TW202043267A - TGFβ之LTBP複合物專一性抑制劑及其用途 - Google Patents

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史特凡 瓦韋西克
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Abstract

本文揭示選擇性結合LTBP1-TGFβ及/或LTBP3-TGFβ之複合物的抑制劑，諸如抗體及其抗原結合部分。本申請案亦提供使用此等抑制劑例如抑制TGFβ活化及治療罹患TGFβ相關病症(諸如纖維化病況)之個體的方法。亦提供為有需要之個體選擇情形依賴性或情形非依賴性同功型專一性TGFβ抑制劑之方法。

Description

TGFβ之LTBP複合物專一性抑制劑及其用途
本發明係關於TGFβ之LTBP複合物專一性抑制劑及其用途。
生長因子之轉形生長因子β (Transforming growth factor beta，TGFβ)超家族與調節不同生物過程之多種信號傳導級聯有關，該等生物過程包括但不限於：抑制細胞生長、組織內穩定、胞外基質(extracellular matrix，ECM)重塑、內皮細胞至間葉細胞轉化、細胞遷移及侵入，及免疫調節/抑制，以及間葉細胞至上皮細胞轉化。相對於ECM重塑，TGFβ信號傳導可增加纖維母細胞群及ECM沈積(例如膠原蛋白)。在免疫系統中，TGFβ配位體調節T調節細胞功能及免疫前驅體細胞生長及內穩定之維持。在正常上皮細胞中，TGFβ為細胞分化之強力生長抑制劑及促進劑。然而，隨著腫瘤發展及進展，其經常失去其對TGFβ之負性生長響應。在此情況中，TGFβ由於能夠刺激血管生成、改變基質環境及誘導局部及全身性免疫抑制而可變成腫瘤發展之促進劑。出於此等及其他原因，TGFβ已成為多種臨床適應症之治療目標。儘管許多群組迄今為止做出許多努力，但TGFβ治療劑之臨床開發仍具有挑戰性。
來自臨床前研究(包括在大鼠及犬中)之觀測結果已揭露與活體內TGFβ之抑制相關之某些毒性。此外，儘管迄今為止已開發出若干TGFβ抑制劑，但由於副作用或毒性風險已停止靶向TGFβ之大部分臨床程式。
舉例而言，Anderton等人(Toxicology Pathology, 39: 916-24, 2011)報導，I型TGFβ (ALK5)受體之小分子抑制劑誘導心臟瓣膜病變，其特徵為臨床前動物模型中之瓣膜間質性細胞之出血、發炎、退化及增殖。在所有所測試劑量下在所有心臟瓣膜中觀測到毒性。Frazier等人(Toxicology Pathology, 35: 284-295, 2007)報導投與I型TGFβ (ALK5)受體GW788388之小分子抑制劑誘導大鼠之生長發育不良。
Stauber等人(J. Clin. Practice 4:3, 2014)報導持續(≥3個月)投與TGFβ受體I激酶抑制劑LY2157299 (其經研究用於某些癌症治療)在大鼠及犬中引起涉及心血管、腸胃、免疫、骨/軟骨、生殖及腎系統之多個器官毒性。
已報導在食蟹獼猴研究中多次投與之後，福萊索單抗(fresolimumab) (GC1008) (能夠中和TGFβ之所有人類同功型的「泛」TGFβ抗體)誘導齒齦、膀胱及鼻甲骨上皮之上皮細胞增殖(Lonning等人, Current Pharmaceutical Biotechnology 12: 2176-89, 2011)。類似地，已在投與多次劑量之藥物之後在臨床試驗中報導各種皮膚皮疹/病變、牙齦出血及疲勞。對福萊索單抗之最顯著不良反應包括誘導人類癌症患者中之皮膚角質棘皮瘤及/或鱗狀細胞癌(參見例如：Lacouture等人, 2015, Cancer Immunol Immunother, 64: 437-46；Stevenson等人, 2013, OncoImmunology, 2:8, e26218；及Lonning等人, 2011)。來自臨床試驗之額外證據表明，在一些情況下，此抗體可促進腫瘤進展(Stevenson等人, 2013, OncoImmunology, 2:8, e26218)。
因此，需要用於調節TGFβ信號傳導之新穎方法及組合物，其可用以有效且安全地治療涉及TGFβ之疾病及病症，包括例如癌症、纖維化及發炎。
隨著對與TGFβ之廣泛抑制相關之潛在危險不良作用的認識日益增加，許多群組最近已轉向鑑別靶向同功型之一 小類而非全部且仍保留足夠功效之抑制劑。舉例而言，WO 2016/161410揭示結合TGFβ1與TGFβ2 (亦即TGFβ1/2抑制劑)之中和抗體。WO 2006/116002提供結合TGFβ1與TGFβ3 (亦即TGFβ1/3抑制劑)，但優先結合於前者之中和抗體。除傳統單株抗體以外，一些群組還開發充當所謂的「配位體捕獲劑」 (參見例如WO 2018/158727、WO 2018029367及WO 2018129331)的經工程改造之融合蛋白，其中至少一些可對TGFβ1/3具有選擇性。另一類TGFβ1/3抑制劑包括α-V (αν)整合素，諸如針對ανβ6之抗體，其為已知活化TGFβ1及TGFβ3兩者(亦即TGFβ1/3)之整合素的抑制劑。然而，其他群組仍繼續採取抑制全部三種同功型(亦即TGFβ1/2/3或泛抑制劑)之「較好」泛抑制劑(參見例如WO 2018/134681)。
然而，自功效立場來看，本領域之盛行觀點仍為抑制TGFβ之多種同功型以獲得治療效果為有利的，且為接納此觀點，提出將藉由「謹慎的給藥方案」之毒性管理作為解決方案(Brennan等人. (2018) mAbs, 10:1, 1-17)。
最近，申請人描述在動物模型中證實為安全且有效之同功型選擇性TGFβ1抑制劑(參見例如WO 2017/156500及WO 2018/129329，以引用之方式併入)，支持選擇性靶向TGFβ1同功型，與廣泛地拮抗所有TGFβ同功型相反之概念可提供實現功效及可接受之毒性的有利方法。
儘管藉由在活體內顯示有效之劑量下選擇性抑制TGFβ1所達成的觀察到之安全概況為開發用於臨床應用之TGFβ1抑制劑的有前景的步驟，但鑑別能夠選擇性地影響所定義之TGFβ1之一小類作用的TGFβ1抑制劑(例如對LTBP呈遞複合物具有選擇性之TGFβ抑制劑)仍然難以理解。近年來，申請人證明，此類「LTBP情形專一性」抑制劑可使用先前由申請人描述之方法(參見例如WO 2014/074532及WO 2014/182676)產生(WO 2019/023661，以引用之方式併入本文中)。然而，前述國際公開案中所述之LTBP選擇性TGFβ1抑制劑顯示出適度親和力及抑制性活性，以及次佳之跨物種反應性。
本發明提供經改良之能夠選擇性靶向基質相關前TGFβ複合物，諸如LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1之TGFβ抑制劑。
此等抑制劑以高親和力(至少奈莫耳濃度範圍)結合及抑制LTBP1-及/或LTBP3呈遞之前TGFβ，但不結合及抑制免疫細胞相關之TGFβ，例如GARP-及/或LRRC33呈遞之前TGFβ1，或結合低於有意義的含量(例如LTBP複合物比GARP或LRRC33複合物高至少50倍親和力)。因此，此等抑制劑可以情形依賴性方式選擇性抑制TGFβ之活化，使得其選擇性結合，由此抑制與ECM相關之TGFβ信號傳導軸。特定言之，本發明包括基質相關(例如LTBP1及/或LTBP3-相關) TGFβ活化之選擇性抑制劑。在一些實施例中，此類抑制劑專一性結合與LTBP1及/或LTBP3相關的TGFβ (例如前TGFβ1、前TGFβ2及/或前TGFβ3)之特定同功型，因此亦提供TGFβ同功型專一性。在一特定實施例中，此類抑制劑專一性結合於LTBP1/3-前TGFβ1。在本發明之實施例中之任一者中，此類抑制劑不抑制GARP及/或LRRC33介導之與免疫細胞功能相關之TGFβ1之活化。本發明所涵蓋之改良抗體在至少一個奈莫耳濃度範圍內(亦即1×10-9 M至10×10-9 M)具有對人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1之親和力。在一些實施例中，此類抗體亦在至少一個奈莫耳濃度範圍內(亦即1×10-9 M至10×10-9 M)具有對鼠類LTBP1-前TGFβ1及/或鼠類LTBP3-前TGFβ1之親和力。
用於不靶向調節T細胞上之GARP-前TGFβ1複合物之TGFβ1抑制劑之治療用途的基本原理為至少三部分：
首先，調節T細胞在維持對自身抗原之免疫耐受性及預防自體免疫疾病中起關鍵作用。由於Treg一般抑制、減弱或下調效應T細胞之誘導及增殖，因此，此功能之全身性抑制可藉由使通常由Treg細胞提供之「中斷」失能而引起宿主中之免疫反應過度活化或擴大。因此，本文中所採用之方法(例如未使Treg功能失能的TGFβ1抑制)旨在避開引發自體免疫之風險。此外，已具有產生過度敏感性免疫反應或自體免疫之傾向的患者可在不具有正常Treg功能之可用性的情況下尤其處於觸發或加重此類病況之風險下；且因此，選擇性靶向基質TGFβ1之抑制劑可有利地將此類風險降至最低。
第二，有證據表明Th17/Treg比率之變化引起促纖維變性Th17細胞介素失衡，其與諸如肝纖維化之纖維化的嚴重程度相關(參見例如Shoukry等人 (2017) J Immunol 198 (第1增刊): 197.12)。本發明人推論，TGFβ1功能之GARP臂的擾動可直接地或間接地加重纖維化病況。
第三，調節T細胞對於免疫內穩定及自體免疫之預防為必不可少的。據推論，特定言之，對於意欲用於長期或持續投與之TGFβ1抑制療法而言，期望避免在維持免疫內穩定方面源於正常Treg功能之擾動的潛在副作用(綜述於例如Richert-Spuhler及Lund (2015) Prog Mol Biol Transl Sci. 136: 217-243)。此策略至少部分地旨在保留尤其對於抗擊感染所需的正常免疫功能。
為此目的，本發明之發明人陳述產生選擇性靶向基質相關TGFβ1活化而非免疫細胞相關TGFβ1活化之TGFβ1的同功型專一性、情形選擇性抑制劑。
迄今為止存在之技術挑戰包括能夠辨別及選擇性調節存在於活體內各種情形(或「生態棲位」)中之TGFβ1之此等子集合受到限制。
在致力於解決此挑戰時，本發明人已鑑別出結合潛伏TGFβ1前結構域之同功型專一性單株抗體，其中沒有潛伏TGFβ2或TGFβ3之可偵測結合，且該等抗體在如本文所描述之情形依賴性下抑制活體外潛伏TGFβ1之整合素介導之活化。此類抗體之發現及表徵可能至少部分藉由TGFβ1活化之情形依賴性基於細胞之分析的發展來進行。在此新穎分析發展及驗證之過程中，證實如αVβ6整合素一樣，αVβ8亦可活化LTBP1-前TGFβ1。進一步證實，類似於LTBP1複合物，LTBP3-前TGFβ1可藉由αVβ6活化。此等分析中藉由篩選發現之抗體揭露僅在由LTBP1或LTBP3呈遞時結合且抑制TGFβ1之一類抗體。在免疫相關之TGFβ1呈遞子GARP及LRRC33之情形下，此類LTBP專一性抗體不抑制TGFβ1。此類抗體為用於治療病症(包括例如纖維化病況)之治療性候選物，且可允許將避免TGFβ相關免疫系統活化之持續給藥。本文亦提供選擇情形專一性或情形非依賴性TGFβ1抑制劑用於各種纖維化病況之方法。
因此，在一個態樣中，本發明提供同功型專一性TGFβ抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物，其中KD ≤50 nM。在一個實施例中，本發明提供同功型專一性TGFβ抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物，其中KD ≤25 nM。在一個實施例中，本發明提供同功型專一性TGFβ抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物，其中KD ≤10 nM。在一個實施例中，本發明提供一種選擇性結合於LTBP1-前TGFβ1複合物及LTBP3-前TGFβ1複合物之分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分不結合於以下目標中之一或多者：(a)單獨LTBP1；(b)單獨前TGFβ1；(c) GARP-前TGFβ1複合物；及(d) LRRC33-前TGFβ1複合物。在另外的實施例中，本發明提供同功型專一性TGFβ抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物，其中KD ＜5 nM。
在一個態樣中，本發明提供胞外基質相關TGFβ活化之抑制劑，其選擇性結合LTBP1/3呈遞之前TGFβ潛伏複合物。在一個實施例中，抑制劑不抑制免疫細胞相關之TGFβ1活化，例如由活化GARP呈遞之前TGFβ1潛伏複合物產生的免疫細胞相關之TGFβ1活化。在例示性實施例中，抑制劑為抗體或其抗原結合部分。
在其他態樣中，本發明提供TGFβ抗體或其抗原結合片段，其特徵在於其選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段選擇性結合於LTBP1-TGFβ1。在一些實施例中，此類抗體結合人類與鼠類對應物。
在一個態樣中，本發明提供一種選擇性結合LTBP1-前TGFβ潛伏複合物及/或LTBP3-前TGFβ潛伏複合物，由此調節來自潛伏複合物的成熟TGFβ生長因子之釋放的分離抗體或其抗原結合部分，其中抗體或其抗原結合部分不單獨結合成熟TGFβ1或GARP-前TGFβ1潛伏複合物。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分不結合LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物。或者，在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分對LTBP1-前TGFβ1潛伏複合物具有專一性。在其他實施例中，抗體或其抗原結合部分對LTBP3-前TGFβ1潛伏複合物具有專一性。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物，其中解離常數(KD )為至少約10-8 M。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(Bio-Layer Interferometry，BLI))所量測，KD ＜50 nM。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＜10 nM。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＜50 nM。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＜10 nM。
本發明進一步提供抗體及其抗原結合片段，其選擇性結合LTBP1-前TGFβ複合物及/或LTBP3-前TGFβ複合物且具有一或多個其他有利特性。實際上，本發明人出人意料地發現可提供此類抗體，其以高親和力及有利地緩慢解離速率結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及人類LTBP3-前TGFβ複合物，同時其亦對小鼠LTBP1-前TGFβ複合物及小鼠LTBP3-前TGFβ複合物具有交叉反應性且不展示與人類GARP-前TGFβ複合物(或實際上與人類LRR33R-前TGFβ複合物)之顯著結合。
另外，本文所揭示之抗體(包括具有一或多個或甚至所有前述有利特性之抗體)在基於細胞之分析中展現對TGFβ1信號傳導之強力抑制，且在多個纖維化之動物模型中顯著減少纖維化之標記及TGFβ信號傳導。
因此，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜5 nM，且具有以下特性中之一或多者： i)對小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物具有交叉反應； ii)對小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物具有交叉反應性； iii)結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜10 nM； iv)結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜10 nM； v)結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中在相同分析條件下，KD 比結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍； vi)在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合； vii)在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與LRRC33-前TGFβ1複合物(例如人類LRRC33-前TGFβ1複合物)之可偵測結合。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(i)-(v)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(i)-(iv)及(vi)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(i)、(iii)及(v)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(ii)、(iv)及(v)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(i)、(iii)及(vi)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(ii)、(iv)及(vi)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(i)-(iii)及(v)，及視情況(vii)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有至少以上特性(i)-(iii)及(vi)，及視情況(vii)。
在一些較佳實施例中，抗體或抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜5 nM，且具有所有上述特性(i)-(vii)。
抗體或抗原結合片段可選擇性地結合LTBP1/3呈遞之前TGFβ潛伏複合物且抑制胞外基質相關TGFβ活化。
另外，TGFβ1活化之另一有利的同功型選擇性抑制劑可包括展現緩慢解離速率(亦即解離率，kOFF )之單株抗體(包括免疫球蛋白及其抗原結合片段或部分)。因此，本發明進一步基於這種認識，即諸如纖維化之慢性及進行性疾病之治療可能需要具有優良耐久性(其可反映在此類抗體之解離速率上)之抑制劑。
抗體對其抗原之親和力通常以平衡解離常數或KD 量測。以實驗方式量測之解離速率及結合速率(kOFF /kON )之比率可用於計算KD 值。kOFF 值表示抗體解離速率，其指示其與其抗原解離之快速程度，而kON 值表示抗體結合速率，其提供其結合於其抗原之快速程度。後者通常為濃度依賴性的，而前者為濃度非依賴性的。KD 值與抗體之濃度(特定實驗所需之抗體之量)相關且因此，KD 值越低(較低濃度)且因此抗體之親和力越高。關於參考抗體，較高親和力抗體可具有較低kOFF 速率、較高kON 速率或兩者。
kOFF 及kON 比率均促成特定抗體對其抗原之總體親和力，且各組分之相對重要性或影響可視抗體之作用機制而定。舉例而言，結合成熟生長因子(例如自潛伏複合物釋放之可溶性暫時TGFβ1配位體)之中和抗體必須與內源性高親和力受體競爭活體內配位體結合。因為配位體-受體相互作用為局部事件且因為配位體短時間存在，所以此類抗體必須能夠在配位體發現其細胞受體之前快速靶向且螯合可溶性生長因子，由此活化組織中之TGFβ1信號傳導路徑。因此，就強力的配位體-靶向中和抗體而言，能夠快速結合目標生長因子，亦即高結合速率(kON )可能尤其重要。
相比之下，申請人推論出，藉由防止成熟生長因子自潛伏複合物(「活化抑制劑」)活化(例如釋放)來抑制TGFβ1信號傳導之抗體可優先受益於在抗體與目標抗原(例如前TGFβ1複合物)接合後具有緩慢解離速率。不同於中和抗體，此類抗體不與細胞受體直接競爭；確切而言，其藉由靶向保持潛伏在組織環境內之非活性前驅體形式(例如潛伏前TGFβ1複合物)而在信號傳導上游起作用，從而搶先防止TGFβ1之活化。此類抗體可藉由防止成熟生長因子自潛伏複合物釋放而發揮其抑制活性。舉例而言，此類抗體可類似於「夾」起作用以將活性生長因子鎖定於前結構域籠型結構中以使其保持處於非活性(例如「潛伏」)狀態。實際上，結構分析，包括抗原決定基定位，提供對分子機制之洞察強調此等抗體阻斷TGFβ1活化之能力。就此而言，前結構域之潛伏期套索區域(Latency Lasso region)可為特別適用之目標。
在目標接合後，預期能夠保持結合於目標(例如自潛伏複合物極其緩慢解離)之抗體在達成優良活體內效能方面為有利的，因為效應及/或親合力之耐久性增強。基於此認識，本發明申請人試圖鑑別相較於先前所描述之抗體具有特別低之kOFF 值的TGFβ1之同功型選擇性活化抑制劑。因此，根據本發明，相較於快速結合速率(kON )，較佳抗體具有主要可歸因於緩慢解離速率(kOFF )之高親和力。因此，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜5 nM，且具有以下特性中之一或多者(其可為除上文闡述之特性(i)-(vii)中之一者或其組合以外的特性)： (viii)當結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物時，低解離速率(kOFF )≤ 5 x 10-4 (1/s) (例如如藉由適合之活體外結合/動力學分析，諸如藉由BLI，例如基於Octet之系統所量測)；及/或 (ix)當結合人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物時，長半結合時間(t½) ≥ 45分鐘(例如如藉由SPR所量測)。
在一些較佳實施例中，抗體或抗原結合片段包含以下六個CDR： a)包含胺基酸序列FTFRSYVMH之CDR-H1； b)包含胺基酸序列VISHEGS(X1 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中：X1 為L或G；及 c)包含胺基酸序列A(X1 )PRIAARRGGFG(X2 )之CDR-H3，其中：X1 為V、R或L；且X2 為Y、S或T； d)包含胺基酸序列TRS(X1 )G(X2 )ID(X3 )NYVQ之CDR-L1，其中，X1 為S或H；X2 為N、L、S或A；且X3 為N、D或Y； e)包含胺基酸序列ED(X1 )(X2 )RPS之CDR-L2，其中：X1 為N、F或A；且X2 為Q、I或V；及 f)包含胺基酸序列Q(X1 )YD(X2 )(X3 )(X4 )Q(X5 )VV之CDR-L3，其中：X1 為S或G；X2 為S、F、Y、D、H或W；X3 為N、D或S；X4 為N、A、L、E或T；且X5 為G、R、A或L。
在一些較佳實施例中，抗體或其抗原結合片段與具有如SEQ ID NO:318中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:319中所示之輕鏈可變區序列的抗體(例如Ab42)競爭或交叉競爭。該抗體可包含具有與SEQ ID NO:318至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:319至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些較佳實施例中，本文提供之抗體或其抗原結合片段可包含以下六個CDR (例如Ab42之CDR)： 包含胺基酸序列FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 166)之CDR-H1； 包含胺基酸序列VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 167)之CDR-H2； 包含胺基酸序列ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 168)之CDR-H3； 包含胺基酸序列TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 169)之CDR-L1； 包含胺基酸序列EDNQRPS (SEQ ID NO: 170)之CDR-L2；及 包含胺基酸序列QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 171)之CDR-L3。
抗體或抗原結合片段可進一步包含具有與SEQ ID NO:318至少95%一致(視情況至少98%一致)之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:319至少95%一致(視情況至少98%一致)之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些替代性實施例中，抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR： a)包含胺基酸序列GSIRSSSYYWG之CDR-H1； b)包含胺基酸序列SISYSATTYY之CDR-H2； c)包含胺基酸序列A(X1 )DPSYDS(X2 )AGM(X3 )V之CDR-H3，其中：X1 為S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q； d)包含胺基酸序列RAS(X1 )(X2 )IS(X3 )YLN之CDR-L1，其中：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y； e)包含胺基酸序列(X1 )AS(X2 )(X3 )QS之CDR-L2，其中：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R； f)包含胺基酸序列QQ(X1 )(X2 )D(X3 )P(X4 )T之CDR-L3，其中：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與具有如SEQ ID NO:360中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:361中所示之輕鏈可變區序列的抗體(例如Ab63)競爭或交叉競爭。該抗體可包含具有與SEQ ID NO:360至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:361至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
本文提供之抗體或其抗原結合片段可包含以下六個CDR (例如Ab63之CDR)： 包含胺基酸序列GSIRSSSYYWG (SEQ ID NO: 292)之CDR-H1； 包含胺基酸序列SISYSATTYY (SEQ ID NO: 293)之CDR-H2； 包含胺基酸序列AGDPSYDSIAGMQV (SEQ ID NO: 294)之CDR-H3； 包含胺基酸序列RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 295)之CDR-L1； 包含胺基酸序列AASNLQS (SEQ ID NO: 296)之CDR-L2；及 包含胺基酸序列QQSFDWPLT (SEQ ID NO: 297)之CDR-L3。
抗體或抗原結合片段可進一步包含具有與SEQ ID NO:360至少95%一致(視情況至少98%一致)之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:361至少95%一致(視情況至少98%一致)之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其用於治療個體之纖維化病症之方法中，其中抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中：a)纖維化病症包含慢性發炎；b)個體受益於免疫抑制；c)個體患有自體免疫疾病或處於患上自體免疫疾病之風險下；d)個體為同種異體移植的候選者或已接受同種異體移植；e)個體具有升高的Th17/Treg比率；及/或f)個體需要長期或持續投與TGFβ1抑制劑。在一些實施例中，個體患有代謝病症或處於患上代謝病症之風險下(且個體視情況為根據a)-f)中之一或多者的個體)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為同功型專一性LTBP1-前TGFβ1抑制劑及/或LTBP3-前TGFβ1抑制劑。
本文所提供之抗體或其抗原結合片段可用於治療個體之纖維化病症之方法中。纖維化病症可包含慢性發炎。個體可受益於免疫抑制。個體可患有自體免疫疾病或處於患上自體免疫疾病之風險下。個體可為同種異體移植的候選者或可已接受同種異體移植。
或者或另外，個體可具有升高之Th17/Treg比率。個體可需要長期或持續投與TGFβ1抑制劑。
或者或另外，個體可患有代謝病症或處於患上代謝病症之風險下。
在另一態樣中，本發明提供一種用於製成包含抗體或其抗原結合片段之組合物的方法，該抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中抗體或其抗原結合片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，該方法包含步驟i)提供包含LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之至少一種抗原，ii)選擇專一性結合步驟(i)之至少一種抗原的抗體或其抗原結合片段之第一集合，以便提供LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之專一性結合物；iii)選擇抑制TGFβ1之活化的抗體或其抗原結合片段之第二集合，以便產生TGFβ1活化之專一性抑制劑；iv)將存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中的抗體或其抗原結合片段調配成醫藥組合物，從而製成包含該抗體或其抗原結合片段之組合物。
在一個實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合GARP-前TGFβ1、LRRC33-前TGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-前TGFβ2、LRRC33-前TGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-前TGFβ3、LRRC33-前TGFβ3、成熟TGFβ3，或其任何組合)的步驟。在一個實施例中，方法進一步包含確定或確認步驟(ii)及/或(iii)中選擇之抗體或其抗原結合片段之同功型專一性的步驟。在一個實施例中，方法進一步包含選擇對人類及嚙齒動物抗原具有交叉反應性之抗體或其抗原結合片段的步驟。在一個實施例中，方法進一步包含產生抗體或其抗原結合片段之完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段之步驟，該抗體或其抗原結合片段存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中。
在一個實施例中，方法進一步包含使存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中之抗體或其抗原結合片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或其片段的步驟。在一個實施例中，親和力成熟/最佳化包含使抗體或其抗原結合片段(存在於抗體之第一集合及/或抗體之第二集合中)經受如本文所描述之輕鏈改組的步驟。在一個實施例中，親和力成熟/最佳化包含使抗體或其抗原結合片段(存在於抗體之第一、第二及/或第三集合中)經受如本文所描述之CDR H1/H2多樣化的步驟。在一個實施例中，親和力成熟/最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之CDR-H3突變誘發的步驟。在一個實施例中，親和力成熟/最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之輕鏈CDR突變誘發的步驟。在一個實施例中，親和力成熟/最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之輕鏈CDR L1/L2多樣化的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含確定抗體或其抗原結合片段自抗體之第一及/或第二集合對人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1之親和力的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞100 nM、＞50 nM、＞25 nM或＞10 nM)的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含確定抗體或其抗原結合片段自第一及/或第二集合對小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1之親和力的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞100 nM、＞50 nM或＞10 nM)的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其不結合小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1)的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含測定抗體或其抗原結合片段(自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合，如藉由如本文所描述之適合的基於功能性活體外細胞之分析(諸如caga分析)所量測)之IC50 的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之基於細胞之分析(諸如caga分析)所量測大於100 nM、50 nM、25 nM、10 nM或5 nM)的步驟。
在一些實施例中，方法包含自第一及/或第二集合、抗體或其抗原結合片段移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之內源性LTBP caga分析所量測大於50 nM或10 nM)的步驟。
在一些實施例中，方法包含自第一及/或第二集合、抗體或其抗原結合片段移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之人類LTBP過度表現caga分析所量測大於50 nM、25 nM或10 nM)的步驟。
在一些實施例中，方法包含自第一及/或第二集合、抗體或其抗原結合片段移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之鼠類LTBP過度表現caga分析所量測大於50 nM、25 nM、10 nM或5 nM)的步驟。
本發明涵蓋用於鑑別或選擇適用於治療用途之TGFβ1選擇性抑制劑的過程及方法，以及製成包含TGFβ1選擇性抑制劑之組合物的方法。在較佳實施例中，TGFβ1抑制劑(例如所選抑制劑)包括一或多種具有尤其有利的動力學準則之抗體或抗原結合片段，其特徵在於：i)對人類LTBP1/3-前TGFβ1複合物中之每一者的高親和力(例如KD ＜5 nM)，及ii)低解離速率(kOFF )，例如≤ 5 x 10-4 (1/s)，如藉由適合的活體外結合/動力學分析(諸如藉由BLI，例如基於Octet之系統)所量測。低解離速率標準可反映於長解離半時間(t½)中，例如自人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物≥45分鐘。較佳地，用於一或多種基質相關複合物之抗體或其抗原結合片段的長解離半時間伴隨著相對於細胞相關複合物(例如人類GARP-前TGFβ1及/或人類LRR33-前TGFβ1複合物)的短解離半時間。特定言之，較佳抗體或片段與人類GARP-前TGFβ1複合物解離,其中t½不超過10分鐘，更佳不超過5分鐘。同樣，用於製成包含如本文所描述之TGFβ1選擇性抑制劑之組合物的方法可進一步包括選擇此類抗體之步驟。採用適合臨床前模型，在包含功效研究及毒理學/安全性研究之臨床前研究中評估所選抗體或複數種抗體。功效研究中測定的一或多種抗體之有效量低於毒理學/安全性研究中測定的產生非所需毒性的量。較佳地，選擇具有至少3倍、6倍且更佳10倍治療窗之一或多種抗體。當每週投與一次時，根據本發明之抗體之有效量可在約0.1 mg/kg與約30 mg/kg之間。在較佳實施例中，當每週給藥一次持續至少4週時，根據本發明之抗體之最大耐受劑量(MTD)＞ 100 mg/kg。在一些實施例中，在臨床前毒理學研究中，抗體顯示＞100 mg/kg/週、＞200 mg/kg/週或＞300 mg/kg/週之NOAEL，其中毒理學研究視情況為4週研究、8週研究或12週研究。舉例而言，NOAEL在健康小鼠或大鼠中之12週次持續給藥方案中＞100 mg/kg/週。
本發明亦包括以下驚人發現：用TGFβ3選擇性抑制劑抑制TGFβ3在小鼠中產生促纖維化 作用。類似地，在同一模型中用TGFβ1選擇性抑制劑與TGFβ3選擇性抑制劑之組合同時抑制TGFβ1與TGFβ3引起TGFβ1抑制劑之抗纖維化作用減弱。此等觀測結果提高了非選擇性TGFβ抑制劑(諸如泛抑制劑及TGFβ1/3抑制劑)實際上可能會加重纖維化之可能性。有利地，本文所揭示之抗體(例如Ab42及其變體，如本文所描述)為同功型選擇性的，因為其專一性地靶向潛伏TGFβ1複合物且以低解離速率如此。因此，本發明包括認識到當選擇用於患有纖維化病況(例如涉及ECM失調之疾病)之患者的特定TGFβ抑制劑時，應謹慎地考慮同功型選擇性以便避免加重ECM失調之風險。因此，本發明包括治療方法，其包含選擇並不抑制TGFβ3治療患有纖維化病況(包括如本文所描述之較佳纖維化病況)之個體的TGFβ抑制劑。
如本文所用之同功型選擇性LTBP1/3-前TGFβ1複合物選擇性抑制劑可在一些實施例中選自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63及Ab64 (視情況Ab42或Ab63) (亦即，具有如本文所提供之對應Ab的重鏈及輕鏈可變區之抗體或抗原結合片段)、其變體/衍生物或抗原結合片段，或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在一些較佳實施例中，LTBP1/3-前TGFβ1複合物選擇性抑制劑抑制劑為Ab42、其變體/衍生物或抗原結合片段，或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在較佳實施例中，LTBP1/3-前TGFβ1複合物選擇性抑制劑為Ab42或其抗原結合片段。
相關申請案
本國際申請案主張2019年1月30日申請之美國臨時申請案第62/798,927號之權益及優先權，該申請案之內容以全文引用之方式明確地併入本文中。
本發明提供適用於減少TGFβ之活化的組合物。在生長因子-受體相互作用上游靶向潛伏前TGFβ複合物之抑制劑一般稱為TGFβ之活化抑制劑。
迄今為止，已鑑別出用於TGFβ之四個呈遞分子：潛伏TGFβ結合蛋白1 (「LTBP1」)、潛伏TGFβ結合蛋白3 (「LTBP3」)、糖蛋白A為主的重複序列(「GARP」)及含富白胺酸重複序列之蛋白33 (「LRRC33」)。此等呈遞分子中之每一者可與TGFβ前驅體之均二聚原蛋白複合物(亦即，前TGFβ)形成二硫鍵。前TGFβ複合物保持潛伏(潛伏)於相應胞外生態棲位(例如ECM及免疫細胞表面)中，直至活化事件觸發可溶性生長因子自複合物釋放。
相較於廣泛地表現之TGFβ生長因子及受體，呈遞分子顯示更多受限或選擇性(例如組織專一性)之表現模式，藉助於結合引起TGFβ活性之功能性分室化。因此，在表現呈遞分子之組織內之四種呈遞分子-前TGFβ複合物，即LTBP1-前TGFβ、LTBP3-前TGFβ、GARP-前TGFβ及LRRC33-前TGFβ，提供TGFβ信號傳導之離散「情形」。此等情形可分成兩種廣泛類別：i)與ECM相關之TGFβ信號傳導(例如基質相關TGFβ功能)；及ii)與細胞相關之TGFβ信號傳導(特定言之，某些免疫細胞功能)。LTBP1-前TGFβ及LTBP3-前TGFβ複合物屬於第一類別，而GARP-前TGFβ及LRRC33-前TGFβ複合物屬於第二類別。因此，本文揭示能夠選擇性抑制與ECM相關之TGFβ之活化的TGFβ之抑制劑。在一些實施例中，抑制劑對特定TGFβ同功型(例如前TGFβ1、前TGFβ2及/或前TGFβ3)亦具有選擇性。
在例示性實施例中，本文中所描述之組合物適用於在LTBP蛋白(例如LTBP1及/或LTBP3蛋白)之情形下選擇性地減少TGFβ1之活化。此類組合物有利地抑制胞外基質相關TGFβ1之活化，而在免疫相關TGFβ1呈遞分子GARP及LRRC33之情形下不抑制TGFβ1。本文所描述之組合物適用於治療與TGFβ1活化相關之病症，例如纖維化病症。因此，在實施例中，本發明提供用於減少TGFβ1之活化的組合物、其使用方法、製造方法及治療方法。亦提供針對展現纖維化病症之症狀的個體選擇TGFβ1抑制劑的方法。 定義
為了使本發明可較易於理解，首先定義某些術語。此等定義應根據本發明之其餘部分來閱讀且如一般熟習此項技術者所理解。除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有如一般熟習此項技術者通常理解之相同的含義。額外定義在整個實施方式中闡述。
親和力 ：親和力為分子(諸如抗體)與其配位體(諸如抗原)之結合強度。其通常藉由平衡解離常數(KD )來量測及報導。KD 為抗體解離速率(「解離速率」或Koff ) (其與其抗原解離之快速程度)與抗體之抗體結合速率(「結合速率」或Kon ) (其結合於其抗原之快速程度)之比率。舉例而言，藉由適合的活體外結合分析測定，親和力為≤1 µM之抗體的KD 值為1 µM或更低(亦即1 µM或更高的親和力)。適合的活體外分析，諸如生物層干涉術(例如Octet)或表面電漿子共振(例如Biacore系統)可用於評估親和力，如藉由基於熟知方法之KD 值所量測。
親和力成熟 ：親和力成熟為抗體最佳化之一種類型且為提高抗體或片段對其抗原之親和力的方法，且通常涉及對抗體或片段之胺基酸序列進行一或多個改變以達成更大親和力。通常，親本抗體及親和力成熟之對應物保留相同抗原決定基。親和力成熟可包括一或多個CDR序列之多樣化及/或突變誘發。
抗體 ：術語「抗體」涵蓋任何天然存在、重組、經修飾或經工程改造之免疫球蛋白或類免疫球蛋白結構或其抗原結合片段或部分，或其衍生物，如本文中其他處進一步所述。因此，該術語係指專一性結合於目標抗原之免疫球蛋白分子，且包括例如嵌合、人類化、完全人類及雙專一性抗體。除非另外說明為相反的，否則如本文所用之術語「抗體」應涵蓋其抗原結合片段及變體。完整抗體通常將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少鏈，諸如駱駝中天然存在之抗體可僅包含重鏈。抗體可僅源自單一來源，或可為「嵌合」的，亦即，抗體之不同部分可源自兩種不同抗體。抗體或其抗原結合部分可在融合瘤中，藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解產生。如本文所用，術語抗體分別包括單株抗體、雙專一性抗體、微型抗體、域抗體、合成性抗體(有時在本文中稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物(有時在本文中稱為「抗體結合物」)。在一些實施例中，該術語亦涵蓋肽體。
抗原 ：術語「抗原」廣泛包括包含抗體或片段專一性結合之結合區域內之抗原決定子的任何分子。抗原可為單一單元分子(諸如蛋白質單體或片段)或由多重組分構成之複合物。抗原提供抗原決定基，例如分子或分子之一部分，或分子或分子之部分的複合物，其能夠經選擇性結合劑，諸如抗原結合蛋白(包括抗體)結合。因此，選擇性結合劑可專一性結合於由兩種或更多種組分形成的呈複合物形式之抗原。在一些實施例中，抗原能夠用於動物中以產生能夠結合於彼抗原之抗體。抗原可具有一或多個能夠與不同抗原結合蛋白，例如抗體相互作用之抗原決定基。在本發明之情形下，適合抗原為複合物(例如由結合之多個組分構成之多聚複合物)，含有前TGF二聚體(為「小潛伏複合物」或SLC)，較佳與呈遞分子結合(共同為「大潛伏複合物」或LLC)。前TGF二聚體之各單體包含前結構域及生長因子域，其藉由弗林蛋白酶(furin)裂解序列分隔。兩種此類單體形成前TGF二聚體複合物。此轉而經由二硫鍵與呈遞分子共價結合，該二硫鍵涉及接近於前TGF單體中之每一者之N端而存在的半胱胺酸殘基。藉由結合於呈遞分子之前TGF二聚體所形成的此多重複合物一般稱作大潛伏複合物。適用於篩選抗體或抗原結合片段之抗原複合物例如包括大潛伏複合物之呈遞分子組分。此類呈遞分子組分可為全長呈遞分子或其一或多個片段。呈遞分子之所需最小部分通常含有呈遞分子多肽之至少50個胺基酸，但更佳至少100個胺基酸，該呈遞分子多肽包含能夠形成與前TGFβ1二聚體之共價鍵的兩個半胱胺酸殘基。
抗原結合部分 / 片段 ：如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指抗體之一或多個片段，其保留專一性結合於抗原(例如LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1)之能力。抗原結合部分包括但不限於專一性結合抗原以形成複合物的任何天然存在、可酶促獲得、合成性或經基因工程改造之多肽或糖蛋白。在一些實施例中，抗體之抗原結合部分可例如使用任何適合之標準技術自完整抗體分子衍生，該等技術諸如蛋白水解消化或重組基因工程改造技術，其涉及編碼抗體可變域及視情況存在之恆定域的DNA之操縱及表現。抗原結合部分之非限制性實例包括：(i) Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，其為在鉸鏈區包含由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單一臂之VL及VH結構域組成的Fv片段；(v)單鏈Fv (scFv)分子(參見例如Bird等人. (1988) SCIENCE 242:423-426；及Huston等人 (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883)；(vi) dAb片段(參見例如Ward等人. (1989) NATURE 341: 544-546)；及(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基(例如分離之互補決定區(CDR))組成之最小識別單元。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。術語抗體之抗原結合部分包括以其他方式稱為「scFab」之「單鏈Fab片段」，其包含抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子，其中該抗體域及該連接子在N端至C端方向具有以下次序之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少30個胺基酸，較佳為在32及50個胺基酸之間的多肽。
晚期纖維 化：如本文所用，若個體處於纖維化病症，尤其器官纖維化之晚期階段，則其罹患晚期纖維化，使得患者成為能夠接受同種異體移植或需要同種異體移植之候選者。
視需要 ：在給藥方案之情形下，術語「視需要」係指並非基於預定給藥時程而為基於在治療期間定期量測或監測之一或多個參數或標記的給藥方案，其提供關於額外劑量是否應有益於個體/患者之資訊或指導。舉例而言，可以足以實現及維持臨床益處(例如減少纖維化之一或多種臨床標記)之治療有效量，在「視需要」基礎上間歇地投與包含TGFβ抑制劑之醫藥組合物，該TGFβ抑制劑諸如TGFβ1/2/3抑制劑(「泛」抑制劑)、TGFβ1/2抑制劑及TGFβ1/3抑制劑。在一些實施例中，投與LTBP1/3-複合物選擇性TGFβ抑制劑，諸如本文所揭示之抗體中之任一者(例如Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63或Ab64 (視情況，Ab42))可與確定或監測治療功效之方法組合使用。在一些實施例中，僅在預期額外劑量之TGFβ抑制劑的臨床益處時，在患者中投與LTBP1/3-複合物選擇性TGFβ抑制劑。預期相較於TGFβ1選擇性抑制劑(諸如本文所揭示之彼等抑制劑)，為了控制毒性，在TGFβ之同功型非選擇性抑制劑之情況下可能更頻繁地需要間歇或「視需要」的給藥方案。
偏向 ：在本發明之情形下，術語「偏向」係指對或針對抗體能夠專一性結合之一小類抗原的偏斜或不勻親和性。舉例而言，當對一種抗原複合物之親和性及對另一抗原複合物之親和性不等(例如親和力相差超過五倍)時，則稱抗體具有偏向。表徵為「無偏向」之抗體對此類抗原複合物具有大致相等親和力(例如親和力相差低於五倍)。本發明之抗體「選擇性」結合EMC-相關複合物(LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ)。在一些實施例中，此類選擇性結合可包含結合以使得基質相關複合物中之至少一者與細胞相關複合物(GARP-前TGFβ1及/或LRRC33-前TGFβ1複合物)中之至少一者(較佳兩者)之間的相對親和力大於五十倍。
生物層干涉術 (BLI) ：BLI為用於光學量測生物分子相互作用，例如在固定於生物感測器尖端表面上之配位體與溶液中之分析物之間的無標記技術。BLI提供精確及準確監測結合專一性、結合速率及解離速率或濃度之能力。BLI平台設備可購自例如ForteBio，且通常稱為Octet®系統。BLI可用於進行如本文所描述之活體外結合分析。
自體免疫疾病 ：自體免疫疾病為由對正常身體部分之異常或過度活化免疫反應而產生之病況。向此類自體免疫病況患者投與的免疫刺激劑可能使病況加重。
細胞相關前 TGFβ1 ： 術語係指經膜結合(例如繫留至細胞表面)之TGFβ1或其信號傳導複合物(例如前/潛伏TGFβ1))。典型地，此類細胞為免疫細胞。藉由GARP或LRRC33呈遞之TGFβ1為細胞相關之TGFβ1。GARP及LRRC33為在某些細胞之細胞表面上表現的跨膜呈遞分子。GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1可統稱為「細胞相關之」(或「細胞表面」) 前TGFβ1複合物，其介導細胞相關之(例如免疫細胞相關之) TGFβ1活化/信號傳導。
慢性發炎 ：在本發明之情形下，涉及慢性發炎之纖維化病症之特徵為組織連續或持久性損傷，使得組織在初始損傷之後不會在正常癒合情況下消退。慢性發炎係指涉及在發炎部位(例如纖維化組織)處存在之細胞類型之漸進變化的延長之發炎反應。其特徵在於自發炎過程同時破壞且修復組織。其可按照急性發炎形式或為長期低級形式。
臨床益處 ：如本文所用，術語「臨床益處」意欲包括療法之功效及安全性兩者。因此，達成所需臨床益處之治療性治療為有效且安全的(例如伴隨可耐受或可接受之毒性或不良事件)。
組合或組合性抗原決定基 ：組合性抗原決定基為在一位點經組合性抗體識別且結合之抗原決定基(亦即，抗原決定子)，其係藉由抗原之一或多種組分的非相鄰部分形成，該等部分以三維結構形式緊靠在一起以形成抗原決定基。因此，本發明之抗體可結合藉由前/潛伏TGFβ1複合物之兩種或更多種組分(例如部分或區段)形成的抗原決定基。組合抗原決定基可包含來自複合物之第一組分的一或多個胺基酸殘基及來自複合物之第二組分的一或多個胺基酸殘基等。各組分可具有抗原複合物之單一蛋白質或兩種或更多種蛋白質。組合抗原決定基係由抗原或抗原複合物之兩種或更多種組分(例如部分或區段，諸如胺基酸殘基)經結構比重形成。
互補決定區 ：如本文所用，術語「CDR」係指在抗體可變序列內之互補決定區。重鏈及輕鏈之可變區中之每一者中存在三個CDR，對於各可變區，該等CDR命名為CDR1、CDR2及CDR3。此等CDR之精確邊界已根據不同系統以不同方式加以定義。由Kabat (Kabat等人(1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.)所述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區的明確殘基編號系統，而且提供界定重鏈及輕鏈中之每一者上之三個CDR的精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。
構形抗原決定基 ：構形抗原決定基為呈三維構形，而非呈相同胺基酸序列之未摺疊肽的由構形抗體識別且結合之抗原決定基。構形抗原決定基可稱為構形-專一性抗原決定基、構形-依賴性抗原決定基或構形-敏感性抗原決定基。專一性結合此類抗原決定基之相應抗體或其片段可稱為構形-專一性抗體、構形-選擇性抗體或構形-依賴性抗體。抗原結合至構形抗原決定基視抗原或抗原複合物之三維結構(構形)而定。
情形專一性 ：本發明之情形專一性(或情形選擇性)抗體(相較於「情形非依賴性」抗體)能夠選擇性地結合於與特定生物情形相關的一小類(而非全部) 前TGFβ1複合物。舉例而言，基質選擇性靶向使得能夠專一性抑制與ECM相關之TGFβ1功能。ECM選擇性抑制可藉由使用選擇性靶向ECM組分LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之抗體或其片段來達成。本文所揭示之抗體及片段因此表示一類情形專一性抗體。TGFβ1活化之LTBP1專一性及LTBP3專一性抑制劑亦為情形專一性抗體。
交叉阻斷 ( cross-block)/ 交叉阻斷 (cross-blocking) ：第一抗體或其抗原結合部分及第二抗體或其抗原結合部分相對於相同抗原彼此交叉阻斷，例如如藉由使用標準測試條件，例如根據製造商的說明(例如在室溫，約20-25℃下分析之結合)，如藉由生物層干涉術(諸如Octet)或表面電漿子共振(諸如Biacore系統)所量測來分析。第一抗體或其片段及第二抗體或其片段可具有相同抗原決定基；可具有不相同但重疊抗原決定基；或可具有在三維空間緊密接近之獨立(不同)抗原決定基，以使得抗體結合經由位阻而發生交叉阻斷。「交叉阻斷」意謂第一抗體結合於抗原阻止第二抗體結合於同一抗原，且類似地，第二抗體結合於抗原阻止第一抗體結合於同一抗原。
解離速率 ：如本文所用之術語解離速率具有熟習相關技術(例如抗體技術)者所理解之含義，如係指藉由配位體(例如抗體或片段)自其結合目標(例如抗原)解離之快速/緩慢的程度所量測的動力學參數。解離速率亦稱為「off」速率(「kOFF 」)。抗體與其抗原之間的相對結合/解離速率(亦即，kON 及kOFF )確定相互相用或親和力之總強度，通常表示為解離常數或KD 。因此，相等親和力(例如KD 值)可藉由具有快速結合(高kON )、緩慢解離(低kOFF )或來自兩個因子之比重來達成。單價相互作用可藉由使用單價抗原結合分子/片段，諸如fAb(Fab)量測，而二價相互作用可藉由使用二價抗原結合分子，諸如完整免疫球蛋白(例如IgG)量測。解離動力學可根據解離半時間(有時稱為半結合時間)或t½表示，定義為一半數目之抗體分子(例如mAb、Fab等)自結合抗原解離所耗費之持續時間。因此，具有緩慢解離速率之抗體具有長解離半時間，且具有快速解離速率之抗體具有短解離半時間。
劑量 ：如本文所用，本發明抗體之典型治療劑量在每劑量約1-30 mg/kg之間的範圍內。典型給藥方案可包括一週一次、每2週一次、每3週一次、每4週一次、一月一次、每6週一次等。
ECM 相關 之 ( 或「基質相關 之 」 ) TGFβ1 ：術語係指TGFβ1或其信號傳導複合物(例如前/潛伏TGFβ1)，其為胞外基質之組分(例如沈積至胞外基質中)。藉由LTBP1或LTBP3呈遞之TGFβ1為ECM相關之TGFβ1。
有效量 ：「有效量」(或治療有效量)為在患者群體中實現統計學上顯著之臨床益處的劑量或給藥方案。
纖維化病症：術語「纖維化」或「纖維化病況/病症」係指特徵為組織或器官內之胞外基質(ECM)組分(諸如膠原蛋白)病理性積聚的過程或表現。纖維化可包括原發性纖維化以及與疾病或病症相關之繼發性纖維化。
GARP- 前 TGFβ1 ：如本文所用，術語「GARP-前TGFβ1」係指包含轉形生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白之原蛋白形式或潛伏形式以及糖蛋白A為主的重複序列蛋白(GARP)或其片段或變體的蛋白複合物。前TGFβ1均二聚體能夠經由二硫鍵與單一GARP分子形成共價結合。術語「GARP-TGFβ1」可互換使用。GARP-前TGFβ1表現限於某些細胞類型，諸如調節T細胞(Treg)。
人類抗體 ：如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括例如CDR，且尤其CDR3 (例如CDR-H3或CDR-L3突變誘發)中非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外無規或定點突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
人類化抗體 ：術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列但該VH及/或VL序列之至少一部分已變成較「類人類(human-like)」 (亦即，更類似於人類生殖系可變序列)的抗體。人類化抗體之一種類型為CDR-移植抗體。
免疫抑制 (immune suppression)/ 免疫抑制 (immunosuppression) ：術語免疫抑制係指抑制或降低身體的免疫系統之強度。「受益於免疫抑制」之患者包括處於器官纖維化之晚期且為進行移植、正考慮移植或已經歷移植之候選者的彼等患者。
同功型專一性 ：術語「同功型專一性」係指藥劑判別一種同功型與其他結構相關同功型之能力(亦即，選擇性)。同功型專一性TGFβ抑制劑在給定濃度下對TGFβ之一種同功型，而非對TGFβ之其他同功型發揮其抑制活性。舉例而言，同功型專一性TGFβ1抗體選擇性地結合TGFβ1。相對於TGFβ2或TGFβ3，TGFβ1專一性抑制劑(抗體)以實質上較高親和性優先靶向(結合，藉此抑制)TGFβ1同功型。舉例而言，此情形下之選擇性可指如藉由活體外結合分析，諸如Octet®及Biacor所量測，各別親和力相差至少500-1000倍。在一些實施例中，選擇性使得當以一定劑量使用時，抑制劑會有效地活體內抑制TGFβ1，而不抑制TGFβ2及TGFβ3。本發明之情形專一性抑制劑亦為同功型專一性的。
分離 ：如本文所用，「分離」抗體係指實質上不含具有不同抗原專一性的其他抗體之抗體。在一些實施例中，分離抗體實質上不含其他非所需細胞材料及/或化學物質。
長期或持續投與 ：如本文所用，涉及超過六個月治療之治療方案視為長期的。在一些患者群體中，長期治療方案涉及在不確定持續時間內投與藥物(諸如情形選擇性TGFβ1抑制劑)。
LRRC33- 前 TGFβ1 ：如本文所用，術語「LRRC33-TGFβ1複合物」係指轉形生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白之原蛋白形式或潛伏形式與含富白胺酸重複序列之蛋白33 (LRRC33；亦稱為活性含氧物種之負調控劑或NRROS)或其片段或變體之間的複合物。在一些實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前/潛伏TGFβ1共價連接之LRRC33。在其他實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物包含與前/潛伏TGFβ1非共價連接之LRRC33。在一些實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之LRRC33-TGFβ1複合物。
LTBP1-TGFβ1 ：如本文所用，術語「LTBP1-TGFβ1複合物」 (或「LTBP1-前TGFβ1複合物」)係指包含轉形生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白之原蛋白形式(在本文中可稱為「前TGFβ1」)或潛伏形式與潛伏TGF-β結合蛋白1 (LTBP1)或其片段或變體的蛋白複合物。在一些實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前/潛伏TGFβ1共價連接之LTBP1。在其他實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物包含與前/潛伏TGFβ1非共價連接之LTBP1。在一些實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之LTBP1-TGFβ1複合物。例示性LTBP1-TGFβ1複合物顯示於圖3中。
LTBP3-TGFβ1 ：如本文所用，術語「LTBP3-TGFβ1複合物」 (或「LTBP3-前TGFβ1複合物」)係指包含轉形生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白之原蛋白形式或潛伏形式(在本文中可稱為「前TGFβ1」)與潛伏TGF-β結合蛋白3 (LTBP3)或其片段或變體的蛋白複合物。在一些實施例中，LTBP3-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前/潛伏TGFβ1共價連接之LTBP3。在其他實施例中，LTBP3-TGFβ1複合物包含與前/潛伏TGFβ1非共價連接之LTBP1。在一些實施例中，LTBP3-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之LTBP3-TGFβ1複合物。例示性LTBP3-TGFβ1複合物顯示於圖3中。
巨噬細胞 ：巨噬細胞為免疫系統之白血球之一種類型且包括骨髓細胞之異質、表型多樣亞群。一些巨噬細胞與源自骨髓之循環單核細胞分化，而其他為駐留於特定身體結構或組織位置內之組織專一性巨噬細胞(「駐留」巨噬細胞)。組織專一性巨噬細胞包括但不限於：脂肪組織巨噬細胞；柯弗氏細胞(Kupffer cell) (肝臟)；鼻竇組織細胞(淋巴結)；肺泡巨噬細胞(或粉塵細胞、肺部肺泡)；產生巨大細胞(結締組織)之組織巨噬細胞(組織細胞)；蘭格漢氏細胞(Langerhans cell) (皮膚及黏膜)；微神經膠質細胞(中樞神經系統)；霍夫包爾氏細胞(Hofbauer cell) (胎盤)；腎小球內系膜細胞(腎臟)；破骨細胞(骨)；上皮狀細胞(肉芽腫)；紅髓巨噬細胞(或肝竇內襯細胞、脾之紅髓)；腹膜巨噬細胞(腹腔)；及LysoMac (派亞氏淋巴叢(Peyer's patch))。巨噬細胞，例如源自骨髓之單核細胞，可由某些刺激(諸如細胞介素)活化，產生極化表型，例如M1及M2。經M2偏向活化之巨噬細胞進一步分類成若干表型不同亞型，諸如M2a、M2b、M2c (例如促纖維化)及M2d (促腫瘤或TAM樣)。
基質相關 前 TGFβ1 ：LTBP1及LTBP3為呈胞外基質(ECM)之組分的呈遞分子。LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1可統稱為介導ECM相關之TGFβ1活化/信號傳導之「ECM相關之」 (或「基質相關之」) 前TGFβ1複合物。
最大耐受劑量 (MTD) ：在安全性/毒理學考慮因素之情形下，術語MTD一般係指在無觀測到之不良反應量(NOAEL)下所評價的測試物品(諸如TGFβ1抑制劑)之最高量。舉例而言，基於四週毒理學研究，大鼠中的Ab2之NOAEL為所評價之最高劑量(100 mg/kg)，其表明Ab2之MTD ＞100 mg/kg。
骨髓衍生之抑制細胞 ：骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)為在多種病理性病況期間產生的異質細胞群，且認為其表示病理活化狀態的單核細胞及相對較不成熟之嗜中性白血球。MDSC包括至少兩類細胞，其稱為i) 「顆粒球性」 (G-MDSC)或多形核(PMN-MDSC)，其在表型及形態上與嗜中性白血球相似；及ii)單核球性(M-MDSC)，其在表型及形態上與單核細胞相似。MDSC之特徵在於一組獨特的基因體及生物化學特徵，且可藉由專一性表面分子來區分。舉例而言，人類G-MDSC/PMN-MDSC通常表現細胞表面標記物CD11b、CD33、CD15及CD66。此外，人類G-MDSC/PMN-MDSC亦可表現HLA-DR及/或精胺酸酶。相比之下，人類M-MDSC通常表現細胞表面標記物CD11b、CD33及CD14。MDSC亦可表現CD39及CD73以介導涉及器官纖維化(諸如肝纖維化及肺纖維化)、癌症及骨髓纖維化)的腺苷信號傳導。此外，人類M-MDSC亦可表現HLA-DR。除了此類細胞表面標記物之外，MDSC之特徵在於能夠抑制免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞及B細胞。MDSC之免疫抑制功能可包括抑制抗原非專一性功能及抑制抗原專一性功能。MDSC可表現細胞表面LRRC33及/或LRRC33-前TGFβ1。
肌纖維母細胞 ：肌纖維母細胞為具有纖維母細胞及平滑肌細胞之某些表型的細胞，且一般表現波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA；人類基因ACTA2)及帕拉丁蛋白(paladin)。在涉及胞外基質失調(諸如基質硬度增加)的多種疾病病況中，正常纖維母細胞以TGFβ依賴性方式變得去分化成肌纖維母細胞。
解離速率 (kOFF )：解離速率(off rate)為抗體(諸如mAb)或抗原結合片段(諸如fAb)自其抗原解離之快速程度或緩慢程度的動力學參數且亦可稱為解離速率(dissociation rate)。解離速率可以實驗方式在適合的活體外結合分析，諸如基於BLI (Octet®)及/或SPR (Biacore)之系統中量測。在抗體-抗原結合動力學之情形下，術語「半結合時間」(T1/2 )或「解離半時間」係指一半數目之抗體分子(例如mAb、Fab)自結合抗原(例如LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1)解離所需的持續時間。因此，自其抗原緩慢解離(亦即低解離速率)之抗體具有長T1/2 。相反，自其抗原快速解離(亦即高解離速率)之抗體具有短T1/2 。
泛 TGFβ 抑制劑 / 泛抑制 TGFβ ：術語「泛TGFβ抑制劑」係指能夠抑制或拮抗TGFβ之所有三種同功型的任何藥劑。此類抑制劑可為TGFβ同功型之小分子抑制劑。術語包括泛TGFβ抗體，其係指能夠結合至TGFβ同功型中之每一者，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3的任何抗體。在一些實施例中，泛TGFβ抗體結合且中和全部三種同功型，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之活性。
效能 ：如本文所用，術語「效能」係指關於產生所定義作用之藥物的濃度或量，具有抑制活性的藥物，諸如功能抗體(或片段)之活性。舉例而言，能夠在給定劑量下產生某些作用的抗體要比為產生相等作用需要兩倍該量(劑量)之另一抗體強效。效能可在基於細胞之分析，諸如TGFβ活化/抑制分析中量測。在一些情況下，可在基於細胞之系統中，在存在或不存在測試物品(例如抑制性抗體)之情況下量測TGFβ活化程度，諸如藉由整合素結合所觸發之活化。通常，具有較高親和力之抗體往往顯示出比具有較低親和力之抗體高的效能。
呈遞分子 ：呈遞分子為與潛伏原蛋白(例如前TGFβ1)形成共價鍵且在胞外生態棲位(諸如ECM或免疫細胞表面)中「呈遞」非活性複合物，由此維持其潛伏性直至發生活化事件為止的蛋白質。已知的針對前TGFβ1之呈遞分子包括：LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33，其可形成呈遞分子-前TGFβ1複合物，即分別為LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。LTBP1及LTBP3為胞外基質(ECM)之組分；因此，LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1可統稱為「ECM相關之」 (或「基質相關之」) 前TGFβ1複合物，其介導ECM相關之TGFβ1信號傳導/活性。另一方面，GARP及LRRC33為表現於某些細胞之細胞表面上之跨膜蛋白；因此，GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1可統稱為「細胞相關之」 (或「細胞表面」) 前TGFβ1複合物，其介導細胞相關之(例如免疫細胞相關之) TGFβ1信號傳導/活性。
前 TGFβ1 ：如本文所用，術語「前TGFβ1」意欲涵蓋在複合物內包含TGFβ1之前結構域序列的非活性TGFβ1複合物之前驅體形式。因此，術語可包括前TGFβ1形式以及潛伏TGFβ1形式。表述「前/潛伏TGFβ1」可互換使用。「前」TGFβ1形式在弗林蛋白酶位點處之蛋白裂解之前存在。裂解後，所得形式稱為TGFβ1之「潛伏」形式。「潛伏」複合物在觸發進一步活化，諸如整合素驅動活化事件之前保持結合。前TGFβ1複合物係由與二硫鍵連接之二聚TGFβ1原蛋白多肽構成。潛伏二聚體複合物經由前TGFβ1多肽中之每一者之位置4處的半胱胺酸殘基(Cys4)共價連接至單一呈遞分子。形容詞「潛伏」可通常用於描述經整合素介導或其他活化事件之前，TGFβ1之「非活性」狀態。前TGFβ1多肽含有前結構域(LAP)及生長因子域(SEQ ID NO:12)。
調節 T 細胞 (Treg) ：「調節T細胞」或Treg為免疫細胞之一種類型，其特徵在於生物標記、CD4、叉頭框P3 (FOXP3)及CD25以及STAT5之表現。Treg有時稱作抑制T細胞且表示調節免疫系統、維持對自身抗原之耐受性及預防自體免疫疾病的T細胞之亞群。Treg為免疫抑制的且一般抑制或下調效應T (Teff)細胞之誘導及增殖。Treg可在藉由抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell，APC)之未處理CD4+ T細胞激活後，例如在暴露於TGFβ或視黃酸後在胸腺(稱作CD4+ Foxp3+「天然」Treg)中發展或在周邊分化。Treg細胞產生且分泌細胞介素，包括IL-10及TGFβ1。一般而言，Treg與Th17細胞之分化係不利相關的。
專一性結合 ：如本文所用，術語「專一性結合(specific binding)」或「專一性結合(specifically binds)意謂抗體或其抗原結合部分與抗原之相互作用視特定結構(例如抗原決定子或抗原決定基)之存在而定。舉例而言，抗體或其抗原結合部分結合於專一性蛋白質而非以一般方式結合於蛋白質。在一些實施例中，若抗體對目標之KD 為至少約10-6 M，則抗體或其抗原結合部分專一性結合於目標(例如TGFβ1)。更佳地，此類抗體之所量測之KD 值在10-100 nM之間的範圍內。更佳地，此類抗體之所量測之KD 值在0.1-10 nM之間的範圍內。
個體 ：在治療性應用之情形下，術語「個體」係指接受臨床照護或干預，諸如治療、診斷等的個體。適合個體包括脊椎動物，其包括但不限於哺乳動物(例如人類及非人類哺乳動物)。在個體為人類個體之情況下，術語「患者」可互換使用。在臨床情形下，術語「患者群體」或「患者亞群」用以指屬於一組準則內之個體群組，諸如臨床準則(例如疾病表現、疾病期、對某些病況之易感性、對療法之反應性等)、病史、健康狀況、性別、年齡群、遺傳準則(例如某些突變、多形現象、基因複製、DNA序列重複序列等之攜帶者)及生活方式因素(例如吸菸、飲酒、運動等)。
TGFβ 抑制劑 ：術語「TGFβ抑制劑」係指能夠拮抗TGFβ生長因子(例如TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3)之生物活性或功能的任何藥劑。術語並不意欲限制其作用機制，且包括例如TGFβ之中和抑制劑、受體拮抗劑、可溶性配位體捕獲劑及活化抑制劑。
T 輔助 17 細胞 ：T輔助17細胞(Th17)為特徵為標記物STAT3及RORγt且產生包括介白素17 (IL-17A/F)及IL-22之細胞介素的一小類促炎性T輔助細胞。當使未處理之T細胞暴露於TGFβ及IL-6時，使Th17細胞分化。Th17細胞通常與某些病原體之組織發炎、自體免疫及清除相關。Th17細胞與Treg細胞之分化一般為逆相關。Th17與Treg比率(例如「Th17/Treg」)之不平衡已牽涉到多種病變，諸如纖維化病況及自體免疫病況。
Th17/Treg 比率 ：Th17與Treg比率係指所關注之組織或樣品中Th17細胞之數目相對於Treg細胞之數目的量測比率(相對比例)。通常，使用已知細胞標記物鑑別、分類或分離細胞類型。此類標記物包括表現於特定細胞類型上之細胞表面分子；由特定細胞類型產生(例如分泌)之細胞介素或細胞介素組，及/或充當特定細胞類型之標誌/概況的某些基因標記物之mRNA表現。舉例而言，Th17/Treg比率為一(1)意謂在所評估之組織或樣品內存在相同或相等數目之細胞類型中之每一者。Th17/Treg比率為二(2)意謂與組織或樣品中之Treg細胞相比，存在約兩倍之Th17細胞數目。Th17/Treg比率升高可起因於增加數目之Th17細胞、減少數目之Treg細胞或其組合。
治療窗 ：術語「治療窗」係指在個體中產生治療反應而不引起顯著/可觀測/不可接受之不良作用(例如在可接受或可耐受之不良作用內)的一系列劑量/濃度。治療窗可計算為最低有效濃度(MEC)與最低毒性濃度(MTC)之間的比率。為進行說明，在10 mg/kg下達成活體內功效且在100 mg/kg下顯示耐受性或可接受毒性的TGFβ1抑制劑至少提供10倍(例如10×)治療窗。相比之下，在10 mg/kg下有效但在5 mg/kg下引起不良反應的TGFβ之泛抑制劑被稱為具有「劑量限制性毒性」。舉例而言，申請人已發現，在諸如大鼠之臨床前模型中，情形非依賴性TGFβ1抑制劑抗體在劑量範圍介於約＜3與30 mg/kg/週之間時為有效的，且在持續4週的至少100 mg/kg/週下不含與泛抑制TGFβ相關的可觀測毒性。基於此，情形非依賴性TGFβ1抑制劑抗體顯示最少3.3倍及最多33倍治療窗。
毒性 ：如本文所用，術語「毒性(toxicity)」或「毒性(toxicities)」係指與向患者投與之療法相關之患者中之非所需活體內作用，諸如不良副作用及不良事件。「耐受性」係指與療法或治療方案相關之毒性水準，其可由患者合理地耐受，而不會由於毒性而中斷療法(亦即可接受之毒性水準)。通常，在臨床開發之前在一或多個臨床前模型中進行毒性/毒理學研究以評定候選藥物(例如單株抗體療法)之安全概況。毒性/毒理學研究可有助於測定測試物品之「無觀測到之不良反應量 (NOAEL) 」及「最大耐受劑量 (MTD) 」，基於其可推斷治療窗。較佳地，應選擇顯示出對特定干預敏感之物種作為在其中待進行安全性/毒性研究之臨床前動物模型。在TGFβ抑制之情況下，適合物種包括大鼠、犬及食蟹獼猴。據報導，小鼠對TGFβ之藥理學抑制較不敏感，且其可能不會揭露出對其他物種，包括人類有潛在危險的毒性，儘管某些研究報導在小鼠中泛抑制TGFβ觀測到毒性。為了說明，基於四週毒理學研究，大鼠中之情形非依賴性TGFβ1抑制劑抗體的NOAEL為所評估之最高劑量(100 mg/kg)，其表明MTD為每週＞100 mg/kg。
治療 (treat) /治療 (treatment) ： 術語「治療(treat)」或「治療(treatment)」包括治療性治療、預防性治療及其中降低個體將患上病症之風險或降低其他風險因素的應用。因此，該術語意欲廣泛地意謂：藉由例如增強或強化身體之免疫性來在患者中產生治療益處；減少或逆轉免疫抑制；減少、移除或根除來自身體之有害細胞或物質；減少疾病負荷(例如腫瘤負荷)；預防再發或復發；延長不反應期及/或以其他方式改良存活期。治療不需要完全治癒病症且涵蓋治療減少症狀或潛在風險因素之實施例。在組合療法之情形下，術語亦可指代：i)第二治療劑降低第一治療劑之有效劑量以降低副作用且增加耐受性之能力；ii)第二療法使得患者對第一療法更具反應之能力；及/或iii)實現附加或協同臨床益處之能力。
可變區 ：術語「可變區」或「可變域」係指抗體之輕鏈及/或重鏈之一部分，其通常包括重鏈中的大約120至130個胺基端胺基酸及輕鏈中的約100至110個胺基端胺基酸。在某些實施例中，不同抗體之可變區的胺基酸序列廣泛不同，即使在相同物種之抗體中亦如此。抗體之可變區通常決定特定抗體對其目標之專一性。 TGFβ1
在哺乳動物中，轉形生長因子β (TGFβ)超家族由至少33種基因產物構成。此等包括骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、活化素、生長及分化因子(growth and differentiation factor，GDF)，及TGFβ家族之三種同功型：TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3。TGFβ被認為在諸如細胞增殖之抑制、胞外基質(ECM)重塑及免疫內穩定之各種過程中起關鍵作用。TGFβ1對於T細胞內穩定之重要性係由TGFβ1-/-小鼠存活僅3-4週，由於大規模免疫活化而面臨多器官衰竭而證明(Kulkarni, A.B., 等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): 第770-4頁；Shull, M.M., 等人, Nature, 1992. 359(6397): 第693-9頁)。TGFβ2及TGFβ3之作用較不透明。儘管三種TGFβ同功型具有不同的時間及空間表現模式，但其經由相同受體TGFβRI及TGFβRII信號傳導，但在一些情況下，例如對於TGFβ2信號傳導，亦需要III型受體，諸如β聚糖。(Feng, X.H.及R. Derynck, Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. 21: 第659- 93頁；Massague, J., Annu Rev Biochem, 1998. 67: 第753-91頁)。TGFβRI/II之經配位體誘導之寡聚會觸發SMAD轉錄因子之磷酸化，引起靶基因，諸如Col1a1、Col3a1、ACTA2及SERPINE1之轉錄(Massague, J., J. Seoane及D. Wotton, Genes Dev, 2005. 19(23): 第2783-810頁)。亦描述SMAD非依賴性TGFβ信號傳導路徑，例如在癌症中或在馬凡氏(Marfan)小鼠之主動脈病變中(Derynck, R.及Y.E. Zhang, Nature, 2003. 425(6958): 第577-84頁；Holm, T.M., 等人, Science, 2011. 332(6027): 第358-61頁)。
TGFβ路徑在人類中之生物重要性已藉由基因疾病驗證。卡-恩二氏病(Camurati-Engelman disease)由於TGFβ1基因中的常染色體顯性突變引起骨發育不良，致使TGFB1信號傳導之組成性活化(Janssens, K., 等人, J Med Genet, 2006. 43(1): 第1-11頁)。患有洛伊-迪茨症候群(Loeys/Dietz syndrome)之患者在TGFβ信號傳導路徑之組分中攜帶常染色體顯性突變，其會引起主動脈瘤、器官過距(hypertelorism)及分岐懸壅垂(bifid uvula)(Van Laer, L., H. Dietz, 及B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: 第95-105頁)。由於TGFβ路徑失調涉及多重疾病，已開發出靶向TGFβ路徑之若干藥物且在患者中進行測試，但成果有限。迄今為止所描述之大多數TGFβ抑制劑缺乏同功型專一性，如下文簡要地概述。
已在患有局部區段性腎小球硬化、惡性黑色素瘤、腎細胞癌及全身性硬化症之患者中臨床上測試福萊索單抗(結合及抑制TGFβ之所有三種同功型之人類化單株抗體)(Rice, L.M., 等人, J Clin Invest, 2015. 125(7): 第2795-807頁；Trachtman, H., 等人, Kidney Int, 2011. 79(11): 第1236-43頁；Morris, J.C., 等人, PLoS One, 2014. 9(3): 第e90353頁)。額外公司已開發出針對TGFβ生長因子之單株抗體，其中對TGFβ同功型之選擇性程度不同。此類藥劑可能經由針對除TGFβ1以外之其他TGFβ家族成員的殘餘活性活體內引發毒性。此同功型專一性之缺乏可歸因於同功型之間的高度序列一致性。
靶向TGFβ路徑之其他方法包括ACE-1332，一種來自Acceleron之可溶性TGFβRII-Fc配位體捕獲劑(Yung, L.M., 等人, A Am J Respir Crit Care Med, 2016. 194(9): 第1140- 1151頁)，或ALK5激酶之小分子抑制劑，諸如Eli Lilly的高倫替布(galunisertib)。ACE-1332以同等高親和力結合TGFβ1及TGFβ3(Yung, L.M., 等人, Am J Respir Crit Care Med, 2016. 194(9): 第1140-1151頁)，且ALK5抑制劑阻斷經由TGFR1傳導信號之所有生長因子之活性。已在使用ALK5抑制劑之臨床前研究中發現大量的毒性(Anderton, M.J., 等人, Toxicol Pathol, 2011. 39(6): 第916-24頁；Stauber, A., 等人, Clinical Toxicology, 2014. 4(3): 第1-10頁)，且需要複雜的臨床給藥方案來維持功效，同時減少不良事件(Herbertz, S., 等人, Drug Des Devel Ther, 2015. 9: 第4479- 99頁)。實際上，在嘗試阻斷TGFβ之候選藥物中之大部分(若非全部)中，尚未引起用已知TGFβ抑制劑所觀測到之TGFβ信號傳導專一性及其對毒性之可能影響的問題。舉例而言，毒性量歸因於對TGFβ1對TGFβ2及/或TGFβ3之抑制尚未解決。類似地，在設計或開發方法中尚未考慮TGFβ活化模式來拮抗TGFβ信號傳導。
