CN113677711A - TGFβ的LTBP复合特异性抑制剂及其用途 - Google Patents

TGFβ的LTBP复合特异性抑制剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了选择性结合LTBP1‑TGFβ和/或LTBP3‑TGFβ的复合物的抑制剂，例如，抗体及其抗原结合部分。本申请还提供了将这些抑制剂用于例如抑制TGFβ激活和治疗患有TGFβ相关病症(如纤维化病症)的受试者的使用方法。还提供了为需要的受试者选择情境依赖性或非情境依赖性的同工型特异性TGFβ抑制剂的方法。

Description

TGFβ的LTBP复合特异性抑制剂及其用途
相关申请
本国际申请要求于2019年1月30日提交的美国临时申请第62/798，927号的利益和优先权，其内容通过引用整体明确地并入本文。
发明背景
生长因子的转化生长因子β(TGFβ)超家族参与调节多种多样生物过程的多种信号传导级联，包括但不限于：细胞生长的抑制、组织稳态、细胞外基质(ECM)重塑、内皮-间充质转化、细胞迁移和侵袭和免疫调节/抑制，以及间充质-上皮转化。关于ECM重塑，TGFβ信号传导可能增加成纤维细胞群体和ECM沉积(例如，胶原蛋白)。在免疫系统中，TGFβ配体调节T调节细胞功能以及免疫前体细胞生长和体内平衡的维持。在正常上皮细胞中，TGFβ是一种有效的生长抑制剂和细胞分化促进剂。然而，随着肿瘤的发生和进展，它们经常失去对TGFβ的负生长反应。在这种情况下，由于TGFβ能够刺激血管生成、改变基质背景并诱导局部和全身免疫抑制，它可能成为肿瘤发展的促进剂。由于这些和其他原因，TGFβ已成为许多临床适应症的治疗靶标。尽管迄今为止许多团体做出了很多努力，但TGFβ治疗剂的临床开发一直具有挑战性。
临床前研究(包括在大鼠和狗中)的观察结果已经揭示了与体内TGFβ抑制相关的某些毒性。此外，尽管迄今为止已经开发了几种TGFβ抑制剂，但由于副作用或毒性风险，大多数靶向TGFβ的临床项目已停止。
例如，Anderton等(Toxicology Pathology，39：916-24，2011)报道了TGFβ I型(ALK5)受体的小分子抑制剂在临床前动物模型中诱导了以出血、炎症、变性和瓣膜间质细胞增殖为特征的心脏瓣膜病变。在所有测试剂量下所有心脏瓣膜中均观察到毒性。Frazier等(Toxicology Pathology,35：284-295,2007)报道了施用TGFβI型(ALK5)受体小分子抑制剂GW788388诱导大鼠的骺端发育不良。
Stauber等(J.Clin.Practice 4：3,2014)报告，正在被研究用于某些癌症治疗的TGFβ受体I激酶抑制剂LY2157299的长期(≥3个月)施用导致在大鼠和狗中涉及心血管、胃肠道、免疫、骨/软骨、生殖和肾脏系统的多器官毒性。
Fresolimumab(GC1008)，一种能够中和所有人TGFβ同工型的“泛”TGFβ抗体，据报道在对食蟹猴的研究中多次给药后诱导牙龈、膀胱和鼻甲上皮的上皮增生(Lonning等，Current Pharmaceutical Biotechnology 12：2176-89,2011)。类似地，在临床试验中已经报道了在施用多个剂量的药物后的多种皮疹/病变、牙龈出血和疲劳。fresolimumab最显著的不良反应包括在人类癌症患者中诱导皮肤角化棘皮瘤和/或鳞状细胞癌(参见，例如：Lacouture等，2015,Cancer Immunol Immunother,64：437-46；Stevenson等,2013,OncoImmunology,2：8,e26218；和Lonning等,2011)。来自临床试验的其他证据表明，在某些情况下，这种抗体可能加速肿瘤进展(Stevenson等，2013,OncoImmunology,2：8,e26218)。
因此，用于调节TGFβ信号传导的新方法和组合物是必要的，其可用于有效且安全地治疗涉及TGFβ的疾病和病症，包括例如癌症、纤维化和炎症。
随着对与广泛抑制TGFβ相关的潜在危险副作用的认识不断提高，许多小组最近转向鉴别靶向同工型的亚组(而不是全部)并且仍保持充分功效的抑制剂。例如，WO 2016/161410公开了结合TGFβ1和TGFβ2两者的中和抗体(即TGFβ1/2抑制剂)。WO 2006/116002提供了结合TGFβ1和TGFβ3两者的中和抗体(即TGFβ1/3抑制剂)，尽管优先结合前者。除了传统的单克隆抗体之外，一些小组正在开发具有所谓“配体陷阱(ligand traps)”功能的工程化融合蛋白(参见，例如，WO 2018/158727、WO2018029367和WO2018129331)，其中至少一些对于TGFβ1/3可能是选择性的。另一类TGFβ1/3抑制剂包括α-V(αv)整联蛋白的抑制剂，例如针对ανβ6的抗体，ανβ6是一种已知激活TGFβl和TGFβ3两者(即TGFβ1/3)的整联蛋白。还有一些人继续寻求抑制所有三种同工型的“更好的”泛抑制剂(即TGFβ1/2/3或泛抑制剂)(参见，例如，WO2018/134681)。
然而，从功效的角度来看，该领域的主流观点仍然是抑制TGFβ的多种同工型以实现治疗效果是有利的，并且为了适应这一点，建议通过“谨慎给药方案”进行毒性管理作为一种解决方案(Brennan等(2018)mAbs，10∶1，1-17)。
最近，申请人描述了在动物模型中被证明为既安全又有效的同工型选择性TGFβ1抑制剂(参见，例如：WO 2017/156500和WO 2018/129329，其通过引用并入)，从而支持以下观点：与广泛拮抗所有TGFβ同工型相反，选择性靶向TGFβ1同工型可提供一种有利的途径以可接受毒性来实现功。
虽然通过以在体内显示有效的剂量选择性抑制TGFβ1实现的观察到的安全性特征是朝着开发用于临床应用的TGFβ1抑制剂的有希望的一步，但鉴定能够选择性地影响确定的TGFβ1亚组效应的TGFβ1抑制剂(例如，对LTBP呈递的复合物选择性的TGFβ抑制剂)仍然是难以捉摸的。最近，申请人证明可以使用申请人先前描述的方法(参见，例如WO 2014/074532和WO 2014/182676)生成这样的“LTBP情境特异性的”抑制剂(WO 2019/023661，通过引用并入本文)。然而，上述国际出版物中描述的LTBP选择性TGFβ1抑制剂显示出有限的亲和力和抑制性活性，以及次优的跨物种反应性。
发明概述
本公开提供了改进的TGFβ抑制剂，其能够选择性靶向基质相关的proTGFβ复合物，例如LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1。
这些抑制剂以高亲和力(至少纳摩尔范围)结合并抑制LTBP1-和/或LTBP3-呈递的proTGFβ，但不结合和抑制免疫细胞相关的TGFβ，例如GARP-和/或LRRC33-呈递的proTGFβ1，或者其结合低于有意义的水平(例如，对于LTBP复合物的亲和力至少是GARP或LRRC33复合物的50倍)。因此，这些抑制剂可以以情境依赖性方式选择性抑制TGFβ的激活，使得使其选择性结合，从而抑制与ECM相关的TGFβ信号传导轴。特别地，本公开包括基质相关(例如，LTBP1和/或LTBP3相关的)TGFβ激活的选择性抑制剂。在一些实施方式中，这种抑制剂特异性结合与LTBP1和/或LTBP3相关的TGFβ的特定同工型(例如proTGFβ1、proTGFβ2和/或proTGFβ3)，因此也提供TGFβ同工型特异性。在一个特定实施方式中，这种抑制剂与LTBP1/3-proTGFβ1特异性结合。在本发明的任何实施方式中，这种抑制剂不抑制由GARP和/或LRRC33介导的与免疫细胞功能相关的TGFβ1的激活。本公开包含的改进的抗体对人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1具有至少纳摩尔范围(即，1x10-9 M至10x10-9 M)的亲和力。在一些实施方式中，这种抗体还对鼠LTBP1-proTGFβ1和/或鼠LTBP3-proTGFβ1具有至少纳摩尔范围(即，1x10-9 M至10x10-9 M)的亲和力。
不靶向调节性T细胞上的GARP-proTGFβ1复合物的TGFβ1抑制剂的治疗用途的基本原理是至少三重的：
首先，调节性T细胞在维持对自身抗原的免疫耐受性和预防自身免疫疾病中起关键作用。由于Treg通常抑制、压制或下调效应T细胞的诱导和增殖，因此对这种功能的系统性抑制可通过使通常由Treg细胞提供的“中断”失能而导致宿主中过度活跃或过度的免疫反应。因此，这里采用的方法(例如，在不使Treg失能的情况下抑制TGFβ1)旨在避免引发自身免疫的风险。此外，已经有发生过度敏感免疫反应或自身免疫的倾向的患者可能特别有触发或加剧这类病症的风险，而没有正常的Treg功能可用；且因此，选择性靶向基质TGFβ1的抑制剂可以有利地将这种风险降至最低。
其次，证据表明Th17/Treg比率的改变导致促纤维化Th17细胞因子的失衡，这与纤维化(例如肝纤维化)的严重程度相关(参见，例如，Shoukry等(2017)J Immunol 198(1Supplement)：197.12)。本发明人推断TGFβ1功能的GARP分支(arm)的扰动可直接或间接地加剧纤维化病症。
第三，调节性T细胞对于免疫稳态和防止自身免疫是必不可少的。据推断，特别是对于打算长期或慢性施用的TGFβ1抑制疗法，希望的是避免由于正常Treg功能在维持免疫稳态中的扰动而产生的潜在副作用(例如，综述于Richert-Spuhler和Lund(2015)Prog MolBiol Transl Sci.136：217–243中)。该策略至少部分在目的在于保持正常的免疫功能，这尤其是对抗感染所必需的。
为此，本公开的发明人着手产生同工型特异性的、情境选择性TGFβ1抑制剂，其选择性靶向基质相关的TGFβ1激活而不是免疫细胞相关的TGFβ1激活。
迄今为止存在的技术挑战包括在体内辨别和选择性调节存在于各种情境(或“生境”)中的这些TGFβ1子池的有限能力。
为了应对这一挑战，本发明人已经鉴定了同工型特异性的单克隆抗体，其结合潜在TGFβ1前结构域，而与潜在TGFβ2或TGFβ3没有可检测的结合，并且其以本文所述的背景依赖性在体外抑制整联蛋白介导的潜在TGFβ1的激活。这类抗体的发现和表征至少部分地通过开发情境依赖性的TGFβ1激活的基于细胞的测定方法而成为可能。在这种新型测定方法的开发和验证过程中，证明与αVβ6整联蛋白一样，αVβ8也可以激活LTBP1-proTGFβ1。进一步证明，与LTBP1复合物类似，LTBP3-proTGFβ1可以被αVβ6激活。在这些测定中通过筛选发现的抗体揭示了一类仅当由LTBP1或LTBP3呈递时才结合和抑制TGFβ1的抗体。在免疫相关的TGFβ1呈递体GARP和LRRC33的情境下，这类LTBP特异性抗体不抑制TGFβ1。这类抗体是用于治疗包括例如纤维化病症的疾病的治疗候选物，并且可以允许长期给药，这避免TGFβ相关的免疫系统激活。本文还提供了筛选用于各种纤维化病症的情境特异性或非情境依赖性的TGFβ1抑制剂的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了同工型特异性的TGFβ抗体或其抗原结合片段，其特征在于它们以≤50nM的KD选择性地结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。在一个实施方式中，本发明提供了同工型特异性的TGFβ抗体或其抗原结合片段，其特征在于它们以≤25nM的KD选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。在一个实施方式中，本发明提供了同工型特异性的TGFβ抗体或其抗原结合片段，其特征在于它们以≤10nM的KD选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合部分，其选择性地结合LTBP1-proTGFβ1复合物和LTBP3-proTGFβ1复合物，其中该抗体或其抗原结合部分不结合一个或多个以下靶标：(a)单独的LTBP1；(b)单独的proTGFβ1；(c)GARP-proTGFβ1复合物；和(d)LRRC33-proTGFβ1复合物。在进一步的实施方式中，本发明提供了同工型特异性TGFβ抗体或其抗原结合片段，其特征在于它们以<5nM的KD选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。
一个方面，本发明提供了细胞外基质相关的TGFβ激活的抑制剂，其选择性地结合LTBP1/3呈递的proTGFβ潜在复合物。在一个实施方式中，抑制剂不抑制免疫细胞相关的TGFβ1激活，例如，由GARP呈递的proTGFβ1潜在复合物的激活引起的免疫细胞相关的TGFβ1激活。在示例性的实施方式中，抑制剂是抗体或其抗原结合部分。
在其他方面，本发明提供了TGFβ抗体或其抗原结合片段，其特征在于它们选择性地结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段选择性结合LTBP1-TGFβ1。在一些实施方式中，这类抗体结合人和鼠对应物两者。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合部分，其选择性地结合LTBP1-proTGFβ潜在复合物和/或LTBP3-proTGFβ潜在复合物，从而调节成熟TGFβ生长因子从潜在复合物的释放，其中该抗体或其抗原结合部分不结合单独的成熟TGFβ1或GARP-proTGFβ1潜在复合物。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分不结合LRRC33-proTGFβ1潜在复合物。或者，在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合LRRC33-proTGFβ1潜在复合物。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分对LTBP1-proTGFβ1潜在复合物具有特异性。在其他实施方式中，抗体或其抗原结合部分对LTBP3-proTGFβ1潜在复合物具有特异性。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合部分以至少约10-8M的解离常数(KD)结合LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合部分以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，如在合适的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，如在合适的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合部分以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物，如在合适的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物，如在合适的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的。
本公开进一步提供抗体及其抗原结合片段，其选择性结合LTBP1-proTGFβ复合物和/或LTBP3-proTGFβ复合物并具有一种或多种更进一步的有利特性。事实上，发明人惊奇地发现，可以提供这类抗体，其以高亲和力结合人LTBP1-proTGFβ复合物和人LTBP3-proTGFβ复合物，并且有利地降低解离速率，同时还与小鼠LTBP1-proTGFβ复合物和小鼠LTBP3-proTGFβ复合物交叉反应并且不显示与人GARP-proTGFβ复合物(或实际上与人LRRC33-proTGFβ复合物)的显著结合。
再此外，本文公开的抗体(包括具有一种或多种或者甚至所有上述有利特性的抗体)在基于细胞的测定中表现出对TGFβ1信号传导的强效抑制，并在多种纤维化动物模型中显著降低纤维化标志物和TGFβ信号传导。
因此，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以通过BLI测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，并且具有一种或多种以下特性：
i)与小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物交叉反应；
ii)与小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物交叉反应；
iii)以通过BLI测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；
iv)以通过BLI测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物；
v)结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，其KD比在相同测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍；
vi)在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，未显示与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测的结合；
vii)在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，未显示与LRRC33-proTGFβ1复合物(例如，人LRRC33-proTGFβ1复合物)的可检测的结合。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(i)-(v)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(i)-(iv)和(vi)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(i)、(iii)和(v)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(ii)、(iv)和(v)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(i)、(iii)和(vi)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(ii)、(iv)和(vi)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(i)-(iii)和(v)，和任选地(vii)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段至少具有以上特性(i)-(iii)和(vi)，和任选地(vii)。
在一些优选的实施方式中，抗体或抗原结合片段以通过BLI测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，和具有所有上述特性(i)-(vii)。
抗体或抗原结合片段可以选择性地结合LTBP1/3呈递的proTGFβ潜在复合物并抑制细胞外基质相关的TGFβ激活。
更进一步地，TGFβ1激活的进一步有利的同工型选择性抑制剂可以包括表现出缓慢的解离速率(即，离解速率，kOFF)的单克隆抗体(包括免疫球蛋白及其抗原结合片段或部分)。因此，本发明进一步基于这样的认识，即慢性和进行性疾病如纤维化的治疗可能需要具有优异耐久性的抑制剂，这可反映在这种抗体的解离速率上。
抗体对其抗原的亲和力通常测量为平衡解离常数或KD。实验测量的解离速率和结合速率的比率(kOFF/kON)可用于计算KD值。kOFF值代表抗体解离速率，表明它多快从其抗原解离，而kON值代表抗体结合速率，表明它多快与其抗原结合。后者通常是浓度依赖性的，而前者与浓度无关。KD值与抗体浓度(特定实验所需的抗体量)有关，且因此KD值越低(浓度越低)，和抗体的亲和力越高。相对于参考抗体，较高亲和力的抗体可具有较低的kOFF速率、较高的kON速率或两者。
kOFF和kON速率都有助于特定抗体对其抗原的总体亲和力，并且每个组分的相对重要性或影响可能取决于抗体的作用机制。例如，结合成熟生长因子(例如从潜在复合物释放的可溶性瞬时TGFβ1配体)的中和抗体必须在体内与内源性高亲和力受体竞争配体的结合。由于配体-受体相互作用是局部事件，和由于配体是短寿命的，因此这类抗体必须能够在配体找到其细胞受体之前快速靶向和隔离组织中的可溶性生长因子，从而激活TGFβ1信号传导通路。因此，为了使配体靶向中和抗体有效，快速结合目标生长因子的能力，即高结合速率(kON)，可能尤其重要。
相比之下，申请人推断，一旦抗体与靶抗原(例如，proTGF+β1复合物)结合，通过阻止成熟生长因子从潜在复合物的激活(例如，释放)来抑制TGFβ1信号传导的抗体(“激活抑制剂”)可能优先受益于具有缓慢的解离速率。与中和抗体不同，这类抗体不直接与细胞受体竞争；相反，它们通过靶向在组织环境中保持休眠的无活性前体形式(例如，潜在proTGFβ1复合物)而在信号传导的上游发挥作用，从而先发地阻止TGFβ1的激活。这类抗体可通过阻止成熟生长因子从潜在复合物释放来发挥其抑制性活性。例如，这类抗体可以像“夹子”一样发挥作用以将活性生长因子锁定在前结构域(promain)笼结构中，而使其保持在非活性(例如，“潜在”)状态。事实上，结构分析(包括表位作图)提供了对作为这些抗体阻断TGFβ1激活能力的基础的分子机制的深入了解。在这方面，前结构域的Latency Lasso区域可能是特别有用的靶标。
在靶标接合后，由于效应和/或亲合力的增强的持久性，预期能够保持与靶标结合(例如，从潜在复合物非常缓慢地解离)的抗体在实现优异的体内功效方面是有利的。基于这种认识，本公开的申请人寻求鉴定与先前描述的抗体相比具有特别低kOFF值的TGFβ1的同工型选择性激活抑制剂。因此，根据本发明，与快速结合速率(kON)相反，优选的抗体具有主要归因于缓慢的解离速率(kOFF)的高亲和力。因此，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以通过BLI测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，并且具有一种或多种以下特性(其可以是以上示出特性(i)-(vii)之一或其组合之外的)：
(viii)当结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物时，≤5x10-4(1/s)的低解离速率(kOFF)(例如，通过适宜的体外结合/动力学分析测量的，例如通过BLI，例如基于Octet的系统)；和/或
(ix)当与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物结合时，≥45分钟的长半结合时间(t1/2)(例如，通过SPR测量的)。
在一些优选的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含以下六个CDR：
a)包含氨基酸序列FTFRSYVMH的CDR-H1；
b)包含氨基酸序列VISHEGS(X1)KYYADSVKG的CDR-H2，其中：X1是L或G；和
c)包含氨基酸序列A(X1)PRIAARRGGFG(X2)的CDR-H3，其中：X1是V、R或L；和X2是Y、S或T；
d)包含氨基酸序列TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ的CDR-L1，其中，X1为S或H；X2是N、L、S或A；和X3是N、D或Y；
e)包含氨基酸序列ED(X1)(X2)RPS的CDR-L2，其中：X1是N、F或A；和X2是Q、I或V；和
f)包含氨基酸序列Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV的CDR-L3，其中：X1是S或G；X2是S、F、Y、D、H或W；X3是N、D或S；X4是N、A、L、E或T；和X5是G、R、A或L。
在一些优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段与具有如SEQ ID NO：318所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：319所示的轻链可变区序列的抗体(例如，Ab42)竞争或交叉竞争。该抗体可包含具有与SEQ ID NO：318至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区和具有与SEQ ID NO：319至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些优选实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可以包含以下六个CDR(例如，Ab42的那些)：
CDR-H1包含氨基酸序列FTFRSYVMH(SEQ ID NO：166)；
CDR-H2包含氨基酸序列VISHEGSLKYYADSVKG(SEQ ID NO：167)；
CDR-H3包含氨基酸序列ARPRIAARRGGFGY(SEQ ID NO：168)；
CDR-L1包含氨基酸序列TRSSGNIDNNYVQ(SEQ ID NO：169)；
CDR-L2包含氨基酸序列EDNQRPS(SEQ ID NO：170)；和
CDR-L3包含氨基酸序列QSYDYDTQGVV(SEQ ID NO：171)。
抗体或抗原结合片段还可包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：318至少95％相同(任选地至少98％相同)，且该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：319至少95％相同(任选地至少98％相同)。
在一些可选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR：
a)包含氨基酸序列GSIRSSSYYWG的CDR-H1；
b)包含氨基酸序列SISYSATTYY的CDR-H2；
c)包含氨基酸序列A(X1)DPSYDS(X2)AGM(X3)V的CDR-H3，其中：X1是S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；
d)包含氨基酸序列RAS(X1)(X2)IS(X3)YLN的CDR-L1，其中：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；
e)包含氨基酸序列(X1)AS(X2)(X3)QS的CDR-L2，其中：X1是Y、A或S；X2是S或N；和X3是L或R；
f)包含氨基酸序列QQ(X1)(X2)D(X3)P(X4)T的CDR-L3，其中：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与具有如SEQ ID NO：360所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：361所示的轻链可变区序列的抗体(例如，Ab63)竞争或交叉竞争。该抗体可包含具有与SEQ ID NO：360至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区和具有与SEQ ID NO：361至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可包含以下六个CDR(例如，Ab63的那些)：
包含氨基酸序列GSIRSSSYYWG(SEQ ID NO：292)的CDR-H1；
包含氨基酸序列SISYSATTYY(SEQ ID NO：293)的CDR-H2；
包含氨基酸序列AGDPSYDSIAGMQV(SEQ ID NO：294)的CDR-H3；
包含氨基酸序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO：295)的CDR-L1；
包含氨基酸序列AASNLQS(SEQ ID NO：296)的CDR-L2；和
包含氨基酸序列QQSFDWPLT(SEQ ID NO：297)的CDR-L3。
抗体或抗原结合片段还可包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：360至少95％相同(任选地至少98％相同)，且该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：361至少95％相同(任选地至少98％相同)。
一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其用于治疗受试者的纤维化病症的方法，其中该抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中：a)纤维化病症包含慢性炎症；b)受试者受益于免疫抑制；c)受试者患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病的风险；d)受试者是同种异体移植的候选者或已经接受同种异体移植；e)受试者的Th17/Treg比率升高；和/或f)受试者需要长期或慢性施用TGFβ1抑制剂。在一些实施方式中，受试者患有代谢紊乱或处于发生代谢紊乱的风险中(并且受试者任选地是根据a)-f)中的一项或多项的受试者)。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是同工型特异性LTBP1-proTGFβ1抑制剂和/或LTBP3-proTGFβ1抑制剂。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可用于治疗受试者的纤维化病症的方法中。纤维化病症可包含慢性炎症。受试者可受益于免疫抑制。受试者可能患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病的风险。受试者可以是同种异体移植的候选者或可能已经接受了同种异体移植。
可选地或另外地，受试者可能具有升高的Th17/Treg比率。受试者可能需要长期或慢性施用TGFβ1抑制剂。
可选地或另外的，受试者可能患有代谢紊乱或处于发生代谢紊乱的风险中。
在另一方面，本发明提供了一种用于制备包含抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，该方法包括以下步骤：i)提供至少一种包含LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的抗原，ii)选择特异性结合步骤(i)的至少一种抗原以提供LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的特异性结合物的第一抗体或其抗原结合片段池；iii)选择抑制TGFβ1激活以产生TGFβ1激活的特异性抑制剂的第二抗体或其抗原结合片段池；iv)将存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或其抗原结合片段配制成药物组合物，从而制备包含抗体或其抗原结合片段的组合物。
在一个实施方式中，该方法进一步包括从第一抗体或其抗原结合片段池中去除结合GARP-proTGFβ1、LRRC33-proTGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-proTGFβ2、LRRC33-proTGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-proTGFβ3、LRRC33-proTGFβ3、成熟TGFβ3或其任何组合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括测定或确认在步骤(ii)和/或(iii)中选择的抗体或其抗原结合片段的同工型特异性的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括选择与人和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包括产生存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或其抗原结合片段的完全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个实施方式中，该方法进一步包括使存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或其抗原结合片段经历亲和力成熟和/或优化的步骤，以便提供亲和力成熟和/或优化的抗体或其片段。在一个实施方式中，亲和力成熟/优化包括使存在于第一抗体池和/或第二抗体池中的抗体或其抗原结合片段经历如本文所述的轻链改组的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟/优化包括使存在于第一、第二和/或第三抗体池中的抗体或其抗原结合片段经历如本文所述的CDR H1/H2多样化的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟/优化包括使抗体或其抗原结合片段经历如本文所述的CDR-H3诱变的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟/优化包括使抗体或其抗原结合片段经历如本文所述的轻链CDR诱变的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟/优化包括使抗体或其抗原结合片段经历如本文所述的轻链CDRL1/L2多样化的步骤。
在一个实施方式中，该方法还包括测定来自第一和/或第二抗体池的抗体或其抗原结合片段对人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的亲和力的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以>100nM、>50nM、>25nM或>10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤，如在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的。
在一个实施方式中，该方法进一步包括测定来自第一和/或第二池的抗体或其抗原结合片段对小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的亲和力的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以>100nM、>50nM或>10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤，如在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的。
在一个实施方式中，该方法进一步包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除不结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个实施方式中，该方法进一步包括测定来自第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池的抗体或其抗原结合片段的IC50的步骤，如通过本文所述的适宜的基于体外细胞的功能性分析如caga分析测量的。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的基于细胞的测定(例如caga分析)测量的大于100nM、50nM、25nM、10nM或5nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的内源性LTBP caga分析法测量的大于50nM或10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过如本文所述的人LTBP过表达caga分析所测定的大于50nM、25nM或10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有通过如本文所述的鼠LTBP过表达caga分析法测定的大于50nM、25nM、10nM或5nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明包含识别或选择适合治疗用途的TGFβ1选择性抑制剂的过程和方法，以及用于制备包含TGFβ1选择性抑制剂的组合物的方法。在优选的实施方式中，TGFβ1抑制剂(例如，选择的抑制剂)包括一种或多种具有特别有利的动力学标准的抗体或抗原结合片段，其特征在于：i)对人LTBP1/3-proTGFβ1复合物每一种的高亲和力(例如，KD<5nM)，以及ii)低解离速率(kOFF)，例如≤5x10-4(1/s)，如通过适宜的体外结合/动力学分析，例如通过BLI，例如，基于Octet的系统所测定的。低解离速率标准可反映在长的半解离期(t1/2)，例如，与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物解离的≥45分钟。优选地，对于基质相关复合物的抗体或其抗原结合片段的长的半解离期与相对于细胞相关复合物例如人GARP-proTGFβ1和/或人LRRC33-proTGFβ1复合物的短的半解离期相结合。特别地，优选的抗体或片段以不超过10分钟、更优选不超过5分钟的t1/2从人GARP-proTGFβ1复合物解离。同样，用于制备包含本文所述的TGFβ1选择性抑制剂的组合物的方法还可包括选择这种抗体的步骤。使用适宜的临床前模型在包含功效研究和毒理学/安全性研究的临床前研究中评估所选择的抗体或多种抗体。在功效研究中测定的一种或多种抗体的有效量低于在毒理学/安全性研究中测定的导致不希望的毒性的水平。优选地，选择具有至少3倍、6倍和更优选10倍治疗窗口的一种或多种抗体。当每周施用时，根据本公开的抗体的有效量可以在约0.1mg/kg和约30mg/kg之间。在优选的实施方式中，当每周给药至少4周时，根据本公开的抗体的最大耐受剂量(MTD)为>100mg/kg。在一些实施方式中，在临床前毒理学研究中，抗体显示>100mg/kg/周、>200mg/kg/周或>300mg/kg/周的NOAEL，其中任选地毒理学研究是4周研究、8周研究或12周研究。例如，在健康小鼠或大鼠的12周亚慢性给药方案中，NOAEL为>100mg/kg/周。
本公开还包括令人惊讶的发现：用TGFβ3选择性抑制剂抑制TGFβ3在小鼠中产生促纤维化作用。类似地，在同一模型中用TGFβ1选择性抑制剂和TGFβ3选择性抑制剂同时抑制TGFβ1和TGFβ3两者导致TGFβ1抑制剂的抗纤维化作用减弱。这些观察结果提出了非选择性TGFβ抑制剂(如泛抑制剂和TGFβ1/3抑制剂)可能实际上加剧纤维化的可能性。有利地，本文公开的抗体(例如，Ab42及其变体，如本文所述)是同工型选择性的，因为它们特异性靶向潜在TGFβ1复合物并且以低解离速率靶向潜在TGFβ1复合物。因此，本发明包含以下认识：当为患有纤维化病症(例如，涉及ECM失调的疾病)的患者选择特定的TGFβ抑制剂时，应仔细考虑同工型选择性以避免加剧ECM失调的风险。因此，本公开包含的治疗方法包括选择不抑制TGFβ3的TGFβ抑制剂来治疗患有纤维化病症(包括优选的纤维化病症，如本文所述)的受试者。
在一些实施方式中，本文使用的同工型选择性LTBP1/3-proTGFβ1复合物选择性抑制剂可选自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63和Ab64(任选地Ab42或Ab63)(即，具有相应Ab的重链和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，如本文所提供的)，其变体/衍生物或抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的工程化分子。在一些优选的实施方式中，LTBP1/3-proTGFβ1复合物选择性抑制剂是Ab42、其变体/衍生物或抗原结合片段或者包含其抗原结合片段的工程化分子。在优选的实施方式中，LTBP1/3-proTGFβ1复合物选择性抑制剂是Ab42或其抗原结合片段。
附图简述
图1通过图表描述了潜在形式TGFβ1的靶向提供同工型和情景特异性。
图2A-2B显示了潜在TGFβ1的同工型特异性的和LTBP复合物特异性的结合物的鉴定。图2A表明SR-AB1结合潜在TGFβ1，与呈递分子无关。SR-AB1是一种通过酵母展示发现的人单克隆抗体，它选择性地结合潜在TGFβ1，而与潜在TGFβ2、TGFβ3或成熟TGFβ1没有可检测的结合。SR-AB1与小鼠、大鼠和食蟹猴蛋白交叉反应，并与所有四种潜在TGFβ1复合物结合。图2B表明SR-AB2，一种抗LTBP1-proTGFβ1抗体，不结合GARP-proTGFβ1或成熟TGFβ1。SR-AB2与啮齿动物LTBP1-proTGFβ1交叉反应。
图3A-3B显示了检测激活的重组潜在TGFβ1抑制的功能性测定(效能测定)。图3A描绘了沉积在细胞外基质(ECM)中的潜在TGFβ1的激活。在该测定中，呈递分子在表达整联蛋白的细胞中与proTGFβ1共转染。在抑制剂存在的情况下，将瞬时转染的细胞接种在分析板中。潜在的LTBP-proTGFβ1复合物嵌入在ECM中。然后将TGFβ报告细胞添加到系统中；游离生长因子(由整联蛋白释放)发出信号并通过荧光素酶分析法检测。图3B描绘了细胞表面上存在的潜在TGFβ1的激活。在表达整联蛋白的细胞中，呈递分子与proTGFβ1共转染。潜在TGFβ1通过GARP或LRRC33在细胞表面上表达。然后将TGFβ报告细胞和抑制剂添加到系统中；游离生长因子(由整联蛋白释放)发出信号并通过荧光素酶分析法检测。
图4A-4B描述了重组功能性测定的优化。图4A描绘了呈递分子和/或在呈递分子和proTGFβ1共转染时proTGFβ1激活的相对贡献。图4B描绘了共转染的优化：用于呈递分子和proTGFβ1的质粒DNA的比率。等同量的每种质粒对于共转染是最佳的。
图5表明纤连蛋白促进LTBP呈递的潜在TGFβ1的整联蛋白激活。分析板用从人血浆纯化的纤连蛋白预涂覆。纤连蛋白增加了由LTBP1和/或LTBP3呈递的潜在TGFβ1的整联蛋白介导的激活。
图6是表明SR-AB1是TGFβ1激活的非情境依赖性抑制剂的图。SR-AB1显示为抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活，而与呈递分子无关。
图7A、7B和7C呈现的数据证实了TGFβ1大潜在复合物(LLC)的LTBP选择性抑制。图7A表明SR-AB2特异性结合LTBP-proTGFβ1复合物；它不结合单独的proTGFβ1或LTBP1。SR-AB2也不结合GARP-proTGFβ1。图7B描绘了SR-AB2抑制LTBP1-proTGFβ1(人和小鼠复合物)的整联蛋白激活。图7C描绘了SR-AB2抑制LTBP3-proTGFβ1的整联蛋白激活。
图8显示了SR-AB2的重链和轻链可变区序列(分别为SEQ ID NO：7-8，按出现顺序)。互补决定区(CDR)加下划线。
图9是表明SR-AB2对LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1复合物的结合特异性的图。
图10A-10B提供的数据显示了SR-AB2对基质相关TGFβ1激活的情景选择性抑制。图10A表明SR-AB2抑制LTBP-proTGFβ，其中转染的proTGFβ1由内源性LTBP1/3呈递。图10B表明SR-AB2不抑制GARP呈递的TGFβ1激活。这些测定在LN229细胞中进行，这些细胞表达高LTBP3mRNA、低LTBP1 mRNA、不可检测的GARP和不可检测的LRRC33。TGFβ活性(针对溶媒标准化)显示在y轴上。
图11呈现了LTBP复合物特异性抗体SR-AB10、SR-AB2和SR-13的结合特征和亲和力数据。
图12A和12B是显示优化的LTBP复合物特异性抗体的改进效力的图。图12A提供的图显示了通过基于细胞的TGFβ报告基因测定测量的SR-AB14(优化的SR-AB10)的抑制效力的提高。图12B提供的图显示了通过基于细胞的TGFβ测定测量的SR-AB15(优化的SR-AB13)的抑制效力的提高。
图13A和13B是显示在CDR-H3诱变后优化的LTBP复合物特异性抗体(即SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22和SR-AB23)的效力提高的图，如通过基于细胞的TGFβ报告基因测定测量的。
图14A和14B是显示在CDR-H3诱变后优化的LTBP复合物特异性抗体(即SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28和SR-AB29)效力提高的图，如通过基于细胞的TGFβ报告基因分析法测量的。
图15是显示亲和力成熟的抗体显示出与LTBP-proTGFβ1复合物的特异性结合的图。
图16是显示在第1、2和3循环的抗体优化后，优化的LTBP复合物特异性抗体的改进效力的图，如通过基于细胞的TGFβ报告基因测定测量的。
图17描述了酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果，其显示了抗体与杆状病毒(BV)颗粒的结合，这测试抗体的多特异性(polyspecificity)。
图18描绘了亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)测定的结果，其测试抗体自身相互作用。增加的等离子体波长表明自相互作用。
图19是显示用SR-AB42和SR-AB31处理抑制胆碱缺乏高脂肪饮食(CDHFD)饲养动物的肝组织中羟脯氨酸(HYP)(μg/mg组织)的增加的图。
图20A是显示Alport小鼠模型中磷酸化的与总的(磷酸化的和未磷酸化的)Smad2/3的相对比率(pSMAD2/3：tSMAD2/3)的图。单剂量的SR-AB42或SR-AB63足以显著抑制全肾裂解产物中的pSmad2/3信号传导。图20B是显示如通过ELISA测定的磷酸化的SMAD2/3(pSMAD2/3)的量的图，和图20C是显示通过ELISA测定的总SMAD2/3(tSMAD2/3)蛋白的量的图。如图20B和图20C所示，pSMAD的减少有助于图20A所示的比率的变化。
图21是显示先导第3循环抗体在LTBP-TGFβ3测定中没有显示抑制作用的图。
图22提供了来自对照、参考Ab、TGFβ3抑制剂或两者处理的CDHFD小鼠的5个代表性PSR染色图像(左)。还提供了显示与对照相比，用参考抗体Ab、TGFβ3抑制剂或两者处理的CDHFD小鼠肝脏切片中的picosirius红色区域(％)的图(右)。
图23显示LTBP-复合物抗体例如SR-AB63是高度特异性的并且具有皮摩尔单价亲和力。
图24显示LTBP-复合物抗体例如SR-AB42是高度特异性的并且具有皮摩尔单价亲和力。
发明详述
本发明提供了可用于降低TGFβ激活的组合物。靶向生长因子-受体相互作用上游的潜在proTGFβ复合物的抑制剂通常被称为TGFβ的激活抑制剂。
迄今为止，已经鉴定了TGFβ的四种呈递分子：潜在TGFβ结合蛋白1(“LTBP1”)、潜在TGFβ结合蛋白3(“LTBP3”)、糖蛋白A重复序列为主(“GARP”)和含富亮氨酸重复序列蛋白质33(“LRRC33”)。这些呈递分子中的每一个都可以与TGFβ前体(即proTGFβ)的同型二聚体前蛋白复合物形成二硫键。proTGFβ复合物在相应的细胞外小生境(例如，ECM和免疫细胞表面)中保持休眠(潜在)直到激活事件触发可溶性生长因子从复合物的释放。
与广泛表达的TGFβ生长因子和受体相比，呈递分子显示出更多限制性或选择性(例如，组织特异性)表达模式，从而借助于结合导致TGFβ活性的功能区室化。因此，四种呈递分子-proTGFβ复合物，即LTBP1-proTGFβ、LTBP3-proTGFβ、GARP-proTGFβ和LRRC33-proTGFβ，在表达呈递分子的组织内提供了TGFβ信号传导的离散“情境”。这些情境可分为两大类：i)与ECM相关的TGFβ信号传导(例如，基质相关的TGFβ功能)；ii)与细胞相关的TGFβ信号传导(特别是某些免疫细胞功能)。LTBP1-proTGFβ和LTBP3-proTGFβ复合物属于第一类，而GARP-proTGFβ和LRRC33-proTGFβ复合物属于第二类。因此，本文公开了能够选择性抑制与ECM相关的TGFβ激活的TGFβ抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂还对特定的TGFβ同工型(例如proTGFβ1、proTGFβ2和/或proTGFβ3)具有选择性。
在示例性实施方式中，本文所述的组合物可用于在LTBP蛋白(例如LTBP1和/或LTBP3蛋白)的情境中选择性地降低TGFβ1的激活。这种组合物有利地抑制细胞外基质相关的TGFβ1的激活，而不抑制在免疫相关的TGFβ1呈递分子GARP和LRRC33的情境中的TGFβ1。本文所述的组合物可用于治疗与TGFβ1激活相关的病症，例如纤维化病症。因此，在实施方式中，本发明提供用于降低TGFβ1激活的组合物、其使用方法、制造方法和治疗方法。还提供了为表现出纤维化病症症状的受试者选择TGFβ1抑制剂的方法。
定义
为了使本公开更易于理解，首先定义某些术语。应根据本公开的其余部分并且如本领域普通技术人员所理解的那样阅读这些定义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
亲和力：亲和力是分子(如抗体)与其配体(如抗原)结合的强度。其通常通过平衡解离常数(KD)测量和报告。KD是抗体的抗体解离速率(“解离速率”或koff)(抗体多快从其抗原解离)与抗体结合速率(“结合速率”或Kon)(抗体多快与其抗原结合)的比率。例如，通过适宜的体外结合分析所测定的，亲和力≤1 μM的抗体的KD值为1μM或更低(即，1μM或更高亲和力)。可以使用适宜的体外测定，例如生物膜层干涉法(例如，Octet)或表面等离子体共振(例如，Biacore System)来评估亲和力，如基于众所周知的方法通过KD值测量的。
亲和力成熟：亲和力成熟是抗体优化的一种类型，且是提高抗体或片段对其抗原的亲和力的过程，和通常涉及对抗体或片段的氨基酸序列进行一个或多个改变以获得更大的亲和力。通常，亲本抗体和亲和力成熟的对应物保留相同的表位。亲和力成熟可包括一个或多个CDR序列的多样化和/或诱变。
抗体：术语“抗体”包括任何天然存在的、重组的、修饰或工程化的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构或其抗原结合片段或部分，或它们的衍生物，如本文别处进一步所述的。因此，该术语意指特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，并且包括例如嵌合、人源化、完全人和双特异性抗体。除非另有相反说明，本文所用的术语“抗体”应包含抗原结合片段及其变体。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包括更少的链，例如天然存在于骆驼科动物中的抗体，其可以仅包含重链。抗体可以仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以来源于两种不同的抗体。抗体或其抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。如本文所用，术语抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(本文中有时称为“抗体缀合物”)。在一些实施方式中，该术语还包括肽体。
抗原：术语“抗原”广义上包括在抗体或片段特异性与其结合的结合区内包含抗原决定簇的任何分子。抗原可以是单一单元分子(如蛋白单体或片段)或由多个组分构成的复合物。抗原提供表位，例如分子或分子的一部分，或者分子或分子的部分的复合物，其能够被选择性结合剂，如抗原结合蛋白(包括，例如抗体)结合。因此，选择性结合剂可以特异性结合由复合物中的两种或更多种组分形成的抗原。在一些实施方式中，抗原能够用于动物中以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可以具有一个或多个能够与不同抗原结合蛋白(例如，抗体)相互作用的表位。在本公开的情况下，适宜的抗原是含有优选与呈递分子(统称为“大潜在复合物”或LLC)结合的proTGF二聚体(“小潜在复合物”或SLC)的复合物(例如，由相结合的多组分构成的多聚复合物)。proTGF二聚体的每个单体包含前结构域和生长因子结构域，其通过弗林蛋白酶(furin)切割序列所分隔。两个此类单体形成proTGF二聚体复合物。这进而通过二硫键与呈递分子共价结合，该二硫键涉及存在于每个proTGF单体的N末端附近的半胱氨酸残基。由与呈递分子结合的proTGF二聚体形成的这种多重复合物通常称为大潜在复合物。适于筛选抗体或抗原结合片段的抗原复合物例如包括大潜在复合物的呈递分子组分。此类呈递分子组分可以是全长呈递分子或其片段。呈递分子的最小所需部分通常含有呈递分子多肽的至少50个氨基酸，但是更优选地至少100个氨基酸，其包含能够与proTGFβ1二聚体形成共价键的两个半胱氨酸残基。
抗原结合部分/片段：如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”意指保留特异性结合抗原(例如，LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1)的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合部分包括但不限于特异性结合至抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。在一些实施方式中，抗体的抗原结合部分可以例如使用任何适宜的标准技术从完整抗体分子衍生而来，例如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变和任选恒定域的DNA的重组遗传工程技术。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子(参见，例如，Bird等，(1988)SCIENCE 242:423-426；和Huston等，(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA 85:5879-5883)；(vi)dAb片段(参见，例如，Ward等，(1989)NATURE 341:544-546)；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR))。还包括其他形式的单链抗体，例如双体抗体。术语抗体的抗原结合部分包括“单链Fab片段”，另外也称为“scFab”，其包含抗体重链可变域(VH)、抗体恒定域1(CH1)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定域(CL)和接头，其中所述抗体结构域和所述接头沿N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；和其中所述接头是至少30个氨基酸，优选是32至50个氨基酸的多肽。
晚期纤维化：如本文所用，如果受试者具有晚期阶段的纤维化病症，特别是器官纤维化，则其患有晚期纤维化，这使得患者成为接受或需要同种异体移植物的候选者。
根据需要(as needed)：在给药方案的情况中，术语“根据需要”是指不基于预定给药方案而是基于在治疗期间定期测量或监测的一个或多个参数或标志物的给药方案，它提供了关于额外剂量是否应该对受试者/患者有益的信息或指导。例如，可以以足以实现和/或维持临床益处(例如，减少一种或多种纤维化临床标志物)的治疗有效量在“根据需要”的基础上间歇地施用包含TGFβ抑制剂例如TGFβ1/2/3抑制剂(“泛”抑制剂)、TGFβ1/2抑制剂和TGFβ1/3抑制剂的药物组合物。在一些实施方式中，施用LTBP1/3-复合物选择性TGFβ抑制剂，例如，本文公开的抗体中的任一种(例如，Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63或Ab64(任选地Ab42))可以与测定或监测治疗功效的方法组合使用。在一些实施方式中，仅当预期来自额外剂量的TGFβ抑制剂的临床益处时，才在患者中施用LTBP1/3-复合物选择性TGFβ抑制剂。预期为了控制毒性，与TGFβ1选择性抑制剂(例如本文公开的那些)相比，TGFβ的非同工型选择性抑制剂可能更频繁地需要间歇或“根据需要”的给药方案。
偏倚：在本公开的背景下，术语“偏倚”是指对于或针对抗体能够特异性结合的抗原亚组的偏斜或不均匀的亲和力。例如，当对一种抗原复合物的亲和力与对另一种抗原复合物的亲和力不等同时(例如，亲和力差异超过5倍)，则称为抗体具有偏倚。表征为“无偏倚”的抗体对此类抗原复合物具有大致等同的亲和力(例如，亲和力差异小于五倍)。本公开的抗体“选择性地”结合EMC相关复合物(LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ)。在一些实施方式中，这种选择性结合可包含结合使得至少一种基质相关复合物与至少一种(优选两者)细胞相关复合物(GARP-proTGFβ1和/或LRRC33-proTGFβ1复合物)之间的相对亲和力超过五十倍。
生物膜层干涉法(BLI)：BLI是用于光学测量生物分子相互作用的无标记技术，例如，固定在生物传感器尖端表面上的配体与溶液中的分析物之间。BLI提供了以精密度和准确性监测结合特异性、结合和解离速率或浓度的能力。BLI平台仪器可以例如从ForteBio购买获得，并且通常称为
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系统。BLI可用于进行本文所述的体外结合分析。
自身免疫性疾病：自身免疫性疾病是由对正常身体部位的异常或过度反应性免疫反应引起的病症。施用于此类患有自身免疫性病症的患者的免疫刺激剂可能会加重病情。
细胞相关proTGFβ1：该术语指膜结合(例如，栓系于细胞表面)的TGFβ1或其信号传导复合物(例如，前/潜在TGFβ1)。通常，这样的细胞是免疫细胞。由GARP或LRRC33呈递的TGFβ1是细胞相关TGFβ1。GARP和LRRC33是在某些细胞的细胞表面上表达的跨膜呈递分子。GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1可以统称为“细胞相关的”(或“细胞表面”)proTGFβ1复合物，其介导细胞相关的(例如，免疫细胞相关的)TGFβ1激活/信号传导。
慢性炎症：在本公开的情况中，涉及慢性炎症的纤维化病症特征在于对组织的连续或持续性损伤，使得其不会在初始损伤后的正常愈合中消退。慢性炎症是指持续的炎症反应，其涉及炎症部位(例如，纤维化组织)处存在的细胞类型的逐渐变化。它特征在于炎症过程中的组织的同时破坏和修复。它可以在急性形式炎症之后，或者是长期的低度炎症形式。
临床益处：如本文所用，术语“临床益处”旨在包括治疗的功效和安全性两者。因此，实现期望的临床益处的治疗性处理既有效又安全(例如，具有可耐受或可接受的毒性或不良事件)。
组合性或组合的表位(combinatory or combinatorial epitope)：组合的表位是由组合抗体在通过抗原的一个或多个组分的非连续部分形成的位点(即，抗原决定簇)处识别并结合的表位，所述抗原的一个或多个组分在三维结构中紧密结合在一起以形成表位。因此，本发明的抗体可结合由前/潜在TGFβ1复合物的两种或更多种组分(例如，部分或区段)形成的表位。组合表位可包含来自复合物的第一组分的氨基酸残基，和来自复合物的第二组分的氨基酸残基，等等。每种组分可以是抗原复合物的单一蛋白质或者两种或更多种蛋白质。组合性表位由来自抗原或抗原复合物的两种或更多种组分(例如，部分或区段，例如氨基酸残基)的结构贡献形成。
互补决定区：如本文所用，术语“CDR”意指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，其被称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的确切边界根据不同的系统被不同地界定。由Kabat描述的系统(Kabat等，(1987；1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.))不仅提供了适用于抗体任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定每个重链和轻链上的三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。
构象表位：构象表位是在三维构象中被构象抗体的表位，但在相同氨基酸序列的未折叠肽中则不识别和结合。可以将构象表位称为构象特异性表位、构象依赖性表位或构象敏感性表位。特异性结合这样的表位的相应抗体或其片段可称为构象特异性抗体、构象选择性抗体或构象依赖性抗体。抗原与构象表位的结合取决于所述抗原或抗原复合物的三维结构(构象)。
情境特异性：本发明的情境特异性(或情境选择性)抗体(与“非情境依赖性”抗体相反)能够选择性地结合与特定的生物学情境相关的proTGFβ1复合物的子集，但不是全部。例如，基质选择性靶向使得能够特异性抑制与ECM相关的TGFβ1功能。ECM选择性抑制可以通过使用选择性靶向ECM组分，LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1，的抗体或其片段来实现。因此，本文公开的抗体和片段代表一类情境特异性抗体。TGFβ1激活的LTBP1特异性和LTBP3特异性抑制剂也是情境特异性抗体。
交叉阻断/交叉封闭(Cross-block/cross-blocking)：第一抗体或其抗原结合部分和第二抗体或其抗原结合部分相对于相同抗原彼此交叉阻断，例如，如通过使用标准测试条件，例如，根据制造商的说明(例如，在室温，～20-25℃下测定的结合)，通过生物膜层干涉法(例如Octet)或表面等离子体共振(例如Biacore系统)测量所测定的。第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可以具有相同的表位；可能有不相同但重叠的表位；或者，可以具有在三维空间中非常接近的分开的(不同的)表位，使得抗体结合通过空间位阻交叉阻断。“交叉阻断”是指第一抗体与抗原的结合阻止第二抗体与相同抗原的结合，并且类似地，第二抗体与抗原的结合阻止第一抗体与相同抗原的结合。
解离速率：本文使用的术语解离速率具有相关领域(例如抗体技术)的技术人员理解的含义，如是指通过配体(例如，抗体或片段)与其结合靶标(例如，抗原)解离多快/慢来衡量的动力学参数。解离速率也称为“脱离”速率(“kOFF”)。抗体与其抗原之间的相对结合/解离速率(即kON和kOFF)决定了相互作用或亲和力的整体强度，通常表示为解离常数或KD。因此，可以通过具有快速结合(高kON)、缓慢解离(低kOFF)或这两种因素的贡献来实现等同的亲和力(例如KD值)。单价相互作用可以通过使用单价抗原结合分子/片段，例如fAb(Fab)来测量，而二价相互作用可以通过使用二价抗原结合分子例如全免疫球蛋白(例如，IgG)来测量。解离动力学可以用解离半衰期(有时称为半结合时间)或t1/2表示，定义为一半数量的抗体分子(例如mAb、Fab等)与结合的抗原解离所花费的持续时间。因此，解离速率慢的抗体具有长的半解离期，和解离速率快的抗体具有短的半解离期。
剂量：如本文所用，本发明抗体的典型治疗剂量范围为每剂约1-30mg/kg。典型的给药方案可包括每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每6周一次等。
ECM相关的(或“基质相关的”)TGFβ1：该术语意指是(例如，沉积入)作为细胞外基质的组分(例如，沉积到细胞外基质中)的TGFβ1或其信号传导复合物(例如，前/潜在TGFβ1)。由LTBP1或LTBP3呈递的TGFβ1是ECM相关的TGFβ1。
有效量：“有效量”(或治疗有效量)是在患者群体中达到统计学上显著的临床益处的剂量或给药方案。
纤维化病症：术语“纤维化”或“纤维化状况/病症”意指其特征在于组织或器官内细胞外基质(ECM)组分(例如胶原蛋白)的病理性积累的过程或表现。纤维化可包括原发性纤维化以及与疾病或病症相关的继发性纤维化。
GARP-proTGFβ1：如本文所用，术语“GARP-proTGFβ1”是指包含与糖蛋白-A重复序列为主的蛋白(GARP)或其片段或变体相关的转化生长因子-β1(TGFβ1)的前蛋白形式或潜在形式的蛋白质复合物。proTGFβ1同源二聚体能够通过二硫键与单个GARP分子形成共价结合。术语“GARP-TGFβ1”可以互换使用。GARP-proTGFβ1表达仅限于某些细胞类型，例如调节性T细胞(Treg)。
人抗体：如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本公开的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中(例如，CDR-H3或CDR-L3诱变)。
人源化抗体：术语“人源化抗体”意指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变结构区序列，但其中至少一部分VH和/或VL序列已被改变为更“人样”，即更类似于人种系可变序列的抗体。一种类型的人源化抗体是CDR移植抗体。
免疫抑制(Immune suppression/immunosuppression)：术语免疫抑制是指抑制或降低身体免疫系统的强度。“受益于免疫抑制”的患者包括患有晚期器官纤维化并且是移植的候选人、正在考虑或已经接受移植的那些患者。
同工型特异性：术语“同工型特异性”意指试剂区分一种同工型与其他结构上相关的同工型的能力(即，选择性)。同工型特异性TGFβ抑制剂在给定浓度下对TGFβ的一种同工型发挥其抑制活性，但不对TGFβ的其他同工型发挥抑制活性。例如，同工型特异性TGFβ1抗体选择性地结合TGFβ1。TGFβ1特异性抑制剂(抗体)以显著更高的亲和力优先于TGFβ2或TGFβ3靶向(结合且从而抑制)TGFβ1同工型。例如，在这种情境下的选择性可以指通过体外结合分析例如Octet和Biacor测量的相应亲和力的至少500-1000倍的差异。在一些实施方式中，所述选择性是使得当抑制剂以有效抑制体内TGFβ1的剂量使用时不抑制TGFβ2和TGFβ3。本公开的情境特异性抑制剂也是同工型特异性的。
分离的：如本文所用，“分离的”抗体意指基本上不含有其他具有不同的抗原特异性的抗体的抗体。在一些实施方式中，分离的抗体基本上不含有其他非预期的细胞物质和/或化学物质。
长期或慢性施用：如本文所用，涉及超过六个月治疗的治疗方案被认为是长期的。在某些患者群体中，长期治疗方案涉及无限期地施用药物(例如情境选择性TGFβ1抑制剂)。
LRRC33-proTGFβ1：如本文所用，术语“LRRC33-TGFβ1复合物”意指前蛋白形式或潜在形式的转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白与含富亮氨酸重复序列蛋白33(LRRC33；也称为活性氧物质的负调节剂或NRROS)或其片段或变体之间的复合物。在一些实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的LRRC33。在其他实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的LRRC33。在一些实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的LRRC33-TGFβ1复合物。
LTBP1-TGFβ1：如本文所用，术语“LTBP1-TGFβ1复合物”(或“LTBP1-proTGFβ1复合物”)意指包含前蛋白形式或潜在形式的转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白(本文中可称为“proTGFβ1”)与潜在TGF-β结合蛋白1(LTBP1)或其片段或变体的蛋白复合物。在一些实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的LTBP1。在其他实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的LTBP1。在一些实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的LTBP1-TGFβ1复合物。示例性的LTBP1-TGFβ1复合物示于图3中。
LTBP3-TGFβ1：如本文所用，术语“LTBP3-TGFβ1复合物”(或“LTBP3-proTGFβ1复合物”)意指包含前蛋白形式或潜在形式的转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白(本文中可称为“proTGFβ1”)与潜在TGF-β结合蛋白3(LTBP3)或其片段或变体的蛋白复合物。在一些实施方式中，LTBP3-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的LTBP3。在其他实施方式中，LTBP3-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的LTBP1。在一些实施方式中，LTBP3-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的LTBP3-TGFβ1复合物。示例性的LTBP3-TGFβ1复合物显示在图3中。
巨噬细胞：巨噬细胞是免疫系统的白细胞的一种类型，且包括异质的、表型多样的骨髓细胞亚群。一些巨噬细胞从骨髓来源的循环单核细胞分化，而其他巨噬细胞则是驻留于特定解剖或组织位置内的组织特异性巨噬细胞(“常驻”巨噬细胞)。组织特异性巨噬细胞包括但不限于：脂肪组织巨噬细胞；Kupffer细胞(肝脏)；鼻窦组织细胞(淋巴结)；肺泡巨噬细胞(或尘细胞，肺的肺泡)；导致巨细胞(结缔组织)的组织巨噬细胞(组织细胞)；Langerhans细胞(皮肤和粘膜)；小胶质细胞(中枢神经系统)；Hofbauer细胞(胎盘)；肾小球内系膜细胞(肾)；破骨细胞(骨)；上皮样细胞(肉芽肿)；红髓巨噬细胞(或窦状隙内衬细胞，脾红髓)；腹膜巨噬细胞(腹腔)；和LysoMac(Peyer集合淋巴小结)。巨噬细胞，例如骨髓来源的单核细胞，可以被某些刺激物(例如细胞因子)激活，从而导致极化表型，例如，M1和M2。M2偏倚激活的巨噬细胞进一步分为几种表型不同的亚型，例如M2a、M2b、M2c(例如，促纤维化)和M2d(促肿瘤或TAM样)。
基质相关proTGFβ1：LTBP1和LTBP3是作为细胞外基质(ECM)组分的呈递分子。LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1可以统称为“ECM相关的”(或“基质相关的”)proTGFβ1复合物，其介导ECM相关的TGFβ1激活/信号传导。
最大耐受剂量(MTD)：出于安全/毒理学考虑，术语MTD通常指以无可见不良反应水平(NOAEL)评价的最高量的待测物(如TGFβ1抑制剂)。例如，在大鼠中Ab2的NOAEL是评价的最高剂量(100mg/kg)，表明基于四周的毒理学研究，Ab2的MTD>100mg/kg。
骨髓来源的抑制细胞：骨髓来源的抑制细胞(MDSC)是在各种病理条件下产生的异质性细胞群体，并且其被认为代表单核细胞和相对不成熟的中性粒细胞激活的病理状态。MDSC包括至少两类细胞，其被称为i)“粒细胞”(G-MDSC)或多形核细胞(PMN-MDSC)，其在表型和形态上均与中性粒细胞相似；和ii)单核细胞(M-MDSC)，其在表型和形态上与单核细胞相似。MDSC具有独特的基因组和生化特征集合，并且可以通过特定的表面分子来区分。例如，人G-MDSC/PMN-MDSC通常表达细胞表面标志物CD11b、CD33、CD15和CD66。此外，人G-MDSC/PMN-MDSC还可以表达HLA-DR和/或精氨酸酶。相比之下，人M-MDSC通常表达细胞表面标志物CD11b、CD33和CD14。MDSC还可表达CD39和CD73以介导参与器官纤维化(如肝纤维化和肺纤维化)、癌症和骨髓纤维化的腺苷信号传导。此外，人M-MDSC还可以表达HLA-DR。除了此类细胞表面标志物以外，MDSC特征还在于抑制免疫细胞(如T细胞、NK细胞和B细胞)的能力。MDSC的免疫抑制功能可以包括抑制抗原非特异性功能和抑制抗原特异性功能。MDSC可以表达细胞表面LRRC33和/或LRRC33-proTGFβ1。
肌成纤维细胞：肌成纤维细胞是具有成纤维细胞和平滑肌细胞的某些表型的细胞，且通常表达波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；人基因ACTA2)和帕拉丁蛋白(paladin)。在涉及细胞外基质失调(如基质硬度增加)的多种疾病状态中，正常成纤维细胞以TGFβ依赖性方式变得去分化成肌成纤维细胞。
解离速率(kOFF)：脱离速率是抗体(例如mAb)或抗原结合片段(例如fAb)与其抗原多快或多慢解离的动力学参数，且也可以称为解离速率。解离速率可以在适宜的体外结合分析中通过实验测量，例如基于BLI
Figure BDA0003288375730000341
和/或SPR(Biacore)的系统。在抗体-抗原结合动力学的情况中，术语“半结合时间”(T1/2)或“半解离时间”是指一半数量的抗体分子(例如，mAb、Fab)与结合的抗原(例如，LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1)解离所需的持续时间。因此，从其抗原缓慢解离(即低解离速率)的抗体具有长的T1/2。相反，与其抗原快速解离(即高解离速率)的抗体具有较短的T1/2。
泛-TGFβ抑制剂/TGFβ的泛抑制：术语“泛-TGFβ抑制剂”指能够抑制或拮抗TGFβ的全部三种同工型的任何药剂。此类抑制剂可以是TGFβ同工型的小分子抑制剂。该术语包括泛-TGFβ抗体，其指能够结合每种TGFβ同工型(即，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的任何抗体。在一些实施方式中，泛-TGFβ抗体结合并中和全部三种同工型的活性(即，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3活性)。
效力：如本文所用，术语“效力”指药物(如具有抑制活性的功能性抗体(或片段))相对于产生限定作用的药物浓度或量的活性。例如，能够在给定剂量下产生某些作用的抗体要比为产生等同作用需要两倍量(剂量)的另一抗体强效。可以在基于细胞的分析法(如TGFβ激活/抑制测定)中测量效力。在一些情况下，可以在基于细胞的系统中在存在或不存在测试物(例如，抑制性抗体)的条件下测量TGFβ激活(如由整联蛋白结合触发的激活)的程度。通常，具有较高亲和力的抗体倾向于显示出比具有较低亲和力的抗体更高的效力。
呈递分子：呈递分子是与潜在前蛋白(例如，proTGFβ1)形成共价键，并将无活性复合物“呈递”到细胞外小生境(如ECM或免疫细胞表面)，从而保持其潜伏直至激活事件发生的蛋白。针对proTGFβ1的已知呈递分子包括：LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33，其可形成呈递分子-proTGFβ1复合物，即分别LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。LTBP1和LTBP3是胞外基质(ECM)的组分；因此，可以将LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1统称为“ECM相关的”(或“基质相关的”)proTGFβ1复合物，其介导ECM-相关的TGFβ1信号传导/活性。另一方面，GARP和LRRC33是在某些细胞的细胞表面上表达的跨膜蛋白；因此，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1可以统称为“细胞相关”(或“细胞表面”)proTGFβ1复合物，其介导细胞相关的(例如，免疫细胞相关的)TGFβ1信号传导/活性。
ProTGFβ1：如本文所用，术语“proTGFβ1”旨在涵盖包含复合物内的TGFβ1前结构域序列的非活性TGFβ1复合物的前体形式。因此，该术语可包括TGFβ1的前形式以及潜在形式。表述“前/潜在TGFβ1”可互换使用。TGFβ1的“前”形式存在于弗林位点处蛋白水解切割之前。一旦切割，所得的形式称为TGFβ1的“潜在”形式。“潜在”复合物保持关联直到进一步激活触发，例如整联蛋白驱动的激活事件。proTGFβ1复合物由用二硫键连接的二聚体TGFβ1前蛋白多肽组成。潜在二聚体复合物通过每个proTGFβ1多肽第4位的半胱氨酸残基(Cys4)共价连接单一呈递分子。形容词“潜在”可通常用于描述在整联蛋白介导的或其他激活事件之前的TGFβ1的“非活性”状态。proTGFβ1多肽含有前结构域(LAP)和生长因子结构域(SEQ ID NO:12)。
调节性T细胞(Treg)：“调节性T细胞”或Treg是一种类型的免疫细胞，其特征在于表达生物标志物CD4、叉头盒P3(FOXP3)和CD25，以及STAT5。Treg有时被称为抑制性T细胞，且代表调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫疾病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制性的并且通常抑制或下调效应T(Teff)细胞的诱导和增殖。Treg可以在胸腺中发育(所谓的CD4+Foxp3+“天然”Treg)或在抗原呈递细胞(APC)启动幼稚CD4+T细胞后在外周分化，例如，在暴露于TGFβ或视黄酸之后。Treg细胞产生和分泌细胞因子，包括IL-10和TGFβ1。通常，Treg和Th17细胞的分化呈负相关。
特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”意指抗体或其抗原结合部分与抗原的相互作用依赖于特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，所述抗体或其抗原结合部分结合特定蛋白而不是一般地结合蛋白。在一些实施方式中，如果抗体对靶标的KD为至少约10-6M，则抗体或其抗原结合部分特异性结合靶标，例如TGFβ1。更优选地，这种抗体的测量KD值范围在10-100nM之间。更优选地，这种抗体的测量KD值范围在0.1-10nM之间。
受试者：术语“受试者”在治疗应用的背景下意指接受临床护理或干预(如治疗、诊断等)的个体。适宜的受试者包括脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，人类和非人类哺乳动物)。在受试者是人受试者的情况下，术语“患者”可以互换使用。在临床背景下，术语“患者群体”或“患者亚群”用于指属于一组标准的一组个体，例如临床标准(例如，疾病表现、疾病阶段、对某些病症的易感性、对治疗的响应性等)、病史、健康状况、性别、年龄组、遗传标准(如某些突变、多态性、基因重复、DNA序列重复等的携带者)和生活方式因素(如吸烟、饮酒、运动等)。
TGFβ抑制剂：术语“TGFβ抑制剂”意指能够拮抗TGFβ生长因子(例如，TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3)的生物活性或功能的任何药剂。该术语不旨在限制其作用机制，并且包括例如中和抑制剂、受体拮抗剂、可溶性配体捕获剂和TGFβ的激活抑制剂。
T辅助17细胞：T助辅17细胞(Th17)是促炎性T辅助细胞的子集，其特征在于标志物STAT3和RORγt以及包括白细胞介素17(IL-17A/F)和IL-22的细胞因子的产生。当幼稚T细胞暴露于TGFβ和IL-6时，Th17细胞被分化。Th17细胞通常与组织炎症、自身免疫和某些病原体的清除相关。Th17细胞和Treg细胞的分化一般反向相关。Th17-Treg比率(例如，“Th17/Treg”)的不平衡参与许多病理，例如纤维化病症和自身免疫病症。
Th17/Treg比率：Th17-Treg比率是指在目的组织或样品中Th17细胞数量与Treg细胞数量的测量的比率(相对比例)。通常，已知的细胞标志物用于识别、分选或分离细胞类型。此类标志物包括在特定细胞类型上表达的细胞表面分子；由特定细胞类型产生(例如，分泌)的细胞因子或一组细胞因子，和/或用作特定细胞类型的印记/特征的某些基因标志物的mRNA表达。例如，一(1)的Th17/Treg比率意味着在被评估的组织或样品内存在相等或相同数量的每一种细胞类型。二(2)的Th17/Treg比率意味着与组织或样品中的Treg细胞相比，Th17细胞的数量大约是其两倍。Th17/Treg比率升高可能是由于Th17细胞数量增加、Treg细胞数量减少或其组合。
治疗窗口：术语“治疗窗口”是指在受试者中产生治疗反应，而不引起显著的/可观察的/不可接受的副作用(例如，在可接受或可耐受的副作用内)的剂量/浓度的范围。可以将治疗窗口计算为最小有效浓度(MEC)与最小毒性浓度(MTC)的比率。为了说明，以10mg/kg达到体内功效并以100mg/kg显示出耐受性或可接受的毒性的TGFβ1抑制剂提供了至少10倍(例如，10x)的治疗窗口。相比之下，在10mg/kg下有效，但在5mg/kg下引起不良反应的TGFβ泛抑制剂被称为具有“剂量限制性毒性”。例如，申请人已经发现，在临床前模型如大鼠中，非情境依赖性TGFβ1抑制剂抗体在约<3至30mg/kg/周范围的剂量下是有效的，并且无至少100mg/kg/周持续4周的TGFβ泛抑制相关的可观察的毒性。基于此，非情境依赖性TGFβ1抑制剂抗体显示出至少3.3倍和高达33倍的治疗窗口。
