CN112996535A - 高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了能够以高效力选择性抑制TGFβ1的单克隆抗体及其抗原结合片段。还公开了相关组合物、方法和治疗性用途。

Description

高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂及其用途
相关申请
本申请要求下列申请的利益和优先权：2018年7月11日提交的美国临时专利申请号62/696,752；2018年8月13日提交的美国临时专利申请号62/718,196；2018年9月27日提交的美国临时专利申请号62/737,534；2018年11月9日提交的美国临时专利申请号62/758,180；2019年2月25日提交的美国临时专利申请号62/810,263和2019年4月1日提交的美国临时专利申请号62/827,552，其各自的标题为“高亲和性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂及其用途”，其全部内容各自明确通过引用并入本文。
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2019年7月11日创建的所述ASCII拷贝命名为127036-03520_SL.txt，大小为261,252字节。
背景技术
转化生长因子β1(TGFβ1)与其他两种结构相关的亚型(即，TGFβ2和TGFβ3)都是生长因子的TGFβ超家族成员，其各自由独立的基因编码。这些TGFβ亚型起多效性细胞因子的作用，在稳态和疾病背景下调节细胞增殖、分化、免疫调节(例如，适应性免疫应答)以及其他多种生物学过程。这三种TGFβ亚型通过相同的细胞表面受体发出信号，并触发类似的典型下游信号传导事件，包括SMAD2/3通路。然而，在小鼠中的基因敲除研究显示出不同表型，表明每种亚型在体内起离散作用。这可以在某种程度上通过三种亚型的差异性表达模式来实现。
在免疫系统中，认为T细胞是TGFβ的主要直接靶点。TGFβ信号传导在效应细胞增殖，以及调控效应物和调控T细胞分化中很重要。例如，TGFβ是Th1和Th2效应T细胞的强效抑制剂。还已经证明TGFβ通过多种机制抑制了细胞毒性T细胞的效应功能。而且，有证据表明，免疫系统的其他细胞类型，如树突状细胞(朗格汉斯细胞)和自然杀伤(NK)细胞，也受到TGFβ信号传导通路的调控。TGFβ失调与很多疾病状况有关，如癌症、纤维化和免疫病症。
其中细胞外基质起作用的很多生物学过程与TGFβ信号传导相关。仅举几例，TGFβ参与伤口愈合、肿瘤侵袭和转移，以及纤维化进展。
出于这些和其他原因，TGFβ已成为用于治疗免疫病症、各种增殖性病症和纤维化病况的引人注目的治疗靶点。然而，来自临床前研究(包括在大鼠和犬中)的观察结果已显示了与体内TGFβ的全身性抑制相关的严重毒性。而且，尽管迄今为止已研发出若干TGFβ抑制剂，但是由于存在严重副作用的风险，大多数针对TGFβ的临床方案已终止(概述于例如WO2017/156500中)。因此，尽管有直接和间接的证据表明TGFβ信号传导参与了诸如癌症和纤维化之类疾病的进展，但是迄今为止，市场上尚没有被认为是安全有效的TGFβ疗法。
此前，申请人描述了一类单克隆抗体，其具有调节生长因子信号传导的新作用机制的功能(参见，例如，WO 2014/182676)。设计这些抗体以利用以下事实：TGFβ1表达为包含前结构域和生长因子的潜在前蛋白复合物，其需要激活步骤才能从潜在复合物中释放出生长因子。新一类的抑制性抗体没有采取激活后直接靶向成熟生长因子本身的传统方法(如中和抗体)，而是特异性靶向了无活性的前蛋白复合物本身，从而抢先阻断了配体-受体相互作用上游的激活步骤。有理由认为，这种独特的作用机制应为实现时间和空间的获益提供优势，因为其在源头起作用，即通过在激活发生之前靶向疾病微环境中的潜在proTGFβ1复合物来发挥作用。
使用这种方法，产生了以亚型选择性方式特异性结合并抑制TGFβ1激活步骤(即，从潜在复合物中释放成熟生长因子)的单克隆抗体(参见，WO 2017/156500)。其中提供的数据支持这样的观点，即TGFβ的亚型特异性抑制(相对于泛抑制而言)可以改善体内拮抗TGFβ的安全性性质。考虑到这一点，申请人随后试图开发TGFβ1抑制剂，其i)具有亚型特异性；和ii)能够靶向与不同呈递分子相关的多种TGFβ1信号传导复合物，作为由多层面TGFβ1效应及其失调驱动的病况的治疗剂。
随后在PCT/US2018/012601(2018年1月5日提交)中描述了此类抗体。实际上，其中描述的亚型特异性抑制剂能够靶向ECM相关的TGFβ1和免疫细胞相关的TGFβ1，从而在维持亚型特异性的同时在多种生物学背景下阻断TGFβ1的多种来源。公开了来自很多体内模型的数据，这些数据显示了亚型选择性TGFβ1激活抑制剂的功效和安全性，表明此类抑制剂可用于治疗涉及ECM相关的TGFβ1和免疫细胞相关的TGFβ1体内失调的疾病。
尽管上文引用的早期工作证明了能够靶向每种已知proTGFβ1复合物和抑制性活性的抗体的效用，但是人们期望具有更高体内效力的改进的亚型选择性TGFβ1抑制剂。
发明内容
本公开提供了一类新型的高亲和性、亚型选择性抗体，其能够高效抑制TGFβ1激活。这些包括能够以高亲和性靶向多个呈递分子-proTGFβ1复合物(称为“大型潜在复合物”或“LLC”)的抗体(包括免疫球蛋白及其抗原结合片段或部分，以及掺入此类片段的工程化分子)。这些抗体保留了同等的选择性和安全性性质，并显示可在可转化为人类病况的多种临床前模型中实现改善的体内功效。TGFβ1抑制剂的这些特性为开发安全有效的TGFβ1疗法提供了机会，以治疗涉及TGFβ1失调的疾病。
在产生本公开的proTGFβ1抗体时考虑了以下选择标准：1)亚型选择性；2)针对人LLC(例如，LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)的高亲和性；3)强大的抑制性效力；4)有利的体内安全性/毒理学性质；5)在概括人类疾病的临床前模型中的体内功效。此外，在评估用作联合疗法(例如，附加疗法)的TGFβ1抑制剂的效用时，应权衡达到协同作用的能力(而不是单纯的累加作用)。基于这些标准，本公开的发明人已经鉴定出一类高亲和性单克隆抗体及其片段，其能够特异性地靶向proTGFβ1复合物并且有效地阻断TGFβ1激活。在一些实施方式中，本文公开的新型抗体在所有靶LLC上均表现出高亲和性(例如，纳摩尔级至亚纳摩尔级的KD)。在优选的实施方式中，此类抗体在不同的proTGFβ1复合物中无偏倚，因此所述抗体对所有靶复合物均具有等同的亲和性。本发明涵盖了相关组合物、治疗用途、制备、制剂、过程和方法。
因此，在一些实施方式中，本发明包括一种单克隆抗体或其抗原结合片段，如通过溶液平衡滴定所测量的，其能够以≤10nM的KD结合下述人LLC复合物中的每一者：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，抗体以≤1nM的KD结合人LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1复合物中的每一者。优选地，抗体针对四种人LLC的每一者具有≤1nM的KD。
在一些实施方式中，抗体或片段结合proTGFβ1的潜伏套索(Latency Lasso)或其片段。在一些实施方式中，抗体或片段还结合生长因子结构域(如指-1和指-2)的一个或多个部分。例如，抗体或片段可以结合包含潜伏套索的一个或多个氨基酸残基的表位。任选地，表位可以进一步包含生长因子结构域的一个或多个氨基酸残基。因而，此类表位可以是组合表位。在优选的实施方式中，抗体不结合不与proTGFβ1复合物相关的游离TGFβ1生长因子。
本发明的TGFβ1抑制剂是功能性抗体，因为其对TGFβ1具有抑制性活性。此类抗体的效力是亚型特异性的，如通过适宜的体外效力测定所测量的，如本文所述的基于细胞的报告因子测定。因此，抗体不结合或抑制TGFβ2或TGFβ3对应物。
本发明的TGFβ1抑制剂能够阻止成熟生长因子从潜在LLC复合物中释放。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可以抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和/或TGFβ1的蛋白酶依赖性激活。在一些实施方式中，蛋白酶是激肽释放酶、纤溶酶或MMP蛋白酶。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂阻断整联蛋白依赖性TGFβ1激活，而不阻断整联蛋白与LLC的结合。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂可以通过对细胞相关LLC的双重抑制作用模式起作用(例如，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)。在一种机制中，此类抑制剂阻断与膜锚定的GARP和/或LRRC33相关的TGFβ1的激活步骤。在第二种机制中，此类抑制剂可以在靶点结合(engagement)后诱导LLC从细胞表面的抗体依赖性内化(因此被去除)，从而减少生态位(niche)处的TGFβ1信号传导。在一些实施方式中，抗体是pH敏感性抗体，其特征在于所述抗体在中性pH下比在酸性pH下以更高的亲和性结合proTGFβ1复合物。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效减少疾病相关基因的表达，如TGFB1、Acta2、Col1a1、Col3a1、Fn1、Itga11、Lox、Loxl2、CCL2和Mmp2。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效减少体内下游效应物SMAD2/3的磷酸化。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效治疗TGFβ1相关的适应症。此类适应症包括涉及异常基因表达的疾病、涉及ECM失调的疾病、以免疫抑制细胞(例如，Treg、MDSC和/或M2巨噬细胞)增加为特征的疾病、涉及间质转化的疾病、涉及蛋白酶的疾病、与异常干细胞增殖和/或分化相关的疾病等等，而这些类别的疾病并非旨在相互排斥。在一些实施方式中，TGFβ1相关的适应症是增殖性病症，如骨髓增殖性病症和实体瘤癌症。在一些实施方式中，TGFβ1相关的适应症是纤维化病症，如器官纤维化。癌症可以是晚期癌症，包括局部晚期肿瘤/癌症和转移性癌症。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂能够降低疾病部位(如肿瘤微环境和纤维化微环境)免疫抑制性细胞群的数量。在一些实施方式中，免疫抑制性细胞群可以包括M2极化的巨噬细胞和/或MDSC。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效实现肿瘤控制(例如，部分缓解和完全缓解)，其中肿瘤任选地是免疫抑制(例如，免疫排除)表型。在一些实施方式中，当与癌症疗法(如检查点阻断疗法、化疗和放疗)联合使用时，TGFβ1抑制剂可以达到协同抗肿瘤作用。检查点阻断疗法可以包括例如一种或多种抗-PD-(L)1抗体。在此类联合疗法中，TGFβ1抑制剂可以克服治疗抗性(例如，原发性抗性)，从而使癌症对癌症疗法更加敏感。因此，TGFβ1抑制剂可以用于治疗癌症，包括在受试者中的免疫抑制性肿瘤。受试者可以是i)对癌症疗法(如检查点抑制剂)的原发性无应答者；或，ii)诊断为患有癌症，针对所述癌症有至少一种检查点抑制剂已被监管机关批准作为疗法。对于针对其已有至少一种检查点抑制剂获批的癌症的缓解率(在已接受治疗的那些中部分和完全应答者之和)小于100％。通常，缓解率在约10-60％之间。TGFβ1抑制剂可以增加患者人群中的缓解率。此外，在原发性应答者中的部分缓解组中，TGFβ1抑制剂可以提供改善的临床获益。在一些实施方式中，在原发性应答者组中，TGFβ1抑制剂可以降低对癌症疗法的获得性抗性。免疫抑制性肿瘤可以是局部晚期癌症/肿瘤或转移性癌症。在一些实施方式中，癌症疗法可以包括，例如，检查点抑制剂疗法、化疗和/或放疗。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效在实体瘤受试者中获得生存获益，其中所述实体瘤任选地是局部晚期或转移性癌症。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂通过诱导T细胞记忆功能有效实现持久的抗肿瘤作用。因此，TGFβ1抑制剂可以减少或推迟疾病复发。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂可有效在主要表达TGFB1和/或TGFb3的肿瘤中实现抗肿瘤作用。在一些实施方式中，共表达TGFβ1和TGFβ3的肿瘤是癌症。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂能够克服肿瘤对癌症疗法的原发性抗性。在一些实施方式中，此类肿瘤浸润有免疫抑制性细胞类型，如调节性T细胞、M2型巨噬细胞和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)。经治疗后，与肿瘤相关的免疫抑制性细胞数量减少，并且抗肿瘤效应T细胞的数量相应增加。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂促进效应细胞浸润至肿瘤。在一些实施方式中，效应细胞可以通过肿瘤的脉管系统进入肿瘤。在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂促进效应细胞扩增(例如，增殖)。这可以至少部分地由抑制GARP阳性的调节性T细胞介导。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效治疗骨髓纤维化。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂实现患有骨髓纤维化的受试者骨髓的抗纤维化作用。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂有效使某些血液学参数正常化。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂有效实现体内抗纤维化作用。抗纤维化作用可以包括逆转已建立的纤维化，其可以是部分逆转或完全逆转。
在一些实施方式中，当每周给药持续至少4周时，本发明的TGFβ1抑制剂在剂量高达100、200或300mg/kg的临床前安全性/毒理学研究中具有良好的耐受性。此类研究可以在已知对TGFβ抑制敏感的动物模型中进行，如大鼠和非人灵长类动物。在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂不会引起与TGFβ的泛抑制相关的可见的毒性，如心血管毒性(例如，瓣膜病)和上皮增生以及本领域公知的其他毒性。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂达到了足够的治疗窗，因为体内功效研究显示的抑制剂的有效量远低于(如至少3倍、至少6倍或至少10倍)引起可见毒性的量或浓度。在一些实施方式中，抑制剂的治疗有效量在每周约1mg/kg至约30mg/kg之间。
附图说明
图1是显示在LN229测定中对LTBP1-proTGFβ激活的抑制的图。
图2是显示在LN229测定中对proTGFβ复合物激活的抑制的图。
图3是显示在SW480β6测定中对GARP-proTGFβ1激活的抑制的图。
图4是显示在SW480β6测定中对LRRC33-proTGFβ1激活的抑制的图。
图5A显示了Ab3和Ab6在体外对激肽释放酶诱导的TGFβ1激活的抑制作用。
图5B显示了Ab3和Ab6在体外对纤溶酶诱导的TGFβ1激活的抑制作用。
图6提供了显示在用LRRC33和proTGFβ1转染的异源细胞中Ab6结合后LRRC33-proTGFb1快速内化的图。
图7提供了显示Ab6或Ab3对UUO小鼠中胶原基因(Col1a1和Col3a1)表达的影响的两幅图。使用3、10或30mg/kg/wk的Ab3或者3或10mg/kg/周的Ab6对小鼠进行治疗。将单独的IgG用作对照。
图8提供了显示Ab3或Ab6对UUO小鼠中Fn1和Loxl2基因表达的影响的两幅图。使用3、10或30mg/kg/wk的Ab3或者3或10mg/kg/周的Ab6对小鼠进行治疗。将单独的IgG用作对照。
图9总结了在UUO模型中治疗后基因表达变化(相对于UUO+IgG)的统计学意义。
图10是显示在以30mg/kg或10mg/kg的Ab3与抗PD-1组合施用后在Cloudman S91黑色素瘤模型中随着时间(天)的推移的存活百分率的图。单独的抗-PD-1、抗-SR-AB3以及用作对照。
图11A提供了显示在以30mg/kg或10mg/kg施用Ab3或Ab6(均与抗PD-1联用)后，随着时间(天数)的推移测量的，以在Cloudman S91黑色素瘤模型中的中位肿瘤进展表示的肿瘤生长(肿瘤体积mm3)变化的五幅图。将单独的抗-PD-1用作对照。虚线表示由于肿瘤溃疡，在达到2000mm3终点标准之前必须被处死的动物。
图11B提供了显示在以30mg/kg或10mg/kg施用Ab3(左图)或Ab6(右图)(与抗-PD-1联用)后作为时间的函数的Cloudman S91中位肿瘤体积的两幅图。将单独的抗-PD-1、单独的Ab3、单独的Ab6和单独的IgG用作对照。
图11C提供了显示在使用(1)对照IgG；(2)仅Ab6；(3)仅抗PD1；(4)抗PD1/Ab6(3mg/kg)；(5)抗PD1/Ab6(10mg/kg)；和(6)抗PD1/Ab6(30mg/kg)治疗的小鼠中作为时间的函数的S91肿瘤体积变化的六幅图。上方的虚线表示终点肿瘤体积为2,000mm3；和下方的虚线表示25％阈值体积为500mm3。将应答者定义为达到肿瘤尺寸小于终点体积的25％的那些。
图11D提供了显示在3种剂量水平(3、10和30mg/kg)下在用抗PD-1和Ab6的组合治疗的小鼠中作为时间的函数的S91肿瘤体积变化的三幅图。治疗后显示出持久的抗肿瘤作用。
图11E提供了总结来自图11C的以中位肿瘤体积表示的数据的图。
图11F提供了显示来自图11C的每一治疗组中随着时间的推移动物的存活的图。
图12是显示在MBT2膀胱癌模型中磷酸化与总SMAD2/3之比(pSMAD/SMAD)的图。使用下述对动物进行治疗：(1)仅抗PD-1抗体；(2)Ab5(3mg/kg)与抗PD-1抗体的组合；(3)Ab5(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合；(4)Ab3(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合；(5)Ab3(30mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。
图13A和13B提供了两组五幅图，显示了在以30mg/kg或10mg/kg的Ab3或以3mg/kg或10mg/kg的Ab6(与抗PD-1联用)施用后随着时间(天数)的推移测量的MBT2肿瘤生长(肿瘤体积mm3)的变化。将单独的抗-PD-1用作对照。以对数标度(图13A)和线性标度(图13B)表示作为时间的函数的肿瘤体积的变化。虚线表示由于肿瘤溃疡，在达到1200mm3终点标准之前必须被处死的动物。
图13C提供了显示在MBT2同系(syngeneic)膀胱癌模型中以30mg/kg或10mg/kg的Ab3(左上)或以10mg/kg或3mg/kg的Ab6(右上)(与抗PD-1联用)施用后作为时间的函数的中位肿瘤体积的图。将单独的抗-PD-1、单独的Ab3、单独的Ab6和单独的IgG用作对照。在下图中总结了第15天时的中位肿瘤体积。
图13D提供了显示在MBT2同系膀胱癌模型中Ab6与抗PD-1联用的作用的五幅图。将应答者定义为在研究终点时达到肿瘤尺寸小于终点体积的25％的那些。
图14是显示在MBT2同系膀胱癌模型中以10mg/kg的Ab3或以3mg/kg或10mg/kg的Ab6(与抗PD-1联用)施用后随着时间(天数)的推移的存活百分比的图。将单独的抗-PD-1用作对照。
图15提供了一组图，其显示了在肿瘤再攻击研究中随着时间(天数)的推移测量的肿瘤生长(肿瘤体积mm3)的变化。使用MBT2肿瘤细胞再攻击此前使用抗PD-1/Ab3或抗PD-1/Ab6治疗已清除了肿瘤的动物(达到完全消退的完全应答者)。将初始未经治疗的动物用作对照。虚线表示由于肿瘤溃疡，在达到1200mm3终点标准之前必须被处死的动物。
图16是显示proTGFβ1的区域(区域1和区域2)中HDX保护的Ab5 Fab结合结果的热图。
图17示出了proTGFβ1复合物的区域，该区域在Ab5结合后如通过HDX测量所示(见图16)免受溶剂交换。
图18A是显示Ab6 Fab与proTGFβ1(C4S)结合的保护作用的热图。受抗体-抗原相互作用影响的区由红色方框(1、2a、2b、2c、3、4、5a、5b、6a和6b)表示。
图18B提供了覆盖在TGFβ1晶体结构上的HDX数据。显示了图18A中鉴定的区。
图19A示出了在统计分析之后鉴定的三个结合区(区1、区2和区3)。区1在proTGFβ1的前结构域内与所谓的“潜伏套索”重叠，而区2和3在生长因子结构域内。
图19B描述了相对于Ab6结合中涉及的三个结合区，proTGFβ1的各种结构域和基序。还提供了在三个亚型间的序列比对。
图20A-20D显示了在各种组织和细胞中TGFβ亚型的相对RNA表达。图20A显示了在各种人癌组织对比正常对照物(按癌症类型)的TGFβ亚型表达。图20B显示了基于来自33个肿瘤类型的超过10,000个样品的分析以人癌症类型计的TGFβ亚型表达的频率。图20C显示了以癌症类型计在单个肿瘤样品中TGFβ亚型的表达。图20D显示了在小鼠同系癌细胞模型系中的TGFβ亚型表达。
图20E提供了4个基因表达小图，显示了在大多数人类癌症类型中均高表达的所有呈递分子(LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33)。
图20F提供了来自同系小鼠肿瘤模型Cloudman S91、MBT-2和EMT-6的TGFβ和相关信号传导通路基因的表达分析。
图20G提供了通过ELISA将Cloudman S91、MBT-2和EMT-6肿瘤模型中的3种TGFβ亚型的蛋白表达进行比较的三幅图。
图20H提供了通过对Cloudman S91、MBT-2和EMT-6肿瘤模型中的呈递分子的全肿瘤裂解物qPCR比较RNA表达水平的图。
图21A描述了根据1周毒理学研究来自泛TGFβ抗体的显微心脏研究结果。图21B描述了根据4周大鼠毒理学研究，与ALK5抑制剂或泛TGFβ抗体相比，来自Ab3的显微心脏研究结果。图21C描述了根据4周大鼠毒理学研究，与ALK5抑制剂或泛TGFβ抗体相比，来自Ab6的显微心脏研究结果。
图22提供了显示作为时间的函数的S91中位肿瘤体积的图。组合组(arm)表示处于两个剂量水平的四种不同亚型选择性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂，其均与抗PD-1治疗组合。
图23A-23B提供了使用CD8+细胞标志物染色的S91肿瘤的代表性免疫组织化学切片。图23A是来自仅使用抗PD-1治疗的动物的肿瘤切片。图23B是来自使用抗PD-1和代表性的不依赖于背景的TGFβ1抑制剂治疗的动物的肿瘤切片。
图24A-24D提供了使用巨噬细胞标志物染色的S91肿瘤的代表性免疫组织化学切片。图24A是来自仅使用抗PD-1治疗的动物的肿瘤切片。图24B是来自使用抗PD-1和代表性的不依赖于背景的TGFβ1抑制剂治疗的动物的肿瘤切片。图24C是使用抗F4/80作为巨噬细胞标志物的来自使用抗PD-1和Ab3(30mg/kg)治疗的动物的肿瘤切片。图24D是使用抗CD163作为M2巨噬细胞标志物的切片，显示了大部分细胞是CD163阴性的。
图25是显示与单独使用抗PD-1治疗的动物相比，用抗PD-1/Ab3治疗MBT2肿瘤1周后，CD8+T淋巴细胞基因(CD8α、穿孔素和颗粒酶B)的log2倍数变化的图。
图26A提供了显示在外周人调节性T细胞中CD3/CD28诱导的GARP上调的FACS数据。
图26B是显示Ab3或Ab6对Treg介导的Teff增殖抑制的效果的图。将IgG用作对照。
图27A显示了用于在MBT2肿瘤中分选T细胞亚群的门控策略。
图27B提供了显示以CD45+细胞的百分比表示的在第13天时的T细胞亚群的一组图。
图28A提供了用于在MBT2肿瘤中分选髓系亚群的门控策略。
图28B提供了显示在第13天时的髓样细胞亚群的一组图。
图28C提供了显示在表达细胞表面LRRC33的MBT-2中的肿瘤相关巨噬细胞的FACS数据。
图28D显示了MBT-2肿瘤浸润MDSC表达细胞表面LRRC33。
图29A-29C提供了另外的FACS数据分析，显示了在MBT2肿瘤中Ab6和抗PD-1治疗的作用。
图30A-30D提供了显示瘤内CD8阳性T细胞的代表性MBT2肿瘤切片的IHC图像。
图30E提供了以在每个治疗组中CD8阳性细胞分数表示的来自图30A-30D的IHC数据的定量。将切片的坏死区从分析中排除。
图30F提供了在MBT2肿瘤中Ab6和抗PD-1治疗的效果的免疫组织化学分析。在来自如所示的三个治疗组的动物中，针对磷酸化SMAD3(上图)或CD8和CD31(下图)对肿瘤切片进行可视化。
图30G提供了证实Ab6和抗PD-1的组合似乎触发CD8+T细胞动员和从CD31+血管浸润至MBT2肿瘤的数据。
图31A-31D提供了如所示的从4个治疗组的MBT2肿瘤收集的免疫应答标志物Ptprc(图31A)；CD8a(图31B)；CD4(图31C)和Foxp3(图31D)的基因表达。
图32A-32C提供了如所示的在第10天和/或第13天时效应功能标志物Ifng(图32A)；Gzmb(图32B)；Prf1(图32C)的基因表达。
图32D提供了显示在第10天的MBT2肿瘤样品中如通过qPCR所测量的四种基因标志物(颗粒酶B、穿孔素、IFNγ和Klrk1)表达的一组图。每幅图提供了在三个治疗组中表达的倍数变化：单独的抗PD-1(左图)；单独的Ab6(中图)；以及抗PD-1和Ab6的组合(右图)。
图33A显示了如通过基于溶液平衡滴定的测定(MSD-SET)所测量的，Ab6对如所示的四种大型潜在复合物的体外结合。在右侧显示了测得的KD值(以皮摩尔表示)。
图33B示出了基于LN229细胞的效力测定，并提供了显示Ab6对如所示的四种大型潜在复合物的浓度依赖性效力的图。还显示了Ab6不抑制proTGFβ3。
图34A提供了一组九幅图，显示了Ab6与或不与抗PD1和/或抗TGFβ3联用对在EMT6中随着时间的推移肿瘤生长/消退的影响(研究1)。在每幅图中上方的虚线表示终点肿瘤体积为2,000mm3；而在每幅图中下方的虚线表示终点体积的25％(即，500mm3)。
图34B提供了显示在EMT6中随着时间的推移(治疗开始后的天数)的存活百分比(研究1)。与单独的抗PD-1相比，同时包含抗PD-1和Ab6的治疗组显示出显著的存活获益。
图34C提供了显示在EMT6中随着时间的推移(治疗开始后的天数)的存活百分比(研究2)。与单独的抗PD-1相比，同时包含抗PD-1和Ab6的治疗组显示出显著的存活获益，并且抗肿瘤作用在治疗结束后是持久的。
图34D提供了在EMT6乳腺癌模型中抗PD-1和Ab6的组合对存活的作用。
图35提供了显示如通过mRNA水平(左图)和蛋白水平(右图)所测量的在EMT6肿瘤中的三种TGFβ亚型的相对表达的两幅图。
图36A提供了显示网状蛋白(reticulin)的银染的一组组织学图像，其是小鼠骨髓增生性疾病模型中骨髓纤维化表型的标志物。
图36B提供了显示在来自两项独立的重复研究中具有高疾病负荷的MPLW515L小鼠中的骨髓纤维化的组织病理学分析和TGFβ1抑制作用的两幅图。
图36C提供了显示在使用Ab6或对照IgG治疗的MPLW515L小鼠中的血液学参数的一组图。
图36D提供了显示在使用Ab6或对照IgG治疗的MPLW515L小鼠中的其他血液学参数的一组图。
图37A提供了显示TGFβ亚型表达与IPRES基因组之间的相关性的基因组变异分析(GSVA)。
图37B提供了显示TGFβ亚型表达与Plasari基因组之间的相关性的基因组变异分析(GSVA)。TGFb1亚型表达与TGFβ通路激活相关。TGFβ反应性基因的Plasari基因组与多种TCGA注释的肿瘤类型之间的TGFb1 RNA亚型的表达显著密切相关。TGFB1 mRNA与TGFβ信号传导标志(signature)的相关性。
具体实施方式
定义
为了使本发明更易于理解，首先定义某些术语。应根据本公开的其余部分并且如本领域普通技术人员所理解的那样阅读这些定义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
晚期癌症，晚期恶性肿瘤：如本文所用，术语“晚期癌症”或“晚期恶性肿瘤”具有相关领域中所理解的含义，例如，如在诊断或治疗患有癌症的受试者/患者的背景下肿瘤学家所理解的。实体瘤的晚期恶性肿瘤可以是局部晚期或转移性的。术语“局部晚期癌症”用于描述其已经开始向器官外生长但尚未扩散到身体远端的癌症(例如，肿瘤)。因此，该术语包括从其起始处扩散到附近组织或淋巴结的癌症。而相反的是，“转移性癌症”是从其起始的身体部分(原发灶)扩散到身体其他部分(例如，远端部分)的癌症。
亲和性：亲和性是分子(如抗体)与其配体(如抗原)结合的强度。其通常通过平衡解离常数(KD)测量和报告。在抗体-抗原相互作用背景下，KD是抗体解离速率(“解离速率(off rate)”或koff)(抗体从其抗原解离的快速程度)与抗体的抗体结合速率(“结合速率(on rate)”或Kon)(抗体与其抗原结合的快速程度)的比率。例如，通过适宜的体外结合测定所确定的，亲和性≤5nM的抗体的KD值为5nM或更低(即，5nM或更高亲和性)。可以使用适宜的体外测定以测量抗体对于其抗原的KD值，如生物层干涉法(BLI)和溶液平衡滴定(例如，MSD-SET)。
抗体：术语“抗体”包括任何天然存在的、重组的、修饰或工程化的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构或其抗原结合片段或部分，或它们的衍生物，如本文别处进一步所述。因此，该术语意指特异性结合至靶抗原的免疫球蛋白分子，并且包括例如嵌合、人源化、完全人源和双特异性抗体。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包括更少的链，例如天然存在于骆驼科动物中可以仅包含重链的抗体。抗体可以仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以来源于两种不同的抗体。抗体或其抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。如本文所用，术语抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体，抗体融合物(本文中有时称为“抗体缀合物”)。在一些实施方式中，该术语还包括肽体。
抗原：术语“抗原”术语“抗原”广义上包括在抗体或片段特异性结合的一个或多个结合区中包含抗原决定簇的任何分子。抗原可以是单一单元分子(如蛋白单体或片段)或由多重组分构成的复合物。抗原提供表位，例如分子或分子的一部分，或者分子或分子的部分的复合物，其能够被选择性结合剂，如抗原结合部分(包括，例如抗体)结合。因此，选择性结合剂可以特异性结合至由两种或更多种组分形成的呈复合物形式的抗原。在一些实施方式中，抗原能够用于动物中以产生能够结合至该抗原的抗体。抗原可以具有一个或多个能够与不同抗原结合蛋白(例如，抗体)相互作用的表位。在本公开的背景下，适宜的抗原是含有与呈递分子结合的proTGF二聚体的复合物(例如，由相结合的多重组分构成的多聚复合物)。proTGF二聚体的每个单体均包含前域和生长因子结构域，其通过弗林蛋白酶(furin)裂解序列所分隔。两个此类单体形成proTGF二聚体复合物(见图19)。这进而通过二硫键与呈递分子共价相关联，该二硫键涉及存在于每个proTGF单体的N末端附近的半胱氨酸残基。由proTGF二聚体结合至呈递分子形成的这种多复合物通常称为大型潜在复合物(largelatent complex)。适于筛选抗体或抗原结合片段的抗原复合物例如包括大型潜在复合物的呈递分子组分。此类呈递分子组分可以是全长呈递分子或其一个或多个片段。呈递分子的最小所需部分通常含有呈递分子多肽的至少50个氨基酸，但是更优选地至少100个氨基酸，其包含能够与proTGFβ1二聚体形成共价键的两个半胱氨酸残基。
抗原结合部分/片段：如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”意指保留特异性结合抗原(例如，TGFβ1)的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合部分包括但不限于特异性结合至抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。在一些实施方式中，抗体的抗原结合部分可以例如使用任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生而来，例如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变和任选恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子(参见，例如，Bird等，(1988)SCIENCE 242:423-426；和Huston等，(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA85:5879-5883)；(vi)dAb片段(参见，例如，Ward等，(1989)NATURE 341:544-546)；和(vii)由抗体的模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR))。还包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。术语抗体的抗原结合部分包括“单链Fab片段”，也称为“scFab”，其包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头，其中抗体结构域和接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；和其中所述接头是至少30个氨基酸，优选是32至50个氨基酸的多肽。
偏倚：在本公开的背景下，术语“偏倚”是指相对于或针对抗体能够特异性结合的一组抗原的偏斜或不均匀的亲和性。例如，当对一种抗原复合物的亲和性与对另一种抗原复合物的亲和性不等同时，认为抗体具有偏倚。根据本公开的不依赖于背景的抗体对此类抗原复合物具有等同的亲和性(即，无偏倚)。
结合区：如本文所用，“结合区”是抗原的一部分，当与抗体或其片段结合时，其能够形成抗体-抗原相互作用的界面。在抗体结合后，结合区变得不受保护暴露表面，可以通过适宜的技术(如HDX-MS)进行检测。抗体-抗原相互作用可以通过多个(例如，两个或更多个)结合区来介导。结合区可以包含抗原决定簇或表位。
生物层干涉法(BLI)：BLI是一种无标记技术，用于光学测量生物分子之间的相互作用，例如，固定在生物传感器尖端表面上的配体与溶液中的分析物之间。BLI提供了以精密度和准确性监测结合特异性、结合和解离速率或浓度的能力。BLI平台仪器可以例如从ForteBio购买获得，并且通常称为
Figure BDA0002970630990000101
系统。
癌症：如本文所用，术语“癌症”意指在多细胞真核生物中的生理状况，其典型特征是不受调节的细胞增殖和恶性肿瘤。因此，该术语广泛地包括实体和液体恶性肿瘤，包括肿瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)，以及骨髓纤维化。
细胞相关proTGFβ1：该术语指膜结合(例如，与细胞表面系链)的TGFβ1或其信号传导复合物(例如，前/潜在TGFβ1)。通常，这样的细胞是免疫细胞。由GARP或LRRC33呈递的TGFβ1是细胞相关TGFβ1。GARP和LRRC33是在某些细胞的细胞表面上表达的跨膜分子。GARP-proTGFβ1和LRRC33-可以统称为“细胞相关的”(或“细胞表面”)proTGFβ1复合物，其介导细胞proTGFβ1相关的(例如，免疫细胞相关的)TGFβ1激活/信号传导。该术语还包括未物理附着在细胞膜上的在溶液中的重组的、纯化的GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1复合物(例如，在体外测定中)。可以计算针对GARP-proTGFβ1复合物和LRRC33-proTGFβ1复合物的抗体(或其片段)的平均KD值，以共同表示针对细胞相关的(例如，免疫细胞相关的)proTGFβ1复合物的亲和性。参见，例如，表8，列(G)。呈递分子或呈递分子复合物的人类对应物可以由蛋白或蛋白复合物前面的“h”表示，例如“hGARP”、“hGARP-proTGFβ1”、“hLRRC33”和“hLRRC33-proTGFβ1”。除了阻止活性TGFβ1生长因子从细胞系链的复合物中释放外，细胞相关的proTGFβ1可能是内化(例如，内吞作用)和/或细胞杀伤的靶点，如ADCC、ADCP或ADC介导的表达这种细胞表面复合物的靶细胞的耗竭。
检查点抑制剂：在本公开的背景中，检查点抑制剂意指免疫检查点抑制剂并且具有如本领域理解的含义。通常，靶标是T细胞或NK细胞上的受体分子，或是抗原呈递细胞(APC)或肿瘤细胞上的相应细胞表面配体。免疫检查点在免疫细胞中被激活以防止针对“自身”的炎性免疫发展。因此，通过检查点抑制来改变免疫系统的平衡应该允许它被完全激活以检测和消除癌症。涉及免疫应答控制的最著名的抑制性受体是细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L1、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM3)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)和含有V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞激活抑制因子(VISTA)。检查点抑制剂的非限制性实例包括：纳武单抗、派姆单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、Avelumab、度伐单抗、伊匹单抗、Tremelimumab、IMP-321、BMS-986016和Lirilumab。
Figure BDA0002970630990000102
是PD-1抑制剂的一个实例。采用一种或多种免疫检查点抑制剂的疗法可以称为检查点阻断疗法(CBT)。
临床益处：如本文所用，术语“临床益处”旨在包括治疗的功效和安全性两者。因此，实现期望的临床益处的治疗性处理是既有效(例如，达到治疗性有益效果)又安全(例如，具有可耐受或可接受的毒性或不良事件水平)。
联合疗法：“联合疗法”是指用于临床适应症的治疗方案，其包含两种或更多种治疗剂。因此，该术语意指一种治疗方案，其中包含第一组合物(例如，活性成分)的第一疗法与包含第二组合物(活性成分)的第二疗法共同(in conjunction with)施用至患者，旨在治疗相同或重叠的疾病或临床状况。第一和第二组合物可以都作用于相同的细胞靶标或不同的细胞靶标。在联合疗法的情形中，短语“共同”意指第一疗法的治疗效果在接受联合疗法的受试者中在时间和/或空间上与第二疗法的治疗效果重叠。因此，联合疗法可以配制成单一制剂，用于同时施用，或者配制成单独的制剂，用于疗法的顺序施用。当向已经用第一疗法治疗过疾病的对象施用第二疗法来治疗相同疾病时，可以将第二疗法称为附加疗法或辅助疗法。
组合表位(combinatory or combinatorial epitope)：组合表位是由组合抗体在由抗原的一个或多个组分的非连续部分形成的位点(即，非抗原决定簇)处识别并结合的表位，所述抗原的一个或多个组分在三维结构中汇合在一起紧密结合以形成表位。因此，本发明的抗体可结合由前/潜在TGFβ1复合物的两种或多种组分(例如，部分或区段)形成的表位。组合表位可包含来自复合物的第一组分的氨基酸残基，和来自复合物的第二组分的氨基酸残基，等等。每种组分可以是抗原复合物的单一蛋白质或两种或更多种蛋白质。组合表位由来自抗原或抗原复合物的两种或更多种组分(例如，部分或区段，例如氨基酸残基)的结构贡献而形成。
