CN104169304A

CN104169304A - 作为pcsk9抑制剂的单域抗体

Info

Publication number: CN104169304A
Application number: CN201280070110.4A
Authority: CN
Inventors: N·G·赛义达; J·张
Original assignee: A Dalata Partnership Co Ltd; National Research Council of Canada
Current assignee: A Dalata Partnership Co Ltd; National Research Council of Canada; Adaerata LP
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-11-26
Also published as: EP2794661A1; WO2013091103A1; JP6170940B2; EP2794661B1; US20150017183A1; JP2015503905A; EP2794661A4; CA2859226C; US9879093B2; CA2859226A1; HK1204477A1

Abstract

本发明描述了结合于PCSK9的抗体(例如sdAb)。描述了编码此类Ab的核酸、表达此类Ab的宿主细胞以及包含前述者的药物组合物。还描述了这些结合PCSK9的Ab用于降低低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)水平和用于治疗心血管病症的用途。

Description

作为PCSK9抑制剂的单域抗体

相关申请的交叉引用

本申请是于2012年12月20日提交并且根据PCT条款21(2)以英文公布的PCT申请号PCT/CA2012/*，其本身要求于2011年12月20日提交的美国临时申请序列号61/578,000的权益。以上所有文件以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及心血管病症，并且更具体地说涉及降低低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的循环水平。

关于序列表

根据37C.F.R.1.821(c)，与此同时以2012年12月19日创建并且大小为92Kb(千字节)的名为12810_458_ST25.TXT的ASCII兼容文本文件提交序列表。上述文件的内容以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

在全世界范围内，由心血管病症引起的并发症是引起死亡的主要原因，与归因于各种形式的癌症的约6百万/年相比影响着约1300万个体/年。最强力的心血管危险因子之一是LDL-C水平升高。预期心血管病变的发生率在接下来的二十年里将显著增加。临床试验数据已证实LDL胆固醇水平降低与冠心病事件的比率有关(Law等，2003BMJ326:1423-1427)。血浆LDL胆固醇水平适度的持久性降低已显示基本上与冠心病事件发生率显著降低有关联(Cohen等,N.Engl.J.Med.354:1264-1272)，甚至在非脂质相关心血管危险因子高发群体中也是如此。因此，从管理式控制LDL胆固醇水平中获得极大益处。在重要的降胆固醇药物之中有他汀类(Briel,M.,Nordmann,A.J.以及Bucher,H.C.Curr.Opin.Lipidol.,16:601-605,2005)。虽然被大部分患者很好地耐受，但不良副作用仍正在收集中(https://www.statineffects.com/info/)。他汀类与依替米贝(ezetimibe)(一种肠内固醇转运体阻断剂)的组合使LDL-C进一步降低≤20％。

因此，需要开发有效的策略来用于降低循环LDL-C水平(Brown,M.S.和Goldstein,J.L.Science,311:1721-1723,2006；Tall,A.R.N.Engl.J Med.,354:1310-1312,2006)。

本说明书提到了许多文献，其内容以全文引用的方式并入本文中。

发明概述

在第一方面中，本发明提供一种特异性结合于人类PCSK9的抗体，所述抗体包含：

(i)互补决定区(CDR)1区，其包含式I氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO:1)(I)

其中

X1是D、N、H、V、A、I或S；

X2是Y、P或A；

X3是I、A、T、V或Y；

X4是L、V、T或M；并且

X5是G、S或A；

或与其基本上同一的序列；

(ii)CDR2区，其包含式II氨基酸序列：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Y-Z17-Z18-Z19-Z20-Z21-G(SEQ ID NO:2)(II)

其中

Z1是A、Q、T、G或S；

Z2是I、V或A；

Z3是R、T、A或S；

Z4是G、E、S、Q、A或D；

Z5是S、P、V、R、H或G；

Z6是G、A或D；

Z7是A、S、D、G或T；

Z8是I、V或不存在；

Z9是R、T或不存在；

Z10是G、A或不存在；

Z11是R、D或不存在；

Z12是E、V或不存在；

Z13是G、E或不存在；

Z14是S、R、F或不存在；

Z15是T、I或S；

Z16是F、Y、E、D、P、A或N；

Z17是V、A、S、E或T；

Z18是D、H、N、E、R或V；

Z19是S、N或F；

Z20是V或A；并且

Z21是K或R；或与其基本上同一的序列；和/或

(iii)CDR3区，其包含式III氨基酸序列：

B1-B2-B3-B4-B5-B6-B7-B8-B9-B10-B11-B12-B13-B14-B14-B15-B16-B17-B18(SEQ ID NO:3)(III)

其中

B1是D、T、A、P、R或Y；

B2是R、Q、K、T、L、Y、P、A或S；

B3是F、Y、S、R、A、G或M；

B4是P、G、Y、S、F或不存在；

B5是T、N、S、Y或不存在；

B6是P、Y、T、I、G、R或不存在；

B7是E、N、R、D、T或不存在；

B8是F、Y、L、I、V或不存在；

B9是S、T、M、P、Y或不存在；

B10是T、G、D、H或S；

B11是Q、P、T、A、R、H、V或E；

B12是V、D、L、H、S、F或T；

B13是G、P、L、H、R、S或M，在一个具体实施方案中，B13是G、P、L、R、S或M，

B14是K、N、E、W、V或不存在；

B15是H、K、E、T、G、N或S；

B16是Y、S或Q；

B17是D、H、V、E、A或不存在；并且

B18是Y、L、H、V或不存在；

或与其基本上同一的序列；

在另一个实施方案中，以上所提到的CDR1区包含以下氨基酸序列中的一者：DYILG(SEQ ID NO:4)、NYIVG(SEQ ID NO:5)、HYILG(SEQ ID NO:6)、VYAMG(SEQ ID NO:7)、DYAMG(SEQ ID NO:8)、NYAMG(SEQ ID NO:9)、AYAMG(SEQ ID NO:10)、IAYMA(SEQ IDNO:11)、SPTMA(SEQ ID NO:12)、HYIVG(SEQ ID NO:13)、HYVTS(SEQ ID NO:14)或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR2区包含以下氨基酸序列中的一者：AIRGSGAIRGREGSTFYVDSVKG(SEQ ID NO:15)、AIRGSGAIRGREGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:16)、AIRESGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:17)、AITSPGDSIPYAHSVKG(SEQ ID NO:18)、AITSSGDSIPYAHSVKG(SEQ ID NO:19)、AAAQSGDSSAYARSVKG(SEQ ID NO:20)、QISQVDGFTYYEDSVKG(SEQ ID NO:21)、TIRDSDASIYYTDSVKG(SEQ ID NO:22)、SISSGGTTNYAVFAKG(SEQ ID NO:23)、AIRSRD DSTYYSNSVKG(SEQID NO:24)、AIRESGSRTYYADSVRG(SEQ ID NO:25)、AVRESGSSTEYAENVKG(SEQ ID NO:26)、AVREPGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:27)、GVTAHAGVTADVESTDYSDSVKG(SEQ ID NO:28)，或与其基本上同一的序列。在一个实施方案中，以上所提到的CDR3区包含以下氨基酸序列中的一者：DRFPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:29)、DRFPTPEFTTQVGHYDV(SEQ ID NO:30)、DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:31)、TKSGNYNYMGPDPKKYHY(SEQ ID NO:32)、TTSGTYNYMGPDPKEYVY(SEQ ID NO:33)、TTRGSYEYMGPDPKKYEY(SEQ ID NO:34)、ALAFPTTSSNTYAY(SEQ ID NO:35)、RQYYSGRVYSTFREEYDY(SEQ IDNO:36)、YAMSTETMVSQDY(SEQ ID NO:37)、TYSGTYNYMGADPKEYVY(SEQ ID NO:38)、DPRTIDLSSRLLWGS(SEQ ID NO:39)、DQYPTTEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:40)、DRFPTPEFSDRVGHYDL(SEQ ID NO:41)、DPYPTPEFTTHVGHYDY(SEQ ID NO:42)、PSGFYRTIPHVHSNYDH(SEQ ID NO:43)或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：DYILG(SEQ ID NO:4)、AIRGSGAIRGREGSTFYVDSVKG(SEQ ID NO:15)以及DRFPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:29)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：NYIVG(SEQ ID NO:5)、AIRGSGAIRGREGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:16)以及DRFPTPEFTTQVGHYDV(SEQ ID NO:30)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：DYILG(SEQ ID NO:4)、AIRESGSSTYYADSVKG(SEQ IDNO:17)以及DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:31)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AIRESGSSTYYADSVKG(SEQ IDNO:17)以及DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:31)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：VYAMG(SEQ ID NO:7)、AITSPGDSIPYAHSVKG(SEQ IDNO:18)以及TKSGNYNYMGPDPKKYHY(SEQ ID NO:32)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：VYAMG(SEQ ID NO:7)、AITSSGDSIPYAHSVKG(SEQ IDNO:19)以及TTSGTYNYMGPDPKEYVY(SEQ ID NO:33)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：DYAMG(SEQ ID NO:8)、AAAQSGDSSAYARSVKG(SEQID NO:20)以及TTRGSYEYMGPDPKKYEY(SEQ ID NO:34)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：NYAMG(SEQ ID NO:9)、QISQVDGFTYYEDSVKG(SEQID NO:21)以及ALAFPTTSSNTYAY(SEQ ID NO:35)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：AYAMG(SEQ ID NO:10)、TIRDSDASIYYTDSVKG(SEQID NO:22)以及RQYYSGRVYSTFREEYDY(SEQ ID NO:36)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：IAYMA(SEQ ID NO:11)、SISSGGTTNYAVFAKG(SEQ IDNO:23)以及YAMSTETMVSQDY(SEQ ID NO:37)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：NYAMG(SEQ ID NO:9)、QISQVDGFTYYEDSVKG(SEQID NO:21)以及TYSGTYNYMGADPKEYVY(SEQ ID NO:38)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：SPTMA(SEQ ID NO:12)、AIRSRDDSTYYSNSVKG(SEQID NO:24)以及DPRTIDLSSRLLWGS(SEQ ID NO:39)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AIRESGSRTYYADSVRG(SEQ IDNO:25)以及DQYPTTEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:40)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYIVG(SEQ ID NO:13)、AVRESGSSTEYAENVKG(SEQID NO:26)以及DRFPTPEFSDRVGHYDL(SEQ ID NO:41)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AIRESGSRTYYADSVRG(SEQ IDNO:25)以及DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:31)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含:HYILG(SEQ ID NO:6)、AVREPGSSTYYADSVKG(SEQ IDNO:27)以及DPYPTPEFTTHVGHYDY(SEQ ID NO:42)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含:HYVTS(SEQ ID NO:14)、GVTAHAGVTADVESTDYSDSVKG(SEQ ID NO:28)以及PSGFYRTIPHVHSNYDH(SEQ ID NO:43)，或与其基本上同一的序列。

在另一个实施方案中，以上所提到的抗体进一步包含构架区(FR)1，所述构架区(FR)1包含式IV氨基酸序列：

Q-V-X6-L-X7-E-S-G-G-G-X8-V-Q-A-G-X9-S-X10-R-L-S-C-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18(SEQ ID NO:44)(IV)

其中

X6是K或Q；

X7是E或V；

X8是L或P；

X9是G或D

X10是L或M；

X11是V、L、S或A；

X12是A或P；

X13是S或P；

X14是G、D或R；

X15是R、L或S；

X16是T、F、I或G；

X17是I、V、P或F；并且

X18是N、R、S或V

或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，X6是K；X7是E；X8是L；X9是G；X10是L；X11是A；X12是A；X13是S；X14是G；X15是R；X16是T；X17是F；并且/或者X18是N.

在另一个实施方案中，以上所提到的FR1包含以下氨基酸序列中的一者：

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTIN(SEQ ID NO：45)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASDRTVN(SEQ ID NO：46)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：47)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS(SEQ ID NO：48)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS(SEQ ID NO：49)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFN(SEQ ID NO：50)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFS(SEQ ID NO：51)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCSPSDRTFS(SEQ ID NO：52)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAAPRSGVV(SEQ ID NO：53)，

QVKLEESGGGPVQAGGSLRLSCLASGRFVN(SEQ ID NO：54)，

QVQLVESGGGLVQAGGSMRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：55)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：56)，

QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRIFN(SEQ ID NO：57)，

或与其基本上同一的序列。

在另一个实施方案中，以上所提到的抗体进一步包含FR2，所述FR2包含式V氨基酸序列：

X19-X20-R-Q-X21-P-X22-X23-X24-X25-X26-X27-V-X28(SEQID NO:58)(V)

其中

X19是W或Y；

X20是F或Y；

X21是A或V；

X22是G、D或E；

X23是K、T、R、A、E或Q；

X24是K、E、Q或L；

X25是R或P；

X26是E或K；

X27是F或L；并且

X28是A、T或G，

或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，X19是W；X20是F；X21是A；X22是G；X23是K；X24是E；X25是R；X26是E；X27是F；并且/或者X28是A。

在一个实施方案中，以上所提到的FR2包含以下氨基酸序列中的一者：

WFRQAPGKKREFVA(SEQ ID NO：59)，

YFRQAPGKEREFVA(SEQ ID NO：60)，

WFRQAPGKQREFVA(SEQ ID NO：61)，

WFRQAPGKEREFVA(SEQ|ID NO：62)，WFRQAPGKEREFVT(SEQ ID NO：63)，

WFRQAPGTEREFVG(SEQ ID NO：64)，

WFRQVPGREREFVA(SEQ ID NO：65)，

WYRQAPEKQRELVA(SEQ ID NO：66)，

WFRQAPGAEREFVG(SEQ ID NO：67)，

WFRQAPGEERKFVA(SEQ ID NO：68)，

WFRQAPGKLPEFVA(SEQ ID NO：69)，

WFRQAPDQEREFVA(SEQ ID NO：70)，

或与其基本上同一的序列。

在另一个实施方案中，以上所提到的抗体进一步包含FR3，所述FR3包含式VI氨基酸序列：

R-X29-X30-X31-S-X32-X33-X34-X35-K-X36-X37-X38-X39-L-X40-M-X41-S-L-X42-P-X43-D-X44-A-X45-Y-X46-C-X47-X48(SEQ IDNO：71)(VI)

其中

X29是Y、F或D；

X30是T、S或V；

X31是I或V；

X32是K、R、A或L；

X33是D或N；

X34是N、G、H或Y；

X35是A、T、V或S；

X36是N或S；

X37是T或A；

X38是V、I、L、A或G；

X39是Y、D或F；

X40是Q或R；

X41是N、D或S；

X42是K、I或Q；

X43是E或D；

X44是S或T；

X45是T、V或A；

X46是Y或I；

X47是A或N；并且

X48是A、V、L或G，

或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，X29是F；X30是T；X31是I；X32是R；X33是D；X34是N；X35是A；X36是N；X37是T；X38是V；X39是Y；X40是Q；X41是N；X42是K；X43是E；X44是T；X45是V；X46是Y；X47是A；并且/或者X48是A。

在一个实施方案中，以上所提到的FR3包含以下氨基酸序列中的一者：RYTISKDNAKNTVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ IDNO：72)，

RFSISKDNAKNTIYLQMNSLKPEDSAVYYCAL(SEQ ID NO：73)，

RYTISRNNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：74)，

RYTISRDNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：75)，

RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：76)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：77)，

RFTISRDGAKNTAYLQMDSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：78)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：79)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLIPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：80)，

RFTISADNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYICNA(SEQ ID NO：81)，

RFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：82)，

RFTISLDNAKNTAYLRMDSLQPEDTAVYYCAG(SEQ ID NO：83)，

RDTISRDNTKNAGDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：84)，

RFVISKDNVKSTVFLQMNSLKPEDSAVYYCAL(SEQ ID NO：85)，

RDTISKDHTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：86)，

RFTVSRDYSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA(SEQ ID NO：87)，

或与其基本上同一的序列。

在另一个实施方案中，以上所提到的抗体进一步包含FR4，所述FR4包含式VII氨基酸序列：

X49-G-X50-G-T-X51-V-T-X52-S-S(SEQ ID NO：88)(VII)

其中

X49是W或S；

X50是R或Q；

X51是Q或E；并且

X52是V或I，

或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，X49是W；X50是Q；X51是Q；并且/或者X52是V，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的FR4包含以下氨基酸序列中的一者：WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:89)、WGRGTQVTVSS(SEQID NO:90)、SGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:91)、WGQGTEVTISS(SEQ ID NO:92)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的抗体包含以下氨基酸序列中的一者或由其组成：

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTINDYILGWFRQAPGKKREFVAAIRGSGAIRGREGSTFYVDSVKGRYTISKDNAKNTVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDRFPTPEFSTQVGHYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：93)；

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASDRTVNNYIVGYFRQAPGKEREFVAAIRGSGAIRGREGSTYYADSVKGRFSISKDNAKNTIYLQMNSLKPEDSAVYYCALDRFPTPEFTTQVGHYDVWGRGTQVTVSS(SEQ ID N0：94)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTINDYILGWFRQAPGKKREFVAAIRESGSSTYYADSVKGRYTISRNNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDQYPTPEFSTQVGHYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：95)；

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPRHYILGWFRQAPGKQREFVAAIRESGSSTYYADSVKGRYTISRDNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDQYPTPEFSTQVGHYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：96)；

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSVYAMGWFRQAPGKEREFVAAlTSPGDSIPYAHSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAAYYCAATKSGNYNYMGPDPKKYHYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：97)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSVYAMGWFRQAPGKEREFVTAITSSGDSIPYAHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYYCAATTSGTYNYMGPDPKEYVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：98)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNDYAMGWFRQAPGKEREFVAAAAQSGDSSAYARSVKGRF刊SRDGAKNTAYLQMDSLKPEDTAAYYCAATTRGSYEYMGPDPKKYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：99)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSNYAMGWFRQAPGTEREFVGQlSQVDGFTYYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAALAFPTTSSNTYAYSGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：100)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCSPSDRTFSAYAMGWFRQVPGREREFVATIRDSDASIYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLIPDDTAVYYCAARQYYSGRVYSTFREEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：101)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAAPRSGVVIAYMAWYRQAPEKQRELVASISSGGTTNYAVFAKGRFTISADNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYICNAYAMSTETMVSQDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：102)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSNYAMGWFRQAPGAEREFVGQISQVDGFTYYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPDDTAVYYCAATYSGTYNYMGADPKEYVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：103)；

QVKLEESGGGPVQAGGSLRLSCLASGRFVNSPTMAWFRQAPGEERKFVAAIRSRDDSTYYSNSVKGRFTISLDNAKNTAYLRMDSLQPEDTAVYYCAGDPRTIDLSSRLLWGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：104)；

QVQLVESGGGLVQAGGSMRLSCAASGRTPRHYILGWFRQAPGKQREFVAAIRESGSRTYYADSVRGRDTISRDNTKNAGDLQMNSLKPEDSATYYCAVDQYPTTEFSTQVGHYDYWGQGTEVTISS(SEQ ID NO：105)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPRHYIVGWFRQAPGKEREFVAAVRESGSSTEYAENVKGRFVISKDNVKSTVFLQMNSLKPEDSAVYYCALDRFPTPEFSDRVGHYDLWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：106)；

QVQLVESGGGLVQAGGSMRLSCAASGRTPRHYILGWFRQAPGKQREFVAAIRESGSRTYYADSVRGRYTISRDNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDQYPTPEFSTQVGHYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：107)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPRHYILGWFRQAPGKLPEFVAAVREPGSSTYYADSVKGRDTISKDHTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDPYPTPEFTTHVGHYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：108)；

QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRIFNHYVTSWFRQAPDQEREFVAGVTAHAGVTADVESTDYSDSVKGRFTVSRDYSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAPSGFYRTIPHVHSNYDHWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：109)；

或与其基本上同一的序列。举例来说，包含与上文所列序列(例如序列93到109)中的一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗体与该序列基本上同一。在另一个实施方案中，所述基本上同一的氨基酸序列与上文所列序列中的一者具有至少80.95％同一性，在其它实施方案中，具有至少81％、82％、83％、83.46％、84％、85％、86％、87％、87.30％、88％、89％、90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

在一个实施方案中，以上所提到的抗体是单域抗体。

在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含以上所提到的抗体。在另一个方面中，该药物组合物进一步包含至少另一种以上所提到的抗体。

在另一个实施方案中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

在另一个方面中，本发明提供以上所提到的抗体或组合物，其用作药剂。

在另一个方面中，本发明提供以上所提到的抗体或组合物，其用于制造药剂。在一个实施方案中，以上所提到的药剂是用于预防或治疗受试者的高胆固醇血症。

在另一个方面中，本发明提供一种预防或治疗高胆固醇血症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的以上所提到的抗体或组合物。

在另一个方面中，本发明提供以上所提到的抗体或组合物作为药剂的用途。

在另一个方面中，本发明提供以上所提到的抗体或组合物用于预防或治疗受试者的高胆固醇血症的用途。

在另一个方面中，本发明提供以上所提到的抗体或组合物用于制造用以预防或治疗受试者的高胆固醇血症的药剂的用途。

在另一个方面中，本发明提供一种核酸，其包含编码以上所提到的抗体的核苷酸序列。

在另一个方面中，本发明提供一种载体，其包含以上所提到的核酸。

在另一个方面中，本发明提供一种细胞，其包含以上所提到的核酸或载体。

在另一个方面中，本发明提供一种用于预防或治疗受试者的高胆固醇血症的试剂盒，其包含以上所提到的抗体中的至少两者。

在另一个方面中，本发明提供一种用于检测生物样品中的PCSK9的试剂盒，其包含以上所提到的抗体的至少两者。

在参考随附图式阅读以下仅以实例方式给出的对本发明的特定实施方案的非限制性描述之后，本发明的其它目标、优势和特征将变得更加显而易见。

附图简述

在随附图式中：

图1显示[A]由前段(prosegment)(氨基酸31到152)和催化亚单位(氨基酸153到692)形成的人类PCSK9异二聚体复合物的杆状病毒表达和纯化。[B]如通过ELISA所示并且用在450nm下所保留蛋白质的光密度(OD₄₅₀)估计的用抗原免疫的美洲驼对人类纯化PCSK9的免疫反应。使用5μg/ml PCSK9涂布ELISA板。[C]如通过ELISA所示的在不同免疫重复之后美洲驼对人类PCSK9的差别性免疫反应。使用约1μg/ml PCSK9涂布ELISA板；

图2显示[A]本发明的代表性单域抗体(sdAb)嵌合构建体的氨基酸比对，这些嵌合构建体即PKE2(SEQ ID NO:110)；PKF8(SEQ IDNO:111)；PKF1(SEQ ID NO:112)；PKG1(SEQ ID NO:113)；P1.70(SEQ ID NO:114)；PKE1(SEQ ID NO:115)；P2.57(SEQ ID NO:116)；P2.55(SEQ ID NO:117)；P1.40(SEQ ID NO:118)；以及PKE9(SEQ IDNO:119)。前30个残基对应于人类PCSK9的信号肽序列。V5标签是粗体的并且加下划线。最后6个残基对应于六组氨酸标签；在P2.55和P2.57中六组氨酸标签前面是10个氨基酸的c-Myc标签和一个连接子残基。[B]本发明的其它代表性单域抗体嵌合构建体的氨基酸序列，即P2.20(SEQ ID NO:120)；PKC2(SEQ ID NO:121)；PKG1-2(SEQ ID NO:122)；PKA6(SEQ ID NO:123)；PKA11(SEQ ID NO:124)；PKC1(SEQ ID NO:125)；以及PKD8(SEQ ID NO:126)；

图3显示对应于各图中所示的单域抗体的序列的比对：[A]图2A，即PKE2(SEQ ID NO:127)；PKF8(SEQ ID NO:128)；PKF1(SEQ IDNO:129)；PKG1(SEQ ID NO:130)；P1.70(SEQ ID NO:131)；PKE1(SEQ ID NO:132)；P2.57(SEQ ID NO:133)；P2.55(SEQ ID NO:134)；P1.40(SEQ ID NO:135)；PKE9(SEQ ID NO:136)；[B]图2B，即P2.20(SEQ ID NO:137)；PKC2(SEQ ID NO:138)；PKG1-2(SEQ ID NO:139)；PKA6(SEQ ID NO:140)；PKA11(SEQ ID NO:141)；PKC1(SEQID NO:142)；以及PKD8(SEQ ID NO:143)；或[C][A]和[B]中所示的所有序列，并且指示出对应于互补决定区(CDR)和构架区(FR)的区域。[D]展示sdAB片段(即含有CDR和FR区)的子群的三个比对和相应序列同一性百分比，这些子群即1)PKG1-2(SEQ ID NO:105)、PKA11(SEQ ID NO:107)、PKG1(SEQ ID NO:96)、PKF1(SEQ ID NO:95)以及PKC1(SEQ ID NO:108)；2)P1.70(SEQ ID NO:97)、PKE1(SEQID NO:98)以及P2.57(SEQ ID NO:99)；以及3)PKG1-2(SEQ ID NO:105)、PKA11(SEQ ID NO:107)、PKG1(SEQ ID NO:96)以及PKF1(SEQ ID NO:95)；以及[E]展示使用Blast^TM基本局部比对搜索工具计算的17个sdAB片段(即所有CDR和FR区)中的每一对的序列同一性百分比。17个表格中的每个表格展示一个特定sdAB片段的序列与16个其它sdAB片段的序列的比较；

图4显示从图3A所示的10个sdAb的蛋白质序列比对中得出的系统发育分析结果；

图5显示本文中标识为“PKE2”的序列(SEQ ID NO:93)的Kabat编号，使用Abnum抗体氨基酸编号工具得知；

图6[A]和[B]显示如通过西方墨点法评估的在用各种单域抗体孵育后的HepG2细胞中的LDLR表达；

图7显示如通过西方墨点法评估的在用单域抗体孵育后的HuH7细胞中的LDLR表达；

图8绘示根据图6和图7的西方墨点分析得出的最有效抗体，展示为[A]柱状图；以及[B]LDLR表达倍数；

图9显示sdAb对野生型(WT)PCSK9诱导的LDLR降解的影响。在不存在(对照组)或存在100μg/mL各种PCSK9sdAb的情况下，将原初HuH7细胞用1ug/mL纯化WT PCSK9孵育24h。接着，将细胞分离并且通过流式细胞术分析细胞表面LDLR(LDLR阳性细胞％)；

图10显示sdAb对WT PCSK9诱导的LDLR降解的影响。在不存在(对照组)或存在50μg/mL各种PCSK9sdAb的情况下，将原初HuH7细胞用1μg/mL纯化WT PCSK9孵育24h。接着，将细胞分离并且如下进行分析：[A]通过流式细胞术分析细胞表面LDLR(LDLR阳性细胞％)；[B]通过西方墨点法分析与β-肌动蛋白对照组相比较的总LDLR。数字表示LDLR水平与β-肌动蛋白对照组相比的比率；或[C]通过流式细胞术分析细胞表面LDLR(LDLR表达水平(任意单位))。在[D]中，在不存在[对照组(-)]或存在单独的[对照组(+)]或与50ug/ml(约3uM)如所指示的各种纯化美洲驼sdAb混合的0.7ug/ml(约9nM)WT PCSK9蛋白的情况下，将原初HuH7细胞孵育18h。使用WT PCSK9蛋白作为瞬时转染Huh7细胞的条件培养基并且通过ELISA定量。在添加到Huh7细胞中之前，将混合物在37℃下预孵育2h。使用抗人LDLR抗体和用alexa 647标记的适合的第二抗体通过FACS测量细胞表面的LDLR水平。细胞表面LDLR是相对于对照组(-)进行报导。PCSK9活性抑制百分比是以[sdAb-对照组(+)]/[对照组(-)-对照组(+)]×100计算；

图11显示sdAb对功能获得性PCSK9-D374Y诱导的LDLR降解的影响。[A]在不存在[对照组(-)]或存在单独的[对照组(+)]或与50ug/ml(约3uM)如所指示的各种纯化美洲驼sdAb混合的0.5ug/ml(约6nM)PCSK9-D374Y蛋白的情况下孵育原初Huh7细胞18h。数据表示以一式两份进行的三次独立实验的平均值；以及[B]在不存在[对照组(-)]或存在单独的[对照组(+)]或与递增浓度的如所指示的PKE2、P1.40或PKF8sdAb混合的0.5ug/ml(约6nM)PCSK9-D374Y蛋白的情况下孵育原初Huh7细胞18h。数据表示以一式两份进行的两次独立实验的平均值。在添加到细胞中之前，将混合物在37℃下预孵育2h。使用抗人LDLR抗体和用alexa647标记的适合的第二抗体通过FACS测量细胞表面的LDLR水平。细胞表面LDLR是相对于对照组(-)进行报导。PCSK9活性抑制百分比是以[sdAb-对照组(+)]/[对照组(-)-对照组(+)]×100计算。使用功能获得性PCSK9蛋白作为瞬时转染HEK293细胞的条件培养基并且通过ELISA定量；

图12显示[A]使用PKF8和P1.40sdAb的功能获得性PCSK9-D374Y蛋白下拉(pull-down)实验。60ul含有单独30ng(0.5ug/ml)PCSK9-D374Y(作为HEK293细胞的条件培养基)或还加上3.5ug(50ug/ml)纯化sdAb(6His)的混合物在37℃下预孵育2h，随后在4℃下在6.6ug抗His Ab琼脂糖小球下免疫沉淀过夜。对上清液和从小球上洗脱的材料进行PAGE-SDS(6％)并且使用抗hPCSK9Ab进行西方墨点分析。通过使用ImageJ^TM程序对检测到的条带进行定量来估计下拉PCSK9-D374Y的百分比；以及[B]所用方法的示意图；

图13显示sdAb对HuH7细胞表面的LDLR的影响。在不存在(阴性对照组)或存在单独的(阳性对照组)或与50ug/ml(约3uM)如所指示的各种纯化美洲驼sdAb混合的0.5ug/ml(约6nM)PCSK9-D374Y蛋白的情况下孵育细胞18h。使用PCSK9-D374Y蛋白作为瞬时转染HEK293细胞的条件培养基并且通过ELISA定量。在添加到细胞中之前，将混合物在37℃下预孵育2h。通过免疫荧光分析透性化或非透性化HuH7细胞。细胞核用DAPI(蓝色标记)染色，LDLR用抗LDLRAb(绿色标记)染色；

图14显示如用Dil-LDL吸收分析所测量的sdAb对PCSK9-D374Y功能获得性突变诱导的LDLR降解的影响。在不存在[对照组(-)]或存在0.5μg/mL纯化PCSK9突变体D374Y[对照组(+)]的情况下，将原初HepG2细胞孵育4h。如下指示添加50μg/mL各种sdAb(PKE1到P2-57)；以及

图15显示PCSK9的体内抑制。在展现“人源化”LDLc型态(LDLc×2-3)并且通过使具有WT和Ldlr^-/-背景的小鼠杂交而产生的杂合子Ldlr^+/-小鼠中测试所选抑制剂。这些小鼠表达正常水平的小鼠PCSK9(Pcsk9^+/+)，不表达PCSK9(Pcsk9^-/-)并且/或者由其自身人类启动子(TgDY)表达编码人类PCSK9-D374Y的转基因的一个或五个拷贝。还测试了PCSK9的人类WT形式。