毒性：如本文所用，术语“毒性(toxicity或toxicities)”意指在患者中与施用至患者的疗法相关的有害体内作用，例如不希望的副作用和不良事件。“耐受性”意指与治疗或治疗方案相关的毒性水平，其可由患者合理地耐受而无需由于毒性而中断治疗(即可接受的毒性水平)。通常，在临床开发之前，在一个或多个临床前模型中进行毒性/毒理学研究以评估药物候选物(例如，单克隆抗体疗法)的安全性特征。毒性/毒理学研究可以帮助确定测试物的“无观察的不良反应水平(NOAEL)”和“最大耐受剂量(MTD)”，据此可以推导出治疗窗口。优选地，应选择显示为对特定干预敏感的物种作为进行安全性/毒性研究的临床前动物模型。在TGFβ抑制的情况下，适宜的物种包括大鼠、狗和食蟹猴。据报道，小鼠对TGFβ的药理学抑制较不敏感，并且可能不会揭示出在其他物种(包括人类)中具有潜在危险的毒性，尽管某些研究报道了在小鼠中使用TGFβ泛抑制观察到了毒性。为了说明，基于四周的毒理学研究，大鼠中的非情境依赖性TGFβ1抑制剂抗体的NOAEL为所评价的最高剂量(100mg/kg)，其表明MTD为每周>100mg/kg。
治疗/处理(treat/treatment)：术语“治疗”或“处理”包括治疗性处理、预防性处理和其中降低受试者发生障碍或其他风险因素的风险的应用。因此，该术语旨在广泛地意指：通过例如提高或增强身体的免疫力而在患者中引起治疗益处；减少或逆转免疫抑制；从身体减少、移除或消除有害细胞或物质；减轻疾病负担(例如，肿瘤负荷)；预防再发或复发；延长不应期，和/或另外地提高生存。治疗不要求病症的完全治愈，并且包括其中减轻症状或潜在风险因素的实施方式。在联合疗法的情况下，该术语还可以指：i)第二治疗降低第一治疗的有效剂量以减少副作用和增加耐受性的能力；ii)第二疗法赋予患者对第一疗法的更高反应的能力；和/或iii)实现累加或协同临床益处的能力。
可变区：术语“可变区”或“可变域”意指抗体的轻链和/或重链的一部分，典型地大致包括在重链中氨基端120到130个氨基酸和轻链中约100至110个氨基端氨基酸。在某些实施方式中，甚至在相同物种的抗体之间不同抗体的可变区在氨基酸序列上差异很大。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
TGFβ1
在哺乳动物中，转化生长因子-β(TGFβ)超家族由至少33种基因产物组成。这些包含骨形态发生蛋白(BMP)、激活素、生长和分化因子(GDF)以及TGFβ家族的三种同工型：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。TGFβ被认为在多样的过程中起关键作用，如抑制细胞增殖、细胞外基质(ECM)重塑和免疫内稳态。通过观察到TGFβ1-/-小鼠仅存活3-4周，而由于大量免疫激活而导致多器官衰竭，证明了TGFβ1对T细胞内稳态的重要性(Kulkarni,A.B.等，Proc NatlAcad Sci U S A,1993.90(2):p.770-4；Shull,M.M.等，Nature,1992.359(6397):p.693-9)。TGFβ2和TGFβ3的作用尚不清楚。尽管这三种TGFβ同工型具有不同的时间和空间表达模式，但其通过相同受体TGFβRI和TGFβRII发出信号，尽管在某些情况下，例如对于TGFβ2信号传导，还需要III型受体(如β聚糖)(Feng,X.H.和R.Derynck,Annu Rev Cell Dev Biol,2005.21:p.659-93；Massague,J.,Annu Rev Biochem,1998.67:p.753-91)。配体诱导的TGFβRI/II寡聚化触发SMAD转录因子的磷酸化，从而导致靶基因(如Col1a1、Col3a1、ACTA2和SERPINE1)的转录(Massague,J.,J.Seoane和D.WO tton,Genes Dev,2005.19(23):p.2783-810)。还已经描述了非SMAD依赖性的TGFβ信号传导途径，例如，在癌症中或在马凡氏(Marfan)小鼠的主动脉病变中(Derynck,R.和Y.E.Zhang,Nature,2003.425(6958):p.577-84；Holm,T.M.等，Science,2011.332(6027):p.358-61)。
已通过遗传疾病验证了TGFβ途径在人体中的生物学重要性。Camurati-Engelman病由于TGFB1基因的常染色体显性突变导致骨发育不良，从而导致TGFβ1信号传导的组成性激活(Janssens,K.等，JMed Genet,2006.43(1):p.1-11)。Loeys/Dietz综合征患者在TGFβ信号传导途径的组分中携带常染色体显性突变，其导致主动脉瘤、器官过距(hypertelorism)和悬雍垂裂(bifid uvula)(Van Laer,L.,H.Dietz和B.Loeys,Adv ExpMed Biol,2014.802:p.95-105)。由于TGFβ途径失调参与多种疾病，因而已开发出多种靶向TGFβ途径的药物并在患者中进行了测试，但成功有限。迄今为止描述的大多数TGFβ抑制剂缺乏同工型特异性，如下简要概述。
Fresolimumab是一种结合并抑制TGFβ的所有三种同工型人源化单克隆抗体，其已在患有局灶节段性肾小球硬化、恶性黑色素瘤、肾细胞癌和系统性硬化症的患者中进行临床测试(Rice,L.M.等，J Clin Invest,2015.125(7):p.2795-807；Trachtman,H.等，KidneyInt,2011.79(11):p.1236-43；Morris,J.C.等，PLoS One,2014.9(3):p.e90353)。其他公司开发了针对TGFβ生长因子的单克隆抗体，其对TGFβ同工型具有不同的选择性水平。这些药剂可能通过对除TGFβ1之外的其他TGFβ家族成员的残留活性在体内引起毒性。这种同工型特异性缺乏可能是由于同工型之间的高度序列同一性。
其他靶向TGFβ途径的方法包括ACE-1332，一种来自Acceleron的可溶性TGFβRII-Fc配体陷阱(Yung,L.M.等，A Am J Respir Crit Care Med,2016.194(9):p.1140-1151)，或ALK5激酶的小分子抑制剂，例如Eli Lilly’s galunisertib。ACE-1332以同样高的亲和力结合TGFβ1和TGFβ3(Yung,L.M.等，Am J Respir Crit Care Med,2016.194(9):p.1140-1151)，并且ALK5抑制剂阻断通过TGFR1发出信号的所有生长因子的活性。在使用ALK5抑制剂的临床前研究中发现了显著毒性(Anderton,M.J.等，Toxicol Pathol,2011.39(6):p.916-24；Stauber,A.等，Clinical Toxicology,2014.4(3):p.1-10)，且需要复杂的临床给药方案来维持疗效而同时减少不良事件(Herbertz,S.等，Drug Des Devel Ther,2015.9:p.4479-99)。事实上，在大多数(如果不是全部)尝试阻断TGFβ的候选药物中，没有产生TGFβ信号传导特异性及其对已知TGFβ抑制剂所观察到的毒性的可能影响的问题。例如，有多少毒性是由于TGFβ1相对TGFβ2和/或TGFβ3的抑制引起的，这一点尚未解决。同样，在设计或开发拮抗TGFβ信号传导的方式时，也没有考虑TGFβ激活的模式。
最近对TGFβ1激活机制的结构性见解(Shi,M.等,Nature,2011.474(7351):p.343-9)实现更特异性的TGFβ抑制方法(参见，例如，PCT/US2017/21972，其全部内容以引用方式并入本文)。与其他细胞因子不同，TGFβ超家族成员不作为活性生长因子分泌，而是作为由N端前结构域和C端生长因子结构域组成的二聚体前蛋白。弗林蛋白酶对proTGFβ1的切割将同源二聚体生长因子结构域与其前结构域(也称为潜在相关肽(LAP))分开。然而，生长因子和LAP保持非共价结合，从而形成潜在复合物，其无法与其受体结合和诱导信号传导。在翻译过程中，潜在TGFβ1，也称为小潜在复合物(SLC)，变成通过二硫键与“呈递分子”相连接，从而形成大潜在复合物(LLC)。这些分子允许proTGFβ1在特定的细胞或组织情境中呈递。靠近潜在TGFβ1的N末端的两个半胱氨酸与呈递分子上适当定位的半胱氨酸连接。呈递分子的身份取决于环境和产生潜在TGFβ1的细胞类型。例如，成纤维细胞分泌栓系于潜在TGFβ结合蛋白(LTBPs)的潜在TGFβ1，其然后与细胞外基质(ECM)中的蛋白质(即纤连蛋白、原纤维蛋白-1)相结合以将潜在TGFβ与ECM连接(Robertson等Matrix Biol 47:44-53(2015))(图2A)。在激活的调节性T细胞表面上，潜在TGFβ1共价连接到跨膜蛋白GARP(糖蛋白-A重复序列为主的蛋白质(GARP)，和与GARP紧密相关的蛋白，LRRC33(含富亮氨酸重复序列蛋白33)，用作在单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞表面上的TGFβ1的呈递分子(Wang,R.等,Mol BiolCell,2012.23(6):p.1129-39和T.A.Springer,Int.BMP Conference 2016)。
许多研究阐明了TGFβ1激活的机制。三种整联蛋白αVβ6、αVβ8和αVβ1已被证明是潜在TGFβ1的关键激活剂(Reed,N.I.等,Sci Transl Med,2015.7(288):p.288ra79；Travis,M.A.和D.Sheppard,Annu Rev Immunol,2014.32:p.51-82；Munger,J.S.等,Cell,1999.96(3):p.319-28)。αV整联蛋白以高亲和力结合TGFβ1和TGFβ1LAP中存在的RGD序列(Dong,X.等,Nat Struct Mol Biol,2014.21(12):p.1091-6)。具有TGFβ1RGD位点中的突变的转基因小鼠阻止整联蛋白结合，但不阻止分泌，拟表型TGFβ1-/-小鼠(Yang,Z.等,J Cell Biol,2007.176(6):p.787-93)。缺乏β6和β8整联蛋白的小鼠重演了TGFβ1和TGFβ3敲除小鼠的所有关键表型，包括多器官炎症和腭裂，从而证实了这两种整联蛋白在发育和体内平衡中对TGFβ1激活的重要作用(Aluwihare,P.等,J Cell Sci,2009.122(Pt 2):p.227-32)。潜在TGFβ1的整联蛋白依赖性激活的关键是共价栓系于呈递分子；通过诱变破坏GARP和TGFβ1LAP之间的二硫键不会损害复合物的形成，但完全消除通过αVβ6的TGFβ1激活(Wang,R.等,Mol Biol Cell,2012.23(6):p.1129-39)。潜在TGFβ1的最新结构阐明了整联蛋白如何实现从潜在复合物释放活性TGFβ1：潜在TGFβ1与其呈递分子的共价连接锚定潜在TGFβ1，通过LTBP连接到ECM或通过GARP或LRRC33连接到细胞骨架。整联蛋白与RGD序列的结合导致LAP结构的力依赖性变化，从而允许释放活性TGFβ1并结合附近的受体(Shi,M.等,Nature,2011.474(7351):p.343-9)。整联蛋白依赖性TGFβ1激活在疾病中的重要性也已得到充分验证。αVβ1的小分子抑制剂防止博来霉素诱导的肺纤维化和四氯化碳诱导的肝纤维化(Reed,N.I.等,Sci Transl Med,2015.7(288):p.288ra79)，和抗体的αVβ6阻断或整联蛋白β6表达的缺失抑制博来霉素诱导的肺纤维化和辐射诱导的纤维化(Munger,J.S.等,Cell,1999.96(3):p.319-28)；Horan,G.S.等,Am J Respir Crit Care Med,2008.177(1):p.56-65)。除整联蛋白外，还涉及TGFβ1激活的其他机制，包括血小板反应蛋白-1和通过蛋白酶如基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶D或激肽释放酶的激活。然而，这些研究中的大部分是使用纯化的蛋白质在体外进行的；体内研究中关于这些分子的作用的证据较少。敲除血小板反应蛋白-1重演了某些组织中TGFβ1-/-表型的某些方面，但对博莱霉素诱导的肺纤维化没有保护作用，已知为TGFβ依赖性的(Ezzie,M.E.等,Am J Respir Cell Mol Biol,2011.44(4):p.556-61)。此外，候选蛋白酶的敲除不会导致TGFβ1表型(Worthington,J.J.,J.E.Klementowicz和M.A.Travis,Trends Biochem Sci,2011.36(1):p.47-54)。这可以通过冗余或通过这些机制在特定疾病中而不是发育和内平衡中至关重要来解释。
TGFβ参与许多生物过程，包含纤维化、免疫调节和癌症进展。TGFβ1是第一个被鉴定的TGFβ蛋白质超家族成员。与TGFβ超家族的其他成员一样，TGFβ1及同工型TGFβ2和TGFβ3最初表达为无活性的前体前蛋白形式(称为proTGFβ)。TGFβ蛋白(例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)被前蛋白转化酶(例如弗林蛋白酶)蛋白水解裂解以产生潜在形式(称为潜在TGFβ)。在一些实施方式中，TGFβ蛋白(例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的前蛋白形式或潜在形式可称为“前/潜在TGFβ蛋白”。TGFβ1可以呈递于与多种分子复合物的其他分子，包含例如GARP(以形成GARP-TGFβ1复合物)、LRRC33(以形成LRRC33-TGFβ1复合物)、LTBP1(以形成LTBP1-TGFβ1复合物)和/或LTBP3(以形成LTBP3-TGFβ1复合物)。这些复合物中存在的TGFβ1可以是潜在形式(潜在TGFβ1)或前体形式(proTGFβ1)。
TGF抑制剂的同工型选择性和作用机制
从安全性的角度来看，人们越来越认识到跨同工型的TGFβ广泛抑制可能是观察到的毒性的原因，这印证了迄今为止还没有成功开发出TGFβ抑制剂的事实。为了规避潜在危险的不良反应，许多团体最近转向鉴定靶向亚组(但不是全部)同工型并仍保持效力的抑制剂。然而，从疗效的角度来看，该领域的主流观点仍然是抑制TGFβ的多种同工型以达到治疗效果是有利的，为此，建议通过“谨慎给药方案”进行毒性管理作为解决方案(Brennan等，(2018)mAbs,10:1,1-17)。与这一前提一致，许多团体正在开发靶向一种以上同工型的TGFβ抑制剂。这些包含TGFβ受体的低分子量拮抗剂，例如ALK5拮抗剂，例如Galunisertib(LY2157299一水合物)；抑制所有三种同工型的单克隆抗体(例如中和抗体)(“泛抑制剂”抗体)(参见，例如，WO 2018/134681)；优先抑制三种同工型中的两种的单克隆抗体(例如，针对TGFβ1/2(例如WO 2016/161410)和TGFβ1/3(例如WO2006/116002)的抗体)；以及工程化分子(例如，融合蛋白)，例如配体陷阱(例如，WO 2018/029367；WO 2018/129331和WO2018/158727)。类似地，整联蛋白如αVβ6的抑制剂也阻断TGFβ1和TGFβ3的整联蛋白依赖性激活，并因此可被视为TGFβ信号传导的同工型非选择性抑制剂。此外，选择性结合和中和TGFβ1和TGFβ2的抗体(即，TGFβ1/2抑制剂)的实例包含XOMA 089(或NIS793)和变体(参见例如WO2016/161410)。
此前，申请人证明，即使在共表达TGFβ1/3的肿瘤中，单独抑制TGFβ1也足以使免疫抑制性肿瘤对检查点抑制剂疗法敏化(PCT/US2019/041373)。类似地，TGFβ1选择性抑制剂在临床前模型中显示减轻纤维化，包含其中TGFβ1/3同工型在纤维化组织中共表达的小鼠肝纤维化模型，尽管是在离散细胞类型中，如通过免疫组织化学观察到的(数据现在显示)。令人惊讶的是，TGFβ3的抑制促进了促纤维化表型。当单独使用TGFβ3抑制剂时，观察到纤维化加剧。此外，当与TGFβ1选择性抑制剂联合使用时，TGFβ3抑制剂减弱了TGFβ1选择性抑制剂的抗纤维化作用，如通过纤维化肝脏中胶原蛋白积累增加所证明的。这些结果提出了一种可能性，即对TGFβ3的抑制效力可能是TGFβ抑制剂在纤维化受到关注的情况中用作治疗的不希望的特征。
在纤维化情况之外，这一意外发现还有更广泛的意义，因为促纤维化表型(例如，胶原蛋白沉积到ECM中增加)不仅与纤维化有关，而且与癌症进展的方面有关，例如肿瘤侵袭和转移。参见例如，Chakravarthy等(Nature Communications,(2018)9:4692.“TGF-β-associated extracellular matrix genes link cancer-associated fibroblasts toimmune evasion and immunotherapy failure”)。ECM失调的患病组织，包含各种肿瘤类型的纤维化组织和基质，可以表达TGFβ1和TGFβ3。截至今天，多个团队正在努力开发靶向这两种同工型的TGFβ抑制剂，例如配体陷阱、中和抗体和整联蛋白抑制剂。然而，本文提出的发现警告，这种方法实际上可能会加剧(例如，恶化)疾病。
因此，本公开提供的教导是对于涉及ECM失调的病症如纤维化和癌症的治疗，应该选择不特异性靶向TGFβ3的TGFβ抑制剂。优选地，这种抑制剂是TGFβ1的同工型选择性抑制剂，例如选择性靶向LTBP1/3相关的TGFβ1的抑制剂(例如，如本文所公开的)。相关方法包括选择用于治疗受试者的纤维化病症的TGFβ抑制剂的方法，其中该方法包括以下步骤：测试一种或多种候选抑制剂抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的能力的效力，并且选择抑制TGFβ1但不抑制TGFβ3的抑制剂用于治疗用途。相关的治疗方法可以进一步包括以足以治疗纤维化病症或治疗患有纤维化病症或有发生纤维化病症的风险的受试者的量向受试者施用抑制TGFβ1但不抑制TGFβ3的抑制剂的步骤。优选地，所选择的抑制剂是选择性抑制LTBP1-和/或LTBP3-相关的TGFβ1信号传导的抗体或其片段(例如，如本文所公开的)。在一些实施方式中，有发生纤维化病症风险的受试者可能患有代谢障碍，例如糖尿病、肥胖症和NASH。建议排除患者亚群旨在降低触发、促进或加剧促纤维化作用的风险。
除了上面关注的抑制TGFβ3的可能问题外，Takahashi等(Nat Metab.2019,1(2):291-303)最近报道了TGFβ2在调节代谢方面的有益作用。作者将TGFβ2鉴定为一种运动诱导的脂肪细胞因子，它在体外刺激葡萄糖和脂肪酸摄取，以及在体内的组织葡萄糖摄取；其改善肥胖小鼠中的新陈代谢；以及其减少了高脂肪饮食引起的炎症。此外，作者观察到，乳酸(是运动过程中从肌肉释放的一种代谢物)刺激人脂肪细胞中的TGFβ2表达，且降乳酸剂降低循环TGFβ2水平并减少运动刺激的葡萄糖耐量改善。这些观察结果表明，治疗性使用对TGFβ2同工型具有抑制活性的TGFβ抑制剂可能至少在代谢方面是有害的。
不受特定理论的束缚，预期选择TGFβ1选择性抑制剂作为TGFβ抑制剂用于治疗代谢疾病如与NASH相关的肝纤维化是有利的。在优选的实施方式中，选择用于治疗代谢疾病的TGFβ1选择性抑制剂选择性地抑制LTBP1/3相关的TGFβ1，例如本文公开的抗体和片段。因此，本发明包含一种用于治疗受试者代谢疾病的TGFβ抑制剂，其中所述治疗包含选择抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2的TGFβ抑制剂，任选地其中所述抑制剂是TGFβ1选择性的，和将抑制剂施用于患有代谢疾病的受试者。该代谢疾病可以是肝脏疾病，例如肝纤维化、NASH、NAFLD，任选地伴有肥胖症和/或2型糖尿病。在优选的实施方式中，TGFβ1选择性抑制剂是选择性靶向基质相关的TGFβ1(例如LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1)的抗体或其抗原结合片段，例如本文公开的那些。
在优选的实施方式中，用于治疗纤维化病症的TGFβ抑制剂是能够在体内靶向基质相关的含TGFβ1的潜在复合物的TGFβ1的同工型选择性激活抑制剂(例如本文公开的具有低kOFF或长t1/2的新型抗体)。
本公开的抗体通过阻止TGFβ1激活的步骤起作用。在一些实施方式中，这些抑制剂可抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性(例如，机械或力驱动)的激活。在一些实施方式中，这些抑制剂可抑制蛋白酶依赖性或蛋白酶诱导的TGFβ1激活。后者包含以非整联蛋白依赖性的方式抑制TGFβ1激活步骤的抑制剂。在一些实施方式中，这些抑制剂可以抑制TGFβ1激活，而不管激活模式如何，例如抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和蛋白酶依赖性激活。可激活TGFβ1的蛋白酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶，例如激肽释放酶、化学胰蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、凝血酶，以及锌金属蛋白酶(MMP家族)，例如MMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-13和ADAM蛋白酶(例如，ADAM10和ADAM17)。激肽释放酶包含血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶，例如KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14和KLK15。
潜在TGFβ结合蛋白(LTBP)
在哺乳动物中，有四种已知的LTBP，LTBP1-4，其每一个有多个剪接变体(Robertson,I.B.等,Matrix Biol,2015.47:p.44-53)。LTBP2是唯一不与潜在TGFβ相关的LTBP(Saharinen,J.和J.Keski-Oja,Mol Biol Cell,2000.11(8):p.2691-704)。虽然LTBP1或LTBP3与潜在TGFβ1之间的关联已得到充分验证，但LTBP4在TGFβ呈递中的作用尚不清楚。LTBP4和潜在TGFβ1的复合物似乎形成的效率要低得多，这可能是由于LTBP4的TGFβ结合结构域中不存在几个带负电荷的残基(Saharinen,J.和J.Keski-Oja,Mol Biol Cell,2000.11(8):p.2691-704；Chen,Y.等，J Mol Biol,2005.345(1):p.175-86)。LTBP4S-/-小鼠和Urban-Rifkin-Davis综合征患者(其具有LTBP4中的无效突变)具有破坏的弹性纤维组装(Urban,Z.等，Am J Hum Genet,2009.85(5):p.593-605；Dabovic,B.等，J CellPhysiol,2015.230(1):p.226-36)。此外，虽然LTBP4S-/-小鼠具有肺分隔和弹性组织生成缺陷，但具有不能与潜在TGFβ1形成复合物的LTBP4的转基因小鼠没有明显的表型(Dabovic,B.等，J Cell Physiol,2015.230(1):p.226-36)。LTBP4是否通过用作呈递分子直接参与潜在TGFβ1的调节尚不清楚；相反，LTBP4可能是ECM中弹性原纤维的正确形成所必需的，并且它的损失通过ECM中的缺陷间接影响潜在TGFβ1激活。
一个方面，本发明涉及抑制剂，例如免疫球蛋白，例如抗体或者其抗原结合部分，其选择性地结合含有TGFβ前蛋白和LTBP蛋白(例如，LTBP1或LTBP3)的复合物。在一个优选的实施方式中，TGFβ蛋白是TGFβ1。在一些实施方式中，本文公开的结合分子选择性结合含有前/潜在TGFβ1和LTBP1或LTBP3的复合物。此类结合分子可以允许以情境依赖性方式选择性调节TGFβ1活性，即通过在LTPB蛋白的情况中调节TGFβ1，而不调节与其他呈递分子(例如GARP和/或LRRC33)复合的TGFβ1的活性。
选择性抑制LTBP介导的TGFβ激活的抗体
本发明提供了选择性靶向基质相关或ECM相关的TGFβ活性的新型TGFβ抑制剂。更具体地说，这种抑制剂包含TGFβ1激活的同工型特异性、情境选择性抑制剂，其在ECM环境中特异性结合TGFβ1的潜在形式(例如proTGFβ1复合物)并防止成熟生长因子在小生境处从复合物释放。这种基质靶向抑制剂是情境特异性的，因为它们选择性地结合与ECM呈递分子即LTBP1和/或LTBP3相关的proTGFβ1。因此，本文公开了能够结合存在于LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物中的表位的单克隆抗体及其片段，而该表位不存在于GARP-proTGFβ1复合物和/或LRRC33-proTGFβ1复合物中。
在一些实施方式中，本公开的情境选择性抑制剂能够在适宜的体外结合分析如Octet中以各自<5nM(测量的KD值)的亲和力特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-proTGFβ1复合物。在优选的实施方式中，在适宜的体外结合分析例如Octet中，这种抗体以各自<5nM(测量的KD值)的亲和力结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-proTGFβ1。另一方面，在相同的测定条件下，这些情境特异性抗体不显示与人GARP-proTGFβ1复合物或人LRRC33-proTGFβ1复合物的任何可检测的结合。优选地，这种抗体或片段以小于1nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-proTGFβ1复合物中的每一个。
在一些实施方式中，本公开的情境选择性抑制剂能够特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物或人LTBP3-proTGFβ1复合物。在相同的测定条件下，两者均未显示与人GARP-proTGFβ1复合物或人LRRC33-proTGFβ1复合物的任何可检测结合。
本领域熟悉适宜的体外结合分析，包含例如基于BLI的分析如Octet，和基于SPR的分析如Biacore，其可用于测量抗体-抗原相互作用(例如，结合动力学)。如本文所用，这些情况中的“不结合”可以指通过特定分析法没有可检测的结合，例如，如果有的话，该结合低于分析法的灵敏度。在一些实施方式中，“无结合”可指“无有意义的结合”，由定义了由特定测定系统测量的被认为有意义所需的最低水平的截止值设定。例如，在BLI(Octet)测定中，在预定分析物(例如，靶抗原)浓度(例如，100nM、200nM等)下测量的0.1nm光学位移可以表明有意义的结合，低于该值可被视为无结合(例如，参见实施例9)。类似地，在典型的SPR(Biacore)测定中，截止水平可以是0.2RU(共振单位)。在一些实施方式中，从以更高浓度获得的所有传感图减去0nM抗体的信号(例如，背景噪声)。在这些条件下，使用SPR(Biacore)，0.2RU可能是适宜的截止值。
在一些实施方式中，本公开的情境选择性抑制剂能够特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物或人LTBP3-proTGFβ1复合物，而在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下不显示与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测结合，如通过BLI测量的。
在一些实施方式中，本公开的情境选择性抑制剂结合人LTBP1-proTGFβ1复合物或人LTBP3-proTGFβ1复合物，所述结合的KD比在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD至少低50倍(例如，至少低75倍、至少低100倍)。在一些实施方式中，该KD由BLI或SPR所测定。在一些实施方式中，KD由SPR所测定。
在一些实施方式中，本公开的情境选择性抑制剂能够特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物或人LTBP3-proTGFβ1复合物，而在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下不显示与LRRC33-proTGFβ1潜在复合物的可检测结合，如通过BLI测量的。
在一些实施方式中，本公开的情境选择性抑制剂结合人LTBP1-proTGFβ1复合物或人LTBP3-TGFβ1复合物，所述结合的KD比在相同的测定条件下与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD至少低50倍(例如，至少低75倍、至少低100倍)。在一些实施方式中，该KD由BLI或SPR所测定。在一些实施方式中，KD由SPR所测定。
本发明包含认识到，优选的抗体(例如，免疫球蛋白和抗原结合片段，例如，Fab，以及包含此类片段的工程构建体)一旦与其靶标/抗原(例如人LTBP1-proTGFβ1、人LTBP3-TGFβ1)结合，则与抗原缓慢解离。因此，选择本发明的新抗体不仅是因为它们的高总体亲和力(例如不超过5nM的KD)，而且尤其是因为它们的低解离速率。根据本公开，这种抗体具有≤5x10-4(1/s)的解离速率，如通过BLI测量的(例如，当与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-TGFβ1结合时)。抗体或抗原结合片段的这种≤5x10-4(1/s)的解离速率可以是单价解离速率或二价解离速率。在一些实施方式中，抗体或片段以通过SPR测量的至少45分钟(例如，≥45、60、75、90分钟)的单价半解离期(t1/2)从人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-TGFβ1(优选地对于人LTBP1-proTGFβ1和人LTBP3-TGFβ1两者)缓慢解离。另一方面，如果可检测到与人GARP-proTGFβ1和/或LRRC33-TGFβ1复合物的结合，则这种抗体从人GARP-proTGFβ1和/或人LRRC33-TGFβ1复合物，特别是人GARP-原TGFβ1迅速解离。在一些实施方式中，抗体以如通过SPR测量的小于5分钟的t1/2从人GARP-proTGFβ1解离。在特别优选的实施方式中，抗体或片段显示物种交叉反应性，使得它们以等同的亲和力结合鼠对应物。
这些复合物中存在的TGFβ1可以是潜在形式(潜在TGFβ1)或前体形式(proTGFβ1)。在一个实施方式中，抑制剂不与单独的LTBP1显著结合(例如，当不与TGFβ1复合时)。在另一个实施方式中，抑制剂不与单独的LTBP3显著结合(例如，当不与TGFβ1复合时)。在另一个实施方式中，抑制剂不显著结合单独的TGFβ1(例如，未与LTBP1或LTBP3复合的前体或潜在TGFβ1，或成熟TGFβ1)。在另一个实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂不显著结合含有TGFβ1和另一呈递分子的复合物，例如GARP-TGFβ1复合物(例如，与前-或潜在TGFβ1复合的GARP)和/或LRRC33-TGFβ1复合物(例如，与前或潜在TGFβ1复合的LRRC33)。在一个实施方式中，选择性结合LTBP1/3-TGFβ1的抑制剂不显著结合以下一种或多种(例如，两种或更多种、三种或更多种或所有四种)：单独的LTBP1、单独的TGFβ1、GARP-TGFβ1复合物和LRRC33-TGFβ1复合物。此外，在一些实施方式中，抑制剂不显著结合单独的LTBP3。
如本文所用，术语“抑制剂”是指能够阻断或拮抗TGFβ1信号传导的任何药剂。此类药剂可包含TGFβ1的小分子拮抗剂和TGFβ1的生物拮抗剂(例如，蛋白质片段和抗体)。在一些实施方式中，抑制剂可以是抗体(包含其片段，例如结构域抗体(dAb)，如在例如美国专利6,291,158、6,582,915、6,593,081、6,172,197和6,696,245中所述)、小分子抑制剂、Adnectin、亲和体(Affibody)、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody或基因疗法。本发明包含的抑制剂的使用还包含抗体模拟物，例如单体(monobodies)和单域抗体。单体是合成结合蛋白，其通常采用纤连蛋白III型结构域(FN3)作为分子支架。单体包含AdnectinsTM，它是基于第10纤连蛋白III型结构域。
在一些方面，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)选择性地结合存在于LTBP1/3-TGFβ1复合物上的表位，该表位不存在于GARP-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物上。在一些实施方式中，由于当LTBP1/3和TGFβ1形成复合物时发生的LTBP1/3和/或TGFβ1的构象变化，表位是可用的。在该实施方式中，当蛋白质不在复合物中结合时，表位不存在于LTBP1/3或TGFβ1中。在一个实施方式中，当TGFβ1与LTBP1或LTBP3复合时，表位存在于TGFβ1上。在另一个实施方式中，当LTBP1与TGFβ1复合时，表位存在于LTBP1上。在另一个实施方式中，当LTBP3与TGFβ1复合时，表位存在于LTBP3上。在另一个实施方式中，表位包含来自LTBP1和TGFβ1的残基。在另一个实施方式中，表位包含来自LTBP3和TGFβ1的残基。
令人惊讶的是，在不存在呈递分子(例如，LTBP1/3)的情况下，本文公开的一些LTBP1/3复合物选择性抗体(例如，Ab14、Ab20、Ab21-23、Ab17和Ab24-29)能够结合小潜在复合物(proTGFβ1C4S)但仍具有情境选择性。不希望受理论束缚，该发现表明抗体(及其变体，或交叉竞争抗体)可以结合在LTBP1/3-proTGFβ1复合物中和单独的proTGFβ1中可用的表位，但当存在LRRC型的呈递分子(GARP或LRRC33)时其不可用。该表位可能完全位于潜在TGFβ1上，但当GARP或LRRC33复合时被阻塞(直接或间接)。
或者，根据本公开的LTBP选择性抑制剂可以结合包含LTBP1或LTBP3的一个或多个氨基酸残基和proTGFβ1的一个或多个氨基酸残基的组合表位，其赋予对LTBP结合复合物相对于GARP/LRRC33结合复合物的情境选择性。在这些实施方式中，对同工型(TGFβ1)以及情境(ECM)的选择性可归因于来自抗原复合物的两种元件的组合贡献。
在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)对TGFβ1同工型具有选择性。在此类实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)不结合TGFβ2和/或TGFβ3。例如，在一个实施方式中，抑制剂例如抗体或其抗原结合部分选择性结合LTBP1/3-TGFβ1复合物，但不结合TGFβ2或含有TGFβ2的复合物。在另一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)选择性地结合LTBP1/3-TGFβ1复合物，但不结合TGFβ3或含有TGFβ3的复合物。
在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)不阻止TGFβ1与整联蛋白结合。例如，在一些实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)不掩蔽TGFβ1的整联蛋白结合位点。
一个方面，本发明提供了调节TGFβ1活性的功能性抑制剂，例如抗体。在示例性实施方式中，本文所述的抗体是抑制性抗体，其抑制TGFβ1的功能或活性。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分抑制TGFβ1从LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的激活(释放)。在示例性实施方式中，本公开提供了TGFβ1激活的“情境特异性”或“情境选择性”抑制剂。此类抑制剂可以结合LTBP1/3-TGFβ1复合物并抑制由LTBP1或LTBP3呈递的TGFβ1的激活，而不抑制由GARP和/或LRRC33呈递的TGFβ1的激活。因此，在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分抑制成熟TGFβ1从LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的释放，但不抑制成熟TGFβ1从GARP-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的释放。由于LTBP、GARP和LRRC33的差异定位，本发明提供的TGFβ1的情境特异性抑制剂可以在体内阻断TGFβ1活性的特定亚集。在一个实施方式中，本文提供的抑制LTBP1/3-TGFβ1但不抑制GARP-TGFβ1或LRRC33-TGFβ1的情境特异性抗体可用于抑制定位于细胞外基质的TGFβ1。在另一个实施方式中，情境特异性抗体可以抑制TGFβ1而不调节TGFβ1相关的免疫活性或免疫反应。在另一个实施方式中，情境特异性抗体可用于抑制与细胞外基质相关的TGFβ1活性而不调节与造血细胞相关的TGFβ1活性。因此，如本文所述，在不希望在GARP和/或LRRC33的情境下的TGFβ1激活的应用中，情境特异性抗体可用于抑制LTBP1/3相关的TGFβ1活性。
在一些实施方式中，TGFβ1包含天然存在的哺乳动物氨基酸序列。在一些实施方式中，TGFβ1包含天然存在的人氨基酸序列。在一些实施方式中，TGFβ1包含人、猴、大鼠或小鼠氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分选择性结合包含TGFβ1蛋白和LTBP1或LTBP3的复合物，所述TGFβ1蛋白包含在SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合部分选择性结合包含非天然存在的TGFβ1氨基酸序列(在本文中另外称为非天然存在的TGFβ1)的LTBP1/3-TGFβ1复合物。例如，非天然存在的TGFβ1可以包含一个或多个相对于天然存在的TGFβ1氨基酸序列的重组产生的突变。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分不结合TGFβ2和/或TGFβ3，或不结合含有TGFβ2和/或TGFβ3的蛋白质复合物。示例性的TGFβ2和TGFβ3氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：10和11。在一些实施方式中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3氨基酸序列包含SEQ IDNO：12-23所示的氨基酸序列，如表1所示。在一些实施方式中，TGFβ1氨基酸序列包含如SEQID NO：24-31所示的氨基酸序列，如表2中所示。
TGFβ1
LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS(SEQ ID NO：9)
TGFβ2
SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS(SEQ ID NO：10)
TGFβ3
SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS(SEQ ID NO：11)
表1.示例性TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3氨基酸序列
Figure BDA0003288375730000551
Figure BDA0003288375730000561
Figure BDA0003288375730000571
Figure BDA0003288375730000581
表2.示例性非人TGFβ1氨基酸序列
Figure BDA0003288375730000582
Figure BDA0003288375730000591
Figure BDA0003288375730000601
在一些实施方式中，如本文所述的抗体或其抗原结合部分能够选择性地结合LTBP-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗原性蛋白质复合物(例如，LTBP-TGFβ1复合物)可包含选自以下的LTBP蛋白：LTBP1、LTBP2、LTBP3和LTBP4。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分选择性地结合LTBP1-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是天然存在的蛋白质。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是非天然存在的蛋白质。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是重组蛋白。此类重组LTBP1蛋白可包含LTBP1、其选择性剪接变体和/或其片段。重组LTBP1蛋白还可以被修饰以包含一个或多个可检测标记。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含前导序列(例如，天然或非天然前导序列)。在一些实施方式中，LTBP1蛋白不包含前导序列(即，前导序列已被加工或切割)。此类可检测标记可以包括但不限于生物素标记、聚组氨酸标签、myc标签、HA标签和/或荧光标签。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是哺乳动物LTBP1蛋白。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是人、猴、小鼠或大鼠LTBP1蛋白。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含如表3中SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含如表3中的SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，如本文所述的抗体或其抗原结合部分能够结合LTBP3-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是天然存在的蛋白质。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是非天然存在的蛋白质。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是重组蛋白。此类重组LTBP3蛋白可包含LTBP3、其选择性剪接变体和/或其片段。在一些实施方式中，LTBP3蛋白包含前导序列(例如，天然或非天然前导序列)。在一些实施方式中，LTBP3蛋白不包含前导序列(即，前导序列已被加工或切割)。重组LTBP3蛋白还可以被修饰以包含一个或多个可检测标记。此类可检测标记可以包括但不限于生物素标记、聚组氨酸标签、myc标签、HA标签和/或荧光标签。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是哺乳动物LTBP3蛋白。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是人、猴、小鼠或大鼠LTBP3蛋白。在一些实施方式中，LTBP3蛋白包含如SEQ ID NO：35中所列的氨基酸序列。在一些实施方式中，LTBP3蛋白包含如SEQ ID NO：36或37中所示的氨基酸序列。
表3.示例性LTBP氨基酸序列。
Figure BDA0003288375730000611
Figure BDA0003288375730000621
Figure BDA0003288375730000631
Figure BDA0003288375730000641
Figure BDA0003288375730000651
Figure BDA0003288375730000661
Figure BDA0003288375730000671
在一个示例性实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ1和/或LTBP3-TGFβ1的抑制剂，例如抗体及其抗原结合部分，不结合含有TGFβ1和GARP或LRRC33的复合物。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分不结合具有在SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39中所示的序列的GARP蛋白，并且不结合包含所述GARP蛋白的复合物。在另一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)不结合具有在SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41中所示的序列的GARP蛋白，并且不结合含有所述GARP蛋白的复合物。在一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)不结合具有在SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43中所示的序列的LRRC33蛋白，并且不结合含有所述LRRC33蛋白的复合物。在一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)不结合GARP/LRRC33嵌合体，例如SEQ ID NO：44中所示的GARP/LRRC33嵌合体。
表4-示例性GARP和LRRC33氨基酸序列。
Figure BDA0003288375730000672
Figure BDA0003288375730000681
Figure BDA0003288375730000691
Figure BDA0003288375730000701
另一方面，本发明提供了在LTBP1和/或LTBP3的情况中抑制TGFβ1激活的方法。在一个实施方式中，该方法包括将LTBP1-proTGFβ1复合物或LTBP3-proTGFβ1复合物暴露于本文所述的抑制剂、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物。例如，在一个实施方式中，抑制剂是细胞外基质相关TGFβ1激活的抑制剂，其选择性地结合LTBP1/3呈递的proTGFβ1潜在复合物。在一个实施方式中，抑制剂不抑制免疫细胞相关的TGFβ1激活，例如由GARP呈递的proTGFβ1潜在复合物的激活引起的免疫细胞相关的TGFβ1激活。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分选择性结合LTBP1-proTGFβ1潜在复合物和/或LTBP3-proTGFβ1潜在复合物，从而调节成熟TGFβ1生长因子从潜在复合物的释放，其中所述抗体或者其抗原结合部分不结合单独的成熟TGFβ1或GARP-proTGFβ1潜在复合物。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分抑制成熟TGFβ1从LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物的释放。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分不抑制成熟TGFβ1从GARP-proTGFβ1复合物或LRRC33-proTGFβ1复合物的释放。
在一个实施方式中，该方法在体外进行。在另一个实施方式中，该方法在体内进行。在一个实施方式中，LTBP1-proTGFβ1复合物或LTBP3-proTGFβ1复合物在细胞外基质中。细胞外基质可包含例如原纤维蛋白和/或纤连蛋白。在一些实施方式中，细胞外基质包含含有RGD基序的蛋白质。
在上述方面的一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分不刺激免疫效应细胞。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分抑制成熟TGFβ1从LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物的释放，并且不抑制成熟TGFβ1从GARP-proTGFβ1复合物和/或LRRC33-proTGFβ1复合物的释放。
在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的本公开的抑制剂，例如抗体，可以以相对高的亲和力，例如以小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更低的解离常数(KD)结合复合物。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分以约10-8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、约10-12M或约10-13M的解离常数(KD)结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。例如，选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体可以以5pM和500nM之间，例如10pM和100nM之间，例如50pM和50nM之间的亲和力结合复合物。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以以小于约300nm，例如约20nM或更低、约10nM或更低、约500pM或更低或者约5pM或更低的亲和力结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。例如，抗体或其抗原结合片段可以以约1nm至约350nm、从约10nm至约200nm、从约15nm至约250nm、从约20nm至约200nm、约1nm、约20nm、约25nm、约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm或约500pm的亲和力结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物。
本公开还包含与本文所述的任何抗体竞争结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，这种抗体对复合物具有50nM或更低(例如，20nM或更低、10nM或更低、500pM或更低、50pM或更低或5pM或更低)的亲和力。可以使用任何适宜的方法(包括但不限于生物传感器技术，例如，OCTET或BIACORE)测试选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体(或其抗原结合片段)的亲和力和结合动力学。
在一个实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段不与抗体SR-Ab1竞争结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
本公开的方面涉及与本文提供的任何抗体竞争或交叉竞争的抗体。如本文所用的关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体以与第二抗体的结合足够相似的方式结合表位(例如，LTBP1-TGFβ1复合物的表位和/或LTBP3-TGFβ1复合物的表位)，使得与不存在第二抗体的情况下第一抗体的结合相比，在第二抗体存在下第一抗体与其表位的结合的结果可检测地降低。其中在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合也可检测地降低的替代方式可能但不必然是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而没有该第二抗体抑制第一抗体与其相应表位的结合。然而，当每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其表位或配体的结合时，无论达到相同、更大还是更小的程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合它们相应的表位。竞争和交叉竞争抗体都在本公开的范围内。无论这样的竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分结合)，技术人员将理解这样的竞争和/或交叉竞争抗体包括并可用于本文提供的方法和/或组合物。
本公开的方面涉及与本文提供的任何特异性抗体或其抗原结合部分竞争或交叉竞争的抗体，例如具有一个或多个在表5中列出的CDR序列(1、2、3、4、5或6个CDR序列)的抗体。在一个实施方式中，本发明提供的抗体及其抗原结合片段与具有包含如表5所列的SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR序列和/或包含如表5所列的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的轻链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争。在一个实施方式中，本发明提供的抗体与具有包含SEQ ID NO：7的重链可变区序列和/或包含SEQ ID NO：8的轻链可变区序列的抗体或其抗原结合部分竞争或交叉竞争。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分在与本文提供的任何抗体相同的表位处或附近结合。在一些实施方式中，如果抗体或其抗原结合部分在表位的15个或更少氨基酸残基内结合，则它在表位附近结合。在一些实施方式中，本文提供的任何抗体或其抗原结合部分在与本文提供的任何抗体结合的表位的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基内结合。
在另一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合部分以小于10-6M的抗体和蛋白质之间的平衡解离常数KD竞争或交叉竞争结合本文提供的任何抗原(例如，LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物)。在其他实施方式中，抗体以10-11M至10-6M范围的KD竞争或交叉竞争与本文提供的任何抗原结合。在其他实施方式中，抗体以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如
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)测定的<50nM的KD竞争或交叉竞争结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。在其他实施方式中，抗体以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<10nM的KD竞争或交叉竞争结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合部分与具有如表6中所示的Ab42的重链可变区序列和轻链可变区序列(例如，分别为SEQ ID NOs:318和319)的抗体竞争或交叉竞争。抗体可以以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<10nM的KD竞争或交叉竞争结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。抗体可以以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<5nM的KD竞争或交叉竞争结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。该抗体可以以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<5nM的KD结合人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物。在适宜的体外结合分析，例如BLI(例如Octet)中，抗体可能不显示出任何可检测的与人GARP-proTGFβ1复合物的结合。如通过BLI测量的，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，该抗体可能不显示可检测的与人GARP-proTGFβ1复合物的结合。可选地或另外地，抗体或抗原结合部分可以结合(例如，选择性结合)人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，其KD比当在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合的KD低至少50倍(并且任选地比与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍)。
在一些实施方式中，该抗体与具有如表6所示的Ab63的重链可变区序列和轻链可变区序列(例如，分别为SEQ ID NO：360和361)的抗体竞争或交叉竞争。该抗体可以以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<10nM的KD竞争或交叉竞争结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。该抗体可以以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<5nM的KD竞争或交叉竞争结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。该抗体可以以如通过适宜的体外结合分析(例如，BLI，如Octet)测定的<5nM的KD结合人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物。在适宜的体外结合分析例如BLI(例如Octet)中，抗体可能不显示出任何可检测的与人GARP-proTGFβ1复合物的结合。在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体可能不显示可检测的与人GARP-proTGFβ1复合物的结合。可选地或另外地，抗体或抗原结合部分可以结合(例如，选择性结合)人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，其KD比当在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(并且任选地比与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍)。
在进一步的实施方式中，当人GARP-proTGFβ1复合物浓度为200nM时，选择性结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物的抗体在BLI测定(例如Octet)中暴露于人GARP-proTGFβ1复合物时可能不显示出有意义的结合(例如，可能不显示出超过0.1单位(nm)的响应)。
在一些实施方式中，本文提供了与本文所述的抗体或其抗原结合部分竞争结合的抗TGFβ1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，本文提供了与本文所述的抗体或其抗原结合部分结合相同的表位的抗TGFβ1抗体或其抗原结合部分。
本文提供的任何抗体可使用任何适宜的方法来表征。例如，一种方法是鉴定抗原所结合的表位，或“表位作图”。有许多适宜的方法用于定位和表征蛋白质上表位的位置，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争分析、基因片段表达测定和基于合成肽的分析，例如，在Harlow和Lane，Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999的第11章中所述的。在另外的实例中，表位作图可用于确定抗体所结合的序列。所述表位可以是线性表位，即包含在单一氨基酸延伸链中，或由可能不必然包含在单一延伸链(一级结构线性序列)中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。在一些实施方式中，当TGFβ1在LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物中时，表位是TGFβ1表位，其仅可供本文所述的抗体或其抗原结合部分结合。在一些实施方式中，表位存在于LTBP1/3-TGFβ1复合物上，而不存在于GARP-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物上。在一些实施方式中，由于当LTBP1/3和TGFβ1形成复合物时发生的LTBP1/3和/或TGFβ1中的构象变化，表位是可用的。在该实施方式中，当蛋白质不与复合物结合时，表位不存在于LTBP1/3或TGFβ1中。在一个实施方式中，当TGFβ1与LTBP1或LTBP复合时，表位存在于TGFβ1上。在另一个实施方式中，当LTBP1与TGFβ1复合时，表位存在于LTBP1上。在另一个实施方式中，当LTBP3与TGFβ1复合时，表位存在于LTBP3上。在另一个实施方式中，表位包含来自LTBP1和TGFβ1的残基。在另一个实施方式中，表位包含来自LTBP3和TGFβ1的残基。可以分离或合成(例如，重组地)不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽，并用于与抗体的结合测定。在另一个实例中，可以通过使用源自靶抗原序列的重叠肽并测定抗体的结合在系统筛选中确定所述抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，编码靶抗原的开放阅读框随机或通过特定的遗传构建进行片段化，并确定抗原的表达片段与待测试抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生，然后在放射性氨基酸存在下在体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。还可以通过使用在噬菌体颗粒表面上展示的大型随机肽序列文库(噬菌体文库)来鉴定某些表位。或者，可以在简单结合测定中测试限定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需、足够和/或必需的残基。例如，可以使用靶抗原的突变体进行域交换实验，其中LTBP1-TGFβ1复合物或LTBP3-TGFβ1复合物的各种片段已被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质(例如，TGFβ蛋白家族的另一个成员(例如GDF 11))的序列替换(交换)。通过评估抗体与LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的突变体的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
或者，可使用已知结合相同抗原的其它抗体来进行竞争分析以确定抗体是否结合与该其他抗体相同的表位。竞争分析是本领域技术人员所熟知的。
此外，可以通过常规技术测定本文提供的任何抗体与LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物中的一个或多个残基的相互作用。例如，可以确定晶体结构，并且可以相应地测定LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物中的残基与抗体中的一个或多个残基之间的距离。基于这样的距离，可以确定LTBP1/3-TGFβ1复合物中的特定残基是否与抗体中的一个或多个残基相互作用。此外，可以应用适宜的方法，例如竞争测定和靶诱变测定，来确定候选抗体的优先结合。
在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的本发明的抗体或其抗原结合部分包含一个或多个在表5中显示的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，本发明提供编码选择性地结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，如本文所述。在一个实施方式中，核酸分子编码表5中所示的一个或多个CDR序列。
表5.如使用Kabat编号方案确定的SR-AB2、SR-AB10、SR-AB13、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB31、SR-AB34、SR-AB37和SR-AB38至SR-AB64的重链互补决定区(CDRH)和轻链互补决定区(CDRL)。
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在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的本发明的抗体包括包含如表5中提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或者其组合的任何抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体包含如表5中提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本发明还提供了编码包含如表5中所提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或者其组合的分子的核酸序列。
抗体重链和轻链CDR3结构域可以在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中起特别重要的作用。因此，在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分，或编码这些抗体或其抗原结合部分的核酸分子，可以至少包含表5中所示的抗体的重链和/或轻链CDR3。
本发明的方面涉及单克隆抗体或其抗原结合部分，其选择性地结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物，并且其包含六个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。抗体或其抗原结合部分可具有表5中所示抗体之一(例如Ab42)的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO：1中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO：2中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ ID NO：3中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL1包含如SEQ ID NO：4中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO：5中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQ ID NO：6中所示的序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含最多一个或多个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO:1；CDR-H2：SEQ ID NO:2；CDR-H3：SEQ ID NO:3；CDR-L1：SEQ ID NO:4；CDR-L2：SEQ ID NO:5；和CDR-L3：SEQ ID NO:6。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含对于每一个CDR最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一些实施方式中(例如，对于抗体SR-AB2，如表5所示)，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分包含：包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDRH2、包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDRL1、包含如SEQ IDNO：5所示氨基酸序列的CDRL2和包含如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，和该轻链可变区包含具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的CDR1。
表5中列出的抗体(例如，SR-AB2)的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列在表6中提供。
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO：94中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO：95中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ ID NO：96中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL1包含如SEQ ID NO：97中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO：98中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQID NO：99中所示的序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含一个或多个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：94；CDR-H2：SEQ ID NO：95；CDR-H3：SEQ ID NO：96；CDR-L1：SEQ ID NO：97；CDR-L2：SEQ ID NO：98；和CDR-L3：SEQ ID NO：99。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含对于每一个CDR的最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一些实施方式中(例如，对于抗体SR-AB10，如表5所示)，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分包含：包含如SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列的CDRH2、包含如SEQ IDNO：96所示的氨基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO：97所示氨基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO：98所示氨基酸序列的CDRL2和包含如SEQ ID NO：99所示氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO：96的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，和该轻链可变区包含具有SEQID NO：97的氨基酸序列的CDR1。
表5中列出的抗体(例如，SR-AB10)的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列在表6中提供。
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO：100中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO：101中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ IDNO：102中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL1包含如SEQ ID NO：103中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO：104中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQ ID NO：105中所示的序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含一个或多个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：100；CDR-H2：SEQ ID NO：101；CDR-H3：SEQ ID NO：102；CDR-L1：SEQ ID NO：103；CDR-L2：SEQ ID NO：104；和CDR-L3：SEQ ID NO：105。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含对于每一个CDR的最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一些实施方式中(例如，对于抗体SR-AB13，如表5所示)，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分包含：包含如SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列的CDRH2、包含如SEQ IDNO：102所示的氨基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO：103所示氨基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO：104所示氨基酸序列的CDRL2和包含如SEQ ID NO：105所示氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO：102的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的CDR1。
表5中列出的抗体(例如，SR-AB13)的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列在表6中提供
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO：124中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO：125中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ IDNO：126中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL1包含如SEQ ID NO：127中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO：128中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQ ID NO：129中所示的序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含至少三个(任选地所有六个)选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含最多一个或多个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO:124；CDR-H2：SEQ ID NO:125；CDR-H3：SEQ ID NO:126；CDR-L1：SEQ ID NO:127；CDR-L2：SEQID NO:128；和CDR-L3：SEQ ID NO:129。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含对于每一个CDR的最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一些实施方式中(例如，对于抗体SR-AB31，如表5所示)，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分包含：包含如SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列的CDRH2、包含如SEQ IDNO：126所示的氨基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO：127所示氨基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的CDRL2和包含如SEQ ID NO：129所示氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO：126的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR1。
表5中列出的抗体(例如，SR-AB31)的HCVR和LCVR的氨基酸序列在表6中提供。
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO：166中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO：167中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ IDNO：168中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL1包含如SEQ ID NO：169中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO：170中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQ ID NO：171中所示的序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含至少三个(任选地全部六个)选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含最多一个或多个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：166；CDR-H2：SEQ ID NO：167；CDR-H3：SEQ ID NO：168；CDR-L1：SEQ ID NO：169；CDR-L2：SEQID NO：170；和CDR-L3：SEQ ID NO：171。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含对于每一个CDR的最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一些实施方式中(例如，对于抗体SR-AB42，如表5所示)，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分包含：包含如SEQ ID NO：166所示的氨基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列的CDRH2、包含如SEQ IDNO：168所示的氨基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO：169所示氨基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO：170所示氨基酸序列的CDRL2和包含如SEQ ID NO：171所示氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：170的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：169的氨基酸序列的CDR1。
表5中列出的抗体(例如，SR-AB42)的HCVR和LCVR的氨基酸序列在表6中提供。
