殖の検出:200μlの上記脾臓細胞をU底の96ウェルプレートに移し、500gでで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をPE抗マウスCD4(クローン:GK1.5,1:500,BD)およびAPC抗マウスCD8a(クローン:53-6.7,1:500,BioLegend)を含む50μlのFACS緩衝液(0.5% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)に再懸濁し、氷上で暗所で15分間インキュベートし、それからPBS緩衝液で細胞を2回洗浄し、DAPI(0.5μg/ml、Invitrogen)とCountBright(商標) Absolute Counting Beads(Life Technologies,2μl/サンプル)を含む200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図12に示すように、抗ヒトOX40抗体はインビボ免疫活性化活性を持っている。
Claims (10)
- 配列番号1に示されるHCDR1、配列番号2に示されるHCDR2、及び配列番号3に示されるHCDR3を含み、及び/又は配列番号4に示されるLCDR1、配列番号5に示されるLCDR2及び配列番号6に示されるLCDR3を含むことを特徴とする、抗OX40抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は、配列番号7-38のいずれか1つに示されるHCDR1、配列番号39-65のいずれか1つに示されるHCDR2、及び配列番号66-114のいずれか1つに示されるHCDR3を含み、及び/又は配列番号115-145のいずれか1つに示されるLCDR1、配列番号146-159のいずれか1つに示されるLCDR2、及び配列番号160-199のいずれか1つに示されるLCDR3を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は表1の群a1~群a7の何れか1群に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3、および/または表2の群b1~群b7の何れか1群に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むことを特徴とする。
- 請求項1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体は表3の群c1~群c71の何れか1群に示されるHCDR及びLCDRを含むことを特徴とする。
- 請求項1~4の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体VHの各FR領域は配列番号200-270に示されるVHのいずれか1つのVHのFR領域であり、VLの各FR領域は配列番号271-341に示されるVLのいずれか1つのVLのFR領域であり;より好ましくは、前記抗OX40抗体VHおよびVLの各FR領域は表4から選ばれるいずれか1つの抗体のVHおよびVLのFR領域であることを特徴とする。
- 請求項1に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列は配列番号200-270の何れか1つに示され、および/またはVLのアミノ酸配列は配列番号271-341のいずれか1つに示され、好ましくは、前記抗OX40抗体のVHのアミノ酸配列およびVLのアミノ酸配列は表4から選ばれるいずれか1つの抗体番号に示されることを特徴とする。
- 請求項1~6の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片において、前記抗OX40抗体はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である、ことを特徴とする。
- 請求項1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤又はベクターと、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
- 核酸分子または当該核酸分子を含む担体であって、
(1)請求項1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
(2)(1)に記載されるポリヌクレオチド配列の相補配列、から選ばれる。 - 請求項1~7の何れか1項に記載の抗OX40抗体又はその抗原結合断片の、T細胞関連疾患を治療するためのものの製造における応用において、好ましくは、前記T細胞関連疾患はT細胞に関連する腫瘍又はOX40媒介性疾患であり、より好ましくは、前記OX40媒介性疾患はOX40媒介性アレルギー、喘息、COPD、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
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