竞争或交叉竞争；交叉阻断：在竞争相同表位的抗原结合蛋白的背景中使用时，术语“竞争”(例如，抗体或其抗原结合部分)意为由测定所测量的抗原结合蛋白之间的竞争，其中所测试的抗原结合蛋白阻止或抑制(例如，降低)参考抗原结合蛋白与共同抗原(例如，TGFβ1或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争结合，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测试、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA、固相直接标记测试和固相直接标记夹心测试。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它会抑制(例如，降低)至少40-45％、45-50％、50-55％，55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多的参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在一些情况下，至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多的结合被抑制。
在一些实施方式中，第一抗体或其抗原结合部分和第二抗体或其抗原结合部分就相同抗原彼此“交叉阻断”，例如，由Biacor或
Figure BDA0002970630990000111
所测定，使用标准测试条件。例如，根据制造商的说明(例如，在室温下测定结合，～20-25℃)。在一些实施方式中，第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可具有相同的表位。在其他实施方式中，第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可具有不完全相同但重叠的表位。在更进一步的实施方式中，第一抗体或其片段和第二抗体或其片段可以具有在三维空间中非常接近的分开的(不同的)表位，使得抗体结合通过空间位阻交叉阻断。“交叉阻断”是指第一抗体与抗原的结合阻止第二抗体与相同抗原的结合，并且类似地，第二抗体与抗原的结合阻止第一抗体与相同抗原的结合。
可以进行抗体分组(binning)(有时称为表位分组或表位作图)以对针对目标蛋白或蛋白复合物(即，抗原)制备的单克隆抗体的集合(例如，“文库”)进行表征和分选。将针对相同靶点的此类抗体针对文库中的所有其他抗体以成对方式进行检测，以评估抗体是否阻断彼此与抗原的结合。紧密相关的分组特性(profile)表明抗体相同或紧密相关(例如，重叠)的表位，并且被“分组”在一起。分组提供了在相同抗原内共用相似结合区的抗体的有用结构-功能特性，因为通过将抗体预期靶点结合而实现的生物学活性(例如，干预；效力)可能会转移到同一分组(bin)中的另一个抗体上。因此，在相同抗原分组内的抗体中，具有较高亲和性(较低KD)的那些通常具有更高效力。
互补决定区：如本文所用，术语“CDR”意指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，其被称为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用，术语“CDR组”意指在可以结合抗原的单个可变区中存在的三个CDR的组。这些CDR的确切边界根据不同的系统被不同地界定。由Kabat描述的系统(Kabat等，(1987；1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.))不仅提供了适用于抗体任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；和Chothia等，(1989)Nature 342:877-883)发现Kabat CDR中的某些子部分采用了几乎相同的肽骨架构象，尽管其在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些子部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已在Padlan(1995)FASEB J.9:133-139和MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-45中有所描述。其他CDR边界定义可能并不严格遵循本文系统中的任一个，但仍将与Kabat CDR重叠，尽管它们可以基于特定残基或残基组甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现而缩短或延长(参见，例如：Lu X等，MAbs.2019Jan；11(1):45-57)。本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR，尽管某些实施方式使用Kabat或Chothia定义的CDR。
构象表位：构象表位是在三维构象中被构象抗体识别并结合的表位，但在相同氨基酸序列的未折叠肽中则不是。可以将构象表位称为构象特异性表位、构象依赖性表位或构象敏感性表位。特异性结合这样的表位的相应抗体或其片段可称为构象特异性抗体、构象选择性抗体或构象依赖性抗体。抗原与构象表位的结合取决于所述抗原或抗原复合物的三维结构(构象)。
恒定区：免疫球蛋白恒定结构域意指重链或轻链的恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
背景偏倚的：如本文所用，“背景偏倚的抗体”是指当抗原与相互作用的蛋白或其片段结合(即，结合至或附着至)时，以不同亲和性结合抗原的构象抗体类型。因此，与proTGFβ1内的表位特异性结合的背景许可性抗体可能以不同亲和性结合LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。例如，如果其对基质相关proTGFβ1复合物(例如，LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1)比细胞相关proTGFβ1复合物(例如，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)具有更高亲和性，则将抗体称为是“基质偏倚的”。[基质相关复合物]：[细胞相关复合物]的相对亲和性可以通过取前者的平均KD值，取后者的平均KD值，并计算两者的比率来获得，如本文中所示例的。
不依赖于背景的：根据本公开，结合proTGFβ1的“不依赖于背景的抗体”在四种已知的呈递分子-proTGFβ1复合物(即LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)之间具有等同的亲和性。也可以将本申请公开的不依赖于背景的抗体表示为无偏倚的。通常，不依赖于背景的抗体显示出等同的(即，偏倚不超过五倍的)亲和性，使得如通过适宜的体外结合测定(如表面等离子体共振、生物层干涉法(BLI)和/或溶液平衡滴定(例如，MSD-SET))所测量的基质相关复合物与细胞相关复合物之间所测量的KD值的相对比率不超过5。
ECM相关TGFβ1/proTGFβ1：该术语意指是(例如，沉积入)细胞外基质的组分的TGFβ1或其信号传导复合物(例如，前/潜在TGFβ1)。由LTBP1或LTBP3呈递的TGFβ1是ECM相关的TGFβ1(分别称为LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1)。LTBP对于ECM中TGFβ的正确沉积和随后的生物利用度至关重要，其中原纤维蛋白(Fbn)和纤连蛋白(FN)被认为是负责LTBP与ECM结合的主要基质蛋白。此类基质相关潜在复合物在结缔组织以及某些疾病相关组织(如肿瘤基质和纤维化组织)中富集。呈递分子或呈递分子复合物的人类对应物可以由蛋白或蛋白复合物前面的“h”表示，例如“hLTBP1”、“hLTBP1-proTGFβ1”、“hLTBP3”和“hLTBP3-proTGFβ1”。
有效量：“有效量”(或治疗有效量，或治疗剂量)为在患者人群中达到统计学上显著的临床获益(例如，功效)的剂量或给药方案。例如，在临床前模型中，在低至3mg/kg和高至30mg/kg的剂量下，Ab6已显示有效。因此，可以说Ab6的有效量在约3-30mg/kg之间。
有效肿瘤控制：术语“有效肿瘤控制”可以用于指响应于治疗而实现的肿瘤消退的程度，其中，例如，肿瘤消退呈终点肿瘤体积的确定分数(如<25％)。例如，在特定模型中，如果将终点肿瘤体积设定为2,000mm3，则肿瘤缩小至小于500mm3(假定阈值<25％)，达到有效肿瘤控制。因此，有效肿瘤控制包括完全消退。在临床上，有效肿瘤控制包括基于本领域公认的标准(如RECIST 1.1和相应iRECIST)的部分缓解(PR)和完全缓解(CR)。在一些实施方式中，在临床背景中的有效肿瘤控制还包括病情稳定，其中即使无法实现缩小，但通过治疗仍可防止通常预期以一定速率生长的肿瘤生长。
效应T细胞：如本文所用，效应T细胞为立即对刺激(如共刺激)产生积极应答的T淋巴细胞，并且包括但不限于CD4+T细胞(也称为T辅助细胞或Th细胞)和CD8+T细胞(也称为细胞毒性T细胞)。Th细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。由于在其表面上表达CD4糖蛋白，因而也将这些细胞称为CD4+T细胞。当辅助T细胞被在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子给予肽抗原呈递时，其被激活。一旦激活，其迅速分裂并分泌调控或辅助活性免疫应答的称为细胞因子的小蛋白。这些细胞可分化成若干亚型之一，包括Th1、Th2、Th3、Th17、Th9或TFh，其分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导将T细胞定向为特定亚型。细胞毒性(杀伤)。另一方面，细胞毒性T细胞(TC细胞、CTL、T杀伤细胞、杀伤性T细胞)破坏病毒感染的细胞和癌细胞，还与移植排斥有关。由于在其表面上表达CD8糖蛋白，因而也将这些细胞称为CD8+T细胞。这些细胞通过结合至存在于所有有核细胞表面上的与MHC I类分子相关的抗原来识别其靶点。细胞毒性效应细胞(例如，CD8+细胞)包括例如穿孔素和颗粒酶B。
表位：术语“表位”也可以称为抗原决定簇，是可以被结合剂、免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的分子决定簇(例如，多肽决定簇)。表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。被抗体或抗体的抗原结合片段识别的表位是与抗体或片段的CDR(例如，互补位点)相互作用的抗原的结构元件。表位可以由几个氨基酸残基的贡献形成，这些残基与抗体的CDR相互作用以产生特异性。抗原片段可以含有一个以上表位。在某些实施方式中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中识别其靶抗原时，其特异性结合抗原。例如，如果抗体交叉竞争(一种抗体阻止另一种抗体的结合或调节作用)，则将这些抗体称为“结合至相同表位”。
等同亲和性：在本公开的背景下，术语“等同亲和性”旨在表示：i)如通过适宜体外结合测定(如溶液平衡滴定(如MSD-SET)、生物层干涉法(如
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)或表面等离子体共振(如Biacore系统))所测量的，抗体以小于5倍的亲和性偏倚结合基质相关proTGFb1复合物和细胞相关proTGFb1复合物；和/或ii)抗体对四种复合物的相对亲和性是均一的，其中：抗体在四种抗原复合物中显示的最低亲和性(最高KD数值)不比由其余三个亲和性计算的平均值低超过五倍；或者，抗体在四种抗原复合物中显示的最高亲和性(最低KD数值)不比由其余三个亲和性计算的平均值高超过五倍。具有相同亲和性的抗体可以达到更均一的抑制效应，而与proTGFβ1复合物结合的特定呈递分子无关(因此“不依赖于背景”)。在特别优选的实施方式中，在基质相关复合物和细胞相关复合物之间观察到的平均亲和性偏倚不超过三倍。
延伸的潜伏套索：如本文所用，术语“延伸的潜伏套索”指包含潜伏套索和α-2螺旋(例如，LASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTR(SEQ ID NO:154))的前域的一部分。在一些实施方式中，延伸的潜伏套索还包含α-1螺旋的一部分(例如，LVKRKRIEA(SEQ ID NO:159))或其部分。
纤维化：术语“纤维化”或“纤维化症状/病症”意指其特征在于组织或器官内细胞外基质(ECM)组分(例如胶原蛋白)病理性积累的过程或表现。
纤维化微环境：术语“纤维化微环境”指组织内的局部疾病生态位(niche)，在其中在体内发生纤维化。纤维化微环境可以包含疾病相关分子标记(一组趋化因子、细胞因子等)、疾病相关细胞群(如激活的巨噬细胞、MDSC等)以及疾病相关的ECM环境(ECM组分和/或结构有变化)。认为纤维化微环境会支持成纤维细胞以TGFβ依赖性方式转化成α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞。还可以通过某些免疫细胞(如巨噬细胞和MDSC)的浸润进一步表征纤维化微环境。
(TGFβ1生长因子的)指-1：如本文所用，“指-1”是TGFβ1生长因子结构域内的结构域。在其未突变形式中，人proTGFβ1的指-1含有下述氨基酸序列：CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFC(SEQ ID NO:151)。在3D结构中，指-1结构域(部分如图18和图19中的区“5a”所示)非常接近潜伏套索。
(TGFβ1生长因子的)指-2：如本文所用，“指-2”是TGFβ1生长因子结构域内的结构域。在其未突变形式中，人proTGFβ1的指-2含有下述氨基酸序列：CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS(SEQ ID NO:152)。指-2包含图18和图19中所描述的“结合区6”(即，“6a”和“6b”)，其在空间上非常接近于潜伏套索。
GARP-proTGFβ1复合物：如本文所用，术语“GARP-TGFβ1复合物”指含有转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白的原蛋白形式或潜在形式以及以糖蛋白-A重复序列为主型蛋白(GARP)或其片段或变体的蛋白复合物。在一些实施方式中，可以将TGFβ1蛋白的原蛋白形式或潜在形式称为“前/潜在TGFβ1蛋白”。在一些实施方式中，GARP-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的GARP。本质上，此类共价键由接近于proTGFβ1二聚体复合物的N末端(例如，氨基酸位置4)存在的半胱氨酸残基形成。在其他实施方式中，GARP-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的GARP。在一些实施方式中，GARP-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的GARP-TGFβ1复合物。术语“hGARP”表示人GARP。
高亲和性：如本文所用，如在“高亲和性proTGFβ1抗体”中的术语“高亲和性”指KD值≤5nM(更优选地≤1nM)的结合活性。因此，由本文中本发明涵盖的高亲和性、不依赖于背景的proTGFβ1抗体对下述抗原复合物中的每一者具有≤5nM(更优选地≤1nM)的KD值：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。
人抗体：如本文所用，术语“人抗体”旨在包括来源于人种系免疫球蛋白序列的具有可变和恒定区域的抗体。本发明中的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
人源化抗体：术语“人源化抗体”意指这样的抗体，其包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变结构域序列，但其中至少一部分VH和/或VL序列已被改变为更类似“人样”，即更类似于人种系的可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR移植抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列中以替换相应的非人CDR序列。此外，“人源化抗体”是抗体、或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性地结合至感兴趣的抗原并且其包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的FR区和具有基本上非人抗体的氨基酸序列的CDR区。如本文所用，术语“基本上”在CDR的背景中意指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本上包含至少一个、通常是两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方式中，人源化抗体还包含免疫球蛋白Fc区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc区的一部分。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。所述抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方式中，人源化抗体仅含有人源化的轻链可变结构域和/或人源化的重链。
氢/氘交换质谱法(HDX-MS)：HDX-MS是一种众所周知的技术，可通过测量溶剂可接近性程度来查询蛋白确认和溶液中的蛋白-蛋白相互作用。参见，例如，Wei等，(2014)DrugDiscov Today 19(1):95-102。“Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry forprobing higher order structure of protein therapeutics:methodology andapplications”。HDX-MS技术可用于确定被抗体结合的抗原的一个或多个区(即，“一个或多个结合区”)。因此，此类一个或多个结合区可以含有或形成表位。
免疫排除或免疫排除肿瘤：如本文所用，表征为“免疫排除”的肿瘤不含或实质上不含瘤内抗肿瘤淋巴细胞。例如，T细胞浸润不良的肿瘤可能具有围绕肿瘤的T细胞，例如，肿瘤块的外周和/或肿瘤的脉管系统(“血管周围”)附近，但其不能有效地涌入肿瘤以发挥针对癌细胞的细胞毒性功能。在其他情况下，肿瘤无法激发强烈的免疫应答(所谓的“冷”或“免疫沙漠”肿瘤)，使得在肿瘤环境附近和环境中几乎没有T细胞存在。与免疫排除肿瘤不同的是，被抗肿瘤淋巴细胞浸润的肿瘤有时被称为“热”或“发炎”的肿瘤；此类肿瘤往往对免疫的反应性更强，因此是免疫检查点阻断疗法(“CBT”)的靶点。然而，通常，由于免疫排除，仅有一小部分患者对CBT产生应答，从而使肿瘤对CBT产生抗性。
免疫抑制，免疫抑制的：该术语指抑制免疫细胞(如T细胞、NK细胞和B细胞)的能力。评价免疫抑制功能的金标准是抑制T细胞活性，其可以包括抗原特异性抑制和非特异性抑制。可以将调节性T细胞(Treg)和MDSC认为是免疫抑制细胞。M2极化的巨噬细胞(例如，疾病定位的巨噬细胞，如TAM和FAM)也可以被表征为免疫抑制性的。
免疫记忆：免疫记忆指免疫系统快速和特异性识别机体此前遇到的抗原并启动相应免疫应答的能力。在通常情况下，这些是对相同抗原的二级、三级和其他后续免疫应答。免疫记忆负责免疫系统的适应性部分，即特殊T细胞和B细胞——所谓的记忆T细胞和B细胞。在遇到专业抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)表面上的MHC分子的环境中的同源抗原后，未接触抗原的T细胞扩增并分化成记忆和效应T细胞。所有记忆T细胞亚型的单一统一主题是其寿命长，并且在重新暴露于其同源抗原后可以迅速扩增成大量效应T细胞。通过这种机制，其为免疫系统提供了针对此前遇到的病原体的“记忆”。记忆T细胞可以是CD4+或CD8+，并且通常表达CD45RO。在临床前背景中，可以在肿瘤再次攻击范例中检测免疫记忆。
亚型特异性：术语“亚型特异性”意指试剂区分一种亚型与其他结构上相关的亚型(即，选择性)的能力。亚型特异性TGFβ抑制剂在给定浓度下对TGFβ的一种亚型发挥其抑制活性，但不对TGFβ的其他亚型发挥抑制活性。例如，亚型特异性TGFβ1抗体选择性地结合TGFβ1。TGFβ1特异性抑制剂(抗体)以显著更高的亲和性优先于TGFβ2或TGFβ3靶向(结合从而抑制)TGFβ1亚型。例如，在这种背景下的选择性可以指通过体外结合测定例如
Figure BDA0002970630990000161
和Biacor测量的相应亲和力的至少500-1000倍的差异。在一些实施方式中，所述选择性是指当抑制剂以有效抑制体内TGFβ1的剂量使用时不抑制TGFβ2和TGFβ3。为了使这样的抑制剂可用作治疗剂，达到期望效果的剂量(例如，治疗有效量)必须落入所述抑制剂可有效抑制TGFβ1亚型而不抑制TGFβ2或TGFβ3的窗口内。
分离的：如本文所用，“分离的”抗体意指基本上不含有其他抗体的抗体，所述其他抗体具有不同的抗原特异性。在一些实施方式中，分离的抗体基本上不含有其他非预期的细胞物质和/或化学物质。
大型潜在复合物：在本公开的背景下，术语“大型潜在复合物”(“LLC”)指由proTGFβ1二聚体结合至所谓的呈递分子构成的复合物。因此，大型潜在复合物是呈递分子-proTGFβ1复合物，如LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。可以使用能够形成复合物的重组的纯化组分在体外形成此类复合物。出于筛选目的，用于形成这种LLC的呈递分子不必是全长多肽；然而，通常需要蛋白的一部分能够通过其N端区域附近的半胱氨酸残基与proTGFβ1二聚体形成二硫键。
潜在相关肽(LAP)：LAP被称为proTGFβ1的“前结构域”。如在本文中更加详细描述的，LAP由“约束衣(Straight Jacket)”结构域和“臂”结构域组成。约束衣本身进一步分成α-1螺旋和潜伏套索结构域。
潜伏套索：如本文所用，“潜伏套索”有时也称为潜伏环，是proTGFb1的前结构域内α-1螺旋和臂侧翼的结构域。在其未突变形式中，人proTGFβ1的潜伏套索包含氨基酸序列：LASPPSQGEVPPGPL(SEQ ID NO:153)，且实质上对应于图18A中所示的区“2a”和“2b”，并被图19A中标识的区1跨越。如本文所用，术语“延伸的潜伏套索区”指潜伏套索连同其被称为前结构域的α-2螺旋(α2-螺旋)的最接近的C末端基序。潜伏套索的C末端处的脯氨酸残基提供了垂直的“转弯(turn)”，就像将套索的环连接到α2-螺旋的“肘(elbow)”一样。延伸的潜伏套索包含如图18和图19中的“2a”、“2b”和“2c”所示的区域。某些高亲和性TGFβ1激活抑制剂至少部分结合潜伏套索或其一部分以赋予抑制效力(例如，阻断激活的能力)，其中任选地，潜伏套索的该部分是ASPPSQGEVPPGPL(SEQ ID NO:266)。在一些实施方式中，本公开的抗体在ASPPSQGEVPPGPL(SEQ ID NO:266)或其一部分结合至proTGFβ1复合物。某些高亲和性TGFβ1激活抑制剂至少部分结合延长的潜伏套索或其一部分以赋予抑制效力(例如，阻断激活的能力)，其中任选地，延长的潜伏套索的该部分是KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQ ID NO:169)。
局部的：在本公开的背景下，术语“局部的”(如在“局部肿瘤”、“局部疾病”等)意指在解剖学上分离的或可分离的异常物，如实体瘤，而非全身性疾病。例如，某些白血病可能具有疾病的局部组分(例如骨髓)和全身组分(例如循环的血细胞)两者。
LRRC33-proTGFβ1复合物：如本文所用，术语“LRRC33-TGFβ1复合物”意指前蛋白形式或潜在形式的转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白与富亮氨酸的重复序列蛋白33(LRRC33；也称为活性氧物质或NRROS的负调节剂)或其片段或变体之间形成的复合物。在一些实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的LRRC33。实际上，此类共价键与proTGFβ1二聚体复合物的N末端(例如，氨基酸位置4)附近存在的半胱氨酸残基形成。在其他实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的LRRC33。在一些实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的LRRC33-TGFβ1复合物。术语“hLRRC33”表示人LRRC33。在体内，细胞表面上的LRRC33和含有LRRC33的复合物可以被内化。LRRC33在包括M2极化的巨噬细胞(如TAM)和MDSC在内的髓样细胞子集上表达。
LTBP1-proTGFβ1复合物：如本文所用，术语“LTBP1-TGFβ1复合物”意指包含前蛋白形式或潜在形式的转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白与潜在TGF-β结合蛋白1(LTBP1)或其片段或变体的蛋白复合物。在一些实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的LTBP1。实际上，此类共价键与proTGFβ1二聚体复合物的N末端(例如，氨基酸位置4)附近存在的半胱氨酸残基形成。在其他实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的LTBP1。在一些实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的LTBP1-TGFβ1复合物。术语“hLTBP1”表示人LTBP1。
LTBP3-proTGFβ1复合物：如本文所用，术语“LTBP3-TGFβ1复合物”意指包含前蛋白形式或潜在形式的转化生长因子-β1(TGFβ1)蛋白和潜在TGF-β结合蛋白3(LTBP3)或其片段或变体的蛋白复合物。在一些实施方式中，LTBP3-TGFβ1复合物包含通过一个或多个二硫键与前/潜在TGFβ1共价连接的LTBP3。实际上，此类共价键与proTGFβ1二聚体复合物的N末端(例如，氨基酸位置4)附近存在的半胱氨酸残基形成。在其他实施方式中，LTBP3-TGFβ1复合物包含与前/潜在TGFβ1非共价连接的LTBP1。在一些实施方式中，LTBP3-TGFβ1复合物是天然存在的复合物，例如细胞中的LTBP3-TGFβ1复合物。术语“hLTBP3”表示人LTBP3。
M2或M2样巨噬细胞：M2巨噬细胞代表激活的或极化的巨噬细胞的子集，并且在纤维化和肿瘤微环境中都包含与疾病相关的巨噬细胞。M2极化的巨噬细胞的细胞表面标志物通常包括CD206和CD163(即，CD206+/CD163+)。M2极化的巨噬细胞还可以表达细胞表面LRRC33。M2巨噬细胞的激活主要由IL-4、IL-13、IL-10和TGFβ促进；其分泌激活其的相同细胞因子(IL-4、IL-13、IL-10和TGFβ)。这些细胞具有高吞噬能力，并且产生ECM组分、血管生成和趋化因子。由巨噬细胞释放TGFβ可以维持在疾病组织(如纤维化组织和肿瘤基质)中的肌成纤维细胞激活、EMT和EndMT诱导。例如，M2巨噬细胞对于TGFβ驱动的肺纤维化必不可少且富集在数种肿瘤中。
基质相关的proTGFβ1：LTBP1和LTBP3呈递分子是细胞外基质(ECM)的组分。LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1可以统称为“ECM相关的”(或“基质相关的”)proTGFβ1复合物，其介导与ECM相关的TGFβ1激活/信号传导。该术语还包括在溶液中的重组的、纯化的LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1复合物(例如，在体外测定中)，其未物理上附着在基质或物质上。
最大耐受剂量(MTD)：出于安全/毒理学考虑，术语MTD通常指以无可见不良反应水平(NOAEL)评价的最高量的待测物(如TGFβ1抑制剂)。例如，在大鼠中Ab6的NOAEL是评价的最高剂量(100mg/kg)，表明基于四周的毒理学研究，Ab6的MTD>100mg/kg。在非人灵长类中Ab6的NOAEL是评价的最高剂量(300mg/kg)，表明基于四周的毒理学研究，在非人灵长类中Ab6的MTD>300mg/kg。
Meso-Scale Discovery：“Meso-Scale Discovery”或“MSD”是一种采用电化学发光(ECL)作为检测技术的免疫测定的类型。通常，使用高结合碳电极来捕获蛋白(例如，抗体)。抗体可以与特定抗原一起孵育，可用与电化学发光标记缀合的二抗检测其结合。出现电信号后，可以测量光强度以对样品中的分析物进行定量。
骨髓纤维化：“骨髓纤维化”，也称为骨髓纤维化，是一种相对罕见的骨髓增生性疾病(例如，癌症)，其属于一组被称为骨髓增生异常的疾病。骨髓纤维化被分类为骨髓增生性肿瘤的费城染色体阴性(-)分支。骨髓纤维化的特征在于骨髓中和其他部位的造血干细胞的异常克隆的增殖导致纤维化，或是瘢痕组织替代骨髓。术语骨髓纤维化涵盖原发性骨髓纤维化(PMF)，也称为慢性特发性骨髓纤维化(cIMF)(术语特发性和原发性意味着在这些情况下该疾病是未知的或自发的起源)，以及继发性骨髓纤维化类型，如继发于真性红细胞增多症(PV)或原发性血小板增多症(ET)的骨髓纤维化。骨髓纤维化是骨髓化生的一种形式，其指的是骨髓的血液形成组织中细胞类型的变化，并且通常这两个术语同义使用。术语同源性髓样化生和骨髓纤维化伴髓样化生(MMM)的术语也可用于指原发性骨髓纤维化。骨髓纤维化的特征是引起下游JAK途径上调或过度激活的突变。
髓样细胞：在造血过程中，髓样细胞是由粒细胞、单核细胞、红细胞或血小板的祖细胞(常见的髓样祖细胞，即CMP或CFU-GEMM)产生的血细胞，或者在狭义上也经常使用，特别是来自骨髓母细胞(骨髓细胞、单核细胞及其子代类型)的谱系，其区别于来自产生B细胞和T细胞的常见淋巴样祖细胞的淋巴样细胞(即淋巴细胞)。下面总结了在小鼠和人中的某些髓样细胞类型，其一般形态、典型细胞表面标志物及其免疫抑制能力。
Figure BDA0002970630990000181
Figure BDA0002970630990000191
骨髓来源的抑制细胞：骨髓来源的抑制细胞(MDSC)是在各种病理条件下产生的异质性细胞群，并且其被认为代表单核细胞和相对不成熟的中性粒细胞激活的病理状态。MDSC至少包括两类细胞，其被称为i)“粒细胞”(G-MDSC)或多形核细胞(PMN-MDSC)，其在表型和形态上均与中性粒细胞相似；和ii)单核细胞(M-MDSC)，其在表型和形态上与单核细胞相似。MDSC具有独特的基因组和生化特征集合，并且可以通过特定的表面分子来区分。例如，人G-MDSC/PMN-MDSC通常表达细胞表面标志物CD11b、CD33、CD15和CD66。此外，人G-MDSC/PMN-MDSC还表达HLA-DR和/或精氨酸酶。相比之下，人M-MDSC通常表达细胞表面标志物CD11b、CD33和CD14。此外，人M-MDSC还可以表达HLA-DR。除了此类细胞表面标志物以外，MDSC具有抑制免疫细胞(如T细胞、NK细胞和B细胞)的能力。MDSC的免疫抑制功能可以包括抑制抗原非特异性功能和抑制抗原特异性功能。MDSC可以表达细胞表面LRRC33和/或LRRC33-proTGFβ1。
肌成纤维细胞：肌成纤维细胞是具有成纤维细胞和平滑肌细胞的某些表型的细胞，通常表达波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；人基因ACTA2)和帕拉丁蛋白(paladin)。在涉及细胞外基质失调(如基质硬度增加)的多种疾病状态中，正常成纤维细胞以TGFβ依赖性方式变得去分化成肌成纤维细胞。TGFβ的异常过表达在肌成纤维细胞驱动的病变中是常见的。已知TGFβ会促进肌成纤维细胞分化、细胞增殖和基质产生。可以将在纤维化微环境中的肌成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞称为纤维化相关的成纤维细胞(或“FAF”)，以及可以将肿瘤微环境中的肌成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞称为癌症相关的成纤维细胞(或“CAF”)。
泛-TGFβ抑制剂/TGFβ的泛抑制：术语“泛-TGFβ抑制剂”指能够抑制或拮抗TGFβ的全部三种亚型的任何药剂。此类抑制剂可以是TGFβ亚型的小分子抑制剂，如本领域公知的那些。该术语包括泛-TGFβ抗体，其指能够结合至每种TGFβ亚型(即，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的任何抗体。在一些实施方式中，泛-TGFβ抗体结合并中和全部三种亚型(即，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的活性。抗体1D11(或人类似物Fresolimumab(GC1008))是泛-TGFβ抗体众所周知的实例，其中和TGFβ的全部三种亚型。小分子泛TGFβ抑制剂的实例包括galunisertib(LY2157299一水合物)，其是介导全部三种TGFβ亚型的信号传导的TGFβ受体I激酶/ALK5的拮抗剂。
血管周围(浸润)：前缀“peri-”指“周围(around)”、“周围(surrounding)”或“附近(near)”，因此“血管周围”字面上翻译为血管的周围。如本文在肿瘤细胞浸润的背景下所使用的，术语“血管周围浸润”指肿瘤浸润免疫细胞(例如，淋巴细胞)通过实体瘤的血管的进入模式。
效力：如本文所用，术语“效力”指药物(如具有抑制活性的抑制性抗体(或片段))相对于产生限定作用的所述药物的浓度或量的活性。例如，能够在给定剂量下产生某些作用的抗体要比为产生等效作用需要两倍所述量(剂量)的另一抗体强效。可以在基于细胞的测定法(如TGFβ激活/抑制测定)中测量效力，从而可以在基于细胞的系统中在存在或不存在待测物(例如，抑制性抗体)的条件下测量TGFβ激活(如由整联蛋白结合而触发的激活)的程度。通常，在能够结合至抗原的相同或重叠结合区域的那些(例如，交叉阻断抗体)中，具有较高亲和性(较低KD值)的抗体倾向于显示出比具有较低亲和性(较高KD值)的抗体更高的效力。
呈递分子：在本公开的背景下，呈递分子指与潜在的前蛋白(例如，proTGFβ1)形成共价键，并将无活性复合物栓系(“呈递”)到胞外生态位(如ECM或免疫细胞表面)，从而保持其潜伏直至激活事件发生为止的蛋白。针对proTGFβ1的已知呈递分子包括：LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33，其各自可分别形成呈递分子proTGFβ1复合物(即，LLC)，称为LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。实际上，LTBP1和LTBP3是胞外基质(ECM)的组分；因此，可以将LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1统称为“ECM相关的”(或“基质相关的”)proTGFβ1复合物，其介导ECM-相关的TGFβ1信号传导/活性。另一方面，GARP和LRRC33是在某些细胞的细胞表面表达的跨膜蛋白；因此，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1可以统称为“细胞相关”(或“细胞表面”)proTGFβ1复合物，其介导细胞相关的(例如，免疫细胞相关的)TGFβ1信号传导/活性。
保护(避免溶剂暴露)：在蛋白-蛋白相互作用(如抗体-抗原结合)的基于HDX-MS的评估的背景下，蛋白(例如，含有表位的蛋白的区域)暴露于溶剂，从而使得质子交换发生的程度与结合/相互作用的程度负相关。因此，当本文中所述的抗体结合至抗原的区域时，结合区是“被保护的”而避免暴露于溶剂，因为蛋白-蛋白相互作用会阻止结合区被周围的溶剂接近。因此，被保护的区域指示相互作用的位点。通常，适宜溶剂是生理缓冲液。
ProTGFβ1：如本文所用，术语“proTGFβ1”旨在涵盖包含复合物中TGFβ1的前结构域序列的不具有活性的TGFβ1复合物的前体形式。因此，该术语可包括TGFβ1的前体以及潜在形式。表述“前/潜在TGFβ1”可互换使用。TGFβ1的“前体”形式存在于弗林位点处蛋白水解切割之前。一旦切割，所得的形式称为TGFβ1的“潜在”形式。“潜在”复合物保持关联直到进一步激活触发，例如整联蛋白驱动的激活事件。proTGFβ1复合物由与二硫键连接的二聚体TGFβ1前蛋白多肽组成。潜在的二聚体复合物通过每个proTGFβ1多肽第4位(Cys4)处的半胱氨酸残基共价连接至单个呈递分子。形容词“潜在”可在整联蛋白介导的或其他激活事件之间，通常/广泛用于描述TGFβ1的“失活”状态。proTGFβ1多肽含有前结构域(LAP)和生长因子结构域(SEQ ID NO:146)。
消退(肿瘤消退)：可以将肿瘤或肿瘤生长的消退用作体内功效指标。例如，在临床前背景下，中位肿瘤体积(MTV)和消退应答治疗功效的标准可由在最后一天研究中剩余动物的肿瘤体积确定。治疗功效也可以由在研究期间观察到的消退应答的发生率和大小来确定。在动物中，治疗可使肿瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。对疗法(例如，药物的施用)产生应答而达到的完全消退可以称为“完全缓解”，并且可以将达到完全缓解的受试者称为“完全应答者”。因此，完全缓解不包括自发的完全消退。在临床前肿瘤模型的一些实施方式中，将PR应答定义为对于研究过程期间的三次连续测量，肿瘤体积为其第1天体积的50％或更小，且对于这三次测量中的一次或多次而言，等于或大于13.5mm3。在一些实施方式中，将CR应答定义为对于研究过程期间的三次连续测量，肿瘤体积低于13.5mm3。在临床前模型中，研究结束时具有CR应答的动物可另外归类为无肿瘤存活者(TFS)。术语“有效肿瘤控制”可用于指对治疗产生应答而达到肿瘤消退的程度，其中举例而言，肿瘤体积缩小至小于对治疗产生应答的终点肿瘤体积的<25％。例如，在特定模型中，如果终点肿瘤体积是2,000mm3，则若肿瘤缩小至小于500mm3，即达到有效肿瘤控制。因此，有效肿瘤控制涵盖完全消退，以及达到阈值缩小的部分消退。
调节性T细胞：“调节性T细胞”或Treg的特征在于表达生物标志物CD4、FOXP3和CD25。Treg有时被称为抑制性T细胞，代表调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫疾病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制性的并且通常抑制或下调效应T(Teff)细胞的诱导和增殖。可以在胸腺中发展(所谓的CD4+Foxp3+“天然”Treg)或从外周的幼稚CD4+T细胞中分化，例如，在暴露于TGFβ或视黄酸之后。Treg能够表达细胞表面GARP-proTGFβ1。
抗性(针对疗法)：对特定疗法(如CBT)的抗性可以归因于诸如癌症的疾病的先天性特征(“原发性抗性”)，或归因于治疗之后随着时间的推移产生的获得性表型(“获得的抗性”)。未显示对疗法有治疗应答的患者(例如，为无应答者或对疗法的应答较差的患者)被称为对疗法具有原发性抗体。将最初对疗法显示出治疗应答，但随后丧失作用(例如，尽管疗法继续，但仍出现进展或复发)的患者称为对疗法具有获得的抗性。
实体瘤中的应答评价标准(RECIST)和iRECIST：RECIST是定义癌症患者中的肿瘤在治疗期间何时改善(“缓解”)、保持原样(“稳定”)或恶化“进展”的一套已发布的规则。该标准是由国际合作组织于2000年2月发布的，该合作组织包括欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)、美国国立癌症研究所和加拿大国立癌症研究所临床试验组。随后，已普遍采用RECIST指南的修订版(RECIST v 1.1)(参见：Eisenhauera等，(2009),“New responseevaluation criteria in solid tumours:Revised RECIST guideline(version 1.1)”Eur J Cancer 45:228-247，并入本文)。