在一些实施方式中，CDRH1包含如SEQ ID NO：292中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH2包含如SEQ ID NO：293中所示的序列。在一些实施方式中，CDRH3包含如SEQ IDNO：294中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL1包含如SEQ ID NO：295中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL2包含如SEQ ID NO：296中所示的序列。在一些实施方式中，CDRL3包含如SEQ ID NO：297中所示的序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含至少三个(任选地全部六个)选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含最多一个或多个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO:292；CDR-H2：SEQ ID NO:293；CDR-H3：SEQ ID NO:294；CDR-L1：SEQ ID NO:295；CDR-L2：SEQID NO:296；和CDR-L3：SEQ ID NO:297。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含对于每一个CDR的最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一些实施方式中(例如，对于抗体SR-AB63，如表5所示)，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分包含：包含如SEQ ID NO：292所示的氨基酸序列的CDRH1、包含如SEQ ID NO：293所示的氨基酸序列的CDRH2、包含如SEQ IDNO：294所示的氨基酸序列的CDRH3、包含如SEQ ID NO：295所示氨基酸序列的CDRL1、包含如SEQ ID NO：296所示氨基酸序列的CDRL2和包含如SEQ ID NO：297所示氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO：294的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：296的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含具有SEQ ID NO:292的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)，和该轻链可变区包含具有SEQ ID NO：295的氨基酸序列的CDR1。
表5中列出的抗体(例如，SR-AB63)的HCVR和LCVR的氨基酸序列在表6中提供。
开发了十种另外的抗体(Ab3-Ab12)，它们特异性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物，并抑制LTBP1/3情境中呈递的成熟TGFβ的释放。除了表5中提及的抗体的HCVR和LCVR氨基酸序列之外，表6还提供了这些另外的LTBP情境特异性抗体的HCVR和LCVR氨基酸序列。
表6.特异性结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列
Figure BDA0003288375730000991
Figure BDA0003288375730001001
Figure BDA0003288375730001011
Figure BDA0003288375730001021
Figure BDA0003288375730001031
Figure BDA0003288375730001041
本发明的方面涉及单克隆抗体或其抗原结合部分，其选择性地结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物，并且包含重链可变区序列和轻链可变区序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链，该可变重链所具有的氨基酸序列与表6中列出的任何一个可变区氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92或SEQ ID NO:106至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:107至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:74至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:74至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:74至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:77至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:77至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:77至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:78至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:79至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:78至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:79至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:78至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:79至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:82至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:83至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:82至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:83至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:82至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:83至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:85至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:85至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:85至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:87至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:87至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:87至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:88至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:89至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:88至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:89至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:88至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:89至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:90至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:91至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:90至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:91至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:90至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:91至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:92至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:93至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:92至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:93至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:92至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:93至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:106至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:107至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:106至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:107至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:106至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:107至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物。该抗体可以选择性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物。该抗体或其抗原结合片段可能不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。该抗体或其抗原结合片段可以是全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可包含可变重链，该可变重链所具有的氨基酸序列与表6中列出的任何一个可变区氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方式中，同一性水平为至少95％(任选地至少98％)。
因此，在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:318至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQID NO:319至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。该抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:318至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:319至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:318至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:319至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在另一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:360至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:361至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。该抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区或轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:360至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:361至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。该抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:360至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该轻链可变区所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:361至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，重链可变区和/或轻链可变区序列在本文提供的任何CDR序列内没有变化。例如，在一些实施方式中，序列变化的程度(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)可以出现在排除本文提供的任何CDR序列的重链可变和/或轻链可变氨基酸序列内。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，包含具有与SEQ ID NO：318至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区和/或具有与SEQ ID NO：319至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段在本文提供的Ab42的任何CDR序列内没有变化。在一些实施方式中，包含具有与SEQ ID NO：360至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区和/或具有与SEQ ID NO：361至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段在本文提供的Ab63的任何CDR序列内没有变化。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含表6中列出的氨基酸序列的重链可变域，和/或包含表6中列出的氨基酸序列的轻链可变域。例如，在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：74所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：75所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：74所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：75所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：74所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：75所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：77所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：77所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：77所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：85所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：85所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：85所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：87所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：87所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：87所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：90所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：90所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：90所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：106所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：107所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：106所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：107所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：106所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：107所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：318所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：319所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：318所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：319所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：318所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：319所示氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：360所示氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：361所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：360所示氨基酸序列的重链可变域或包含SEQ ID NO：361所示氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO：360所示氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：361所示氨基酸序列的轻链可变域。
以下提供了表5中所示抗体SR-AB2的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列。
SR-AB2–重链可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAPLGNFDSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:7)
SR-AB2–轻链可变区氨基酸序列
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNHPVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:8)
以下提供了表5中所示抗体SR-AB10的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列。
SR-AB10–重链可变区氨基酸序列
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFNNYPIHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:88)
SR-AB10–轻链可变区氨基酸序列
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:89)
以下提供了表5中所示抗体SR-AB13的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列。
SR-AB13–重链可变区氨基酸序列
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDPSYDSIAGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:106)
SR-AB13–轻链可变区氨基酸序列
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFDFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:107)
以下提供了表5中所示抗体SR-AB42的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列。
SR-AB42–重链可变区氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:318)
63–轻链可变区氨基酸序列
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDYDTQGVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:319)
以下提供了表5中所示抗体SR-AB63的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列。
SR-AB63–重链可变区氨基酸序列
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSATTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGDPSYDSIAGMQVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:360)
SR-AB63–轻链可变区氨基酸序列
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFDWPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:361)
在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的本发明的抗体或其抗原结合部分具有一个或多个与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3基本相似的CDR序列。例如，该抗体可以包含一个或多个如表5所示的CDR序列(SEQ IDNO:1-6、SEQ ID NO:94-99或SEQ ID NO:100-105)，其与SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:94-99或SEQ ID NO:100-105中任一个的相应CDR区相比，包含最多6、5、4、3、2或1个氨基酸残基变化。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每个CDR包含最多6个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ IDNO：1；CDR-H2：SEQ ID NO：2；CDR-H3：SEQ ID NO：3；CDR-L1：SEQ ID NO：4；CDR-L2：SEQ IDNO：5和CDR-L3：SEQ ID NO：6。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每个CDR包含最多6个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：94；CDR-H2：SEQ ID NO：95；CDR-H3：SEQ ID NO：96；CDR-L1：SEQ IDNO：97；CDR-L2：SEQ ID NO：98；和CDR-L3：SEQ ID NO：99。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每个CDR包含最多6个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：100；CDR-H2：SEQ ID NO：101；CDR-H3：SEQID NO：102；CDR-L1：SEQ ID NO：103；CDR-L2：SEQ ID NO：104；和CDR-L3：SEQ ID NO：105。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每个CDR包含最多6个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：166；CDR-H2：SEQ ID NO：167；CDR-H3：SEQ ID NO：168；CDR-L1：SEQ ID NO：169；CDR-L2：SEQ IDNO：170；和CDR-L3：SEQ ID NO：171。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每个CDR包含最多6个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化：CDR-H1：SEQ ID NO：292；CDR-H2：SEQ ID NO：293；CDR-H3：SEQ ID NO：294；CDR-L1：SEQ ID NO：295；CDR-L2：SEQ ID NO：296；和CDR-L3：SEQ ID NO：297。
在一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：包含CDR-H1：SEQID NO：1；CDR-H2：SEQ ID NO：2；和CDR-H3：SEQ ID NO：3的重链可变区；以及包含CDR-L1：SEQ ID NO：4；CDR-L2：SEQ ID NO：5；和CDR-L3：SEQ ID NO：6的轻链可变区，任选地对于每个CDR，包含一个或多个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：包含CDR-H1：SEQID NO：94；CDR-H2：SEQ ID NO：95；和CDR-H3：SEQ ID NO：96的重链可变区；以及包含CDR-L1：SEQ ID NO：97；CDR-L2：SEQ ID NO：98；和CDR-L3：SEQ ID NO：99的轻链可变区，任选地对于每个CDR，包含一个或多个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一个方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含：包含CDR-H1：SEQID NO：100；CDR-H2：SEQ ID NO：101；和CDR-H3：SEQ ID NO：102的重链可变区；以及包含CDR-L1：SEQ ID NO：103；CDR-L2：SEQ ID NO：104；和CDR-L3：SEQ ID NO：105的轻链可变区，任选地对于每个CDR，包含一个或多个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。
在一个方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含：包含CDR-H1：SEQID NO：166；CDR-H2：SEQ ID NO：167；和CDR-H3：SEQ ID NO：168的重链可变区；以及包含CDR-L1：SEQ ID NO：169；CDR-L2：SEQ ID NO：170；和CDR-L3：SEQ ID NO：171的轻链可变区，任选地对于每个CDR，包含一个或多个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。例如，如果存在CDR内的变化，可能每个CDR最多有1个变化。所有6个CDR可以有不超过2个变化。
在一个方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含：包含CDR-H1：SEQID NO：292；CDR-H2：SEQ ID NO：293；和CDR-H3：SEQ ID NO：294的重链可变区；以及包含CDR-L1：SEQ ID NO：295；CDR-L2：SEQ ID NO：296；和CDR-L3：SEQ ID NO：297的轻链可变区，任选地对于每个CDR，包含一个或多个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸变化(例如，最多两个)。例如，如果存在CDR内的变化，则每个CDR最多可能有1个变化。所有6个CDR可以有不超过2个变化。
在一个方面，本发明提供了一种包含重链可变区的抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含具有特定的氨基酸变化的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。如本文所用，短语“氨基酸变化”或“氨基酸残基的变化”包含氨基酸置换、添加和/或删除。在一些实施方式中，具有本文所述的任何一个CDR和/或可变区内的氨基酸残基的一个或多个变化。例如，在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含一个氨基酸变化。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含最多两个氨基酸变化。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含最多三个氨基酸变化。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含最多四个氨基酸变化。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含最多五个氨基酸变化。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含最多六个氨基酸变化。在一些实施方式中，该一个或多个氨基酸变化包含最多七个氨基酸变化。
例如，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是在SEQ ID NO：1的第4位的苏氨酸残基可以被组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是SEQ ID NO：1的第5位的丝氨酸残基可以被亮氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是SEQ ID NO：1的第9位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是(i)在SEQ ID NO：1的第4位的苏氨酸残基可以被组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸置换；(ii)SEQ ID NO：1的第5位的丝氨酸残基可以被亮氨酸置换；和/或(iii)SEQ ID NO：1的第9位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是在SEQ ID NO：2的第3位的丝氨酸残基可以被天冬氨酸或天冬酰胺置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是SEQ ID NO：2的第5位的酪氨酸残基可以被组氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是SEQ ID NO：2的第6位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是SEQ ID NO：2的第8位的天冬酰胺残基可以被苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是SEQ ID NO：2的第10位的天冬酰胺残基可以被天冬氨酸或丙氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是(i)在SEQ ID NO：2的第3位的丝氨酸残基可以被天冬氨酸或天冬酰胺置换；(ii)SEQ ID NO：2的第5位的酪氨酸残基可以被组氨酸置换；(iii)SEQ ID NO：2的第6位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；(iv)SEQ ID NO：2的第8位天冬酰胺残基可以被苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换；和/或(v)SEQ ID NO：2的第10位的天冬酰胺残基可以被天冬氨酸或丙氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中该重链CDR包含：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是：
i.SEQ ID NO：1的第4位苏氨酸残基可以被组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：1的第5位的丝氨酸残基可以被亮氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：1的第9位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是：
i.SEQ ID NO：2的第3位的丝氨酸残基可以被天冬氨酸或天冬酰胺置换；
ii.SEQ ID NO：2的第5位的酪氨酸残基可以被组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：2的第6位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：2的第8位的天冬酰胺残基可以被苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换；和/或
v.SEQ ID NO：2的第10位的天冬酰胺残基可以被天冬氨酸或丙氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：4中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：5中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：6中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是：
i.SEQ ID NO：1的第4位的苏氨酸残基可以被组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：1的第5位的丝氨酸残基可以被亮氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：1的第9位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是：
i.SEQ ID NO：2的第3位的丝氨酸残基可以被天冬氨酸或天冬酰胺置换；
ii.SEQ ID NO：2的第5位的酪氨酸残基可以被组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：2的第6位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：2的第8位的天冬酰胺残基可以被苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换；和/或
v.SEQ ID NO：2的第10位的天冬酰胺残基可以被天冬氨酸或丙氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：3，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：4，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：5，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：6，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一个特定的实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体，其特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物或人LRRC33-proTGFβ1复合物；其中抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中所述抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，并且其中所述抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是：
i.SEQ ID NO：1的第4位的苏氨酸残基可以被组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：1的第5位的丝氨酸残基可以被亮氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：1的第9位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是：
i.SEQ ID NO：2的第3位的丝氨酸残基可以被天冬氨酸或天冬酰胺置换；
ii.SEQ ID NO：2的第5位的酪氨酸残基可以被组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：2的第6位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：2的第8位的天冬酰胺残基可以被苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换；和/或
v.SEQ ID NO：2的第10位的天冬酰胺残基可以被天冬氨酸或丙氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：3，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：4，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：5，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：6，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活，并且不结合人GARP-proTGFβ1。
在另一方面，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是在SEQID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以用丙氨酸置换。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ IDNO：94，条件是SEQ ID NO：94的第7位脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是SEQ ID NO：94的第8位的异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是(i)SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；(ii)SEQ ID NO：94的第4位天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；(iii)SEQ IDNO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；(iv)SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；(v)SEQ ID NO：94的第7位的脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；(vi)SEQ ID NO：94的第8位的异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或(vii)SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中重链CDR包含：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是：
i.SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；
v.SEQ ID NO：94的第7位的脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；
vi.SEQ ID NO：94的第8位的异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或
vii.SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：95，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
c)CDR-H3：SEQ ID NO：96，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：97中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：98中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：99中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是：
i.SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；
v.SEQ ID NO：94的第7位脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；
vi.SEQ ID NO：94的第8位异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或
vii.SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：95，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：96，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：97，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：98，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：99，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在一个特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中所述抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，并且其中所述抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是：
i.SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；
v.SEQ ID NO：94的第7位脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；
vi.SEQ ID NO：94的第8位异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或
vii.SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：95，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：96，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：97，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：98，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：99，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体也是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
在另一方面，该抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；和X2是G或S。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是R。在一些实施方式中，X2是G。在一些实施方式中，X2是S。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2，其包含氨基酸序列(X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG，其中任选地：X1是V或S；X2是S或G；和X3是F或L。在一些实施方式中，X1是V。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X2是S。在一些实施方式中，X2是G。在一些实施方式中，X3是F。在一些实施方式中，X3是L。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H3，其包含氨基酸序列(X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)，其中任选地：X1是A或V；X2是R、V、G或K；X3是R、H或L；X4是I、V或G；X5是A、S或L；X6是A或V；X7是F或Y；X8是D、G、R或S；和X9是Y、G、R、L、V、A或K。在一些实施方式中，X1是A。在一些实施方式中，X1是V。在一些实施方式中，X2是R。在一些实施方式中，X2是V。在一些实施方式中，X2是G。在一些实施方式中，X2是K。在一些实施方式中，X3是R。在一些实施方式中，X3是H。在一些实施方式中，X3是L。在一些实施方式中，X4是I。在一些实施方式中，X4是V。在一些实施方式中，X4是G。在一些实施方式中，X5是A。在一些实施方式中，X5是S。在一些实施方式中，X5是L。在一些实施方式中，X6是A。在一些实施方式中，X6是V。在一些实施方式中，X7是F。在一些实施方式中，X7是Y。在一些实施方式中，X8是D。在一些实施方式中，X8是G。在一些实施方式中，X8是R。在一些实施方式中，X8是S。在一些实施方式中，X9是Y。在一些实施方式中，X9是G。在一些实施方式中，X9是R。在一些实施方式中，X9是L。在一些实施方式中，X9是V。在一些实施方式中，X9是A。在一些实施方式中，X9是K。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中重链CDR包含：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG的CDR-H2，其中任选地：X1是V或S；X2是S或G；X3是F或L；和
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、V、G或K；X3是R、H或L；X4是I、V或G；X5是A、S或L；X6是A或V；X7是F或Y；X8是D、G、R或S；和X9是Y、G、R、L、V、A或K。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：97中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：98中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：99中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG的CDR-H2，任选地：X1是V或S；X2是S或G；和X3是F或L；
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、V、G或K；X3是R、H或L；X4是I、V或G；X5是A、S或L；X6是A或V；X7是F或Y；X8是D、G、R或S；和X9是Y、G、R、L、V、A或K；
d)如SEQ ID NO：97所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)如SEQ ID NO：99中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在特定实施方式中，抗体或抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；和X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG的CDR-H2，其中任选地：X1是V或S；X2是S或G；和X3是F或L；
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、V、G或K；X3是R、H或L；X4是I、V或G；X5是A、S或L；X6是A或V；X7是F或Y；X8是D、G、R或S；和X9是Y、G、R、L、V、A或K；
d)如SEQ ID NO：97所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)如SEQ ID NO：99所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体也是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
在另一方面，该抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；和X2是G或S。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是R。在一些实施方式中，X2是G。在一些实施方式中，X2是S。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H2，其包含氨基酸序列(X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG，其中任选地：X1是V或S；和X2是F或L。在一些实施方式中，X1是V。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X3是F。在一些实施方式中，X3是L。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY的CDR-H3，其中任选地：X1是R或V；X2是A或L。在一些实施方式中，X1是R。在一些实施方式中，X1是V。在一些实施方式中，X2是A。在一些实施方式中，X2是L。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中重链CDR包含：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；和X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG的CDR-H2，其中任选地：X1是V或S；和X2是F或L；和
c)包含氨基酸序列A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY的CDR-H3，其中任选地：X1是R或V；X2是A或L。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：97中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：98中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：99中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；和X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG的CDR-H2，其中任选地：X1是V或S；和X2是F或L；
c)包含氨基酸序列A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY的CDR-H3，其中任选地：X1是R或V；X2是A或L；
d)如SEQ ID NO：97所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)如SEQ ID NO：99所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；和X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG的CDR-H2，其中任选地：X1是V或S；和X2是F或L；
c)包含氨基酸序列A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY的CDR-H3，其中任选地：X1是R或V；X2是A或L；
d)如SEQ ID NO：97所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)如SEQ ID NO：99所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体也是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
在另一方面，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是SEQID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是SEQ ID NO：100的第11位的甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是(i)SEQ ID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换；(ii)SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换；和/或(iii)SEQ ID NO：100的第11位甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：101，条件是SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：101，条件是SEQ ID NO：101的第6位的甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ IDNO：101，条件是SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1：SEQ ID NO：101，条件是(i)在SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；(ii)SEQ ID NO：101的第6位的甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换；和/或(iii)SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中重链CDR包含：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是：
i.SEQ ID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：100的第11位的甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：101，条件是：
i.SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：101的第6位甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换；和
c)CDR-H3：SEQ ID NO：102，任选地包含最多三个、四个、五个或六个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：103中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：104中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：105中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是：
i.SEQ ID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：100的第11位的甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：101，条件是：
i.SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：101的第6位甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换；和
c)CDR-H3：SEQ ID NO：102，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在特定实施方式中，抗体或抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是：
i.SEQ ID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：100的第11位的甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：101，条件是：
i.SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：101的第6位甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换；和/或
iii.SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：102，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体也是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
在另一方面，该抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是P。在一些实施方式中，X2是S。在一些实施方式中，X2是H。在一些实施方式中，X2是R。在一些实施方式中，X3是S。在一些实施方式中，X3是G。在一些实施方式中，X4是G。在一些实施方式中，X4是I。在一些实施方式中，X4是N。在一些实施方式中，X4是V。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是T。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含CDR-H3，其包含氨基酸序列(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)，其中任选地：X1是A或V；X2是R、S或G；X3是P、Y、R、V、I、H、T或E；X4是S、D、E或N；X5是D、A或T；X6是S、G、T或A；X7是I、A、R、Q或V；X8是A、E、K、G或T；X9是M或I；X10是D、L、Q、V、N或G；和X11是V、R、N、E或K。在一些实施方式中，X1是A。在一些实施方式中，X1是V。在一些实施方式中，X2是R。在一些实施方式中，X2是S。在一些实施方式中，X2是G。在一些实施方式中，X3是P。在一些实施方式中，X3是Y。在一些实施方式中，X3是R。在一些实施方式中，X3是V。在一些实施方式中，X3是I。在一些实施方式中，X3是H。在一些实施方式中，X3是T。在一些实施方式中，X3是E。在一些实施方式中，X4是S。在一些实施方式中，X4是D。在一些实施方式中，X4是E。在一些实施方式中，X4是N。在一些实施方式中，X5是D。在一些实施方式中，X5是A。在一些实施方式中，X5是T。在一些实施方式中，X6是S。在一些实施方式中，X6是G。在一些实施方式中，X6是T。在一些实施方式中，X6是A。在一些实施方式中，X7是I。在一些实施方式中，X7是A。在一些实施方式中，X7是R。在一些实施方式中，X7是Q。在一些实施方式中，X7是V。在一些实施方式中，X8是A。在一些实施方式中，X8是E。在一些实施方式中，X8是K。在一些实施方式中，X8是G。在一些实施方式中，X8是T。在一些实施方式中，X9是M。在一些实施方式中，X9是I。在一些实施方式中，X10是D。在一些实施方式中，X10是L。在一些实施方式中，X10是Q。在一些实施方式中，X10是V。在一些实施方式中，X10是N。在一些实施方式中，X10是G。在一些实施方式中，X11是V。在一些实施方式中，X11是R。在一些实施方式中，X11是N。在一些实施方式中，X11是E。在一些实施方式中，X11是K。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中重链CDR包含：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V；
b)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；和
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、S或G；X3是P、Y、R、V、I、H、T或E；X4是S、D、E或N；X5是D、A或T；X6是S、G、T或A；X7是I、A、R、Q或V；X8是A、E、K、G或T；X9是M或I；X10是D、L、Q、V、N或G；和X11是V、R、N、E或K。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：103中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：104中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：105中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V；
b)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、S或G；X3是P、Y、R、V、I、H、T或E；X4是S、D、E或N；X5是D、A或T；X6是S、G、T或A；X7是I、A、R、Q或V；X8是A、E、K、G或T；X9是M或I；X10是D、L、Q、V、N或G；和X11是V、R、N、E或K；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在特定实施方式中，抗体或抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V；
b)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、S或G；X3是P、Y、R、V、I、H、T或E；X4是S、D、E或N；X5是D、A或T；X6是S、G、T或A；X7是I、A、R、Q或V；X8是A、E、K、G或T；X9是M或I；X10是D、L、Q、V、N或G；和X11是V、R、N、E或K；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体也是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
在另一方面，该抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是H或R；和X3是G、I或N。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是P。在一些实施方式中，X2是H。在一些实施方式中，X2是R。在一些实施方式中，X3是G。在一些实施方式中，X3是I。在一些实施方式中，X3是N。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是T。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：包含氨基酸序列A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)的CDR-H3，其中任选地：X1是R、S或G；X2是P或V；X3是S或A；X4是A、R、I或V；X5是D、Q或G；和X6是V或R。在一些实施方式中，X1是R。在一些实施方式中，X1是S。在一些实施方式中，X1是G。在一些实施方式中，X2是P。在一些实施方式中，X2是V。在一些实施方式中，X3是S。在一些实施方式中，X3是A。在一些实施方式中，X4是A。在一些实施方式中，X4是R。在一些实施方式中，X4是I。在一些实施方式中，X4是V。在一些实施方式中，X5是D。在一些实施方式中，X5是Q。在一些实施方式中，X5是G。在一些实施方式中，X6是V。在一些实施方式中，X6是R。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中重链CDR包含：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是H或R；和X3是G、I或N；
b)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；和
c)包含氨基酸序列A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)的CDR-H3，其中任选地：X1是R、S或G；X2是P或V；X3是S或A；X4是A、R、I或V；X5是D、Q或G；和X6是V或R。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：103中所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：104中所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO：105中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是H或R；和X3是G、I或N；
b)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；
c)包含氨基酸序列A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)的CDR-H3，其中任选地：X1是R、S或G；X2是P或V；X3是S或A；X4是A、R、I或V；X5是D、Q或G；和X6是V或R；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；其中所述抗体是完全人的或人源化的抗体或其片段，其中所述抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是H或R；和X3是G、I或N；
b)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；
c)包含氨基酸序列A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)的CDR-H3，其中任选地：X1是R、S或G；X2是P或V；X3是S或A；X4是A、R、I或V；X5是D、Q或G；和X6是V或R；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，这种抗体还与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<100nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<25nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，这种抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物；和/或如在适宜的体外结合分析例如生物膜层干涉法(BLI)中测量的，该抗体以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在另一个实施方式中，这种抗体不结合人GARP-proTGFβ1。在优选的实施方式中，这种情境选择性抗体也是同工型特异性的，因为它选择性地结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
本文还提供了抗体或其抗原结合片段，其以还更高的亲和力和进一步有利的结合特性的组合结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。
因此，在一个方面，该抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR：
a)包含氨基酸序列FTFRSYVMH的CDR-H1；
b)包含氨基酸序列VISHEGS(X1)KYYADSVKG的CDR-H2，其中：X1是L或G；和
c)包含氨基酸序列A(X1)PRIAARRGGFG(X2)的CDR-H3，其中：X1是V、R或L；和X2是Y、S或T；
d)包含氨基酸序列TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ的CDR-L1，其中，X1为S或H；X2是N、L、S或A；和X3是N、D或Y；
e)包含氨基酸序列ED(X1)(X2)RPS的CDR-L2，其中：X1是N、F或A；和X2是Q、I或V；和
f)包含氨基酸序列Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV的CDR-L3，其中：X1是S或G；X2是S、F、Y、D、H或W；X3是N、D或S；X4是N、A、L、E或T；和X5是G、R、A或L。
在一些实施方式中，在CDR-H3内：X1是R或L。在CDR-L3内：X2可以是Y。在CDR-L3内：X3可以是D；和X4可以是T。在一些优选的实施方式中，在CDR-H3内：X1是R或L(任选地，R)，在CDR-L3内：X2是Y；和在CDR-L3内：X3是D；X4是T。
在可选的实施方式中，在CDR-H3内：X1是R或L(任选地，R)，在CDR-L3内：X2是Y和在CDR-L3内：X3是D；X4是N；和X5是A。
在一些实施方式中：在CDR-L1中：X1是S或H；X2是N或A；和X3是N、D或Y；在CDR-L2内：X1是N或F；和X2是Q或V；并且在CDR-L3内：X1是S或G；X2是S、Y、D或W；X3是D或S；X4是N、L或T；和X5是G、R、A或L。在一些实施方式中，在CDR-L1内：X1是S；X2是N；和X3是N或Y；在CDR-L2内：X1为N；和X2是Q或V；和在CDR-L3内：X1是S或G；X2是S、Y或W；X3是D；X4是N或T；和X5是G、R或A。在一些实施方式中，在CDR-L3内：X1是S；X2是S或Y；X3是D；X4是N或T；和X5是G、R或A。在一些实施方式中，在CDR-L3内：X1是S；X2是Y；X3是D；X4是N或T；和X5是G或A。在一些优选的实施方式中，在CDR-L3内：X1是S；X2是Y；X3是D；X4是T；和X5是G。
在特别优选的实施方式中，抗体或抗原结合片段具有Ab42的CDR，例如：包含氨基酸序列FTFRSYVMH(SEQ ID NO:166)的CDR-H1；包含氨基酸序列VISHEGSLKYYADSVKG(SEQ IDNO:167)的CDR-H2；包含氨基酸序列ARPRIAARRGGFGY(SEQ ID NO:168)的CDR-H3；包含氨基酸序列TRSSGNIDNNYVQ(SEQ ID NO:169)的CDR-L1；包含氨基酸序列EDNQRPS(SEQ ID NO:170)的CDR-L2；包含氨基酸序列QSYDYDTQGVV(SEQ ID NO:171)的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO：318至少90％相同的氨基酸序列；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：319至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段以如通过适宜的体外结合分析例如BLI测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。例如，该抗体或抗原结合片段可以如通过适宜的体外结合分析例如BLI测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段以如通过适宜的体外结合分析例如BLI测量的<1nM的KD结合人LTBP1-和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。
在一些实施方式中，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测结合。例如，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或抗原结合片段可能不显示出与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测结合。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，其中所述结合的KD比在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。例如，该抗体或其抗原结合片段可以结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，其中所述结合的KD比在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。在一些实施方式中，KD是如通过BLI或SPR测定的。在一些实施方式中，KD是如通过SPR测定的。
在一些实施方式中，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与LRRC33-proTGFβ1潜在复合物的可检测结合。例如，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与LRRC33-proTGFβ1潜在复合物的可检测结合。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，所述结合的KD比在相同的测定条件下与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。例如，抗体或其抗原结合片段可以结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，所述结合的KD比在相同的测定条件下与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。在一些实施方式中，KD是如通过BLI或SPR测定的。在一些实施方式中，KD如通过SPR测定的。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以如通过BLI测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以如通过BLI测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在进一步的实施方式中，当人GARP-proTGFβ1复合物浓度为200nM时，选择性结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物的抗体在BLI测定(例如Octet)中暴露于人GARP-proTGFβ1复合物时可能不显示出有意义的结合(例如，可能不显示出超过0.1单位(nm)的响应)。
在另一方面，抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR：
a)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V；
b)包含氨基酸序列SISYS(X1)(X2)TYY的CDR-H2，其中任选地，X1是G或A；和X2是S或T；
c)包含氨基酸序列A(X1)DPSYDS(X2)AGM(X3)V的CDR-H3，其中任选地：X1是R、S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；
d)包含氨基酸序列RAS(X1)(X2)IS(X3)YLN的CDR-L1，其中任选地：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；
e)包含氨基酸序列(X1)AS(X2)(X3)QS的CDR-L2，其中任选地：X1是Y、A或S；X2是S或N；X3是L或R；
f)包含氨基酸序列QQ(X1)(X2)D(X3)P(X4)T的CDR-L3，其中任选地：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
在一些实施方式中：在CDR-H1内：X1是S；X2是S或R；X3是S；和X4是G；在CDR-H2内：X1是G或A；X2是S或T；在CDR-H3内：X1是R、S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；在CDR-L1内：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；在CDR-L2内：X1是Y、A或S；X2是S或N；和X3是L或R；和在CDR-L3内：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
在一些实施方式中：CDR-H1包含氨基酸序列GSIRSSSYYWG；CDR-H2包含氨基酸序列SISYSATTYY；在CDR-H3内：X1是S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；在CDR-L1内：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；在CDR-L2内：X1是Y、A或S；X2是S或N；和X3是L或R；并且在CDR-L3内：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
