CN109897110A

CN109897110A - 纳米抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN109897110A
Application number: CN201711298806.3A
Authority: CN
Inventors: 王媚娘; 杨乃波; 曹丽霞; 黄谧; 刘楚新; 张婷婷; 李新洋; 李波; 侯勇
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN109897110B

Abstract

本发明提出了一种纳米抗体。该抗体包括：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。该纳米抗体是特异性靶向PCSK9的抗体，能够结合天然构象的PCSK9，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

Description

纳米抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及纳米抗体及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及纳米抗体、分离的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物、纳米抗体在制备药物中的用途以及制备纳米抗体的方法。

背景技术

目前市面上用于降低胆固醇的药物主要有他汀类(statins)、胆固醇吸收抑制剂、普罗布考等。尽管他汀类药物心血管疾病治疗上表现出色，但随着其广泛使用，可能产生的弊端也渐渐被发现。首先，强化他汀治疗患者仍有较高心血管事件残余风险，在2年内发生的风险达22.4％；其次，有大量患者无法耐受他汀类药物，尤其是家族性高胆固醇血症患者，即使接受最大剂量的最有效的他汀类药物治疗，仍然不能达到降低LDL-C浓度的目的；最重要的是，他汀类药物存在多种副作用，如引起患者血糖异常、肌肉毒性、记忆和认知障碍等，副作用的发生率高达20％，严重的副作用会导致横纹肌溶解和急性肾功能衰竭，相当一部分患者因不能忍受副作用带来的肌肉疼痛而终止了治疗。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)，枯草蛋白酶亚家族的一种新的前蛋白转化酶，是常染色体显性家族性高胆固醇血症的重要影响因子之一。研究发现，PCSK9除了能影响血浆胆固醇水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前对于PCSK9的研究主要集中在对肝脏脂质代谢的调节功能。前期的研究显示，PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDL-R)的降解，调节肝脏脂质代谢，进而影响血浆中低密度脂蛋白胆固醇 (low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。但PCSK9存在两种突变类型，功能获得型突变和功能缺失型突变。族群试验显示，若干PCSK9“获得功能”的突变常发生于体染色体显性高胆固醇血症的个体，而PCSK9“失去功能”的突变则与血浆胆固醇减少有，PCSK9功能缺失型突变个体患冠心病的风险明显降低。2005年，Hobbs等在Dallas Heart Study上报道了携带PCSK9无义突变基因的个体中LDL-C水平会比一般人低28％；在2006， Hobbs等又发表PCSK9基因突变对冠心病的作用，该结果基于一项动脉粥样硬化风险调查，他们对9523个白人和3363个非洲裔美国人进行了长达15年的跟踪观察，发现缺失1个或 2个PCSK9功能基因的人群的冠心病的发病率显著低于普通人群。CopenhagenHeart Study 发现PCSK9基因的功能性缺失会使LDL-C水平下降11-15％，冠心病患病率下降6-46％。 Zimbabwe等报道了PCSK9的缺失突变可使非洲女性的LDL-C水平下降27％。PCSK9抑制剂提供了一种全新的治疗模式来对抗LDL-C，被视为他汀类之后降脂领域取得的最大进步。PCSK9抑制剂的出现，为那些服用他汀类药物时出现严重副作用的患者，及他汀类药物治疗无法达到LDL-C目标水平的患者，如遗传性高胆固醇血症患者带来了福音。

PCSK9抑制剂除了能阻止LDL-R回收，还可以抑制NF-κB通道，从而减少血栓、炎症、血管内皮细胞激活等急性冠状动脉综合症的风险。目前PCSK9抑制剂这个领域潜在的研究项目有抑制蛋白抗体、siRNA、反意寡核苷酸以及小分子抑制剂等。单克隆抗体药物因具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，是目前PCSK9抑制剂研究的主要领域。在动物水平的研究显示，加入中和抗PCSK9的抗体之后，小鼠肝脏中的LDL-R表达水平显著上升，血液中LDL-C浓度下降30％。对灵长类动物，PCSK9单克隆抗体也表现出显著的效果，LDL-C水平的下降效果可维持数周以上。到目前为止，还没有发现抗PCSK9 蛋白单抗类药物有比较明显的毒副作用，只有报道称出现过局部注射反应、腹泻和头疼等较轻微的副作用。赛诺菲的Praluent(Alirocumab)和安进的Repatha(evolocumab)是目前全球市场唯二获批的人源化的PCSK9抗体。

因此，开发我国国产化PCSK9抗体抑制剂，满足我国国民对于抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

现有技术对于PCSK9纳米抗体的开发集中在鼠源传统抗体，传统抗体无论是大量表达，还是进行抗体人源化都比较困难，耗时长，花费高，并且有效抗体获得率低，严重限制了 PCSK9抗体抑制剂的开发，特别是国内抗体药物刚刚处于起步阶段，完全不能满足CVD患者的需求。本申请的发明人采用骆驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，开发出了靶向PCSK9的高亲和纳米抗体，为治疗因PCSK9异常而导致的疾病奠定了良好的基础，为满足我国国民对于PCSK9抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

ESGGGSVQAGGSLRLSCTVSGYTYSSNCMGWFRQAPGKEHEGVASIYIGGGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAVGCQGLVDFGYWDQGTQVTVS S(SEQ ID NO:1)。