应答标准如下所示：完全缓解(CR)：所有目标病灶消失；部分缓解(PR)：以基线LD总和作为参考，目标病灶的LD总和下降至少30％；病情稳定(SD)：自开始治疗起，以最小LD总和作为参考，既未足以缩小至符合PR，又未足以增加至符合PD；进展性疾病(PD)：自开始治疗或出现一个或多个新病灶起，以所记录的最小LD总和作为参考，目标病灶的LD总和增加至少20％。
另一方面，iRECIST提供了考虑免疫相关应答的经修改的一套标准参见：www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5648544/，其内容通过引用并入本文)。RECIST和iRECIST标准是标准化的，可随着更多数据变得可用进行不定期修订，且在本领域中得到较好理解。
实体瘤：术语“实体瘤”意指导致异常生长或通常不含有囊肿或液体区域的组织块的增殖性疾病。实体瘤可以是良性(非癌性)或恶性(癌性)。实体瘤包括晚期恶性肿瘤，如局部晚期实体瘤和转移性癌症。实体瘤通常由多种细胞类型构成，包括但不限于，癌性(恶性)细胞、诸如CAF的基质细胞和浸润性白细胞，如巨噬细胞、MDSC和淋巴细胞。用TGFβ1的亚型选择性抑制剂治疗实体瘤，如本文所述的实体瘤通常为TGFβ1-阳性(TGFβ1+)肿瘤，其可以包括产生TGFβ1的多种细胞类型。在某些实施方式中，TGFβ1+肿瘤亦可供表达TGFβ3(即，TGFβ3阳性)。例如，某些肿瘤是TGFβ1/3-共显性的。在一些实施方式中，此类肿瘤是由上皮细胞癌症(例如，癌瘤)引起。
溶液平衡滴定(SET)：SET是一种测定，通过该测定可以在溶液中平衡时测量两个分子(如抗原和结合抗原的抗体)之间的结合。例如，基于Meso-Scale Discovery(“MSD”)的SET或MSD-SET是确定特别高亲和性蛋白-蛋白相互作用(如结合至其抗原的皮摩尔亲和性抗体)在平衡下的解离常数的适用模式(参见，例如：Ducata等，(2015)J BiomolecularScreening 20(10):1256-1267)。基于SET的测定特别适用于确定具有亚纳摩尔(例如，皮摩尔)亲和性的抗体的KD值。
特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合(specific binding或specificallybinds)”意指抗体或其抗原结合部分与抗原的相互作用依赖于特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，所述抗体或其抗原结合部分结合至特定蛋白而不是多种蛋白。在一些实施方式中，如果抗体对靶标的KD为至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更小，则抗体或其抗原结合部分特异性结合至靶标，例如TGFβ1。在一些实施方式中，如本文所用，术语“特异性结合proTGFβ1的表位”、“特异性地结合proTGFβ1的表位”、“特异性结合TGFβ1”或“特异性地结合TGFβ1”或”意指抗体或其抗原结合部分，其结合至proTGFβ1，并且如通过适宜的体外结合测定(如表面等离子体共振和生物层干涉法(BLI))所确定的具有1.0x 10-8M或更低的解离常数(KD)。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分可以特异性结合至proTGFβ1的人和非人(例如，小鼠)两者的直系同源物。
受试者：术语“受试者”在治疗应用的背景下意指接收临床照料或干预(如治疗、诊断等)的个体。合适的受试者包括脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，人类和非人类哺乳动物)。在受试者是人受试者的情况下，术语“患者”可以互换使用。在临床背景下，术语“患者群体”或“患者亚群”用于指代属于一组标准的一组个体，例如临床标准(例如，疾病表现、疾病阶段、对某些症状的易感性、对治疗的响应性等)、病史、健康状况、性别、年龄组、遗传标准(如某些突变的携带者、多态性、基因重复、DNA序列重复等)和生活方式因素(如吸烟、饮酒、运动等)。
表面等离子体共振(SPR)：表面等离子体共振是一种光学现象，可以实时检测未标记的相互作用物。基于SPR的生物传感器，如可以从Biacore商购的传感器，可用于测量生物分子的相互作用，包括蛋白-蛋白相互作用，如抗原-抗体结合。该技术在本领域中是众所周知的，可用于确定诸如结合亲和性、动力学速率常数和热力学的参数。
TGFβ1-相关适应症：“TGFβ1相关适应症”意指其中至少部分发病机制和/或进展可归因于TGFβ1信号传导或其失调的任何疾病或病症。某些TGFβ1相关的病症主要由TGFβ1亚型驱动。具有TGFβ1相关适应症的受试者可受益于抑制TGFβ1的活性和/或水平。某些TGFβ1相关的适应症主要由TGFβ1亚型驱动。TGFβ1-相关适应症包括但不限于：纤维化病况(如器官纤维化，和涉及慢性炎症的组织纤维化)、增殖性病症(如癌症，例如实体瘤和骨髓纤维化)、与ECM失调相关的疾病(如涉及基质变硬和重塑的病况)、涉及间质转化的疾病(例如，EndMT和/或EMT)、涉及蛋白酶的疾病、具有本文所述的某些标志物的异常基因表达的疾病。这些疾病类别并非旨在相互排斥。
TGFβ抑制剂：术语“TGFβ抑制剂”意指能够拮抗TGFβ生长因子(例如，TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3)的生物活性、信号传导或功能的任何试剂。该术语不旨在限制其作用机制，并且包括例如中和抑制剂、受体拮抗剂、可溶性配体捕获剂和TGFβ的激活抑制剂。TGFβ抑制剂还包括能够例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADPC)来降低可在生态位中激活的潜在proTGFβ可用性的抗体，以及引起包含潜在proTGFβ的细胞表面复合物的内化从而在不耗竭细胞本身的情况下从质膜除去前体的抗体。内化可以是针对含有LRRC33的蛋白复合物(如人LRRC33-proTGFβ1)的适宜作用机制，这会导致细胞表面表达含LRRC33的蛋白复合物的细胞水平降低。
所述“TGFβ家族”是TGFβ超家族中的一类，在人类中包含三个成员：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，其在结构上相似。已知这三种生长因子通过相同受体进行信号传导。
TGFβ1-阳性癌症/肿瘤：如本文所用，该术语指具有异常TGFβ1表达(过表达)的癌症/肿瘤。很多人类癌症/肿瘤类型均显示出TGFβ1(请注意，“TGFB”有时用于指与蛋白相对的基因)亚型的主要表达。在一些情况下，此类癌症/肿瘤可能显示出其他亚型(如TGFβ3)的共表达。很多上皮癌症(例如，癌瘤)可以共表达TGFβ1和TGFβ3。在TGFβ1阳性肿瘤的肿瘤环境中，TGFβ1可能来自多种来源，包括，例如，癌细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、癌症相关成纤维细胞(CAF)、调节性T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和周围的细胞外基质(ECM)。在本公开的背景下，概括人类病况的临床前癌症/肿瘤模型是TGFβ1-阳性癌症/肿瘤。
治疗窗：术语“治疗窗”是指在受试者中产生治疗性应答，而不会引起显著的/可观察的/不可接受的副作用(例如，在可接受或可耐受的副作用范围内)的剂量范围。可以将治疗窗计算为最小有效浓度(MEC)与最小毒性浓度(MTC)之比。为了说明，以10mg/kg剂量达到体内功效并以100mg/kg剂量显示出耐受性或可接受的毒性的TGFβ1抑制剂提供了至少10倍(例如，10x)的治疗窗。相比之下，TGFβ的泛抑制剂在10mg/kg时有效，但以低于有效剂量的剂量引起不良反应，因此认为其具有“剂量限制性毒性”。在通常情况下，可以将最大耐受剂量(MTD)设为治疗窗的上限。
例如，在大鼠或非人灵长类动物中，已证明Ab6在约3-30mg/kg/周的剂量范围内是有效的，还显示出在至少100或300mg/kg/周持续4周的剂量下无与TGFβ的泛抑制相关的可见毒性。基于此，Ab6显示了最低3.3倍和至多100倍的治疗窗。
毒性：如本文所用，术语“毒性(toxicity或toxicities)”意指在受试者(例如，患者)中与施用至受试者(例如，患者)的疗法相关的有害体内作用，例如非理想的副作用和不良事件。“耐受性”意指与治疗或治疗方案相关的毒性水平，其可由患者合理耐受，而不会由于毒性而中断治疗。通常，在临床研发之前，在一个或多个临床前模型中进行毒性/毒理学研究，以评估药物候选物(例如，单克隆抗体疗法)的安全性性质。毒性/毒理学研究可以帮助确定待测物的“无可见不良反应水平(NOAEL)”和“最大耐受剂量(MTD)”，据此可以推导出治疗窗。优选地，应选择对特定干预措施敏感的物种作为进行安全性/毒性研究的临床前动物模型。在TGFβ抑制的情况下，适宜的物种包括大鼠、犬和食蟹猴。据报道，小鼠对TGFβ的药理学抑制作用较不敏感，并且可能不会显示出在其他物种(包括人类)中具有潜在危险的毒性，尽管某些研究报道了在小鼠中使用TGFβ的泛抑制观察到了毒性。为了在本公开的背景下进行说明，基于为期四周的毒理学研究，大鼠中的Ab6的NOAEL为所评价的最高剂量(100mg/kg)，其表明MTD>100mg/kg。基于为期四周的毒理学研究，在非人灵长类动物中Ab6的MTD>300mg/kg。
为确定NOAEL和MTD，优选地，应该选择对特定干预措施敏感的物种作为进行安全性/毒理学研究的临床前动物模型。在TGFβ抑制的情况下，适宜的物种包括但不限于大鼠、犬和食蟹猴。据报道，小鼠对TGFβ的药理学抑制作用较不敏感，并且可能不会显示出在其他物种(包括人类)中潜在严重或危险的毒性。
可转化性(translatability)：在药物发现和临床开发的背景下，术语“可转化性”或“可转化的”指能够概况人类状况的临床前模型或数据的某些质量或特性。如本文所用，概况TGFβ1适应症的临床前模型通常显示出相对于TGFB2(或TGFβ2)和TGFB3(或TGFβ3)的TGFB1(或TGFβ1)的主要表达。在联合疗法范例中，例如，可翻译性可能需要与活性成分组合旨在在模型中实现作用相同的强调作用机制。例如，很多人类肿瘤被免疫排除，TGFβ1-阳性肿瘤表现出对检查点阻断疗法(CBT)的原发性抗性。可以联合使用第二种疗法(如TGFβ1抑制剂)以克服对CBT的抗性。在这种情况下，适宜的可翻译的临床前模型包括TGFβ1-阳性肿瘤，其对检查点阻断疗法(CBT)显示出原发性抗性。
治疗(treat/treatment)：术语“治疗”包括疗法性治疗、预防性治疗和其中一种降低受试者将发展障碍或其他风险因素的风险的应用。因此，该术语旨在广泛地意指：通过例如提高或增强身体的免疫力而在患者中引起治疗益处；减少或逆转免疫抑制；减少、移除或消除体内有害细胞或物质；减轻疾病负担(例如，肿瘤负担)；预防再发或复发；延长不应期，和/或提高生存。该术语包括疗法性治疗、预防性治疗和其中一种降低受试者发展病症或其他风险因素的风险的应用。治疗不要求病症的完全治愈，并且包括其中减轻症状或潜在风险因素的实施方式。在联合疗法的背景下，该术语还可以指：i)第二疗法降低第一疗法的有效剂量以减少副作用和增加耐受性的能力；ii)第二疗法使患者对第一疗法更敏感的能力；和/或iii)实现累加或协同临床益处的能力。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)：TAM是具有前肿瘤表型的极化/激活巨噬细胞(M2样表型)。TAM可以是募集至肿瘤部位的骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞或来源于红细胞-髓系祖细胞的组织驻留的巨噬细胞。单核细胞/巨噬细胞向TAM的分化受许多因素的影响，包括局部化学信号，如细胞因子、趋化因子、生长因子和其他作为配体的分子，以及单核细胞/巨噬细胞之间存在于生态位(肿瘤微环境)中的细胞-细胞相互作用。通常，单核细胞/巨噬细胞可以被极化成所谓的“M1”或“M2”亚型，后者与更多的前肿瘤表型相关。在实体肿瘤中，高达50％的肿瘤质量可能对应于巨噬细胞，其优选地是M2极化的。在肿瘤相关单核细胞和髓样细胞群中，M1巨噬细胞通常表达细胞表面HLA-DR、CD68和CD86，而M2巨噬细胞通常表达细胞表面HLA-DR、CD68、CD163和CD206。肿瘤相关的、M2样巨噬细胞(如M2c和M2d亚型)可以表达细胞表面LRRC33和/或LRRC33-proTGFβ1。
肿瘤微环境：术语“肿瘤微环境(TME)”意指局部疾病生态位，其中肿瘤(例如，实体瘤)驻留在体内。TME可以包含疾病相关分子标记(一组趋化因子、细胞因子等)、疾病相关细胞群(如TAM、CAF、MDSC等)以及疾病相关ECM环境(ECM组分和/或结构中的改变)。
可变区：术语“可变区”或“可变结构域”意指抗体的轻链和/或重链的一部分，典型地大致包括在重链中氨基端120到130个氨基酸和轻链中约100至110个氨基端氨基酸。在某些实施方式中，甚至在相同物种的抗体之间不同抗体的可变区在氨基酸序列上差异很大。抗体的所述可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
除了在操作实施方式中或另有说明，本文使用的表达成分或反应条件的数量的所有数字应当在所有情况下都理解为被术语“大约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“大约”可以表示±1％。
如本文在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个/一种(a/an)”，除非明确指出相反意义，应被理解为意指“至少一个/一种”。
如本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应当被理解为意指如此连接的所述元素的“任一或两者”，即，共同存在于某些情况下和分别存在于其他情况下的元素。除了与“和/或”条款具体标识的元素之外，任选地存在其他元素，无论是否与具体标识的那些元素相关或不相关，除非明确相反指出。因此，作为非限制性示例，当与例如“包含”的开放式语言结合使用时，在一个实施方式对“A和/或B”的引用可意指A而没有B(任选地包括除B以外的其他元素)；在另一个实施方式中，可意指B而没有A(任选地包括除A以外的其他元素)；在另一个实施方式中，可意指A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中使用的，关于一个或多个元素的列表，短语“至少一个”应理解为表示选自元素列表中任何一个或多个元素中的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每一个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许任选地存在除了在短语“至少一个”所指的元素列表内具体标识的元素之外的元素，无论与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可意指在一个实施方式中，至少一个、任选地包括多于一个A、不存在B(并且任选地包括除B以外的元素)；在另一个实施方式中，至少一个、任选地包括多于一个B、不存在A(并且任选地包括除A以外的元素)；在另一个实施方式中，至少一个、任选地包括多于一个A，和至少一个、任选地包括多于一个B(和任选地包括其他元素)；等等。
在权利要求中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等序数术语来修饰权利要求元素，本身并不意味着任何优先级、先后次序，或一个权利要求元素的级别或者执行方法的动作的时间顺序高于另一个，仅用作标记以将具有特定名称的一个权利要求元素与具有相同名称(但是对于序数术语的使用)的另一个元素进行区分，以区分权利要求元素。
本文提供的范围应理解为简写所有范围内的值的。例如，1至50的范围应理解为包括源自于由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1112、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组中的任意数字、数字组合或子范围，例如10至20、1至10、30至40等。
转化生长因子-β(TGFβ)
首先在1970年代末至1980年代初描述了转化生长因子-β(TGFβ)的活性和随后的可溶性生长因子的部分纯化，而TGFβ领域则始于40年前。迄今为止，已鉴定出33个基因产物，其构成了大型TGFβ超家族。根据结构相似性可以将TGFβ超家族分为至少三个亚类：TGFβ、生长分化因子(GDF)和骨形成蛋白(BMP)。TGFβ亚类由三种高度保守的亚型组成，即TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，在人类中其由三个独立基因编码。
TGFβ被认为在多种过程中起关键作用，如抑制细胞增殖、细胞外基质(ECM)重塑和免疫稳态。通过观察到TGFβ1-/-小鼠仅能存活3-4周，而由于大量免疫激活而导致多器官衰竭，证明了TGFβ1对T细胞稳态的重要性(Kulkarni,A.B.等，Proc Natl Acad Sci U S A,1993.90(2):p.770-4；Shull,M.M.等，Nature,1992.359(6397):p.693-9)。TGFβ2和TGFβ3的作用尚不清楚。尽管这三种TGFβ亚型具有不同的时间和空间表达模式，但其通过相同受体TGFβRI和TGFβRII发出信号，尽管在某些情况下，例如对于TGFβ2信号传导，还需要III型受体(如β聚糖)(Feng,X.H.和R.Derynck,Annu Rev Cell Dev Biol,2005.21:p.659-93；Massague,J.,Annu Rev Biochem,1998.67:p.753-91)。配体诱导的TGFβRI/II寡聚化触发SMAD转录因子的磷酸化，从而导致目标基因(如Col1a1、Col3a1、ACTA2和SERPINE1)的转录(Massague,J.,J.Seoane和D.Wotton,Genes Dev,2005.19(23):p.2783-810)。还已经描述了SMAD非依赖性TGFβ信号传导通路，例如，在癌症或在马凡氏(Marfan)小鼠的主动脉病变中(Derynck,R.和Y.E.Zhang,Nature,2003.425(6958):p.577-84；Holm,T.M.等，Science,2011.332(6027):p.358-61)。
已通过遗传疾病验证了TGFβ途径在人类中的生物学重要性。Camurati-Engelman病由于TGFB1基因的常染色体显性突变导致骨发育不良，从而导致TGFβ1信号传导的组成性激活(Janssens,K.等，J Med Genet,2006.43(1):p.1-11)。Loeys/Dietz综合征患者在TGFβ信号传导通路的组分中携带常染色体显性突变，从而导致主动脉瘤、器官过距(hypertelorism)和悬雍垂裂(bifid uvula)(Van Laer,L.,H.Dietz和B.Loeys,Adv ExpMed Biol,2014.802:p.95-105)。由于TGFβ通路失调与多种疾病有关，因而已开发出多种针对TGFβ通路的药物并在患者中进行了检测，但成功率有限。
TGFβ信号传导的失调与多种人类疾病有关。实际上，在很多疾病状况中，这种失调可能涉及TGFβ功能的多个方面。患病的组织(如纤维化和/或发炎的组织和肿瘤)可能会在局部环境中产生TGFβ激活，从而导致疾病的恶化或进展，其以自分泌和/或旁分泌的方式与在特定疾病背景中起作用的很多其他细胞因子、趋化因子和生长因子一起被激活。
例如，除了癌(例如，恶性)细胞以外，肿瘤微环境(TME)还包含多种表达TGFβ1的细胞类型，如激活的肌成纤维细胞样成纤维细胞、基质细胞、浸润性巨噬细胞、MDSC和其他免疫细胞。因此，TME代表表达和/或响应于TGFβ1但与在生态位内的不止一种类型的呈递细胞(例如，LTBP1、LTBP3、LRRC33和GARP)相关的异质性细胞群。
免疫疗法的进步已经改变了越来越多癌症患者的有效治疗方式。最突出的是检查点阻断疗法(CBT)，现在其已经成为越来越多癌症的标准护理方案的一部分。尽管在越来越多的癌症类型中都观察到了对CBT具有深远意义且持久的应答，但现在清楚的是，即使在治疗开始时，仍有相当一部分肿瘤针对CBT而言是难治性的，因此，将原发性抗性作为使得很多患者的免疫系统能够靶向并消除肿瘤细胞主要挑战。为了扩大对更多患者的治疗功效，已经尽力理解并解决赋予CBT的原发性抗性的潜在机制。然而，当将CBT与已知会影响相同肿瘤类型或调节免疫系统看似相关组分的药剂联合使用时，临床试验结果的乏善可陈和失败使这种热情被抑制。一个可能的原因是，给定组合的明确机理性原理通常不源自临床来源的数据，并且由此导致在旨在增强已获批的单药疗法试验中的不明确且混杂的结局。显然，联合免疫疗法的设计应源自与潜在肿瘤和免疫系统生物学相关的科学证据。
最近，创造了一种被称为“免疫排除”的现象来描述肿瘤环境，抗肿瘤效应T细胞(例如，CD8+T细胞)通过免疫抑制局部线索(cues)保持在该肿瘤环境外(因此“被排除”)。最近，很多临床来源的肿瘤的回顾性分析表明，TGFβ通路的激活介导了对CBT的原发性抗性。例如，转录谱和治疗前黑色素瘤活检分析显示，在对抗PD-1CBT无应答的肿瘤中，存在与TGFβ相关通路和生物学过程的富集。在免疫排除肿瘤中，原本能够通过识别细胞表面肿瘤抗原攻击癌细胞的效应细胞被阻止进入癌细胞部位。以此方式，癌细胞逃避了宿主免疫力以及利用和依赖这种免疫力的免疫肿瘤疗法，如检查点抑制剂。实际上，此类肿瘤显示出对检查点抑制(如抗PD-1和抗PD-L1抗体)的抗性，大概是因为靶T细胞被阻止进入肿瘤，从而无法发挥抗癌作用。
对很多临床来源的肿瘤的回顾性分析指出，TGFβ通路的激活介导了对CBT的原发性抗性。例如，转录谱和治疗前黑色素瘤活检分析显示，在对抗PD-1CBT无应答的肿瘤中，存在与TGFβ相关通路和生物学过程的富集。最近，对来自转移性尿路上皮癌患者的肿瘤的类似分析显示，缺乏对使用阿特珠单抗的PD-L1阻断的应答与TGFβ信号传导的转录特征相关，特别是在其中CD8+T细胞似乎被排除进入该肿瘤的肿瘤中。在乳腺癌的EMT-6同系小鼠模型中，已经证实了TGFβ信号传导在介导导致抗-PD(L)1抗性的免疫排除中的关键作用。尽管EMT-6肿瘤对使用抗-PD-L1抗体的治疗应答较弱，但是将这种检查点抑制剂与1D11(一组阻断所有TGFβ亚型活性的抗体)联合使用时，与使用单个抑制剂治疗相比，其导致完全缓解的频率大大增加。协同抗肿瘤活性被认为是由于癌症相关成纤维细胞(CAF)表型的改变和免疫排除表型的破坏，导致激活的CD8+T细胞浸润至肿瘤中。在结直肠癌和转移性小鼠模型中，使用抗-PD-L1抗体与galunisertib(一种I型TGFβ受体ALK5激酶的小分子抑制剂)的组合得到了类似结果。总体而言，这些发现表明，抑制CBT抗性肿瘤中的TGFβ通路可能是改善或增加对CBT的临床应答数量的有前途的方法。尽管最近的工作暗示TGFβ通路激活与原发性CBT抗性之间的关系，但是TGFβ信号传导长期以来与癌症发病机制的特征有关。作为强效免疫抑制因子，TGFβ阻止抗肿瘤T细胞激活并促进免疫抑制巨噬细胞。作为逃避其生长和肿瘤抑制作用的机制，恶性细胞通常对TGFβ信号传导具有抗性。TGFβ激活CAF，诱导细胞外基质产生并促进肿瘤进展。最后，TGFβ诱导EMT，从而支持组织侵袭和肿瘤转移。
哺乳动物具有编码和表达三种TGFβ生长因子TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的不同基因，所有这些生长因子均通过相同的异聚TGFβ受体复合物发出信号。尽管有共同的信号传导通路，但是每种TGFβ亚型似乎都具有独特的生物学功能，如通过非重叠TGFβ敲除小鼠表型所证明的。所有这三种TGFβ亚型均以无活性的前结构域生长因子复合物形式表示，其中TGFβ前结构域也称为包绕其生长因子并使其处于潜在的非信号传导状态的潜在相关肽(LAP)。而且，潜在TGFβ与潜在TGFβ结合蛋白共表达，并通过二硫键形成大型潜在复合物(LLC)。潜在TGFβ与潜在TGFβ结合蛋白-1(LTBP1)或LTBP3的结合使得能够栓系到细胞外基质，而与跨膜蛋白GARP或LRRC33的结合使得能够分别在Treg或巨噬细胞表面上加工。在体内，潜在TGFβ1和潜在TGFβ3被一组αV整联蛋白激活，后者结合LAP上的共有RGD序列，触发构象变化以释放生长因子。潜在TGFβ2激活的机制尚不清楚，因为其缺乏共有RGD基序。通过LAP的蛋白水解切割释放的TGFβ1也被认为是激活机制，但其生物学相关性尚不清楚。
尽管在几种疾病状态中TGFβ激活的致病作用均是清楚的，但同样清楚的是，由于广泛且持续的通路抑制引起的多效性效应，使得TGFβ通路的治疗性靶向已具有挑战性。例如，多项研究已显示，TGFβI型受体激酶ALK5(TGFΒR1)的小分子介导的抑制，或用高亲和性抗体阻断全部三种高度相关的TGFβ生长因子导致在小鼠、大鼠和犬中的严重心脏瓣膜病。这些阻断所有TGFβ信号传导的“泛”TGFβ方法因此具有非常窄的治疗窗，事实证明，这阻碍了对很多与疾病相关的过程的治疗，这些过程具有非常高的未满足的医疗需求。迄今为止，尚未批准任何靶向TGFβ的疗法，并且采用此类模式的临床试验结果大部分是令人失望的，这很可能是由于使用了为解决安全性问题而被证明无效的给药方案。
广泛抑制TGFβ出现的安全性问题，以及该通路在多种疾病过程中起关键作用的令人信服的证据表明，对一个或多个TGFβ家族成员在疾病病理性中所起到的特定作用的更好理解可产生治疗性干预的可行途径。就TGFβ及对TGFβ的应答而言，在本文中我们观察到TGFβ1在很多人类肿瘤中普遍表达，表明此家族成员可能是此通路对原发性抗性的贡献的主要驱动力。
如上文所述，越来越多的证据表明，TGFβ可能是在疾病组织(包括免疫排除的肿瘤环境)中建立和/或维持免疫抑制的主要参与者。因此，TGFβ抑制作用可以解除免疫抑制，并使效应T细胞(特别是细胞毒性CD8+T细胞)能够进入并杀死靶癌细胞。除了肿瘤浸润以外，TGFβ抑制作用还可以促进CD8+T细胞扩增。此类扩增可以发生在淋巴结和/或在肿瘤中(瘤内)。尽管尚不清楚阐明该过程的确切机制，但可以预期免疫抑制至少部分地由涉及调节性T细胞和激活的巨噬细胞的免疫细胞相关的TGFβ1激活所介导。据报道，TGFβ直接促进CD4+T细胞中Foxp3的表达，从而将其转化为调节性(免疫抑制)表型(即，Treg)。而且，Treg抑制效应T细胞增殖(参见，例如，图26B)，从而减少免疫应答。已表明该过程是TGFβ1依赖性的，并且可能涉及GARP相关的TGFβ1信号传导。在人和动物模型中的观察结果均表明，TME中Treg的增加与多种类型癌症的预后不良有关。此外，申请人此前已发现，暴露于肿瘤衍生因子(如M-CSF)的M2极化巨噬细胞显著上调LRRC33的细胞表面表达，其是TGFβ1的呈递分子(参见，例如：PCT/US2018/031759)。这些所谓的肿瘤相关巨噬细胞(或TAM)被认为会促进TME中所观察到的TGFβ1依赖性免疫抑制并促进肿瘤生长。
多种实体瘤的特征在于其肿瘤基质中富含肌成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞。这些细胞产生包围或包裹肿瘤(如结缔组织形成)的胶原蛋白基质，其至少部分地可以由过度激活TGFβ1信号传导引起。预期TGFβ1激活是在肿瘤基质中通过ECM相关的呈递分子(例如，LTBP1和LTBP3)所介导的。
申请人此前公开了能够在很多这些生物学背景下抑制TGFβ1激活的抗体，其在体内和体外均显示出有希望的作用(参见，例如，PCT/US2018/012601)。然而，存在以下挑战：i)开发一种改进的抗体，其对各种抗原复合物的亲和性的偏倚较小，以确保在不同生物学背景下或其中基本相关的TGFβ1所处的生态位中具有一致的抑制作用，和/或，ii)开发出一种抗体，其提供比此前描述的对应物甚至更高的效力。
对于本文呈现的工作而言，可以设想改进的抗体应体现以下所有或大部分特征：1)应维持对TGFβ1的选择性以使得与泛抑制相关的不希望的毒性降至最低(“亚型选择性”)(参见，例如，PCT/US2017/021972)；2)应在各种生物学背景下，或者与基质相关的和与细胞相关的类型两者中显示出广泛的结合活性(“不依赖于背景”)；3)应当在多个抗原复合物之间实现更均一或无偏倚的亲和性(“均一性”)；4)针对每种抗原复合物均应显示出较强的结合活性(“高亲和性”)；和，5)针对每种背景均具有强大的抑制活性(“效力”)。此外，优选的作用机制是抑制激活步骤，以便抑制剂能够靶向组织系链的潜在TGFβ1复合物，从而抢先阻止下游激活事件以实现持久的作用，而不是直接靶向可溶性/游离生长因子(“持久性”)。如本文进一步详细公开的，本公开的新型、改进的TGFβ1抑制剂是潜在TGFβ1激活的高效和高选择性抑制剂。本文呈现的数据尤其表明，亚型特异性抑制的这种机制足以克服在同系小鼠模型中对抗-PD-1的原发性抗性，该模型充分概括了在人类癌症中出现的对CBT的原发性抗性的一些特征。与“泛”TGFβ抑制剂相比，这些抗体的临床前安全性性质得到了改善，这些功效数据为探索选择性TGFβ1抑制在癌症免疫疗法中拓宽和增强对检查点阻断的临床应答，以及治理多种其他TGFβ1相关的适应症提供了理论依据。
proTGFβ1的新型、高亲和性、亚型选择性抗体
一般特征
本文公开了高亲和性、改进的TGFβ1抑制剂，其特征在于，与此前公开的TGFβ1选择性抑制剂相比，这些抗体具有增强的结合性质、增加的抑制效力，并保持所需的安全性性质和亚型选择性。本公开的这些TGFβ1选择性抑制剂是单克隆抗体(例如，免疫球蛋白，工程化的免疫球蛋白样分子，其抗原结合片段或部分)，其特异性结合潜在proTGFβ1复合物的前结构域(有时称为“LAP”)的至少一部分，并对TGFβ1具有亚型选择性抑制活性(参见表1的“核心特性”)。
根据本公开的抗体的增强的结合特性包括增加的亲和性，如在平衡下所测量的。在一些实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，抗体针对至少一种人LLC复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和/或hLRRC33-proTGFβ1)具有≤1nM的KD。在一些实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，此类抗体针对选自以下的两种人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，此类抗体针对选自以下的三种人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在优选的实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，此类抗体针对以下每种人LLC复合物均具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。根据本公开，在平衡时，高亲和性抗体对特定抗原(例如，抗原复合物)可以具有1nM或更小(例如，≤1nM、≤0.5nM、≤400pM、≤300pM、≤200pM和≤100pM)的KD值。
本发明还包括抗体或其抗原结合片段，如在平衡时(如MSD-SET)所测量的，其能够以≤10nM(例如，≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.5nM和≤0.1nM)的KD特异性结合每种人LLC复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1)。在一些实施方式中，如通过基于溶液平衡滴定法所测量的，抗体以≤5nM的KD结合每种前述的LLC复合物。在一些实施方式中，如通过基于溶液平衡滴定法所测量的，抗体以≤1nM的KD结合每种前述的LLC复合物。
对于治疗涉及细胞外基质和免疫组分失调两者的TGFβ1相关适应症的治疗用途，宜选择对ECM相关的proTGFβ1复合物(hLTBP1-proTGFβ1和/或hLTBP3-proTGFβ1)中的至少一种以及另外地细胞相关的proTGFβ1复合物(hGARP-proTGFβ1和/或hLRRC33-proTGFβ1)中的至少一种具有高亲和性(例如，KD≤1nM)的抗体，以便对这两种情况(例如，在ECM处和吸引至免疫细胞)均施加抑制作用。在一些实施方式中，抗体对hLTBP1-proTGFβ1和hLTBP3-proTGFβ1两者以及另外地至少一种细胞相关proTGFβ1复合物(hGARP-proTGFβ1或hLRRC33-proTGFβ1)均具有高亲和性(例如，KD≤1nM)。而在其他实施方式中，抗体对每种前述复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1)均具有高亲和性(例如，KD≤1nM)。在优选的实施方式中，如通过基于溶液平衡滴定的方法(如MSD-SET)所测量的，此类抗体针对每种人复合物均具有≤200pM(例如，≤100pM)的KD。
本公开的实施方式包括高亲和性不依赖于背景的抗体。此类抗体能够以等同的亲和性结合至四种已知呈递分子-proTGFβ1复合物，即，LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。等同的亲和性可以指抗体在四种抗原复合物中显示出的最低亲和性(最高KD数值)不低于从其余三个亲和性计算得出的平均值的五倍；或者抗体在四种抗原复合物中显示出的最高亲和性(最低KD数值)不超过从其余三个亲和性计算得出的平均值的五倍。在一些实施方式中，当两种ECM相关复合物的平均KD值与两种细胞相关复合物的平均KD值的比值不超过三倍时，可以将此类抗体称为具有等同的亲和性。
具有等同的亲和性的抗体可以实现更加均匀(例如，无偏倚)的抑制作用，而无论与proTGFβ1复合物相关的特定呈递分子是什么(因此“不依赖于背景”)。在特别优选的实施方式中，抗体是高亲和性、不依赖于背景的抗体，因为如通过基于溶液平衡滴定的方法所测量的针对四种人LLC的每一种的亲和性是1nM或更低(例如，200pM或更低)，并且抗体针对上文所讨论的全部四种人LLC具有等同的亲和性。例如，在基质相关复合物与细胞相关复合物之间的平均亲和性中观察到的偏倚不超过三倍。
在一些实施方式中，如通过基于溶液平衡滴定的方法(如MSD-SET)所测量的，此类抗体以≤10nM(例如，≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.5nM和≤0.1nM)的KD特异性结合每种前述复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1)。
本文涵盖的任何一种抑制性抗体可以在包含proTGFβ1复合物的前结构域内的潜伏套索的至少一部分的一个或多个结合区结合每种前述大型潜在复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1)。此类结合区还可以包含生长因子结构域的至少一部分。在特别优选的实施方式中，此类抗体在包含潜伏套索的至少一部分和生长因子结构域的至少一部分的LLC复合物内的结合区以≤200pM(如≤150pM和≤100pM)的KD值结合每种LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1复合物。
在一些实施方式中，无论激活模式如何，能够选择性抑制TGFβ1的高亲和、不依赖于背景的抗体能够抑制激活的TGFβ1。例如，已知某些整联蛋白直接结合LLC的前结构域内的RGD基序，并且以机械方式“拉开”笼状的前结构域结构，从而使TGFβ1生长因子从潜在复合物中释放。分别地，在胞外环境中存在的某些蛋白酶已显示出以不依赖于整联蛋白的方式激活TGFβ1。直接靶向RGD基序从而干扰整联蛋白结合的抗体可能不抑制TGFβ1的蛋白酶依赖性激活。而相反的是，直接靶向蛋白酶识别或裂解位点中的一个或多个的抗体可能不抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活。相比之下，在本发明的优选实施方式中，高亲和性、不依赖于背景的抗体能够抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和TGFβ1的蛋白酶依赖性激活。
尽管与靶人蛋白的高亲和性结合是抗体治疗剂的必需特征，但亦与其他物种对应物交叉反应的能力是有利的。特别地，鉴于大部分临床前药理学模型在啮齿动物中，与小鼠/大鼠蛋白的物种交叉反应性以替代抗体形式为临床前研究提供了适宜工具。因此，在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体有利地与其他哺乳动物对应物(如小鼠、大鼠和/或非人灵长类动物)交叉反应。
在由本公开涵盖的新型抗体中，在下文分类并讨论了特别优选的抗体类别及其特征。
优选的特征
在一些实施方式中，除了核心性质特征以外，本文公开的优选的抗体还符合如本文表1中所列的类别1-5中的一个或多个的抗体标准。
在一些实施方式中，本发明抗体的其他所需标准由其结合性质(例如，抗体对抗原的亲和性)来定义。在这一背景下，“抗原”包括至少四种蛋白复合物，即TGFβ1的人类大型潜在复合物(LLC)，其被称作hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物。根据本公开的发明，抗体能够以通常按照KD值测量的一定亲和性结合至这些复合物的每一种。类别1和类别2的抗体录入这些实施方式的范围内。出于基于结合性质(例如，类别1和2)定义标准的目的，确定在平衡时抗体的亲和性，而非通过动力学测定(如BLI)。
另外地或可替代地，本发明抗体的其他所需标准由其氨基酸序列定义。类别3和类别4抗体由所述抗体的CDR序列定义，而类别5抗体由其重链和轻链可变结构域序列定义。
表1：本发明的新型、高亲和性、TGFβ1选择性抑制剂的优选特征
Figure BDA0002970630990000301
Figure BDA0002970630990000311
Figure BDA0002970630990000321
Figure BDA0002970630990000331
下文提供了每个类别的非限制性实施方式。
类别1抗体
本文公开的抗体是能够特异性靶向人TGFβ1潜在大型复合物的高亲和性、亚型选择性抗体。
在一个方面中，本发明提供了以≤200pM的KD特异性结合以下人LLC中的每一者的抗体或其抗原结合片段：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物，其中亲和性是使用适宜测定(如基于溶液平衡滴定的测定)在平衡状态下测量的。
如通过溶液平衡滴定所测量的，此类抗体或片段可以以≤150pM的KD结合每种hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物。更优选地，如通过溶液平衡滴定所测量的，此类抗体或片段可以以≤100pM的KD结合每种hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物。可以采用能够在平衡下测量抗体的KD值的任何适宜的体外亲和性测定，包括，例如，MSD-SET，在本文的其他地方对其进行了更详细的描述。符合类别1的优选抗体的抗体标准的本文公开的抗体的非限制性实例包括：Ab6、Ab22、Ab24、Ab26、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32和Ab33。
抗体还可以以高特异性和高亲和性结合至其他物种的相应LLC。在优选的实施方式中，抗体显示出与小鼠对应物的物种交叉反应性。
类别2抗体
本文公开的抗体是能够特异性靶向人TGFβ1潜在大型复合物的高亲和性、亚型选择性抗体。
在另一个方面中，本发明提供了以≤1nM的KD特异性结合以下人LLC中的每一者的抗体或其抗原结合片段：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物，其中亲和性是使用适宜测定(如基于溶液平衡滴定的测定)在平衡状态下测量的，并且，其中，所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。潜伏套索是形成前结构域的所谓的“约束衣(Straight Jacket)”的一部分的蛋白结构域。在其天然形式中，人proTGFβ1多肽的潜伏套索具有氨基酸序列LASPPSQGEVPPGPL(SEQ ID NO:153)。可以采用任何适宜的技术来确定抗体是否在包含潜伏套索的至少一部分的区域结合人TGFβ1LLC。例如，可以进行利用对应多肽的竞争测定。在一些实施方式中，可以通过HD-X或X射线结晶学测定确定结合区。