发明详述

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-可馨类型9(PCSK9)(也称为神经凋亡调节转化酶1(NARC-1))是一种人类中具692个氨基酸的蛋白酶K-Hke枯草杆菌酶(NP_777596.2)，并且包含信号肽(1-30)继之以前段(残基31-152)、催化结构域(残基153-454)以及C端富含Cys-His结构域(CHRD；残基455-692)。PCSK9表达于诸如以下的能够增殖和分化的细胞中：肝细胞、肾间充质细胞、肠道回肠、结肠上皮和胚胎脑端脑神经元(Seidah等,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:928-933)。

在ER中移位之后，PCSK9的前段在VFAQ₁₅₂↓SIP位点自身催化裂解。在PC中，前段(pro)是一种分子内伴侣/抑制剂，其通常细胞内移除以产生具充分活性的蛋白酶。与其它PC不同，PCSK9是以稳定非共价复合物[pro≡PCSK9]形式分泌。因此，由PCSK9诱导的LDLR降解的增强不需要成熟PCSK9形式的催化活性。在人类和小鼠血浆中，可检测到全长PCSK9(153-692)和截短形式PCSK9-ΔN218(219-692)。对LDLR不具活性的后者可能由Furin和/或PC5产生，因为它们在RFHR218↓处离体裂解PCSK9。

在本文所公开的研究中，本发明人已产生针对人类PCSK9的单域抗体并且证实这些抗体抑制HuH7肝癌和HepG2细胞系中PCSK9诱导的LDLR降解。

因此，在第一方面中，本发明提供一种特异性结合于人类PCSK9的抗体，所述抗体包含：

(i)互补决定区(CDR)1区，其包含式I氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO:1)(I)

其中

X1是D、N、H、V、A、I或S；

X2是Y、P或A；

X3是I、A、T、V或Y；

X4是L、V、T或M；并且

X5是G、S或A；

或与其基本上同一的序列；

(ii)CDR2区，其包含式II氨基酸序列：

其中

Z1是A、Q、T、G或S；

Z2是I、V或A；

Z3是R、T、A或S；

Z4是G、E、S、Q、A或D；

Z5是S、P、V、R、H或G；

Z6是G、A或D；

Z7是A、S、D、G或T；

Z8是I、V或不存在；

Z9是R、T或不存在；

Z10是G、A或不存在；

Z11是R、D或不存在；

Z12是E、V或不存在；

Z13是G、E或不存在；

Z14是S、R、F或不存在；

Z15是T、I或S；

Z16是F、Y、E、D、P、A或N；

Z17是V、A、S、E或T；

Z18是D、H、N、E、R或V；

Z19是S、N或F；

Z20是V或A；并且

Z21是K或R；或与其基本上同一的序列；和/或

(iii)CDR3区，其包含式III氨基酸序列：

其中

B1是D、T、A、P、R或Y；

B2是R、Q、K、T、L、Y、P、A或S；

B3是F、Y、S、R、A、G或M；

B4是P、G、Y、S、F或不存在；

B5是T、N、S、Y或不存在；

B6是P、Y、T、I、G、R或不存在；

B7是E、N、R、D、T或不存在；

B8是F、Y、L、I、V或不存在；

B9是S、T、M、P、Y或不存在；

B10是T、G、D、H或S；

B11是Q、P、T、A、R、H、V或E；

B12是V、D、L、H、S、F或T；

B13是G、P、L、H、R、S或M，在一个具体实施方案中，B13是G、P、L、R、S或M；

B14是K、N、E、W、V或不存在；

B15是H、K、E、T、G、N或S；

B16是Y、S或Q；

B17是D、H、V、E、A或不存在；并且

B18是Y、L、H、V或不存在；

或与其基本上同一的序列；

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：VYAMG(SEQ ID NO:7)、AITS PGDSIPYAHSVKG(SEQID NO:18)以及TKSGNYNYMGPDPKKYHY(SEQ ID NO:32)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AVREPGSSTYYADSVKG(SEQ IDNO:27)以及DPYPTPEFTTHVGHYDY(SEQ ID NO:42)，或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYVTS(SEQ ID NO:14)、GVTAHAGVTADVESTDYSDSVKG(SEQ ID NO:28)以及PSGFYRTIPHVHSNYDH(SEQ ID NO:43)，或与其基本上同一的序列。

Q-V-X6-L-X7-E-S-G-G-G-X8-V-Q-A-G-X9-S-X10-R-L-S-C-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18

(SEQ ID NO:44)(IV)

其中

X6是K或Q；

X7是E或V；

X8是L或P；

X9是G或D

X10是L或M；

X11是V、L、S或A；

X12是A或P；

X13是S或P；

X14是G、D或R；

X15是R、L或S；

X16是T、F、I或G；

X17是I、V、P或F；并且

X18是N、R、S或V；

或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，X6是K；X7是E；X8是L；X9是G；X10是L；X11是A；X12是A；X13是S；X14是G；X15是R；X16是T；X17是F；并且/或者X18是N。

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTIN(SEQ ID NO：45)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASDRTVN(SEQ ID NO：46)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：47)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS(SEQ ID NO：48)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS(SEQ ID NO：49)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFN(SEQ ID NO：50)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFS(SEQ ID NO：51)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCSPSDRTFS(SEQ ID NO：52)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAAPRSGVV(SEQ ID NO：53)，

QVKLEESGGGPVQAGGSLRLSCLASGRFVN(SEQ ID NO：54)，

QVQLVESGGGLVQAGGSMRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：55)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：56)，

QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRIFN(SEQ ID NO：57),

或与其基本上同一的序列。

X19-X20-R-Q-X21-P-X22-X23-X24-X25-X26-X27-V-X28(SEQID NO:58)(V)

其中

X19是W或Y；

X20是F或Y；

X21是A或V；

X22是G、D或E；

X23是K、T、R、A、E或Q；

X24是K、E、Q或L；

X25是R或P；

X26是E或K；

X27是F或L；并且

X28是A、T或G，

或与其基本上同一的序列。

WFRQAPGKKREFVA(SEQ ID NO：59)，

YFRQAPGKEREFVA(SEQ ID NO：60)，

WFRQAPGKQREFVA(SEQ ID NO：61)，

WFRQAPGKEREFVA(SEQ ID NO：62)，

WFRQAPGKEREFVT(SEQ ID NO：63)，

WFRQAPGTEREFVG(SEQ ID NO：64)，

WFRQVPGREREFVA(SEQ ID NO：65)，

WYRQAPEKQRELVA(SEQ ID NO：66)，

WFRQAPGAEREFVG(SEQ ID NO：67)，

WFRQAPGEERKFVA(SEQ ID NO：68)，

WFRQAPGKLPEFVA(SEQ ID NO：69)，

WFRQAPDQEREFVA(SEQ ID NO：70)，

或与其基本上同一的序列。

R-X29-X30-X31-S-X32-X33-X34-X35-K-X36-X37-X38-X39-L-X40-M-X41-S-L-X42-P-X43-D-X44-A-X45-Y-X46-C-X47-X48(SEQ IDNO:71)(VI)

其中

X29是Y、F或D；

X30是T、S或V；

X31是I或V；

X32是K、R、A或L；

X33是D或N；

X34是N、G、H或Y；

X35是A、T、V或S；

X36是N或S；

X37是T或A；

X38是V、I、L、A或G；

X39是Y、D或F；

X40是Q或R；

X41是N、D或S；

X42是K、I或Q；

X43是E或D；

X44是S或T；

X45是T、V或A；

X46是Y或I；

X47是A或N；并且

X48是A、V、L或G，

或与其基本上同一的序列。

RFSISKDNAKNTIYLQMNSLKPEDSAVYYCAL(SEQ ID NO：73)，

RYTISRNNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：74)，

RYTISRDNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：75)，

RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：76)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：77)，

RFTISRDGAKNTAYLQMDSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：78)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：79)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLIPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：80)，

RFTISADNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYICNA(SEQ ID NO：81)，

RFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：82)，

RFTISLDNAKNTAYLRMDSLQPEDTAVYYCAG(SEQ ID NO：83)，

RDTISRDNTKNAGDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：84)，

RFVISKDNVKSTVFLQMNSLKPEDSAVYYCAL(SEQ ID NO：85)，

RDTISKDHTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：86)，

RFTVSRDYSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA(SEQ ID NO：87)，

或与其基本上同一的序列。

X49-G-X50-G-T-X51-V-T-X52-S-S(SEQ ID NO：88)(VII)

其中

X49是W或S；

X50是R或Q；

X51是Q或E；并且

X52是V或I，

或与其基本上同一的序列。

在一个实施方案中，以上所提到的FR4包含以下氨基酸序列中的一者：WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：89)、WGRGTQVTVSS(SEQID NO：90)、SGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：91)、WGQGTEVTISS(SEQ ID NO：92)，或与其基本上同一的序列。

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASDRTVNNYIVGYFRQAPGKEREFVAAIRGSGAIRGREGSTYYADSVKGRFSISKDNAKNTIYLQMNSLKPEDSAVYYCALDRFPTPEFTTQVGHYDVWGRGTQVTVSS(SEQ ID NO：94)；

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSVYAMGWFRQAPGKEREFVAAITSPGDSIPYAHSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAAYYCAATKSGNYNYMGPDPKKYHYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：97)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNDYAMGWFRQAPGKEREFVAAAAQSGDSSAYARSVKGRFTISRDGAKNTAYLQMDSLKPEDTAAYYCAATTRGSYEYMGPDPKKYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：99)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSNYAMGWFRQAPGTEREFVGQISQVDGFTYYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAALAFPTTSSNTYAYSGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：100)；

或与其基本上同一的序列。

如本文所提到的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)、其单链以及单域抗体。常规抗体典型地至少包含通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2以及C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有称为构架区(FR)的更保守区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。大体上参见FundamentalImmunology第7章(Paul,W.,编著,第2版.Raven Press,N.Y.(1989))。

如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地称为“抗体部分”)是指抗体中保留特异性结合于抗原(例如PCSK9)的能力的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L以及C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种包含在绞链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)F_d片段，其由V_H和C_H1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成，(v)dAb片段(Ward等,Nature341:544-546(1989))，其由V_H结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H是由独立的基因编码，但是它们可使用重组方法通过使它们能够被制成单一蛋白链的合成接头相连，所述单一蛋白链中V_L和V_H区配对而形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段可使用任何适用技术获得，包括本领域技术人员已知的常规技术，并且可以与完整抗体相同的方式对片段的效用进行筛检。

在一个实施方案中，以上所提到的抗体是单域抗体。如本文所用的单域抗体(sdAb)是指互补决定区(CDR)是单域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体(天然缺失轻链的抗体)、衍生自常规4-链抗体的单域抗体、工程改造型抗体以及不同于衍生自抗体的那些的单域骨架。单域抗体可以是本领域中的任一种或任何将来的单域抗体。单域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼、羊驼、原驼、山羊、兔、牛。根据本发明的一个方面，如本文所用的单域抗体是称为缺失轻链的重链抗体的天然存在的单域抗体。出于清楚性的原因，此衍生自天然缺失轻链的重链抗体的可变域在本文中称为V_HH或纳米体，以将它与四链免疫球蛋白的常规V_H区别开。这种V_HH分子或sdAb可衍生自骆驼科物种中(例如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼以及原驼中)所产生的抗体。除骆驼科之外的其它物种可产生天然缺失轻链的重链抗体；此类V_HH在本发明范围内。它们也已在鲨鱼中观察到并且称为V_NAR，并且可基于人类重链序列进行工程改造。如本文所用，sdAb包括通过噬菌体展示或其它展示技术直接分离自任何来源的VH、V_HH或V_NAR储库的sdAb以及通过利用人源化、亲和力成熟、稳定化和其它抗体工程改造方式进一步修饰此类sdAb而产生的sdAb。所述术语还包括同系物、衍生物或能够充当单域抗体结构域并且展现生物活性(例如结合于PCSK9)的片段。

如本文进一步所描述，可认为(然而不限于此)sdAb的氨基酸序列和结构包含四个构架区或“FR”，其在本领域中和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；以及“构架区4”或“FR4”；这些构架区穿插有三个互补决定区或“CDR”，其在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；以及“互补决定区3”或“CDR3”。单域抗体中氨基酸残基的总数目可以是约110-140或约110-130。然而，应注意，单域抗体的部分、片段或类似物关于其长度和/或大小不受特别限制，只要此类部分、片段或类似物满足本文所概述的其它要求，并且还优选地适合用于本文所描述的目的即可。

如对Riechmann和Muyldermans的文章(Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods1999年12月10日；231(1-2):25-38；参见例如所述参考文献的图2)中骆驼的V_HH结构域所应用，根据由Kabat等给出的V_H结构域的一般编号法("Sequence of proteins of immunological interest",US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,出版号91)对单域抗体的氨基酸残基进行编号。根据此编号，单域抗体的FR1包含约位置1-30处的氨基酸残基，CDR1包含约位置31-35处的氨基酸残基，FR2包含约位置36-49处的氨基酸，CDR2包含约位置50-65处的氨基酸残基，FR3包含约位置66-94处的氨基酸残基，CDR3包含约位置95-102处的氨基酸残基并且FR4包含约位置103-113处的氨基酸残基。应注意，如本领域中对于V_H结构域和V_HH结构域所熟知，CDR中的每一者中的氨基酸残基的总数目可能不同并且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数目(即在实际序列中根据kabat编号的一个或多个位置可能不被占据，或实际序列可能含有比通过kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常根据kabat的编号可能或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。然而，通常，可以说，根据Kabat编号并且不管CDR中氨基酸残基的数目，根据kabat编号的位置1对应于FR1的起点，根据kabat编号的位置36对应于FR2的起点，根据kabat编号的位置66对应于FR3的起点，并且根据kabat编号的位置103对应于FR4的起点。用于使用Kabat编号方案编号给定抗体序列的软件和在线工具(例如Abnum，http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/)是可获得的(参见Abhinandan,K.R.和Martin,A.C.R.(2008)Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains Molecular Immunology,45,3832-3839)。在本文中使用Abnum抗体氨基酸编号工具标识为“PKE2”的序列的Kabat编号示于图5中。

基本上同一的序列可包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域中已知参考序列的一个或多个保守氨基酸突变可产生与参考序列相比在生理、化学或功能性质方面基本上没有变化的突变肽；在这种情况下，参考序列和突变序列将被视为“基本上同一的”多肽。保守氨基酸突变可包括氨基酸的添加、缺失或取代；保守氨基酸取代在本文中定义为用一个氨基酸残基取代具有类似化学性质(例如尺寸、电荷或极性)的另一个氨基酸残基。

在一个非限制性实例中，保守突变可以是氨基酸取代。这种保守氨基酸取代可用一个碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸取代同一组中的另一者。术语“碱性氨基酸”意指侧链pK值大于7的亲水性氨基酸，在生理pH值下其典型地带正电荷。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)以及赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)意指侧链在生理pH值下不带电荷但其至少一个键中由两个原子共有的电子对由原子中的一者更紧密地固持的亲水性氨基酸。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)以及谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)意在包括根据Eisenberg(1984)的规范化共有疏水性标度展现大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(He或I)、苯基丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)以及甘氨酸(Gly或G)。“酸性氨基酸”是指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸，其典型地在生理pH值下带负电荷。酸性氨基酸包括谷氨酸盐(Glu或E)和天冬氨酸盐(Asp或D)。