對TGFβ1之活化機制的最近結構性見解(Shi, M., 等人, Nature, 2011. 474(7351): 第343-9頁) 已實現對TGFβ抑制之更特定方法(參見例如PCT/US2017/21972，其全部內容以引用之方式併入本文中)。不同於其他細胞介素，TGFβ超家族成員不分泌為活性生長因子，而是作為由N末端前結構域及C末端生長因子域組成之二聚原蛋白。藉由弗林蛋白酶裂解前TGFβ1使均二聚生長因子域與其前結構域分離，亦稱為潛伏相關肽(LAP)。然而，生長因子及LAP保持非共價結合，形成不能結合其受體且誘導信號傳導之潛伏複合物。在轉譯期間，潛伏TGFβ1 (亦稱為小潛伏複合物(SLC))經由二硫橋鍵與「呈遞分子」連接，從而形成大潛伏複合物(LLC)。此等分子允許前TGFβ1呈遞於專一性細胞或組織情形中。靠近潛伏TGFβ1之N末端的兩個半胱胺酸連接至呈遞分子上適當定位之半胱胺酸。呈遞分子之特性取決於產生潛伏TGFβ1之環境及細胞類型。舉例而言，纖維母細胞分泌繫留至潛伏TGFβ結合蛋白(LTBP)之潛伏TGFβ1，其隨後與胞外基質(ECM)中之蛋白(亦即纖維結合蛋白、小纖維蛋白-1)結合以將潛伏TGFβ連接至ECM (Robertson等人. Matrix Biol 47: 44-53 (2015) (圖2A)。在活化之調節T細胞表面上，潛伏TGFβ1共價連接至跨膜蛋白GARP (糖蛋白A為主的重複序列蛋白(GARP)，且與GARP、LRRC33 (含富白胺酸重複序列之蛋白33)緊密相關之蛋白充當單核細胞、巨噬細胞及微神經膠質細胞表面上之TGFβ1的呈遞分子(Wang, R., 等人, Mol Biol Cell, 2012. 23(6): 第1129-39頁及T.A. Springer, Int. BMP Conference 2016)。
多種研究已闡明TGFβ1活化之機制。已證明三種整合素，αVβ6、αVβ8及αVβ1為潛伏TGFβ1之主要活化劑(Reed, N.I., 等人, Sci Transl Med, 2015. 7(288): 第288ra79頁；Travis, M.A.及D. Sheppard, Annu Rev Immunol, 2014. 32: 第51-82頁；Munger, J.S., 等人, Cell, 1999. 96(3): 第319-28頁)。αV整合素以高親和性結合TGFβ1及TGFβ1 LAP中所存在之RGD序列(Dong, X., 等人, Nat Struct Mol Biol, 2014. 21(12): 第1091-6頁)。在TGFβ1 RGD位點處具有阻止整合素結合，而非分泌之突變的轉殖基因小鼠表型複製TGFβ1-/-小鼠(Yang, Z., 等人, J Cell Biol, 2007. 176(6): 第787-93頁)。缺乏β6及β8整合素兩者之小鼠複製TGFβ1及TGFβ3基因剔除小鼠之所有基本表型，包括多器官發炎及裂顎，證實此等兩種整合素對於開發及內穩定中的TGFβ1活化的基本作用(Aluwihare, P., 等人, J Cell Sci, 2009. 122(Pt 2): 第227-32頁)。潛伏TGFβ1之整合素依賴性活化的關鍵在於共價繫留至呈遞分子；突變誘發所致的GARP與TGFβ1 LAP之間的二硫鍵之斷裂不會損害複合物形成，但完全破壞藉由αVβ6之TGFβ1活化(Wang, R., 等人, Mol Biol Cell, 2012. 23(6): 第1129-39頁)。潛伏TGFβ1之最新結構闡明整合素如何實現活性TGFβ1自潛伏複合物釋放：潛伏TGFβ1共價連接至其呈遞分子將潛伏TGFβ1經由LTBP錨定至ECM或經由GARP或LRRC33錨定至細胞骨架。整合素結合於RGD序列引起LAP之結構發生力依賴性變化，使得活性TGFβ1釋放且結合鄰近受體(Shi, M., 等人, Nature, 2011. 474(7351): 第343-9頁)。疾病中整合素依賴性TGFβ1活化之重要性亦已得到良好驗證。αVβ1之小分子抑制劑預防經博萊黴素(bleomycin)誘導之肺纖維化及經四氯化碳誘導之肝纖維化(Reed, N.I., 等人, Sci Transl Med, 2015. 7(288): 第288ra79頁)，且經抗體阻斷αVβ6或整合素β6表現之喪失抑制經博萊黴素誘導之肺纖維化及放射線誘導之纖維化(Munger, J.S., 等人, Cell, 1999. 96(3): 第319-28頁)；Horan, G.S., 等人, Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(1): 第56-65頁)。除整合素之外，亦牽涉TGFβ1活化之其他機制，包括凝血栓蛋白-1及藉由諸如基質金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶D或激肽釋放素之蛋白酶活化。然而，此等研究中之大部分使用純化蛋白質活體外進行；存在較少證據證明此等分子在活體內研究中之作用。凝血栓蛋白-1之基因剔除在一些組織中複製TGFβ1-/-表型之一些態樣，但在經博萊黴素誘導之肺纖維化方面並不具有保護性，已知為TGFβ依賴性的(Ezzie, M.E., 等人, Am J Respir Cell Mol Biol, 2011. 44(4): 第556-61頁)。另外，候選蛋白酶之基因剔除並未產生TGFβ1表型(Worthington, J.J., J.E. Klementowicz, 及M.A. Travis, Trends Biochem Sci, 2011. 36(1): 第47-54頁)。此可藉由冗餘或藉由此等機制來解釋，此等機制，並非開發及內穩定在特定疾病中至關重要。
TGFβ已牽涉多種生物過程，包括纖維化、免疫調節及癌症進展。TGFβ1為蛋白質之TGFβ超家族之第一確定成員。如同TGFβ超家族之其他成員，TGFβ1及同功型TGFβ2及TGFβ3最初表現為無活性前驅體原蛋白形式(稱為TGFβ)。TGFβ蛋白(例如TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)藉由原蛋白轉換酶(例如弗林蛋白酶)以蛋白分解方式裂解以產生潛伏形式(稱為潛伏TGFβ)。在一些實施例中，TGFβ蛋白(例如TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)之原蛋白形式或潛伏形式可稱為「前/潛伏TGFβ蛋白」。可將TGFβ1呈遞至與多種分子複合之其他分子，該等分子包括例如GARP (以形成GARP-TGFβ1複合物)、LRRC33 (以形成LRRC33-TGFβ1複合物)、LTBP1 (以形成LTBP1-TGFβ1複合物)及/或LTBP3 (以形成LTBP3-TGFβ1複合物)。此等複合物中所存在之TGFβ1可呈潛伏形式(潛伏TGFβ1)或呈前驅體形式(前TGFβ1)。 TGF抑制劑之同功型選擇性及作用機制
自安全立場來看，已日益認識到，在同功型中廣泛抑制TGFβ可為所觀測到之毒性的原因，其強調至今沒有成功開發TGFβ抑制劑之事實。為避開潛在危險的不良作用，許多群組最近已轉向鑑別靶向同功型之一小類 而非全部且仍保持功效之抑制劑。然而，自功效立場來看，本領域之盛行觀點仍為抑制TGFβ之多種同功型以獲得治療效果為有利的，且為接納此觀點，提出將藉由「謹慎的給藥方案」之毒性管理作為解決方案(Brennan等人. (2018) mAbs, 10:1, 1-17)。與此假定一致，許多群組正開發靶向一種以上同功型之TGFβ抑制劑。此等包括TGFβ受體之低分子量拮抗劑，例如ALK5拮抗劑，諸如高倫替布(Galunisertib) (LY2157299單水合物)；抑制所有三種同功型之單株抗體(諸如中和抗體) (「泛抑制劑」抗體) (參見例如WO 2018/134681)；優先抑制三種同功型中之兩種的單株抗體(例如針對TGFβ1/2 (例如WO 2016/161410)及TGFβ1/3 (例如WO 2006/116002)之抗體；及經工程改造之分子(例如融合蛋白)，諸如配位體捕獲劑(例如WO 2018/029367；WO 2018/129331及WO 2018/158727)。類似地，整合素抑制劑(諸如αVβ6)亦阻斷TGFβ1及TGFβ3兩者之整合素依賴性活化且因此可被視為TGFβ信號傳導之同功型非選擇性抑制劑。另外，選擇性結合及中和TGFβ1與TGFβ2之抗體(亦即TGFβ1/2抑制劑)的實例包括XOMA 089 (或NIS793)及變體(參見例如WO 2016/161410)。
先前，申請人證實單獨抑制TGFβ1即使在TGFβ1/3共表現之腫瘤(PCT/US2019/041373)中足以使免疫抑制腫瘤對檢查點抑制劑療法敏感。類似地，在臨床前模型，包括小鼠肝纖維化模型中顯示TGFβ1選擇性抑制劑緩和纖維化，其中兩個TGFβ1/3同功型皆共表現於纖維化組織中，但在離散細胞類型中，如藉由免疫組織化學所觀測(現資料顯示)。出人意料地，TGFβ3之抑制促進促纖維化表型。當單獨使用TGFβ3抑制劑時，觀測到纖維化之加重。另外，當與TGFβ1選擇性抑制劑組合使用時，TGFβ3抑制劑減輕TGFβ1選擇性抑制劑之抗纖維化作用，如纖維化肝臟中之膠原蛋白積聚增加所證明。此等結果增加了針對TGFβ3之抑制性效能可能為TGFβ抑制劑的非所需特徵之可能性，該等TGFβ抑制劑在關注纖維化之情況下用作治療。
除纖維化情形以外，此未預期發現存在更廣泛含義，此係因為促纖維化表型(例如增加之膠原蛋白沈積至ECM中)不僅與纖維化相關聯，且亦與癌症進展之態樣(諸如腫瘤侵襲及癌轉移)相關聯。參見例如Chakravarthy等人(Nature Communications, (2018) 9:4692.  「TGF-β-associated extracellular matrix genes link cancer-associated fibroblasts to immune evasion and immunotherapy failure」)。具有失調ECM之患病組織，包括各種腫瘤類型之纖維化組織及基質，可表現TGFβ1及TGFβ3兩者。迄今為止，多個群組致力於開發靶向兩種此等同功型之TGFβ抑制劑，諸如配位體捕獲劑、中和抗體及整合素抑制劑。然而，本文中呈現之發現注意到此類方法可能實際上使疾病加重(例如惡化)。
因此，本發明提供用於治療涉及ECM失調之病症(諸如纖維化及癌症)的教示，應選擇不 專一性靶向TGFβ3之TGFβ抑制劑。較佳地，此類抑制劑為TGFβ1之同功型選擇性抑制劑，諸如選擇性靶向LTBP1/3相關TGFβ1之抑制劑(例如如本文所揭示)。相關方法包括一種選擇TGFβ抑制劑用於治療個體之纖維化病症之方法，其中該方法包括以下步驟：測試一或多種候選抑制劑能夠抑制TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之效能，及選擇抑制TGFβ1但不抑制TGFβ3之抑制劑用於治療用途。相關處理方法可以進一步包含，以足以治療纖維化病症或治療患有纖維化病症或處於產生纖維化病症之風險下的個體之量，向個體投與抑制TGFβ1但不會抑制TGFβ3之抑制劑的步驟。較佳地，所選抑制劑為選擇性抑制LTBP1-及/或LTBP3-相關TGFβ1信號傳導(例如如本文所揭示)之抗體或其片段。在一些實施例中，處於患上纖維化病症之風險下之個體可能罹患代謝病症，諸如糖尿病、肥胖症及NASH。所提議之排除患者亞群旨在降低觸發、促進或加重促纖維化作用之風險。
除以上解決之抑制TGFβ3之可能問題以外，Takahashi 等人(Nat Metab. 2019, 1(2): 291-303)最近報導TGFβ2在調節代謝方面之有益作用。作者將TGFβ2鑑別為運動誘導之脂肪細胞因子，其刺激活體外葡萄糖及脂肪酸攝取，以及活體內組織葡萄糖攝取；其在肥胖小鼠中改善代謝；及其減少高脂飲食誘導之發炎。此外，作者觀察到乳酸鹽(其為在運動期間自肌肉釋放之代謝物)刺激人類脂肪細胞中之TGFβ2表現，且乳酸鹽降低劑減少循環TGFβ2含量且降低葡萄糖耐受性方面之運動刺激改良。此等觀測結果表明對TGFβ2同功型具有抑制活性之TGFβ抑制劑的治療用途至少在代謝態樣中可為有害的。
在不受特定理論束縛之情況下，預期選擇TGFβ1選擇性抑制劑作為TGFβ抑制劑以用於治療代謝疾病，諸如與NASH相關之肝纖維化為有利的。在較佳實施例中，經選擇用於治療代謝疾病之TGFβ1-選擇性抑制劑選擇性抑制LTBP1/3-相關TGFβ1，諸如本文所揭示之抗體及片段。因此，本發明包括用於治療個體之代謝疾病之TGFβ抑制劑，其中該治療包含選擇抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2之TGFβ抑制劑，視情況其中該抑制劑為TGFβ1選擇性，以及向罹患代謝疾病之個體投與抑制劑。代謝疾病可為肝病，諸如肝纖維化、NASH、NAFLD，視情況伴有肥胖症及/或2型糖尿病。在較佳實施例中，TGFβ1選擇性抑制劑為選擇性靶向基質相關TGFβ1 (例如LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1)之抗體或其抗原結合片段，諸如本文所揭示之彼等。
在較佳實施例中，用於治療纖維化病症之TGFβ抑制劑為能夠在活體內靶向基質相關含TGFβ1潛伏複合物之TGFβ1的同功型選擇性活化抑制劑(諸如具有本文所揭示之低kOFF 或長t½之新穎抗體)。
本發明之抗體藉由阻止TGFβ1活化之步驟起作用。在一些實施例中，此類抑制劑可抑制TGFβ1之整合素依賴性(例如機械或力驅動)活化。在一些實施例中，此類抑制劑可抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性或經蛋白酶誘導之活化。後者包括以整合素非依賴性方式抑制TGFβ1活化步驟之抑制劑。在一些實施例中，此類抑制劑可無關於活化模式抑制TGFβ1活化，例如抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及蛋白酶依賴性活化兩者。可活化TGFβ1之蛋白酶之非限制性實例包括絲胺酸蛋白酶，諸如激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶以及鋅金屬蛋白酶(MMP家族) (諸如MMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-13)及ADAM蛋白酶(例如ADAM10及ADAM17)。激肽釋放酶包括血漿-激肽釋放酶及組織激肽釋放酶，諸如KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14及KLK15。 潛伏TGFβ-結合蛋白(LTBP)
在哺乳動物中存在四個已知的LTBP (LTBP1-4)，其各自具有多個剪接變體(Robertson, I.B., 等人, Matrix Biol, 2015. 47: 第44-53頁)。LTBP2為不與潛伏TGFβ結合之唯一LTBP(Saharinen, J.及J. Keski-Oja, Mol Biol Cell, 2000. 11(8): 第2691-704頁)。雖然LTBP1或LTBP3與潛伏TGFβ1之間的結合已得到良好證實，但LTBP4在TGFβ呈遞中之作用較不清楚。與LTBP4及潛伏TGFβ1之複合物的形成效率似乎低得多，可能歸因於LTBP4之TGFβ結合結構域中不存在若干個帶負電殘基。(Saharinen, J.及J. Keski-Oja, Mol Biol Cell, 2000. 11(8): 第2691-704頁；Chen, Y., 等人, J Mol Biol, 2005. 345(1): 第175-86頁)。LTBP4S-/-小鼠及Urban-Rifkin-Davis症候群患者(其在LTBP4中具有無效突變)均罹患經破壞彈性纖維總成(Urban, Z., 等人, Am J Hum Genet, 2009. 85(5): 第593-605頁；Dabovic, B., 等人, J Cell Physiol, 2015. 230(1): 第226-36頁)。另外，雖然LTBP4S-/-小鼠具有肺間隔及彈性發生缺陷，但具有LTBP4 (其不能與潛伏TGFβ1形成複合物)之轉殖基因小鼠不具有明顯表型(Dabovic, B., 等人, J Cell Physiol, 2015. 230(1): 第226-36頁)。LTBP4是否直接參與藉由充當呈遞分子之潛伏TGFβ1的調控並不清楚；實際上可能需要LTBP4以便在ECM中適當形成彈性原纖維且其損失經由ECM中之缺陷間接影響潛伏TGFβ1活化。
在一個態樣中，本發明係關於選擇性結合於含有TGFβ原蛋白及LTBP蛋白(例如LTBP1或LTBP3)之複合物的抑制劑，例如免疫球蛋白，例如抗體或其抗原結合部分。在一較佳實施例中，TGFβ蛋白為TGFβ1。在一些實施例中，本文揭示之結合分子選擇性地結合於含有前/潛伏TGFβ1及LTBP1或LTBP3之複合物。此類結合分子可允許TGFβ1活性以情形依賴性方式選擇性調節，亦即藉由在LTPB蛋白情形下，在無需調節與其他呈遞分子(例如GARP及/或LRRC33)複合之TGFβ1之活性的情況下調節TGFβ1。 選擇性抑制 LTBP 介導之 TGF β 活化之抗體
本發明提供選擇性靶向基質或ECM相關TGFβ活性之新穎TGFβ抑制劑。更具體言之，此類抑制劑包括專一性結合TGFβ1 (例如前TGFβ1複合物)在ECM環境內之潛伏形式且防止成熟生長因子在生態棲位處自複合物釋放之TGFβ1活化的同功型專一性、情形選擇性抑制劑。此類基質靶向抑制劑具有情形專一性，因為其選擇性結合與ECM呈遞分子，即LTBP1及/或LTBP3相關之前TGFβ1。因此，本文揭示單株抗體及其片段，其能夠結合存在於LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物中之抗原決定基，而抗原決定基不存在於GARP-前TGFβ1複合物及/或LRR33-前TGFβ1複合物中。
在一些實施例中，本發明之情形選擇性抑制劑能夠專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中在適合的活體外結合分析(諸如Octet)中，各親和力＜5 nM (量測KD 值)。在較佳實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-前TGFβ1，其中在適合的活體外結合分析(諸如Octet)中，各親和力＜5 nM (量測KD 值)。另一方面，此等情形專一性抗體在相同分析條件下不顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物或人類LRRC33-前TGFβ1複合物之任何可偵測結合。較佳地，此類抗體或片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-前TGFβ1複合物中之每一者，其KD 小於1 nM。
在一些實施例中，本發明之情形選擇性抑制劑能夠專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物或人類LTBP3-前TGFβ1複合物。在相同分析條件下皆不顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物或人類LRR33-前TGFβ1複合物之任何可偵測結合。
此項技術熟悉適合之活體外結合分析，包括例如基於BLI之分析(諸如Octet)及基於SPR之分析(諸如Biacore)，其可用於量測抗體-抗原相互作用(例如結合動力學)。如本文所用，此等情形下之「無結合」可指藉由特定分析無可偵測結合，例如結合(若存在)低於分析之靈敏度。在一些實施例中，「無結合」可指藉由截止值設定之「無意義的結合」，其界定如藉由特定分析系統所量測之被認為係有意義的所需之最低水準。舉例而言，在BLI (Octet)分析中，在預定分析物(例如目標抗原)濃度(例如100 nM、200 nM等)下量測之0.1 nm之光學位移可指示有意義的結合，低於該結合可被認為無結合(參見例如實例9)。類似地，在典型SPR (Biacore)分析中，截止水準可為0.2 RU (共振單元)。在一些實施例中，自在較高濃度下獲得之所有感測器圖譜減去在0 nM抗體下之信號(例如背景雜訊)。在此等條件下，使用SPR (Biacore)，0.2 RU可為適合截止值。
在一些實施例中，本發明之情形選擇性抑制劑能夠專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，而不顯示在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測的與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。
在一些實施例中，本發明之情形選擇性抑制劑結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。在一些實施例中，KD 如藉由BLI或SPR所測定。在一些實施例中，KD 如藉由SPR所測定。
在一些實施例中，本發明之情形選擇性抑制劑能夠專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，而不顯示在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測的與LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物之可偵測結合。
在一些實施例中，本發明之情形選擇性抑制劑結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。在一些實施例中，KD 如藉由BLI或SPR所測定。在一些實施例中，KD 如藉由SPR所測定。
本發明包括識別較佳抗體(例如免疫球蛋白及抗原結合片段，諸如Fab，以及併有此類片段之經工程改造之構築體)，一旦結合於其目標/抗原(例如人類LTBP1-前TGFβ1、人類LTBP3-TGFβ1)，即與抗原緩慢解離。因此，選擇本發明之新穎抗體，不僅由於其高整體親和力(諸如不超過5 nM之KD )，而且尤其其低解離速率。根據本發明，如藉由BLI所量測(例如當結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-TGFβ1時)，此類抗體之解離速率≤ 5×10-4 (1/s)。抗體或抗原結合片段之≤5×10-4 (1/s)的此類解離速率可為單價解離速率或二價解離速率。在一些實施例中，抗體或片段自人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-TGFβ1，較佳地人類LTBP1-前TGFβ1及人類LTBP3-TGFβ1兩者緩慢解離，其中如藉由SPR所量測，單價解離半時間(t½)為至少45分鐘(例如≥45、60、75、90分鐘)。另一方面，若結合於人類GARP-前TGFb1及/或LRRC33-TGFb1複合物為可偵測的，則此類抗體自人類GARP-前TGFβ1及/或人類LRRC33-TGFβ1複合物，尤其人類GARP-前TGFβ1快速解離。在一些實施例中，抗體自人類GARP-前TGFβ1解離，其中如藉由SPR所量測，t½小於5分鐘。在尤其較佳實施例中，抗體或片段顯示物種交叉反應性，使得其以相等親和力結合鼠類對應物。
此等複合物中所存在之TGFβ1可呈潛伏形式(潛伏TGFβ1)或呈前驅體形式(前TGFβ1)。在一個實施例中，抑制劑不顯著結合於單獨LTBP1 (例如當不與TGFβ1複合時)。在另一實施例中，抑制劑不顯著結合於單獨LTBP3 (例如當不與TGFβ1複合時)。在另一實施例中，抑制劑不顯著結合於單獨TGFβ1 (例如不與LTBP1或LTBP3複合的前TGFβ1或潛伏TGFβ1，或成熟TGFβ1)。在另一實施例中，選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑不顯著結合於含有TGFβ1及另一種呈遞分子之複合物，例如GARP-TGFβ1複合物(例如與前TGFβ1或潛伏TGFβ1複合之GARP)及/或LRRC33-TGFβ1複合物(例如與前TGFβ1或潛伏TGFβ1複合之LRRC33)。在一個實施例中，選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1之抑制劑不顯著結合以下中之一或多種(例如兩種或更多種、三種或更多種或所有四種)：單獨LTBP1、單獨TGFβ1、GARP-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物。另外，在一些實施例中，抑制劑不顯著結合單獨LTBP3。
如本文所用，術語「抑制劑」係指能夠阻斷或拮抗TGFβ1信號傳導之任何藥劑。此類藥劑可包括TGFβ1之小分子拮抗劑及TGFβ1之生物拮抗劑(例如蛋白質片段及抗體)。在一些實施例中，抑制劑可為抗體(包括其片段，諸如域抗體(dAb)，如例如美國專利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；及6,696,245中所描述)、小分子抑制劑、阿德奈汀(Adnectin)、親和抗體(Affibody)、DARPin、抗運載蛋白(Anticalin)、高親和性多聚體(Avimer)、Versabody或基因療法。使用本發明所涵蓋之抑制劑亦包括抗體模擬物，諸如單功能抗體及單結構域抗體。單功能抗體為通常採用III型纖維結合蛋白結構域(FN3)作為分子架構之合成結合蛋白。單功能抗體包括基於第10個III型纖維結合蛋白結構域之Adnectins™。
在一些態樣中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)選擇性結合於呈遞於LTBP1/3-TGFβ1複合物上之抗原決定基，該抗原決定基不呈遞於GARP-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物上。在一些實施例中，抗原決定基由於LTBP1/3及/或TGFβ1之構形變化而可獲得，該構形變化在LTBP1/3及TGFβ1形成複合物時發生。在此實施例中，當蛋白質在複合物中不結合時抗原決定基不呈遞於LTBP1/3或TGFβ1中。在一個實施例中，當TGFβ1與LTBP1或LTBP3複合時，抗原決定基呈遞於TGFβ1上。在另一實施例中，當LTBP1與TGFβ1複合時，抗原決定基呈遞於LTBP1上。在另一實施例中，當LTBP3與TGFβ1複合時，抗原決定基呈遞於LTBP3上。在另一實施例中，抗原決定基包含來自LTBP1與TGFβ1之殘基。在另一實施例中，抗原決定基包含來自LTBP3及TGFβ1之殘基。
出人意料地，本文中揭示之LTBP1/3複合物選擇性抗體中之一些(例如Ab14、Ab20、Ab21-23、Ab17及Ab24-29)能夠在不存在呈遞分子(例如LTBP1/3)的情況下結合於小潛伏複合物(前TGFβ1 C4S)且仍發揮情形選擇性。不希望受理論所束縛，此發現表明抗體(及其變體或交叉競爭抗體)可結合LTBP1/3-前TGFβ1複合物及單獨前TGFβ1中可獲得之抗原決定基，但其在LRRC類型之呈遞分子(GARP或LRRC33)呈遞時不可獲得。抗原決定基可能完全位於潛伏TGFβ1上，但在複合GARP或LRRC33時受到阻隔(直接或間接)。
或者，根據本發明之LTBP選擇性抑制劑可結合包含LTBP1或LTBP3之一或多個胺基酸殘基及前TGFβ1之一或多個胺基酸殘基的組合性抗原決定基，其賦予與GARP/LRRC33-結合複合物相比，針對LTBP結合複合物之情形選擇性。在此等實施例中，對同功型(TGFβ1)以及情形(ECM)之選擇性可歸因於來自抗原複合物之兩個成分的組合比重。
在一些實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)對TGFβ1同功型具有選擇性。在此類實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)不結合於TGFβ2及/或TGFβ3。舉例而言，在一個實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物，但不結合TGFβ2或含有TGFβ2之複合物。在另一實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物，但不結合TGFβ3或含有TGFβ3之複合物。
在一些實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)並不防止TGFβ1結合於整合素。舉例而言，在一些實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)並不遮蔽TGFβ1之整合素結合位點。
在一個態樣中，本發明提供調節TGFβ1活性之功能抑制劑，例如抗體。在例示性實施例中，本文所描述之抗體為抑制TGFβ1之功能或活性的抑制性抗體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分抑制TGFβ1自LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物活化(釋放)。在例示性實施例中，本發明提供TGFβ1活化之「情形專一性」或「情形選擇性」抑制劑。此類抑制劑可結合LTBP1/3-TGFβ1複合物且抑制LTBP1或LTBP3呈遞之TGFβ1之活化，而不抑制GARP及/或LRRC33呈遞之TGFβ1之活化。因此，在一些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合部分抑制成熟TGFβ1自LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物釋放，但不抑制成熟TGFβ1自GARP-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物釋放。歸因於LTBP、GARP及LRRC33之不同定位，由本發明提供之TGFβ1之情形專一性抑制劑可活體內阻斷特定小類之TGFβ1活性。在一個實施例中，本文所提供之抑制LTBP1/3-TGFβ1但不抑制GARP-TGFβ1或LRRC33-TGFβ1之情形專一性抗體可用於抑制定位於胞外基質之TGFβ1。在另一實施例中，情形專一性抗體可抑制TGFβ1而不調節TGFβ1相關之免疫活性或免疫反應。在另一實施例中，在不調節與造血細胞相關之TGFβ1活性之情況下，可使用情形專一性抗體以抑制與胞外基質相關之TGFβ1活性。因此，在GARP及/或LRRC33之情形下的TGFβ1活化為非所需之應用中，可使用情形專一性抗體以抑制LTBP1/3相關之TGFβ1活性，如本文所描述。
在一些實施例中，TGFβ1包含天然存在之哺乳動物胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβ1包含天然存在之人類胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβ1包含人類、猴、大鼠或小鼠胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合部分選擇性結合於包含TGFβ1蛋白(包含SEQ ID NO:9中所示之胺基酸序列)及LTBP1或LTBP3之複合物。在一些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合部分選擇性結合於包含非天然存在之TGFβ1胺基酸序列(在本文中另外稱為非天然存在之TGFβ1)的LTBP1/3-TGFβ1複合物。舉例而言，非天然存在之TGFβ1可包含相對於天然存在之TGFβ1胺基酸序列的一或多個經重組生成之突變。
在一些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合部分不結合TGFβ2及/或TGFβ3，或不結合於含有TGFβ2及/或TGFβ3之蛋白複合物。例示性TGFβ2及TGFβ3胺基酸序列分別示於SEQ ID NO:10及11中。在一些實施例中，如表1中所示，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3胺基酸序列包含如SEQ ID NO:12-23中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，如表2中所示，TGFβ1胺基酸序列包含如SEQ ID NO:24-31中所示之胺基酸序列。
TGFβ1
Figure 02_image001
TGFβ2
Figure 02_image003
TGFβ3
Figure 02_image005
表1.例示性TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3胺基酸序列
蛋白 序列 SEQ ID NO
前TGFβ1 LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGP LPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVL MVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRA ELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSP EWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQ VDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSS RHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKD LGWKWIHEP KGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAP CCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS 12
前TGFβ1 C4S LSTS KTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGP LPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVL MVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRA ELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSP EWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQ VDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSS RHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKD LGWKWIHEP KGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAP CCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS 13
前TGFβ1 D2G LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGP LPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVL MVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRA ELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSP EWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQ VDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSS RHGALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKD LGWKWIHEPK GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPC CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS 14
前TGFβ1 C4S D2G LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGP LPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVL MVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRA ELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSP EWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQ VDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSS RHGALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKD LGWKWIHEPK GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPC CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS 15
前TGFβ2 SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPE EVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKE VYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNL VKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKD LTSPTQRYID SKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKD RNLGFKISLH CPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIK STRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAY CFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCA GACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPL TILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS 16
前TGFβ2 C5S SLSTSSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEE VPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEV YKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLV KAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKD LTSPTQRYIDS KVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKD RNLGFKISLHC PCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKS TRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYC FRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAG ACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTI LYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS 17
前TGFβ2 C5S D2G SLSTSSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEE VPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEV YKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLV KAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKD LTSPTQRYIDS KVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKD RNLGFKISLHC PCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKS TRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKGALDAAYCF RNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGA CPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTIL YYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS 18
前TGFβ2 D2G SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPE EVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKE VYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNL VKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKD LTSPTQRYID SKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKD RNLGFKISLH CPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIK STRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKGALDAAYC FRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAG ACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTI LYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS 19
前TGFβ3 SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMT HVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAK EIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRT NLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYI GGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHC PCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRL KKQKD HHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNY CFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCS GPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPL TILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS 20
前TGFβ3 C7S SLSLSTSTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMT HVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAK EIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRT NLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYI GGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHC PCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRL KKQKD HHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNY CFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCS GPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPL TILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS 21
前TGFβ3 C7S D2G SLSLSTSTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMT HVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAK EIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRT NLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYI GGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHC PCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRL KKQKD HHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKGALDTNYC FRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGP CPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTIL YYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS 22
前TGFβ3 D2G SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMT HVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAK EIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRT NLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYI GGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHC PCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRL KKQKD HHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKGALDTNYC FRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGP CPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTIL YYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS 23
表 2. 例示性非人類 TGF β 1 胺基酸序列
蛋白 物種 序列 SEQ ID NO
前TGFβ1 小鼠 LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKEV TRVLMVDRNNAIYEKTKD ISHSIYMFFNTSDIREAVPEPP LLSRAELRLQRLKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNRL LTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQGDGIQGFRFSAHCS CDSKD NKLHVEINGISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDF RKD LGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVL ALYNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQ LSNMIVRSCKCS 24
前TGFβ1 食蟹獼猴 LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVT RVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPV LLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRL LAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSC DSKD NTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDF RKD LGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVL ALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQ LSNMIVRSCKCS 25
TGFβ1 LAP C4S 小鼠 LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKEV TRVLMVDRNNAIYEKTKD ISHSIYMFFNTSDIREAVPEPP LLSRAELRLQRLKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNRL LTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQGDGIQGFRFSAHCS CDSKD NKLHVEINGISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHRR 26
TGFβ1 LAP C4S 食蟹獼猴 LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVT RVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPV LLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRL LAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSC DSKD NTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHRR 27
前TGFβ1 C4S D2G 小鼠 LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKEV TRVLMVDRNNAIYEKTKD ISHSIYMFFNTSDIREAVPEPP LLSRAELRLQRLKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNRL LTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQGDGIQGFRFSAHCS CDSKD NKLHVEINGISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHGALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFR KD LGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLA LYNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLS NMIVRSCKCS 28
前TGFβ1 C4S 小鼠 LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKEV TRVLMVDRNNAIYEKTKD ISHSIYMFFNTSDIREAVPEPP LLSRAELRLQRLKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNRL LTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQGDGIQGFRFSAHCS CDSKD NKLHVEINGISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDF RKD LGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVL ALYNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQ LSNMIVRSCKCS 29
前TGFβ1 C4S 食蟹獼猴 LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVT RVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPV LLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRL LAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSC DSKD NTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDF RKD LGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVL ALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQ LSNMIVRSCKCS 30
前TGFβ1 C4S D2G 食蟹獼猴 LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPP GPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVT RVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPV LLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRL LAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSC DSKD NTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHGALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFR KD LGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLA LYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQL SNMIVRSCKCS 31
在一些實施例中，如本文所描述之抗體或其抗原結合部分能夠選擇性結合於LTBP-TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗原性蛋白複合物(例如LTBP-TGFβ1複合物)可包含選自以下之LTBP蛋白：LTBP1、LTBP2、LTBP3及LTBP4。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物。在一些實施例中，LTBP1蛋白為天然存在之蛋白。在一些實施例中，LTBP1蛋白為非天然存在之蛋白。在一些實施例中，LTBP1蛋白為重組蛋白。此類重組LTBP1蛋白可包含LTBP1，或者其剪接變體及/或其片段。重組LTBP1蛋白亦可經修飾以包含一或多個可偵測標記。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含前導序列(例如天然或非天然前導序列)。在一些實施例中，LTBP1蛋白不包含前導序列(亦即該前導序列已經加工或裂解)。此類可偵測標記可包括但不限於生物素標記、聚組胺酸標籤、myc標籤、HA標籤及/或螢光標籤。在一些實施例中，LTBP1蛋白為哺乳動物LTBP1蛋白。在一些實施例中，LTBP1蛋白為人類、猴、小鼠或大鼠LTBP1蛋白。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含如表3中之SEQ ID NO:32中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含如表3中之SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，如本文中所描述之抗體或其抗原結合部分能夠結合於LTBP3-TGFβ1複合物。在一些實施例中，LTBP3蛋白為天然存在之蛋白。在一些實施例中，LTBP3蛋白為非天然存在之蛋白。在一些實施例中，LTBP3蛋白為重組蛋白。此類重組LTBP3蛋白可包含LTBP3，或者其剪接變體及/或其片段。在一些實施例中，LTBP3蛋白包含前導序列(例如天然或非天然前導序列)。在一些實施例中，LTBP3蛋白不包含前導序列(亦即該前導序列已經加工或裂解)。重組LTBP3蛋白亦可經修飾以包含一或多個可偵測標記。此類可偵測標記可包括但不限於生物素標記、聚組胺酸標籤、myc標籤、HA標籤及/或螢光標籤。在一些實施例中，LTBP3蛋白為哺乳動物LTBP3蛋白。在一些實施例中，LTBP3蛋白為人類、猴、小鼠或大鼠LTBP3蛋白。在一些實施例中，LTBP3蛋白包含如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，LTBP3蛋白包含如SEQ ID NO:36或37中所示之胺基酸序列。
表3.例示性LTBP胺基酸序列.
蛋白 物種 序列 SEQ ID NO
LTBP1S 人類 NHTGRIKVVFTPSICKVTCTKGSCQNSCEKGNTTTL ISENGHAADTLTATNFRVVICHLPCMNGGQCSSRD KCQCPPNFTGKLCQIPVHGASVPKLYQHSQQPGKA LGTHVIHSTHTLPLTVTSQQGVKVKFPPNIVNIHVK HPPEASVQIHQVSRIDGPTGQKTKEAQPGQSQVSY QGLPVQKTQTIHSTYSHQQVIPHVYPVAAKTQLGR CFQETIGSQCGKALPGLSKQEDCCGTVGTSWGFNK CQKCPKKPSYHGYNQMMECLPGYKRVNNTFCQDI NECQLQGVCPNGECLNTMGSYRCTCKIGFGPDPTF SSCVPDPPVISEEKGPCYRLVSSGRQCMHPLSVHLT KQLCCCSVGKAWGPHCEKCPLPGTAAFKEICPGG MGYTVSGVHRRRPIHHHVGKGPVFVKPKNTQPVA KSTHPPPLPAKEEPVEALTFSREHGPGVAEPEVATA PPEKEIPSLDQEKTKLEPGQPQLSPGISTIHLHPQFPV VIEKTSPPVPVEVAPEASTSSASQVIAPTQVTEINEC TVNPDICGAGHCINLPVRYTCICYEGYRFSEQQRKC VDIDECTQVQHLCSQGRCENTEGSFLCICPAGFMAS EEGTNCIDVDECLRPDVCGEGHCVNTVGAFRCEYC DSGYRMTQRGRCEDIDECLNPSTCPDEQCVNSPGS YQCVPCTEGFRGWNGQCLDVDECLEPNVCANGDC SNLEGSYMCSCHKGYTRTPDHKHCRDIDECQQGN LCVNGQCKNTEGSFRCTCGQGYQLSAAKD QCEDI DECQHRHLCAHGQCRNTEGSFQCVCDQGYRASGL GDHCEDINECLEDKSVCQRGDCINTAGSYDCTCPD GFQLDDNKTCQDINECEHPGLCGPQGECLNTEGSF HCVCQQGFSISADGRTCEDIDECVNNTVCDSHGFC DNTAGSFRCLCYQGFQAPQDGQGCVDVNECELLS GVCGEAFCENVEGSFLCVCADENQEYSPMTGQCR SRTSTDLDVDVDQPKEEKKECYYNLNDASLCDNV LAPNVTKQECCCTSGVGWGDNCEIFPCPVLGTAEF TEMCPKGKGFVPAGESSSEAGGENYKD ADECLLFG QEICKNGFCLNTRPGYECYCKQGTYYDPVKLQCFD MDECQDPSSCIDGQCVNTEGSYNCFCTHPMVLDAS EKRCIRPAESNEQIEETDVYQDLCWEHLSDEYVCS RPLVGKQTTYTECCCLYGEAWGMQCALCPLKD SD DYAQLCNIPVTGRRQPYGRDALVDFSEQYTPEADP YFIQDRFLNSFEELQAEECGILNGCENGRCVRVQEG YTCDCFDGYHLDTAKMTCVDVNECDELNNRMSL CKNAKCINTDGSYKCLCLPGYVPSDKPNYCTPLNT ALNLEKD SDLE 32
LTBP1S 食蟹獼猴 NHTGRIKVVFTPSICKVTCTKGSCQNSCEKGNTTTL ISENGHAADTLTATNFRVVLCHLPCMNGGQCSSRD KCQCPPNFTGKLCQIPVHGASVPKLYQHSQQPGKA LGTHVIHSTHTLPLTVTSQQGVKVKFPPNIVNIHVK HPPEASVQIHQVSRIDGPTGQKTKEAQPGQSQVSY QGLPVQKTQTIHSTYSHQQVIPHVYPVAAKTQLGR CFQETIGSQCGKALPGLSKQEDCCGTVGTSWGFNK CQKCPKKPSYHGYNQMMECLPGYKRVNNTFCQDI NECQLQGVCPNGECLNTMGSYRCTCKIGFGPDPTF SSCVPDPPVISEEKGPCYRLVSSGRQCMHPLSVHLT KQLCCCSVGKAWGPHCEKCPLPGTAAFKEICPGG MGYTVSGVHRRRPIHHHVGKGPVFVKPKNTQPVA KSTHPPPLPAKEEPVEALTFSREHGPGVAEPEVATA PPEKEIPSLDQEKTKLEPGQPQLSPGISTIHLHPQFPV VIEKTSPPVPVEVAPEASTSSASQVIAPTQVTEINEC TVNPDICGAGHCINLPVRYTCICYEGYKFSEQQRKC VDIDECTQVQHLCSQGRCENTEGSFLCICPAGFMAS EEGTNCIDVDECLRPDVCGEGHCVNTVGAFRCEYC DSGYRMTQRGRCEDIDECLNPSTCPDEQCVNSPGS YQCVPCTEGFRGWNGQCLDVDECLEPNVCTNGDC SNLEGSYMCSCHKGYTRTPDHKHCKD IDECQQGN LCVNGQCKNTEGSFRCTCGQGYQLSAAKD QCEDI DECQHHHLCAHGQCRNTEGSFQCVCDQGYRASGL GDHCEDINECLEDKSVCQRGDCINTAGSYDCTCPD GFQLDDNKTCQDINECEHPGLCGPQGECLNTEGSF HCVCQQGFSISADGRTCEDIDECVNNTVCDSHGFC DNTAGSFRCLCYQGFQAPQDGQGCVDVNECELLS GVCGEAFCENVEGSFLCVCADENQEYSPMTGQCR SRTSTDLDVEQPKEEKKECYYNLNDASLCDNVLAP NVTKQECCCTSGAGWGDNCEIFPCPVLGTAEFTEM CPKGKGFVPAGESSSEAGGENYKD ADECLLFGQEI CKNGFCLNTRPGYECYCKQGTYYDPVKLQCFDMD ECQDPSSCIDGQCVNTEGSYNCFCTHPMVLDASEK RCIRPAESNEQIEETDVYQDLCWEHLSDEYVCSRPL VGKQTTYTECCCLYGEAWGMQCALCPMKD SDDY AQLCNIPVTGRRQPYGRDALVDFSEQYAPEADPYFI QDRFLNSFEELQAEECGILNGCENGRCVRVQEGYT CDCFDGYHLDTAKMTCVDVNECDELNNRMSLCK NAKCINTEGSYKCLCLPGYVPSDKPNYCTPLNTAL NLEKD SDLE 33
LTBP1S 小鼠 NHTGRIKVVFTPSICKVTCTKGNCQNSCQKGNTTT LISENGHAADTLTATNFRVVICHLPCMNGGQCSSR DKCQCPPNFTGKLCQIPVLGASMPKLYQHAQQQG KALGSHVIHSTHTLPLTMTSQQGVKVKFPPNIVNIH VKHPPEASVQIHQVSRIDSPGGQKVKEAQPGQSQV SYQGLPVQKTQTVHSTYSHQQLIPHVYPVAAKTQL GRCFQETIGSQCGKALPGLSKQEDCCGTVGTSWGF NKCQKCPKKQSYHGYTQMMECLQGYKRVNNTFC QDINECQLQGVCPNGECLNTMGSYRCSCKMGFGP DPTFSSCVPDPPVISEEKGPCYRLVSPGRHCMHPLS VHLTKQICCCSVGKAWGPHCEKCPLPGTAAFKEIC PGGMGYTVSGVHRRRPIHQHIGKEAVYVKPKNTQ PVAKSTHPPPLPAKEEPVEALTSSWEHGPRGAEPEV VTAPPEKEIPSLDQEKTRLEPGQPQLSPGVSTIHLHP QFPVVVEKTSPPVPVEVAPEASTSSASQVIAPTQVT EINECTVNPDICGAGHCINLPVRYTCICYEGYKFSE QLRKCVDIDECAQVRHLCSQGRCENTEGSFLCVCP AGFMASEEGTNCIDVDECLRPDMCRDGRCINTAGA FRCEYCDSGYRMSRRGYCEDIDECLKPSTCPEEQC VNTPGSYQCVPCTEGFRGWNGQCLDVDECLQPKV CTNGSCTNLEGSYMCSCHRGYSPTPDHRHCQDIDE CQQGNLCMNGQCRNTDGSFRCTCGQGYQLSAAK DQCEDIDECEHHHLCSHGQCRNTEGSFQCVCNQG YRASVLGDHCEDINECLEDSSVCQGGDCINTAGSY DCTCPDGFQLNDNKGCQDINECAQPGLCGSHGECL NTQGSFHCVCEQGFSISADGRTCEDIDECVNNTVC DSHGFCDNTAGSFRCLCYQGFQAPQDGQGCVDVN ECELLSGVCGEAFCENVEGSFLCVCADENQEYSPM TGQCRSRVTEDSGVDRQPREEKKECYYNLNDASL CDNVLAPNVTKQECCCTSGAGWGDNCEIFPCPVQ GTAEFTEMCPRGKGLVPAGESSYDTGGENYKD AD ECLLFGEEICKNGYCLNTQPGYECYCKQGTYYDPV KLQCFDMDECQDPNSCIDGQCVNTEGSYNCFCTHP MVLDASEKRCVQPTESNEQIEETDVYQDLCWEHLS EEYVCSRPLVGKQTTYTECCCLYGEAWGMQCALC PMKD SDDYAQLCNIPVTGRRRPYGRDALVDFSEQ YGPETDPYFIQDRFLNSFEELQAEECGILNGCENGR CVRVQEGYTCDCFDGYHLDMAKMTCVDVNECSE LNNRMSLCKNAKCINTEGSYKCLCLPGYIPSDKPN YCTPLNSALNLDKESDLE 34
LTBP3S 人類 ETDECRLNQNICGHGECVPGPPDYSCHCNPGYRSH PQHRYCVDVNECEAEPCGPGRGICMNTGGSYNCH CNRGYRLHVGAGGRSCVDLNECAKPHLCGDGGFC INFPGHYKCNCYPGYRLKASRPPVCEDIDECRDPSS CPDGKCENKPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDVNE CAEGSPCSPGWCENLPGSFRCTCAQGYAPAPDGRS CLDVDECEAGDVCDNGICSNTPGSFQCQCLSGYHL SRDRSHCEDIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCLCP QGHRLVGGRKCQDIDECSQDPSLCLPHGACKNLQ GSYVCVCDEGFTPTQDQHGCEEVEQPHHKKECYL NFDDTVFCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHCE IYPCPVYSSAEFHSLCPDGKGYTQDNNIVNYGIPAH RDIDECMLFGSEICKEGKCVNTQPGYECYCKQGFY YDGNLLECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYRC ACTPPAEYSPAQRQCL 364
LTBP3 人類 GPAGERGAGGGGALARERFKVVFAPVICKRTCLK GQCRDSCQQGSNMTLIGENGHSTDTLTGSGFRVVV CPLPCMNGGQCSSRNQCLCPPDFTGRFCQVPAGGA GGGTGGSGPGLSRTGALSTGALPPLAPEGDSVASK HAIYAVQVIADPPGPGEGPPAQHAAFLVPLGPGQIS AEVQAPPPVVNVRVHHPPEASVQVHRIESSNAESA APSQHLLPHPKPSHPRPPTQKPLGRCFQDTLPKQPC GSNPLPGLTKQEDCCGSIGTAWGQSKCHKCPQLQY TGVQKPGPVRGEVGADCPQGYKRLNSTHCQDINE CAMPGVCRHGDCLNNPGSYRCVCPPGHSLGPSRT QCIADKPEEKSLCFRLVSPEHQCQHPLTTRLTRQLC CCSVGKAWGARCQRCPTDGTAAFKEICPAGKGYH ILTSHQTLTIQGESDFSLFLHPDGPPKPQQLPESPSQ APPPEDTEEERGVTTDSPVSEERSVQQSHPTATTTP ARPYPELISRPSPPTMRWFLPDLPPSRSAVEIAPTQV TETDECRLNQNICGHGECVPGPPDYSCHCNPGYRS HPQHRYCVDVNECEAEPCGPGRGICMNTGGSYNC HCNRGYRLHVGAGGRSCVDLNECAKPHLCGDGGF CINFPGHYKCNCYPGYRLKASRPPVCEDIDECRDPS SCPDGKCENKPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDVN ECAEGSPCSPGWCENLPGSFRCTCAQGYAPAPDGR SCLDVDECEAGDVCDNGICSNTPGSFQCQCLSGYH LSRDRSHCEDIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCLC PQGHRLVGGRKCQDIDECSQDPSLCLPHGACKNLQ GSYVCVCDEGFTPTQDQHGCEEVEQPHHKKECYL NFDDTVFCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHCE IYPCPVYSSAEFHSLCPDGKGYTQDNNIVNYGIPAH RDIDECMLFGSEICKEGKCVNTQPGYECYCKQGFY YDGNLLECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYRC ACTPPAEYSPAQRQCLSPEEMDVDECQDPAACRPG RCVNLPGSYRCECRPPWVPGPSGRDCQLPESPAER APERRDVCWSQRGEDGMCAGPLAGPALTFDDCCC RQGRGWGAQCRPCPPRGAGSHCPTSQSESNSFWD TSPLLLGKPPRDEDSSEEDSDECRCVSGRCVPRPGG AVCECPGGFQLDASRARCVDIDECRELNQRGLLCK SERCVNTSGSFRCVCKAGFARSRPHGACVPQRRR 35
LTBP3 食蟹獼猴 GPAGERGAGGGGALARERFKVVFAPVICKRTCLK GQCRDSCQQGSNMTLIGENGHSTDTLTGSGFRVVV CPLPCMNGGQCSSRNQCLCPPDFTGRFCQVPAGGA GGGTGGSGPGLSRAGALSTGALPPLAPEGDSVASK HAIYAVQVIADPPGPGEGPPAQHAAFLVPLGPGQIS AEVQAPPPVVNVRVHHPPEASVQVHRIESSNAEGA APSQHLLPHPKPSHPRPPTQKPLGRCFQDTLPKQPC GSNPLPGLTKQEDCCGSIGTAWGQSKCHKCPQLQY TGVQKPGPVRGEVGADCPQGYKRLNSTHCQDINE CAMPGVCRHGDCLNNPGSYRCVCPPGHSLGPSRT QCIADKPEEKSLCFRLVSPEHQCQHPLTTRLTRQLC CCSVGKAWGARCQRCPADGTAAFKEICPAGKGYH ILTSHQTLTIQGESDFSLFLHPDGPPKPQQLPESPSQ APPPEDTEEERGVTTDSPVSEERSVQQSHPTATTSP ARPYPELISRPSPPTMRWFLPDLPPSRSAVEIAPTQV TETDECRLNQNICGHGECVPGPPDYSCHCNPGYRS HPQHRYCVDVNECEAEPCGPGRGICMNTGGSYNC HCNRGYRLHVGAGGRSCVDLNECAKPHLCGDGGF CINFPGHYKCNCYPGYRLKASRPPVCEDIDECRDPS SCPDGKCENKPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDVN ECAEGSPCSPGWCENLPGSFRCTCAQGYAPAPDGR SCVDVDECEAGDVCDNGICTNTPGSFQCQCLSGYH LSRDRSHCEDIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCLC PQGHRLVGGRKCQDIDECTQDPGLCLPHGACKNL QGSYVCVCDEGFTPTQDQHGCEEVEQPHHKKECY LNFDDTVFCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHC EIYPCPVYSSAEFHSLCPDGKGYTQDNNIVNYGIPA HRDIDECMLFGAEICKEGKCVNTQPGYECYCKQGF YYDGNLLECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYR CACTPPAEYSPAQRQCLSPEEMDVDECQDPAACRP GRCVNLPGSYRCECRPPWVPGPSGRDCQLPESPAE RAPERRDVCWSQRGEDGMCAGPQAGPALTFDDCC CRQGRGWGAQCRPCPPRGAGSQCPTSQSESNSFW DTSPLLLGKPRRDEDSSEEDSDECRCVSGRCVPRPG GAVCECPGGFQLDASRARCVDIDECRELNQRGLLC KSERCVNTSGSFRCVCKAGFARSRPHGACVPQRRR 36
LTBP3 小鼠 GPAGERGTGGGGALARERFKVVFAPVICKRTCLKG QCRDSCQQGSNMTLIGENGHSTDTLTGSAFRVVVC PLPCMNGGQCSSRNQCLCPPDFTGRFCQVPAAGTG AGTGSSGPGLARTGAMSTGPLPPLAPEGESVASKH AIYAVQVIADPPGPGEGPPAQHAAFLVPLGPGQISA EVQAPPPVVNVRVHHPPEASVQVHRIEGPNAEGPA SSQHLLPHPKPPHPRPPTQKPLGRCFQDTLPKQPCG SNPLPGLTKQEDCCGSIGTAWGQSKCHKCPQLQYT GVQKPVPVRGEVGADCPQGYKRLNSTHCQDINEC AMPGNVCHGDCLNNPGSYRCVCPPGHSLGPLAAQ CIADKPEEKSLCFRLVSTEHQCQHPLTTRLTRQLCC CSVGKAWGARCQRCPADGTAAFKEICPGKGYHILT SHQTLTIQGESDFSLFLHPDGPPKPQQLPESPSRAPP LEDTEEERGVTMDPPVSEERSVQQSHPTTTTSPPRP YPELISRPSPPTFHRFLPDLPPSRSAVEIAPTQVTETD ECRLNQNICGHGQCVPGPSDYSCHCNAGYRSHPQH RYCVDVNECEAEPCGPGKGICMNTGGSYNCHCNR GYRLHVGAGGRSCVDLNECAKPHLCGDGGFCINFP GHYKCNCYPGYRLKASRPPICEDIDECRDPSTCPDG KCENKPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDVNECSEG TPCSPGWCENLPGSYRCTCAQYEPAQDGLSCIDVD ECEAGKVCQDGICTNTPGSFQCQCLSGYHLSRDRS RCEDIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCLCPLGHRL VGGRKCKKD IDECSQDPGLCLPHACENLQGSYVC VCDEGFTLTQDQHGCEEVEQPHHKKECYLNFDDT VFCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHCEIYPCPV YSSAEFHSLVPDGKRLHSGQQHCELCIPAHRDIDEC ILFGAEICKEGKCVNTQPGYECYCKQGFYYDGNLL ECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYRCACTPPA EYSPAQAQCLIPERWSTPQRDVKCAGASEERTACV WGPWAGPALTFDDCCCRQPRLGTQCRPCPPRGTG SQCPTSQSESNSFWDTSPLLLGKSPRDEDSSEEDSD ECRCVSGRCVPRPGGAVCECPGGFQLDASRARCV DIDECRELNQRGLLCKSERCVNTSGSFRCVCKAGF TRSRPHGPACLSAAADDAAIAHTSVIDHRGYFH 37
LTBP3S 小鼠 ETDECRLNQNICGHGQCVPGPSDYSCHCNAGYRSH PQHRYCVDVNECEAEPCGPGKGICMNTGGSYNCH CNRGYRLHVGAGGRSCVDLNECTKPHLCGDGGFC INFPGHYKCNCYPGYRLKASRPPICEDIDECRDPST CPDGKCENKPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDVNE CSEGTPCSPGWCENLPGSYRCTCAQGYEPAQDGLS CIDVDECEAGKVCQDGICTNTPGSFQCQCLSGYHL SRDRSRCEDIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCLCP QGHRLVGGRKCQDIDECSQDPGLCLPHGACENLQ GSYVCVCDEGFTLTQDQHGCEEVEQPHHKKECYL NFDDTVFCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHCE IYPCPVYSSAEFHSLCPDGKGYTQDNNIVNYGIPAH RDIDECILFGAEICKEGKCVNTQPGYECYCKQGFY YDGNLLECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYRC ACTPPAEYSPAQRQCL 365
在一例示性實施例中，選擇性結合LTBP1-TGFβ1及/或LTBP3-TGFβ1之抑制劑(例如抗體及其抗原結合部分)不結合於含有TGFβ1及GARP或LRRC33之複合物。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分不結合具有SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39中所示之序列的GARP蛋白，且不結合於含有該GARP蛋白之複合物。在另一實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)不結合具有SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41中所示之序列的GARP蛋白，且不結合於含有該GARP蛋白之複合物。在一個實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)不結合具有SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43中所示之序列的LRRC33蛋白，且不結合含有該LRRC33蛋白之複合物。在一個實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)不結合GARP/LRRC33嵌合體，例如SEQ ID NO:44中所示之GARP/LRRC33嵌合體。
表4-例示性GARP及LRRC33胺基酸序列.