根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向PCSK9的单价抗体，能够结合天然构象的 PCSK9，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向PCSK9，结合天然构象的PCSK9，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。根据本发明实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。根据本发明实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种噬菌体。根据本发明的实施例，所述噬菌体包含前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体、表达载体或表达前面所述的纳米抗体。根据本发明实施例的噬菌体可将前面所述的纳米抗体在噬菌体表面融合表达出来，所述噬菌体具有与PCSK9高特异性的亲和活性。

在发明的第六方面，本发明提出了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述细胞携带前面所述的核酸构建体或前面所述的表达载体。根据本发明实施例的宿主细胞能够高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括：前面所述的纳米抗体；以及药学上可接收的佐剂。根据本发明实施例的药物组合物能够特异性靶向PCSK9，结合天然构象的PCSK9，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗PCSK9相关性疾病。前面所述的纳米抗体能够特异性靶向PCSK9，结合天然构象的PCSK9，利用前面所述的纳米抗体制备的药物能够有效预防或治疗PCSK9相关性疾病。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种制备前面所述纳米抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：分别采集免疫前和免疫后澳洲羊驼的外周血单核细胞，并提取所述外周血单核细胞总RNA，所述免疫是通过注射人PCSK9抗原多肽实现的；利用Nest-PCR技术克隆VHH区，并将克隆产物插入噬菌体，以便获得噬菌体展示库，所述噬菌体展示库表达PCSK9抗体VHH区；以及利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库，以便获得所述纳米抗体。利用根据本发明实施例的上述方法将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)容易对库容量较大的文库进行筛选，操作简单，通量高；(2)可获得一些自然界不存在，但能与抗原高亲和结合的抗体，这是因为噬菌体复制和增殖的过程中会产生一些体外突变，这些突变可能在羊驼体内不能天然存在，但可在筛选中获得；(3)抗体分子可以通过噬菌体的增殖而扩增，操作方便，实验成本低；(4)由生物体转录翻译产生的抗体具有生物活性，无需纯化可达到70％-94％的纯度。所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性的优势。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的Nest-PCR扩增羊驼重链抗体的VHH片段的结果图；

图2是根据本发明实施例的clone PCR验证构建的噬菌体展示库中VHH片段的重组效率的结果图；

图3是根据本发明实施例的淘洗PCSK9纳米抗体单克隆ELISA筛选的结果图；

图4是根据本发明实施例的淘洗PCSK9纳米抗体单克隆PCR筛选的结果图；

图5是根据本发明实施例的SDS-PAGE验证PCSK9纳米抗体的表达和纯化的结果图；以及

图6是根据本发明实施例的ELISA验证纯化的PCSK9纳米抗体的亲和力的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

纳米抗体

在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向PCSK9的抗体，能够结合天然构象的PCSK9，该纳米抗体(Nanobody,Nb)为天然缺失轻链的重链抗体，只有15KDa左右，约传统抗体大小的十分之一，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和PH有较强的抵抗力；PCSK9Nb缺乏Fc段和轻链的性质使其能够识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位，且避免了补体反应；此外，PCSK9纳米抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选，和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。序列同源性分析显示，羊驼Nb的VHH胚系基因序列和人VH3高度同源，但CDR1 和CDR3比人稍长，CDR3在三级结构中向外凸出，因而PCSK9纳米抗体具有更高的 PCSK9抗原结合的特异性和亲和力。

根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQ ID NO：3 所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

ESGGGSVQAGGSLRLSCTVS(SEQ ID NO:2)。

MGWFRQAPGKEHEGVAS(SEQ ID NO:3)。

YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO:4)。

WDQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)。

GYTYSSNC(SEQ ID NO:6)。

IYIGGGST(SEQ ID NO:7)。

AVGCQGLVDFGY(SEQ ID NO:8)。

分离的核酸

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向结合天然构像的PCSK9，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

GAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGTGTCTGGATACACCTACAGTAGCAATTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCACGAGGGGGTCGCATCTATTTATATTGGTGGTGGTAGCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGTCGGATGTCAGGGCTTAGTTGACTTTGGTTACTGGGACCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:9)。

根据本发明实施例的上述核酸所编码的多肽具有与PCSK9显著的高亲和活性，且该多肽具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1， CDR2和CDR3)构成。

需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

核酸构建体

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导抗体在宿主中表达的一个或多个控制序列。根据本发明的实施例，控制序列包括但不限于U6，H1，CMV， EF-1，LTR或RSV启动子。本发明实施例所提出的核酸构建体可在适合条件下，与表达载体连接后，在适宜的宿主细胞中高效表达上述纳米抗体，进而可有效用于对PCSK9相关性疾病的特异性治疗或预防。根据本发明实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

表达载体

在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。所述表达载体的类型不受特别限制，只要能够实现前面所述的核酸构建体在受体细胞中高效表达即可，表达载体包括但不限于反转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺病毒相关病毒载体。本发明实施例所述提出的表达载体可在适合条件下，在表达宿主中高效表达上述纳米抗体，所述表达载体可有效用于对PCSK9相关性疾病的特异性治疗或预防。根据本发明实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