在一些实施方式中：CDR-H1包含氨基酸序列GSIRSSSYYWG(SEQ ID NO:292)；CDR-H2包含氨基酸序列SISYSATTYY(SEQ ID NO:293)；CDR-H3包含氨基酸序列AGDPSYDSIAGMQV(SEQ ID NO:294)；CDR-L1包含氨基酸序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO:295)；CDR-L2包含氨基酸序列AASNLQS(SEQ ID NO:296)；和CDR-L3包含氨基酸序列QQSFDWPLT(SEQ ID NO:297)。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO：360至少90％相同的氨基酸序列；所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：361至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段以如通过适宜的体外结合分析法(例如，BLI)测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物。例如，该抗体或抗原结合片段以如通过适宜的体外结合分析法(例如，BLI)测量的<5nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段以如通过适宜的体外结合分析法(例如，BLI)测量的<1nM的KD结合人LTBP1-和/或LTBP3-proTGFβ1复合物。
在一些实施方式中，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测结合。例如，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测结合。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，其中所述结合的KD比在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。例如，抗体或其抗原结合片段可以结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，其中所述结合的KD比在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。在一些实施方式中，KD是如通过BLI或SPR测定的。在一些实施方式中，KD是如通过SPR测定的。
在一些实施方式中，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与LRRC33-proTGFβ1潜在复合物的可检测结合。例如，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，该抗体或其抗原结合片段未显示出与LRRC33-proTGFβ1潜在复合物的可检测结合。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物，其中所述结合的KD比在相同的测定条件下与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。例如，抗体或其抗原结合片段可以结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，其中所述结合的KD比在相同的测定条件下与人LRRC33-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍(例如，低至少75倍，低至少100倍)。在一些实施方式中，KD是如通过BLI或SPR测定的。在一些实施方式中，KD是如通过SPR测定的。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以如通过BLI测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段以如通过BLI测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
在进一步的实施方式中，当人GARP-proTGFβ1复合物浓度为200nM时，选择性结合人LTBP1-TGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物的抗体在BLI测定(例如Octet)中暴露于人GARP-proTGFβ1复合物时可能不显示出有意义的结合(例如，可能不显示出超过0.1单位(nm)的响应)。
在一些实施方式中，两个氨基酸序列的“同一性百分比”使用如Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993改良的Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法来确定。这种算法被并入Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得与目标蛋白分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以如Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在本文所述的任何抗体或抗原结合片段中，可以在残基不太可能参与抗体-抗原相互作用的位置处将一个或多个保守突变引入CDR或框架序列中。在一些实施方式中，可以在基于晶体结构确定的残基不太可能参与与LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的相互作用的位置处将这样的保守突变引入CDR或框架序列中。在一些实施方式中，可以从共有结构相似性的另一抗原的已知结构信息推导出可能的界面(例如，参与抗原-抗体相互作用的残基)。
如本文所用，“保守氨基酸置换”意指不改变在其中进行氨基酸置换的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸置换。可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法制备变体，例如可在汇总这样的方法的参考文献中找到的，例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,J.Sambrook等编著，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编著，John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守置换包括在下列组中的氨基酸之间进行的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
在一些实施方式中，本文提供的抗体包含赋予抗体期望性质的突变。例如，为了避免由于已知天然发生在IgG4 mAb中的Fab臂交换引起的潜在并发症，本文提供的抗体可以包含稳定化“Adair”突变((Angal等，“A single amino acid substitution abolishesthe heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody,”Mol Immunol30,105-108；1993)，其中丝氨酸228(EU编号；Kabat编号为残基241)被转化为脯氨酸，导致IgG1样(CPPCP(SEQ ID NO:54))铰链序列。因此，任何抗体可包括稳定化‘Adair’突变或氨基酸序列CPPCP(SEQ ID NO:45)。在一个实施方式中，本文所述的抗体包含具有Ser至Pro主链置换的人IgG4的重链免疫球蛋白恒定域，其产生IgGl样铰链并允许形成链间二硫键。
选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的本公开的抗体可任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C末端连接到轻链恒定域，例如Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其部分可以连接至重链的全部或部分，例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及任何同种型亚类。抗体可包含合适的恒定区(参见，例如，Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of HealthPublications,Bethesda,Md.(1991))。因此，在本公开范围内的抗体可以包含与任何合适的恒定区组合的VH和VL结构域或其抗原结合部分。在示例性实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链免疫球蛋白恒定域，该重链免疫球蛋白恒定域含有人IgG1或人IgG4恒定域的全部或部分。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含轻链免疫球蛋白恒定域，该轻链免疫球蛋白恒定域含有人Igλ恒定域或人Igκ恒定域的全部或一部分。
在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体可以包含或不包含SEQ ID NO：7和8的抗体的框架区。在一些实施方式中，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抗体是鼠抗体并且包含鼠框架区序列。在其他实施方式中，抗体是嵌合抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，抗体是人源化的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，抗体是完全人的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，抗体包含：包含人种系氨基酸序列的框架区。
本文所述的抗体及其抗原结合片段可以具有适合于结合抗原的任何构型。例如，在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含四个多肽链，包括两个重链可变区和两个轻链可变区。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含一个重链可变区和一个轻链可变区。在示例性实施方式中，抗体或其抗原结合部分是Fab片段、F(ab’)2片段、scFab片段、scFv或双体抗体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含人IgGl恒定域或人IgG4恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。在示例性实施方式中，重链免疫球蛋白恒定域是人IgG4恒定域。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合构象表位。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合组合表位。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含具有Ser至Pro主链置换的人IgG4恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定域，其产生IgGl样铰链并允许形成链间二硫键。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分进一步包含轻链免疫球蛋白恒定域，该轻链免疫球蛋白恒定域包含人Igλ恒定域或人Igκ恒定域。
在一个实施方式中，抗体是具有四个多肽链的IgG，所述四个多肽链是两条重链和两条轻链。在示例性实施方式中，抗体可以是人源化的抗体、人源的抗体或嵌合抗体。在一个实施方式中，抗体包含具有人种系氨基酸序列的框架。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合部分，其与本文所述的抗体或其抗原结合部分竞争结合。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合部分，其与本文所述的抗体或其抗原结合部分结合相同的表位。在一个实施方式中，该抗体或其抗原结合片段不与抗体SR-Ab1竞争结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
新型抗体的结合动力学
本文公开的新型抗体及其抗原结合片段(例如，Fab)的特征在于增强的结合特性。抗体和片段能够选择性地结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物(也称为大潜在复合物(LLC))。重组产生的、纯化的蛋白质复合物可用作抗原(例如，抗原复合物)以在适宜的体外结合分析中筛选、评估或确认抗体结合抗原复合物的能力。此类分析是本领域众所周知的，且包括但不限于：基于BLI的分析(如
Figure BDA0003288375730001651
)和基于SPR的分析(如Biacore)。
先前，鉴定了对LLC表现出高亲和力(例如，亚纳摩尔KD)的抗体和片段。在这里，有利地，特别选择解离速率特别慢的抗体和片段，旨在实现特别持久的抑制作用。
因此，选择适宜的TGFβ抑制剂用于实施根据本公开的方法和治疗用途可包括实施体外结合分析以测定结合动力学。在优选的实施方式中，抗体或抗原结合片段以高亲和力和低解离速率kOFF结合hLTBP1-proTGFβ1和/或hLTBP3-proTGFβ1，如本文所述。优选地，抗体或片段进一步以与人LLC相同的亲和力结合鼠LLC对应物，即mLTBP1-proTGFβ1和/或mLTBP3-proTGFβ1。通过测量测试抗体(例如抗原结合片段)和适宜的抗原(例如LLC和小潜在复合物(SLC))的相互作用，可以容易地测定体外结合动力学。用于测定结合动力学参数的体外结合分析的适宜方法包括基于BLI的分析，例如Octet，以及基于表面等离子体共振的分析，例如Biacore系统。实施例9/表9中提供了基于Octet的体外结合分析的实例。在该实验中显示了几种抗体具有≤5x10-4(1/s)的“OFF”速率(kOFF)。这些结果与Ab10显示的结果形成鲜明对比，Ab10与hLTBP1-proTGFβ1和/或hLTBP3-proTGFβ1的结合甚至无法通过相同的Octet分析检测到(表8)。实施例9中提供了基于SPR的体外结合分析的实例。本实验中使用了Ab42、Ab63和Ab43的Fab片段，它们是TGFβ1的激活抑制剂。如本实例所示，这些抗体具有亚纳摩尔KD和≤5x10-4(1/s)的“OFF”速率。因此，例如，Ab42能够比具有高得多的“OFF”率的抗体保持与抗原的结合更长的持续时间(例如，更大的t1/2)，后者相对快地从抗原“脱落”(例如，与其解离)。因此，解离动力学的差异主要归因于它们的总体亲和力(KD)的显著差异，这可能导致效力增强。因此，结合动力学的表征提供了关于效果的潜在持久性和产生的体内效力的有用信息。
因此，本发明包含选择用于治疗用途的TGFβ激活抑制剂的方法，其中该方法包括选择具有如通过SPR测量的≤5x10-4(1/s)的解离速率的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或片段以小于1nM(即亚纳摩尔)，例如小于500pM、400pM、300pM、200pM、100pM或50pM的亲和力结合抗原。
选择方法可以包含通过适宜的方法，例如基于BLI的分析和基于SPR的分析，测定或测量受试抗体的半解离时间(也称为半结合时间或t1/2)。可以使用单价或多价(例如，二价)测试抗体。例如，Fab片段是适宜的单价抗体，其可用于测定半解离时间。类似地，全长免疫球蛋白(例如，IgG)可用于测定半解离时间。在一些实施方式中，该方法包括选择对人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1具有45分钟或更长的t1/2的抗体或其抗原结合片段。优选地，抗体或片段对人LTBP1-proTGFβ1和人LTBP3-proTGFβ1中的每一个具有45分钟或更长的t1/2。更优选地，该抗体或片段进一步对鼠LTBP1-proTGFβ1和/或鼠LTBP3-proTGFβ1具有45分钟或更长的t1/2。最优选地，抗体或片段对鼠LTBP1-proTGFβ1和鼠LTBP3-proTGFβ1中的每一个具有45分钟或更长的t1/2。该方法还可以包括选择对人GARP-proTGFβ1具有5分钟或更短的t1/2的抗体或抗原结合片段。如通过BLI(例如，Octet)或SPR(例如，Biacore)测量的，具有有利的半解离时间的任何这些抗体应优选具有小于1nM的KD。优选地，SPR分析用于测定半解离时间(t1/2)。
多肽
本公开的一些方面涉及分离的多肽。例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含如表5中提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3，或其组合。在一个示例性实施方式中，分离的多肽可以包含如表5中提供的CDRH1、CDRH2和CDRH3。在其他实施方式中，分离的多肽可以包含如表5中提供的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，与表5中提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其组合的任一者中的相应CDR区相比，多肽可以包含最多6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基变异。在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：7的分离的多肽。在另一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ IDNO：8的分离的多肽。在另一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的分离的多肽。在该实施方式中，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8可以任选地通过接头肽连接。在一些实施方式中，多肽是重链可变域。在一些实施方式中，该多肽与SEQ ID NO：7至少75％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在一些实施方式中，多肽是轻链可变域。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO：8至少75％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含表6中所列的重链可变区序列。在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：106。在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：107。在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：318的分离的多肽。在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：319的分离的多肽。在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：360的分离的多肽。在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：361的分离的多肽。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含表6中列出的轻链可变区的分离的多肽。在另一个实施方式中，本发明提供了包含表6中列出的重链可变区序列(例如，SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:106)和表6中列出的轻链可变区序列(例如，SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:107)的分离的多肽。在该实施方式中，重链和轻链序列(例如，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)可以任选地通过接头肽连接。在一些实施方式中，多肽是重链可变域。在一些实施方式中，该多肽与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO：106至少75％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在一些实施方式中，该多肽是轻链可变域。在一些实施方式中，该多肽与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO：107至少75％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：318中所示的重链可变区序列和SEQ ID NO：319中所示的轻链可变区序列。在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO：360中所示的重链可变区序列和SEQ ID NO：361中所示的轻链可变区序列。在该实施方式中，重链和轻链序列(例如，SEQ ID NO：318和SEQID NO：319)可以通过接头肽连接。在一些实施方式中，多肽是重链可变域。在一些实施方式中，该多肽与SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:360至少85％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在一些实施方式中，多肽是轻链可变结构域。在一些实施方式中，该多肽与SEQ ID NO:319或SEQ ID NO:361至少85％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
核酸
在一些实施方式中，本公开的抗体、其抗原结合部分和/或组合物可以由核酸分子编码。这样的核酸分子包括但不限于DNA分子、RNA分子、多核苷酸、寡核苷酸、mRNA分子、载体、质粒等。在一些实施方式中，本公开可包含经编程或产生以表达编码本公开的化合物和/或组合物的核酸分子的细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了编码上述抗体或其抗原结合部分的核酸分子。例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子编码包含如表5中提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其组合的多肽。在一些实施方式中，核酸分子可以编码包含表5中提供的CDRH1、CDRH2和CDRH3的多肽。在一些实施方式中，核酸分子可以编码包含表5中提供的CDRL1、CDRL2和CDRL3的多肽。在一些实施方式中，核酸分子编码的多肽与如表5中提供的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3或其组合中任一个的相应CDR区相比可包含最多6、5、4、3、2或1个氨基酸残基变异。在示例性实施方式中，核酸分子编码包含重链可变域和/或轻链可变域的多肽，其中该重链可变域与SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该轻链可变域与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个实施方式中，核酸分子编码包含重链可变域和/或轻链可变域的多肽，其中该重链可变域与表6中所示的重链可变区序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该轻链可变域与表6中所示的轻链可变区序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在示例性实施方式中，该核酸分子编码包含重链可变域和/或轻链可变域的多肽，其中该重链可变域与SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该轻链可变域与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:106中所示的重链可变域氨基酸序列，和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:107中所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO：7中所示的重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：8中所示的轻链可变域氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了编码上述抗体或其抗原结合部分的核酸分子。在一个示例性实施方式中，该核酸分子编码包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域的多肽，其中该重链可变结构域与SEQ ID NO：318中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该轻链可变结构域与SEQ ID NO：319中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，该核酸分子编码包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域的多肽，其中该重链可变结构域与SEQ ID NO：360中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该轻链可变结构域与SEQ ID NO：361中所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在另一个实施方式中，本发明提供了编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ IDNO：318所示的重链可变区序列和SEQ ID NO：319所示的轻链可变区序列。在另一个实施方式中，本发明提供了编码分离的多肽的核酸分子，所述分离的多肽包含SEQ ID NO：360所示的重链可变区序列和SEQ ID NO：361所示的轻链可变区序列。在该实施方式中，重链和轻链序列(例如，SEQ ID NO：318和SEQ ID NO：319)可以通过接头肽连接。在一些实施方式中，核酸分子编码作为重链可变域的多肽。在一些实施方式中，核酸分子编码的多肽与SEQ IDNO：318或SEQ ID NO：360至少85％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在一些实施方式中，核酸分子编码作为轻链可变结构域的多肽。在一些实施方式中，核酸分子编码的多肽与SEQ ID NO：319或SEQ ID NO：361至少85％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO：318中所示的重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：319中所示的轻链可变域氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO：360中所示的重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：361中所示的轻链可变域氨基酸序列。
在一些情况下，本公开的核酸包括密码子优化的核酸。产生密码子优化的核酸的方法是本领域已知的，并且可以包括但不限于美国专利号5,786,464和6,114,148中描述的那些，它们各自的内容通过引用整体并入本文。本文还提供了包含任何上述核酸的表达载体。
结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的抗体的产生
本领域熟悉可用于获得本公开的抗体或其抗原结合片段的各种技术和方法。例如，可以使用重组DNA方法、杂交瘤技术、噬菌体或酵母展示技术、转基因动物(例如，
Figure BDA0003288375730001721
)或其一些组合来产生抗体。
免疫和杂交瘤
在本文所述的一些方法中，特定的抗原(例如，LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物)可用于免疫非人类动物(“宿主”)，例如，啮齿动物，例如，小鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施方式中，非人类动物是小鼠。在另一个实施方式中，宿主可以是骆驼科动物。
可包含单个或多个抗原暴露步骤(例如，注射)的免疫后，从动物收获脾细胞，并将相关的B细胞与永生化的骨髓瘤细胞融合以形成用于抗体生产的杂交瘤。可以根据已知方法(参见，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)产生杂交瘤。然后使用标准方法筛选以这种方式形成的杂交瘤，例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)、生物膜层干涉(BLI)技术(例如，OCTET)和表面等离子共振(例如BIACORE)分析，以鉴定产生特异性结合指定抗原的抗体的一种或多种杂交瘤。任何形式的指定抗原可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段，以及其抗原性肽(例如，如本文所述的作为线性表位或在支架中作为构象表位的任何表位)。
筛选库/文库
在一些实施方式中，制备或识别抗体的方法或过程包含筛选表达抗体或其片段(例如，scFv)的蛋白质表达文库的步骤，例如噬菌体、酵母或核糖体展示文库。例如，可以在噬菌体或酵母上合成人组合抗体或scFv片段的文库，然后用目的抗原或其抗体结合部分筛选该文库，并分离与抗原结合的噬菌体或酵母，从其中可以获得抗体或免疫反应性片段(Vaughan等，1996,PMID:9630891；Sheets等，1998,PMID:9600934；Boder等，1997,PMID:9181578；Pepper等，2008,PMID:18336206)。
噬菌体展示进一步描述于，例如，Ladner等，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；Clackson等，(1991)Nature,352:624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO93/01288；WO92/01047；WO 92/09690；和WO 90/02809中。酵母展示进一步描述于，例如，US7,700,302和US8,877,688中。在特定方法中，酵母展示文库表达全长抗体(例如Adimab，LLC)。
用于产生噬菌体或酵母展示文库的试剂盒是可商购的。还有其他方法和试剂可用于生成和筛选抗体展示文库(参见，US 5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；和Barbas等，1991,PMID:1896445)。此类技术有利地允许筛选大量的候选抗体。
无论如何获得，产生抗体的细胞(例如，酵母菌落、杂交瘤等)可以被选择、克隆并进一步筛选所需特征，包括例如，稳健生长、高抗体产量和所需的抗体特征，如对目的抗原的高亲和力。选择、克隆和扩增菌落和/或杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。一旦确定了所需的抗体，就可以使用常见的、本领域公认的分子生物学和生化技术来分离、操作和表达相关的遗传物质。
人源化
本发明的抗体或片段优选为全人抗体或人源化抗体。因此，无论来源如何，应当理解该方法可以包含人源化一种或多种抗体或其片段，其中可以使用本领域已知的分子工程技术来制造人抗体序列并引入表达系统和宿主细胞中，如本文所述的。这种非天然重组产生的人抗体(和受试组合物)与本公开的教导完全相容并且明确认为在本发明的范围内。在某些选择的方面，本发明的LTBP1-TGFβ1复合物结合抗体和/或LTBP3-TGFβ1复合物结合抗体将包含重组产生的人抗体。
亲和力成熟
在一些实施方式中，通过上述方法产生的抗体可以具有中等亲和力(Ka约106至107M-1)。因此，如果需要，抗体或其片段可以经历亲和力成熟过程作为优化的一部分。术语“亲和力成熟”应具有技术人员容易理解的含义。简而言之，它是指进一步修饰候选抗体或片段(通常称为“亲本”)的氨基酸序列以实现对特定抗原的改进的结合特征。通常，亲本抗体和亲和力成熟的对应物(有时称为“后代”或“子代”)保留相同的表位。可以在亲和力成熟过程中的适当步骤进行适宜的体外结合分析以筛选改进的结合者。任选地，在一些实施方式中，还可以进行功能分析(例如，基于细胞的效能分析)以确认所需的功能性。
亲和力成熟通常涉及序列多样化和/或诱变，而引入或产生突变的确切方式不受限制。在一些实施方式中，诱变包含在一个或多个CDR的氨基酸残基中引入一个或多个改变(例如，置换或缺失)。因此，在一些实施方式中，本文所述的VR或CDR序列可包含最多1、2、3、4、5或6个氨基酸变化。在一些实施方式中，本文所述的VR或CDR序列可包含最多1、2、3、4、5或6个氨基酸置换。在一些实施方式中，本文所述的VR或CDR序列可包含最多1、2、3或4个缺失。另外或可选地，诱变可包含可变区或CDR的所谓的寡步移(oligo-walking)。
例如，抗体的亲和力成熟可以通过多种方法完成，包含随机诱变(Gram H.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89,3576–3580,和Hawkins R.E.等J.Mol.Biol.(1992)226,889–896)、CDR序列的随机诱变，例如CDR步移(Yang W.P.等，J.Mol.Biol.(1995)254,392–403)、残基定向诱变(Ho M.等J.Biol.Chem.(2005)280,607–617和Ho M.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,9637–9642)，以及体外复制体细胞超突变(SHM)的方法(Bowers P.M.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,20455–20460)。
在一个实施方式中，可以通过对可变重链或可变轻链区进行诱变来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR或可变轻链CDR中的任何一个进行诱变来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR3进行诱变(例如，CDR-H3诱变)来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR2进行诱变(例如，CDR-H2诱变)来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变重链CDR1进行诱变(例如，CDR-H1诱变)来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变轻链CDR3进行诱变(例如，CDR-L3诱变)来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变轻链CDR2进行诱变(例如，CDR-L2诱变)来使抗体亲和力成熟。在另一个实施方式中，可以通过对可变轻链CDR1进行诱变(例如，CDR-L1诱变)来使抗体亲和力成熟。
在一些实施方式中，可以通过分别对三个轻链CDR(即，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)中的一些或全部进行诱变对抗体进行亲和力成熟和/或优化以产生最多三个不同的抗体文库，每一个文库在三个CDR之一中具有独特的突变。然后可以筛选新抗体的改进特性(例如，抗原结合)。然后，如果需要进一步提高亲和力，可以混合和匹配来自每一个文库的独特CDR以生成抗体的新文库，并筛选改进的特性(例如，抗原结合)。在一些实施方式中，亲和力成熟涉及筛选包含一个或多个CDR的变体的抗体文库(“库”)，其可以与亲本抗体的至少一个CDR组合。此过程有时称为CDR改组或CDR多样化。在一些实施方式中，可变重链CDR3(例如，CDR-H3)可用于筛选包含变体的可变重链CDR1和CDR2库(又名，CDR-H1/H2多样化)的文库。在一些实施方式中，可变轻链CDR3(例如，CDR-L3)可用于筛选包含变体的可变轻链CDR1和CDR2库(又名，CDR-L1/L2多样化)的文库。
在一些实施方式中，亲和力成熟涉及筛选包含轻链变体的抗体文库(“库”)，其可与亲本抗体的重链组合(轻链改组)。例如，在一些实施方式中，将选定的重链引入包含轻链变体的抗体文库中，从而产生可筛选提高的亲和力的新抗体文库。在一些实施方式中，可以从未免疫的供体获得天然存在的可变区变体的库。重链或轻链改组的实例在以下文件中描述：Marks等，(1992)Nature Biotech 10:779-78；Schier等，(1996)J.Mol.Biol.255,28-43；Park等，(2000)BBRC.275.553-557；和Chames等，(2002)J.Immunol 1110-1118。在一些实施方式中，轻链文库包含λ轻链变体。在一些实施方式中，轻链文库包含κ轻链变体。在一些实施方式中，轻链文库包含λ和κ轻链变体。
应当理解，可以以任何顺序组合用于亲和力成熟的各种方法。例如，在一个实施方式中，选择的抗体可以经历重链CDR-H1/H2多样化，然后是CDR-H3诱变。在另一个实施方式中，选择的抗体可以经历重链CDR-H1/H2多样化，然后是CDR-H3诱变，然后是轻链改组。在另一个实施方式中，选择的抗体可以经历重链CDR-H1/H2多样化，然后是轻链改组，然后是CDR-H3诱变。在另一个实施方式中，选择的抗体可以经历轻链改组，然后是重链CDR-H1/H2多样化，然后是CDR-H3诱变。在另一个实施方式中，选择的抗体可以经历轻链改组，然后是重链CDR-H1/H2多样化，然后是CDR-H3诱变，然后是CDR-L3诱变。
在一些实施方式中，选择的抗体可以经历轻链改组，然后是重链CDR-H1/H2多样化，然后是CDR-H3诱变，然后是CDR-L1、CDR-L2和/或CDRL3诱变。在一些实施方式中，选择的抗体可以经历重链CDR-H1/H2多样化，然后是CDR-H3诱变，然后是CDR-L1、CDR-L2和/或CDRL3诱变。在一些实施方式中，对三个轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDRL3)中的一些或全部分别进行轻链CDR诱变以产生多达三个抗体文库。在一些实施方式中，每一个文库的轻链CDR被混合和匹配以产生具有轻链CDR突变的独特组合的抗体的新文库。
在上述用于亲和力成熟的任何方法中，可以使用已知技术(例如，FACS)选择产生的新抗体用于结合靶抗原(例如，LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物)。可以通过改变抗原浓度和/或对未标记(冷)抗原的竞争来测试使用FACS的结合特异性和亲和力。可以使用本领域已知的其他技术进一步评估结合亲和力，例如ELISA、BLI(例如OCTET)和SPR(例如BIACORE)。
除了上面讨论的亲和力成熟过程之外，还可以进行进一步的优化以获得所需的产物谱。因此，抗体可进一步经受优化步骤并基于某些有利的物理化学特性进行选择。对于治疗性抗体(生物制剂)，可评价的针对可开发性的物理化学标准包括但不限于：溶解性、稳定性、免疫原性、缺乏自身缔合或聚集、Fc功能性、内化特征、pH敏感性、糖基化和可制造性，例如细胞存活力和/或基因表达。在一些实施方式中，优化过程涉及恒定区内的一个或多个氨基酸序列的诱变。
在一个方面，本发明提供了一种制备包含抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-proTGFβ1复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ1复合物；其中该抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，该方法包括以下步骤：i)提供至少一种抗原，包含LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1，ii)选择特异性结合步骤(i)的该至少一种抗原的第一抗体或其抗原结合片段的池以提供LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的特异性结合物；iii)选择抑制TGFβ1激活的第二抗体或其抗原结合片段的池，以产生TGFβ1激活的特异性抑制剂；iv)将存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或其抗原结合片段配制成药物组合物，从而制备包含抗体或其抗原结合片段的组合物。
在一个实施方式中，该方法进一步包含从第一抗体或其抗原结合片段池中去除结合GARP-proTGFβ1、LRRC33-proTGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-proTGFβ2、LRRC33-proTGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-proTGFβ3、LRRC33-proTGFβ3、成熟TGFβ3或其任何组合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包含测定或确认在步骤(ii)和/或(iii)中选择的抗体或其抗原结合片段的同工型特异性的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包含选择与人和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方式中，该方法进一步包含产生存在于第一抗体池和第二池中的抗体或其抗原结合片段的完全人的或人源化的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个实施方式中，该方法进一步包含使存在于第一抗体池和/或第二抗体池中的抗体或其抗原结合片段经历亲和力成熟和/或优化的步骤，以提供亲和力成熟的和/或优化的抗体或其片段。在一个实施方式中，亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受如本文所述的轻链改组的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受如本文所述的CDR H1/H2多样化的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受如本文所述的CDR-H3诱变的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受如本文所述的轻链CDR诱变的步骤。在一个实施方式中，亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受如本文所述的轻链CDR L1/L2多样化的步骤。
可以进行进一步的优化步骤以提供对治疗组合物有利的物理化学性质。此类步骤可包括但不限于诱变或工程化以提供改善的溶解度、自聚集的缺乏、稳定性、pH敏感性、Fc功能等。
在一个实施方式中，该方法进一步包含测定抗体或其抗原结合片段对人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的亲和力的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>100nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>25nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个实施方式中，该方法进一步包含测定来自第一和/或第二抗体池的抗体或其抗原结合片段对小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的亲和力的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>100nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以在适宜的体外结合分析如生物膜层干涉法(BLI)中测量的>10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个实施方式中，该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除不结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一个实施方式中，该方法进一步包含如通过适宜的基于细胞的体外功能性分析，例如，如本文所述的caga分析测定来自第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池的抗体或其抗原结合片段的IC50的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有通过如本文所述的caga分析测定的大于50nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有通过如本文所述的caga分析测定的大于25nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有通过如本文所述的caga分析测定的大于10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有通过如本文所述的caga分析测定的大于5nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的内源性LTBP caga分析测量的大于100nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的内源性LTBP caga分析测量的大于50nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的内源性LTBP caga分析测量的大于25nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的内源性LTBP caga分析测量的大于10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的内源性LTBP caga分析测量的大于5nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的人LTBP过表达caga分析测量的大于100nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的人LTBP过表达caga分析测量的大于50nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的人LTBP过表达caga分析测量的大于25nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的人LTBP过表达caga分析测量的大于10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的人LTBP过表达caga分析测量的大于5nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的鼠LTBP过表达caga分析测量的大于100nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的鼠LTBP过表达caga分析测量的大于50nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的鼠LTBP过表达caga分析测量的大于25nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的鼠LTBP过表达caga分析测量的大于10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些实施方式中，该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有如通过本文所述的鼠LTBP过表达caga分析测量的大于5nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
在另一个实施方式中，利用合适的重组DNA技术从非人类动物获得单克隆抗体，然后进行修饰，例如，使其嵌合。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。参见，例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851,1985；Takeda等，Nature 314:452,1985，Cabilly等，美国专利号4,816,567；Boss等，美国专利号4,816,397；Tanaguchi等，欧洲专利公开号EP171496；欧洲专利公开号0173494，英国专利号GB 2177096B。
关于其他抗体生产技术，参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,eds.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory,1988。本公开不必限于抗体的任何特定来源、生产方法或其他特殊特征。
本公开的某些方面涉及以多核苷酸或载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或者可以维持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞。在一些实施方式中，真菌细胞是例如酵母属的那些，特别是酿酒酵母种的那些。术语“原核”包括可以用DNA或RNA分子转化或转染用于表达抗体或相应的免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌。术语“真核”包括酵母、高等植物、昆虫和脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如NSO和CHO细胞。取决于重组生产过程中使用的宿主，由多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的或可以是非糖基化的。抗体或相应的免疫球蛋白链还可包含初始甲硫氨酸氨基酸残基。
在一些实施方式中，一旦载体被引入合适的宿主中，宿主可以在适合该核苷酸序列的高水平表达的条件下维持，并且，按照需要，可接着进行免疫球蛋白轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体、抗原结合片段或其他免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见，Beychok,Cells of Immunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。因此，将多核苷酸或载体引入细胞中，其进而产生抗体或抗原结合片段。此外，包含上述宿主细胞的转基因动物(优选地为哺乳动物)可用于大规模生产所述抗体或抗体片段。
转化的宿主细胞可以在发酵罐中生长并且使用任何合适的技术培养以实现最佳细胞生长。一旦表达，可以根据本领域的标准程序纯化全抗体、其二聚体、单个轻链和重链、其他免疫球蛋白形式或抗原结合片段，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、凝胶电泳和类似技术；参见，Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。然后可以从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分中分离抗体或抗原结合片段。例如，微生物表达的抗体或抗原结合片段的分离和纯化可以通过任何常规手段进行，例如制备型色谱分离和免疫分离，例如涉及使用针对例如抗体恒定区的单克隆或多克隆抗体的那些。
本公开的方面涉及提供无限持续的单克隆抗体来源的杂交瘤。作为直接从杂交瘤培养获得免疫球蛋白的替代方案，永生化杂交瘤细胞可用作重排的重链和轻链基因座的来源用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。在一些实施方式中，重链恒定区可以与不同同种型的重链恒定区交换或完全消除。可变区可以连接以编码单链Fv区。可以连接多个Fv区以赋予对一个以上靶标的结合能力，或者可以使用嵌合重链和轻链组合。任何合适的方法可用于克隆抗体可变区和产生重组抗体。
在一些实施方式中，获得编码重链和/或轻链的可变区的合适的核酸，并插入到可以被转染到标准的重组宿主细胞中的表达载体中。多样的这种宿主细胞可以使用。在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞对于有效加工和生产可能是有利的。可用于此目的的典型哺乳动物细胞系包括CHO细胞、293细胞或NSO细胞。抗体或抗原结合片段的产生可以通过在适于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行。可以通过从培养物中分离抗体或抗原结合片段来回收它们。表达系统可以设计成包括信号肽，以便所得抗体分泌到培养基中；然而，细胞内产生也是可能的。
本公开还包括编码至少本文所述的抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。在一些实施方式中，由多核苷酸编码的可变区包含由任何一种上述杂交瘤产生的抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸可以是，例如，DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或者包含单独或组合的任何那些多核苷酸的重组产生的嵌合核酸分子。在一些实施方式中，多核苷酸是载体的部分。这样的载体可以包含其他基因，例如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下β该载体。
在一些实施方式中，多核苷酸被可操作地连接至允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选地哺乳动物细胞中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。它们可包括促进转录起始的调控序列和任选的促进转录终止和转录物稳定的poly-A信号。另外的调控元件可包括转录以及翻译的增强子，和/或天然相关或异源的启动子区。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、Lac、Trp或Tac启动子，且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录的起始的元件外，这种调节元件也可包括转录终止信号，例如多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于所用的表达系统，能够将多肽导向细胞区室或将其分泌到培养基中的前导序列可以添加到多核苷酸的编码序列中，且之前已有过描述。前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，且优选地，前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌到例如细胞外培养基中。任选地，可以使用编码融合蛋白的异源多核苷酸序列，所述融合蛋白包括赋予所需特征的C-或N-末端识别肽，例如表达的重组产物的稳定化或简化的纯化。
在一些实施方式中，编码至少轻链和/或重链的可变域的多核苷酸可以编码两条免疫球蛋白链或仅一者的可变结构域。同样地，多核苷酸可以在相同启动子的控制下，或者可以单独地控制以进行表达。此外，一些方面涉及载体，特别是遗传工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸；任选地，与编码抗体的另一免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸组合。
在一些实施方式中，表达控制序列在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中作为真核启动子系统提供，但也可使用原核宿主的控制序列。源自病毒例如逆转录病毒、痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送到靶向的细胞群体中(例如，工程化细胞以表达抗体或抗原结合片段)。多种合适的方法可用于构建重组病毒载体。在一些实施方式中，多核苷酸和载体可以重构到脂质体中以递送至靶细胞。含有多核苷酸(例如，免疫球蛋白链的重链和/或轻链可变结构域编码序列和表达控制序列)的载体可以通过合适的方法转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。
修饰
本公开的抗体或其抗原结合部分可用可检测的标记或可检测部分进行修饰，包括但不限于：用于检测和/或分离LTBP1-TGFβ1复合物或LTBP3-TGFβ1复合物的酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属、非放射性顺磁金属离子和亲和标记。可检测物质或部分可以直接偶联或缀合至本公开的多肽或使用合适的技术通过中间体(例如，接头(例如，可切割的接头))间接偶联或缀合。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的非限制性实例包含链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适宜的荧光材料的非限制性实例包括生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的非限制性实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；和合适的放射性物质的实例包含放射性金属离子，例如，α-发射体或其他放射性同位素，例如，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)和锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、86R、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、和锡(113Sn、117Sn)。可检测物质可直接偶联或缀合至结合LTBP 1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的本公开的抗体，或使用适宜的技术通过中间体(例如，接头)间接偶联或缀合。与可检测物质缀合的本文提供的任何抗体可用于任何适宜的诊断测定，例如本文所述的那些。
此外，本公开的抗体或其抗原结合部分也可以用药物修饰以形成例如，抗体-药物缀合物。所述药物可以使用合适的技术直接偶联或缀合至本公开的多肽，或通过中间体(例如，接头(例如，可切割的接头))间接偶联或缀合。
靶向剂
在一些实施方式中，本公开的方法包括使用一种或多种靶向剂将本文公开的抗体或其抗原结合部分靶向受试者中的特定位点，以用于富集或定位此类试剂到目标小生境的目的。在一些实施方式中，这种靶向可实现调节从LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的成熟TGFβ释放。例如，LTBP1-TGFβ1和LTBP3-TGFβ1复合物通常定位于细胞外基质。因此，在一些实施方式中，本文公开的抗体可缀合至细胞外基质靶向剂以将抗体定位于LTBP1-TGFβ1和LTBP3-TGFβ1复合物所驻留的位点。在此类实施方式中，抗体的选择性靶向导致LTBP1-TGFβ1和/或LTBP3-TGFβ1复合物的选择性调节。在一些实施方式中，抗体的选择性靶向导致LTBP1-TGFβ1和/或LTBP3-TGFβ1复合物的选择性抑制(例如，用于治疗纤维化的目的)。在一些实施方式中，细胞外基质靶向剂包括肝素结合剂、基质金属蛋白酶结合剂、赖氨酰氧化酶结合结构域、原纤维蛋白结合剂、透明质酸结合剂等。
在一些实施方式中，可以使用具有选择性结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的第一部分和选择性结合靶位点的组分(例如ECM的组分(例如，纤维蛋白))的第二部分的双特异性抗体。
在一些实施方式中，这种靶向剂可以与另一药剂或治疗剂偶联以将复合物携带或定位到感兴趣的小生境。
安全性/毒性考虑
组织病理学、毒理学
如上所述，拮抗所有TGFβ同工型即TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的已知的泛抑制剂已被证明在多种哺乳动物物种中引起各种毒性。最显著的已知毒性包含心血管毒性(如瓣膜病)和上皮增生、皮肤损伤、炎症和出血。更具体地，文献中报道的与泛TGFβ抑制剂(例如，TGFβR的小分子拮抗剂和非选择性中和抗体)相关的一些观察到的毒性包含以下。
与TGFβ抑制相关的心血管毒性包含在主动脉瓣、右AV瓣和左AV瓣中的增生；在主动脉瓣、左AV瓣和升主动脉中的炎症；在升主动脉、主动脉瓣和左AV瓣中的出血；在升主动脉中的结缔组织退化(参见例如，Strauber等，(2014)“Nonclinical safety evaluationof aTransforming Growth Factorβreceptor I kinase inhibitor in Fischer 344ratsand beagle dogs”J.Clin.Pract 4(3)∶1000196)。
此外，已将结合所有三种TGFβ同工型的中和抗体与某些上皮细胞毒性相关联，其在下表中总结。
1D11和GC1008的跨物种的上皮和其他毒性
Figure BDA0003288375730001881
本公开的申请人先前证明了通过靶向潜在proTGFβ1复合物选择性阻断TGFβ1激活步骤的单克隆抗体的改进安全性特征(参见，例如，WO 2017/156500和WO 2018/129329)。在其中描述的大鼠毒理学研究中，当动物被给药最多每周100mg/kg的抑制剂持续4周时，没有可观察的与测试品相关的毒性。
基于本公开的申请人较早的认识(参见PCT/US2017/021972)：常规TGFβ拮抗剂缺乏同工型特异性可能是与TGFβ抑制相关的毒性来源，本发明人试图进一步实现情境选择性的TGFβ1抑制，用于治疗各种表现出TGFβ1失调的疾病，尤其是纤维化病症，并具有增强的安全性/耐受性。因此，本文提出的工作进一步在高亲和力抑制剂中提供了具有特别低的解离速率(kOFF)的抗体子集，以提高持久性。
因此，在一些实施方式中，当每周给药至少4周(例如，4、6、8、10、12周)时，根据本公开的新抗体具有>100mg/kg的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施方式中，当在大鼠中每周给药至少4周时，根据本公开的新抗体具有最高100mg/kg的无可见不良作用水平(NOAEL)。在一些实施方式中，当在小鼠中给药4周或12周时，抗体具有至少100mg/kg/周的NOAEL。用于进行TGFβ抑制剂和TGFβ1抑制剂的安全性/毒理学研究的适宜动物模型包括但不限于：大鼠、犬、食蟹猴和小鼠。在优选的实施方式中，基于适宜临床前功效研究的抗体的最小有效量低于NOAEL。更优选地，抗体的最小有效量为NOAEL的约三分之一或更低。在特别优选的实施方式中，抗体的最小有效量为NOAEL的约六分之一或更低。在一些实施方式中，抗体的最小有效量为NOAEL的约十分之一或更低。
在一些实施方式中，本发明包括能够抑制TGFβ1信号传导的同工型选择性抗体，当向受试者施用时，其在有效治疗TGFβ1相关适应症的剂量下不会引起心血管或已知上皮毒性。在一些实施方式中，该抗体每周、每两周或每月施用的最低有效量为约3-10mg/kg。优选地，抗体在最小有效量至少六倍的剂量下(例如，六倍的治疗窗)不引起最低毒性。更优选地，抗体在最小有效量至少十倍的剂量下(例如，十倍的治疗窗)不引起最低毒性。甚至更优选地，抗体在最小有效量至少十五倍的剂量下(例如，十五倍的治疗窗)不引起最低毒性。
因此，用于治疗用途的抗体或其抗原结合片段的选择可包含：选择满足一种或多种TGFβ抑制剂的标准的抗体或抗原结合片段(例如，选择例如，具有缓慢的解离速率，例如，kOFF<5x10-4(1/s)的单克隆抗体和抗原结合片段)；在适宜的临床前模型中进行体内功效研究，以确定抗体或片段的有效量；在适宜模型中进行体内安全性/毒理学研究，以确定安全或有毒的抗体的量(例如，MTD、NOAEL或用于评价安全性/毒性的任何本领域公认的参数)；和选择提供至少三倍的治疗窗(优选地6倍，更优选地10倍的治疗窗，甚至更优选地15倍的治疗窗)的抗体或片段。选择的抗体或片段可用于制备包含抗体或片段的药物组合物。此类药物组合物可用于治疗如本文所述的受试者的TGFβ1适应症。例如，TGFβ1适应症可能是纤维化障碍。优选地，选择用于治疗用途或大规模生产的TGFβ抑制剂在持续暴露至少4周，例如8周和12周后，不会在所治疗的动物中产生可观察到的副作用。在一些实施方式中，在组织病理学分析中观察到的某些毒性被认为是非不良的。
免疫安全性评估
细胞因子在正常的免疫反应中起着重要作用，但当免疫系统被触发以变得过度活跃时，细胞因子产生的正反馈循环可导致“细胞因子风暴”或高细胞因子血症，这种情况中细胞因子产生过多导致损害器官，尤其是肺和肾脏，甚至导致死亡的免疫反应。这种病症的特征在于血清中的促炎细胞因子显著升高。从历史上看，在健康志愿者中进行的抗CD28单克隆抗体TGN1412的1期试验导致了威胁生命的“细胞因子风暴”反应，这是由于促炎细胞因子的意外全身性和快速诱导引起的(Suntharalingam G等，N Engl J Med.2006Sep 7；355(10):1018-28)。这一事件促使人们更加意识到与T细胞药物刺激相关的潜在危险。
虽然TGFβ导向疗法不靶向特定的T细胞受体或其配体，但预计进行免疫安全性评估是谨慎的，包括，例如，体外细胞因子释放分析、来自用TGFβ抑制剂处理的非人灵长类动物血浆样品的体内细胞因子测量以及使用人血小板的血小板分析。
在一些实施方式中，选择用于治疗用途和/或其大规模生产的TGFβ抑制剂包含评估TGFβ抑制剂触发细胞因子从产生细胞因子的细胞释放的能力。在这样的评估中，可以测定一种或多种细胞因子(例如，炎性细胞因子)IL-2、TNFα、IFNγ、IL-1β、CCL2(MCP-1)和IL-6。在一些实施方式中，细胞因子产生细胞可包含来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)成分。可将暴露于本文中的TGFβ抑制剂(例如，公开的抗体)后的细胞因子反应与暴露于对照(例如，IgG同种型阴性对照或取决于所测试的TGFβ抑制剂的任何其他合适对照)后的释放进行比较。可以以平板结合(例如，固定的)和/或可溶性分析形式评估细胞因子激活。IFNγ、IL-2、IL-1β、TNFα、IL-6和CCL2(MCP-1)的水平不应超过阴性对照中激活的10倍，例如8、6、4或2倍。在一些实施方式中，阳性对照也可用于确认样品中，例如PBMC中的细胞因子激活。在一些实施方式中，这些体外细胞因子释放结果可在体内进一步证实，例如在动物模型中，例如猴毒理学研究，例如4周GLP或非GLP重复剂量猴研究。
在一些实施方式中，用于治疗用途的抗体或其抗原结合片段的选择可以包含：鉴定满足本文所述的那些标准中的一个或多个标准的抗体或抗原结合片段；在适宜的临床前模型中进行体内功效研究以确定抗体或片段的有效量；在适宜模型中进行体内安全性/毒理学研究，以确定安全或有毒的抗体量(例如，MTD、NOAEL或用于评价安全性/毒性的任何本领域公认的参数)；及选择提供至少三倍的治疗窗(优选地6倍，更优选地10倍的治疗窗，甚至更优选地15倍的治疗窗)的抗体或片段。在某些实施方式中，在两个或更多个重演人类状况的适宜的临床前模型中进行体内功效研究。在一些实施方式中，这种临床前模型包含TGFβ1阳性纤维化。在一些实施方式中，临床前模型选自肝纤维化模型、肾纤维化模型、肺纤维化模型、心脏(心的)纤维化模型、皮肤纤维化模型。
用于治疗用途的抗体或其抗原结合片段的鉴定可进一步包含进行免疫安全性测定，其可包括但不限于测量细胞因子释放和/或测定抗体或抗原结合片段对血小板结合、激活和/或聚集的影响。在某些实施方式中，可以在体外使用PBMC或在体内使用临床前模型例如非人灵长类动物测量细胞因子释放。在某些实施方式中，在免疫安全性评估中，与IgG对照样品中的水平相比，抗体或其抗原结合片段不会在IL-6、IFNγ和/或TNFa水平上诱导大于10倍的释放。在某些实施方式中，可以使用PBMC在体外进行血小板结合、激活和聚集的评估。在一些实施方式中，在免疫安全性评估中，与缓冲液或同种型对照相比，抗体或其抗原结合片段不会诱导血小板结合、激活和/或聚集中超过10％的增加。
选择的抗体或片段可用于制备包含抗体或片段的药物组合物。此类药物组合物可用于治疗本文所述的受试者中的TGFβ适应症。例如，TGFβ适应症可以是纤维化病症，例如器官纤维化，例如肝纤维化。因此，本发明包含制备包含TGFβ抑制剂的药物组合物的方法，其中该方法包括选择TGFβ抑制剂的步骤，其中该抑制剂如通过免疫安全性评估所评价的进行免疫安全性测试，包含细胞因子释放分析，并且任选地进一步包含血小板分析。与对照(例如IgG对照)相比，通过该方法选择的TGFβ抑制剂不引发不可接受的细胞因子释放水平。类似地，通过该方法选择的TGFβ抑制剂不导致不可接受水平的血小板聚集、血小板激活和/或血小板结合。然后大规模生产这种TGFβ抑制剂，例如250L或更大，例如1000L、2000L、3000L、4000L或更大，用于商业生产包含TGFβ抑制剂的药物组合物。
药物组合物
本发明进一步提供了用作药物的药物组合物，该药物适合施用于人类和非人类受试者。可将一种或多种选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体与药学上可接受的载体(赋形剂)(包含例如缓冲剂)配制或混合，以形成药物组合物。此类制剂可用于治疗涉及TGFβ信号传导或其失调的疾病或病症。在一些实施方式中，与TGFβ信号传导相关的此类疾病或病症涉及一种或多种情境，即TGFβ与一个或多个特定类型的呈递分子相关联。在一些实施方式中，这种情境以细胞类型特异性和/或组织特异性方式存在。在一些实施方式中，例如，TGFβ信号传导的这种情境依赖性作用部分地经由GARP、LRRC33、LTBP1和/或LTBP3介导。
在一些实施方式中，本发明的抗体选择性地结合单一TGFβ情境，使得该抗体结合与LTBP呈递分子(例如，LTBP1和/或LTBP3)的复合物中的TGFβ。因此，这类药物组合物可以施用于患者以减轻与从LTBP1和/或LTBP3的TGFβ1激活/释放相关的TGFβ-相关适应症(例如，纤维化)。
药学上“可接受的”载体(赋形剂)是指载体与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)(包括缓冲剂)的实例对于本领域技术人员而言是显而易见的并且已在之前描述过。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。在一个实例中，本文所述的药物组合物含有多于一种选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体，其中抗体识别LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的不同表位/残基。
本方法中使用的药物组合物可以在冻干制剂或水溶液形式中包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温TM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述了药学上可接受的赋形剂。
本发明还包括药物组合物，其包含根据本发明的抗体或其片段，以及药学上可接受的赋形剂。
因此，可以将抗体或包含此类抗体的抗原结合片段的分子配制成适于人类施用的药物组合物。
药物制剂可以包含一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，赋形剂可以从以下提供的列表中选择：https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm？event＝browse ByLetter.page&Letter＝A。
通常将药物组合物配制成活性生物制品(例如，单克隆抗体，包含抗原结合片段的工程化的结合分子等)的终浓度为约2mg/mL至约200mg/mL之间。例如，制剂的终浓度(wt/vol)可以在约2-200、2-180、2-160、2-150、2-120、2-100、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、5-200、5-180、5-160、5-150、5-120、5-100、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、10-200、10-180、10-160、10-150、10-120、10-100、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、20-200、20-180、20-160、20-150、20-120、20-100、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、30-200、30-180、30-160、30-150、30-120、30-100、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-200、40-180、40-160、40-150、40-120、40-100、40-80、40-70、40-60、40-50、50-200、50-180、50-160、50-150、50-120、50-100、50-80、50-70、50-60、60-200、60-180、60-160、60-150、60-120、60-100、60-80、60-70、70-200、70-180、70-160、70-150、70-120、70-100、70-80mg/mL之间的范围内。在一些实施方式中，制剂中生物制品的终浓度为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/mL。
根据一些实施方式，以约3000mg、2400mg、1600mg、800mg、240mg、80mg或更少的量施用TGFβ抑制剂。
本发明的药物组合物优选地用适宜的缓冲剂配制。适宜的缓冲剂包括但不限于：磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和组氨酸缓冲剂。
制剂的最终pH通常在pH 5.0至8.0之间。例如，药物组合物的pH可以是约5.0、5.2、5.5、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.5、7.6或7.8。
本公开的药物组合物可以包含批准用于药物制剂的表面活性剂，如非离子去垢剂。此类表面活性剂包括，例如，聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20(吐温-20)、聚山梨醇酯80(吐温-80)和NP-40。
本公开的药物组合物可以包含稳定剂。对于液体-蛋白质制品，可以通过选择pH缓冲盐来增强稳定性，并且通常还可以使用氨基酸。通常是在液体/空气界面或液体/固体界面(与包装物)处发生导致蛋白吸附和解折叠后的聚集的相互作用。适宜的稳定剂包括但不限于：蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇以及某些氨基酸，如组氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和精氨酸。
本公开的药物组合物可以含有以下赋形剂的一种或任何组合：磷酸钠、精氨酸、蔗糖、氯化钠、氨丁三醇、甘露醇、苄醇、组氨酸、蔗糖、聚山梨醇酯80、柠檬酸钠、甘氨酸、聚山梨醇酯20、海藻糖、泊洛沙姆188、蛋氨酸、海藻糖、rh透明质酸酶、琥珀酸钠、磷酸钾、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、氯化钾、麦芽糖、组氨酸乙酸盐、山梨糖醇、五醋三胺、人血清白蛋白、三胺五乙酸。
在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以含有防腐剂。
本公开的药物组合物通常以液体或冻干形式存在。通常，可以将产品装在小瓶(例如，玻璃小瓶)中。在注射器、笔或自动注射器中可用的产品可以以在这些容器/密封系统中的预充式液体的形式存在。
在一些实例中，本文描述的药物组合物包含脂质体，所述脂质体包含选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体，其可通过任何适宜的方法制备，例如，被描述于Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。
在一些实施方式中，选择具有靶向性质的脂质体以优先将药物组合物递送或定位于某些组织或细胞类型。例如，可以使用某些具有骨髓靶向特性的基于纳米颗粒的载体，例如基于脂质的纳米颗粒或脂质体。参见，例如，Sou(2012)“Advanced drug carrierstargeting bone marrow”,ResearchGate publication 232725109。
选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此前已描述了示例性技术，参见，例如，Remington,TheScience and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。
在其他实例中，本文描述的药物组合物可以配制成持续释放的形式。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号No.3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可以通过例如无菌过滤膜的过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物置于具有无菌进入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以是单位剂型，例如用于经口、肠胃外或直肠施用，或经吸入或吹入施用的片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液，或栓剂。
合适的表面活性试剂包括，特别是，非离子试剂，例如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TWEEENTM 20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如，SPANTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05至5％的表面活性剂，并且可以为0.1至2.5％。应当理解，如果需要，可以加入其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介。
适宜的乳液可使用市售的脂肪乳剂，如INTRALIPIDTM,LIPSYNTM,INFONUTROLTM,LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM来制备。活性成分可以溶解在预混合的乳液组合物中，或者它可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳液中。应当理解，可以加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有高达20％的油，例如5至20％之间。
乳液组合物可以是通过将选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
选择性结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的抑制剂的用途
本文所述的选择性结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的抑制剂，例如抗体及其抗原结合部分，可用于其中需要调节与LTBP1或LTBP3相关的TGFβ1活性的广泛应用。