蛋白 序列 SEQ ID NO
GARP AQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDTETLDLS GNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHL EHLSLAHNRLAMATALSAGGLGPLPRVTSLDLSGNSLYSG LLERLLGEAPSLHTLSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDL HSNVLMDIEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLRV LDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKLLHFPDLAA LPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKGIHAPSEGWSALPLSAPS GNASGRPLSQLLNLDLSYNEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRN CLRTFEARRLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRT LLLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPCGGPDEP GPSGCVAFSGITSLRSLSLVDNEIELLRAGAFLHTPLTELDLS SNPGLEVATGALGGLEASLEVLALQGNGLMVLQVDLPCFI CLKRLNLAENRLSHLPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSA MGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDA TQDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNINLIIILTFILVS AILLTTLAACCCVRRQKFNQQYKA 38
sGARP AQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDTETLDLS GNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHL EHLSLAHNRLAMATALSAGGLGPLPRVTSLDLSGNSLYSG LLERLLGEAPSLHTLSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDL HSNVLMDIEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLRV LDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKLLHFPDLAA LPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKGIHAPSEGWSALPLSAPS GNASGRPLSQLLNLDLSYNEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRN CLRTFEARRLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRT LLLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPCGGPDEP GPSGCVAFSGITSLRSLSLVDNEIELLRAGAFLHTPLTELDLS SNPGLEVATGALGGLEASLEVLALQGNGLMVLQVDLPCFI CLKRLNLAENRLSHLPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSA MGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDA TQDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNIN 39
GARP 小鼠 ISQRREQVPCRTVNKEALCHGLGLLQVPSVLSLDIQALYLS GNQLQSILVSPLGFYTALRHLDLSDNQISFLQAGVFQALPY LEHLNLAHNRLATGMALNSGGLGRLPLLVSLDLSGNSLHG NLVERLLGETPRLRTLSLAENSLTRLARHTFWGMPAVEQL DLHSNVLMDIEDGAFEALPHLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQL QVLDLSCNSIEAFQTAPEPQAQFQLAWLDLRENKLLHFPDL AVFPRLIYLNVSNNLIQLPAGLPRGSEDLHAPSEGWSASPLS NPSRNASTHPLSQLLNLDLSYNEIELVPASFLEHLTSLRFLN LSRNCLRSFEARQVDSLPCLVLLDLSHNVLEALELGTKVLG SLQTLLLQDNALQELPPYTFASLASLQRLNLQGNQVSPCGG PAEPGPPGCVDFSGIPTLHVLNMAGNSMGMLRAGSFLHTP LTELDLSTNPGLDVATGALVGLEASLEVLELQGNGLTVLR VDLPCFLRLKRLNLAENQLSHLPAWTRAVSLEVLDLRNNS FSLLPGNAMGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQ GRVDVDATQDLICRFGSQEELSLSLVRPEDCEKGGLKNVN LILLLSFTLVSAIVLTTLATICFLRRQKLSQQYKA 40
sGARP 小鼠 ISQRREQVPCRTVNKEALCHGLGLLQVPSVLSLDIQALYLS GNQLQSILVSPLGFYTALRHLDLSDNQISFLQAGVFQALPY LEHLNLAHNRLATGMALNSGGLGRLPLLVSLDLSGNSLHG NLVERLLGETPRLRTLSLAENSLTRLARHTFWGMPAVEQL DLHSNVLMDIEDGAFEALPHLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQL QVLDLSCNSIEAFQTAPEPQAQFQLAWLDLRENKLLHFPDL AVFPRLIYLNVSNNLIQLPAGLPRGSEDLHAPSEGWSASPLS NPSRNASTHPLSQLLNLDLSYNEIELVPASFLEHLTSLRFLN LSRNCLRSFEARQVDSLPCLVLLDLSHNVLEALELGTKVLG SLQTLLLQDNALQELPPYTFASLASLQRLNLQGNQVSPCGG PAEPGPPGCVDFSGIPTLHVLNMAGNSMGMLRAGSFLHTP LTELDLSTNPGLDVATGALVGLEASLEVLELQGNGLTVLR VDLPCFLRLKRLNLAENQLSHLPAWTRAVSLEVLDLRNNS FSLLPGNAMGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQ GRVDVDATQDLICRFGSQEELSLSLVRPEDCEKGGLKNVN 41
 LRRC33 (亦稱為NRROS；Uniprot登錄號Q86YC3) MELLPLWLCLGFHFLTVG WRNRSGTATAASQGVCKLVG GAADCRGQSLASVPSSLPPHARMLTLDANPLKTLWNHSLQ PYPLLESLSLHSCHLERISRGAFQEQGHLRSLVLGDNCLSEN YEETAAALHALPGLRRLDLSGNALTEDMAALMLQNLSSLR SVSLAGNTIMRLDDSVFEGLERLRELDLQRNYIFEIEGGAFD GLAELRHLNLAFNNLPCIVDFGLTRLRVLNVSYNVLEWFL ATGGEAAFELETLDLSHNQLLFFPLLPQYSKLRTLLLRDNN MGFYRDLYNTSSPREMVAQFLLVDGNVTNITTVSLWEEFS SSDLADLRFLDMSQNQFQYLPDGFLRKMPSLSHLNLHQNC LMTLHIREHEPPGALTELDLSHNQLSELHLAPGLASCLGSL RLFNLSSNQLLGVPPGLFANARNITTLDMSHNQISLCPLPAA SDRVGPPSCVDFRNMASLRSLSLEGCGLGALPDCPFQGTSL TYLDLSSNWGVLNGSLAPLQDVAPMLQVLSLRNMGLHSSF MALDFSGFGNLRDLDLSGNCLTTFPRFGGSLALETLDLRRN SLTALPQKAVSEQLSRGLRTIYLSQNPYDCCGVDGWGALQ HGQTVADWAMVTCNLSSKIIRVTELPGGVPRDCKWERLDL GLLYLVLILPSCLTLLVACTVIVLTFKKPLLQVIKSRCHWSS VY *天然信號肽以粗體繪示。 42
可溶性LRRC33 (sLRRC33) MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLG WRNRSGTATAASQGV CKLVGGAADCRGQSLASVPSSLPPHARMLTLDANPLKTLW NHSLQPYPLLESLSLHSCHLERISRGAFQEQGHLRSLVLGD NCLSENYEETAAALHALPGLRRLDLSGNALTEDMAALML QNLSSLRSVSLAGNTIMRLDDSVFEGLERLRELDLQRNYIFE IEGGAFDGLAELRHLNLAFNNLPCIVDFGLTRLRVLNVSYN VLEWFLATGGEAAFELETLDLSHNQLLFFPLLPQYSKLRTL LLRDNNMGFYRDLYNTSSPREMVAQFLLVDGNVTNITTVS LWEEFSSSDLADLRFLDMSQNQFQYLPDGFLRKMPSLSHL NLHQNCLMTLHIREHEPPGALTELDLSHNQLSELHLAPGLA SCLGSLRLFNLSSNQLLGVPPGLFANARNITTLDMSHNQISL CPLPAASDRVGPPSCVDFRNMASLRSLSLEGCGLGALPDCP FQGTSLTYLDLSSNWGVLNGSLAPLQDVAPMLQVLSLRNM GLHSSFMALDFSGFGNLRDLDLSGNCLTTFPRFGGSLALET LDLRRNSLTALPQKAVSEQLSRGLRTIYLSQNPYDCCGVDG WGALQHGQTVADWAMVTCNLSSKIIRVTELPGGVPRDCK WERLDLGLHHHHHH *經修飾之人類κ輕鏈信號肽以粗體繪示。 **組胺酸標籤加下劃線。 43
人類LRRC33-GARP嵌合體 MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLG WRNRSGTATAASQGV CKLVGGAADCRGQSLASVPSSLPPHARMLTLDANPLKTLW NHSLQPYPLLESLSLHSCHLERISRGAFQEQGHLRSLVLGD NCLSENYEETAAALHALPGLRRLDLSGNALTEDMAALML QNLSSLRSVSLAGNTIMRLDDSVFEGLERLRELDLQRNYIFE IEGGAFDGLAELRHLNLAFNNLPCIVDFGLTRLRVLNVSYN VLEWFLATGGEAAFELETLDLSHNQLLFFPLLPQYSKLRTL LLRDNNMGFYRDLYNTSSPREMVAQFLLVDGNVTNITTVS LWEEFSSSDLADLRFLDMSQNQFQYLPDGFLRKMPSLSHL NLHQNCLMTLHIREHEPPGALTELDLSHNQLSELHLAPGLA SCLGSLRLFNLSSNQLLGVPPGLFANARNITTLDMSHNQISL CPLPAASDRVGPPSCVDFRNMASLRSLSLEGCGLGALPDCP FQGTSLTYLDLSSNWGVLNGSLAPLQDVAPMLQVLSLRNM GLHSSFMALDFSGFGNLRDLDLSGNCLTTFPRFGGSLALET LDLRRNSLTALPQKAVSEQLSRGLRTIYLSQNPYDCCGVDG WGALQHGQTVADWAMVTCNLSSKIIRVTELPGGVPRDCK WERLDLGL LIIILTFILVSAILLTTLAACC CVRRQKFNQQYKA *經修飾之人類κ輕鏈信號肽以粗體繪示。 **LRRC33胞外域加下劃線。 # GARP跨膜結構域為斜體。 ## GARP胞內尾端加雙下劃線。 44
在另一態樣中，本發明提供在LTBP1及/或LTBP3之情形下抑制TGFβ1活化之方法。在一個實施例中，該方法包含將本文所描述之抑制劑，抗體或其抗原結合部分及/或醫藥組合物暴露於LTBP1-前TGFβ1複合物或LTBP3-前TGFβ1複合物。舉例而言，在一個實施例中，抑制劑為胞外基質相關TGFβ1活化之抑制劑，其選擇性結合LTBP1/3呈遞之前TGFβ1潛伏複合物。在一個實施例中，抑制劑不抑制免疫細胞相關之TGFβ1活化，例如由活化GARP呈遞之前TGFβ1潛伏複合物產生的免疫細胞相關之TGFβ1活化。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分選擇性結合LTBP1-前TGFβ1潛伏複合物及/或LTBP3-前TGFβ1潛伏複合物，從而調節成熟TGFβ1生長因子自潛伏複合物釋放，其中抗體或其抗原結合部分不單獨結合成熟TGFβ1或GARP-前TGFβ1潛伏複合物。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分抑制成熟TGFβ1自LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物釋放。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分不抑制成熟TGFβ1自GARP-前TGFβ1複合物或LRRC33-前TGFβ1複合物釋放。
在一個實施例中，方法在活體外進行。在另一實施例中，方法在活體內進行。在一個實施例中，LTBP1-前TGFβ1複合物或LTBP3-前TGFβ1複合物係在胞外基質中。胞外基質可包含例如小纖維蛋白及/或纖維結合蛋白。在一些實施例中，胞外基質包含含有RGD基元之蛋白質。
在前述態樣之一些實施例中，抗體或其抗原結合部分不刺激免疫效應細胞。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分抑制成熟TGFβ1自LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物釋放，且不抑制成熟TGFβ1自GARP-前TGFβ1複合物及/或LRRC33-前TGFβ1複合物釋放。
在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之本發明之抑制劑(例如抗體)可以相對高親和力結合複合物，例如以小於10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或更低之解離常數(KD )。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分以約10-8 M、約 10-9 M、約 10-10 M、約 10-11 M、約 10-12 M，或約10-13 M之解離常數(KD )結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物。舉例而言，選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體可以5 pM與500 nM之間(例如10 pM與100 nM之間，例如50 pM與50 nM之間)的親和力結合複合物。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段可以小於約300 nm，例如約20 nM或更低、約10 nM或更低、約500 pM或更低或約5 pM或更低之親和力結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可以約1 nm至約350 nm、約10 nm至約200 nm、約15 nm至約250 nm、約20 nm至約200 nm、約1 nm、約20 nm、約25 nm、約50 nm、約100 nm、約150 nm、約200 nm、約250 nm、約300 nm或約500 pm的親和力結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物。
本發明亦包括與本文所描述之抗體中之任一者競爭結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，此類抗體對複合物之親和力為50 nM或更低(例如20 nM或更低、10 nM或更低、500 pM或更低、50 pM或更低或5 pM或更低)。可使用任何適合的方法測試選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體(或其抗原結合片段)之親和力及結合動力學，該方法包括但不限於生物感測器技術(例如OCTET或BIACORE)。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段不與抗體SR-Ab1競爭結合於人類LTBP1-前TGFβ1複合物。
本發明之態樣係關於與本文所提供之抗體中之任一者競爭或交叉競爭的抗體。如本文中關於抗體所用，術語「競爭」意謂第一抗體以足以類似於第二抗體結合之方式結合於抗原決定基(例如LTBP1-TGFβ1複合物之抗原決定基及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗原決定基)，使得在第二抗體存在下第一抗體與其抗原決定基之結合結果相比於在第二抗體不存在的情況下第一抗體的結合可偵測地減少。替代方案可能但不必如此：在第一抗體存在下第二抗體與其抗原決定基之結合亦可偵測地減少。亦即，在第二抗體不抑制第一抗體與其相應抗原決定基之結合的情況下，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合。然而，當各抗體無論在相同、較大或較小的程度上可偵測地抑制另一抗體與其抗原決定基或配位體之結合時，該等抗體稱為彼此「交叉競爭」結合其相應抗原決定基。競爭及交叉競爭抗體均在本發明之範疇內。不論此類競爭或交叉競爭發生之機制(例如位阻、構形變化或與共同抗原決定基或其部分之結合)如何，熟習此項技術者應瞭解，此類競爭及/或交叉競爭抗體涵蓋於且可適用於本文所提供之方法及/或組合物。
本發明之態樣係關於與如本文所提供之專一性抗體或其抗原結合部分中之任一者競爭或交叉競爭的抗體，例如具有表5中所示之一或多個CDR序列(1、2、3、4、5或6個CDR序列)的抗體。在一個實施例中，本發明提供與具有如表5中所示之包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3之重鏈CDR序列及/或如表5中所示之包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6之輕鏈CDR序列的抗體競爭或交叉競爭的抗體及其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供與具有包含SEQ ID NO:7之重鏈可變區序列及/或包含SEQ ID NO:8之輕鏈可變區序列的抗體或其抗原結合部分競爭或交叉競爭的抗體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與本文所提供之抗體中之任一者結合於相同抗原決定基或接近相同抗原決定基。在一些實施例中，若抗體或其抗原結合部分結合於抗原決定基之15個或更少胺基酸殘基內，則其結合於抗原決定基附近。在一些實施例中，如本文所提供之抗體或其抗原結合部分中之任一者結合於由本文所提供之抗體中之任一者所結合之抗原決定基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基內。
在另一實施例中，本文中提供競爭或交叉競爭結合於本文中提供之抗原中之任一者(例如LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物)的抗體或其抗原結合部分，其中在抗體與蛋白質之間的解離常數KD 小於10-6 M。在其他實施例中，抗體競爭或交叉競爭結合於本文所提供之抗原中之任一者，其中KD 在10-11 M至10-6 M範圍內。在其他實施例中，抗體競爭或交叉競爭結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet®)所測定，KD ＜50 nM。在其他實施例中，抗體競爭或交叉競爭結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜10 nM。
在一些實施例中，抗體或抗原結合部分與具有Ab42之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列(如表6中所示(例如分別為SEQ ID NO:318及319))的抗體競爭或交叉競爭。抗體可競爭或交叉競爭結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜10 nM。抗體可競爭或交叉競爭結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜5 nM。抗體可結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜5 nM。抗體在適合的活體外結合分析(諸如BLI (例如Octet))中可不顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之任何可偵測結合。如在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合的相同分析條件下，藉由BLI所量測，抗體可不顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。或者或另外，抗體或抗原結合部分可結合(例如選擇性結合)人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(且視情況比結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍)。
在一些實施例中，抗體與具有Ab63之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列(如表6中所示(例如分別為SEQ ID NO:360及361))的抗體競爭或交叉競爭。抗體可競爭或交叉競爭結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜10 nM。抗體可競爭或交叉競爭結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜5 nM。抗體可結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(例如BLI，諸如Octet)所測定，KD ＜5 nM。抗體在適合的活體外結合分析(諸如BLI (例如Octet))中可不顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之任何可偵測結合。如在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合的相同分析條件下，藉由BLI所量測，抗體可不顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。或者或另外，抗體或抗原結合部分可結合(例如選擇性結合)人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(且視情況比結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍)。
在另外的實施例中，當人類GARP-前TGFβ1複合物在200 nM之濃度下時，在BLI分析(例如Octet)中，選擇性結合人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之抗體可不顯示在暴露於人類GARP-前TGFβ1複合物時的有意義的結合(例如可不顯示超過0.1單位(nm)之響應)。
在一些實施例中，本文提供與本文所描述之抗體或其抗原結合部分競爭結合的抗TGFβ1抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，本文提供與本文所描述之抗體或其抗原結合部分結合於相同抗原決定基的抗TGFβ1抗體或其抗原結合部分。
本文所提供之抗體可使用任何適合方法表徵。舉例而言，一種方法為鑑別抗原所結合之抗原決定基，或「抗原決定基定位」。許多對蛋白質上之抗原決定基位置進行定位及表徵的合適方法，包括解決抗體-抗原複合物之晶體結構問題、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽之分析，如例如Harlow及Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999之第11章中所描述。在額外實例中，抗原決定基定位可用於測定抗體所結合之序列。抗原決定基可為線性抗原決定基，亦即包含於單一延伸段胺基酸中，或藉由可未必包含於單一延伸段(初級結構線性序列)中之胺基酸的三維相互作用形成的構形抗原決定基。在一些實施例中，當TGFβ1在LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物中時，抗原決定基為僅可用於藉由本文中所描述之抗體或其抗原結合部分結合的TGFβ1抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基呈遞於LTBP1/3-TGFβ1複合物上，且不呈遞於GARP-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物上。在一些實施例中，抗原決定基由於LTBP1/3及/或TGFβ1之構形變化而可獲得，該構形變化在LTBP1/3及TGFβ1形成複合物時發生。在此實施例中，當蛋白質在複合物中不結合時抗原決定基不呈遞於LTBP1/3或TGFβ1中。在一個實施例中，當TGFβ1與LTBP1或LTBP3複合時，抗原決定基呈遞於TGFβ1上。在另一實施例中，當LTBP1與TGFβ1複合時，抗原決定基呈遞於LTBP1上。在另一實施例中，當LTBP3與TGFβ1複合時，抗原決定基呈遞於LTBP3上。在另一實施例中，抗原決定基包含來自LTBP1與TGFβ1之殘基。在另一實施例中，抗原決定基包含來自LTBP3及TGFβ1之殘基。不同長度(例如至少4-6個胺基酸長)之肽可經分離或合成(例如以重組方式)且用於與抗體之結合分析。在另一實例中，抗體所結合的抗原決定基可在系統性篩選中藉由使用來源於目標抗原序列之重疊肽以及測定抗體之結合來確定。根據基因片段表現分析，編碼目標抗原的開放閱讀框架可隨機地或依據特定遺傳構造加以片段化，且測定抗原之所表現片段與待測試之抗體的反應性。基因片段可例如藉由PCR產生，且隨後在放射性胺基酸存在下活體外轉錄且轉譯成蛋白質。隨後藉由免疫沈澱及凝膠電泳測定抗體與放射性標記之抗原片段的結合。某些抗原決定基亦可藉由使用噬菌體粒子表面上所展示之隨機肽序列之大型庫(噬菌體庫)來鑑別。或者，可在簡單結合分析中測試重疊肽片段之所定義庫與測試抗體的結合。在一額外實例中，可進行抗原結合結構域之突變誘發、域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發以鑑別抗原決定基結合所需、足夠及/或必需的殘基。舉例而言，可使用目標抗原之突變體進行域交換實驗，其中LTBP1-TGFβ1複合物或LTBP3-TGFβ1複合物之各種片段已經來自緊密相關但抗原不同的蛋白，諸如TGFβ蛋白家族之另一成員(例如GDF11)之序列置換(交換)。藉由評定抗體與LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之突變體的結合，可評定特定抗原片段對抗體結合之重要性。
或者，可使用已知結合於相同抗原之其他抗體進行競爭分析，以確定抗體是否與其他抗體結合於相同抗原決定基。競爭分析為熟習此項技術者所熟知。
另外，可藉由常規技術測定本文所提供之抗體中之任一者與LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物中之一或多個殘基的相互作用。舉例而言，可測定晶體結構，且可相應地測定LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物中之殘基與抗體中之一或多個殘基之間的距離。基於此類距離，可確定LTBP1/3-TGFβ1複合物中之專一性殘基是否與抗體中之一或多個殘基相互作用。此外，可應用適合之方法，諸如競爭分析及目標突變誘發分析來確定候選抗體之優先結合。
在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物的本發明之抗體或其抗原結合部分包括表5中所示的互補決定區(CDR)中之一或多者。在一些實施例中，本發明提供一種核酸分子，其編碼選擇性結合於如本文所描述之LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分。在一個實施例中，核酸分子編碼表5中所示之CDR序列中之一或多者。
表5.如使用Kabat編號方案所測定之SR-AB2、SR-AB10、SR-AB13、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB31、SR-AB34、SR-AB37及SR-AB38至SR-AB64之重鏈(CDRH)及輕鏈(CDRL)的互補決定區.
抗體 SR-AB2  
CDRH1 GYTFTSYG (SEQ ID NO: 1)  
CDRH2 ISAYNGNT (SEQ ID NO: 2)  
CDRH3 ARAPLGNFDS (SEQ ID NO: 3)  
CDRL1 SGSIASNY (SEQ ID NO: 4)  
CDRL2 EDN (SEQ ID NO: 5)  
CDRL3 QSYDSSNHPVV (SEQ ID NO: 6)  
抗體 SR-AB10  
CDRH1 FTFNNYPIH (SEQ ID NO: 94)  
CDRH2 VMSYDGINKYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFDY (SEQ ID NO: 96)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 97)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 98)  
CDRL3 QSYDSDNQGVV (SEQ ID NO: 99)  
抗體 SR-AB13  
CDRH1 GSISSSSYYWG (SEQ ID NO: 100)  
CDRH2 SISYSGSTYY (SEQ ID NO: 101)  
CDRH3 ARDPSYDSIAGMDV (SEQ ID NO: 102)  
CDRL1 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 103)  
CDRL2 AASNLQS (SEQ ID NO: 104)  
CDRL3 QQSFDFPFT (SEQ ID NO: 105)  
抗體 SR-AB22  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 108)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 109)  
CDRH3 AVPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 110)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 111)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 112)  
CDRL3 QSYDSDNQGVV (SEQ ID NO: 113)  
抗體 SR-AB23  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 116)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 117)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 118)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 119)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 120)  
CDRL3 QSYDSDNQGVV (SEQ ID NO: 121)  
抗體 SR-AB31  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 124)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 125)  
CDRH3 AVPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 126)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 127)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 128)  
CDRL3 QSYDFNNQGVV (SEQ ID NO: 129)  
抗體 SR-AB34  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 130)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 131)  
CDRH3 AVPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 132)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 133)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 134)  
CDRL3 QSYDYDAQGVV (SEQ ID NO: 135)  
抗體 SR-AB37  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 136)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 137)  
CDRH3 AVPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 138)  
CDRL1 TRSSGLIDDNYVQ (SEQ ID NO: 139)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 140)  
CDRL3 QSYDSDLQRVV (SEQ ID NO: 141)  
抗體 SR-AB38  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 142)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 143)  
CDRH3 AVPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 144)  
CDRL1 TRSSGSIDNNYVQ (SEQ ID NO: 145)  
CDRL2 EDFIRPS (SEQ ID NO: 146)  
CDRL3 QSYDDDLQGVV (SEQ ID NO: 147)  
抗體 SR-AB39  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 148)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 149)  
CDRH3 AVPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 150)  
CDRL1 TRSSGLIDDNYVQ (SEQ ID NO: 151)  
CDRL2 EDAQRPS (SEQ ID NO: 152)  
CDRL3 QSYDHDEQGVV (SEQ ID NO: 153)  
抗體 SR-AB40  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 154)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 155)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 156)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 157)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 158)  
CDRL3 QSYDYSNQGVV (SEQ ID NO: 159)  
抗體 SR-AB41  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 160)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 161)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 162)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 163)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 164)  
CDRL3 QSYDYDNQAVV (SEQ ID NO: 165)  
抗體 SR-AB42  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 166)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 167)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 168)  
CDRL1 TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 169)  
CDRL2 EDNQRPS (SEQ ID NO: 170)  
CDRL3 QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 171)  
抗體 SR-AB43  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 172)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 173)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 174)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 175)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 176)  
CDRL3 QSYDSDNQRVV (SEQ ID NO: 177)  
抗體 SR-AB44  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 178)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 179)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 180)  
CDRL1 TRSHGNIDDNYVQ (SEQ ID NO: 181)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 182)  
CDRL3 QSYDSDNQLVV (SEQ ID NO: 183)  
抗體 SR-AB45  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 184)  
CDRH2 VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 185)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 186)  
CDRL1 TRSSGAIDDNYVQ (SEQ ID NO: 187)  
CDRL2 EDFQRPS (SEQ ID NO: 188)  
CDRL3 QSYDDDLQGVV (SEQ ID NO: 189)  
抗體 SR-AB46  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 190)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 191)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 192)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 193)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 194)  
CDRL3 QSYDSDNQRVV (SEQ ID NO: 195)  
抗體 SR-AB47  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 196)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 197)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 198)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 199)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 200)  
CDRL3 QSYDYDNQAVV (SEQ ID NO: 201)  
抗體 SR-AB48  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 202)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 203)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 204)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 205)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 206)  
CDRL3 QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 207)  
抗體 SR-AB49  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 208)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 209)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 210)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 211)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 212)  
CDRL3 QGYDWDTQGVV (SEQ ID NO: 213)  
抗體 SR-AB50  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 214)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 215)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 216)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 217)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 218)  
CDRL3 QSYDSDNQRVV (SEQ ID NO: 219)  
抗體 SR-AB51  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 220)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 221)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 222)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 223)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 224)  
CDRL3 QSYDYDNQAVV (SEQ ID NO: 225)  
抗體 SR-AB52  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 226)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 227)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 228)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 229)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 230)  
CDRL3 QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 2312)  
抗體 SR-AB53  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 232)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 233)  
CDRH3 ARPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 234)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 235)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 236)  
CDRL3 QGYDWDTQGVV (SEQ ID NO: 237)  
抗體 SR-AB54  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 238)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 239)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 240)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 241)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 242)  
CDRL3 QSYDSDNQRVV (SEQ ID NO: 243)  
抗體 SR-AB55  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 244)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 245)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 246)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 247)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 2489)  
CDRL3 QSYDYDNQAVV (SEQ ID NO: 249)  
抗體 SR-AB56  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 250)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 251)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 252)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 253)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 254)  
CDRL3 QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 255)  
抗體 SR-AB57  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 256)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 257)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGS (SEQ ID NO: 258)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 259)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 260)  
CDRL3 QGYDWDTQGVV (SEQ ID NO: 261)  
抗體 SR-AB58  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 262)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 263)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 264)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 265)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 266)  
CDRL3 QSYDSDNQRVV (SEQ ID NO: 267)  
抗體 SR-AB59  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 268)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 269)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 270)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 271)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 272)  
CDRL3 QSYDYDNQAVV (SEQ ID NO: 273)  
抗體 SR-AB60  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 274)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 275)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 276)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 277)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 278)  
CDRL3 QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 279)  
抗體 SR-AB61  
CDRH1 FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 280)  
CDRH2 VISHEGSGKYYADSVKG (SEQ ID NO: 281)  
CDRH3 ALPRIAARRGGFGT (SEQ ID NO: 282)  
CDRL1 TRSSGNIDYNYVQ (SEQ ID NO: 283)  
CDRL2 EDNVRPS (SEQ ID NO: 284)  
CDRL3 QGYDWDTQGVV (SEQ ID NO: 285)  
抗體 SR-AB62  
CDRH1 GSIRSSSYYWG (SEQ ID NO: 286)  
CDRH2 SISYSATTYY (SEQ ID NO: 287)  
CDRH3 ASDPSYDSAAGMDV (SEQ ID NO: 288)  
CDRL1 RASKVISSYLN (SEQ ID NO: 289)  
CDRL2 YASSLQS (SEQ ID NO: 290)  
CDRL3 QQSNDWPFT (SEQ ID NO: 291)  
抗體 SR-AB63  
CDRH1 GSIRSSSYYWG (SEQ ID NO: 292)  
CDRH2 SISYSATTYY (SEQ ID NO: 293)  
CDRH3 AGDPSYDSIAGMQV (SEQ ID NO: 294)  
CDRL1 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 295)  
CDRL2 AASNLQS (SEQ ID NO: 296)  
CDRL3 QQSFDWPLT (SEQ ID NO: 297)  
抗體 SR-AB64  
CDRH1 GSIRSSSYYWG (SEQ ID NO: 298)  
CDRH2 SISYSATTYY (SEQ ID NO: 299)  
CDRH3 AGDPSYDSIAGMQV (SEQ ID NO: 300)
CDRL1 RASQSISYYLN (SEQ ID NO: 301)
CDRL2 SASSRQS (SEQ ID NO: 302)
CDRL3 QQGFDFPLT (SEQ ID NO: 303)
在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之本發明抗體包括如表5中所提供之任何抗體或其抗原結合部分，其包括CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其組合。在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體包括如表5中所提供之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3。
本發明亦提供編碼包含如表5中所提供之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其組合之分子的核酸序列。
抗體重鏈及輕鏈CDR3結構域可在抗體對抗原之結合專一性/親和力中起尤其重要作用。因此，在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分，或編碼此等抗體或其抗原結合部分之核酸分子可包括至少表5中所示之抗體的重鏈及/或輕鏈CDR3。
本發明之態樣係關於單株抗體或其抗原結合部分，其選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物，且包含六個互補決定區(CDR)：CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3。抗體或其抗原結合部分可具有表5中所示之抗體中之一者(例如Ab42)的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3。
在一些實施例中，CDRH1包含如SEQ ID NO: 1中所示之序列。在一些實施例中，CDRH2包含如SEQ ID NO: 2中所示之序列。在一些實施例中，CDRH3包含如SEQ ID NO: 3中所示之序列。在一些實施例中，CDRL1包含如SEQ ID NO: 4中所示之序列。在一些實施例中，CDRL2包含如SEQ ID NO: 5中所示之序列。在一些實施例中，CDRL3包含如SEQ ID NO: 6中闡述之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR中之每一者之至多一或多個胺基酸變化：CDR-H1: SEQ ID NO:1；CDR-H2: SEQ ID NO:2；CDR-H3: SEQ ID NO:3；CDR-L1: SEQ ID NO:4；CDR-L2: SEQ ID NO:5；及CDR-L3: SEQ ID NO:6。在一些實施例中，針對CDR中之每一者，一或多個胺基酸變化包含至多1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一些實施例中(例如關於表5中所示之抗體SR-AB2)，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分包含：包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列的CDRL2及包含如SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的CDRL3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3之互補決定區3 (CDR3)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 6之CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2之互補決定區2 (CDR2)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5之CDR2。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1之互補決定區1 (CDR1)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4之CDR1。
表5中所示之抗體(例如SR-AB2)的重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於表6中。
在一些實施例中，CDRH1包含如SEQ ID NO: 94中所示之序列。在一些實施例中，CDRH2包含如SEQ ID NO: 95中所示之序列。在一些實施例中，CDRH3包含如SEQ ID NO: 96中所示之序列。在一些實施例中，CDRL1包含如SEQ ID NO: 97中所示之序列。在一些實施例中，CDRL2包含如SEQ ID NO: 98中所示之序列。在一些實施例中，CDRL3包含如SEQ ID NO: 99中所示之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化：CDR-H1: SEQ ID NO:94；CDR-H2: SEQ ID NO:95；CDR-H3: SEQ ID NO:96；CDR-L1: SEQ ID NO:97；CDR-L2: SEQ ID NO:98；及CDR-L3: SEQ ID NO:99。在一些實施例中，針對CDR中之每一者，一或多個胺基酸變化包含至多1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一些實施例中(例如關於表5中所示之抗體SR-AB10)，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分包含：包含如SEQ ID NO: 94中所示之胺基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO: 95中所示之胺基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO: 96中所示之胺基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO: 97中所示之胺基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO: 98中所示之胺基酸序列的CDRL2及包含如SEQ ID NO: 99中所示之胺基酸序列的CDRL3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 96之互補決定區3 (CDR3)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 99之CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 95之互補決定區2 (CDR2)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 98之CDR2。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 94之互補決定區1 (CDR1)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 97之CDR1。
表5中所示之抗體(例如SR-AB10)的重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於表6中。
在一些實施例中，CDRH1包含如SEQ ID NO: 100中所示之序列。在一些實施例中，CDRH2包含如SEQ ID NO: 101中所示之序列。在一些實施例中，CDRH3包含如SEQ ID NO: 102中所示之序列。在一些實施例中，CDRL1包含如SEQ ID NO: 103中所示之序列。在一些實施例中，CDRL2包含如SEQ ID NO: 104中所示之序列。在一些實施例中，CDRL3包含如SEQ ID NO: 105中所示之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化：CDR-H1: SEQ ID NO:100；CDR-H2: SEQ ID NO:101；CDR-H3: SEQ ID NO:102；CDR-L1: SEQ ID NO:103；CDR-L2: SEQ ID NO:104；及CDR-L3: SEQ ID NO:105。在一些實施例中，針對CDR中之每一者，一或多個胺基酸變化包含至多1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一些實施例中(例如關於表5中所示之抗體SR-AB13)，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分包含：包含如SEQ ID NO: 100中所示之胺基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO: 101中所示之胺基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO: 102中所示之胺基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO: 103中所示之胺基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO: 104中所示之胺基酸序列的CDRL2及包含如SEQ ID NO: 105中所示之胺基酸序列的CDRL3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 102之互補決定區3 (CDR3)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 105之CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 101之互補決定區2 (CDR2)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 104之CDR2。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 100之互補決定區1 (CDR1)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 103之CDR1。
表5中所示之抗體(例如SR-AB13)的重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於表6中。
在一些實施例中，CDRH1包含如SEQ ID NO: 124中所示之序列。在一些實施例中，CDRH2包含如SEQ ID NO: 125中所示之序列。在一些實施例中，CDRH3包含如SEQ ID NO: 126中所示之序列。在一些實施例中，CDRL1包含如SEQ ID NO: 127中所示之序列。在一些實施例中，CDRL2包含如SEQ ID NO: 128中所示之序列。在一些實施例中，CDRL3包含如SEQ ID NO: 129中所示之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含至少三個(視情況所有六個)選自以下之CDR，視情況包含針對CDR中之每一者之至多一或多個胺基酸變化：CDR- H1: SEQ ID NO:124；CDR-H2: SEQ ID NO:125；CDR-H3: SEQ ID NO:126；CDR-L1: SEQ ID NO:127；CDR-L2: SEQ ID NO:128；及CDR-L3: SEQ ID NO:129。在一些實施例中，針對CDR中之每一者，一或多個胺基酸變化包含至多1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一些實施例中(例如關於表5中所示之抗體SR-AB31)，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分包含：包含如SEQ ID NO: 124中所示之胺基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO: 125中所示之胺基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO: 126中所示之胺基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO: 127中所示之胺基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO: 128中所示之胺基酸序列的CDRL2及包含如SEQ ID NO: 129中所示之胺基酸序列的CDRL3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 126之互補決定區3 (CDR3)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 129之CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 125之互補決定區2 (CDR2)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 128之CDR2。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 124之互補決定區1 (CDR1)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 127之CDR1。
表5中所示之抗體(例如SR-AB31)之HCVR及LCVR之胺基酸序列提供於表6中。
在一些實施例中，CDRH1包含如SEQ ID NO: 166中所示之序列。在一些實施例中，CDRH2包含如SEQ ID NO: 167中所示之序列。在一些實施例中，CDRH3包含如SEQ ID NO: 168中所示之序列。在一些實施例中，CDRL1包含如SEQ ID NO: 169中所示之序列。在一些實施例中，CDRL2包含如SEQ ID NO: 170中所示之序列。在一些實施例中，CDRL3包含如SEQ ID NO: 171中闡述之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含至少三個(視情況所有六個)選自以下之CDR，視情況包含針對CDR中之每一者之至多一或多個胺基酸變化：CDR- H1: SEQ ID NO:166；CDR-H2: SEQ ID NO:167；CDR-H3: SEQ ID NO:168；CDR-L1: SEQ ID NO:169；CDR-L2: SEQ ID NO:170；及CDR-L3: SEQ ID NO:171。在一些實施例中，針對CDR中之每一者，一或多個胺基酸變化包含至多1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一些實施例中(例如關於表5中所示之抗體SR-AB42)，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分包含：包含如SEQ ID NO: 166中所示之胺基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO: 167中所示之胺基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO: 168中所示之胺基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO: 169中所示之胺基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO: 170中所示之胺基酸序列的CDRL2及包含如SEQ ID NO: 171中所示之胺基酸序列的CDRL3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 168之互補決定區3 (CDR3)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 171之CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 167之互補決定區2 (CDR2)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 170之CDR2。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 166之互補決定區1 (CDR1)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 169之CDR1。
表5中所示之抗體(例如SR-AB42)之HCVR及LCVR之胺基酸序列提供於表6中。
在一些實施例中，CDRH1包含如SEQ ID NO: 292中所示之序列。在一些實施例中，CDRH2包含如SEQ ID NO: 293中所示之序列。在一些實施例中，CDRH3包含如SEQ ID NO: 294中所示之序列。在一些實施例中，CDRL1包含如SEQ ID NO: 295中所示之序列。在一些實施例中，CDRL2包含如SEQ ID NO: 296中所示之序列。在一些實施例中，CDRL3包含如SEQ ID NO: 297中所示之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含至少三個(視情況所有六個)選自以下之CDR，視情況包含針對CDR中之每一者之至多一或多個胺基酸變化：CDR- H1: SEQ ID NO:292；CDR-H2: SEQ ID NO:293；CDR-H3: SEQ ID NO:294；CDR-L1: SEQ ID NO:295；CDR-L2: SEQ ID NO:296；及CDR-L3: SEQ ID NO:297。在一些實施例中，針對CDR中之每一者，一或多個胺基酸變化包含至多1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一些實施例中(例如關於表5中所示之抗體SR-AB63)，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分包含：包含如SEQ ID NO: 292中所示之胺基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO: 293中所示之胺基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO: 294中所示之胺基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO: 295中所示之胺基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO: 296中所示之胺基酸序列的CDRL2及包含如SEQ ID NO: 297中所示之胺基酸序列的CDRL3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 294之互補決定區3 (CDR3)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 297之CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 293之互補決定區2 (CDR2)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 296之CDR2。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 292之互補決定區1 (CDR1)，且該輕鏈可變區包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 295之CDR1。
表5中所示之抗體(例如SR-AB63)之HCVR及LCVR之胺基酸序列提供於表6中。
開發出十個額外抗體(Ab3-Ab12)，其專一性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物，且抑制在LTBP1/3之情形下呈遞的成熟TGFβ之釋放。表6亦提供除表5中所提及之抗體之HCVR及LCVR胺基酸序列以外的此等額外LTBP情形專一性抗體之HCVR及LCVR胺基酸序列。
表6.專一性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物之抗體的重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列
抗體 HCVR 序列 LCVR 序列
SR-AB2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWM GWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTT DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCA RAPLGNFDSWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 7) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGSIASNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSSNHPVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 8)
SR-AB3 QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWM GWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTT NTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCA RDDYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 74) QSGLTQPASVSGSPGQSVTISCT GTSSDVGGYNYASWYQQHPGK APKLMIYDVSKRPSGVPDRFSG SKSGNTASLTISGLQAEDEADY YCSSYTSSSTYVFGTGTKLTVL (SEQ ID NO: 75)
SR-AB4 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI GEIIHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGV GLGRFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 76) QSELTQSPSASGTPGQRVTISCS GSNSNIGTNTVNWYQQFPGTAP KLLIYYNDQRPSGVSDRFSGSRS GTSASLAINGLQSEDEADYYCA TWDDSLSGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 77)
SR-AB5 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI GEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARG VGLGRFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 78) QSELTQSPSASGTPGQRVTISCS GSNSNIGTNTVNWYQQFPGTAP KLLIYYNDQRPSGVSDRFSGSRS GTSASLAINGLQSEDEADYYCA TWDDSLSGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 79)
SR-AB6 QVQLQQSGPGLVRPSQTLSLTCAISG DSVSSNGAAWNWIRQSPSRGLEWL GRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINP DTSKNQFSLKLTSVTPEDTAVYYCA RGEDWGYAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 80) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGSIASNYVQWYQQRPGSAP TTVIYDDKQRPSGIPDRFSGSIDS SSNSASLTISGLKTEDEADYYCQ SYDSSNVVFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 81)
SR-AB7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWM GWISAYDGNTNYAQKLQGRVTMTT DTSTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCA RNPYYYYMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 82) QSELTQAPSVSVAPGQTARITCG GNNIGGRSKSVHWYQHKLGQA PVLIVYDNTDRPSGISERFSGSSS VNAATLTITTAEAGDEGDYYCQ VWDVSTDHVVFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 83)
SR-AB8 QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEW MGWINPNGGGTNYAQKFQGRVTM TRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYY CANRRRGSAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 84) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT GSSGSIASNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDDNYHVIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 85)
SR-AB9 QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWV AVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KETGYGFGLFWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 86) NFMLTQPHSVSESPGRTLTIPCF RSSGNIGDSYVHWYQQRPGSAP TTVIYRDSQRPSGVPDRFSGSID FSSNSASLTISGLKTEDEAAYYC QSYDRSNQWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 87)
SR-AB10 QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFNNYPIHWVRQAPGKGLEWVA VMSYDGINKYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR PRIAARRGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 88) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 89)
SR-AB11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWM GWISAYNGNTDYAQKLQGRVTMTT DTSTSTAYMELRGLRSDDTAVYYC ARAPLGNFDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 90) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGSIASNYVQWYQQRPGSAP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSSNHVVFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 91)
SR-AB12 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFPNYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKD LEGGYYWDYYYYGMDVWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 92) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGSIASNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSSIVVFGGGTQLTVL (SEQ ID NO: 93)
SR-AB13 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG GSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDPS YDSIAGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 106) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPK LLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQS FDFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 107)
SR-AB22 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 114) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 115)
SR-AB23 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 122) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 123)
SR-AB31 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 304) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDFNNQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 305)
SR-AB34 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 306) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDYDAQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 307)
SR-AB37 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 308) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGLIDDNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSDLQRVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 309)
SR-AB38 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 310) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGSIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDFIRPSGVPDRFSGSIDS SSNSASLTISGLKTEDEADYYCQ SYDDDLQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 311)
SR-AB39 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 312) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGLIDDNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDAQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDHDEQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 313)
SR-AB40 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 314) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDYSNQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 315)
SR-AB41 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 316) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDYDNQAVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 317)
SR-AB42 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 318) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDYDTQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 319)
SR-AB43 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 320) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDYNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNVRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSDNQRVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 321)
SR-AB44 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 322) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSHGNIDDNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNVRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDSDNQLVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 323)
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SR-AB60 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWV AVISHEGSGKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA LPRIAARRGGFGTWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 354) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT RSSGNIDYNYVQWYQQRPGSSP TTVIYEDNVRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYDYDTQGVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 355)
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SR-AB62 QLQLQESGPGLAKPSETLSLTCTVSG GSIRSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SISYSATTYYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCASDPS YDSAAGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 358) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKVISSYLNWYQQKPGKAPK LLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQS NDWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 359)
SR-AB63 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG GSIRSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SISYSATTYYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGDPS YDSIAGMQVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 360) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPK LLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQS FDWPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 361)
SR-AB64 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG GSIRSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIG SISYSATTYYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGDPS YDSIAGMQVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 362) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISYYLNWYQQKPGKAPK LLIYSASSRQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQG FDFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 363)
本發明之態樣係關於單株抗體或其抗原結合部分，其選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物，且包含重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體，或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段；其中該抗體或其抗原結合片段包含具有與表6中所示之可變區胺基酸序列中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的可變重鏈。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 106至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 107至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 8至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 8至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 8至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 74至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 75至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 74至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 75至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 74至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 75至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 76至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 77至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 76至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 77至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 76至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 77至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 78至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 79至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 78至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 79至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 78至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 79至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 80至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 81至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 80至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 81至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 80至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 81至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 82至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 83至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 82至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 83至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 82至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 83至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 84至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 85至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 84至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 85至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 84至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 85至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 86至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 87至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 86至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 87至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 86至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 87至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 88至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 89至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 88至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 89至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 88至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 89至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 90至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 91至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 90至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 91至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 90至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 91至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 92至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 93至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 92至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 93至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 92至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 93至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 106至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 107至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 106至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 107至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 106至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 107至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物。抗體可選擇性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物。抗體或其抗原結合片段可不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。抗體或其抗原結合片段可為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可包含具有與表6中所示之可變區胺基酸序列中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的可變重鏈。在一些實施例中，一致性水準為至少95% (視情況至少98%)。
因此，在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 318至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 319至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。抗體或其抗原結合片段可包含具有與SEQ ID NO: 318至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 319至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。抗體或其抗原結合片段可包含具有與SEQ ID NO: 318至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 319至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 360至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 361至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。抗體或其抗原結合片段可包含具有與SEQ ID NO: 360至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區或具有與SEQ ID NO: 361至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。抗體或其抗原結合片段可包含具有與SEQ ID NO: 360至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO: 361至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，重鏈可變區及/或輕鏈可變區序列在本文所提供之CDR序列中之任一者內不變化。舉例而言，在一些實施例中，序列變化程度(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)可發生在本文所提供之重鏈可變及/或輕鏈可變胺基酸序列(不包括任何CDR序列)內。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，包含具有與SEQ ID NO: 318至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 319至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段不在本文提供之Ab42之CDR序列中的任一者內變化。在一些實施例中，包含具有與SEQ ID NO: 360至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及/或具有與SEQ ID NO: 361至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段不在本文提供之Ab63之CDR序列中之任一者內變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含表6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域，及/或包含表6中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。舉例而言，在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 74中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 75中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 74中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 75中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 74中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 75中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 76中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 77中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 76中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 77中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 76中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 77中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 78中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 79中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 78中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 79中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 78中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 79中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 80中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 81中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 80中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 81中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 80中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 81中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 82中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 83中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 82中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 83中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 82中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 83中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 84中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 85中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 84中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 85中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 84中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 85中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 86中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 87中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 86中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 87中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 86中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 87中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 88中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 89中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 88中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 89中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 88中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 89中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 90中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 91中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 90中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 91中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 90中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 91中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 93中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 93中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 93中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 106中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 107中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 106中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 107中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 106中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 107中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 318中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 319中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 318中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 319中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 318中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 319中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 360中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及/或包含SEQ ID NO: 361中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 360中所示之胺基酸序列的重鏈可變域或包含SEQ ID NO: 361中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 360中所示之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 361中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