在一些实施方式中，如通过溶液平衡滴定所测量的，此类抗体或片段可以以≤500pM(任选地≤400pM、≤300pM、≤200pM或≤100pM)的KD结合hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物的每一者，其中所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。符合类别2的优选抗体的抗体标准的本文公开的抗体的非限制性实例包括：Ab5和Ab6。
在一些实施方式中，此类抗体可以在包含proTGFβ1复合物内生长因子结构域的至少一部分的一个或多个其他结合区域进一步结合人LLC。在一些实施方式中，其他结合仅在潜在复合物的背景下发生，以使得抗体不特异性结合至不与前结构域复合物结合的游离生长因子。LLC生长因子结构域内的一个或多个其他结合区域可以包含称为“指1”和/或“指2”的至少一部分蛋白结构域。因此，此类抗体可以结合组合表位，该组合物表位包含潜伏套索的至少一个氨基酸残基和生长因子结构域的至少一个氨基酸残基。
抗体还可以以高特异性和高亲和性结合至其他物种的相应LLC。在优选的实施方式中，抗体显示出与小鼠对应物的物种交叉反应性。
类别3抗体
本文公开的抗体是能够特异性靶向人TGFβ1潜在大型复合物的高亲和性、亚型选择性抗体。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中CDR-H1具有由FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5)(SEQ ID NO:143)表示的氨基酸序列。在一些实施方式中，X1可以是S、G或A；X2可以是S或F；X3可以是F或Y；X4可以是S或A；和/或，X5可以是D、N或Y，以任何组合。在其中H-CDR1含有至少一个氨基酸取代的一些实施方式中，位置X1可以被S替代；位置X2可以被S替代；位置X3可以被F替代；位置X4可以被S替代；和/或，位置X5可以被D替代。
抗体CDR-H2具有由YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG(SEQ ID NO:144)表示的氨基酸序列。在一些实施方式中，X1可以是S或H；X2可以是P或S；X3可以是S或D；X4可以是D或S；和/或，X5可以是D或G，以任何组合。在其中H-CDR2含有至少一个氨基酸取代的一些实施方式中，位置X1可以被S替代；位置X2可以被P替代；位置X3可以被D替代；位置X4可以被S替代；和/或，位置X5可以被D替代。
抗体的CDR-H3具有由(X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P(SEQ ID NO:145)表示的氨基酸序列。在一些实施方式中，X1可以是A或V；X2可以是G或A；X3可以是V或T；X4可以是L或W；X5可以是Y或M；和/或，X6可以是M或D，以任何组合。在其中H-CDR3含有至少一个氨基酸取代的一些实施方式中，位置X1可以被A替代；位置X2可以被G替代；位置X3可以被V替代；位置X4可以被L替代；位置X5可以被Y替代；和/或，位置X6可以被D替代。
CDR-L1具有氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO:105)，其任选地具有1或2个氨基酸改变。
CDR-L2具有氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:106)，其任选地具有1或2个氨基酸改变。
CDR-L3具有氨基酸序列QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)，其任选地具有1或2个氨基酸改变。
符合类别3的优选抗体的抗体标准的本文公开的抗体的非限制性实例包括：Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32和Ab34。
下表2总结了类别3抗体的CDR共有序列。在一些实施方式中，每个CDR序列可以任选地包含如下所示的一个或多个氨基酸取代。
表2：重链和轻链共有CDR序列和优选的氨基酸取代
Figure BDA0002970630990000341
Figure BDA0002970630990000351
在一些实施方式中，类别3的抗体或其抗原结合片段以≤1nM的KD特异性结合以下人LLC的每一者：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物，其中亲和性是使用适宜测定(如基于溶液平衡滴定的测定)在平衡状态下测量的。
在一些实施方式中，所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。潜伏套索是形成前结构域的所谓的“约束衣(Straight Jacket)”的一部分的蛋白结构域。在其天然形式中，人proTGFβ1多肽的潜伏套索具有氨基酸序列LASPPSQGEVPPGPL(SEQID NO:153)。可以采用任何适宜的技术来确定抗体是否在包含潜伏套索的至少一部分的区域结合人TGFβ1LLC。例如，可以进行利用对应多肽的竞争测定。在一些实施方式中，可以通过HD-X或X射线结晶学测定确定结合区。
在一些实施方式中，如通过溶液平衡滴定所测量的，此类抗体或片段可以以≤500pM(任选地≤400pM、≤300pM、≤200pM或≤100pM)的KD结合hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物的每一者，其中所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。
在一些实施方式中，此类抗体可以在包含proTGFβ1复合物内生长因子结构域的至少一部分的一个或多个其他结合区域进一步结合人LLC。在一些实施方式中，其他结合仅在潜在复合物的背景下发生，以使得抗体不特异性结合至不与前结构域复合物结合的游离生长因子。LLC生长因子结构域内的一个或多个其他结合区域可以包含称为“指1”和/或“指2”的至少一部分蛋白结构域。因此，此类抗体可以结合组合表位，该组合物表位包含潜伏套索的至少一个氨基酸残基和生长因子结构域的至少一个氨基酸残基。
抗体还可以以高特异性和高亲和性结合至其他物种的相应LLC。在优选的实施方式中，抗体显示出与小鼠对应物的物种交叉反应性。
本文包括交叉阻断抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或其片段交叉阻断类别3抗体中的一者或与其交叉竞争，其中如通过MSD-SET所测量的，所述抗体对至少一种人LLC复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和/或hLRRC33-proTGFβ1)具有≤1nM的KD。在一些实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，所述抗体对选自以下的两种人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，如MSD-SET所测量的，此类抗体针对三种选自以下的人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在优选的实施方式中，如MSD-SET所测量的，此类抗体针对每种选自以下的人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。根据本公开，在平衡时，高亲和性抗体针对特定抗原(例如，抗原复合物)可以具有1nM或更低的KD值，例如≤1nM、≤0.5nM、≤400pM、≤300pM、≤200pM和≤100pM。
类别4抗体
本文公开的抗体是能够特异性靶向人TGFβ1潜在大型复合物的高亲和性、亚型选择性抗体。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：H-CDR1包含FTFSSFSMD(SEQ ID NO:107)或FTFSSFSMN(SEQ ID NO:114)，其中任选地每个可以含有至多4个氨基酸改变(任选地至多4个、至多3个、至多2个或1个氨基酸改变)；H-CDR2包含YISPDASTIYYADSVKG(SEQ IDNO:111)，其中任选地H-CDR2可以含有至多4个氨基酸改变(任选地至多4个、至多3个、至多2个或1个氨基酸改变)，H-CDR3包含ARGVLDYGDMLDP(SEQ ID NO:110)，其中任选地H-CDR3可以含有至多3个氨基酸改变(任选地至多3个、至多2个或1个氨基酸改变)；L-CDR1QASQDITNYLN(SEQ ID NO:105)，其具有任选地1个或2个氨基酸改变；L-CDR2包含DASNLET(SEQ ID NO:106)，其具有任选地1个或2个氨基酸改变；和L-CDR3包含QQADNHPPWT(SEQ IDNO:12)，其具有任选地1个或2个氨基酸改变。
符合类别4的优选抗体的抗体标准的本文公开的抗体的非限制性实例包括：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33和Ab34。
下表3总结了类别4抗体的CDR序列。在一些实施方式中，每个CDR序列可以任选地包含如下所示的一个或多个氨基酸取代。
表3：CDR序列和变体
Figure BDA0002970630990000361
Figure BDA0002970630990000371
在一些实施方式中，类别4的抗体或其抗原结合片段以≤1nM的KD特异性结合每种下述人LLC：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物，其中亲和性是使用适宜测定(如基于溶液平衡滴定的测定)在平衡状态下测量的。
在一些实施方式中，所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。潜伏套索是形成前结构域的所谓的“约束衣(Straight Jacket)”的一部分的蛋白结构域。在其天然形式中，人proTGFβ1多肽的潜伏套索具有氨基酸序列LASPPSQGEVPPGPL(SEQID NO:153)。可以采用任何适宜的技术来确定抗体是否在包含潜伏套索的至少一部分的区域结合人TGFβ1LLC。例如，可以进行利用对应多肽的竞争测定。在一些实施方式中，可以通过HD-X或X射线结晶学测定确定结合区。
在一些实施方式中，如通过溶液平衡滴定所测量的，此类抗体或片段可以以≤500pM(任选地≤400pM、≤300pM、≤200pM或≤100pM)的KD结合hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物的每一者，其中所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。
在一些实施方式中，此类抗体可以在包含proTGFβ1复合物内生长因子结构域的至少一部分的一个或多个其他结合区域进一步结合人LLC。在一些实施方式中，其他结合仅在潜在复合物的背景下发生，以使得抗体不特异性结合至不与前结构域复合物结合的游离生长因子。LLC生长因子结构域内的一个或多个其他结合区域可以包含称为“指1”和/或“指2”的至少一部分蛋白结构域。因此，此类抗体可以结合组合表位，该组合物表位包含潜伏套索的至少一个氨基酸残基和生长因子结构域的至少一个氨基酸残基。
抗体还可以以高特异性和高亲和性结合至其他物种的相应LLC。在优选的实施方式中，抗体显示出与小鼠对应物的物种交叉反应性。
本文包括交叉阻断抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或其片段交叉阻断类别4抗体中的一者或与其交叉竞争，其中如通过MSD-SET所测量的，所述抗体对至少一种人LLC复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和/或hLRRC33-proTGFβ1)具有≤1nM的KD。在一些实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，所述抗体对选自以下的两种人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，如MSD-SET所测量的，此类抗体针对三种选自以下的人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在优选的实施方式中，如MSD-SET所测量的，此类抗体针对每种选自以下的人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。根据本公开，在平衡时，高亲和性抗体针对特定抗原(例如，抗原复合物)可以具有1nM或更低的KD值，例如≤1nM、≤0.5nM、≤400pM、≤300pM、≤200pM和≤100pM。
类别5抗体
本文公开的抗体是能够特异性靶向人TGFβ1潜在大型复合物的高亲和性、亚型选择性抗体。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含与下述具有至少90％序列同一性的重链可变结构域(VH)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)；和，与下述具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域(VL)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方式中，抗体的重链可变结构域与SEQ ID NO:13所示的VH序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方式中，抗体的重链可变结构域与上述VH序列具有至少95％同一性。
在一些实施方式中，抗体的重链可变结构域与SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方式中，抗体的轻链可变结构域与上述VL序列具有至少95％同一性。
符合类别5的优选抗体的抗体标准的本文公开的抗体的非限制性实例包括：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33和Ab34。
在一些实施方式中，类别5的抗体或其抗原结合片段以≤1nM的KD特异性结合每种下述人LLC：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物，其中亲和性是使用适宜测定(如基于溶液平衡滴定的测定)在平衡状态下测量的。
在一些实施方式中，所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。潜伏套索是形成前结构域的所谓的“约束衣(Straight Jacket)”的一部分的蛋白结构域。在其天然形式中，人proTGFβ1多肽的潜伏套索具有氨基酸序列LASPPSQGEVPPGPL(SEQID NO:153)。可以采用任何适宜的技术来确定抗体是否在包含潜伏套索的至少一部分的区域结合人TGFβ1LLC。例如，可以进行利用对应多肽的竞争测定。在一些实施方式中，可以通过HD-X或X射线结晶学测定确定结合区。
在一些实施方式中，如通过溶液平衡滴定所测量的，此类抗体或片段可以以≤500pM(任选地≤400pM、≤300pM、≤200pM或≤100pM)的KD结合hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物的每一者，其中所述抗体或片段在包含潜伏套索的至少一部分的结合区结合人LLC。
在一些实施方式中，此类抗体可以在包含proTGFβ1复合物内生长因子结构域的至少一部分的一个或多个其他结合区域进一步结合人LLC。在一些实施方式中，其他结合仅在潜在复合物的背景下发生，以使得抗体不特异性结合至不与前结构域复合物结合的游离生长因子。LLC生长因子结构域内的一个或多个其他结合区域可以包含称为“指1”和/或“指2”的至少一部分蛋白结构域。因此，此类抗体可以结合组合表位，该组合物表位包含潜伏套索的至少一个氨基酸残基和生长因子结构域的至少一个氨基酸残基。
抗体还可以以高特异性和高亲和性结合至其他物种的相应LLC。在优选的实施方式中，抗体显示出与小鼠对应物的物种交叉反应性。
本文包括交叉阻断抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或其片段交叉阻断类别5抗体中的一者或与其交叉竞争，其中如通过MSD-SET所测量的，所述抗体对至少一种人LLC复合物(hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和/或hLRRC33-proTGFβ1)具有≤1nM的KD。在一些实施方式中，如通过MSD-SET所测量的，所述抗体对选自以下的两种人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，如MSD-SET所测量的，此类抗体针对三种选自以下的人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。在优选的实施方式中，如MSD-SET所测量的，此类抗体针对每种选自以下的人LLC复合物具有≤1nM的KD：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。根据本公开，在平衡时，高亲和性抗体针对特定抗原(例如，抗原复合物)可以具有1nM或更低的KD值，例如≤1nM、≤0.5nM、≤400pM、≤300pM、≤200pM和≤100pM。
本发明的示例性抗体
用于实施本发明的示例性抗体和编码此类抗体的相应核酸序列包含表4和表5中所示的一个或多个CDR氨基酸序列。表5中列出的每组H-CDR(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)可以与表5中提供的L-CDR(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)组合。
因此，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含6个CDR(例如，H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)，其中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3选自表4中列出的抗体的H-CDR集合，且其中L-CDR1包含QASQDITNYLN(SEQ ID NO:105)，L-CDR2包含DASNLET(SEQ ID NO:106)，和L-CDR3包含QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)，其中任选地，H-CDR1可以包含FTFSSFSMD(SEQ ID NO:107)；H-CDR-2可以包含YISPSADTIYYADSVKG(SEQ ID NO:103)；和/或，H-CDR3可以包含ARGVLDYGDMLMP(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，抗体或片段包含具有氨基酸序列FTFSSFSMD(SEQ ID NO:107)的H-CDR1，具有氨基酸序列YISPSADTIYYADSVKG(SEQ ID NO:103)的H-CDR2，和具有氨基酸序列ARGVLDYGDMLMP(SEQ IDNO:6)的H-CDR-3；具有氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO:105)的L-CDR1，具有氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:106)的L-CDR2，和具有氨基酸序列QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)的L-CDR3。
表4：如使用Lu等中所描述的编号方案确定的，示例性抗体的重链的互补性决定区
Figure BDA0002970630990000391
Figure BDA0002970630990000401
表5：如使用Kabat编号方案或Lu等的编号系统所确定的，示例性抗体的轻链的互补性决定区
Figure BDA0002970630990000402
抗体内CDR序列的确定取决于所使用的特定编号方案。常用系统包括但不限于：Kabat编号系统、IMTG编号系统、Chothia编号系统以及其他，如Lu等所描述的编号方案(LuX等，MAbs.2019Jan；11(1):45-57)。为了进行说明，下面举例说明了由四种不同编号系统定义的Ab6的6个CDR序列。可以将任何本领域公知的CDR编号系统用于定义本公开的抗体的CDR序列。
表6：基于四种编号方案的示例性抗体(Ab6)的6个CDR
Figure BDA0002970630990000403
Figure BDA0002970630990000411
在表7中提供了本公开的示例性抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，本公开的高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂可以是包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中VH和VL序列选自下表7中列出的任何一组VH和VL序列。
表7：示例性抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域
Figure BDA0002970630990000412
Figure BDA0002970630990000421
因此，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中，重链可变结构域与选自下组的任一序列具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％)序列同一性：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33和Ab34；和，其中轻链可变结构域与选自下组的任一序列具有至少90％同一性：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33和Ab34，其中，任选地，重链可变结构域可以任选地具有至少95％序列同一性，和/或，轻链可变结构域可以具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％和100％)序列同一性。在一些实施方式中，抗体或片段的重链可变结构域与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性，和其中任选地，抗体或片段的轻链可变结构域与SEQ ID NO:15具有至少90％序列同一性。在一些实施方式中，抗体或片段的重链可变结构域与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性，和其中任选地，抗体或片段的轻链可变结构域与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性。在一些实施方式中，抗体或片段的重链可变结构域与SEQ ID NO:13具有至少98％序列同一性，和其中任选地，抗体或片段的轻链可变结构域与SEQ ID NO:15具有至少98％序列同一性。在一些实施方式中，抗体或片段的重链可变结构域与SEQ ID NO:13具有100％序列同一性，和其中任选地，抗体或片段的轻链可变结构域与SEQ ID NO:15具有100％序列同一性。
在一些实施方式中，特异性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分包含重链可变结构域的氨基酸序列，其由与SEQ ID NO:14所示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码，和轻链可变结构域的氨基酸序列，其由与SEQ ID NO:16所示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO:14所示的核酸序列编码的重链可变结构域的氨基酸序列，和由SEQ IDNO:16所示的核酸序列编码的轻链可变结构域的氨基酸序列。
在一些实例中，特异性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的本公开的任何抗体包括具有一个或多个与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3基本上相似的CDR(例如，CDRH或CDRL)序列的任何抗体(包括其抗原结合部分)。例如，抗体可以包含如表4中所示的一个或多个CDR序列，其与以下中任一者的对应CDR区相比，含有至多5、4、3、2或1个氨基酸残基改变：SEQ ID NO：6、12、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125和126。在一些实施方式中，与表4中所提供的序列相比，六个CDR序列中的一个或多个含有至多三(3)个氨基酸改变。每个CDR包含至多3个氨基酸改变的此类抗体变体涵盖在本发明中。在一些实施方式中，此类变体抗体由诸如亲和性成熟的优化方法产生的。表7中所列抗体(例如，Ab6)的重链可变区和轻链可变区的完整氨基酸序列，以及编码某些抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列提供如下：
Ab3–重链可变区氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:95)
Ab6–重链可变区氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)
Ab6–轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:15)
Ab6–重链氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:17)
Ab6–重链核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTTCAGCATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTCCCAGTGCAGACACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGGGTGCTCGACTACGGAGACATGTTAATGCCATGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCTGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCAGCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGGC(SEQ ID NO:18)
Ab6–轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:19)
Ab6–轻链核酸序列(人κ)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTACCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGGCCGACAATCACCCTCCTTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:20)
在一些实施方式中，两个氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990、修改如Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993的算法来确定。这种算法被并入Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与目标蛋白分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在本文所述的任何抗体或抗原结合片段中，可以在残基不太可能参与抗体-抗原相互作用的位置处将一个或多个保守突变引入CDR或框架序列中。在一些实施方式中，可以在基于晶体结构确定的残基不太可能参与与GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物LTBP3-TGFβ1复合物和LRRC33-TGFβ1复合物的相互作用的位置处将这样的保守突变引入CDR或框架序列中。在一些实施方式中，可以从共享结构相似性的另一抗原的已知结构信息推导出可能的界面(例如，参与抗原-抗体相互作用的残基)。
如本文所用，“保守氨基酸置换”意指不改变其中进行氨基酸置换的蛋白相对电荷或大小特征的氨基酸置换。可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法制备变体，例如可在汇总这样的方法的参考文献中找到的，例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,J.Sambrook等编著，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编著，John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守置换包括在下列组中的氨基酸之间进行的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
在一些实施方式中，本文提供的抗体包含赋予抗体期望性质的突变。例如，为了避免由于已知天然发生在IgG4 mAb中的Fab臂交换引起的潜在并发症，本文提供的抗体可以包含稳定化“Adair”突变((Angal等，“A single amino acid substitution abolishesthe heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody,”Mol Immunol 30,105-108；1993)，其中丝氨酸228(EU编号；其Kabat编号为残基241)被转化为脯氨酸，导致IgG1样(CPPCP(SEQ ID NO:54))铰链序列。因此，任何所述抗体可包括稳定化‘Adair’突变或氨基酸序列CPPCP(SEQ ID NO:54)。
本公开的TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂可任选包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C-末端连接至轻链恒定结构域，如Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其部分可以连接到重链的全部或部分，如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及任何亚型亚类。抗体可包含合适的恒定区(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991))。因此，在本公开范围内的抗体可以包含与任何合适的恒定区组合的VH和VL结构域或其抗原结合部分。
另外地或可替代地，这样的抗体可以包含或可以不包含SEQ ID NO：127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142和15的抗体的框架区。在一些实施方式中，特异性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体是小鼠抗体，并且包含小鼠框架区序列。
在一些实施方式中，这样的抗体以相对高的亲和性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物，例如，KD小于10-9M、10-10M、10-11M或更低。例如，这样的抗体可以以5pM和1nM之间(例如，在10pM和1nM之间，例如，在10pM和100pM之间)的亲和性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物。本公开还包括抗体或抗原结合片段，其与本文所述的任何抗体竞争结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物，并且具有1nM或更低(例如，1nM或更低、500pM或更低、100pM或更低)的KD值。可以使用任何合适的方法测试特异性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体的亲和性和结合动力学，包括但不限于基于生物传感器的技术(例如，
Figure BDA0002970630990000461
或BIACORE)和基于溶液平衡滴定的技术(例如，MSD-SET)。
在一些实施方式中，根据本发明的细胞相关TGFβ1(例如，GARP呈递的TGFβ1和LRRC33呈递的TGFβ1)的抑制剂包括特异性结合这样的复合物(例如，GARP-前/潜在TGFβ1和LRRC33-前/潜在TGFβ1)并触发复合物的内化的抗体或其片段。这种作用模式导致从细胞表面(例如，Treg、巨噬细胞等)移除或耗尽无活性TGFβ1复合物，由此减少可用于激活的TGFβ1。在一些实施方式中，这样的抗体或其片段以pH依赖性方式结合靶复合物，使得在中性或生理pH下发生结合，但抗体在酸性pH下与其抗原解离；或者，在酸性pH下比在中性pH下的解离速率更高。这样的抗体或其片段可以作为再循环抗体起作用。
与TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制抗体竞争的抗体
本公开的方面涉及与本文提供的任何抗体竞争或交叉竞争的抗体。如本文所用，与抗体有关的术语“竞争”是指第一抗体以与第二抗体的结合充分相似的方式结合至表位(例如，GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的表位)，使得在第二抗体存在下第一抗体与其表位结合的结果与第二抗体不存在时第一抗体的结合相比可检测地降低。或者，可以但不必是，在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合也可检测地降低。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不发生第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，当每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其表位或配体的结合时，无论其程度相同、更大还是更小，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”以结合它们各自的表位。竞争和交叉竞争抗体都在本公开的范围内。无论这样的竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分结合)，技术人员将理解这样的竞争性和/或交叉竞争抗体包括在本文中并可用于本文提供的方法和/或组合物。术语“交叉阻断”可以互换使用。
如果结合位点在三维空间中相距足够远，以使得每种结合均不干扰其他结合，则结合同一抗原的两种不同的单克隆抗体(或抗原结合片段)可能能够同时与抗原结合。而相比之下，两种不同单克隆抗体可以具有相同或重叠的抗原结合区，在这种情况下，第一抗体的结合可以使第二抗体不能结合抗原，或反之亦然。在后一种情况下，将两种抗体称为相对于相同抗原彼此“交叉阻断”。
抗体“分组(binning)”实验用于基于相对交叉阻断活性，将针对相同抗原制备的多个抗体分类至各种“分组(bin)”中。各“分组”因此表示抗原的一个或多个离散结合区。在相同分组中的抗体按照定义彼此交叉阻断。可以使用标准体外结合测定(如Biacor或
Figure BDA0002970630990000462
)，使用标准检测条件，例如，根据生产厂商的说明书(例如，在室温～20-25℃下，进行结合测定)考察分组。
本公开的方面涉及与本文提供的任何特定的抗体或其抗原结合部分竞争或交叉竞争的抗体。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分与本文提供的任何抗体在相同表位处或附近结合。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分如果结合在表位的15个或更少氨基酸残基内，则其结合在表位附近。在一些实施方式中，本文提供的任何抗体或其抗原结合部分在与本文提供的任何抗体结合的表位的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基内结合。
在另一个实施方式中，本文提供的是抗体或其抗原结合部分，其以抗体和蛋白质之间的平衡解离常数KD小于10-8M竞争或交叉竞争结合本文提供的任何抗原(例如，GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物)。在其他实施方式中，抗体以10-12M至10-9M范围的KD竞争或交叉竞争结合本文提供的任何抗原。在一些实施方式中，本文提供的是抗TGFβ1抗体或其抗原结合部分，其竞争结合本文中所述抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，本文提供的是抗TGFβ1抗体或其抗原结合部分，其结合至与本文所述的抗体或其抗原结合部分相同的表位。
本文提供的任何抗体可使用任何合适的方法来表征。例如，一种方法是鉴定抗原所结合的表位，或“表位定位”。有许多合适的方法用于定位和表征蛋白质上表位的位置，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，例如，在Harlow和Lane，Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999的第11章中所述。在另外的实例中，表位定位可用于确定抗体所结合的序列。所述表位可以是线性表位，即包含在单条氨基酸链中，或由可以不必包含在单条氨基酸链(一级结构线性序列)中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。在一些实施方式中，表位是TGFβ1表位，当TGFβ1在GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物中时，其仅可用于被本文所述的抗体或其抗原结合部分结合。可以分离或合成(例如，重组)不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽，并用于与抗体的结合测定。在另一个实例中，可以通过使用源自靶抗原序列的重叠肽并通过抗体确定结合来在系统筛选中确定所述抗体结合的所述表位。根据基因片段表达测定，编码靶抗原的开放阅读框随机或通过特定的遗传构建进行片段化，并确定所述抗原的表达片段与待测抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生，然后在放射性氨基酸存在下在体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定所述抗体与放射性标记的抗原片段的结合。还可以通过使用在噬菌体颗粒表面上展示的大型随机肽序列文库(噬菌体文库)来鉴定某些表位。或者，可以在简单结合测定中测试限定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变，以鉴定表位结合所必需的、充分的和/或需要的残基。例如，可以使用靶抗原的突变体进行结构域交换实验，其中GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的各种片段已经被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质的序列替换(交换)，例如TGFβ蛋白质家族的另一成员(例如GDF11)。