在一个实施方式中，本发明提供了一种通过将LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物暴露于选择性地结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)来抑制TGFβ1激活的方法。前述方法可在体外进行，例如以抑制培养细胞中的TGFβ1激活。上述方法也可以在体内进行，例如，在需要抑制TGFβ1的受试者中，或在评估TGFβ1抑制作用的动物模型中。
本文所述的选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的任何抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以及包含这种抗体的任何药物组合物，均适用于本发明的方法。例如，在一个实施方式中，抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)选择性地结合LTBP1-TGFβ1复合物和LTBP3-TGFβ1复合物，但不结合选自单独的LTBP1、单独的成熟TGFβ1、GARP-TGFβ1复合物、LRRC33-TGFβ1复合物及其组合的一个或多个靶标。示例性抑制剂，例如抗体，可以抑制成熟TGFβ1从LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物的释放，而不抑制成熟TGFβ1从GARP-proTGFβ1复合物和/或LRRC33-proTGFβ1复合物的释放。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分可以以约10-8M或更低的解离常数(KD)结合LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分具有约10-9M或更小的KD值。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分具有约10-10M或更小(例如，约10-11M或更小)的KD值。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分对LTBP1-proTGFβ1复合物和/或LTBP3-proTGFβ1复合物具有<10nM、<5nM、<1nM的KD值，如在适宜的体外结合分析例如BLI(例如，Octet)中测量的。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含表5中所示的至少一个(例如，一个、两个或三个)重链CDR，和/或表5中所示的至少一个(例如，一个、两个、三个)轻链CDR。在示例性实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO：7的重链可变区和/或含有SEQ ID NO：8的轻链可变区。与前述抗体结合相同表位和/或与前述抗体竞争结合LTBP1/3-proTGFβ1的抗体及其抗原结合部分也可用于本文所述的方法中。本文描述了适合实施本发明方法的抗体或其抗原结合部分的其他特征。
在一个实施方式中，使LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物与抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)接触抑制成熟TGFβ1从LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的释放。在一个实施方式中，所述接触不抑制成熟TGFβ1从LTBP1和LTBP3以外的呈递分子释放。例如，将GARP-TGFβ1复合物或LRRC33-TGFβ1复合物暴露于选择性结合LTBP1/3-TGFβ1但不结合GARP或LRRC33情境中的TGFβ1的情境特异性抑制剂(例如，抗体)将不抑制成熟TGFβ1从GARP-TGFβ1复合物或LRRC33-TGFβ1复合物的释放。
LTBP1和LTBP3通常沉积在细胞外基质中。因此，在一个实施方式中，包含LTBP1-TGFβ1和/或LTBP3-TGFβ1的复合物与细胞外基质相关，例如与细胞外基质结合。在一些实施方式中，LTBP1/3-TGFβ1复合物与包含原纤维蛋白的细胞外基质和/或包含RGD基序的蛋白质结合。
本发明还提供了通过向受试者施用如本文所述的选择性地结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)降低受试者中TGFβ1激活的方法。本文所述的选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的任何抗体或其抗原结合部分，以及包含这种抗体的任何药物组合物，均适用于本发明的方法。
示例性的LTBP1/3抑制剂，例如抗体，结合LTBP1/3-TGFβ1复合物，并通过抑制由LTBP1和LTBP3呈递的TGFβ1的释放，而不抑制通过GARP和/或LRRC33呈递的TGFβ1的释放，以情境特异性方式抑制TGFβ1激活。这种抗体可用于在体内阻断TGFβ1活性的特定亚集。在一个实施方式中，本文提供的情境特异性抗体可用于抑制定位于细胞外基质的TGFβ1。在另一个实施方式中，情境特异性抗体可以抑制TGFβ1而不调节主要由GARP和LRRC33呈递的TGFβ1介导的TGFβ1相关免疫活性或免疫反应。在另一个实施方式中，情境特异性抗体可用于抑制与细胞外基质相关的TGFβ1活性(例如，LTBP1相关的TGFβ1活性和LTBP3相关的TGFβ1活性)而不调节与造血细胞(例如，表达GARP和/或LRRC33的造血细胞)相关的TGFβ1活性。
临床应用
申请人先前描述了所谓的TGFβ1的“非情境依赖性”抑制剂(参见，例如：PCT/US2017/021972和PCT/US2018/012601)，其可用于治疗涉及TGFβ1失调的各种疾病和病症，包括但不限于癌症和纤维化。与传统的TGFβ1拮抗剂不同，这些非情境依赖性TGFβ1抑制剂能够选择性地靶向TGFβ1同工型。然而，在由TGFβ1同工型驱动的多方面生物学功能中，非情境依赖性抑制剂不区分组织特异性(因此情境特异性)的proTGFβ1复合物，使得此类抑制剂能够结合并从而抑制成熟生长因子从任何呈递分子-proTGFβ1复合物的释放或激活
至少部分地基于这样的认识，即提供仅靶向TGFβ活性的一个子集的更大选择性可能是有利的，产生了本公开的情境选择性抑制剂。预期通过进一步缩小抑制TGFβ功能的特定生物学情境，可以在疾病状况或患者群体的子集中实现更高的安全性。具体地，本发明的发明人已经认识到，在某些情况下，免疫调节的全身性扰动可能是特别不合需要的。由于TGFβ在介导免疫反应和维持免疫稳态方面发挥着重要作用，因此以非情境依赖性方式实现TGFβ活性的广泛抑制可能导致不需要的副作用而没有合理的益处。在这些情况下，设想使用不抑制TGFβ1功能的免疫成分的情境选择性抑制剂(例如本文包含的那些)特异性靶向和抑制基质相关的TGFβ功能是有利的。
因此，情境特异性抗体可用于在LTBP1或LTBP3情境中的TGFβ激活且是可取的及在GARP和/或LRRC33情况中TGFβ激活是有害的应用中抑制LTBP1/3相关的TGFβ活性。
该疾病可能涉及ECM成分或功能的失调或损害，并且包含增加的胶原沉积。在一些实施方式中，ECM组分或功能的失调或损害还可包含增加的刚性和/或ECM重组。在一些实施方式中，ECM组分或功能的失调或损害包含疾病部位内增加的肌成纤维细胞。在一些实施方式中，ECM的失调包含基质刚性的增加，这与多种纤维化病症和肿瘤的发病机理和/或疾病进展有关。在一些实施方式中，ECM的失调涉及纤连蛋白和/或原纤维蛋白。
开发不抑制GARP相关TGFβ的基质靶向TGFβ抑制剂的基本原理
本发明包含LTBP1相关和/或LTBP3相关TGFβ的情境特异性抑制剂。因此，这种抑制剂能够特异性靶向ECM相关的潜在TGFβ复合物(例如，LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1)，从而在疾病环境(例如纤维化组织)中抑制成熟TGFβ生长因子从潜在复合物的释放。这些抑制剂对GARP-proTGFβ1复合物没有显示显著的结合活性，从而最小化不需要的全身性免疫调节。这些抗体可能有利于用于治疗具有具有ECM失调的病症，例如异常的ECM重构和/或刚性。
本文提供的情境选择性抗体可用于治疗其中不希望刺激受试者的免疫反应的病症和/或用于在预期受试者受益于长期TGFβ抑制疗法的情况下控制慢性病症，例如许多类型的纤维化。
下面讨论了支持不靶向在调节性T细胞上表达的GARP-proTGFβ1复合物的TGFβ抑制剂的潜在益处的至少三个基础。
首先，表达GARP的T调节细胞是免疫系统的组分，其抑制或阻碍其他细胞的免疫反应。这个概念可以被称为“耐受”。这是免疫系统内置的一项重要“自检”，以防止在某些情况下可能导致危及生命的情况的过度反应，例如败血症、细胞因子释放综合征和细胞因子风暴。因此，当正常的Treg功能受损，特别是持续时间较长时，发挥Treg抑制作用的TGFβ抑制疗法可能会带来一定的风险，例如涉及六个月或更长时间治疗的治疗方案，以及无限期施用的慢性治疗。出于这个原因，需要TGFβ抑制疗法的患者，特别是为了避免引发自身免疫的风险，可能会受益于不直接干扰正常Treg功能的TGFβ1抑制剂。例如，需要长期TGFβ抑制治疗的患者群体可包含那些患有遗传或先天性疾病的患者，例如DMD、CF等。此外，患有包括炎症的疾病的患者群体可能受益于不干扰GARP/Treg功能的情境特异性抑制剂，从而将加剧现有炎性病症的风险降至最低。
其次，越来越多的证据指向不成比例的Th17/Treg比率与涉及炎症和/或纤维化的病理之间的联系。人们普遍认为，两种细胞类型Th17和Treg的分化以反相关负向调节。TGFβ1似乎是该过程的主要把关者，使得TGFβ1暴露促进幼稚T细胞分化为Foxp3+Treg，而TGFβ1与IL-6组合反而促进幼稚T细胞分化为RORγt+Th17细胞。此外，一旦分化，这些细胞群体相互负向调节。
一系列证据表明，Th17/Treg比率的不平衡与涉及慢性炎症的纤维化疾病的发病机制和/或进展或其严重程度相关。
例如，Shoukry等报道，Th17细胞因子通过调节TGFβ信号传导驱动肝纤维化。作者在活体外检查了肝活检样品中Th17和Treg群体的频率，且发现与中度纤维化或健康组织样品相比，增加的Th17/Treg比率与晚期纤维化相关。与观察结果一致，在纤维化肝脏中也检测到对Th17细胞因子，特别是IL-22的强烈偏向。这些数据表明，增加的Th17/Treg比率导致促纤维化Th17细胞因子的失衡，这与肝纤维化的严重程度相关。
在其他疾病中观察到Th17和Treg群体的类似反相关。
例如，报道了杜氏肌营养不良症(DMD)患者的IL-17肌肉表达增加，这是一种表现出慢性炎症的病症。De Pasquale等，(Neurology78(17):1309-14)发现与对照相比，DMD肌肉活检样品含有更高水平的IL-17(Th17标志物)和较低水平的Foxp3(Treg标志物)mRNA。还观察到其他促炎细胞因子(如TNF-α和MCP-1)的升高，并发现这与患者的差临床结果相关。作者得出结论，该数据指向IL-17的可能致病作用。
类似地，Jamshidian等(J Neuroimmunol 2013,262(1-2):106-12)报道了复发性多发性硬化症患者中偏离对炎症表型的调节的偏倚的Treg/Th17平衡及其与临床症状严重程度的相关性。
调节性T细胞的作用也与囊性纤维化(CF)的发病机制有关。特别是，受疾病影响的CF肺与加剧的Th17和Th2细胞反应有关，指示典型的炎症表型，但也与Treg细胞的数量或功能不足(即受损)有关(McGuire(2015)Am J Respir Crit Care Med 191(8):866-8)。
此外，Zhuang等(Scientific Reports(2017)7:40141)发现急性前葡萄膜炎(人I类主要组织相容性复合物阳性的眼内前段炎症)患者中Th17/Treg细胞的失衡，其中观察到Th17细胞显著增加和Treg细胞显著减少。
综上所述，本公开的发明人认识到，在与升高的Th17/Treg比率相关的这些各种疾病中共同特征似乎是，患者患有伴有炎症成分的纤维化病症。
因此，在本公开中设想，保留TGFβ功能的Treg/GARP-分支的TGFβ抑制疗法可能特别有利于有效治疗以Th17/Treg比率水平升高为特征的疾病。以此方式，根据本发明的TGFβ的情境选择性抑制剂旨在避免可能干扰Treg功能的TGFβ抑制的更多全身性效应，这可能导致患者中现有纤维化/炎症状况的恶化。因此，本文所述的基质靶向的TGFβ抑制剂用于治疗患有或有发展为包含炎症的纤维化病症的风险的患者的方法。在一些实施方式中，患者具有升高的Th17-Treg细胞比率。在一些实施方式中，升高的Th17/Treg比率可能主要由Th17细胞数量增加引起，而在其他实施方式中，升高的Th17/Treg比率可能主要由患者(或从患者采集的生物样品)中Treg细胞数量减少引起。然而在进一步的实施方式中，升高的Th17/Treg比率可能由增加的Th17细胞数量和减少的Treg细胞数量的组合引起。在一些实施方式中，在患者中检测(或在从患者收集的样品中测量)的IL-17和/或IL-22水平升高也指示伴随慢性炎症的纤维化病症。因此可以选择这样的患者作为接受本文公开的情境选择性TGFβ1抑制剂疗法的候选者。
在TGFβ抑制疗法中保持GARP-TGFβ1轴完整的第三条推理与维持正常Treg功能的益处有关。如所述的，GARP在Tregs的细胞表面上表达，且被认为在TGFβ介导的免疫调节中发挥作用。因为Tregs对于免疫稳态和预防自身免疫是必不可少的，对其不必要的扰动可能会使某些患者群体面临更高的例如感染的风险(例如，综述于Richert-Spuhler和Lund(2015)Prog Mol Biol Transl Sci.136:217-243)。
在TGFβ抑制疗法中保持GARP-TGFβ1轴完整的第三条推理是，调节性T细胞起到“中断”的作用，以调节或抑制过度反应性的免疫反应。Foxp3作为Treg细胞发育和功能的主要调节子的发现对于理解Treg细胞生物学至关重要。Foxp3中的失活突变导致小鼠中具有皮疹表型的严重自身免疫和人类中的IPEX综合征(“免疫失调、多内分泌病、肠病、X连锁”)的自发发展(参见Dominguez-Villear和Haler,Nature Immunology 19,665-673,2018)。因此，它提出了一种可能性，即引起TGFb功能的Treg/GARP臂的抑制效应的TGFb1疗法，尤其是在长期治疗中，可能引起或加剧自身免疫反应。
越来越多的证据表明，Tregs不仅抑制旺盛的效应子免疫反应，还能够通过参与病原体清除和保护宿主免受附带损害来增强对病原体的适当免疫反应。Treg细胞的这种多样化功能在如肺的脆弱组织(其不断暴露在外部环境中)中尤为明显，其中来自外部环境的多种病原体和其他外来组分(例如病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体和过敏原)可以进入宿主细胞。
例如，流感病毒感染引起强烈的促炎细胞因子反应，并伴有大量免疫细胞浸润。在急性和/或严重感染中，这种反应可在易感个体中引起严重的后遗症。Tregs提供了一种通过控制宿主中免疫反应的强度来抑制病毒感染相关的病理的机制。事实上，病原体暴露的Tregs在过继转移中保留了保护作用。此外，这种激发的Treg的过继转移已被证明改善流感病毒相关的发病率并延长严重免疫功能低下动物模型的存活。
因此，本发明提供了ECM靶向的情境选择性TGFβ抑制剂(例如，TGFβ1激活抑制剂的LTBP1-选择性或LTBP1/3-选择性抑制剂)用于治疗受试者中涉及基质相关TGFβ失调的疾病的用途。受试者患有感染或有感染的风险。感染可以是病毒感染(例如，流感病毒、呼吸道合胞病毒或RSV、人类免疫缺陷病毒或HIV、MARS、SARS、单纯疱疹病毒或HSV、甲型肝炎病毒或HAV、乙型肝炎病毒或HBV、丙型肝炎病毒或HCV、CMV、登革热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和西尼罗河病毒)、细菌感染(脑膜炎、结核分枝杆菌、单核细胞增生李斯特菌、啮齿类柠檬酸杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌)和/或真菌感染(例如，念珠菌、肺炎球菌、曲霉菌、隐球菌和球孢子菌)。
通常，高危或有风险的人群(被认为特别容易受到严重感染或感染引发反应的个体)包含儿科人群(婴儿、幼儿，例如7岁以下的人类个体)；老年人群(65岁或以上的人)；由于医疗状况、健康状态、生活方式(如吸烟)和/或具有免疫抑制作用的药物等原因导致免疫系统受损的人。
例如，某些药物会导致免疫力减弱，例如化疗、靶向造血细胞的疗法(例如CD33疗法)、类固醇、免疫抑制剂和他汀类药物。
在一些实施方式中，高危或有风险的人群是那些患有现有疾病的人群，例如患有慢性感染如HIV的人群、接受骨髓移植的人群、前期糖尿病个体、糖尿病个体、患有自身免疫性疾病(如RA、哮喘和过
因此，本文涵盖的基质靶向、情境选择性TGFβ抑制剂可能特别有利于治疗需要长期或慢性TGFβ治疗的患者，因为在这些情况中，避免免疫稳态和正常免疫功能的受损是有益的，其提供有效应对由各种病原体(例如上面列出的病原体)引起的可能感染的能力。
因此，选择性结合LTBP-TGFβ(例如，LTBP1-TGFβ1和LTBP3-TGFβ1)并且在免疫相关的TGFβ呈递物GARP和LRRC33的背景下不抑制TGFβ的抗体是用于治疗纤维化适应症，如器官纤维化的治疗性候选者，并旨在避免TGFβ相关的总体免疫激活。在一个实施方式中，情境特异性抗体可用于在其中TGFβ介导的免疫抑制有益的应用中抑制LTBP1/3相关的TGFβ活性，例如，在已经接受移植的、接受移植的候选者或预计接受移植的受试者中。在一些实施方式中，受试者患有晚期纤维化和/或骨髓疾病。在一些实施方式中，受试者患有或有发生自身免疫性疾病的风险。
上述方法可用于治疗患有病症的受试者，其中抑制或降低LTBP相关TGFβ活性对该病症是有益的。例如，受试者可能患有或有患与细胞外基质相关的TGFβ活性有关的疾病的风险。
细胞外基质中整联蛋白介导的潜在TGFβ的激活是纤维化的关键因素。不希望受理论束缚，目前理解包含αVβ6和αVβ8的整联蛋白可以触发TGFβ从包含LTBP1和LTBP3的呈递分子释放。抑制这种情况中TGFβ的释放或激活可以减少或消除纤维化和/或与之相关的症状。
如上所述，LTBP1和LTBP3作为ECM的组分产生并细胞外沉积，在此处它们可以在ECM内“呈递”proTGFβ复合物(TGFβ1的潜在、无活性前体)。受到刺激时，LTBP1/3-proTGFβ复合物释放TGFβ生长因子(生长因子的活性的、成熟的形式)，这随之被认为参与局部组织微环境的调节，例如ECM维持/重塑和纤维化过程，可能是通过对各种细胞因子、趋化因子和生长因子做出反应，以及通过与其他ECM组分相互作用，如纤连蛋白、原纤维蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和基质金属肽酶(MMP)。
例如，在对损伤作出反应的正常伤口愈合过程中，TGFβ被认为促进颗粒组织形成、血管生成和胶原蛋白合成和产生。TGFβ信号传导还涉及异常组织纤维发生(即，纤维化)，这导致在修复或反应性过程中器官或组织中形成过多的纤维结缔组织，其特征在于细胞外基质(ECM)成分例如胶原蛋白的病理性积累。在这些和其他情况下，TGFβ轴可能会影响其他方面(除了纤维化方面)，例如炎症、各种细胞类型的募集和表型转换，这可能是由其与一种或多种其他呈递分子(例如，GARP/LRRC32和LRRC33)的相互作用介导的。在某些情况下，在驱动纤维化的ECM相关TGFβ被选择性抑制的情况中，优先抑制TGFβ激活的LTBP1/3情境而不显著抑制的一个或多个TGFβ1激活的其他情境是有利的。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种通过向受试者施用如本文所述的选择性地结合LTBP1/3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分来减少患有纤维化病症或有发展纤维化病症的风险的受试者的TGFβ激活的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了通过向受试者施用如本文所述的选择性地结合LTBP1/3-TGFβ复合物的抗体或其抗原结合部分来治疗纤维化病症的方法。
在一个实施方式中，纤维化病症是器官纤维化，其中任选地，器官纤维化是晚期器官纤维化。在另一个实施方式中，器官纤维化选自肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、胰腺纤维化、皮肤纤维化、硬皮病、肌肉纤维化、子宫纤维化和子宫内膜异位症。在另一个进一步的实施方式中，包含慢性炎症的纤维化病症是肌营养不良症、多发性硬化症(MS)或囊性纤维化(CF)。在另一个实施方式中，肌营养不良症是杜氏肌营养不良症(DMD)。在另一个进一步的实施方式中，MS包含血管周围纤维化。在另一个实施方式中，肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。在另一个进一步的实施方式中，受试者患有慢性肾病(CKD)。在另一个实施方式中，受试者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在示例性实施方式中，纤维化病症是纤维化、Alport综合征、纤维瘤、结缔组织增生、肌萎缩侧索硬化(ALS)或杜氏肌营养不良症(DMD)。
在一个实施方式中，受试者患有结缔组织增生。
在一个实施方式中，受试者患有器官纤维化，例如肾纤维化(例如，与慢性肾病(CKD)相关的纤维化)、肝纤维化(例如，与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关的纤维化)、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化(IPF))、心脏纤维化和/或皮肤纤维化(例如硬皮病)。在一些实施方式中，受试者可能患有晚期器官纤维化。例如，受试者可能需要器官移植。在一个实施方式中，受试者可能需要器官移植，并且施用本文所述的化合物和组合物以防止受试者在接受移植后发生同种异体移植物纤维化。
最近的一项研究检查了抑制整联蛋白αVβ6是否可以预防肾移植后TGFβ介导的同种异体移植纤维化(Lo等，Am.J.Transplant.(2013),13:3085-3093)。令人惊讶的是，与安慰剂动物相比，用抑制性抗αVβ6抗体治疗的动物的无排斥存活率显著降低。作者得出结论，该结果警告肾移植中的TGFβ抑制，因为TGFβ的免疫抑制特性有助于防止同种异体移植排斥。本文所述的抑制剂，例如抗体及其抗原结合部分，有利地抑制细胞外基质中由LTBP1或LTBP3呈递的TGFβ的激活，但不抑制免疫细胞上由GARP或LRRC33呈递的TGFβ的激活。因此，本文所述的情境特异性LTBP1/3-TGFβ抑制剂，例如抗体，可以预防或减少同种异体移植物纤维化，而不会消除TGFβ可用于预防同种异体移植排斥的免疫抑制特性。因此，一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的纤维化病症的方法，包含向受试者施用治疗有效量的TGFβ信号传导抑制剂，其中所述抑制剂是ECM相关的TGFβ的选择性抑制剂；和其中受试者受益于免疫抑制。在一个实施方式中，受试者患有纤维化病症并且将受益于同种异体移植或者已经接受同种异体移植。
本公开的抗体和/或组合物可用于治疗的另外的纤维化病症包括但不限于，肺适应症(例如，特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性哮喘、囊性纤维化(CF)、急性肺损伤、嗜酸性粒细胞性食管炎、肺动脉高压和化学气体损伤)、肾脏适应症(例如，糖尿病性肾小球硬化、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、慢性肾病、与肾移植相关的纤维化和慢性排斥反应、IgA肾病和溶血性尿毒症综合征)、肝纤维化(例如，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性病毒性肝炎、寄生虫血症、先天性代谢障碍、毒素介导的纤维化，例如酒精性纤维化、非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌(NASH-HCC)、原发性胆汁性肝硬化和硬化性胆管炎)、心血管纤维化(例如心肌病、肥厚性心肌病、动脉粥样硬化和再狭窄)、系统性硬化症，皮肤纤维化(例如，系统性硬化症中的皮肤纤维化、弥漫性皮肤系统性硬化症、硬皮病、病理性皮肤疤痕、瘢痕疙瘩、手术后疤痕、疤痕修复手术、放射诱发的疤痕和慢性伤口)、眼相关疾病，例如视网膜下纤维化、葡萄膜炎综合征、与特发性腹膜后纤维化相关的葡萄膜炎、眼外肌纤维化、与主要组织相容性复合物(MHC I类)或组织相容性抗原相关的眼病、黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性)中的视网膜下纤维化和癌症或继发性纤维化(例如，骨髓纤维化、头颈癌、M7急性巨核细胞白血病和粘膜炎)。可以使用本公开的化合物和/或组合物治疗的与纤维化相关的其他疾病、病症或病状包括但不限于马凡氏综合征、皮肤僵硬综合征、硬皮病、类风湿性关节炎、骨髓纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、肌肉萎缩症(如DMD)、Dupuytren挛缩、Camurati-Engelmann病、神经瘢痕、痴呆、增殖性玻璃体视网膜病变、角膜损伤、青光眼引流手术后的并发症和多发性硬化症(MS)。许多此类纤维化适应症也与受影响组织的炎症有关，表明免疫成分的参与。这种炎症可能伴随着异常的免疫细胞群体，例如Th17细胞数量增加、Treg细胞数量减少和/或两者。在每一种情况下，受影响的患者都可能表现出增加的Th17/Treg细胞比率。在一些实施方式中，待用根据本公开的抗体治疗的疾病包含代谢紊乱，例如代谢性肝紊乱。代谢紊乱的非限制性实例包含NASH、NAFLD、2型糖尿病和肥胖症。在一些实施方式中，待用根据本公开的抗体治疗的疾病是主动脉狭窄。
在另一方面，本发明提供了选择用于治疗受试者的纤维化病症的同工型特异性TGFβ1抑制剂的方法，包含：(a)测定受试者是否表现出包含纤维化和一种或多种以下的临床表现：(i)炎症；(ii)免疫抑制；(iii)增殖性失调；(iv)需要同种异体移植；(v)有严重感染的风险；(vi)需要长期TGFβ1抑制治疗；和(vii)自身免疫性疾病的表现；和(b)基于步骤(a)中确定的临床表现，选择同工型特异性、情境依赖性TGFβ1抑制剂或同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂用于治疗纤维化病症。
在另一方面，本发明提供治疗患有纤维化病症的受试者的方法，包含(a)为受试者选择包含同工型特异性TGFβ1抑制剂的治疗方案，所述选择包含(i)确定纤维化疾病是否表现出包含纤维化和以下一项或多项的临床表现：炎症、免疫抑制、增殖失调和需要同种异体移植；和(ii)基于步骤(i)中确定的临床表现，选择包含同工型特异性、情境依赖性TGFβ1抑制剂或同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂的治疗方案；和(b)向受试者施用选定的治疗方案。
在前述方面的一个实施方式中，纤维化病症表现出包含纤维化、炎症、免疫抑制和增殖失调的临床表现。在一个示例性实施方式中，纤维化病症是骨髓纤维化，并且选择的同工型特异性TGFβ1抑制剂是同工型特异性的、非情境依赖性TGFβ1抑制剂。
在另一个实施方式中，纤维化病症表现出包含纤维化、炎症和需要同种异体移植物的临床表现。在一个实施方式中，纤维化病症表现出包含纤维化和炎症的临床表现。在另一个实施方式中，纤维化病症是退行性疾病。
在一个实施方式中，纤维化病症表现出包含免疫抑制和增殖失调的临床表现。在示例性实施方式中，纤维化病症与实体瘤相关，并且选择的同工型特异性TGFβ1抑制剂是同工型特异性LTBP1/3特异性抑制剂和/或GARP选择性抑制剂。在一个实施方式中，实体瘤是恶性肿瘤。在另一个实施方式中，肿瘤是良性肿瘤。在一个实施方式中，受试者患有结缔组织增生，例如胰腺结缔组织增生。在另一个实施方式中，受试者患者纤维瘤。
在另一方面，本发明提供了一种用同工型特异性、LTBP1/3特异性TGFβ1抑制剂治疗患有纤维化病症的受试者的方法，包含确定纤维化病症是否表现出包含纤维化和需要同种异体移植的临床表现；和如果纤维化病症表现出纤维化和需要同种异体移植，则向受试者施用有效量的同工型特异性、LTBP1/3特异性TGFβ1抑制剂。
在另一方面，本发明提供了一种用同工型特异性的、非情境依赖性TGFβ1抑制剂治疗患有纤维化病症的受试者的方法，包含确定纤维化病症是否表现出包含纤维化、免疫抑制和/或增殖失调的临床表现；和如果纤维化病症表现出与免疫抑制和/或增殖失调结合的纤维化，则向受试者施用有效量的同工型特异性、非情境依赖性的TGFβ1抑制剂。
可以有效治疗或减轻纤维化症状的量向受试者施用本文所述的抑制剂，例如抗体。这种抑制剂的有效量是在受试者中有效实现治疗功效和临床安全性的量。在一个实施方式中，有效量是有效降低细胞外基质中TGFβ1活性的量。在另一个实施方式中，有效量是有效减少受试者中纤维化的量。在另一个实施方式中，有效量不抑制TGFβ1介导的免疫抑制。在一些实施方式中，这种抑制剂，例如抗体，是可以阻断由含有LTBP的、ECM相关的TGFβ1介导的TGFβ1激活的情境特异性抑制剂。在一些实施方式中，LTBP是LTBP1和/或LTBP3。可用于测定本公开的抑制剂例如抗体和/或组合物对纤维化改变的功效的测定包括但不限于用于计数成纤维细胞的组织学分析和本领域已知的基本免疫组织化学分析。
涉及蛋白酶的疾病：
TGFβ从其潜在复合物的激活可以由整联蛋白以力依赖性方式和/或通过蛋白酶触发。有证据表明某些类型的蛋白酶可能参与该过程，包括但不限于Ser/Thr蛋白酶，如凝血酶、激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)、弹性蛋白酶、纤溶酶，以及ADAM家族，例如ADAM10和ADAM17，以及MMP家族，如MMP-2、MMP-9和MMP-13，的锌金属蛋白酶。MMP-2降解基底膜中最丰富的成分，胶原蛋白IV，提高了它可以在ECM相关的TGFβ1调节中起作用的可能性。已表明MMP-9在肿瘤进展、血管生成、基质重塑和转移中起关键作用。因此，TGFβ1在ECM中的蛋白酶依赖性激活对于治疗癌症可能是重要的。
激肽释放酶(KLK)是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其包括血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。ECM在组织稳态中起作用，其作为结构和信号传导支架起到抑制恶性生长的屏障的作用。KLK可能在降解ECM蛋白和其他可能促进肿瘤扩张和侵袭的组分中发挥作用。例如，KLK1在某些乳腺癌中高度上调，并且可以激活前MMP-2和前MMP-9。KLK2激活潜在TGFβ1，使得与成纤维细胞相邻的前列腺癌允许癌症生长。KLK3作为前列腺癌(PSA)的诊断标志物已被广泛研究。KLK3可以通过将纤溶酶原加工成纤溶酶直接激活TGFβ1，所述纤溶酶蛋白水解切割LAP。KLK6可能是阿尔茨海默病的潜在标志物。
已知的TGFβ1激活剂，例如纤溶酶、TSP-1和αVβ6整联蛋白，都与LAP直接相互作用。据推测，LAP的蛋白水解切割可能使LAP-TGFβ相互作用不稳定，从而释放活性的TGFβ1。有人提出，含有54-LSKLRL-59的区域对于维持TGFβ1潜伏状态非常重要。因此，稳定该相互作用或阻断LAP蛋白水解切割的试剂(例如，抗体)可能阻止TGFβ激活。
与病理状况(例如，癌症)相关的很多这些蛋白酶通过不同的作用机制起作用。因此，特定蛋白酶或蛋白酶的组合的靶向抑制可以为涉及蛋白酶-TGFβ轴的病症的治疗提供治疗获益。因此，预期的是，选择性抑制蛋白酶诱导的TGFβ1激活的抑制剂(例如，TGFβ1抗体)在治疗此类疾病(例如，癌症)中可能是有利的。类似地，取决于所治疗的病症，通过一种蛋白酶相对于另一种蛋白酶对TGFβ1活性的选择性抑制也可能是优选的。
纤溶酶是一种以称为纤溶酶原的前体形式产生的丝氨酸蛋白酶。释放后，纤溶酶进入循环并因此在血清中被检测到。纤溶酶水平升高似乎与癌症进展相关，可能是通过涉及破坏细胞外基质(例如，基底膜和基质屏障)的机制，这促进肿瘤细胞运动、侵袭和转移。纤溶酶还可能影响粘附、增殖、凋亡、癌症营养、氧供应、血管形成和VEGF的激活(Didiasova等，Int.J.Mol.Sci,2014,15,21229-21252)。此外，纤溶酶可以促进巨噬细胞迁移进入肿瘤微环境中(Philips等，Cancer Res.2011Nov 1；71(21):6676-83和Choong等，Clin.Orthop.Relat.Res.2003,415S,S46-S58)。实际上，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过其促进肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成的能力是良好表征的肿瘤发生的驱动物。
纤溶酶活性主要与ECM的破坏关联。然而，越来越多的证据表明，纤溶酶还调节下游的MMP和TGFβ激活。具体地，已提出纤溶酶通过蛋白水解酶切割潜在相关肽(LAP)导致TGFβ激活，其源自TGFβ基因产物的N末端区域(Horiguchi等，J Biochem.2012Oct；152(4):321-9)，从而导致活性生长因子的释放。由于TGFβ1可促进癌症进展，因而这增加了纤溶酶诱导的TGFb激活可能至少部分地介导这一过程的可能性。
TGFβ1还显示出调控uPA的表达，uPA是纤溶酶原转化成纤溶酶的关键参与者(Santibanez,Juan F.,ISRN Dermatology,2013:597927)。uPA通过与其细胞表面受体(uPAR)结合并促进纤溶酶原转化成纤溶酶而独立地显示出促进癌症进展(例如，粘附、增殖和迁移)。而且，研究表明，uPA和/或纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达是结直肠癌(D.Q.Seetoo等，Journal of Surgical Oncology,vol.82,no.3,pp.184–193,2003)、乳腺癌(N.Harbeck等，Clinical Breast Cancer,vol.5,no.5,pp.348–352,2004)和皮肤癌(Santibanez,Juan F.,ISRN Dermatology,2013:597927)的不良预后的预测子。因此，不希望受到特定理论的束缚，纤溶酶、TGFβ1和uPA之间的相互作用可产生一个正反馈环，从而促进癌症进展。因此，选择性抑制剂纤溶酶依赖性TGFβ1激活的抑制剂可能特别适合治疗依赖于纤溶酶/TGFβ1信号传导轴的癌症。
在本发明的一个方面中，本文所述的TGFβ1的同工型特异性抑制剂包括能够抑制TGFβ1的蛋白酶依赖性激活的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂能够抑制不依赖于整联蛋白的方式的蛋白酶依赖性TGFβ1激活。在一些实施方式中，此类抑制剂可抑制TGFβ1激活而无论激活方式如何，例如，抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和蛋白酶依赖性激活。在一些实施方式中，蛋白酶选自以下：丝氨酸蛋白酶，如激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶以及锌金属蛋白酶(MMP家族)，如MMP-2、MMP-9和MMP-13。
在一些实施方式中，抑制剂可以抑制纤溶酶诱导的TGFβ1激活。在一些实施方式中，抑制剂可以抑制纤溶酶和整联蛋白诱导的TGFβ1激活。在一些实施方式中，抑制剂是特异性结合TGFβ1的单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是特异性结合proTGFβ1的单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体结合潜在proTGFβ1，从而抑制成熟生长因子从潜在复合物的释放。在一些实施方式中，TGFβ1激活的高亲和力、LTBP复合物特异性抑制剂适用于抑制TGFβ1的纤溶酶依赖性激活的方法中。在一些实施方式中，TGFβ1激活的LTBP复合物特异性抑制剂选自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63和Ab64(任选地Ab42或Ab63)(即，具有相应Ab的重链和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，如本文所提供)，其变体/衍生物或抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的工程化分子。在一些优选的实施方式中，TGFβ1激活的LTBP复合物特异性抑制剂是Ab42、其变体/衍生物或抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的工程化分子。在优选的实施方式中，TGFβ1激活的LTBP复合物特异性抑制剂是Ab42或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，抑制剂(例如，TGFβ1抗体)抑制癌细胞迁移。在一些实施方式中，抑制剂抑制巨噬细胞迁移。在一些实施方式中，抑制剂抑制TAM的积累。
在另一个方面中，本文提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的TGFβ1抑制剂(例如，TGFβ1抗体)，其中所述抑制剂抑制TGFβ1的蛋白酶诱导的激活(例如，纤溶酶)，从而在受试者中治疗癌症。
在另一个方面中，本文提供了一种用于在有需要的受试者中减少肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的TGFβ1抑制剂(例如，TGFβ1抗体)，其中所述抑制剂抑制TGFβ1的蛋白酶诱导的激活(例如，纤溶酶)，从而在受试者中减少肿瘤生长。
涉及ECM失调的疾病
细胞外基质是一种细胞分泌网络，其围绕着细胞并且主要由蛋白聚糖和纤维状蛋白组成，其中最丰富的是胶原蛋白。本文公开的新型抗体可用于治疗与细胞外基质失调相关的疾病。与细胞外基质失调相关的疾病通常是肌成纤维细胞驱动的病理，并包含癌症、纤维化和心血管疾病(例如，综述于：Lampi和Reinhart-King(2018)“Targetingextracellular matrix stiffness to attenuate disease:From molecular mechanismsto clinical trials”Sci Tarnsl Med 10(422):eaao0475)。纤维化病症的进展涉及沉积到ECM中的基质组分水平增加和/或ECM的维持/重塑。TGFβ1至少部分造成了这一过程。例如，通过观察到ECM成分(如胶原蛋白)的沉积增加可以改变ECM的机械物理特性(例如，基质/基底的刚度)，并且这种现象与TGFβ1信号传导相关，这一点得到了支持。TGFβ1抑制剂，例如本文所述的那些，可用于阻断该过程以对抗涉及ECM改变的疾病进展，例如纤维化。此类抑制剂的LTBP分支可以直接阻断由LTBP1和/或LTBP3呈递的ECM相关前/潜在TGFβ复合物，从而在疾病位点中防止生长因子从复合物激活/释放。在一些实施方式中，同工型特异性TGFβ1抑制剂例如本文所述的那些可使ECM硬度正常化以治疗涉及整联蛋白依赖性信号传导的疾病。在一些实施方式中，整联蛋白包含α11链、β1链或两者。
因此，可以以有效治疗疾病的量将抗体施用于被诊断患有具有细胞外基质失调的疾病的受试者。抗体的治疗有效量可以是足以降低一种或多种肌成纤维细胞标志物例如α-SMA的表达的量。该量可以是足以降低受影响组织(例如，纤维化组织)的细胞外基质硬度的量。该量可以是足以减少TGFβ1下游效应物的量，例如SMAD2和/或SMAD3的磷酸化。在一些实施方式中，TGFβ1的同工型选择性激活抑制剂选自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63和Ab64(任选地Ab42或Ab63)、其变体/衍生物或其抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的工程化分子。在一些优选的实施方式中，TGFβ1的同工型选择性激活抑制剂是Ab42、其变体/衍生物或抗原结合片段或包含其抗原结合片段的工程化分子。在优选的实施方式中，TGFβ1选择性抑制剂是Ab42或其抗原结合片段。
涉及上皮间质转化(EMT)的疾病：
EMT(上皮间质转化)是具有紧密连接的上皮细胞转化为间质特性(表型)如松散的细胞-细胞接触的过程。所述过程在许多正常生物学过程以及病理情况中观察到，包括胚胎发生、伤口愈合、癌症转移和纤维化(综述于例如，Shiga等，(2015)“Cancer-AssociatedFibroblasts:Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth.”Cancers,7:2443-2458中)。通常，认为EMT信号主要由TGFβ诱导。例如，许多类型的癌症似乎涉及细胞向间质表型(例如CAF)的转分化，其与较差的预后相关。因此，TGFβ1的LTBP特异性抑制剂，例如本文所述的那些，可用于治疗由EMT引发或驱动的疾病。实际上，本文中示例的数据(例如，图12和13)显示这样的抑制剂具有在体内抑制CAF标志物表达的能力，例如α-SMA、Col1(I型胶原蛋白)和FN(纤连蛋白)。
涉及基质硬化和重塑的疾病
纤维化病症的进展涉及沉积到ECM中的基质组分水平增加和/或ECM的维持/重塑。TGFβ1至少部分促成了这一过程。例如，通过观察到ECM组分(如胶原蛋白)的沉积增加可以改变ECM的机械物理特性(例如，基质/基底的刚度)，并且这种现象与TGFβ1信号传导相关，这一点得到了支持。为了证实这一观点，本发明人已经评估了基质硬度在影响用proTGFβ和LTBP1转染的并在具有确定硬度(例如，5kPa、15kPa或100kPa)的硅基基质上生长原代成纤维细胞中TGFβ的整联蛋白依赖性激活中的作用。具有较大硬度的基质增强TGFβ1激活，并且这可以被能够结合并因此抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1激活的抗体及其抗原结合部分抑制。这些观察结果表明TGFβ1影响ECM特性(如硬度)，这随之可以进一步诱导TGFβ1激活，反映疾病进展。因此，选择性结合LTBP1-TGFβ1和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体及其抗原结合部分，例如本文所述的那些，可用于阻断该过程以对抗涉及ECM改变的疾病进展，例如纤维化、肿瘤的生长、侵袭、转移和结缔组织增生。此类抑制剂可以直接阻断由LTBP1和/或LTBP3呈递的ECM相关的前/潜在TGFβ复合物，从而在疾病位点中防止生长因子从复合物激活/释放。
纤维化：
响应于由于物理损伤/创伤、有毒物质和/或感染引起的组织损伤或慢性损伤，开始自然修复过程，其涉及几个细胞类型，包括成纤维细胞、几种不同类型的免疫细胞以及驻留的上皮和内皮细胞。然而，如果不加控制，这一过程可能导致细胞外基质(ECM)过度累积和纤维化，进而可导致组织功能的逐步丧失和器官衰竭(Caja等，Int.J.Mol.Sci.2018,19,1294)。
纤维化可能发生在几种不同的器官中，包括肺、肾、肝、心脏和皮肤。与器官无关，纤维化反应特征是炎症、上皮-间质相互作用改变和成纤维细胞增殖。纤维化的标志之一是成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，这极大地造成ECM的失调。然而，还提出肌成纤维细胞来自其他细胞来源(例如，内皮细胞、上皮细胞和间充质干细胞)(Kim,K.K.等，Cold SpringHarb.Perspect.Biol.,2017；Okabe,H.Histol.Histophathol.,2016,31,141-148；和Li,C等，Nat Commun.,2016,7,11455)。而且，免疫细胞通过分泌促进肌成纤维细胞分化、刺激ECM沉积并向受损组织募集额外的免疫细胞的细胞因子和趋化因子而在这一过程中发挥重要作用(Caja等，Int.J.Mol.Sci.2018,19,1294)。
与纤维化组织类似，与癌症相关的成纤维细胞能够在肿瘤环境中激活，从而产生过量的ECM。ECM提供了用于其他细胞(例如，促肿瘤原性免疫细胞)的浸润的支架，和用于细胞迁移的基质。在其他情况下，过多的ECM可能会成为对抗肿瘤原性免疫细胞的屏障。
TGFβ被认为是纤维化反应的中央协调器。TGFβ能够促进肌成纤维细胞分化、募集免疫细胞以及影响上皮和内皮细胞分化。特别地，TGFβ上调ECM和基底膜蛋白的产生，如纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、肌腱蛋白、弹性蛋白、核心蛋白聚糖。TGFβ诱导的肌成纤维细胞分化可导致ECM蛋白的进一步沉积，基质金属蛋白酶(MMP)的分泌以及肌成纤维细胞的增殖(Fabregat等，FEBS J.2016,283,2219-2232；Meng等，Nat.Rev.Nephrol.2016,12,325-338；和Kulkarni等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2016,54,751-760)。此外，TGFβ介导影响血管平滑肌细胞(VSCM)中收缩蛋白和胶原蛋白I的表型变化，并可激活肌成纤维细胞和其他基质细胞以增强胶原交联蛋白的合成，例如基质重塑酶的赖氨酰氧化酶(LOX)家族(Busnadiego等，Mol.Cell.Biol.2013,33,2388-2401)。而且，已经显示出TGFβ调节EMT和EndMT两者，这有助于促纤维化细胞类型的分化，如肌成纤维细胞和CAF。而且，TGFβ已显示出诱导上皮细胞凋亡，除其他组织外，这可促进肺和肝纤维化(Barbas-Filho等，J.Clin.Pathol.2001,54,132-138；和Wang等，Dev.Dyn.2017,247,492-508)。
无论是先天的还是募集的，巨噬细胞被认为在对组织损伤和修复的应答中起重要作用。然而，在某些信号后，其会变为促纤维化的。除其他细胞因子外，TGFβ还显示可激活促炎性的M2巨噬细胞。激活后，这些巨噬细胞分泌其自己的细胞因子，包括TGFβ、ECM组分、血管生成因子和趋化因子。已显示M2巨噬细胞对TGFβ驱动的肺纤维化至关重要(Murray等，Int.J.Biochem.Cell Biol.2011,43,154-162)。
鉴于越来越多的证据表明M2型巨噬细胞对多种类型纤维化的疾病进展很重要，仍然存在的问题是，是否对单独的LTBP1/3相关TGFβ1的情境选择性抑制(也就是说，不涉及巨噬细胞相关的TGFβ1活性的LRRC33分支)可能足以在体内产生有效的抗纤维化作用。然而，令人惊讶的是，本文提供的数据表明，选择性靶向基质相关的TGFβ1(例如，LTBP1/3-proTGFβ1)似乎在多个临床前模型中实现抗纤维化作用方面与使用所谓的非情境依赖性TGFβ1抑制剂(参见例如图19和20)靶向所有四种已知的LLC(例如，LTBP1/3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)一样有效—如果不是更好，并且这样不会触发通过GARP-proTGFβ1抑制介导的T细胞刺激。此外，先前公开的LTBP1/3复合物选择性抗体缺乏强大的物种交叉反应性，这对于临床前(例如，啮齿动物)和临床(例如，人类)使用都是有利的。尚不清楚正在寻找的同时赋予同工型选择性和情境选择性的稀有表位是否也能实现有利的物种交叉反应性特征。有利地，本文公开的新抗体具有所有这些标准。
根据本发明，例如本文所述的那些的同工型特异性TGFβ1用于受试者中纤维化(例如，纤维化适应症、纤维化状况)的治疗。用于实施本发明的合适的抑制剂包括可用于改变或改善纤维化的根据本公开的抗体和/或组合物。更具体地，这样的抗体和/或组合物是TGFβ1的选择性拮抗剂，其能够靶向由各种类型的呈递分子呈递的TGFβ1。TGFβ1被认为是纤维化反应的中心协调者。靶向TGFβ的抗体在许多临床前模型中减少纤维化。这样的抗体和/或基于抗体的化合物包括LY2382770(Eli Lilly,Indianapolis,IN)。还包括在美国专利号US6,492,497、US 7,151,169、US 7,723,486和美国专利申请公开号2011/0008364中描述的那些，其全部内容各自通过引用并入本文。现有技术的TGFβ拮抗剂包括，例如，靶向和阻断整联蛋白依赖性TGFβ激活的药剂。
然而，证据表明，这样的现有技术的试剂可能不介导同工型特异性的抑制，并且可能通过无意地阻断TGFβ2和/或TGFβ3的正常功能造成不良影响。实际上，本文提供的数据支持这一观点。正常(未患病)肺部组织含有相对低但可测量水平的TGFβ2和TGFβ3，但TGFβ1显著较少。相比之下，在某些疾病状况如纤维化中，TGFβ1相对于其他同工型变得优先上调。优选地，在这类状况的治疗中使用的TGFβ拮抗剂仅针对疾病诱导或疾病相关的同工型发挥其抑制活性，同时保持在组织中正常表达以介导主调性信号传导(tonic signaling)的其它同工型的功能。现有技术的抑制剂(LY2109761，一种小分子TGFβ受体拮抗剂，和靶向αVβ6整联蛋白的单克隆抗体)均显示在非患病大鼠BAL中抑制TGFβ下游的主调性信号传导，提高了这些抑制剂可能引起不必要的副作用的可能性。可选地或另外地，靶向和阻断TGFβ的整联蛋白依赖性激活的药剂可能在由各种细胞类型表达并在发病机理中起作用的大量的整联蛋白类型中能够只阻断负责疾病相关TGFβ1激活的整联蛋白的子集。此外，即使这样的拮抗剂可能选择性地阻断整联蛋白介导的TGFβ1同工型的激活，它可能在阻断由其他模式触发的TGFβ1激活(例如蛋白酶依赖性激活)方面无效。因此，如本文所述的那些的TGFβ1的同工型特异性抑制剂旨在阻止TGFβ1的激活步骤而不管特定的激活模式，同时保持同工型选择性。
进一步预期，相对于细胞相关抗原复合物优先抑制基质相关抗原复合物(即，显示情境偏倚)的同工型特异性TGFβ1抑制剂可能在某些临床情况下提供治疗优势(例如，文中描述的LTBP特异性抑制剂)。例如，TGFβ1非情境依赖性抑制剂(其靶向所有四种抗原复合物)可以通过靶向细胞相关的TGFβ1(例如，在调节性T细胞上表达的GARP-TGFβ1)来增加免疫激活。免疫激活可能对某些患者不利，例如，患有自身免疫性疾病或有败血症风险的患者。因此，情境偏倚的抗体可用于治疗与基质相关的TGFβ1复合物相关的疾病(例如，纤维化)，同时最小化免疫激活。
此前，设想同工型特异性TGFβ3抑制剂可能在特定疾病状态下提供附加的治疗益处。例如，使用TGFβ1抑制剂治疗的某些纤维化疾病也可以是TGFβ3阳性的(即，TGFβ1+/TGFβ3+纤维化组织)，其特征是该疾病组织(例如，纤维化组织)表达这两种同工型。因此，本发明包括将同工型选择性TGFβ1抑制剂与同工型选择性TGFβ3抑制剂联合使用以治疗此类病症。
对于本发明的抗体和/或组合物可用于治疗的纤维化适应症包括但不限于肺适应症(例如特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性哮喘、急性肺损伤、嗜酸性粒细胞性食管炎、肺动脉高压和化学性气体损伤)，肾适应症(例如，糖尿病肾小球硬化、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、慢性肾脏疾病(CKD)、与肾移植相关的纤维化和慢性排斥反应、IgA肾病和溶血性尿毒症综合征)，肝纤维化(例如，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性病毒性肝炎、寄生虫血症、先天性代谢紊乱、毒素介导的纤维化如酒精性纤维化、非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌(NASH-HCC)、原发性胆汁性肝硬化症和硬化性胆管炎)，心血管纤维化(例如，心肌病、肥厚性心肌病、动脉粥样硬化和再狭窄)，系统性硬化症，皮肤纤维化(例如，系统性硬化症中的皮肤纤维化、弥漫性皮肤系统性硬化症、硬皮病、病理性皮肤瘢痕、瘢痕疙瘩、手术后瘢痕形成、瘢痕修复手术、放射诱导瘢痕形成和慢性伤口)，眼相关的病症，如视网膜下纤维化、葡萄膜炎综合征、与特发性腹膜后纤维化相关的葡萄膜炎、眼外肌纤维化、与主要组织相容性复合物(I类MHC)或组织相容性抗原相关的眼部疾病、黄斑变性的视网膜下纤维化(例如，年龄相关的黄斑变性)和癌症或继发性纤维化(例如，骨髓纤维化、头颈癌、M7急性巨核细胞白血病和粘膜炎)。可以使用本公开的化合物和/或组合物治疗的与纤维化相关的其他疾病、病症或状况(包括退行性病症)包括但不限于子宫腺肌症、子宫内膜异位症、马凡氏综合征、皮肤僵硬综合征、硬皮病、类风湿性关节炎、骨髓纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、肌营养不良(如DMD)、帕金森病、ALS、杜普瑞氏挛缩、卡穆拉蒂-恩格尔曼病、神经瘢痕、痴呆、增生性玻璃体视网膜病变、角膜损伤、青光眼引流术后并发症和多发性硬化症(MS)。许多此类纤维化适应症也与受影响组织的炎症有关，表明免疫成分的参与。这种炎症可能伴随着异常的免疫细胞群体，例如Th17细胞数量增加、Treg细胞数量减少和/或两者。在每一种情况下，受影响的患者可能表现出增加的Th17/Treg细胞比率。
在一些实施方式中，可以用本文描述的组合物和/或方法治疗的纤维化适应症包括器官纤维化，例如肺的纤维化(例如，IPF)、肾的纤维化(例如，与CKD相关的纤维化)、肝的纤维化、心脏或心脏组织的纤维化、皮肤的纤维化(例如，硬皮病)、子宫(例如，子宫内膜、子宫肌层)的纤维化和骨髓的纤维化。在一些实施方式中，这样的疗法可能减少或延迟患者器官移植的需要。在一些实施方式中，这样的疗法可能延长患者的存活期。
为了治疗IPF，可能从治疗中受益的患者包括具有家族性IPF的那些和具有分散性IPF的那些。施用治疗有效量的TGFβ1同工型特异性抑制剂可以减少肺组织中的肌成纤维细胞积聚、减少胶原蛋白沉积、减少IPF症状、改善或维持肺功能并延长存活。在一些实施方式中，抑制剂阻断IPF的纤维化环境内ECM相关TGFβ1(例如，由LTBP1/3呈递的前/潜在TGFβ1)的激活。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包含一系列组织学变化，从简单的肝脏脂肪浸润开始，也称为单纯性或孤立性脂肪变性或非酒精性脂肪肝(NAFL)，其可能会逐渐，有时在数十年内，进展为慢性炎症(脂肪性肝炎或NASH)、纤维化和最终肝硬化。只有一部分NAFL患者会进展为NASH和随后的肝硬化。目前，没有明确的标准来识别这组患者。NAFLD是北美慢性肝病的最常见原因。目前，没有批准的药物用于治疗NASH。鉴于NASH的高患病率、相关的发病率、终末期肝病的不断增加的负担以及用于器官移植的肝脏有限，确定将减缓NASH和NAFLD进展、停止或逆转NASH和NAFLD的疗法将解决未满足的医疗需求。
一致认为TGFβ是肝纤维化的核心参与者(例如，综述于Dewidar等，Cells 2019,8,1419，其内容通过引用并入本文)。同工型特异性TGFβ1抑制剂，例如本文提供的那些(即对LTBP1/3-TGFβ1复合物选择性的TGFβ1同工型特异性抑制剂，或“基质靶向”抑制剂)可用于治疗肝脏纤维化病症，例如非酒精性脂肪肝(NAFL)和与脂肪肝相关的纤维化(如NASH)。脂肪肝可能是或不是发炎的。由于脂肪肝(即脂肪性肝炎)导致的肝脏炎症可能发展成瘢痕形成(纤维化)，其然后往往发展为肝硬化(扭曲肝脏结构并损害其功能的瘢痕形成)。因此，抑制剂可用于治疗这些状况。在一些实施方式中，抑制剂阻断肝脏纤维化环境内ECM相关TGFβ1(例如，由LTBP1/3呈递的前/潜在TGFβ1)的激活。在具有这样的状况的受试者中施用抑制剂与未用抑制剂治疗的对照群体相比可能减轻一种或多种症状、预防或延缓疾病的进展、减少或稳定肝脏中的脂肪积累、减少与疾病相关的生物标志物(例如血清胶原蛋白片段)、减少肝脏瘢痕形成、降低肝硬度和/或在使用抑制剂治疗的患者群体中另外产生临床上有意义的结果。在一些实施方式中，效量的抑制剂可能在NASH患者中实现肝脏脂肪降低和纤维化(例如，瘢痕形成)减少两者。在一些实施方式中，有效量的抑制剂可能通过至少一个脂肪性肝炎无恶化的阶段在NASH患者中实现纤维化的改善。在一些实施方式中，有效量的抑制剂可能降低NASH患者中肝衰竭和/或肝癌的发生率。在一些实施方式中，与对照相比，有效量的抑制剂可使多种炎症或纤维化血清生物标志物的水平正常化，如在治疗开始后，例如，12-36周时所评估的。一些实施方式中，在NASH患者中，同工型特异性TGFβ1抑制剂可在接受一种或多种额外疗法的患者中施用，包括但不限于肌生长抑制素抑制剂，其通常可增强具有代谢综合征(包含NASH)临床表现的患者的代谢调节。
在一些实施方式中，在NASH或NAFLD患者中，可以在接受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(ACCi)(例如，firsocostat(也称GS-0976)或PF-05221304)的患者中施用同工型特异性、基质靶向的TGFβ1抑制剂。可与本文所述的改进的同工型特异性TGFβ1抑制剂联合使用的其他治疗剂包括但不限于：GLP-1受体激动剂或止痛剂(例如，司美鲁肽)、法尼醇X受体(FXR)激动剂(例如，GS-9674；又名Cilofexor)、ASK1抑制剂(例如，selonsertib)；奥贝胆酸、PPAR激动剂(例如GFT505；又名elafibranor)；硝唑尼特，己酮糖激酶(KHK)抑制剂(例如，PF-06835919)；肌生长抑制素抑制剂和/或二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)抑制剂(例如，PF-06865571)。在一些实施方式中，可以将上文提及的任何一种或多种治疗剂与本公开的同工型特异性TGFβ1抑制剂联用，例如，将同工型特异性TGFβ1抑制剂与FXR激动剂、ACC抑制剂和/或GLP-1类似物联用。在一些实施方式中，TGFβ抑制剂可以与肌生长抑制素抑制剂组合用于治疗受试者的代谢性肝病，例如NASH和NAFLD，以及与其相关的肝纤维化。受试者也可能患有2型糖尿病和/或肥胖症。所用的TGFβ抑制剂优选为TGFβ1选择性抑制剂，更优选靶向LTBP1/2相关TGFβ1的情境选择性TGFβ1选择性抑制剂，例如本文公开的那些。肌生长抑制素抑制剂优选为肌生长抑制素选择性抑制剂，例如SRK-015(例如，参见WO 2017/218592A1)和trevogrumab或其任何变体，或者根据WO2016/098357的抗体。
在一些实施方式中，如通过MRI-PDFF测量的，单独使用同工型特异性TGFβ1抑制剂或与一种或多种另外的治疗剂联合治疗减少肝脏脂肪。在一些实施方式中，肝脏脂肪减少至少20％，例如≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％或≥50％。在一些实施方式中，单独使用同工型特异性TGFβ1抑制剂或与一种或多种另外的治疗剂联合治疗使血清ALT和/或GGT减少至少20％，例如≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％或≥50％。在一些实施方式中，单独使用同工型特异性TGFβ1抑制剂或与一种或多种另外的治疗剂联合治疗减少胆汁酸合成。
在一些实施方式中，作为单一疗法或与一种或多种另外的疗法结合(例如，联合疗法)，本公开的TGFβ1抑制剂可有效治疗NASH。“有效治疗”可以是指肝脏脂肪变性、肝脏硬度、肝脏生化和血清纤维化标志物的改善。在一些实施方式中，12周治疗可导致至少50％患者中通过磁共振成像-质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)测量的肝脏脂肪从基线到12周至少30％的显著下降。肝脏生化测试的改善，包含血清ALT至少25％中位相对减少和GGT的至少25％，以及胆汁酸合成减少的标志物，可在12周时实现。
在一些实施方式中，NASH患者可能患有晚期肝纤维化(F3/F4期)。在一些实施方式中，此类患者患有F3期晚期肝纤维化。在一些实施方式中，此类患者患有以肝硬化为特征的F4期肝纤维化。在一些实施方式中，NASH患者发生或处于发生肝细胞癌和/或食管静脉曲张的风险中。
根据非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络病理委员会得出的分类，非酒精性脂肪肝疾病的纤维化分期如下：
纤维化的分期
纤维化表现 纤维化分期
窦周或门静脉周纤维化 1
轻度窦周纤维化(3区) 1A
中度窦周纤维化(3区) 1B
门静脉/门静脉周纤维化 1C
窦周和门静脉/门静脉周纤维化 2
桥接纤维化 3
肝硬化 4
治疗益处也可以通过疾病负担和患者报告的结果来评估。NASH还对患有这种疾病的人的生活质量产生影响，通过患者报告的结果(PRO)来衡量。PRO可以在治疗前(例如，基线)使用慢性肝病问卷(CLDQ-NASH)等工具进行评估，特别是与身体健康相关评分关联的那些。
TGFβ1抑制剂(例如本文所述的LTBP1/3复合物选择性抑制剂)单独(例如，单一疗法)或与另一种疗法组合的治疗，与基线相比或与人群标准相比可有效改善PRO。在一些实施方式中，糖尿病可能与PRO的损害有关，包含身体机能、身体疼痛、一般健康和活力。使用TGFβ1抑制剂(例如本文所述的LTBP1/3复合物选择性抑制剂)单独(例如，单一疗法)或与另一种疗法组合进行治疗，可以有效改善患有糖尿病(例如，2型糖尿病)和/或肥胖症的受试者的身体健康相关评分(例如PRO)。
文献中已发表的研究表明，调节性T细胞(Tregs)可以在肝病进展为更严重的晚期纤维化中发挥作用。例如，Zhang等报道，肝硬化的持续存在是由抑制纤维化消退过程的肝内调节性T细胞维持的(Transl Res.2016；169：67-79.e1-2)。Kobayashi等提出Treg参与肝纤维化进展为肝细胞癌(HCC)，这一过程被称为肝癌发生(Clin Cancer Res.2007；13(3)：902-911)。
因此，设想在仔细选择针对疾病类型和疾病进展阶段订制的适宜的TGFβ抑制剂应认为对特定患者或患者群体的治疗益处最大化。
在一些实施方式中，选择靶向基质相关的TGFβ1(例如，LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1)的TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂，例如本文公开的那些，用于治疗早期肝病，如非酒精性脂肪肝(“NAFL”)和与NASH相关的非肝硬化性肝纤维化。非肝硬化性肝纤维化包含1-3期的肝纤维化。以有效治疗疾病，例如减缓、停止或逆转NAFL和非肝硬化NASH的进展的量向受试者施用TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂。优选地，有效量足以防止进展为肝硬化和肝硬化并发症，减少对肝移植的需要，和/或提高存活率。在一些实施方式中，功效可以通过例如炎症变化的减少、纤维化的改善或两者来显示。在一些实施方式中，受试者患有代谢病症，例如肥胖症、2型糖尿病。患有非肝硬化NASH的受试者可以包含具有NASH活动性评分(NAS)大于或等于4且在炎症和气球样变中各至少1分以及NASH临床研究网络(CRN)纤维化评分大于1期纤维化但小于4期纤维化的那些。在一些实施方式中，治疗在整体组织病理学读数上实现了脂肪性肝炎的消退并且在NASH CRN纤维化评分上肝纤维化没有恶化。脂肪性肝炎的消退定义为不存在脂肪性肝病或无脂肪性肝炎的孤立性或单纯性脂肪变性，以及炎症的NAS评分为0-1，气球样变的评分为0，脂肪变性的任何值；或者，肝纤维化改善大于或等于一个分期(NASH CRN纤维化评分)并且脂肪性肝炎没有恶化(定义为NAS没有因气球样变、炎症或脂肪变性而增加)；或者，脂肪性肝炎的消退和纤维化的改善两者，如上文所定义。
在一些实施方式中，选择靶向基质相关的TGFβ1(例如，LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1)的TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂，例如本文公开的那些，用于治疗NASH伴代偿性肝硬化。NASH相关代偿性肝硬化的特征是明显的疤痕形成，这在组织病理学上是明显的，其中肝细胞簇集在被致密细胞外基质包围的结节中。以有效阻止或减缓纤维化进展、防止临床失代偿、减少对肝移植的需要和/或提高存活率的量向受试者施用TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂。
伴有失代偿性肝硬化的NASH的特征是可能具有以下标准的一项或多项：门脉高压(门脉高压的证据可包含低血小板计数、食管静脉曲张、腹水、肝性脑病史、脾肿大)；胆红素升高；或国际标准化比率升高或凝血酶原时间延长。因此，患有伴代偿期肝硬化的NASH的患者可能是不符合上述失代偿肝硬化标准中的一项或多项的患者。
在一些实施方式中，选择靶向基质相关的TGFβ1(例如，LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1)的TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂，例如本文公开的那些，用于治疗NASH伴有失代偿性肝硬化或与肝纤维化相关的HCC。在一些实施方式中，在疾病进展为以肝硬化或HCC表现为特征的晚期或终末期肝病后，TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂被替换为有效治疗肝硬化或HCC的量的TGFβ1选择性、非情境依赖性抑制剂，其能够靶向基质相关和免疫细胞相关的TGFβ1，例如LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1(参见，例如，WO 2020/014473)。在一些实施方式中，TGFβ1选择性、情境选择性抑制剂和/或TGFβ1选择性、非情境依赖性抑制剂可作为单一疗法使用或与一种或多种另外的疗法联合使用。
在一些实施方式中，有效量的抑制剂可使多种炎症或纤维化血清生物标志物的水平与对照相比正常化，如在治疗开始后(例如，12-36周)评估的。在一些实施方式中，可以将炎症或纤维化生物标志物用于评估NAFLD的严重程度(通过测量肝脂肪变性的水平)、选择要治疗的患者和/或监测疾病进展或治疗反应。例如，血液生物标志物和标志物组(panel)可以包括但不限于：
i)脂肪肝指数(BMI、腰围、血清甘油三酯和γ-谷氨酰转移酶(GGT))；
ii)肝硬化指数(血清天冬氨酸转氨酶(AST)：丙氨酸转氨酶(ALT)比率、BMI、性别和糖尿病的存在)；
i)NAFLD肝脂肪评分(血清ALT、HDL胆固醇、甘油三酯、血红蛋白A1c和白细胞计数)；
ii)SteatoTest(BioPredictive)(血清总胆红素水平、GGT、α2-巨球蛋白、触珠蛋白、ALT、载脂蛋白AI、总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖(根据年龄和性别调整)和BMI)；和
iii)NAFLD脊评分(血清ALT水平、HDL胆固醇、甘油三酯、血红蛋白A1c、白细胞计数以及共病数据(和高血压的存在))。
在一些实施方式中，对生物标志物成像可用于评估肝脂肪变性的水平。例如，生物标志物成像可以包括但不限于：超声检查、受控衰减参数(CAP)、MRI-估计的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)和磁共振谱分析(MRS)。
肝脏活检是目前诊断NASH的标准，然而，病理学家之间的差异限制了这种诊断方法的效用。因此，脂肪肝进展抑制(FLIP)算法(包括组织学脂肪变性、活性和纤维化评分)的使用可用于通过活检提高对NASH诊断的一致性。而且，很多非侵入性生物标志物也可以用于诊断和监测疾病。因此，在一些实施方式中，可以将炎症或纤维化生物标志物用于评估NASH的严重程度、选择用于治疗的患者和/或监测疾病进展或治疗反应。血液生物标志物可以包括：
i)凋亡标志物，如CK18片段、总细胞角蛋白和sFAS；
ii)炎症标志物，如CRP、TNF、IL-8和CXCL10；
iii)脂质氧化产物，如11-HETE、9-HODE、13-HODE、12-oxo-ODE、LA-13-HODE(oxNASHscore)和11,12-diHETrE；
iv)溶酶体酶，如组织蛋白酶D；和
v)组合标志物组(panel)，如NASHTest(BioPredictive)和NASH诊断组(包括，糖尿病的存在、性别、BMI和血清甘油三酯水平、CK18片段和总CK18)。
在一些实施方式中，可以将生物标志物和相关生物标志物组用于诊断纤维化和/或硬化的程度、选择用于治疗的患者和/或监测疾病进展或治疗反应。例如，肝纤维化和肝硬化的无创检测包括但不限于：AST:ALT比率、AST:血小板比率指数、纤维化-4指数(年龄、AST、ALT和血小板计数)、NAFLD纤维化评分(年龄、BMI、空腹血糖受损和/或糖尿病、ASTALT、血小板计数和白蛋白)、BARD评分(AST、ALT、BMI和糖尿病)。
特异性的纤维化标志物和标志物组也可能是有用的，并且包括但不限于：透明质酸；PIIPNP；Pro-C3；TIMP1；层粘连蛋白；增强的肝纤维化(ELF)组(PIINP、透明质酸、TIMP1)；FibroTest(GGT、总胆红素、α2m、载脂蛋白AI和触珠蛋白)；和FibroMeter NAFLD(体重、凝血酶原指数、ALT、AST、铁蛋白和空腹血糖)。用于肝纤维化的成像生物标志物可以包括但不限于：FibroScan(TE)、点剪切波弹性成像(pSWE)(又称为超声辐射力脉冲(ARFI))、2D-3DSWE、磁共振弹性成像(MRE)和多参数MRI。
具有炎症或自身炎性成分的任何RGFb相关疾病都可以受益于本公开的新型抑制剂，该抑制剂不影响调节性T细胞功能。特别是在肝脏疾病中，例如代谢性肝病症，选择性靶向基质相关TGFb1信号传导的TGFb抑制剂的选择可能是有利的。
在一个实施方式中，如本文所述使用的方法和组合物可用于治疗患有原发性胆汁性胆管炎(PBC)的受试者。在一个实施方式中，患有PBC的受试者对UDCA(熊去氧胆酸)治疗没有反应。在一个实施方式中，受试者具有对UCDA反应不足的Barcelona、Paris-I、Toronto、Rotterdam或Paris-II。在一个实施方式中，尽管以标准推荐剂量(10-15mg/kgb.w./天)用UDCA治疗至少1年，患有PBC的受试者具有ALP≥2x ULN(正常上限)和胆红素>1xULN。
在另一个实施方式中，如本文所述使用的方法和组合物可用于治疗患有原发性硬化性胆管炎(PSC)的受试者。在一个实施方式中，患有PSC的受试者具有升高的ALP、异常的胆管造影、内窥镜逆行胰胆管造影或经皮经肝胆管造影。在一个实施方式中，患有PSC的受试者具有至少14的终末期肝病模型(MELD)评分。
在另一个实施方式中，如本文所述使用的方法和组合物可用于治疗患有NASH的受试者。在一个实施方式中，受试者患有2期纤维化NASH、3期纤维化NASH或4期纤维化NASH。在一个实施方式中，受试者具有至少4或至少5的NAS(NAFLD活动评分)。在一个实施方式中，患有NASH的受试者具有NAS>4和纤维化分期2或分期3。在一个实施方式中，患有NASH的受试者具有NAS>5和纤维化分期2或分期3。在一个实施方式中，患有NASH的受试者具有至少14的终末期肝病模型(MELD)评分。
同工型特异性TGFβ1抑制剂，如本文提供的那些，可用于治疗肾脏的纤维化状况，例如以细胞外基质积聚为特征的疾病(IgA肾病、局灶和节段性肾小球硬化、新月体性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和糖尿病肾病)，其中已观察到肾小球和肾小管间质中TGFβ的表达显著增加。虽然由TGFβ诱导的两种基质组分，纤连蛋白EDA+和PAI-1，的肾小球和肾小管间质沉积在具有基质累积的所有疾病中显著升高，相关性分析已揭示主要与TGFβ1同工型的密切相关性。因此，同工型特异性TGFβ1抑制剂可用作其中TGFβ与细胞外基质的病理积累相关的一系列人肾小球病症的治疗剂。
在一些实施方式中，肾的纤维化状况与慢性肾病(CKD)相关。CKD主要由高血压或糖尿病引起，每年夺去超过一百万人的生命。CKD患者需要终身医疗护理，从严格的饮食和药物治疗到透析和移植。在一些实施方式中，本文所述的TGFβ1抑制剂疗法可减少或延迟透析和/或移植的需要。在一些实施方式中，这样的疗法可减少其他治疗的需要(例如，剂量、频率)。在一些实施方式中，同工型特异性TGFβ1抑制剂可以在接受一种或多种其他疗法的患者中施用，包括但不限于肌肉生长抑制素抑制剂，其通常可以增强CKD患者的代谢调节。
可以使用本公开的TGFβ1抑制剂治疗的纤维化病症包括涉及纤维化和/或慢性炎症的病症。此类病症可以是神经肌肉病症，包括但不限于杜氏肌营养不良(DMD)，以及其他遗传病症，如多发性硬化症(MS)和囊性纤维化(CF)。通过抑制ECM相关和免疫细胞相关的TGFβ1分支两者，认为如本文所述的那些的TGFβ1抑制剂抑制纤维化进展并恢复M1/M2巨噬细胞极化。
可用本文提供的方法治疗的器官纤维化包括心脏(例如，心血管)纤维化。在一些实施方式中，心脏纤维化与心力衰竭相关，例如慢性心力衰竭(CHF)。在一些实施方式中，心力衰竭可能与心肌疾病和/或代谢疾病有关。在一些实施方式中，同工型特异性TGFβ1抑制剂可以在接受一种或多种其他疗法的患者中施用，包括但不限于涉及心脏纤维化和代谢紊乱的心脏功能障碍患者中的肌肉生长抑制素抑制剂。
在一些实施方式中，可用本文所述的组合物和/或方法治疗的纤维化病症包括结缔组织增生。结缔组织增生可能发生在赘生物周围，导致肿瘤(例如，促纤维增生基质瘤)周围的致密纤维化，或腹部手术后腹部内的瘢痕组织。在一些实施方式中，结缔组织增生与恶性肿瘤相关。由于围绕恶性肿瘤的致密形成，常规的抗癌疗法(例如，化学疗法)可能无法有效地穿透以到达癌细胞而实现临床效果。如本文所述的那些的TGFβ1的同工型特异性抑制剂可用于破坏结缔组织增生，从而可以松散纤维化形成以有助于抗癌疗法的效果。在一些实施方式中，TGFβ1的同工型特异性抑制剂可以用作单一疗法(更多描述见下文)。
在一些实施方式中，患者患有纤维化实体瘤(例如，结缔组织增生)，并且被排除或已经被排除在外科手术候选池之外，使得该纤维化实体瘤被认为是不可切除或不可手术的(例如，手术干预的风险大于其潜在的益处)。此类患者可以是接受本公开的TGFβ1抑制疗法的候选人。向这些患者施用本发明的TGFβ1抑制疗法可以使肿瘤变得可切除或可手术，使得患者可以成为手术切除的候选人。
为了治疗具有纤维化状况的患者，TGFβ1同工型特异性抑制剂以有效治疗纤维化的量施用至受试者。这样的抗体的有效量是在受试者中实现治疗功效和临床安全性两者的有效量。在一些实施方式中，抑制剂是可以阻断定位(例如，系着)于ECM中的LTBP介导的TGFβ1的激活的抗体。在一些实施方式中，LTBP是LTBP1和/或LTBP3。在一些实施方式中，TGFβ1的LTBP特异性抑制剂可以与LRRC33-proTGFβ的抑制剂组合。
在确定本公开所述抗体和/或组合物改变纤维化的功效中有用的测定包括但不限于：用于计数成纤维细胞的组织学分析和在本领域中熟知的基本免疫组织化学分析。
在一些实施方式中，可以将循环LAP片段用作纤维化发生的血清标志物。参见，例如，美国专利号8,198,412，其内容通过引用并入本文。
已经开发了许多动物模型来研究纤维化。例如，小鼠的某些高脂肪饮食已被证明可以模拟人NAFLD的组织病理学和发病机制。而且，一些遗传模型还显示了人类代谢综合征和NAFLD的特征，如db/db和ob/ob小鼠模型。还有一些用于研究NASH的动物模型，其主要由各种饮食诱导的模型构成，包括但不限于甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(MCD)、高胆固醇饮食(HCD)、胆碱缺乏的高脂饮食(CDHFD)、胆碱缺乏的L-氨基酸缺乏的饮食、胆碱缺乏的L-氨基酸缺乏的饮食+四氯化碳、高脂饮食+链脲佐菌素、高脂+高胆固醇饮食(HFHC)、高果糖饮食(HFD)和高果糖高脂饮食(HFHF)。用于研究NASH的遗传小鼠模型包括但不限于foz/foz小鼠、肝细胞特异性PTEN-缺陷型小鼠、Db/db小鼠+二乙基亚硝胺(DEN)和db/db小鼠+MCD。在Jennie Ka Ching Lau等，J Pathol 2017；241:36–44中概述了所有这些模型(包括每个模型的优缺点)的细节；其内容均通过引用并入本文。
其他可用于测试TGFβ抑制剂在纤维化中的功效的模型包含四氯化碳(CCL4)诱导的肝纤维化模型和腺嘌呤诱导的肾纤维化模型。可用于检测同工型选择性TGFβ抑制剂在肝纤维化中的功效的另一个模型包括胆管结扎(BDL)模型(参见，例如，Tag等，J VisExp.2015；(96):52438)。有用的肾纤维化遗传模型包含Alport模型(在本文别处讨论)。
在任何这样的临床前模型中，可以通过任何适宜的方法评估纤维化中的功效(例如，体内促纤维化或抗纤维化作用)，例如：组织切片中天狼星红(PSR)阳性区域的百分比；组织中羟脯氨酸的含量(定量)；和组织切片上col1A染色的免疫组织化学检测和定量。在一些实施方式中，可以进行组织病理学评估，其中可以采用纤维化评分系统。可通过适宜的药效学(PD)测量(例如，测量下游信号转导事件)来检查受测试品(例如，TGFβ抑制剂)的药理作用。例如，在TGFβ途径的情况下，适宜的PD测量包含SMAD2/3的相对磷酸化。
与纤维化相关的肌肉病症
越来越多的证据表明，TGFβ在肌肉稳态、修复和再生中起着重要作用。选择性调节LTBP相关的TGFβ信号传导的药剂，例如本文所述的单克隆抗体，可有效治疗受损的肌纤维，例如慢性/遗传性肌营养不良、眼/眼外肌的先天性纤维化和急性肌肉损伤中，而没有与更广泛作用的TGFβ抑制剂相关的毒性。
因此，本发明提供了使用在体内优先调节TGFβ作用的子集但不是全部的药剂来治疗受损肌纤维的方法。此类药剂可以在特定情境中(即当由LTBP1或LTBP3呈递时)选择性调节TGFβ1信号传导(“同工型特异性调节”)。
在骨骼肌中，TGFβ起着多种作用，包括抑制增殖和分化、萎缩的诱导和纤维化的发展。TGFβ减少卫星细胞增殖并阻止分化(通过抑制MyoD和肌细胞生成素)(Allen,R.E.和L.K.J Cell Physiol,1987.133(3):p.567-72；Brennan,T.J.等，Proc Natl Acad Sci U SA,1991.88(9):p.3822-6；Massague,J.等，Proc Natl Acad Sci U S A,1986.83(21):p.8206-10；Olson,E.N.等，J Cell Biol,1986.103(5):p.1799-805)。在这些早期论文中没有指定TGFβ的同工型(即TGFβ1、2或3)，但推测其为TGFβ1。TGFβ也有助于肌肉纤维化；直接注射重组TGFβ1导致骨骼肌纤维化，并且泛TFGβ抑制减少急性和慢性损伤肌肉中的纤维化(Li,Y.等，Am J Pathol,2004.164(3):p.1007-19；Mendias,C.L.等，Muscle Nerve,2012.45(1):p.55-9；Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21)。TGFβ1由骨骼肌内的肌纤维、巨噬细胞、调节性T细胞、成纤维细胞和纤维细胞表达(Li,Y.等，Am JPathol,2004.164(3):p.1007-19；Lemos,D.R.等，Nat Med,2015.21(7):p.786-94；Villalta,S.A.等，Sci Transl Med,2014.6(258):p.258ra142；Wang,X.等，J Immunol,2016.197(12):p.4750-4761)；并且在损伤时和疾病中表达增加(Li,Y.等，Am J Pathol,2004.164(3):p.1007-19；Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21；Bernasconi,P.等，J Clin Invest,1995.96(2):p.1137-44；Ishitobi,M.等，Neuroreport,2000.11(18):p.4033-5)。TGFβ2和TGFβ3也在mdx肌肉(杜氏肌营养不良症小鼠模型)中上调(在mRNA水平上)，尽管程度小于TGFβ1(Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21；Zhou,L.等，Neuromuscul Disord,2006.16(1):p.32-8)。Pessina等人最近使用谱系追踪实验来证明营养不良肌肉中多种来源的细胞通过TGFβ依赖性途径采取成纤维命运(Pessina,P.等，Stem Cell Reports,2015.4(6):p.1046-60)。