使用序列同一性来评估两个序列的相似性；它是通过计算在比对两个序列在残基位置之间的最大对应性时相同的残基的百分比来确定。可使用任何已知方法来计算序列同一性；例如计算机软件可用于计算序列同一性。在不希望具限制性的情况下，可通过诸如NCBIBLAST2、BLAST-P、BLAST-N、COBALT或FASTA-N等软件或本领域中已知的任何其它适当的软件/工具来计算序列同一性(JohnsonM,等(2008)Nucleic Acids Res.36:W5-W9；Papadopoulos JS andAgarwala R(2007)Bioinformatics 23:1073-79)。

本发明的基本上同一的序列可以是至少75％同一；在另一个实例中，基本上同一的序列可以在氨基酸水平上与本文所描述的序列至少80、85、90、95、96、97、98或99％同一。基本上同一的序列基本上保持参考序列的活性和特异性。

本发明的sdAb还可以包含其它序列以帮助表达、检测或纯化重组抗体或其片段。举例来说并且不希望具限制性，抗体或其片段可包含目标或信号序列(例如但不限于ompA或PCSK9)、检测和/或纯化标签(例如但不限于c-Myc、His-标签或V5标签)或其组合。

本发明的sdAb还可以呈多价展示。可通过本领域中已知的任何适合的方法来实现多聚化。举例来说并且不希望以任何方式具限制性，如PCT公布号WO 2003/046560中所描述，可使用自组装分子来实现多聚化(Zhang,J.等J Mol.Biol 341,161-169(2004)；Zhang,J.等,JMol Biol 335,49-56(2004))。所描述的方法通过表达包含抗体或其片段和五聚结构域的融合蛋白来产生五聚体抗体，所述融合蛋白组装成五聚体，通过所述五聚体实现抗体或其片段的多价展示。五聚体的各亚单位可以相同或不同。本发明还涵盖其它形式的多价展示。举例来说并且不希望具限制性，抗体或其片段可以二聚体、三聚体或任何其它适合的低聚物形式呈现。此可通过本领域中已知的例如以下方法来实现：直接键联连接(Nielsen等Cancer research 60,6434-6440(2000))、c-jun/Fos相互作用(de Kruif,J.和Logtenberg,T.J Biol Chem 271,7630-7634(1996))或“杵-臼”相互作用(Ridgway等Protein Eng 9,617-621(1996))。

本发明的sdAb还可以与特定部分缀合或融合，以例如增加其稳定性/半衰期和/或促进其靶向特定细胞、器官和/或组织和/或促进细胞进入。在一个实施方案中，单域抗体与抗体的Fc区融合，在另一个实施方案中，与人类lgG4-Fc区融合。

在一个实施方案中，以上所提到的sdAb阻断或干扰PCSK9与LDLR的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域之间的相互作用。在一个实施方案中，以上所提到的sdAb是针对PCSK9的催化结构域，在另一个实施方案中，针对PCSK9中对应于残基153-156和/或367-381的区域。

在一个实施方案中，以上所提到的单域抗体的离解常数(K_D)为1×10^－7或更小，或更小，在其它实施方案中，以上所提到的单域抗体的离解常数(K_D)为1×10^－8M、1×10^－9M、1×10^－10M、1×10^－11M或1×10^－12M或更小。

sdAb的功能表征

本发明的sdAb的功能特征可在体外和体内进行测试。举例来说，可测试结合PCSK9的sdAb抑制PCSK9与LDLR的相互作用、触发sdAb进入细胞的能力，还可以通过对针对LDLR的PCSK9依赖性效应(例如LDLR介导的LDL-C吸收)的抑制、对PCSK9蛋白水解活性的抑制、对PCSK9依赖性LDLR降解的抑制以及降低体内LDL-C来测量。PCSK9与LDLR的结合可通过表面等离子体共振(SPR)(使用)通过将LDLR固定到固体载体上并且检测可溶性PCSK9与LDLR的结合来检测。作为另外一种选择，可固定PCSK9，并且检测LDLR结合。还可以通过ELISA(例如通过检测PCSK9与所固定的LDLR的结合)、通过荧光共振能量转移(FRET)或噬菌体展示来分析PCSK-9/LDLR结合。为了进行FRET，可检测带荧光团标记的PCSK9与LDLR在溶液中的结合(参见例如美国专利号5,631,169)。已通过共免疫沉淀来检测PCSK9与LDL-R的结合(Lagace等,2006J.Clin.Inv.116(11):2995-3005)。为以此方式检验PCSK9-LDLR结合，将HepG2细胞在耗尽固醇的培养基中培养18小时。在0.1mM氯喹存在下将纯化PCSK9添加到培养基中并且将细胞孵育一小时。将细胞溶解在温和洗涤剂(1％洋地黄皂苷，w/v)中。从细胞溶解产物中免疫沉淀析出PCSK9或LDLR，通过SDS-PAGE分离，并且形成免疫印迹以分别检测共免疫沉淀的LDLR或PCSK9的存在(Lagace等,2006,同上)。

这些分析可使用以较高亲合力结合于LDLR的PCSK9的突变形式(例如hPCSK9D374Y，Lagace等,2006,同上)进行。肝细胞表达细胞表面的LDLR。将纯化PCSK9添加到所培养的肝细胞(例如HepG2细胞、ATCC HB-8065、HuH7细胞、原代人类或小鼠肝细胞)中以剂量和时间依赖性方式使LDLR表达降低(Lagace等,2006同上)。可测试结合PCSK9的sdAb增加肝细胞中的LDLR水平的能力。举例来说，将HepG2细胞在耗尽固醇的培养基(补充有100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和1g/l葡萄糖、5％(v/v)新生小牛脂蛋白缺乏性血清(NCLPDS)、10μΜ康百汀钠(sodium compactin)以及50μΜ甲羟戊酸钠的DMEM)中培养18小时以诱导LDLR表达。将纯化PCSK9(5μg/ml)添加到培养基中。测定添加PCSK9之后第0、0.5、1、2以及4小时所收获的细胞中的LDLR水平(Lagace等,2006,同上)。LDLR水平可通过流式细胞术、FRET、免疫印迹或其它手段来测定。细胞(例如HepG2细胞、HuH7细胞)吸收的LDL-C可如Stephan和Yurachek所描述使用荧光标记LDL-C、Dil-LDL(3,3'-双十八烷基吲哚羰花青-低密度脂蛋白)进行测量(1993,J.Lipid Res.34:325-330)。简言之，将细胞在37℃下在具有Dil-LDL(每毫升20-100μg蛋白质)的培养物中孵育2小时。将细胞洗涤，溶解并且使用分光荧光计测定内化Dil-LDL的浓度。LDL-C吸收可在与PCSK9结合剂接触的细胞中(在Dil-LDL存在于细胞培养物中之前和/或在其期间)进行测量。

过表达肝脏中的人类PCSK9的转基因小鼠相对于非转基因小鼠具有增加的血浆LDL-C水平(Lagace等,2006同上)。还参见Maxwell和Breslow,2004Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:7100，其描述在小鼠中使用腺病毒载体来过表达PCSK9。已产生PCSK9^－/－小鼠(Rashid等,2005Proc.Natl.Acad.Sci.102(5):5374-5379)。这些小鼠可以被基因修饰以表达hPCSK9转基因。可在任何这些模型中或在未被基因修饰的动物中测试结合PCSK9的分子清除或降低总胆固醇和/或LDL-C的能力。

血浆LDL清除动力学可如下测定：向动物注射[¹²⁵I]标记的LDL，在注射后0、5、10、15以及30分钟时获得血液样品，并且测定样品中的[¹²⁵I]-LDL量(Rashid等,2005同上)。相对于野生型小鼠，PCSK9^－/－小鼠中的LDL清除速率增加(Rashid等,2005同上)。施用了结合PCSK9的sdAb的动物中LDL清除率增加表明所述试剂抑制体内PCSK9活性。

响应于用结合PCSK9的sdAb处理的总血浆胆固醇、血浆甘油三酯以及/或LDL-C降低指示结合PCKS9的分子的治疗功效。胆固醇和脂质型态可通过比色、气-液色谱或酶手段使用市售试剂盒来测定。

用于测定PCSK9活性的方法/分析描述如下。

PCSk9依赖性LDLR降解的体外分析。

测试化合物针对人类肝细胞细胞系HepG2或HuH7抑制由PCSK9增强的LDLR降解的能力。所述分析在于在存在或不存在测试化合物的情况下，将已经转染或纯化的野生型(WT)、突变体或嵌合PCSK9直接添加到培养物上清液中。针对4到6种不同剂量一式三份地进行各“剂量-反应”实验。PCSK9活性的抑制由LDLR蛋白表达增加证实并且/或者在细胞表面由以下证实：

·针对总LDLR对细胞溶解产物的西方墨点分析；

·针对LDLR对细胞表面的FACS分析；

·监测LDLR的细胞表面活性的荧光Dil-LDL并入。

Dil-LDL荧光吸收分析在于对经由LDLR内化进行的Dil-LDL细胞并入(细胞表面LDLR活性的量度)进行荧光测量。在存在或不存在不同剂量的测试化合物的情况下，将细胞按96孔样式孵育2h，并且接着添加Dil-LDL再持续2h。PCSK9活性的抑制是通过Dil-LDL荧光增加来检测。

a.WT PCSK9。所述分析在于在存在或不存在测试化合物的情况下，添加野生型(WT)PCSK9作为转染细胞的条件培养基，或将其纯化并且添加到培养物上清液中。针对细胞外添加的PCSK9常规选择的剂量是1ug/ml。

b.突变体PCSK9(功能获得性)。为了进一步表征测试化合物是否可抑制功能获得性突变的功能，将细胞在存在或不存在不同剂量测试化合物的情况下用纯化突变蛋白质孵育。纯化PCSK9突变体是例如PCSK9-D374Y(展现比LDLR高约25倍的亲和力)或S127R(显示增加的PCSK9稳定性)。针对细胞外添加的PCSK9和其功能获得性天然突变体D374Y常规选择的剂量是1μg/ml和0.2μg/ml。类似地使用其它PCSK9突变体。还可以使用从用功能获得性PCSK9突变体转染的细胞收获的培养基进行分析。

c.sdAb。使用直接添加到培养物上清液中或与PCSK9一起预孵育的纯化sdAb(6His)进行分析。还使用从用带V5标记的sdAb的可分泌形式(例如在sdAb的氨基末端含有信号肽的嵌合构建体)转染的细胞收集到的培养基进行这些分析。

d.对分析—嵌合PCSK9的描述。测试使PCSK9与细胞表面血管紧张素转化酶2的跨膜和胞质结构域融合的嵌合蛋白(PCSK9-ACE2)，以便测量测试化合物对PCSK9胞外通路活性的活性。作为另外一种选择，测试使PCSK9与将蛋白质直接运输到内体/溶酶体中的Lamp-1的跨膜和胞质结构域融合的嵌合蛋白(PCSK9-Lamp1)，以便测量测试化合物对PCSK9细胞内通路活性的活性。可获得表达嵌合PCSK9-ACE2或PCSK9-Lamp1的稳定细胞并且在存在或不存在不同剂量测试化合物的情况下进行孵育。

e.对分析—原代人类肝细胞的描述。针对小鼠和人类原代肝细胞测试PCSK9抑制性化合物，以便测量其对细胞表面LDLR的影响。使用小鼠原代肝细胞的优势在于，其也测量化合物分别在表达或缺乏PCSK9的野生型或基因敲除小鼠情形下的特异性。不再内源性(例如在shRNA基因敲低下)表达PCSK9的HepG2和HuH7细胞也用于类似药物特异性目的。

PCSK9加工和分泌的体外分析。

在细胞和培养基中使用PCSK9的生物合成途径和/或西方墨点分析对原PCSK9到PCSK9的加工和分泌进行测试。将化合物与HEK293(稳定表达PCSK9)和HuH7(内源性表达PCSK9)一起进行孵育。关于统计显著性，以一式三份进行各实验。进行化合物的“剂量依赖”反应。

方案

转染细胞的培养基培养物中所含的PCSK9。通过在HEK293细胞或Huh7细胞中过表达来产生人类野生型PCSK9(PCSK9-WT)和功能获得性(PCSK9-D374Y)蛋白。简言之，使HEK 293或Huh7细胞系在具有10％胎牛血清(Invitrogen)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)中生长并且在5％CO2下维持在37℃下。根据制造商的方案，将HEK293细胞用jetPRIME^TM(Polyplustransfection)转染，并且将Huh7细胞用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染。转染后二十四小时，洗涤细胞并且在不含血清的培养基中孵育。24小时后收集含有分泌的人类PCSK9-D374Y或PCSK9-WT蛋白的条件培养基。如先前所描述，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)定量条件培养基中PCSK9蛋白的水平(Dubuc G,Tremblay M,ParéG,JacquesH,Hamelin J,Benjannet S,Boulet L,Genest J,Bernier L,Seidah NG,Davignon J.2010.A new method for measurement of total plasmaPCSK9:clinical applications.J Lipid Res.51:140-149)。

转染细胞的培养基培养物中分泌的sdAb。将含有位于3'末端的六组氨酸(6His)标签或者6His标签和c-Myc标签的sdAb cDNA克隆到plRES2-EGFP主干载体(Clonetech)中。为了确保sdAb从转染细胞分泌，在sdAb序列的氨基末端引入人类PCSK9的信号肽(SP)(图2)。SP后面是V5标签。对照载体plRES2含有信号肽、V5标签和六组氨酸标签顺序。从转染HEK293细胞的培养基培养物收集sdAb。简言之，使HEK 293细胞在具有10％胎牛血清(Invitrogen)的杜尔贝科改良伊格尔培养基中生长并且在5％CO2下维持在37℃下。在80-90％汇合时，根据制造商方案将HEK293细胞用jetPRIME^TM(Polyplustransfection)转染。转染后二十四小时，洗涤细胞并且在不含血清的培养基中孵育。24小时后收集含有sdAb的条件培养基。使用针对V5标签的抗体通过ELISA定量条件培养基中sdAb(V5)的水平。

通过西方墨点法检测。将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3次并且溶解在补充有1ⅹ完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche AppliedScience)的完全RIPA缓冲液(50mM Tris/HCl(pH 8.0)、1％(v/v)Nonidet P40、0.5％脱氧胆酸钠、150mM NaCl以及0.1％(v/v)SDS)中。通过8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并且在已在含有5％脱脂奶粉的TBS-T(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1％Tween-20)中阻断1h的聚偏二氟乙烯(PVDF，Perkin Elmer)膜(GEHealthcare)上进行点墨。接着将膜在具有多克隆hPCSK9抗体(1:2500)和人类LDLR抗体(1:1000，R & D Systems)的1％脱脂奶中孵育3h。使用适当的辣根过氧化酶缀合第二抗体(1:10,000，Sigma)来在增强的化学发光下使用ECL plus试剂盒(GE Healthcare)进行检测。