噬菌体

在本发明的第五方面，本发明提出了一种噬菌体。根据本发明的实施例，所述噬菌体包含前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体、表达载体或表达前面所述的纳米抗体。根据本发明实施例的噬菌体衣壳蛋白基因中整合有前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体，前面所述的纳米抗体在噬菌体表面融合表达出来，所述噬菌体具有与PCSK9高特异性的亲和活性，并且有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

宿主细胞

根据本发明的具体实施例，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得。采用何种转染或转化的方式是根据宿主细胞的性质以及待转核酸构建体或表达载体的性质所决定的，只要能够在所述宿主细胞中实现前面所述多肽的高效表达并对宿主细胞的良好的细胞状态不产生较大影响即可。根据本发明的实施例，所述宿主细胞在合适条件下可高效表达上述纳米抗体，所述宿主细胞可有效用于对PCSK9相关性疾病的特异性治疗或预防。

根据本发明的具体实施例，所述宿主细胞为原核细胞，如HB2151。进而实现上述纳米抗体的大规模制备和纯化。

需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述多肽表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合多肽表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体表达的条件。

药物组合物

用途

根据本发明的实施例，所述PCSK9相关性疾病为脑血管疾病、高胆固醇血症、冠心病或急性冠状动脉综合症。发明人发现，根据本发明实施例的药物对脑血管疾病、高胆固醇血症、冠心病或急性冠状动脉综合症的治疗效果更佳。

更进一步，本发明提出了一种治疗方法。根据本发明的实施例，该治疗方法包括：对患者给予治疗有效量的前面所述的纳米抗体、前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体、前面所述的表达载体、前面所述的噬菌体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物。如前所述，本发明实施例所提出的治疗方法，包括给予任一种有效量的前面所述的纳米抗体等，均可有效治疗或预防PCSK9相关性疾病。

在本文中所使用的术语“给予”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明实施例中的多肽、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物可以通过任何常见的途径给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明实施例中的纳米抗体、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。本文使用的“治疗”涵盖将发明实施例中的纳米抗体、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物给予个体以治疗，包括但不限于将含本文所述的给予有需要的个体。

制备前面所述纳米抗体的方法

在本发明的第九方面，本发明提出了一种制备前面所述纳米抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

S100：分别采集免疫前和免疫后澳洲羊驼的外周血单核细胞，并提取所述外周血单核细胞总RNA，所述免疫是通过注射人PCSK9抗原多肽实现的；

根据本发明的实施例，所述外周血单核细胞为淋巴细胞。免疫后澳洲羊驼的外周血淋巴细胞能够亲和PCSK9。

根据本发明的实施例，所述人PCSK9抗原多肽是通过将携带编码人PCSK9抗原多肽的基因的表达载体导入CHO细胞后获得的。

其中，编码人PCSK9抗原多肽的基因具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

GTACAAAAAAGCAGAAGGGCCGTCAAGGCCCACCATGGGCACCGTCAGCTCCAGGCGGTCCTGGTGGCCGCTGCCACTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGGGTCCCGCGGGCGCCCGTGCGCAGGAGGACGAGGACGGCGACTACGAGGAGCTGGTGCTAGCCTTGCGTTCCGAGGAGGACGGCCTGGCCGAAGCACCCGAGCACGGAACCACAGCCACCTTCCACCGCTGCGCCAAGGATCCGTGGAGGTTGCCTGGCACCTACGTGGTGGTGCTGAAGGAGGAGACCCACCTCTCGCAGTCAGAGCGCACTGCCCGCCGCCTGCAGGCCCAGGCTGCCCGCCGGGGATACCTCACCAAGATCCTGCATGTCTTCCATGGCCTTCTTCCTGGCTTCCTGGTGAAGATGAGTGGCGACCTGCTGGAGCTGGCCTTGAAGTTGCCCCATGTCGACTACATCGAGGAGGACTCCTCTGTCTTTGCCCAGAGCATCCCGTGGAACCTGGAGCGGATTACCCCTCCACGGTACCGGGCGGATGAATACCAGCCCCCCGACGGAGGCAGCCTGGTGGAGGTGTATCTCCTAGACACCAGCATACAGAGTGACCACCGGGAAATCGAGGGCAGGGTCATGGTCACCGACTTCGAGAATGTGCCCGAGGAGGACGGGACCCGCTTCCACAGACAGGCCAGCAAGTGTGACAGTCATGGCACCCACCTGGCAGGGGTGGTCAGCGGCCGGGATGCCGGCGTGGCCAAGGGTGCCAGCATGCGCAGCCTGCGCGTGCTCAACTGCCAAGGGAAGGGCACGGTTAGCGGCACCCTCATAGGCCTGGAGTTTATTCGGAAAAGCCAGCTGGTCCAGCCTGTGGGGCCACTGGTGGTGCTGCTGCCCCTGGCGGGTGGGTACAGCCGCGTCCTCAACGCCGCCTGCCAGCGCCTGGCGAGGGCTGGGGTCGTGCTGGTCACCGCTGCCGGCAACTTCCGGGACGATGCCTGCCTCTACTCCCCAGCCTCAGCTCCCGAGGTCATCACAGTTGGGGCCACCAATGCCCAAGACCAGCCGGTGACCCTGGGGACTTTGGGGACCAACTTTGGCCGCTGTGTGGACCTCTTTGCCCCAGGGGAGGACATCATTGGTGCCTCCAGCGACTGCAGCACCTGCTTTGTGTCACAGAGTGGGACATCACAGGCTGCTGCCCACGTGGCTGGCATTGCAGCCATGATGCTGTCTGCCGAGCCGGAGCTCACCCTGGCCGAGTTGAGGCAGAGACTGATCCACTTCTCTGCCAAAGATGTCATCAATGAGGCCTGGTTCCCTGAGGACCAGCGGGTACTGACCCCCAACCTGGTGGCCGCCCTGCCCCCCAGCACCCATGGGGCAGGTTGGCAGCTGTTTTGCAGGACTGTATGGTCAGCACACTCGGGGCCTACACGGATGGCCACAGCCGTCGCCCGCTGCGCCCCAGATGAGGAGCTGCTGAGCTGCTCCAGTTTCTCCAGGAGTGGGAAGCGGCGGGGCGAGCGCATGGAGGCCCAAGGGGGCAAGCTGGTCTGCCGGGCCCACAACGCTTTTGGGGGTGAGGGTGTCTACGCCATTGCCAGGTGCTGCCTGCTACCCCAGGCCAACTGCAGCGTCCACACAGCTCCACCAGCTGAGGCCAGCATGGGGACCCGTGTCCACTGCCACCAACAGGGCCACGTCCTCACAGGCTGCAGCTCCCACTGGGAGGTGGAGGACCTTGGCACCCACAAGCCGCCTGTGCTGAGGCCACGAGGTCAGCCCAACCAGTGCGTGGGCCACAGGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGCTGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTCAGGAGCAGGTGACCGTGGCCTGCGAGGAGGGCTGGACCCTGACTGGCTGCAGTGCCCTCCCTGGGACCTCCCACGTCCTGGGGGCCTACGCCGTAGACAACACGTGTGTAGTCAGGAGCCGGGACGTCAGCACTACAGGCAGCACCAGCGAAGGGGCCGTGACAGCCGTTGCCATCTGCTGCCGGAGCCGGCACCTGGCGCAGGCCTCCCAGGAGCTCCAGTAGGGCCTCATGGGCCCAGCTTTCTTGTAC(SEQ ID NO:17)。