TGFβ1涉及人类肌营养不良症。杜氏肌营养不良症(DMD)是由缺乏肌营养不良蛋白引起的严重的、进行性和最终致命的疾病(Bushby,K.等，Lancet Neurol,2010.9(1):p.77-93)。肌营养不良蛋白的缺乏导致对收缩诱导的损伤的易感性增加，从而导致持续的肌肉退化(Petrof,B.J.等，Proc Natl Acad Sci U S A,1993.90(8):p.3710-4；Dellorusso,C.等，J Muscle Res Cell Motil,2001.22(5):p.467-75；Pratt,S.J.等，Cell Mol LifeSci,2015.72(1):p.153-64)。重复轮的修复造成慢性炎症、纤维化、卫星细胞池的耗尽，最终丧失活动性和死亡(Bushby,K.等，Lancet Neurol,2010.9(1):p.77-93；McDonald,C.M.,et al.,Muscle Nerve,2013.48(3):p.343-56)。在DMD患者中TGFβ1的表达显著增加，并且与在这些患者中观察到的纤维化程度相关(Bernasconi,P.等，J Clin Invest,1995.96(2):p.1137-44；Chen,Y.W.等，Neurology,2005.65(6):p.826-34)。过量的ECM沉积对肌肉的收缩性质具有不利影响，并且由于肌纤维从其血液供应中分离，可限制营养的获取(Klingler,W.等，Acta Myol,2012.31(3):p.184-95)。最近，更多的数据进一步涉及TGFβ1在肌营养不良症中的作用。已发现LTBP4中的变体改变小鼠和人的疾病严重程度。在小鼠中，LTBP4的变体在缺乏肌营养不良蛋白或γ-肌聚糖的小鼠中具有保护作用(Coley,W.D.等，Hum Mol Genet,2016.25(1):p.130-45；Heydemann,A.等，J Clin Invest,2009.119(12):p.3703-12)。在人中，两个小组独立地确定了LTBP4的变体在DMD中是保护性的，从而将离床活动的丧失延迟了几年(Flanigan,K.M.等，Ann Neurol,2013.73(4):p.481-8；vanden Bergen,J.C.等，J Neurol Neurosurg Psychiatry,2015.86(10):p.1060-5)。
虽然小鼠和人的遗传变体的性质不同，但在两个物种中，保护性变体导致TGFβ信号传导减少(Heydemann,A.等，J Clin Invest,2009.119(12):p.3703-12)；Ceco,E.等，SciTransl Med,2014.6(259):p.259ra144)。已经从将纯化的活性生长因子注射到动物中或添加到在培养的细胞的实验中推断出TGFβ1在骨骼肌生物学中的许多功能(Massague,J.等，Proc Natl Acad Sci U S A,1986.83(21):p.8206-10；Li,Y.等，Am J Pathol,2004.164(3):p.1007-19；Mendias,C.L.等，Muscle Nerve,2012.45(1):p.55-9)。鉴于细胞情境对TGFβ1特定功能的重要性(参见，例如，Hinck等，Cold Spring Harb.Perspect.Biol,2016.8(12))，在这些实验中观察到的一些效应可能不反映细胞因子在体内的内源性作用。例如，用重组TGFβ1、肌肉生长抑制素或GDF11处理人皮肤成纤维细胞导致这些细胞中基因表达的几乎相同的变化，尽管在体内这些蛋白质的作用是完全不同的(Tanner,J.W.,Khalil,A.,Hill,J.,Franti,M.,MacDonnell,S.M.,Growth Differentiation Factor 11PotentiatesMyofibroblast Activation,in Fibrosis:From Basic Mechanisms to Targetedtherapies.2016:Keystone,CO)。
多名研究人员已使用TGFβ抑制剂来阐明生长因子在体内的作用。用泛TFGβ中和抗体1D11处理mdx小鼠明显导致纤维化减少(通过组织学和羟脯氨酸含量)、减少肌肉损伤(血清肌酸激酶减少和肌纤维密度增加)，并改善肌肉功能(通过体积描记法，分离EDL肌肉的力生成和前肢握力的增加)(Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21；Andreetta,F.等，J Neuroimmunol,2006.175(1-2):p.77-86；Gumucio,J.P.等，J ApplPhysiol(1985),2013.115(4):p.539-45)。此外，显性阴性TGFβII型受体的肌纤维特异性表达在心脏毒素损伤后和在δ-肌聚糖-/-小鼠中防止肌肉损伤(Accornero,F.等，Hum MolGenet,2014.23(25):p.6903-15)。在骨骼肌中丰富并抑制TGFβ活性的蛋白多糖核心蛋白聚糖在mdx小鼠中减少肌肉纤维化和随后的撕裂损伤(Li,Y.等，Mol Ther,2007.15(9):p.1616-22；Gosselin,L.E.等，Muscle Nerve,2004.30(5):p.645-53)。其他具有TGFβ抑制活性的分子，如苏拉明(一种抗肿瘤药)和氯沙坦(一种血管紧张素受体阻滞剂)在损伤、马凡氏综合征和肌营养不良症的小鼠模型中有效改善肌肉病理学并且减少纤维化(Spurney,C.F.等，J Cardiovasc Pharmacol Ther,2011.16(1):p.87-95；Taniguti,A.P.等，MuscleNerve,2011.43(1):p.82-7；Bedair,H.S.等，Am J Sports Med,2008.36(8):p.1548-54；Cohn,R.D.等，Nat Med,2007.13(2):p.204-10)。虽然上述所有治疗剂都抑制TGFβ1或其信号传导，但它们都不是对TGFβ1同工型特异的。例如，1D11结合并抑制TGFβ1、2和3同工型(Dasch,J.R.等，J Immunol,1989.142(5):p.1536-41)。除TGFβ1外，苏拉明还抑制多种生长因子结合其受体的能力，包括PDGF、FGF和EGF(Hosang,M.,J Cell Biochem,1985.29(3):p.265-73；Olivier,S.等，Eur J Cancer,1990.26(8):p.867-71；Scher,H.I.和W.D.Heston,Cancer Treat Res,1992.59:p.131-51)。核心蛋白聚糖还通过直接结合和通过卵泡抑素(一种肌生长抑制素抑制剂)的上调两者来抑制肌生长抑制素活性(Miura,T.等，Biochem Biophys Res Commun,2006.340(2):p.675-80；Brandan,E.,C.Cabello-Verrugio和C.Vial,Matrix Biol,2008.27(8):p.700-8；Zhu,J.等，J Biol Chem,2007.282(35):p.25852-63)。氯沙坦通过其对肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用影响其他的信号传导通路，包括IGF-1/AKT/mTOR途径(Burks,T.N.等，Sci Transl Med,2011.3(82):p.82ra37；Sabharwal,R.和M.W.Chapleau,Exp Physiol,2014.99(4):p.627-31；McIntyre,M.等，Pharmacol Ther,1997.74(2):p.181-94)。因此，所有这些疗法都抑制可能造成其治疗效果以及毒性的其他分子。
除了慢性炎症外，DMD的标志是过度的和进行性的纤维化。在晚期疾病中，纤维化是如此严重以至于它实际上可以将个体肌纤维与其血液供应隔离。它还改变肌肉的收缩特性。在人类患者中，TGFβ1上调的程度与纤维化之间存在很强的相关性，并且纤维化程度与不良运动结果之间存在密切关联。因此，在一些实施方式中，LTBP-proTGFβ1抑制剂可以施用于营养不良患者以预防和/或减少纤维化，以选择性地靶向疾病中ECM相关的TGFβ1效应。在一些实施方式中，本文所述的各种同工型和/或情境选择性药剂可用于实现TGFβ1信号传导的抑制以阻止纤维化和促进肌生成，但不会对免疫系统产生不希望的影响(例如，通过GARP或LRRC33)。
施用
为了实施本文所公开的方法，有效量的前文所述的药物组合物可以通过合适的途径施用给需要治疗的受试者(例如，人)，例如静脉内施用，例如，在一段时间内作为推注(bolus)或连续输注，通过肌肉、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。当用于治疗纤维化和/或代谢病症时，优选皮下施用TGFβ抑制剂。用于液体制剂的市售喷雾器，包括喷射雾化器和超声雾化器，可用于施用。液体制剂可以直接雾化，并且冻干粉末可以在重构后雾化。或者，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)可以使用碳氟化合物制剂和计量剂量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。
通过本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有TGFβ相关适应症、处于TGFβ相关适应症的风险或怀疑具有TGFβ相关适应症的人类患者，例如前文提到的那些。患有TGFβ相关适应症的受试者可通过常规医学检查鉴定，例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声检查。怀疑患有任何这样的适应症的受试者可能显示该适应症的一种或多种症状。具有患适应症的风险的受试者可以是具有该适应症的一种或多种风险因素的受试者。
如本文所用，术语“有效量”和“有效剂量”是指足以实现其预期目的(即在组织或受试者中以可接受的益处/风险比率的期望的生物或医学反应)的化合物或组合物的任何量或剂量。例如，在本发明的某些实施方式中，预期目的可以是抑制体内TGFβ-1激活，实现与TGFβ-1抑制相关的临床上有意义的结果。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、同时治疗的性质(如果有的话)、特定的施用途径以及健康从业者的知识和专业知识中的相似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可坚持较低剂量或可耐受剂量。
经验考虑，例如半衰期，通常将有助于确定剂量。例如，与人类免疫系统相容的抗体，例如人源化抗体或完全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于TGFβ相关适应症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体的持续连续释放制剂可能是适宜的。用于实现持续释放的各种制剂和装置对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在本公开的范围内。
在一个实例中，选择性结合如本文所述的LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体)的剂量可以在已经给予一次或多次抑制剂施用的个体中凭经验确定。向个体给予增量剂量的抑制剂。为了评估功效，可以遵循TGFβ相关适应症的指标。例如，用于测量肌纤维损伤、肌纤维修复、肌肉中的炎症水平和/或肌肉中的纤维化水平的方法是本领域普通技术人员所公知的。
本发明包括这样的认识：能够以同工型特异性方式和情境特异性方式调节TGFβ的激活步骤的药剂当用作药物时，可以提供改进的安全性特征。因此，本发明包括选择性结合和抑制TGFβ1激活但不抑制TGFβ2或TGFβ3激活的抑制剂，例如抗体及其抗原结合片段，从而赋予体内TGFβ1信号传导的特异性抑制，同时最小化影响TGFβ2和/或TGFβ3信号传导的不需要的副作用。同样，本发明包含选择性抑制由LTBP1和/或LTBP3呈递的TGFβ1而不是由GARP或LRRC33呈递的TGFβ1的激活的抑制剂，例如抗体及其抗原结合片段，从而赋予对体内LTBP1/3相关TGFβ1信号传导的特异性抑制，同时最大限度地减少由调节GARP相关的TGFβ1和/或LRRC33相关的TGFβ1引起的不需要的副作用。
在一些实施方式中，如本文所述的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)当被施用于受试者时是无毒的。在一些实施方式中，与结合TGFβ1和TGFβ2两者的抗体相比，本文所述的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)当被施用于受试者时表现出降低的毒性。在一些实施方式中，与结合TGFβ1和TGFβ3两者的抑制剂相比，如本文所述的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)当被施用于受试者时表现出降低的毒性。在一些实施方式中，与结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抑制剂相比，如本文所述的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)当被施用于受试者时表现出降低的毒性。
通常，对于任何本文所述的抑制剂(例如，抗体)的施用，初始候选剂量可以是每剂约0.5-30mg/kg，例如每剂约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg。通常，将包含本公开所涵盖的抗体或其片段的组合物以适宜的时间间隔，例如每周一次或两次、每1-8周等，以该剂量施用于人类患者。在一些实施方式中，给药频率可以调整为，例如每周两次、每周、每两周、每三周、每四周、每六周、每八周一次，等。为了本公开的目的，典型的日剂量可以为从约1mg/kg到20mg/kg或更多中任何一种的范围，取决于前文提到的因素。对于数天或更长时间的重复给药，取决于病症，持续治疗直至出现所期望的症状抑制或直至达到足够的治疗水平以减轻TGFβ相关适应症或其症状。
在一个实施方式中，将抗体或其抗原结合片段施用于受试者，其剂量为0.1至30mg/kg之间、0.5至30mg/kg之间、1至30mg/kg之间、5至30mg/kg之间、10至30mg/kg之间、15至30mg/kg之间、20至30mg/kg之间、25至30mg/kg之间、0.1至25mg/kg之间、0.5至25mg/kg之间、1至25mg/kg之间、5至25mg/kg之间、10至25mg/kg之间、15至25mg/kg之间、20至25mg/kg之间、0.1至20mg/kg之间、0.5至20mg/kg之间、1至20mg/kg之间、5.0至20mg/kg之间、10至20mg/kg之间、15至20mg/kg之间、0.1至15mg/kg之间、0.5至15mg/kg之间、1至15mg/kg之间、5至15mg/kg之间、10至15mg/kg之间、5.0至20mg/kg之间、10至20mg/kg之间、15至20mg/kg之间、0.1至10mg/kg之间、0.5至10mg/kg之间、1至10mg/kg之间、5至10mg/kg之间，任选地，其中向受试者施用抗体或其抗原结合部分，每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每隔一月一次。
示例性给药方案包括施用初始剂量约2mg/kg，随后施用一个或多个维持剂量。例如，初始剂量可以是约2和30mg/kg之间，例如，一周一次或一周两次。此后，可以给予一个或多个维持剂量，例如，约0.1和20mg/kg之间，例如，一周一次、隔周一次、一个月一次等。然而，取决于从业者希望实现的药代动力学衰变的模式，其他剂量方案可能是有用的。药代动力学实验已显示本文公开的抑制剂(例如，抗体，例如，SR-AB2)的血清浓度在施用于临床前动物模型(例如，小鼠模型)后保持稳定至少7天。不希望受任何特定理论的束缚，施用后的这种稳定性可能是有利的，因为可以较不频繁地施用抗体，同时在施用抗体的受试者(例如，人受试者)中维持临床有效的血清浓度。在一些实施方式中，给药频率是每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次、或每3个月或更长时间。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。给药方案(包括使用的抗体)可随时间变化。
根据一些实施方式，根据本公开，治疗上有效治疗TGFβ1相关适应症的LTBP情境选择性TGFβ1抑制剂的血清浓度可以是至少约10μg/mL，例如，约10μg/mL至1.0mg/mL之间。在一些实施方式中，如通过血清浓度测量的抗体的有效量是约20-400μg/mL。在一些实施方式中，如通过血清浓度测量的抗体的有效量是约100-800μg/mL。在一些实施方式中，如通过血清浓度测量的，抑制剂的有效量是至少约20μg/mL，例如，至少约50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL或200μg/mL。在优选的实施方式中，在非人灵长类动物中，在保持血清浓度水平约2,000-3,000μg/mL至少4周，例如至少4周，优选至少8周，更优选至少12周后，没有观察到与这种抑制剂相关的毒性(例如：无心脏毒性、增生和炎症、牙齿和牙龈发现)。因此，可以达到约10-100倍的治疗窗。
在一些实施方式中，对于正常体重的成年患者，可以施用约0.3至5.00mL/kg范围的剂量。具体的剂量方案，例如剂量、时间和重复，将取决于具体的个体和该个体的病史以及个体药剂的性质(例如药剂的半衰期以及其他相关的考虑因素)。
出于本公开的目的，选择性结合LTBP1-TGFβ复合物和/或LTBP3-TGFβ复合物的抑制剂例如抗体或其抗原结合片段的适当剂量将取决于使用的特异性抗体(或其组合物)、适应症的类型和严重程度、抗体是用于预防或治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抑制剂的响应以及主治医师的判断。在一些实施方式中，临床医生将施用选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂，例如抗体，直到剂量达到实现所期望的结果。选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体)的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、给药的目的是治疗性的还是预防性的、以及技术人员已知的其他因素。选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体)的施用可以在预选的一段时间内基本上连续，或者可以是一系列的间隔剂量，例如，在发生TGFβ相关适应症之前、期间或之后。
基于抑制TGFβ3可增加纤维化中胶原蛋白沉积或积累的观察结果，可以考虑对用具有TGFβ3抑制活性的TGFβ抑制剂(例如TGFβ1/2/3、TGFβ1/3和TGFβ3的抑制剂)治疗的患者进行包含TGFβ1选择性抑制剂(例如，本文公开的新型抗体)的附加疗法。具有TGFβ3抑制活性的TGFβ抑制剂的实例包括但不限于：TGFβ受体的低分子量拮抗剂，例如ALK5拮抗剂，例如Galunisertib(LY2157299一水合物)；抑制所有三种同工型的单克隆抗体(例如中和抗体)(“泛抑制剂”抗体)(参见，例如，WO 2018/134681)；优先抑制三种同工型中的两种(例如，TGFβ1/3)的单克隆抗体(例如WO 2006/116002)；以及工程化分子(例如，融合蛋白)，例如配体陷阱(例如，WO2018/029367；WO 2018/129331和WO 2018/158727)。在一些实施方式中，配体陷阱包含根据WO/2018/15872公开的结构。在一些实施方式中，配体陷阱包含根据WO2018/029367；WO 2018/129331公开的结构。在一些实施方式中，配体陷阱是称为M7824的构建体。在一些实施方式中，配体陷阱是称为AVID200的构建体。在一些实施方式中，中和泛TGFβ抗体是GC1008或其衍生物。在一些实施方式中，这种抗体包含根据WO/2018/134681的公开内容的序列。
在一些实施方式中，抗体是特异性结合TGFβ1和TGFβ3的中和抗体。在一些实施方式中，这种抗体比TGFβ3优先结合TGFβ1。例如，抗体包含根据WO/2006/116002的公开的序列。在一些实施方式中，抗体是21D1。
附加疗法旨在对抗或克服已接受或正在接受具有TGFβ3抑制活性的TGFβ抑制剂的患者中TGFβ3抑制的促纤维化作用。在一些实施方式中，患者患有纤维化病症或处于发展成纤维化病症的风险中。例如，患者可能患有与发生肝纤维化的较高风险相关的代谢病症。与此类风险关联的代谢状况包含肥胖、2型糖尿病和NASH。因此，本发明包含TGFβ1选择性抑制剂，其用于用TGFβ3抑制剂治疗的受试者的附加疗法，其量足以降低TGFβ3抑制剂的促纤维化作用。在一些实施方式中，受试者患有纤维化。在一些实施方式中，受试者患有骨髓纤维化。在一些实施方式中，受试者患有晚期癌症，例如，转移性或局部晚期肿瘤。在一些实施方式中，TGFβ1选择性抑制剂选自Ab31、Ab34、Ab37、Ab38、Ab39、Ab40、Ab41、Ab42、Ab43、Ab44、Ab45、Ab62、Ab63和Ab64(任选地Ab42或Ab63)、其变体/衍生物或其抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的工程化分子。在一些实施方式中，TGFβ1选择性抑制剂是Ab42、其变体/衍生物或抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的工程化分子。在优选的实施方式中，TGFβ1选择性抑制剂是Ab42或其抗原结合片段。
不受理论束缚，在一些实施方式中，保留具有抗-TGFβ3活性的TGFβ抑制剂可能对于治疗被诊断患有已知高度转移、骨髓纤维化癌症的类型和/或患有纤维化疾病或者具有发生纤维化疾病的风险的患者特别有用。因此，本文的公开内容包含用于治疗癌症的TGFβ抑制剂，其中该抑制剂不抑制TGFβ3，并且其中患者患有转移性癌症或骨髓纤维化，或者患者患有或处于发展纤维化病症的风险中，其中任选地纤维化病症是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
如本文所用，术语“治疗”是指出于治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响适应症、适应症的症状或朝向适应症的倾向的目的，将包含一种或多种活性药剂的组合物应用或施用至具有TGFβ-相关适应症、适应症的症状或朝向适应症的倾向的受试者。
使用选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如抗体)缓解TGFβ相关适应症包含延迟适应症的发展或进展、或减少适应症的严重程度。缓解适应症并不一定需要治愈结果。如其中所使用的，“延迟”与TGFβ相关适应症相关的适应症的发展意味着推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推后适应症的进展。该延迟可以具有不同的时间长度，取决于适应症的历史和/或被治疗的个体。“延迟”或缓解适应症的发展或延迟适应症的发作的方法是与不使用该方法相比在给定时间范围内降低发展适应症的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内减轻症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的许多受试者。
用于治疗纤维化疾病的TGFβ抑制剂的选择
TGFβ抑制剂包含同工型非选择性抑制剂和同工型选择性抑制剂，前者是大多数已知的TGFβ抑制剂/拮抗剂。同工型非选择性抑制剂包含泛抑制剂(TGFβ1/2/3抑制剂)、TGFβ1/2抑制剂和TGFβ1/3抑制剂。同工型选择性抑制剂包含选择性结合一种同工型的中和抗体和以同工型选择性方式靶向潜在proTGFβ复合物的激活抑制剂。激活抑制剂的类别包含非情境依赖性和情境选择性抑制剂。例如，还描述了同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂，其结合由LTBP1/3、GARP或LRRC33呈递的前/潜在TGFβ1，并抑制成熟TGFβ1从呈递分子复合物的释放(参见，例如，WO 2017/156500、WO 2020/014473和WO2020/014460)。每一个前述申请的全部内容通过引用并入本文。最近在WO 2018/013939中描述了选择性结合GARP-TGFβ1复合物并抑制在GARP情境中呈递的TGFβ1激活的情境特异性抗体。
本发明包含ECM相关的TGFβ1激活的特异性抑制剂，例如抗体及其抗原结合部分，其选择性地结合LTBP1/3-TGFβ1复合物，并且抑制在LTBP1或LTBP3的情境中呈递的TGFβ1的激活。本公开进一步提供了关于针对某些患者群体和相关治疗方案定制的在上面列出的那些中选择适宜的TGFβ抑制剂的指导。
本文中显示的令人惊讶的观察结果(参见实施例17；图22)表明TGFβ3抑制实际上可能加重ECM失调，这在选择正确的TGFβ抑制剂的决策过程中提供了信息。例如，对于用于治疗纤维化病症，选择对TGFβ3缺乏抑制活性的TGFβ抑制剂可能是有利的。观察到的响应于TGFβ3抑制的纤维化恶化(例如，促纤维化作用)提出了TGFβ3的作用扩展超出稳态的可能性。更重要的是，这可能不仅与纤维化疾病有关，而且与其他疾病情境有关。大量证据表明，在许多疾病状况中都发现了ECM失调，包含纤维化和癌症。事实上，许多关键的促纤维化基因也被识别为各种癌症的标志物。这些标志物包含例如col1A1、col3A1、PAI-1、CCL2、ACTA2、FN-1、CTGF和TGFB1。因此，阻断TGFβ3似乎对纤维化有害(例如，具有促纤维化作用)的发现可能适用于更广泛的与ECM失调相关的病症。
本发明包含为“正确的患者”选择“正确的TGFβ抑制剂”以治疗具有某些标准和/或临床特征的疾病状况的见解。一个方面，本发明提供适用于具有纤维化病症的特定患者群体的优选TGFβ1抑制剂的用途。因此，本发明包含LTBP1/LTBP3-proTGFβ1抑制剂在治疗受试者纤维化病症中的用途，其中受试者受益于免疫抑制。这是基于这样一种观点，即至少TGFβ1活性的一个子集涉及由GARP相关和/或LRRC33相关TGFβ1介导的免疫调节。因此，本发明包含使用也影响TGFβ1效应的免疫方面的TGFβ1抑制剂可能不利于治疗患有纤维化病症的患者的认识，其中免疫刺激可能导致疾病恶化。因此，本发明至少部分旨在提供选择性抑制ECM情境(例如，LTBP相关的)的TGFβ1效应同时保留与非ECM情境(例如，在细胞表面表达GARP或LRRC33的免疫细胞、白细胞等)相关的TGFβ1效应的方法，以防止不必要的免疫刺激。这种方法可能特别有利于早期纤维化，例如非肝硬化性肝纤维化。
在一些实施方式中，受益于以下两者的患者群体：i)TGFβ1信号传导的抑制，以及ii)免疫抑制，包含患有严重或晚期器官纤维化及将接受同种异体器官移植的那些患者。严重或晚期器官纤维化可能与IPF、CKD和/或NASH相关。这些患者可能已经接受了用于治疗纤维化疾病的其他疗法，但可能未能充分治疗或控制病情。主治医师可能会确定剩余的治疗选择可能包含同种异体移植。此类患者可能会被置于移植可用器官的等待名单中。此类患者可用免疫抑制剂治疗。LTBP1/LTBP3呈递的TGFβ1激活的选择性抑制剂，其不抑制GARP呈递的TGFβ1激活，可用于治疗此类患者，而不会增加触发由效应T细胞介导的免疫刺激的风险。类似地，移植后，这些患者可能会继续接受LTBP1/LTBP3呈递的TGFβ1激活的选择性抑制剂，以避免器官排斥的风险。
在一些实施方式中，受益于以下两者的患者群体：i)TGFβ1信号传导的抑制，以及ii)免疫抑制，包含患有纤维化病症及患有炎症或自身免疫疾病的那些患者。
在一些实施方式中，患者或患者群体患有一种或多种自身免疫性疾病或处于发展为一种或多种自身免疫性疾病的风险中，例如：贲门失弛缓症；阿狄森氏病；成人斯蒂尔病；无丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变性；强直性脊柱炎；抗GBM/抗TBM肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性自主神经功能障碍；自身免疫性脑脊髓炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳疾病(AIED)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病变；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病(AMAN)；Baló病；白塞氏病；良性黏膜类天疱疮；大疱性类天疱疮；卡斯尔曼病(CD)；乳糜泻；恰加斯病；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)；慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)；Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)；瘢痕性类天疱疮；科根综合征；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇心肌炎；CREST综合征；克罗恩病；疱疹样皮炎；皮肌炎；Devic病(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；德雷斯勒综合征；子宫内膜异位症；嗜酸性食管炎(EoE)；嗜酸性筋膜炎；结节性红斑；原发性混合性冷球蛋白血症；埃文斯综合征；纤维肌痛；纤维化性肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肾小球肾炎；古德帕斯特综合征；韦格纳肉芽肿；格雷夫斯病；吉兰-巴利综合征；桥本氏甲状腺炎；溶血性贫血；过敏性紫癜(HSP)；妊娠疱疹或类天疱疮(PG)；化脓性汗腺炎(HS)(反向痤疮)；低丙种球蛋白血症；IgA肾病；IgG4相关硬化性疾病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)；包涵体肌炎(IBM)；间质性膀胱炎(IC)；幼年关节炎；青少年糖尿病(1型糖尿病)；幼年肌炎(JM)；川崎病；兰伯特-伊顿综合征；白细胞碎裂性血管炎；扁平苔藓；地衣硬化症；木质结膜炎；线性IgA病(LAD)；狼疮；莱姆病慢性；梅尼埃病(Meniere’s disease)；显微镜下多血管炎(MPA)；混合性结缔组织病(MCTD)；莫伦溃疡；穆夏-哈伯曼病；多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；发作性睡病；新生儿狼疮；视神经脊髓炎；中性粒细胞减少症；眼瘢痕性类天疱疮；视神经炎；回文风湿病(PR)；PANDAS；副肿瘤性小脑变性(PCD)；阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；帕里罗姆伯格综合征；Pars planitis(外周葡萄膜炎)；牧师-特纳综合征；天疱疮；周围神经病变；周围脑脊髓炎；恶性贫血(PA)；POEMS综合征；结节性多动脉炎；多腺体综合征I、II、III型；风湿性多肌痛；多发性肌炎；心肌梗塞后综合征；心包切开术后综合征；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；孕酮皮炎；银屑病；银屑病关节炎；纯红细胞再生障碍(PRCA)；坏疽性脓皮病；雷诺现象；反应性关节炎；反射性交感神经营养不良；复发性多软骨炎；不宁腿综合征(RLS)；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿关节炎；结节病；施密特综合征；巩膜炎；硬皮病；干燥综合征；精子和睾丸自身免疫；僵人综合症(SPS)；亚急性细菌性心内膜炎(SBE)；苏萨克综合征；交感神经性眼炎(SO)；高安氏动脉炎；颞动脉炎/巨细胞；动脉炎血小板减少性紫癜(TTP)；Tolosa-Hunt综合征(THS)；横贯性脊髓炎；1型糖尿病；溃疡性结肠炎(UC)；未分化结缔组织病(UCTD)；葡萄膜炎；血管炎；白癜风；Vogt-Koyanagi-Harada病。
在一些实施方式中，炎症或自身免疫病症与纤维化有关。与纤维化相关的炎性或自身免疫病症的非限制性实例包含肌营养不良症，例如DMD。
在其他实施方式中，其中受益于以下两者的患者群体：i)TGFβ1信号传导的抑制以及ii)免疫抑制，包含患有纤维化疾病和具有与纤维化不直接相关的而是独立的疾病的炎症或自身免疫病症的患者。
此类炎症或自身免疫病症，无论是否与潜在的纤维化疾病或单独的病症直接相关，都可能由人类自身免疫疾病中的调节性T细胞(Treg)失衡引起或与之相关。例如，与Treg失调相关的此类疾病包括但不限于：幼年特发性关节炎；类风湿性关节炎(RA)；脊柱关节炎；银屑病关节炎；HCV混合型冷球蛋白血症；冷球蛋白血症；多发性硬化症；自身免疫性肝病；系统性红斑狼疮；免疫介导的糖尿病；重症肌无力；原发性干燥综合征；川崎病；和炎症性肠病(IBD)。
因此，TGFβ1信号传导的LTBP1/3-选择性抑制剂，例如本文所述的那些，可用于治疗患有纤维化病症和炎性或自身免疫病症例如一种或多种上述病症的患者。相应地使用的TGFβ1信号传导的LTBP1/3特异性抑制剂可以治疗或减轻ECM中TGFβ1依赖性纤维化，同时保留免疫相关的TGFβ1信号传导。
因此，本发明的相关方法包括基于受试者中纤维化病症的临床表现选择适宜的TGFβ1抑制剂用于治疗纤维化病症的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种选择同工型特异性TGFβ1抑制剂用于治疗受试者的纤维化病症的方法。该方法包括(a)确定纤维化疾病是否表现出包含纤维化及炎症、免疫抑制、增殖失调和需要同种异体移植中的一种或多种的临床表现，以及(b)基于步骤(a)中确定的临床表现，选择同工型特异性、情境依赖性TGFβ1抑制剂或同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂用于治疗纤维化病症。在另一个实施方式中，本发明提供了治疗患有纤维化病症的受试者的方法，包含为受试者选择包含同工型特异性TGFβ1抑制剂的治疗方案，并向受试者施用所选择的治疗方案，其中所述选择包含(a)确定纤维化疾病是否表现出包含纤维化和以下一项或多项的临床表现：炎症、免疫抑制、增殖失调和需要同种异体移植；(b)基于步骤(a)中确定的临床表现，选择包含同工型特异性、情境依赖性TGFβ1抑制剂或同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂的治疗方案。
患有纤维化疾病的受试者除了纤维化之外，还可以表现出广泛的症状。受试者临床表现的具体组合可以指导选择适宜的TGFβ1抑制治疗方案。例如，如果受试者的临床表现表明需要抑制TGFβ1，而不调节TGFβ2或TGFβ3的活性，则可以使用非情境依赖性、同工型特异性TGFβ1抑制剂来治疗受试者。如果受试者的临床表现表明抑制细胞外基质中的TGFβ1是有益的，则可以使用包含LTBP情境特异性抑制剂的治疗方案来治疗受试者。如果受试者的临床表现表明刺激免疫效应细胞是不可取的，则LTBP情境特异性抑制剂也是有利的。如果受试者的临床表现表明阻断调节性T细胞(Treg细胞)上TGFβ1的激活/释放将是有益的，例如防止Treg细胞抑制效应T细胞活性，则GARP情境特异性抑制剂可用于治疗受试者。如果受试者的临床表现表明阻断骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或小胶质细胞上TGFβ1的激活/释放是有益的，例如，逆转或减少受试者的免疫抑制，则LRRC33情境特异性抑制剂可用于治疗受试者。
举例说明，患有纤维化病症的受试者可能表现出包含纤维化、炎症、免疫抑制和增殖失调的临床表现。通常表现为上述症状组合的纤维化病症包含例如骨髓纤维化。在该实施方式中，可选择同工型特异性的、非情境依赖性的TGFβ1抑制剂来治疗受试者。
患有纤维化病症的受试者可能会表现出的临床表现包含纤维化、炎症和需要同种异体移植。通常表现为上述症状组合的纤维化病症包含例如器官纤维化，例如肾纤维化(例如，与慢性肾病相关的纤维化)、肝纤维化(例如，与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关的纤维化)或肺纤维化(例如，与特发性肺纤维化(IPF)相关的纤维化)。在该实施方式中，选择情境特异性LTBP1/3特异性抑制剂来治疗受试者。
在另一个实例中，患有纤维化病症的受试者可能表现出包含纤维化和炎症的临床表现。通常呈现上述症状组合的纤维化病症包含例如硬皮病。在该实施方式中，选择情境特异性LTBP1/3特异性抑制剂来治疗受试者。通常具有上述症状组合的其他纤维化病症包含例如退行性疾病，例如肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症(DMD)。在该实施方式中，选择情境特异性LTBP1/3特异性抑制剂来治疗受试者。
患有纤维化病症的受试者可能表现出的临床表现包含免疫抑制和增殖失调。通常表现为上述症状组合的纤维化病症包含例如实体瘤。在一些实施方式中，实体瘤是恶性肿瘤。在其他实施方式中，实体瘤是良性肿瘤。在示例性实施方式中，受试者患有结缔组织增生(例如，胰腺结缔组织增生)。在一些实施方式中，患者可能患有已被评估为“不能手术”或不适合手术切除的实体瘤。因此，在一些实施方式中，患者不是肿瘤手术切除的候选者。然而，包含本发明的情境选择性TGFβ1抑制剂的TGFβ1抑制疗法可以逆转此类非候选患者为更适合接受手术。在一些实施方式中，患有实体瘤的受试者对癌症疗法，例如化学疗法、放射疗法、CAR-T疗法和检查点抑制剂疗法的反应较差(例如，肿瘤对癌症疗法具有抗性)。包含本发明的情境选择性TGFβ1抑制剂的TGFβ1抑制疗法可至少部分逆转抗性以使患者对癌症疗法更敏感。在一些实施方式中，包含情境选择性TGFβ1抑制疗法和癌症疗法的联合疗法可以协同治疗癌症。在一些实施方式中，与癌症疗法联合施用的情境选择性TGFβ1抑制疗法可减少癌症疗法所需的剂量以产生等效或改善的临床效果。
在另一个示例性实施方式中，受试者患有纤维瘤。在前述实施方式中，其中纤维化病症表现出包含免疫抑制和增殖失调的临床表现，选择情境特异性LTBP1/3特异性抑制剂和/或情境特异性GARP特异性抑制剂来治疗受试者。
在另一方面，本发明提供了一种用同工型特异性、LTBP1/3情境特异性TGFβ1抑制剂治疗患有纤维化病症的受试者的方法，其中该方法通过选择具有表现出包含纤维化和需要同种异体移植的临床表现的纤维化病症的受试者，并向受试者施用有效量的同工型特异性、LTBP1/3特异性TGFβ1抑制剂。在一个实施方式中，该方法包括确定纤维化病症是否表现出包含纤维化和需要同种异体移植在内的临床表现。如果受试者表现出包含纤维化和需要同种异体移植在内的症状，则向受试者施用LTBP1/3特异性TGFβ1抑制剂。
在另一方面，本发明提供了一种用同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂治疗患有纤维化病症的受试者的方法，其中该方法通过选择具有表现出包含纤维化、免疫抑制和/或增殖性失调的临床表现的纤维化病症的受试者，并向受试者施用有效量的同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂。在一个实施方式中，该方法包括确定纤维化病症是否表现出包含纤维化、免疫抑制和/或增殖失调的临床表现。如果受试者表现出包含纤维化、免疫抑制和/或增殖失调的症状，则向受试者施用同工型特异性、非情境依赖性TGFβ1抑制剂。
可以使用本领域已知的方法和实践在患有纤维化病症的受试者中确定临床表现，包含炎症、免疫抑制、增殖失调和/或需要同种异体移植。此类方法包括，例如，身体检查和标准诊断测试。在一个实施方式中，可以通过确定受试者是否在血浆、血液或血清中表现出升高水平的炎症生物标志物来评估炎症。此类炎症生物标志物包含，例如，C反应蛋白、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)或其组合。包含红细胞沉降率(ESR)和血浆粘度(PV)在内的血液测试也可以表明患有纤维化疾病的受试者是否存在炎症。在另一个实施方式中，可以通过确定受试者的血细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞等)的数量和组成来评估免疫抑制。也可以通过确定受试者是否是服用或有服用免疫抑制剂药物的历史，或确定受试者是否患有与免疫抑制相关的病症(例如，血液系统恶性肿瘤、HIV/AIDS等)来评估免疫抑制。在另一个实施方式中，可以使用标准测试来评估增殖失调，其中所述标准测试包含血液测试、活组织检查和/或成像程序，例如CT扫描、超声和MRI。用于诊断癌症的其他标准测试(例如，生物标志物测试等)也可用于评估增殖失调。临床医生可以使用标准程序确定是否需要同种异体移植。在一个实施方式中，器官功能的丧失或部分丧失，或器官功能丧失的可能性增加，表明需要移植。
如上所述，本发明提供了通过使用能够特异性结合LTBP呈递的TGFβ1前体的抗体实现的ECM相关TGFβ1复合物的选择性靶向。虽然本发明的一些抗体能够结合和抑制与LTBP1和LTBP3相关的proTGFβ1复合物两者，但其他抗体显示出更大的选择性，因为它们仅结合LTBP1-proTGFβ1或LTBP3-proTGFβ1。
因此，本发明包含某些患者群体可能受益于TGFβ1抑制疗法的认识，其中该疗法包含对LTBP1/3-proTGFβ1特异性的情境选择性抑制剂，而不是也影响TGFβ信号传导的免疫成分的TGFβ抑制剂，即与GARP相关的TGFβ。因此，本文预期为了治疗患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病风险的受试者的TGFβ相关病症，选择性抑制基质相关TGFβ的TGFβ抑制剂(例如，本文公开的TGFβ1的LTBP1/3情境选择性抑制剂)可提供治疗益处，同时将过度刺激免疫系统的风险降至最低。此类受试者可能患有自身免疫性疾病或可能处于发展为自身免疫性疾病的风险中，例如：贲门失弛缓症；阿狄森氏病；成人斯蒂尔病；无丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变性；强直性脊柱炎；抗GBM/抗TBM肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性自主神经功能障碍；自身免疫性脑脊髓炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳疾病(AIED)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病变；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病(AMAN)；Baló病；白塞氏病；良性黏膜类天疱疮；大疱性类天疱疮；卡斯尔曼病(CD)；乳糜泻；恰加斯病；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)；慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)；Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)；瘢痕性类天疱疮；科根综合征；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇心肌炎；CREST综合征；克罗恩病；疱疹样皮炎；皮肌炎；Devic病(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；德雷斯勒综合征；子宫内膜异位症；嗜酸性食管炎(EoE)；嗜酸性筋膜炎；结节性红斑；原发性混合性冷球蛋白血症；埃文斯综合征；纤维肌痛；纤维化性肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肾小球肾炎；古德帕斯特综合征；韦格纳肉芽肿；格雷夫斯病；吉兰-巴利综合征；桥本氏甲状腺炎；溶血性贫血；过敏性紫癜(HSP)；妊娠疱疹或类天疱疮(PG)；化脓性汗腺炎(HS)(反向痤疮)；低丙种球蛋白血症；IgA肾病；IgG4相关硬化性疾病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)；包涵体肌炎(IBM)；间质性膀胱炎(IC)；幼年关节炎；青少年糖尿病(1型糖尿病)；幼年肌炎(JM)；川崎病；兰伯特-伊顿综合征；白细胞碎裂性血管炎；扁平苔藓；地衣硬化症；木质结膜炎；线性IgA病(LAD)；狼疮；莱姆病慢性；梅尼埃病(Meniere’s disease)；显微镜下多血管炎(MPA)；混合性结缔组织病(MCTD)；莫伦溃疡；穆夏-哈伯曼病；多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；发作性睡病；新生儿狼疮；视神经脊髓炎；中性粒细胞减少症；眼瘢痕性类天疱疮；视神经炎；回文风湿病(PR)；PANDAS；副肿瘤性小脑变性(PCD)；阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；帕里·罗姆伯格综合征；Pars planitis(外周葡萄膜炎)；牧师-特纳综合征；天疱疮；周围神经病变；周围脑脊髓炎；恶性贫血(PA)；POEMS综合征；结节性多动脉炎；多腺体综合征I、II、III型；风湿性多肌痛；多发性肌炎；心肌梗塞后综合征；心包切开术后综合征；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；孕酮皮炎；银屑病；银屑病关节炎；纯红细胞再生障碍(PRCA)；坏疽性脓皮病；雷诺现象；反应性关节炎；反射性交感神经营养不良；复发性多软骨炎；不宁腿综合征(RLS)；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿关节炎；结节病；施密特综合征；巩膜炎；硬皮病；干燥综合征；精子和睾丸自身免疫；僵人综合症(SPS)；亚急性细菌性心内膜炎(SBE)；苏萨克综合征；交感神经性眼炎(SO)；高安氏动脉炎；颞动脉炎/巨细胞；动脉炎血小板减少性紫癜(TTP)；Tolosa-Hunt综合征(THS)；横贯性脊髓炎；1型糖尿病；溃疡性结肠炎(UC)；未分化结缔组织病(UCTD)；葡萄膜炎；血管炎；白癜风；Vogt-Koyanagi-Harada病。
LTBP1和LTBP3都是ECM的组分，它们可以在其中展示或“呈递”潜在TGFβ前体复合物。来自表达研究的一些观察结果提出了LTBP3的缺失、消除或功能抑制可能导致某些毒性的可能性。LTBP3-/-小鼠(以及一些人类突变)具有身材矮小，以及骨骼和牙齿异常。这些表型可能与发育中断有关，然而，LTBP3仍可能在成人的这些组织的稳态中发挥作用(据报道在成人骨骼中表达)。根据这些观察结果，在某些临床情况下(其中疾病表现在已知表达LTBP3并与毒性相关的组织中)或某些患者群体中，例如仍处于活跃发育阶段的儿科患者，可以建议避免潜在的LTBP3相关抑制的毒性。LTBP1功能的丧失似乎足以防止至少某些形式的纤维化，因为LTBP1-/-KO小鼠可以防止肝纤维化(由胆管结扎诱导)。综上所述，这些数据提出了在某些情况下与LTBP1/3-TGFβ1抑制剂相比，LTBP1特异性TGFβ1抑制剂具有更高安全性的可能性。
因此，选择适合的或可能受益于本发明的LTBP1/3选择性抑制剂的患者或患者群体可包含评估或确认LTBP1、LTBP2、LTBP3、LTBP4、GARP、LRRC33、前或成熟TGFβ1、前或成熟TGFβ2、前或成熟TGFβ3，或其任何组合的表达谱。可以通过在适宜的测定中从受试者(例如，患者)收集的生物样品中测量mRNA和/或蛋白质的存在/不存在或水平来获得表达谱。在一些实施方式中，LAP的一个或多个可溶性循环片段可用作特定TGFβ同工型表达的替代标志物。在一些实施方式中，TGFβ1LAP片段可用作纤维发生的标志物。参见例如，美国专利8,198,412，其内容通过引用并入本文。
疾病的遗传标志物：
已经观察到，在各种疾病状况中TGFβ1信号转导通路的异常激活与多种标志物的基因表达的改变相关。这些基因表达标志物(例如，通过mRNA测量)包括但不限于：Serpine1(编码PAI-1)、MCP-1(也称为CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、ACTA2(编码α-SMA)、SNAI1(通过下调钙粘蛋白(Cdh1)驱动纤维化和转移中的EMT)、MMP2(与EMT相关的基质金属蛋白酶)、MMP9(与EMT相关的基质金属蛋白酶)、TIMP1(与EMT相关的基质金属蛋白酶)、FOXP3(Treg诱导的标志物)、CDH1(由TGFβ下调的E钙粘蛋白(上皮细胞的标志物))和CDH2(由TGFβ上调的N钙粘蛋白(间叶细胞的标志物))。有趣的是，许多这些基因涉及在多种疾病状况中发挥作用，包括各种类型的器官纤维化以及许多癌症，包括骨髓纤维化。实际上，已经提出了纤维化病症与异常细胞增殖、肿瘤发生和转移之间的病理生理学联系。参见，例如，Cox和Erler(2014)Clinical Cancer Research 20(14):3637-43“Molecularpathways:connecting fibrosis and solid tumor metastasis”；Shiga等，(2015)Cancers7:2443-2458“Cancer-associated fibroblasts:their characteristics andtheir roles in tumor growth”；Wynn和Barron(2010)Semin.Liver Dis.30(3):245-257“Macrophages:master regulators of inflammation and fibrosis”，其内容各自通过引用并入本文。无意受特定理论的束缚，本公开的发明人考虑到TGFβ1信号传导通路实际上可能是这些广泛病理之间的关键联系。
趋化性细胞因子(或趋化因子)介导白细胞募集(例如，单核细胞/巨噬细胞)至受伤或疾病组织的能力在疾病进展中具有至关重要的作用。C-C趋化因子家族的成员，如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，也称为CCL2，巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)，也称为CCL3，和MIP-1β，也称为CCL4已牵涉到这一过程中。
例如，MCP-1/CCL2被认为在纤维化和癌症两者中发挥作用。MCP-1/CCL2的特征在于作为促纤维化趋化因子且是单核细胞化学引诱物，并且证据表明其可能参与癌症的启动和进展两者。在纤维化中，MCP-1/CCL2已显示在纤维化的炎症阶段中起重要作用。例如，MCP-1的中和导致肾小球新月体形成和I型胶原沉积的显著减少。类似地，使用抗MCP-1或抗MIP-1α抗体进行的被动免疫疗法显示出显著减少博来霉素攻击小鼠的单核吞噬细胞累积，表明MIP-1α和MCP-1有助于肺部炎症反应过程中白细胞的募集(Smith,BiolSignals.1996Jul-Aug；5(4):223-31,“Chemotactic cytokines mediate leukocyterecruitment in fibrotic lung disease”)。据报道，囊性纤维化和多发性骨髓瘤患者的MIP-1α水平升高(参见，例如：Mrugacz等，J Interferon Cytokine Res.2007Jun；27(6):491-5)，这支持了MIP-1α与局部或全身炎症反应相关的观点。
一系列证据表明C-C趋化因子参与了肿瘤进展。例如，肿瘤来源的MCP-1/CCL2可以促进巨噬细胞中的“前癌”表型。例如，在肺癌中，已显示MCP-1/CCL2由基质细胞产生并促进转移。在人胰腺癌中，肿瘤分泌CCL2，且免疫抑制性CCR2阳性巨噬细胞浸润这些肿瘤。具有显示出高CCL2表达/低CD8 T细胞浸润的肿瘤患者存活率显著降低。不希望受到特定理论的束缚，预期被募集到受伤或患病组织环境中的单核细胞随后可响应于局部诱因(如对肿瘤衍生的细胞因子的应答)而变得极化，从而进一步导致疾病进展。这些M2样巨噬细胞可能通过抑制效应细胞(如CD4+和CD8+T细胞)来促进免疫逃逸。在一些实施方式中，这一过程部分地由激活的巨噬细胞表达的LRRC33-TGFβ1介导。在一些实施方式中，该过程部分地由Treg表达的GARP-TGFβ1介导。
同样，PAI-1/Serpine1的参与涉及多种癌症、血管生成、炎症、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病)。肿瘤和/或血清中PAI-1的表达升高与各种癌症(例如，乳腺癌和膀胱癌(例如，移行细胞癌))以及骨髓纤维化的不良预后(例如，存活更短、转移增加)相关。在纤维化状况的背景下，PAI-1已被认为是TGFβ1诱导的纤维化的重要的下游效应物，并且在各种形式的组织纤维化中观察到PAI-1表达增加，包括肺纤维化(例如特发性肺纤维化(IPF))、肾纤维化、肝纤维化和硬皮病。在一些实施方式中，该过程部分地由ECM相关的TGFβ1介导，例如，通过LTBP1和/或LTBP3。
因此，在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂疗法的体内效果可以通过测量基因标志物的变化来评估。适宜的标志物包含TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)。适合的标志物还可以包括针对TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的一种或多种呈递分子，如LTBP1、LTBP3、GARP(或LRRC32)和LRRC33。在一些实施方式中，合适的标志物包括间充质转化基因(例如，AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN和/或FAP)、免疫抑制基因(例如，IL10、VEGFA、VEGFC)、单核细胞和巨噬细胞趋化基因(例如，CCL2、CCL3、CCL4、CCL7、CCL8和CCL13)，和/或本文讨论的各种纤维化标志物。优选的标志物是血浆标志物。
在一些实施方式中，用TGFβ1的LTBP复合物抑制剂来治疗与以下一种或多种的过表达相关的疾病：PAI-1(由Serpine1编码)、MMP2、MMP9、MCP-1(也称为CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、α-SMA、ITGA11和ACTA2，其中治疗包含以有效治疗疾病的量向患有疾病的受试者施用抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂用于治疗与PAI-1、MCP-1/CCL2、CTGF和/或α-SMA过表达相关的疾病。在一些实施方式中，疾病是骨髓纤维化。在一些实施方式中，疾病是癌症，例如包含实体瘤的癌症。在一些实施方式中，疾病是器官纤维化，例如，肝、肾、肺、肌肉、皮肤和/或心脏或者心血管组织的纤维化。在一些实施方式中，疾病是Alport综合征。在一些实施方式中，抑制剂降低以下一种或多种的表达：PAI-1(由Serpine1编码)、MMP2、MMP9、MCP-1(也称为CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、α-SMA、ITGA11和ACTA2。
可用于评估TGFβ1抑制剂治疗的体内效果的另一种生物标志物是血尿素氮(BUN)。尿素作为蛋白质分解的副产物在体内自然形成。尿素从您的肝脏传输到您的肾脏，在那里它被过滤/从血液中去除。因此，当患者的肾脏功能不正常时，BUN水平可能会增加。例如，患有肾纤维化的患者可能会出现BUN增加。因此，在一些实施方式中，测量BUN以评估如本文所述的TGFβ1的LTBP特异性抑制剂的体内效果。在其他实施方式中，TGFβ1的LTBP特异性抑制剂用于治疗与增加的BUN相关的疾病(例如，肾纤维化和/或急性或慢性肾病、损伤或衰竭)。在一个具体的实施方式中，与增加的BUN相关的疾病是Alport综合征。
因此，本公开包含选择可能对TGFβ1抑制疗法产生应答的候选患者或患者群体的方法。此类方法可包含测试从患者(或患者群体)收集的生物样品(例如活检样品)的一种或多种本文讨论的标志物的表达的步骤。类似地，这种遗传标志物可用于监测患者对治疗的反应的目的。监测可以包括检测从患者中收集的两种或更多种生物样品，例如，在治疗施用之前和之后，以及随时间进行治疗方案的过程中收集的，以评价指示治疗反应或功效的一个或多个标志物的基因表达水平的变化。
在一些实施方式中，选择可能对TGFβ1抑制疗法产生应答的候选患者或患者人群的方法可以包括以下步骤：鉴定此前针对遗传标志物(如本文所述的那些)检测显示出其异常表达的患者或患者人群。在一些实施方式中，异常标志物表达包含以下至少一种的水平的升高：TGFβ1(和/或TGFB1)、LRRC33、GARP、LTBP1、LTBP3、CCL2、CCL3、PAI-1/Serpine1、MMP2、MMP9、Col1a1、Col3a1、FN1、CTGF、α-SMA、ITGA11和ACTA2。在一些实施方式中，患者或患者群体(例如，从其收集的生物样品)显示升高的TGFβ1激活、磷酸-Smad2/3或其组合。在一些实施方式中，患者或患者群体表现出升高的BUN。
联合疗法
本公开还包括作为联合疗法用于治疗可以从体内TGFβ1抑制受益的受试者的药物组合物和相关方法。在任何这些实施方式中，这样的受试者可以接受联合疗法，所述联合疗法包括含有至少一种TGFβ1抑制剂例如本文所述的抗体或其抗原结合部分的第一组合物，以及包含至少一种用于治疗相同或重叠的疾病或临床病症的另外的治疗剂的第二组合物。第一和第二组合物两者可以作用于相同的细胞靶标或独立的细胞靶标。在一些实施方式中，第一和第二组合物可以治疗或减轻疾病或临床病症的相同或重叠的症状或方面组。在一些实施方式中，第一和第二组合物可以治疗或减轻疾病或临床病症的单独的症状或方面组。仅举一个实例，第一组合物可以治疗与TGFβ1信号传导有关的疾病或病症，而第二组合物可以治疗与同一疾病有关的炎症或纤维化等。这样的联合疗法可以相互结合给药。在联合疗法的上下文中，短语“与...组合”意指在接受联合疗法的受试者中第一疗法的治疗效果在时间和/或空间上与第二疗法的治疗效果重叠。因此，联合疗法可以配制成用于同时施用的单一制剂，或者配制成用于疗法的顺序施用的单独制剂。
在优选的实施方式中，联合疗法在疾病的治疗中产生协同效应。术语“协同”是指大于每种单一疗法总计的累加效应的效应(例如，更高的功效)。
在一些实施方式中，包含本文所述的药物组合物的联合疗法产生整体相当于由另一种疗法产生的(例如第二药剂的单一疗法)功效，但与第二药剂的单一疗法相比与较少的不希望的第二药剂的不利影响或较不严重的第二药剂的毒性相关联。在一些实施方式中，这样的联合疗法允许较低剂量的第二药剂但保持总体功效。这样的联合疗法可能特别适用于需要长期治疗和/或涉及儿科患者的患者群体。
因此，如本文所述，本发明提供在用于减少TGFβ1蛋白激活和治疗或预防与TGFβ1信号传导相关的疾病或病症的联合疗法中使用的药物组合物和方法。因此，该方法或药物组合物还包含第二疗法。在一些实施方式中，第二疗法可用于治疗或预防与TGFβ1信号传导相关的疾病或病症。第二疗法可以减少或治疗与目标疾病相关的至少一种症状。第一和第二疗法可以通过相似或不相关的作用机制发挥其生物学作用；或者，第一和第二疗法中的一种或两种可以通过多种作用机制发挥其生物学作用。
应当理解的是，本文所述的药物组合物可含有在相同的药学上可接受的载体中或在对各个所述的实施方式不同的药学上可接受的载体中的第一和第二疗法。还应当理解，第一和第二疗法可在所述实施方式中同时或顺序施用。
在一个实施方式中，本文所述的选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体)可以与抑制TGFβ1活性的另一种药剂一起施用。例如，第二药剂可以是另一种情境特异性TGFβ1抑制剂。在一个实施方式中，联合疗法包含(i)选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分，和(ii)选择性结合GARP-TGFβ1复合物的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方式中，联合疗法包含(i)选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分，和(ii)选择性结合LRRC33-TGFβ1复合物的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分。例如，在US 62/503,785中描述了选择性结合LRRC33-TGFβ1的情境特异性抗体，并且上文描述了选择性结合GARP-TGFβ1的情境特异性抗体。前述申请的全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，联合疗法包含(i)选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分，和(ii)非情境依赖性抑制剂，例如，抗体或其抗原结合部分，其选择性地结合与呈递分子(例如，LTBP1/3、GARP和/或LRRC33)复合的前/潜在TGFβ1。TGFβ1的非情境依赖性抑制剂描述于例如WO2017/156500中，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的一种或多种抗TGFβ1抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)可以与一种或多种另外的治疗剂组合使用。可与本发明的抗TGFβ抗体一起使用的其他治疗剂的实例包含，但不限于，肌生长抑制素抑制剂、VEGF激动剂、IGF1激动剂、FXR激动剂、CCR2抑制剂、CCR5抑制剂、双重CCR2/CCR5抑制剂、赖氨酰氧化酶样-2抑制剂、ASK1抑制剂、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂、p38激酶抑制剂、吡非尼酮(Pirfenidone)、尼达尼布(Nintedanib)、selonsertib、cilofexor、firsocostat、吡非尼酮、奥贝胆酸(obeticholic acid)、elafibranor、抗CD147抗体、抗GP73抗体、Galactin-1抑制剂、selonsertib、半胱天冬酶抑制剂(Emricasan，IDN-6556，PF-03491390)、GDF11抑制剂、GDF8/肌生长抑制素抑制剂，等。GDF8/肌生长抑制素抑制剂优选是肌生长抑制素选择性抑制剂(例如，抗体或抗原结合片段)。肌生长抑制素选择性抑制剂可结合潜在肌生长抑制素。肌生长抑制素选择性抑制剂的非限制性实例包含SRK-015(例如，参见WO2017/218592A1)和trevogrumab，或其任何变体，或根据WO2016/098357的抗体。
在一些实施方式中，另外的药剂是检查点抑制剂。在一些实施方式中，另外的药剂选自PD-1拮抗剂、PDL1拮抗剂、PD-L1或PDL2融合蛋白、CTLA4拮抗剂、GITR激动剂、抗-ICOS抗体、抗-ICOSL抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗OX40抗体、抗CD27抗体、抗CD70抗体、抗CD47抗体、抗41BB抗体、抗PD-1抗体、溶瘤病毒和PARP抑制剂。在一些实施方式中，另外的疗法是放射。在一些实施方式中，另外的药剂是化学治疗剂。在一些实施方式中，化学治疗剂是紫杉醇。在一些实施方式中，另外的药剂是抗炎剂。在一些实施方式中，另外的药剂抑制单核细胞/巨噬细胞募集和/或组织浸润的过程。在一些实施方式中，另外的药剂是肝星状细胞激活的抑制剂。在一些实施方式中，另外的药剂是趋化因子受体拮抗剂，例如CCR2拮抗剂和CCR5拮抗剂。在一些实施方式中，这样的趋化因子受体拮抗剂是双特异性拮抗剂，例如CCR2/CCR5拮抗剂。在一些实施方式中，作为联合疗法施用的另外的药剂是或包含TGFβ生长因子超家族的成员或其调节剂。在一些实施方式中，这样的药剂选自GDF8/肌肉生长抑制素和GDF11的调节剂(例如，抑制剂和激活剂)。在一些实施方式中，这样的药剂是GDF8/肌肉生长抑制素信号传导的抑制剂。在一些实施方式中，这样的药剂是单克隆抗体，其结合前/潜在肌肉生长抑制素复合物并阻断肌肉生长抑制素的激活。在一些实施方式中，结合前/潜在肌肉生长抑制素复合物并阻断肌肉生长抑制素激活的单克隆抗体不结合游离的成熟的肌肉生长抑制素。
包含TGFβ抑制剂(例如，本文公开的TGFβ1选择性抑制剂)与一种或多种额外疗法相结合的联合疗法可被考虑用于治疗多种肝病。肝病的非限制性实例包含：非酒精性脂肪肝(NAFLD)，例如，非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其可包含：具有肝纤维化的非肝硬化NASH、肝硬化、NASH伴代偿性肝硬化、NASH伴失代偿性肝硬化、肝脏炎症伴纤维化、肝脏炎症不伴纤维化；2和3期肝纤维化、4期纤维化(NASH肝硬化或肝硬化NASH伴纤维化)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)(以前称为原发性胆汁性肝硬化)和原发性硬化性胆管炎(PSC)。
一种或多种以下疗法可以与TGFβ抑制剂(例如，本文公开的TGFβ1-选择性抑制剂)联合用于治疗肝病，例如上文所列的那些：吡格列酮(Pioglitazone，PPARγ激动剂)；Elafibranor(PPARα/δ激动剂)；Saroglitazar(PPARα/γ激动剂)；奥贝胆酸(FXR激动剂)；利拉鲁肽(Liraglutide，GLP-1受体激动剂)；Aramchol(SCD抑制剂)；Volixibat(SHP-626)(ASBT抑制剂)；BMS-986036(FGF-21类似物)；NGM-282(FGF-19类似物)；替沙瑞林(Tesamorelin，GHRH类似物)；NDI-010976(ACC抑制剂)；GS-9674(FXR激动剂)；Dur-928(硫酸化氧甾醇)；AZD4076(miR-103/107拮抗剂)；瑞舒伐他汀(Rosuvastatin，HMG-CoA还原酶抑制剂)；INT-767(FXR/TGR5激动剂)；司维拉姆(Sevelamer，胆汁酸螯合剂)；维生素E(抗氧化剂)；己酮可可碱(Pentoxifylline，PDE抑制剂)；Cenicriviroc(CCR2/CCR5拮抗剂)；Emricasan(半胱天冬酶抑制剂)；GS-4997(ASK1抑制剂)；Amlexanox(IKKε/TBK1抑制剂)；PXS-4728A(VAP-1抑制剂)；奥利司他(Orlistat，肠脂肪酶抑制剂)；IMM-124e(富含IgG的牛初乳)；索利霉素(Solithromycin，抗生素)；粪便微生物移植(肠道微生物组的调节)；Simtuzumab(LOXL2抗体)；GR-MD-02(Galectin-3抑制剂)；Trevogrumab(肌生长抑制素抑制剂)；Garetosmab(激活素A抑制剂)；和SRK-015(肌生长抑制素抑制剂)。
这种联合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
检测LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的分析法
在一些实施方式中，本文提供的方法和组合物涉及用于检测从受试者获得的样品中的LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的方法。如本文所用，“受试者”是指个体生物，例如个体哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物。在一些实施方式中，受试者是绵羊、山羊、牛、家禽、猫或狗。在一些实施方式中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、苍蝇或线虫。在一些实施方式中，受试者是研究动物。在一些实施方式中，受试者是遗传工程化的，例如遗传工程化的非人受试者。受试者可以是任一性别和任何发育阶段。在一些实施方式中，受试者是患者或健康志愿者。
在一些实施方式中，用于检测从受试者获得的样品中的LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的方法涉及：(a)在适合抗体与抗原结合的条件下，使选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抗体与样品接触，如果抗原存在于样品中，则由此形成结合复合物；和(b)确定与抗原结合的抗体水平(例如，确定结合复合物的水平)。
在一个实施方式中，使用了利用固定在表面上的生物素化的潜在TGFβ1复合物的筛选测定，这允许通过整联蛋白激活潜在TGFβ1，例如通过提供系链。其他非整联蛋白激活剂也可以在该系统中测试。可以通过报告细胞或其他TGFβ依赖性细胞响应测量读取结果。
用于测定TGFβ激活的基于细胞的分析
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来测量TGFβ的激活(和TGFβ测试抑制剂例如抗体对其的抑制)。例如，整联蛋白介导的TGFβ激活可用于基于细胞的测定，例如本文更详细描述的“CAGA12”萤光素酶测定。这样的测定系统可包含以下组分：i)TGFβ源(重组、内源或转染的)；ii)整联蛋白源(重组、内源或转染的)；和iii)对TGFβ激活响应的报告系统，例如表达能够对TGFβ响应的TGFβ受体并将信号转化为可读输出的细胞(例如，CAGA12细胞或其他报告细胞系中的荧光素酶活性)。在一些实施方式中，报告细胞系包含在TGFβ响应性启动子(例如PAI-1启动子)控制下的报告基因(例如，荧光素酶基因)。在一些实施方式中，赋予敏感性的某些启动子元件可以整合到报告系统中。在一些实施方式中，这样的启动子元件是CAGA12元件。已经描述了可用于测定的报告细胞系，例如，Abe等，(1994)AnalBiochem.216(2):276-84，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，前述测定组分中各自由相同的来源(例如，相同的细胞)提供。在一些实施方式中，前述测定组分中的两种由相同的来源提供，并且第三测定组分由不同的来源提供。在一些实施方式中，所有三种测定组分均由不同的来源提供。例如，在一些实施方式中，整联蛋白和潜在TGFβ复合物(proTGFβ和呈递分子)由相同的来源(例如，相同的转染细胞系)提供用于测定。在一些实施方式中，整联蛋白和TGF由单独的来源(例如，两种不同的细胞系、纯化的整联蛋白和转染的细胞的组合)提供用于测定。当细胞用作一种或多种测定组分的来源时，这样的测定组分可以是细胞内源的、在细胞中稳定表达的、瞬时转染或其任何组合。
本领域技术人员可以容易地将这样的测定适应于各种合适的配置。例如，可以考虑多种TGFβ来源。在一些实施方式中，TGFβ来源是表达和沉积TGFβ的细胞(例如，原代细胞、增殖细胞、永生化细胞或细胞系等)。在一些实施方式中，使用合适的方法纯化TGFβ来源和/或将重组TGFβ固定在测定系统中。在一些实施方式中，固定在测定系统中的TGFβ存在于具有或不具有去细胞化的测定板上的细胞外基质(ECM)组合物中，其模拟成纤维细胞来源的TGFβ。在一些实施方式中，TGFβ存在于测定中使用的细胞的细胞表面上。另外，选择的呈递分子可以被包括在测定系统中以提供合适的潜在TGFβ复合物。本领域普通技术人员可以容易地确定哪些呈递分子可以在某些细胞或细胞类型中存在或表达。使用这样的测定系统，可以容易地测量在存在或不存在测试试剂(如抗体)的情况下TGFβ激活的相对变化以评价测试试剂对体外TGFβ激活的影响。
这样的基于细胞的测定可以根据正在研究的TGFβ同工型、潜在复合物的类型(例如，呈递分子)等以许多方式被修改或者定制。在一些实施方式中，已知表达能够激活TGFβ的整联蛋白的细胞可用作测定中整联蛋白的来源。这样的细胞包括SW480/β6细胞(例如，克隆1E7)。在一些实施方式中，表达整联蛋白的细胞可以用编码感兴趣的呈递分子(例如GARP、LRRC33、LTBP(例如，LTBP1或LTBP3)等)的质粒和编码感兴趣的TGFβ同工型的前体形式(例如proTGFβ1)的质粒共转染。转染后，将细胞孵育足够的时间以允许转染基因的表达(例如，约24小时)，洗涤细胞，并与连续稀释的测试试剂(例如抗体)一起孵育。在一些实施方式中，组织培养孔或板可被涂覆提供有利基质的物质，细胞可在所述基质上粘附、生长和/或沉积ECM组分。这可以有利于ECM结构、组织化或细胞在其上的粘附。例如，带电荷的物质如聚赖氨酸可用于预涂覆组织培养基材。另外地或可选地，ECM的一种或多种组分，例如层粘连蛋白、纤连蛋白等，可以用作涂覆的基质。在一些实施方式中，在转染之前将细胞接种在ECM蛋白涂覆的孔/板上。在一些实施方式中，在转染后将细胞接种在ECM涂覆的孔/板上。在一些实施方式中，孔/板涂覆有纤连蛋白。在一些实施方式中，孔/板涂覆有人纤连蛋白。
在转染(和任选地接种在ECM涂覆的孔/板上)后，将报告细胞系(例如，CAGA12细胞)加入到测定系统中，然后经过适当的孵育时间以允许TGFβ信号传导。在加入测试试剂后的孵育期(例如，约18-20小时)后，使用合适的方法(例如，对于表达荧光素酶的报告细胞系，可以使用Bright-Glo试剂(Promega))检测信号/读取结果(例如，荧光素酶活性)。在一些实施方式中，可以使用具有自动增益(autogain)设置的BioTek(Synergy H1)读板仪检测荧光素酶荧光。
用于缓解与LTBP1/3-TGFβ相关的疾病/病症的试剂盒
本公开还提供了用于缓解与TGFβ相关适应症相关的疾病/病症的试剂盒。此类试剂盒可包含一个或多个容器，所述容器包含选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)，例如本文所述的任何那些。
在一些实施方式中，试剂盒可以包含根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包含的说明可包含施用选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)以治疗、延迟发作、或减轻本文所述的目标疾病的描述。试剂盒还可以包括基于鉴定该个体是否患有目标疾病来选择适合于治疗的个体的描述。在其他实施方式中，说明书包含向处于目标疾病风险的个体施用抗体或其抗原结合部分的描述。
关于选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)的使用的说明书一般包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可以接受的。标签或包装插页可以指示该组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解与TGFβ-相关适应症相关的疾病或病症。可以提供用于实践本文所述的任何方法的说明书。
可以以适宜的包装提供本公开的试剂盒。适宜的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑了与特定装置组合使用的包装，例如吸入器、鼻腔施用装置(例如雾化器)或输液装置，例如微型泵。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是，如本文所述的，选择性结合LTBP1-TGFβ1复合物和/或LTBP3-TGFβ1复合物的抑制剂(例如，抗体或其抗原结合部分)。
试剂盒可以任选地提供附加的组分如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施方式中，本公开提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
诊断、患者选择、监测
包括TGFβ1抑制疗法的治疗方法可以包含TGFβ1适应症的诊断和/或可能对此类疗法产生反应的患者的选择。此外，可以监测接受TGFβ1抑制剂治疗的患者的治疗效果，其通常涉及测量一种或多种适宜的参数，这些参数可以指示病况，并且可以在治疗前后进行测量(例如，测定)，并评估治疗相关的参数改变。例如，此类参数可以包括在从患者收集的生物样品中存在的生物标志物的水平。生物标志物可以是基于RNA的、基于蛋白质的、基于细胞的和/或基于组织的。例如，可以将在某些疾病条件下过表达的基因用作诊断和/或监测疾病或对疗法的反应的生物标志物。可以将疾病相关细胞群体的细胞表面蛋白作为生物标志物。此类方法可以包括直接测量指示特定疾病程度的疾病参数。可以使用任何适宜的取样方法，如血清/血液样品、活检和成像。
尽管传统上活检是诊断和监测各种疾病，如纤维化(例如，器官纤维化)和增殖性病症(例如，癌症)的标准，但创伤性较小的替代方法可能是优选的。例如，很多无创体内成像技术可以用于诊断、监测和选择要治疗的患者。因此，本发明包括在患者或受试者中诊断和/或监测疾病的体内成像技术的使用。在一些实施方式中，患者或受试者正在接受如本文所述的同工型特异性TGFβ1抑制剂。在一些实施方式中，患者或受试者正在接受如本文所述的同工型特异性TGFβ1抑制剂。在其他实施方式中，体内成像技术可以用于选择使用同工型选择性TGFβ1抑制剂治疗的患者。在一些实施方式中，此类技术可以用于确定患者是否对疗法(例如，TGFβ1抑制疗法)产生反应或者如何反应。
用于所述方法的示例性体内成像技术包括但不限于X射线照相术、磁共振成像(MRI)、医学超声成像或超声、内窥镜检查、弹性成像、触觉成像(tactile imaging)、热成像、医学摄影。其他成像技术包括核医学功能成像，例如正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。进行这些技术和分析结果的方法是本领域已知的。
通常用于诊断和监测癌症的无创成像技术包括但不限于：磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、超声、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、荧光反射成像(FRI)和荧光介导的断层扫描(FMT)。混合成像平台也可以用于诊断和监测癌症。例如，混合技术包括但不限于：PET-CT、FMT-CT、FMT-MRI和PET-MRI。动态对比增强MRI(DCE-MRI)是另一种通常用于检测乳腺癌的成像技术。执行这些技术和分析结果的方法是本领域公知的。
通常用于诊断和监测纤维化的无创成像技术包括但不限于：超声(例如，常规超声或对比增强超声)、超声弹性成像(例如，瞬时弹性成像、点剪切波弹性成像和2D剪切波弹性成像)、CT扫描(例如，常规CT或CT灌注成像)、磁共振成像(MRI)(例如，常规MRI、磁共振弹性成像、弥散加权磁共振成像、钆塞酸二钠和磁共振灌注成像)。
在一些实施方式中，将无创成像技术用于评估肝纤维化或肝脂肪变性的水平。例如，特别地用于评估肝纤维化的成像技术可以包括但不限于：FibroScan(瞬时弹性成像；TE)、点剪切波弹性成像(pSWE；又称为声辐射力脉冲(ARFI))、2D-3D SWE、磁共振弹性成像(MRE)和多参数MRI。对于评估肝脂肪变性特别有用的成像技术可以包括但不限于：超声检查、受控衰减参数(CAP)弹性成像、MRI估计的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)和磁共振波谱(MRS)。在一些实施方式中，将体内成像技术用于评估肝脏硬度。在一些实施方式中，将体内成像技术用于检测和评估肝内甘油三酯水平。在一些实施方式中，将体内成像技术用于评估肝脏表面结节(LSN；又称为“肝脏评分”)、肝脏硬度和/或肝脏节段体积比(LSVR)，这些均对肝纤维化分期和肝硬化亚分期有益。进行这些技术和分析结果的方法是本领域公知的。
最近，正在开发无创成像方法，其将允许在体内检测目标细胞(例如，细胞毒性T细胞、巨噬细胞和癌细胞)。参见，例如，www.imaginab.com/technology/；Tavare等，(2014)PNAS,111(3):1108-1113；Tavare等，(2015)J Nucl Med 56(8):1258-1264；Rashidian等，(2017)J Exp Med 214(8):2243-2255；Beckford Vera等，(2018)PLoS ONE 13(3):e0193832；和Tavare等，(2015)Cancer Res 76(1):73-82，其每一个均通过引用并入本文。所谓的“T细胞追踪”旨在在体内检测和定位抗肿瘤效应T细胞。这可能为了解实体瘤的免疫抑制表型提供有用的见解。细胞毒性T细胞充分浸润的肿瘤(“发炎”或“热”肿瘤)可能对癌症治疗(如检查点阻断疗法(CBT))产生应答。另一方面，即使存在抗肿瘤免疫应答，具有免疫抑制表型的肿瘤也往往具有较差的T细胞浸润。这些所谓的“免疫排除”肿瘤可能无法对癌症疗法(如CBT)产生应答。T细胞追踪技术可以揭示这些不同表型，并提供信息以指导将可能对患者有益的治疗方法。例如，具有“免疫排除”肿瘤的患者可能从TGFβ1抑制剂疗法中获益，以帮助逆转免疫抑制表型。可以预期的是，可以将相似技术用于诊断和监测其他疾病(例如，纤维化)。通常，可以将使用检测部分(例如，放射性标记、荧光等)工程化改造的抗体或抗体样分子输注入患者体内，然后其分布并定位在特定标志物(例如CD8+和M2巨噬细胞)的位点。
可以将无创体内成像技术以各种适宜的方法应用于诊断患者的目的；选择或鉴定可能从TGFβ1抑制剂疗法获益的患者；和/或，监测治疗时的患者治疗反应。具有已知细胞表面标志物的任何细胞都可以通过使用特异性结合细胞标志物的抗体或类似分子来检测/定位。通常，通过使用此类技术检测的细胞是免疫细胞，如细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、MDSC、疾病相关的巨噬细胞(M2巨噬细胞，如TAM和FAM)、NK细胞、树突状细胞和中性粒细胞。
适宜免疫细胞标志物的非限制性实例包括单核细胞标志物、巨噬细胞标志物(例如，M1和/或M2巨噬细胞标志物)、CTL标志物、抑制性免疫细胞标志物、MDSC标志物(例如，针对G-和/或M-MDSC的标志物)，包括但不限于：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD206、CD68、CD14、CD15、CD66、CD34、CD25和CD47。