或者，竞争测定法可使用已知结合至相同抗原的其它抗体来确定抗体是否结合至与其他抗体相同的表位来进行。竞争测定法是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方式中，本发明包括与类别1、类别2、类别3、类别4和/或类别5抗体的任一者交叉阻断(交叉竞争)的抗体(例如，免疫球蛋白、抗原结合片段等)。因此，在一些实施方式中，可以通过包括以下步骤的方法制备药物组合物：选择与类别1抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段；将抗体配制成药物组合物。
在一些实施方式中，可以通过包括以下步骤的方法制备药物组合物：选择与类别2抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段；将抗体配制成药物组合物。
在一些实施方式中，可以通过包括以下步骤的方法制备药物组合物：选择与类别3抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段；将抗体配制成药物组合物。
在一些实施方式中，可以通过包括以下步骤的方法制备药物组合物：选择与类别4抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段；将抗体配制成药物组合物。
在一些实施方式中，可以通过包括以下步骤的方法制备药物组合物：选择与类别5抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段；将抗体配制成药物组合物。
在一些实施方式中，可以通过包括以下步骤的方法制备药物组合物：选择与选自以下的抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33和Ab34；和，配制成药物组合物。
优选地，该方法选择的抗体是高亲和性结合物，其特征在于所述抗体或抗原结合片段能够以≤5nM的KD结合至每个任LLC(例如，hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1)，如通过溶液平衡滴定所测量的。在一些实施方式中，抗体符合类别1、类别2、类别3、类别4和类别5的一个或多个的标准。根据本公开，此类交叉竞争抗体可以用于治疗受试者的TGFβ1相关的适应症。
抗体的各种修饰和变异
由本公开涵盖的任何抗体或其抗原结合片段的非限制性变异、修饰和特征简要讨论如下。还提供了相关分析方法的实施方式。
天然存在的抗体结构单元通常包括一个四聚体。每个这样的四聚体通常由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一个全长的“轻”链(在某些实施方式中，约25kDa)和一个全长的“重”链(在某些实施方式中，约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分通常包含约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义可以负责效应子功能的恒定区。人抗体轻链通常分类为κ和λ轻链。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并定义抗体的亚型。抗体可以是任何类型(例如，IgM、IgD、IgG、IgA、IgY和IgE)和类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1和IgA2)。通常，在全长轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区(参见，例如，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(其全部内容通过引用并入)。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常显示出由三个高变区连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构，也称为互补决定区或CDR。来自每对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，其使得可以结合至特定的表位。从N末端到C末端，轻链和重链两者的可变结构域通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配通常符合Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等，(1989)Nature 342:878-883中的定义。轻链的CDR也可以称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，重链的CDR也可以称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方式中，抗体可包含来自重链羧基末端的少量氨基酸缺失。在一些实施方式中，抗体包含在重链羧基末端具有1-5个氨基酸缺失的重链。在某些实施方式中，对CDR的明确界定和包含抗体结合位点的残基的鉴定通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成。在某些实施方式中，其可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来实现，例如X射线晶体学。在一些实施方式中，可以采用各种分析方法来鉴定或粗略估算CDR区。这样的方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、Lu等所描述的定义(见上文)和接触定义。
“亲和性成熟”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致其相比于其不具有这些改变的亲本抗体，抗体对抗原的亲和力提高。示例性亲和性成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和性(例如，～10-9M-10-12M范围的KD)。通过本领域已知的方法产生亲和性成熟抗体。Marks等，(1992)Bio/Technology10:779-783描述了通过VH和VL结构域混排的亲和性成熟。Barbas,等，(1994)ProcNat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813；Schier等，(1995)Gene 169:147-155；Yelton等，(1995)J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等，(1995)J.Immunol.154(7):3310-9；和Hawkins等，(1992)J.Mol.Biol.226:889-896描述了CDR和/或框架残基的随机诱变；和美国专利号6,914,128中描述了在具有活性增强氨基酸残基的选择性诱变位置、接触或超突变位置上的选择性突变。通常，亲本抗体及其亲和性成熟的子代(例如，衍生物)在抗原内保留了相同的结合区，尽管由于亲和性成熟而引入的氨基酸残基改变可能会改变分子水平上的某些相互作用。
术语“CDR嫁接抗体”意指其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但是其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一物种的CDR序列所置换的抗体，例如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDR(例如，CDR3)已被人CDR序列取代。
术语“嵌合抗体”意指其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有连接至人恒定区的鼠重链和轻链可变区的抗体。
如本文所用，术语“框架”或“框架序列”意指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同系统确定，所以框架序列的含义受到相应不同解释的影响。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3和重链的CDR-H1、-H2和-H3)也在每条链上将轻链和重链上的框架区划分为四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3位于FR3和FR4之间。如其他人所提及的，在没有将特定的亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，框架区域表示单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区域内的组合的FR。如本文所用，单数FR表示四个亚区中的一个，复数FR表示构成框架区的四个亚区中的两个或更多个。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链框架区1(H-FR1)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG(SEQ IDNO:174)。例如，位置16处的Gly残基可以被Arg(R)置换；和/或，位置23处的Ala可以被Thr(T)置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链框架区2(H-FR2)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:175)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链框架区3(H-FR3)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQID NO:176)。例如，位置12处的Ser残基可以被Thr(T)置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链框架区4(H-FR4)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:177)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链框架区1(L-FR1)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:178)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链框架区2(L-FR2)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:179)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链框架区3(L-FR3)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID NO:180)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链框架区4(L-FR4)，其具有任选地具有1、2或3个氨基酸改变的下述氨基酸序列：FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:181)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含人IgM恒定结构域、人IgG恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG2A恒定结构域、人IgG2B恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域，人IgA恒定结构域、人IgA1恒定结构域，人IgA2恒定结构域、人IgD恒定结构域或人IgE恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定结构域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含人IgG1恒定结构域或人IgG4恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定结构域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含人IgG4恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定结构域。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含人IgG4恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定结构域，其具有产生IgG1样铰链并允许形成链间二硫键的Ser至Pro的骨架置换。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分还包含轻链免疫球蛋白恒定结构域，其包含人Igλ恒定结构域或人Igκ恒定结构域。
在一些实施方式中，抗体是具有其是两个重链和两个轻链的四个多肽链的IgG。
在一些实施方式中，其中抗体是人源化抗体、双抗体，或嵌合抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，抗体是人抗体。在一些实施方式中，抗体包含具有人种系氨基酸序列的框架。
在一些实施方式中，抗原结合部分是Fab片段、F(ab’)2片段、scFab片段或scFv片段。
如本文所用，术语“种系抗体基因”或“基因片段”意指由未经历成熟过程的非淋巴细胞编码的免疫球蛋白序列，其导致遗传重排和突变以表达特定免疫球蛋白(参见，例如，Shapiro等，(2002)Crit.Rev.Immunol.22(3):183-200；Marchalonis等，(2001)Adv.Exp.Med.Biol.484:13-30)。本公开的各种实施方式提供的优点之一源于认识到种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体特有的必需氨基酸序列结构，因此在该物种中用于治疗时更不可能被认为是来自外界来源。
如本文所用，“中和”意指当结合蛋白特异性结合至抗原时抵消抗原(例如，靶蛋白)的生物学活性。在一个实施方式中，中和结合蛋白结合至抗原/靶标，例如细胞因子、激酶、生长因子、细胞表面蛋白、可溶性蛋白、磷酸酶或受体配体，并将其生物学活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％。98％、99％或更多。在一些实施方式中，针对生长因子的中和抗体特异性结合已从潜在复合物中释放的成熟的、可溶性生长因子，从而阻止所述生长因子结合其受体以激发下游信号传导的能力。在一些实施方式中，成熟生长因子是TGFβ1或TGFβ3。
如本文所用，术语“结合蛋白”包括特异性结合至抗原(例如，TGFβ1)的任何多肽，包括但不限于抗体或者其抗原结合部分、DVD-IgTM、TVD-Ig、RAb-Ig、双特异性抗体和双特异性抗体。
术语“单克隆抗体”或“mAb”在包含相同的组合物情况下使用时可能意指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体制备物，即，除了可能以少量存在的可能天然变异以外，构成群体的个体抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的，定向针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体定向针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下文II部分C中进一步描述)、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom,H.R.(1997)TIB Tech.15:62-70；Azzazy,H.和Highsmith,W.E.(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo,J.V.和Larrick,J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom,H.和Chames,P.(2000)Immunol.Today 21:371-378，其通过引用并入本文)、从其是转人免疫球蛋白基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，Taylor,L.D.等，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann,S-A.和Green,L.L.(2002)Cur.Opin.in Biotechnol.13:593-597；Little,M.等，(2000)Immunol.Today 21:364-370)或是通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用表达人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但其可能不天然存在于体内人抗体种系库中。
如本文所用，“双重可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-IgTM”及类似术语是其包含成对的重链DVD多肽和轻链DVD多肽的结合蛋白，每个成对的重链和轻链提供两个抗原结合位点。每个结合位点包含每个抗原结合位点参与抗原结合的总共6个CDR。DVD-IgTM通常具有至少部分地通过CH3结构域的二聚化彼此结合的两个臂，其中DVD的每个臂是双特异性的，提供具有四个结合位点的免疫球蛋白。DVD-IgTM在美国专利公开号2010/0260668和2009/0304693中提供，其全部内容包括序列表各自通过引用并入本文。
如本文所用，“三重可变结构域免疫球蛋白”或“TVD-Ig”及类似术语是其包含成对的重链TVD结合蛋白多肽和轻链TVD结合蛋白多肽的结合蛋白，每个成对的重链和轻链提供三个抗原结合位点。每个结合位点包括每个抗原结合位点参与抗原结合的总共6个CDR。TVD结合蛋白可以具有至少部分地通过CH3结构域的二聚化彼此结合的两个臂，其中TVD结合蛋白的每个臂是三特异性的，提供具有六个结合位点的结合蛋白。
如本文所用，“受体抗体免疫球蛋白”或“RAb-Ig”及类似术语是包含重链RAb多肽和轻链RAb多肽的结合蛋白，其共同形成总共三个抗原结合位点。通过配对每个重链RAb多肽和轻链RAb多肽中存在的重链和轻链抗体可变结构域以形成提供第一抗原结合位点的具有总共6个CDR的单个结合位点，从而形成一个抗原结合位点。每个重链RAb多肽和轻链RAb多肽包括独立结合配体、提供第二和第三“抗原”结合位点的受体序列。RAb-Ig通常具有两个至少部分地通过CH3结构域的二聚化彼此结合的臂，RAb-Ig的每个臂是三特异性的，提供具有六个结合位点的免疫球蛋白。RAb-Ig在美国专利申请公开号2002/0127231中描述，其全部内容包括序列表各自通过引用并入本文。
如本文所用，与“双特异性半Ig结合蛋白”或“双特异性(半Ig)结合蛋白”相区别，术语“双特异性抗体”，是指由四价体瘤(quadroma)技术产生的全长抗体(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.(1983)Nature 305(5934):p.537-540)，其通过两种不同的单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz,U.D.等，(1985)Nature 314(6012):628-631)，或通过在Fc区中引入不抑制CH3-CH3二聚化的突变的杵臼或类似方法(参见Holliger,P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90(14):6444-6448)，而产生多种不同的免疫球蛋白种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。通过分子功能，双特异性抗体在其两个结合臂(一对HC/LC)中的一个上结合一个抗原(或表位)，并在其第二臂(一对不同的HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)。通过该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者方面)，并且对于其结合的每种抗原是单价的。
如本文所用，并且与双特异性半Ig结合蛋白或双特异性结合蛋白相区别，术语“双重特异性抗体”意指可以在其两个结合臂(一对HC/LC)的每个中结合两个不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开号WO 02/02773)。因此，双特异性结合蛋白具有两个相同的抗原结合臂，其具有相同的特异性和相同的CDR序列，并且对于其结合的每种抗原是二价的。
如本文所用，术语“Kon”旨在指代结合蛋白(例如，抗体)与抗原结合以形成本领域所知的例如抗体/抗原复合物的速率常数。已知术语“结合速率常数”或“ka”也称为“Kon”，在本文中可互换使用。该值表示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体和抗原之间形成复合物的速率，也由下式表示：抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本文所用，术语“Koff”旨在指代结合蛋白(例如，抗体)从本领域所知的例如抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。已知术语“解离速率常数”或“kd”也称为“Koff”，在本文中可互换使用。该值表示抗体与其靶抗原的解离速率，或是Ab-Ag复合物分离成游离的抗体和抗原的时间，由下式表示：Ab+Ag←Ab-Ag。
术语“平衡解离常数”或“KD”，在本文中可互换使用，意指在平衡状态下滴定测量中获得的值，或是通过用解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示结合蛋白(例如，抗体)对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域熟知的。使用基于荧光的技术提供高灵敏度和在平衡状态下检查生理缓冲液中的样品的能力。可以使用其他的实验方法和仪器，例如
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(生物分子相互作用分析)测定(例如，仪器可从GE Healthcare公司的BIAcoreInternational AB,Uppsala,Sweden获得)。另外，还可以使用购自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)的
Figure BDA0002970630990000522
(动力学排除测定)测定。
如本文所用，术语“晶体(crystal/crystallized)”意指以晶体形式存在的结合蛋白(例如，抗体)或其抗原结合部分。晶体是固态物质的一种形式，其不同于其他例如无定形固态或液晶态的形式。晶体由原子、离子、分子(例如，蛋白，如抗体)或分子组合(例如，抗原/抗体复合物)的规则的、重复的、三维的阵列组成。这些三维阵列根据本领域熟知的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单元或构建块称为不对称单元。所述不对称单元在符合给定的、明确定义的晶体学对称性的排布中的重复提供晶体的“晶胞”。所述晶胞通过在所有三个维度上的常规平移重复提供晶体。参见Giege,R.和Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach,2nd ea.,pp.201-16,Oxford University Press,New York,New York,(1999)。术语“接头”用于表示包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基并用于连接一个或多个抗原结合部分的多肽。这样的接头多肽是本领域熟知的(参见，例如，Holliger,P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等，(1994)Structure 2:1121-1123)。示例性接头包括但不限于：ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:55)；ASTKGP(SEQ ID NO:56)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:57)；TVAAP(SEQ ID NO:58)；AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ IDNO:59)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:60)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO:61)；SAKTTPKLGG(SEQID NO:62)；SAKTTP(SEQ ID NO:63)；RADAAP(SEQ ID NO:64)；RADAAPTVS(SEQ ID NO:65)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:66)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:67)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQID NO:68)；ADAAP(SEQ ID NO:69)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:70)；QPKAAP(SEQ ID NO:71)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:72)；AKTTPP(SEQ ID NO:73)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:74)；AKTTAP(SEQ ID NO:75)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:76)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:77)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO:78)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:79)；GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:80)；TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:81)；和ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:82)。
“标记”和“可检测标记”或“可检测部分”意指附着在特定结合配偶体，例如抗体或分析物，例如以使特定结合对的成员(如抗体和分析物)和特异性结合配偶体(例如抗体或分析物)之间的反应可检测的，如此标记被称为“可检测标记”。因此，如本文所用的术语“标记的结合蛋白”意指具有掺入的用于鉴定结合蛋白的标记的蛋白。在一个实施方式中，标记是可检测的标识物，其可以产生可通过视觉或仪器手段检测的信号，例如掺入放射性标记的氨基酸或附着于生物素基部分的多肽，其可以通过标记的亲和素蛋白(例如，含有荧光标志物或酶活性的链球菌亲和素蛋白，其可通过光学或比色法检测)检测。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，18F、11C、13N、15O、68Ga、18F、89Zr、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm)；发色团；荧光标记(例如，FITC、罗丹明和镧系元素荧光粉)；酶标记(例如，辣根过氧化物酶、荧光素酶和碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素基团；由第二报告分子识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域和表位标签)；和磁性试剂，如钆螯合物。通常用于免疫测定的标记的代表性实例包括产生光的部分，例如吖啶化合物，和产生荧光的部分，例如荧光素。本文描述了其他标记。在这方面，所述部分本身可能没有被可检测地标记，但在与另一部分反应时可能变得可检测。“可检测标记”的使用旨在包括后一种类型的可检测标记。
在一些实施方式中，使用Octet测定法测定抗体或其抗原结合部分与抗原(例如，蛋白复合物)的结合亲和性，如呈递分子-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，Octet测定是确定可指示抗体和抗原之间结合的一个或更多个动力学参数的测定法。在一些实施方式中，使用
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系统(ForteBio,Menlo Park,CA)测定抗体或其抗原结合部分与呈递分子-proTGFβ1复合物的结合亲和性。例如，可以使用fortéBio Octet QKe dip和使用生物层干涉法的无标记读取测定系统来确定抗体的结合亲和力。在一些实施方式中，抗原固定至生物传感器(例如，链球菌亲和素蛋白包被的生物传感器)上，并且抗体和复合物(例如，生物素化的呈递分子-proTGFβ1复合物)以高浓度(50μg/mL)存在于溶液中，以测量结合相互作用。在一些实施方式中，使用本文中概述的方案确定抗体或其抗原结合部分与呈递分子-proTGFβ1复合物的结合亲和性。
新型、高亲和性、不依赖于背景的proTGFβ1抗体的表征
结合性质
本公开的抗体具有增强的结合活性。包括能够选择性抑制TGFβ1激活的一类高亲和性、不依赖于背景的抗体。值得注意的是，与此前更通用的用法相比，术语“不依赖于背景”在本文中以更大程度的严谨性使用。根据本公开，该术语赋予抗体能够对不同抗原复合物施加相对亲和性的均匀水平(即，无偏倚)。因此，本发明的不依赖于背景的抗体能够靶向多种类型的前体复合物(例如，呈递分子-proTGFβ1复合物)，并能够以等同亲和性(即，复合物的相对亲和性差异不超过三倍)结合每种此类复合物，其中如通过例如MSD-SET所测量的，KD值低于10nM，优选地低于5nM，更优选地低于1nM，甚至更优选地低于100pM。如下所示，本发明涵盖的很多抗体具有在亚纳摩尔范围内的KD值。
因此，抗体能够特异性结合至每种人呈递分子-proTGFβ1复合物(有时称为“大型潜在复合物”，其是由proTGFβ1二聚体与单个呈递分子偶联而成的三元复合物，即，LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。通常，将重组生产、纯化的蛋白复合物作为抗原(例如，抗原复合物)，以在适宜的体外结合测定中评价或确证抗体结合抗原复合物的能力。此类测定是本领域熟知的，并且包括但不限于基于生物层干涉法(BLI)的测定(如
Figure BDA0002970630990000541
)和基于溶液平衡滴定的测定(如MSD-SET)。
基于BLI的结合测定在本领域中广泛用于测量抗体对抗原的亲和性和动力学。这是一种无标记技术，其中基于光学干涉来分析生物分子相互作用。可以将一种蛋白(例如，待检测的抗体)固化在生物传感器尖端。当在溶液中的其他蛋白(例如，抗原)开始结合至固化的抗体时，其引起干扰模式的变化，能够对其进行实时测量。这使得能够对结合特异性、结合和解离速率以及浓度依赖性进行监测。因此，BLI是一种揭示系统动态的动力学指标。由于其易用性和快速的结果，基于BLI的测定，如
Figure BDA0002970630990000542
系统(可以从ForteBio/MolecularDevices,Fremont California获得)作为初始筛选方法在筛选过程中将“结合剂”的混合物与“非结合剂”或“弱结合剂”的混合物识别和分离是特别方便的。
基于BLI的结合测定表明，当通过
Figure BDA0002970630990000543
测量结合亲和性时，新抗体被表征为“背景平衡/不依赖于背景”的抗体。如在总结抗体的非限制性实例的基于BLI的结合性质的表8中可见，这些抗体在四种靶向复合物之间在亚纳摩尔范围内显示出相对均匀的KD值，以及相对较低的基质与细胞差异(不超过五倍偏倚)(参见(H)列)。这可以与以参照形式提供的此前鉴定的抗体Ab3形成对比，其显示比与细胞相关复合物明显更高的对基质相关复合物的相对亲和性(27+倍偏倚)。
下表8提供了本发明所涵盖的高亲和性、不依赖于背景的proTGFβ1抗体的非限制性实例。该表提供了如通过
Figure BDA0002970630990000544
所测量的体外结合测定的代表性结果。通过基于SPR的技术(Biacore System)也获得了类似的结果。
表中的(A)列列出了具有离散的氨基酸序列的单克隆抗体。Ab3(以粗体显示)是此前鉴定的参照抗体，其在基于细胞的测定中显示为是强效的；在多种动物模型中有效；以及具有清楚的毒理学性质(在PCT/US2018/012601中公开)。(B)列、(D)列、(E)列和(F)列提供了以KD测量的每种所列抗体的亲和性。(B)列显示了每种抗体对重组人LTBP1-proTGFβ1复合物的亲和性；(C)列显示了对重组人LTBP3-proTGFβ1复合物的亲和性；(E)显示了对重组人GARP-proTGFβ1复合物的亲和性；和(F)显示了对重组人LRRC33-proTGFβ1复合物的亲和性。(B)和(C)的平均KD值显示在相应的(D)列中，其共同表示抗体对ECM或基质相关proTGFβ1复合物的亲和性。类似地，(E)和(F)的平均KD值显示在相应的(G)列中，其共同表示抗体对细胞表面或细胞相关proTGFβ1复合物的亲和性。最后，来自(D)列和(G)列的平均KD值之间的相对比值以在(H)列中的“倍数偏倚”表示。因此，当针对基质相关复合物和细胞表面复合物比较抗体的结合偏好时，(H)列的数值越大，针对特定抗体存在的偏倚越大。这是定量地呈现和比较抗体对其靶向复合物的内在偏倚的一种方式。这种分析可以用于指导针对用于特定治疗用途的候选抗体的选择过程。
表8：不依赖于背景的TGFβ1抗体的非限制性实例和通过BLI测量的KD值
Figure BDA0002970630990000551
本发明提供了一类高亲和性、不依赖于背景的抗体，其均能够以等同的亲和性结合至四种已知呈递分子-proTGFβ1复合物，即LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，与此前描述的参照抗体Ab3相比，抗体以等同或更高的亲和性结合每种呈递分子-proTGFβ1复合物。根据本发明，如通过适宜的体外结合测定(如生物层干涉法和表面等离子体共振)所测量的，此类抗体以≤5nM的亲和性(通过KD确定)特异性结合每种前述复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合人LTBP1-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合人LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合人GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合人LRRC33-proTGFβ1复合物。
在优选的实施方式中，此类抗体是人和小鼠交叉反应性的。因此，在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合小鼠LTBP1-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合小鼠LTBP3-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合小鼠GARP-proTGFβ1复合物。在一些实施方式中，抗体或片段以≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤5nM或≤0.5nM的亲和性结合小鼠LRRC33-proTGFβ1复合物。
如所示的，本公开的proTGFβ1抗体针对基质相关的proTGFβ1复合物具有特别高的亲和性。在一些实施方式中，基质相关复合物(即，LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1)的平均KD值是≤1nM或≤0.5nM。
如所示的，本公开的proTGFβ1抗体针对细胞相关的proTGFβ1复合物具有很高的亲和性。在一些实施方式中，细胞相关复合物(即，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)的平均KD值是≤2nM或≤1nM。
本公开的高亲和性proTGFβ1抗体的特征在于其对所有四种抗原复合物均具有一致的(非偏倚的)亲和性(例如，与Ab3相比)。在本文所述的四种已知呈递分子-proTGFβ复合物中，没有一个抗原复合物的KD显著偏离。换句话说，相对于此前描述的proTGFβ1抗体(包括Ab3)，本公开已经实现了更均匀的结合活性，因为每种这样的抗体在四种抗原复合物中显示出等同的亲和性。在一些实施方式中，抗体或片段显示出无偏倚或均一的结合性质，其特征在于抗体或片段在四种proTGFβ1抗原复合物中的亲和性差异(或范围)在最低和最高KD值之间不超过五倍。在一些实施方式中，亲和性的相对差异(范围)不超过三倍。
在表8中进一步说明了“均一性”或缺乏偏倚的概念。分别计算了两种基质相关的和细胞相关的复合物之间的平均KD值(见(D)列和(G)列)。然后，可以将这些平均KD值用于询问基质相关的复合物与细胞表面(例如，免疫细胞)相关的复合物之间的结合活性是否存在偏倚。如表8中所示，偏倚可以表示为平均KD值的“倍数差异”。与此前描述的抗体Ab3相比，本公开涵盖的高亲和性、不依赖于背景的proTGFβ1抗体是显著无偏倚的，因为很多抗体在基质相关复合物与细胞相关复合物之间的平均KD值的差异不超过三倍(将其与Ab3的25倍+的偏倚进行比较)。
因此，提供了一类不依赖于背景的单克隆抗体或片段，其均能够以等同的亲和性结合至每种下述呈递分子-proTGFβ1复合物，如通过生物层干涉法或表面等离子体共振所测量的，亲和性≤1nM：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。如通过生物层干涉法或表面等离子体共振所测量的，此类抗体以≤5nM的亲和性特异性结合每种前述复合物，其中单克隆抗体或片段显示对上述复合物中的任一者相对于其他复合物的亲和性不超过三倍的偏倚，且其中单克隆抗体或片段抑制成熟TGFβ1生长因子从proTGFβ1复合物中的每一者而非从proTGFβ2或proTGFβ3复合物释放。