进而从CHO细胞中可纯化获得大量人PCSK9抗原多肽，大大的提高了有效抗体的获得率。

根据本发明的实施例，所述免疫的次数为4。在4次免疫结束后，采用ELISA法，检测血清中有针对PCSK9的抗体的富集，且经过4次免疫后，TRPV3有效刺激羊驼产生了特异性的抗体。

S200:利用Nest-PCR技术克隆VHH区，并将克隆产物插入噬菌体，以便获得噬菌体展示库，所述噬菌体展示库表达PCSK9抗体VHH区；

根据本发明的实施例，所述利用Nest-PCR技术克隆VHH区是通过如下方式实现的：

(1)对所述外周血淋巴细胞总RNA进行反转录，以便获得cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，以具有SEQ ID NO:10～13所示核苷酸序列的引物为第一轮引物，进行第一轮Nest-PCR，以具有SEQ ID NO:14～15所示核苷酸序列的引物为第二轮引物，进行第二轮Nest-PCR；以及

(3)对Nest-PCR产物进回收纯化处理，以便获得所述克隆产物。

GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(SEQ ID NO:10)。

GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO:11)。

TGGTGGCAGGTCCCCAAGGT(SEQ ID NO:12)。

TTCTTGGTGGCAGTAGCCGCAGT(SEQ ID NO:13)。

GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO:14)。

CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO:15)。

S300:利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库，以便获得所述纳米抗体，

根据本发明的实施例，所述利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库是通过如下方式实现的：将所述噬菌体展示库与PCSK9抗原进行孵育、淘洗处理，以便获得PCSK9纳米抗体噬菌体库；以及对所述PCSK9纳米抗体噬菌体库进行序列分析，以便获得所述纳米抗体的编码基因，其中，所述PCSK9抗原具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:16)。

进而通过生物淘选(bio-panning)，即将插入噬菌体衣壳蛋白基因中PCSK9纳米抗体的VHH文库，在噬菌体表面融合表达出来，再利用抗原抗体的特异性亲和作用来筛选具有结合活性的噬菌体株。上述方法将PCSK9纳米抗体的表型和基因型统一起来，通过表型的筛选就能获得相应PCSK9纳米抗体的编码基因信息。

根据本发明的实施例，所述序列分析是通过sanger测序实现的。进而序列分析的准确率和效率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括将携带有纳米抗体的编码基因的构建体导入原核细胞进行诱导表达的步骤，以便获得所述纳米抗体。进而可将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量的表达和纯化，并可对所获得的纳米抗体的亲和力进行进一步验证。

根据本发明的再一具体实施例，所述原核细胞为HB2151。

根据本发明的再一具体实施例，所述构建体的载体为pMECS。pMECS在HA标签和M13GIII基因之间为琥珀终止子(TAG)，普通的表达系统不能有效识别该终止子，从而有效表达纳米抗体蛋白，纳米抗体的表达效率进一步提高。