细胞表面LDLR水平的荧光激活细胞分选(FACS)定量。在存在或不存在所添加的化合物的情况下，将HuH7细胞在37℃下用各种PCSK9构建体孵育1-4h，并且接着用含有0.5％牛血清白蛋白(Sigma)和1g/l葡萄糖的不含钙/镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(溶液A)洗涤3次。接着将细胞在37℃下用500μl1ⅹVersene^TM溶液(Invitrogen)孵育5min并且在5ml溶液A上分层。接着将细胞在1000rpm下离心5min并且再悬浮于1ml含有1:100针对人类LDLR的单克隆LDLR抗体C7(mAb-C7，Santa Cruz Biotechnology)的溶液A中40min。将细胞用5ml溶液A洗涤一次，离心并且在1ml含有1:250驴抗小鼠Alexa Fluor 647(Molecular Probes)的PBS中再悬浮20min。洗涤细胞并且再悬浮于300μl含有0.2％碘化丙锭(PI)的PBS中。接着，使用FACS BD LSR(BD Biosciences)通过FACS针对PI与AlexaFluor 647两者对活细胞(PI阴性)进行分析。人类Huh7细胞中LDLR的免疫荧光.在已放置于24孔细胞培养板中的聚-L-赖氨酸-涂布(50ug/ml)的1.12mm厚圆形显微镜盖玻片(Fisherbrand 12CIR#1)上涂铺Huh7细胞。在DMEM完全培养基中进行接种并且6小时后将培养基换成不含血清的孵育混合物(300ul/孔)。接着将细胞用缺乏或含有单独的或加上50ug/ml(约3uM)纯化美洲驼sdAb的0.5ug/ml(约6nM)的PCSK9蛋白(WT或变体，例如D374Y)的混合物孵育18小时。使用PCSK9作为纯化蛋白或作为从转染细胞收集到的条件培养基。在添加到Huh7细胞中之前，将含有PCSK9和sdAb的混合物在37℃下预孵育2小时。在18小时孵育结束时，将Huh7细胞用PBS洗涤3次并且接着用3.7％多聚甲醛固定10min。对于细胞内染色，用0.7％Triton X-100将细胞透性化5min。再用PBS洗涤3次后，用1％BSA将透性化或非透性化细胞阻断30min，随后在4℃下用第一抗体(含于1％BSA中的1:200山羊多克隆抗hLDLR，R & D Systems)孵育过夜。用PBS最后洗涤3次之后，通过在室温下用Alexa氟标记的第二抗体(绿色标记)孵育1小时来显示抗原-抗体复合物并且将其安放在含有DAPI(蓝色标记)的ProLong Gold抗衰减试剂(Molecular Probes,Invitrogen)中。用共焦显微镜(Zeiss LSM-710)进行免疫荧光分析。

在人类Huh7细胞中通过免疫荧光来测试sdAb内化。用i)含有或不含PCSK9的不同构建体的条件培养基、ii)含有或不含各种V5标记sdAb的条件培养基或iii)PCSK9条件培养基与sdAb(V5)条件培养基两者的混合物孵育Huh7细胞18小时。在非透性化(sdAb的细胞表面定位)或透性化(sdAb的细胞内定位)条件下使用mAb-V5(Invitrogen)(1:200，于1％BSA中在4℃下孵育过夜)通过免疫荧光分析(上文所描述)来显示V5标记的sdAb的存在。

下拉实验。将从单独的或与纯化sdAb(6His)混合的PCSK9转染细胞(例如Huh7、HEK239细胞)收获的培养基在37℃下预孵育2h，随后使用6.6ug抗His Ab-琼脂糖小球在4℃下进行免疫沉淀过夜。对上清液和从小球上洗脱的材料进行PAGE-SDS(6％)并且使用抗hPCSK9Ab进行西方墨点分析。

基于Dil-LDL吸收细胞的PCSK9活性分析。开发用于分析PCSK9针对LDLR的功能活性的细胞培养方法，从而以荧光标记LDL的吸收测量细胞LDLR活性。在RPMI+10％FBS中，将HepG2细胞以20,000个细胞/孔按96孔样式涂铺，并且在第二天将培养基换成具有100nM他汀的RPMI+10％LPDS持续16h。接着将细胞用重组人类PCSK9蛋白在所指示的水平下预孵育2h，随后添加5μg/mLDil-LDL在37℃下再孵育2h。在20℃下通过添加含4％甲醛的10μMHoechst-33342持续20min来使吸收停止。接着用PBS将细胞洗涤两次，并且在激发/发射360/460nm(分色镜＝400nm)下测量Hoeschst的荧光(DNA含量)。在DNA读取之后，将细胞溶解在0.1N NaOH、0.1％SDS中，并且振荡10min，随后在LJL Analyst仪器上进行关于Dil-LDL在530/580nm(分色镜＝561nm)下激发/发射的荧光读取。对于数据分析，使用Dil-LDL/Hoechst 33342的荧光比率来将Dil-LDL吸收值规范化为细胞计数。

PCSK9的转染、生物合成分析、免疫沉淀。使用Effectene^TM(Qiagen)和总共0.5μg的cDNA对3×10⁵个HEK293细胞进行转染。作为另外一种选择，用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)中的总共4μg的cDNA转染5×10⁵个HuH7细胞或6×10⁵个HepG2细胞。转染后两天，洗涤HEK293细胞并且接着用250μCi/ml[35S]Met/Cys(PerkinElmer Life Sciences)孵育不同的时间。将细胞溶解在改良RIPA缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche AppliedScience)中，其后溶解产物和培养基准备用于免疫沉淀。所用抗体是抗V5mAb(Invitrogen，1:500)和专有兔抗PCSK9 31-454(A-03)。免疫沉淀物通过8％Tricine凝胶上的SDS-PAGE来解析并且被自动射线照相。这些实验重复至少三次。在Storm Imager^TM(AmershamBiosciences)上通过使用ImageQuant^TM 5.2版软件进行定量。此灵敏方法是测试化合物是否影响内质网中从原PCSK9到PCSK9的激活以及与前段复合的活性PCSK9从细胞到培养基中的分泌。

将被工程改造以内源性和稳定地表达PCSK9或其天然突变体的细胞用存在于培养基中的化合物和不同PCSK9形式孵育，并且使用敏感性人类PCSK9抗体通过西方墨点法分析细胞溶解产物。

核酸、宿主细胞

本发明还涉及包含编码以上所提到的结合PCSK9的sdAb的核苷酸序列的核酸。核酸可以是密码子最佳化的。核酸可以是DNA或RNA。核酸序列可由熟练技工基于所公开的氨基酸序列来推断。

本发明还涵盖包含以上所提到的核酸的载体(质粒)。载体可以是例如适合用于在特定有机体中表达所述多肽或繁殖编码所述多肽的基因的任何类型。有机体可源于真核或原核生物。载体的具体选择取决于宿主有机体并且是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，载体包含转录调控序列或启动子(与包含编码本发明的结合PCSK9的sdAb的序列的核酸可操作地连接)。当使第一核酸序列与第二核酸序列处于一种功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地连接”。举例来说，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是邻接的并且在有必要连接两个蛋白质编码区域时处于阅读框中。然而，因为例如增强子通常在与启动子相隔数千碱基时起作用并且内含子序列可具有不同长度，所以一些多核苷酸元件可以可操作地连接但不邻接。“转录调控序列”或“转录调控元件”是指DNA序列的通用术语，所述DNA序列诸如起始信号和终止信号、增强子以及启动子、剪接信号、聚腺苷酸化信号等，其诱导或控制与其可操作地连接的蛋白质编码序列的转录。

包含本发明的核酸序列的重组表达载体可引入细胞(例如宿主细胞)中，该细胞可包括能够由所定义的重组表达载体表达蛋白质编码区域的活细胞。因此，本发明还涉及包含如上文所描述的核酸和/或载体的细胞(宿主细胞)。适合的宿主细胞可以是例如适合用于sdAb的表达或编码所述sdAb的基因/核酸的繁殖的源于真核或原核生物(细菌)的任何细胞。真核细胞系可源于哺乳动物、酵母或无脊椎动物。细胞系的具体选择是本领域技术人员已知的。细菌菌株的选择将取决于手头任务并且是本领域技术人员已知的。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。此类术语不仅指特定受试者细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为后续各代中可能归因于突变或环境影响而产生某些修改，所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同，但其仍包括在如本文所用的术语范围内。载体可经由常规转化或转染技术引入细胞中。术语“转化”和“转染”是指用于将外来核酸引入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体转染、电穿孔、显微注射以及病毒介导的转染。适合用于转化或转染宿主细胞的方法例如可见于Sambrook等(同上)、Sambrook和Russell(同上)以及其它实验手册中。用于将核酸引入哺乳动物细胞体内的方法也是已知的，并且可用于将本发明的载体DNA递送给受试者，以用于基因治疗。

可使用本领域中熟知的诸如以下的方法将以上所提到的核酸或载体递送到细胞体内(以诱导单域抗体的表达)：直接注射DNA、受体介导的DNA吸收、病毒介导的转染或非病毒转染以及基于脂质的转染，所有这些均可能涉及使用基因治疗载体。已使用直接注射来将裸DNA引入细胞体内。可使用用于将DNA注射到细胞体内的传递设备(例如“基因枪”)。这种设备可以是市售的(例如来自BioRad)。还可以通过使DNA与偶联于细胞表面受体的配体的阳离子(诸如聚赖氨酸)复合来将裸DNA引入细胞中。DNA-配体复合物与受体结合可通过受体介导的内吞作用而促进DNA的吸收。键联到会破坏内体从而释放材料到细胞质中的腺病毒衣壳的DNA-配体复合物可用于避免该复合物因细胞内溶酶体而降解。

已对缺陷型逆转录病毒用作基因治疗载体进行了充分地表征(关于综述可参见Miller,A.D.(1990)Blood 76:271)。用于产生重组逆转录病毒和用于用此类病毒体外或体内感染细胞的方案可见于CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等(编著)GreenePublishing Associates,(1989),第9.10-9.14章节和其它标准实验手册中。适合的逆转录病毒的实例包括pLJ、pZIP、pWE以及pEM，其是本领域技术人员熟知的。适合的包装病毒系的实例包括psiCrip、psiCre、psi2以及psiAm。逆转录病毒已用于将各种基因体外和/或体内引入许多不同细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞。

关于用作基因治疗载体，可操纵腺病毒的基因组使得其编码并且表达本发明的核酸(例如编码结合PCSK9的sdAb的核酸)，但就其在正常溶解病毒生命周期中复制的能力而言是灭活的。衍生自腺病毒株Ad类型5dl324或其它腺病毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的适合的腺病毒载体是本领域技术人员熟知的。重组腺病毒是有利的，因为它们不要求分裂细胞是有效基因递送媒介物，并且可用于感染多种细胞类型，包括气道上皮、内皮细胞、肝细胞以及肌细胞。

腺相关病毒(AAV)可用作基因治疗载体，用于出于基因治疗目的递送DNA。AAV是一种天然存在的缺陷型病毒，其需要另一种病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)作为辅助病毒来用于有效复制和生产性生命周期。AAV可用于将DNA整合到非分裂细胞中。慢病毒基因治疗载体也可以适合于用于本发明。

本发明还涉及一种产生本发明的结合PCSK9的sdAb的方法，包括在允许sdAb表达的条件下培养以上所提到的宿主细胞，以及从细胞群收集(例如在培养基中)所表达的sdAb。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对所收集的sdAb进行一个或多个富集/纯化步骤。

药物组合物

在另一个方面中，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制的一种本发明的结合PCSK9的sdAb或其组合。

此类组合物可包括一种sdAb或其组合(例如两种或两种以上不同的sdAb)。举例来说，本发明的药物组合物可包含结合于目标抗原上的不同抗原决定基和/或具有互补活性的结合PCSK9的sdAb的组合。

本发明的药物组合物还可以组合疗法(即与其它试剂组合)的形式施用。举例来说，组合疗法可包括与至少一种其它降胆固醇剂组合的结合PCSK9的sdAb。在下文中更详细地描述可用于组合疗法的治疗剂的实例。

如本文所用，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括在生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。载体应适于静脉内、肌肉内、皮下、肠外、经脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。视施用途径而定，活性sdAb可被包覆有一种材料，以保护化合物不受可能使化合物灭活的酸作用和其它自然条件的影响。

本发明的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不合希望的毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等,1977J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些衍生自无毒无机酸以及无毒有机酸的盐，所述无毒无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、亚磷酸等，所述无毒有机酸诸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括那些衍生自碱土金属以及无毒有机胺的盐，所述碱土金属诸如钠、钾、镁、钙等，所述无毒有机胺诸如Ν,Ν'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等。

本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明的药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及其适合的混合物；植物油，诸如橄榄油；以及可注射有机酯，诸如油酸乙酯。可例如通过使用涂层材料(诸如卵磷脂)、在分散体情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防微生物的存在可通过杀菌程序(同上)与通过包括各种抗细菌和抗真菌剂(例如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两者来确保。可能还需要使等张剂(诸如糖、氯化钠等)包括到组合物中。此外，通过包括延迟吸收的药剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)可使得可注射药物形式的吸收延长。

药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌水溶液或分散体以及用于无菌可注射溶液或分散体的即席制备的无菌粉末。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域中已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则涵盖其在本发明的药物组合物中的用途。还可以将补充活性化合物并入组合物中。

治疗性组合物典型地必须是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构的形式。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)和其适合的混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、在分散体情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，可使等张剂(例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)或氯化钠)包括在组合物中。

可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括一种延迟吸收的试剂(单硬脂酸盐和明胶)引起。

无菌可注射溶液按需要可通过将活性化合物(例如结合PCSK9的sdAb)以所需量并入具有一种上文所列举的成分或其组合的适当的溶剂中来制备，随后是杀菌微量过滤。通常，通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末情况下，制备方法是真空干燥并且冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌-滤过的溶液的任何额外所需成分的粉末。

可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分(例如结合PCSK9的sdAb)的量将视所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗作用的组合物的量。通常，在100％之中，此量将在约0.01％到约99％的活性成分、约0.1％到约70％、或约1％到约30％的活性成分与药学上可接受的载体组合的范围内。

调节给药方案以提供最佳所需反应(例如治疗反应)。举例来说，可施用单个大丸剂(bolus)，可随时间推移施用数个分次剂量，或如由治疗情况的急迫性所指示剂量可按比例降低或增加。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用并且获得剂量均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于所要治疗的受试者的物理离散单位；各单位含有预定量的适于与所需药物载体结合产生所需治疗作用的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗作用以及在混配这种活性化合物用于治疗个体敏感性的领域中所固有的局限性决定并且直接地取决于这些因素。

关于结合PCSK9的sdAb的施用，剂量在约0.0001到100mg/kg并且更通常为0.01到5mg/kg(宿主体重)范围内。举例来说，剂量可以是每千克体重0.3mg、每千克体重1mg、每千克体重3mg、每千克体重5mg或每千克体重10mg或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每三到6个月一次。本发明的结合PCSK9的sdAb的给药方案包括通过静脉内施用每千克体重1mg或每千克体重3mg，其中抗体是使用以下给药流程中的一种来给出：每四周六次剂量，接着每三个月；每三周；一次每千克体重3mg，随后每三周每千克体重1mg。

在一些方法中，同时施用具有不同结合亲和力和/或特异性的两种或更多种sdAb，在这种情况下各sdAb的施用剂量属于所指示的范围内。sdAb通常是在多种场合下施用。单次剂量之间的时间间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者的sdAb血液水平所指示，时间间隔还可以是无规律的。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000μg/ml并且在一些方法中约25-300μg/ml的sdAb血浆浓度。

作为另外一种选择，可以持续释放制剂形式施用结合PCSK9的sdAb，在这种情况下需要更不频繁的施用。剂量和频率视患者中sdAb的半衰期而变化。施用的剂量和频率可视治疗是预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，以相对不频繁的时间间隔历时一段长的时间施用相对低的剂量。一些患者在其余下的生命中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔使用相对高的剂量直到疾病的进展减缓或终止或直到患者显示疾病症状部分或完全改善。其后，可对患者施用预防性方案。

本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化，以便获得一个活性成分的量，所述活性成分的量针对特定患者、组合物以及施用模式有效实现所需治疗反应(例如降低血浆LDL/胆固醇水平)而没有对患者具毒性。所选剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所使用的特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物以及/或者材料；所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、总体健康以及现有病史；以及医学领域中熟知的类似因素。