虽然可从基于BLI的测定获得的结合曲线的动力学(例如，“结合”和“解离”速率)提供有用的信息，但本发明的申请人预期，基于本文公开的激活抑制剂的作用机理，即，通过与栓系的(例如，组织定位的)无活性(例如，潜在)靶点结合而起作用，从而防止其被激活的抗体，在平衡状态下测量的结合性质可能更准确地反映其体内行为和效价。以此观点来看，例如，具有快速“结合”速率(“Kon”)的，将在通过BLI获得的结合测量结果中得到反映的抗体可提供评价中和抗体(例如，直接靶向且必须快速隔离活性、可溶性生长因子本身，以便其作为有效抑制剂起作用的抗体)的相关参数。然而，其可能未必适用于充当激活抑制剂的抗体，如本文公开的那些。如所描述的，本发明的新型TGFβ1抑制剂的作用机制是通过对激活步骤的抑制，与隔离可溶性、激活后的生长因子相反，该抑制通过靶向组织/细胞栓系的潜在复合物来完成。这是因为TGFβ1的激活抑制剂靶向位于各个组织(例如，在ECM内、免疫细胞表面等)的非活性前体，从而抢先阻止成熟生长因子从复合物中释放。这种作用机制被认为使抑制剂能够在体内达到靶点饱和(例如，平衡)，而无需像常规中和抑制剂所要求的那样迅速地与内源性受体竞争瞬时生长因子分子。
考虑到这种作用机制上的差异，通过使用另一种体外结合测定模式进行结合性质的进一步评价，该测定能够确定平衡时的亲和性。
有鉴于此，可以预期在平衡时测量此类抗体的结合亲和性的测定可以更准确地代表体内靶点结合的模式。因此，可以进行基于MSD-SET的结合测定(或其他适宜的测定)，如下表9中所示。
溶液平衡滴定(“SET”)是一种测定，可以在溶液中处于平衡状态时测量两个分子(如抗原和结合抗原的抗体)之间的结合。例如，基于Meso-Scale Discovery(“MSD”)的SET或MSD-SET是确定平衡状态下具有特别高亲和性的蛋白-蛋白相互作用的解离常数的有用模式(参见，例如：Ducata等，(2015)J Biomolecular Screening 20(10):1256-1267)。基于SET的测定对于确定具有亚纳摩尔(例如，皮摩尔)亲和性的抗体的KD值是特别有用的。
表9：高亲和性不依赖于背景的TGFβ1抗体的非限制性实例(hIgG4)和通过MSD-SET测量的KD值(“h”表示人复合物)
Figure BDA0002970630990000571
表9中还包括了三种此前描述的TGFβ1选择性抗体(C1、C2和Ab3)作为参照抗体。C1和C2首先在公开为WO 2017/156500的PCT/US2017/021972中公开，且Ab3在公开为WO 2018/129329的PCT/US2018/012601中进行了描述。
从表9中提供的亲和性数据可以看出，根据本公开的新型抗体的结合活性明显高于此前鉴定的参照抗体。而且，新型TGFβ1抗体是“不依赖于背景的”，因为其以等同的亲和性(例如，～亚纳摩尔范围，例如，KD<1nM)与每种人LLC复合物结合。高亲和性，不依赖于背景的结合性质表明，这些抗体可能有利于治疗TGFβ1相关适应症，包括与ECM相关的和免疫组分的失调，如癌症。
对于基于溶液平衡滴定的结合测定，可以将包含呈递分子(如上文所示的那些)之一的蛋白复合物用作抗原(呈递分子-TGFβ1复合物，或LLC)。允许待测抗体在溶液中形成抗原-抗体复合物。对抗原-抗体反应混合物进行孵育以使其达到平衡；可以通过本领域熟知的适宜方法测量在测定反应物中存在的抗原-抗体复合物的量。与基于BLI的测定相比，基于SET的测定受抗原-抗体复合物的结合/解离速率的影响较小，从而可以非常灵敏地检测非常高的亲和性相互作用。如表9中所示，在本公开中，优选的TGFβ1高亲和性抑制剂在所有检测的大型潜在复合物中表现出亚纳摩尔(例如，皮摩尔)亲和性范围，如通过基于SET的测定所确定的。
因此，提供了一类不依赖于背景的单克隆抗体或片段，如通过溶液平衡滴定测定所测量的，其每一种均能够以等同的亲和性以≤1nM的KD结合至每种下述人呈递分子-proTGFβ1复合物，如MSD-SET：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1。如通过MSD-SET所测量的，此类抗体以≤1nM的KD特异性结合每种前述复合物，并且其中单克隆抗体或片段抑制成熟TGFβ1生长因子从每种proTGFβ1复合物而非从proTGFβ2或proTGFβ3复合物释放。在优选的实施方式中，此类抗体或片段以500pM或更低(即，≤500pM)、250pM或更低(即，≤250pM)或200pM或更低(即，≤200pM)的KD结合每种前述复合物。甚至更优选地，此类抗体或片段以100pM或更低(即，≤100pM)的KD结合每种前述复合物。在一些实施方式中，抗体或片段不结合不与前结构域复合物结合的游离TGFβ1生长因子。这能够通过本领域公知的适宜体外结合测定检测或确证，如生物层干涉法。
在进一步优选的实施方式中，此类抗体或片段也与鼠类(例如，大鼠和/或小鼠)和/或非人灵长类(例如，cyno)对应物具有交叉反应性。仅举一个例子，Ab6能够以高亲和性结合至多个物种的每种大型潜在复合物，包括：人、小鼠、大鼠和食蟹猴，如在表10和下文的实施例9中所示。
表10：如通过MSD-SET所测量的具有交叉物种反应性的高亲和性不依赖于背景的TGFβ1抗体的非限制性实例(“h”表示人；“m”表示小鼠)
Figure BDA0002970630990000581
效力
本文公开的抗体由于其抑制TGFβ1信号传导的能力而可以广泛地表征为“功能性抗体”。如本文所用，“功能性抗体”由于其以调节其功能的方式结合靶蛋白(例如，抗原)的能力而赋予一种或多种生物学活性。因此，功能性抗体广泛包括能够调节靶分子(即，抗原)的活性/功能的那些抗体。此类调节抗体包括抑制抗体(或抑制性抗体)和激活抗体。本公开涉及可抑制由与TGFβ1的多重背景相关的TGFβ1信号传导介导的生物学过程的抗体。当以治疗有效量(在可接受的毒性水平内达到足够的功效的剂量)施用时，用于实施本发明的抑制剂(如本文所述的抗体)旨在具有TGFβ1选择性，而不是靶向或干扰TGFβ2和TGFβ3。与此前鉴定的TGFβ1激活抑制剂相比，本公开的新型抗体具有增强的抑制活性(效力)。
在一些实施方式中，可以在适宜的基于细胞的测定中测量抑制性抗体的效力，如本文所述的CAGA报告细胞测定。在通常情况下，培养的细胞(如异源细胞和原代细胞)可以用于进行基于细胞的效力测定。可以使用表达内源性TGFβ1和/或目标呈递分子(如LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33)的细胞。或者，可以将编码一种或多种目标蛋白(如TGFβ1)和/或目标呈递分子(如LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33)的核酸引入此类细胞中进行表达，例如通过转染(例如，稳定转染或瞬时转染)或通过基于病毒载体的感染。在一些实施方式中，使用LN229细胞用于此类测定。使表达TGFβ1和目标呈递分子(例如，LTBP1、LTBP3、GARP或LRRC33)的细胞在培养基中生长，其在细胞表面上或沉积在ECM中(当与LTBP结合时)“呈递”大型潜在复合物。TGFβ1的激活可以由在另一细胞表面上表达的整联蛋白触发。表达整联蛋白的细胞可以是共表达大型潜在复合物的相同细胞或单独的细胞类型。将报告细胞加入掺入TGFβ响应元件的测定系统。以这种方式，可以通过在TGFβ激活时检测来自报告细胞(例如，与TGFβ响应启动子元件偶联的TGFβ响应报告基因，如荧光素酶)的信号来测量TGFβ激活的程度。使用此类基于细胞的测定系统，可以通过测量在存在或不存在待测抗体的条件下报告信号(例如，通过荧光读取结果测量的荧光素酶活性)的改变(降低)或差异确定抗体的抑制活性。此类测定如本文实施例2中所示。
因此，在一些实施方式中，针对hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物的每一者所测量的，根据用于测量TGFβ1激活的基于细胞的报告测定(如本文其他地方描述的LN229细胞测定)计算的本公开的新抗体的抑制效力(IC50)可以是5nM或更低。在一些实施方式中，针对每种LLC所测量的，抗体具有2nM或更低(即，≤2nM)的IC50。在优选的实施方式中，针对每种LLC复合物测量的抗体的IC50是1nM或更低。在一些实施方式中，针对hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1复合物的每一者，抗体具有小于1nM的IC50。
表11：如通过报告细胞测定所测量的所选抗体的抑制效力(以IC50计)
Figure BDA0002970630990000591
可以通过整联蛋白依赖性机制或蛋白酶依赖性机制触发TGFβ1的激活。可以针对阻断由一种或两种激活模式诱导的TGFβ1激活的能力评价根据本公开的抗体的抑制活性(例如，效力)。可以对上文所述的报告细胞测定进行设计以测量抗体阻断或抑制TGFβ1激活的整联蛋白依赖性激活的能力。还可以通过测量抗体阻断蛋白酶诱导的TGFβ1激活的能力来评估抑制效力。本公开的实施例3提供了此类测定的非限制性实施方式。结果总结在图5A和图5B中。因此，在本发明的一些实施方式中，根据本公开的亚型选择性抑制剂能够抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和TGFβ1的蛋白酶依赖性激活。此类抑制剂可以用于治疗以与蛋白酶活性相关的EDM失调为特征的TGFβ1相关适应症。例如，此类TGFβ1相关适应症可能与肌成纤维细胞增加，ECM的刚性增加，胶原沉积过多或异常或者其任何组合相关。此类病况包括例如纤维化病症和癌症，包括实体瘤(如转移性癌症)或骨髓纤维化。
在一些实施方式中，作为功效和/或药效学作用的指标，可以在适宜的体内模型中评价效力。例如，如果第一抗体在一定浓度下在体内模型中有效，而第二抗体在更低浓度下在相同体内模型中同样有效，则可以认为第二抗体比第一抗体更有效。可以将本领域公知的任何适宜疾病模型用于评估TGFβ1抑制剂的相对效力，其取决于特定目标适应症，例如癌症模型和纤维化模型。优选地，在此类研究中包括每周待测抗体的多个剂量或浓度。
类似地，可以测量药效学(PD)作用以确定抑制性抗体的相对效力。针对TGFβ信号传导通路的常用PD指标包括但不限于SMAD2/3的磷酸化和下游效应基因的表达，其转录对TGFβ激活敏感，如使用TGFβ响应启动子元件(例如，Smad结合元件)的那些。在一些实施方式中，当以3mg/kg或更低剂量向动物施用时，本公开的抗体能够在临床前纤维化模型中完全阻断疾病诱导的SMAD2/3磷酸化。在一些实施方式中，当在肾纤维化的UUO模型中以10mg/kg或更低剂量向动物施用时，本公开的抗体能够显著抑制包括Acta2、Col1a1、Col3a1、Fn1、Itga11、Lox、Loxl2在内的一组标志物基因的纤维化诱导的表达。
在一些实施方式中，因此，用于治疗用途的抗体或其抗原结合片段的选择过程可以包括鉴定显示出足够抑制效力的抗体或片段。例如，选择过程可以包括进行基于细胞的TGFβ1激活测定以测量一种或多种待测抗体或其片段的效力(例如，IC50)，并选择显示出所需效力的候选抗体或其片段的步骤。在一些实施方式中，每种人LLC的IC50是5nM或更低。然后，可以将所选抗体或片段用于治疗本文所述的TGFβ1相关适应症。
结合区
在本公开的背景下，抗原的“一个或多个结合区”提供了抗体-抗原相互作用的结构基础。如本文所用，“结合区”指抗体和抗原之间的界面区域，这样，当结合至生理溶液中的proTGFβ1复合物(“抗原”)时，抗体或片段可保护结合区免于溶剂暴露，如通过适宜技术(如氢-氘交换质谱(HDX-MS))所确定的。结合区的鉴定可用于深入了解抗原-抗体相互作用和特定抗体的作用机制。通过能够进行抗原分组的交叉阻断实验可以有助于鉴定具有相似或重叠结合区的其他抗体。任选地，可以将X-射线晶体学用于鉴定介导抗原-抗体相互作用的表位的确切氨基酸残基。
本领域熟悉HDX-MS，这是一种广泛使用的探索蛋白构象或溶液中蛋白-蛋白相互作用的技术。这种方法依赖于蛋白主链酰胺中的氢与溶液中存在的氘的交换。通过测量氢-氘交换速率，可以获得关于蛋白动力学和构象的信息(综述于：Wei等，(2014)“Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure ofprotein therapeutics:methodology and applications.”Drug Disco Today.19(1):95-102；通过引用并入)。该技术的应用是基于这样的前提：当抗体-抗原复合物形成时，结合伴侣之间的界面可能会阻塞溶剂，从而由于空间上排斥溶剂而降低或阻止交换速率。
本公开包括在包含潜伏套索或其一部分的区域(“结合区”)结合人LLC的抗体或其抗原结合片段。潜伏套索是前结构域内的蛋白模块。预期很多有效的激活抑制剂可以以这样的方式结合proTGFβ1复合物的该区域，使得抗体结合将“锁定”生长因子，从而阻止其释放。有趣的是，这是复合物的某一部分，其中生长因子的蝴蝶状伸长区域(例如，对应于例如指-1和指-2)与前结构域的笼状结构紧密相互作用。
如在图18B中所示，潜伏套索包含标记为2a和2b的一部分的区域，其是前结构域的一部分。值得注意的是，紧邻潜伏套索标记为5a的区域对应于生长结构域内所谓的指-1，而标记为6b的相对侧周围的区域，则是生长因子结构域内指-2的一部分。基于此，不难设想紧紧包裹在这些区域周围的抗体可以有效防止proTGFβ1复合物脱离，从而阻止激活。
使用HDX-MS技术，可以确定proTGFβ1的结合区。在一些实施方式中，被鉴定为对结合抗体或片段重要的proTGFβ1上的一部分包括前结构域的至少一部分和生长因子结构域的至少一部分。结合包含潜伏套索的至少一部分的第一结合区(在图19A中的“区1”)的抗体或片段是优选的。更优选地，此类抗体或片段还结合第二结合区(图19A中的“区2”)，所述第二结合区包含在生长因子结构域的指-1的生长因子结构域的至少一部分。此类抗体或片段还可以结合第三结合区(在图19A中的“区3”)，所述第三结合区包含生长因子结构域的指-2的至少一部分。
proTGFβ1内的其他区域也可能直接或间接地有助于本文公开的这些抗体的高亲和性相互作用。认为对于介导抗体与proTGFβ1复合物(见图18A)的高亲和性结合重要的区域可以包括但不限于：LVKRKRIEA(SEQ ID NO:159)；LASPPSQGEVP(SEQ ID NO:160)；PGPLPEAV(SEQ ID NO:161)；LALYNSTR(SEQ ID NO:162)；REAVPEPVL(SEQ ID NO:163)；YQKYSNNSWR(SEQ ID NO:164)；RKDLGWKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:165)；LGPCPYIWS(SEQ IDNO:166)；ALEPLPIV(SEQ ID NO:167)；和，VGRKPKVEQL(SEQ ID NO:168)(基于人proTGFβ1的天然序列)。
在可能有助于抗体-抗原相互作用的区域中，在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体可以结合某一表位，所述表位包含氨基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(“区1”)(SEQ ID NO:169)的至少一个残基。
在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体可以结合某一表位，所述表位包含氨基酸序列RKDLGWKWIHEPKGYHANF(“区2”)(SEQ ID NO:165)的至少一个残基。
在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体可以结合某一表位，所述表位包含氨基酸序列VGRKPKVEQL(“区3”)(SEQ ID NO:168)的至少一个残基。
在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体可以结合某一表位，所述表位包含氨基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(“区1”)(SEQ ID NO:169)的至少一个残基和氨基酸序列RKDLGWKWIHEPKGYHANF(“区2”)(SEQ ID NO:165)的至少一个残基。
在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体可以结合某一表位，所述表位包含氨基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(“区1”)(SEQ ID NO:169)的至少一个残基和氨基酸序列VGRKPKVEQL(“区3”)(SEQ ID NO:168)的至少一个残基。
在一些实施方式中，本公开的高亲和性抗体可以结合某一表位，所述表位包含氨基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(“区1”)(SEQ ID NO:169)的至少一个残基，氨基酸序列RKDLGWKWIHEPKGYHANF(“区2”)(SEQ ID NO:165)的至少一个残基和氨基酸序列VGRKPKVEQL(“区3”)(SEQ ID NO:168)的至少一个残基。
除了来自区域1、2和/或3的贡献外，此类表位还可以包含选自以下序列的至少一个氨基酸残基：LVKRKRIEA(SEQ ID NO:159)；LASPPSQGEVP(SEQ ID NO:160)；PGPLPEAV(SEQID NO:161)；LALYNSTR(SEQ ID NO:162)；REAVPEPVL(SEQ ID NO:163)；YQKYSNNSWR(SEQ IDNO:164)；RKDLGWKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:165)；LGPCPYIWS(SEQ ID NO:166)；ALEPLPIV(SEQ ID NO:167)；和VGRKPKVEQL(SEQ ID NO:168)。
值得注意的是，发现在结构研究中使用四种代表性的亚型选择性TGFβ1抗体鉴定出的很多结合区是重叠的，表明proTGFβ1复合物中的某些区域可能对维持proTGFβ1复合物的潜伏特别重要。因此，有利地，可以至少部分地基于其一个或多个结合区来选择抗体或其片段，所述结合区包括跨本文所述的多种抑制剂鉴定的重叠部分。这些结合区的重叠部分包括，例如，SPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQ ID NO:201)，WKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:202)和PGPLPEAVL(SEQ ID NO:203)。因此，根据本公开的高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂可以在某一表位结合proTGFβ1复合物(例如，人LLC)，所述表位包含SPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQID NO:201)，WKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:202)和/或PGPLPEAVL(SEQ ID NO:203)的一个或多个氨基酸残基。
因此，本公开涵盖的任何抗体或抗原结合片段，如本文公开的类别1至5的抗体或片段，可以结合本文鉴定的一个或多个结合区。如本文所述的，可以将此类抗体用于在受试者中治疗TGFβ1适应症。因此，选择适于根据本公开的治疗性用途的抗体或其抗原结合片段可以包括鉴定或选择某一抗体或其片段，所述抗体或其片段结合SPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQID NO:201)，WKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:202)，PGPLPEAVL(SEQ ID NO:203)，或其任何部分。
在表12中提供了如此前所述的(WO 2014/182676)人proTGFβ1的蛋白结构域或基序的非限制性实例。
表12：人TGFβ1相关多肽的选择的蛋白结构域/基序
Figure BDA0002970630990000621
安全性/毒性
已知能够拮抗多种亚型的TGFβ的常规泛抑制剂会引起多种毒性，包括，例如，在包括犬和大鼠在内的多个物种中都报道了心血管毒性(心脏损伤，最显著的是瓣膜病)。这些包括在主动脉瓣、右AV瓣和左AV瓣中的增生；在主动脉瓣、左AV瓣和升主动脉中的炎症；在升主动脉、主动脉瓣和左AV瓣中的出血；在升主动脉中的结缔组织退化(参见例如，Strauber等，(2014)“Nonclinical safety evaluation of a Transforming GrowthFactorβreceptor I kinase inhibitor in Fischer 344rats and beagle dogs”J.Clin.Pract 4(3):1000196)。亦参见图21A。
此外，已将结合所有三种TGFβ亚型的中和抗体与遍及多个物种所观察到的某些上皮细胞毒性相关联，下文中总结了其中的一些。
表13：与TGFβ的泛抑制剂相关的上皮毒性
Figure BDA0002970630990000631
基于本公开申请人的较早认识(参见PCT/US2017/021972)，常规TGFβ拮抗剂的亚型特异性的缺乏可成为与TGFβ抑制相关的毒性来源，本发明人寻求进一步实现广谱TGFβ1抑制，用于治疗表现出多方面TGFβ1失调的各种疾病，同时保持亚型选择性抑制剂的安全性/耐受性。
在临床背景下，仅当药物(例如，单克隆抗体)的最低有效浓度(MEC)低于药物的最低毒性浓度(MTC)时，才能达到治疗获益。大多数(如果不是全部)传统的TGFβ泛抑制剂都无法实现这一点，而事实上，泛抑制剂似乎会引起剂量限制性毒性。申请人此前的工作描述了TGFβ1的亚型选择性抑制剂，与传统泛抑制剂(如小分子受体拮抗剂和中和抗体)相比，安全性性质显著提高。WO 2017/156500公开了一种TGFβ1激活的亚型选择性抑制剂，当以高达每周100mg/kg的剂量在大鼠中施用4周时，未观察到待测物相关的毒性，从而确定了抗体的NOAEL为所检测的最高剂量，即100mg/kg。申请人的后续工作还表明，功能增强的抗体也具有相同的安全性性质。在此，目的之一是鉴定具有更高亲和性和效力，但至少具有相同或相当安全性水平的抗体。
在图21B和图21C中提供了来自四周大鼠毒理学研究的结果。在单独的研究中检测了两个亚型选择性TGFβ1抑制剂(Ab3和Ab6)，以及小分子ALK5抑制剂和单克隆中和抗体作为对照。两种亚型选择性抗体均未发现与待测物相关的毒性，而如所预期的非选择性抑制剂引起多种不良事件，这与已发表的研究一致。而且，当连续4周每周给药时，在食蟹猴中在高达300mg/kg的剂量水平下显示Ab6是安全的(例如，未观察到不良时间)。由于在低至3mg/kg的剂量下Ab6在很多体内模型中均显示有效，因而可提供高达100倍的治疗窗。重要的是，这表明高效力不一定意味着更高的毒性风险。不希望受到特定理论的束缚，可以预期本文公开的抗体的高选择性性质可能导致缺乏观察到的毒性。
因此，在一些实施方式中，当至少连续4周每周给药时，根据本公开的新抗体具有>100mg/kg的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施方式中，当至少连续4周每周给药时，根据本公开的新抗体具有高达100mg/kg的无可见不良效应水平(NOAEL)。用于进行TGFβ抑制剂和TGFβ1抑制剂的安全性/毒理学研究的适宜动物模型包括但不限于：大鼠、犬、食蟹猴和小鼠。在优选的实施方式中，基于适宜临床前功效研究的抗体的最小有效量低于NOAEL。更优选地，抗体的最小有效量为NOAEL的约三分之一或更低。在特别优选的实施方式中，抗体的最小有效量为NOAEL的约六分之一或更低。在一些实施方式中，抗体的最小有效量为NOAEL的约十分之一或更低。
在一些实施方式中，本发明包括能够抑制TGFβ1信号传导的亚型选择性抗体，当将其向受试者施用时，在有效治疗TGFβ1相关适应症的剂量下不会引起心血管或已知上皮毒性。在一些实施方式中，该抗体每周、每两周或每月施用的最低有效量约3-10mg/kg。优选地，抗体在最小有效量至少六倍的剂量下(例如，六倍的治疗窗)不会引起最低毒性。更优选地，抗体在最小有效量至少十倍的剂量下(例如，十倍的治疗窗)不会引起最低毒性。甚至更优选地，抗体在最小有效量至少十五倍的剂量下(例如，十五倍的治疗窗)不会引起最低毒性。
因此，用于治疗用途的抗体或其抗原结合片段的选择可以包括：选择符合本文所述类别1-5的一个或多个的标准的抗体或抗原结合片段；在适宜的临床前模型中进行体内功效研究，以确定抗体或片段的有效量；在适宜模型中进行体内安全性/毒理学研究，以确定安全或有毒的抗体的量(例如，MTD、NOAEL或用于评价安全性/毒性的任何本领域公知的参数)；并且，选择提供至少三倍的治疗窗(优选地6倍的，更优选地10倍的治疗窗，甚至更优选地15倍的治疗窗)的抗体或片段。在优选的实施方式中，在概括人病况的两个或更多个适宜的临床前模型中进行体内功效研究。在一些实施方式中，此类临床前模型包括TGFβ1阳性癌症，其可以任选地包括免疫抑制性肿瘤。免疫抑制性肿瘤可能对癌症疗法(如CBT、化疗和放疗)具有抗性。在一些实施方式中，临床前模型选自MBT-2、Cloudman S91和EMT6肿瘤模型。
所选择的抗体或片段可以用于制备包含抗体或片段的药物组合物。此类药物组合物可以用于治疗如本文所述的受试者的TGFβ1适应症。例如，TGFβ1的适应症可以时增殖性病症和/或纤维化病症。
作用机制
用于治疗的本发明的抗体是TGFβ1的抑制性抗体。此外，抗体是激活抑制剂，即，抗体阻断TGFβ1的激活步骤，而不是直接追赶已经激活的生长因子。
在广义上，术语“抑制抗体”意指拮抗或中和靶标功能的抗体，例如，生长因子活性。有利地，本公开的优选的抑制性抗体能够抑制成熟生长因子从潜在复杂体中释放，从而减少生长因子信号传导。抑制抗体包括靶向任何表位的抗体，所述表位当与这些抗体结合时降低生长因子释放或活性。这样的表位可位于TGFβ蛋白(例如，TGFβ1)的前结构域、生长因子或其他当被抗体结合时导致生长因子活性降低的表位上。本发明的抑制抗体包括但不限于抑制TGFβ1的抗体。在一些实施方式中，本公开的抑制性抗体特异性结合组合表位，即由抗原或抗原复合物的两种或更多种组分/部分形成的表位。例如，组合表位可以由来自单个蛋白质的多个部分的贡献形成，即来自相同蛋白质的多于一个的非连续区段的氨基酸残基。或者，组合表位可以由来自抗原复合物的多种蛋白质组分的贡献形成。在一些实施方式中，本公开的抑制性抗体特异性结合构象表位(或构象特异性表位)，例如对抗原或抗原复合物的三维结构(即构象)敏感的表位。
拮抗TGFβ信号传导的传统方法已经用于：i)在已经变得具有活性之后直接中和成熟生长因子，从而以耗尽可用于受体结合的游离配体(例如，从它的潜在前体复合物中释放)；ii)使用能够螯合游离配体的可溶性受体片段(例如，所谓的配体捕获物)；或者，iii)靶向其细胞表面受体以阻断配体-受体相互作用。这些常规方法中的每一种都需要拮抗剂与内源对应物竞争。此外，上述前两种方法(i和ii)靶向活性配体，其是一种过渡形式。因此，这样的拮抗剂必须能够在短暂的窗口期内从动力学上超过内源性受体。相比之下，第三种方法可能提供更持久的效果，但是无意中导致不希望的抑制效应(由此可能的毒性)，因为许多生长因子(例如，高达～20种)通过相同的受体转导信号。
为提供对这些缺点的解决方案，并进一步实现更大的选择性和局部化的作用，抑制性抗体潜在的优选作用机制例如本文描述的作用于TGFβ1激活和配体-受体相互作用的上游的那些。因此，预期适合于实施本发明的TGFβ1的亚型特异性、背景许可性抑制剂应当优选地靶向其激活之前的无活性(例如，潜在的)proTGFβ1复合物(例如，包含前/潜在TGFβ1的复合物)，以在其来源处(例如，在疾病微环境中，例如，TME)阻断激活步骤。根据本发明的优选实施方式，这样的抑制剂靶向ECM相关的和/或细胞表面系链的前/潜在TGFβ1复合物，而不是瞬时可用于受体结合的游离配体。
最近的研究进一步证明了，与可溶性活性物质(即，从来源释放出来的成熟生长因子)相反，在来源处局部靶向组织/细胞栓系复合物的优势。Ishihara等(Sci.Transl.Med.11,eaau3259(2019)“Targeted antibody and cytokine cancerimmunotherapies through collagen affinity”)报道，当全身施用的药物通过与胶原结合部分缀合而靶向肿瘤部位时，与非靶向对应物相比，其能够增强抗肿瘤免疫力并降低与治疗相关的毒性。
通过本公开的抗体实现的作用机制可以进一步有助于增强作用的持久性，以及总体上更大的效力和安全性。
有趣的是，这些抗体可能对细胞相关的TGFβ1(LRRC33-proTGFβ1和GARP-proTGFβ1)发挥额外的抑制活性。申请人已发现结合LRRC33的抗体在结合至细胞表面LRRC33时趋向于被内化。尚不清楚该内化是通过抗体结合主动诱导的，还是该现象是由巨噬细胞的天然(例如，被动)内吞活性引起的。然而，高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂Ab6能够在LRRC33和proTGFβ1转染细胞中迅速内化，并且Ab6实现的内化速率明显高于识别细胞表面LRRC33的参照抗体(图6)。从原代人巨噬细胞获得了相似结果。这些观察结果增加了Ab6在结合其靶点LRRC33-proTGFβ1时能够诱导内化的可能性，从而从细胞表面除去含LRRC33的复合物。在疾病部位，这可能会降低可激活潜在LRRC33-proTGFβ1水平的可用性。因此，亚型选择性TGFβ1抑制剂可以通过两种平行作用机制抑制TGFβ1的LRRC33臂：i)阻止从潜在复合物中释放成熟生长因子；和，ii)通过内化从细胞表面除去LRRC33-proTGFβ1复合物。类似的抑制性作用机制可能适用于GARP-proTGFβ1。
在一些实施方式中，该抗体是一种pH敏感性抗体，在中性pH(如pH约7)下比在酸性pH(如pH约5)下以更高的亲和性结合其抗原。此类抗体在酸性条件下比在中性或生理条件下可以具有更高的解离速率。例如，在酸性pH下测量的解离速率与在中性pH下测量的解离速率之比(例如，在pH5下的Koff高于在pH7下的Koff)可以至少为1.2。任选地，该比率是至少1.5。在一些实施方式中，该比率是至少2。可以将此类pH敏感性抗体作为回收抗体。在靶点在细胞表面上接合后，抗体可以触发膜结合的proTGFβ1复合物(与LRRC33或GARP结合)的抗体依赖性内化(因此被除去)。随后，在酸性胞内区室(如溶酶体)中，抗体-抗原复合物解离，并且游离抗体可被转运回到胞外域。
因此，在一些实施方式中，用于治疗用途的抗体或抗原结合片段的选择可以部分基于抗体诱导抗体依赖性内化和/或pH依赖性的能力。
抗原复合物及其组分
本公开的新型抗体特异性结合四种已知的人大型潜在复合物(例如，hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1)中的每一者，选择性抑制TGFβ1激活。优选的抗体进一步满足表1中列出的类别1-5的一种或多种的标准。
此类抗体的筛选(例如，鉴定和选择)涉及使用适宜的抗原复合物，其通常是重组生产的。提供了可以包含此类抗原复合物的有用的蛋白组分，包括TGFβ亚型和相关多肽，片段和变体，呈递分子(例如，LTBP、GARP、LRRC33)和相关多肽，片段和变体。这些组分可以表达、纯化并能够形成蛋白复合物(如大型潜在复合物)，能够将其用于抗体筛选过程。筛选可以包括阳性选择，其中将所需结合子从结合子和非结合子的池或文库中选择出来，以及阴性选择，其中将不需要的结合子从池中除去。通常，在阳性筛选中包括至少一种基质相关的复合物(例如，LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP1-proTGFβ1)和至少一种细胞相关的复合物(例如，GARP-proTGFβ1和/或LRRC33-proTGFβ1)，以确保被选择出的结合子对这两种生物学背景均具有亲和性。
在一些实施方式中，TGFβ1包含天然存在的哺乳动物氨基酸序列。在一些实施方式中，TGFβ1包含天然存在的氨基酸序列。在一些实施方式中，TGFβ1包含人、猴、大鼠或小鼠的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分不特异性结合至TGFβ2。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分不特异性结合至TGFβ3。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分不特异性结合至TGFβ2或TGFβ3。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分特异性结合至TGFβ1，所述TGFβ1包含SEQ IDNO:34中所示的氨基酸序列。TGFβ2的氨基酸序列和TGFβ3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:38和32所示。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分特异性结合至TGFβ1，所述TGFβ1包含非天然存在的氨基酸序列(或者，在本文中称为非天然存在的TGFβ1)。例如，相对于天然存在的TGFβ1氨基酸序列，非天然存在的TGFβ1可以包含一个或多个重组产生的突变。在一些实施方式中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3氨基酸序列包含如SEQ ID NO:24-35中所示的氨基酸序列，如表14中所示。在一些实施方式中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3氨基酸序列包含如SEQ ID NO:36-43中所示的氨基酸序列，如表15中所示。
TGFβ1(前结构域+生长因子结构域)
LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP CPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS(SEQ ID NO:24)
TGFβ2(前结构域+生长因子结构域)
SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQD NCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTIL YYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS(SEQ ID NO:28)
TGFβ3(前结构域+生长因子结构域)
SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCFRNLEENCC VRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYV GRTPKVEQLSNMVVKSCKCS(SEQ ID NO:32)
表14：示例性TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3氨基酸序列
Figure BDA0002970630990000671
Figure BDA0002970630990000681
表15：示例性非人氨基酸序列
Figure BDA0002970630990000682
Figure BDA0002970630990000691
Figure BDA0002970630990000701
Figure BDA0002970630990000711
在一些实施方式中，抗原蛋白复合物(例如，LTBP-TGFβ1复合物)可以包含一种或多种呈递分子，如LTBP蛋白(例如，LTBP1、LTBP2、LTBP3和LTBP4)、GARP蛋白、LRRC33蛋白或其一个或多个片段。通常，适用于实施本文公开的实施方式的最小所需片段包括呈递分子蛋白的至少50个氨基酸，优选地至少100个氨基酸，所述呈递分子蛋白包含能够与proTGFβ1复合物形成二硫键的至少两个半胱氨酸残基。特别地，这些Cys残基与存在于proTGFβ1复合物的每个单体的N末端附近的半胱氨酸形成共价键。在proTGFβ1二聚体复合物的三维结构中，每个单体的N末端所谓的“α-1螺旋”彼此非常接近(参见，例如，图18B，两个螺旋靠近灰色结构的底部)，设置与在呈递分子中存在的相应半胱氨酸对形成有效共价键所需的两个半胱氨酸残基(每个螺旋一个)之间的距离(参见，例如，Cuende等，(2015)Sci.Trans.Med.7:284ra56)。因此，当在筛选过程中(例如，免疫、文库筛选、鉴定和选择)将呈递分子的片段用于形成LLC时，此类片段应包含以正确距离分隔的半胱氨酸残基，这将允许与proTGFβ1复合物形成正确的二硫键形式，以保留所得LLC的正确构象。LTBP(例如，LTBP1、LTBP3和LTBP4)，例如，可以含有“富含半胱氨酸的结构域”以介导与proTGFβ1的共价相互作用。
如本文所述的抗体或其抗原结合部分能够结合至LTBP1-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是非天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是重组蛋白。此类重组LTBP1蛋白可以包含LTBP1，或者其剪接变体和/或其片段。重组LTBP1蛋白还可以被修饰以包含一个或多个可检测标记。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含前导序列(例如，天然或非天然前导序列)。在一些实施方式中，LTBP1蛋白不包含前导序列(即，前导序列已被加工或切割)。此类可检测标记可以包括但不限于生物素标记、聚组氨酸标签、myc标签、HA标签和/或荧光标签。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是哺乳动物LTBP1蛋白。在一些实施方式中，LTBP1蛋白是人、猴、小鼠或大鼠LTBP1蛋白。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含如表15中的SEQ ID NO:46和47所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含如表17中的SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
如本文所述的抗体或其抗原结合部分能够结合至LTBP3-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是非天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是重组蛋白。此类重组LTBP3蛋白可以包含LTBP3，或者其剪接变体和/或其片段。在一些实施方式中，LTBP3蛋白包含前导序列(例如，天然或非天然前导序列)。在一些实施方式中，LTBP3蛋白不包含前导序列(即，前导序列已被加工或切割)。重组LTBP3蛋白还可以被修饰以包含一个或多个可检测标记。此类可检测标记可以包括但不限于生物素标记、聚组氨酸标签、myc标签、HA标签和/或荧光标签。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是哺乳动物LTBP3蛋白。在一些实施方式中，LTBP3蛋白是人、猴、小鼠或大鼠LTBP3蛋白。在一些实施方式中，LTBP3蛋白包含如表15中的SEQ ID NO:44和45所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，LTBP1蛋白包含如表17中的SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