表5中所示之抗體SR-AB2之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於下文中。
SR-AB2-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image007
SR-AB2-輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image009
表5中所示之抗體SR-AB10之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於下文中。
SR-AB10-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image011
SR-AB10-輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image013
表5中所示之抗體SR-AB13之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於下文中。
SR-AB13-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image015
SR-AB13-輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image017
表5中所示之抗體SR-AB42之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於下文中。
SR-AB42-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image019
63-輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image021
表5中所示之抗體SR-AB63之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之胺基酸序列提供於下文中。
SR-AB63-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image023
SR-AB63-輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image025
在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之本發明之抗體或其抗原結合部分具有一或多個實質上類似於CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR序列。舉例而言，相較於SEQ ID NO: 1-6、SEQ ID NO: 94-99或SEQ ID NO: 100-105中之任一者中之對應CDR區，抗體可包括含有至多6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基變體之表5中所示之一或多個CDR序列(SEQ ID NO: 1-6、SEQ ID NO: 94-99或SEQ ID NO: 100-105)。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR CDR-H1中之每一者之至多6個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化：SEQ ID NO: 1；CDR- H2: SEQ ID NO: 2；CDR-H3: SEQ ID NO: 3；CDR-L1: SEQ ID NO: 4；CDR-L2: SEQ ID NO: 5；及CDR-L3: SEQ ID NO: 6。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR CDR-H1中之每一者之至多6個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化：SEQ ID NO: 94；CDR-H2: SEQ ID NO: 95；CDR-H3: SEQ ID NO: 96；CDR-L1: SEQ ID NO: 97；CDR-L2: SEQ ID NO: 98；及CDR-L3: SEQ ID NO: 99。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR CDR-H1中之每一者之至多6個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化：SEQ ID NO: 100；CDR-H2: SEQ ID NO: 101；CDR-H3: SEQ ID NO: 102；CDR-L1: SEQ ID NO: 103；CDR-L2: SEQ ID NO: 104；及CDR-L3: SEQ ID NO: 105。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR CDR-H1中之每一者之至多6個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化：SEQ ID NO: 166；CDR-H2: SEQ ID NO: 167；CDR-H3: SEQ ID NO: 168；CDR-L1: SEQ ID NO: 169；CDR-L2: SEQ ID NO: 170；及CDR-L3: SEQ ID NO: 171。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含針對CDR CDR-H1中之每一者之至多6個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化：SEQ ID NO: 292；CDR-H2: SEQ ID NO: 293；CDR-H3: SEQ ID NO: 294；CDR-L1: SEQ ID NO: 295；CDR-L2: SEQ ID NO: 296；及CDR-L3: SEQ ID NO: 297。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR-H1: SEQ ID NO: 1；CDR-H2: SEQ ID NO: 2；及CDR-H3: SEQ ID NO: 3之重鏈可變區；及包含CDR-L1: SEQ ID NO: 4；CDR-L2: SEQ ID NO: 5；及CDR-L3: SEQ ID NO: 6之輕鏈可變區，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94；CDR-H2: SEQ ID NO: 95；及CDR-H3: SEQ ID NO: 96之重鏈可變區；及包含CDR-L1: SEQ ID NO: 97；CDR-L2: SEQ ID NO: 98；及CDR-L3: SEQ ID NO: 99之輕鏈可變區，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR-H1: SEQ ID NO: 100；CDR-H2: SEQ ID NO: 101；及CDR-H3: SEQ ID NO: 102之重鏈可變區；及包含CDR-L1: SEQ ID NO: 103；CDR-L2: SEQ ID NO: 104；及CDR-L3: SEQ ID NO: 105之輕鏈可變區，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR-H1: SEQ ID NO: 166；CDR-H2: SEQ ID NO: 167；及CDR-H3: SEQ ID NO: 168之重鏈可變區；及包含CDR-L1: SEQ ID NO: 169；CDR-L2: SEQ ID NO: 170；及CDR-L3: SEQ ID NO: 171之輕鏈可變區，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化。舉例而言，若CDR內存在變化，則每個CDR可存在至多1個變化。所有6個CDR中可能存在不超過2個變化。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR-H1: SEQ ID NO: 292；CDR-H2: SEQ ID NO: 293；及CDR-H3: SEQ ID NO: 294之重鏈可變區；及包含CDR-L1: SEQ ID NO: 295；CDR-L2: SEQ ID NO: 296；及CDR-L3: SEQ ID NO: 297之輕鏈可變區，視情況包含針對CDR中之每一者之一或多個胺基酸變化，例如1、2、3、4、5或6個胺基酸變化(例如至多2個)。舉例而言，若CDR內存在變化，則每個CDR可存在至多1個變化。所有6個CDR中可能存在不超過2個變化。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含：包含具有特定胺基酸變化之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3的重鏈可變區。如本文所用，片語「胺基酸變化」或「胺基酸殘基中之變化」包括胺基酸取代、添加及/或缺失。在一些實施例中，具有本文所描述之CDR及/或可變區中之任一者的胺基酸殘基存在一或多個變化。舉例而言，在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含一個胺基酸變化。在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含至多兩個胺基酸變化。在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含至多三個胺基酸變化。在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含至多四個胺基酸變化。在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含至多五個胺基酸變化。在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含至多六個胺基酸變化。在一些實施例中，一或多個胺基酸變化包含至多七個胺基酸變化。
舉例而言，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 1，其限制條件為SEQ ID NO: 1之位置4處之蘇胺酸殘基可經組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸或甘胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 1，其限制條件為SEQ ID NO: 1之位置5處之絲胺酸殘基可經白胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 1，其限制條件為SEQ ID NO: 1之位置9處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 1，其限制條件為(i) SEQ ID NO: 1之位置4處之蘇胺酸殘基可經組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸或甘胺酸取代；(ii) SEQ ID NO: 1之位置5處之絲胺酸殘基可經白胺酸取代；及/或(iii) SEQ ID NO: 1之位置9處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2: SEQ ID NO: 2，其限制條件為SEQ ID NO: 2之位置3處之絲胺酸殘基可經天冬胺酸或天冬醯胺取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2: SEQ ID NO: 2，其限制條件為SEQ ID NO: 2之位置5處之酪胺酸殘基可經組胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2: SEQ ID NO: 2，其限制條件為SEQ ID NO: 2之位置6處之天冬醯胺殘基可經絲胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2: SEQ ID NO: 2，其限制條件為SEQ ID NO: 2之位置8處之天冬醯胺殘基可經苯丙胺酸、白胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2: SEQ ID NO: 2，其限制條件為SEQ ID NO: 2之位置10處之天冬醯胺殘基可經天冬胺酸或丙胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2: SEQ ID NO: 2，其限制條件為(i) SEQ ID NO: 2之位置3處之絲胺酸殘基可經天冬胺酸或天冬醯胺取代；(ii) SEQ ID NO: 2之位置5處之酪胺酸殘基可經組胺酸取代；(iii) SEQ ID NO: 2之位置6處之天冬醯胺殘基可經絲胺酸取代；(iv) SEQ ID NO: 2之位置8處之天冬醯胺殘基可經苯丙胺酸、白胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸取代；及/或(v) SEQ ID NO: 2之位置10處之天冬醯胺殘基可經天冬胺酸或丙胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a) CDR-H1: SEQ ID NO:1，其限制條件為： i.  SEQ ID NO: 1之位置4處之蘇胺酸殘基可經組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸或甘胺酸取代； ii.  SEQ ID NO: 1之位置5處之絲胺酸殘基可經白胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 1之位置9處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:2，其限制條件為： i.  SEQ ID NO: 2之位置3處之絲胺酸殘基可經天冬胺酸或天冬醯胺取代； ii. SEQ ID NO: 2之位置5處之酪胺酸殘基可經組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 2之位置6處之天冬醯胺殘基可經絲胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 2之位置8處之天冬醯胺殘基可經苯丙胺酸、白胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸取代；及/或 v. SEQ ID NO: 2之位置10處之天冬醯胺殘基可經天冬胺酸或丙胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:5中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:6中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:1，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 1之位置4處之蘇胺酸殘基可經組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸或甘胺酸取代； ii.  SEQ ID NO: 1之位置5之絲胺酸殘基可經白胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 1之位置9處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:2，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 2之位置3處之絲胺酸殘基可經天冬胺酸或天冬醯胺取代； ii. SEQ ID NO: 2之位置5處之酪胺酸殘基可經組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 2之位置6處之天冬醯胺殘基可經絲胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 2之位置8處之天冬醯胺殘基可經苯丙胺酸、白胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸取代；及/或 v. SEQ ID NO: 2之位置10處之天冬醯胺殘基可經天冬胺酸或丙胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:3，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:4，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:5，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:6，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，本發明提供專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物或人類LRR33-前TGFβ1複合物之分離抗體；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，且其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:1，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 1之位置4處之蘇胺酸殘基可經組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸或甘胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 1之位置5之絲胺酸殘基可經白胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 1之位置9處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:2，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 2之位置3處之絲胺酸殘基可經天冬胺酸或天冬醯胺取代； ii. SEQ ID NO: 2之位置5處之酪胺酸殘基可經組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 2之位置6處之天冬醯胺殘基可經絲胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 2之位置8處之天冬醯胺殘基可經苯丙胺酸、白胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸取代；及/或 v. SEQ ID NO: 2之位置10處之天冬醯胺殘基可經天冬胺酸或丙胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:3，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:4，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:5，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:6，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化且不結合於人類GARP-前TGFβ1。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置7處之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為SEQ ID NO: 94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 94，其限制條件為(i) SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代；(ii) SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代；(iii) SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代；(iv) SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代；(v) SEQ ID NO: 94之位置7之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代；(vi) SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或(vii) SEQ ID NO: 94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a) CDR-H1: SEQ ID NO:94，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代； v. SEQ ID NO: 94之位置7之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代； vi. SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或 vii. SEQ ID NO:94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:95，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 c) CDR-H3: SEQ ID NO:96，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:94，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代； v. SEQ ID NO: 94之位置7之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代； vi. SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或 vii. SEQ ID NO:94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:95，視情況包含一或多個胺基酸變化； c) CDR-H3: SEQ ID NO:96，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:97，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:98，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:99，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:94，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代； v. SEQ ID NO: 94之位置7之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代； vi. SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或 vii. SEQ ID NO:94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:95，視情況包含一或多個胺基酸變化； c) CDR-H3: SEQ ID NO:96，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:97，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:98，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:99，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體亦具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1，其包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為R。在一些實施例中，X2 為G。在一些實施例中，X2 為S。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2，其包含胺基酸序列(X1 )ISHEG(X2 )(X3 )KYYADSVKG，其中視情況：X1 為V或S；X2 為S或G；且X3 為F或L。在一些實施例中，X1 為V。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X2 為S。在一些實施例中，X2 為G。在一些實施例中，X3 為F。在一些實施例中，X3 為L。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H3，其包含胺基酸序列(X1 )(X2 )P(X3 )(X4 )(X5 )(X6 )RRGG(X7 )(X8 )(X9 )，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、V、G或K；X3 為R、H或L；X4 為I、V或G；X5 為A、S或L；X6 為A或V；X7 為F或Y；X8 為D、G、R或S；且X9 為Y、G、R、L、V、A或K。在一些實施例中，X1 為A。在一些實施例中，X1 為V。在一些實施例中，X2 為R。在一些實施例中，X2 為V。在一些實施例中，X2 為G。在一些實施例中，X2 為K。在一些實施例中，X3 為R。在一些實施例中，X3 為H。在一些實施例中，X3 為L。在一些實施例中，X4 為I。在一些實施例中，X4 為V。在一些實施例中，X4 為G。在一些實施例中，X5 為A。在一些實施例中，X5 為S。在一些實施例中，X5 為L。在一些實施例中，X6 為A。在一些實施例中，X6 為V。在一些實施例中，X7 為F。在一些實施例中，X7 為Y。在一些實施例中，X8 為D。在一些實施例中，X8 為G。在一些實施例中，X8 為R。在一些實施例中，X8 為S。在一些實施例中，X9 為Y。在一些實施例中，X9 為G。在一些實施例中，X9 為R。在一些實施例中，X9 為L。在一些實施例中，X9 為V。在一些實施例中，X9 為A。在一些實施例中，X9 為K。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列(X1 )ISHEG(X2 )(X3 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中視情況：X1 為V或S；X2 為S或G；且X3 為F或L；及 c)包含胺基酸序列(X1 )(X2 )P(X3 )(X4 )(X5 )(X6 )RRGG(X7 ) (X8 )(X9 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、V、G或K；X3 為R、H或L；X4 為I、V或G；X5 為A、S或L；X6 為A或V；X7 為F或Y；X8 為D、G、R或S；且X9 為Y、G、R、L、V、A或K。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列 (X1 )ISHEG(X2 )(X3 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中視情況：X1 為V或S；X2 為S或G；且X3 為F或L； c)包含胺基酸序列 (X1 )(X2 )P(X3 )(X4 )(X5 )(X6 )RRGG(X7 ) (X8 )(X9 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、V、G或K；X3 為R、H或L；X4 為I、V或G；X5 為A、S或L；X6 為A或V；X7 為F或Y；X8 為D、G、R或S；且X9 為Y、G、R、L、V、A或K； d)如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化； e)如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f)如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列(X1 )ISHEG(X2 )(X=)KYYADSVKG之CDR-H2，其中視情況：X1 為V或S；X2 為S或G；且X3 為F或L； c)包含胺基酸序列(X1 )(X2 )P(X3 )(X4 )(X5 )(X6 )RRGG(X7 ) (X8 )(X9 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、V、G或K；X3 為R、H或L；X4 為I、V或G；X5 為A、S或L；X6 為A或V；X7 為F或Y；X8 為D、G、R或S；且X9 為Y、G、R、L、V、A或K； d)如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化； e)如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f)如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體亦具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1，其包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為R。在一些實施例中，X2 為G。在一些實施例中，X2 為S。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2，其包含胺基酸序列(X1 )ISHEGS(X2 )KYYADSVKG，其中視情況：X1 為V或S；且X2 為F或L。在一些實施例中，X1 為a V。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X3 為F。在一些實施例中，X3 為L。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H3，其包含胺基酸序列A(X1 )PRI(X2 )ARRGGFGY，其中視情況：X1 為R或V；X2 為A或L。在一些實施例中，X1 為R。在一些實施例中，X1 為V。在一些實施例中，X2 為A。在一些實施例中，X2 為L。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列(X1 )ISHEGS(X2 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中視情況：X1 為V或S；且X2 為F或L；及 c)包含胺基酸序列A(X1 )PRI(X2 )ARRGGFGY之CDR-H3，其中視情況：X1 為R或V；X=為A或L。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO: 98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列(X1 )ISHEGS(X2 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中視情況：X1 為V或S；且X2 為F或L； c)包含胺基酸序列A(X1 )PRI(X2 )ARRGGFGY之CDR-H3，其中視情況：X1 為R或V；X2 為A或L； d)如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化； e)如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f)如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列(X1 )ISHEGS(X2 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中：X1 為V或S；且X2 為F或L； c)包含胺基酸序列A(X1 )PRI(X2 )ARRGGFGY之CDR-H3，其中視情況：X1 為R或 V；X2 為A或L； d)如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化； e)如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f)如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體亦具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 100，其限制條件為SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 100，其限制條件為SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 100，其限制條件為SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 100，其限制條件為(i) SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代；(ii) SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代；及/或(iii) SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 101，其限制條件為SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 101，其限制條件為SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 101，其限制條件為SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1: SEQ ID NO: 101，其限制條件為(i) SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代；(ii) SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代；及/或(iii) SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a) CDR-H1: SEQ ID NO:100，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:101，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代；及 c) CDR-H3: SEQ ID NO:102，視情況包含至多三個、四個、五個或六個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:103中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:104中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:105中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:100，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:101，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代；及 c) CDR-H3: SEQ ID NO:102，視情況包含一或多個胺基酸變化。 d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:105，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:100，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:101，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:102，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:105，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體亦具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1，其包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )，其中視情況：X1 為S或P；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為P。在一些實施例中，X2 為S。在一些實施例中，X2 為H。在一些實施例中，X2 為R。在一些實施例中，X3 為S。在一些實施例中，X3 為G。在一些實施例中，X4 為G。在一些實施例中，X4 為I。在一些實施例中，X4 為N。在一些實施例中，X4 為V。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2，其包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS，其中視情況X1 為S或T。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為T。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H3，其包含胺基酸序列(X1 )(X2 )D(X3 )(X4 )Y(X5 )(X6 )(X7 )(X8 )G(X9 )(X10 )(X11 )，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、S或G、X3 為P、Y、R、V、I、H、T或E；X4 為S、D、E或N；X5 為D、A或T；X6 為S、G、T或A；X7 為I、A、R、Q或V；X8 為A、E、K、G或T；X9 為M或I；X10 為D、L、Q、V、N或G；且X11 為V、R、N、E或K。在一些實施例中，X1 為A。在一些實施例中，X1 為V。在一些實施例中，X2 為R。在一些實施例中，X2 為S。在一些實施例中，X2 為G。在一些實施例中，X3 為P。在一些實施例中，X3 為Y。在一些實施例中，X3 為R。在一些實施例中，X3 為V。在一些實施例中，X3 為I。在一些實施例中，X3 為H。在一些實施例中，X3 為T。在一些實施例中，X3 為E。在一些實施例中，X4 為S。在一些實施例中，X4 為D。在一些實施例中，X4 為E。在一些實施例中，X4 為N。在一些實施例中，X5 為D。在一些實施例中，X5 為A。在一些實施例中，X5 為T。在一些實施例中，X6 為S。在一些實施例中，X6 為G。在一些實施例中，X6 為T。在一些實施例中，X6 為A。在一些實施例中，X7 為I。在一些實施例中，X7 為A。在一些實施例中，X7 為R。在一些實施例中，X7 為Q。在一些實施例中，X7 為V。在一些實施例中，X8 為A。在一些實施例中，X8 為E。在一些實施例中，X8 為K。在一些實施例中，X8 為G。在一些實施例中，X8 為T。在一些實施例中，X9 為M。在一些實施例中，X9 為I。在一些實施例中，X10 為D。在一些實施例中，X10 為L。在一些實施例中，X10 為Q。在一些實施例中，X10 為V。在一些實施例中，X10 為N。在一些實施例中，X10 為G。在一些實施例中，X11 為V。在一些實施例中，X11 為R。在一些實施例中，X11 為N。在一些實施例中，X11 為E。在一些實施例中，X11 為K。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V； b)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況，X1 為S或T；及 c)包含胺基酸序列(X1 )(X2 )D(X3 )(X4 )Y(X5 )(X6 )(X7 )(X8 )G(X9 )(X10 )(X11 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、S或G、X3 為P、Y、R、V、I、H、T或E；X4 為S、D、E或N；X5 為D、A或T；X6 為S、G、T或A；X7 為I、A、R、Q或V；X8 為A、E、K、G或T；X9 為M或I；X10 為D、L、Q、V、N或G；且X11 為V、R、N、E或K。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:103中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO: 104中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:105中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V； b)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況，X1 為S或T； c)包含胺基酸序列 (X1 )(X2 )D(X3 )(X4 )Y(X5 )(X6 )(X7 )(X8 )G(X9 )(X10 )(X11 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、S或G、X3 為P、Y、R、V、I、H、T或E；X4 為S、D、E或N；X5 為D、A或T；X6 為S、G、T或A；X7 為I、A、R、Q或V；X8 為A、E、K、G或T；X9 為M或I；X10 為D、L、Q、V、N或G；且X11 為V、R、N、E或K； d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO: 104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO: 105，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V； b)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況，X1 為S或T； c)包含胺基酸序列(X1 )(X2 )D(X3 )(X4 )Y(X5 )(X6 )(X7 )(X8 )G(X9 ) (X10 )(X11 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、S或G、X3 為P、Y、R、V、I、H、T或E；X4 為S、D、E或N；X5 為D、A或T；X6 為S、G、T或A；X7 為I、A、R、Q或V；X8 為A、E、K、G或T；X9 為M或I；X10 為D、L、Q、V、N或G；且X11 為V、R、N、E或K； d)如SEQ ID NO:103中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化； e)如SEQ ID NO: 104中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f)如SEQ ID NO: 105中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體亦具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H1，其包含胺基酸G(X1 )I(X2 )SSSYYW(X3 )，其中視情況：X1 為S或P；X2 為H或R；且X3 為G、I或N。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為P。在一些實施例中，X2 為H。在一些實施例中，X2 為R。在一些實施例中，X3 為G。在一些實施例中，X3 為I。在一些實施例中，X3 為N。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H2，其包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS，其中視情況X1 為S或T。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為T。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含CDR-H3，其包含胺基酸序列A(X1 )D(X2 )SYD(X3 )(X4 )AGM(X5 )(X6 )，其中視情況：X1 為R、S或G、X2 為P或V；X3 為S或A；X4 為A、R、I或V；X5 為D、Q或G；且X6 為V或R。在一些實施例中，X1 為R。在一些實施例中，X1 為S。在一些實施例中，X1 為G。在一些實施例中，X2 為P。在一些實施例中，X2 為V。在一些實施例中，X3 為S。在一些實施例中，X3 為A。在一些實施例中，X4 為A。在一些實施例中，X4 為R。在一些實施例中，X4 為I。在一些實施例中，X4 為V。在一些實施例中，X5 為D。在一些實施例中，X5 為Q。在一些實施例中，X5 為G。在一些實施例中，X6 為V。在一些實施例中，X6 為R。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中重鏈CDR包含： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )SSSYYW(X3 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為H或R；且X3 為G、I或N； b)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況，X1 為S或T；及 c)包含胺基酸序列A(X1 )D(X2 )SYD(X3 )(X4 )AGM(X5 )(X6 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為R、S或G、X2 為P或V；X3 為S或A；X4 為A、R、I或V；X5 為D、Q或G；且X6 為V或R。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:103中所示之CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO: 104中所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO:105中所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )SSSYYW(X3 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為H或R；且X3 為G、I或N； b)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況，X1 為S或T； c)包含胺基酸序列A(X1 )D(X2 )SYD(X3 )(X4 )AGM(X5 )(X6 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為R、S或G、X2 為P或V；X3 為S或A；X4 為A、R、I或V；X5 為D、Q或G；且X6 為V或R； d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO: 104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO: 105，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一特定實施例中，抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中該抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其片段，其中該抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )SSSYYW(X3 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為H或R；且X3 為G、I或N； b)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況，X1 為S或T； c)包含胺基酸序列A(X1 )D(X2 )SYD(X3 )(X4 )AGM(X5 )(X6 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為R、S或G、X2 為P或V；X3 為S或A；X4 為A、R、I或V；X5 為D、Q或G；且X6 為V或R； d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO: 104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO: 105，視情況包含一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或此類抗體結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體亦對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜100 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜50 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜25 nM。在一些實施例中，此類抗體結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM；及/或該抗體結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如在適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))中所量測，KD ＜10 nM。
在另一實施例中，此類抗體不結合於人類GARP-前TGFβ1。在較佳實施例中，此類情形選擇性抗體亦具有同功型專一性，因為其選擇性結合且抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。
本文亦提供結合具有較高親和力及結合特性之其他有利組合之人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物的抗體或其抗原結合片段。
因此，在一個態樣中，抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR： a)包含胺基酸序列FTFRSYVMH之CDR-H1； b)包含胺基酸序列VISHEGS(X1 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中：X1 為L或G；及 c)包含胺基酸序列A(X1 )PRIAARRGGFG(X2 )之CDR-H3，其中：X1 為V、R或L；且X2 為Y、S或T； d)包含胺基酸序列TRS(X1 )G(X2 )ID(X3 )NYVQ之CDR-L1，其中， X1 為S或H；X2 為N、L、S或A；且X3 為N、D或Y； e)包含胺基酸序列ED(X1 )(X2 )RPS之CDR-L2，其中：X1 為N、F或A；且X2 為Q、I或V；及 f)包含胺基酸序列Q(X1 )YD(X2 )(X3 )(X4 )Q(X5 )VV之CDR-L3，其中：X1 為S或G；X2 為S、F、Y、D、H或W；X3 為N、D或S；X4 為N、A、L、E或T；且X5 為G、R、A或L。
在一些實施例中，在CDR-H3內：X1 為R或L。在CDR-L3內：X2 可為Y。在CDR-L3內：X3 可為D；且X4 可為T。在一些較佳實施例中，在CDR-H3內：X1 為R或L (視情況R)，在CDR-L3內：X2 為Y；且在CDR-L3內：X3 為D；且X4 為T。
在替代實施例中，在CDR-H3內：X1 為R或L (視情況R)，在CDR-L3內：X2 為Y且在CDR-L3內：X3 為D；X4 為N；且X5 為A。
在一些實施例中，在CDR-L1內：X1 為S或H；X2 為N或A；且X3 為N、D或Y；在CDR-L2內：X1 為N或F；且X2 為Q或V；且在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為S、Y、D或W；X3 為D或S；X4 為N、L或T；且X5 為G、R、A或L。在一些實施例中，在CDR-L1內：X1 為S；X2 為N；且X3 為N或Y；在CDR-L2內：X1 為N；且X2 為Q或V；且在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為S、Y或W；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G、R或A。在一些實施例中，在CDR-L3內：X1 為S；X2 為S或Y；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G、R或A。在一些實施例中，在CDR-L3內：X1 為S；X2 為Y；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G或A。在一些較佳實施例中，在CDR-L3內：X1 為S；X2 為Y；X3 為D；X4 為T；且X5 為G。
在尤其較佳實施例中，抗體或抗原結合片段具有Ab42之CDR，例如：包含胺基酸序列FTFRSYVMH (SEQ ID NO: 166)之CDR-H1；包含胺基酸序列VISHEGSLKYYADSVKG (SEQ ID NO: 167)之CDR-H2；包含胺基酸序列ARPRIAARRGGFGY (SEQ ID NO: 168)之CDR-H3；包含胺基酸序列TRSSGNIDNNYVQ (SEQ ID NO: 169)之CDR-L1；包含胺基酸序列EDNQRPS (SEQ ID NO: 170)之CDR-L2；及包含胺基酸序列QSYDYDTQGVV (SEQ ID NO: 171)之CDR-L3。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 318至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及具有與SEQ ID NO: 319至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(諸如BLI)所量測，KD ＜5 nM。舉例而言，抗體或抗原結合片段可結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(諸如BLI)所量測，KD ＜5 nM。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合人類LTBP1-及/或LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(諸如BLI)所量測，KD ＜1 nM。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。舉例而言，抗體或抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測可未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。在一些實施例中，KD 如藉由BLI或SPR所測定。在一些實施例中，KD 如藉由SPR所測定。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物之可偵測結合。舉例而言，抗體或其抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測可未顯示與LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物之可偵測結合。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。在一些實施例中，KD 如藉由BLI或SPR所測定。在一些實施例中，KD 如藉由SPR所測定。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜10 nM。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜10 nM。
在另外的實施例中，當人類GARP-前TGFβ1複合物在200 nM之濃度下時，在BLI分析(例如Octet)中，選擇性結合人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之抗體可不顯示在暴露於人類GARP-前TGFβ1複合物時的有意義的結合(例如可不顯示超過0.1單位(nm)之響應)。
在另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR： a)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V； b)包含胺基酸序列SISYS(X1 )(X2 )TYY之CDR-H2，其中視情況：X1 為G或A；且X2 為S或T； c)包含胺基酸序列A(X1 )DPSYDS(X2 )AGM(X3 )V之CDR-H3， 其中視情況：X1 為R、S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q； d)包含胺基酸序列RAS(X1 )(X2 )IS(X3 )YLN之CDR-L1，其中視情況：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y； e)包含胺基酸序列(X1 )AS(X2 )(X3 )QS之CDR-L2，其中視情況：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R； f)包含胺基酸序列QQ(X1 )(X2 )D(X3 )P(X4 )T之CDR-L3，其中視情況：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。
在一些實施例中：在CDR-H1內：X1 為S；X2 為S或R；X3 為S；且X4 為G；在CDR-H2內：X1 為G或A；且X2 為S或T；在CDR-H3內：X1 為R、S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q；在CDR-L1內：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y；在CDR-L2內：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R；且在CDR-L 3內：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。
在一些實施例中：CDR-H1包含胺基酸序列GSIRSSSYYWG；CDR- H2包含胺基酸序列SISYSATTYY；在CDR-H3內：X1 為S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q；在CDR-L1內：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y；在CDR-L2內：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R；且在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。
在一些實施例中：CDR-H1包含胺基酸序列GSIRSSSYYWG (SEQ ID NO: 292)；CDR-H2包含胺基酸序列SISYSATTYY (SEQ ID NO: 293)；CDR- H3包含胺基酸序列AGDPSYDSIAGMQV (SEQ ID NO: 294)；CDR-L1包含胺基酸序列RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 295)；CDR-L2包含胺基酸序列AASNLQS (SEQ ID NO: 296)；且CDR-L3包含胺基酸序列QQSFDWPLT (SEQ ID NO: 297)。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 360至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及具有與SEQ ID NO: 361至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(諸如BLI)所量測，KD ＜5 nM。舉例而言，抗體或抗原結合片段可結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(諸如BLI)所量測，KD ＜5 nM。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合人類LTBP1-及/或LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由適合的活體外結合分析(諸如BLI)所量測，KD ＜1 nM。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。舉例而言，抗體或抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測可未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。在一些實施例中，KD 如藉由BLI或SPR所測定。在一些實施例中，KD 如藉由SPR所測定。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物之可偵測結合。舉例而言，抗體或其抗原結合片段在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1之結合的相同分析條件下，如藉由BLI所量測可未顯示與LRRC33-前TGFβ1潛伏複合物之可偵測結合。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其KD 比在相同分析條件下結合於人類LRRC33-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍(例如低至少75倍、低至少100倍)。在一些實施例中，KD 如藉由BLI或SPR所測定。在一些實施例中，KD 如藉由SPR所測定。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜10 nM。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由BLI所量測，KD ＜10 nM。
在另外的實施例中，當人類GARP-前TGFβ1複合物在200 nM之濃度下時，在BLI分析(例如Octet)中，選擇性結合人類LTBP1-TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物之抗體可不顯示在暴露於人類GARP-前TGFβ1複合物時的有意義的結合(例如可不顯示超過0.1單位(nm)之響應)。
在一些實施例中，使用如在Karlin及Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993中經修改的Karlin及Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990之演算法來測定兩個胺基酸序列之「百分比一致性」。此類演算法併入至Altschul等人 J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990之NBLAST及XBLAST程式(版本2.0)中。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程式(評分=50，字長=3)進行以獲得與所關注蛋白質分子同源之胺基酸序列。當兩個序列之間存在間隙時，可如Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997中所描述利用Gapped BLAST。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
在本文中所描述之抗體或抗原結合片段中之任一者中，可將一或多個保守突變引入至CDR或構架序列中之位置處，其中殘基不可能參與抗體-抗原相互作用。在一些實施例中，可將此類保守性突變引入CDR或構架序列中之位置處，其中殘基不可能參與與LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物的相互作用，如基於晶體結構所測定。在一些實施例中，可由關於共有結構相似性之另一抗原的已知結構資訊推斷可能界面(例如參與抗原-抗體相互作用之殘基)。
如本文所用，「保守胺基酸取代」係指其中進行胺基酸取代不會改變蛋白質之相對電荷或尺寸特徵的胺基酸取代。可根據一般熟習此項技術者已知的改變多肽序列之方法製備變體，諸如見於彙編此類方法之參考文獻，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, 等人, 編, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989或Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, 等人, 編, John Wiley & Sons, Inc., New York。胺基酸之保守取代包括在以下群組內之胺基酸中進行之取代：(a) M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c) K、R、H；(d) A、G；(e) S、T；(f) Q、N；及(g) E、D。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含賦予抗體所需特性之突變。舉例而言，為了避免因Fab-臂交換(已知其伴隨原生IgG4 mAb發生)所致之可能併發症，本文所提供之抗體可包含穩定化『Adair』突變(Angal等人, 「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody」,Mol Immunol 30, 105-108; 1993)，其中絲胺酸228 (EU編號；殘基241 (Kabat編號))轉化成脯胺酸，產生類IgG1 (CPPCP (SEQ ID NO: 45))鉸鏈序列。因此，抗體中之任一者可包括穩定化『Adair』突變或胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 45)。在一個實施例中，本文所描述之抗體包含具有Ser至Pro主鏈取代(其產生類IgG1 鉸鏈且允許形成鏈間二硫鍵)之人類IgG4 的重鏈免疫球蛋白恆定域。
選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之本發明抗體可視情況包含抗體恆定區或其部分。舉例而言，VL 結構域可在其C端末端連接至輕鏈恆定域，諸如Cκ或Cλ。類似地，VH 結構域或其部分可連接至重鏈之全部或一部分，諸如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，及任何同型子類。抗體可包括適合恆定區(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第91-3242期, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991))。因此，在本發明範疇內之抗體包括VH 及VL 結構域，或其抗原結合部分，與任何適合恆定區組合。在例示性實施例中，抗體或其抗原結合部分包含含有人類IgG1 或人類IgG4 恆定域之全部或一部分的重鏈免疫球蛋白恆定域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含含有人類Igλ恆定域或人類Igκ恆定域之全部或一部分的輕鏈免疫球蛋白恆定域。
在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體可包括或可不包括SEQ ID NO: 7及8之抗體之構架區。在一些實施例中，選擇性結合於LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抗體為鼠類抗體且包括鼠類構架區序列。在其他實施例中，抗體為嵌合抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為人類化抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為完全人類抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，抗體包含有包含人類生殖系胺基酸序列之構架區。
本文所描述之抗體及其抗原結合片段可具有適合於結合抗原之任何組態。舉例而言，在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分包含四個多肽鏈，包括兩個重鏈可變區及兩個輕鏈可變區。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分包含一個重鏈可變區及一個輕鏈可變區。在例示性實施例中，抗體或其抗原結合部分為Fab片段、F(ab')2片段、scFab片段、scFv或雙功能抗體。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分包含人類IgG1 恆定域或人類IgG4 恆定域之重鏈免疫球蛋白恆定域。在一例示性實施例中，重鏈免疫球蛋白恆定域為人類IgG4 恆定域。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合構形抗原決定基。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合組合性抗原決定基。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分包含具有Ser至Pro主鏈取代(其產生類IgG1 鉸鏈且允許形成鏈間二硫鍵)之人類IgG4 恆定域的重鏈免疫球蛋白恆定域。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分進一步包含有包含人類Igλ恆定域或人類Igκ恆定域之輕鏈免疫球蛋白恆定域。
在一個實施例中，抗體為具有為兩條重鏈及兩條輕鏈之四條多肽鏈的IgG。在例示性實施例中，抗體可為人類化抗體、人類抗體或嵌合抗體。在一個實施例中，抗體包含具有人類生殖系胺基酸序列之構架。
在一個實施例中，本發明提供與本文所描述之抗體或其抗原結合部分競爭結合之抗體或其抗原結合部分。在一個實施例中，本發明提供與本文所描述之抗體或其抗原結合部分結合於相同抗原決定基的抗體或其抗原結合部分。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段不與抗體SR-Ab1競爭結合於人類LTBP1-前TGFβ1複合物。 新穎抗體之結合動力學
本文揭示之新穎抗體及其抗原結合片段(例如Fab)之特徵為增強之結合特性。抗體及片段能夠選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物(亦稱為大潛伏複合物(LLC))。以重組方式產生，經純化之蛋白複合物可用作抗原(例如抗原複合物)以篩選、評估或證實在適合的活體外結合分析中抗體結合抗原複合物之能力。此類分析為此項技術中所熟知且包括但不限於：基於BLI之分析(諸如Octet®)及基於SPR之分析(諸如Biacore)。
先前，鑑別展現與LLC之高親和力(例如亞奈莫耳KD )之抗體及片段。在此，有利地，特定選擇具有尤其緩慢解離速率之抗體及片段，旨在達成尤其持久之抑制作用。
因此，選擇用於實現根據本發明之方法及治療用途的適合TGFβ抑制劑可包括進行活體外結合分析以量測結合動力學。在較佳實施例中，抗體或抗原結合片段以高親和力及低解離速率kOFF 結合hLTBP1-前 TGFβ1及/或hLTBP3-前TGFβ1，如本文所描述。較佳地，抗體或片段進一步以與人類LLC相等的親和力結合鼠類LLC對應物，即mLTBP1-前TGFβ1及/或mLTBP3-前TGFβ1。活體外結合動力學可易於藉由量測測試抗體(諸如抗原結合片段)與適合抗原(諸如LLC及小潛伏複合物(SLC))之相互作用來測定。用於活體外結合分析以測定結合動力學之參數的適合方法包括基於BLI之分析(諸如Octet)及基於表面電漿子共振之分析(諸如Biacore系統)。基於Octet之活體外結合分析之實例提供於實例9/表9中。若干抗體在此實驗中顯示「OFF」速率(kOFF )≤ 5 x 10-4 (1/s)。此等結果與Ab10所示結果形成鮮明對比，其中與hLTBP1-前 TGFβ1及/或hLTBP3-前TGFβ1之結合甚至無法藉由相同Octet分析偵測(表8)。基於SPR之活體外結合分析之實例提供於實例9中。在此實驗中使用Ab42、Ab63及Ab43之Fab片段(其為TGFβ1之活化抑制劑)。如此實例中所說明，此等抗體具有亞奈莫耳KD 且「OFF」速率≤ 5 x 10-4 (1/s)。因此，舉例而言，Ab42能夠保持結合於抗原的持續時間比具有高得多的「OFF」速率之抗體長得多(例如t1/2更大)，該抗體相對快速「脫落於抗原」(例如自抗原解離)。因此，解離動力學之差異主要在於其總體親和力(KD )之顯著差異，其可引起效能增強。因此，結合動力學之表徵提供關於效應之潛在耐久性及引起活體內效能之有用資訊。
因此，本發明包括選擇用於治療用途之TGFβ活化抑制劑的方法，其中該方法包含選擇如藉由SPR所量測之解離速率為≤5×10-4 (1/s)之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或片段以小於1 nM (亦即亞奈莫耳)，例如小於500 pM、400 pM、300 pM、200 pM、100 pM或50 pM之親和力結合抗原。
選擇方法可包括藉由適合手段(諸如基於BLI之分析及基於SPR之分析)測定或量測測試抗體之解離半時間(亦稱為半結合時間或t½)。可使用單價或多價(例如二價)測試抗體。舉例而言，Fab片段為可用於測定解離半時間之適合單價抗體。類似地，全長免疫球蛋白(例如IgG)可用於測定解離半時間。在一些實施例中，方法包含對於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1選擇t½為45分鐘或更長之抗體或其抗原結合片段。較佳地，抗體或片段對於人類LTBP1-前TGFβ1及人類LTBP3-前TGFβ1中之每一者的t½為45分鐘或更長。更佳地，抗體或片段對於鼠類LTBP1-前TGFβ1及/或鼠類LTBP3-前TGFβ1之t½進一步為45分鐘或更長。最佳地，抗體或片段對於鼠類LTBP1-前TGFβ1及鼠類LTBP3-前TGFβ1中之每一者的t½為45分鐘或更長。方法可進一步包括對於人類GARP-前TGFβ1選擇t½為5分鐘或更短之抗體或抗原結合片段。具有有利解離半時間之此等抗體中之任一者應較佳具有如藉由BLI (例如Octet)或SPR (例如Biacore)所量測之小於1 nM之KD 。較佳地，SPR分析用於測定解離半時間(t½)。 多肽
本發明之一些態樣係關於分離多肽。舉例而言，在一個實施例中，本發明提供一種分離多肽，其包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其組合，如表5中所提供。在一例示性實施例中，分離多肽可含有如表5中所提供之CDRH1、CDRH2及CDRH3。在其他實施例中，分離多肽可含有如表5中所提供之CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些實施例中，多肽可相比於CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其組合中之任一者中之對應CDR區含有至多6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基變體，如表5中所提供。在一個實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO: 7之分離多肽。在另一實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO: 8之分離多肽。在另一實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8之分離多肽。在此實施例中，SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8可視情況藉由連接肽連接。在一些實施例中，多肽為重鏈可變域。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 7至少75% (例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。在一些實施例中，多肽為輕鏈可變域。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 8至少75% (例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。
在另一實施例中，本發明提供分離多肽，其包含表6中所示之重鏈可變區序列。在一個實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO: 106。在一個實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO: 107。在一個實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 318。在一個實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 319。在一個實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 360。在一個實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 361。
在另一實施例中，本發明提供分離多肽，其包含表6中所示之輕鏈可變區。在另一實施例中，本發明提供分離多肽，其包含表6中所示之重鏈可變區序列(例如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO: 106)及表6中所示之輕鏈可變區序列(例如SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO: 107)。在此實施例中，重鏈及輕鏈序列(例如SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8)可視情況藉由連接肽連接。在一些實施例中，多肽為重鏈可變域。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO: 106至少75% (例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。在一些實施例中，多肽為輕鏈可變域。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO: 107至少75% (例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。
在另一實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 318中所示之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 319中所示之輕鏈可變區序列。在另一實施例中，本發明提供分離多肽，其包含SEQ ID NO: 360中所示之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 361中所示之輕鏈可變區序列。在此實施例中，重鏈及輕鏈序列(例如SEQ ID NO: 318及SEQ ID NO: 319)可藉由連接肽連接。在一些實施例中，多肽為重鏈可變域。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 318或SEQ ID NO: 360至少85% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。在一些實施例中，多肽為輕鏈可變域。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 319或SEQ ID NO: 361至少85% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。 核酸
在一些實施例中，本發明之抗體、其抗原結合部分及/或組合物可由核酸分子編碼。此類核酸分子包括但不限於DNA分子、RNA分子、聚核苷酸、寡核苷酸、mRNA分子、載體、質體及其類似者。在一些實施例中，本發明可包含經程式化或產生以表現編碼本發明之化合物及/或組合物之核酸分子的細胞。
在一些實施例中，本發明提供核酸分子，其編碼前述抗體或其抗原結合部分。舉例而言，在一個實施例中，本發明提供編碼多肽之核酸分子，該多肽包含如表5中所提供之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其組合。在一些實施例中，核酸分子可編碼包含如表5中所提供之CDRH1、CDRH2及CDRH3之多肽。在一些實施例中，核酸分子可編碼包含如表5中所提供之CDRL1、CDRL2及CDRL3之多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼多肽，該多肽相比於如表5中所提供之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其組合中之任一者中的對應CDR區可含有至多6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基變體。在一例示性實施例中，核酸分子編碼包含具有與SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變域及/或具有與SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變域的多肽。在一個實施例中，核酸分子編碼包含具有與表6中所示之重鏈可變區序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變域及/或具有與表6中所示之輕鏈可變區序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變域的多肽。在一例示性實施例中，核酸分子編碼包含具有與SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變域及/或具有與SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變域的多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO: 106中所示之重鏈可變域胺基酸序列及SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO: 107中所示之輕鏈可變域胺基酸序列。在一些實施例中，核酸分子編碼包含SEQ ID NO: 7中所示之重鏈可變域胺基酸序列及SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈可變域胺基酸序列的抗體或其抗原結合部分。
在另一實施例中，本發明提供編碼前述抗體或其抗原結合部分之核酸分子。在一例示性實施例中，核酸分子編碼包含具有與SEQ ID NO: 318中所示之胺基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變域及/或具有與SEQ ID NO: 319中所示之胺基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變域的多肽。在另一實施例中，核酸分子編碼包含具有與SEQ ID NO: 360中所示之胺基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變域及/或具有與SEQ ID NO: 361中所示之胺基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變域的多肽。
在另一實施例中，本發明提供核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO: 318中所示之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 319中所示之輕鏈可變區序列的多肽。在另一實施例中，本發明提供核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO: 360中所示之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 361中所示之輕鏈可變區序列的分離多肽。在此實施例中，重鏈及輕鏈序列(例如SEQ ID NO: 318及SEQ ID NO: 319)可藉由連接肽連接。在一些實施例中，核酸分子編碼作為重鏈可變域之多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼與SEQ ID NO: 318或SEQ ID NO: 360至少85% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼作為輕鏈可變域之多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼與SEQ ID NO: 319或SEQ ID NO: 361至少85% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼包含SEQ ID NO: 318中所示之重鏈可變域胺基酸序列及SEQ ID NO: 319中所示之輕鏈可變域胺基酸序列的抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，核酸分子編碼包含SEQ ID NO: 360中所示之重鏈可變域胺基酸序列及SEQ ID NO: 361中所示之輕鏈可變域胺基酸序列的抗體或其抗原結合部分。
在一些情況下，本發明之核酸包括密碼子優化核酸。產生密碼子優化核酸之方法為此項技術中已知的，且可包括但不限於美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所描述之方法，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。本文亦提供包含前述核酸中之任一者之表現載體。 產生結合 LTBP1/3-TGFβ1 複合物之抗體
本領域熟悉可用於獲得本發明之抗體或其抗原結合片段的各種技術及方法。舉例而言，可使用重組DNA方法、融合瘤技術、噬菌體或酵母展示技術、轉殖基因動物(例如XenoMouse®)或其某一組合產生抗體。免疫接種及融合瘤
在本文所描述之一些方法中，指定抗原(例如LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物)可用於免疫接種非人類動物(「宿主」) (例如嚙齒動物，例如小鼠、倉鼠或大鼠)。在一個實施例中，非人類動物為小鼠。在另一實施例中，宿主可為駱駝科。
免疫接種(其可包括單個或多個抗原暴露步驟(例如注射))之後，自動物收集脾細胞且使相關B細胞與永生化骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤以便產生抗體。融合瘤可根據已知方法產生(參見例如Kohler及Milstein (1975) Nature, 256: 495- 499)。隨後使用標準方法篩選以此方式形成之融合瘤，該等標準方法諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、生物層干涉術(BLI)技術(例如OCTET)及表面電漿子共振(例如BIACORE)分析，以鑑別一或多種產生專一性結合於指定抗原之抗體的融合瘤。指定抗原之任何形式可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在之形式、任何變體或其片段以及其抗原肽(例如作為線性抗原決定基或處於架構內的作為構形抗原決定基的本文中所描述之抗原決定基中之任一者)。篩選庫 / 庫
在一些實施例中，製成或鑑別抗體之方法或製程包括篩選表現抗體或其片段(例如scFv)之蛋白質表現庫(例如噬菌體、酵母或核糖體展示庫)的步驟。舉例而言，可在噬菌體或酵母上合成人類組合性抗體或scFv片段之庫，隨後用所關注之抗原或其抗體結合部分篩選庫，且分離出結合抗原之噬菌體或酵母，由此可獲得抗體或免疫反應性片段(Vaughan 等人, 1996, PMID: 9630891；Sheets 等人, 1998, PMID: 9600934；Boder等人, 1997, PMID: 9181578；Pepper等人, 2008, PMID: 18336206)。
噬菌體展示進一步描述於例如Ladner 等人, 美國專利第5,223,409號；Smith (1985) Science 228:1315-1317；Clackson等人. (1991) Nature, 352: 624-628；Marks等人. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；及WO 90/02809中。酵母展示進一步描述於例如US 7,700,302及US 8,877,688中。在特定方法中，酵母展示庫表現全長抗體(例如Adimab，LLC)。
用於產生噬菌體或酵母展示庫的套組可市購。亦存在可用於產生及篩選抗體展示庫的其他方法及試劑(參見US 5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人, 1991, PMID: 1896445)。此類技術有利地允許篩選大量候選抗體。
無論如何獲得，產抗體細胞(例如酵母群落、融合瘤等)可加以選擇、選殖且針對所需特徵進行進一步篩選，所需特徵包括例如穩定生長、高抗體產量及所需抗體特徵，諸如對所關注抗原之高親和力。選擇、選殖及擴增群落及/或融合瘤之方法已為一般技術者熟知。鑑別出所需抗體之後，可使用此項技術中公認的通用分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關基因材料。人類化
本發明之抗體或片段較佳為完全人類抗體或人類化抗體。因此，無論任何來源如何，應瞭解，該方法可包含使一或多種抗體或其片段人類化，其中人類抗體序列可使用本領域公認分子工程改造技術製造且引入至如本文所描述之表現系統及宿主細胞中。此類非天然重組產生人類抗體(及本發明組合物)與本發明之教示內容完全相容且明確屬於本發明之範疇內。在某些選擇態樣中，本發明之LTBP1-TGFβ1複合物結合及/或LTBP3-TGFβ1複合物結合抗體將包含以重組方式產生之人類抗體。親和力成熟
在一些實施例中，藉由上文所描述之方法產生之抗體可具有中等親和力(Ka為約106 至107 M-1)。因此，必要時，抗體或其片段可經受作為最佳化之一部分的親和力成熟之方法。術語「親和力成熟」應為熟習此項技術者容易理解之含義。簡言之，其係指進一步修飾候選抗體或片段(通常稱為「親本」)之胺基酸序列以實現與專一性抗原之改良的結合概況。通常，親本抗體及親和力成熟之對應物(有時稱為「後代(progeny)」或「後代(offspring)」)保留相同抗原決定基。可在親和力成熟過程期間在適當步驟進行適合的活體外結合分析以篩選改良之結合劑。視情況，在一些實施例中，亦可進行功能分析(例如基於細胞之效能分析)以確認所需功能性。
親和力成熟通常涉及序列多樣化及/或突變誘發，而引入或產生突變之確切方式不具限制性。在一些實施例中，突變誘發包含在一或多個CDR之胺基酸殘基中引入一或多個變化(例如取代或缺失)。因此，在一些實施例中，本文所描述之VR或CDR序列可包含至多一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸變化。在一些實施例中，本文所描述之VR或CDR序列可包含至多一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸取代。在一些實施例中，本文所描述之VR或CDR序列可包含至多一個、兩個、三個或四個缺失。另外或或者，突變誘發可包含可變區或CDR之所謂的寡-行走(oligo-walking)。
舉例而言，抗體之親和力成熟可藉由多種方法實現，包括隨機突變誘發(Gram H.,等人. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89, 3576-3580及Hawkins R. E., 等人. J. Mol. Biol. (1992) 226, 889-896)、CDR序列之隨機突變誘發，例如CDR行走(Yang W. P., 等人, J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)、殘基之定向突變誘發(Ho M., 等人, J. Biol. Chem. (2005) 280, 607-617及Ho M., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 9637-9642)及活體外再生體細胞超突變(SHM)之方法(Bowers P. M., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 20455-20460)。
在一個實施例中，抗體可藉由在可變重鏈或可變輕鏈區上進行突變誘發而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變重鏈CDR或可變輕鏈CDR中之任一者上進行突變誘發而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變重鏈CDR3上進行突變誘發(例如CDR-H3突變誘發)而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變重鏈CDR2上進行突變誘發(例如CDR-H2突變誘發)而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變重鏈CDR1上進行突變誘發(例如CDR-H1突變誘發)而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變輕鏈CDR3上進行突變誘發(例如CDR-L3突變誘發)而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變輕鏈CDR2上進行突變誘發(例如CDR-L2突變誘發)而經親和力成熟。在另一實施例中，抗體可藉由在可變輕鏈CDR1上進行突變誘發(例如CDR-L1突變誘發)而經親和力成熟。
在一些實施例中，抗體可藉由分別對三個輕鏈CDR (亦即CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)中之一些或全部進行突變誘發而經親和力成熟及/或最佳化以產生至多三個不同抗體庫，各庫在三個CDR中之一者中具有獨特突變。隨後可針對改良之特性(例如抗原結合)篩選新穎抗體。隨後，若需要進一步親和力改良，則來自各庫之獨特CDR可經混合及匹配以產生新穎抗體庫，且根據改良特性(例如抗原結合)進行篩選。在一些實施例中，親和力成熟涉及篩選包含一或多個CDR (「譜系(repertoire)」)之變體的抗體庫，其可與親本抗體之至少一個CDR組合。此方法有時稱為CDR改組或CDR多樣化。在一些實施例中，可變重鏈CDR3 (例如CDR-H3)可用於篩選含有變體之可變重鏈CDR1及CDR2譜系之庫(亦稱為CDR-H1/H2多樣化)。在一些實施例中，可變輕鏈CDR3 (例如CDR-L3)可用於篩選含有變體之可變輕鏈CDR1及CDR2譜系之庫(亦稱為CDR-L1/L2多樣化)。
在一些實施例中，親和力成熟涉及篩選包含可與親本抗體之重鏈組合之輕鏈變體(「譜系」)的抗體庫(輕鏈改組)。舉例而言，在一些實施例中，將所選重鏈引入包含輕鏈變體之抗體庫中，從而產生可針對經改良之親和力篩選的新穎抗體庫。在一些實施例中，天然存在之可變區變體之譜系可獲自未經免疫接種之供體。重鏈或輕鏈改組之實例描述於以下文獻中：Marks等人, (1992) Nature Biotech 10: 779-78；Schier等人, (1996) J. Mol. Biol. 255, 28-43；Park等人, (2000) BBRC. 275. 553-557；及Chames等人, (2002) J. Immunol 1110-1118。在一些實施例中，輕鏈庫包含λ輕鏈變體。在一些實施例中，輕鏈庫包含κ輕鏈變體。在一些實施例中，輕鏈庫包含λ及κ輕鏈變體。
應瞭解，親和力成熟之各種方法可以任何次序組合。舉例而言，在一個實施例中，所選抗體可進行重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後進行CDR-H3突變誘發。在另一實施例中，所選抗體可進行重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後CDR-H3突變誘發，隨後輕鏈改組。在另一實施例中，所選抗體可進行重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後輕鏈改組，隨後CDR-H3突變誘發。在另一實施例中，所選抗體可進行輕鏈改組，隨後重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後CDR-H3突變誘發。在另一實施例中，所選抗體可進行輕鏈改組，隨後重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後CDR-H3突變誘發，隨後CDR-L3突變誘發。
在一些實施例中，所選抗體可進行輕鏈改組，隨後重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後CDR-H3突變誘發，隨後CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3突變誘發。在一些實施例中，所選抗體可進行重鏈CDR-H1/H2多樣化，隨後CDR-H3突變誘發，隨後CDR-L1、CDR-L2及/或CDRL3突變誘發。在一些實施例中，輕鏈CDR突變誘發分別在三個輕鏈CDR (CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)中之一些或所有上進行以產生至多三個抗體庫。在一些實施例中，來自各庫之輕鏈CDR經混合及匹配以產生具有輕鏈CDR突變之獨特組合的新穎抗體庫。
在以上所描述之用於親和力成熟之方法中之任一者中，可使用已知技術(例如FACS)選擇所得新穎抗體以用於與目標抗原(例如LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物)結合。使用FACS之結合專一性及親和力可藉由改變抗原濃度及/或競爭未標記(冷)抗原來測試。結合親和力可使用此項技術中已知之其他技術，諸如ELISA、BLI (例如OCTET)及SPR (例如BIACORE)進一步評定。
除上文所論述之親和力成熟方法以外，可進行進一步最佳化以獲得所需產物概況。因此，可進一步使抗體經受最佳化步驟且基於有利之某些物理化學特性進行選擇。對於治療性抗體(生物製劑)，可評價的針對可開發性之物理化學準則包括但不限於：溶解性、穩定性、免疫原性、缺乏自結合或聚集、Fc官能基、內化概況、pH敏感性、糖基化及可製造性，諸如細胞存活率及/或基因表現。在一些實施例中，最佳化方法涉及恆定區內之一或多個胺基酸序列之突變誘發。
在一個態樣中，本發明提供一種用於製成包含抗體或其抗原結合片段之組合物的方法，該抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ1複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ1複合物；其中抗體或其抗原結合片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，該方法包含步驟i)提供包含LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之至少一種抗原，ii)選擇專一性結合步驟(i)之至少一種抗原的抗體或其抗原結合片段之第一集合，以便提供LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之專一性結合物；iii)選擇抑制TGFβ1之活化的抗體或其抗原結合片段之第二集合，以便產生TGFβ1活化之專一性抑制劑；iv)將存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中的抗體或其抗原結合片段調配成醫藥組合物，從而製成包含該抗體或其抗原結合片段之組合物。
在一個實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合GARP-前TGFβ1、LRRC33-前TGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-前TGFβ2、LRRC33-前TGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-前TGFβ3、LRRC33-前TGFβ3、成熟TGFβ3，或其任何組合)的步驟。在一個實施例中，方法進一步包含確定或確認步驟(ii)及/或(iii)中選擇之抗體或其抗原結合片段之同功型專一性的步驟。在一個實施例中，方法進一步包含選擇對人類及嚙齒動物抗原具有交叉反應性之抗體或其抗原結合片段的步驟。在一個實施例中，方法進一步包含產生抗體或其抗原結合片段之完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段之步驟，該抗體或其抗原結合片段存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中。
在一個實施例中，方法進一步包含使存在於抗體之第一集合及/或抗體之第二集合中之抗體或其抗原結合片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或其片段的步驟。在一個實施例中，親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之輕鏈改組的步驟。在一個實施例中，親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之CDR H1/H2多樣化的步驟。在一個實施例中，親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之CDR-H3突變誘發之步驟。在一個實施例中，親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之輕鏈CDR突變誘發的步驟。在一個實施例中，親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受如本文所描述之輕鏈CDR L1/L2多樣化的步驟。
可進行其他最佳化步驟以提供有利於治療組合物之物理化學特性。此類步驟可包括但不限於突變誘發或工程改造以提供改良之溶解性、缺乏自聚集、穩定性、pH敏感性、Fc功能等。
在一個實施例中，方法進一步包含測定抗體或其抗原結合片段對人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1之親和力的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞100 nM)的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞50 nM)的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞25 nM)的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞10 nM)的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含確定自抗體之第一及/或第二集合的抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1之親和力的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞100 nM)的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞50 nM)的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞25 nM)的步驟。在一些實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如以適合的活體外結合分析(諸如生物層干涉術(BLI))所量測，KD ＞10 nM)的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其不結合小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1)的步驟。
在一個實施例中，方法進一步包含測定抗體或其抗原結合片段(自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合，如藉由如本文所描述之適合的基於功能性活體外細胞之分析(諸如caga分析)所量測)之IC50 的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之caga分析所量測大於50 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之caga分析所量測大於25 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之caga分析所量測大於10 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之caga分析所量測大於5 nM)的步驟。
在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之內源性LTBP caga分析所量測大於100 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之內源性LTBP caga分析所量測大於50 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之內源性LTBP caga分析所量測大於25 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之內源性LTBP caga分析所量測大於10 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之內源性LTBP caga分析所量測大於5 nM)的步驟。
在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之人類LTBP過度表現caga分析所量測大於100 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之人類LTBP過度表現caga分析所量測大於50 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之人類LTBP過度表現caga分析所量測大於25 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之人類LTBP過度表現caga分析所量測大於10 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之人類LTBP過度表現caga分析所量測大於5 nM)的步驟。
在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之鼠類LTBP過度表現caga分析所量測大於100 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之鼠類LTBP過度表現caga分析所量測大於50 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之鼠類LTBP過度表現caga分析所量測大於25 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之鼠類LTBP過度表現caga分析所量測大於10 nM)的步驟。在一些實施例中，方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 如藉由如本文所描述之鼠類LTBP過度表現caga分析所量測大於5 nM)的步驟。
在另一實施例中，單株抗體獲自非人類動物，且隨後使用適合重組DNA技術修飾，例如使其嵌合。已描述多種製成嵌合抗體之方法。參見例如Morrison 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985；Takeda等人, Nature 314:452, 1985, Cabilly等人, 美國專利第4,816,567號；Boss等人, 美國專利第4,816,397號；Tanaguchi 等人, 歐洲專利公開案EP171496；歐洲專利公開案0173494, 美國專利GB 2177096B。
對於額外抗體產生技術而言，參見例如 Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow 等人, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988。本發明不必限制於抗體之任何特定來源、產生方法或其他特殊特徵。