利用根据本发明实施例的上述方法将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)容易对库容量较大的文库进行筛选，操作简单，通量高； (2)可获得一些自然界不存在，但能与抗原高亲和结合的抗体；(3)抗体分子可以通过噬菌体的增殖而扩增，操作方便，实验成本低；(4)由生物体转录翻译产生的抗体具有生物活性，无需纯化可达到70％-94％的纯度。所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性的优势。

根据本发明的实施例，发明人利用CHO细胞表达的PCSK9抗原免疫骆驼，分离免疫后的骆驼PBMC细胞，从中扩增出针对PCSK9抗原的VHH文库，删除了多余的背景干扰，大大的提高了有效抗体的获得效率。进一步结合使用了噬菌体展示技术，能够比较直观的获得抗体亲和信息，在较短时间内获得了高亲和力的PCSK9的纳米抗体基因。此外，本发明还提供了上述PCSK9纳米抗体的制备方案，由于pMECS在HA标签和M13GIII基因之间为琥珀终止子(TAG)，普通的表达系统不能有效识别该终止子，从而有效表达纳米抗体蛋白。本发明优化了原核表达系统，对PCSK9纳米抗体进行了大量表达和纯化，该纳米抗体经ELISA和ProteOn系统验证具有靶向PCSK9的高特异性和高亲和性，表明本发明得到的PCSK9纳米抗体具有继续开发价值。

需要说明的是，根据本发明实施例的纳米抗体及其用途和制备方法、编码所述纳米堕胎的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才发现和完成的。

下面将结合实施例进一步对本发明的方案进行解释。如前所述，本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

以下实施例的方法可概括如下：采用CHO细胞中表达的PCSK9抗原免疫骆驼，采集免疫后的骆驼的外周血细胞，分离外周血单核细胞(PBMC)，提取总RNA，采用Nest-PCR 技术克隆骆驼重链抗体的V区，将其插入到噬菌体质粒中，构建噬菌体表达文库，接着通过噬菌体展示技术对PCSK9抗原进行多轮筛选，最后将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量表达纯化，并经过ELISA和ProteOn对所获得的纳米抗体的亲和力和结合常数进行验证。

下面详细描述本发明PCSK9纳米抗体的制备过程：

实施例1 PCSK9纳米抗体噬菌体展示文库构建；

(1)PCSK9免疫骆驼

将1mg的PCSK9与等体积的弗氏佐剂混合至5ml，注射于骆驼颈部皮下3-5点，免疫前从骆驼的耳缘静脉采血。每月免疫一次，共免疫注射4次；每次免疫时，采取骆驼外周血10ml。采血时将骆驼头向一侧固定，对动物采血部位的皮肤先剃毛(拔毛)，75％酒精消毒，待干燥后采血，用手指压迫颈静脉沟处，待血管怒张后，于采血部位消毒进针采血，采集血液10ml于15mlEDTA抗凝管中，立即连续、缓慢摇动，充分混合，置于冰上，运回实验室。

(2)血液淋巴细胞样品分离

对免疫前和每次免疫后采集的血液样本分离淋巴细胞，分离方法如下：

i.在15ml离心管中加入7ml淋巴细胞分离液Ficoll；

ii.在已加入抗凝剂(EDTA)的新鲜全血中加入等体积PBS(1×)或生理盐水，充分混匀；

iii.取加淋巴细胞分离液的15ml离心管，小心地缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的15ml离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上(即两种液体不要混合，保留清晰的界面)，3000g离心20min；

iv.用1ml移液枪将上清(血浆样品)小心转移到1.5ml细胞冻存管中，写上动物编号和血浆字样，放入带绳小布袋中，置液氮罐保存。

v.用1ml移液枪小心分离出白细胞层到一个15ml离心管中；加满PBS(1×)到15ml；用PBS(1×)清洗白细胞，离心(3000g离心20min)，小心倾倒掉上清，不要搅动管底的细胞团块，回收白细胞在剩余0.1-0.2ml PBS中。

vi.加5倍体积的RNA later，轻轻混溶细胞团块，分成2份到1.5ml细胞冻存管中，置液氮罐保存。

(3)总RNA提取，cDNA合成

取一份冻存的淋巴细胞，加入1ml Trizol，室温静置10min后，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，室温静置，待溶液分层(约10min)，12,000rpm离心后，收集上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，待核酸沉淀，高速离心去上清，RNA沉淀加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)进行洗涤，高速离心去上清，控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μl用于浓度和纯度测定。

取1μg RNA，采用SuperScript^TMIII First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)试剂盒进行cDNA合成，逆转录引物用Oligo dT，合成cDNA在-20℃冻存；

(4)噬菌体展示文库构建

PCR扩增：

以上述合成的cDNA为模板，采用Nest-PCR扩增骆驼重链抗体的V区(VHH)，表1为Nest-PCR引物的名称及序列。

表1：骆驼VHH片段扩增使用的引物信息

PCR反应条件如下：

第一轮

反应条件：95℃,5min；94℃，1min；57℃,1min；72℃,1min per cycle；72℃,7min；扩增 35cycles

第二轮

反应条件：95℃,5min；94℃,45’；60℃,45’；72℃,45’per cycle；72℃,7min；扩增25cycles

PCR反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，图1为nest-PCR的电泳结果，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，切胶回收目的条带，进行第二轮PCR，目的基因片段在500bp处，切胶回收目的条带，即VHH片段；