如本文所述的抗体或其抗原结合部分能够结合至GARP-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，GARP蛋白是天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，GARP蛋白是非天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，GARP蛋白是重组蛋白。此类GARP可以是重组的，在本文中称为重组GARP。与野生型GARP相比，一些重组GARP可以包含一个或多个修饰、截短和/或突变。重组GARP可以被修饰而具有可溶性。在一些实施方式中，GARP蛋白包含前导序列(例如，天然或非天然前导序列)。在一些实施方式中，GARP蛋白不包含前导序列(即，前导序列已被加工或切割)。在其他实施方式中，重组GARP可以被修饰以包含一个或多个可检测标记。在进一步的实施方式中，此类可检测标记可以包括但不限于生物素标记、聚组氨酸标签、flag标签、myc标签、HA标签和/或荧光标签。在一些实施方式中，GARP蛋白是哺乳动物GARP蛋白。在一些实施方式中，GARP蛋白是人、猴、小鼠或大鼠GARP蛋白。在一些实施方式中，GARP蛋白包含如表15中的SEQ ID NO:48-49所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，GARP蛋白包含如表18中的SEQ ID NO:52和53所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分不以依赖于背景的方式结合TGFβ1，例如仅当TGFβ1分子与特定的呈递分子(如GARP)复合时才发生与TGFβ1的结合。而相反的是，抗体及其抗原结合部分以不依赖于背景的方式结合至TGFβ1。换言之，当结合至下述任何呈递分子时，抗体或其抗原结合部分结合至TGFβ1：GARP、LTBP1、LTBP3和/或LRCC33。
如本文所述的抗体或其抗原结合部分能够结合至LRRC33-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，LRRC33蛋白是天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，LRRC33蛋白是非天然存在的蛋白或其片段。在一些实施方式中，LRRC33蛋白是重组蛋白。此类LRRC33可以是重组的，在本文中称为重组LRRC33。与野生型LRRC33相比，一些重组LRRC33蛋白可以包含一个或多个修饰、截短和/或突变。重组LRRC33蛋白可以被修饰而具有可溶性。例如，在一些实施方式中，LRRC33的胞外域可以与C末端His标签一起表达，以表达可溶性LRRC33蛋白(sLRRC33；参见，例如，SEQ ID NO:84)。在一些实施方式中，LRRC33蛋白包含前导序列(例如，天然或非天然前导序列)。在一些实施方式中，LRRC33蛋白不包含前导序列(即，前导序列已被加工或切割)。在其他实施方式中，重组LRRC33蛋白可以被修饰以包含一个或多个可检测标记。在进一步的实施方式中，此类可检测标记可以包括但不限于生物素标记、聚组氨酸标签、flag标签、myc标签、HA标签和/或荧光标签。在一些实施方式中，LRRC33蛋白是哺乳动物LRRC33蛋白。在一些实施方式中，LRRC33蛋白是人、猴、小鼠或大鼠LRRC33蛋白。在一些实施方式中，LRRC33蛋白包含如表18中的SEQ ID NO:83、84和101所示的氨基酸序列。
表17：示例性LTBP氨基酸序列
Figure BDA0002970630990000731
Figure BDA0002970630990000741
表18：示例性GARP和LRRC33氨基酸序列
Figure BDA0002970630990000742
Figure BDA0002970630990000751
药物组合物和制剂
本发明进一步提供了药物组合物，其用作适于在人和非人受试者中施用的药物。可以将本发明涵盖的一种或多种高亲和性、不依赖于背景的抗体与药学上可接受的载体(赋形剂)，包括例如缓冲剂，一起配制或混合，以形成药物组合物。可以将此类制剂用于治疗涉及TGFβ信号传导的疾病或病症。在特别优选的实施方式中，此类制剂可以用于免疫-肿瘤学应用。
可以将本发明的药物组合物施用至患者以减轻TGFβ相关适应症(例如，纤维化、免疫病症和/或癌症)。“可接受的”意指载体与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)(包括缓冲剂)的实例对于本领域技术人员而言是显而易见的并且已在前面描述过。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams andWilkins,Ed.K.E.Hoover。在一个实例中，本文所述的药物组合物含有一种以上特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体，其中抗体识别复合物的不同表位/残基。
本方法中使用的药物组合物可以包含药学上可接受的载体、赋形剂或冻干制剂或水溶液形式的稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯、如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温TM、普郎尼克TM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述了药学上可接受的赋形剂。
本发明还包括药物组合物，其包含根据本发明的抗体或其片段，以及药学上可接受的赋形剂。
因此，可以将抗体或包含此类抗体的抗原结合片段的分子配制成适于人类施用的药物组合物。
药物制剂可以包含一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，一种或多种赋形剂可以从以下提供的列表中选择：https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm？event＝browseByLetter.page&Letter＝A
通常将药物组合物配制成活性生物制品(例如，单克隆抗体，包含抗原结合片段的工程化的结合分子等)的终浓度为约2mg/mL至约200mg/mL之间。例如，制剂的终浓度(wt/vol)可以在约2-200、2-180、2-160、2-150、2-120、2-100、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、5-200、5-180、5-160、5-150、5-120、5-100、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、10-200、10-180、10-160、10-150、10-120、10-100、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、20-200、20-180、20-160、20-150、20-120、20-100、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、30-200、30-180、30-160、30-150、30-120、30-100、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-200、40-180、40-160、40-150、40-120、40-100、40-80、40-70、40-60、40-50、50-200、50-180、50-160、50-150、50-120、50-100、50-80、50-70、50-60、60-200、60-180、60-160、60-150、60-120、60-100、60-80、60-70、70-200、70-180、70-160、70-150、70-120、70-100、70-80mg/mL之间的范围内。在一些实施方式中，制剂中生物制品的终浓度为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/mL。
本发明的药物组合物优选地与适宜缓冲剂配制。适宜的缓冲剂包括但不限于：磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和组氨酸缓冲剂。
制剂的最终pH通常在pH 5.0至8.0之间。例如，药物组合物的pH可以是约5.0、5.2、5.5、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.5、7.6或7.8。
本公开的药物组合物可以包含表面活性剂，如批准用于药物制剂的非离子去垢剂。此类表面活性剂包括，例如，聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20(吐温-20)、聚山梨醇酯80(吐温-80)和NP-40。
本公开的药物组合物可以包含稳定剂。对于液体-蛋白制品，可以通过选择pH缓冲盐来增强稳定性，并且通常还可以使用氨基酸。通常是在液体/空气界面或液体/固体界面(与包装物)处发生相互作用，导致蛋白吸附和解折叠后发生聚集。适宜的稳定剂包括但不限于：蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇以及某些氨基酸，如组氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和精氨酸。
本公开的药物组合物可以含有以下赋形剂的一种或任何组合：磷酸钠、精氨酸、蔗糖、氯化钠、氨丁三醇、甘露醇、苄醇、组氨酸、蔗糖、聚山梨醇酯80、柠檬酸钠、甘氨酸、聚山梨醇酯20、海藻糖、泊洛沙姆188、蛋氨酸、海藻糖、rh透明质酸酶、琥珀酸钠、磷酸钾、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、氯化钾、麦芽糖、组氨酸乙酸盐、山梨糖醇、喷替酸、人血清白蛋白、喷替酸。
在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以含有防腐剂。
本公开的药物组合物通常以液体或冻干形式存在。通常，可以将产品装在小瓶(例如，玻璃小瓶)中。在注射器、笔或自动注射器中可用的产品可以以在这些容器/密封系统中的预充式液体的形式存在。
在一些实例中，本文描述的药物组合物包含可以通过任何合适的方法制备的含有特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体的脂质体，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。
在一些实施方式中，选择具有靶向性质的脂质体以优先将药物组合物递送或定位于某些组织或细胞类型。例如，可以使用某些具有骨髓靶向特性的基于纳米颗粒的载体，例如基于脂质的纳米颗粒或脂质体。参见，例如，Sou(2012)“Advanced drug carrierstargeting bone marrow”,ResearchGate publication 232725109。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物可包含佐剂或可与佐剂一起使用。预期某些佐剂可以增强受试者对例如肿瘤抗原的免疫应答，并促进效应T细胞(Teffector)的功能、单核细胞的DC分化、抗原摄取和APC的呈递增强等。合适的佐剂包括但不限于基于视黄酸的佐剂及其衍生物、基于水包油乳剂的佐剂，例如MF59和其他含角鲨烯的佐剂、Toll样受体(TRL)配体(例如，CpG)、α-生育酚(维生素E)及其衍生物。
本文所述的抗体也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲-甲基丙烯酸酯)微胶囊。此前已描述了示例性技术，参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20thEd.Mack Publishing(2000)。
在其他实例中，本文描述的药物组合物可以配制成持续释放的形式。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号No.3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可以通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物置于具有无菌通道的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以是单位剂型，例如用于经口、肠胃外或直肠施用，或经吸入或吹入施用的片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液，或栓剂。
合适的表面活性剂包括，特别是，非离子试剂，例如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如，SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05至5％的表面活性剂，并且可以为0.1至2.5％。应当理解，如果需要，可以加入其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。
合适的乳液可使用市售的脂肪乳剂，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM来制备。活性成分可以溶解在预混合的乳液组合物中，或者可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)并且在与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成乳液。应当理解，可以加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有高达20％的油，例如5至20％之间。
乳液组合物可以是通过将本发明抗体与IntralipidTM或其组分(豆油、鸡蛋磷脂、甘油和水)混合来制备的那些。
用于检测、监测或缓解TGFβ相关适应症的试剂盒
本公开还提供了用于缓解与TGFβ相关的适应症相关的疾病/病症的试剂盒。此类试剂盒可以包含一个或多个容器，所述容器含有抗体或其抗原结合部分，其特异性结合至GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物，例如任何本文所述的那些。
在一些实施方式中，试剂盒可以包含根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可包括施用特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分以治疗、延迟发作、或减轻本文所述的靶疾病的描述。试剂盒还可以包括基于鉴定该个体是否患有靶疾病来选择适合于治疗的个体的描述。在其他实施方式中，说明书包括向处于靶疾病风险的个体施用抗体或其抗原结合部分的描述。
关于特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分的使用的说明书一般包括关于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可以接受的。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解与TGFβ-相关适应症相关的疾病或病症。可以提供用于实践本文所述的任何方法的说明书。
本发明的试剂盒是在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑了与特定装置组合使用的包装，例如吸入器、鼻腔施用装置(例如雾化器)或输液装置，例如微型泵。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物(如本文所述的那些)的抗体或其抗原结合部分。
试剂盒可以任选地提供附加的组分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施方式中，本公开提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
筛选、鉴定和生产TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制剂的方法
本发明涵盖能够以等同亲和性结合下述每一者的抗体或其片段，以及包含其的药物组合物和相关试剂盒的筛选/选择方法、生产方法和生产工艺：GARP-proTGFβ1复合物、LTBP1-proTGFβ1复合物、LTBP3-proTGFβ1复合物和LRRC33-proTGFβ1复合物。出于筛选目的，优选包括LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1复合物的至少一者以及GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1复合物的至少一者，以最大程度地鉴定对ECM相关复合物和细胞相关复合物两者具有广泛结合特异性的所需抗体。优选地对在筛选方法中鉴定的抗体或其片段进行进一步检测，以确证其以高亲和性结合每种目标LLC的能力。
许多方法可以用于获得本公开的抗体或其抗原结合片段。例如，可以使用重组DNA方法产生抗体。单克隆抗体也可以按照已知方法通过生成杂交瘤产生(参见例如，Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)。然后使用标准方法筛选以这种方式形成的杂交瘤，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(例如，
Figure BDA0002970630990000781
或BIACORE)分析，以鉴定产生特异性结合至指定抗原的抗体的一种或多种杂交瘤。任何形式的指定抗原可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段，以及其抗原性肽(例如，如本文所述作为线性表位或在支架中作为构象表位的任何表位)。制备抗体的一种示例性方法包括筛选表达抗体或其片段(例如，scFv)的蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；Clackson等，(1991)Nature,352:624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597；WO92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO92/09690；和WO 90/02809。
除了使用展示文库，指定的抗原(例如，呈递分子-TGFβ1复合物)可用于免疫非人宿主，例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠、仓鼠、绵羊、山羊、鸡、骆驼科动物，以及非哺乳动物宿主，例如鲨鱼。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
可以使用具有或不具有与其结合的呈递分子(或其片段)的纯化的重组蛋白复合物作为抗原(如proTGFβ1)。这些包括但不限于：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。结合的呈递分子不必是全长对应物，但优选地包含与proTGFβ1二聚体复合物形成共价键的两个半胱氨酸残基。
或者，可以使用基于细胞的抗原进行对非人宿主的免疫。术语基于细胞的抗原指表达proTGFβ1蛋白复合物的细胞(例如，异源细胞)。这可以通过过表达proTGFβ1(任选地与优选的呈递分子共表达)实现。在一些实施方式中，可以将一种或多种内源性对应物作为基于细胞的抗原。可以通过众所周知的方法(如FACS)确证形成含有proTGFβ1的蛋白复合物的蛋白的细胞表面表达。在使用此类细胞(基于细胞的抗原)免疫宿主后，在宿主中激发了对抗原的免疫应答，以使得能够产生抗体并进行随后的筛选。在一些实施方式中，使用适宜的敲除动物以促进增强对抗原的免疫应答。或者，在不同物种中的结构差异可能足以触发在宿主中产生抗体。
在另一个实施方式中，利用合适的重组DNA技术从非人动物获得单克隆抗体，然后修饰，例如，嵌合抗体。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。参见，例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851,1985；Takeda等，Nature 314:452,1985，Cabilly等，美国专利号4,816,567；Boss等，美国专利号4,816,397；Tanaguchi等，欧洲专利公开号EP171496；欧洲专利公开号0173494，英国专利号GB 2177096B。
关于其他抗体生产技术，参见Antibodies:A Laboratory Manual,eds。Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory,1988。本公开不必限于抗体的任何特定来源、生产方法或其他特征。
本公开的某些方面涉及到以多核苷酸或载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的多核苷酸或载体或者可以整合到宿主细胞的基因组中，或者可以维持在染色体外。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞。在一些实施方式中，真菌细胞是例如酿酒酵母属的那些，特别是酿酒酵母菌种的真菌细胞。术语“原核”包括可以用DNA或RNA分子转化或转染用于表达抗体或相应的免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌。术语“真核”包括酵母、高等植物、昆虫和脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如NSO和CHO细胞。取决于重组生产方法中使用的宿主，由多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的或可以是非糖基化的。抗体或相应的免疫球蛋白链还可包含初始甲硫氨酸氨基酸残基。
在一些实施方式中，一旦载体被引入合适的宿主中，宿主可以在适合该核苷酸序列高水平表达的条件下维持，并且，理想状态下，可进行免疫球蛋白轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体、抗原结合片段或其他免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见，参见，Beychok,Cells of Immunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。因此，将多核苷酸或载体引入细胞中，其进而产生抗体或抗原结合片段。此外，包含上述宿主细胞的转基因动物(优选地为哺乳动物)可用于大规模生产所述抗体或抗体片段。
转化的宿主细胞可以在发酵罐中生长并且使用任何合适的技术培养，以实现最佳细胞生长。一旦表达，可以根据本领域的标准程序纯化完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链、其他免疫球蛋白形式或抗原结合片段，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳和类似技术；参见，Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。然后可以从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分中分离所述抗体或抗原结合片段。例如，微生物表达的抗体或抗原结合片段的分离和纯化可以通过任何常规手段进行，例如制备色谱分离和免疫分离，例如涉及使用定向针对例如抗抗体恒定区的单克隆或多克隆抗体的那些。
本公开的各方面涉及提供无限持续的单克隆抗体来源的杂交瘤。作为直接从杂交瘤培养物中获得免疫球蛋白的替代方案，永生化杂交瘤细胞可用作重排的重链和轻链基因座的来源用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。在一些实施方式中，重链恒定区可以与不同亚型的重链恒定区交换或完全消除。可以连接可变区以编码单链Fv区。可以连接多个Fv区以赋予对一个以上靶标的结合能力，或者可以使用嵌合重链和轻链组合。任何合适的方法可用于克隆抗体可变区和产生重组抗体。
在一些实施方式中，获得编码重链和/或轻链的可变区的合适的核酸，并插入到其可以被转染进入标准的重组宿主细胞中的表达载体。各种这样的宿主细胞可以使用。在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞可有利于有效加工和生产。可用于此目的的典型哺乳动物细胞系包括CHO细胞、293细胞或NSO细胞。抗体或抗原结合片段的产生可以通过在适于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行。可以通过从培养物中分离抗体或抗原结合片段来回收它们。表达系统可以设计成包括信号肽，以便所得抗体分泌到培养基中；然而，也可能是在细胞内产生。
本发明还包括编码本文所述的抗体的免疫球蛋白链的至少一个可变区的多核苷酸。在一些实施方式中，由所述多核苷酸编码的所述可变区包含由任何一种上述杂交瘤产生的抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸可以是，例如，DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或包含任何单独或组合的那些多核苷酸的重组产生的嵌合核酸分子。在一些实施方式中，多核苷酸是载体的一部分。这样的载体可以包含其他基因，例如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择载体。
在一些实施方式中，多核苷酸被可操作地连接至允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选地为哺乳动物细胞中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们可包括促进转录起始的调节序列和任选的促进转录终止和转录物稳定的poly-A信号。另外的调节元件可包括转录以及翻译的增强子，和/或天然相关或异源的启动子区。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括例如大肠杆菌中的PL、Lac、Trp或Tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或哺乳动物和其他动物细胞中的球蛋白内含子。
除了负责转录的起始，这种调节元件也可包括转录终止信号，例如多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于所用的表达系统，能够将多肽导向细胞区室或将其分泌到培养基中的前导序列可以添加到多核苷酸的编码序列中，之前已有过描述。前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，优选地，前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌到例如细胞外培养基中。任选地，可以使用编码融合蛋白的异源多核苷酸序列，所述融合蛋白包括赋予目标特征的C-或N-末端识别肽，例如表达的重组产物的稳定化或简化纯化。
在一些实施方式中，编码至少轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码免疫球蛋白链两者或仅一者的可变结构域。同样地，多核苷酸可以在相同启动子的控制下，或者可以单独控制以进行表达。此外，一些方面涉及载体，特别是遗传工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸；任选地，与编码抗体的另一免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸组合。
在一些实施方式中，表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中作为真核启动子系统提供的，但也可使用原核宿主的控制序列。来自病毒例如逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送到靶细胞群中(例如，以工程化细胞以表达抗体或抗原结合片段)。多种合适的方法可用于构建重组病毒载体。在一些实施方式中，多核苷酸和载体可以重构在脂质体中以递送至靶细胞。含有多核苷酸(例如，编码序列和表达控制序列的免疫球蛋白链的重链和/或轻链可变结构域)的载体可以通过合适的方法转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。
筛选方法可以包括评估或确认抗体或其片段的理想活性的步骤。在一些实施方式中，步骤包括选择抑制靶标功能的能力，例如抑制成熟/可溶性生长因子(例如，TGFβ1)从潜在复合物中的释放。在优选的实施方式中，此类步骤包括基于细胞的效力测定，其中当proTGFβ复合物在细胞表面上表达时，通过测量激活后在培养基(例如，测定溶液)中释放的生长因子水平测定一种或多种待测抗体的抑制活性。可以通过例如测量TGFβ的活性测定释放进入培养基/溶液中的生长因子的水平。在本文的实施例2中描述了有用的基于细胞的效力测定的非限制性实例。
在一些实施方式中，筛选所需抗体或片段的步骤包括选择促进抗体-抗原复合物内化及后续从细胞表面除去的抗体或其片段。在一些实施方式中，所述步骤包括选择诱导ADCC的抗体或其片段。在一些实施方式中，所述步骤包括选择在体内累积至一个或多个所需部位(例如，细胞类型、组织或器官)的抗体或其片段。在一些实施方式中，所述步骤包括选择具有穿过血脑屏障的能力的抗体或其片段。该方法可以任选地包括以下步骤：优化一个或多个抗体或其片段，以提供具有所需性质的变体对应物，如通过诸如稳定性、结合亲和性、功能性(例如，抑制活性、Fc功能等)、免疫原性、pH敏感性和可发展性(例如，高溶解度、低自结合等)的标准所确定的。
用于制备包含根据本发明的抗体或片段的组合物的方法可以包括优化已鉴定具有所需结合和功能(例如，抑制)性质的一种或多种抗体。优化可以包括抗体或其片段的亲和性成熟。可以进行进一步的优化步骤以提供对治疗组合物具有优势的理化性质。此类步骤可以包括但不限于诱变或工程化以提供改善的溶解度、缺乏自结合、稳定性、pH敏感性、Fc功能等。得到的优化抗体优选地是适合向人类施用的完全人抗体或人源化抗体。
包含这样的抗体或其片段的药物组合物的制备方法可包括纯化、配制、无菌过滤、包装等步骤。例如，根据由相关监管机构，如FDA制定的指南进行某些步骤，例如无菌过滤。这样的组合物可以以一次性容器的形式获得，例如预填充注射器，或多剂量容器，例如小瓶。
修饰
本公开的抗体或其抗原结合部分可用可检测的标记或可检测部分进行修饰，包括但不限于：酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属、非放射性顺磁金属离子和用于检测和分离GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的亲和标记。可检测物质或部分可以直接偶联或缀合至本公开的多肽或使用合适的技术通过中间体(例如，接头(例如，可切割的接头))间接偶联或缀合。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的非限制性实例包括链球菌亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的非限制性实例包括生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的非限制性实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；和合适的放射性物质的实例包括放射性金属离子，例如α-发射体或其他放射性同位素，例如，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、Lu(177Lu)、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、86R、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、锆(89Zr)和锡(113Sn、117Sn)。在一些实施方式中，放射性标记可以选自以下：11C、13N、15O、68Ga、177Lu、18F和89Zr。在一些实施方式中，使用的标记是正电子发射同位素，可以通过正电子发射断层扫描对其进行检测。可检测物质可以直接，或使用适宜技术通过中间体(诸如，例如，接头)间接偶联或缀合至本公开的抗体，所述抗体特异性结合至GARP-proTGFβ1复合物、LTBP1-proTGFβ1复合物、LTBP3-proTGFβ1复合物和/或LRRC33-proTGFβ1复合物。可以将缀合至可检测物质的本文提供的任何抗体用于任何适宜的诊断测定，如本文所述的那些。
此外，本公开的抗体或其抗原结合部分也可用药物修饰。所述药物可以使用合适的技术直接偶联或缀合至本公开的多肽，或通过中间体(例如，接头(例如，可切割的接头))间接偶联或缀合。
靶向剂
在一些实施方式中，出于调节成熟TGFβ从GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物中释放的目的，本公开的方法包括使用一种或多种靶向剂以将本公开的抗体或其抗原结合部分靶向至受试者中的特定位点。例如，LTBP1-TGFβ1和LTBP3-TGFβ1复合物通常定位于细胞外基质。因此，在一些实施方式中，出于将抗体定位于LTBP相关TGFβ1复合物驻留在所在的位点的目的，本公开的抗体可与细胞外基质靶向剂缀合。在这样的实施方式中，抗体的选择性靶向导致LTBP1-TGFβ1和LTBP3-TGFβ1复合物的选择性调节。在一些实施方式中，细胞外基质靶向剂包括肝素结合剂、基质金属蛋白酶结合剂、赖氨酰氧化酶结合结构域、原纤维蛋白结合剂、透明质酸结合剂等。
类似地，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1复合物通常定位于细胞表面。前者在激活的FOXP3+调节性T细胞(Treg)上表达，而后者在某些髓样细胞和一些癌细胞(如AML)上表达。因此，在一些实施方式中，可以将本文公开的抗体缀合至免疫细胞(例如，Treg细胞、激活的巨噬细胞等)结合剂，以将抗体定位于这些细胞相关的proTGFβ1复合物所驻留的位点。在此类实施方式中，抗体的选择性靶向导致细胞相关proTGFβ1复合物的选择性抑制(例如，出于免疫调节的目的，例如，在癌症治疗中，选择性抑制成熟TGFβ1的释放)。在此类实施方式中，免疫细胞靶向剂可以包括，例如，CCL22和CXCL12蛋白或其片段。
在一些实施方式中，可以使用双特异性抗体，其具有选择性结合proTGFβ1复合物的第一部分和选择性结合靶位点组分的第二部分，例如，ECM的组分(例如，原纤蛋白)或Treg细胞的组分(例如，CTLA-4)。
如本文中进一步详述的，本发明预期亚型选择性TGFβ1抑制剂(如本文所述的那些)可以用于促进或恢复骨髓中的造血作用。因此，在一些实施方式中，可以将包含此类抑制剂(例如，TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂)的组合物靶向至骨髓。实现骨髓靶向的一种模式是使用某些靶向骨髓定位或累积的载体。例如，可以使用某些具有骨髓靶向性质的基于纳米颗粒的载体，例如，基于脂质的纳米颗粒或脂质体。参见，例如，Sou(2012)“Advanced drug carriers targeting bone marrow”,ResearchGate publication232725109。
在一些实施方式中，靶向剂包括免疫增强剂，例如包含角鲨烯和/或α-生育酚的佐剂以及包含TLR配体/激动剂(如TLR3配体/激动剂)的佐剂。例如，包含角鲨烯的佐剂可以优先靶向某些免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞，以增强初免、抗原加工和/或免疫细胞分化，从而增强宿主的免疫力。在一些实施方式中，此类佐剂可以刺激宿主对新表位的免疫应答，以激活T细胞。
治疗靶点和体内作用机制
因此，本文公开的高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂可以用于在任何适宜的生物系统中抑制TGFβ1，如体外、离体和/或体内系统。相关方法可以包括将生物系统与TGFβ1抑制剂接触。生物系统可以是测定系统、生物样品、细胞培养物等等。在一些情况下，这些方法包括改善生物系统中游离生长因子的水平。
因此，此类药物组合物和制剂可以用于在体内靶向通过抑制剂可接近的包含TGFβ的潜在复合物。因此，本发明抗体的目的是在疾病部位(例如，TME)处靶向以下复合物，在该疾病部位处所述抗体抢先结合潜在复合物，从而阻止生长因子的释放：i)由GARP呈递的proTGFβ1；ii)由LRRC33呈递的proTGFβ1；iii)由LTBP1呈递的proTGFβ1；和iv)由LTBP3呈递的proTGFβ1。通常，上述复合物(i)和(ii)存在于细胞表面上，因为GARP和LRRC33两者都是能够在表达LRRC33的细胞外表面上锚定或栓系潜在proTGFβ1的跨膜蛋白，而复合物(iii)和(iv)是细胞外基质的组分。以这种方式，本文所示的抑制剂消除了必须与内源性高亲和性受体完全结合以发挥抑制作用的作用。而且，靶向配体/受体相互作用的上游可以实现更持久的作用，因为靶点可接近性窗更长，且与仅在其从潜在复合物中释放之后靶向暂时性可溶性生长因子的常规抑制剂相比，更多地定位至相关组织。因此，与常规中和抗体相比，靶向栓系至某些生态位的潜在复合物可以促进体内改善的靶点接合，常规中和抗体必须在生长因子从潜在复合物中释放后，以可溶性(游离)生长因子形式在其较短的半衰期(例如，约两分钟)期间，与竞争与内源性受体的结合。
很多研究揭示了TGFβ1激活的机制。三种整联蛋白αVβ6、αVβ8和αVβ1已被证明是潜在TGFβ1的关键激活因子(Reed,N.I.等，Sci Transl Med,2015.7(288):p.288ra79；Travis,M.A.和D.Sheppard,Annu Rev Immunol,2014.32:p.51-82；Munger,J.S.等，Cell,1999.96(3):p.319-28)。αV整联蛋白以高亲和力结合TGFβ1和TGFβ1LAP中存在的RGD序列(Dong,X.等，Nat Struct Mol Biol,2014.21(12):p.1091-6)。具有阻止整联蛋白结合但不阻止分泌的TGFβ1RGD位点的突变的转基因小鼠模拟TGFβ1-/-小鼠的表型(Yang,Z.等，JCell Biol,2007.176(6):p.787-93)。缺乏β6和β8整联蛋白的小鼠重现了TGFβ1和TGFβ3敲除小鼠的所有基本表型，包括多器官炎症和腭裂，证实了这两种整联蛋白对于发育和内稳态中TGFβ1激活的基本作用(Aluwihare,P.等，J Cell Sci,2009.122(Pt 2):p.227-32)。整联蛋白依赖性激活潜在TGFβ1的关键是共价连接至呈递分子；通过诱变破坏GARP和TGFβ1LAP之间的二硫键不会损害复合物的形成，但完全消除αVβ6对TGFβ1的激活(Wang,R.等，Mol Biol Cell,2012.23(6):p.1129-39)。潜在TGFβ1的最近结构阐明了整联蛋白如何能够从潜在复合物中释放活性TGFβ1：潜在TGFβ1与其呈递分子的共价连接将潜在TGFβ1通过LTBP锚定至ECM，或通过GARP或LRRC33锚定至细胞骨架。整联蛋白与RGD序列的结合导致LAP结构的外力依赖性变化，允许具有活性的TGFβ1释放并结合附近的受体(Shi,M.等，Nature,2011.474(7351):p.343-9)。疾病中整联蛋白依赖性TGFβ1的激活的重要性也得到了很好的验证。αVβ1的小分子抑制剂可防止博来霉素诱导的肺纤维化和四氯化碳诱导的肝纤维化(Reed,N.I.等，Sci Transl Med,2015.7(288):p.288ra79)，并且用抗体阻断αVβ6或整联蛋白β6表达丧失抑制博来霉素诱导的肺纤维化和放射诱导的纤维化(Munger,J.S.等，Cell,1999.96(3):p.319-28；Horan,G.S.等，Am J Respir Crit Care Med,2008.177(1):p.56-65)。
除整联蛋白外，TGFβ1激活的其他机制也有涉及，包括血小板反应蛋白-1和通过蛋白酶，如纤维蛋白溶酶、基质金属蛋白酶(MMP，例如MMP2、MMP9和MMP12)、组织蛋白酶D、激肽释放酶和ADAM家族锌指蛋白酶(例如，ADAM10、ADAM12和ADAM17)的激活。血小板反应蛋白-1的敲除再现了某些组织中TGFβ1-/-表型的某些方面，但在博来霉素诱导的肺纤维化(已知其为TGFβ依赖性)中不具有保护作用(Ezzie,M.E.等，Am J Respir Cell Mol Biol,2011.44(4):p.556-61)。此外，候选蛋白酶的敲除并未导致产生TGFβ1表型(Worthington,J.J.,J.E.Klementowicz和M.A.Travis,Trends Biochem Sci,2011.36(1):p.47-54)。这可以通过重复(redundance)或这些机制在特定疾病中而不是发育和内稳态中具有关键性来解释。