本發明之一些態樣係關於經聚核苷酸或載體轉形之宿主細胞。宿主細胞可為原核或真核細胞。存在於宿主細胞中的聚核苷酸或載體可整合至宿主細胞之基因組中或其可維持在染色體外。宿主細胞可為任何原核或真核細胞，諸如細菌細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞或人類細胞。在一些實施例中，真菌細胞為例如酵母菌屬之真菌細胞，尤其釀酒酵母菌(S. cerevisiae)物種之真菌細胞。術語「原核」包括可經DNA或RNA分子轉形或轉染以表現抗體或相應免疫球蛋白鏈的所有細菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性以及革蘭氏陽性細菌，諸如大腸桿菌(E. coli )、鼠傷寒沙門桿菌(S. typhimurium )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens )及枯草桿菌(Bacillus subtilis )。術語「真核」包括酵母、高級植物、昆蟲及脊椎動物細胞，例如哺乳動物細胞，諸如NSO及CHO細胞。視重組產生程序中所用之宿主而定，由聚核苷酸編碼之抗體或免疫球蛋白鏈可為糖基化或可為非糖基化的。抗體或相應免疫球蛋白鏈亦可包括初始甲硫胺酸胺基酸殘基。
在一些實施例中，在載體已併入至合適宿主中後，宿主可維持在適用於核苷酸序列之高度表現的條件下，且視需要，之後可進行免疫球蛋白輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二聚體或完整抗體、抗原結合片段或其他免疫球蛋白形式之收集及純化；參見Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)。因此，將聚核苷酸或載體引入至細胞中，其反過來產生抗體或抗原結合片段。此外，包含前述宿主細胞之轉殖基因動物，較佳哺乳動物，可用於大規模產生抗體或抗體片段。
轉形宿主細胞可在醱酵槽中生長且使用任何適合技術培養為達成最佳細胞生長。在表現後，可根據此項技術之標準程序，包括硫酸銨沈澱、親和管柱、管柱層析、凝膠電泳及其類似者來純化完整抗體、其二聚體、個別輕鏈及重鏈、其他免疫球蛋白形式或抗原結合片段；參見Scopes, 「Protein Purification」, Springer Verlag, N.Y. (1982)。抗體或抗原結合片段可隨後自生長培養基、細胞溶解物或細胞膜部分分離。可藉由任何習知手段，諸如製備型層析分離及免疫分離，諸如涉及使用針對例如抗體之恆定區的單株或多株抗體的彼等分離，對例如經微生物表現之抗體或抗原結合片段進行分離及純化。
本發明之態樣係關於融合瘤，其提供單株抗體之無限期來源。作為直接自融合瘤之培養物獲得免疫球蛋白的替代方案，可使用永生化融合瘤細胞作為用於後續表現及/或基因操控的重排重鏈及輕鏈基因座之來源。重排抗體基因可自合適mRNA反轉錄以產生cDNA。在一些實施例中，重鏈恆定區可與不同同型之重鏈恆定區交換或一起消除。可變區可經連接以編碼單鏈Fv區。多個Fv區可經連接以賦予與多於一種目標結合之能力，或可採用嵌合重鏈及輕鏈組合。可使用任何合適方法來選殖抗體可變區且生成重組抗體。
在一些實施例中，獲得編碼重鏈及/或輕鏈之可變區的合適核酸，且將其插入至可轉染至標準重組宿主細胞中的表現載體。可使用多種此類宿主細胞。在一些實施例中，哺乳動物宿主細胞可有利於高效加工及產生。適用於此目的之典型哺乳動物細胞株包括CHO細胞、293細胞或NSO細胞。可藉由在適合於宿主細胞之生長及編碼序列表現之培養條件下培養經修飾之重組宿主來進行抗體或抗原結合片段之產生。抗體或抗原結合片段可藉由自培養物分離其來回收。表現系統可經設計以包括信號肽，以使得所得抗體分泌於培養基中；然而亦可進行胞內產生。
本發明亦包括編碼本文中所描述之抗體之免疫球蛋白鏈的至少一個可變區的聚核苷酸。在一些實施例中，由聚核苷酸編碼之可變區包含由上述融合瘤中之任一者產生的抗體之可變區之VH及/或VL的至少一個互補決定區(CDR)。
編碼抗體或抗原結合片段之聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、RNA或經合成產生之DNA或RNA或經重組產生之嵌合核酸分子，其包含單獨或組合形式之彼等聚核苷酸中之任一者。在一些實施例中，聚核苷酸為載體之一部分。此類載體可包含其他基因，諸如標記基因，其考慮到可在適合宿主細胞中且在適合條件下的β載體。
在一些實施例中，聚核苷酸以可操作方式連接於允許在原核或真核細胞中進行表現的表現控制序列。聚核苷酸之表現包含將聚核苷酸轉錄成可轉譯mRNA。確保在真核細胞(較佳為哺乳動物細胞)中達成表現的調控元件已為熟習此項技術者熟知。其可包括促進轉錄開始之調節序列及視情況選用之促進轉錄結束及轉錄物之穩定的聚-A (poly-A)信號。額外調控元件可包括轉錄以及轉譯增強子，及/或天然相關的或異質啟動子區。准許原核宿主細胞中之表現的可能調控元件包括例如大腸桿菌中的PL、Lac、Trp或Tac啟動子，且准許真核宿主細胞中之表現的調節元件之實例為酵母中的AOX1或GAL1啟動子，或哺乳動物及其他動物細胞中的CMV啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、CMV強化子、SV40強化子或血球蛋白內含子。
除負責轉錄起始之元件之外，此類調節元件亦可在聚核苷酸之下游包括轉錄終止信號，諸如SV40-聚-A位點或tk-聚-A位點。此外，視所用表現系統而定，能夠將多肽導引至細胞區室或將其分泌於培養基中的前導序列可添加至聚核苷酸之編碼序列，且先前已有描述。前導序列，且較佳地，能夠引導轉譯之蛋白質之分泌的前導序列或其一部分係在適期與轉譯、起始及終止序列一起組裝於胞外培養基中。視情況地，可使用異質聚核苷酸序列，其編碼包括C或N端鑑別肽之融合蛋白，該肽賦予所需特徵，例如經表現之重組產物的穩定或簡化純化。
在一些實施例中，編碼至少輕鏈及/或重鏈之可變域的聚核苷酸可編碼兩個免疫球蛋白鏈或僅一者之可變域。同樣，聚核苷酸可處於同一啟動子控制下或可單獨地受控以供表現。此外，一些態樣係關於基因工程改造中所習知使用的載體，特定而言，質體、黏質體、病毒及噬菌體，其包含編碼抗體或抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之可變域的聚核苷酸；其視情況與編碼抗體之另一免疫球蛋白鏈之可變域的聚核苷酸組合。
在一些實施例中，表現控制序列提供為載體中能夠轉形或轉染真核宿主細胞的真核啟動子系統，但亦可使用原核宿主之控制序列。可使用源自諸如反轉錄病毒、痘瘡病毒、腺相關病毒、疱疹病毒或牛乳頭狀瘤病毒之病毒的表現載體來將聚核苷酸或載體遞送至目標細胞群中(例如以對細胞進行工程改造來表現抗體或抗原結合片段)。可使用多種合適方法來構築重組病毒載體。在一些實施例中，聚核苷酸及載體可重建於脂質體中以遞送至目標細胞。含有聚核苷酸(例如免疫球蛋白鏈編碼序列及表現控制序列的一或多個重鏈及/或輕鏈可變域)之載體可藉由適合方法轉移至宿主細胞中，其視細胞宿主類型而變化。 修飾
本發明之抗體或其抗原結合部分可經可偵測標記或可偵測部分修飾，該可偵測標記或可偵測部分包括但不限於酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、正電子發射金屬、非放射性順磁性金屬離子及用於偵測及/或分離LTBP1-TGFβ1複合物或LTBP3-TGFβ1複合物之親和力標記。可偵測物質或部分可直接偶合或結合於本發明之多肽，或間接地使用適合技術經由中間物(諸如連接子(例如可裂解連接子))來偶合或結合於本發明之多肽。適合酶之非限制性實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖、葡萄糖氧化酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之非限制性實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生蛋白/生物素；適合螢光材料之非限制性實例包括生物素、傘酮、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料之實例包括魯米諾(luminol)；生物發光材料之非限制性實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白；且適合放射性材料之實例包括放射性金屬離子,例如α發射體或其他放射性同位素，諸如碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 mIn、113 mIn、112 In、111 In)及鎝(99 Tc、99 mTc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、86 R、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se及錫(113 Sn、117 Sn)。可偵測物質可直接偶合或結合於選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物的本發明抗體，或間接地使用適合技術經由中間物(諸如連接子)結合於該等抗體。與可偵測物質結合的本文所提供之抗體中之任一者可用於任何適合診斷分析，諸如本文中所描述之分析。
另外，本發明之抗體或其抗原結合部分亦可經藥物修飾以形成例如抗體-藥物結合物。藥物可直接偶合或結合於本發明之多肽，或間接地使用適合技術經由中間物(諸如連接子(例如可裂解連接子))來偶合或結合於本發明之多肽。 靶向劑
在一些實施例中，出於富集或定位此類試劑至所關注生態棲位之目的，本發明之方法包含使用一或多種靶向劑以使如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分靶向個體之特定位點。在一些實施例中，此類靶向可實現調節成熟TGFβ自LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之釋放。舉例而言，LTBP1-TGFβ1及LTBP3-TGFβ1複合物通常定位於胞外基質。因此，在一些實施例中，出於將抗體定位至LTBP1-TGFβ1及LTBP3-TGFβ1複合物所駐留之位點的目的，本文所揭示之抗體可與胞外基質靶向劑結合。在此類實施例中，抗體之選擇性靶向引起LTBP1-TGFβ1及/或LTBP3-TGFβ1複合物之選擇性調節。在一些實施例中，抗體之選擇性靶向引起LTBP1-TGFβ1及/或LTBP3-TGFβ1複合物之選擇性抑制(例如出於治療纖維化之目的)。在一些實施例中，胞外基質靶向劑包括肝素結合劑、基質金屬蛋白酶結合劑、離胺醯氧化酶結合域、小纖維蛋白結合劑、玻尿酸結合劑及其他。
在一些實施例中，可使用雙專一性抗體，其具有選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物之第一部分及選擇性結合目標位點之組分(例如ECM (例如小纖維蛋白)之組分)的第二部分。
在一些實施例中，此類目標試劑可偶合至另一試劑或治療劑以將複合物攜帶或定位至所關注生態棲位。 安全性/毒性考慮因素組織病理學 、毒理學
如上文所提及，已證明拮抗所有TGFβ異構體，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之已知泛抑制劑在多種哺乳動物物種中會引起多種毒性。最顯著之已知毒性包括心血管毒性(諸如瓣膜病)及上皮細胞增生、皮膚病變、發炎及出血。更具體言之，文獻中所報導的與泛TGFβ抑制劑(例如TGFβR之小分子拮抗劑及非選擇性中和抗體)相關的所觀測到之毒性中之一些包括以下。
與TGFβ抑制相關之心血管毒性包括：主動脈瓣膜、右AV瓣膜及左AV瓣膜中之增生；主動脈瓣膜、左AV瓣膜及升主動脈中發炎；升主動脈、主動脈瓣膜及左AV瓣膜中出血；升主動脈中結締組織退化(參見例如Strauber等人 (2014) 「Nonclinical safety evaluation of a Transforming Growth Factor β receptor I kinase inhibitor in Fischer 344 rats and beagle dogs」 J. Clin. Pract 4(3): 1000196)。
此外，結合全部三種TGFβ同功型之中和抗體與某些上皮細胞毒性相關，其概述於下表中。 針對 1D11 及 GC1008 在 物種中的上皮細胞及其他毒性
   小鼠 食蟹獼猴 人類
毒性 • 舌、牙齦及食道出現增生及發炎。 • 研究結果不可逆(12週恢復) • 牙齦、鼻部上皮及膀胱出現增生 • 貧血導致治療停止 • 變化可逆(膀胱除外) •牙齦出血 •流鼻血 •頭疼 •疲勞 •多種皮膚病症，包括角化棘皮瘤(KA)、過度角化、皮膚SCC及基底細胞癌
藥物 / 劑量 / 持續時間 1D11 劑量：50 mg/kg(3x/週) 持續時間：9-12週 GC1008 劑量：10及50 mg/kg 持續時間：6個月 GC1008 劑量：0.1、0.3、1、3、0、15 mg/kg 持續時間：4個月劑量
暴露量 血清濃度=1-2 mg/mL (超過4-12週) 未揭示 半衰期：21.7 d DN Cmax 約(350 ng/mL)mg
*Vitsky等人 Am. J Pathology 第174卷, 2009；及Lonning等人 Current Pharmaceutical Biotech, 2011
申請人先前證明單株抗體之改良之安全概況，該等單株抗體藉由靶向潛伏前TGFβ1複合物選擇性阻斷TGFβ1之活化步驟(參見例如WO 2017/156500及WO 2018/129329)。在其中所描述之大鼠毒理學研究中，當用至多100 mg/kg/週之抑制劑給藥動物持續4週時，未可觀測到測試物品相關毒性。
本發明之申請人更早認識到(參見PCT/US2017/021972)缺少習知TGFβ拮抗劑之同功型專一性可構成與TGFβ抑制相關之毒性來源的基礎，基於此認識建構，本發明人試圖進一步實現用於治療表現TGFβ1失調之各種疾病(特定言之纖維化病況)，具有增強的安全性/耐受性的情形選擇性TGFβ1抑制。因此，在高親和力抑制劑(其為具有尤其低解離速率(kOFF )之一小類抗體)中進一步提供本文中所呈現之作用，以便改良耐久性。
因此，在一些實施例中，當每週一次給藥持續至少4週(例如4、6、8、10、12週)時，根據本發明之新穎抗體具有＞100 mg/kg之最大耐受劑量(MTD)。在一些實施例中，當在大鼠中每週一次給藥持續至少4週時，根據本發明之新穎抗體之無觀測到之不良反應量(NOAEL)為至多100 mg/kg。在一些實施例中，當在小鼠中給藥4週或12週時，抗體之NOAEL為至少100 mg/kg/週。用於進行TGFβ抑制劑之安全性/毒理學研究及TGFβ1抑制劑的適合動物模型包括但不限於：大鼠、犬、食蟹獼猴及小鼠。在較佳實施例中，基於適合臨床前功效研究的抗體之最低有效量低於NOAEL。更佳地，抗體之最低有效量為NOAEL之約三分之一或更小。在尤其較佳實施例中，抗體之最低有效量為NOAEL之約六分之一或更小。在一些實施例中，抗體之最低有效量為NOAEL之約十分之一或更小。
在一些實施例中，本發明涵蓋能夠抑制TGFβ1信號傳導之同功型選擇性抗體，其在向個體投與時在有效治療TGFβ1相關適應症之劑量下不引起心臟血管或已知上皮細胞毒性。在一些實施例中，抗體之最低有效量為每週一次、兩週一次或每月一次投與之約3-10 mg/kg。較佳地，抗體在至少六倍最低有效量(例如六倍治療窗)之劑量下不引起最低毒性。更佳地，抗體在至少十倍最低有效量(例如十倍治療窗)之劑量下不引起最低毒性。甚至更佳地，抗體在至少十五倍最有效量(例如十五倍治療窗)之劑量下不引起最低毒性。
因此，選擇用於治療用途之抗體或其抗原結合片段可包括：選擇符合一或多種TGFβ抑制劑之準則的抗體或抗原結合片段(諸如針對具有緩慢解離速率，例如kOFF ＜ 5 x 10-4 (1/s)所選之單株抗體及抗原結合片段)；在適合臨床前模型中進行活體內功效研究以確定抗體或片段之有效量；在適合模型中進行活體內安全性/毒理學研究以確定安全或有毒的抗體之量(例如MTD、NOAEL或用於評估安全性/毒性之此項技術公認的的參數)；及選擇提供至少三倍治療窗(較佳6倍，更佳10倍治療窗，甚至更佳15倍治療窗)之抗體或片段。所選抗體或片段可用於製造包含抗體或片段之醫藥組合物。此類醫藥組合物可用於治療個體中之TGFβ1適應症，如本文所描述。舉例而言，TGFβ1適應症可為纖維化病症。較佳地，待選擇用於治療用途或大規模製造之TGFβ抑制劑在持續暴露至少4週，例如8週及12週之後在經治療動物中不會產生可觀測的不良作用。在一些實施例中，在組織病理學分析中觀測到之某些毒性視為非不良的。免疫安全性評定
細胞介素在正常免疫反應中起重要作用，但當免疫系統經觸發而變得過度活化時，細胞介素產生之正反饋迴路可引起「細胞介素風暴」或高細胞因子血症，其中過度細胞介素產生引起可損害器官，尤其是肺及腎，且甚至導致死亡之免疫反應的情形。此類病況之特徵為血清中顯著升高之促炎性細胞介素。歷史上，抗CD28單株抗體TGN1412在健康志願者中的1期試驗導致危及生命的「細胞介素風暴」反應，其由出人意料的全身性及快速誘導促炎性細胞介素引起(Suntharalingam G 等人 N Engl J Med. 2006 Sep 7;355(10):1018-28)。此事件促使與T細胞之藥理學刺激相關之潛在危險的意識加強。
儘管針對TGFβ之療法並不靶向專一性T細胞受體或其配位體，但意欲小心地進行免疫安全評估，包括例如活體外細胞介素釋放分析、來自用TGFβ抑制劑處理之非人類靈長類動物之血漿樣品的活體內細胞介素量測及使用人類血小板之血小板分析。
在一些實施例中，選擇用於治療用途及/或其大規模生產之TGFβ抑制劑包括評定TGFβ抑制劑觸發細胞介素以自細胞介素產生細胞釋放之能力。在此類評定中，可分析細胞介素(例如發炎性細胞介素) IL-2、TNFα、IFNγ、IL-1β、CCL2 (MCP-1)及IL-6中之一或多者。在一些實施例中，細胞介素產生之細胞可包括來自健康供體之周邊血液單核細胞(PBMC)組分。可將在暴露於本文中之TGFβ抑制劑(諸如所揭示之抗體)之後的細胞介素反應與在暴露於對照物(例如IgG同型陰性對照物)或任何其他適合對照物(視待測試之TGFβ抑制劑而定)之後的釋放進行比較。可在盤結合(例如固定)及/或可溶分析形式中評估細胞介素活化。IFNγ、IL-2、IL-1β、TNFα、IL-6及CCL2 (MCP-1)之水準不應超過陰性對照物中之活化的10倍，例如8倍、6倍、4倍或2倍。在一些實施例中，亦可使用陽性對照物證實樣品(例如PBMC)中之細胞介素活化。在一些實施例中，此等活體外細胞介素釋放結果可在活體內，例如在動物模型，諸如猴毒理學研究，例如4週GLP或非GLP重複性劑量猴研究中進一步證實。
在一些實施例中，選擇用於治療用途之抗體或其抗原結合片段可包括：鑑別符合本文所描述的一或多種彼等之準則的抗體或抗原結合片段；在適合臨床前模型中進行活體內功效研究以確定抗體或片段之有效量；在適合模型中進行活體內安全性/毒理學研究以確定安全或有毒的抗體之量(例如MTD、NOAEL或用於評估安全性/毒性之此項技術公認的的參數)；及選擇提供至少三倍治療窗(較佳6倍，更佳10倍治療窗，甚至更佳15倍治療窗)之抗體或片段。在某些實施例中，活體內功效研究在複製人類病況之兩種或更多種適合之臨床前模型中進行。在一些實施例中，此類臨床前模型包含TGFβ1陽性纖維化。在一些實施例中，臨床前模型係選自肝纖維化模型、腎臟纖維化模型、肺纖維化模型、心(心臟)纖維化模型、皮膚纖維化模型。
鑑別用於治療用途之抗體或其抗原結合片段可進一步包括進行免疫安全分析，其可包括但不限於量測細胞介素釋放及/或測定抗體或抗原結合片段對血小板結合、活化及/或凝集之影響。在某些實施例中，可使用PBMC活體外或使用臨床前模型(諸如非人類靈長類動物)活體內量測細胞介素釋放。在某些實施例中，相較於免疫安全性評定中IgG對照樣品中之水準，抗體或其抗原結合片段在IL-6、IFNγ及/或TNFα水準下不誘導大於10倍釋放。在某些實施例中，血小板結合、活化及凝集之評定可使用PBMC活體外進行。在一些實施例中，在免疫安全性評定中，與緩衝液或同型對照物相比，抗體或其抗原結合片段不誘導血小板結合、活化及/或凝集增加超過10%。
所選抗體或片段可用於製造包含抗體或片段之醫藥組合物。此類醫藥組合物可用於治療個體中之TGFβ適應症，如本文所描述。舉例而言，TGFβ適應症可為纖維化病症，諸如器官纖維化，例如肝纖維化。因此，本發明包括一種用於製造包含TGFβ抑制劑之醫藥組合物的方法，其中該方法包括如下步驟：選擇如藉由包含細胞介素釋放分析之免疫安全性評定所評定之針對免疫安全性所測試且視情況進一步包含血小板分析之TGFβ抑制劑。相較於對照物(諸如IgG對照物)，藉由該方法所選擇之TGFβ抑制劑並不觸發不可接受之細胞介素釋放水準。類似地，藉由該方法所選擇之TGFβ抑制劑並不引起不可接受之血小板凝集、血小板活化及/或血小板結合水準。隨後以大規模製造此類TGFβ抑制劑，例如250 L或更大，例如1000 L、2000 L、3000 L、4000 L或更大，用於商業產生包含TGFβ抑制劑之醫藥組合物。 醫藥組合物
本發明進一步提供醫藥組合物，其用作適用於在人類及非人類個體中投與之藥劑。選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之一或多種抗體可與醫藥學上可接受之載劑(賦形劑) (包括例如緩衝劑)調配或摻合以形成醫藥組合物。此類調配物可用於治療涉及TGFβ信號傳導或其失調之疾病或病症。在一些實施例中，與TGFβ信號傳導相關之此類疾病或病症涉及一或多個情形，亦即TGFβ與特定一種類型或多種類型之呈遞分子相關。在一些實施例中，此類情形以細胞類型專一性及/或組織專一性方式發生於。在一些實施例中，舉例而言，TGFβ信號傳導之此類情形依賴性作用部分經由GARP、LRRC33、LTBP1及/或LTBP3介導。
在一些實施例中，本發明之抗體選擇性地結合於TGFβ之單一情形，使得抗體結合與LTBP呈遞分子(例如LTBP1及/或LTBP3)複合之TGFβ。因此，可向患者投與此類醫藥組合物以緩解與自LTBP1及/或LTBP3之TGFβ1活化/釋放相關的TGFβ相關適應症(例如纖維化)。
醫藥學上「可接受之」載劑(賦形劑)意謂載劑與組合物之活性成分相容(且更佳能夠穩定活性成分)，且對所治療之個體無不利作用。醫藥學上可接受之賦形劑(載劑)之實例(包括緩衝劑)將對熟習此項技術者顯而易見，且先前已有描述。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版. (2000) Lippincott Williams及Wilkins, Ed. K. E. Hoover。在一個實例中，本文中所描述之醫藥組合物含有選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之超過一種抗體，其中該等抗體識別LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之不同抗原決定基/殘基。
本發明方法中所用之醫藥組合物可包含呈凍乾調配物或水溶液形式的醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版 (2000) Lippincott Williams及Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)之多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；以及鹽形成相對離子，諸如鈉離子；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。本文中將進一步描述醫藥學上可接受之賦形劑。
本發明亦包括包含根據本發明之抗體或其片段及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
因此，包含此類抗體之抗原結合片段的抗體或分子可調配於適用於人類投與之醫藥組合物中。
醫藥調配物可包括一或多種賦形劑。在一些實施例中，一或多種賦形劑可選自以下中所提供之清單：https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm?event=browseByLetter.page&Letter=A
醫藥組合物通常調配至最終濃度在約2 mg/mL與約200 mg/mL之間的活性生物製劑(例如單株抗體、包含抗原結合片段中經工程改造之結合分子等)。舉例而言，調配物之最終濃度(wt/vol)可在介於以下之間的範圍內：約2-200、2-180、2-160、2-150、2-120、2-100、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、5-200、5-180、5-160、5-150、5-120、5-100、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、10-200、10-180、10-160、10-150、10-120、10-100、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、20-200、20-180、20-160、20-150、20-120、20-100、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、30-200、30-180、30-160、30-150、30-120、30-100、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-200、40-180、40-160、40-150、40-120、40-100、40-80、40-70、40-60、40-50、50-200、50-180、50-160、50-150、50-120、50-100、50-80、50-70、50-60、60-200、60-180、60-160、60-150、60-120、60-100、60-80、60-70、70-200、70-180、70-160、70-150、70-120、70-100、70-80 mg/mL。在一些實施例中，調配物中的生物製劑之最終濃度為約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mg/mL。
本發明之醫藥組合物較佳調配有適合緩衝劑。適合緩衝劑包括但不限於：磷酸鹽緩衝劑、檸檬酸緩衝劑及組胺酸緩衝劑。
調配物之最終pH通常在pH 5.0與8.0之間。舉例而言，醫藥組合物之pH可為約5.0、5.2、5.5、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.5、7.6或7.8。
本發明之醫藥組合物可包含批准用於醫藥調配物中的界面活性劑，諸如非離子型清潔劑。此類界面活性劑包括例如聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20 (Tween-20)、聚山梨醇酯80 (Tween-80)及NP-40。
本發明之醫藥組合物可包含穩定劑。對於液體-蛋白製備，可藉由選擇緩衝pH鹽增強穩定性，且通常亦可使用胺基酸。其通常在液體/空氣界面或液體/固體界面相互作用(伴隨封裝)，引起聚集，隨後吸附及解摺疊蛋白質。適合穩定劑包括但不限於：蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇以及某些胺基酸，諸如組胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸及精胺酸。
本發明之醫藥組合物可含有以下賦形劑中之一者或任何組合：磷酸鈉、精胺酸、蔗糖、氯化鈉、緩血酸胺、甘露糖醇、苯甲醇、組胺酸、蔗糖、聚山梨醇酯80、檸檬酸鈉、甘胺酸、聚山梨醇酯20、海藻糖、泊洛沙姆(Poloxamer) 188、甲硫胺酸、海藻糖、rh-玻尿酸酶(rhHyaluronidase)、丁二酸鈉、磷酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、麥芽糖、乙酸組胺酸、山梨糖醇、噴替酸、人類血清白蛋白、噴替酸。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可含有防腐劑。
本發明之醫藥組合物通常以液體或凍乾形式存在。通常，產物可存在於小瓶(例如玻璃瓶)中。可用於注射器、筆或自動注射器之產物可以預填充液體形式存在於此等容器/封閉系統中。
在一些實例中，本文中所描述之醫藥組合物包含脂質體，其含有選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體，其可藉由任何適合的方法製備，諸如描述於Epstein等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang等人. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。具有延長之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。特別適用之脂質體可藉由逆相蒸發法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經由孔徑經限定之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。
在一些實施例中，選擇具有靶向特性之脂質體以將醫藥組合物優先遞送或定位至某些組織或細胞類型。舉例而言，可採用具有靶向骨髓特性之某些基於奈米粒子之載劑，例如基於脂質之奈米粒子或脂質體。參見例如Sou (2012) 「Advanced drug carriers targeting bone marrow」, ResearchGate publication 232725109。
選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體亦可包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中，例如分別在膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或在巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。例示性技術先前已有描述，參見例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版 Mack Publishing (2000)。
在其他實施例中，本文中所描述之醫藥組合物可以持續釋放形式調配。持續釋放製備物之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM ) (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)構成之可注射微球體)、蔗糖乙酸酯異丁酸鹽及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於活體內投與之醫藥組合物必須為無菌的。此易於藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。治療抗體組合物一般置放於具有無菌接取口之容器中，例如靜脈內溶液袋或具有可用皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶。
本文中所描述之醫藥組合物可呈單位劑型，諸如錠劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒、溶液或懸浮液或栓劑，以用於經口、非經腸或經直腸投與或藉由吸入或吹入投與。
詳言之，適合的表面活性劑包括非離子型試劑，諸如聚氧乙烯去水山梨糖醇(例如TWEENTM 20、40、60、80或85)及其他去水山梨糖醇(例如SPANTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑之組合物宜將包含0.05%與5%之間的表面活性劑，且可在0.1%與2.5%之間。應瞭解必要時可添加其他成分，例如甘露醇，或其他醫藥學上可接受之媒劑。
適合的乳液可使用市售脂肪乳液，諸如INTRALIPIDTM 、LIPSYNTM 、INFONUTROLTM 、LIPOFUNDINTM 及LIPIPHYSANTM 製備。活性成分可溶解於預混乳液組合物中，或者其可溶解於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及在與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合時形成的乳液中。應瞭解可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳液張力。適合的乳液將通常含有至多20%油，例如5%與20%之間。
乳液組合物可為藉由混合選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體與IntralipidTM 或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備的彼等物。 使用選擇性結合 LTBP1/3-TGFβ1 複合物之抑制劑
本文中所描述的選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體及其抗原結合部分可用於其中需要調節與LTBP1或LTBP3相關之TGFβ1活性的廣泛多種應用中。
在一個實施例中，本發明提供藉由將LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物暴露於抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)來抑制TGFβ1活化的方法，所述抑制劑選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物。前述方法可活體外進行，例如以抑制所培養細胞中之TGFβ1活化。前述方法亦可在活體內進行，例如在需要TGFβ1抑制之個體中，或在評定TGFβ1抑制之效果的動物模型中進行。
選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物的本文所描述之任何抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)及包含此類抗體之任何醫藥組合物適用於本發明之方法中。舉例而言，在一個實施例中，抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及LTBP3-TGFβ1複合物，但不結合於選自以下之一或多個目標：單獨LTBP1、單獨成熟TGFβ1、GARP-TGFβ1複合物、LRRC33-TGFβ1複合物及其組合。例示性抑制劑，例如抗體可抑制成熟TGFβ1自LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物釋放，而不抑制成熟TGFβ1自GARP-前TGFβ1複合物及/或LRRC33-前TGFβ1複合物釋放。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分可以約10-8 M或更小之解離常數(KD )結合LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分之KD 值為約10-9 M或更小。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分之KD 值為約10-10 M或更小(例如約10-11 M或更小)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分針對LTBP1-前TGFβ1複合物及/或LTBP3-前TGFβ1複合物之KD 值為＜10 nM、＜5 nM ＜1 nM，如在適合的活體外結合分析(諸如BLI (例如Octet))中所量測。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分包含表5中所示之至少一個(例如一個、兩個或三個)重鏈CDR及/或表5中所示之至少一個(例如一個、兩個、三個)輕鏈CDR。在例示性實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 7之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區。結合與前述抗體相同之抗原決定基及/或與前述抗體競爭結合於LTBP1/3-前TGFβ1之抗體及其抗原結合部分亦適用於本文所描述之方法中。本文描述適用於實踐本發明之方法的抗體或其抗原結合部分的額外特徵。
在一個實施例中，使LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物與抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)接觸抑制成熟TGFβ1自LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物釋放。在一個實施例中，該接觸不抑制成熟TGFβ1自除LTBP1及LTBP3外之呈遞分子釋放。舉例而言，使GARP-TGFβ1複合物或LRRC33-TGFβ1複合物暴露於情形專一性抑制劑，例如選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1但在GARP或LRRC33之情形下不結合TGFβ1之抗體將不抑制成熟TGFβ1自GARP-TGFβ1複合物或LRRC33-TGFβ1複合物釋放。
LTBP1及LTBP3一般沈積於胞外基質中。因此，在一個實施例中，包含LTBP1-TGFβ1及/或LTBP3-TGFβ1之複合物與胞外基質相關，例如結合於胞外基質。在一些實施例中，LTBP1/3-TGFβ1複合物結合於包含小纖維蛋白及/或含有RGD基元之蛋白質的胞外基質。
本發明亦提供減少個體中之TGFβ1活化的方法，該方法藉由向個體投與選擇性結合如本文所描述之LTBP1/3-TGFβ1複合物的抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分。選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物的本文所描述之任何抗體或其抗原結合部分及包含此類抗體之任何醫藥組合物適用於本發明之方法中。
例示性LTBP1/3抑制劑(例如抗體)結合LTBP1/3-TGFβ1複合物，且藉由抑制由LTBP1及LTBP3呈遞之TGFβ1之釋放而不抑制由GARP及/或LRRC33呈遞之TGFβ1之釋放，來以情形專一性方式抑制TGFβ1活化。此類抗體適用於在活體內阻斷特定一小類TGFβ1活性。在一個實施例中，本文所提供之情形專一性抗體可用於抑制定位於胞外基質之TGFβ1。在另一實施例中，情形專一性抗體可抑制TGFβ1而不調節TGFβ1相關之免疫活性或免疫反應，該免疫活性或免疫反應主要由GARP及LRRC33所呈遞之TGFβ1介導。在另一實施例中，在不調節與造血細胞相關之TGFβ1活性的情況下，可使用情形專一性抗體抑制與胞外基質相關之TGFβ1活性(例如LTBP1-相關TGFβ1活性及LTBP3-相關TGFβ1活性)，該等造血細胞例如表現GARP及/或LRRC33之造血細胞。 臨床應用
申請人先前描述TGFβ1之所謂的「情形非依賴性」抑制劑(參見例如：PCT/US2017/021972及PCT/US2018/012601)，其可適用於治療涉及TGFβ1失調之各種疾病及病症，包括但不限於癌症及纖維化。不同於傳統TGFβ1拮抗劑，此等情形非依賴性TGFβ1抑制劑能夠選擇性靶向TGFβ1同功型。然而，在由TGFβ1同功型驅動之多層面生物功能內，情形非依賴性抑制劑並不區別組織專一性(因此情形專一性) 前TGFβ1複合物，使得此類抑制劑能夠結合且從而抑制成熟生長因子自呈遞分子-前TGFβ1複合物中之任一者釋放或活化。
認識到在僅靶向一小類TGFβ活性方面提供甚至更大選擇性可為有利的，至少部分地基於此認識，已產生本發明之情形選擇性抑制劑。預期藉由進一步使抑制TGFβ功能之特定生物情形縮小，可在一小類疾病病況或患者群體中實現較大安全性。特定言之，本發明之發明人已認識到，在某些病況下，免疫調節之全身性擾動可為尤其非所需的。因為TGFβ在介導免疫反應及維持免疫內穩定中起重要作用，所以以情形非依賴性方式所實現的對TGFβ活性之廣泛抑制可引起非所需副作用且無合理的益處。在此等情況下，設想，使用情形選擇性抑制劑(諸如本文所涵蓋之彼等抑制劑)專一性靶向及抑制基質相關TGFβ功能為有利的，該抑制劑不抑制TGFβ1功能之免疫組分。
因此，在需要在LTBP1或LTBP3之情形下的TGFβ活化的應用中，情形專一性抗體可用於抑制LTBP1/3相關TGFβ活性，且其中在GARP及/或LRRC33之情形下的TGFβ活化為有害的。
疾病可涉及ECM組分或功能之失調或受損，且包含膠原蛋白沈積增加。在一些實施例中，ECM組分或功能之失調或受損可進一步包含硬度及/或ECM重組增加。在一些實施例中，ECM組分或功能之失調或受損包括疾病位點中之肌纖維母細胞增加。在一些實施例中，ECM之失調包括基質硬度增加，其牽涉多種纖維化病況及腫瘤之發病機制及/或疾病進展。在一些實施例中，ECM之失調涉及纖維結合蛋白及/或小纖維蛋白。 用於開發不抑制 GARP- 相關 TGFβ 之基質靶向 TGFβ 抑制劑的基本原理
本發明包括LTBP1-相關及/或LTBP3-相關TGFβ之情形專一性抑制劑。因此，此類抑制劑能夠專一性靶向與ECM相關之潛伏TGFβ複合物(例如LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1)，由此抑制在疾病環境(例如纖維化組織)下自潛伏複合物釋放成熟TGFβ生長因子。此類抑制劑未顯示針對GARP-前TGFβ1複合物之顯著結合活性，從而使非所需之全身性免疫調節最小化。此類抗體可有利於用於治療具有ECM失調，諸如ECM之異常重塑及/或硬度的病況。
本文所提供之情形選擇性抗體可用於治療其中不期望刺激個體之免疫反應的病況；及/或於預期個體受益於長期TGFβ抑制療法以管理慢性病況(諸如多種類型之纖維化)之情形中。
下文論述用於支持不靶向表現於調節T細胞上之GARP-前TGFβ1複合物之TGFβ抑制劑之潛在益處的至少三個基礎。
首先，表現GARP之T調節細胞為抑制或減弱其他細胞之免疫反應的免疫系統之組分。此概念可被稱作「耐受性」。此為建置於免疫系統中以預防在一些情況下可引起危及生命之病況(諸如敗血症、細胞介素釋放症候群及細胞介素風暴)之過度反應的重要「自我檢查」。因此，發揮Treg抑制效應之TGFβ抑制療法可在正常Treg功能受損時，特定言之在較長時間持續時間內，例如涉及治療六個月或更長時間之治療方案及在持續一不確定時間段內投與之慢性治療時，造成某些風險。出於此原因，需要TGFβ抑制療法、尤其是為了避免引起自體免疫之風險的患者可受益於不直接干擾正常Treg功能之TGFβ1抑制劑。舉例而言，需要長期TGFβ抑制療法之患者群體可包括具有遺傳或先天性病況，諸如DMD、CF及其他之彼等患者群體。另外，罹患包括發炎之病況的患者群體可受益於不干擾GARP/Treg功能以便使加重現有發炎病況之風險降至最低的情形專一性抑制劑。
其次，越來越多的證據指明，不對稱Th17/Treg比率與涉及發炎及/或纖維化之病變之間存在聯繫。通常公認兩種細胞類型Th17及Treg之分化係以逆關係不利地調節。TGFβ1呈現為此方法之主要守門因子，使得TGFβ1暴露促進未處理T細胞分化成Foxp3+ Treg，而TGFβ1與IL-6之組合促進未處理T細胞實際上分化成RORγt+ Th17細胞。另外，在經分化後，此等細胞群彼此不利地調節。
一系列證據表明Th17/Treg比率不平衡與涉及慢性發炎或其嚴重程度之纖維化病況的發病機制及/或進展相關。
舉例而言，Shoukry等人報導，Th17細胞介素藉由調控TGFβ信號傳導驅動肝纖維化。作者離體檢查肝臟活檢樣品中之Th17及Treg群體之頻率且發現與晚期纖維化相關之Th17/Treg比率增加(相較於中度纖維化或健康組織樣品)。與觀察結果一致，尤其在纖維化肝臟中亦偵測到對Th17細胞介素，IL-22之強烈偏向。此等資料表明，Th17/Treg比率增加引起促纖維化Th17細胞介素之不平衡，該等細胞介素與肝纖維化之嚴重程度相關。
在其他疾病中觀測到Th17及Treg群體之類似逆相關性。
舉例而言，已報導患有杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy，DMD) (其為表現慢性發炎之病況)之患者中IL-17之肌肉表現增加。De Pasquale等人(Neurology 78(17): 1309-14)發現與對照物相比，DMD肌肉活檢樣品含有更高水準之IL-17 (Th17標記)及更低水準之Foxp3 (Treg標記) mRNA。亦觀測到諸如TNF-A及MCP-1之其他促炎性細胞介素中之升高且發現其與患者之較差臨床結果相關。作者推斷資料指出IL-17之可能病原作用。
類似地，Jamshidian等人(J Neuroimmunol 2013, 262(1-2): 106-12)報導患有復發性多發性硬化症之患者中偏向Treg/Th17平衡遠離發炎性表型之調節及其與臨床症狀嚴重程度之相關性。
調節T細胞之作用亦牽涉囊腫性纖維化(CF)之發病機制。特定言之，受疾病影響之CF肺與放大的Th17及Th2細胞反應相關，該等反應指示典型發炎性表型，且亦具有Treg細胞之數目或功能缺陷(亦即減損) (McGuire (2015) Am J Respir Crit Care Med 191(8): 866-8)。
此外，Zhuang等人(Scientific Reports (2017) 7: 40141)發現患有急性前葡萄膜炎(伴隨人類I級主要組織相容複合體陽性的前段眼內發炎)之患者中的Th17/Treg細胞不平衡，其中可見Th17細胞之顯著增加及Treg細胞之顯著減少兩者。
綜合而言，本發明之發明人認識到，呈現為與Th17/Treg比率升高相關之此等各種疾病中之共同特徵為患者罹患伴隨有發炎性組分之纖維化病況。
因此，在本發明中設想，免去TGFβ功能之Treg/GARP-臂的TGFβ抑制療法對於有效治療表徵為Th17/Treg比率之水準提高的疾病可為尤其有利的。以此方式，根據本發明之TGFβ之情形選擇性抑制劑旨在避免可能干擾Treg功能之TGFβ抑制之更全身性效應，其可引起患者之現有纖維化/發炎病況加重。因此，本文所描述之基質靶向TGFβ抑制劑用於治療患有包含發炎之纖維化病症或處於患上包含發炎之纖維化病症之風險下的患者之方法中。在一些實施例中，患者具有升高之Th17與Treg細胞比率。在一些實施例中，升高的Th17/Treg比率可主要由增加數目之Th17細胞引起，而在其他實施例中，升高的Th17/Treg比率可主要由患者中減少數目之Treg細胞(或自患者收集之生物樣品)引起。然而在另外的實施例中，升高的Th17/Treg比率可由增加數目之Th17細胞與減少數目之Treg細胞的組合引起。在一些實施例中，在患者中偵測(或在自患者收集之樣品中所量測)之IL-17及/或IL-22之水準升高亦指示伴隨慢性發炎之纖維化病況。因此，此類患者可選擇為用於接受本文所揭示之情形選擇性TGFβ1抑制劑療法之候選者。
在TGFβ抑制療法中保持GARP-TGFβ1軸完整之第三條理由係關於維持正常Treg功能之益處。如所提及，GARP表現於Treg之細胞表面上，且認為其在TGFβ介導之免疫調節中起作用。由於Treg對於免疫內穩定及預防自體免疫為必不可少的，因此其不必要擾動可使某些患者群體處於例如感染之更高風險下(例如由以下綜述：Richert-Spuhler及Lund (2015) Prog Mol Biol Transl Sci. 136:217-243)。
在TGFβ抑制療法中保持GARP-TGFβ1軸完整之第三條理由為調節T細胞起調節或減弱過度反應性免疫反應的「斷裂」作用。作為Treg細胞發展及功能之主控調節因子的Foxp3之發現對於理解Treg細胞生物學而言為關鍵的。Foxp3中之不活化突變引起嚴重自體免疫之自發性發展，其中小鼠之枇狀表型及人類之IPEX症候群(免疫失調、多內分泌病變、腸病、X性聯) (參見Dominguez-Villear及Haler, Nature Immunology 19, 665-673, 2018)。因此，引發TGFb功能之Treg/GARP臂之抑制效應(尤其在長期治療中)之TGFb1療法可引起或加重自體免疫反應的可能性增加。
越來越多的證據表明，Treg不僅起減弱激烈的效應子免疫反應作用，其亦能夠藉由參與病原體清除及保護宿主免受附帶損害來增強對病原體之適當免疫反應。Treg細胞之此類不同功能在諸如肺之精細組織中特別明顯，該等組織不斷地暴露於外部環境，多種病原體及其他外來組分(例如病毒病原體、細菌病原體、真菌病原體及過敏原)可進入宿主細胞。
舉例而言，流感病毒感染藉由大量免疫細胞浸潤引發強促炎性細胞介素反應。在急性及/或重度感染中，此類反應可在敏感個體中引起嚴重後遺症。Treg提供藉由控制宿主中免疫反應之量值來減弱病毒感染相關之病變的機制。實際上，病原體暴露之Treg在授受性轉移中保留保護作用。此外，經預致敏之Treg的此類授受性轉移已顯示在嚴重免疫功能不全動物模型中改善流感病毒相關之發病率且延長存活率。
因此，本發明提供ECM靶向、情形選擇性TGFβ抑制劑(例如TGFβ1活化抑制劑之LTBP1-選擇性或LTBP1/3-選擇性抑制劑)用於治療個體中涉及基質相關TGFβ失調之疾病的用途。個體罹患感染或處於感染風險下。感染可為病毒感染(例如流感病毒、呼吸道融合性病毒或RSV、人類免疫缺陷病毒或HIV、MARS、SARS、單純疱疹病毒或HSV、A型肝炎病毒或HAV、B型肝炎病毒或HBV、C型肝炎病毒或HCV、CMV、登革熱病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒及西尼羅河病毒(West Nile virus))、細菌感染(腦膜炎、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis )、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes )、檸檬酸桿菌(Citrobacter rodentium)、沙門氏菌(Salmonella)及大腸桿菌)，及/或真菌感染(例如念珠菌屬(Candida )、肺孢子菌(Pneumocytis )、麴菌屬(Aspergillus )、 隱球菌屬(Cryptococcus )及球黴菌屬(Coccidioides )。
通常，高風險或處於風險群體(被認為特別易受嚴重感染或感染觸發之反應的個體)包括兒童群體(嬰兒、幼兒，例如年齡為7歲以下之人類個體)；老年人群體(65歲或以上之彼等者)；具有因醫學病況、健康狀況、生活方式(諸如抽菸)及/或具有免疫抑制作用之藥物治療等所致之免疫系統受損的彼等者。
舉例而言，某些藥物治療引起減弱之免疫性，諸如化學療法、靶向造血細胞之療法，諸如CD33療法、類固醇、免疫抑止劑及士他汀。
在一些實施例中，高風險或處於風險群體為具有現有醫學病況之彼等，諸如患有慢性感染，諸如HIV之彼等、具有骨髓移植之彼等、糖尿病初期個體、糖尿病個體、患有自體免疫病症，諸如RA、哮喘及過敏之彼等。
因此，本文所涵蓋之基質靶向、情形選擇性TGFβ抑制劑可特別有利於治療需要長期或慢性TGFβ療法之患者，因為在此等情形下，避免免疫內穩定及正常免疫功能受損係有益的，該正常免疫功能提供有效應對由多種病原體(諸如以上所列之病原體)引起之可能感染之能力。
因此，選擇性結合LTBP-TGFβ (例如LTBP1-TGFβ1及LTBP3-TGFβ1)且在免疫相關TGFβ呈遞子GARP及LRRC33之情形下不抑制TGFβ的抗體為治療纖維化適應症(諸如器官纖維化)之治療候選者，且旨在避免TGFβ相關之總體免疫活化。在一個實施例中，情形專一性抗體可用於在TGFβ介導之免疫抑制為有益的之應用中抑制LTBP1/3相關TGFβ活性，例如在已接受移植之個體中，該個體為接受移植之候選者，或該個體預期接受移植。在一些實施例中，個體患有晚期纖維化及/或骨髓疾病。
前述方法可用於治療患有病況之個體，對於該病況，抑制或減少LTBP-相關TGFβ活性為有益的。舉例而言，個體可患有已牽涉胞外基質相關TGFβ活性之病症或處於患上該病症之風險中。
胞外基質中潛伏TGFβ之整合素介導之活化為纖維化之關鍵促成者。不希望受理論所束縛，當前應理解，包括αVβ6及αVβ8之整合素可觸發自包括LTBP1及LTBP3之呈遞分子釋放TGFβ。在此情形下，抑制釋放或活化TGFβ可減少或消除纖維化及/或與其相關之症狀。
如所描述，產生LTBP1及LTBP3且其作為ECM之組分在胞外沈積，其中其可將前TGFβ複合物(TGFβ1之潛伏、非活性前驅體) 「呈遞」於ECM內。在刺激後，LTBP1/3-前TGFβ複合物釋放TGFβ生長因子(活性、成熟形式生長因子)，其繼而被認為參與局部組織微環境(諸如ECM維持/重塑)之調節及纖維化過程，可能藉由對各種細胞介素、趨化因子及生長因子作出反應，且藉由與其他ECM組分(諸如纖維結合蛋白、小纖維蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白及基質金屬肽酶(MMP)相互作用。
在回應於損傷發生之正常創傷癒合過程中，例如認為TGFβ促進顆粒組織形成、血管生成及膠原蛋白合成及產生。TGFβ信號傳導亦牽涉異常組織纖維發生(亦即纖維化)，其引起在藉由胞外基質(ECM)組分(諸如膠原蛋白)之病理性積聚表徵的修復或反應性過程中在器官或組織中形成過量纖維結締組織。在此等及其他情形中，TGFβ軸可影響其他態樣(除纖維化態樣之外)，諸如各種細胞類型之發炎、募集及表型交換，其可藉由其與其他呈遞分子中之一或多者(諸如GARP/LRRC32及LRRC33)之相互作用來介導。在某些情況下，有利的是在驅動纖維化之ECM相關TGFβ選擇性抑制的情形中優先抑制TGFβ活化之LTBP1/3情形，而不顯著抑制TGFβ1活化之其他情形中之一或多者。
因此，在一個實施例中，本發明提供藉由向個體投與抗體或其抗原結合部分來降低患有纖維化病症或處於患上纖維化病症之風險中的個體中之TGFβ活化的方法，所述抗體或其抗原結合部分選擇性結合LTBP1/3-TGFβ複合物，如本文所描述。在另一實施例中，本發明提供藉由向個體投與選擇性結合LTBP1/3-TGFβ複合物之抗體或其抗原結合部分來治療纖維化病症之方法，如本文所描述。
在一個實施例中，纖維化病症為器官纖維化，其中視情況，器官纖維化為晚期器官纖維化。在一另外的實施例中，器官纖維化選自由以下組成之群：腎臟纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、胰臟纖維化、皮膚纖維化、硬皮病、肌肉纖維化、子宮纖維化及子宮內膜異位。在另一另外的實施例中，包含慢性發炎之纖維化病症為肌肉萎縮症、多發性硬化症(MS)或囊腫性纖維化(CF)。在一另外的實施例中，肌肉萎縮症為杜興氏肌肉失養症(DMD)。在另一另外的實施例中，MS包含血管周纖維化。在一另外的實施例中，肺纖維化為特發性肺纖維化(IPF)。在另一另外的實施例中，個體患有慢性腎病(CKD)。在另一實施例中，個體患有非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。
在例示性實施例中，纖維化病症為纖維化、阿爾波特症候群、類纖維瘤、結締組織增生、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)或杜興氏肌肉失養症(DMD)。
在一個實施例中，個體具有結締組織增生。
在一個實施例中，個體患有器官纖維化，例如腎臟纖維化(例如與慢性腎病(CKD)相關之纖維化)、肝纖維化(例如與非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)相關之纖維化)、肺纖維化(例如特發性肺纖維化(IPF))、心臟纖維化及/或皮膚纖維化(例如硬皮病)。在一些實施例中，個體可患有晚期器官纖維化。舉例而言，個體可能需要器官移植。在一個實施例中，個體可能需要器官移植，且投與本文所描述之化合物及組合物以預防接受移植之後，個體患上同種異體移植纖維化。
當前研究檢查在腎臟移植之後抑制整合素αVβ6是否可以預防TGFβ介導之同種異體移植纖維化(Lo等人, Am. J. Transplant. (2013), 13:3085-3093)。出人意料地，相較於安慰劑動物，用抑制性抗αVβ6抗體處理之動物經歷無排斥存活期之顯著降低。作者推斷此結果關注腎臟移植中之TGFβ抑制，因為TGFβ之免疫抑制特性有助於防止同種異體移植排斥反應。本文所描述之抑制劑(例如抗體及其抗原結合部分)有利地抑制胞外基質中由LTBP1或LTBP3呈遞之TGFβ之活化，但不抑制免疫細胞上由GARP或LRRC33呈遞之TGFβ之活化。因此，本文所描述之情形專一性LTBP1/3-TGFβ抑制劑(例如抗體)可預防或減少同種異體移植纖維化，而不消除適用於預防同種異體移植排斥反應之TGFβ的免疫抑制特性。因此，在一個態樣中，本發明提供治療個體之纖維化病症的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之TGFβ信號傳導抑制劑，其中抑制劑為ECM相關TGFβ之選擇性抑制劑；且其中該個體受益於抑制免疫。在一個實施例中，個體患有纖維化病況且將得益於同種異體移植，或已接受同種異體移植。
可在治療上使用本發明之抗體及/或組合物的額外纖維化適應症包括但不限於肺臟適應症(例如特發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、過敏性哮喘、囊腫性纖維化(CF)、急性肺損傷、嗜伊紅血球性食道炎、肺動脈高血壓及化學氣體損傷)、腎臟適應症(例如糖尿病性腎小球硬化、局部區段性腎小球硬化(FSGS)、慢性腎病、與腎臟移植及慢性排斥反應相關之纖維化、IgA腎病變及溶血性尿毒症候群)、肝纖維化(例如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、慢性病毒性肝炎、寄生蟲血症、先天性代謝缺陷、經毒素介導之纖維化(諸如酒精纖維化)、非酒精性脂肪變性肝炎-肝細胞癌(NASH-HCC)、原發性膽汁性肝硬化症及硬化性膽管炎)、心血管纖維化(例如心肌病、肥厚性心肌症、動脈粥樣硬化及再狹窄)、全身性硬化症、皮膚纖維化(例如全身性硬化症、彌漫性皮膚全身性硬化症、硬皮病、病理性皮膚疤痕、瘢痕瘤、手術後疤痕、疤痕修復手術、輻射誘發之疤痕及慢性創傷中的皮膚纖維化)、眼部相關病況(諸如視網膜下纖維化、葡萄膜炎症候群、與特發性腹膜後纖維化相關之葡萄膜炎、眼外肌肉纖維化、與主要組織相容複合體(MHC I類)或組織相容抗原相關之眼病、黃斑變性(例如年齡相關之黃斑變性)中的視網膜下纖維化及癌症或繼發性纖維化(例如骨髓纖維化、頭頸癌、M7急性巨核母細胞白血病及黏膜炎)。可使用本發明之化合物及/或組合物治療的與纖維化相關之其他疾病、病症或病況包括但不限於馬凡氏症候群(Marfan's syndrome)、僵直皮膚症候群、硬皮病、類風濕性關節炎、骨髓纖維化、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑性狼瘡症、肌肉萎縮症(諸如DMD)、杜普宜特朗氏攣縮(Dupuytren's contracture)、卡穆拉蒂-恩格爾曼疾病(Camurati-Engelmann disease)、類神經疤痕、癡呆、增生性玻璃體視網膜病變、角膜損傷、在青光眼引流手術之後的併發症及多發性硬化症(MS)。許多此類纖維化適應症亦與受感染組織之發炎相關，其表明涉及免疫組分。此類發炎可伴有異常免疫細胞群，諸如增加之Th17細胞數目，減少之Treg細胞數目及/或兩者。在各情況下，受感染患者可展現增加之Th17/Treg細胞比率。在一些實施例中，用根據本發明之抗體治療之疾病包括代謝障礙，諸如代謝肝臟病症。代謝障礙之非限制性實例包括NASH、NAFLD、2型糖尿病及肥胖症。在一些實施例中，用根據本發明之抗體待治療之疾病為主動脈狹窄。
在另一態樣中，本發明提供選擇用於治療個體之纖維化病症之同功型專一性TGFβ1抑制劑的方法，該方法包含：(a)測定個體是否表現包括纖維化及以下中之一或多者的臨床表現：(i)發炎；(ii)免疫抑制；(iii)增殖失調；(iv)需要同種異體移植；(v)具有嚴重感染之風險；(vi)需要長期TGFβ1抑制療法；及(vii)自體免疫病況之表現；及(b)基於步驟(a)中所測定之臨床表現選擇同功型專一性、情形依賴性TGFβ1抑制劑或同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑來治療纖維化病症。
在另一態樣中，本發明提供治療患有纖維化病症之個體的方法，該方法包含(a)選擇包含用於個體之同功型專一性TGFβ1抑制劑的治療方案，該選擇包含(i)測定纖維化病症是否表現包括纖維化及以下中之一或多者的臨床表現：發炎、免疫抑制、增殖失調及需要同種異體移植；及(ii)基於步驟(i)中所測定之臨床表現選擇包含同功型專一性、情形依賴性TGFβ1抑制劑或同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑之治療方案；及(b)向該個體投與所選擇之治療方案。
在前述態樣之一個實施例中，纖維化病症表現包含纖維化、發炎、免疫抑制及增殖失調之臨床表現。在一例示性實施例中，纖維化病症為骨髓纖維化，且所選同功型專一性TGFβ1抑制劑為同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑。
在另一實施例中，纖維化病症表現包含纖維化、發炎及需要同種異體移植之臨床表現。在一個實施例中，纖維化病症表現包含纖維化及發炎之臨床表現。在另一實施例中，纖維化病症為退化性疾病。
在一個實施例中，纖維化病症表現包含免疫抑制及增殖失調之臨床表現。在一例示性實施例中，纖維化病症與實體腫瘤相關，且所選同功型專一性TGFβ1抑制劑為同功型專一性LTBP1/3專一性抑制劑及/或GARP選擇性抑制劑。在一個實施例中，實體腫瘤為惡性腫瘤。在另一實施例中，腫瘤為良性腫瘤。在一個實施例中，個體具有結締組織增生，例如胰臟結締組織增生。在另一實施例中，個體具有類纖維瘤。
在另一態樣中，本發明提供用同功型專一性LTBP1/3專一性TGFβ1抑制劑治療患有纖維化病症之個體的方法，其包含測定纖維化病症是否表現包括纖維化及需要同種異體移植之臨床表現；及若纖維化病症表現纖維化及需要同種異體移植，則向該個體投與有效量之同功型專一性LTBP1/3專一性TGFβ1抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供用同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑治療患有纖維化病症之個體的方法，該方法包含測定纖維化病症是否表現包括纖維化、免疫抑制及/或增殖失調之臨床表現；及若纖維化病症表現纖維化與免疫抑制及/或增殖失調結合，則向該個體投與有效量之同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑。
本文所描述之抑制劑，例如抗體，可以能有效地治療或減輕纖維化症狀之量向個體投與。此類抑制劑之有效量為在個體中有效地達成治療功效及臨床安全性兩者的量。在一個實施例中，有效量為有效減少胞外基質中之TGFβ1活性的量。在另一實施例中，有效量為能有效減少個體中之纖維化之量。在另一實施例中，有效量不抑制TGFβ1介導之免疫抑制。在一些實施例中，此類抑制劑(例如抗體)為可阻斷由含LTBP、ECM相關TGFβ1介導之TGFβ1之活化的情形專一性抑制劑。在一些實施例中，LTBP為LTBP1及/或LTBP3。適用於針對纖維化之變化測定本發明之抑制劑，例如抗體及/或組合物之功效的分析包括但不限於此項技術中已知的用於對纖維母細胞進行計數之組織學分析及基礎免疫組織化學分析。 涉及蛋白酶之疾病：
TGFβ自其潛伏複合物活化可藉由整合素以力依賴性方式觸發及/或藉由蛋白酶觸發。有證據表明，某些類別之蛋白酶可涉及該過程，其包括但不限於Ser/Thr蛋白酶，諸如凝血酶、激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶以及ADAM家族(諸如ADAM 10及ADAM 17)之鋅金屬蛋白酶以及MMP家族(諸如MMP-2、MMP-9及MMP-13)之鋅金屬蛋白酶。MMP-2降解基底膜之最豐富組分，膠原蛋白IV，提高可在ECM相關之TGFβ1調節中起一定作用的可能性。MMP-9已牽涉在腫瘤進展、血管生成、基質重塑及癌轉移中起主要作用。因此，ECM中TGFβ1之蛋白酶依賴性活化對於治療癌症可為重要的。
激肽釋放酶(KLK)為類胰蛋白酶或類胰凝乳蛋白酶絲胺酸蛋白酶，其包括血漿激肽釋放酶及組織激肽釋放酶。ECM在組織內穩定中起一定作用，充當抑制惡性過度生長之結構性及信號傳導架構及障壁。KLK可在降解ECM蛋白及可促進腫瘤擴增及侵襲之其他組分中起一定作用。舉例而言，KLK1在某些乳癌中高度上調且可活化前MMP-2及前MMP-9。KLK2活化潛伏TGFβ1，使得鄰近於纖維母細胞之前列腺癌容許癌症生長。KLK3已作為前列腺癌(PSA)之診斷標記物得到普遍研究。KLK3可藉由將纖維蛋白溶酶原加工成以蛋白分解方式裂解LAP之纖維蛋白溶酶來直接活化TGFβ1。KLK6可為阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之潛在標記物。
諸如纖維蛋白溶酶、TSP-1及αVβ6整合素的TGFβ1之已知活化劑均與LAP直接相互作用。假定LAP之蛋白水解裂解可使LAP-TGFβ相互作用不穩定，藉此釋放活性TGFβ1。已表明含有54-LSKLRL-59之區域對維持TGFβ1潛伏性至關重要。因此，穩定相互作用或阻斷LAP之蛋白水解裂解的試劑(例如抗體)可防止TGFβ活化。
與病理性病況(例如癌症)相關之許多此等蛋白酶經由不同作用機制起作用。因此，特定蛋白酶或蛋白酶之組合之靶向抑制可為涉及蛋白酶-TGFβ軸之病況的治療提供治療益處。因此，預期選擇性地抑制TGFβ1之經蛋白酶誘導之活化的抑制劑(例如TGFβ1抗體)在此類疾病(例如癌症)之治療中可為有利的。同樣，相對於另一蛋白酶藉由一種蛋白酶選擇性抑制TGFβ1活化亦可為較佳的，其視所治療之病況而定。
纖維蛋白溶酶為經產生呈稱作纖維蛋白溶酶原之前驅體形式的絲胺酸蛋白酶。釋放後，纖維蛋白溶酶進入循環且因此會在血清中偵測到。升高之纖維蛋白溶酶水準呈現與癌症進展相關，可能經由涉及促進腫瘤細胞活動力、侵襲及癌轉移的胞外基質(例如基底膜及基質障壁)之中斷的機制。纖維蛋白溶酶亦可影響黏著力、增殖、細胞凋亡、癌症營養、氧氣供應、血管形成及VEGF活化(Didiasova 等人,Int. J. Mol. Sci , 2014, 15, 21229-21252)。此外，纖維蛋白溶酶可促進巨噬細胞遷移至腫瘤微環境中(Philips等人,Cancer Res. 2011 Nov 1;71(21):6676-83及Choong等人,Clin. Orthop. Relat. Res. 2003,415S , S46-S58)。實際上，經由其促進腫瘤生長、侵襲、癌轉移及血管生成之能力，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)為腫瘤形成之經充分表徵之驅動子。
纖維蛋白溶酶活性主要與ECM之中斷相關。然而，愈來愈多之證據表明纖維蛋白溶酶亦調節下游MMP及TGFβ活化。特定言之，已表明纖維蛋白溶酶經由衍生自TGFβ基因產物之N端區的潛伏期相關肽(LAP)之蛋白水解裂解而引起TGFβ之活化(Horiguchi等人,J Biochem . 2012 Oct; 152(4):321-9)，引起活性生長因子之釋放。由於TGFβ1可促進癌症進展，因此此會提高TGFb之經纖維蛋白溶酶誘導之活化可至少部分地介導此過程的可能性。
亦已顯示TGFβ1可調節uPA之表現，uPA為纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶之重要參與者(Santibanez, Juan F.,ISRN Dermatology , 2013: 597927)。已獨立地顯示uPA藉由結合於其細胞表面受體(uPAR)且促進纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶來促進癌症進展(例如黏著力、增殖及遷移)。此外，研究已顯示，uPA及/或纖維蛋白溶酶原活化因子抑制劑-1 (PAI-1)之表現為結腸直腸癌(D. Q. Seetoo, 等人,Journal of Surgical Oncology , 第82卷, 第3期, 第184-193頁, 2003)、乳癌(N. Harbeck等人,Clinical Breast Cancer , 第5卷, 第5期, 第348-352頁, 2004)及皮膚癌(Santibanez, Juan F.,ISRN Dermatology , 2013: 597927)中不良預後之預測因子。因此，在不希望受特定理論束縛之情況下，纖維蛋白溶酶、TGFβ1及uPA之間的相互作用可形成針對促進癌症進展之正反饋迴路。因此，選擇性地抑制纖維蛋白溶酶依賴性TGFβ1活化的抑制劑可尤其適用於治療依賴纖維蛋白溶酶/TGFβ1信號傳導軸之癌症。
在本發明之一個態樣中，本文中所描述之同功型專一性TGFβ1抑制劑包括可抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性活化的抑制劑。在一些實施例中，抑制劑可以整合素非依賴性方式抑制蛋白酶依賴性TGFβ1活化。在一些實施例中，此類抑制劑可無關於活化模式抑制TGFβ1活化，例如抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及蛋白酶依賴性活化兩者。在一些實施例中，蛋白酶係選自由以下組成之群：絲胺酸蛋白酶，諸如激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶以及鋅金屬蛋白酶(MMP家族) (諸如MMP-2、MMP-9及MMP-13)。
在一些實施例中，抑制劑可抑制TGFβ1之經纖維蛋白溶酶誘導之活化。在一些實施例中，抑制劑可抑制經纖維蛋白溶酶及經整合素誘導之TGFβ1活化。在一些實施例中，抑制劑為專一性結合TGFβ1之單株抗體。在一些實施例中，抗體為專一性結合前TGFβ1之單株抗體。在一些實施例中，抗體結合潛伏前TGFβ1，藉此抑制成熟生長因子自潛伏複合物釋放。在一些實施例中，TGFβ1活化之LTBP-複合物專一性抑制劑適用於抑制TGFβ1之纖維蛋白溶酶依賴性活化之方法中。在一些實施例中，TGFβ1活化之LTBP-複合物專一性抑制劑選自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63及Ab64 (視情況Ab42或Ab63) (亦即，具有如本文所提供之相應Ab之重鏈及輕鏈可變區的抗體或抗原結合片段)、其變體/衍生物或其抗原結合片段，或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在一些較佳實施例中，TGFβ1活化之LTBP-複合物專一性抑制劑為Ab42、其變體/衍生物或抗原結合片段或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在較佳實施例中，TGFβ1活化之LTBP-複合物專一性抑制劑為Ab42或其抗原結合片段。
在一些實施例中，抑制劑(例如TGFβ1抗體)抑制癌細胞遷移。在一些實施例中，抑制劑抑制巨噬細胞遷移。在一些實施例中，抑制劑抑制TAM積聚。
在另一態樣中，本文提供治療有需要之個體的癌症之方法，該方法包含向個體投與有效量之TGFβ1抑制劑(例如TGFβ1抗體)，其中該抑制劑抑制TGFβ1之經蛋白酶(例如纖維蛋白溶酶)誘導之活化，藉此治療個體之癌症。
在另一態樣中，本文提供降低有需要之個體中的腫瘤生長之方法，該方法包含向個體投與有效量之TGFβ1抑制劑(例如TGFβ1抗體)，其中該抑制劑抑制TGFβ1之經蛋白酶(例如纖維蛋白溶酶)誘導之活化，藉此降低個體中之腫瘤生長。 涉及 ECM 失調之疾病
胞外基質為圍繞細胞的經細胞分泌之網路且主要由蛋白聚糖及纖維蛋白構成，其中膠原蛋白為最豐富的。本文所揭示之新穎抗體可用於治療與胞外基質失調相關之疾病。與胞外基質失調相關之疾病通常為經肌纖維母細胞驅動之病變，且包括癌症、纖維化及心血管疾病(例如以下中所綜述：Lampi及Reinhart-King (2018) 「Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease: From molecular mechanisms to clinical trials」 Sci Tarnsl Med 10(422): eaao0475)。纖維化病況之進展涉及沈積至ECM中之基質組分水準增加及/或ECM之維持/重塑。TGFβ1至少部分地促成此過程。此例如藉由觀測到諸如膠原蛋白之ECM組分的沈積之增加可改變ECM之物理機械特性(例如基質/受質之硬度)所支持，且此現象係與TGFβ1信號傳導相關。TGFβ1之抑制劑，諸如本文所描述之抑制劑，可用於阻斷此過程來對抗涉及諸如纖維化之ECM改變之疾病進展。此類抑制劑之LTBP臂可直接阻斷由LTBP1及/或LTBP3呈遞的ECM相關前TGFβ/潛伏TGFβ複合物，藉此阻止生長因子自疾病生態棲位處之複合物活化/釋放。在一些實施例中，同功型專一性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所描述之抑制劑可標準化ECM硬度以治療涉及整合素依賴性信號傳導之疾病。在一些實施例中，整合素包含α11鏈、β1鏈或兩者。
因此，可以有效治療疾病之量向診斷患有伴隨胞外基質失調之疾病的個體投與該抗體。抗體之治療有效量可為足以減少肌纖維母細胞之一或多種標記物，諸如α-SMA之表現的量。該量可為足以減少受感染組織(例如纖維化組織)之胞外基質之硬度的量。該量可為足以減少TGFβ1下游效應子，諸如SMAD2及/或SMAD3之磷酸化的量。在一些實施例中，TGFβ1之同功型選擇性活化抑制劑係選自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63及Ab64 (視情況Ab42或Ab63)、其變體/衍生物或抗原結合片段或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在一些較佳實施例中，TGFβ1之同功型選擇性活化抑制劑為Ab42、其變體/衍生物或抗原結合片段或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在較佳實施例中，TGFβ1選擇性抑制劑為Ab42或其抗原結合片段。 涉及上皮細胞與間葉細胞轉化 (EMT) 之疾病：
上皮細胞-間葉細胞轉化(EMT)為以下過程，藉由該方法具有緊密連接(tight junction)之上皮細胞轉化呈間葉細胞特性(表型)，諸如疏鬆細胞-細胞接觸。該過程會在多種正常生物過程以及病理性情況，包括胚胎發生、創傷癒合、癌轉移及纖維化中觀測到(綜述於例如Shiga等人 (2015) 「Cancer-Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth.」 Cancers, 7: 2443-2458中)。通常，咸信EMT信號主要由TGFβ誘導。舉例而言，許多類型之癌症呈現涉及細胞朝向間葉細胞表型(諸如CAF)之轉分化，其與較不良預後相關。因此，可使用LTBP專一性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所描述之抑制劑來治療由EMT引發或由其驅動之疾病。實際上，本文中(例如圖12及圖13)所例示之資料顯示，此類抑制劑具有活體內抑制CAF標記物，諸如α-SMA、I型膠原蛋白(Col1)及纖維結合蛋白(FN)之表現的能力。 涉及基質硬度及重塑之疾病
纖維化病況之進展涉及沈積至ECM中之基質組分水準增加及/或ECM之維持/重塑。TGFβ1至少部分地促成此過程。此例如藉由觀測到諸如膠原蛋白之ECM組分的沈積之增加可改變ECM之物理機械特性(例如基質/受質之硬度)所支持，且此現象係與TGFβ1信號傳導相關。為證實此概念，本發明人已評價基質硬度在影響經前TGFβ及LTBP1轉染之且在具有定義硬度(例如5 kPa、15 kPa或100 kPa)之基於矽之受質上生長的原纖維母細胞中TGFβ之整合素依賴性活化方面的作用。具有較大硬度之基質增強TGFβ1活化，且此可由抗體及其抗原結合部分抑制，該等抗體及抗原結合部分能夠結合且因此抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1活化。此等觀察結果表明TGFβ1影響ECM特性(諸如硬度)，其又可進一步誘導TGFβ1活化，反映疾病進展。因此，選擇性結合LTBP1-TGFβ1及/或LTBP3-TGFβ1之複合物的抗體及其抗原結合部分(諸如本文所描述之抗體及抗原結合部分)可用於阻斷此過程以對抗涉及ECM改變(諸如纖維化、腫瘤生長、侵襲、癌轉移及結締組織增生)之疾病進展。此類抑制劑可直接阻斷由LTBP1及/或LTBP3呈遞的ECM相關前TGFβ/潛伏TGFβ複合物，藉此阻止生長因子自疾病生態棲位處之複合物活化/釋放。 纖維化 ：
響應於組織損傷或因物理損害/創傷、毒性物質及/或感染所致之慢性傷害，開始天然修復過程，其涉及數種細胞類型，包括纖維母細胞、若干不同類型之免疫細胞及駐留上皮細胞及內皮細胞。然而，若不進行檢查，此過程會引起胞外基質(ECM)之過度積聚及纖維化，其反過來會引起組織功能之進行性喪失及器官衰竭(Caja等人,Int. J. Mol. Sci . 2018, 19, 1294)。
纖維化可發生在若干不同器官中，包括肺臟、腎臟、肝臟、心臟及皮膚。無關於器官，纖維化反應之特徵在於發炎、變化之上皮細胞-間葉細胞相互作用及纖維母細胞增殖。纖維化之標誌中之一者為纖維母細胞分化成肌纖維母細胞，其在很大程度上促成ECM之失調。然而亦已提出肌纖維母細胞來自其他細胞來源(例如內皮細胞、上皮細胞及間葉幹細胞) (Kim, K.K.等人, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2017; Okabe, H. Histol. Histophathol., 2016, 31, 141-148；及Li, C等人, Nat Commun., 2016, 7, 11455)。另外，免疫細胞藉由分泌促進肌纖維母細胞之分化、刺激ECM沈積及將額外免疫細胞募集至受損組織的細胞介素及趨化因子而在該過程中起重要作用(Caja等人,Int. J. Mol. Sci . 2018, 19, 1294)。
與纖維化組織相似，癌症相關纖維母細胞之活化可發生在腫瘤環境中，其產生過量ECM。ECM提供用於其他細胞(例如促致瘤免疫細胞)之浸潤的架構及用於細胞遷移之受質。在其他情況下，過量ECM可充當抗致瘤免疫細胞之障壁。
認為TGFβ為纖維化反應之主要協調器。TGFβ可促進肌纖維母細胞分化、募集免疫細胞且影響上皮細胞及內皮細胞分化。特定而言，TGFβ上調ECM及基底膜蛋白，諸如纖維結合蛋白、膠原蛋白、層黏連蛋白、骨橋蛋白、肌腱蛋白、彈性蛋白、核心蛋白聚糖的產生。TGFβ誘導之肌纖維母細胞分化會引起ECM蛋白之額外沈積、基質金屬蛋白酶(MMP)之分泌及肌纖維母細胞增殖(Fabregat等人,FEBS J. 2016, 283, 2219- 2232；Meng等人,Nat. Rev. Nephrol. 2016, 12, 325-338；及Kulkarni等人,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2016, 54, 751-760)。另外，TGFβ介導影響血管平滑肌細胞(VSCM)中之收縮蛋白及膠原蛋白I的表型改變，且可活化肌纖維母細胞及其他基質細胞以增強膠原蛋白交聯蛋白質(諸如基質重塑酶之離胺醯氧化酶(LOX)家族)之合成 (Busnadiego等人,Mol. Cell. Biol. 2013, 33, 2388- 2401)。此外，已顯示TGFβ調節EMT及EndMT兩者，其促成促纖維化細胞類型，諸如肌纖維母細胞及CAF分化。此外，已顯示TGFβ誘導上皮細胞凋亡，其可促進肺及肝纖維化以及其他組織纖維化(Barbas-Filho等人,J. Clin. Pathol. 2001, 54, 132-138；及Wang等人,Dev. Dyn. 2017, 247, 492-508)。
無論先天性或經募集，巨噬細胞在對組織損害及修復之反應中起重要作用。然而，在特定信號後，其可變得促纖維化。亦已顯示其他細胞介素中之TGFβ活化M2巨噬細胞，其為促炎性的。活化後，此等巨噬細胞分泌其自身細胞介素，包括TGFβ、ECM組分、血管生成因子及趨化因子。已顯示M2巨噬細胞對於TGFβ驅動肺纖維化必不可少(Murray等人,Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, 43, 154- 162)。
鑒於越來越多的跡象指明M2型巨噬細胞在許多類型的纖維化中對於疾病進展的重要性，仍存在關於情形選擇性抑制單獨LTBP1/3相關TGFβ1 (亦即不處理巨噬細胞相關、TGFβ1活性之LRRC33-臂)是否可足以在活體內產生有效抗纖維化作用的問題。然而，出人意料地，本文中呈現之資料表明選擇性靶向基質相關TGFβ1 (例如LTBP1/3-前TGFβ1)呈現僅如同在多個臨床前模型中實現抗纖維化作用一般有效(若非較佳)，在使用所謂的TGFβ1 (參見例如圖19及20)之情形非依賴性抑制劑靶向所有四個已知LLC (例如LTBP1/3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-TGFβ1)時且如此進行而不觸發經由GARP-前TGFβ1抑制介導之T細胞刺激。此外，先前揭示之LTBP1/3複合物選擇性抗體缺乏對於臨床前(例如嚙齒動物)及臨床(例如人類)用途將為有利的穩固物種交叉反應性。正尋求之將會賦予同功型選擇性及情形選擇性的罕見抗原決定基是否亦將實現有利物種交叉反應性概況尚不清楚。有利地，本文揭示之新穎抗體具有所有此等準則。
根據本發明，使用諸如本文所描述之彼等的同功型專一性TGFβ1治療個體之纖維化(例如纖維化適應症、纖維化病況)。進行本發明之適合抑制劑包括根據本發明之抗體及/或組合物，其可適用於改變或改善纖維化。更具體言之，此類抗體及/或組合物為能夠靶向由各種類型之呈遞分子呈遞的TGFβ1的TGFβ1之選擇性拮抗劑。認為TGFβ1為纖維化反應之主要協調器。靶向TGFβ之抗體降低多種臨床前模型中的纖維化。此類抗體及/或基於抗體之化合物包括LY2382770 (Eli Lilly, Indianapolis, IN)。亦包括美國專利第US 6,492,497號、第US 7,151,169號、第US 7,723,486號及美國申請公開案第2011/0008364號中所描述之彼等者，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。先前技術TGFβ拮抗劑包括例如靶向及阻斷TGFβ之整合素依賴性活化的藥劑。
然而，有證據表明此類先前技術藥劑可能並不介導同功型專一性抑制，且藉由無意阻斷TGFβ2及/或TGFβ3之正常功能而可能引起非所需之作用。實際上，本文中呈現之資料支持此概念。正常(未患病)肺臟組織含有相對較低但可量測水準之TGFβ2及TGFβ3，但顯著較少TGFβ1。相比之下，在諸如纖維化之某些疾病病況中，TGFβ1相對於其他異構體變得優先上調。較佳地，供用於此類病況之治療中的TGFβ拮抗劑僅對疾病誘導或疾病相關同功型發揮其抑制性活性，同時保留其他同功型經正常表現以介導組織中之強直信號傳導的功能。顯示先前技術抑制劑(LY2109761 (一種小分子TGFβ受體拮抗劑)及靶向αVβ6整合素之單株抗體)兩者抑制未患病大鼠BAL中的TGFβ下游強直信號傳導，提高此等抑制劑可引起非所需之副作用的可能性。或者或另外，靶向及阻斷TGFβ之整合素依賴性活化的藥劑可能夠在由多種細胞類型表現且在發病機制中起一定作用的多種整合素類型中，僅阻斷造成疾病相關TGFβ1活化之一小類整合素。此外，即使在此類拮抗劑可選擇性地阻斷TGFβ1同功型之經整合素介導之活化的情況下，在藉由諸如蛋白酶依賴性活化之其他模式觸發的阻斷TGFβ1活化方面可為無效的。因此，同功型專一性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所描述之抑制劑旨在無關於特定活化模式防止發生TGFβ1之活化步驟，同時維持同功型選擇性。
進一步預期優先抑制基質相關而非細胞相關之抗原複合物之同功型專一性TGFβ1抑制劑(亦即呈現情形偏向)可在某些臨床情況下提供治療優勢(例如本文所描述之LTBP專一性抑制劑)。舉例而言，TGFβ1情形非依賴性抑制劑(其靶向所有四種抗原複合物)可經由靶向細胞相關之TGFβ1 (例如GARP-TGFβ1，其表現於調節T細胞上)而增加免疫活化。免疫活化對於某些患者，例如患有自體免疫疾病或處於敗血症風險下之患者可能為不利的。因此，情形偏向之抗體可適用於治療與基質相關之TGFβ1複合物相關之疾病(例如纖維化)，同時使免疫活化降至最低。
先前，預期同功型專一性TGFβ3抑制劑可在尤其疾病病狀中提供額外治療益處。舉例而言，用TGFβ1抑制劑待治療之某些纖維化疾病亦可呈TGFβ3陽性(亦即，TGFβ1+/TGFβ3+纖維化組織)，其特徵在於疾病組織(例如纖維化組織)表現該等同功型兩者。因此，本發明包括同功型選擇性TGFβ1抑制劑以及同功型選擇性TGFβ3抑制劑在治療此類病況中之用途。
可在治療上使用本發明之抗體及/或組合物的纖維化適應症包括但不限於肺臟適應症(例如特發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、過敏性哮喘、急性肺損傷、嗜伊紅血球性食道炎、肺動脈高血壓及化學氣體損傷)、腎臟適應症(例如糖尿病性腎小球硬化、局部區段性腎小球硬化(FSGS)、慢性腎病(CKD)、與腎臟移植及慢性排斥反應相關之纖維化、IgA腎病變及溶血性尿毒症候群)、肝纖維化(例如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、慢性病毒性肝炎、寄生蟲血症、先天性代謝缺陷、經毒素介導之纖維化(諸如酒精纖維化)、非酒精性脂肪變性肝炎-肝細胞癌(NASH-HCC)、原發性膽汁性肝硬化症及硬化性膽管炎)、心血管纖維化(例如心肌病、肥厚性心肌症、動脈粥樣硬化及再狹窄)、全身性硬化症、皮膚纖維化(例如全身性硬化症、彌漫性皮膚全身性硬化症、硬皮病、病理性皮膚疤痕、瘢痕瘤、手術後疤痕、疤痕修復手術、輻射誘發之疤痕及慢性創傷中的皮膚纖維化)、眼部相關病況(諸如視網膜下纖維化、葡萄膜炎症候群、與特發性腹膜後纖維化相關之葡萄膜炎、眼外肌肉纖維化、與主要組織相容複合體(MHC I類)或組織相容抗原相關之眼病、黃斑變性(例如年齡相關之黃斑變性)中的視網膜下纖維化及癌症或繼發性纖維化(例如骨髓纖維化、頭頸癌、M7急性巨核母細胞白血病及黏膜炎)。可使用本發明之化合物及/或組合物治療的與纖維化相關之其他疾病、病症或病況包括但不限於子宮腺肌症、子宮內膜異位、馬凡氏症候群、僵直皮膚症候群、硬皮病、類風濕性關節炎、骨髓纖維化、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑性狼瘡症、肌肉萎縮症(諸如DMD)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、ALS、杜普宜特朗氏攣縮、卡穆拉蒂-恩格爾曼疾病、類神經疤痕、癡呆、增生性玻璃體視網膜病變、角膜損傷、在青光眼引流手術之後的併發症及多發性硬化症(MS)。許多此類纖維化適應症亦與受感染組織之發炎相關，其表明涉及免疫組分。此類發炎可伴有異常免疫細胞群，諸如增加之Th17細胞數目，減少之Treg細胞數目及/或兩者。在各情況下，受感染患者可展現增加之Th17/Treg細胞比率。
在一些實施例中，可用本文所描述之組合物及/或方法治療之纖維化適應症包括器官纖維化，諸如肺之纖維化(例如IPF)、腎臟之纖維化(例如與CKD相關之纖維化)、肝臟之纖維化、心或心臟組織之纖維化、皮膚之纖維化(例如硬皮病)、子宮(例如子宮內膜、子宮肌層)之纖維化及骨髓之纖維化。在一些實施例中，此類療法可在患者中減少或延遲對器官移植之需求。在一些實施例中，此類療法可延長患者之存活期。
為了治療IPF，可受益於該治療之患者包括患有家族性IPF之患者及患有偶發性IPF之患者。投與治療有效量之同功型專一性TGFβ1抑制劑可減少肌纖維母細胞在肺臟組織中之積聚、減少膠原蛋白沈積物、減少IPF症狀、改善或維持肺臟功能且延長存活期。在一些實施例中，抑制劑阻斷IPF之纖維化環境中的ECM相關之TGFβ1 (例如由LTBP1/3所呈遞之前TGFβ1/潛伏TGFβ1)之活化。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括以肝臟之簡單脂肪浸潤開始的一系列組織學變化，亦稱為簡單或分離之脂肪變性或非酒精性脂肪肝(NAFL)，其可逐漸，有時經幾十年發展成慢性發炎(脂肪變性肝炎或NASH)、纖維化及最終肝硬化。僅一小組患有NAFL之患者將發展為NASH及後續肝硬化。當前，不存在鑑別此組患者之明確準則。NAFLD為北美慢性肝病之最常見原因。目前，不存在用於治療NASH之經審批通過的藥物。鑒於NASH之高發生率、相關發病率、晚期肝病之增加負擔及器官移植之肝臟之有限可用性，減緩NASH及NAFLD之進展、停止或逆轉NASH及NAFLD之療法的鑑別將解決未滿足之醫學需求。
存在這樣一個共識，TGFβ為肝纖維化中之主要參與者(綜述於例如Dewidar等人, Cells 2019, 8, 1419中，其內容以引用之方式併入本文中)。可使用同功型專一性TGFβ1抑制劑(諸如本文所提供之彼等抑制劑(亦即對LTBP1/3-TGFβ1複合物具有選擇性之TGFβ1之同功型專一性抑制劑，或「基質靶向」抑制劑)治療肝纖維化病況，諸如非酒精性脂肪肝(NAFL)及與脂肪肝相關之纖維化(例如NASH)。脂肪肝可或可不為發炎的。脂肪肝(亦即，脂肪變性肝炎)所致的肝臟之發炎可發展成疤痕(纖維化)，其隨後通常發展成肝硬化(使肝臟結構變形且損害其功能的疤痕)。可因此使用抑制劑來治療此類病況。在一些實施例中，抑制劑阻斷肝臟之纖維化環境中的ECM相關之TGFβ1 (例如由LTBP1/3所呈遞之前TGFβ1/潛伏TGFβ1)之活化。在患有此類病況之個體中投與抑制劑可減少一種或多種症狀、預防或延緩疾病之進展、減少肝中之脂肪堆積物或使其穩定、減少疾病相關生物標記物(諸如血清膠原蛋白片段)、減少肝臟疤痕、降低肝臟硬度及/或相較於未用該抑制劑治療之對照群體，在用抑制劑治療之患者群體中另外產生有臨床意義之結果。在一些實施例中，有效量之抑制劑可在NASH患者中達成減少之肝臟脂肪及減少之纖維化(例如疤痕)。在一些實施例中，有效量之抑制劑可在NASH患者中藉由至少一個階段未出現惡化之脂肪變性肝炎而達成改善纖維化。在一些實施例中，有效量之抑制劑可在NASH患者中減少肝功能衰竭及/或肝癌之出現率。在一些實施例中，有效量之抑制劑可相較於對照物，標準化如在療法開始後，在例如12-36週所評定的多種發炎或纖維化血清生物標記物的量。在NASH患者中之一些實施例中，可在接受一或多種額外療法之患者中投與同功型專一性TGFβ1抑制劑，該等額外療法包括但不限於肌肉抑制素抑制劑，其一般可促進具有代謝症候群(包括NASH)之臨床表現的患者中之代謝調節。
在NASH或NAFLD患者中之一些實施例中，可在接受乙醯CoA羧化酶抑制劑(ACCi) (例如非斯可司他(firsocostat) (亦稱為GS-0976)或PF-05221304)之患者中投與同功型專一性、基質靶向TGFβ1抑制劑。可適用於與經改良之本文中所描述之同功型專一性TGFβ1抑制劑組合的其他療法包括但不限於：GLP-1受體促效劑或類似物(例如索馬魯肽(semaglutide))、法尼醇X受體(FXR)促效劑(例如GS-9674；亦稱為Cilofexor)、ASK1抑制劑(例如司隆色替(selonsertib))；奧貝膽酸(obeticholic acid)、PPAR促效劑(例如GFT505；亦稱為艾拉菲諾(elafibranor))；硝唑尼特(nitazoxanide)、己酮糖激酶(KHK)抑制劑(例如PF-06835919)；肌肉抑制素抑制劑及/或二醯甘油鄰醯基轉移酶2 (DGAT2)抑制劑(例如PF-06865571)。在一些實施例中，上述療法中之任何一或多者可用於與本發明之同功型專一性TGFβ1抑制劑組合，舉例而言，同功型專一性TGFβ1抑制劑與FXR促效劑、ACC抑制劑及/或GLP-1類似物組合。在一些實施例中，TGFβ抑制劑可與肌肉抑制素抑制劑組合用於治療個體之代謝肝病，諸如NASH及NAFLD及與其相關之肝纖維化。個體亦可罹患2型糖尿病及/或肥胖症。所用TGFβ抑制劑較佳為TGFβ1選擇性抑制劑，更佳為靶向LTBP1/2-相關TGFβ1之情形選擇性TGFβ1選擇性抑制劑，諸如本文所揭示之抑制劑。肌肉抑制素抑制劑較佳為肌肉抑制素選擇性抑制劑，諸如SRK-015 (例如參見WO2017/218592A1)及特里沃單抗(trevogrumab)，或其任何變體，或根據WO 2016/098357之抗體。
在一些實施例中，如藉由MRI-PDFF所量測，用單獨或與一或多種額外療法組合的同功型專一性TGFβ1抑制劑進行之治療會減少肝脂肪。在一些實施例中，肝脂肪減少至少20%，例如≥ 20%、≥ 25%、≥ 30%、≥ 35%、≥ 40%、≥ 45%或≥ 50%。在一些實施例中，用單獨或與一或多種額外療法組合的同功型專一性TGFβ1抑制劑進行之治療會使血清ALT及/或GGT減少至少20%，例如≥ 20%、≥ 25%、≥ 30%、≥ 35%、≥ 40%、≥ 45%或≥ 50%。在一些實施例中，用單獨或與一或多種額外療法組合的同功型專一性TGFβ1抑制劑進行之治療會減少膽汁酸合成。
在一些實施例中，NASH患者可能患有晚期肝纖維化(F3/F4階段)。在一些實施例中，此類患者患有F3階段晚期肝纖維化。在一些實施例中，此類患者患有F4階段肝纖維化，其特徵在於肝硬化。在一些實施例中，NASH患者患上或處於患上肝細胞癌及/或食道靜脈曲張之風險下。
根據源於非酒精性脂性肝炎臨床研究網路病理學委員會(Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network Pathology Committee)的分類法的非酒精性脂肪肝病之纖維化階段提供如下：纖維化階段
纖維化表現 纖維化階段
竇周或門靜脈周纖維化 1
輕度竇周纖維化(3區) 1A
中度竇周纖維化(3區) 1B
門靜脈/門靜脈周纖維化 1C
竇周及門靜脈/門靜脈周纖維化 2
橋接纖維化 3
肝硬化 4
文獻中之公開研究表明，調節T細胞(Treg)可在肝病發展為更嚴重程度之晚期纖維化中起作用。舉例而言，Zhang等人報導藉由肝內調節T細胞所維持之肝硬化之持久性，該等細胞抑制纖維化消退之過程(Transl Res. 2016; 169: 67-79.e1-2)。Kobayashi等人提出Treg涉及肝纖維化進展為肝細胞癌(HCC)，一種稱為肝癌發生之過程(Clin Cancer Res. 2007; 13(3): 902-911)。
因此，預期謹慎選擇適於疾病類型及疾病進展階段之適合TGFβ抑制劑應視為最大化對特定患者或患者群體之治療益處。
在一些實施例中，選擇靶向基質相關TGFβ1 (例如LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1)之TGFβ1選擇性、情形選擇性抑制劑(諸如本文所揭示之彼等)用於治療諸如非酒精性脂肪肝(「NAFL」)之早期階段肝病，及與NASH相關之非肝硬化肝纖維化。非肝硬化肝纖維化包括肝纖維化之階段1-3。以可有效治療疾病，例如減緩NAFL及非肝硬化NASH之進展、停止或逆轉NAFL及非肝硬化NASH之量，向個體投與TGFβ1選擇性、情形選擇性抑制劑。較佳地，該有效量足以預防肝硬化及肝硬化併發症進展、減少對肝臟移植之需要及/或改善存活率。在一些實施例中，功效可藉由例如發炎性變化減少、纖維化改良或兩者顯示。在一些實施例中，個體患有代謝病況，諸如肥胖症、2型糖尿病。患有非肝硬化NASH之個體可包括具有以下之個體：NASH活動評分(NAS)大於或等於4，其中發炎及細胞腫脹中之每一者為至少1分，以及NASH臨床研究網路(CRN)纖維化評分大於階段1纖維化但小於階段4纖維化。在一些實施例中，治療在總體組織病理學讀數上實現脂肪變性肝炎之消除且在NASH CRN纖維化評分上肝纖維化並未惡化。脂肪變性肝炎之消除定義為不存在脂肪肝病或無脂肪變性肝炎之分離或簡單脂肪變性且NAS評分，對於發炎為0-1、對於細胞腫脹為0及對於脂肪變性為任何值；或改良大於或等於一個階段(NASH CRN纖維化評分)之肝纖維化及無脂肪變性肝炎之惡化(定義為對於細胞腫脹、發炎或脂肪變性NAS無增加)；或脂肪變性肝炎之消除及如上文所定義之纖維化改良兩者。
在一些實施例中，選擇靶向基質相關TGFβ1 (例如LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1)的TGFβ1選擇性、情形選擇性抑制劑(諸如本文所揭示之彼等)用於治療具有補償性肝硬化之NASH。NASH相關之補償性肝硬化之特徵為顯著疤痕形成，其藉由組織病理學可見，其中肝細胞聚集在由密集胞外基質包圍之節結中。以可有效地停止纖維化或減緩纖維化進展、預防臨床代償能減退、減少對肝臟移植之需要及/或改良存活率之量向個體投與TGFβ1-選擇性、情形選擇性抑制劑。
具有失代償肝硬化之NASH之特徵可在於以下準則中之一或多者：門靜脈高血壓(門靜脈高血壓之跡象可包括低血小板計數、食道靜脈曲張、腹水、肝腦病之病史、脾腫大)；高膽紅素；或高國際標準化比率或延長之凝血酶原時間。因此，具有補償性肝硬化之NASH的患者可為不符合前述失代償肝硬化準則中之一或多者的彼等患者。
在一些實施例中，選擇靶向基質相關TGFβ1 (例如LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1)的TGFβ1選擇性、情形選擇性抑制劑(諸如本文所揭示之彼等)用於治療具有失代償肝硬化或與肝纖維化相關的HCC之NASH。在一些實施例中，在疾病發展成特徵為肝硬化或HCC表現之晚期或末期階段肝病之後，TGFβ1選擇性、情形選擇性抑制劑經TGFβ1選擇性、情形非依賴性抑制劑替換，該TGFβ1選擇性、情形非依賴性抑制劑能夠以可有效治療肝硬化或HCC之量靶向基質相關及免疫細胞相關TGFβ1，例如LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1 (參見例如WO 2020/014473)。
在一些實施例中，有效量之抑制劑可相較於對照物，標準化如在療法開始後，在例如12-36週所評定的多種發炎或纖維化血清生物標記物的量。在一些實施例中，發炎或纖維化生物標記物可用於評定NAFLD之嚴重程度(藉由量測肝脂肪變性之程度)、選擇治療患者及/或監測疾病進展或治療反應。舉例而言，血液生物標記物及小組可包括但不限於： i)脂肪肝指數(BMI、腰圍、血清三酸甘油酯及γ-麩胺醯轉化酶(GGT)； ii)肝脂肪變性指數(血清天冬胺酸轉胺酶(AST):丙胺酸轉胺酶(ALT)比率、BMI、性別及糖尿病之存在)； i) NAFLD肝臟脂肪評分(血清ALT、HDL膽固醇、三酸甘油酯、血紅素A1c及白血球計數)； ii) SteatoTest (BioPredictive) (總膽紅素之血清量、GGT、α2-巨球蛋白、結合球蛋白、ALT、脂蛋白元AI、總膽固醇、三酸甘油酯、葡萄糖(針對年齡及性別加以調整)及BMI)；及 iii) NAFLD嶺評分(ALT之血清量、HDL膽固醇、三酸甘油酯、血紅素A1c 、白血球計數及共同罹病率資料(及高血壓之存在))。
在一些實施例中，成像生物標記物可用於評定肝脂肪變性之水準。舉例而言，成像生物標記物可包括但不限於：超音波檢查術、受控衰減參數(CAP)、經MRI估計之質子密度脂肪分數(MRI-estimated proton density fat fraction；MRI-PDFF)及磁共振光譜分析(MRS)。
肝臟活檢體為用於診斷NASH之當前標準，然而，病理學家中的變化性限制了此類診斷方法之有效性。因此，脂肪肝進展抑制(Fatty Liver Inhibition of Progression；FLIP)演算法(包含組織學脂肪變性、活性及纖維化評分)之使用可用於改良利用活檢體進行的NASH診斷之一致性。另外，多種非侵襲性生物標記物亦可適用於診斷及監測疾病。因此，在一些實施例中，發炎或纖維化生物標記物可用於評定NASH之嚴重程度、選擇治療患者及/或監測疾病進展或治療反應。血液生物標記物可包括： i)細胞凋亡標記物，諸如CK18片段、總細胞角蛋白及sFAS； ii)發炎標記物，諸如CRP、TNF、IL-8及CXCL10； iii)脂質氧化產物，諸如11-HETE、9-HODE、13-HODE、12-側氧基-ODE、LA-13-HODE (oxNASHscore)及11,12-二HETrE； iv)溶酶體酶，諸如組織蛋白酶D；及 v)組合小組，諸如NASHTest (BioPredictive)及NASH診斷小組(包含糖尿病之存在、性別、BMI及三酸甘油酯之血清量、CK18片段及總CK18)。
在一些實施例中，生物標記物及相關小組可適用於診斷纖維化及/或肝硬化之水準、選擇治療患者及/或監測疾病進展或治療反應。舉例而言，肝纖維化及肝硬化之非侵襲性測試包括但不限於：AST:ALT比率、AST:血小板比率指數、纖維化-4指數(年齡、AST、ALT及血小板計數)、NAFLD纖維化評分(年齡、BMI、空腹葡萄糖異常及/或糖尿病、AST ALT、血小板計數及白蛋白)、BARD評分(AST、ALT、BMI及糖尿病)。
特定纖維化標記物及小組亦可適用，且包括但不限於：玻尿酸；PIIPNP；Pro-C3；TIMP1；層黏連蛋白；增強型肝纖維化(ELF)小組(PIINP、玻尿酸、TIMP1)；FibroTest (GGT、總膽紅素、α2m、脂蛋白元AI及結合球蛋白)；及FibroMeter NAFLD (體重、凝血酶原指數、ALT、AST、鐵蛋白及空腹葡萄糖)。肝纖維化之成像生物標記物可包括但不限於：FibroScan (TE)、點剪切波彈性成像(pSWE) (亦稱為聲輻射力脈衝(ARFI))、2D-3D SWE、磁共振彈性成像(MRE)及多參數MRI。
具有發炎性或自身發炎性元素之任何RGFb-相關疾病可受益於本發明之免去調節T細胞功能之新穎抑制劑。特定言之，在肝病，例如代謝肝臟病況中，選擇選擇性靶向基質相關TGFb1信號傳導之TGFb抑制劑可為有利的。
在一個實施例中，如本文所描述使用之方法及組合物適用於治療患有原發性膽汁性膽管炎(PBC)之個體。在一個實施例中，患有PBC之個體對UDCA (熊去氧膽酸)治療無反應。在一個實施例中，個體具有對UCDA之Barcelona、Paris-I、Toronto、Rotterdam或Paris-II不充分反應。在一個實施例中，患有PBC之個體具有ALP≥2xULN (正常值上限)，且膽紅素＞1xULN，儘管以標準推薦劑量利用UDCA進行至少1年治療(10-15 mg/kg b.w./天)。
在另一實施例中，如本文所描述使用之方法及組合物適用於治療患有原發性硬化性膽管炎(PSC)之個體。在一個實施例中，患有PSC之個體具有升高的ALP、異常膽管造影、內鏡逆行胰膽管造影或經皮肝穿刺造影。在一個實施例中，患有PSC之個體具有至少14之末期階段肝病(MELD)評分之模型。
在另一實施例中，如本文所描述使用之方法及組合物適用於治療患有NASH之個體。在一個實施例中，個體患有纖維化階段2 NASH、纖維化階段3 NASH或纖維化階段4 NASH。在一個實施例中，個體具有至少4，或至少5之NAS (NAFLD活動評分)。在一個實施例中，患有NASH之個體具有NAS＞4及纖維化階段2或階段3。在一個實施例中，患有NASH之個體具有NAS＞5及纖維化階段2或階段3。在一個實施例中，患有NASH之個體具有至少14之末期肝病(MELD)評分之模型。
同功型專一性TGFβ1抑制劑(諸如本文中所提供之彼等)可用於治療腎臟之纖維化病況，例如特徵為胞外基質積聚之疾病(IgA腎病變、局部及區段性腎小球硬化、新月體性型絲球體腎炎(crescentic glomerulonephritis)、狼瘡性腎炎及糖尿病性腎病變)，其中已在腎小球及腎小管間質中觀測到明顯增加之TGFβ表現。儘管由TGFβ、纖維結合蛋白EDA+及PAI-1誘導的兩種基質組分之腎小球及腎小管間質沈積在具有基質積聚之所有疾病中明顯升高，但相關分析已揭露主要與TGFβ1同功型之密切關係。因此，同功型專一性TGFβ1抑制劑適用作其中TGFβ與胞外基質之病理性積聚相關的一系列人類腎小球病症之治療劑。
在一些實施例中，腎臟之纖維化病況與慢性腎病(CKD)相關。CKD主要由高血壓或糖尿病造成且每年會奪去超過一百萬條生命。CKD患者需要介於嚴格飲食與藥物治療範圍內的終身醫療照護以透析及移植。在一些實施例中，本文中所描述之TGFβ1抑制劑療法可減少或延遲對滲析及/或移植之需求。在一些實施例中，此類療法可減少其他治療需求(例如劑量、頻率)。在一些實施例中，可在接受一或多種額外療法之患者中投與同功型專一性TGFβ1抑制劑，該等額外療法包括但不限於肌肉抑制素抑制劑，其一般可促進患有CKD之患者中的代謝調節。
可用本發明之TGFβ1抑制劑治療的纖維化病況包括涉及纖維化及/或慢性發炎之病況。此類病況可為神經肌肉病症，其包括但不限於杜興氏肌肉失養症(DMD)及其他遺傳病症，諸如多發性硬化症(MS)及囊腫性纖維化(CF)。經由ECM及免疫細胞相關之TGFβ1臂兩者之抑制，認為TGFβ1抑制劑，諸如本文中所描述之彼等抑制劑會抑制纖維化進展且恢復M1/M2巨噬細胞極化。
可用本文所提供之方法治療的器官纖維化包括心臟(例如心血管)纖維化。在一些實施例中，心臟纖維化與心臟衰竭，例如慢性心臟衰竭(CHF)相關。在一些實施例中，心臟衰竭可能與心肌疾病及/或代謝疾病相關。在一些實施例中，可在接受一或多種額外療法之患者中投與同功型專一性TGFβ1抑制劑，該等額外療法包括但不限於在患有涉及心臟纖維化及代謝病症之心臟功能障礙的患者中的肌肉抑制素抑制劑。
在一些實施例中，可用本文所描述之組合物及/或方法治療之纖維化病況包括結締組織增生。結締組織增生可發生在贅瘤周圍，引起腫瘤周圍緻密纖維化(例如結締組織增生性基質)或腹部手術之後腹內有疤痕組織。在一些實施例中，結締組織增生與惡性腫瘤相關。歸因於其圍繞惡性疾病之緻密形成，習知抗癌療法(例如化學療法)可能不會有效地滲透而達至針對臨床作用之癌細胞。同功型專一性TGFβ1抑制劑(諸如本文中所述之彼等)可用於破壞結締組織增生，使得纖維化形成物可得以鬆散以輔助抗癌療法之作用。在一些實施例中，同功型專一性TGFβ1抑制劑可用作單一療法(詳情見下文)。
在一些實施例中，患者具有纖維化實體腫瘤(例如結締組織增生)且為自或已自手術候選者集合排除，使得纖維化實體腫瘤被認為不可切除或不可手術(例如手術干預之風險超過其潛在益處)。此類患者可為接受本發明之TGFβ1抑制療法的候選者。向此類患者投與之本發明之TGFβ1抑制療法可使得腫瘤變得可切除或可手術，使得患者可變成手術切除之候選者。
為了治療患有纖維化病況之患者，以可有效治療纖維化之量向個體投與TGFβ1同功型專一性抑制劑。此類抗體之有效量為在個體中有效地達成治療功效及臨床安全性兩者的量。在一些實施例中，抑制劑為可阻斷ECM中之LTBP介導之TGFβ1定位(例如繫留)之活化的抗體。在一些實施例中，LTBP為LTBP1及/或LTBP3。在一些實施例中，TGFβ1之LTBP專一性抑制劑可與LRRC33-前TGFβ之抑制劑組合。
適用於針對纖維化之變化測定本發明之抗體及/或組合物之功效的分析包括但不限於此項技術中已知的用於對纖維母細胞進行計數之組織學分析及基礎免疫組織化學分析。
在一些實施例中，循環LAP片段可用作纖維生成之血清標記物。參見例如美國專利8,198,412，其內容以引用之方式併入本文中。
存在已開發以研究肝纖維化的多種動物模型。舉例而言，已顯示小鼠中之高脂飲食來模仿人類NAFLD之組織病理學及發病機制。另外，一些基因模型亦顯示人類代謝症候群及NAFLD之特徵，諸如db/db 及ob/ob 小鼠模型。亦存在用於研究NASH之動物模型、其主要由多種飲食誘導之模型組成，包括但不限於甲硫胺酸及膽鹼缺乏飲食(MCD)、高膽固醇飲食(HCD)、膽鹼缺乏高脂飲食(CDHFD)、膽鹼缺乏L-胺基酸缺乏飲食、膽鹼缺乏L-胺基酸缺乏飲食+四氯化碳、高脂飲食+鏈佐黴素、高脂+高膽固醇飲食(HFHC)、高果糖飲食(HFD)及高果糖高脂飲食(HFHF)。用於研究NASH之基因小鼠模型包括但不限於foz/foz小鼠、肝細胞專一性PTEN缺乏小鼠、Db/db小鼠+二乙基亞硝胺(DEN)及db/db 小鼠+ MCD。所有此等模型之詳情，包括各者之利弊，概述於Jennie Ka Ching Lau等人,J Pathol 2017;241 : 36-44中；其內容以引用之方式併入本文中。
適用於測試同功型專一性TGFβ抑制劑在肝纖維化中之功效的另一模型包括四氯化碳(CCL4 )模型及膽鹼缺乏高脂飲食(CDHFD)肝纖維化模型。適用於測試同功型專一性TGFβ抑制劑在肝纖維化中之功效的另一模型包括膽管結紮(BDL)模型(參見例如Tag等人,J Vis Exp . 2015; (96): 52438)。 與纖維化相關之肌肉病況
累積證據表明TGFβ在肌肉內穩定、修復及再生中起重要作用。選擇性調節LTBP相關TGFβ信號傳導之諸如本文所描述之單株抗體的藥劑可對治療受損肌纖維有效，諸如在慢性/遺傳性肌肉萎縮症、眼部/眼外肌肉之先天性纖維化及急性肌肉損傷中，而無與更廣泛起作用之TGFβ抑制劑相關的毒性。
因此，本發明提供使用較佳調節一小組而非所有活體內TGFβ效應之藥劑來治療受損肌纖維的方法。此類藥劑可在特定情形下，亦即當由LTBP1或LTBP3呈遞時，選擇性調節TGFβ1信號傳導(「同功型專一性調節」)。
在骨胳肌肉中，TGFβ起多種作用，包括抑制增殖及分化、誘導萎縮及發展纖維化。TGFβ降低衛星細胞增殖且防止分化(經由抑制MyoD及生肌素) (Allen, R.E.及L.K. J Cell Physiol, 1987. 133(3): 第567-72頁；Brennan, T.J., 等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(9): 第 3822-6頁；Massague, J., 等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): 第8206-10頁；Olson, E.N., 等人, J Cell Biol, 1986. 103(5): 第1799-805頁)。在此等早期論文中未指定TGFβ之同功型(亦即TGFβ1、2或3)，但假定為TGFβ1。TGFβ亦促成肌肉纖維化；直接注射重組TGFβ1導致骨胳肌肉纖維化，且在急性及慢性受傷肌肉中，泛TGFβ抑制降低纖維化(Li, Y., 等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁；Mendias, C.L., 等人, Muscle Nerve, 2012. 45(1): 第55-9頁；Nelson, C.A., 等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁)。TGFβ1由骨胳肌肉內之肌纖維、巨噬細胞、調節T細胞、纖維母細胞及纖維細胞表現(Li, Y., 等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁；Lemos, D.R., 等人, Nat Med, 2015. 21(7): 第786-94頁；Villalta, S.A., 等人, Sci Transl Med, 2014. 6(258): 第258ra142頁；Wang, X., 等人, J Immunol, 2016. 197(12): 第4750-4761頁)；且表現量在損傷及疾病時增加(Li, Y., 等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁；Nelson, C.A., 等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁；Bernasconi, P., 等人, J Clin Invest, 1995. 96(2): 第1137-44頁；Ishitobi, M., 等人, Neuroreport, 2000. 11(18): 第4033-5頁)。mdx肌肉(杜興氏肌肉失養症之小鼠模型)中亦上調(在mRNA水準下) TGFβ2及TGFβ3，但比TGFβ1以更小程度上調(Nelson, C.A., 等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁Zhou, L., 等人, Neuromuscul Disord, 2006. 16(1): 第32-8頁)。Pessina等人最近使用譜系追蹤實驗以顯示營養不良肌肉內之多個來源之細胞採用經由TGFβ依賴性路徑之纖維生成去向(Pessina, P., 等人, Stem Cell Reports, 2015. 4(6): 第1046-60頁)。
TGFβ1已牽涉於人類肌肉萎縮症中。杜興氏肌肉失養症(DMD)為由缺乏肌縮蛋白引起之嚴重、進展性及最終致命疾病(Bushby, K., 等人, Lancet Neurol, 2010. 9(1): 第77-93頁)。缺乏肌縮蛋白引起對收縮誘導之損傷的易感性增加，導致持續的肌肉退化(Petrof, B.J., 等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(8): 第3710-4頁；Dellorusso, C., 等人, J Muscle Res Cell Motil, 2001. 22(5): 第467-75頁；Pratt, S.J., 等人, Cell Mol Life Sci, 2015. 72(1): 第153-64頁)。重複數輪修復造成慢性發炎、纖維化、衛星細胞集合耗盡、最終失去活動性及死亡(Bushby, K., 等人, Lancet Neurol, 2010. 9(1): 第77-93頁；McDonald, C.M., 等人, Muscle Nerve, 2013. 48(3): 第343-56頁)。TGFβ1之表現在患有DMD之患者中顯著增加且與在此等患者中觀測到的纖維化程度相關(Bernasconi, P., 等人, J Clin Invest, 1995. 96(2): 第1137-44頁；Chen, Y.W., 等人, Neurology, 2005. 65(6): 第826- 34頁)。過量ECM沈積對肌肉之收縮特性具有不利影響，且隨著肌纖維自其血液供應分離，可限制營養之進入(Klingler, W., 等人, Acta Myol, 2012. 31(3): 第184-95頁)。最近，額外資料已進一步涉及肌肉萎縮症中之TGFβ1。已發現LTBP4中之變體在小鼠及人類中改變疾病嚴重程度。在小鼠中，LTBP4之變體在缺乏肌縮蛋白或γ-肌聚糖之小鼠中具有保護性(Coley, W.D., 等人, Hum Mol Genet, 2016. 25(1): 第130-45頁；Heydemann, A., 等人, J Clin Invest, 2009. 119(12): 第3703-12頁)。在人類中，兩組獨立地鑑別出LTBP4之變體在DMD具有保護性，延遲行走喪失若干年(Flanigan, K.M., 等人, Ann Neurol, 2013. 73(4): 第481-8頁；van den Bergen, J.C., 等人, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2015. 86(10): 第1060-5頁)。
儘管小鼠及人類中之遺傳變體之性質不同，但在兩種物種中，保護性變體導致TGFβ信號傳導減少(Heydemann, A., 等人, J Clin Invest, 2009. 119(12): 第3703-12頁)；Ceco, E., 等人, Sci Transl Med, 2014. 6(259): 第259ra144頁)。已經由實驗推斷骨胳肌肉生物學中TGFβ1之許多功能，其中將純化之活性生長因子注射至動物中或添加至培養物中之細胞中(Massague, J., 等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): 第8206-10頁；Li, Y., 等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁；Mendias, C.L., 等人, Muscle Nerve, 2012. 45(1): 第55-9頁)。鑒於細胞情形對TGFβ1之特定功能的重要性(參見例如Hinck 等人, Cold Spring Harb. Perspect. Biol, 2016. 8(12))有可能在此等實驗中觀測到之一些作用不會反映細胞介素在活體內之內源作用。舉例而言，用重組TGFβ1、肌肉抑制素或GDF11處理人類真皮纖維母細胞在此等細胞中引起基因表現幾乎一致之變化，但在活體內此等蛋白質之作用非常不同(Tanner, J.W., Khalil, A., Hill, J., Franti, M., MacDonnell, S.M., Growth Differentiation Factor 11 Potentiates Myofibroblast Activation, in Fibrosis: From Basic Mechanisms to Targeted therapies. 2016: Keystone, CO).