用NEB的限制性内切酶NotI和PstI分别对VHH片段和载体进行双酶切，反应体系如下：

载体酶切体系：

加H₂O至500μl；

片段酶切体系：

加H₂O至500μl；

37℃，酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收；将载体和VHH片段的酶切产物混合，用NEB的连接酶在16℃连接过夜；

(5)噬菌体展示库的构建

连接产物经PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化后，取1μl转化TG感受态细胞，37℃ 复苏2h，梯度稀释至10¹，10²，10³，分别取300μL涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数，约10⁵个克隆/平板。

采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到10⁷以上。将所有克隆用 LB洗脱下，5,000g，离心5min，沉淀用2ml LB悬浮，加入等体积的30％甘油，-80冻存。

(6)文库多样性检测：

随机挑取(5)的克隆30个，作为模板，进行克隆PCR反应，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，如图2所示，构建的PCSK9纳米抗体文库的重组率为100％。然后对其测序，分析PCSK9纳米抗体文库的多样性，测序结果显示，15个单克隆有13种氨基酸序列，表明构建的文库有较好的多样性。

(7)噬菌体扩增和拯救

采用辅助噬菌体对PCSK9纳米抗体的噬菌体库进行扩增和拯救。将(5)保存的单克隆文库接入100ml培养基中培养至对数生长期，加入MOI为20的辅助噬菌体，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300ml培养基中，培养过夜。次日，3,000离心30min，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置30min，3,000离心30min，沉淀为PCSK9纳米抗体噬菌体库，用PBS悬浮沉淀后，测定其滴度为2.9X 10¹²pfu/ml。

实施例2用噬菌体展示技术淘洗PCSK9纳米抗体抗体

(1)亲和PCSK9纳米抗体噬菌体库淘洗

取100ng PCSK9抗原包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，加入拯救出的PCSK9纳米抗体噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗孔10次，加入100μl三乙胺，室温，孵育30min，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的PCSK9纳米抗体噬菌体库；取10μl感染TG细胞涂布平板，用于测定筛选后的克隆数测定，剩余筛选后的噬菌体的用于扩增。

(2)筛选后噬菌体的扩增和拯救

扩增和拯救方法同实施例1(7)，获得的PBS悬浮液即扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选；按上述相同筛选步骤，逐次递减抗原量，筛选3-4轮。

(3)ELISA评价特异性抗体的富集程度

ELISA板包被100ng的PCSK9抗原，4℃，过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；实验组分别加入每轮淘洗后扩增的噬菌体，对照组加入等量野生型的噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗10次，以去除没有结合的噬菌体；加入HRP标记的抗M13抗体，室温孵育1h；加入显色液，避光反应10-30min，测吸光值，吸光值随着淘洗次数逐渐上升，并在第三轮到第四轮淘洗时趋于稳定，表明特异性的抗体得到了富集。

(4)鉴定PCSK9特异性的纳米抗体阳性克隆

ELISA板包被100ng的PCSK9抗原，4℃孵育过夜；取最后一轮筛选获得的噬菌体涂布的平板，随机挑取38个单克隆于1ml培养基中，37℃，培养至对数期，加入1mM IPTG诱导过夜；次日，离心收集菌沉，破碎后，5,000g离心15min，收集上清；同时取ELISA板，加 2％的BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆破碎上清，对照组加入空白TG破碎上清，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值；当吸光值与对照孔比值大于2.1(Base line)时，判定为阳性克隆；ELISA验证结果显示，获得30个阳性克隆(图3)；

(5)阳性克隆序列分析

提取(4)中获得的30个阳性克隆的DNA对插入片段进行PCR验证，如图4所示，经PCR验证为阳性的克隆进行测序分析。测序结果显示，获得两种核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中一种序列具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4) 和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这株纳米抗体单克隆的核苷酸和氨基酸序列如下：

核苷酸序列：

5’-GAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGTGTCTGGATACACCTACAGTAGCAATTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCACGAGGGGGTCGCATCTATTTATATTGGTGGTGGTAGCACATACTATGC CGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGT ATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGTCGGATGTCAGGGCTTAGTTGACTTTGGTTACTGGGACCAGGGGACCCAGGTCACCGTCT CCTCA-3’(SEQ ID NO:9)。

氨基酸序列：

框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：

FR1为ESGGGSVQAGGSLRLSCTVS(SEQ ID NO:2)，

FR2为MGWFRQAPGKEHEGVAS(SEQ ID NO:3)，

FR3为YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO:4)，

FR4为WDQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)，

CDR1为GYTYSSNC(SEQ ID NO:6)，

CDR 2的序列为IYIGGGST(SEQ ID NO:7)，

CDR 3的序列为AVGCQGLVDFGY(SEQ ID NO:8)。

实施例3 PCSK9纳米抗体的诱导表达和纯化

(1)PCSK9纳米抗体表达菌构建

首先将PCSK9纳米抗体单克隆转接培养基，37℃，过夜培养；次日，用Plasmid Mini Kit I(OMEGA)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳并测定浓度后，将含有PCSK9纳米抗体序列的质粒转化入表达菌HB2151中，涂布平板，37℃，培养过夜。