“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效剂量”的本发明的结合PCSK9的sdAb可使得受试者的LDL-C水平降低、至少一种疾病症状的严重性降低(例如血浆LDL-胆固醇降低或LDL-胆固醇相关病症的症状减轻)、无疾病症状期的频率和持续时间增加或受试者因疾病痛苦而造成的损伤或残疾的预防。

本发明的组合物可通过一种或多种施用途径使用本领域中已知的各种方法中的一种或多种来施用。如熟练技工将了解，施用途径和/或模式将视所要结果而变化。本发明的sdAb的施用途径包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、经脊柱或其它肠外施用途径，例如通过注射或灌注。如本文所用的短语“肠外施用”意指除了肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网腹下、脊柱内、硬膜外以及经皮注射和灌注。作为另外一种选择，本发明的结合PCSK9的sdAb可通过诸如以下的非肠外途径施用：局部、表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部施用。

活性化合物可用将保护化合物不快速释放的载体制备，诸如控释制剂，包括插入物、经皮贴片以及微囊封递送系统。可使用可生物降解、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是获得专利的或是本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编著,MarcelDekker,Inc.,New York,1978。治疗性组合物可使用本领域中已知的医疗装置施用。举例来说，在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可使用无针皮下注射装置施用。

在某些实施方案中，可配制本发明的sdAb以确保适当体内分布。举例来说，血脑屏障(BBB)将许多高度亲水性化合物排除在外。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，它们可例如在脂质体中配制。脂质体可包含一个或多个被选择性运输到特异性细胞、组织或器官中的部分，因此增强目标药物递送(参见例如V.V.Ranade,1989J.Clin.Pharmacol.29:685)。在一个实施方案中，本发明的sdAb可被配制成递送到肝脏(即递送到肝细胞)中。

sdAb的用途

已在胆固醇稳态中涉及PCSK9，因为其似乎在胆固醇生物合成或吸收中具有特定作用。在一项饲喂胆固醇的大鼠的研究中，据报导PCSK9以类似于胆固醇生物合成所涉及的其它基因的方式下调(Maxwell等,2003J Lipid Res.44:2109-2119)。已发现他汀以归因于药物的胆固醇降低作用的方式上调PCSK9表达(Dubuc等,2004,Arterioscler Thromb Vase Biol.24:1454-1459)。PCSK9的腺病毒表达使得循环低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)时间依赖性增加(Benjannet等,2004J.Biol.Chem.279:48865-48875)，并且PCSK9基因缺失的小鼠具有增加水平的肝脏LDL受体(LDLR)并且从血浆中清除LDL-C更快速(Rashid等,2005同上)。发现用PCSK9瞬时转染的HepG2细胞的培养基使当转化到未转染HepG2细胞中时细胞表面LDLR的量以及LDL-C的内化降低(Cameron等,2006Human Mol.Genet.15:1551-1558)。另外，添加到HepG2细胞的培养基中的纯化PCSK9以剂量依赖和时间依赖方式使细胞表面LDLR的数目降低(Lagace等，2006，同上)。

基因PCSK9中的许多突变体与常染色体显性高胆固醇血症(ADH)(一种遗传性代谢病症，其特征在于血浆中LDL-C粒子的明显升高，这可引起早产儿心血管衰竭)有关(例如Abifadel等,2003Nat.Genetics 34:154-156；Tirnms等,2004Hum.Genetics 114:349-353；Leren,2004Clin.Genet.65:419-422)。

PCSK9的表达或上调与增加的LDL-C血浆水平有关，并且PCSK9的抑制或其表达的缺乏与低LDL-C血浆水平有关并且与PCSK9的序列变化有关的较低水平的LDL-C带来了针对冠心病的保护作用(Cohen等,2006N.Engl.J.Med.354:1264-1272)。

本文描述的结合PCSK9的sdAb具有体外和体内诊断和治疗功效。举例来说，可向培养物中(例如体外或离体)或有需要的受试者(例如体内)的细胞施用这些分子，以治疗、预防或判断各种与PCSK9活性/功能有关的病症。

结合PCSK9的sdAb尤其适用于治疗胆固醇升高或具有与胆固醇(例如LDL胆固醇)升高有关的病状(包括脂质病症(例如高脂血症、高胆固醇血症、黄瘤病))或处于这种危险中的人类患者。

结合PCSK9的sdAb还可以适用于治疗具有动脉硬化病状(例如动脉粥样硬化)、冠状动脉疾病、心血管疾病、中风、局部缺血、外周血管疾病的人类患者，并且预防性地适用于例如因一个或多个危险因素(例如高血压、抽烟、糖尿病、肥胖或高同型半胱氨酸血症)的存在而处于具有这些病症的危险中的患者。

如本文所用的术语“LDL-胆固醇相关疾病或病症”是指部分因血流中的循环LDL-胆固醇的高水平导致的疾病或病状。不限于此，LDL-胆固醇相关疾病或病症包括高脂血症、高胆固醇血症、黄瘤病以及心血管疾病，诸如动脉硬化病状(例如动脉粥样硬化)、冠状动脉疾病、心血管疾病、中风、局部缺血、外周血管疾病。

当结合PCSK9的sdAb与另一种药剂一起施用时，两者可以任何顺序连续地或同时(在相同组合物中或在不同组合物中)施用。在一些实施方案中，结合PCSK9的sdAb是向还接受使用适用于治疗疾病/病状的第二药剂(例如第二降胆固醇剂)的疗法的受试者施用。降胆固醇剂包括他汀类、胆汁酸螯合剂、烟酸、纤维酸衍生物以及长链α,ω-二羧酸。他汀类通过阻断HMGCoA(在胆固醇生物合成中的一种关键酶)抑制胆固醇合成。胆汁酸螯合剂防止胆汁酸从肠到肝脏的再循环。本发明的可组合施用的活性成分的实例包括但不限于可改善患者的脂质型态的其它化合物，诸如(a)HMG-CoA还原酶抑制剂(例如他汀类，包括洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、罗伐他汀(rosuvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、立伐他汀(rivastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、伊伐他汀(itavastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)和其它他汀类)，(b)胆固醇吸收抑制剂，诸如甾醇酯、β-谷甾醇、甾醇糖苷，诸如替奎安(tiqueside)；以及氮杂环丁酮，诸如依替米贝(ezetimibe)，(c)胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂(例如安塞曲匹(anacetrapib)或达塞曲匹(dalcetrapib))，其现在临床试验中增加HDL并且降低LDL胆固醇，(d)烟酸和相关化合物，诸如烟醇、烟酰胺以及烟酸或其盐，(e)胆汁酸螯合剂(消胆胺(cholestyramine)、考来替泊(colestipol)(例如盐酸考来替泊)、交联右旋糖酐的二烷基氨基烷衍生物、)，(f)酰基CoA:胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂，诸如阿伐米贝(avasimibe)和美林那胺(melinamide)，并且包括选择性ACAT-1和ACAT-2抑制剂以及双抑制剂，(g)PPARy激动剂，诸如吉非罗齐(gemfibrozil)和非诺贝特酸(fenofibric acid)衍生物(贝特)，包括氯苯丁酯(clofibrate)、非诺贝特(fenofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)以及依托贝特(etofibrate)，(h)微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)/ApoB分泌抑制剂，(i)抗氧化维生素，诸如维生素C和E以及β胡萝卜素，(k)拟甲状腺素药，(l)LDL受体诱导剂，(m)血小板凝聚抑制剂，例如糖蛋白llb/llla纤维蛋白原受体拮抗剂和阿司匹林(aspirin)，(n)维生素B12(也称为氰钴胺(cyanocobalamin))，(o)叶酸或其药学上可接受的盐或酯，诸如钠盐和甲基葡糖胺盐，(p)FXR和LXR配体，包括抑制剂与激动剂两者，(q)增强ABCA1基因表达的药剂，以及(r)回肠胆汁酸转运体。

组合治疗方案可以是叠加性的，或其可产生协同结果(例如胆固醇降低程度大于对于两种药剂的组合使用所预期的)。在一些实施方案中，使用结合PCSK9的sdAb和降胆固醇剂(例如他汀、贝特类(fibrates)、依替米贝或其组合)的组合治疗产生协同结果(例如胆固醇协同降低)。在一些受试者中，这可允许降低降胆固醇剂的剂量以实现所需胆固醇水平。结合PCSK9的sdAb可适用于不能耐受使用另一种降胆固醇剂进行治疗或使用另一种降胆固醇剂进行治疗已经产生不适当的结果的受试者(例如在他汀治疗时经历不充足的LDL-C降低的受试者)。

可向胆固醇(例如LDL-胆固醇)升高的受试者(例如总血浆胆固醇水平为200mg/dl或更高的人类受试者、LDL-C水平为160mg/dl或更高的人类受试者)施用本文描述的结合PCSK9的sdAb。

在一个实施方案中，本发明的结合PCSK9的sdAb可用于检测PCSK9的水平。这可例如通过使样品(例如生物样品，诸如血液、血清、血浆或细胞样品)与结合PCSK9的sdAb在允许结合PCSK9的sdAb与PCSK9之间形成复合物的条件下接触来实现。检测并且比较样品与对照样品中分子与PCSK9之间形成的任何复合物。举例来说，可使用本发明的结合PCSK9的sdAb进行本领域中熟知的标准检测方法，诸如ELISA和流式细胞术分析。

因此，在一个方面中，本发明进一步提供用于检测样品中PCSK9(例如hPCSK9)的存在或测量PCSK9(例如PCSK9的活性形式)的量的方法，其包括使样品与本发明的结合PCSK9的sdAb在允许sdAb与PCSK9之间形成复合物的条件下接触。接着检测复合物的形成，其中与对照样品相比，该样品之间的复合物形成的差异指示样品中PCSK9的存在。

包含本发明的sdAb或本发明的组合物和使用说明书的试剂盒也在本发明范围之内。所述试剂盒可进一步含有至少一种其它试剂，或另外一种或多种本发明sdAb。试剂盒典型地包括指示试剂盒内含物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何书面材料或记录资料，或其以其它方式伴随试剂盒。试剂盒可进一步包含一个或多个容器、试剂、施用装置(例如注射器)。

在充分描述了本发明之后，通过以下实施例和权利要求书对其进一步说明，但所述实施例是说明性的，而不意在进一步施加限制性。本领域技术人员仅仅使用常规实验就应认识到或能够确定本文所描述的具体程序的许多等效形式。此类等效形式在本发明和权利要求书范围内。本申请通篇中所引用的所有参考文献(包括已颁布的专利和已公布的专利申请)的内容以引用的方式并入本文中。

实施本发明的模式

通过以下非限制性实施例更详细地说明本发明。

实施例1：重组PCSK9蛋白的产生和纯化

从35L杆状病毒High Five^TM细胞大量产生PCSK9-(His)₆并且对它进行多个纯化步骤，依次包括Ni²⁺亲和力纯化继之以mono-Q^TM阴离子交换以及最后的凝胶过滤色谱法。从各制剂在非还原性条件下在MES缓冲液SDS-PAGE中以4-12％梯度分离的18μg总蛋白的考马斯蓝染色(Coomassie blue staining)结果显示于图1A中。分子大小标记(M)的位置；纯化之前High Five^TM上清液(S)中的总蛋白；通过Ni²⁺亲和色谱法(Ni)、SOURCE^TM 15Q阴离子交换(Q)以及Superdex^TM 200凝胶过滤(GF)进行纯化。M：标记12(25μl)；S，上清液(10μl)；Ni,Ni-NTA池(18μg)；Q，SOURCE Q池(18μg)；GF，批次7的凝胶过滤池(18μg)，GFB：批次7B的凝胶过滤池(18μg)，GFCP，批次7CP的凝胶过滤池(18μg)。

实施例2：用纯化PCSK9蛋白使美洲驼免疫

从免疫噬菌体展示文库分离是最容易的产生高亲和力sdAb的方式。这涉及用抗原使美洲驼免疫；监测免疫反应；构建噬菌体展示文库；以及后续的噬菌体展示淘选。通过若干次注射由前段(氨基酸31到152)和催化亚单位(氨基酸153到692)形成的人类纯化PCSK9异二聚体复合物来用于使美洲驼免疫。监测免疫反应并且使用针对PCSK9的反应性进行表征。图1B和1C显示美洲驼的免疫反应。虽然在[B]中，在4次和8次免疫之后美洲驼的免疫反应是明显的，但在[C]中，结果表明当使用较低浓度的抗原(PCSK9)时4次和8次免疫的确有所不同—这指示在8周免疫之后可存在极高亲和力的Ab。在用总共1mg纯人类PCSK9使美洲驼免疫之后，在4次免疫中分别从动物收集到2×10⁸个淋巴细胞，并且将其用作文库构建的初始物质。从分离自淋巴细胞的RNA合成cDNA。

实施例3：筛选对PSCK9具特异性的V_HH结构域(sdAb)

使用对骆驼IgG的V_H/V_HH与绞链区两者均具特异性的引物对编码V_H以及V_HH的DNA进行扩增。将V_HH片段基于其尺寸与V_H分离。使用对V_HH具特异性的引物扩增V_HH基因并且将其克隆到基于噬菌粒的噬菌体展示载体中。更具体地说，使用三种不同有义引物(称为J'并且对应于IgG的5'末端)(包括MJ1(GCCCAGCCGGCCATGGCCSMKGTGCAGCTGGTGGAKTCTGGGGGA(SEQ ID NO:144))、MJ2(CAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGA(SEQ ID NO:145))以及MJ3(GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTCAGGTACAGCTGGTGGAGTCT(SEQ ID NO:146)))和两种对应于CH2结构域DNA序列的反义引物(CH2(CGCCATCAAGGTACCAGTTGA(SEQ ID NO:147))和CH2b3(GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA(SEQ ID NO:148))来扩增常规IgG的VH-CH1-绞链-CH2区或V_HH-绞链-CH2。将由引物组合J'-CH2扩增的约600bp的V_HH产物从1％琼脂糖凝胶中提取出来并且用QIAquick^TM凝胶萃取试剂盒(Qiagen)纯化，并且对由引物J'-CH2b3扩增的产物进行PCR纯化。在第二PCR反应中，使用两种引物(MJ7BACK(CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC(SEQ ID NO:149))和MJ8FOR(CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGG(SEQ ID NO:150)))来引入Sfil限制位点并且从组合的J'-CH2和J'-CH2b3扩增产物扩增最终sdAb片段。用Sfil消化最终PCR产物并且连结到pMED1中(A.Bell,等CancerLetters 289:81-90)并且通过电穿孔转化到大肠杆菌(E.coli)TG1(New England Biolabs,Ipswich,MA)中。进行大量转化以制备高多样性文库。文库的实际大小经测量为2×10⁸个独立转化体，超过了用于文库构建的淋巴细胞的数目。添加辅助噬菌体M13KO7(NEB)以使噬菌粒文库指数生长从而“拯救”噬菌体，意指使大肠杆菌细胞能够通过提供噬菌粒构建体中丢失的最需要的组分来产生所有为噬菌体粒子自组装所必需的蛋白质。在所筛选的总共2.3×10⁸种候选美洲驼sdAb中，选择50种特异性结合PCSK9的sdAb并且进一步表征。