多位研究者已使用TGFβ之抑制劑來闡明活體內生長因子之作用。用泛TGFβ中和抗體1D11治療mdx小鼠明顯導致纖維化減少(藉由組織學及羥脯胺酸含量)、肌肉損害減少(血清肌酸激酶降低及肌纖維密度更大)及肌肉功能改善(藉由體積描記法、經分離EDL肌肉之力產生及增加的前肢握力)(Nelson, C.A., 等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁；Andreetta, F., 等人, J Neuroimmunol, 2006. 175(1-2): 第77-86頁；Gumucio, J.P., 等人, J Appl Physiol (1985), 2013. 115(4): 第539-45頁)。另外，顯性陰性TGFβ II型受體之肌纖維專一性表現保護在心臟毒素損傷之後及δ-肌聚糖-/-小鼠中免受肌肉損害(Accornero, F., 等人, Hum Mol Genet, 2014. 23(25): 第6903-15頁)。在骨胳肌肉中充足且抑制TGFβ活性之蛋白聚糖在mdx小鼠中及在破裂損傷之後減少肌肉纖維化(Li, Y., 等人, Mol Ther, 2007. 15(9): 第1616-22頁；Gosselin, L.E., 等人, Muscle Nerve, 2004. 30(5): 第645-53頁)。具有TGFβ抑制活性之其他分子，諸如蘇拉明(suramin) (一種抗贅生劑)及洛沙坦(losartan) (一種血管收縮素受體阻斷劑)，在小鼠損傷模型、馬凡氏症候群及肌肉萎縮症中，已有效改善肌肉病變及減少纖維化(Spurney, C.F., 等人, J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2011. 16(1): 第87-95頁；Taniguti, A.P., 等人, Muscle Nerve, 2011. 43(1): 第82-7頁；Bedair, H.S., 等人, Am J Sports Med, 2008. 36(8): 第1548-54頁；Cohn, R.D., 等人, Nat Med, 2007. 13(2): 第204-10頁)。雖然上文所描述之所有治療劑確實抑制TGFβ1或其信號傳導，但其中無一者對TGFβ1同功型具有專一性。舉例而言，1D11結合於且抑制TGFβ1、2及3同功型(Dasch, J.R., 等人, J Immunol, 1989. 142(5): 第1536-41頁)。總之，蘇拉明抑制多種生長因子結合於其受體之能力，該等受體除TGFβ1以外亦包括PDGF、FGF及EGF(Hosang, M., J Cell Biochem, 1985. 29(3): 第265-73頁；Olivier, S., 等人, Eur J Cancer, 1990. 26(8): 第867-71頁；Scher, H.I.及W.D. Heston, Cancer Treat Res, 1992. 59: 第131-51頁)。核心蛋白聚糖亦藉由直接結合及經由卵泡抑素、肌肉抑制素抑制劑上調來抑制肌肉抑制素活性(Miura, T., 等人, Biochem Biophys Res Commun, 2006. 340(2): 第675-80頁；Brandan, E., C. Cabello-Verrugio及C. Vial, Matrix Biol, 2008. 27(8): 第700-8頁；Zhu, J., 等人, J Biol Chem, 2007. 282(35): 第25852-63頁)。沙坦經由其對腎素-血管收縮素-醛固酮系統(包括IGF-1/AKT/mTOR路徑)之作用影響額外信號傳導路徑(Burks, T.N., 等人, Sci Transl Med, 2011. 3(82): 第82ra37頁；Sabharwal, R.及M.W. Chapleau, Exp Physiol, 2014. 99(4): 第627-31頁；McIntyre, M., 等人, Pharmacol Ther, 1997. 74(2): 第181-94頁)。因此，所有此等療法抑制可有助於其治療效果之額外分子以及毒性。
除慢性發炎之外，DMD之標誌過量，且為進行性，纖維化。在晚期疾病中纖維化非常嚴重，使得其可實際上將個別肌纖維與其血液供應分離。其亦改變肌肉之收縮特性。在人類患者中，TGFβ1上調程度與纖維化之間存在強相關性，且纖維化程度與負遷移結果之間存在強連接性。因此，在一些實施例中，可向營養不良患者投與LTBP-前TGFβ1抑制劑以預防及/或減少纖維化，從而選擇性靶向疾病中之ECM相關TGFβ1作用。在一些實施例中，可採用本文所描述之各種同功型及/或情形選擇性藥劑來實現TGFβ1信號傳導之抑制以預防纖維化及促進肌生成，但對免疫系統不具有非所需作用(例如經由GARP或LRRC33)。 投與
為實踐本文所揭示之方法，有效量之上文所描述之醫藥組合物可經由適合途徑(諸如靜脈內投與(例如以推注或連續輸注一段時間)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、吸入或局部途徑)投與需要治療之個體(例如人類)。當用於治療纖維化及/或代謝病況時，較佳地皮下投與TGFβ抑制劑。包括噴嘴式噴霧器及超音波噴霧器之供液體調配物用之市售噴霧器適用於投與。液體調配物可直接霧化且凍乾粉末可在復原之後霧化。或者，選擇性結合LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抑制劑(例如抗體或其抗原結合部分)可使用碳氟化合物調配物及定量吸入器氣霧化，或以凍乾且研磨之粉末形式吸入。
藉由本文所描述之方法治療的個體可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括但不限於農畜、運動型動物、寵物、靈長類動物、馬、犬、貓、小鼠及大鼠。需要治療之人類個體可為患有TGFβ相關適應症，諸如上述彼等適應症、處於其風險下或疑似患有其之人類患者。患有TGFβ相關適應症之個體可藉由常規醫學檢查，例如實驗室測試、器官功能測試、CT掃描或超音波來鑑別。疑似患有此類適應症中之任一者的個體可顯示該適應症之一或多種症狀。處於適應症風險下之個體可為具有適應症之風險因素中之一或多者的個體。
如本文所用，術語「有效量」及「有效劑量」係指足以滿足其預期一或多個目的，亦即可接受效益/風險比下的組織或個體中的所需生物或醫學反應的化合物或組合物之任何量或劑量。舉例而言，在本發明之某些實施例中預期目的可為抑制TGFβ-1活體內活化，達成與TGFβ-1抑制相關的有臨床意義的結果。如熟習此項技術者所認知，有效量可變化，此視以下而定：所治療之特定病況、病況嚴重程度、個別患者參數(包括年齡、身體狀況、體型、性別及體重)、治療持續時間、並行療法(若存在)之性質、特定投與途徑，及健康從業者之知識及專長範圍內的類似因素。此等因素已為一般技術者熟知且可僅用常規實驗便可解決。一般較佳的是，使用個別組分或其組合之最大劑量，亦即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。然而一般技術者應瞭解，患者因醫療原因、心理原因或實際上任何其他原因可堅持較低劑量或可耐受劑量。
經驗考慮因素，諸如半衰期一般將促進劑量之測定。舉例而言，與人類免疫系統相容之抗體，諸如人類化抗體或完全人類抗體，可用於延長抗體半衰期且防止抗體受宿主之免疫系統攻擊。投與頻率可加以確定且在治療過程中加以調整，且通常(但不一定)基於TGFβ相關適應症之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲。或者，選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體的持續連續釋放調配物可為適當的。用於達成持續釋放之多種調配物及裝置對熟習此項技術者將為顯而易知的且在本發明之範疇內。
在一個實例中，可憑經驗在已給與抑制劑之一或多次投與的個體中確定如本文所描述之選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑(例如抗體)的劑量。向個體給與遞增劑量之抑制劑。為評定功效，可根據TGFβ相關適應症之指示物。舉例而言，用於量測肌纖維損害、肌纖維修復、肌肉中發炎程度及/或肌肉中纖維化程度的方法為一般熟習此項技術者所熟知。
本發明涵蓋以下認識：能夠以同功型專一性方式及情形專一性方式調節TGFβ之活化步驟的藥劑當用作藥劑時，可提供改良之安全概況。因此，本發明包括選擇性結合且抑制TGFβ1而非TGFβ2或TGFβ3之活化的抑制劑，例如抗體及其抗原結合片段，由此賦予TGFβ1活體內信號傳導之專一性抑制，同時使影響TGFβ2及/或TGFβ3信號傳導之非所需副作用最小化。同樣，本發明包括選擇性抑制由LTBP1及/或LTBP3呈遞之TGFβ1而非由GARP或LRRC33之呈遞之TGFβ1之活化的抑制劑，例如抗體及其抗原結合片段，由此賦予LTBP1/3相關的TGFβ1活體內信號傳導之專一性抑制，同時使由調節GARP相關TGFβ1及/或LRRC33相關TGFβ1引起之非所需副作用最小化。
在一些實施例中，如本文所描述之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分在投與個體時無毒。在一些實施例中，如本文所描述之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分在向個體投與時展現相比於結合於TGFβ1及TGFβ2兩者之抗體降低的毒性。在一些實施例中，如本文所描述之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分在向個體投與時展現相比於結合於TGFβ1及TGFβ3兩者之抑制劑降低的毒性。在一些實施例中，如本文所描述之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分在向個體投與時展現相比於結合於TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之抑制劑降低的毒性。
一般而言，投與本文所描述之抑制劑(例如抗體)中之任一者，初始候選劑量可為每劑量約0.5-30 mg/kg，例如每劑量約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約30 mg/kg。通常，包含本發明涵蓋之抗體或其片段之組合物以適合間隔，諸如每週一次或兩次、每1-8週一次等投與給人類患者。在一些實施例中，投與頻率可調節至例如一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每六週一次、每八週一次等。出於本發明之目的，視以上提及之因素而定，典型日劑量可在約1 mg/kg至20 mg/kg或更多中之任一者之範圍內。對於歷經數天或更長時間之重複投與，視病況而定，持續治療直至出現所需症狀抑制或直至達成足夠治療水準以緩解TGFβ相關適應症或其症狀。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段以0.1與30 mg/kg之間、0.5與30 mg/kg之間、1與30 mg/kg之間、5與30 mg/kg之間、10與30 mg/kg之間、15與30 mg/kg之間、20與30 mg/kg之間、25與30 mg/kg之間、0.1與25 mg/kg之間、0.5與25 mg/kg之間、1與25 mg/kg之間、5與25 mg/kg之間、10與25 mg/kg之間、15與25 mg/kg之間、20與25 mg/kg之間、0.1與20 mg/kg之間、0.5與20 mg/kg之間、1與20 mg/kg之間、5.0與20 mg/kg之間、10與20 mg/kg之間、15與20 mg/kg之間、0.1與15 mg/kg之間、0.5與15 mg/kg之間、1與15 mg/kg之間、5與15 mg/kg之間、10與15 mg/kg之間、5.0與20 mg/kg之間、10與20 mg/kg之間、15與20 mg/kg之間、0.1與10 mg/kg之間、0.5與10 mg/kg之間、1與10 mg/kg之間、5與10 mg/kg之間之劑量向個體投與，視情況，其中一週兩次、一週一次、每2週一次、每3週一次、一月一次或每隔一個月一次向個體投與抗體或其抗原結合部分。
例示性給藥方案包含投與約2 mg/kg之初始劑量，隨後投與一或多次維持劑量。舉例而言，初始劑量可在約2與30 mg/kg之間，例如一週一次或一週兩次。其後，維持劑量可按照例如約0.1與20 mg/kg之間，例如一週一次、每隔一週一次、一月一次等。然而，其他劑量方案可能適用，視行醫者希望達成之藥物動力學衰變模式而定。藥物動力學實驗已顯示，在投與臨床前動物模型(例如小鼠模型)之後，本文所揭示之抑制劑(例如抗體) (例如SR-AB2)之血清濃度保持穩定至少7天。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，此投與後穩定性可為有利的，因為抗體可能以更低頻率投與，同時維持抗體所投與之個體(例如人類個體)中之臨床上有效的血清濃度。在一些實施例中，給藥頻率為每週、每2週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週或每10週一次；或每月、每2個月或每3個月或更長時間一次。此療法之進展易於藉由習知技術及分析來監測。給藥方案(包括所用抗體)可隨時間改變。
在一些實施例中，對於正常體重之成人患者而言，可投與介於約0.3至5.00 mg/kg範圍內之劑量。特定劑量(dosage)方案，例如劑量(dose)、時間安排及重複，將視特定個體及個體病史，以及個別藥劑之特性(諸如藥劑之半衰期及其他相關考慮因素)而定。
出於本發明之目的，選擇性結合LTBP1-TGFβ複合物及/或LTBP3-TGFβ複合物之抑制劑(例如抗體或其抗原結合片段)之適當劑量將視以下而定：所採用之專一性抗體(或其組合物)、適應症之類型及嚴重程度、投與抗體用於預防或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抑制劑之反應，以及主治醫師之判斷。在一些實施例中，臨床醫師將投與選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體，直至達到達成所需結果之劑量為止。投與選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體可為連續或間歇的，視例如接受者之生理學病況，無論投與目的為治療性或預防性，及熟習此項技術者已知之其他因素而定。投與選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體可基本上在預選時間段內連續或可以呈一系列間隔劑量，例如在患上TGFβ相關適應症之前、期間或之後。
基於觀察到抑制TGFβ3可在纖維化中增加膠原蛋白沈積或積聚，可考慮包含TGFβ1選擇性抑制劑(諸如本文所揭示之新穎抗體)之附加療法用於用具有TGFβ3抑制活性之TGFβ抑制劑(TGFβ1/2/3、TGFβ1/3及TGFβ3之抑制劑)治療之患者。具有TGFβ3抑制活性之TGFβ抑制劑之實例包括但不限於：TGFβ受體之低分子量拮抗劑，例如ALK5拮抗劑，諸如高倫替布(LY2157299單水合物)；抑制所有三種同功型之單株抗體(諸如中和抗體) (「泛抑制劑」抗體) (參見例如WO 2018/134681)；優先抑制三種同功型中之兩種的單株抗體(例如TGFβ1/3 (例如WO 2006/116002)；及經工程改造之分子(例如融合蛋白)，諸如配位體捕獲劑(例如WO 2018/029367；WO 2018/129331及WO 2018/158727)。在一些實施例中，配位體捕獲劑包含根據WO/2018/15872之揭示內容之結構。在一些實施例中，配位體捕獲劑包含根據WO 2018/029367；WO 2018/129331之揭示內容之結構。在一些實施例中，配位體捕獲劑為稱為M7824之構築體。在一些實施例中，配位體捕獲劑為稱為AVID200之構築體。在一些實施例中，中和泛TGFβ抗體為GC1008或其衍生物。在一些實施例中，此類抗體包含根據WO/2018/134681之揭示內容之序列。
在一些實施例中，抗體為專一性結合TGFβ1與TGFβ3的中和抗體。在一些實施例中，此類抗體優先結合TGFβ1而非TGFβ3。舉例而言，抗體包含根據WO/2006/116002之揭示內容之序列。在一些實施例中，抗體為21D1。
附加療法旨在對抗或克服已接受或正接受具有TGFβ3抑制活性之TGFβ抑制劑的患者中TGFβ3抑制的促纖維化作用。在一些實施例中，患者患有纖維化病症或處於患上纖維化病症之風險中。舉例而言，患者可罹患與患上肝纖維化之較高風險相關之代謝病況。與此類風險有關之代謝病況包括肥胖症、2型糖尿病及NASH。因此，本發明包括TGFβ1選擇性抑制劑，其用於以足以減少TGFβ3抑制劑之促纖維化作用的量，用TGFβ3抑制劑治療之個體的附加療法中。在一些實施例中，個體患有纖維化。在一些實施例中，個體患有骨髓纖維化。在一些實施例中，個體患有晚期癌症，例如轉移性或局部晚期腫瘤。在一些實施例中，TGFβ1選擇性抑制劑係選自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63及Ab64 (視情況Ab42或Ab63)、其變體/衍生物或抗原結合片段或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在一些實施例中，TGFβ1-選擇性抑制劑為Ab42、其變體/衍生物或抗原結合片段或包含其抗原結合片段之經工程改造之分子。在較佳實施例中，TGFβ1選擇性抑制劑為Ab42或其抗原結合片段。
在不受理論束縛之情況下，在一些實施例中，免去具有抗TGFβ3活性之TGFβ抑制劑可尤其適用於治療經診斷患有一種類型之已知為高度轉移性、骨髓纖維化之癌症的患者及/或患有纖維化病況或處於患上纖維化病況之風險下的彼等患者。因此，本文中之揭示內容包括用於治療癌症之TGFβ抑制劑，其中抑制劑不抑制TGFβ3且其中患者患有轉移性癌症或骨髓纖維化，或患者患有纖維化病況或處於患上纖維化病況之風險下，其中視情況纖維化病況為非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。
如本文所用，術語「治療」係指向患有TGFβ相關適應症、具有該適應症之症狀或適應症之傾向性的個體施加或投與包括一或多個活性劑之組合物，以便治癒、癒合、緩解、降低、改變、補救、減輕、改善或影響該適應症、該適應症之症狀或適應症之傾向性。
用選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體使TGFβ相關適應症緩解，該抑制劑包括延遲適應症之發展或進展，或降低適應症之嚴重程度。緩解該適應症未必需要治癒性結果。如其中所用，「延遲」與TGFβ相關適應症相關的適應症之發展意謂推遲、阻止、減緩、延緩、穩定或推遲該適應症之進展。此延遲可具有不同時間長度，視所治療適應症及/或個體之病史而定。「延遲」或緩解適應症發展或延遲適應症發作的方法為，與不使用該方法相比，在指定時間範圍內使出現適應症之一或多種症狀的機率降低及/或在指定時間範圍內降低症狀程度的方法。此類比較通常係基於臨床研究，使用足以產生統計學上顯著之結果的多名個體。 選擇用於治療纖維化病症之 TGFβ 抑制劑
本發明包括ECM相關TGFβ活化之專一性抑制劑，例如抗體及其抗原結合部分，其選擇性結合LTBP1/3-TGFβ1複合物且抑制在LTBP1或LTBP3之情形下呈遞的TGFβ1之活化。近年來已在美國臨時申請案62/362,393及62/371,355中描述選擇性結合GARP-TGFβ1複合物且抑制在GARP之情形下呈遞之TGFβ1之活化的情形專一性抗體。亦已描述結合由LTBP1/3、GARP或LRRC33呈遞之前/潛伏TGFβ1且抑制成熟TGFβ1自呈遞分子複合物釋放之同功型專一性，情形非依賴性TGFβ1抑制劑(參見例如WO 2017/156500)。前述申請案中之每一者的全部內容以引用之方式併入本文中。
此外，鼠類纖維化模型中之最近觀測結果表明在具有失調ECM之組織中TGFβ3抑制之不利影響(參見實例17；圖22)，提高了TGFβ3之作用超過內穩定之可能性。充分的證據表明，ECM之失調發現於多種疾病病況，包含纖維化及癌症中。實際上，許多關鍵促纖維化基因亦在各種癌症之標記物中識別。此等標記物包括例如col1A1、col3A1、PAI-1、CCL2、ACTA2、FN-1、CTGF及TGFβ1。因此，阻斷TGFβ3在纖維化中呈現有害(例如具有促纖維化作用)之發現可適用於與ECM失調相關之更廣泛範圍之病況。
本發明涵蓋選擇「合宜的 TGFβ抑制劑」用於「合宜的患者」以治療具有某些準則及/或臨床特徵之疾病病況的見解。在一個態樣中，本發明提供較佳TGFβ1抑制劑適用於患有纖維化病況之特定患者群體之用途。因此，本發明包括LTBP1/LTBP3-前TGFβ1抑制劑在治療個體之纖維化病況中之用途，其中個體受益於免疫抑制。此係基於以下概念：至少一小組TGFβ1活性涉及由GARP相關及/或LRRC33相關TGFβ1介導之免疫調節。因此，本發明包括認識到使用亦影響TGFβ1作用之免疫態樣之TGFβ1抑制劑可能對治療患有纖維化病況(其中免疫刺激可能導致疾病加重)之患者不利。因此，本發明至少部分旨在提供選擇性抑制ECM情形內之TGFβ1作用(例如LTBP相關)，同時免去與非ECM情形(例如在細胞表面上表現GARP或LRRC33之免疫細胞、白血球等)相關之TGFβ1作用的方式，以防止非所需免疫刺激。此方法在諸如非肝硬化肝纖維化之早期階段纖維化中可尤其有利。
在一些實施例中，受益於i)抑制TGFβ1信號傳導，及ii)免疫抑制兩者之患者群體包括，罹患嚴重或晚期階段器官纖維化且接受同種異體移植器官移植的患者群體。嚴重或晚期階段器官纖維化可與IPF、CKD及/或NASH相關。此類患者可能已接受用於治療纖維化疾病之其他療法，但其可能未能充分治療或控制病況。主治醫師可判定剩餘治療選擇方案可包括同種異體移植。此類患者可置放於可用於移植器官之等待清單中。此類患者可用免疫抑制劑治療。LTBP1/LTBP3呈遞之TGFβ1活化之選擇性抑制劑(其不抑制GARP呈遞之TGFβ1活化)可用於治療此類患者，而不提高觸發由效應T細胞介導之免疫刺激的風險。類似地，在移植之後，此類患者可繼續接受LTBP1/LTBP3呈遞之TGFβ1活化之選擇性抑制劑以避免器官排斥反應之風險。
在一些實施例中，受益於i)抑制TGFβ1信號傳導，及ii)免疫抑制兩者之患者群體包括，罹患纖維化病症及患有發炎或自身免疫病況的患者群體。
在一些實施例中，發炎或自體免疫病況與纖維化相關。與纖維化相關之發炎或自體免疫病況之非限制性實例包括肌肉萎縮症，諸如DMD。
在其他實施例中，受益於i)抑制TGFβ1信號傳導，及ii)免疫抑制兩者之患者群體包括，罹患纖維化疾病及患有不與纖維化而與各別病症直接相關之發炎或自體免疫病況的患者群體。
無論是否與所強調纖維化疾病或獨立病況直接相關之此類發炎或自體免疫病況可由人類自體免疫疾病中之調節性T細胞(Treg)之不平衡引起或與調節T細胞之不平衡相關。舉例而言，與Treg失調有關之此類病症包括但不限於：幼年特發性關節炎；類風濕性關節炎(RA)；脊柱關節炎；牛皮癬性關節炎；HCV混合冷球蛋白血症；冷球蛋白血症；多發性硬化症；自體免疫肝病；全身性紅斑狼瘡；免疫介導之糖尿病；重症肌無力；原發性乾燥綜合征(Primary Sjögren syndrome)；川崎病(Kawasaki disease)；以及發炎性腸病(IBD)。
因此，TGFβ1信號傳導之LTBP1/3選擇性抑制劑(諸如本文所描述之彼等)可用於治療罹患纖維化病況及發炎或自體免疫病況(諸如上文所列之病症中之一或多者)之患者。因此所用TGFβ1信號傳導之LTBP1/3選擇性抑制劑可治療或緩解ECM中TGFβ1依賴型纖維化，同時免去免疫相關之TGFβ1信號傳導。
因此，本發明之相關方法包括基於個體之纖維化病症之臨床表現選擇用於治療纖維化病症之適當TGFβ1抑制劑的方法。在一個實施例中，本發明提供選擇同功型專一性TGFβ1抑制劑用於治療個體之纖維化病症之方法。該方法包含(a)測定纖維化病症是否表現包括纖維化及發炎、免疫抑制、增殖失調及需要同種異體移植中之一或多者的臨床表現，及(b)基於步驟(a)中所測定之臨床表現選擇同功型專一性、情形依賴性TGFβ1抑制劑或同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑來治療纖維化病症。在另一實施例中，本發明提供治療患有纖維化病症之個體的方法，該方法包含為個體選擇包括同功型專一性TGFβ1抑制劑之治療方案，且向個體投與所選治療方案，其中該選擇包含(a)測定纖維化病症是否表現包括纖維化以及以下中之一或多者：發炎、免疫抑制、增殖失調及需要同種異體移植移植之臨床表現；(b)基於步驟(a)中所測定之臨床表現選擇包含同功型專一性、情形依賴性TGFβ1抑制劑或同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑之治療方案。
罹患纖維化病症之個體可呈現除纖維化外的廣泛範圍之症狀。個體中之臨床表現之特定組合可引導適當TGFβ1-抑制治療方案之選擇。舉例而言，若個體之臨床表現表明需要抑制TGFβ1，而不會調節TGFβ2或TGFβ3之活性，則可使用情形非依賴性、同功型專一性TGFβ1抑制劑來治療個體。若個體之臨床表現表明胞外基質中TGFβ1之抑制將為有益的，則可使用包括LTBP情形專一性抑制劑之治療方案來治療個體。若個體之臨床表現表明免疫效應細胞之刺激非所需，則LTBP情形專一性抑制劑亦為有利的。若個體之臨床表現表明阻斷TGFβ1在調節T細胞(Treg細胞)上之活化/釋放將為有益的，例如以預防Treg細胞抑制效應T細胞活性，則GARP情形專一性抑制劑可用於治療該個體。若個體之臨床表現表明阻斷TGFβ1在骨髓細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及/或微神經膠質細胞上之活化/釋放將為有益的，例如逆轉或減少個體之中之免疫抑制，則LRRC33情形專一性抑制劑可用於治療個體。
舉例而言，患有纖維化病症之個體可呈現包括纖維化、發炎、免疫抑制及增殖失調之臨床表現。通常伴隨前述症狀組合存在之纖維化病症包括例如骨髓纖維化。在此實施例中，可選擇同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑來治療個體。
患有纖維化病症之個體可呈現包括纖維化、發炎及需要同種異體移植之臨床表現。通常伴隨前述症狀組合存在之纖維化病症包括例如器官纖維化，諸如腎臟纖維化(例如與慢性腎病相關之纖維化)、肝纖維化(例如與非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)相關之纖維化)或肺纖維化(例如與特發性肺纖維化(IPF)相關之纖維化)。在此實施例中，選擇情形專一性LTBP1/3專一性抑制劑來治療個體。
在另一實例中，患有纖維化病症之個體可呈現包括纖維化及發炎之臨床表現。通常伴隨前述症狀組合存在之纖維化病症包括例如硬皮病。在此實施例中，選擇情形專一性LTBP1/3專一性抑制劑來治療個體。通常伴隨前述症狀組合存在之額外纖維化病症包括例如退化性疾病，諸如肌肉萎縮症，例如杜興氏肌肉失養症(DMD)。在此實施例中，選擇情形專一性LTBP1/3專一性抑制劑來治療個體。
患有纖維化病症之個體可呈現包括免疫抑制及增殖失調之臨床表現。通常伴隨前述症狀組合存在之纖維化病症包括例如實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤為惡性腫瘤。在其他實施例中，實體腫瘤為良性腫瘤。在一例示性實施例中，個體具有結締組織增生(例如胰臟結締組織增生)。在一些實施例中，患者可具有已評定為「不可手術」或不適合於手術切除之實體腫瘤。因此，在一些實施例中，患者不為手術切除腫瘤之候選者。然而，包含本發明之情形選擇性TGFβ1抑制劑的TGFβ1抑制療法可逆轉以使此類非候選患者更適合於接受手術。在一些實施例中，具有實體腫瘤之個體對諸如化學療法、放射療法、CAR-T療法及檢查點抑制劑療法之癌症療法(例如腫瘤對癌症療法具有抗性)反應不良。包含本發明之情形選擇性TGFβ1抑制劑的TGFβ1抑制療法可至少部分逆轉對其抗性以使患者對癌症療法更具反應性。在一些實施例中，包含情形選擇性TGFβ1抑制療法及癌症療法兩者之組合療法可以協同方式治療癌症。在一些實施例中，與癌症療法結合投與之情形選擇性TGFβ1抑制療法可減少所需劑量之癌症療法以產生相等或改良之臨床作用。
在另一例示性實施例中，個體具有類纖維瘤。在其中纖維化病症呈現包括免疫抑制及增殖失調之臨床表現的前述實施例中，選擇情形專一性LTBP1/3專一性抑制劑及/或情形專一性GARP專一性抑制劑用於治療個體。
在另一態樣中，本發明提供藉由選擇患有展現包括纖維化及需要同種異體移植之臨床表現的纖維化病症之個體及向該個體投與有效量之同功型專一性LTBP1/3專一性TGFβ1抑制劑，來用同功型專一性LTBP1/3情形專一性TGFβ1抑制劑治療患有纖維化病症之個體的方法。在一個實施例中，方法包含測定纖維化病症是否表現包括纖維化及需要同種異體移植之臨床表現。若個體呈現包括纖維化及需要同種異體移植之症狀，則向該個體投與LTBP1/3專一性TGFβ1抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供藉由選擇患有展現包括纖維化、免疫抑制及/或增殖失調之臨床表現之纖維化病症的個體及向該個體投與有效量之同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑，來用同功型專一性、情形非依賴性TGFβ1抑制劑治療患有纖維化病症之個體的方法 在一個實施例中，該方法包含測定纖維化病症是否表現包括纖維化、免疫抑制及/或增殖失調之臨床表現。若個體抑制包括纖維化、免疫抑制及/或增殖失調之症狀，則向該個體投與同功型專一性，情形非依賴性TGFβ1抑制劑。
可使用此項技術中已知之方法及實踐，在患有纖維化病症之個體中測定包括發炎、免疫抑制、增殖失調及/或需要同種異體移植之臨床表現。此類方法包括例如身體檢查及標準診斷測試。在一個實施例中，可藉由測定個體在血漿、血液或血清中是否呈現升高水準之發炎生物標記物來評估發炎。此類發炎生物標記物包括例如C反應蛋白、介白素1 (IL-1)、介白素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)或其組合。包括紅血球沈積速率(ESR)及血漿黏度(PV)之血液測試亦可指示患有纖維化病症之個體中存在發炎。在另一實施例中，免疫抑制可藉由測定個體之血細胞，例如T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞等之數目及組成來評估。免疫抑制亦可藉由測定個體是否取得或具有採用免疫抑制劑藥物治療史，或測定個體是否患有與免疫抑制相關之病況(例如血液惡性病、HIV/AIDS等)來評估。在另一實施例中，增殖失調可使用標準測試評估，包括血液測試、活檢體檢查及/或成像程序，諸如CT掃描、超音波及MRI。用於診斷癌症之其他標準測試(例如生物標記測試等)亦可用於評估增殖失調。需要同種異體移植可藉由臨床醫師使用標準程序來確定。在一個實施例中，器官功能之缺失或部分缺失或器官功能缺失之可能性增加指示需要移植。
如所提及，本發明提供藉由使用能夠專一性結合LTBP呈遞之TGFβ1前驅體之抗體實現之ECM相關TGFβ1複合物之選擇性靶向。儘管本發明之一些抗體能夠結合及抑制LTBP1及LTBP3相關前TGFβ1複合物，但其他抗體顯示甚至更大的選擇性，因為其僅結合LTBP1-前TGFβ1或LTBP3-前TGFβ1。
因此，本發明涵蓋以下認識：某些患者群體可受益於包含對LTBP1-前TGFβ1具有專一性之情形選擇性抑制劑的TGFβ1抑制療法。
LTBP1及LTBP3均為ECM之兩種組分，其中其可呈現或「呈遞」潛伏TGFβ前驅體複合物。來自表現研究之一些觀測結果提高了LTBP3之缺失、去除或功能抑制可引起某些毒性之可能性。LTBP3-/-小鼠(以及一些人類突變)具有較短身材，以及骨骼及牙齒異常。此等表型可能與發展中之破壞相關，然而，LTBP3可能在成年的此等組織之內穩定中起作用(報導在成年骨中之表現)。基於此等觀測結果，在某些臨床情況中(其中疾病表現於已知表現LTBP3且與毒性相關之組織中)或在某些患者群體(諸如仍處於活躍發展中之小兒患者)中，可合理地避免LTBP3相關抑制之潛在毒性。LTBP1功能缺失似乎足以防止至少一些形式之纖維化，因為LTBP1-/-KO小鼠經保護免於肝纖維化(由膽管結紮誘導)。綜合而言，此等資料提出如下可能性：在某些情況下，相比於LTBP1/3-TGFβ1抑制劑，LTBP1專一性TGFβ1抑制可具有優良的安全概況。
因此，選擇適於或可能受益於本發明之LTBP1/3選擇性抑制劑的患者或患者群體可涉及評估或確定LTBP1、LTBP2、LTBP3、LTBP4、GARP、LRRC33、前TGFβ1或成熟TGFβ1、前TGFβ2或成熟TGFβ2、前TGFβ3或成熟TGFβ3或其任何組合之表現概況。表現概況可藉由在來自個體(例如患者)收集之生物樣品的適合分析中量測mRNA及/或蛋白質之水準的存在/缺失來獲得。在一些實施例中，LAP之可溶性循環片段可用作特定TGFβ同功型之表現的替代標記物。在一些實施例中，可使用TGFβ1 LAP片段作為纖維發生之標記物。參見例如美國專利8,198,412，其內容以引用之方式併入本文中。 疾病之基因標記物：
已觀測到，多種疾病病況中的TGFβ1信號轉導路徑之異常活化係與多個標記物之變化的基因表現相關。此等基因表現標記物(例如如藉由mRNA所量測)包括但不限於：Serpine 1 (編碼PAI-1)、MCP-1(亦稱為CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、ACTA2 (編碼α-SMA)、SNAI1 (藉由下調E-鈣黏素(Cdh1)驅動纖維化及癌轉移中的EMT)、MMP2 (與EMT相關之基質金屬蛋白酶)、MMP9 (與EMT相關之基質金屬蛋白酶)、TIMP1 (與EMT相關之基質金屬蛋白酶)、FOXP3 (Treg誘導之標記物)、CDH1 (經TGFβ下調之E鈣黏素(上皮細胞之標記物))及CDH2 (經TGFβ上調之N鈣黏素(間葉細胞之標記物))。引起關注地是，許多此等基因牽涉到在各類疾病病況，包括各種類型之器官纖維化，以及在包括骨髓纖維化之多種癌症中起一定作用。實際上，已表明纖維化病況及異常細胞增殖、腫瘤發生及癌轉移之間的病理生理學聯繫。參見例如Cox及Erler (2014) Clinical Cancer Research 20(14): 3637-43「Molecular pathways: connecting fibrosis and solid tumor metastasis」；Shiga等人 (2015) Cancers 7:2443-2458「Cancer-associated fibroblasts: their characteristics and their roles in tumor growth」；Wynn及Barron (2010) Semin. Liver Dis. 30(3): 245-257「Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis」，其內容以引用之方式併入本文中。在不希望受特定理論束縛之情況下，本發明之發明人預期TGFβ1信號傳導路徑實際上可為此等廣泛病變之間的關鍵連接。
趨化性細胞介素(或趨化因子)介導白血球(例如單核細胞/巨噬細胞)募集至受傷或疾病組織的能力在疾病進展中具有至關重要結果。此過程涉及C-C趨化因子家族之成員，諸如單核細胞化學引誘劑蛋白1 (MCP-1) (亦稱為CCL2)、巨噬細胞發炎蛋白1-α (MIP-1α) (亦稱為CCL3)及MIP-1β (亦稱為CCL4)。
舉例而言，認為MCP-1/CCL2在纖維化及癌症兩者中起一定作用。MCP-1/CCL2表徵為促纖維化趨化因子且為單核細胞化學引誘劑，且有證據表明其可能涉及癌症之開始及進展。在纖維化中，已顯示MCP-1/CCL2在纖維化之發炎期中起重要作用。舉例而言，MCP-1之中和引起腎小球新月體形成及I型膠原蛋白之沈積顯著減少。類似地，使用抗MCP-1或抗MIP-1α抗體之被動免疫療法顯示在博萊黴素刺激的小鼠中可顯著減少單核性吞噬細胞積聚，表明MIP-1α及MCP-1促使在肺發炎反應期間白血球募集(Smith, Biol Signals. 1996 Jul-Aug;5(4):223-31, 「Chemotactic cytokines mediate leukocyte recruitment in fibrotic lung disease」)。已報導患有囊腫性纖維化及具有多發性骨髓瘤之患者中MIP-1 α水準升高(參見例如：Mrugacz等人, J Interferon Cytokine Res. 2007 Jun;27(6):491-5)，支持MIP-1α與局部或全身性發炎反應相關之概念。
一系列證據指出腫瘤進展中涉及C-C趨化因子。舉例而言，腫瘤衍生MCP-1/CCL2可在巨噬細胞中促進「促癌」表型。舉例而言，在肺癌中，已顯示MCP-1/CCL2由基質細胞產生且促進癌轉移。在人類胰臟癌中，腫瘤分泌CCL2，且免疫抑制性CCR2-陽性巨噬細胞浸潤此等腫瘤。展現高CCL2表現/低CD8 T細胞浸潤的具有腫瘤之患者具有明顯減少之存活期。在不希望受特定理論束縛之情況下，預期募集至受傷或患病組織環境的單核細胞可隨後對局部線索起反應(諸如對腫瘤衍生細胞介素起反應)而變得極化，藉此進一步促成疾病進展。此等類M2巨噬細胞有可能藉由抑制效應細胞，諸如CD4+及CD8+ T細胞促成免疫逃避。在一些實施例中，此過程由活化巨噬細胞所表現之LRRC33-TGFβ1部分介導。在一些實施例中，此過程由Treg所表現之GARP-TGFβ1部分介導。
同樣，PAI-1/Serpine1之參與已涉及多種癌症、血管生成、發炎、神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)。在多種癌症，諸如乳癌及膀胱癌(例如移行細胞癌)以及骨髓纖維化中，腫瘤及/或血清中之升高的PAI-1表現與不良預後(例如較短存活期、增加之癌轉移)相關。在纖維化病況之情形下，PAI-1已被認為經TGFβ1誘導之纖維化的重要下游效應子，且已在多種形式之組織纖維化，包括肺纖維化(諸如特發性肺纖維化(IPF))、腎臟纖維化、肝纖維化及硬皮病中觀測到增加之PAI-1表現。在一些實施例中，此過程例如經由LTBP1及/或LTBP3，由ECM相關之TGFβ1部分介導。
因此，在一些實施例中，TGFβ1抑制劑療法之活體內作用可藉由量測基因標記物之變化來評定。適合標記物包括TGFβ (例如TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)。適合的標記物亦可包括一或多種TGFβ (例如TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)之呈遞分子，諸如LTBP1、LTBP3、GARP (或LRRC32)及LRRC33。在一些實施例中，適合標記物包括間葉轉化基因(例如AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN及/或FAP)、免疫抑制基因(例如IL10、VEGFA、VEGFC)、單核細胞及巨噬細胞趨化性基因(例如CCL2、CCL3、CCL4、CCL7、CCL8及CCL13)及/或本文所論述之多種纖維化標記物。較佳標記物為血漿標記物。
在一些實施例中，TGFβ1之LTBP複合物抑制劑用於治療與以下中之一或多者之過度表現相關的疾病：PAI-1 (由Serpine1編碼)、MMP2、MMP9、MCP-1 (亦稱為CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、α-SMA、ITGA11及ACTA2，其中該治療包含以有效地治療疾病之量向罹患疾病之個體投與抑制劑。在一些實施例中，抑制劑用於治療與PAI-1、MCP-1/CCL2、CTGF及/或α-SMA之過度表現相關的疾病。在一些實施例中，疾病為骨髓纖維化。在一些實施例中，疾病為癌症，舉例而言，癌症包含實體腫瘤。在一些實施例中，疾病為器官纖維化，例如肝臟、腎臟、肺、肌肉、皮膚及/或心臟或心血管組織之纖維化。在一些實施例中，疾病為阿爾波特症候群。在一些實施例中，抑制劑減少以下中之一或多者的表現：PAI-1 (由Serpine1編碼)、MMP2、MMP9、MCP-1 (亦稱為CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、α-SMA、ITGA11及ACTA2。
可用於評定TGFβ1抑制劑療法之活體內作用之另一生物標記物為血尿素氮(BUN)。尿素作為蛋白質分解之副產物天然形成於體內。尿素自肝臟行進至腎臟，在該等腎臟中，其自血液過濾/移除。因此，在當患者之腎臟不正常起作用時之情況下，BUN水準有所增加。舉例而言，患有腎臟纖維化之患者可顯示增加之BUN。因此，在一些實施例中，量測BUN以評定如本文所描述之LTBP專一性TGFβ1抑制劑之活體內作用。在其他實施例中，LTBP專一性TGFβ1抑制劑用於治療與增加之BUN相關之疾病(例如腎臟纖維化及/或急性或慢性腎病、損害或衰竭)。在一特定實施例中，與增加之BUN相關之疾病為阿爾波特症候群。
因此，本發明包括選擇可能對TGFβ1抑制療法起反應之候選患者或患者群體的方法。方法可包含以下步驟：針對本文所論述之標記物中之一或多者的表現來測試自患者(或患者群體)收集之生物樣品，諸如活檢體樣品。同樣，此類基因標記物可用於監測患者對療法之反應性的目的。監測可包括例如在投與療法之前及之後、在治療方案隨時間推移之過程期間測試自患者收集之兩個或更多個生物樣品，以評估標記物中之一或多者之基因表現量的變化，其指示治療反應或有效性。
在一些實施例中，選擇可能對TGFβ1抑制療法起反應的候選患者或患者群體之方法可包含以下步驟：鑑別先前針對基因標記物，諸如本文中所描述之彼等所測試的顯示其異常表現的患者或患者群體。在一些實施例中，異常標記物表現包括升高水準之以下中之至少一者：TGFβ1 (及/或TGFβ1)、LRRC33、GARP、LTBP1、LTBP3、CCL2、CCL3、PAI-1/Serpine1、MMP2、MMP9、Col1a1、Col3a1、FN1、CTGF、α-SMA、ITGA11及ACTA2。在一些實施例中，患者或患者群體(例如自其收集之生物樣品)顯示升高之TGFβ1活化、磷酸化Smad2/3或其組合。在一些實施例中，患者或患者群體顯示升高之BUN。 組合療法
本發明進一步涵蓋醫藥組合物及相關方法，其用作用於治療可受益於活體內TGFβ1抑制之個體的組合療法。在此等實施例中之任一者中，此類個體可接受組合療法，其包括包含至少一種TGFβ1抑制劑，例如本文中所描述之抗體或其抗原結合部分的第一組合物；以及包含至少一種意欲治療相同或重疊疾病或臨床病況的額外治療劑的第二組合物。第一和第二組合物可均對相同細胞靶向物或對離散細胞靶向物起作用。在一些實施例中，第一和第二組合物可治療或緩解相同或重疊疾病或臨床病況之症狀或態樣組。在一些實施例中，第一和第二組合物可治療或緩解單獨的疾病或臨床病況之症狀或態樣組。僅給出一個實例，第一組合物可治療與TGFβ1信號傳導相關之疾病或病況，而第二組合物可治療與相同疾病相關之發炎或纖維化等。此類組合療法可結合彼此投與。在組合療法之情形下，片語「結合」意謂在接受組合療法之個體中，第一療法之治療作用暫時及/或在空間上與第二療法之治療作用重疊。因此，組合療法可調配為用於療法之同時投與之單一調配物，或用於療法之連續投與的獨立調配物。
在較佳實施例中，組合療法在疾病治療中產生協同效應。術語「協同」係指總體上大於各單一療法之累加效應(例如較高功效)的效應。
在一些實施例中，包含本文中所描述之醫藥組合物的組合療法產生總體上等效於由另一療法(諸如第二藥劑之單一療法)產生之功效，但相較於第二藥劑之單一療法，伴隨有較少與第二藥劑相關的非所需不良作用或較少嚴重毒性。在一些實施例中，此類組合療法容許較低劑量之第二藥劑但維持總體功效。此類組合療法可尤其適用於確定進行長期治療及/或涉及小兒患者之患者群體。
因此，本發明提供供用於減少TGFβ1蛋白活化且治療或預防與TGFβ1信號傳導相關之疾病或病況的組合療法中的醫藥組合物及方法，如本文所描述。因此，方法或醫藥組合物進一步包含第二療法。在一些實施例中，第二療法可適用於治療或預防與TGFβ1信號傳導相關之疾病或病況。第二療法可減輕或治療與靶向疾病相關之至少一種症狀。第一和第二療法可藉由相似或不相關作用機制發揮其生物效應；或第一和第二療法中之任一者或兩者可藉由多重作用機制發揮其生物效應。
應理解，本文中所描述之醫藥組合物可具有處於相同醫藥學上可接受之載劑中或處於針對各所描述實施例不同的醫藥學上可接受之載劑中的第一及第二療法。應進一步理解，在所描述實施例中，第一和第二療法可同時或連續投與。
在一個實施例中，選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物的本文中所描述之抑制劑，例如抗體可與抑制TGFβ1活性之另一藥劑一起投與。舉例而言，第二藥劑可為另一情形專一性TGFβ1抑制劑。在一個實施例中，組合療法包含(i)選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分，及(ii)選擇性結合GARP-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分。在另一實施例中，組合療法包含(i)選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分，及(ii)選擇性結合LRRC33-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分。選擇性結合LRRC33-TGFβ1之情形專一性抗體描述於例如US 62/503,785中，且以上描述選擇性結合GARP-TGFβ1之情形專一性抗體。前述申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，組合療法包含(i)抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分，其選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物；及(ii)情形非依賴性抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分，其選擇性結合與呈遞分子(例如LTBP1/3、GARP及/或LRRC33)複合之前/潛伏TGFβ1。TGFβ1之情形非依賴性抑制劑描述於例如WO 2017/156500中，其全部內容以引用之方式併入本文中。
本發明之一或多種抗TGFβ1抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分可與一或多種額外治療劑組合使用。可與本發明之抗TGFβ抗體一起使用之額外治療劑之實例包括但不限於肌肉抑制素抑制劑、VEGF促效劑、IGF1促效劑、FXR促效劑、CCR2抑制劑、CCR5抑制劑、雙重CCR2/CCR5抑制劑、類離胺醯氧化酶-2抑制劑、ASK1抑制劑、乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑、p38激酶抑制劑、吡非尼酮(Pirfenidone)、尼達尼布(Nintedanib)、GDF11抑制劑、GDF8/肌肉抑制素抑制劑及類似者。GDF8/肌肉抑制素抑制劑較佳為肌肉抑制素選擇性抑制劑(例如抗體或抗原結合片段)。肌肉抑制素選擇性抑制劑可結合潛伏肌肉抑制素。肌肉抑制素選擇性抑制劑之非限制性實例包括SRK-015 (例如參見WO2017/218592A1)及特里沃單抗或其任何變體，或根據WO 2016/098357之抗體。
在一些實施例中，額外藥劑為檢查點抑制劑。在一些實施例中，額外藥劑係選自由以下組成之群：PD-1拮抗劑、PDL1拮抗劑、PD-L1或PDL2融合蛋白、CTLA4拮抗劑、GITR促效劑、抗ICOS抗體、抗ICOSL抗體、抗B7H3抗體、抗B7H4抗體、抗TIM3抗體、抗LAG3抗體、抗OX40抗體、抗CD27抗體、抗CD70抗體、抗CD47抗體、抗41BB抗體、抗PD-1抗體、溶瘤病毒及PARP抑制劑。在一些實施例中，額外療法為放射。在一些實施例中，額外藥劑為化學治療劑。在一些實施例中，化學治療劑為紫杉醇(Taxol)。在一些實施例中，額外藥劑為消炎劑。在一些實施例中，額外藥劑抑制單核細胞/巨噬細胞募集及/或組織浸潤之過程。在一些實施例中，額外藥劑為肝星狀細胞活化之抑制劑。在一些實施例中，額外藥劑為趨化因子受體拮抗劑，例如CCR2拮抗劑及CCR5拮抗劑。在一些實施例中，此類趨化因子受體拮抗劑為雙重專一性拮抗劑，諸如CCR2/CCR5拮抗劑。在一些實施例中，以組合療法形式待投與之額外藥劑為或包含生長因子之TGFβ超家族之成員或其調節劑。在一些實施例中，此類藥劑係選自GDF8/肌肉抑制素及GDF11之調節劑(例如抑制劑及活化劑)。在一些實施例中，此類藥劑為GDF8/肌肉抑制素信號傳導之抑制劑。在一些實施例中，此類藥劑為結合前/潛伏肌肉抑制素複合物且阻斷肌肉抑制素之活化的單株抗體。在一些實施例中，結合前/潛伏肌肉抑制素複合物且阻斷肌肉抑制素之活化的單株抗體不結合游離成熟肌肉抑制素。
此類組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，從而避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。 用於偵測 LTBP1-TGFβ1 複合物及 / 或 LTBP3-TGFβ1 複合物之分析
在一些實施例中，本文所提供之方法及組合物係關於一種用於偵測獲自個體之樣品中的LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之方法。如本文所使用，「個體」係指個別生物體，例如個別哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為非人類哺乳動物。在一些實施例中，個體為非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為嚙齒動物。在一些實施例中，個體為綿羊、山羊、牛、家禽、貓或犬。在一些實施例中，個體為脊椎動物、兩棲動物、爬行動物、魚、昆蟲、蒼蠅或線蟲。在一些實施例中，個體為研究動物。在一些實施例中，個體為經基因工程改造，例如經基因工程改造之非人類個體。個體可為任一性別且在發展之任何階段下。在一些實施例中，個體為患者或健康志願者。
在一些實施例中，在獲自個體之樣品中用於偵測LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之方法涉及(a)使樣品與選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抗體在適於抗體結合於抗原之條件下接觸，若抗原存在於樣品中，則由此形成結合複合物；及(b)測定抗體結合於抗原之水準(例如測定結合複合物之水準)。
在一個實施例中，採用利用固定於表面上之生物素標記之潛伏TGFβ1複合物的篩選分析，其允許藉由整合素活化潛伏TGFβ，例如藉由提供繫留物。其他非整合素活化劑亦可在彼系統中測試。讀數可經由報導子細胞或其他TGFβ依賴性細胞反應量測。 用於量測 TGFβ 活化之基於細胞之分析
TGFβ之活化(及藉由TGFβ測試抑制劑，諸如抗體進行的其抑制)可藉由此項技術中已知的任何適合方法量測。舉例而言，TGFβ之經整合素介導之活化可用於基於細胞之分析，諸如「CAGA12」螢光素酶分析中，其較詳細地描述於本文中。此類分析系統可包含以下組分：i) TGFβ之來源(重組、內源性或經轉染)；ii)整合素之來源(重組、內源性或經轉染)；及iii)對TGFβ活化起反應之報導子系統，諸如表現能夠對TGFβ起反應且將信號轉譯成可讀輸出(例如CAGA12細胞或其他報導子細胞株中之螢光素酶活性)的TGFβ受體之細胞。在一些實施例中，報導子細胞株包含處於TGFβ反應性啟動子(例如PAI-1啟動子)之控制下的報導子基因(例如螢光素酶基因)。在一些實施例中，賦予敏感性之某些啟動子元件可併入至報導子系統中。在一些實施例中，此類啟動子元件為CAGA12元件。可用於分析中之報導子細胞株已描述於例如Abe等人 (1994)Anal Biochem . 216(2): 276-84中，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，自相同來源(例如相同細胞)提供前述分析組分中之每一者。在一些實施例中，自相同來源提供前述分析組分中之兩者，且自不同來源提供第三分析組分。在一些實施例中，自不同來源提供所有三種分析組分。舉例而言，在一些實施例中，自相同來源(例如相同經轉染之細胞株)為分析提供整合素及潛伏TGFβ複合物(前TGFβ及呈遞分子)。在一些實施例中，自獨立來源(例如兩種不同細胞株，純化整合素及經轉染之細胞之組合)為分析提供整合素及TGF。當細胞用作分析組分中之一或多者之來源時，此類分析組分對細胞可為內源性的、穩定地表現於細胞中、經瞬時轉染或其任何組合。
熟習此項技術者可容易地使此類分析適於各種適合組態。舉例而言，可考慮TGFβ之多種來源。在一些實施例中，TGFβ之來源為表現及沈積TGFβ之細胞(例如初級細胞、繁殖細胞、永生化細胞或細胞株等)。在一些實施例中，TGFβ之來源為使用適合手段固定於分析系統中的純化及/或重組TGFβ。在一些實施例中，固定於分析系統中的TGFβ存在於分析盤上的胞外基質(ECM)組合物內，其經或不經脫細胞化，模擬源於纖維母細胞之TGFβ。在一些實施例中，TGFβ存在於分析中所用的細胞之細胞表面上。另外，選定呈遞分子可包括於分析系統中，以提供適合的潛伏TGFβ複合物。一般熟習此項技術者可容易判定何種呈遞分子可存在或表現於某些細胞或細胞類型中。使用此類分析系統，在存在或不存在測試劑(諸如抗體)下的TGFβ活化之相對變化可容易量測，以評估測試劑對TGFβ活體外活化之影響。
此類基於細胞之分析可以多種方式加以修改或調整，其視所研究之TGFβ同功型、潛伏複合物(例如呈遞分子)之類型及其類似者而定。在一些實施例中，已知的表現能夠活化TGFβ之整合素的細胞可用作分析中的整合素之來源。此類細胞包括SW480/β6細胞(例如純系1E7)。在一些實施例中，表現整合素之細胞可與編碼所關注呈遞分子(諸如GARP、LRRC33、LTBP (例如LTBP1或LTBP3)等)之質體及編碼所關注TGFβ同功型之前驅體形式(諸如前TGFβ1)之質體共轉染。轉染之後，培育細胞持續足夠時間以允許表現經轉染之基因(例如約24小時)，洗滌細胞，且與測試劑(例如抗體)之連續稀釋液一起培育。在一些實施例中，組織培養孔或盤可塗佈有提供有利受質之物質，在該受質上細胞可黏著、生長及/或沈積ECM組分。此可促進細胞於其上之ECM架構、組織或黏著。舉例而言，諸如聚離胺酸之帶電物質可用於預塗佈組織培養受質。另外或或者，ECM之一或多種組分，諸如層黏連蛋白、纖維結合蛋白等可用作塗佈之受質。在一些實施例中，細胞在轉染之前接種於塗佈有ECM蛋白之孔/盤上。在一些實施例中，在轉染之後將細胞接種於ECM塗佈之孔/盤上。在一些實施例中，孔/盤用纖維結合蛋白塗佈。在一些實施例中，孔/盤用人類纖維結合蛋白塗佈。
在轉染(且視情況接種於ECM塗佈之孔/盤)之後，將報導子細胞株(例如CAGA12細胞)添加至分析系統中，隨後持續培育時間以允許TGFβ信號傳導。在培育時段(例如約18-20小時)之後，隨後添加測試劑，使用適合手段(例如對於表現螢光素酶之報導子細胞株，可使用Bright-Glo試劑(Promega))偵測信號/讀數(例如螢光素酶活性)。在一些實施例中，可使用BioTek (Synergy H1)盤讀取器，在自動增益設置(autogain setting)下偵測螢光素酶螢光。 用於緩解與 LTBP1/3-TGF β 相關之疾病 / 病症的套組
本發明亦提供供用於緩解與TGFβ相關適應症相關之疾病/病症中的套組。此類套組可包括一或多個容器，該等容器包含選擇性結合於LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分。
在一些實施例中，套組可包含根據本文所描述之任一方法的使用說明書。所包括之說明書可包含投與抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分的描述，該抑制劑選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物以治療如本文所描述之目標疾病、延遲如本文所描述之目標疾病的發作或緩解如本文所描述之目標疾病。套組可進一步包含基於鑑別個體是否患有目標疾病來選擇適用於治療之個體的描述。在再其他實施例中，說明書包含向處於目標疾病之風險下的個體投與抗體或其抗原結合部分的描述。
與選擇性結合LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分之用途相關的說明書一般包括關於預期治療之劑量、給藥時程及投與途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量封裝)或次單位劑量。本發明之套組中供應之說明書為通常在標籤或藥品說明書(例如套組中包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁化或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。標記或藥品說明書可指示組合物用於治療與TGFβ相關適應症相關之疾病或病症、延遲該疾病或病症的發作及/或緩解該疾病或病症。可提供說明書以用於實踐本文所描述之任一方法。
本發明之套組可提供於適合的封裝中。適合的封裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、可撓性封裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋用於與特定裝置，諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合之封裝。套組可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可用皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可用皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為選擇性結合如本文所描述之LTBP1-TGFβ1複合物及/或LTBP3-TGFβ1複合物之抑制劑，例如抗體或其抗原結合部分。
套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相關之標記或藥品說明書。在一些實施例中，本發明提供包含上文所描述的套組之內含物的製品。診斷、患者選擇、監測
包括TGFβ1抑制療法之治療方法可包含診斷TGFβ1適應症及/或選擇可能對此類療法起反應之患者。另外，可監測接受TGFβ1抑制劑之患者的治療效果，該監測通常涉及量測指示病況且可在治療之前及之後量測的一或多個適合參數，及評估治療相關參數變化。舉例而言，此類參數可包括自患者收集之生物樣品中存在的生物標記物之水準。生物標記物可為基於RNA、基於蛋白質、基於細胞及/或基於組織的。舉例而言，在某些疾病病況中過度表現之基因可充當診斷及/或監測疾病或對療法之反應的生物標記物。疾病相關細胞群之細胞表面蛋白質可充當生物標記物。此類方法可包括指示特定疾病之程度的疾病參數之直接量測結果。可採用任何適合之取樣方法，諸如血清/血液取樣、活檢體檢查及成像。
雖然活檢體檢查傳統地為診斷及監測各種疾病，諸如纖維化(例如器官纖維化)及增生性病症(例如癌症)之標準，但較少侵襲性替代方案可為較佳的。舉例而言，多種非侵襲性活體內成像技術可用於診斷、監測及選擇治療患者。因此，本發明包括使用活體內成像技術以診斷及/或監測患者或個體之疾病。在一些實施例中，患者或個體接受如本文所描述之同功型專一性TGFβ1抑制劑。在一些實施例中，患者或個體接受如本文所描述之同功型專一性TGFβ1抑制劑。在其他實施例中，活體內成像技術可用於選擇用同功型專一性TGFβ1抑制劑進行處理的患者。在一些實施例中，此類技術可用於確定患者是否對療法(例如TGFβ1抑制療法)起反應或如何起反應。