在一些实施方式中，体内成像技术可测量肝脂肪变性、肝甘油三酯、免疫细胞(例如，如下文所述)和/或肌成纤维细胞。在一些实施方式中，治疗降低病变组织中的甘油三酯、脂肪变性、肝表面结节、炎症和/或巨噬细胞。在一些实施方式中，所选患者的肝内甘油三酯含量为肝体积的>5.5％，任选地其中肝内甘油三酯含量为肝体积的>10％。在一些实施方式中，治疗将肝内甘油三酯含量降低至肝脏体积的≤5.5％。在一些实施方式中，治疗减少病变组织中的MDSC。在一些实施方式中，治疗减少病变组织中的巨噬细胞。在一些实施方式中，有效量是从0.1mg/kg至30mg/kg，优选地3mg/kg至30mg/kg。在一些实施方式中，所述方法还包括监测受试者的如本文所述的治疗反应(例如，甘油三酯降低、脂肪变性减少、肝表面结节减少、炎症减少、巨噬细胞减少和/或肝脏评分降低)。
筛选过程；生产
本发明包含结合hLTBP1-proTGFβ1复合物和/或hLTBP3-proTGFβ1复合物并以慢速从其解离的抗体或其片段的筛选方法、生产方法和制造过程，以及包含它们的药物组合物和相关试剂盒。
包含抗体(或含其抗原结合片段的工程构建体)的药物组合物的制备方法需要鉴定和选择具有所需属性的这种抗体。在此，本发明包含具有低kOFF值的抗体可以提供反映这些激活抑制剂作用机制的持久性的认识，其不依赖于快速竞争结合内源性受体的能力，而是通过在组织内锁定在TGFβ1的无活性的潜在形式上发挥抑制作用。与潜在抗原复合物保持结合的能力(对应于低解离速率)可以在体内实现持久的效力。
因此，本发明提供了一种用于制造包含TGFβ1选择性激活抑制剂的药物组合物的方法，其中该方法包括以下步骤：选择以低解离率(例如，≤5x10-4(1/s))特异性结合人LLC的抗体或其抗原结合片段，并大规模生产抗体。
可以用单价抗体(例如，Fab片段)或全长抗体(例如，IgG)确定具有有利的解离速率(低解离)的抑制剂的选择。
在一些实施方式中，生产步骤包含体积为250L或更大，例如1000L、2000L、3000L、4000L的哺乳动物细胞培养物。该方法可以进一步包含从细胞培养物中纯化抗体的步骤，并且任选地将纯化的抗体配制成药物组合物。在一些实施方式中，该方法进一步包含在适宜的临床前模型中测试所选抗体的有效性和安全性并确认该抗体在NOAEL下有效的步骤。安全性评估可包含体内毒理学研究，包括组织病理学和免疫导向的安全性评估，包含例如，体外细胞因子释放分析和血小板分析。
为了实现持久的抑制作用，可以选择解离速率(例如，单价解离速率)不大于10.0E-4(s-1)(例如，5.0E-4或更低，1.0E-4或更低、5.0E-5或更低)的抗体用于根据本公开的治疗用途和/或大规模制造。
虽然本文已经描述和图示了本公开的若干实施方式，但是本领域的普通技术人员将容易地设想用于实施本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且每一个这样的变化和/或修改被认为在本公开的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置旨在属于示例性的并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本公开的教导的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的公开内容的具体的实施方式的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方式仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实践本公开。本公开涉及本文描述的每一个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料和/或方法不是相互矛盾的，则两个或多个这样的特征、系统、制品、材料和/或方法的任何组合包含在本发明的范围内。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不旨在以任何方式进行限制。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图的全部内容在此通过引用并入。
实施例
转化生长因子β1(TGFβ1)被表达为前蛋白，它被蛋白水解切割成C-端生长因子和N-端前结构域。切割后，前结构域保持与生长因子非共价结合，从而阻止受体结合。这种潜在TGFβ1通过连接前结构域与呈递分子的二硫键形成大潜在复合物(LLC)，然后这些大潜在复合物被沉积到细胞外基质(ECM)中或被带到细胞表面。这些呈递分子为特定的αVβ整联蛋白提供了锚点，以对潜在TGFβ1施加牵引力。已鉴定出四种TGFβ1呈递蛋白：潜在TGFβ结合蛋白-1(LTBP1)和LTBP3沉积在细胞外基质中，而糖蛋白-A重复为主(GARP/LRRC32)和富亮氨酸重复序列蛋白33(LRRC33)将潜在TGFβ1呈递在免疫细胞表面上。TGFβ1参与组织稳态过程和免疫反应的调节，其激活失调是器官纤维化、癌症和自身免疫的关键驱动因素。
与广泛表达的TGFβ生长因子和受体相比，四种呈递分子-proTGFβ复合物，即LTBP1-proTGFβ、LTBP3-proTGFβ、GARP-proTGFβ和LRRC33-proTGFβ，显示出更高限制性或选择性(例如，组织特异性)的表达模式，从而通过关联产生TGFβ活性的功能区室化。因此，呈递分子-proTGFβ复合物在表达呈递分子的组织内提供了TGFβ信号传导的独立“情境”。这些情境可分为两大类：i)与ECM相关的TGFβ信号传导(例如，基质相关的TGFβ功能)；和ii)与细胞相关的TGFβ信号传导(特别是某些免疫细胞功能)。LTBP1-proTGFβ和LTBP3-proTGFβ复合物属于第一类，而GARP-proTGFβ和LRRC33-proTGFβ复合物属于第二类。
由于泛TGFβ通路抑制剂报道的剂量限制性毒性以及通过慢性TGFβ抑制的免疫系统激活，用于治疗目的的TGFβ活性的非选择性靶向一直具有挑战性。为了解决对TGFβ1靶向的同工型和情境选择性的这种治疗需求，本文提供了能够选择性抑制与ECM相关的TGFβ激活的TGFβ抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂还对特定的TGFβ同工型(例如proTGFβ1、proTGFβ2和/或proTGFβ3)具有选择性。同工型特异性单克隆抗体结合潜在TGFβ1前结构域，而与潜在TGFβ2或TGFβ3没有可检测的结合，并在体外以情境选择性抑制整联蛋白介导的潜在TGFβ1的激活。为了促进抗体的发现和表征工作，开发了TGFβ1激活的情境依赖性的基于细胞的分析。
实施例1：开发结合LTBP1/3-TGFβ1复合物的情境特异性抑制剂
SR-AB1用作对照。SR-AB1结合潜在TGFβ1，而与呈递分子无关(见图2A)。
开发了对含有TGFβ1的大潜在复合物具有选择性的抗体。选择SR-AB2用于使用以下实施例中描述的功能分析进行进一步分析。对SR-AB2的重链和轻链可变区进行测序(图8)；互补决定区加下划线。已证明SR-AB2结合LTBP呈递的潜在TGFβ1复合物，但不结合单独的GARP-TGFβ1或proTGFβ1(图2B)。然而，如下所述，这种选择性结合的功能效应是未知的，并且如果不进一步开发新的功能分析法，就不能使用目前已知的技术来测定。
实施例2：检测激活的重组潜在TGFβ1的抑制的功能分析
为了鉴定与潜在TGFβ1前结构域结合而与潜在TGFβ2或TGFβ3没有可检测结合，并以情境依赖性在体外抑制整联蛋白介导的潜在TGFβ1激活的同工型特异性抑制剂，需要新的功能分析。在本发明之前，没有可以检测仅与LTBP结合的同工型特异性TGFβ1抗体的分析法。具体地，以前的分析形式无法区分内源性呈递分子呈递的proTGFβ1的激活和外源性LTBP呈递的proTGFβ1的激活。通过直接转染表达整联蛋白的细胞，本文公开的新分析法在内源呈递物-proTGFβ1活性和外源LTBP-proTGFβ1活性之间建立了一个窗口。由于LTBP-proTGFβ1复合物嵌入细胞外基质中，因此分析板涂层也是分析的重要组成部分。使用涂覆有ECM蛋白纤连蛋白的高结合板使LTBP分析更加稳定。换言之，在本公开之前，proTGFβ1转染和LTBP1/3+proTGFβ1的共转染之间没有分析窗口。在本发明之前，唯一可用的分析形式是三重共培养系统：转染体(潜在TGFβ呈递细胞)+整联蛋白表达细胞(激活剂)+CAGA细胞(报告体)。通过组合前两个细胞群体，并用TGFβ和呈递分子直接转染表达整联蛋白的细胞，本文建立了LTBP-proTGFβ1激活的窗口。
“批转染”(即在接种到分析孔之前在单独的孔/板/培养皿中转染)与“直接转染”(即在分析孔中转染)方案的问题以及是否观察到对于LTBP复合物的分析窗口在某些情况下似乎是细胞依赖性的。因此，如果不开发本文所述的TGFβ1激活的情境依赖性的基于细胞的分析，LTBP1/3-TGFβ1抑制剂(例如，抗体及其抗原结合部分)的发现和表征将是不可能的(也参见图3A和3B)。
具体地，为了确定实施例1中开发的抗体是否具有功能性，开发了TGFβ1大潜在复合物(LLC)的αVβ整联蛋白激活的基于细胞的分析，其对每一个已知的呈递分子具有特异性：LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33。通过分析法开发和优化过程，确定纤连蛋白是用于LTBP呈递的TGFβ1LLC的整联蛋白依赖性体外激活的关键的ECM蛋白。非情境依赖性和LTBP复合物特异性TGFβ1LLC抗体也被验证为使用以下分析法的整联蛋白依赖性激活的抑制剂。因此，实施例1中开发的抗体可分为两类：结合所有含TGFβ1的复合物的抗体(同工型特异性和非情境依赖性)，和仅结合LTBP呈递的TGFβ1LLC的抗体。如本文中更详细描述的，在本文开发和描述的分析法之前无法鉴定的LTBP复合物特异性抑制剂类别的开发实现了用于治疗纤维化适应症的治疗方法，并且可以允许长期给药而同时避免由于免疫抑制细胞的TGFβ1抑制导致的免疫系统激活。
分析I.使用SW480/β6细胞激活潜在TGFβ1
对于图3A中描述的分析，开发了以下方案。该分析对于整联蛋白细胞的细胞外基质(LTBP呈递)激活是最佳的。
材料：
·MvLu1-CAGA12细胞(克隆4A4)
·SW480/β6细胞(克隆1E7)(αV亚基以高水平内源性表达；β6亚基是稳定过表达的)
·Costar白壁经TC处理的96孔分析板#3903
·Greiner Bio-One高结合白色μclear 96孔分析板#655094
·人纤连蛋白(Corning#354008)
·P200多道移液器
·P20、P200和P1000移液器，每一个移液器带有无菌过滤头
·无菌离心管和架
·无菌试剂容器
·0.4％台盼蓝
·2mL、5mL、10mL和25mL无菌移液器
·组织培养物处理的100毫米或150毫米平板
·70％乙醇
·Opti-MEM还原性血清培养基(Life Tech#31985-070)
·Lipofectamine3000(Life Tech#L3000015)
·Bright-Glo荧光素酶分析试剂(Promega#E2620)
·0.25％胰蛋白酶+0.53mM EDTA
·proTGFb1表达质粒，人类(SR005)
·LTBP1S表达质粒，人类(SR044)
·LTBP3表达质粒，人类(SR117)
·LRRC32(GARP)表达质粒，人类(SR116)
·LRRC33表达质粒，人类(SR386)
设备：
·BioTek Synergy H1读板器
·TC柜
·台式离心机
·CO2培养箱37℃，5％CO2
·37℃水/珠浴
·振荡摇床(platform shaker)
·显微镜
·血球计数器/countess
定义：
·CAGA12 4A4细胞：MvLu1细胞(貂肺上皮细胞)的衍生物，其使用CAGA12合成启动子稳定转染，驱动荧光素酶基因表达
·DMEM-0.1％BSA：分析培养基；基础培养基为DMEM(Gibco目录号11995-065)，培养基还含有稀释至0.1％w/v的BSA、青霉素/链霉素和4mM谷氨酰胺
·D10：DMEM 10％FBS、P/S、4mM谷氨酰胺、1％NEAA、1XGlutaMAX(Gibco目录号35050061)
·SW480/β6培养基：D10+1000μg/mL G-418
·CAGA12(4A4)培养基：D10+0.75ug/mL嘌呤霉素
过程：
在第0天，接种细胞用于转染。SW480/β6(克隆1E7)细胞用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5分钟)。将细胞沉淀重悬在D10培养基中并计数每ml的活细胞。以5.0e6个细胞/12ml/100mm TC皿接种细胞。对于CAGA12细胞，将细胞以每T75培养瓶100万的密度传代，以用于第3天的测定。将培养物在37℃和5％CO2下孵育。
在第1天，转染表达整联蛋白的细胞。使用Lipofectamine 3000试剂根据生产厂商的转染方案。简言之，将以下稀释到OptiMEM I中，每孔125μl：7.5μg DNA(呈递分子)+7.5μgDNA(proTGFβ1)，30μl P3000和使用OptiMEM I至125μl。孔通过一起吹打DNA混合，然后加入OptiMEM。加入P3000，通过吹打将孔中的所有物质充分混合。制备Lipofectamine3000的主混合物，待添加到DNA混合物中：对于LTBP1测定：每孔15μl Lipofectamine3000，OptiMEM I中至125μl；对于LTBP3测定：每孔45μl Lipofectamine3000，OptiMEM I中至125μl。将稀释的Lipofectamine3000加入DNA中，通过吹打充分混合，并在室温下孵育15分钟。孵育后，通过吹打将溶液混合几次，且然后每皿滴加250μl DNA:Lipofectamine3000(2x 125μl)。轻轻转动每个皿以进行混合，并将皿放回组织培养箱中培养～24小时。
在第1-2天，使用人纤连蛋白涂覆测定板。具体地，将冻干的纤连蛋白在超纯蒸馏水(无菌)中稀释至1mg/ml。在PBS(无菌)中将1mg/ml储备溶液稀释至19.2μg/ml。然后以50μl/孔加入测定板(高结合)并在组织培养箱(37℃和5％CO2)中孵育过夜。终浓度为3.0μg/cm2。
在第2天，将转染细胞铺板用于测定和添加抑制剂。首先，通过向已经存在于测定板中的纤连蛋白溶液中添加200μl/孔PBS来洗涤纤连蛋白涂层。使用多通道移液器手动移除洗涤物。重复洗涤，共洗涤两次。在加入细胞之前，将板在室温下除盖干燥。然后，通过使用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5分钟)，将细胞铺板。将沉淀重悬在分析培养基中，并计数每ml中的活细胞。对于LTBP1测定，将细胞稀释至0.10e6个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔5,000个细胞)。对于LTBP3测定，将细胞稀释至0.05e6个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔2,500个细胞)。为制备功能性抗体稀释液，将抗体在媒介中预先稀释至一致工作浓度。将储备抗体在媒介中连续稀释(PBS是最佳选择，避免使用柠檬酸钠缓冲液)。将连续稀释的每个点稀释到分析培养基中，以得到4X终浓度的抗体。每孔添加25μl的4X抗体，并在37℃和5％CO2下孵育培养物～24小时。
在第3天，加入TGFβ报告细胞。使用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5分钟)用于测定的CAGA12(克隆4A4)细胞。将沉淀重悬在分析培养基中，并计数每ml中的活细胞。将细胞稀释至0.4e6个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔20,000个细胞)。将细胞放回培养箱中。
在第4天，读取测定结果(抗体和/或报告细胞加入后16-20小时)。读取前，使Bright-Glo试剂和测试板达到室温。使用TMLC_std方案设置BioTek Synergy H1的读取设置-此方法具有自动增益设置。选择的阳性对照孔用于自动标定(高)。每孔加入100μLBright-Glo试剂。在室温下振荡孵育2分钟，避光保护板。在BioTek Synergy H1上读板。
在一些实施方式中，与内源性呈递分子(例如，LTBP1/3)相关的TGFβ活性可以通过仅转染proTGFβ1(即，不共转染LTBP1/3)来评估。在一些实施方式中，可以将呈递分子和proTGFβDNA直接转染到接种在分析孔中的SW480/β6细胞中(即，“直接转染”)，而不是基本如上所述在单独的孔/培养皿/板中转染细胞(即“批转染”)。有关直接转染方案，也请见下面的分析II。在一些实施方式中，SW480/β6细胞可接种在不含纤连蛋白的分析孔中，如基本上在下面分析II中所述的。
结果：
该分析产生的数据反映了细胞上清液中的TGFβ活性(图3A)。具体地，SW480/β6细胞用LTBP1/3和proTGFβ1批转染，并如上所述接种在纤连蛋白上。原始数据单位是相对光单位(RLU)。图3A证明了LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的转染，而不是单独的proTGFβ1，诱导了TGFβ激活信号。
如图4所述进一步优化该分析。具体地，测定了呈递分子和/或proTGFβ1对潜在TGFβ1激活的相对贡献。在该分析中，用指定的DNA分子批转染SW480/β6细胞，并接种在用纤连蛋白预涂覆的分析孔上，基本上如上所述。如图4A所示，在呈递分子和proTGFβ1共转染后，观察到潜在TGFβ1激活显著增加。图4B描绘了通过改变用于呈递分子和proTGFβ1的质粒DNA的比率来优化共转染。发现等同量的每种质粒对于共转染是最佳的。
图5表明纤连蛋白促进LTBP呈递的潜在TGFβ1的整联蛋白激活。在该分析中，用指定的DNA分子批转染SW480/β6细胞，并接种在具有不同浓度的从人血浆纯化的纤连蛋白的预涂覆分析孔上。纤连蛋白增加了由LTBP1和LTBP3呈递的潜在TGFβ的激活。
分析II.使用LN229细胞的潜在TGFβ1激活
对于图3B中描述的分析，开发了以下方案。这种分析或“直接转染”方案对于整联蛋白细胞的细胞表面呈递的TGFβ1(GARP或LRRC33呈递物)激活是最佳的。LN229细胞表达整联蛋白αVβ8(与被工程化为表达αVβ6的SW480b6细胞系相反)。
这两种细胞系能够在由两种最佳验证的TGFβ激活整联蛋白中任何一种激活的潜在TGFβ1上测试抗体。
材料：
·MvLu1-CAGA12细胞(克隆4A4)
·LN229细胞系(高水平的内源性αVβ8整联蛋白)
·Costar白壁TC处理的96孔分析板#3903
·Greiner Bio-One高结合白色μclear 96孔分析板#655094
·人纤连蛋白(Corning#354008)
·P200多道移液器
·P20、P200和P1000移液器，每一个移液器带有无菌过滤头
·无菌离心管和架
·无菌试剂容器
·0.4％台盼蓝
·2mL、5mL、10mL和25mL无菌移液器
·组织培养物处理的100毫米或150毫米平板
·70％乙醇
·Opti-MEM还原性血清培养基(Life Tech#31985-070)
·Lipofectamine3000(Life Tech#L3000015)
·Bright-Glo荧光素酶检测试剂(Promega#E2620)
·0.25％胰蛋白酶+0.53mM EDTA
·proTGFb1表达质粒，人类(SR005)
·LTBP1S表达质粒，人类(SR044)
·LTBP3表达质粒，人类(SR117)
·LRRC32(GARP)表达质粒，人类(SR116)
·LRRC33表达质粒，人类(SR386)
设备：
·BioTek Synergy H1读板器
·TC柜
·台式离心机
·CO2培养箱37℃，5％CO2
·37℃水/珠浴
·振荡摇床
·显微镜
·血球计数器/countess
定义：
·CAGA12 4A4细胞：MvLu1细胞(貂肺上皮细胞)的衍生物，其使用CAGA12合成启动子稳定转染，驱动荧光素酶基因表达
·DMEM-0.1％BSA：分析培养基；基础培养基为DMEM(Gibco目录号11995-065)，培养基还含有稀释至0.1％w/v的BSA、青霉素/链霉素和4mM谷氨酰胺
·D10：DMEM 10％FBS、P/S、4mM谷氨酰胺、1％NEAA、1XGlutaMAX(Gibco目录号35050061)
·CAGA12(4A4)培养基：D10+0.75ug/mL嘌呤霉素
过程：
在第0天，接种表达整联蛋白的细胞用于转染。细胞用胰蛋白酶分离并沉淀(以200x g离心5分钟)。将细胞沉淀重悬于D10培养基中并计数每毫升的活细胞。将细胞稀释至0.1e6个细胞/ml并以每孔100μl(每孔10,000个细胞)接种在分析板中。对于CAGA12细胞，以每T75烧瓶150万个的密度传代，用于第2天的分析。将培养物在37℃和5％CO2下孵育。
在第1天，细胞被转染。按照制造商的方案使用Lipofectamine3000试剂进行转染。简而言之，将以下稀释到OptiMEM I中，每孔5μl：0.1μg DNA(呈递分子)+0.1μg DNA(proTGFβ1)，0.4μl P3000，和使用OptiMEM I至5μl。孔通过一起移液DNA混合，然后添加OptiMEM。添加P3000并通过吸打将所有物质混合均匀。用Lipofectamine3000制成主混合物以添加到DNA混合物中：每孔0.2μlLipofectamine3000，在OptiMEMI中至5μl。将稀释的Lipofectamine3000添加到DNA中，通过吸打充分混合，并在室温下孵育15分钟。孵育后，通过吸打将溶液混合数次，然后每孔加入10μlDNA:Lipofectamine3000(2x5μl)。将细胞板放回组织培养箱中约24小时。
在第2天，添加抗体和TGFβ报告细胞。为了制备功能性抗体稀释液，将媒介(PBS最佳)中的储备抗体连续稀释。然后将每个点稀释到分析培养基中以获得2X终浓度的抗体。制备抗体后，将细胞板通过抽吸(真空抽吸器)用分析培养基洗涤两次，然后每孔加入100μl分析培养基。第二次洗涤后，用每孔50μl的2X抗体替换分析培养基。将细胞板放回培养箱中约15-20分钟。
为了制备用于分析的CAGA12(克隆4A4)细胞，用胰蛋白酶分离细胞并沉淀(以200xg离心5分钟)。将沉淀物重新悬浮在分析培养基中并计数每毫升中的活细胞。将细胞稀释至0.3e6个细胞/ml，并每孔接种50μl(每孔15,000个细胞)。将细胞返回培养箱。
在第3天，在添加抗体和/或报告细胞后约16-20小时读取分析结果。在读取前使Bright-Glo试剂和测试板达到室温。BioTek Synergy H1上的读取设置被设置为使用TMLC_std方案-此方法具有自动增益设置。阳性对照孔设置为自动标定(高)。每孔加入100μL的Bright-Glo试剂。室温振荡孵育2分钟，板避光。在BioTek Synergy H1上读板。
在一些实施方式中，与内源性呈递分子(例如，LTBP1/3)相关的TGFβ活性可以通过仅转染proTGFβ1(即，不共转染LTBP1/3)来评估。在一些实施方式中，可以将呈递分子和proTGFβDNA在单独的孔/培养皿/板中批转染到LN229细胞中(即，“批转染”)，基本如上文分析I中所述，而不是直接转染细胞(即，“直接转染”)。在一些实施方式中，LN229细胞可以接种在具有纤连蛋白的分析孔中(参见分析I的纤连蛋白预涂覆方案)。
该分析产生的数据反映了细胞上清液中的TGFβ1活性(图3B)。具体地，将LN229细胞接种在不含纤连蛋白的分析孔中，并通过“直接转染”用指定的DNA分子转染。原始数据单位是相对光单位(RLU)。具有高RLU值的样品含有大量游离TGFβ，具有低RLU值的样品含有低水平的TGFβ。
实施例3. SR-AB1是通过整联蛋白的TGFβ LLC激活的非情境依赖性抑制剂
图6是证明SR-AB1是通过整联蛋白对TGFβ1大潜在复合物(LLC)的非情境依赖性抑制剂的图。在该分析中，SW480/β6细胞接种在不含纤连蛋白的分析孔中，并分别用GARP-proTGFβ1或LRRC33-proTGFβ1直接转染，基本上如实施例2中上述方案所述。为了评估LTBP1对TGFβ1的激活，将LN229细胞接种在用纤连蛋白预涂覆的分析孔中并用LTBP1-proTGFβ1直接转染，基本如实施例2中的上述方案中描述的。SR-AB1显示抑制TGFβ的整联蛋白激活而与呈递分子无关。
实施例4. SR-AB2是LTBP-proTGFβ1的复合物特异性抑制剂
SR-AB2被选择用于进一步的分析和测试结合不同TGFβ呈递分子的特异性。最初，如下进行ELISA分析以测试复合物特异性。
材料：
·来自96孔板SOP的NeutrAvidin涂层的纯白色96孔板
·生物素化抗原
·Maine Biotechnology Services抗组氨酸抗体MAB230P
·Jackson ImmunoResearch Laboratories过氧化物酶Affinipure山羊α-人类FCγ
·片段特异性(Fragment Specific)。目录号109-035-008。
·Jackson ImmunoResearch Laboratories Affinipure山羊α-小鼠FCγ片段特异性。
·目录号115-035-008
·QuantaBlu ELISA底物(Pierce Biotech目录号15162)
设备：
·多道移液器
·P200吸头
·台式超速离心机
·1.5mL离心管
·0.5mL离心管
·P1000
·P1000吸头
·P200
·P10
·P10吸头
·15mL Falcon试管
·50mL Falcon试管
·Biotek ELx 405Select CW洗板机
·Multidrop
·Biotek Synergy H1读板仪
定义：
·洗涤缓冲液：TBS(Tris缓冲盐水；50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH 7.6)，含0.05％Tween-20。对于人工(手)洗，添加0.1％BSA，因为BSA是粘性的且不应与自动洗板机系统一起使用。
·样品缓冲液：TBS(Tris缓冲盐水；50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH 7.6)，含0.05％Tween-20和0.1％BSA。
·ELISA 3X方案：Biotek ELx 405Select CW洗板机上的清洗方案。用200μL洗涤缓冲液洗涤。再重复洗涤两次。规格：3个循环。不振荡。每孔分配200μL。分配流速设置7(范围1–10)。分配高度15.24mm。水平x分配位置0mm。水平y分配位置0mm。吸气高度3.048mm。水平x抽吸位置1.372mm。水平抽吸y位置0.452mm。抽吸速率3.4mm/秒。抽吸延迟0毫秒。最后一次清洗时交叉线抽吸。交叉线高度3.048mm。交叉线水平x位置：-1.829mm。交叉线水平y位置：-0.457mm。
过程：
从4℃中移出预涂覆和预封闭的96孔板。将1xPBS pH 7.4 1％BSA和0.1％Tween-20从盘子中倒出，然后用力将盘子放在衬有纸巾的聚苯乙烯泡沫塑料垫上。如果尚未准备96孔板，使用96孔板的NeutrAvidin涂覆方案准备一个。具体地，对于一个NeutrAvidin涂覆板，从1mg/mL NeutrAvidin储备溶液的顶部取出5μL，并将其稀释到10mL的1x碳酸盐缓冲液pH 9.4中。通过倒转Falcon试管混合。使用多通道移液器在Corning高结合96孔分析板的每一个孔中加入100μL，并将96孔板在4℃下孵育过夜。用每孔200μL的洗涤缓冲液清洗96孔板，和再重复此步骤两次。该板应总共洗涤3次。用每孔200μL PBS pH 7.4中的1％BSA封闭板，并将板在37℃下孵育1小时或在4℃下孵育过夜。
在样品缓冲液中稀释生物素化抗原。应首先通过滴定每一个单独的蛋白质来确定最佳捕获浓度。每孔加入50μl，室温下孵育1小时。
使用具有洗涤缓冲液的洗板机使用ELISA 3X方案洗涤板。
在样品缓冲液中稀释抗体。以1μg/mL进行抗体筛选。在样品缓冲液中以1μg/mL制备α-His涂覆的对照抗体(Maine Biotechnology Services目录号：MAB230P)。将50μL稀释的抗体放在指定的孔中，并在室温下孵育1小时。
使用具有洗涤缓冲液的洗板机，使用ELISA 3X方案洗涤板。
稀释人第二抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Peroxidase)。
Affinipure山羊α-人FCγ片段特异性(目录号109-035-008)在样品缓冲液中1：10,000。对于α-his孔，在样品缓冲液中以1：10,000稀释小鼠第二抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories Affinipure山羊α-鼠FCγ片段特异性，目录号115-035-008)。
将50μL稀释的抗体放在指定的孔中。在室温下孵育1小时。使用ELISA 3X方案，使用带有洗涤缓冲液的洗板机洗涤板。
根据制造商的方案制备SuperSignal ELISA Femto Substrate(PierceBiotech目录号15162)工作溶液。一个板需要10mL。每孔放置100μL QuantBlu Substrate工作溶液。在室温下孵育10分钟。
在读板仪上测量相对荧光单位(RFU)，激发波长为325nm，发射波长为420nm。
结果：
通过ELISA，图7A证明SR-AB2仅结合LTBP-proTGFβ1复合物；它不结合单独的proTGFβ1或LTBP1。通过ELISA，图7A证明SR-AB2不结合GARP-proTGFβ1。
此外，还在基于细胞的分析中测定了SR-AB2抑制LTBP1/3-proTGFβ1的能力。基本上如上文实施例2中所述，将LN229细胞接种在纤连蛋白预涂覆的分析孔上并用指定的DNA分子直接转染。图7B描绘了SR-AB2抑制LTBP1-proTGFβ1(人和小鼠复合物)的整联蛋白激活。图7C描绘了SR-AB2抑制LTBP3-proTGFβ1的整联蛋白激活。
基本上如上所述，通过ELISA证明SR-AB2特异性结合proTGFβ1：LTBP1和3复合物，而不结合GARP-TGFβ1或GARP-Lap复合物(见图9)。
如上所述，LTBP1和LTBP3沉积在细胞外基质中，而GARP/LRRC32和LRRC33呈递在免疫细胞表面上的潜在TGFβ1。已证明SR-AB2抑制LTBP-proTGFβ1信号传导，但不影响GARP-proTGFβ1(图10A和图10B)。图10A证明SR-AB2抑制由内源性LTBP1/3呈递的LTBP-proTGFβ。该分析在LN229细胞中进行，该细胞接种在纤连蛋白预涂覆的孔中并直接用proTGFβ1转染。图10B证明SR-AB2不抑制GARP-proTGFβ。SR-AB1独立于呈递分子结合潜在TGFβ1。该分析在LN229细胞中进行，该细胞接种在不含纤连蛋白的分析孔中，并直接用GARP-proTGFβ1转染。
在基于细胞的测定中(人和小鼠，数据未显示)，SR-AB2对LTBP-proTGFβ1的抑制也显示在LTBP1呈递的TGFβ1的αVβ6整联蛋白依赖性激活中。SR-AB2对过表达的LRRC33-proTGFβ1没有抑制作用。
实施例5：LTBP1-proTGFβ1抗体的Octet结合
500nM的人LTBP1-proTGFb1复合物与1μM的每一种测试抗体一起预孵育。过夜孵育后，测试LTBP1-proTGFβ1+第一抗体与第二抗体的结合，第二抗体以67nM固定到抗人IgG Fc捕获(AHC)传感器尖端。在看到LTBP1-proTGFβ1+第一抗体之前，传感器尖端用阴性对照抗体(HuNeg)封闭。
复合物与特定的第二抗体的结合相对于未抑制的相互作用标准化，即在不结合TGFβ复合物的阴性对照抗体(HuNeg)存在下的复合物。低于未抑制相互作用的70％或低于0.7的标准化的反应被认为是交叉阻断的抗体。大于1的反应表明两种抗体同时结合。结果示于下表7中。
表7：
Figure BDA0003288375730002901
如表7所示，抗体SR-AB13、SR-AB10、SR-AB2和SR-AB1不相互交叉阻断，且因此每一种抗体在人LTBP1-proTGFβ1表面上占据不同的表位。
实施例6：体外结合特征和亲和力数据
用于确定结合动力学参数的体外结合分析的合适方法包括基于生物膜层干涉测量(BLI)的分析，例如Octet，和基于表面等离子体共振(SPR)的分析，例如Biacore系统(参见，例如：http：//www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Biacore_assay_handbook.pdf)。
通过Octet分析测量SR-AB10、SR-AB2和SR-AB13的亲和力。用于测量抗体对本文提供的复合物的亲和力的方案总结如下。
材料：
·96孔黑色聚丙烯板
·AHC Octet尖头(抗人IgG Fc捕获头)(FortéBio)
·10x动力学缓冲液(FortéBio)(在PBS中稀释至1x)
·reiner Bio-One 96孔半面积微孔板(VWR cat#82050-044)
过程：
注意：Octet实验过程中每孔内的体积为100uL。
所有测定步骤使用1000rpm的振摇速度。
预湿尖头：
·在开始实验之前，生物传感器必须在1x动力学缓冲液(1xKB)中预润湿至少10分钟。这可以在Octet内或在工作台上完成。
加载：
·在加载前，将尖头在1x KB中建立基线1分钟。
·AHC尖头以1μg/mL(～7nM)的浓度加载抗体3分钟。设置限制以便在任何一个传感器达到1纳米的响应时停止加载。
·尖头在加载后在缓冲液中建立基线1分钟。在此期间，抗体不应从尖头解离。
抗原缔合：
·与各种呈递分子复合的TGFβ1以100nM的单一浓度在1x KB中与固定化抗体相缔合。
抗体解离：
·1x KB中的解离进行了3分钟。
使用ForteBio数据分析软件8.2进行数据分析：
·处理：将Y轴与基线的最后5秒对齐，使用与解离对齐执行步间校正，并执行Savitzky-Golay过滤。
·分析：使用1：1拟合模型。拟合是局部的和完全的。(局部表示单独评估每一个抗体，完全表示考虑缔合和解离。)拟合曲线，然后保存报告/导出数据。
结果：
图11呈现了LTBP复合物特异性抗体SR-AB10、SR-AB2和SR-AB13的结合特征和亲和力数据。值得注意的是，SR-AB13结合与proTGFβ1复合的人LTBP1和人LTBP3，而SR-AB2和SR-AB10对与TGFβ1复合的人LTBP1具有特异性。
实施例7：优化的LTBP复合物特异性抗体的效力提高
选择LTBP复合物特异性抗体SR-AB10和SR-AB13用于初始轮的亲和力成熟/优化(即，如本文所述的H1/H2 CDR改组/多样化)，和使用LN229细胞评估特定的后代抗体(SR-AB14和SR-AB15)的抑制TGFβ活性的能力。对于图12A和12B中描述的分析，使用了以下方案，其是实施例2中分析II的修改版本。
材料：
·MvLu1-CAGA12细胞(克隆4A4)
·LN229细胞系(高水平的内源性αVβ8整联蛋白)
·Costar白壁TC处理的96孔分析板#3903
·Greiner Bio-One高结合白色μclear 96孔分析板#655094
·人纤连蛋白(Corning#354008)
·P200多道移液器
·P20、P200和P1000移液器，各自带有无菌过滤头
·无菌离心管和架
·无菌试剂容器
·0.4％台盼蓝
·2mL、5mL、10mL和25mL无菌移液器
·组织培养物处理的100毫米或150毫米平板
·70％乙醇
·Opti-MEM还原性血清培养基(Life Tech#31985-070)
·Lipofectamine3000(Life Tech#L3000015)
·Bright-Glo荧光素酶检测试剂(Promega#E2620)
·0.25％胰蛋白酶+0.53mM EDTA
·proTGFb1表达质粒，人类
·LTBP1S表达质粒，人类
设备：
·PerkinElmer EnVision读板仪
·TC柜
·台式离心机
·CO2培养箱37℃，5％CO2
·37℃水/珠浴
·振荡摇床
·显微镜
·血细胞计数器/countess
定义：
·CAGA12 4A4细胞：MvLu1细胞(貂肺上皮细胞)的衍生物，使用CAGA12合成启动子稳定转染，驱动荧光素酶基因表达
·DMEM-0.1％BSA：分析培养基；基础培养基为DMEM(Gibco目录号11995-065)，培养基还含有稀释至0.1％w/v的BSA、青霉素/链霉素和4mM谷氨酰胺
·D10：DMEM 10％FBS、P/S、4mM谷氨酰胺、1％NEAA、1XGlutaMAX(Gibco目录号35050061)
·CAGA12(4A4)培养基：D10+0.75ug/mL嘌呤霉素
过程：
·始终在无菌生物安全柜中工作，并应始终使用无菌技术。
·在开始前准备所有培养基，对所有材料进行消毒，并将材料移入生物安全柜。
·生长培养基应加热至37℃。
·在此分析过程中，几乎所有步骤都使用反向移液技术。
·依赖于proTGFβ1的LTBP呈递的分析需要在接种细胞进行转染之前用纤连蛋白预涂覆分析板4小时-过夜。
在第-1天，用纤连蛋白涂覆分析板。在超纯水(无菌)中制备1mg/ml的纤连蛋白储备溶液。将储备溶液在PBS中稀释至19.2μg/ml的工作溶液，和每孔加入50μl(3μg/cm2)。平板在37℃和5％CO2下孵育过夜。
在第0天，在细胞接种之前，用纤连蛋白涂覆分析板(仅LTBP过表达分析)。在超纯水(无菌)中制备1mg/ml的纤连蛋白储备溶液。将储备溶液在PBS中稀释至19.2μg/ml的工作溶液，并向每一孔加入50μl(3μg/cm2)。平板在37℃和5％CO2下孵育4小时。涂覆后，用多通道移液管手动洗涤分析板，以200μl/孔PBS洗涤2次。最后洗涤后，将板除去盖在柜中干燥。然后用胰蛋白酶分离LN229细胞并沉淀(以200xg旋转5分钟)。将细胞沉淀重新悬浮在D10培养基中，并计数每毫升的活细胞。将细胞稀释至0.125e6个细胞/ml，并以每孔100μl(每孔12,500个细胞)接种在分析板中。对于用于第2天分析的CAGA12细胞，将细胞以每个T75烧瓶150万的密度传代。培养物在37℃和5％CO2下孵育。
在第1天，LN229细胞被转染。按照制造商的方案使用Lipofectamine 3000试剂进行转染。简而言之，将以下稀释到OptiMEM I中，每孔5μl：0.1μg DNA(proTGFβ1)，任选地0.1μg LTBP1 DNA，0.4μl P3000，以及使用OptiMEM I至5μl。对于图12A，0.1μg proTGFβ1(人)DNA单独转染，没有LTBP DNA，以测量在内源性呈递分子存在下的激活。对于图12B，将0.1μgLTBP1(人)DNA与proTGFβ1(人)DNA共转染，以测量过表达LTBP1存在下的激活。
Lipofectamine3000的主混合物是通过每孔在OptiMEM I中稀释0.2μlLipofectamine3000制备的，在OptiMEM I中至5μl。将稀释的Lipofectamine3000添加到DNA混合物中，通过移液充分混合，并在室温下孵育15分钟。孵育后，将10μl的DNA：Lipofectamine3000(2x5μl)混合物加入到每个孔中。将板放回组织培养箱中约24小时。
在第2天，将指定的抗体和TGFβ报告细胞(CAGA12)加入孔中。将抗体连续稀释到PBS中，然后进一步稀释到分析培养基中，直至2x终浓度。通过抽吸(真空抽吸器)用分析培养基洗涤板两次，然后每孔加入100μl分析培养基。第二次洗涤后，每孔用50μl 2X抗体替换分析培养基。将细胞板放回培养箱中约15-20分钟。用胰蛋白酶分离CAGA12(克隆4A4)细胞并沉淀(以200x g离心5分钟)。将沉淀重悬于分析培养基中并计数活细胞。活细胞稀释至0.3e6个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔15,000个细胞)。将细胞放回培养箱。
在第3天，在添加抗体和/或报告细胞后约16-20小时读取分析。使Bright-Glo试剂和测试板在读取前达到室温。BioTek Synergy H1上的读取设置被设置为使用TMLC_std方案-此方法具有自动增益设置。阳性对照孔设置为自动标定(高)。每孔加入100μL的Bright-Glo试剂。室温下振荡孵育2分钟，板避光保护。然后在读板仪上检测发光。
结果：
该分析产生的数据反映了细胞上清液中的TGFβ活性。图12A是显示如通过TGFβ活性测量的SR-AB14(优化的SR-AB10)的提高的效力的图。值得注意的是，SR-AB14的活性类似于非情境依赖性抗体SR-AB1。该分析是在没有过表达LTBP1的情况下进行的，因此测量了在内源性呈递分子存在下TGFβ的激活。图12B是显示如通过TGFβ活性测量的SR-AB15(优化的SR-AB13)的提高的效力的图。在过表达的人LTBP1-proTGFβ1存在下进行该分析。值得注意的是，SR-AB14的活性类似于非情境依赖性抗体SR-AB1。
图12A和12B中描述的分析均在LN229细胞中进行，其表达低LTBP1 mRNA、高LTBP3mRNA、不可检测的GARP和不可检测的LRRC33。
实施例8：CDR-H3诱变后优化的LTBP-proTGFβ1特异性抗体的亲和力提高
选择来自第一轮亲和力成熟/优化的LTBP复合物特异性抗体(SR-AB14、SR-AB16、SR-AB17、SR-AB18、SR-AB19)用于第二轮亲和力成熟/优化(即，如本文所述的CDR-H3诱变)和评估特定的后代抗体(SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28和SR-AB29)结合各种proTGFβ1构建体的能力。通过Octet针对人LTBP1-proTGFβ1、人LTBP3-proTGFb1、小鼠LTBP1-proTGFβ1、小鼠LTBP3-proTGFb1和GARP-proTGFβ1复合物测量优化抗体的结合亲和力，基本上如实施例6中所述。简而言之，将测试抗体固定在抗人Fc捕获生物传感器(AHC)
Figure BDA0003288375730002962
的表面，然后以100nM的单一浓度测试针对各种TGFβ1复合物的结合，以评估结合亲和力。使抗原结合3分钟，然后解离5分钟。在整个实验过程中使用动力学缓冲液
Figure BDA0003288375730002963
，并使用1：1以合模型测定每一个抗体抗原对的KD。
表8提供了由Octet测定的指定LTBP复合物特异性抗体(IgG1-agly)的结合特征和亲和力数据。值得注意的是，优化的抗体SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28和SR-AB29对与proTGFβ1复合的人LTBP1和人LTBP3显示个位数nM的亲和力。此外，没有抗体结合与proTGFβ1复合的人GARP，表明这些抗体对LTBP复合物具有特异性。
表8：
Figure BDA0003288375730002961
P.F.＝不良拟合
N.B.＝在本分析条件下非结合物
实施例9：轻链优化循环3后优化的LTBP复合物特异性抗体的亲和力提高
选择来自第二轮亲和力成熟/优化的LTBP复合物特异性抗体用于第三轮亲和力成熟/优化(即，如本文所述的轻链优化)，并评估特定子代抗体结合各种proTGFβ1构建体的能力。
通过在整个轻链CDR3中进行诱变和对轻链CDR1和CDR2进行预制序列的改组来产生循环3抗体。通过酵母展示利用正向和负向选择然后测序鉴定目的抗体。
通过Octet针对人LTBP1-proTGFβ1、人LTBP3-proTGFβ1、小鼠LTBP1-proTGFβ1、小鼠LTBP3-proTGFβ1和GARP-proTGFβ1复合物测量优化抗体的结合亲和力，基本上如实施例6中所述。简而言之，将测试抗体固定在抗人Fc捕获生物传感器(AHC)
Figure BDA0003288375730002971
的表面，然后以100nM的单一浓度测试针对各种TGFβ1复合物的结合，以评估结合亲和力。使抗原结合3分钟，然后解离5分钟。在整个实验过程中使用动力学缓冲液
Figure BDA0003288375730002972
并使用1：1拟合模型测定每一个抗体抗原对的KD。
表9提供了从轻链优化循环3鉴定的指定LTBP复合物特异性抗体(IgGl-agly)的结合特征和亲和力数据，通过Octet测定的。值得注意的是，几种优化的抗体对人LTBP1和人LTBP3复合的proTGFβ1都显示出个位数nM的亲和力。此外，如表10所示，在相同的分析条件下，几种抗体不结合与proTGFβ1复合的人GARP，表明这些抗体对LTBP复合物具有特异性。
Figure BDA0003288375730002981
表10：
Figure BDA0003288375730002991
N.B.＝在本分析条件下的非结合物
图15表明亲和力成熟的抗体显示与LTBP-proTGFβ1复合物的特异性结合。该实验在200、100、50和25nM人GARPproTGFb1和人LTBP1proTGFb1下进行。图15显示了200nM值，其中0.1nm截止值用于确定什么是有意义的结合和什么不是有意义的结合。如图15所示，对于某些抗体，与GARP-proTGFβ1的结合仅在非常高的浓度(200nM)下才有意义，而某些抗体即使在如此高的浓度下也不显示与GARP-proTGFβ1的结合。
基于表面等离子体共振(SPR)的分析
使用Biacore 8K系统来测定受测试抗体的抗原结合的单价结合亲和力和动力学参数。测定了Fab片段SR-AB42-HuFab、SR-AB63-HuFab和SR-AB43-HuFab与抗原复合物的解合和解离动力学，并在下面提供了所得的ka、kd和KD。简而言之，使用Biacore8K(GEHealthcare)通过表面等离子体共振评估结合动力学。生物素化的捕获抗原被固定在芯片上(10nM，～200RU负载)。生物素捕获(Biotin CAPture)传感器芯片用于捕获生物素化抗原。将10、5、2.5、1.25和0.6nM浓度的Fab注射到捕获的抗原上。0nM用作参考。使用较高浓度的Fab(100、50、25、12.5、6.25nM)证实了LTBP抗体对GARP和LRRC33的亲和力。0nM用作参考。采用多循环动力学，其中每一个分析物浓度在单独的循环中注射，并且在每一个循环后再生传感器芯片表面。所有分析均在新鲜制备的1xHBS-EP+缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween20，pH 7.4)中进行。将数据全局拟合于1：1结合模型以获得动力学参数。0nM分析物浓度的传感图用作参考。
结果显示在下表11-15中。图23和图24分别表明SR-AB63和SR-AB42人Fab显示针对huLTBP1 proTGFβ1和huLTBP3 proTGFβ1的新型抗体的情境选择性结合。
表11
Figure BDA0003288375730003001
Figure BDA0003288375730003011
*五次重复实验的平均值
**四次重复实验的平均值
表12
Figure BDA0003288375730003012
表13
Figure BDA0003288375730003013
表14
Figure BDA0003288375730003014
表15
Figure BDA0003288375730003015
*两次重复实验的平均值
实施例10：CDR-H3诱变后优化的LTBP复合物特异性抗体的效力提高
选择来自第一轮亲和力成熟/优化的LTBP复合物特异性抗体(即SR-AB14、SR-AB16、SR-AB17、SR-AB18、SR-AB19)用于第二轮亲和力成熟/优化(即本文所述的CDR-H3诱变)和使用LN229细胞评估特定的后代抗体(SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28和SR-AB29)抑制TGFβ活性的能力。对于图13A、13B、14A和14B中描述的分析，使用了以下方案，它是实施例2中分析II的修改版本。
材料：
·MvLu1-CAGA12细胞(克隆4A4)
·LN229细胞系(高水平的内源性αVβ8整联蛋白)
·Costar白壁TC处理的96孔分析板#3903
·Greiner Bio-One高结合白色μclear 96孔分析板#655094
·人纤连蛋白(Corning#354008)
·P200多道移液器
·P20、P200和P1000移液器，各自带有无菌过滤头
·无菌离心管和架
·无菌试剂容器
·0.4％台盼蓝
·2mL、5mL、10mL和25mL无菌移液器
·组织培养物处理的100毫米或150毫米平板
·70％乙醇
·Opti-MEM还原性血清培养基(Life Tech#31985-070)
·Lipofectamine 3000(Life Tech#L3000015)
·Bright-Glo荧光素酶检测试剂(Promega#E2620)
·0.25％胰蛋白酶+0.53mM EDTA
·proTGFb1表达质粒，人
·proTGFb1表达质粒，小鼠
·LTBP1S表达质粒，小鼠
设备：
·PerkinElmer EnVision读板仪
·TC柜
·台式离心机
·CO2培养箱37℃，5％CO2
·37℃水/珠浴
·振荡摇床
·显微镜
·血球计数器/countess
定义：
·CAGA12 4A4细胞：MvLu1细胞(貂肺上皮细胞)的衍生物，其使用CAGA12合成启动子稳定转染，驱动荧光素酶基因表达
·DMEM-0.1％BSA：测定培养基；基础培养基为DMEM(Gibco目录号11995-065)，培养基还含有稀释至0.1％w/v的BSA、青霉素/链霉素和4mM谷氨酰胺
·D10：DMEM 10％FBS、P/S、4mM谷氨酰胺、1％NEAA、1XGlutaMAX(Gibco目录号35050061)
·CAGA12(4A4)培养基：D10+0.75ug/mL嘌呤霉素
过程：
·始终在无菌生物安全柜中工作，并应始终使用无菌技术。
·在开始前准备所有培养基，对所有材料进行消毒，并将材料移入生物安全柜。生长培养基应加热至37℃。
·在此分析过程中，几乎所有步骤都使用反向移液技术。
在第0天，在细胞接种之前，用纤连蛋白涂覆分析板(仅LTBP过表达测定)。在超纯水(无菌)中制备1mg/ml的纤连蛋白储备溶液。将储备溶液在PBS中稀释至19.2ug/ml的工作溶液，并向每一孔加入50μl(3ug/cm2)。平板在37℃和5％CO2下孵育4小时。涂覆后，用多通道移液管手动洗涤分析板，用200ul/孔PBS洗涤2次。最后洗涤后，将板移除盖在柜中干燥。然后用胰蛋白酶分离LN229细胞并沉淀(以200xg旋转5分钟)。将细胞沉淀重新悬浮在D10培养基中，并计数每毫升的活细胞。将细胞稀释至0.125e6个细胞/ml，并以每孔100μl(每孔12,500个细胞)接种在分析板中。对于第2天用于分析的CAGA12细胞，将细胞以每个T75烧瓶150万个的密度传代。培养物在37℃和5％CO2下孵育。
在第1天，LN229细胞被转染。按照制造商的方案使用Lipofectamine 3000试剂进行转染。简而言之，将以下稀释到OptiMEM I中，每孔5μl：0.1μg proTGFβ1DNA与0.1μg呈递分子DNA和0.4μlP3000合并，使用OptiMEM I至5μl。对于图13A和图14A，0.1μg人proTGFβ1DNA与0.1ug空载体一起转染，而无LTBP DNA，以测量存在内源性呈递分子时的激活。对于图13B和图14B，将0.1μg小鼠LTBP1 DNA与小鼠proTGFβ1DNA共转染以测量过表达LTBP1存在下的激活。
Lipofectamine3000的主混合物是通过每孔在OptiMEM I中稀释0.2μlLipofectamine3000制备的，在OptiMEM I中至5μl。将稀释的Lipofectamine3000添加到DNA混合物中，通过移液充分混合，并在室温下孵育15分钟。孵育后，将10uμl DNA：Lipofectamine3000(2x5μl)混合物加入到每个孔中。将板放回组织培养箱中约24小时。
在第2天，将指定的抗体和TGFβ报告细胞(CAGA12)加入孔中。将抗体连续稀释到PBS中，然后进一步稀释到测定培养基中，直至2x终浓度。通过抽吸(真空抽吸器)然后每孔加入100μl分析培养基，用分析培养基洗涤板两次。第二次洗涤后，每孔用50μl 2X抗体替换分析培养基。将细胞板放回培养箱中约15-20分钟。用胰蛋白酶分离CAGA12(克隆4A4)细胞并沉淀(以200x g离心5分钟)。将沉淀重悬于分析培养基中并计数活细胞。活细胞稀释至0.3e6个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔15,000个细胞)。将细胞返回培养箱。
在第3天，在添加抗体和/或报告细胞后约16-20小时读取分析。使Bright-Glo试剂和测试板在读取前达到室温。每孔加入100μLBright-Glo试剂。室温振荡孵育2分钟，板避光保护。然后在读板仪上检测发光。
结果：
该分析产生的数据反映了细胞上清液中的TGFβ活性。图13A和13B是显示如通过TGFβ活性测量的抗体SR-AB20、SR-AB21、SR-AB22和SR-AB23(SR-AB10家族抗体)的提高的效力的图。图13A分析是在没有过表达LTBP1的情况下进行的，和因此测量了在内源性呈递分子存在下的TGFβ激活。图13B分析是用过表达的鼠LTBP1-proTGFβ1进行的。值得注意的是，抗体SR-AB22和SR-AB23在两种分析中都显示出类似于(或大于)非情境依赖性抗体SR-AB1的活性。
图14A和图14B是显示如通过TGFβ活性测量的抗体SR-AB24、SR-AB25、SR-AB26、SR-AB27、SR-AB28和SR-AB29(SR-AB13家族抗体)的提高的效力的图。图14A分析是在没有过表达LTBP1的情况下进行的，和因此测量了在内源性呈递分子存在下的TGFβ激活。图14B分析是用过表达的鼠LTBP1-proTGFβ1进行的。值得注意的是，优化的抗体在LTBP1-proTGFβ1过表达细胞分析中显示出高于非情境依赖性抗体SR-AB1的活性(图14B)。
图13A、图13B、图14A和图14B中描述的分析均在LN229细胞中进行，其表达低LTBP1mRNA、高LTBP3 mRNA、不可检测的GARP和不可检测的LRRC33。
实施例11：轻链诱变后优化的LTBP复合物特异性抗体的效力提高
使用LN229细胞评估来自第三和第四轮亲和力成熟/优化的LTBP复合物特异性抗体抑制TGFβ活性的能力。使用实施例10中描述的方案进行分析。
为了计算抑制效力(IC50)值，原始发光值针对仅用PBS(媒介物)处理的孔进行标准化。使用
Figure BDA0003288375730003063
软件绘制标准化值，并使用3点非线性回归计算值。下表显示了两种不同测定形式中同工型特异性抗体的IC50值(nM)：内源性人LTBP(hLTBP)分析和小鼠LTBP分析(mLTBP)。对于4种不同抗体谱系在两种分析形式中确定IC50值：SR-AB22、SR-AB23、SR-AB24和SR-AB26，如表16-19所示。
表16：SR-AB22谱系
Figure BDA0003288375730003061
表17：SR-AB23谱系
Figure BDA0003288375730003062
表18：SR-AB24谱系
Figure BDA0003288375730003071
表19：SR-AB26谱系
内源性hLTBP mLTBP1
SR-AB1 0.7682 SR-AB63(循环3) 0.2075
SR-AB63(循环3) 1.777 SR-AB64(循环3) 0.2683
SR-AB64(循环3) 3.12 SR-AB26(循环2) 1.172
SR-AB1 4.446 RefAb 1.571
SR-AB13(亲本) 4.825 SR-AB17(循环1) 4.038
SR-AB26(循环2) 8.742 SR-AB1 6.381
SR-AB17(循环1) 24.14 SR-AB 13(亲本) 25.44
该分析产生的数据反映了细胞上清液中的TGFβ活性。如图16所示，LTBP复合物特异性抗体的功能活性(效力)在每一个亲和力成熟循环中提高。如图16所示，亲和力成熟的每一个循环的提高导致活性超过非情境依赖性参考抗体(Ref Ab)，一种有效的潜在TGFβ1非情境依赖性抑制剂。上述分析均在用鼠LTBP1和鼠proTGFβ1瞬时转染的LN229细胞中进行。
对于表20中所示的结果，使用实施例10中描述的方案进行分析，但在该分析中使用Fab。
表20
Figure BDA0003288375730003072
Figure BDA0003288375730003081
实施例12：可开发性
表现出有利生物物理特性的抗体在开发中具有更高的成功率。评估来自第三和第四轮亲和力成熟/优化的LTBP复合物特异性抗体的聚集倾向和多特异性。图17显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，其中显示了SR-AB与杆状病毒(BV)颗粒的结合。图18显示了亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)分析的结果。该分析测试抗体与其自身相互作用的可能性。它使用涂有抗Fc抗体的金纳米颗粒。当加入抗体稀溶液时，它们迅速地变成固定在Fc涂覆的金珠上。如果这些抗体随后彼此相互作用，则会导致较短的原子间距离和可通过光谱检测的等离子体波长增加。
这些结果表明，候选抗体表现出有利的可开发性，如AC-SINS分析中小于5nM的等离子体位移和小于阴性对照5倍的BV ELISA信号所证明的。
实施例13：LTBP复合物特异性抗体在小鼠胆碱缺乏高脂肪饮食(CDHFD)的NASH模 型中抑制TGFβ信号传导
缺乏胆碱的高脂肪饮食(CDHFD)是一种已建立的饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型。在该模型中，向雄性C57BL/6J小鼠喂食缺乏胆碱的、0.1％蛋氨酸、高脂肪饮食12周。CDHFD开始后三到六周，可以通过α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(肝星状细胞激活的标志物)的表达增加和组织羟脯氨酸含量升高(其反映增加的胶原蛋白合成和沉积)来检测促纤维化过程的激活(Matsumoto等，Int JExp Pathol.2013Apr；94(2)：93-103)。
如下在CDHFD模型中测试LTBP复合物特异性抗体抑制和/或降低小鼠肝纤维化程度的能力。研究概要如下表21所示。
表21
Figure BDA0003288375730003091
测试组中的动物在研究期间接受CDHFD。给单独的一个群组小鼠(第1组)施用常规食物作为研究对照。通过在CDHFD开始后4周开始的腹膜内(i.p.)注射向小鼠施用抗体SR-AB42和SR-AB31。动物以抗体测试浓度15mg/kg每周两次(即30mg/kg/周)给药，共8周测试持续时间(即第4周至第12周)。将小鼠IgG1同种型抗体以15mg/kg每周两次(即30mg/kg/周)用作阴性对照。Ref Ab被用作参考抗体，因为它是一种有效的非情境依赖性TGFβ1抑制剂。给药8周后，处死动物并收集肝脏用于分析。终点读数是羟脯氨酸含量。
CDHFD肝纤维化模型中的羟脯氨酸含量
羟脯氨酸由氨基酸脯氨酸的羟基化产生，是纤维状胶原蛋白主要成分的标志性氨基酸，且约占蛋白质的13.5％。羟脯氨酸用作纤维化严重程度的重要诊断指标。喂食CDHFD的动物表现出肝组织中羟脯氨酸(HYP)的增加。如图19所示，用SR-AB42和SR-AB31处理抑制了喂食CDHFD的动物肝组织中HYP(μg/mg组织)的增加。
实施例14：Alport综合征遗传模型中LTBP复合物特异性抗体对TGFβ信号传导的抑 制
鼠Col4a3-/-模型是常染色体隐性Alport综合征的已建立遗传模型。Alport小鼠缺乏功能性胶原蛋白4A3基因(Co14A3-/-)，并因此无法形成需要α3、α4和α5链的正常IV型胶原蛋白三聚体。C0l4a3-/-小鼠在肾脏中发生纤维化，与人类患者的肾纤维化一致，包含间质纤维化和肾小管萎缩，且Col4a3-/-小鼠在8至30周龄之间发生终末期肾病(ESRD)，取决于小鼠的遗传背景。Col4a3-/-小鼠肾脏病理的结构和功能表现，加上ESRD的进展，使Col4a3-/-小鼠成为了解肾纤维化的理想模型。先前的报告指出了TGFβ信号传导通路在该过程中的重要性，且据报道，使用αVβ6整联蛋白抑制剂(一种已知的TGFβ1和TGFβ3激活剂)或TGFβ配体陷阱治疗防止Alport小鼠的肾纤维化和炎症(Hahm等，(2007)The AmericanJournal of Pathology，170(1)：110-125、)。
如下测试LTBP复合物特异性抗体抑制和/或减少Alport小鼠肾纤维化的能力。该研究的概要如下表22所示。
表22
Figure BDA0003288375730003101
来自129/Sv遗传背景的Col4a3+/-雄性与C57BL/6遗传背景的Col4a3+/-雌性杂交的F1后代被用于研究。这些小鼠通常在4-5周大时表现出蛋白尿，和通常在13-15周大时进展为ESRD，从而为测试治疗效果提供了良好的治疗窗口。11周龄Col4a3-/-小鼠在动物处死和肾脏收集前48小时腹膜内(i.p.)给药30mg/kg的SR-AB42和SR-AB63。Ref Ab被用作参考抗体，因为它是一种有效的TGFβ1激活的非情境依赖性抑制剂。
Alport肾脏模型中的pSMAD分析
有充分证据表明，TGFβ受体激活导致细胞内事件的下游信号传导级联，包含Smad2/3的磷酸化。因此，如根据制造商的说明，如通过ELISA(Cell SignalingTechnologies)测定的，通过测量Smad2/3的相对磷酸化水平在肾脏裂解物样品中评估SR-AB42和SR-AB63处理抑制TGFβ信号传导的能力。图20A是显示Alport小鼠模型中磷酸化与总的(磷酸化的和未磷酸化的)Smad2/3(pSMAD2/3：tSMAD2/3)的相对比率的图。图20B是显示通过ELISA测定的磷酸化的SMAD2/3(pSMAD2/3)的量的图，和图20C是显示通过ELISA测定的总SMAD2/2(tSMAD2/3)蛋白的量的图。如图20B和图20C所示，pSMAD的减少正造成图20A所示比率的变化。单剂量的SR-AB42或SR-AB63足以显著抑制整个肾脏裂解物中的pSmad2/3信号传导，证明SR-AB42和SR-AB63的有效靶标接合，并且Alport模型中的LTBP复合物特异性抑制降低了pSmad水平。
实施例15.proTGβ1C4S结合的测定
使用一种修饰的proTGFβ1复合物(proTGFβ1C4S)通过Octet来评估抗体与C4S抗原的结合，其中前结构域第4位的半胱氨酸残基已被丝氨酸残基置换(描述于WO 2014/182676)。循环2抗体固定并针对3种抗原进行测试。如下表所示，观察到与LTBP-1proTGFβ1抗原(表23)和proTGFβ1C4S抗原的稳定抗体结合(表24)，而未观察到与LRRC33proTGFβ1抗原的结合(表25)。
表23：与人LTBP-1proTGFb1的结合
样品ID 加载样品ID 响应(nm)
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB14 0.3197
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB20 0.4132
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB21 0.3196
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB22 0.4317
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB23 0.3449
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB17 0.3036
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB24 0.3796
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB25 0.3085
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB26 0.2953
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB27 0.3717
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB28 0.4046
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB29 0.3242
人LTBP-1proTGFb1 HuNeg -0.0007
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB16 0.2594
人LTBP-1proTGFb1 SR-AB1 0.4311
表24：与人TGFb1 C4S的结合
Figure BDA0003288375730003121
Figure BDA0003288375730003131
表25：与人LRRC33 proTGFb1的结合
样品ID 加载样品ID 响应(nm)
人LRRC33 prOTGFb1 SR-AB14 0.03
人LRRC33proTGFb1 SR-AB20 0.0894
人LRRC33proTGFb1 SR-AB21 0.0141
人LRRC33proTGFb 1 SR-AB22 0.1329
人LRRC33proTGFb 1 SR-AB23 0.0233
人LRRC33proTGFb1 SR-AB17 0.0043
人LRRC33proTGFb1 SR-AB24 0.0394
人LRRC33proTGFb1 SR-AB25 0.024
人LRRC33proTGFb1 SR-AB26 0.0208
人LRRC33prOTGFb1 SR-AB27 0.0317
人LRRC33proTGFb1 SR-AB28 0.037
人LRRC33proTGFb1 SR-AB29 0.0288
人LRRC33proTGFb1 HuNeg 0.0023
人LRRC33proTGFb1 SR-AB16 0.0161
人LRRC33proTGFb 1 SR-AB1 0.4006
实施例16.循环3先导抗体在TGFβ3分析中未显示抑制
图21是显示先导循环3抗体在LTBP-TGFβ3分析中没有显示抑制的图。类似于实施例10中的分析进行TGFβ3分析，但转染proTGFβ3而不是proTGFβ1。没有转染LTBP构建体，因为该分析依赖于LN229细胞系中的内源性呈递分子。
实施例17：TGFβ3-选择性激活抑制剂在肝纤维化模型中的促纤维化作用
肝脏表达TGFβ1和TGFβ3。为了研究在CDHFD模型中抑制两种同工型是否会进一步减轻肝脏纤维化，用有效的TGFβ1选择性激活抑制剂(其在人LTB P1和LTBP3复合物的情境下抑制TGFβ1的激活)和TGFβ3-选择性激活抑制剂单独地或组合治疗CDHFD小鼠。在用TGFβ3抑制剂治疗的小鼠中，观察到疾病恶化，如PSR分析和另外的组织病理学分析所证明的(图22)。在第12周，例如，研究结束时，与IgG处理的动物(阴性对照)相比，接受TGFβ1选择性激活抑制剂的动物显示出明显更少的纤维化。相比之下，用TGFβ3选择性抑制剂治疗的动物表现出明显更多的纤维化，PSR阳性面积约为12％。接受TGFβ3选择性抑制剂和TGFβ1选择性抑制剂组合的动物表现出中等水平的纤维化，表明TGFβ 1选择性激活抑制剂的抗纤维化作用正在被TGFβ3抑制减轻。
实施例18：轻链优化循环4后优化的LTBP复合物特异性抗体的亲和力提高
选择来自第三轮亲和力成熟/优化的LTBP复合物特异性抗体用于第四轮亲和力成熟/优化(即，如本文所述的轻链优化)，并且评估特定子代抗体对各种proTGFβ1构建体的结合能力。
材料：
·96孔板-Greiner Bio-one REF650101
·微孔板Foils-GE Healthcare-CAT#28-9758-16
·生物素捕获试剂盒GE Healthcare产品编号28920233
·Biacore运行缓冲液-以20x溶液提供，在Milli-Q水中稀释，TEKnova CAT#H8022
方法：
使用Biacore 8K用“使用生物素捕获试剂盒的多循环动力学/亲和力”方法进行这些实验。
将数据收集速率设置为10Hz，并将生物素捕获步骤以2μL/分钟的流速执行300秒。在1x Biacore运行缓冲液中1：5稀释后使用生物素捕获试剂。以10nM的浓度使用生物素化配体(TGFβ1的各种复合物)，并以10μL/分钟的流速固定在传感器芯片上180秒。分析物(每一个Fab)在10、5、2.5、1.25和0.625nM下进行测试，包含0nM对照。分析物接触时间为120秒，解离时间为900秒。使用的再生循环为120秒，流速为10μL/分钟。
使用的评估方法是“使用捕获的多循环亲和力”，并使用1∶1结合模型。对于针对给定生物素化抗原测试的每个Fab，将Rmax设置为等于参考Ab的亲和力成熟形式的Rmax，其具有显著较低的结合解离速率并因此在同一实验中具有与相同抗原结合的更高亲和力。每次KD测定使用全局拟合。KD值显示在下表26中。
表26
Figure BDA0003288375730003151
表27显示了单价半结合时间(T1/2)。对于hLTBP1-proTGFβ1和hLTBP3-proTGFβ1复合物中的每一种，其单价半结合时间(T1/2)值至少为45分钟。对于hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物中的每一种，其单价T1/2值都小于5分钟，如通过SPR测量的。
表27：单价半结合时间(T1/2)
LTBP-SR-AB42HuFab KD(nM) T<sub>1/2</sub>结合
Hu LTBP1-ProTGFβ1 0.38 1.7小时
Hu LTBP3-ProTGFβ1 0.57 1.7小时
Hu GARP-ProTGFβ1 144 1.9分钟
Hu LRRC33-ProTGFβ1 134 4.3分钟
Mu LTBP1-ProTGFβ1 0.6 1.1小时
Mu LTBP3-ProTGFβ1 0.68 1.2小时
Mu GARP-ProTGFβ1 29 5.1分钟
鼠LRRC33-ProTGFβ1 110 7.4分钟
实施方式
本发明包含各种实施方式。下面列出了非限制性实例：
1.一种抗体或其抗原结合片段，包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是，任选地：
i.SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；
v.SEQ ID NO：94的第7位的脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；
vi.SEQ ID NO：94的第8位的异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或，
vii.SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：95，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：96，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：97，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：98，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：99，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
2.根据实施方式1的抗体或其抗原结合片段，包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中任选地：X1是S或R；X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG的CDR-H2，其中任选地：X1是V或S；X2是S或G；和X3是F或L；和
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、V、G或K；X3是R、H或L；X4是I、V或G；X5是A、S或L；X6是A或V；X7是F或Y；X8是D、G、R或S；和X9是Y、G、R、L、V、A或K。
d)如SEQ ID NO：97所示的CDR-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
f)如SEQ ID NO：99中所示的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
3.根据实施方式2的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)在CDR-H2内；X2是S；和
b)在CDR-H3内；X1是A；X2是R或V；X3是R；X4是I；X5是A或L；X6是A；X7是F；X8是G；和X9是Y。
3.1根据实施方式3的抗体或其抗原结合片段，其中CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的一个或多个通过CDR多样化和/或诱变进行亲和力成熟和/或优化。
4.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：SEQ ID NO：88至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和/或，
其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列的可变轻链可变区。
5.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
具有与SEQ ID NO：88至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
6.一种抗体或其抗原结合片段，包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是，任选地：
i.SEQ ID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换；和/或，
iii.SEQ ID NO：100的第11位甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：101，条件是，任选地：
i.SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：101的第6位甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换；和/或，
iii.SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：102，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
7.根据实施方式6的抗体或其抗原结合片段，包含以下六个CDR中的至少三个：
g)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S或P；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V；
h)包含氨基酸序列SISYSA(X1)TYYNPSLKS的CDR-H2，其中任选地，X1是S或T；
i)包含氨基酸序列(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)的CDR-H3，其中任选地：X1是A或V；X2是R、S或G；X3是P、Y、R、V、I、H、T或E；X4是S、D、E或N；X5是D、A或T；X6是S、G、T或A；X7是I、A、R、Q或V；X8是A、E、K、G或T；X9是M或I；X10是D、L、Q、V、N或G；和X11是V、R、N、E或K；
j)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
k)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和
l)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
8.根据实施方式7的抗体或其抗原结合片段，其中：
g)在CDR-H1内：X2是H或R；X3是S；和X4是G、I或N；和
h)在CDR-H3内：X1是A；X3是P或V；X4是S；X5是D；X6是S或A；X7是A、R、I或V；X8是A；X9是M；X10是D、Q或G；和X11是V或R。
8.1根据实施方式8的抗体或其抗原结合片段，其中CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的一个或多个通过CDR多样化和/或诱变进行亲和力成熟和/或优化。
9.根据实施方式6-8.1中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含至少三个选自以下的CDR，对于每一个CDR任选地包含一个或多个氨基酸变化：
CDR-H1：SEQ ID NO：100；
CDR-H2：SEQ ID NO：101；
CDR-H3：SEQ ID NO：102；
CDR-L1：SEQ ID NO：103；
CDR-L2：SEQ ID NO：104；和，
CDR-L3：SEQ ID NO：105。
10.根据实施方式6-9之一的抗体或其抗原结合片段，包含可变重链区和可变轻链区，其中：
i)可变重链区包含与SEQ ID NO：SEQ ID NO：106至少90％相同的氨基酸序列；和/或，
ii)可变轻链可变区包含与SEQ ID NO：107至少90％相同的氨基酸序列。
11.根据实施方式6-9之一的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
i)具有与SEQ ID NO：106至少90％相同的氨基酸序列的可变重链区；和，
ii)具有与SEQ ID NO：107至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
12.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含所有六个CDR。
12.1根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含一个氨基酸变化。
12.2根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含最多两个氨基酸变化。
12.3根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含最多三个氨基酸变化。
12.4根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含最多四个氨基酸变化。
12.5根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含最多五个氨基酸变化。
12.6根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含最多六个氨基酸变化。
12.7根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸变化包含最多七个氨基酸变化。
12.8根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中任何一个CDR不包含氨基酸变化。
13.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物。
14.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP3-proTGFβ复合物。
15.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合人GARP-proTGFβ复合物。
16.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ复合物。
17.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3。
18.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是全人的或人源化的抗体。
19.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是分离的抗体或其抗原结合片段。
20.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不与抗体SR-Ab1、SR-Ab2或SR-Ab13中的任一种竞争结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
21.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不与抗体SR-Ab1、SR-Ab2或SR-Ab10中的任一种竞争结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
22.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG4或IgG1亚型。
23.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对人LTBP1-TGFβ1复合物具有特异性。