实施例4：对PCSK9具特异性的sdAb的表达和纯化

在其选择之后，将47种sdAb的DNA亚克隆到表达载体中，并且纯化重组蛋白(r-蛋白)。尽管哺乳动物细胞转染是一种广泛地以小规模用于产生微克量的r-蛋白的熟知技术，但仅在最近才使此技术在大规模下有可能。人类胚肾293(HEK293)的大规模转染和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的较低程度转染正在变成得到确认的使能技术，其允许在cDNA克隆到适当的表达载体中之后数天内产生毫克到克量的r-蛋白(Atkinson,A.,Jack,G.W.(1973).Biochimica et Biophysica Acta,308(7):41-52；Baldi,L.,等(2007).Biotechnology Letters,29(5):677-684；Wurm,F.,Bernard,A.(1999).Current Opinion inBiotechnology,10(2):156-159)。与使用带有埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)复制起点(oriP)的表达载体组合，通常由类似非oriP载体获得r-蛋白产量的3倍提高(Berntzen,G.等(2005).Journal ofImmunological Methods,298(1-2):93-104；Durocher,Y.,Perret,S.,Kamen,A.(2002).Nucleic Acids Research,30(2):E9)。当与高度有效的表达质粒载体组合使用适合于在不含血清的培养基中悬浮培养的HEK293-EBNA1细胞系时，通常获得重组蛋白的高水平表达。

实施例5：抑制PCSK9依赖性LDLR降解的sdAb的选择和表征

使带6xHis标记的sdAb过表达并且以约1mg/L的量从HEK293细胞中纯化出来。在一些实验中，将从sdAb-V5转染的HEK293细胞收集的培养基用作sdAb来源。测试每种sdAb抑制添加到人类肝细胞细胞系HepG2和HuH7的胞外环境中的1μg/ml野生型PCSK9对LDLR降解的增强的能力。如Benjannet S.等J.Biol.Chem.285:40965-40978,2010中所描述使用西方墨点分析在HepG2(图6和8)和Huh7(图7、8以及10B)细胞系中所例证，若干所测试的sdAb抑制PCSK9依赖性LDLR降解。通过LDLR表达的增加来检测PCSK9功能的抑制。

如在Huh7细胞中所例证，如Benjannet S.等,2010(同上)中所描述通过使用流式细胞术分析还显示所选sdAb的存在会阻止PCSK9对细胞表面的LDLR的活性。这些分析中PCSK9功能的抑制是通过与细胞表面LDLR的表达增加相关联的阳性细胞数目增加来检测。使用纯化形式的PCSK9-WT蛋白(图9、10A以及10C)或分别衍生自WT(图10D)或D374Y(图11)PCSK9转染的Huh7细胞和HEK293细胞的培养基来进行分析。

在图10D中，在不存在[对照组(-)]或存在单独的0.7ug/ml(约9nM)PCSK9-WT蛋白(作为转染Huh7细胞的条件培养基)[对照组(+)]或与50ug/ml(约3uM)各种纯化美洲驼sdAb混合的0.7ug/ml(约9nM)PCSK9-WT蛋白的情况下，将原初HuH7细胞孵育18h。在添加到细胞中之前，将混合物在37℃下预孵育2h。使用抗人LDLR抗体和用alexa 647标记的适合的第二抗体通过FACS测量细胞表面的LDLR水平。细胞表面LDLR是相对于对照组(-)进行报导。PCSK9活性抑制百分比是以[sdAb-对照组(+)]/[对照组(-)-对照组(+)]×100计算。如所示，4种sdAb能够将PCSK9-WT的活性抑制54到88％。

也在不存在[对照组(-)]或存在单独的0.5ug/ml(约6nM)PCSK9-D374Y(转染HEK293细胞的条件培养基)[对照组(+)]或与50ug/ml(约3uM)各种纯化美洲驼sdAb混合的0.5ug/ml(约6nM)PCSK9-D374Y的情况下孵育原初HuH7细胞18h(图11A)。在图11B中，使用递增浓度的PKE2、P1.40或PKF8sdAb。这些sdAb以剂量依赖性方式抑制PCSK9的功能获得性突变体(D374Y)对LDLR降解的活性，在10ug/ml下达到最大60-70％抑制率。

将含有单独的或与3.5ug(约3uM)纯化sdAb(6His)混合的30ng(约6nM)PCSK9-D374Y的HEK293细胞的条件培养基在37℃下预孵育2h，随后在4℃下在6.6ug抗His Ab琼脂糖小球下免疫沉淀过夜。对上清液和从小球上洗脱的材料进行PAGE-SDS(6％)并且使用抗hPCSK9Ab进行西方墨点分析。下拉分析显示相对于PCSK9-D374Y约500倍摩尔过量的PKF8和P1.40sdAb能够结合约90％的PCSK9-D374Y蛋白(图12)。

在不存在或存在0.5ug/ml(约6nM)PCSK9-D374Y蛋白(转染HEK293细胞的条件培养基)的情况下孵育Huh7细胞，随后添加50ug/ml(约3uM)各种纯化美洲驼sdAb。在添加到细胞中之前，将混合物在37℃下预孵育2h。通过免疫荧光分析透性化或非透性化HuH7细胞。细胞核用DAPI(蓝色标记)染色，LDLR用抗LDLR Ab(绿色标记)染色。如图13中所示，PKE2、PKF8、PKG1以及P1.40使非透性化HuH7细胞的细胞表面的LDLR水平增加。透性化细胞的LDLR免疫荧光显示某些sdAb(例如P2.55和P2.57)还可以细胞内阻断LDLR，而细胞表面LDLR水平几乎没有增加。

还通过免疫荧光进行sdAb内化分析。将Huh7细胞用从i)用对照V5-CTL+6His载体、ii)用缺失V5标签的PCSK9(D374Y或WT)或者iii)用带V5标记的sdAb转染的HEK293细胞收集到的条件培养基孵育18小时。也将Huh7细胞用ii)与iii)的各种2h预孵育混合物孵育18小时。在带V5标记的sdAb的内化之后是在非透性化(sdAb的细胞表面定位)或透性化(sdAb的细胞内定位)条件下使用mAb-V5(Invitrogen)进行的V5标签的免疫荧光分析

还如Poirier等,J.Biol.Chem.284:28856-28864,2009中所描述使用Dil-LDL荧光吸收分析表征sdAb。该方法由以下组成：在存在或不存在PCSK9纯化蛋白的情况下，对在人类肝细胞源性HuH7或HepG2细胞系中经由LDLR内化进行的Dil-LDL细胞并入(细胞表面LDLR活性的量度)进行荧光测量。在存在或不存在10μg/ml sdAb的情况下，将细胞按96孔样式孵育2h，并且接着添加Dil-LDL再持续2h。使用荧光板读数器测量细胞对Dil-LDL的吸收。通过Dil-LDL荧光的增加来检测PCSK9≡LDLR功能性相互作用的抑制。

为了进一步测试这些sdAb是否也可以抑制PCSK9的功能获得性突变体D374Y的功能，将细胞用纯化PCSK9-D374Y蛋白孵育并且通过使用Dil-LDL荧光吸收分析来分析抗体活性。P1.40sdAb能够完全阻断PCSK9-D374Y对HepG2细胞中的LDLR的活性(图14)。

最后，也针对原代人类肝细胞测试sdAb，以便测量其对细胞表面LDLR的影响。

对sdAb DNA进行测序。图2和3显示抑制PCSK9依赖性LDLR降解的17种sdAb的氨基酸比对。具体地说，对sdAb的子群的比对展示于图3D(具有三到五种的子群)和3E(配对)中，其中许多显示80％或更大(例如80％、80.95％、81％、83％、83.46％、84％、85％、86％、87％、87.30％、88％、90％、91％、93％、94％、96、98％)的序列同一性。图4提供图2A和3A中所示的sdAb的序列的系统发育树。

实施例6：sdAb≡PCSK9相互作用和sdAb性质的表征

与各sdAb(包括P1.40)相互作用的PCSK9结构域是通过进行删除和突变分析来测定。此可例如通过使1)编码各sdAb的cDNA与2)具有允许特定PCSK9结构域(例如前段-V5、催化亚单位-V5、CHRD-V5等)、其亚片段或携带V5标记序列的PCSK9突变体表达的结构的cDNA共表达来实现。用携带对V5序列具特异性的单克隆抗体(mAb-V5)的磁性小球将PCSK9≡sdAb复合物下拉。sdAb通过其与PCSK9结构域、亚片段或突变体相互作用而下拉。分析所选sdAb的生物化学和生物物理性质。表面等离子共振(SPR)测量sdAb对PCSK9的亲和力。使用不同PCSK9结构域(例如前段、催化结构域和CHRD结构域)作为抗原来评估结构域特异性。

生物物理性质是候选药物的其它重要特征。针对以下方面评估sdAb的性质：1)聚集体形成；以及2)耐蛋白水解降解性。聚集体的形成是通过对样品进行尺寸排阻色谱分析来评估。聚集体的分子量是基于相同条件下的蛋白质标准操作来估算。此类具有所计算的分子量的团块的比较将指示它们是否以单体、低聚物或多种样式的混合物形式存在。优选地选择单体sdAb来进行进一步的研发。

所分离的sdAb的蛋白水解稳定性可通过用人类血浆的三种主要蛋白酶(组织蛋白酶B、凝血酶或胰蛋白酶样蛋白酶)处理sdAb来评估。

实施例7：所选PCSK9特异性sdAb的可能的修饰

最近已建立一种新的蛋白质筛选途径，即表达、生物性质以及亲和力的快速筛选(FASEBA)(美国临时专利申请号61/272,119，其优先权在WO/2011/020183中被要求)。此方法使用蛋白锚定将有待于筛选的候选蛋白连接到载体蛋白上，允许在不进行任何蛋白质纯化的情况下评估蛋白质的多种性质并且使得能够筛选非常多数目的蛋白候选物。此新方法可用于进一步改善sdAb的性质。

sdAb的亲和力成熟：溶解的sdAb-抗体复合物的结构显示抗原结合中主要涉及CDR3。sdAb亲和力的提高是通过使CDR3与其它CDR(CDR1和CDR2)突变来实现。对于CDR3，引入突变以使得各位置处约50％的残基是原始残基。对于CDR1和CDR2，此百分比降为约25％。这些区域的差别处理是基于CDR在抗原结合中的重要性。尽管在CDR3中保留大量残基以产生具有高结合物百分比的文库，但是在CDR1和CDR2中引入更大无规性以增强主要由CDR3介导的结合。鉴于在同时对所有CDR进行工程改造时具有巨大的理论文库尺寸，较佳策略是连续地工程改造CDR3和CDR1/CDR2。使用FASEBA方法首先筛选此类突变文库以排除高百分比的具有不令人满意的特征的sdAb。在未经蛋白质纯化的情况下直接通过SPR分析剩余sdAb的亲和力。将亲和力提高的sdAb纯化并且评估其生物物理性质。

sdAb的人源化：与亲和力成熟中类似地进行人源化，但使用不同文库构建策略。将具有令人满意的亲和力的sdAb的序列与人类V_H的共有序列相比较，并且选择骆驼与人类sdAb中不同的关键残基。通过用人类残基置换骆驼残基来构建人源化文库，并且使用FASEBA方法筛选以移除具有不令人满意的性质的sdAb。不需要进行亲和力筛选，因为CDR保持相同。

工程改造sdAb与IgG4-Fc的融合以及融合蛋白的产生：通过使sdAb与人类IgG4-Fc融合以产生lgG4类型来延长sdAb的体内血清半衰期。在瞬时哺乳动物表达系统中产生大量此类融合蛋白(HCAb-Fc)。将HCAb-Fc在功能性亲和力、生物物理特征以及抑制PCSK9功能的能力/效能方面与其sdAb对应物相比较。

实施例8：对动物模型中PCSK9诱导的LDLR降解的抑制的表征

接着在表达人类PCSK9的小鼠模型中使用药物候选物来评估其较低体内血浆胆固醇水平的能力。

在过表达人类PCSK9的小鼠中测试PCSK9 sdAb抑制剂。构建携带由自身的启动子表达人类PCSK9(WT、D374Y低或D374Y高)的约190kb的人类基因组DNA的转基因细胞系(Herbert,B.等(2010).Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,30(7):1333-1339)。其它杂交在Pcsk9^－/－Ldlr^+/－背景中产生表达人类PCSK9转基因的小鼠品系(Ldlr杂合子)。这消除了由小鼠PCSK9基因的内源性表达产生的干扰并且增加其LDLc水平(图15)。通过多次回交，在纯C57BL/6背景中获得这些模型小鼠，用于分析的均一性和再现性。作为关于特异性的对照，测试Ldlr^－/－背景中的转基因的效应。

小鼠注射：将抑制剂(10mg/Kg sdAb和0.1-1mg/Kg肽)静脉内注射给WT、Pcsk9^－/－、Ldlr^-/－以及Pcsk9-Tg小鼠，6只小鼠/基因型(图15)。在第一周期间每天和接下来的2周每三天测量总胆固醇(TC)、LDLc以及PCSK9水平。还通过使用先前描述的抗体进行免疫沉淀来测量血浆中的剩余未复合PCSK9的水平(Zaid,A.,等(2008).Hepatology,48(2):646-65)。在另一组实验中，在最低LDLc时间点(注射后4-7天)将6只小鼠处死并且分析其FPLC血浆脂质型态以及肝LDLR蛋白。若相关，则评估¹²⁵I标记sdAb或肽的半衰期作为体内最佳化的前兆。仔细监测任何明显毒性和/或病态效应。Pcsk9^－/－、Ldlr^－/－小鼠的对照允许检验所观察到的效应是PCSK9依赖性的。

他汀+sdAb的作用：评估阿伐他汀(atorvastatin)与最佳sdAb的组合，因为他汀增加PCSK9表达，同时降低LDLR的表达(Dubuc,G.,等(2004).Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,24(8)：1454-1459；Lakoski,S.G.,等(2009).The Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolism,94(7):2537-2543)，并且显示他汀使Pcsk9^－/－小鼠的LDLc进一步减少(Rashid,S.,等(2005).Proc NatlAcad Sci USA 102(15):5374-5379)。

肝脂肪变性：在高胆固醇膳食之后保护Pcsk9^－/－小鼠不发生肝脂肪变性(Zaid,A.,等(2008).Hepatology,48(2):646-65)。因此，接着对用含有0.2％胆固醇的膳食饲喂2周的小鼠注射sdAb或生理盐水，并且在LDLc处于其最低值时的最佳注射后时间，使用油红O(Oil-Red-O)分析其肝脏的中性脂质的累积(或缺乏)(Zaid,A.,等(2008).Hepatology,48(2):646-65)。

尽管上文已通过本发明的具体实施方案描述了本发明，但可以对它进行修改，而不脱离如随附权利要求书中所界定的本发明精神和性质。在权利要求书中，词语“包含”用作开放性术语，基本上等效于短语“包括但不限于”。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(或一种)(a/an)”和“所述”包括相应复数参考物。

Claims

1.一种特异性结合于人类PCSK9的抗体，所述抗体包含：

(i)互补决定区(CDR)1区，其包含式I氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO:1)(I)

其中

X1是D、N、H、V、A、I或S；

X2是Y、P或A；

X3是I、A、T、V或Y；

X4是L、V、T或M；并且

X5是G、S或A；

或与其基本上同一的序列；

(ii)CDR2区，其包含式II氨基酸序列：

其中

Z1是A、Q、T、G或S；

Z2是I、V或A；

Z3是R、T、A或S；

Z4是G、E、S、Q、A或D；

Z5是S、P、V、R、H或G；

Z6是G、A或D；

Z7是A、S、D、G或T；

Z8是I、V或不存在；

Z9是R、T或不存在；

Z10是G、A或不存在；

Z11是R、D或不存在；

Z12是E、V或不存在；

Z13是G、E或不存在；

Z14是S、R、F或不存在；

Z15是T、I或S；

Z16是F、Y、E、D、P、A或N；

Z17是V、A、S、E或T；

Z18是D、H、N、E、R或V；

Z19是S、N或F；

Z20是V或A；并且

Z21是K或R；或与其基本上同一的序列；和/或

(iii)CDR3区，其包含式III氨基酸序列：

其中

B1是D、T、A、P、R或Y；

B2是R、Q、K、T、L、Y、PA或S；

B3是F、Y、S、R、A、G或M；

B4是P、G、Y、S、F或不存在；

B5是T、N、S、Y或不存在；

B6是P、Y、T、I、G、R或不存在；

B7是E、N、R、D、T或不存在；

B8是F、Y、L、I、V或不存在；

B9是S、T、M、P、Y或不存在；

B10是T、G、D、H或S；

B11是Q、P、T、A、R、H、V或E；

B12是V、D、L、H、S、F或T；

B13是G、P、L、H、R、S或M；

B14是K、N、E、W、V或不存在；

B15是H、K、E、T、G、N或S；

B16是Y、S或Q；

B17是D、H、V、E、A或不存在；并且

B18是Y、L、H、V或不存在，

或与其基本上同一的序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述CDR1区包含以下氨基酸序列中的一者：