用於該等方法之例示性活體內成像技術包括但不限於X射線放射線攝影術、磁共振成像(MRI)、醫學超音波檢查或超音波、內視鏡檢法、彈性成像、觸覺成像、熱成像法、醫學攝影。其他成像技術包括核子醫學功能成像，例如正電子發射斷層攝影術(PET)及單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)。用於進行此等技術及分析結果之方法為此項技術中已知的。
常用於診斷及監測癌症之非侵襲性成像技術包括但不限於：磁共振成像(MRI)、電腦斷層攝影術(CT)、超音波、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、螢光反射成像(FRI)及螢光介導之斷層攝影術(FMT)。亦可使用混合成像平台來診斷及監測癌症。舉例而言，混合技術包括但不限於：PET-CT、FMT-CT、FMT-MRI及PET-MRI。動態顯影增強MRI (DCE-MRI)為常用於偵測乳癌之另一成像技術。用於進行此等技術及分析結果之方法為此項技術中已知的。
常用於診斷及監測纖維化之非侵襲性成像技術包括但不限於：超音波(例如習知或顯影增強超音波)、超音波彈性成像(例如瞬時彈性成像、點剪切波彈性成像及2D剪切波彈性成像)、CT掃描(例如習知CT或CT灌注成像)、磁共振成像(MRI) (例如習知MRI、磁共振彈性成像、擴散加權磁共振成像、釓塞酸二鈉及磁共振灌注成像)。
在一些實施例中，使用非侵襲性成像技術來評定肝纖維化或肝脂肪變性之程度。舉例而言，尤其適用於評定肝纖維化之成像技術可包括但不限於：FibroScan (瞬時彈性成像；TE)、點剪切波彈性成像(pSWE；亦稱為聲輻射力脈衝(ARFI))、2D-3D SWE、磁共振彈性成像(MRE)及多參數MRI。尤其適用於評定肝脂肪變性之成像技術可包括但不限於：超音波檢查術、受控衰減參數(CAP)彈性成像、經MRI評估之質子密度脂肪分數(MRI-PDFF)及磁共振光譜分析(MRS)。在一些實施例中，活體內成像技術用於評定肝臟硬度。在一些實施例中，活體內成像技術用於偵測及評定肝內三酸甘油酯含量。在一些實施例中，活體內成像技術用於評定肝臟表面結節 (LSN；亦稱為「肝臟評分」)、肝臟硬度及/或肝臟段體積比(LSVR)，其皆有益於肝纖維化之分階段及次分階段肝硬化。用於進行此等技術及分析結果之方法為此項技術中已知的。
近年來，正在開發將允許活體內偵測所關注細胞(例如細胞毒性T細胞、巨噬細胞及癌細胞)的非侵襲性成像方法。參見例如www.imaginab.com/technology/; Tavare等人(2014) PNAS, 111(3): 1108-1113；Tavare等人 (2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264；Rashidian等人 (2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255；Beckford Vera等人 (2018) PLoS ONE 13(3): e0193832；及Tavare等人 (2015) Cancer Res 76(1): 73-82，其中之每一者以引用之方式併入本文中。所謂的「T細胞追蹤」旨在活體內偵測及定位抗腫瘤效應T細胞。此可對理解實體腫瘤之免疫抑制表型提供有用的見解。經細胞毒性T細胞充分浸潤之腫瘤(「發炎」或「熱」腫瘤)可能對諸如檢查點阻斷療法(CBT)之癌症療法起反應。另一方面，具有免疫抑制表型之腫瘤往往具有不良T細胞浸潤，即使在存在抗腫瘤免疫反應時亦如此。此等所謂的「免疫排斥之」腫瘤可能無法對諸如CBT之癌症療法起反應。T細胞追蹤技術可揭露此等不同表型且提供導引治療方法中之將可能有益於患者之資訊。舉例而言，具有「免疫排除之」腫瘤的患者可能受益於TGFβ1抑制劑療法以有助於逆轉免疫抑制表型。預期可使用相似技術來診斷及監測其他疾病，例如纖維化。通常，經偵測部分(例如放射性標記、螢光等)工程改造之抗體或抗體類分子可輸注至患者中，其隨後將分佈且定位於特定標記物(例如CD8+及M2巨噬細胞)之位點。
可出於以下目的在多種適合方法中應用非侵襲性活體內成像技術：診斷患者；選擇或鑑別有可能受益於TGFβ1抑制劑療法之患者；及/或監測患者治療後之治療反應。具有已知細胞表面標記物之任何細胞可藉助於採用專一性結合於該細胞標記物之抗體或相似分子來偵測/定位。通常，藉由使用此類技術待偵測之細胞為免疫細胞，諸如細胞毒性T淋巴球、調節T細胞、MDSC、疾病相關巨噬細胞(M2巨噬細胞，諸如TAM及FAM)、NK細胞、樹突狀細胞及嗜中性白血球。
適合免疫細胞標記物之非限制性實例包括單核細胞標記物、巨噬細胞標記物(例如M1及/或M2巨噬細胞標記物)、CTL標記物、抑制免疫細胞標記物、MDSC標記物(例如G-MDSC及/或M-MDSC之標記物)，其包括但不限於：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD206、CD68、CD14、CD15、CD66、CD34、CD25及CD47。
在一些實施例中，活體內成像技術量測肝脂肪變性、肝三酸甘油酯、免疫細胞(例如如下文所描述)及/或肌纖維母細胞。在一些實施例中，治療減少患病組織中之三酸甘油酯、脂肪變性、肝臟表面結節、發炎及/或巨噬細胞。在一些實施例中，所選患者之肝內三酸甘油酯含量＞肝臟體積之5.5%，視情況其中肝內三酸甘油酯含量＞肝臟體積之10%。在一些實施例中，治療使肝內三酸甘油酯含量降低至≤肝臟體積之5.5%。在一些實施例中，治療減少患病組織中的MDSC。在一些實施例中，治療減少患病組織中的巨噬細胞。在一些實施例中，有效量為0.1 mg/kg至30 mg/kg，視情況3 mg/kg至30 mg/kg。在一些實施例中，方法進一步包含監測個體之如本文所描述之治療反應(例如降低之三酸甘油酯、減少之脂肪變性、減少之肝臟表面結節、減少之發炎、減少之巨噬細胞及/或降低之肝臟評分)。 篩選方法；製造
本發明涵蓋抗體或其片段之篩選方法、產生方法及製造方法，該抗體或其片段結合於hLTBP1-前TGFβ1複合物及/或hLTBP3-前TGFβ1複合物且以較慢速率自其解離，以及醫藥組合物及包含上述者之相關套組。
用於製成包含抗體(或包含其抗原結合片段之經工程改造之構築體)之醫藥組合物的方法需要鑑別及選擇具有所需屬性之此類抗體。此處，本發明包括認識到具有低kOFF 值之抗體可提供反映此等活化抑制劑之作用機制的耐久性，該等抑制劑不依賴於迅速與內源性受體競爭結合之能力，而是藉由鎖存至組織內之TGFβ1之非活性潛伏形式上發揮抑制作用。保持結合於潛伏抗原複合物(對應於低解離速率)之能力可在活體內達成持久效能。
因此，本發明提供用於製造包含TGFβ1選擇性活化抑制劑之醫藥組合物的方法，其中該方法包含以下步驟：選擇以低解離速率(例如≤ 5 x 10-4 (1/s))專一性結合人類LLC之抗體或其抗原結合片段，且以大規模產生抗體。
選擇具有有利解離速率(低解離)之抑制劑可用單價抗體(例如Fab片段)或全長抗體(例如IgG)測定。
在一些實施例中，產生步驟包含體積為250 L或更大，例如1000 L、2000 L、3000 L、4000 L之哺乳動物細胞培養物。該方法可進一步包含以下步驟：純化細胞培養物中之抗體且視情況將經純化之抗體調配成醫藥組合物。在一些實施例中，該方法進一步包含以下步驟：在適合之臨床前模型中測試所選抗體之功效及安全性，且證實抗體在NOAEL下有效。安全性評定可包括活體內毒理學研究，其包含組織病理學及針對免疫之安全性評定，包括例如活體外細胞介素釋放分析及血小板分析。
為達成持久抑制作用，可選擇解離速率(例如單價解離速率)不超過10.0E (s-1 ) (例如5.0E-4或更低、1.0E-4或更低、5.0E-5或更低)之抗體用於根據本發明之治療用途及/或大規模製造。
儘管在本文中已描述及說明本發明之若干實施例，但一般技術者將易於設想多種其他方式及/或結構來執行功能及/或獲得結果及/或一或多種本文所描述之優勢，且將此類變化及/或修改中之每一者視為在本發明之範疇內。更一般而言，熟習此項技術者容易瞭解，本文所描述之所有參數、尺寸、材料及組態均欲為例示性的且實際參數、尺寸、材料及/或組態將視使用本發明教示之一或多種特定應用而定。熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用習知實驗來確定本文中所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。因此應瞭解，前述實施例僅藉由實例呈現且在隨附申請專利範圍及其等效物之範疇內，本發明可以不同於特定描述及主張之其他方式來實施。本發明係關於本文所描述之各個別特徵、系統、物品、材料及/或方法。另外，若該等特徵、系統、物品、材料及/或方法非相互不相容，則在本發明之範疇內包括兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料及/或方法之任何組合。
藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例並不意欲以任何方式限制。整個本申請案中所列舉之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之全部內容以及圖式在此以引用之方式併入本文中。 實例
轉形生長因子β1 (TGFβ1)表示為蛋白分解裂解為C端生長因子及N端前結構域之原蛋白。在裂解之後，前結構域保持與生長因子非共價結合，防止受體結合。此潛伏TGFβ1經由將前結構域連接至呈遞分子之二硫鍵形成大潛伏複合物(LLC)，且隨後將此等大潛伏複合物沈積至胞外基質(ECM)中或使其進入細胞表面。此等呈遞分子為專一性αVβ整合素提供固定力以對潛伏TGFβ1施加牽引力。已鑑別出四種TGFβ1呈遞蛋白質：潛伏TGFβ結合蛋白1 (LTBP1)及LTBP3沈積於胞外基質中，而糖蛋白A為主的重複序列蛋白(GARP/LRRC32)及含富白胺酸重複序列之蛋白33 (LRRC33)在免疫細胞表面上呈遞潛伏TGFβ1。TGFβ1參與組織內穩定過程及調節免疫反應，且其活化之失調為器官纖維化、癌症及自體免疫之關鍵驅動因素。
相較於廣泛表現之TGFβ生長因子及受體，四種呈遞分子-前TGFβ複合物，即LTBP1-前TGFβ、LTBP3-前TGFβ、GARP-前TGFβ及LRRC33-前TGFβ顯示更多受限或選擇性(例如組織專一性)表現模式，藉助於結合引起TGFβ活性之功能性分室化。呈遞分子-前TGFβ複合物因此在表現呈遞分子之組織內提供TGFβ信號傳導之離散「情形」。此等情形可分成兩種廣泛類別：i)與ECM相關之TGFβ信號傳導(例如基質相關TGFβ功能)；及ii)與細胞相關之TGFβ信號傳導(特定言之，某些免疫細胞功能)。LTBP1-前TGFβ及LTBP3-前TGFβ複合物屬於第一類別，而GARP-前TGFβ及LRRC33-前TGFβ複合物屬於第二類別。
出於治療目的之TGFβ活性之非選擇性靶向已具有挑戰性，此係由於對於泛TGFβ路徑抑制劑所報導之劑量限制性毒性以及經由慢性TGFβ抑制之免疫系統活化。為了致力於解決此針對靶向TGFβ1之同功型及情形選擇性兩者的治療需要，本文提供能夠選擇性地抑制與ECM相關之TGFβ之活化的TGFβ抑制劑。在一些實施例中，抑制劑對特定TGFβ同功型(例如前TGFβ1、前TGFβ2及/或前TGFβ3)亦具有選擇性。同功型專一性單株抗體結合潛伏TGFβ1前結構域，而無與潛伏TGFβ2或TGFβ3之可偵測結合，且在情形選擇性之情況下活體外抑制潛伏TGFβ1之整合素介導之活化。為了促進抗體發現及表徵成果，開發出TGFβ1活化之基於情形依賴性細胞之分析。 實例 1 ： 開發結合 LTBP1/3-TGF β 1 複合物之情形專一性抑制劑
SR-AB1用作對照物。SR-AB1不依賴於呈遞分子結合潛伏TGFβ1 (參見圖 2A )。
開發對含TGFβ1大潛伏複合物具有選擇性之抗體。選擇SR-AB2用於使用以下實例中所描述之功能分析的進一步分析。對SR-AB2之重鏈及輕鏈可變區進行測序(圖 8 )；互補決定區加下劃線。證實SR-AB2結合LTBP呈遞之潛伏TGFβ1複合物，但不結合單獨的GARP-TGFβ1或前TGFβ1 (圖 2B )。然而，如下文所描述，此類選擇性結合之功能作用尚未知且在無新穎功能分析之進一步發展的情況下不可使用當前已知之技術進行測定。 實例 2 ： 偵測活化重組潛伏 TGFβ1 之抑制的功能分析
為了鑑別結合潛伏TGFβ1前結構域而無與潛伏TGFβ2或TGFβ3之可偵測結合且在情形依賴性之情況下活體外抑制潛伏TGFβ1之整合素介導之活化的同功型專一性抑制劑，需要新穎功能分析。在本發明之前，不可獲得可偵測同功型專一性TGFβ1抗體的分析，該等抗體僅結合於LTBP。特定言之，先前分析形式在由內源性呈遞分子呈遞的前TGFβ1之活化與由外源性LTBP呈遞的前TGFβ1之活化之間可能無法區分。藉由直接轉染表現整合素之細胞，本文所揭示之新穎分析在內源性呈遞子-前TGFβ1活性與外源性LTBP-前TGFβ1活性之間建立窗口。當LTBP-前TGFβ1複合物包埋於胞外基質中，分析盤塗層亦為分析之重要成分。使用塗佈有ECM蛋白質纖維結合蛋白之高結合盤使得LTBP分析更穩定。換言之，在本發明之前，在前TGFβ1轉染與LTBP1/3+前TGFβ1之共轉染之間不存在分析窗口。在本發明之前，唯一可用的分析形式為三重共培養物系統：轉染物(潛伏TGFβ呈遞細胞)+整合素表現細胞(活化子)+CAGA細胞(報導子)。藉由組合前兩個細胞群，且用TGFβ及呈遞分子直接轉染整合素表現細胞，本文中建立LTBP-前TGFβ1活化之窗口。
『主體轉染』(亦即在分析孔中接種之前在單獨孔/盤/器皿中轉染)對比『直接轉染』(亦即在分析孔中轉染)方案之問題及是否發現LTBP複合物之分析窗口似乎在一些情況下為細胞依賴性的。因此，在不開發本文所描述之TGFβ1活化的基於情形依賴性細胞之分析的情況下，將不可能發現且表徵LTBP1/3-TGFβ1抑制劑，例如抗體及其抗原結合部分(亦參見圖 3A 及3B )。
特定言之，為確定實例1中所開發之抗體是否為功能性的，開發出TGFβ1大潛伏複合物(LLC)之αVβ整合素活化的基於細胞之分析，其對各已知呈遞分子：LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33具有專一性。經由分析開發及最佳化之過程，測定出纖維結合蛋白為經LTBP呈遞之TGFβ1 LLC之整合素依賴性活體外活化的關鍵ECM蛋白。使用以下分析，亦驗證情形非依賴性及LTBP複合物專一性TGFβ1 LLC抗體作為整合素依賴性活化之抑制劑。因此，實例1中開發之抗體可分成2類：結合含有所有TGFβ1之複合物之抗體(同功型專一性及情形非依賴性)，及僅結合LTBP呈遞之TGFβ1 LLC之抗體。如本文中更詳細地描述，LTBP複合物專一性類別之抑制劑(在本文中所開發及描述之分析之前不能夠經鑑別)的開發實現用於治療纖維化適應症之治療方法，且由於免疫抑制細胞之TGFβ1抑制可允許長期給藥同時避免免疫系統活化。分析 I. 使用 SW480/ β 6 細胞活化潛伏 TGF β 1
對於圖 3A 中描繪之分析，開發以下方案。此分析對於藉由整合素細胞進行之胞外基質(經LTBP呈遞)活化為最佳的。 材料： • MvLu1-CAGA12細胞(純系4A4) • SW480/β 6細胞(純系1E7) (αV次單元以高水準內源性表現；β6次單元穩定過度表現) • Costar白壁經TC處理之96孔分析盤#3903 • Greiner Bio-One High Binding白色µ透明96孔分析盤#655094 • 人類纖維結合蛋白(Corning #354008) • P200多通道吸液管 • 各具有無菌過濾嘴之P20、P200及P1000吸液管 • 無菌微量離心管及擱架 • 無菌試劑儲集器 • 0.4%錐蟲藍(trypan blue) • 2mL、5mL、10mL及25mL無菌吸液管 • 經組織培養物處理之100 mm或150 mm盤 • 70%乙醇 • Opti-MEM降低之血清培養基(Life Tech #31985-070) • 脂染胺3000 (Life Tech #L3000015) • Bright-Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E2620) • 0.25%胰蛋白酶+0.53 mM EDTA • 前TGFb1表現質體，人類(SR005) • LTBP1S表現質體，人類(SR044) • LTBP3表現質體，人類(SR117) • LRRC32 (GARP)表現質體，人類(SR116) • LRRC33表現質體，人類(SR386) 儀器： • BioTek SynergyH1盤讀取器 • TC罩 • 台式離心機 • CO2 培育箱37℃ 5% CO2 • 37℃水/恆溫珠浴箱 • 平台震盪器 • 顯微鏡 • 血球計/countess 定義： • CAGA12 4A4細胞：MvLu1細胞(貂肺臟上皮細胞)之衍生物，其經CAGA12合成啟動子穩定地轉染，驅動螢光素酶基因表現 • DMEM-0.1%BSA：分析培養基；基礎培養基為DMEM (Gibco目錄號11995-065)，培養基亦含有稀釋至0.1% w/v之BSA、青黴素/鏈黴素及4 mM麩醯胺酸 • D10：DMEM 10% FBS、P/S、4 mM麩醯胺酸、1% NEAA、1× GlutaMAX (Gibco目錄號35050061) • SW480/β6培養基：D10+1000 µg/mL G-418 • CAGA12 (4A4)培養基：D10+0.75 µg/mL嘌呤黴素 程序：
在第0天，接種細胞用於轉染。SW480/β6 (純系1E7)細胞用胰蛋白酶分離且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將細胞集結粒再懸浮於D10培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞接種在5.0e6個細胞/12 ml/100 mm TC器皿中。對於CAGA12細胞，以每T75燒瓶1.0百萬之密度對細胞進行繼代，以用於在第3天之分析。在37℃及5% CO2 下培育培養物。
在第1天，轉染表現整合素之細胞。遵循製造商用脂染胺3000試劑轉染之方案。簡言之，將以下各者稀釋至OptiMEM I中，對於每孔125 µl：7.5 µg DNA (呈遞分子)+7.5 µg DNA (前TGFβ1)、30 µl P3000及用OptiMEM I最多125 µl。藉由用移液管將DNA移在一起來將孔混合，隨後添加OptiMEM。添加P3000，且藉由用移液管來充分混合所有物質。製成脂染胺3000之主混合物，將其添加至DNA混合物中：對於LTBP1分析：每孔OptiMEM I中15 µl脂染胺3000，最多125 µl；對於LTBP3分析：每孔OptiMEM I中45 µl脂染胺3000，最多125 µl。將經稀釋之脂染胺3000添加至DNA中，藉由用移液管來混合孔，且在室溫下培育15分鐘。培育之後，藉由用移液管將溶液混合數次，且隨後逐滴添加250 µl DNA：脂染胺3000 (2×125 µl)/器皿。輕輕地旋動各器皿以加以混合，且將器皿返回至組織培養恆溫箱持續約24小時。
在第1-2天，用人類纖維結合蛋白塗佈分析盤。特定言之，將凍乾纖維結合蛋白在超純蒸餾水(無菌)中稀釋至1 mg/ml。在PBS(無菌)中將1 mg/ml儲備溶液稀釋至19.2 µg/ml。接著將50 µl/孔添加至分析盤(高結合)且在組織培養恆溫箱(37℃及5% CO2 )中培育O/N。最終濃度為3.0 µg/cm2 。
在第2天，塗鋪經轉染之細胞以供分析且添加抑制劑。首先，藉由將200 µl/孔PBS添加至分析盤中已有的纖維結合蛋白溶液中來洗滌纖維結合蛋白塗層。用多通道吸液管手動地移除洗液。重複洗滌，總共洗滌兩次。在添加細胞之前，拿掉蓋子，使盤在室溫下乾燥。隨後藉由用胰蛋白酶分離來塗鋪細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將集結粒再懸浮於分析培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。對於LTBP1分析，將細胞稀釋至0.10e6個細胞/ml且每孔接種50 µl (每孔5,000個細胞)。對於LTBP3分析，將細胞稀釋至0.05e6個細胞/ml且每孔接種50 µl (每孔2,500個細胞)。為了製備功能性抗體稀釋液，將抗體在媒劑中預稀釋至恆定操作濃度。將儲備抗體連續稀釋於媒劑(PBS為最佳的，避免檸檬酸鈉緩衝液)中。針對抗體之4×最終濃度，將連續稀釋液之各點稀釋於分析培養基中。每孔添加25 µl 4X抗體且在37℃及5% CO2 下培育培養物約24小時。
在第3天，添加TGFβ報導子細胞。用胰蛋白酶分離供分析用之CAGA12 (純系4A4)細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將集結粒再懸浮於分析培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞稀釋至0.4e6 個細胞/ml且每孔接種50 µl (每孔20,000個細胞)。使細胞返回至培育箱。
在第4天，讀取分析(添加抗體及/或報導子細胞之後16-20小時)。在讀取之前，使Bright-Glo試劑及測試盤達至室溫。使用TMLC_std方案設定BioTek Synergy H1上之讀取設置，此方法具有自動增益設置。選擇陽性對照孔以供自動調整(高)。每孔添加100 µL Bright-Glo試劑。在室溫下在震盪下培育2分鐘，保護盤避光。在BioTek Synergy H1上讀取盤。
在一些實施例中，與內源性呈遞分子(例如LTBP1/3)相關之TGFβ活性可藉由僅轉染前TGFβ1 (亦即不共轉染LTBP1/3)來評定。在一些實施例中，可將呈遞分子及前TGFβ DNA直接轉染至接種於分析孔中之SW480/β6細胞中(亦即，「直接轉染」)，而非基本上如上文所描述將細胞轉染於單獨孔/器皿/盤中(亦即，「主體轉染」)。關於直接轉染方案，亦參見下文分析II。在一些實施例中，SW480/β6細胞可接種於不具有纖維結合蛋白之分析孔中，如基本上如下文分析II中所描述。
結果：
由此分析產生之資料反映細胞上清液中之TGFβ活性(圖 3A )。特定言之，SW480/β6細胞用LTBP1/3及前TGFβ1經主體轉染且接種於纖維結合蛋白上，如上文所描述。原始資料單位為相對光單位(RLU)。圖 3A 表明，轉染LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1但非單獨的前TGFβ1誘導TGFβ活化信號。
如在圖 4 中所描述進一步最佳化分析。特定言之，確定呈遞分子及/或前TGFβ1對潛伏TGFβ1活化之相對比重。在此分析中，SW480/B6細胞用指定DNA分子經主體轉染且接種於具有纖維結合蛋白的預塗佈分析孔上，如上文基本上描述。如圖 4A 中所顯示，觀測到潛伏TGFβ1活化在共轉染呈遞分子及前TGFβ1後顯著增加。圖 4B 描繪藉由改變用於呈遞分子與前TGFβ1之質體DNA之比率來最佳化共轉染。發現等效量之各質體對於共轉染為最佳的。
圖 5 表明纖維結合蛋白促進LTBP呈遞之潛伏TGFβ1之整合素活化。在此分析中，SW480/β6細胞用指定DNA分子經主體轉染且以自人類血漿純化之纖維結合蛋白的不同濃度接種於預塗佈分析孔上。纖維結合蛋白增加由LTBP1及LTBP3呈遞之潛伏TGFβ之活化。分析 II. 使用 LN229 細胞活化潛伏 TGF β 1
對於圖 3B 中描繪之分析，開發以下方案。此分析或「直接轉染」方案對於藉由整合素細胞進行的經細胞表面呈遞之TGFβ1 (GARP或LRRC33呈遞子)活化為最佳的。LN229細胞表現整合素αVβ8 (與經工程改造以表現αVβ6之SW480b6細胞株相反)。
此等兩種細胞株能夠關於藉由兩種經最佳驗證之TGFβ-活化整合素中之任一者活化的潛伏TGFβ1測試抗體。 材料： • MvLu1-CAGA12細胞(純系4A4) • LN229細胞株(高水準之內源性αVβ8整合素) • Costar白壁經TC處理之96孔分析盤#3903 • Greiner Bio-One High Binding白色µ透明96孔分析盤#655094 • 人類纖維結合蛋白(Corning #354008) • P200多通道吸液管 • 各具有無菌過濾嘴之P20、P200及P1000吸液管 • 無菌微量離心管及擱架 • 無菌試劑儲集器 • 0.4%錐蟲藍 • 2mL、5mL、10mL及25mL無菌吸液管 • 經組織培養物處理之100 mm或150 mm盤 • 70%乙醇 • Opti-MEM降低之血清培養基(Life Tech #31985-070) • 脂染胺3000 (Life Tech #L3000015) • Bright-Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E2620) • 0.25%胰蛋白酶+0.53 mM EDTA • 前TGFb1表現質體，人類(SR005) • LTBP1S表現質體，人類(SR044) • LTBP3表現質體，人類(SR117) • LRRC32 (GARP)表現質體，人類(SR116) • LRRC33表現質體，人類(SR386) 儀器： • BioTek SynergyH1盤讀取器 • TC罩 • 台式離心機 • CO2 培育箱37℃ 5% CO2 • 37℃水/恆溫珠浴箱 • 平台震盪器 • 顯微鏡 • 血球計/countess定義： • CAGA12 4A4細胞：MvLu1細胞(貂肺臟上皮細胞)之衍生物，其經CAGA12合成啟動子穩定地轉染，驅動螢光素酶基因表現 • DMEM-0.1%BSA：分析培養基；基礎培養基為DMEM (Gibco目錄號11995-065)，培養基亦含有稀釋至0.1% w/v之BSA、青黴素/鏈黴素及4 mM麩醯胺酸 • D10：DMEM 10% FBS、P/S、4 mM麩醯胺酸、1% NEAA、1× GlutaMAX (Gibco目錄號35050061) • CAGA12 (4A4)培養基：D10 + 0.75ug/mL嘌呤黴素 程序：
在第0天，接種整合素表現細胞用於轉染。用胰蛋白酶分離細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將細胞集結粒再懸浮於D10培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞稀釋至0.1e6 個細胞/ml且在分析盤中每孔接種100 µl (每孔10,000個細胞)。對於CAGA12細胞，以每T75燒瓶1.5百萬之密度進行繼代，以用於在第2天之分析。在37℃及5% CO2 下培育培養物。
在第1天，轉染細胞。遵循製造商之方案用脂染胺3000試劑轉染。簡言之，將以下各者稀釋至OptiMEM I中，對於每孔5 µl：0.1 µg DNA (呈遞分子)+0.1 µg DNA (前TGFβ1)、0.4 µl P3000及用OptiMEM I達至5 µl。藉由用移液管將DNA移在一起來將孔混合，隨後添加OptiMEM。添加P3000且藉由用移液管混合所有物質。用脂染胺3000製成主混合物，將其添加至DNA混合物中：每孔OptiMEM I中0.2 µl脂染胺3000，最多5 µl。將經稀釋之脂染胺3000添加至DNA中，藉由用移液管來混合孔，且在室溫下培育15分鐘。培育之後，藉由用移液管將溶液混合數次，且隨後添加10 µl/孔DNA：脂染胺3000 (2×5 µl)。將盤返回至組織培養恆溫箱持續約24小時。
在第2天，添加抗體及TGFβ報導子細胞。為了製備功能性抗體稀釋液，將儲備抗體連續稀釋於媒劑(PBS為最佳的)中。針對抗體之2×最終濃度，將各點稀釋於分析培養基中。在製備抗體之後，藉由抽吸(真空抽吸器)用分析培養基洗滌細胞盤兩次，接著每孔添加100 µl分析培養基。第二次洗滌之後，用每孔50 µl之2×抗體替換分析培養基。使細胞盤返回至培育箱持續約15-20分鐘。
為了製備CAGA12 (純系4A4)細胞以供分析，用胰蛋白酶分離細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將集結粒再懸浮於分析培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞稀釋至0.3e6 個細胞/ml且每孔接種50 µl (每孔15,000個細胞)。使細胞返回至培育箱。
在第3天，在添加抗體及/或報導子細胞之後約16-20小時讀取分析。在讀取之前，使Bright-Glo試劑及測試盤達至室溫。BioTek Synergy H1上之讀取設置設定成使用TMLC_std方案，此方法具有自動增益設置。設定陽性對照孔以供自動調整(高)。每孔添加100 µL Bright-Glo試劑。在室溫下在震盪下培育2分鐘，保護盤避光。在BioTek Synergy H1上讀取盤。
在一些實施例中，與內源性呈遞分子(例如LTBP1/3)相關之TGFβ活性可藉由僅轉染前TGFβ1 (亦即不共轉染LTBP1/3)來評定。在一些實施例中，可將呈遞分子及前TGFβ DNA經主體轉染至單獨孔/器皿/盤中之LN229細胞中(亦即，「主體轉染」) (基本上如上文在分析I所描述)，而非直接轉染細胞(亦即，「直接轉染」)。在一些實施例中，LN229細胞可接種於具有纖維結合蛋白之分析孔中(參見針對纖維結合蛋白預塗佈方案之分析I)。
由此分析產生之資料反映細胞上清液中之TGFβ1活性(圖 3B )。特定言之，LN229細胞接種於無纖維結合蛋白之分析孔中且藉由「直接轉染」來用指定DNA分子轉染。原始資料單位為相對光單位(RLU)。具有高RLU值之樣品含有大量游離TGFβ，具有低RLU值之樣品含有低水準TGFβ。 實例 3. SR-AB1 為藉由整合素之 TGFβ LLC 活化的情形非依賴性抑制劑
圖 6 為表明SR-AB1為TGFβ1大潛伏複合物(LLC)之情形非依賴性抑制劑的圖式。在此分析中，將SW480/β6細胞接種在無纖維結合蛋白之分析孔中且分別用GARP-前TGFβ1或LRRC33-前TGFβ1直接轉染，如實例2中之以上方案中基本上所描述。為了評定由LTBP1活化TGFβ1，將LN229細胞接種在預塗佈有纖維結合蛋白之分析孔中且用LTBP1-前TGFβ1直接轉染，如實例2中之以上方案中基本上所描述。顯示SR-AB1抑制不依賴於呈遞分子之TGFβ之整合素活化。 實例 4. SR-AB2 為 LTBP- 前 TGFβ1 之複合物專一性抑制劑
選擇SR-AB2用於進一步分析及測試對結合於不同TGFβ呈遞分子之專一性。首先，如下進行ELISA分析以測試複合物專一性。
材料： • 來自96-Well Plates SOP之NeutrAvidin Coating的固體白色96孔盤 • 生物素標記之抗原 • Maine Biotechnology Services Anti-His抗體MAB230P • Jackson ImmunoResearch Laboratories Peroxidase Affinipure Goat α-人類FCγ • Fragment Specific.目錄號109-035-008. • Jackson ImmunoResearch Laboratories Affinipure Goat α-小鼠FCγ Fragment Specific. • 目錄號115-035-008 • QuantaBlu ELISA Substrate (Pierce Biotech目錄號15162) 儀器： • 多通道吸液管 • P200吸頭 • 台面超離心機 • 1.5 mL離心管 • 0.5 mL離心管 • P1000 • P1000吸頭 • P200 • P10 • P10吸頭 • 15 mL Falcon管 • 50 mL Falcon管 • Biotek ELx 405 Select CW盤洗滌器 • Multidrop • Biotek SynergyH1盤讀取器 定義： • 洗滌緩衝液：具有0.05% Tween-20之TBS (Tris-緩衝鹽水；50 mM Tris-Cl、150 mM NaCl，pH 7.6)。對於手動(手)洗滌液，添加0.1% BSA，因為BSA係黏性的而且不應與自動化盤洗滌器系統一起使用。 • 樣品緩衝液：具有0.05% Tween-20及0.1% BSA之TBS (Tris-緩衝鹽水；50 mM Tris-Cl、150 mM NaCl，pH 7.6)。 • ELISA 3X方案：關於Biotek ELx 405之洗滌方案選擇CW盤洗滌器。用200 µL洗滌緩衝液洗滌。再重複洗滌兩次。規範：3個週期。無震盪。每孔施配200 µL。施配流動速率設定7 (範圍1-10)。施配高度15.24 mm。水平x施配位置0 mm。水平y施配位置0 mm。抽吸物高度3.48 mm。水平x抽吸物位置1.372 mm。水平抽吸物y位置0.452 mm。抽吸速率3.4 mm/秒。抽吸延遲0毫秒。最終洗滌時之交叉線抽吸。交聯線高度3.048 mm。交叉線水平x位置：-1.829 mm。交叉線水平y位置：-0.457 mm。 程序：
自4℃移除預塗佈及預封閉之96孔盤。用來自盤之0.1% Tween-20傾倒1×PBS pH 7.4 1%BSA及在內襯有紙巾之苯乙烯發泡體墊上有力衝擊該盤。若96孔盤尚未製備，則用96-Well Plates方案之NeutrAvidin Coating製備一者。特定言之，對於一個經NeutrAvidin塗佈之培養盤，自1 mg/mL NeutrAvidin儲備溶液之頂部移除5 µL且將其稀釋至10 mL pH為9.4之1×碳酸鹽緩衝液中。藉由倒置falcon管混合。使用多通道移液管，將100 µL置放於Corning高結合96孔分析盤之各孔中且在4℃下培育96孔盤隔夜。用每孔200 µL洗滌緩衝液洗滌96孔盤，且再重複此步驟兩次。盤應洗滌總共三次。用含每孔200 µL 1% BSA之PBS pH 7.4阻斷該盤且在37℃下培育盤1小時或在4℃下培育隔夜。
在樣品緩衝液中稀釋生物素標記之抗原。最佳捕捉濃度應首先藉由各個別蛋白質之滴定確定。每孔添加50 µl且在室溫下培育1小時。
使用ELISA 3X方案，使用具有洗滌緩衝液的盤洗滌器來洗滌盤。
在樣品緩衝液中稀釋抗體。在1 µg/mL下進行抗體之篩選。在樣品緩衝液中以1 µg/mL製備α-His塗層對照抗體(Maine Biotechnology Services目錄號：MAB230P)。將50 µL經稀釋抗體置放於指定孔上，且在室溫下培育1小時。
使用ELISA 3X方案，使用具有洗滌緩衝液的盤洗滌器來洗滌盤。
稀釋人類二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories Peroxidase。
Affinipure Goat α-人類FCγ Fragment Specific. 目錄號109-035-008) 1:10,000於樣品緩衝液中。對於α-his孔，稀釋小鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories Affinipure Goat α-小鼠FCγ Fragment Specific. 目錄號115-035-008) 1:10,000於樣品緩衝液中。
將50 µL經稀釋抗體置放於指定孔上。在室溫下培育1小時。使用ELISA 3X方案，使用具有洗滌緩衝液的盤洗滌器來洗滌盤。
根據製造商之方案製備SuperSignal ELISA Femto Substrate (Pierce Biotech目錄號15162)操作溶液。對於一個盤將需要10 mL。將100 µL QuantBlu Substrate操作溶液/孔置放。在室溫下培育10分鐘。
在盤讀取器上在325 nm激發及420 nm發射下量測相對螢光單位(RFU)。
結果：
圖 7A 表明SR-AB2僅結合LTBP-前TGFβ1複合物；其不藉由ELISA單獨結合前TGFβ1或LTBP1。圖 7A 表明SR-AB2不藉由ELISA結合GARP-前TGFβ1。
另外，亦在基於細胞之分析中執行SR-AB2抑制LTBP1/3-前TGFβ1之能力。如上文實例2中基本上所描述，LN229細胞接種於經纖維結合蛋白預塗佈之分析孔上且用指定DNA分子直接轉染。圖 7B 描繪SR-AB2抑制LTBP1-前TGFβ1 (人類及小鼠複合物)之整合素活化。圖 7C 描繪SR-AB2抑制LTBP3-前TGFβ1之整合素活化。
證明SR-AB2專一性結合於前TGFβ1:LTBP1及3複合物，而非藉由基本上如上文所描述的ELISA的GARP-TGFβ1或GARP-Lap複合物(參見圖 9 )。
如上文所論述，LTBP1及LTBP3沈積於胞外基質中，而GARP/LRRC32及LRRC33在免疫細胞表面上呈遞潛伏TGFβ1。證明SR-AB2抑制LTBP-前TGFβ1信號傳導，但不影響GARP-前TGFβ1 (圖 10A 及圖 10B )。圖 10A 表明SR-AB2抑制由內源性LTBP1/3呈遞之LTBP-前TGFβ。此分析在LN229細胞中進行，將其接種於預塗佈纖維結合蛋白之孔中且用前TGFβ1直接轉染。圖 10B 表明SR-AB2不抑制GARP-前TGFβ。SR-AB1結合不依賴於呈遞分子之潛伏TGFβ1。此分析在LN229細胞中進行，該等細胞接種在無纖維結合蛋白之分析孔中且用GARP-前TGFβ1直接轉染。
在基於細胞之分析(人類及小鼠，資料未顯示)中，藉由SR-AB2抑制LTBP-前TGFβ1亦顯示於LTBP1呈遞之TGFβ1的αVβ6整合素依賴性活化中。SR-AB2顯示對過度表現LRRC33-前TGFβ1無抑制作用。 實例 5 ： LTBP1- 前 TGFβ1 抗體之 Octet 結合
將500 nM人類LTBP1-前TGFb1複合物與1 µM各測試抗體一起預培育。在隔夜培育之後，測試LTBP1-前TGFβ1+第一抗體與第二抗體之結合，該第二抗體以67 nM固定至抗人類IgG Fc捕獲(AHC)感測器尖端。在看到LTBP1-前TGFβ1+第一抗體之前用陰性對照抗體(HuNeg)阻斷感測器尖端。
複合物與專一性第二抗體之結合標準化為不受抑制之相互作用，亦即在不結合於TGFβ複合物之陰性對照抗體(HuNeg)存在下為複合物。小於70%或小於0.7%之不受抑制之相互作用的標準化反應視為交叉阻斷之抗體。大於1之反應指示兩種抗體同時結合。結果顯示於下文表7中。 表7:
   SR-AB13 SR-AB10 SR-AB2 SR-AB1 第二抗體
SR-AB13 0.47 1.38 1.29 1.08   
SR-AB10 1.27 0.51 1.53 0.82
SR-AB2 1.31 1.54 0.47 1.11
SR-AB1 1.43 0.76 1.38 0.69
HuNeg 1 1 1 1
第一抗體   
如表7中所示，抗體SR-AB13、SR-AB10、SR-AB2及SR-AB1彼此不交叉阻斷，且因此各抗體在人類LTBP1-前TGFβ1之表面上佔用不同抗原決定基。 實例 6 ：活體外結合概況及親和力資料
用於活體外結合分析以測定結合動力學之參數的適合方法包括基於生物層干涉術(BLI)之分析，諸如Octet及基於表面電漿子共振(SPR)之分析，諸如Biacore系統(參見例如http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Biacore_assay_handbook.pdf)。
藉由Octet分析量測SR-AB10、SR-AB2及SR-AB13之親和力。下文概述用於量測抗體對本文所提供之複合物之親和力的方案。 材料： • 96孔黑色聚丙烯盤 • AHC Octet尖端(抗人類IgG Fc捕獲尖端) (FortéBio) • 10×動力學緩衝液(FortéBio) (在PBS中稀釋至1×) • reiner Bio-One 96-Well Half Area Microplates (VWR目錄號82050-044) 程序： 注意：Octet實驗期間各孔內之體積為100 uL。 1000 rpm之震盪速度用於所有分析步驟。 預潤濕提示： • 生物感測器在開始實驗之前必須在1×動力學緩衝液(1×KB)中預潤濕至少10分鐘。此可在Octet內或在實驗台上進行。 負載： • 在裝載之前，尖端在1×KB中基線化1分鐘。 • 使AHC尖端負載有濃度為1 µg/mL (約7 nM)之抗體3分鐘。設定限值，使得當任一感測器達到1奈米之響應時，負載將停止。 • 在裝載之後，尖端在緩衝液中基線化1分鐘。抗體在此時間期間不應與尖端解離。 抗原結合： • 與各種呈遞分子複合之TGFβ1與固定抗體在1×KB中以100 nM之單一濃度結合。 抗體結合： • 在1×KB中進行解離3分鐘。 使用ForteBio資料分析軟體8.2之資料分析： • 處理：對齊Y軸至基線之最後5秒，執行步驟間校正(與解離對齊)，且進行Savitzky-Golay過濾。 • 分析：利用1:1擬合模型。擬合係局部且完整的。(局部指示分別評價各抗體且完整指示考慮到結合及解離兩者)擬合曲線且接著保存報告/導出資料。 結果：
圖 11 呈現LTBP複合物專一性抗體SR-AB10、SR-AB2及SR-AB13之結合概況及親和力資料。值得注意的是，SR-AB13結合與前TGFβ1複合之人類LTBP1及人類LTBP3，而SR-AB2與SR-AB10對與TGFβ1複合之人類LTBP1具有專一性。 實例 7 ： 最佳化 LTBP 複合物專一性抗體之效能改良
選擇LTBP複合物專一性抗體SR-AB10及SR-AB13用於初輪親和力成熟/最佳化(亦即如本文所描述之H1/H2 CDR改組/多樣化)，且使用LN229細胞評定特定後代抗體(SR-AB14及SR-AB15)抑制TGFβ活性之能力。對於圖12A 及 12B 中描繪之分析，使用以下方案，其為實例2中分析II之修改型式。 材料： • MvLu1-CAGA12細胞(純系4A4) • LN229細胞株(高水準之內源性αVβ8整合素) • Costar白壁經TC處理之96孔分析盤#3903 • Greiner Bio-One High Binding白色µ透明96孔分析盤#655094 • 人類纖維結合蛋白(Corning #354008) • P200多通道吸液管 • 各具有無菌過濾嘴之P20、P200及P1000吸液管 • 無菌微量離心管及擱架 • 無菌試劑儲集器 • 0.4%錐蟲藍 • 2mL、5mL、10mL及25mL無菌吸液管 • 經組織培養物處理之100 mm或150 mm盤 • 70%乙醇 • Opti-MEM降低之血清培養基(Life Tech #31985-070) • 脂染胺3000 (Life Tech #L3000015) • Bright-Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E2620) • 0.25%胰蛋白酶+0.53 mM EDTA • 前TGFb1表現質體，人類 • LTBP1S表現質體，人類 儀器： • PerkinElmer EnVision盤讀取器 • TC罩 • 台式離心機 • CO2 培育箱37℃ 5% CO2 • 37℃水/恆溫珠浴箱 • 平台震盪器 • 顯微鏡 • 血球計/countess 定義 • CAGA12 4A4細胞：MvLu1細胞(貂肺臟上皮細胞)之衍生物，其經CAGA12合成啟動子穩定地轉染，驅動螢光素酶基因表現 • DMEM-0.1%BSA：分析培養基；基礎培養基為DMEM (Gibco目錄號11995-065)，培養基亦含有稀釋至0.1% w/v之BSA、青黴素/鏈黴素及4 mM麩醯胺酸 • D10：DMEM 10% FBS、P/S、4 mM麩醯胺酸、1% NEAA、1× GlutaMAX (Gibco目錄號35050061) • CAGA12 (4A4)培養基：D10 + 0.75 ug/mL嘌呤黴素 程序： • 始終在無菌生物安全機櫃中工作，且應始終使用無菌技術。 • 製備所有培養基，將所有材料滅菌，且在起始之前將材料移至生物安全機櫃中。 • 應使生長培養基升溫至37℃。 • 在此分析期間，針對幾乎所有步驟使用反向吸液技術。 • 依賴於前TGFβ1之LTBP呈遞之分析需要用纖維結合蛋白預塗佈分析盤4小時至隔夜，隨後接種細胞以便轉染。
在第-1天，分析盤用纖維結合蛋白塗佈。在超純水(無菌)中製備纖維結合蛋白之1 mg/ml儲備溶液。儲備溶液在PBS中稀釋至19.2 µg/ml工作溶液且將50 µl添加至各孔(3 µg/cm2 )中。在37℃及5% CO2 下培育各盤隔夜。
在第0天，在細胞接種之前，分析盤用纖維結合蛋白塗佈(僅LTBP過度表現分析)。在超純水(無菌)中製備纖維結合蛋白之1 mg/ml儲備溶液。儲備溶液在PBS中稀釋至19.2 µg/ml工作溶液且將50 µl添加至各孔(3 µg/cm2 )中。在37℃及5% CO2 下培育各盤4小時。塗佈後，用多通道吸液管手動洗滌分析盤，以200 µl/孔PBS洗滌2次。在最終洗滌之後，拿掉蓋子，在罩中乾燥各盤。接著用胰蛋白酶分離LN229細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將細胞集結粒再懸浮於D10培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。在分析盤中將細胞稀釋至0.125e6 個細胞/ml且每孔接種100 µl (每孔12,500個細胞)。對於待用於第2天之分析之CAGA12細胞，細胞以每T75燒瓶1.5百萬之密度繼代。在37℃及5% CO2 下培育培養物。
在第1天，轉染LN229細胞。遵循製造商之方案用脂染胺3000試劑轉染。簡言之，將以下各者稀釋至OptiMEM I中，對於每孔5 µl：0.1 µg DNA (前TGFβ1)、視情況選用之0.1 µg LTBP1 DNA、0.4 µl P3000及用OptiMEM I最多5 µl。對於圖 12A ，在無LTBP DNA之情況下單獨轉染0.1 µg 前TGFβ1 (人類) DNA以量測在內源性呈遞分子存在下之活化。對於圖 12B ，將0.1 µg LTBP1 (人類) DNA與前TGFβ1 (人類) DNA共轉染以量測在過度表現LTBP1存在下之活化。
藉由在每孔OptiMEM I中稀釋0.2 µl脂染胺3000，最多在OptiMEM I中稀釋5 µl來製成脂染胺3000的主混合物。將經稀釋之脂染胺3000添加至DNA混合物中，藉由用移液管來充分混合，且在室溫下培育15分鐘。培育之後，將10 µl DNA:脂染胺3000 (2×5 µl)混合物添加至各孔中。各盤返回至組織培養恆溫箱持續約24小時。
在第2天，將指定抗體及TGFβ報導子細胞(CAGA12)添加至各孔中。將抗體連續稀釋於PBS中，隨後進一步稀釋於分析培養基中直至2×最終濃度。藉由抽吸(真空抽吸器)用分析培養基洗滌盤兩次，接著每孔添加100 µl分析培養基。第二次洗滌之後，用每孔50 µl之2×抗體替換分析培養基。使細胞盤返回至培育箱持續約15-20分鐘。用胰蛋白酶分離CAGA12 (純系4A4)細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將集結粒再懸浮於分析培養基中且計數活細胞。將活細胞稀釋至0.3e6 個細胞/ml且每孔接種50 µl (每孔15,000個細胞)。使細胞返回至培育箱。
在第3天，在添加抗體及/或報導子細胞之後約16-20小時讀取分析。在讀取之前，使Bright-Glo試劑及測試盤達至室溫。BioTek Synergy H1上之讀取設置設定成使用TMLC_std方案，此方法具有自動增益設置。設定陽性對照孔以供自動調整(高)。每孔添加100 µL Bright-Glo試劑。在室溫下在震盪下培育2分鐘，保護盤避光。隨後在盤讀取器上偵測發光。 結果：
由此分析產生之資料反映細胞上清液中之TGFβ活性。圖 12A 為顯示如藉由TGFβ活性所量測之SR-AB14 (最佳化SR-AB10)之效能改良的圖式。值得注意的是，SR-AB14活性類似於情境非依賴性抗體SR-AB1。此分析在不過度表現LTBP1之情況下進行且因此量測在內源性呈遞分子存在下之TGFβ之活化。圖 12B 為顯示如藉由TGFβ活性所量測之SR-AB15 (最佳化SR-AB13)之效能改良的圖式。此分析在過度表現之人類LTBP1-前TGFβ1存在下進行。值得注意的是，SR-AB14活性類似於情形非依賴性抗體SR-AB1。
圖12A 及12B 中描繪之分析均在LN229細胞中進行，該等細胞表現低LTBP1 mRNA、高LTBP3 mRNA、不可偵測到之GARP及不可偵測到之LRRC33。 實例 8 ： 在 CDR-H3 突變誘發之後最佳化 LTBP- 前 TGFβ1 專一性抗體之親和力改良
選擇來自第一輪親和力成熟/最佳化(SR-AB14、SR-AB16、SR-AB17、SR-AB18、SR-AB19)之LTBP複合物專一性抗體用於第二輪親和力成熟/最佳化(亦即，如本文所描述之CDR-H3突變誘發)且評定特定後代抗體(SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28及SR-AB29)之結合各種前TGFβ1構築體之能力。基本上如實例6中所描述，藉由Octet針對人類LTBP1-前TGFβ1、人類LTBP3-前TGFb1、小鼠LTBP1-前TGFβ1、小鼠LTBP3-前TGFb1及GARP-前TGFβ1複合物量測最佳化抗體之結合親和力。簡言之，將測試抗體固定至抗人類Fc捕獲生物感測器(AHC) (ForteBio®)之表面且接著以100 nM之單一濃度針對各種TGFβ1複合物測試結合以評定結合親和力。使抗原結合3分鐘，隨後5分鐘解離。在整個實驗中使用動力學緩衝液(ForteBio®)，且使用各抗體抗原對之1:1擬合模型測定KD 。
表8呈現藉由Octet所確定之指定LTBP複合物專一性抗體(IgG1-agly)的結合概況及親和力資料。值得注意的是，最佳化抗體SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28及SR-AB29呈現與前TGFβ1複合之人類LTBP1及人類LTBP3的單一數位nM親和力。另外，抗體均不結合與前TGFβ1複合之人類GARP，表明抗體對LTBP複合物具有專一性。 表8:
Ref 譜系 ForteBio IgG KD Hu LTBP1- 前 TGFβ1 (M) Avid ForteBio IgG KD Hu LTBP3- 前 TGFβ1 (M) Avid ForteBio IgG KD Mo LTBP1- 前 TGFβ1 (M) Avid ForteBio IgG KD Mo LTBP3- 前 TGFβ1 (M) Avid ForteBio IgG KD Hu GARP- 前 TGFβ1 (M) Avid
SR-AB10    P.F. N.B. 1.42E-08 2.30E-08 N.B.
SR-AB16 SR-AB10 3.44E-08 1.69E-08 3.29E-08 2.12E-08 N.B.
SR-AB14 SR-AB10 2.44E-08 1.46E-08 2.04E-08 1.23E-08 N.B.
SR-AB20 SR-AB16 3.93E-09 2.08E-09 6.46E-09 2.23E-09 N.B.
SR-AB21 SR-AB16 6.78E-09 1.08E-09 1.06E-08 3.29E-08 N.B.
SR-AB22 SR-AB14 1.88E-09 P.F. 2.43E-09 1.56E-09 P.F.
SR-AB23 SR-AB14 5.98E-09 1.26E-09 8.38E-09 7.93E-09 N.B.
SR-AB13    3.92E-08 3.59E-08 5.95E-08 N.B. N.B.
SR-AB17 SR-AB13 6.16E-09 5.28E-09 8.83E-09 5.36E-08 N.B.
SR-AB18 SR-AB13 9.27E-09 1.17E-08 1.45E-08 8.66E-08 N.B.
SR-AB19 SR-AB13 1.10E-08 1.64E-08 1.59E-08 8.40E-08 N.B.
SR-AB24 SR-AB17 1.74E-09 1.27E-09 2.07E-09 7.85E-08 N.B.
SR-AB25 SR-AB17 2.37E-09 1.05E-09 2.92E-09 3.88E-08 N.B.
SR-AB26 SR-AB17 2.73E-09 2.13E-09 3.73E-09 1.38E-08 N.B.
SR-AB27 SR-AB18 2.70E-09 2.33E-09 3.89E-09 5.11E-07 N.B.
SR-AB28 SR-AB18 2.84E-09 2.70E-09 4.52E-09 1.25E-08 N.B.
SR-AB29 SR-AB19 4.23E-09 4.08E-09 7.22E-09 7.91E-08 N.B.
P.F.=不佳擬合 N.B.=在此分析之條件下無結合體 實例 9 ： 輕鏈最佳化第 3 週期後最佳化 LTBP- 複合物專一性抗體之親和力改良
選擇來自第二輪親和力成熟/最佳化之LTBP複合物專一性抗體用於第三輪親和力成熟/最佳化(亦即，如本文所描述之輕鏈最佳化)且評定特定後代抗體之結合各種前TGFβ1構築體之能力。
第3週期抗體係藉由在整個輕鏈CDR3中進行突變誘發及對輕鏈CDR1及CDR2進行隨機的預製測序而產生。經由酵母呈現，利用陽性及陰性選擇，隨後測序來鑑別所關注之抗體。
基本上如實例6中所描述，藉由Octet針對人類LTBP1-前TGFβ1、人類LTBP3-前TGFb1、小鼠LTBP1-前TGFb1、小鼠LTBP3-前TGFb1及GARP-前TGFb1複合物量測最佳化抗體之結合親和力。簡言之，將測試抗體固定至抗人類Fc捕獲生物感測器(AHC) (ForteBio®)之表面且接著以100 nM之單一濃度針對各種TGFβ1複合物測試結合以評定結合親和力。使抗原結合3分鐘，隨後5分鐘解離。在整個實驗中使用動力學緩衝液(ForteBio®)，且使用各抗體抗原對之1:1擬合模型測定KD 。
表9呈現藉由Octet所確定，用於自輕鏈最佳化第3週期所鑑別之指定LTBP複合物專一性抗體(IgG1-agly)的結合概況及親和力資料。值得注意的是，若干最佳化抗體呈現與前TGFβ1複合之人類LTBP1及人類LTBP3的單一數位nM親和力。另外，如表10中所示，在相同分析條件下，若干抗體不結合與前TGFβ1複合之人類GARP，表明抗體對LTBP複合物具有專一性。表 9 ： 第 3 週期最佳化抗體之結合概況及親和力資料 (N.B.=在此分析之條件下無結合體)
Ref 最佳化 譜系 ForteBio IgG KD Hu LTBP1- 前 TGFβ1 (M) Avid Hu LTBP1- 前 TGFβ1 Kon (1/Ms) Hu LTBP1- 前 TGFβ1 Koff (1/s) Fortebio IgG KD Hu LTBP3- 前 TGFβ1 (M) Avid Hu LTBP3- 前 TGFβ1 Kon (1/Ms) Hu LTBP3- 前 TGFβ1 Koff (1/s) ForteBio IgG KD Mo LTBP1- 前 TGFβ1 (M) Avid ForteBio IgG KD Mo LTBP3- 前 TGFβ1 (M) Avid ForteBio IgG KD Hu GARP- 前 TGFβ1 (M) Avid
SR-AB30 SR-AB22 2.17E-10 2.77E+05 6.00E-05 1.56E-10 3.85E+05 6.00E-05 4.38E-10 4.21E-10 1.09E-08
SR-AB31 SR-AB22 4.12E-10 2.40E+05 9.89E-05 2.21E-10 3.08E+05 6.81E-05 6.82E-10 5.89E-10 1.12E-08
SR-AB32 SR-AB22 3.22E-10 2.83E+05 9.14E-05 1.49E-10 4.02E+05 6.00E-05 4.85E-10 4.18E-10 1.09E-08
SR-AB33 SR-AB22 5.61E-10 3.02E+05 1.69E-04 2.72E-10 4.45E+05 1.21E-04 8.67E-10 4.78E-10 1.61E-08
SR-AB34 SR-AB22 2.31E-10 2.59E+05 6.00E-05 1.79E-10 3.72E+05 6.68E-05 4.17E-10 4.50E-10 7.35E-08
SR-AB35 SR-AB22 3.15E-10 3.42E+05 1.08E-04 1.41E-10 4.85E+05 6.85E-05 3.89E-10 3.98E-10 6.66E-09
SR-AB36 SR-AB22 2.54E-10 2.89E+05 7.34E-05 1.46E-10 4.10E+05 6.00E-05 3.35E-10 4.29E-10 9.55E-09
SR-AB37 SR-AB22 3.28E-10 3.60E+05 1.18E-04 1.39E-10 5.45E+05 7.58E-05 3.84E-10 3.25E-10 3.61E-08
SR-AB38 SR-AB22 3.57E-10 3.27E+05 1.17E-04 1.45E-10 5.02E+05 7.26E-05 3.91E-10 3.31E-10 8.42E-09
SR-AB39 SR-AB22 2.05E-10 2.92E+05 6.00E-05 1.36E-10 4.41E+05 6.00E-05 2.32E-10 3.42E-10 3.89E-07
SR-AB40 SR-AB23 4.01E-10 1.50E+05 6.00E-05 3.33E-10 1.82E+05 6.07E-05 1.08E-09 1.16E-09 N.B.
SR-AB41 SR-AB23 2.96E-10 2.03E+05 6.00E-05 2.35E-10 2.55E+05 6.00E-05 4.04E-10 7.17E-10 7.64E-07
SR-AB42 SR-AB23 3.89E-10 1.54E+05 6.00E-05 2.59E-10 2.32E+05 6.00E-05 3.59E-10 1.05E-09 N.B.
SR-AB43 SR-AB23 6.49E-10 2.44E+05 1.59E-04 1.78E-10 3.37E+05 6.00E-05 7.31E-10 8.91E-10 N.B.
SR-AB44 SR-AB23 2.14E-10 2.80E+05 6.00E-05 1.46E-10 4.10E+05 6.00E-05 2.10E-10 4.07E-10 2.12E-07
SR-AB45 SR-AB23 1.93E-10 3.10E+05 6.00E-05 1.22E-10 4.91E+05 6.00E-05 1.93E-10 2.69E-10 1.95E-07
SR-AB62 SR-AB24 4.86E-10 1.40E+05 6.82E-05 3.68E-10 2.03E+05 7.47E-05 6.09E-10 3.37E-09 N.B.
SR-AB63 SR-AB26 6.11E-10 1.18E+05 7.24E-05 4.94E-10 1.59E+05 7.84E-05 1.09E-09 2.00E-09 N.B.
SR-AB64 SR-AB26 4.67E-10       4.71E-10 1.95E+05 9.18E-05 1.03E-09 2.85E-09 N.B.
人類IgG1同型對照物 N.A. N.B.       N.B.       N.B. N.B. N.B.
表 10:
Ref VHCDR3 譜系 ForteBio IgG KD Hu GARP- 前 TGFβ1 於溶液中 (M) Avid
SR-AB30 SR-AB10 1.09E-08
SR-AB31 SR-AB10 1.12E-08
SR-AB32 SR-AB10 1.09E-08
SR-AB33 SR-AB10 1.61E-08
SR-AB34 SR-AB10 7.35E-08
SR-AB35 SR-AB10 6.66E-09
SR-AB36 SR-AB10 9.55E-09
SR-AB37 SR-AB10 3.61E-08
SR-AB38 SR-AB10 8.42E-09
SR-AB39 SR-AB10 3.89E-07
SR-AB40 SR-AB10 N.B.
SR-AB41 SR-AB10 7.63909E-07
SR-AB42 SR-AB10 N.B.
SR-AB43 SR-AB10 N.B.
SR-AB44 SR-AB10 2.1153E-07
SR-AB45 SR-AB10 1.95124E-07
SR-AB62 SR-AB13 N.B.
SR-AB63 SR-AB13 N.B.
SR-AB64 SR-AB13 N.B.
人類IgG1 同型對照物 N.A. N.B.