24.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对人LTBP3-TGFβ1复合物具有特异性。
25.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物具有特异性。
26.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体不结合人GARP-TGFβ1复合物或GARP-TGFβ3复合物。
27.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<50nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
28.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<50nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
29.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
30.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。
31.根据实施方式27-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。
32.根据实施方式27-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。
33.根据实施方式27-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与小鼠LTBP1-proTGFβ1和小鼠LTBP3-proTGFβ1两者都交叉反应。
34.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物。
35.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<50nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
36.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物。
37.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
38.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是同工型特异性的，因为其选择性结合并抑制与LTBP1/3相关的TGFβ1的激活。
39.根据实施方式38所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不结合GARP-TGFβ1。
40.一种抗体或其抗原结合片段，包含以下六个CDR：
a)包含氨基酸序列FTFRSYVMH的CDR-H1；
b)包含氨基酸序列VISHEGS(X1)KYYADSVKG的CDR-H2，其中：X1是L或G；和
c)包含氨基酸序列A(X1)PRIAARRGGFG(X2)的CDR-H3，其中：X1是V、R或L；X2是Y、S或T；
d)包含氨基酸序列TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ的CDR-L1，其中，X1为S或H；X2是N、L、S或A；和X3是N、D或Y；
e)包含氨基酸序列ED(X1)(X2)RPS的CDR-L2，其中：X1是N、F或A；和X2是Q、I或V；和
f)包含氨基酸序列Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV的CDR-L3，其中：X1是S或G；X2是S、F、Y、D、H或W；X3是N、D或S；X4是N、A、L、E或T；和X5是G、R、A或L。
41.根据实施方式40的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-H3内：X1是R或L。
42.根据实施方式41的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X2是Y。
43.根据实施方式42的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X3是D；X4是T。
44.根据实施方式42的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X3是D；X4是N；和X5是A。
45.根据实施方式41的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L1内：X1是S或H；X2是N或A；和X3是N、D或Y；
在CDR-L2内：X1是N或F；和X2是Q或V；和
在CDR-L3内：X1是S或G；X2是S、Y、D或W；X3是D或S；X4是N、L或T；和X5是G、R、A或L。
46.根据实施方式45所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L1内：X1为S；X2是N；和X3是N或Y；
在CDR-L2内：X1为N；X2是Q或V；和
在CDR-L3内：X1是S或G；X2是S、Y或W；X3是D；X4是N或T；X5是G、R或A。
47.根据实施方式46所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X1是S；X2是S或Y；X3是D；X4是N或T；和X5是G、R或A。
48.根据实施方式47所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X1是S；X2是Y；X3是D；X4是N或T；和X5是G或A。
49.根据实施方式48所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X1是S；X2是Y；X3是D；X4是T；和X5是G。
50.根据实施方式45-49中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)CDR-H1包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列；
b)CDR-H2包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列；
c)CDR-H3包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列；
d)CDR-L1包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列；
e)CDR-L2包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列；和
f)CDR-L3包含SEQ ID NO：171的氨基酸序列。
51.根据实施方式40-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含：
具有与SEQ ID NO：318至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：319至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
52.根据实施方式40-51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与具有如SEQID NO：318所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：319所示的轻链可变区序列的抗体竞争或交叉竞争。
53.一种抗体或其抗原结合片段，其选择性地结合人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物并与具有如SEQ ID NO:318所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：319所示的轻链可变区序列的抗体竞争或交叉竞争。
54.一种抗体或其抗原结合片段，包含以下六个CDR：
g)包含氨基酸序列G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)的CDR-H1，其中任选地：X1是S；X2是S、H或R；X3是S或G；和X4是G、I、N或V；
h)包含氨基酸序列SISYS(X1)(X2)TYY的CDR-H2，其中任选地：X1是G或A；和X2是S或T；
i)包含氨基酸序列A(X1)DPSYDS(X2)AGM(X3)V的CDR-H3，其中任选地：X1是R、S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；
j)包含氨基酸序列RAS(X1)(X2)IS(X3)YLN的CDR-L1，其中任选地：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；
k)包含氨基酸序列(X1)AS(X2)(X3)QS的CDR-L2，其中任选地：X1是Y、A或S；X2是S或N；和X3是L或R；
l)包含氨基酸序列QQ(X1)(X2)D(X3)P(X4)T的CDR-L3，其中任选地：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
55.根据实施方式54所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)在CDR-H1内：X1是S；X2是S或R；X3是S；和X4是G；
b)在CDR-H2内：X1是G或A；和X2是S或T；
c)在CDR-H3内：X1是R、S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；
d)在CDR-L1内：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；
e)在CDR-L2内：X1是Y、A或S；X2是S或N；和X3是L或R；和
f)在CDR-L3内：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
56.根据实施方式55所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)CDR-H1包含氨基酸序列GSIRSSSYYWG；
b)CDR-H2包含氨基酸序列SISYSATTYY；
c)在CDR-H3内：X1是S或G；X2是A或I；和X3是D或Q；
d)在CDR-L1内：X1是K或Q；X2是V或S；和X3是S或Y；
e)在CDR-L2内：X1是Y、A或S；X2是S或N；和X3是L或R；和
f)在CDR-L3内：X1是S或G；X2是F或N；X3是W或F；和X4是F或L。
57.根据实施方式56所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
g)CDR-H1包含SEQ ID NO：292的氨基酸序列；
h)CDR-H2包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列；
i)CDR-H3包含SEQ ID NO：294的氨基酸序列；
j)CDR-L1包含SEQ ID NO：295的氨基酸序列；
k)CDR-L2包含SEQ ID NO：296的氨基酸序列；和
l)CDR-L3包含SEQ ID NO：297的氨基酸序列。
58.根据实施方式54-57中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是根据权利要求1-5中任一项所述的抗体。
59.根据实施方式54-58中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
具有与SEQ ID NO：360至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：361至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
60.根据实施方式54-59中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与具有如SEQID NO：360所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：361所示的轻链可变区序列的抗体竞争或交叉竞争。
61.一种抗体或其抗原结合片段，其选择性地结合人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物并与具有如SEQ ID NO:360所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：361所示的轻链可变区序列的抗体竞争或交叉竞争。
62.根据实施方式40-61中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同的分析条件下，如通过BLI测量的，所述抗体或其抗原结合片段没有显示出与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测结合。
63.根据实施方式40-62中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物的KD比在相同的分析条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍。
64.根据实施方式40-63中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同的分析条件下，如通过BLI测量的，所述抗体或其抗原结合片段没有显示出与LRRC33-proTGFβ1复合物的可检测结合。
65.根据实施方式40-64中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如通过SPR测量的，其中所述抗体或其抗原结合片段对于hLTBP1-proTGFβ1和hLTBP3-proTGFβ1复合物中的每一个具有至少45分钟的单价半结合时间(t1/2)。
66.根据实施方式65所述的抗体或其抗原结合片段，如通过SPR测量的，其对于hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物中的每一个具有小于5分钟的单价t1/2。
67.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<5nM，任选地<1nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物。
68.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。
69.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。
70.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物。
71.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。
72.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人和鼠LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1复合物交叉反应，各自具有<5nM，任选地<1nM的KD。
73.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG4或IgG1亚型。
74.根据实施方式73所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人IgG4亚型，其中任选地所述抗体包含Ser至Pro的骨架置换，其产生IgGl样铰链。
75.一种药物组合物，其包含根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
76.根据实施方式75所述的药物组合物，制备其用于静脉内施用或皮下施用。
77.一种组合物，其包含含有实施方式75或76的药物组合物的多剂量小瓶。
78.一种组合物，其包含含有实施方式75或76的药物组合物的单剂量注射器，任选地其中所述注射器是一次性注射器。
79.根据实施方式75或78中任一项所述的组合物，其用于治疗人类受试者的纤维化病症的方法，其中所述治疗包含以有效治疗所述纤维化病症的量向所述受试者施用所述组合物。
80.根据实施方式79使用的组合物，其中所述纤维化病症是器官纤维化。
81.根据实施方式80使用的组合物，其中器官纤维化是晚期器官纤维化。
82.根据实施方式80或81使用的组合物，其中所述器官纤维化选自：
肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、胰腺纤维化、皮肤纤维化、硬皮病、肌肉纤维化、子宫纤维化和子宫内膜异位症。
83.根据实施方式82使用的组合物，其中：
a)该纤维化病症包含慢性炎症；
b)受试者受益于免疫抑制；
c)受试者患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病的风险；
d)受试者是同种异体移植的候选者；和/或，
e)受试者已接受同种异体移植。
84.根据实施方式79使用的组合物，包含慢性炎症的纤维化病症是肌营养不良、多发性硬化(MS)或囊性纤维化(CF)。
85.根据实施方式84使用的组合物，其中肌营养不良症是杜氏肌营养不良症(DMD)。
86.根据实施方式84使用的组合物，其中MS包含血管周围纤维化。
87.根据实施方式82使用的组合物，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。
88.根据实施方式82使用的组合物，其中所述受试者患有慢性肾病(CKD)。
89.根据实施方式82使用的组合物，其中所述受试者患有与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关的肝纤维化。
90.根据实施方式89使用的组合物，其中所述受试者患有与NASH相关的肝硬化或肝细胞癌。
91.根据实施方式90使用的组合物，其中所述受试者患有代谢病症(例如，肥胖症、2型糖尿病)。
92.根据实施方式89-91中任一项使用的组合物，其中所述受试者进一步用肌生长抑制素抑制剂治疗，其中任选地，该肌生长抑制素抑制剂是肌生长抑制素选择性抑制剂，其中进一步任选地，该肌生长抑制素选择性抑制剂是SRK-015、trevogrumab或其任何变体或者根据WO 2016/098357的抗体。
93.根据实施方式79-92中任一项使用的组合物，其中以0.1至30mg/kg之间的剂量向受试者施用所述抗体。
94.根据实施方式93使用的组合物，其中每周两次、每周一次、每两周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每6周一次或每两个月一次施用所述抗体。
95.根据实施方式93使用的组合物，其中治疗方案包含治疗的初始阶段和治疗的后续阶段，
其中受试者在初始阶段接受负荷剂量，随后在后续阶段接受维持剂量。
96.根据实施方式95使用的组合物，其中负荷剂量在2-30mg/kg之间，并且维持剂量在0.1-20mg/kg之间。
97.根据实施方式95或96使用的组合物，其中每周两次、每周一次、每2周一次或每3周一次向受试者施用所述负荷剂量。
98.根据实施方式95-97中任一项使用的组合物，其中每2-12周向受试者施用一次维持剂量。
99.根据实施方式95-97中任一项使用的组合物，其中根据需要向受试者施用维持剂量。
100.根据实施方式79-99中任一项使用的组合物，其中所述方法进一步包含测试或确认从受试者收集的生物样品中TGFβ1、LTBP1或LTBP3的表达。
101.一种制备根据实施方式75-78中任一项所述的组合物的方法，所述组合物包含特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物，并且不结合人GARP-proTGFβ复合物的抗体或其抗原结合片段；其中该抗体或片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，其中该方法包括以下步骤：
i)提供至少一种包含LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的抗原，
ii)选择与步骤(i)的至少一种抗原特异性结合的第一抗体或片段池以提供LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的特异性结合物；
iii)选择抑制TGFβ1激活的第二抗体或片段池，以产生TGFβ1激活的特异性抑制剂；和
iv)将存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或片段配制成药物组合物，
从而制备包含抗体或片段的组合物。
102.如实施方式101所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
从第一抗体或片段池中去除结合GARP-proTGFβ1、LRRC33-proTGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-proTGFβ2、LRRC33-proTGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-proTGFβ3、LRRC33-proTGFβ3、成熟TGFβ3或其任何组合的任何抗体或片段。
103.实施方式101或102的方法，其中该方法还包括以下步骤：
确定或确认在步骤(ii)和/或(iii)中选择的抗体或片段的同工型特异性。
104.根据实施方式101-103中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
选择与人和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或片段。
105.根据实施方式101-104中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
产生第一抗体池和第二抗体池中存在的抗体或片段的完全人的或人源化的抗体或片段。
106.根据实施方式101-105中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
使存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
107.根据实施方式101-106中任一项所述的方法，其中所述亲和力成熟和/或优化包含使所述抗体或其抗原结合片段经受轻链改组的步骤。
108.根据实施方式101-107中任一项所述的方法，其中所述亲和力成熟和/或优化包含使所述抗体或其抗原结合片段经受CDR H1/H2多样化的步骤。
109.根据实施方式101-108中任一项所述的方法，其中所述亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受CDR-H3诱变的步骤。
110.根据实施方式101-109中任一项所述的方法，其中所述亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受轻链CDR诱变的步骤。
111.根据实施方式101-110中任一项所述的方法，其中所述亲和力成熟和/或优化包含使抗体或其抗原结合片段经受轻链CDR L1/L2多样化的步骤。
112.根据实施方式101-111中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含测定抗体或其抗原结合片段对人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的亲和力的步骤。
113.根据实施方式101-112的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>100nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
114.根据实施方式101-113所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>50nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
115.根据实施方式101-114所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>25nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
116.根据实施方式101-115所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>10nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
117.根据实施方式101-116中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含测定来自第一和/或第二抗体池的抗体或其抗原结合片段对小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的亲和力的步骤。
118.根据实施方式117所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>100nM的KD与小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1结合的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
119.根据实施方式117所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>50nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
120.根据实施方式117所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>25nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
121.根据实施方式117所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的>10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
122.根据实施方式101-121中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除不结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的任何抗体或其抗原结合片段的步骤。
123.根据实施方式101-122中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含测定来自第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池的抗体或其抗原结合片段的IC50的步骤，如通过适宜的基于体外细胞的功能性分析测量的。
124.根据实施方式123所述的方法，其中该适宜的基于体外细胞的功能性分析是caga分析。
125.根据实施方式123或124所述的方法，其中该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有>100nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
126.根据实施方式123或124所述的方法，其中该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有>50nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
127.根据实施方式123或124所述的方法，其中该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有>25nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
128.根据实施方式123或124所述的方法，其中该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具有>10nM的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
129.根据实施方式123或124所述的方法，其中该方法包括从第一和/或第二抗体或其抗原结合片段池中去除具>5nM有的IC50的抗体或其抗原结合片段的步骤。
130.根据实施方式124-129中任一项所述的方法，其中所述caga分析是内源性LTBP caga分析。
131.根据实施方式124-129中任一项所述的方法，其中所述caga分析是人LTBP过表达caga分析。
132.根据实施方式124-129中任一项所述的方法，其中所述caga分析是鼠LTBP过表达caga分析。
133.一种制备包含选择性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：
选择相对于免疫细胞相关的TGFβ1优先抑制基质相关的TGFβ1的抗体或其抗原结合片段；
在包含表达抗体的细胞的细胞培养物中产生抗体，其中该细胞培养物具有250L或更大的体积，
任选地进一步包含从细胞培养物中纯化抗体的步骤；和
进一步任选地包含将纯化的抗体配制成药物组合物的步骤。
134.根据133所述的方法，其中所述药物组合物被配制用于皮下施用。
135.根据133所述的方法，其中所述选择步骤进一步包含选择对于人LTBP1-proTGFβ和人LTBP3-proTGFβ复合物中的每一个具有45分钟或更长的t1/2并且任选地对于人GARP-proTGFβ复合物具有5分钟或更少的t1/2的抗体或抗原结合片段，如通过SPR测量的。
136.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：94、(CDR-H2)SEQ ID NO：95和(CDR-H3)SEQ IDNO：96的至少三个重链CDR序列的抗体或片段；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
137.根据实施方式136所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含(CDR-L1)SEQ ID NO：97、(CDR-L2)SEQ ID NO：98和(CDR-L3)SEQ ID NO：99的轻链CDR序列。
138.根据实施方式136或137所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ IDNO：88所示的氨基酸序列的可变重链区。
139.根据实施方式136-138中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列的可变轻链区。
140.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：100、(CDR-H2)SEQ ID NO：101和(CDR-H3)SEQ IDNO：102的至少三个CDR序列的抗体或片段；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
141.如实施方式140的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含(CDR-L1)SEQ ID NO：103、(CDR-L2)SEQ ID NO：104和(CDR-L3)SEQ ID NO：105的轻链CDR序列。
142.根据实施方式140或141所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ IDNO：106所示的氨基酸序列的可变重链区。
143.根据实施方式140-142中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ ID NO：107中所示的氨基酸序列的可变轻链区。
144.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：108、(CDR-H2)SEQ ID NO：109和(CDR-H3)SEQ IDNO:110的至少三个重链CDR序列的抗体或片段，和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
145.根据实施方式144所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含(CDR-L1)SEQ ID NO：111、(CDR-L2)SEQ ID NO：112和(CDR-L3)SEQ ID NO：113的轻链CDR序列。
146.根据实施方式144或145所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ IDNO：114中所示的氨基酸序列的可变重链区。
147.根据实施方式144-146中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的可变轻链区。
148.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：116、(CDR-H2)SEQ ID NO：117和(CDR-H3)SEQ IDNO:118的至少三个重链CDR序列的抗体或片段：和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
149.根据实施方式148所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含(CDR-L1)SEQ ID NO：119、(CDR-L2)SEQ ID NO：120和(CDR-L3)SEQ ID NO：121的轻链CDR序列。
150.根据实施方式148或149所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ IDNO：122所示的氨基酸序列的可变重链区。
151.根据实施方式148-150中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段包含具有如SEQ ID NO：123中所示的氨基酸序列的可变轻链区。
152.根据实施方式136-151中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含轻链改组。
153.根据实施方式136-152中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含CDR-H1/H2多样化。
154.根据实施方式136-153中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含CDR-L1/L2多样化。
155.根据实施方式136-154中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含在CDR、可变区和/或恒定区的任一个内的诱变。
156.根据实施方式155所述的方法，其中所述诱变在CDR内。
157.根据实施方式155和156中任一项所述的方法，其中所述诱变在CDR-H3内。
158.根据实施方式155-157中任一项所述的方法，其中所述诱变在CDR-L1内。
159.根据实施方式155-158中任一项所述的方法，其中所述诱变在CDR-L2内。
160.根据实施方式155-159中任一项所述的方法，其中所述诱变在CDR-L3内。
161.根据实施方式155所述的方法，其中所述诱变在可变区内。
162.根据实施方式155所述的方法，其中所述诱变在恒定区内。
163.如实施方式136-162中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
选择不结合GARP-proTGFβ1、LRRC33-proTGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-proTGFβ2、LRRC33-proTGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-proTGFβ3、LRRC33-proTGFβ3、成熟TGFβ3或其任何组合的亲和力成熟和/或优化的抗体或其抗原结合片段。
164.如实施方式136-163中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
测定或确认亲和力成熟和/或优化的抗体或片段的同工型特异性。
165.根据实施方式136-164中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
选择与人和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或片段。
166.根据实施方式136-165中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
产生亲和力成熟和/或优化的抗体或片段的完全人的或人源化的抗体或片段。
167.根据实施方式136-166中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
测定亲和力成熟和/或优化的抗体或片段对人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1的亲和力。
168.根据实施方式136-167所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<100nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
169.根据实施方式136-168所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<50nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
170.根据实施方式136-169所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<25nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
171.根据实施方式136-170所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD与人LTBP1-proTGFβ1和/或人LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
172.根据实施方式136-171中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
测定亲和力成熟和/或优化的抗体或片段对小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的亲和力。
173.根据实施方式136-172所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<100nM的KD与小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
174.根据实施方式136-173所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<50nM的KD与小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
175.根据实施方式136-174所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<25nM的KD与小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
176.根据实施方式136-175所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：选择以通过生物膜层干涉法(BLI)测量的<10nM的KD与小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1结合的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
177.根据实施方式136-176中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
选择不结合小鼠LTBP1-proTGFβ1和/或小鼠LTBP3-proTGFβ1的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
178.根据实施方式136-177中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
测定亲和力成熟和/或优化的抗体或片段的IC50，如通过适宜的基于体外细胞的功能分析测量的。
179.根据实施方式178所述的方法，其中该适宜的基于体外细胞的功能分析是caga分析。
180.根据实施方式136-179中任一项所述的方法，其中该方法包括以下步骤：
选择具有<100nM的IC50的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
181.根据实施方式136-179中任一项所述的方法，其中该方法包括以下步骤：
选择具有<50nM的IC50的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
182.根据实施方式136-179的方法，其中该方法包括以下步骤：
选择具有<25nM的IC50的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
183.根据实施方式136-179的方法，其中该方法包括以下步骤：
选择具有<10nM的IC50的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
184.根据实施方式136-179的方法，其中该方法包括以下步骤：
选择具有<5nM的IC50的亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
185.根据实施方式179-184中任一项所述的方法，其中所述caga分析是内源性LTBP caga分析。
186.根据实施方式179-184中任一项所述的方法，其中所述caga分析是人LTBP过表达caga分析。
187.根据实施方式179-184中任一项所述的方法，其中所述caga分析是鼠LTBP过表达caga分析。
188.根据前述实施方式中任一项所述的抗体或其片段、其用途或其相关方法，
a)其包含以下可变重链和/或可变轻链序列，或其变体：
i)可变重链序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS或QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS，
其中任选地所述变体与相应的可变重链序列至少85％相同、90％相同或95％相同。
ii)可变轻链序列
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL或NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL，其中任选地所述变体与相应的可变轻链序列至少85％相同、90％相同或95％相同；
b)其具有以下可变重链CDR序列或其变体：
i)FTFRSYVMH的CDR-H1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
ii)VISHEGSLKYYADSVKG的CDR-H2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和/或；
iii)AVPRIAARRGGFGY或ARPRIAARRGGFGY的CDR-H3，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和/或；
c)其具有以下可变轻链CDR序列或其变体：
i)TRSSGNIDNNYVQ的CDR1-L1，任选地包含一个或多个氨基酸变化；
ii)EDNQRPS的CDR-L2，任选地包含一个或多个氨基酸变化；和/或；
iii)QSYDSDNQGVV的CDR-L3，任选地包含一个或多个氨基酸变化。
A1.一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段，
其中该抗体包含至少三个选自以下的CDR，任选地对于每一个CDR包含最多3个氨基酸变化：
CDR-H1：SEQ ID NO：100；
CDR-H2：SEQ ID NO：101；
CDR-H3：SEQ ID NO：102；
CDR-L1：SEQ ID NO：103；
CDR-L2：SEQ ID NO：104；和，
CDR-L3：SEQ ID NO：105。
A1.1.一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段，
其中所述抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：100，条件是：
i.SEQ ID NO：100的第4位的丝氨酸残基可以被组氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：100的第7位的丝氨酸残基可以被丙氨酸或甘氨酸置换；和/或，
iii.SEQ ID NO：100的第11位甘氨酸残基可以被苏氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：101，条件是：
i.SEQ ID NO：101的第3位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：101的第6位甘氨酸残基可以被丙氨酸或丝氨酸置换；和/或，
iii.SEQ ID NO：101的第7位的丝氨酸残基可以被苏氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：102，任选地包含最多三个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：103，任选地包含最多三个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：104，任选地包含最多三个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：105，任选地包含最多三个氨基酸变化。
A2.一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段；
其中该抗体包含的重链可变区具有与SEQ ID NO：SEQ ID NO：106至少90％相同的氨基酸序列；和/或，
其中该抗体包含的可变轻链可变区具有与SEQ ID NO：107至少90％相同的氨基酸序列。
A3.根据实施方式A2所述的抗体，其中所述抗体包含：
具有与SEQ ID NO：106至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：107至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
A3.1一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段，
其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是：
i.SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；
v.SEQ ID NO：94的第7位脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；
vi.SEQ ID NO：94的第8位异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或，
vii.SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：95，任选地包含最多六个氨基酸变化；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：96，任选地包含最多三个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：97，任选地包含最多三个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：98，任选地包含最多三个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：99，任选地包含最多三个氨基酸变化。
A3.2.一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段；
其中该抗体包含的重链可变区具有与SEQ ID NO：SEQ ID NO：88至少90％相同的氨基酸序列；和/或，
其中该抗体包含的可变轻链可变区具有与SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列。
A3.3.根据实施方式A3.2所述的抗体，其中所述抗体包含：
具有与SEQ ID NO：88至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
A3.4.一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段，
其中该抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：1，条件是：
i.SEQ ID NO：1的第4位苏氨酸残基可以被组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：1的第5位的丝氨酸残基可以被亮氨酸置换；和/或，
iii.SEQ ID NO：1的第9位的丝氨酸残基可以被丙氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：2，条件是：
i.SEQ ID NO：2的第3位的丝氨酸残基可以被天冬氨酸或天冬酰胺置换；
ii.SEQ ID NO：2的第5位的酪氨酸残基可以被组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：2的第6位的天冬酰胺残基可以被丝氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：2的第8位的天冬酰胺残基可以被苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或丝氨酸置换；和/或，
v.SEQ ID NO：2的第10位的天冬酰胺残基可以被天冬氨酸或丙氨酸置换；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：3，任选地包含最多三个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：4，任选地包含最多三个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：5，任选地包含最多三个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：6，任选地包含最多三个氨基酸变化。
A3.5.一种特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物但不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中该抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中该抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段；
其中该抗体包含的重链可变区具有与SEQ ID NO：SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列；和/或，
其中该抗体包含的可变轻链可变区具有与SEQ ID NO：8至少90％相同的氨基酸序列。
A3.6.根据实施方式A3.5所述的抗体，其中该抗体包含：
具有与SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：8至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
A4.根据实施方式A1-A3.6中任一项所述的抗体，其中所述抗体不与抗体SR-Ab1、SR-Ab2或SR-Ab10中的任一个竞争结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。
A5.根据实施方式A1-A4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG4或IgG1亚型。
A5.1根据实施方式A1-A5中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人LTBP1-TGFβ1复合物具有特异性。
A5.2根据实施方式A1-A5.1中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人LTBP3-TGFβ1复合物具有特异性。
A5.3根据实施方式A1-A5.2中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物具有特异性。
A5.4根据实施方式A1-A5.3中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合人GARP-TGFβ1复合物或GARP-TGFβ3复合物。
A6.一种药物组合物，包含实施方式A1-A5.4中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂。
A7.根据实施方式A6所述的药物组合物，制备其用于静脉内施用或皮下施用。
A8.一种组合物，包含含有实施方式A6或A7的药物组合物的多剂量小瓶。
A9.一种组合物，包含含有实施方式A6或A7的药物组合物的单剂量注射器，其中任选地所述注射器是一次性注射器。
A10.如实施方式A6-A9中任一项的组合物，用于治疗人类受试者的纤维化病症的方法，其中所述治疗包含以有效治疗纤维化病症的量向受试者施用所述组合物。
A11.根据实施方式A10使用的组合物，其中所述纤维化病症是器官纤维化。
A12.根据实施方式A11使用的组合物，其中所述器官纤维化是晚期器官纤维化。
A13.根据实施方式A10或A11使用的组合物，其中所述器官纤维化选自：
肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、胰腺纤维化、皮肤纤维化、硬皮病、肌肉纤维化、子宫纤维化和子宫内膜异位症。
A14.根据实施方式A10使用的组合物，其中：
a)所述纤维化病症包含慢性炎症；
b)所述受试者受益于免疫抑制；
c)所述受试者患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病的风险；
d)所述受试者是同种异体移植的候选者；和/或，
e)所述受试者已接受同种异体移植。
A15.根据实施方式A10使用的组合物，包含慢性炎症的纤维化病症是肌营养不良症、多发性硬化症(MS)或囊性纤维化(CF)。
A16.根据实施方式A15使用的组合物，其中该肌营养不良症是杜氏肌营养不良症(DMD)。
A17.根据实施方式A15使用的组合物，其中MS包含血管周围纤维化。
A18.根据实施方式A13使用的组合物，其中肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。
A19.根据实施方式A13使用的组合物，其中受试者患有慢性肾病(CKD)。
A20.根据实施方式A13使用的组合物，其中受试者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
A21.根据实施方式A10-A20中任一项使用的组合物，其中以0.1至30mg/kg之间的剂量向受试者施用所述抗体。
A22.根据实施方式A21使用的组合物，其中每周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次或每隔一个月施用所述抗体。
A23.根据实施方式A21使用的组合物，其中治疗方案包含治疗的初始阶段和治疗的后续阶段，
其中受试者在初始阶段接受负荷剂量，随后在后续阶段接受维持剂量。
A24.根据实施方式A21使用的组合物，其中负荷剂量为2-30mg/kg之间，和维持剂量为0.1-20mg/kg之间。
A25.根据实施方式A21使用的组合物，其中每周两次或每周一次向受试者施用负荷剂量。
A26.根据实施方式A21使用的组合物，其中每2-8周向受试者施用一次维持剂量。
A27.根据实施方式A10-A26中任一项使用的组合物，其中所述方法进一步包含测试或确认从受试者收集的生物样品中TGFβ1、LTBP1或LTBP3的表达。
A28.一种用于制备实施方式A6-A9中任一项所述的组合物的方法，其中所述组合物包含特异性地结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物并且不结合人GARP-proTGFβ复合物的抗体或其抗原结合片段；其中该抗体或片段抑制TGFβ1但不抑制TGFβ2或TGFβ3，其中该方法包括以下步骤：
i).提供至少一种包含LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的抗原，
ii).选择与步骤(i)的至少一种抗原特异性地结合的第一抗体或片段池以提供LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1的特异性结合物；
iii).选择抑制TGFβ1激活的第二抗体或片段池，以产生TGFβ1激活的特异性抑制剂；和
iv).将存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或片段配制成药物组合物，
从而制备包含抗体或片段的组合物。
A29.实施方式A28的方法，其中该方法还包括以下步骤：
从第一抗体或片段池中去除结合GARP-proTGFβ1、LRRC33-proTGFβ1、成熟TGFβ1、GARP-proTGFβ2、LRRC33-proTGFβ2、成熟TGFβ2、GARP-proTGFβ3、LRRC33-proTGFβ3、成熟TGFβ3或其任何组合的任何抗体或片段。
A30.如实施方式A28或A29的方法，其中该方法还包括以下步骤：
测定或确认在步骤(ii)和/或(iii)中选择的抗体或片段的同工型特异性。
A31.如实施方式A28-A30中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
选择与人和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或片段。
A32.如实施方式A28-A31中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
产生第一抗体池和第二抗体池中存在的抗体或片段的完全人的或人源化的抗体或片段。
A33.如实施方式A28-A32中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
使存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A34.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：1、(CDR-H2)SEQ ID NO：2和(CDR-H3)SEQ ID NO：3中的至少三个CDR序列的抗体或片段；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A35.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：94、(CDR-H2)SEQ ID NO：95和(CDR-H3)SEQ IDNO：96中的至少三个CDR序列的抗体或片段；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A36.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含(CDR-H1)SEQ ID NO：100、(CDR-H2)SEQ ID NO：101和(CDR-H3)SEQ IDNO：102中的至少三个CDR序列的抗体或片段；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A37.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含重链可变区的抗体或片段，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A38.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含重链可变区的抗体或片段，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A39.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
i)提供包含重链可变区的抗体或片段，其中该重链可变区具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列；和
ii)使步骤(i)的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
A40.如实施方式A34-A39中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含诱变。
A41.如实施方式A40的方法，其中诱变在CDR内。
A42.如实施方式A40的方法，其中诱变在可变区内。
A43.如实施方式A40的方法，其中诱变在恒定区内。
A44.如实施方式A34-A43中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包含轻链改组。

Claims (59)

1.一种特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物且不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中所述抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中所述抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段，
其中所述抗体包含以下六个CDR中的至少三个：
a)CDR-H1：SEQ ID NO：94，条件是：
i.SEQ ID NO：94的第2位的苏氨酸残基可以被丙氨酸置换；
ii.SEQ ID NO：94的第4位的天冬酰胺残基可以被丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iii.SEQ ID NO：94的第5位的天冬酰胺残基可以被谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸置换；
iv.SEQ ID NO：94的第6位的酪氨酸残基可以被精氨酸置换；
v.SEQ ID NO：94的第7位的脯氨酸残基可以被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺置换；
vi.SEQ ID NO：94的第8位的异亮氨酸残基可以被甲硫氨酸或亮氨酸置换；和/或，
vii.SEQ ID NO：94的第9位的组氨酸残基可以被苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸置换；
b)CDR-H2：SEQ ID NO：95，其包含最多六个氨基酸变化；
c)CDR-H3：SEQ ID NO：96，其包含最多三个氨基酸变化；
d)CDR-L1：SEQ ID NO：97，其包含最多三个氨基酸变化；
e)CDR-L2：SEQ ID NO：98，其包含最多三个氨基酸变化；和，
f)CDR-L3：SEQ ID NO：99，其包含最多三个氨基酸变化。
2.一种特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物且不结合人GARP-proTGFβ复合物的分离的抗体；
其中所述抗体不结合成熟TGFβ1、成熟TGFβ2或成熟TGFβ3；
其中所述抗体是完全人的或人源化的抗体或者其抗原结合片段；
其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO：SEQ ID NO：88至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和/或
其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
3.一种抗体或其抗原结合片段，其包含以下六个CDR中的至少三个：
a)包含氨基酸序列FTF(X1)(X2)YVMH的CDR-H1，其中：X1是S或R；和X2是G或S；
b)包含氨基酸序列(X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG的CDR-H2，其中：X1是V或S；X2是S或G；和X3是F或L；和
c)包含氨基酸序列(X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)的CDR-H3，其中：X1是A或V；X2是R、V、G或K；X3是R、H或L；X4是I、V或G；X5是A、S或L；X6是A或V；X7是F或Y；X8是D、G、R或S；和X9是Y、G、R、L、V、A或K；
d)如SEQ ID NO：97所示的CDR-L1，其包含最多三个氨基酸变化；
e)如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2，其包含最多三个氨基酸变化；和
f)如SEQ ID NO：99所示的CDR-L3，其包含最多三个氨基酸变化。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
b)在CDR-H2内；X2是S；和
c)在CDR-H3内；X1是A；X2是R或V；X3是R；X4是I；X5是A或L；X6是A；X7是F；X8是G；和X9是Y。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
具有与SEQ ID NO：88至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述最多三个氨基酸变化包括最多两个氨基酸变化。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含所有六个CDR。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人LTBP1-TGFβ1复合物具有特异性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人LTBP3-TGFβ1复合物具有特异性。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物具有特异性。
11.一种抗体或其抗原结合片段，其包含以下六个CDR：
a)包含氨基酸序列FTFRSYVMH的CDR-H1；
b)包含氨基酸序列VISHEGS(X1)KYYADSVKG的CDR-H2，其中：X1是L或G；和
c)包含氨基酸序列A(X1)PRIAARRGGFG(X2)的CDR-H3，其中：X1是V、R或L；和X2是Y、S或T；
d)包含氨基酸序列TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ的CDR-L1，其中，X1为S或H；X2是N、L、S或A；和X3是N、D或Y；
e)包含氨基酸序列ED(X1)(X2)RPS的CDR-L2，其中：X1是N、F或A；和X2是Q、I或V；和
f)包含氨基酸序列Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV的CDR-L3，其中：X1是S或G；X2是S、F、Y、D、H或W；X3是N、D或S；X4是N、A、L、E或T；和X5是G、R、A或L。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-H3内：X1是R或L。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3中：X2是Y。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X3是D；和X4是T。
15.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X3是D；X4是N；和X5是A。
16.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L1内：X1是S或H；X2是N或A；和X3是N、D或Y；
在CDR-L2内：X1是N或F；和X2是Q或V；和
在CDR-L3内：X1是S或G；X2是S、Y、D或W；X3是D或S；X4是N、L或T；和X5是G、R、A或L。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L1内：X1为S；X2是N；和X3是N或Y；
在CDR-L2内：X1为N；和X2是Q或V；和
在CDR-L3内：X1是S或G；X2是S、Y或W；X3是D；X4是N或T；和X5是G、R或A。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X1是S；X2是S或Y；X3是D；X4是N或T；和X5是G、R或A。
19.根据权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X1是S；X2是Y；X3是D；X4是N或T；和X5是G或A。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
在CDR-L3内：X1是S；X2是Y；X3是D；X4是T；和X5是G。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)CDR-H1包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列；
b)CDR-H2包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列；
c)CDR-H3包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列；
d)CDR-L1包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列；
e)CDR-L2包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列；和
f)CDR-L3包含SEQ ID NO：171的氨基酸序列。
22.根据权利要求11-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
具有与SEQ ID NO：318至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区；和
具有与SEQ ID NO：319至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
23.根据权利要求11-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与具有如SEQ IDNO：318所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO：319所示的轻链可变区序列的抗体竞争或交叉竞争。
24.一种抗体或其抗原结合片段，其选择性地结合人LTBP1-TGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，并与具有如SEQ ID NO：318所示的重链可变区序列和SEQ ID NO：319所示的轻链可变区序列的抗体竞争或交叉竞争。
25.根据权利要求11-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，未显示与人GARP-proTGFβ1复合物的可检测的结合。
26.根据权利要求11-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和/或人LTBP3-TGFβ1复合物的KD比在相同的测定条件下与人GARP-proTGFβ1复合物结合时的KD低至少50倍。
27.根据权利要求11-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在与用于测量与人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物结合的相同测定条件下，如通过BLI测量的，未显示与LRRC33-proTGFβ1复合物的可检测的结合。
28.根据权利要求11-27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段针对hLTBP1-proTGFβ1和hLTBP3-proTGFβ1复合物中的每一个具有至少45分钟的单价半结合时间(t1/2)，如通过SPR测量的。
29.根据权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其针对hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物中的每一个具有小于5分钟的单价t1/2，如通过SPR测量的。
30.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以<5nM，任选地<1nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1复合物和人LTBP3-TGFβ1复合物，如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的。
31.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与小鼠LTBP1-proTGFβ1交叉反应。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与小鼠LTBP3-proTGFβ1交叉反应。
33.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以<10nM的KD结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物，如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的。
34.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以<10nM的KD结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物，如通过生物膜层干涉法(BLI)测量的。
35.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人和鼠LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1复合物交叉反应，各具有<5nM或任选地<1nM的KD。
36.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG4或IgG1亚型，任选地其中所述抗体是人IgG4亚型并包含Ser至Pro的骨架置换，这产生IgG1样铰链。
37.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其制备用于静脉内施用或皮下施用。
39.一种组合物，其包含含有权利要求37或38的药物组合物的多剂量小瓶。
40.一种组合物，其包含含有权利要求37或38的药物组合物的单剂量注射器，任选地其中所述注射器是一次性注射器。
41.如权利要求37-40中任一项所述的组合物，其用于治疗人类受试者的纤维化病症的方法，其中所述治疗包含以有效治疗所述纤维化病症的量向所述受试者施用所述组合物。
42.根据权利要求41所述用途的组合物，其中所述纤维化病症是器官纤维化。
43.根据权利要求42所述用途的组合物，其中器官纤维化是晚期器官纤维化。
44.根据权利要求42或43所述用途的组合物，其中所述器官纤维化选自：肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、胰腺纤维化、皮肤纤维化、硬皮病、肌肉纤维化、子宫纤维化和子宫内膜异位症。
45.根据权利要求44所述用途的组合物，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。
46.根据权利要求44所述用途的组合物，其中所述受试者患有慢性肾病(CKD)。
47.根据权利要求44所述用途的组合物，其中所述肝纤维化与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关。
48.根据权利要求41-47中任一项所述用途的组合物，其中所述抗体以0.1和30mg/kg之间的剂量向所述受试者施用。
49.根据权利要求48所述用途的组合物，其中所述抗体每周两次、每周一次、每两周一次、每3周一次、每月一次或每隔一个月施用。
50.根据权利要求48所述用途的组合物，其中治疗方案包括治疗的初始阶段和治疗的后续阶段，其中所述受试者在所述初始阶段中接受负荷剂量，随后在所述后续阶段中接受维持剂量。
51.根据权利要求50所述用途的组合物，其中所述负荷剂量为2-30mg/kg，和所述维持剂量为0.1-20mg/kg。
52.根据权利要求50或51所述用途的组合物，其中所述负荷剂量每周两次或每周一次施用于所述受试者。
53.根据权利要求50-52中任一项所述用途的组合物，其中所述维持剂量每2-8周一次施用于所述受试者。
54.根据权利要求41-53中任一项所述用途的组合物，其中所述方法进一步包括测试或确认从所述受试者收集的生物样品中TGFβ1、LTBP1或LTBP3的表达。
55.一种用于制备权利要求37-40中任一项所述的组合物的方法，所述组合物包含特异性结合人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物的抗体或其抗原结合片段，所述方法包括以下步骤：
i)选择以至少45分钟的t1/2从人LTBP1-proTGFβ复合物和/或人LTBP3-proTGFβ复合物解离的抗体或其抗原结合片段，和
ii)将所述抗体或片段配制成药物组合物，
从而制备包含所述抗体或片段的组合物。
56.如权利要求55所述的方法，还包括以下步骤：选择IC50＜5nM，任选地＜2nM的抗体或抗原结合片段，如通过基于细胞的测定测量的。
57.如权利要求55或56所述的方法，还包括以下步骤：在体内临床前模型中确认功效，其中任选地所述临床前模型是肝纤维化模型、肾纤维化模型或心脏纤维化模型。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
选择与人和啮齿动物抗原交叉反应的抗体或片段。
59.如权利要求55-58中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
使存在于第一抗体池和第二抗体池中的抗体或片段经历亲和力成熟和/或优化，以提供亲和力成熟和/或优化的抗体或片段。
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