DYILG(SEQ ID NO：4)，

NYIVG(SEQ ID NO：5)，

HYILG(SEQ ID NO：6)，

VYAMG(SEQ ID NO：7)，

DYAMG(SEQ ID NO：8)，

NYAMG(SEQ ID NO：9)，

AYAMG(SEQ ID NO：10)，

IAYMA(SEQ ID NO：11)，

SPTMA(SEQ ID NO：12)，

HYIVG(SEQ ID NO：13)，

HYVTS(SEQ ID NO：14)，

或与其基本上同一的序列。

3.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述CDR2区包含以下氨基酸序列中的一者：

AIRGSGAIRGREGSTFYVDSVKG(SEQ ID NO：15)，

AIRGSGAIRGREGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：16)，

AIRESGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO：17)，

AITSPGDSIPYAHSVKG(SEQ ID NO：18)，

AITSSGDSIPYAHSVKG(SEQ ID NO：19)，

AAAQSGDSSAYARSVKG(SEQ ID NO：20)，

QISQVDGFTYYEDSVKG(SEQ ID NO：21)，

TIRDSDASIYYTDSVKG(SEQ ID NO：22)，

SISSGGTTNYAVFAKG(SEQ ID NO：23)，

AIRSRDDSTYYSNSVKG(SEQ ID NO：24)，

AIRESGSRTYYADSVRG(SEQ ID NO：25)，

AVRESGSSTEYAENVKG(SEQ ID NO：26)，

AVREPGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO：27)，

GVTAHAGVTADVESTDYSDSVKG(SEQ ID NO：28)，

或与其基本上同一的序列。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述CDR3区包含以下氨基酸序列中的一者：

DRFPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO：29)，

DRFPTPEFTTQVGHYDV(SEQ ID NO：30)，

DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO：31)，

TKSGNYNYMGPDPKKYHY(SEQ ID NO：32)，

TTSGTYNYMGPDPKEYVY(SEQ ID NO：33)，

TTRGSYEYMGPDPKKYEY(SEQ ID NO：34)，

ALAFPTTSSNTYAY(SEQ ID NO：35)，

RQYYSGRVYSTFREEYDY(SEQ ID NO：36)，

YAMSTETMVSQDY(SEQ ID NO：37)，

TYSGTYNYMGADPKEYVY(SEQ ID NO：38)，

DPRTIDLSSRLLWGS(SEQ ID NO：39)，

DQYPTTEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO：40)，

DRFPTPEFSDRVGHYDL(SEQ ID NO：41)，

DPYPTPEFTTHVGHYDY(SEQ ID NO：42)，

PSGFYRTIPHVHSNYDH(SEQ ID NO：43)，

或与其基本上同一的序列。

5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：DYILG(SEQ ID NO：4)、AIRGSGAIRGREGSTFYVDSVKG(SEQ ID NO：15)以及DRFPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO：29)，或与其基本上同一的序列。

6.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：NYIVG(SEQ ID NO：5)、AIRGSGAIRGREGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：16)以及DRFPTPEFTTQVGHYDV(SEQ ID NO：30)，或与其基本上同一的序列。

7.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：DYILG(SEQ ID NO：4)、AIRESGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO：17)以及DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO：31)，或与其基本上同一的序列。

8.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AIRESGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:17)以及DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:31)，或与其基本上同一的序列。

9.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：VYAMG(SEQ ID NO:7)、AITSPGDSIPYAHSVKG(SEQ ID NO:18)以及TKSGNYNYMGPDPKKYHY(SEQ ID NO:32)，或与其基本上同一的序列。

10.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：VYAMG(SEQ ID NO:7)、AITSSGDSIPYAHSVKG(SEQ ID NO:19)以及TTSGTYNYMGPDPKEYVY(SEQ ID NO:33)，或与其基本上同一的序列。

11.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：DYAMG(SEQ ID NO:8)、AAAQSGDSSAYARSVKG(SEQ ID NO:20)以及TTRGSYEYMGPDPKKYEY(SEQ ID NO:34)，或与其基本上同一的序列。

12.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：NYAMG(SEQ ID NO:9)、QISQVDGFTYYEDSVKG(SEQ ID NO:21)以及ALAFPTTSSNTYAY(SEQID NO:35)，或与其基本上同一的序列。

13.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：AYAMG(SEQ ID NO:10)、TIRDSDASIYYTDSVKG(SEQ ID NO:22)以及RQYYSGRVYSTFREEYDY(SEQ ID NO:36)，或与其基本上同一的序列。

14.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：IAYMA(SEQ ID NO:11)、SISSGGTTNYAVFAKG(SEQ ID NO:23)以及YAMSTETMVSQDY(SEQ IDNO:37)，或与其基本上同一的序列。

15.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：NYAMG(SEQ ID NO:9)、QISQVDGFTYYEDSVKG(SEQ ID NO:21)以及TYSGTYNYMGADPKEYVY(SEQ ID NO:38)，或与其基本上同一的序列。

16.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：SPTMA(SEQ ID NO:12)、AIRSRDDSTYYSNSVKG(SEQ ID NO:24)以及DPRTIDLSSRLLWGS(SEQ ID NO:39)，或与其基本上同一的序列。

17.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AIRESGSRTYYADSVRG(SEQ ID NO:25)以及DQYPTTEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:40)，或与其基本上同一的序列。

18.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYIVG(SEQ ID NO:13)、AVRESGSSTEYAENVKG(SEQ ID NO:26)以及DRFPTPEFSDRVGHYDL(SEQ ID NO:41)，或与其基本上同一的序列。

19.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AIRESGSRTYYADSVRG(SEQ ID NO:25)以及DQYPTPEFSTQVGHYDY(SEQ ID NO:31)，或与其基本上同一的序列。

20.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYILG(SEQ ID NO:6)、AVREPGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:27)以及DPYPTPEFTTHVGHYDY(SEQ ID NO:42)，或与其基本上同一的序列。

21.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2以及CDR3区分别包含：HYVTS(SEQ ID NO:14)、GVTAHAGVTADVESTDYSDSVKG(SEQ ID NO:28)以及PSGFYRTIPHVHSNYDH(SEQ ID NO:43)，或与其基本上同一的序列。

22.如权利要求1至21中任一项所述的抗体，其进一步包含构架区(FR)1，所述构架区(FR)1包含式IV氨基酸序列：

其中

X6是K或Q；

X7是E或V；

X8是L或P；

X9是G或D；

X10是L或M；

X11是V、L、S或A；

X12是A或P；

X13是S或P；

X14是G、D或R；

X15是R、L或S；

X16是T、F、I或G；

X17是I、V、P或F；并且

X18是N、R、S或V，

或与其基本上同一的序列。

23.如权利要求22所述的抗体，其中X6是K；X7是E；X8是L；X9是G；X10是L；X11是A；X12是A；X13是S；X14是G；X15是R；X16是T；X17是F；和/或X18是N。

24.如权利要求22所述的抗体，其中所述FRl包含以下氨基酸序列中的一者：

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTIN(SEQ ID NO：45)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASDRTVN(SEQ ID NO：46)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：47)，

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS(SEQ ID NO：48)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS(SEQ ID NO：49)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFN(SEQ ID NO：50)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFS(SEQ ID NO：51)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCSPSDRTFS(SEQ ID NO：52)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAAPRSGVV(SEQ ID NO：53)，

QVKLEESGGGPVQAGGSLRLSCLASGRFVN(SEQ ID NO：54)，

QVQLVESGGGLVQAGGSMRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：55)，

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPR(SEQ ID NO：56)，

QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRIFN(SEQ ID NO：57)，

或与其基本上同一的序列。

25.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，其进一步包含FR2，所述FR2包含式V氨基酸序列：

X19-X20-R-Q-X21-P-X22-X23-X24-X25-X26-X27-V-X28(SEQID NO：58)(V)

其中

X19是W或Y；

X20是F或Y；

X21是A或V；

X22是G、D或E；

X23是K、T、R、A、E或Q；

X24是K、E、Q或L；

X25是R或P；

X26是E或K；

X27是F或L；并且

X28是A、T或G，

或与其基本上同一的序列。

26.如权利要求25所述的抗体，其中X19是W；X20是F；X21是A；X22是G；X23是K；X24是E；X25是R；X26是E；X27是F；和/或X28是A。

27.如权利要求18所述的抗体，其中所述FR2包含以下氨基酸序列中的一者：

WFRQAPGKKREFVA(SEQ ID NO：59)，

YFRQAPGKEREFVA(SEQ ID NO：60)，

WFRQAPGKQREFVA(SEQ ID NO：61)，

WFRQAPGKEREFVA(SEQ ID NO：62)，

WFRQAPGKEREFVT(SEQ ID NO：63)，

WFRQAPGTEREFVG(SEQ ID NO：64)，

WFRQVPGREREFVA(SEQ ID NO：65)，

WYRQAPEKQRELVA(SEQ ID NO：66)，

WFRQAPGAEREFVG(SEQ ID NO：67)，

WFRQAPGEERKFVA(SEQ ID NO：68)，

WFRQAPGKLPEFVA(SEQ ID NO：69)，

WFRQAPDQEREFVA(SEQ ID NO：70)，

或与其基本上同一的序列。

28.如权利要求1至20中任一项所述的抗体，其进一步包含FR3，所述FR3包含式VI氨基酸序列：

其中

X29是Y、F或D：

X30是T、S或V：

X31是I或V：

X32是K、R、A或L：

X33是D或N：

X34是N、G、H或Y：

X35是A、T、V或S；

X36是N或S；

X37是T或A；

X38是V、I、L、A或G；

X39是Y、D或F；

X40是Q或R；

X41是N、D或S；

X42是K、I或Q；

X43是E或D；

X44是S或T；

X45是T、V或A；

X46是Y或I；

X47是A或N；并且

X48是A、V、L或G，

或与其基本上同一的序列。

29.如权利要求21所述的抗体，其中X29是F；X30是T；X31是I；X32是R；X33是D；X34是N；X35是A；X36是N；X37是T；X38是V；X39是Y；X40是Q；X41是N；X42是K；X43是E；X44是T；X45是V；X46是Y；X47是A；和/或X48是A。

30.如权利要求21所述的抗体，其中所述FR3包含以下氨基酸序列中的一者：

RYTISKDNAKNTVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：72)，

RFSISKDNAKNTIYLQMNSLKPEDSAVYYCAL(SEQ ID NO：73)，

RYTISRNNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：74)，

RYTISRDNTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：75)，

RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：76)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：77)，

RFTISRDGAKNTAYLQMDSLKPEDTAAYYCAA(SEQ ID NO：78)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：79)，

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLIPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：80)，

RFTISADNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYICNA(SEQ ID NO：81)，

RFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPDDTAVYYCAA(SEQ ID NO：82)，

RFTISLDNAKNTAYLRMDSLQPEDTAVYYCAG(SEQ ID NO：83)，

RDTISRDNTKNAGDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：84)，

RFVISKDNVKSTVFLQMNSLKPEDSAVYYCAL(SEQ ID NO：85)，

RDTISKDHTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAV(SEQ ID NO：86)，

RFTVSRDYSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA(SEQ ID NO：87)，

或与其基本上同一的序列。

31.如权利要求1至30中任一项所述的抗体，其进一步包含FR4，所述FR4包含式VII氨基酸序列：

X49-G-X50-G-T-X51-V-T-X52-S-S(SEQ ID NO：88)(VII)

其中

X49是W或S：

X50是R或Q；

X51是Q或E；并且

X52是V或I；

或与其基本上同一的序列。

32.如权利要求31所述的抗体，其中X49是W；X50是Q；X51是Q；和/或X52是V。

33.如权利要求31所述的抗体，其中所述FR4包含以下氨基酸序列中的一者：

WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：89)，

WGRGTQVTVSS(SEQ ID NO：90),

SGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：91)

WGQGTEVTISS(SEQ ID NO：92),

或与其基本上同一的序列。

34.如权利要求1所述的抗体，其包含以下氨基酸序列中的一者：

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTINDYILGWFRQAPGKKREFVAAIRGSGAIRGREGSTFYVDSVKGRYTISKDNAKNTVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDRFPTPEFSTQVGHYDWVGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：93)；

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTPRHYILGWFRQAPGKLPEFVAAVREPGSSTYYADSVKGRDTISKDHTKNAVDLQMNSLKPEDSATYYCAVDPYPTPEFTTHVGHYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：108；

或与其基本上同一的序列。

35.如权利要求1至34中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单域抗体(sdAb)。

36.一种药物组合物，其包含如权利要求1至35中任一项所述的抗体中的至少一者。

37.如权利要求36所述的药物组合物，其进一步包含至少另一种如权利要求1至35中任一项所述的抗体。

38.如权利要求36或37所述的药物组合物，其进一步包含药物载体或赋形剂。

39.如权利要求1至35中任一项所述的抗体或如权利要求36至38中任一项所述的组合物，其用作药剂。

40.如权利要求1至35中任一项所述的抗体或如权利要求36至38中任一项所述的组合物，其用于制造药剂。

41.如权利要求39或40所述的抗体或组合物，其中所述药剂是用于预防或治疗受试者的低密度脂质一胆固醇相关疾病。

42.如权利要求41所述的抗体或组合物，其中所述低密度脂质-胆固醇相关疾病是高胆固醇血症。

43.一种预防或治疗低密度脂质-胆固醇相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求1至35中任一项所述的抗体或如权利要求36至38中任一项所述的组合物。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述低密度脂质-胆固醇相关疾病是高胆固醇血症。如权利要求1至35中任一项所述的抗体或如权利要求36至38中任一项所述的组合物作为药剂的用途。

45.如权利要求1至35中任一项所述的抗体或如权利要求36至38中任一项所述的组合物用于预防或治疗受试者的低密度脂质-胆固醇相关疾病的用途。

46.如权利要求1至35中任一项所述的抗体或如权利要求36至38中任一项所述的组合物用于制造用以预防或治疗受试者的低密度脂质-胆固醇相关疾病的药剂的用途。

47.如权利要求46或47所述的用途，其中所述低密度脂质-胆固醇相关疾病是高胆固醇血症。

48.一种核酸，其包含编码如权利要求1至35中任一项所述的抗体的核苷酸序列。

49.一种载体，其包含如权利要求49所述的核酸。

50.一种细胞，其包含如权利要求49所述的核酸或如权利要求50所述的载体。

51.一种用于预防或治疗受试者的低密度脂质-胆固醇相关疾病的试剂盒，其包含如权利要求1至35中任一项所述的抗体中的至少两者。

52.如权利要求52所述的试剂盒，其中所述低密度脂质-胆固醇相关疾病是高胆固醇血症。

53.一种用于检测生物样品中的PCSK9的试剂盒，其包含如权利要求1至35中任一项所述的抗体中的至少两者。