N.B.=在此分析之條件下無結合體
圖 15 顯示親和力成熟抗體顯示與LTBP-前TGFβ1複合物之專一性結合。在200 nM、100 nM、50 nM及25 nM人類GARP 前TGFb1及人類LTBP1 前TGFb1下進行此實驗。圖 15 顯示200 nM值，其中0.1 nm截止值用於確定什麼為或什麼不為有意義的結合。如圖 15 中所顯示，對於一些抗體，與GARP-前TGFβ1之結合僅在極高濃度(200 nM)下為有意義的，且一些抗體甚至在高濃度下仍未顯示與GARP-前TGFβ1之結合。基於表面電漿子共振 (SPR) 之分析
採用Biacore 8K系統測定測試抗體之抗原結合的單價結合親和力及動力學參數。量測Fab片段SR-AB42-HuFab、SR-AB63-HuFab及SR-AB43-HuFab與抗原複合物之結合及解離動力學，且所得ka、Kd及KD 提供於下文中。簡言之，使用Biacore 8K (GE Healthcare)藉由表面電漿子共振評估結合動力學。將生物素標記之捕獲抗原固定至晶片(10 nM，約200 RU負載量)。Biotin CAPture感測器晶片用於捕獲生物素標記之抗原。將10、5、2.5、1.25及0.6 nM濃度下之Fab注射於所捕獲之抗原上。使用0 nM作為參考。使用較高濃度之Fab (100、50、25、12.5、6.25 nM)證實LTBP抗體對GARP及LRRC33之親和力。使用0 nM作為參考。採用多週期動力學，其中各分析物濃縮物在單獨循環中注射且感測器晶片表面在各週期之後再生。所有分析均在新鮮製備之1×HBS-EP+緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween20，pH 7.4)中進行。將資料總體擬合於1:1結合模型以獲得動力學參數。使用0 nM分析物濃縮物之感測器圖譜作為參考。
結果顯示於下表11-15中。圖 23 及圖 24 分別顯示SR-AB63及SR-AB42人類Fab顯示新穎抗體對huLTBP1 前TGFβ1及huLTBP3 前TGFβ1之情形選擇性結合。表 11
   huLTBP1 前TGFβ1   
   ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
SR-AB42-HuFab* 5.43E+05 1.05E-04 1.94E-10
SR-AB63-HuFab** 3.71E+05 3.82E-08 1.03E-13
SR-AB43-HuFab 1.03E+06 2.84E-04 2.76E-10
SR-AB46-HuFab 2.47E+06 1.10E-04 4.44E-11
SR-AB47-HuFab 1.84E+06 1.36E-04 7.40E-11
SR-AB48-HuFab 1.76E+06 1.04E-04 5.93E-11
SR-AB49-HuFab 8.09E+05 1.38E-04 1.70E-10
SR-AB50-HuFab 3.31E+06 1.82E-04 5.50E-11
SR-AB51-HuFab 2.55E+06 1.50E-04 5.89E-11
SR-AB52-HuFab 2.50E+06 9.91E-05 3.96E-11
SR-AB53-HuFab 1.82E+06 1.28E-04 7.07E-11
SR-AB54-HuFab 1.80E+06 8.83E-05 4.91E-11
SR-AB55-HuFab 8.62E+05 1.13E-04 1.31E-10
SR-AB56-HuFab 2.58E+06 1.26E-04 4.89E-11
SR-AB57-HuFab 1.35E+06 1.81E-04 1.33E-10
SR-AB58-HuFab 3.11E+06 1.62E-04 5.21E-11
SR-AB59-HuFab 2.55E+06 1.30E-04 5.09E-11
SR-AB60-HuFab 2.35E+06 1.20E-04 5.10E-11
SR-AB61-HuFab 1.17E+06 1.55E-04 1.32E-10
*五次重複實驗之平均值 **四次重複實驗之平均值表 12
   huLTBP3 前TGFb1   
   ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
SR-AB42-HuFab 4.05E+05 1.42E-04 3.50E-10
SR-AB63-HuFab 3.94E+05 4.99E-05 1.27E-10
表 13
   huGARP 前TGFb1   
   ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
SR-AB42-HuFab 1.55E+05 6.04E-03 3.89E-08
SR-AB63-HuFab 2.66E+03 9.30E-04 3.49E-07
表 14
   huLRRC33 前TGFb1   
   ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
SR-AB42-HuFab 8.09E+04 3.53E-03 4.36E-08
SR-AB63-HuFab 5.00E+03 1.08E-03 2.16E-07
表 15
   鼠類LTBP3 前TGFb1   
   ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
SR-AB42-HuFab* 1.23E+08 3.97E-01 2.66E-09
SR-AB43-HuFab* 1.82E+09 6.37E+00 4.43E-09
*兩次重複實驗之平均值 實例 10 ： 在 CDR-H3 突變誘發之後最佳化 LTBP 複合物專一性抗體之效能改良
選擇來自第一輪親和力成熟/最佳化(亦即，SR-AB14、SR-AB16、SR-AB17、SR-AB18、SR-AB19)之LTBP複合物專一性抗體用於第二輪親和力成熟/最佳化(亦即，如本文所描述之CDR-H3突變誘發)且評定特定後代抗體(SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28及SR-AB29)之使用LN229細胞抑制TGFβ活性之能力。對於圖13A 、 13B 、 14A 及14B 中描繪之分析，使用以下方案，其為實例2中分析II之修改型式。 材料： • MvLu1-CAGA12細胞(純系4A4) • LN229細胞株(高水準之內源性αVβ8整合素) • Costar白壁經TC處理之96孔分析盤#3903 • Greiner Bio-One High Binding白色uclear 96孔分析盤#655094 • 人類纖維結合蛋白(Corning #354008) • P200多通道吸液管 • 各具有無菌過濾嘴之P20、P200及P1000吸液管 • 無菌微量離心管及擱架 • 無菌試劑儲集器 • 0.4%錐蟲藍 • 2 mL、5 mL、10 mL及25 mL無菌吸液管 • 經組織培養物處理之100 mm或150 mm盤 • 70%乙醇 • Opti-MEM降低之血清培養基(Life Tech #31985-070) • 脂染胺3000 (Life Tech #L3000015) • Bright-Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E2620) • 0.25%胰蛋白酶+0.53 mM EDTA • 前TGFb1表現質體，人類 • 前TGFb1表現質體，小鼠 • LTBP1S表現質體，小鼠 儀器： • PerkinElmer EnVision盤讀取器 • TC罩 • 台式離心機 • CO2 培育箱37℃ 5% CO2 • 37℃水/恆溫珠浴箱 • 平台震盪器 • 顯微鏡 • 血球計/countess 定義： • CAGA12 4A4細胞：MvLu1細胞(貂肺臟上皮細胞)之衍生物，其經CAGA12合成啟動子穩定地轉染，驅動螢光素酶基因表現 • DMEM-0.1%BSA：分析培養基；基礎培養基為DMEM (Gibco目錄號11995-065)，培養基亦含有稀釋至0.1% w/v之BSA、青黴素/鏈黴素及4 mM麩醯胺酸 • D10：DMEM 10% FBS、P/S、4 mM麩醯胺酸、1% NEAA、1× GlutaMAX (Gibco 目錄號35050061) • CAGA12 (4A4)培養基：D10 + 0.75 ug/mL嘌呤黴素 程序： • 始終在無菌生物安全機櫃中工作，且應始終使用無菌技術。 • 製備所有培養基，將所有材料滅菌，且在起始之前將材料移至生物安全機櫃中。應使生長培養基升溫至37℃。 • 在此分析期間，針對幾乎所有步驟使用反向吸液技術。
在第0天，在細胞接種之前，分析盤用纖維結合蛋白塗佈(僅LTBP過度表現分析)。在超純水(無菌)中製備纖維結合蛋白之1 mg/ml儲備溶液。儲備溶液在PBS中稀釋至19.2 ug/ml工作溶液且將50 µl添加至各孔(3 ug/cm2 )中。在37℃及5% CO2 下培育各盤4小時。塗佈後，用多通道吸液管手動洗滌分析盤，以200 ul/孔PBS洗滌2次。在最終洗滌之後，拿掉蓋子，在罩中乾燥各盤。接著用胰蛋白酶分離LN229細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將細胞集結粒再懸浮於D10培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。在分析盤中將細胞稀釋至0.125e6 個細胞/ml且每孔接種100 µl (每孔12,500個細胞)。對於待用於第2天之分析之CAGA12細胞，細胞以每T75燒瓶1.5百萬之密度繼代。在37℃及5% CO2 下培育培養物。
在第1天，轉染LN229細胞。遵循製造商之方案用脂染胺3000試劑轉染。簡言之，將以下各者稀釋至OptiMEM I中，對於每孔5 µl：0.1 µg 前TGFβ1 DNA以及0.1 µg呈遞分子DNA，及0.4 µl P3000及用OptiMEM I達至5 µl。對於圖 13A 及圖 14A ，在無LTBP DNA之情況下用0.1 ug空載體轉染0.1 µg人類前TGFβ1 DNA以量測在內源性呈遞分子存在下之活化。對於圖 13B 及圖 14B ，將0.1 µg小鼠LTBP1 DNA與小鼠前TGFβ1 DNA共轉染以量測在過度表現LTBP1存在下之活化。
藉由在OptiMEM I中稀釋0.2 µl脂染胺3000，在OptiMEM I中稀釋至多5 µl來製成脂染胺3000之主混合物。將經稀釋之脂染胺3000添加至DNA混合物中，藉由用移液管來充分混合，且在室溫下培育15分鐘。在培育之後，將10 µl之DNA:脂染胺3000 (2×5 µl)混合物添加至各孔中。各盤返回至組織培養恆溫箱持續約24小時。
在第2天，將指定抗體及TGFβ報導子細胞(CAGA12)添加至各孔中。將抗體連續稀釋於PBS中，隨後進一步稀釋於分析培養基中直至2×最終濃度。藉由抽吸(真空抽吸器)用分析培養基洗滌盤兩次，接著每孔添加100 µl分析培養基。第二次洗滌之後，用每孔50 µl之2×抗體替換分析培養基。使細胞盤返回至培育箱持續約15-20分鐘。用胰蛋白酶分離CAGA12 (純系4A4)細胞且球粒化(在200×g下旋轉5分鐘)。將集結粒再懸浮於分析培養基中且計數活細胞。將活細胞稀釋至0.3e6 個細胞/ml且每孔接種50 µl (每孔15,000個細胞)。使細胞返回至培育箱。
在第3天，在添加抗體及/或報導子細胞之後約16-20小時讀取分析。在讀取之前，使Bright-Glo試劑及測試盤達至室溫。每孔添加100 µL Bright-Glo試劑。在室溫下在震盪下培育2分鐘，保護盤避光。隨後在盤讀取器上偵測發光。 結果：
由此分析產生之資料反映細胞上清液中之TGFβ活性。圖13A 及 13B 為顯示如藉由TGFβ活性所量測之抗體SR-AB-20、SR-AB-21、SR-AB-22及SR-AB-23 (SR-AB-10家族抗體)之效能改良的圖式。圖 13A 分析在不過度表現LTBP1之情況下進行且因此量測在內源性呈遞分子存在下之TGFβ之活化。圖 13B 分析在過度表現鼠類LTBP1-前TGFβ1之情況下進行。值得注意的是，在兩種分析中，抗體SR-AB22及SR-AB23顯示類似於(或大於)情形非依賴性抗體SR-AB1之活性。
圖 14A 及 14B 為顯示如藉由TGFβ活性所量測之抗體SR-AB-24、SR-AB-25、SR-AB-26、SR-AB-27、SR-AB-28及SR-AB-29 (SR-AB-13家族抗體)之效能改良的圖式。圖 14A 分析在不過度表現LTBP1之情況下進行且因此量測在內源性呈遞分子存在下之TGFβ之活化。圖 14B 分析在過度表現鼠類LTBP1-前TGFβ1之情況下進行。值得注意地，最佳化抗體在LTBP1-前TGFβ1過度表現細胞分析中顯示大於情形非依賴性抗體SR-AB1之活性(圖 14B )。
圖 13A 、圖 13B 、圖 14A 及圖 14B 中描繪之分析均在LN229細胞中進行，其表現低LTBP1 mRNA、高LTBP3 mRNA、不可偵測到之GARP及不可偵測到之LRRC33。 實例 11 ：在輕鏈突變誘發後最佳化 LTBP 複合物專一性抗體之效能改良
使用LN229細胞評定來自第三輪及第四輪親和力成熟/最佳化之LTBP複合物專一性抗體抑制TGFβ活性之能力。使用實例10中所描述之方案進行分析。
為計算抑制效能(IC50 )值，針對僅用PBS (媒劑)處理之孔標準化原始發光值。使用PRISM®軟體標繪標準化值，且使用3點非線性回歸計算各值。下表顯示兩種不同分析形式之同功型專一性抗體之IC50 值(nM)：內源性人類LTBP (hLTBP)分析及小鼠LTBP分析(mLTBP)。在兩種分析形式中測定4種不同抗體譜系之IC50 值：表16-19中所示之SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24及SR-AB26。表 16 ： SR-AB22 譜系
   內源性 hLTBP 分析          mLTBP1 分析
Ref Ab 0.7682    SR-AB36 ( 第 3 週期 ) 0.3
SR-AB34 (第3週期) 0.9088    SR-AB30 (第3週期) 0.4038
SR-AB39 (第3週期) 1.015    SR-AB34 (第3週期) 0.4231
SR-AB36 ( 第 3 週期 ) 1.153    SR-AB35 (第3週期) 0.4298
SR-AB31 ( 第 3 週期 ) 1.261    SR-AB31 ( 第 3 週期 ) 0.4313
SR-AB35 (第3週期) 1.343    SR-AB33 (第3週期) 0.4491
SR-AB30 (第3週期) 1.344    SR-AB32 (第3週期) 0.4744
SR-AB31 (第3週期) 1.563    SR-AB39 (第3週期) 0.4786
SR-AB37 (第3週期) 1.93    SR-AB37 (第3週期) 0.5426
SR-AB32 (第3週期) 2.223    SR-AB22 (第2週期) 1.394
SR-AB10 (親本) 3.64    Ref Ab 1.571
SR-AB1 4.446    SR-AB1 6.381
SR-AB22 (第2週期) 4.618    SR-AB14 (第1週期) 12.59
SR-AB14 (第1週期) 51.65    SR-AB10 (親本) 118.9
表 17 ： SR-AB23 譜系
   內源性 hLTBP       mLTBP1
Ref Ab 0.7682    SR-AB45 ( 第 3 週期 ) 0.2638
SR-AB42( 第 3 週期 ) 1.434    SR-AB42( 第 3 週期 ) 0.2708
SR-AB44 (第3週期) 1.515    SR-AB44 (第3週期) 0.3001
SR-AB41 ( 第 3 週期 ) 1.542    SR-AB43 ( 第 3 週期 ) 0.3189
SR-AB43 ( 第 3 週期 ) 1.756    SR-AB40 ( 第 3 週期 ) 0.333
SR-AB40 ( 第 3 週期 ) 2.105    SR-AB41 ( 第 3 週期 ) 0.4086
SR-AB45 ( 第 3 週期 ) 2.247    SR-AB23 (第2週期) 0.9458
SR-AB10 (親本) 3.64    Ref Ab 1.571
SR-AB1 4.446    SR-AB1 6.381
SR-AB23 (第2週期) 6.043    SR-AB14 (第1週期) 12.59
SR-AB14 (第1週期) 51.65    SR-AB10 (親本) 118.9
表 18 ： SR-AB24 譜系
   內源性 hLTBP          mLTBP1
Ref Ab 0.7682    SR-AB62 ( 第 3 週期 ) 0.3861
SR-AB1 4.446    SR-AB24 (第2週期) 1.313
SR-AB13 (親本) 4.825    Ref Ab 1.571
SR-AB62 ( 第 3 週期 ) 8.683    SR-AB17 (第1週期) 4.038
SR-AB24 (第2週期) 9.599    SR-AB1 6.381
SR-AB17 (第1週期) 24.14    SR-AB13 (親本) 25.44
表 19 ： SR-AB26 譜系
   內源性 hLTBP       mLTBP1
SR-AB1 0.7682    SR-AB63 ( 第 3 週期 ) 0.2075
SR-AB63 ( 第 3 週期 ) 1.777    SR-AB64 ( 第 3 週期 ) 0.2683
SR-AB64 ( 第 3 週期 ) 3.12    SR-AB26 (第2週期) 1.172
SR-AB1 4.446    Ref Ab 1.571
SR-AB13 (親本) 4.825    SR-AB17 (第1週期) 4.038
SR-AB26 (第2週期) 8.742    SR-AB1 6.381
SR-AB17 (第1週期) 24.14    SR-AB13 (親本) 25.44
由此分析產生之資料反映細胞上清液中之TGFβ活性。如圖 16 中所顯示，LTBP複合物專一性抗體之功能活性(效能)在親和力成熟之各週期中得以改良。如圖 16 中所顯示，自各親和力成熟週期之改良產生超過情形非依賴性參考抗體(Ref Ab) (一種潛伏TGFβ1之有效情形非依賴性抑制劑)之活性。上文所描述之分析均在用鼠類LTBP1及鼠類前TGFβ1短暫轉染之LN229細胞中進行。
對於表20中所示之結果，使用實例10中所描述之方案進行分析，但在此分析中利用Fab。表 20
抗體 IC50 ， nM
RefAb (hIgG4) 0.7676
RefAb (Fab) 3.607
SR-AB47 Fab 0.1861
SR-AB59 Fab 0.1947
SR-Ab56 Fab 0.4393
SR-AB52 Fab 0.4589
SR-AB61 Fab 0.4699
SR-AB41 Fab 0.4861
SR-AB46 Fab 0.4946
SR-AB48 Fab 0.5233
SR-AB51 Fab 0.5354
SR-AB55 Fab 0.5363
SR-AB42 Fab 0.6675
SR-AB60 Fab 0.742
SR-AB57 Fab 0.7754
SR-AB49 Fab 1.024
SR-AB43 Fab 1.077
SR-AB53 Fab 1.181
SR-AB58 Fab 4.856
SR-AB54 Fab 5.87
SR-AB23 Fab 8.533
SR-AB50 Fab 10.97
實例 12 ：可開發性
展現有利生物物理特性之抗體之可開發成功率增加。評定來自第三輪及第四輪親和力成熟/最佳化之LTBP複合物專一性抗體的聚集傾向及多專一性。圖 17 顯示酶聯免疫吸附分析(ELISA)之結果，其顯示SR-AB與桿狀病毒(BV)粒子之結合。圖 18 顯示親和力捕獲自我相互作用奈米粒子光譜分析(AC-SINS)分析之結果。此分析測試抗體本身相互作用之可能性。其使用塗佈有抗Fc抗體之金奈米粒子。當添加抗體之稀釋溶液時，其快速固定於經Fc塗佈之金珠粒上。若此等抗體隨後彼此相互作用，則其產生較短原子間距離及可藉由光譜分析偵測之電漿子波長增加。
此等結果顯示，如藉由在AC-SINS分析中小於5 nM之電漿位移及小於陰性對照物5倍之BV ELISA信號所證明，候選抗體表明有利的可開發性特性。 實例 13 ： 小鼠 NASH 之膽鹼缺乏高脂飲食 (CDHFD) 模型中藉由 LTBP 複合物專一性抗體抑制 TGFβ 信號傳導
膽鹼缺乏高脂飲食(CDHFD)為非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)之現有飲食誘發之模型。在此模型中，向雄性C57BL/6J小鼠饋入膽鹼缺乏(0.1%甲硫胺酸)高脂飲食持續12週。在CDHFD開始三週至六週之後，可經由α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白之表現增加、肝星形細胞活化之標記物及反映膠原蛋白合成及沈積增加之組織羥脯胺酸含量升高來偵測促纖維化過程之活化(Matsumoto等人,Int J Exp Pathol . 2013 Apr;94(2):93-103)。
測試LTBP複合物專一性抗體之抑制及/或降低如下CDHFD模型中小鼠中之肝纖維化程度的能力。研究之概述顯示於下表21中。表 21
  群組   飲食   譜系   Ab (mIgG1) 劑量 (mg/kg)   頻率 記錄   N
1 常規Chow    NA NA NA 4週 5
2 CDAA/HFD    NA NA NA 4週 8
3 常規 Chow    HuNeg 15 每週2x 12週 5
4 CDAA/HFD    HuNeg 15 每週2x 12週 10
3 CDAA/HFD    Ref Ab 15 每週2x 12週 10
4 CDAA/HFD SR-AB23 SR-AB42 15 每週2x 12週 10
5 CDAA/HFD SR-AB22 SR-AB31 15 每週2x 12週 10
在研究持續期間使測試組中之動物處於CDHFD中。向小鼠之一單獨組(群組1)投與普通飲食作為研究對照。抗體SR-AB42及SR-AB31在CDHFD開始後4週藉由腹膜內(i.p.)注射投與小鼠。以抗體測試濃度15 mg/kg一週兩次(亦即，30 mg/kg/週)給藥動物，持續8週之測試持續時間(亦即4至12週)。小鼠IgG1同型抗體用作每週兩次15 mg/kg (亦即，30 mg/kg/週)之陰性對照物。由於Ref Ab為TGFβ1之有效情形非依賴性抑制劑，因此Ref Ab用作參考抗體。在給藥8週之後，處死動物且收集肝臟用於分析。端點讀數為羥脯胺酸含量。CDHFD 肝纖維化模型中之羥脯胺酸含量
藉由胺基酸脯胺酸之羥基化產生之羥脯胺酸為原纖維膠原蛋白之主要組分之標誌胺基酸，且包含約13.5%之蛋白質。羥脯胺酸充當纖維化之嚴重程度之重要診斷指示物。饋入CDHFD之動物顯示肝臟組織中之羥脯胺酸(HYP)增加。如圖 19 中所顯示，用SR-AB42及SR-AB31處理抑制對CDHFD之動物中肝臟組織中之HYP (µg/mg組織)增加。 實例 14 ： 在 阿爾波特 症候群之基因模型中藉由 LTBP 複合物專一性抗體抑制 TGFβ 信號傳導
鼠類Col4a3-/-模型為現有常染色體隱性阿爾波特症候群之基因模型。阿爾波特小鼠缺乏功能性膠原蛋白4A3基因(Col4A3-/-)，且因此無法形成正常IV型膠原蛋白三聚體，該等三聚體需要α3、α4及α5鏈。Col4a3-/-小鼠在腎臟中患上與人類患者中之腎纖維化相一致之纖維化，包括間質纖維化及腎小管萎縮，且Col4a3-/-小鼠在8及30週齡之間患上末期腎病(ESRD)，其視小鼠之遺傳背景而定。Col4a3-/-小鼠中之腎臟病理學的結構性及功能性表現結合進展至ESRD使得Col4a3-/-小鼠成為理解腎臟纖維化之理想模型。先前報告指出TGFβ信號傳導路徑在此過程中之重要性，且已報導用αVβ6整合素之抑制劑，一種已知TGFβ1及TGFβ3活化劑或用TGFβ配位體捕獲劑進行之處理會預防阿爾波特小鼠中出現腎臟纖維化及發炎(Hahm等人 (2007) The American Journal of Pathology, 170(1): 110-125)。
測試LTBP複合物專一性抗體之抑制及/或減少阿爾波特小鼠中之腎臟纖維化的能力如下。研究之概述顯示於下表22中。表 22
  群組   基因型   Ab (hIgG4)   劑量 (mg/kg)   頻率   N
1 Het HuNeg 30 1 6
2 KO HuNeg 30 1 10
3 KO Ref Ab 30 1 10
4 KO SR-AB42 30 1 10
5 KO SR-AB63 30 1 10
將來自與C57/BL6基因背景下之Col4a3+/-雌性雜交的129/Sv基因背景下之Col4a3+/-雄性的F1後代用於研究。此等小鼠達4-5週齡時通常會展現蛋白尿，且達13-15週齡時通常進展至ESRD，提供用於測試處理之功效之良好治療窗。在動物處死及腎臟收集前48小時，向11週齡Col4a3-/-小鼠腹膜內(i.p.)給藥30 mg/kg SR-AB42及SRR-AB63。由於Ref Ab為TGFβ1活化之有效情形非依賴性抑制劑，因此Ref Ab用作參考抗體。阿爾波特 腎臟模型中之 pSMAD 分析
已充分證明，TGFβ受體活化會產生胞內事件(包括Smad2/3之磷酸化)之下游信號級聯。因此，如藉由ELISA (細胞信號傳導技術)根據製造商的說明書所分析，藉由量測Smad2/3之相對磷酸化水準，在腎臟溶解物樣品中評定SR-AB42及SR-AB63治療抑制TGFβ信號傳導之能力。圖 20A 為顯示阿爾波特小鼠模型中磷酸化對比總(磷酸化及無磷酸化) Smad2/3 (pSMAD2/3:tSMAD2/3)之相對比率的圖式。圖 20B 為顯示如藉由ELISA所測定之磷酸化SMAD2/3 (pSMAD2/3)之量的圖式，且圖 20C 為顯示如藉由ELISA所測定之總SMAD2/2 (tSMAD2/3)蛋白之量的圖式。如藉由圖 20B 及圖 20C 所示，pSMAD之減少促成圖 20A 中所示之比率的變化。單次劑量之SR-AB42或SR-AB63足以顯著抑制整個腎臟溶解物中之pSmad2/3信號傳導，證實藉由SR-AB42及SR-AB63之有效目標接合且阿爾波特模型中之LTBP複合物專一性抑制降低pSmad水準。 實例 15. 測定 前 TGB1 C4S 結合
使用經改質之前TGFβ1複合物(前TGFβ1 C4S) (其中前結構域之位置4處的半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代(描述於WO 2014/182676中))來藉由Octet評定抗體與C4S抗原之結合。使第2週期抗體固定且針對3種抗原進行測試。如下表中所示，觀測到與LTBP-1 前TGFβ1抗原(表23)及前TGFβ1C4S抗原之穩固抗體結合(表24)，同時未觀測到與LRRC33 前TGFβ1抗原之結合(表25)。表 23 ： 與人類 LTBP-1 前 TGFb1 之結合
樣品ID 裝載樣品ID 響應(nm)
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB14 0.3197
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB20 0.4132
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB21 0.3196
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB22 0.4317
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB23 0.3449
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB17 0.3036
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB24 0.3796
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB25 0.3085
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB26 0.2953
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB27 0.3717
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB28 0.4046
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB29 0.3242
人類LTBP-1 前TGFb1 HuNeg -0.0007
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB16 0.2594
人類LTBP-1 前TGFb1 SR-AB1 0.4311
表 24 ： 與人類 TGFb1 C4S 之結合
   樣品ID 裝載樣品ID    響應(nm)
人類TGFb1 C4S SR-AB14 0.2002
人類TGFb1 C4S SR-AB20 0.2891
人類TGFb1 C4S SR-AB21 0.1812
人類TGFb1 C4S SR-AB22 0.2937
人類TGFb1 C4S SR-AB23 0.2263
人類TGFb1 C4S SR-AB17 0.2835
人類TGFb1 C4S SR-AB24 0.3846
人類TGFb1 C4S SR-AB25 0.329
人類TGFb1 C4S SR-AB26 0.3764
人類TGFb1 C4S SR-AB27 0.3814
人類TGFb1 C4S SR-AB28 0.3605
人類TGFb1 C4S SR-AB29 0.3334
人類TGFb1 C4S HuNeg 0.001
人類TGFb1 C4S SR-AB16 0.1454
人類TGFb1 C4S SR-AB1 0.3604
表 25 ： 與人類 LRRC33 前 TGFb1 之結合
樣品ID 裝載樣品ID 響應(nm)
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB14 0.03
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB20 0.0894
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB21 0.0141
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB22 0.1329
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB23 0.0233
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB17 0.0043
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB24 0.0394
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB25 0.024
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB26 0.0208
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB27 0.0317
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB28 0.037
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB29 0.0288
人類LRRC33 前TGFb1 HuNeg 0.0023
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB16 0.0161
人類LRRC33 前TGFb1 SR-AB1 0.4006
實例 16. 第 3 週期前導抗體在 TGF β 3 分析中未顯示抑制
圖 21 為顯示在LTBP-TGFβ3分析中前導第3週期抗體未顯示抑制的圖式。類似於實例10中之分析進行TGFβ3分析，但前TGFβ3而非前TGFβ1經轉染。無LTBP構築體經轉染，因為此分析依賴於LN229細胞株中之內源性呈遞分子。 實例 17 ： 在肝纖維化模型中 TGF β 3 選擇性活化抑制劑之促纖維化作用
肝臟表現TGFβ1及TGFβ3兩者。為研究兩種同功型在CDHFD模型中之抑制是否將進一步緩和肝之纖維化，用有效TGFβ1選擇性活化抑制劑(其在人類LTBP1及LTBP3複合物之情形下抑制TGFβ1之活化)及TGFβ3選擇性活化抑制劑(單獨或組合)處理CDHFD小鼠。在用TGFβ3抑制劑處理之小鼠中，觀測到疾病之加重，如藉由PSR分析及額外組織病理學分析所證明(圖 22 )。在12週(例如研究結束)，接受TGFβ1選擇性活化抑制劑之動物與經IgG處理之動物(陰性對照物)相比顯示顯著較少的纖維化。相比之下，用TGFβ3選擇性抑制劑處理之動物顯示顯著更多的具有約12% PSR陽性面積之纖維化。接受TGFβ3選擇性抑制劑與TGFβ1選擇性抑制劑之組合的動物顯示纖維化之中間水準，表明TGFβ1選擇性活化抑制劑之抗纖維化作用由TGFβ3抑制緩和。 實例 18 ： 在輕鏈最佳化第 4 週期後的最佳化 LTBP 複合物專一性抗體之親和力改良
選擇來自第三輪親和力成熟/最佳化的LTBP複合物專一性抗體用於第四親和力成熟/最佳化(亦即如本文所描述之輕鏈最佳化)且評定特定後代抗體之結合各種前TGFβ1構築體之能力。 材料： • 96孔盤- Greinerbio-one REF 650101 • Microplate Foils-GE Healthcare - 目錄號28-9758-16 • Biotin CAPture Kit GE Healthcare產品編號28920233 • Biacore操作緩衝液-以20×溶液形式提供，在Milli-Q水中稀釋，TEKnova目錄號H8022 方法：
使用方法「使用Biotin CAPture套組之多週期動力學/親和力」，使用Biacore 8K進行此等實驗。
資料收集速率設定成10 Hz且Biotin CAPture步驟在2 µL/分鐘流動速率下進行300秒。在1×Biacore操作緩衝液中1:5稀釋之後使用Biotin CAPture試劑。生物素標記之配位體(TGFβ1之各種複合物)以10 nM之濃度使用且以10 µL/分鐘之流動速率固定至感測器晶片持續180秒。在10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM及0.625 nM下測試各自為Fab之分析物，其中包括0 nM對照物。分析物接觸時間為120秒且解離時間為900秒。所利用之再生週期為120秒，流動速率為10 µL/分鐘。
所用評估方法為「使用捕獲之多週期親和力」且使用1:1結合模型。對於針對給定生物素標記抗原測試之每一Fab，Rmax設定為等於參考Ab之親和力成熟型式的Rmax，其中結合解離速率顯著較慢且因此在相同實驗中與相同抗原之親和力結合較高。利用總體擬合進行每一KD 測定。KD 值顯示於下表26中。表 26
   HuLTBP1- 前 TGFb1 HuLTBP3- 前 TGFb1 HuGARP- 前 TGFb1 HuLRRC33- 前 TGFb1
SR-AB42-HuFab 0.381 0.57 144.614 134.249
SR-AB47-HuFab 0.217 0.33 6.496 6.663
SR-AB49-HuFab 0.319 0.58 6.551 7.704
Ref Ab-HuFab 0.077 0.11 0.202 0.154
   MuLTBP1- 前 TGFb1 MuLTBP3- 前 TGFb1 MuGARP- 前 TGFb1 MuLRRC33- 前 TGFb1
SR-AB42-HuFab 0.611 0.68 29.102 109.989
SR-AB47-HuFab 0.198 0.40 1.950 9.164
SR-AB49HuFab 0.379 0.65 2.820 6.945
Ref Ab-HuFab 0.078 0.09 0.264 0.107
表 27 顯示單價半結合時間(T½)。對於hLTBP1-前TGFβ1及hLTBP3-前TGFβ1複合物中之每一者，單價半結合時間(T½)值為至少45分鐘。如藉由SPR所量測，對於hGARP-前TGFβ1及hLRR33-前TGFβ1複合物中之每一者，單價T½值小於5分鐘。表 27 ：單價半結合時間 (T 1/2)
LTBP-SR-AB42 HuFab KD (nM) T 1/2 結合
Hu LTBP1-前TGFβ1 0.38 1.7小時
Hu LTBP3-前TGFβ1 0.57 1.7小時
Hu GARP-前TGFβ1 144 1.9分鐘
Hu LRRC33-前TGFβ1 134 4.3分鐘
Mu LTBP1-前TGFβ1 0.6 1.1小時
Mu LTBP3-前TGFβ1 0.68 1.2小時
Mu GARP-前TGFβ1 29 5.1分鐘
Mu LRRC33-前TGFβ1 110 7.4分鐘
實施例 本發明涵蓋各種實施例。非限制性實例列於下文中： 1.一種抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:94，其限制條件為，視情況： i. SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代； v. SEQ ID NO: 94之位置7之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代； vi. SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或 vii. SEQ ID NO:94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:95，視情況包含一或多個胺基酸變化； c) CDR-H3: SEQ ID NO:96，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:97，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:98，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:99，視情況包含一或多個胺基酸變化。 2.如實施例1之抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR中之至少三個： a)包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)包含胺基酸序列 (X1 )ISHEG(X2 )(X3 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中視情況：X1 為V或S；X2 為S或G；且X3 為F或L；及 c)包含胺基酸序列 (X1 )(X2 )P(X3 )(X4 )(X5 )(X6 )RRGG(X7 ) (X8 )(X9 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、V、G或K；X3 為R、H或L；X4 為I、V或G；X5 為A、S或L；X6 為A或V；X7 為F或Y；X8 為D、G、R或S；且X9 為Y、G、R、L、V、A或K。 d)如SEQ ID NO:97所示之 CDR-L1，視情況包含一或多個胺基酸變化； e)如SEQ ID NO:98所示之CDR-L2，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) 如SEQ ID NO:99所示之CDR-L3，視情況包含一或多個胺基酸變化。 3.如實施例2之抗體或其抗原結合片段，其中： a)在CDR-H2內：X2 為S；及 b)在CDR-H3內：X1 為A；X2 為R或V；X3 為R；X4 為I；X5 為A或L；X6 為A；X7 為F；X8 為G；且X9 為Y。 3.1如實施例3之抗體或其抗原結合片段，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之一或多者藉由CDR多樣化及/或突變誘發而經親和力成熟及/或最佳化。 4.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 88至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或 其中該抗體包含具有與SEQ ID NO: 89至少90%一致之胺基酸序列的可變輕鏈可變區。 5.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含： 具有與SEQ ID NO:88至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:89至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 6.一種抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:100，其限制條件為，視情況： i. SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:101，其限制條件為，視情況： i. SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:102，視情況包含一或多個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:105，視情況包含一或多個胺基酸變化。 7.如實施例6之抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR中之至少三個： g)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S或P；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V； h)包含胺基酸序列SISYSA(X1 )TYYNPSLKS之CDR-H2，其中視情況：X1 為S或T； i)包含胺基酸序列(X1 )(X2 )D(X3 )(X4 )Y(X5 )(X6 )(X7 )(X8 )G(X9 ) (X10 )(X11 )之CDR-H3，其中視情況：X1 為A或V；X2 為R、S或G、X3 為P、Y、R、V、I、H、T或E；X4 為S、D、E或N；X5 為D、A或T；X6 為S、G、T或A；X7 為I、A、R、Q或V；X8 為A、E、K、G或T；X9 為M或I；X10 為D、L、Q、V、N或G；且X11 為V、R、N、E或K； j) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含一或多個胺基酸變化； k) CDR-L2: SEQ ID NO: 104，視情況包含一或多個胺基酸變化；及 l) CDR-L3: SEQ ID NO: 105，視情況包含一或多個胺基酸變化。 8.如實施例7之抗體或其抗原結合片段，其中： g)在CDR-H1內：X2 為H或R；X3 為S；且X4 為G、I或N；及 h)在CDR-H3內：X1 為A；X3 為P或V；X4 為S；X5 為D；X6 為S或A；X7為A、R、I或V；X8為A；X9為M；X10為D、Q或G；且X11為V或R。 8.1如實施例8之抗體或其抗原結合片段，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之一或多者藉由CDR多樣化及/或突變誘發經親和力成熟及/或最佳化。 9.如實施例6至8.1中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含至少三個選自以下之CDR，視情況包含CDR中之每一者的一或多個胺基酸變化： CDR-H1: SEQ ID NO:100；CDR-H2: SEQ ID NO:101；CDR-H3: SEQ ID NO:102；CDR-L1: SEQ ID NO:103；CDR-L2: SEQ ID NO:104；及CDR-L3: SEQ ID NO:105。 10.如實施例6至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈區及可變輕鏈區，其中： i)該可變重鏈區包含與SEQ ID NO:  106至少90%一致之胺基酸序列；及/或 ii)該可變輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 107至少90%一致之胺基酸序列。 11.如實施例6至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合部分包含： i)具有與SEQ ID NO: 106至少90%一致之胺基酸序列的可變重鏈區；及， ii)具有與SEQ ID NO: 107至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 12.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含所有六個CDR。 12.1如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含一個胺基酸變化。 12.2如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含至多兩個胺基酸變化。 12.3如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含至多三個胺基酸變化。 12.4如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含至多四個胺基酸變化。 12.5如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含至多五個胺基酸變化。 12.6如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含至多六個胺基酸變化。 12.7如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該一或多個胺基酸變化包含至多七個胺基酸變化。 12.8如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中CDR中之任一者不包含胺基酸變化。 13.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物。 14.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP3-前TGFβ複合物。 15.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不結合人類GARP-前TGFβ複合物。 16.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物。 17.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。 18.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類或人類化抗體。 19.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為分離抗體或其抗原結合片段。 20.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與抗體SR-Ab1、SR-Ab2或SR-Ab13中之任一者競爭結合於人類LTBP1-前TGFβ1複合物。 21.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與抗體SR-Ab1、SR-Ab2或SR-Ab10中之任一者競爭結合於人類LTBP1-前TGFβ1複合物。 22.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為IgG4或IgG1亞型。 23.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類LTBP1-TGFβ1複合物具有專一性。 24.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類LTBP3-TGFβ1複合物具有專一性。 25.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物具有專一性。 26.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體不結合人類GARP-TGFβ1複合物或GARP-TGFβ3複合物。 27.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜50 nM。 28.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜50 nM。 29.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 30.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 31.如實施例27至30中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。 32.如實施例27至30中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。 33.如實施例27至30中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1及小鼠LTBP3-前TGFβ1兩者具有交叉反應性。 34.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜50 nM。 35.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜50 nM。 36.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 37.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 38.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為同功型專一性的，因為其選擇性結合及抑制與LTBP1/3相關之TGFβ1之活化。 39.如實施例38之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不結合GARP-TGFβ1。 40.一種抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR： a)包含胺基酸序列FTFRSYVMH之CDR-H1； b)包含胺基酸序列VISHEGS(X1 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中：X1 為L或G；及 c)包含胺基酸序列A(X1 )PRIAARRGGFG(X2 )之CDR-H3，其中：X1 為V、R或L；及 X2 為Y、S或T； d)包含胺基酸序列TRS(X1 )G(X2 )ID(X3 )NYVQ之CDR-L1，其中， X1 為S或H；X2 為N、L、S或A；且X3 為N、D或Y； e)包含胺基酸序列ED(X1 )(X2 )RPS之CDR-L2，其中：X1 為N、F或A；且X2 為Q、I或V；及 f)包含胺基酸序列Q(X1 )YD(X2 )(X3 )(X4 )Q(X5 )VV之CDR-L3，其中：X1 為S或G；X2 為S、F、Y、D、H或W；X3 為N、D或S；X4 為N、A、L、E或T；且X5 為G、R、A或L。 41.如實施例40之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-H3內：X1 為R或L。 42.如實施例41之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L3內：X2 為Y。 43.如實施例42之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L3內：X3 為D；且X4 為T。 44.如實施例42之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L3內：X3 為D；X4 為N；且X5 為A。 45.如實施例41之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L1內：X1 為S或H；X2 為N或A；且X3 為N、D或Y； 在CDR-L2內：X1 為N或F；且X2 為Q或V；及 在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為S、Y、D或W；X3 為D或S；X4 為N、L或T；且X5 為G、R、A或L。 46.如實施例45之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L1內：X1 為S；X2 為N；且X3 為N或Y； 在CDR-L2內：X1 為N；且X2 為Q或V；及 在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為S、Y或W；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G、R或A。 47.如實施例46之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L3內：X1 為S；X2 為S或Y；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G、R或A。 48.如實施例47之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L3內：X1 為S；X2 為Y；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G或A。 49.如實施例48之抗體或其抗原結合片段，其中：在CDR-L3內：X1 為S；X2 為Y；X3 為D；X4 為T；且X5 為G。 50.如實施例45至49中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中： a) CDR-H1包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列； b) CDR-H2包含SEQ ID NO: 167之胺基酸序列； c) CDR-H3包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列； d) CDR-L1包含SEQ ID NO: 169之胺基酸序列； e) CDR-L2包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列；及 f) CDR-L3包含SEQ ID NO: 171之胺基酸序列。 51.如實施例40至50中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含： 具有與SEQ ID NO:318至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:319至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 52.如實施例40至51中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與具有如SEQ ID NO: 318中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO: 319中所示之輕鏈可變區序列的抗體競爭或交叉競爭。 53.一種抗體或其抗原結合片段，其選擇性結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物且與具有如SEQ ID NO:318中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:319中所示之輕鏈可變區序列的抗體競爭或交叉競爭。 54.一種抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR： g)包含胺基酸序列G(X1 )I(X2 )S(X3 )SYYW(X4 )之CDR-H1，其中視情況：X1 為S；X2 為S、H或R；X3 為S或G；且X4 為G、I、N或V； h)包含胺基酸序列SISYS(X1 )(X2 )TYY之CDR-H2，其中視情況：X1 為G或A；且X2 為S或T； i)包含胺基酸序列A(X1 )DPSYDS(X2 )AGM(X3 )V之CDR-H3，其中視情況：X1 為R、S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q； j)包含胺基酸序列RAS(X1 )(X2 )IS(X3 )YLN之CDR-L1，其中視情況：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y； k)包含胺基酸序列(X1 )AS(X2 )(X3 )QS之CDR-L2，其中視情況：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R； l)包含胺基酸序列QQ(X1 )(X2 )D(X3 )P(X4 )T之CDR-L3，其中視情況：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。 55.如實施例54之抗體或其抗原結合片段，其中： a) 在CDR-H1內：X1 為S；X2 為S或R；X3 為S；且X4 為G； b) 在CDR-H2內：X1 為G或A；且X2 為S或T； c) 在CDR-H3內：X1 為R、S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q； d) 在CDR-L1內：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y； e) 在CDR-L2內：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R；及 f) 在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。 56.如實施例55之抗體或其抗原結合片段，其中： a) CDR-H1包含胺基酸序列GSIRSSSYYWG； b) CDR-H2包含胺基酸序列SISYSATTYY； c) 在CDR-H3內：X1 為S或G；X2 為A或I；且X3 為D或Q； d) 在CDR-L1內：X1 為K或Q；X2 為V或S；且X3 為S或Y； e) 在CDR-L2內：X1 為Y、A或S；X2 為S或N；且X3 為L或R；及 f) 在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為F或N；X3 為W或F；且X4 為F或L。 57.如實施例56之抗體或其抗原結合片段，其中： g) CDR-H1包含SEQ ID NO: 292之胺基酸序列； h) CDR-H2包含SEQ ID NO: 293之胺基酸序列； i) CDR-H3包含SEQ ID NO: 294之胺基酸序列； j) CDR-L1包含SEQ ID NO: 295之胺基酸序列； k) CDR-L2包含SEQ ID NO: 296之胺基酸序列；及 l) CDR-L3包含SEQ ID NO: 297之胺基酸序列。 58.如實施例54至57中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為如技術方案1至5中任一項之抗體。 59. 如實施例54至58中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含： 具有與SEQ ID NO:360至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:361至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 60. 如實施例54至59中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與具有如SEQ ID NO: 360中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO: 361中所示之輕鏈可變區序列的抗體競爭或交叉競爭。 61.一種抗體或其抗原結合片段，其選擇性結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物且與具有如SEQ ID NO:360中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:361中所示之輕鏈可變區序列的抗體競爭或交叉競爭。 62.如實施例40至61中任一項之抗體或其抗原結合片段，其在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合相同的分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。 63.如實施例40至62中任一項之抗體或其抗原結合片段，其結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中在相同分析條件下，KD 比結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍。 64.如實施例40至63中任一項之抗體或其抗原結合片段，其在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合相同的分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與LRRC33-前TGFβ1複合物之可偵測結合。 65.如實施例40至64中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對於hLTBP1-前TGFβ1及hLTBP3-前TGFβ1複合物中之每一者具有至少45分鐘之單價半結合時間(t½)，如藉由SPR所量測。 66.如實施例65之抗體或其抗原結合片段，其對於hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者具有小於5分鐘之單價t½，如藉由SPR所量測。 67.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜5 nM，視情況＜1 nM。 68.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。 69. 如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應。 70.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 71.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 72.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與人類及鼠類LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1複合物交叉反應，其各自KD ＜5 nM或視情況＜1 nM。 73.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為IgG4或IgG1亞型。 74.如實施例73之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人類IgG4亞型，其中視情況該抗體包含Ser至Pro之主鏈取代，其產生類IgG1鉸鏈。 75.一種醫藥組合物，其包含如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之賦形劑。 76.如實施例75之醫藥組合物，其經製備用於靜脈內投與或皮下投與。 77.一種組合物，其包含含有如實施例75或76之醫藥組合物的多劑量小瓶。 78.一種組合物，其包含含有如實施例75或76之醫藥組合物的單劑量注射器，視情況其中該注射器為拋棄式注射器。 79.如實施例75或78中任一項之組合物，其供用於治療人類個體之纖維化病況之方法中，其中治療包含以有效治療纖維化病症之量向個體投與組合物。 80.根據實施例79之供使用之組合物，其中纖維化病症為器官纖維化。 81.如實施例80之供使用之組合物，其中該器官纖維化為晚期器官纖維化。 82.如實施例80或81之供使用之組合物，其中該器官纖維化係選自由以下組成之群： 腎臟纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、胰臟纖維化、皮膚纖維化、硬皮病、肌肉纖維化、子宮纖維化及子宮內膜異位。 83.如實施例82之供使用之組合物，其中： a)纖維化病症包含慢性發炎； b)個體受益於免疫抑制； c)個體患有自體免疫疾病或處於患上自體免疫疾病之風險下； d)個體為同種異體移植的候選者；及/或 e)個體已接受同種異體移植。 84.如實施例79之供使用之組合物，其中包含慢性發炎之纖維化病症為肌肉萎縮症、多發性硬化症(MS)或囊腫性纖維化(CF)。 85.如實施例84之供使用之組合物，其中肌肉萎縮症為杜興氏肌肉失養症(DMD)。 86.如實施例84之供使用之組合物，其中MS包含血管周纖維化。 87.如實施例82之供使用之組合物，其中肺纖維化為特發性肺纖維化(IPF)。 88.如實施例82之供使用之組合物，其中個體患有慢性腎病(CKD)。 89.如實施例82之供使用之組合物，其中個體患有與非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)相關之肝纖維化。 90.如實施例89之供使用之組合物，其中個體患有與NASH相關之肝硬化或肝細胞癌。 91.如實施例90之供使用之組合物，其中個體罹患代謝病況(例如肥胖症、2型糖尿病)。 92.如實施例89至91中任一項之供使用之組合物，其中個體進一步用肌肉抑制素抑制劑治療，其中視情況，肌肉抑制素抑制劑為肌肉抑制素選擇性抑制劑，其中進一步視情況，肌肉抑制素選擇性抑制劑為SRK-015、特里沃單抗或其任何變體，或根據WO 2016/098357之抗體。 93.如實施例79至92中任一項之供使用之組合物，其中抗體以0.1與30 mg/kg之間的劑量向個體投與。 94.如實施例93之供使用之組合物，其中抗體一週兩次、一週一次、每2週一次、每3週一次、每4週一次、一月一次、每6週一次或每隔一個月一次投與。 95.如實施例93之供使用之組合物，其中治療方案包含療法之初期及療法之後期， 其中個體在初期期間接受速效劑量，隨後在後期期間接受維持劑量。 96.如實施例95之供使用之組合物，其中速效劑量在2-30 mg/kg之間，且維持劑量在0.1-20 mg/kg之間。 97.如實施例95或96之供使用之組合物，其中一週兩次、一週一次、每2週一次或每3週向個體投與速效劑量。 98.如實施例95至97中任一項之供使用之組合物，其中每2-12週一次向個體投與維持劑量。 99.如實施例95至97中任一項之供使用之組合物，其中基於所需向個體投與維持劑量。 100.如實施例79至99中任一項之供使用之組合物，其中方法進一步包含測試或證實自個體收集之生物樣品中的TGFβ1、LTBP1或LTBP3之表現。 101.一種用於製成如實施例75至78中任一項之組合物的方法，其包含專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物且不結合人類GARP-前TGFβ複合物的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，該方法包含以下步驟： i)提供至少一種包含LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之抗原， ii)選擇專一性結合步驟(i)之至少一種抗原的抗體或片段之第一集合以便提供LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之專一性結合子； iii)選擇抑制TGFβ1之活化的抗體或片段之第二集合，以便產生TGFβ1活化之專一性抑制劑；及 iv)將存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中之抗體或片段調配成醫藥組合物， 藉此製成包含抗體或片段之組合物。 102.如實施例101之方法，其中方法進一步包含以下步驟：自抗體或片段之第一集合移除結合GARP-前TGFβ1、LRRC33-前TGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-前TGFβ2、LRR33-前TGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-前TGFβ3、LRRC33-前TGFβ3、成熟TGFβ3或其任何組合之任何抗體或片段。 103.如實施例101或102之方法，其中方法進一步包含以下步驟：確定或確認步驟(ii)及/或(iii)中選出之抗體或片段之同功型專一性。 104.如實施例101至103中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 選擇對人類及嚙齒動物抗原具有交叉反應性之抗體或片段。 105.如實施例101至104中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 產生抗體或片段之完全人類或人類化抗體或片段，其呈遞於抗體之第一集合及抗體之第二集合中。 106.如實施例101至105中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 使存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 107.如實施例101至106中任一項之方法，其中親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受輕鏈改組之步驟。 108.如實施例101至107中任一項之方法，其中親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受CDR H1/H2多樣化之步驟。 109.如實施例101至108中任一項之方法，其中親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受CDR-H3突變誘發之步驟。 110.如實施例101至109中任一項之方法，其中親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受輕鏈CDR突變誘發之步驟。 111.如實施例101至110中任一項之方法，其中親和力成熟及/或最佳化包含使抗體或其抗原結合片段經受輕鏈CDR L1/L2多樣化之步驟。 112.如實施例101至111中任一項之方法，其中方法進一步包含確定抗體或其抗原結合片段對人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1之親和力的步驟。 113.如實施例101至112之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞100 nM)的步驟。 114.如實施例101至113之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞50 nM)的步驟。 115.如實施例101至114之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞25 nM)的步驟。 116.如實施例101至115之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞10 nM)的步驟。 117.如實施例101至116中任一項之方法，其中方法進一步包含確定自抗體之第一及/或第二集合的抗體或其抗原結合片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1之親和力的步驟。 118.如實施例117之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞100 nM)的步驟。 119.如實施例117之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞50 nM)的步驟。 120.如實施例117之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞25 nM)的步驟。 121.如實施例117之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＞10 nM)的步驟。 122.如實施例101至121中任一項之方法，其中方法進一步包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除任何抗體或其抗原結合片段(其不結合小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1)的步驟。 123.如實施例101至122中任一項之方法，其中方法進一步包含測定抗體或其抗原結合片段(自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合，如藉由如本文所描述之適合的基於功能性活體外細胞之分析所量測)之IC50 的步驟。 124.如實施例123之方法，其中適合的基於功能性活體外細胞之分析為caga分析。 125.如實施例123或124之方法，其中方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 ＞100 nM)的步驟。 126.如實施例123或124之方法，其中方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 ＞50 nM)的步驟。 127.如實施例123或124之方法，其中方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 ＞25 nM)的步驟。 128.如實施例123或124之方法，其中方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 ＞10 nM)的步驟。 129.如實施例123或124之方法，其中方法包含自抗體或其抗原結合片段之第一及/或第二集合移除抗體或其抗原結合片段(其IC50 ＞5 nM)的步驟。 130.如實施例124至129中任一項之方法，其中caga分析為內源性LTBP caga分析。 131.如實施例124至129中任一項之方法，其中caga分析為人類LTBP過度表現caga分析。 132.如實施例124至129中任一項之方法，其中caga分析為鼠類LTBP過度表現caga分析。 133.一種用於製造醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包含選擇性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物之抗體或其抗原結合片段，該方法包含以下步驟： 選擇優先抑制基質相關TGFβ1而非免疫細胞相關TGFβ1之抗體或其抗原結合片段； 在包含表現抗體之細胞的細胞培養物中產生該抗體，其中該細胞培養物之體積為250 L或更大， 視情況進一步包含以下步驟：自細胞培養物純化抗體；且進一步視情況包含將純化抗體調配成醫藥組合物的步驟。 134.如133之方法，其中醫藥組合物經調配以用於皮下投與。 135.如133之方法，其中該選擇步驟進一步包含對於人類LTBP1-前TGFβ及人類LTBP3-前TGFβ中之每一者選擇t½為45分鐘或更久之抗體或抗原結合片段，且視情況對於人類GARP-前TGFβ複合物選擇t½為5分鐘或更低之抗體或抗原結合片段，如藉由SPR所量測。 136.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO: 94、(CDR-H2) SEQ ID NO: 95及(CDR-H3)SEQ ID NO: 96之至少三個重鏈CDR序列之抗體或片段； 及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 137.如實施例136之方法，其中抗體或其抗原結合片段進一步包含(CDR-L1) SEQ ID NO: 97、(CDR-L2) SEQ ID NO: 98及(CDR-L3) SEQ ID NO: 99之輕鏈CDR序列。 138.如實施例136或137之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 88中所示之胺基酸序列的可變重鏈區。 139.如實施例136至138中任一項之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 89中所示之胺基酸序列的可變輕鏈區。 140.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO:100、(CDR-H2) SEQ ID NO:101及(CDR-H3) SEQ ID NO:102之至少三個CDR序列之抗體或片段；及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 141.如實施例140之方法，其中抗體或其抗原結合片段進一步包含(CDR-L1) SEQ ID NO:103、(CDR-L2) SEQ ID NO:104及(CDR-L3) SEQ ID NO:105之輕鏈CDR序列。 142.如實施例140或141之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 106中所示之胺基酸序列的可變重鏈區。 143.如實施例140至142中任一項之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 107中所示之胺基酸序列的可變輕鏈區。 144.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO:108、(CDR-H2) SEQ ID NO:109及(CDR-H3) SEQ ID NO:110之至少三個重鏈CDR序列之抗體或片段及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 145.如實施例144之方法，其中抗體或其抗原結合片段進一步包含(CDR-L1) SEQ ID NO:111、(CDR- L2) SEQ ID NO:112及(CDR-L3) SEQ ID NO:113之輕鏈CDR序列。 146.如實施例144或145之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 114中所示之胺基酸序列的可變重鏈區。 147.如實施例144至146中任一項之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 115中所示之胺基酸序列的可變輕鏈區。 148.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO:116、(CDR-H2) SEQ ID NO:117及(CDR-H3) SEQ ID NO:118之至少三個重鏈CDR序列之抗體或片段及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 149.如實施例148之方法，其中抗體或其抗原結合片段進一步包含(CDR-L1) SEQ ID NO:119、(CDR- L2) SEQ ID NO:120及(CDR-L3) SEQ ID NO:121之輕鏈CDR序列。 150.如實施例148或149之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 122中所示之胺基酸序列的可變重鏈區。 151.如實施例148至150中任一項之方法，其中抗體或片段包含具有如SEQ ID NO: 123中所示之胺基酸序列的可變輕鏈區。 152.如實施例136至151中任一項之方法，其中步驟(ii)包含輕鏈改組。 153.如實施例136至152中任一項之方法，其中步驟(ii)包含CDR-H1/H2多樣化。 154.如實施例136至153中任一項之方法，其中步驟(ii)包含CDR-L1/L2多樣化。 155.如實施例136至154中任一項之方法，其中步驟(ii)包含CDR、可變區及/或恆定區中之任一者內的突變誘發。 156.如實施例155之方法，其中突變誘發係在CDR內。 157.如實施例155及156中任一項之方法，其中突變誘發係在CDR-H3內。 158.如實施例155至157中任一項之方法，其中突變誘發係在CDR-L1內。 159.如實施例155至158中任一項之方法，其中突變誘發係在CDR-L2內。 160.如實施例155至159中任一項之方法，其中突變誘發係在CDR-L3內。 161.如實施例155之方法，其中突變誘發係在可變區內。 162.如實施例155之方法，其中突變誘發係在恆定區內。 163.如實施例136至162中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 選擇並不結合GARP-前TGFβ1、LRRC33-前TGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-前TGFβ2、LRRC33-前TGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-前TGFβ3、LRRC33-前TGFβ3、成熟TGFβ3或其任何組合之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或其抗原結合片段。 164.如實施例136至163中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 確定或確認經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段之同功型專一性。 165.如實施例136至164中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 選擇對人類及嚙齒動物抗原具有交叉反應性之抗體或片段。 166.如實施例136至165中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 產生經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段之完全人類或人類化抗體或片段。 167.如實施例136至166中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 確定經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段對人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1之親和力。 168.如實施例136至167之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜100 nM。 169.如實施例136至168之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜50 nM。 170.如實施例136至169之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜25 nM。 171.如實施例136至170之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於人類LTBP1-前TGFβ1及/或人類LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 172.如實施例136至171中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 確定經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段對小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1之親和力。 173.如實施例136至172之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜100 nM。 174.如實施例136至173之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜50 nM。 175.如實施例136至174之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜25 nM。 176.如實施例136至175之方法，其中方法進一步包含以下步驟：選擇結合於小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1的經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。 177.如實施例136至176中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 選擇不結合小鼠LTBP1-前TGFβ1及/或小鼠LTBP3-前TGFβ1之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 178.如實施例136至177中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 如藉由適合的基於功能性活體外細胞之分析所量測，測定經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段之IC50 。 179.如實施例178之方法，其中適合的基於功能性活體外細胞之分析為caga分析。 180.如實施例136至179中任一項之方法，其中方法包含以下步驟： 選擇IC50 ＜100 nM之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 181.如實施例136至179中任一項之方法，其中方法包含以下步驟： 選擇IC50 ＜50 nM之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 182.如實施例136至179之方法，其中方法包含以下步驟：選擇IC50 ＜25 nM之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 183.如實施例136至179之方法，其中方法包含以下步驟：選擇IC50 ＜10 nM之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 184.如實施例136至179之方法，其中方法包含以下步驟：選擇IC50 ＜5 nM之經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 185.如實施例179至184中任一項之方法，其中caga分析為內源性LTBP caga分析。 186.如實施例179至184中任一項之方法，其中caga分析為人類LTBP過度表現caga分析。 187.如實施例179至184中任一項之方法，其中caga分析為鼠類LTBP過度表現caga分析。 188.如前述實施例中任一項之抗體或片段、其用途或其相關方法， a)其包含以下可變重鏈及/或可變輕鏈序列或其變體： i)可變重鏈序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS或QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS， 其中視情況地，變體與對應可變重鏈序列至少85%一致、90%一致或95%一致。 ii)可變輕鏈序列NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFS GSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL或NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFS GSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL，其中視情況地，變體與對應可變輕鏈序列至少85%一致、90%一致或95%一致。 b)其具有以下可變重鏈CDR序列或其變體： i)視情況包含一或多個胺基酸變化之FTFRSYVMH之CDR-H1； ii)視情況包含一或多個胺基酸變化之VISHEGSLKYYADSVKG之CDR-H2；及/或； iii)視情況包含一或多個胺基酸變化之AVPRIAARRGGFGY或ARPRIAARRGGFGY之CDR-H3；及/或； c)其具有以下可變輕鏈CDR序列或其變體： i)視情況包含一或多個胺基酸變化之TRSSGNIDNNYVQ之CDR1-L1； ii)視情況包含一或多個胺基酸變化之EDNQRPS之CDR-L2；及/或； iii)視情況包含一或多個胺基酸變化之QSYDSDNQGVV之CDR-L3。 A1.一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段， 其中抗體包含至少三個選自以下之CDR，視情況針對CDR中之每一者包含至多3個胺基酸變化： CDR-H1: SEQ ID NO:100； CDR-H2: SEQ ID NO:101； CDR-H3: SEQ ID NO:102； CDR-L1: SEQ ID NO:103； CDR-L2: SEQ ID NO:104；及 CDR-L3: SEQ ID NO:105。 A1.1.一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物；其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段， 其中抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:100，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 100之位置4處之絲胺酸殘基可經組胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 100之位置7處之絲胺酸殘基可經丙胺酸或甘胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 100之位置11處之甘胺酸殘基可經蘇胺酸、絲胺酸、組胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸或丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:101，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 101之位置3處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 101之位置6處之甘胺酸殘基可經丙胺酸或絲胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 101之位置7處之絲胺酸殘基可經蘇胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:102，視情況包含至多三個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:103，視情況包含至多三個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:104，視情況包含至多三個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:105，視情況包含至多三個胺基酸變化。 A2.一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段； 其中抗體包含具有與SEQ ID NO:  106至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或 其中抗體包含具有與SEQ ID NO: 107至少90%一致之胺基酸序列的可變輕鏈可變區。 A3.如實施例A2之抗體，其中該抗體包含： 具有與SEQ ID NO:106至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO: 107至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 A3.1一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段， 其中抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:94，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代； v. SEQ ID NO: 94之位置7之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代； vi. SEQ ID NO: 94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或 vii. SEQ ID NO:94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:95，視情況包含至多六個胺基酸變化； c) CDR-H3: SEQ ID NO:96，視情況包含至多三個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:97，視情況包含至多三個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:98，視情況包含至多三個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:99，視情況包含至多三個胺基酸變化。 A3.2.一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段； 其中抗體包含具有與SEQ ID NO:  88至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或 其中抗體包含具有與SEQ ID NO: 89至少90%一致之胺基酸序列的可變輕鏈可變區。 A3.3.如實施例A3.2之抗體，其中該抗體包含： 具有與SEQ ID NO:88至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:89至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 A3.4.一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段， 其中抗體包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:1，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 1之位置4處之蘇胺酸殘基可經組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸或甘胺酸取代； ii. SEQ ID NO: 1之位置5之絲胺酸殘基可經白胺酸取代；及/或 iii. SEQ ID NO: 1之位置9處之絲胺酸殘基可經丙胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:2，其限制條件為： i. SEQ ID NO: 2之位置3處之絲胺酸殘基可經天冬胺酸或天冬醯胺取代； ii. SEQ ID NO: 2之位置5處之酪胺酸殘基可經組胺酸取代； iii. SEQ ID NO: 2之位置6處之天冬醯胺殘基可經絲胺酸取代； iv. SEQ ID NO: 2之位置8處之天冬醯胺殘基可經苯丙胺酸、白胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸取代；及/或 v. SEQ ID NO: 2之位置10處之天冬醯胺殘基可經天冬胺酸或丙胺酸取代； c) CDR-H3: SEQ ID NO:3，視情況包含至多三個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:4，視情況包含至多三個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:5，視情況包含至多三個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:6，視情況包含至多三個胺基酸變化。 A3.5.一種分離抗體，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中抗體不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段； 其中抗體包含具有與SEQ ID NO: 7至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或 其中抗體包含具有與SEQ ID NO: 8至少90%一致之胺基酸序列的可變輕鏈可變區。 A3.6.如實施例A3.5之抗體，其中該抗體包含： 具有與SEQ ID NO:7至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:8至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。 A4.如實施例A1至A3.6中任一項之抗體，其中該抗體不與抗體SR-Ab1、SR-Ab2或SR-Ab10中之任一者競爭結合於人類LTBP1-前TGFβ1複合物。 A5.如實施例A1至A4中任一項之抗體，其中該抗體為IgG4或IgG1亞型。 A5.1如實施例A1至A5中任一項之抗體，其中該抗體對人類LTBP1-TGFβ1複合物具有專一性。 A5.2如實施例A1至A5.1中任一項之抗體，其中該抗體對人類LTBP3-TGFβ1複合物具有專一性。 A5.3如實施例A1至A5.2中任一項之抗體，其中該抗體對人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物具有專一性。 A5.4如實施例A1至A5.3中任一項之抗體，其中該抗體不結合人類GARP-TGFβ1複合物或GARP-TGFβ3複合物。 A6.一種醫藥組合物，其包含如實施例A1至A5.4中任一項之抗體及醫藥學上可接受之賦形劑。 A7.如實施例A6之醫藥組合物，其經製備用於靜脈內投與或皮下投與。 A8.一種組合物，其包含含有如實施例A6或A7之醫藥組合物的多劑量小瓶。 A9.一種組合物，其包含含有如實施例A6或A7之醫藥組合物的單劑量注射器，視情況其中該注射器為拋棄式注射器。 A10.如實施例A6至A9中任一項之組合物，其供用於治療人類個體之纖維化病況之方法中，其中治療包含以有效治療纖維化病症之量向個體投與組合物。 A11.如實施例A10之供使用之組合物，其中纖維化病症為器官纖維化。 A12.如實施例A11之供使用之組合物，其中器官纖維化為晚期器官纖維化。 A13.如實施例A10或A11之供使用之組合物，其中器官纖維化選自由以下組成之群： 腎臟纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、胰臟纖維化、皮膚纖維化、硬皮病、肌肉纖維化、子宮纖維化及子宮內膜異位。 A14.如實施例A10之供使用之組合物，其中： a)纖維化病症包含慢性發炎； b)個體受益於免疫抑制； c)個體患有自體免疫疾病或處於患上自體免疫疾病之風險下； d)個體為同種異體移植的候選者；及/或 e)個體已接受同種異體移植。 A15.如實施例A10之供使用之組合物，其中包含慢性發炎之纖維化病症為肌肉萎縮症、多發性硬化症(MS)或囊腫性纖維化(CF)。 A16.如實施例A15之供使用之組合物，其中該肌肉萎縮症為杜興氏肌肉失養症(DMD)。 A17.如實施例A15之供使用之組合物，其中該MS包含血管周纖維化。 A18.如實施例A13之供使用之組合物，其中肺纖維化為特發性肺纖維化(IPF)。 A19.如實施例A13之供使用之組合物，其中個體患有慢性腎病(CKD)。 A20.如實施例A13之供使用之組合物，其中個體患有非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。 A21.如實施例A10至A20中任一項之供使用之組合物，其中抗體以0.1與30 mg/kg之間的劑量向個體投與。 A22.如實施例A21之供使用之組合物，其中抗體一週兩次、一週一次、每2週一次、每3週一次、一月一次或每隔一個月一次投與。 A23.如實施例A21之供使用之組合物，其中治療方案包含療法之初期及療法之後期， 其中個體在初期期間接受速效劑量，隨後在後期期間接受維持劑量。 A24.如實施例A21之供使用之組合物，其中速效劑量在2-30 mg/kg之間，且維持劑量在0.1-20 mg/kg之間。 A25.如實施例A21之供使用之組合物，其中速效劑量一週兩次或一週一次向個體投與。 A26.如實施例A21之供使用之組合物，其中每2-8週一次向個體投與維持劑量。 A27.如實施例A10至A26中任一項之供使用之組合物，其中方法進一步包含測試或證實自個體收集之生物樣品中的TGFβ1、LTBP1或LTBP3之表現。 A28.一種用於製成如實施例A6至A9中任一項之組合物的方法，其包含專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物且不結合人類GARP-前TGFβ複合物的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，該方法包含以下步驟： i)提供至少一種包含LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之抗原， ii)選擇專一性結合步驟(i)之至少一種抗原的抗體或片段之第一集合以便提供LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3-前TGFβ1之專一性結合子； iii)選擇抑制TGFβ1之活化的抗體或片段之第二集合，以便產生TGFβ1活化之專一性抑制劑；及 iv)將存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中之抗體或片段調配成醫藥組合物， 藉此製成包含抗體或片段之組合物。 A29.如實施例A28之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 自抗體或片段之第一集合移除結合GARP-前TGFβ1、LRRC33-前TGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-前TGFβ2、LRR33-前TGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-前TGFβ3、LRRC33-前TGFβ3、成熟TGFβ3或其任何組合之任何抗體或片段。 A30.如實施例A28或A29之方法，其中方法進一步包含以下步驟：確定或確認步驟(ii)及/或(iii)中選出之抗體或片段之同功型專一性。 A31.如實施例A28至A30中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 選擇對人類及嚙齒動物抗原具有交叉反應性之抗體或片段。 A32.如實施例A28至A31中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 產生抗體或片段之完全人類或人類化抗體或片段，其呈遞於抗體之第一集合及抗體之第二集合中。 A33.如實施例A28至A32中任一項之方法，其中方法進一步包含以下步驟： 使存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A34.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO:1、(CDR-H2) SEQ ID NO:2及(CDR-H3) SEQ ID NO:3之至少三個CDR序列之抗體或片段；及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A35.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO:94、(CDR-H2) SEQ ID NO:95及(CDR-H3) SEQ ID NO:96之至少三個CDR序列之抗體或片段；及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A36.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含(CDR-H1) SEQ ID NO:100、(CDR-H2) SEQ ID NO:101及(CDR-H3) SEQ ID NO:102之至少三個CDR序列之抗體或片段；及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A37.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含具有SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列之重鏈可變區的抗體或片段；及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A38.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含具有SEQ ID NO: 88中所示之胺基酸序列之重鏈可變區的抗體或片段；及 ii)使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A39.一種用於製成抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含具有SEQ ID NO: 106中所示之胺基酸序列之重鏈可變區的抗體或片段；及 ii) 使步驟(i)之抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。 A40.如實施例A34至A39中任一項之方法，其中步驟(ii)包含突變誘發。 A41.如實施例A40之方法，其中該突變誘發係在CDR內。 A42.如實施例A40之方法，其中該突變誘發係在可變區內。 A43.如實施例A40之方法，其中該突變誘發係在恆定區內。 A44.如實施例A34至A43中任一項之方法，其中步驟(ii)包含輕鏈改組。
圖 1 以圖形方式描繪靶向TGFβ1之潛伏形式提供同功型及情形專一性。
圖 2A-2B 表明潛伏TGFβ1之同功型專一性及LTBP複合物專一性結合劑之鑑別。圖 2A 表明不依賴於呈遞分子，SR-AB1結合潛伏TGFβ1。SR-AB1為藉由酵母展示發現之人類單株抗體，其選擇性結合潛伏TGFβ1，而無與潛伏TGFβ2、TGFβ3或成熟TGFβ1之可偵測結合。SR-AB1與小鼠、大鼠及食蟹獼猴蛋白交叉反應且結合於所有四種潛伏TGFβ1複合物。圖 2B 表明SR-AB2，抗LTBP1-前TGFβ1抗體不結合GARP-前TGFβ1或成熟TGFβ1。SR-AB2與嚙齒動物LTBP1-前TGFβ1交叉反應。
圖 3A-3B 表明偵測經活化重組潛伏TGFβ1之抑制的功能分析(效能分析)。圖 3A 描繪沈積於胞外基質(ECM)中之潛伏TGFβ1之活化。在此分析中，呈遞分子在表現整合素之細胞中用前TGFβ1共轉染。在抑制劑存在下在分析盤中接種經短暫轉染之細胞。潛伏LTBP-前TGFβ1複合物嵌入於ECM中。接著將TGFβ報導子細胞添加至系統中；游離生長因子(藉由整合素釋放)信號且藉由螢光素酶分析來偵測。圖 3B 描繪細胞表面上所呈遞之潛伏TGFβ1之活化。呈遞分子在表現整合素之細胞中用前TGFβ1共轉染。潛伏TGFβ1在細胞表面上由GARP或LRRC33表現。接著將TGFβ報導子細胞及抑制劑添加至系統中；游離生長因子(藉由整合素釋放)信號且藉由螢光素酶分析來偵測。
圖 4A-4B 描繪重組功能分析之最佳化。圖 4A 描繪在呈遞分子及前TGFβ1共轉染時呈遞分子及/或前TGFβ1活化之相對比重。圖 4B 描繪共轉染之最佳化：呈遞分子之質體DNA與前TGFβ1之比率。對於共轉染，相等量之各質體為最佳的。
圖 5 表明纖維結合蛋白促進LTBP呈遞之潛伏TGFβ1之整合素活化。分析盤用自人類血漿純化之纖維結合蛋白預塗佈。纖維結合蛋白增加由LTBP1及/或LTBP3呈遞之潛伏TGFβ1的整合素介導之活化。
圖 6 為表明SR-AB1為TGFβ1活化之情形非依賴性抑制劑的圖式。顯示SR-AB1以抑制不依賴於呈遞分子之TGFβ1的整合素依賴性活化。
圖 7A 、 7B 及 7C 呈現證實TGFβ1大潛伏複合物(LLC)之LTBP選擇性抑制之資料。圖 7A 表明SR-AB2專一性結合LTBP-前TGFβ1複合物；其不單獨結合前TGFβ1或LTBP1。SR-AB2亦不結合GARP-前TGFβ1。圖 7B 描繪SR-AB2抑制LTBP1-前TGFβ1 (人類及小鼠複合物)之整合素活化。圖 7C 描繪SR-AB2抑制LTBP3-前TGFβ1之整合素活化。
圖 8 呈現SR-AB2 (按出現之次序分別為SEQ ID NO: 7-8)之重鏈及輕鏈可變區序列。互補決定區(CDR)為加下劃線的。
圖 9 為表明SR-AB2與LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1複合物之結合專一性的圖式。
圖 10A-10B 提供顯示藉由SR-AB2之基質相關TGFβ1活化之情形選擇性抑制的資料。圖 10A 表明SR-AB2抑制LTBP-前TGFβ，其中經轉染之前TGFβ1由內源性LTBP1/3呈遞。圖 10B 表明SR-AB2不抑制GARP呈遞之TGFβ1活化。此等分析在LN229細胞中進行，其表現高LTBP3 mRNA、低LTBP1 mRNA、不可偵測到之GARP及不可偵測到之LRRC33。對照媒劑標準化之TGFβ活性顯示在y軸上。
圖 11 呈現LTBP複合物專一性抗體SR-AB10、SR-AB2及SR-13之結合概況及親和力資料。
圖 12A 及 12B 為顯示最佳化LTBP複合物專一性抗體之效能改良的圖式。圖 12A 提供顯示如藉由基於細胞之TGFβ報導子分析所量測之SR-AB14 (最佳化SR-AB10)之抑制效能改良的圖式。圖 12B 提供顯示如藉由基於細胞之TGFβ分析所量測之SR-AB15 (最佳化SR-AB13)之抑制效能改良的圖式。
圖 13A 及 13B 為顯示如藉由基於細胞之TGFβ報導子分析所量測，在CDR-H3突變誘發(亦即SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22及SR-AB23)之後最佳化LTBP複合物專一性抗體之效能改良的圖式。
圖 14A 及 14B 為顯示如藉由基於細胞之TGFβ報導子分析所量測，在CDR-H3突變誘發(亦即SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28及SR-AB29)之後最佳化LTBP複合物專一性抗體之效能改良的圖式。
圖 15 為顯示親和力成熟抗體顯示與LTBP-前TGFβ1複合物專一性結合的圖式。
圖 16 為顯示如藉由基於細胞之TGFβ報導子分析所量測，在抗體最佳化之第1、2及3週期之後最佳化LTBP複合物專一性抗體之效能改良的圖式。
圖 17 描繪酶聯免疫吸附分析(ELISA)之結果，其顯示與桿狀病毒(BV)粒子之抗體結合，測試抗體多專一性。
圖 18 描繪親和力捕獲自我相互作用奈米粒子光譜分析(AC-SINS)分析之結果，其測試抗體自我相互作用。增加之電漿子波長指示自我相互作用。
圖 19 為顯示用SR-AB42及SR-AB31治療來抑制膽鹼缺乏高脂飲食(choline-deficient high fat diet，CDHFD)之動物中肝臟組織中之羥脯胺酸(HYP) (µg/mg組織)增加的圖式。
圖 20A 為顯示阿爾波特小鼠模型中磷酸化對比總(磷酸化及無磷酸化) Smad2/3 (pSMAD2/3:tSMAD2/3)之相對比率的圖式。單次劑量之SR-AB42或SR-AB63足以顯著抑制整個腎臟溶解物中pSmad2/3信號傳導。圖 20B 為顯示如藉由ELISA所測定之磷酸化SMAD2/3 (pSMAD2/3)之量的圖式，且圖 20C 為顯示如藉由ELISA所測定之總SMAD2/2 (tSMAD2/3)蛋白之量的圖式。如藉由圖 20B 及圖 20C 所示，pSMAD之減少促成圖 20A 中所示之比率的變化。
圖 21 為顯示在LTBP-TGFβ3分析中前導第3週期抗體未顯示抑制的圖式。
圖 22 提供5張來自經參考Ab、TGFβ3抑制劑或兩者(左)處理之對照物、CDHFD小鼠的代表性PSA染色影像。亦提供顯示與對照物相比，用參考Ab、TGFβ3抑制劑或兩者處理之CDHFD小鼠之肝切片中天狼猩紅面積(%)的圖式(右)。
圖 23 顯示諸如SR-AB63之LTBP-複合物抗體具有高度專一性且具有皮莫耳單價親和力。
圖 24 顯示諸如SR-AB42之LTBP-複合物抗體具有高度專一性且具有皮莫耳單價親和力。
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Claims (59)

  1. 一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段， 其中該抗體或其抗原結合片段包含以下六個CDR中之至少三個： a) CDR-H1: SEQ ID NO:94，其限制條件為： i. SEQ ID NO:94之位置2處之蘇胺酸殘基可經丙胺酸取代； ii. SEQ ID NO:94之位置4處之天冬醯胺殘基可經丙胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iii. SEQ ID NO:94之位置5處之天冬醯胺殘基可經麩醯胺酸、絲胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩胺酸、精胺酸或組胺酸取代； iv. SEQ ID NO:94之位置6處之酪胺酸殘基可經精胺酸取代； v. SEQ ID NO:94之位置7處之脯胺酸殘基可經甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、天冬胺酸或麩醯胺酸取代； vi. SEQ ID NO:94之位置8處之異白胺酸殘基可經甲硫胺酸或白胺酸取代；及/或 vii. SEQ ID NO:94之位置9處之組胺酸殘基可經苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺或絲胺酸取代； b) CDR-H2: SEQ ID NO:95，其包含至多六個胺基酸變化； c) CDR-H3: SEQ ID NO:96，其包含至多三個胺基酸變化； d) CDR-L1: SEQ ID NO:97，其包含至多三個胺基酸變化； e) CDR-L2: SEQ ID NO:98，其包含至多三個胺基酸變化；及 f) CDR-L3: SEQ ID NO:99，其包含至多三個胺基酸變化。
  2. 一種分離抗體或其抗原結合片段，其專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物，且不結合人類GARP-前TGFβ複合物； 其中該抗體或其抗原結合片段不結合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3； 其中該抗體為完全人類或人類化抗體或其抗原結合片段； 其中該抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:  88至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或 其中該抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:89至少90%一致之胺基酸序列的可變輕鏈可變區。
  3. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR中之至少三個： a)     包含胺基酸序列FTF(X1 )(X2 )YVMH之CDR-H1，其中：X1 為S或R；且X2 為G或S； b)     包含胺基酸序列(X1 )ISHEG(X2 )(X3 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中：X1 為V或S；X2 為S或G；且X3 為F或L；及 c)     包含胺基酸序列(X1 )(X2 )P(X3 )(X4 )(X5 )(X6 )RRGG(X7 ) (X8 )(X9 )之CDR-H3，其中：X1 為A或V；X2 為R、V、G或K；X3 為R、H或L；X4 為I、V或G；X5 為A、S或L；X6 為A或V；X7 為F或Y；X8 為D、G、R或S；且X9 為Y、G、R、L、V、A或K； d)     如SEQ ID NO:97中所示之CDR-L1，其包含至多三個胺基酸變化； e)     如SEQ ID NO:98中所示之CDR-L2，其包含至多三個胺基酸變化；及 f) 如SEQ ID NO:99中所示之CDR-L3，其包含至多三個胺基酸變化。
  4. 如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中： b)     在CDR-H2內：X2 為S；及 c)     在CDR-H3內：X1 為A；X2 為R或V；X3 為R；X4 為I；X5 為A或L；X6 為A；X7 為F；X8 為G；且X9 為Y。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： 具有與SEQ ID NO:88至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:89至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  6. 如請求項3至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該至多三個胺基酸變化包含至多兩個胺基酸變化。
  7. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含所有六個CDR。
  8. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類LTBP1-TGFβ1複合物具有專一性。
  9. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類LTBP3-TGFβ1複合物具有專一性。
  10. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物具有專一性。
  11. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含以下六個CDR： a)     包含胺基酸序列FTFRSYVMH之CDR-H1； b)     包含胺基酸序列VISHEGS(X1 )KYYADSVKG之CDR-H2，其中：X1 為L或G；及 c)     包含胺基酸序列A(X1 )PRIAARRGGFG(X2 )之CDR-H3，其中：X1 為V、R或L；且X2 為Y、S或T； d)     包含胺基酸序列TRS(X1 )G(X2 )ID(X3 )NYVQ之CDR-L1，其中X1 為S或H；X2 為N、L、S或A；且X3 為N、D或Y； e)     包含胺基酸序列ED(X1 )(X2 )RPS之CDR-L2，其中：X1 為N、F或A；且X2 為Q、I或V；及 f) 包含胺基酸序列Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV之CDR-L3，其中：X1為S或G；X2為S、F、Y、D、H或W；X3為N、D或S；X4為N、A、L、E或T；且X5為G、R、A或L。
  12. 如請求項11之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-H3內：X1 為R或L。
  13. 如請求項12之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L3內：X2 為Y。
  14. 如請求項13之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L3內：X3 為D；且X4 為T。
  15. 如請求項13之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L3內：X3 為D；X4 為N；且X5 為A。
  16. 如請求項12之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L1內：X1 為S或H；X2 為N或A；且X3 為N、D或Y； 在CDR-L2內：X1 為N或F；且X2 為Q或V；及 在CDR-L3內：X1為S或G；X2為S、Y、D或W；X3為D或S；X4為N、L或T；且X5為G、R、A或L。
  17. 如請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L1內：X1 為S；X2 為N；且X3 為N或Y； 在CDR-L2內：X1 為N；且X2 為Q或V；及 在CDR-L3內：X1 為S或G；X2 為S、Y或W；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G、R或A。
  18. 如請求項17之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L3內：X1為S；X2為S或Y；X3為D；X4為N或T；且X5為G、R或A。
  19. 如請求項18之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L3內：X1 為S；X2 為Y；X3 為D；X4 為N或T；且X5 為G或A。
  20. 如請求項19之抗體或其抗原結合片段，其中： 在CDR-L3內：X1 為S；X2 為Y；X3 為D；X4 為T；且X5 為G。
  21. 如請求項16至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中： a) CDR-H1包含SEQ ID NO:166之胺基酸序列； b) CDR-H2包含SEQ ID NO: 167之胺基酸序列； c) CDR-H3包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列； d) CDR-L1包含SEQ ID NO: 169之胺基酸序列； e) CDR-L2包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列；及 f) CDR-L3包含SEQ ID NO: 171之胺基酸序列。
  22. 如請求項11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含： 具有與SEQ ID NO:318至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變區；及 具有與SEQ ID NO:319至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  23. 如請求項11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與具有如SEQ ID NO:318中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:319中所示之輕鏈可變區序列的抗體競爭或交叉競爭。
  24. 一種抗體或其抗原結合片段，其選擇性結合於人類LTBP1-TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物且與具有如SEQ ID NO:318中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:319中所示之輕鏈可變區序列的抗體競爭或交叉競爭。
  25. 如請求項11至20及24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合相同的分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與人類GARP-前TGFβ1複合物之可偵測結合。
  26. 如請求項11至20及24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及/或人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中在相同分析條件下，KD 比結合於人類GARP-前TGFβ1複合物時的KD 低至少50倍。
  27. 如請求項11至20及24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其在與用於量測與人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物之結合相同的分析條件下，如藉由BLI所量測，未顯示與LRRC33-前TGFβ1複合物之可偵測結合。
  28. 如請求項11至20及24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對於hLTBP1-前TGFβ1及hLTBP3-前TGFβ1複合物中之每一者具有至少45分鐘之單價半結合時間(t½)，如藉由SPR所量測。
  29. 如請求項28之抗體或其抗原結合片段，其對於hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者具有小於5分鐘之單價t½，如藉由SPR所量測。
  30. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物及人類LTBP3-TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(Bio-Layer Interferometry，BLI)所量測，KD ＜5 nM，視情況＜1 nM。
  31. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其對小鼠LTBP1-前TGFβ1具有交叉反應性。
  32. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其對小鼠LTBP3-前TGFβ1具有交叉反應性。
  33. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP1-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。
  34. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合小鼠LTBP3-前TGFβ1複合物，其中如藉由生物層干涉術(BLI)所量測，KD ＜10 nM。
  35. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與人類及鼠類LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1複合物交叉反應，其各自KD ＜5 nM或視情況＜1 nM。
  36. 如請求項1至4及11至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為IgG4或IgG1亞型，視情況其中該抗體或其抗原結合片段為人類IgG4亞型且包含Ser至Pro之主鏈取代，其產生類IgG1鉸鏈。
  37. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至36中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之賦形劑。
  38. 如請求項37之醫藥組合物，其經製備用於靜脈內投與或皮下投與。
  39. 一種組合物，其包含含有如請求項37或38之醫藥組合物的多劑量小瓶。
  40. 一種組合物，其包含含有如請求項37或38之醫藥組合物的單劑量注射器，視情況其中該注射器為拋棄式注射器。
  41. 一種如請求項37至40中任一項之組合物之用途，其用於製備用以治療人類個體之纖維化病況之藥劑。
  42. 如請求項41之用途，其中纖維化病症為器官纖維化。
  43. 如請求項42之用途，其中該器官纖維化為晚期器官纖維化。
  44. 如請求項42之用途，其中該器官纖維化係選自由以下組成之群： 腎臟纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、胰臟纖維化、皮膚纖維化、硬皮病、肌肉纖維化、子宮纖維化及子宮內膜異位。
  45. 如請求項44之用途，其中該肺纖維化為特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)。
  46. 如請求項44之用途，其中該個體患有慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)。
  47. 如請求項44之用途，其中該肝纖維化與非酒精性脂肪變性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)相關。
  48. 如請求項41至47中任一項之用途，其中該抗體用於以0.1與30 mg/kg之間的劑量向該個體投與。
  49. 如請求項48之用途，其中該抗體用於一週兩次、一週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次或每隔一個月一次投與。
  50. 如請求項48之用途，其中該藥劑用於治療方案中，該治療方案包含療法之初期及該療法之後期， 其中該個體在該初期期間接受速效劑量，隨後在該後期期間接受維持劑量。
  51. 如請求項50之用途，其中該速效劑量在2-30 mg/kg之間，且該維持劑量在0.1-20 mg/kg之間。
  52. 如請求項50之用途，其中該速效劑量一週兩次或一週一次向該個體投與。
  53. 如請求項50之用途，其中該維持劑量用於每2-8週一次向該個體投與。
  54. 如請求項41至47中任一項之用途，其中該治療進一步包含測試或證實自該個體收集之生物樣品中的TGFβ1、LTBP1或LTBP3之表現。
  55. 一種用於製成如請求項37至40中任一項之組合物的方法，該組合物包含專一性結合人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物的抗體或其抗原結合片段，該方法包含以下步驟： i) 選擇以至少45分鐘之t½與人類LTBP1-前TGFβ複合物及/或人類LTBP3-前TGFβ複合物解離之抗體或其抗原結合片段，及 ii) 將該抗體或片段調配成醫藥組合物，藉此製成包含該抗體或片段之該組合物。
  56. 如請求項55之方法，其進一步包含以下步驟：選擇如藉由基於細胞之分析所量測，IC50 ＜5 nM，視情況＜2 nM之抗體或抗原結合片段。
  57. 如請求項55或56之方法，其中該抗體或片段之功效在活體內臨床前模型中得到證實，其中視情況該臨床前模型為肝纖維化模型、腎臟纖維化模型或心臟纖維化模型。
  58. 如請求項55之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： 選擇對人類及嚙齒動物抗原具有交叉反應性之抗體或片段。
  59. 如請求項55之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： 使存在於抗體之第一集合及抗體之第二集合中之該抗體或片段經受親和力成熟及/或最佳化，以便提供經親和力成熟及/或最佳化之抗體或片段。
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