(2)PCSK9纳米抗体的诱导表达

次日，从平板挑取5个克隆进行clone PCR验证质粒是否转入表达菌株；挑取阳性克隆 37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG进行诱导表达。离心菌液，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体，离心收集破碎后的菌体上清。

(3)PCSK9纳米抗体的纯化

通过Ni柱亲和纯化获得PCSK9纳米抗体。Ni柱先用超纯水清洗，然后用裂解液清洗；将上述PCSK9纳米抗体表达菌的破碎上清以1ml/min的流速加入Ni柱；用5倍柱体积的亲和A 液(20mM咪唑)洗去杂蛋白，再用等体积的亲和B液(250mM咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液；最后15％的SDS-PAGE监测PCSK9纳米抗体的表达和纯化情况(图5)。

实施例4PCSK9纳米抗体的亲和力测定

(1)ELISA法分析PCSK9纳米抗体抗体的亲和力

实验组以100ng的PCSK9蛋白，对照组用未诱导的质粒表达的蛋白和BSA包被酶标板， 4℃孵育过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；取纯化的PCSK9纳米抗体分别加入对照组和实验组，空白组加入PBS，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温 1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值。ELISA检测结果(图6)显示，PCSK9纳米抗体对PCSK9具有较好的亲和力，结合活性远远高于对照组。

(2)ProteOn分析PCSK9纳米抗体的结合常数

活化芯片后，加入500nM的PCSK9抗原进行反应；加入150μl的1M乙醇胺盐酸洗掉残留的活性羧基基团；将PCSK9纳米抗体进行梯度稀释后加入360μl，速率为25μl/min，结合120s，解离400s；获得数据后，进行结果处理，结果显示，纳米抗体与抗原PCSK9相互作用的参数分别是，K_a(1/Ms)为4.49E+03，K_d(1/s)为1.12E-04，R_max(RU)为322.52，表示抗体的结合位点被抗原占领时的信号强度，K_D(M)为2.50E-08为抗原抗体相互作用的解离常数，表明PCSK9纳米抗体与PCSK9抗原的相互作用良好，具有继续开发的价值。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 纳米抗体及其制备方法

<130> PIDC3173845

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 纳米抗体的氨基酸序列

<400> 1

Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Met Gly Trp Phe

20 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu His Glu Gly Val Ala Ser Ile Tyr Ile

35 40 45

Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser

65 70 75 80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Cys Gln

85 90 95

Gly Leu Val Asp Phe Gly Tyr Trp Asp Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区1的氨基酸序列

<400> 2

Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Thr Val Ser

20

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区2的氨基酸序列

<400> 3

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu His Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ser

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区3的氨基酸序列

<400> 4

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区4的氨基酸序列

<400> 5

Trp Asp Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区1的氨基酸序列

<400> 6

Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区2的氨基酸序列

<400> 7

Ile Tyr Ile Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区3的氨基酸序列

<400> 8

Ala Val Gly Cys Gln Gly Leu Val Asp Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 342

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗体的核酸的核苷酸序列

<400> 9

gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg tacagtgtct 60

ggatacacct acagtagcaa ttgcatgggc tggttccgcc aggctccagg gaaggagcac 120

gagggggtcg catctattta tattggtggt ggtagcacat actatgccga ctccgtgaag 180

ggccgattca ccatctccca agacaacgcc aagaacacgg tgtatctgca aatgaacagc 240

ctgaaacctg aggacactgc catgtactac tgtgcggtcg gatgtcaggg cttagttgac 300

tttggttact gggaccaggg gacccaggtc accgtctcct ca 342

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 10

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 11

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 12

tggtggcagg tccccaaggt 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 13

ttcttggtgg cagtagccgc agt 23

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第二轮Nest-PCR引物

<400> 14

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第二轮Nest-PCR引物

<400> 15

ctagtgcggc cgctggagac ggtgacctgg gt 32

<210> 16

<211> 692

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PCSK9抗原的氨基酸序列

<400> 16

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

<210> 17

<211> 2140

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码人PCSK9抗原多肽的基因的核苷酸序列

<400> 17

gtacaaaaaa gcagaagggc cgtcaaggcc caccatgggc accgtcagct ccaggcggtc 60

ctggtggccg ctgccactgc tgctgctgct gctgctgctc ctgggtcccg cgggcgcccg 120

tgcgcaggag gacgaggacg gcgactacga ggagctggtg ctagccttgc gttccgagga 180

ggacggcctg gccgaagcac ccgagcacgg aaccacagcc accttccacc gctgcgccaa 240

ggatccgtgg aggttgcctg gcacctacgt ggtggtgctg aaggaggaga cccacctctc 300

gcagtcagag cgcactgccc gccgcctgca ggcccaggct gcccgccggg gatacctcac 360

caagatcctg catgtcttcc atggccttct tcctggcttc ctggtgaaga tgagtggcga 420

cctgctggag ctggccttga agttgcccca tgtcgactac atcgaggagg actcctctgt 480

ctttgcccag agcatcccgt ggaacctgga gcggattacc cctccacggt accgggcgga 540

tgaataccag ccccccgacg gaggcagcct ggtggaggtg tatctcctag acaccagcat 600

acagagtgac caccgggaaa tcgagggcag ggtcatggtc accgacttcg agaatgtgcc 660

cgaggaggac gggacccgct tccacagaca ggccagcaag tgtgacagtc atggcaccca 720

cctggcaggg gtggtcagcg gccgggatgc cggcgtggcc aagggtgcca gcatgcgcag 780

cctgcgcgtg ctcaactgcc aagggaaggg cacggttagc ggcaccctca taggcctgga 840

gtttattcgg aaaagccagc tggtccagcc tgtggggcca ctggtggtgc tgctgcccct 900

ggcgggtggg tacagccgcg tcctcaacgc cgcctgccag cgcctggcga gggctggggt 960

cgtgctggtc accgctgccg gcaacttccg ggacgatgcc tgcctctact ccccagcctc 1020

agctcccgag gtcatcacag ttggggccac caatgcccaa gaccagccgg tgaccctggg 1080

gactttgggg accaactttg gccgctgtgt ggacctcttt gccccagggg aggacatcat 1140

tggtgcctcc agcgactgca gcacctgctt tgtgtcacag agtgggacat cacaggctgc 1200

tgcccacgtg gctggcattg cagccatgat gctgtctgcc gagccggagc tcaccctggc 1260

cgagttgagg cagagactga tccacttctc tgccaaagat gtcatcaatg aggcctggtt 1320

ccctgaggac cagcgggtac tgacccccaa cctggtggcc gccctgcccc ccagcaccca 1380

tggggcaggt tggcagctgt tttgcaggac tgtatggtca gcacactcgg ggcctacacg 1440

gatggccaca gccgtcgccc gctgcgcccc agatgaggag ctgctgagct gctccagttt 1500

ctccaggagt gggaagcggc ggggcgagcg catggaggcc caagggggca agctggtctg 1560

ccgggcccac aacgcttttg ggggtgaggg tgtctacgcc attgccaggt gctgcctgct 1620

accccaggcc aactgcagcg tccacacagc tccaccagct gaggccagca tggggacccg 1680

tgtccactgc caccaacagg gccacgtcct cacaggctgc agctcccact gggaggtgga 1740

ggaccttggc acccacaagc cgcctgtgct gaggccacga ggtcagccca accagtgcgt 1800

gggccacagg gaggccagca tccacgcttc ctgctgccat gccccaggtc tggaatgcaa 1860

agtcaaggag catggaatcc cggcccctca ggagcaggtg accgtggcct gcgaggaggg 1920

ctggaccctg actggctgca gtgccctccc tgggacctcc cacgtcctgg gggcctacgc 1980

cgtagacaac acgtgtgtag tcaggagccg ggacgtcagc actacaggca gcaccagcga 2040

aggggccgtg acagccgttg ccatctgctg ccggagccgg cacctggcgc aggcctccca 2100

ggagctccag tagggcctca tgggcccagc tttcttgtac 2140

Claims

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述抗体：

(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或

(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQID NO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸为：

编码权利要求1～2任一项所述抗体的核酸或其互补序列，

优选地，所述核酸具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

4.一种核酸构建体，其特征在于，包含：

编码序列，所述编码序列为权利要求3所述的核酸，以及

可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。

5.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4所述的核酸构建体。

6.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体包含权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的核酸构建体、权利要求5所述的表达载体或表达权利要求1～2任一项所述的纳米抗体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求4所述的核酸构建体或权利要求5所述的表达载体，

可选地，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得，

任选地，所述宿主细胞为原核细胞；

任选地，所述原核细胞为HB2151。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括：

权利要求1～2任一项所述的纳米抗体；以及

药学上可接受的佐剂。

9.权利要求1～2任一项所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗PCSK9相关性疾病，

任选地，所述PCSK9相关性疾病为脑血管疾病、高胆固醇血症、冠心病或急性冠状动脉综合症。

10.一种制备权利要求1～2任一项所述纳米抗体的方法，其特征在于，包括：

分别采集免疫前和免疫后澳洲羊驼的外周血单核细胞，并提取所述外周血单核细胞总RNA，所述免疫是通过注射人PCSK9抗原多肽实现的；

利用Nest-PCR技术克隆VHH区，并将克隆产物插入噬菌体，以便获得噬菌体展示库，所述噬菌体展示库表达PCSK9抗体VHH区；以及

利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库，以便获得所述纳米抗体，

任选地，所述外周血单核细胞为淋巴细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述人PCSK9抗原多肽是通过将携带编码人PCSK9抗原多肽的基因的表达载体导入CHO细胞后获得的，

任选地，所述免疫的次数为4。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述利用Nest-PCR技术克隆VHH区是通过如下方式实现的：

(1)对所述外周血淋巴细胞总RNA进行反转录，以便获得cDNA；

(3)对Nest-PCR产物进回收纯化处理，以便获得所述克隆产物。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库是通过如下方式实现的：

将所述噬菌体展示库与PCSK9抗原进行孵育、淘洗处理，以便获得PCSK9纳米抗体噬菌体库；以及

对所述PCSK9纳米抗体噬菌体库进行序列分析，以便获得所述纳米抗体的编码基因，

其中，所述PCSK9抗原具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，

任选地，所述序列分析是通过sanger测序实现的。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，进一步包括将携带有纳米抗体的编码基因的构建体导入原核细胞进行诱导表达的步骤，以便获得所述纳米抗体，

任选地，所述原核细胞为HB2151；

任选地，所述构建体的载体为pMECS。