因此，本文所述的高亲和性、亚型特异性TGFβ1抑制剂包括通过防止TGFβ1激活的步骤起作用的抑制剂。在一些实施方式中，此类抑制剂可以抑制整联蛋白依赖性(例如，机械或外力驱动)TGFβ1的激活。在一些实施方式中，此类抑制剂可以抑制蛋白酶依赖性或蛋白酶诱导的TGFβ1的激活。后者包括以整联蛋白非依赖性方式抑制TGFβ1激活步骤的抑制剂。在一些实施方式中，这样的抑制剂可抑制TGFβ1激活，而与激活模式无关，例如，抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和蛋白酶依赖性激活两者。可激活TGFβ1的蛋白酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶，例如激肽释放酶、化学胰蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶，以及锌金属蛋白酶(MMP家族)，如MMP-2、MMP-9和MMP-13。激肽释放酶包括血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶，如KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14和KLK15。本文提供的数据显示了能够在体外抑制激肽释放酶依赖性TGFβ1激活的亚型特异性TGFβ1抑制剂的实例。在一些实施方式中，本发明的抑制剂防止具有活性(成熟)的TGFβ1生长因子从潜在复合物中的释放或解离。在一些实施方式中，这样的抑制剂可通过稳定复合物的不具有活性(例如，潜在)的构象起作用。数据进一步证明，高亲和性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂(Ab6)也可以抑制纤维蛋白溶酶依赖性TGFβ1激活。然而，令人吃惊的是，背景偏倚的TGFβ1抑制剂(Ab3)不能抑制此过程。Ab3和Ab6两者对基质相关的proTGFβ1复合物具有相似的亲和性。然而，Ab3对细胞相关的proTGFβ1复合物具有明显更弱的结合亲和性。两种类别之间的相对差异超过20倍(“偏倚”)。相比之下，Ab6显示出对两个类别的抗原复合物等同的高亲和性。一种可能的解释是所观察到的功能差异可能源于Ab3的偏倚特性。另一种可能的解释是该差异由表位或结合区的差异所介导。
本发明对于某些与TGFβ1信号传导的多种生物学作用有关的疾病的治疗用途特别有用，这些作用不限于TGFβ1功能的单一背景。在这种情况下，在多种背景下抑制TGFβ1的作用可能是有益的。因此，本公开提供了以亚型特异性方式而非背景特异性方式靶向和抑制TGFβ1的方法。可以将此类药剂称为“亚型特异性、不依赖于背景的”TGFβ1调节剂。
大量证据支持以下观点：很多疾病都表现出TGFβ信号传导的复杂扰动，这可能涉及异质细胞类型的参与，这些异质细胞类型赋予TGFβ功能不同的作用，而这种作用是由其与所谓的呈递分子的相互作用介导的。已经鉴定出至少四种此类呈递分子，其可以在各种胞外生态位中“呈递”TGFβ，以使其能够响应于局部刺激而被激活。在一个类别中，TGFβ与介导ECM相关的TGFβ活性的ECM相关的呈递分子(如LTBP1和LTBP3)一起沉积在ECM中。在另一个类别中，TGFβ通过介导某些免疫功能的诸如GARP和LRRC33的呈递分子被栓系到免疫细胞表面上。这些呈递分子在不同的组织和细胞类型中显示出差异表达、定位和/或功能，表明触发事件和TGFβ激活的结局将是不同的，其取决于微环境。根据很多TGFβ效应可能相互作用并促进疾病进展的观点，可以拮抗TGFβ功能的多个方面的治疗剂可能会提供更高的功效。
与背景偏倚的TGFβ1抑制剂相比，不依赖于背景的TGFβ1抑制剂作为治疗某些疾病的治疗剂(如本文中进一步详细描述的)的有利用途的基本原理包括以下内容：
本文公开的工作证实了异质TGFβ1复合物参与疾病环境并扩展了对下突出机制的理解，从而为多种疾病的改良治疗方法提供了见解。
已经认识到，各种疾病涉及作为TGFβ1来源的异质细胞群体，这些细胞共同促成所述疾病的发病机制和/或进展。在相同的疾病微环境中，可能存在不止一种类型的含TGFβ1的复合物(“背景”)。特别地，此类疾病可能涉及TGFβ1信号传导的ECM(或“基质”)组分和TGFβ1信号传导的免疫组分两者。在这样的情况下，仅选择性地靶向单一TGFβ1背景(例如，与一种特定类型的呈递分子相关的TGFβ1)可以提供有限的缓解。因此，广泛的抑制性TGFβ1拮抗剂有望用于治疗用途。此前描述的广泛靶向TGFβ1多个潜在复合物的抑制性抗体在靶复合物之间显示出偏斜的结合性质。因此，发明人着手鉴定更均一的抑制性抗体，其选择性地抑制TGFβ1激活，而不管与之连接的特定呈递分子如何。可以认为，特别是对于免疫肿瘤学应用，有效地抑制基质相关的TGFβ1和免疫细胞相关的TGFβ1都是有利的。
其次，在肿瘤基质和纤维化组织之间观察到组织/细胞特征的显著相似性，突出了强调各种适应症的共同机制。表明在以下之间和其中具有串扰(crosstalk)：i)TGFβ1依赖性促成纤维表型；ii)TGFβ1依赖性促肿瘤表型；和，iii)TGFβ依赖性免疫抑制表型，其在很多病理学条件下观察到。因此，使用以等同效力广泛作用于很多这样的成分的不依赖于背景的抑制剂可提供在多种类型疾病条件中的最佳治疗效果。例如，原发性骨髓纤维化的临床表现包括某些细胞群的异常增殖和骨髓中的纤维化。
第三，已有证据表明，TGFβ1可能至少部分地负责在很多癌症类型(癌症患者)中观察到的抗癌疗法(如免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、工程化的免疫细胞疗法、化学疗法、放射疗法等)的耐药性。在一些情况下，这种抗性对于患者的背景而言似乎是特定癌症/肿瘤类型所固有的(通常称为先天性抗性、原发性抗性、内在抗性或固有抗性；这些术语在本文中可以互换使用)。此类抗性可能代表对癌症疗法(如免疫检查点抑制剂)具有较差响应的患者子集，并且可能反映了免疫排除的环境。这可能至少部分地由TGFβ1依赖性通路介导。因此，本文所述的亚型选择性抑制剂可以使抗性癌症对此类疗法具有更高的响应。特别地，在其中对疗法的抗体与在疾病部位(如肿瘤)的免疫排除相关的情况下，TGFβ1抑制可能会解除免疫抑制并允许效应细胞接近其靶点(例如，癌细胞)。相同作用机制适用于很多治疗范例，其中治疗效果必须与待治疗的疾病或受保组织接触。认为本发明的高亲和性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂通过TGFβ1功能的多个臂(类，抑制Treg、调节巨噬细胞和调节ECM)起作用来促进这一过程，从而克服抗药性。
或者，可能会随着时间的推移而出现抗性，使得对治疗表现出重大临床响应的患者随着时间的推移会变得响应较差(即适应性抗性或获得性抗性)。例如，据报道，PD-1疗法能够导致适应性抗性，其与其他T细胞抗原(例如，TCR组分)的上调有关，表明癌细胞通过另一种机制进化为逃避PD-1的阻断。随后，靶向不同T细胞受体组分(如TIM3)的第二种检查点抑制剂能够恢复对免疫疗法的响应。这些观察结果表明，阻断多种通路来对抗癌细胞的适应性应答可能会降低癌细胞逃避宿主免疫力的可能性。能够靶向多种TGFβ1背景的TGFβ1抑制剂可以通过在TGFβ1功能的多个点上提供阻断来有利地规避获得的耐药性。
并且最后，基于各种呈递分子的表达可以随着时间的推移而改变的观点，例如，响应于局部线索(例如，细胞因子、趋化因子、ECM环境等)和/或伴随着疾病微环境的变化而改变，可以认为，即使在呈递分子的表达发生异常变化时，TGFβ1的亚型选择性抑制剂(如本文所述的那些)也可以用于承受这种可塑性并提供广泛、持久的抑制作用。
在任何这些情景中，TGFβ1的不依赖于背景的抑制剂有利地旨在与多种呈递分子相关联地靶向TGFβ1的前/潜在形式，所述呈递分子在疾病微环境中全部或以不同组合存在。更具体地，在异种模式中，抑制剂靶向ECM相关的TGFβ1(LTBP1/3-TGFβ1复合物)。在另一种模式中，抑制剂靶向免疫细胞相关的TGFβ1。这包括GARP呈递的TGFβ1，如在Treg细胞上表达的GARP-TGFβ1复合物，和在巨噬细胞和其他髓样/淋巴样细胞，和某些癌细胞上表达的LRRC33-TGFβ1复合物。
此类抗体包括TGFβ1的亚型特异性抑制剂，其以不依赖于背景的方式结合并防止成熟TGFβ1生长因子从前/潜在TGFβ1复合物中激活(或释放)，从而所述抗体能够抑制与多种类型的呈递分子相关的TGFβ1的激活(或释放)。特别地，本发明提供了能够阻断ECM相关的TGFβ1(LTBP呈递的和LTBP3呈递的复合物)和细胞相关的TGFβ1(GARP呈递的和LRRC33呈递的复合物)的抗体。
已表明多种疾病状况涉及作为促成因素的TGFβ信号传导失调。实际上，某些人类疾病的发病机制和/或进展似乎主要由TGFβ1活性驱动或与其相关。特别地，很多此类疾病和病症涉及TGFβ1功能的ECM组分和免疫组分两者，这表明涉及多个背景下(例如，由一个以上类型的呈递分子所介导)的TGFβ1激活。而且，预期在TGFβ1应答细胞之间存在串扰。在一些情况下，TGFβ1轴多方面活动之间的相互作用可能触发一系列事件，从而导致疾病进展、加重和/或宿主抵抗疾病的能力抑制。例如，某些疾病微环境，如肿瘤微环境(TME)和纤维化微环境(FME)，可能与多个不同呈递分子呈递的TGFβ1相关，例如，LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1、LRRC33-proTGFβ1及其任何组合。一种情况下的TGFβ1活性可能继而调节或影响另一种情况下的TGFβ1活性，从而增加了当失调时这可能导致疾病状况恶化的可能性。因此，理想的是广泛抑制TGFβ1功能的多种模式(即多种情况)，同时选择性地将这种抑制作用限制在TGFβ1亚型。目的不是干扰由其他亚型(TGFβ3)介导的稳态TGFβ信号传导，TGFβ3在伤口愈合中起重要作用。
TGFβ1活性的免疫组分在很大程度上由细胞相关的TGFβ1(例如，GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)介导。TGFβ1功能的GARP臂和LRRC33臂两者均与免疫抑制特性有关，这些特性导致很多疾病的进展。因此，可以将高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂用于抑制与免疫抑制细胞相关的TGFβ1。免疫抑制细胞包括调节性T细胞(Treg)、M2巨噬细胞和MDSC。因此，TGFβ1抑制剂可在体内的疾病部位(例如，TME和FME)抑制或逆转免疫抑制表型。
在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂抑制与表达GARP-TGFβ1复合物或LRRC33-TGFβ1复合物的细胞相关的TGFβ1，其中任选地，细胞可以是T细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、抗原呈递细胞、中性粒细胞、髓样抑制细胞(MDSC)、淋巴细胞、肥大细胞或小胶质细胞。T细胞可以是调节性T细胞(例如，免疫抑制T细胞)。中性粒细胞可以是激活的中性粒细胞。巨噬细胞可以是激活的(例如，极化的)巨噬细胞，包括促纤维化和/或肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)，例如，M2c亚型和M2d亚型的巨噬细胞。在一些实施方式中，巨噬细胞暴露于肿瘤衍生的因子(例如，细胞因子、生长因子等)，这些因子可以进一步诱导巨噬细胞中的促癌症表型。在一些实施方式中，此类肿瘤衍生的因子是CSF-1/M-CSF。
在一些实施方式中，表达GARP-TGFβ1复合物或LRRC33-TGFβ1复合物的细胞是癌细胞，例如循环癌细胞和肿瘤细胞。
GARP-proTGFβ1作为靶点
调节性T细胞(Treg)代表CD4阳性T淋巴细胞的一个小子集，其在抑制免疫应答中起“中断”以维持内稳态的重要作用。在疾病状况(如癌症)下，报道了Treg水平升高，这与预后较差相关。可以通过CD3/CD28刺激来激活从供体外周血细胞中分离的人Treg。Treg激活显示可诱导GARP-proTGFβ1细胞表面表达的显著增加(图26A)。如此前报道的，Treg发挥免疫抑制活性，其包括有效抑制效应T细胞(Teff)增殖。如本文所示(图26B)，在大多数Teff经历细胞分裂的标准实验条件下，共培养的Treg将其减少到很小一部分。并且通过用TGFβ1的亚型选择性抑制剂处理Teff和Treg的共培养物，可以有效地克服(即，去抑制)该Treg对Teff增殖的抑制，表明本文公开的亚型选择性TGFβ1可有效抑制TGFβ1功能的GARP臂。在疾病环境(如肿瘤微环境和纤维化环境中)，这将转变为这些抑制剂阻断Treg介导的免疫抑制的能力。这继而应导致效应T细胞的增殖增强以增强免疫。TGFβ1的亚型选择性抑制剂的GARP臂可以靶向TGFβ1功能的这一方面。在一些实施方式中，如本文所述的抗体或其抗原结合部分可以降低调节性T细胞(Treg)的抑制性活性。
LRRC33-proTGFβ1作为靶点
LRRC33在选择性细胞类型中表达，特别是髓系谱系的那些，包括单核细胞和巨噬细胞。单核细胞起源于骨髓祖细胞，并在血液中循环并达到周围组织。然后，循环单核细胞能够迁移到组织中，并在其中暴露于局部环境(例如，组织特异性、疾病相关的等)，其包括多种因素，如细胞因子和趋化因子、触发单核细胞分化成巨噬细胞、树突状细胞等。这些包括，例如，在肺中的肺泡巨噬细胞、在骨髓中的破骨细胞、在CNS中的小胶质细胞、在结缔组织中的组织细胞、在肝脏中的枯否细胞以及在棕色脂肪组织中的棕色脂肪组织巨噬细胞。在实体瘤中，浸润的巨噬细胞可能是肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、肿瘤相关的中性粒细胞(TAN)和髓样来源的抑制细胞(MDSC)等。此类巨噬细胞可以激活和/或与激活的成纤维细胞相关，如癌瘤相关的(或癌症相关的)成纤维细胞(CAF)和/或基质。因此，抑制成熟TGFβ1从含有LRRC33的复合物释放的本文所述的TGFβ1激活的抑制剂能够靶向在细胞表面上表达LRRC33-proTGFβ1的任何这些细胞。在纤维化微环境中，表达LRRC33的细胞可以包括M2巨噬细胞、组织驻留巨噬细胞和/或MDSC。
在一些实施方式中，LRRC33-TGFβ1复合物存在于促纤维化(M2样)巨噬细胞的外表面上。在一些实施方式中，促纤维化(M2样)巨噬细胞存在于纤维化微环境中。在一些实施方式中，与仅靶向LTBP1-TGFβ1和/或LTBP1-TGFβ1复合物相比，将LRRC33-TGFβ1复合物靶向促纤维化(M2样)巨噬细胞的外表面可提供更好的效果。在一些实施方式中，M2样巨噬细胞进一步被极化成具有不同表型的多种亚型，如M2c和M2d TAM样巨噬细胞。在一些实施方式中，巨噬细胞可以被在肿瘤微环境中存在的多种因子(例如，生长因子、趋化因子、细胞因子和ECM重塑分子)激活，包括但不限于TGFβ1、CCL2(MCP-1)、CCL22、SDF-1/CXCL12、M-CSF(CSF-1)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、CXCR4、VEGF、PDGF、前列腺素调节剂如花生四烯酸和环氧合酶-2(COX-2)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、RUNX2、HIF1α和金属蛋白酶。暴露于一种或多种这样的因子可以进一步促进单核细胞/巨噬细胞进入促肿瘤表型。仅举一个实例，已证明肿瘤中CCL2和VEGF的共表达与TAM增加和诊断不良相关。继而，激活的肿瘤相关细胞也可以促进其他细胞募集和/或分化为促肿瘤细胞，例如，CAF、TAN、MDSC等。基质细胞也可能对巨噬细胞的激活作出应答，并影响ECM重塑，最终影响血管形成、侵袭和转移。例如，CCL2不仅起单核细胞引诱剂的作用，而且还通过上调在激活的内皮中表达的MAC-1(其是ICAM-1的受体)来促进细胞粘附。这可能导致CCL2依赖性动脉生成和癌症进展。因此，本文所述的TGFβ1抑制剂可用于通过干扰CCL2信号传导轴来抑制动脉生成的方法中。
髓系细胞的一个子集表达细胞表面LRRC33，包括M2极化的巨噬细胞和髓样来源的抑制细胞(MDSC)，这两者均具有免疫抑制表型并在疾病环境(例如TME和FME)中富集。骨髓来源的循环单核细胞似乎不表达细胞表面LRRC33。LRRC33的限制性表达使其成为特别吸引人的治疗靶点。尽管文献中可获得的大部分研究都集中于癌症中的效应T细胞生物学(例如，CD8+细胞毒性细胞)，但越来越多的证据(如本文中提供的数据)指出了抑制性髓系细胞群在疾病中的重要作用。重要的是，本文公开的高选择性TGFβ1抑制性抗体能够在体内靶向TGFβ1功能的该臂。更具体地，本文呈现的数据表明，肿瘤相关的M2巨噬细胞和表达细胞表面LRRC33的MDSC与疾病进展密切相关。本文公开的高亲和性、TGFβ1选择性抗体能够克服在多种药理学模型中对肿瘤的检查点阻断疗法(CBT)的原发性抗性。实际上，抗肿瘤功效与肿瘤相关巨噬细胞和MDSC水平的显著降低相吻合，表明靶向TGFβ1功能的这一方面可能有助于治疗性有益效果。这可能适用于这些免疫抑制细胞富集的其他疾病。多种纤维化病况也与这些细胞群的局部频率升高相关。因此，预期高亲和性、TGFβ1选择性抗体在此类适应症中有望发挥相似的体内作用。
LTBP1/3-proTGFβ1作为靶点
细胞外基质是在细胞、组织、器官和全身水平上协调复杂信号传导事件的部位。在很多病理学中观察到ECM失调。TGFβ1生长因子储库以潜在proTGFβ1复合物形式存在于ECM中。潜在proTGFβ1复合物通过与ECM组分、LTBP1和/或LTBP3的共价相互作用锚定到基质上。据信其他ECM蛋白，如纤连蛋白和原纤蛋白(例如，原纤蛋白-1)在介导ECM沉积和LTBP定位方面是重要的。靶向LLC至ECM是在TGFβ1激活过程中必不可少的步骤。因为大多数(如果不是全部)TGFβ1相关的适应症可能涉及TGFβ1依赖性ECM功能的某些方面，所以考虑用于治疗剂的TGFβ抑制剂必须能够靶向TGFβ1信号传导的这种池。实际上，根据本公开的高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂针对人LTBP1/3-proTGFβ1复合物显示出显著较高的亲和性和效力。因为这些抗体在其激活前状态下直接靶向ECM定位的复合物，所以这种作用机制将消除必须与内源性高亲和性受体竞争配体结合的作用。此外，因为这些抗体的抑制活性位于与TGFβ1激活增加相关的疾病部位(例如，ECM内的生态位失调)，所以设想这些抗体应在实现增强功效的同时限制副作用。
在一些实施方式中，LTBP1-TGFβ1复合物或LTBP3-TGFβ1复合物是细胞外基质组分。LTBP的N末端可以通过异肽键与ECM共价结合，其形成可以通过转谷氨酰酶来催化。据信ECM的结构完整性在介导LTBP相关的TGFβ1活性中是重要的。例如，基质的硬度能够显著影响TGFβ1激活。此外，在支架中掺入纤连蛋白和/或原纤蛋白可以显著增加LTBP介导的TGFβ1激活。类似地，在LTBP测定(例如，基于细胞的效力测定)中存在纤连蛋白和/或原纤蛋白可以增加测定窗。在一些实施方式中，细胞外基质包含原纤蛋白和/或纤连蛋白。在一些实施方式中，细胞外基质包含含有RGD基序的蛋白。
因此，本文提供的TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂能够有效抑制TGFβ1功能的每个生物学背景，即GARP臂、LRRC33臂和LTBP1/3臂。
治疗适应症的选择和/或可能对包含TGFβ1-选择性、高亲和性、广谱抑制剂的疗法产生应答的受试者
可以进行三次询问以鉴定/筛选/选择适宜适应症和/或患者群体，针对其如本文所述的那些TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制剂可能具有有利的治疗获益：i)相对于其他亚型，人类中的疾病是否主要由TGFβ1亚型驱动或依赖于其(或至少是共显性)；ii)病况(或受累组织)是否与免疫抑制表型相关；和，iii)疾病是否涉及基质相关的和细胞相关的TGFβ1功能两者。
在各种组织的正常(健康；内稳态)以及疾病状况下已经观察到三种已知的TGFβ亚型(即，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的差异表达。然而，亚型选择性的概念尚未得到充分利用，也没有通过有利于跨多种亚型泛抑制TGFβ的常规方法稳健地实现。而且，不仅在正常(内稳态)与异常(病理)条件下，而且在患者的不同亚群中，亚型的表达模式都可能被差异调控。由于大多数临床前研究是在有限数量的动物模型中进行的，这些动物模型可能会也可能不会再现人类病况，因此使用此类模型获得的数据可能会产生偏倚，从而导致对数据的错误解读或关于出于开发治疗剂目的的可译性的误导性结论。
因此，本发明包括这样的认识，即在预测特定候选药物(例如，TGFβ1抑制剂)的疗效，以及解释有关可转化为人类病况的临床前数据时，应考虑到临床前动物模型中TGFβ亚型的表达差异。
此前对人类肿瘤样本的分析表明，TGFβ信号传导是导致疾病进展和治疗应答的主要耐药性的重要因素，其中包括针对各种类型恶性肿瘤的检查点阻断疗法(“CBT”)。文献报道的研究表明，TGFB基因表达可能与治疗抗性特别相关，表明该亚型的活性可能正在驱动这些疾病中的TGFβ信号传导。如实施例11中所详述的，在癌症基因组图谱(TCGA)概述的大多数人类肿瘤类型中，TGFB1表达似乎最为普遍，这表明选择更密切地重现TGFβ亚型的人类疾病表达模式的临床前模型可能是有益的。
如本文中所举例说明的，TGFβ1和TGFβ3在临床前研究中广泛使用的某些鼠类同系癌症模型(例如，EMT-6和4T1)中是共显性的(以相似水平共表达)(参见图20D)。而相比之下，很多其他癌症模型(例如，S91、B16和MBT-2)几乎只表达TGFβ1，与在很多人类肿瘤中观察到的那样，其中TGFβ1似乎是比TGFβ2/3更为常见的显性亚型(参见图20B和图20C)。此外，在内稳态条件下主要表达的TGFβ亚型可能不是与疾病相关的亚型。例如，在健康大鼠的正常肺组织中，强直(tonic)TGFβ信号传导似乎主要由TGFβ3介导。然而，TGFβ1似乎在疾病状况下边的显著上调，如肺纤维化。综上所述，虽然不是先决条件，但检测或确证临床样品中TGFβ亚型的相对表达，以选择患者可能对其产生应答的适宜治疗剂，可能是有益的。在一些实施方式中，可以在治疗后确定相对亚型表达。在这种情况下，患者对TGFβ1抑制疗法应答的响应(例如，临床应答/获益)可能与TGFβ亚型的相对表达水平相关。在一些实施方式中，事后回溯(ex post facto)显示TGFβ1亚型的过表达与对治疗的更高响应相关。
如本文所述，亚型选择性TGFβ1抑制剂对于治疗其中TGFβ1亚型相对于其他亚型(例如，称为TGFβ1显性)主要表达的疾病特别有利。例如，在图20B和图20C中提供了具有TGFB1(左)、TGFB2(中)和TGFB3(右)的相对表达水平的人类癌症临床样品的非限制性列表。三种异构体中的各水平线表示单一患者。可以看出，在大多数这些人类肿瘤/癌症中，总体TGFβ1表达(TGFB1)在大多数这些人类肿瘤/癌症中要显著高于其他两种亚型，表明TGFβ1选择性抑制在这些疾病类型中可能是有益的。综上所述，这些证据支持以下观点：选择性抑制TGFβ1活性可以克服对CBT的原发性抗性。产生高度选择性的TGFβ1抑制剂也将使人们能够评价这种方法是否能解决因泛TGFβ抑制而观察到的关键安全性问题，这对于评估其治疗效用至关重要。
然而，应注意某些例外情况。首先，这种趋势并不总是适用于该疾病类型内的某些个体患者。也就是说，即使在总体上相对于TGFβ2/3显示几乎均一的TGFβ1显性的癌症类型中，仍存在未遵循该一般规律的少数个体，如图20C所示。因此，属于少数亚群的患者可能不会以对大多数患者有效的方式对TGFβ1亚型特异性抑制剂治疗产生应答。其次，在某些癌症类型中，TGFβ1与另一种亚型共显性，或TGFβ2和/或TGFβ3的表达显著高于TGFβ1。在这些情况下，如本文所述的那些的TGFβ1选择性抑制剂不可能单独有效地使用。相反，可以联合使用靶向其他亚型的适宜的其他抑制剂(参见，例如，WO 2016/201282)。然而，为了控制潜在的严重毒性，应避免使用泛TGFβ抑制剂以及与TGFβ2和TGFβ3两者拮抗的抑制剂。
例如，在其中TGFβ1与TGFβ3呈共显性(例如，在类似水平下共表达)(例如，如通过活检分析所示)的疾病(如某些类型的癌症和肉瘤)或个体患者中，适宜的治疗方案可以包括TGFβ1抑制剂和TGFβ3抑制剂两者。优选地，每种抑制剂均是亚型选择性抑制剂，以避免与所有TGFβ亚型的泛抑制相关的不需要的副作用或毒性。在一些实施方式中，亚型选择性抑制剂的一种或两种抑制TGFβ亚型(例如，TGFβ1和/或TGFβ3)的激活步骤。在优选的实施方式中，亚型选择性TGFβ1抑制剂是高亲和性、不依赖于背景的激活抑制剂，如本文所述的那些。在一些实施方式中，亚型选择性TGFβ3抑制剂是TGFβ3的不依赖于背景的激活抑制剂，其通过包括选择与proTGFβ3复合物特异性结合的抗体或抗原结合片段的步骤的方法制备。通常，此类方法还包括选择或确认抗体或片段结合多种抗原复合物的能力，例如，LTBP1-proTGFβ3、LTBP3-proTGFβ3、GARP-proTGFβ3和/或LRRC33-proTGFβ3。优选地，此类方法还包括选择或确认抗体或片段抑制生长因子(TGFβ3)从潜在复合物中释放的能力(即，激活抑制)。
当适宜的治疗方案包括两种亚型选择性TGFβ抑制剂，如TGFβ1和TGFβ3(如上述所示例的)时，此类疗法可以包括包含TGFβ1和TGFβ3抑制剂两者的单一制剂。此类制剂可以包含，例如，10-50mg/mL每种抑制剂以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
或者，此类疗法可以包括使用两种单独的制剂，每种制剂包含用于向患者或患者群体施用的单一抑制剂。这提供了更大的灵活性，可根据(并定制为)从患者或患者人群中收集的一种或多种生物样品中显示存在的两个TGFβ亚型的相对表达水平(高于健康水平)，调整向患者或患者人群施用的两种抑制剂剂量的比率。例如，对于在TGFβ1阳性、TGFβ3阳性癌症/肿瘤(如乳腺癌)的治疗(其中相对于后者，前者是显性疾病相关的亚型)中的使用，可以更高剂量和/或更长持续时间使用TGFβ1抑制剂作为治疗方案的一部分。
因此，检测或确认从单个患者中收集的临床样品中的三种TGFβ亚型(即，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的相对表达水平是有益的。此类新型可以提供关于特定疗法在个体患者或患者人群中的疗效更好的预测，其可以帮助确保选择适当的治疗方案(例如，个体化/个性化治疗)，以便增加临床应答的可能性。
最近，本申请的发明人得到了出人意料的发现，即将高亲和性、TGFβ1选择性抑制剂(例如，Ab6)与检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)联合使用能够在EMT-6模型中引起显著的肿瘤消退，已知该模型以相似水平表达TGFβ1和TGFβ3两者。已通过RNA测量和ELISA测定确证了该共显性(参见图35)。此观察结果是令人吃惊的，因为此前已经假设，为了在检查点阻断的背景下，在TGFβ1阳性和TGFβ3阳性肿瘤中实现物质的功效，必须同时特异性抑制这两种共显性亚型。然而，出乎意料地，单独使用TGFβ1选择性抑制剂(与PD-1联合使用)，不使用TGFβ3选择性抑制剂，足以克服CBT的原发性抗性，并且获得缩小肿瘤体积和增强存活获益的体内功效(参见实施例18)。不受特定理论的束缚，这可能是由于TGFβ1是真正驱动疾病的亚型，即使TGF3在肿瘤中共表达。另一个可能性是抑制TGFβ1会导致下游TGFβ3的下调。两种亚型也可能受到不同的时间和/或空间调控。例如，两种亚型可能定位于离散的细胞或组织隔室。另外地或可替代地，与检查点抑制剂联合使用的高效TGFβ1抑制剂可能足以克服免疫抑制阈值。因此，本发明包括TGFβ1抑制剂在促进肿瘤消退中的用途，其中肿瘤是TGFβ1+/TGFβ3+。此类肿瘤可以包括，例如，上皮来源的癌症，即癌(例如，基底细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、原位导管癌(DCIS)、浸润性导管癌和腺癌)。在一些实施方式中，TGFβ1主要是与疾病相关的亚型，而TGFβ3支持组织(如上皮细胞)中的内稳态功能。
某些肿瘤，如各种癌症，可以被表征为低突变负荷肿瘤(MBT)。此类肿瘤通常免疫应答较差，并且不能引起足够的T细胞应答。包括化学疗法、放射疗法、癌症疫苗和/或溶瘤病毒在内的癌症疗法可能有助于在此类肿瘤中激发T细胞免疫。因此，可以将本文详述的TGFβ1抑制疗法用于与一种或多种这些抗癌疗法联用，以增加抗肿瘤作用。本质上，这种联合疗法旨在通过促进新抗原和促进效应细胞攻击肿瘤而将“冷”肿瘤(例如，免疫原性较差的肿瘤)转化为“热”肿瘤。此类肿瘤的实例包括乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌，例如胰腺导管腺癌(PDAC)。因此，本文所述的任何一种或多种抗体或其片段可以用于治疗使用癌症疗法敏化旨在促进T细胞免疫的免疫原性较差的肿瘤(“冷肿瘤”)。
在其中效应T细胞远离肿瘤部位的(因此被“排除”)免疫排除的肿瘤中，免疫抑制肿瘤环境可以以TGFβ1依赖性方式被介导。这些通常是具有免疫原性的肿瘤；然而，由于免疫抑制的环境，T细胞不能充分浸润、增殖和激发其细胞毒作用。通常，此类肿瘤对癌症疗法(如CBT)具有较差响应。如本文提供的数据所暗示的，包含TGFβ1抑制剂的辅助疗法可以克服免疫抑制表型，允许T细胞浸润、增殖和抗肿瘤功能，从而使这种肿瘤对癌症疗法(如CBT)更加敏感。
因此，第二个询问是鉴定或选择可能从TGFβ1抑制剂疗法中获益的患有免疫抑制肿瘤的患者。肿瘤中效应T细胞的存在或频率的程度指示抗肿瘤免疫性。因此，检测肿瘤中的抗肿瘤细胞(如CD8+细胞)可提供有用的信息，以评估患者是否可以从CBT和/或TGFβ1抑制剂疗法中获益。
可以通过已知方法进行检测，如肿瘤活检样品的免疫组织化学分析。最近，正常开发无创成像方法，其将允许在体内检测目标细胞(例如，细胞毒性T细胞)。参见例如，http://www.imaginab.com/technology/；Tavare等，(2014)PNAS,111(3):1108-1113；Tavare等，(2015)J Nucl Med 56(8):1258-1264；Rashidian等，(2017)J Exp Med 214(8):2243-2255；Beckford Vera等，(2018)PLoS ONE 13(3):e0193832；和Tavare等，(2015)Cancer Res 76(1):73-82，其每一个均通过引用并入本文。通常，可以将使用检测部分(例如，放射性标记)工程化的抗体或抗体样分子输注进入患者，然后其将分布并定位至特定标志物(例如CD8+)的部位。以这种方式，可以确定肿瘤是否具有免疫排除表型。如果确定肿瘤具有免疫排除表型，则单独的癌症疗法(如CBT)可能是无效的，因为在肿瘤环境内肿瘤缺乏足够的细胞毒性细胞。使用如本文所述的那些TGFβ1抑制剂的加用疗法可以降低免疫抑制，从而使癌症疗法抗性肿瘤对癌症疗法具有更高的响应。
无创体内成像技术可以以各种适宜方法应用于诊断患者的目的；选择或鉴定可能从TGFβ1抑制剂疗法中获益的患者；和/或监测治疗后患者的治疗应答。具有已知细胞表面标志物的任何细胞都可以通过使用特异性结合细胞标志物的抗体或类似分子来检测/定位。通常，通过使用此类技术检测的细胞是免疫细胞，如细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、MDSC、肿瘤相关巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞和中性粒细胞。识别此类标志物的抗体或工程化的抗体样分子可以与检测部分偶联。
适宜免疫细胞标志物的非限制性实例包括单核细胞标志物、巨噬细胞标志物(例如，M1和/或M2巨噬细胞标志物)、CTL标志物、抑制性免疫细胞标志物、MDSC标志物(例如，针对G-和/或M-MDSC的标志物)，包括但不限于：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD206、CD68、CD14、CD15、CD66、CD34、CD25和CD47。
在一些实施方式中，体内成像包括T细胞示踪，如细胞毒性CD8阳性T细胞。因此，任何一种本文公开的TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂均可以用于在患有实体瘤的受试者中治疗癌症，其中所述治疗包括：i)进行体内成像分析以检测受试者中的T细胞，其中任选地T细胞是CD8+T细胞，以及如果根据步骤(i)的体内成像分析，实体瘤被确定为是免疫排除的实体瘤，则，向所述受试者施用治疗有效量的TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂。在一些实施方式中，受试者已接受CBT，其中任选地所述实体瘤对CBT具有抗性。在一些实施方式中，给予受试者CBT以及TGFβ1抑制剂，作为联合疗法。联用可以包括施用单一制剂，其包含检查点抑制剂和TGFβ1抑制剂两者。或者，联合疗法可以包括施用包含检查点抑制剂的第一制剂和包含TGFβ1抑制剂的第二制剂。
在一些实施方式中，体内成像包括MDSC示踪，如G-MDSC(又称为PMN-MDSC)和M-MDSC。例如，在基线时，MDSC可以在疾病部位(如纤维化组织和实体瘤)富集。治疗(例如，TGFβ1抑制剂疗法)后，可以观察到更少的MDSC，如通过标记(如放射性同位素和荧光)强度降低所测量的，提示治疗作用。
在一些实施方式中，体内成像包括示踪或定位LRRC33阳性细胞。LRRC33阳性细胞包括，例如，MDSC和激活的M2样巨噬细胞(例如，TAM和与纤维化组织相关的激活的巨噬细胞)。例如，在基线时，LRRC33阳性细胞可以在疾病部位(如纤维化组织和实体瘤)富集。治疗(例如，TGFβ1抑制剂疗法)后，可以观察到更少的表达细胞表面LRRC33的细胞，如通过标记(如放射性同位素和荧光)强度降低所测量的，提示治疗作用。
在一些实施方式中，体内成像包括使用PET-SPECT、MRI和/或光学荧光/生物发光法，以检测目标靶点(例如，能够被标记的试剂结合的分子或实体，如表达一种或多种适当标志物的细胞和组织)。
在一些实施方式中，使用检测部分标记抗体或抗体样分子可以包括直接标记或间接标记。
在一些实施方式中，检测部分可以是示踪剂。在一些实施方式中，示踪剂可以是放射性同位素，其中任选地所述放射性同位素可以是正电子发射同位素。在一些实施方式中，放射性同位素选自以下：18F、11C、13N、15O、68Ga、177Lu、18F和89Zr。
因此，此类方法可用于在免疫PET中使用标记的抗体进行体内成像。
在一些实施方式中，进行这种体内成像，以在受试者中监测对TGFβ1抑制疗法的治疗应答。例如，治疗应答可以包括免疫排除肿瘤转化成发炎的肿瘤，其与免疫细胞向肿瘤的浸润增加有关。这可以通过肿瘤内免疫细胞的频率或检测信号(如放射性标记和荧光)的程度增加来目测观察。
因此，本发明包括一种治疗癌症的方法，所述方法可以包括以下步骤：i)选择被诊断为患有包括实体瘤在内的癌症的患者，其中所述实体瘤是或疑似是免疫排除的肿瘤；和，ii)以治疗癌症的有效量向所述患者施用本文涵盖的抗体或片段。在一些实施方式中，患者已接受或者是接受癌症疗法的候选人，如免疫检查点抑制疗法(例如，PD-(L)1抗体)、化学疗法、放射疗法、工程化免疫细胞疗法和癌症疫苗疗法。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括检测免疫细胞或其一种或多种标志物，其中任选地所述检测包括肿瘤活检分析、血清标志物分析和/或体内成像。
在一些实施方式中，患者被诊断为针对其CBT已获批的癌症，其中任选地，统计学上类似的患有特定癌症的患者人群对已获批CBT的应答率相对较低，例如，低于25％。例如，针对CBT的应答率可以在约10-25％之间，例如约10-15％。此类癌症可以包括，例如，卵巢癌、胃癌和三阴性乳腺癌。可以将本公开的高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂用于治疗此类癌症，其中所述受试者未曾接受过CBT。TGFβ1抑制剂可以与CBT联合向受试者施用。在一些实施方式中，受试者可能接受或可能已接受了另外的癌症疗法，如化学疗法和放射疗法。
可以采用上文所述的体内成像技术进行检测、定位和/或示踪被诊断出TGFβ1相关疾病(如癌症和纤维化)的患者中的某些MDSC。健康个体在循环中不具有或具有较低频率的MDSC。随着这种疾病的发作或进展，可以检测到升高水平的循环和/或疾病定位的MDSC。例如，据报道，CCR2阳性的M-MDSC在炎症组织中累积，并可能导致组织中纤维化的进展(如肺纤维化)，并且已显示这与TGFβ1的表达相关。类似地，在多种实体瘤(包括三阴性乳腺癌)中富含MDSC，并且其部分有助于TME的免疫抑制表型。因此，可以通过定位或示踪MDSC监测对根据本公开的TGFβ1抑制疗法的治疗应答。可检测的MDSC的减少或频率降低通常提示治疗获益或更好的预后。
因此，TGFβ1激活的高亲和性、不依赖于背景的抑制可以用于在受试者中治疗癌症，其中所述癌症的特征在于免疫抑制，其中所述癌症任选地包括TGFβ1阳性和TGFβ3阳性的实体瘤。此类受试者可以被诊断出患有癌症。在一些实施方式中，所述癌症是乳腺癌，其中任选地所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。此类治疗可以进一步包括癌症疗法，包括但不限于，化学疗法、放射疗法、癌症疫苗、工程化的免疫细胞疗法(如CAR-T)和免疫检查点阻断疗法，如抗PD(L)-1抗体。
在一些实施方式中，鉴定出冷肿瘤，其中几乎不存在效应细胞，或者已知是特征为免疫原性较差的癌症。使用免疫敏化癌症疗法对患有此类肿瘤的受试者/患者进行治疗，如化学疗法、放射疗法、溶瘤病毒疗法和癌症疫苗，以激发对肿瘤抗原(例如，新抗原)更强的T细胞应答。该步骤可以将冷肿瘤转化成“免疫排除”肿瘤。该受试者任选地进一步接受CBT，如抗-PD-(L)1。进一步使用TGFβ1抑制剂对受试者进行治疗，如本文公开的抗体。这可以将冷肿瘤或免疫排除肿瘤转化为“发炎的”或“热”肿瘤，从而赋予对免疫疗法的响应。免疫原性较差的癌症的非限制性实例包括乳腺癌(如TNBC)、前列腺癌(如去势抗性前列腺癌(CRPC))和胰腺癌(如胰腺腺癌(PDAC))。
如图5B中所示，本发明的TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂(如Ab6)能够抑制纤溶酶诱导的TGFβ1激活。纤溶酶-纤溶酶原轴涉及多种癌症类型(癌瘤，特别是乳腺癌)的某些肿瘤发生、侵袭和/或转移。因此，TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂(如本文所述的那些)可能通过这种机制在涉及上皮的肿瘤或肿瘤模型(如EMT6)中发挥抑制性作用。实际上，纤溶酶依赖性上皮细胞的破坏或重塑可能导致涉及上皮损伤和癌的侵袭/扩散的病况的发病机制。后者可能由上皮至向间质的转化(“EMT”)而触发。据报道，纤溶酶原激活和纤溶酶原依赖性侵袭在上皮样细胞中更为突出，其部分由S100A10和PAI-1的表达决定(Bydoun等，(2018)Scientific Reports,8:14091)。
本发明包括一种选择可能对包含亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂的疗法有应答的患者人群或受试者的方法。此类方法可以包括以下步骤：提供从受试者中收集的生物样品(例如，临床样品)，确定(例如，测量或测定)样品中TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的相对水平，和如果与TGFβ2和TGFβ3相比，TGFβ1是显性亚型；和/或如果与对照相比，TGFβ1显著过表达或上调，则向所述受试者施用包含亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂的组合物。在一些实施方式中，此类方法包括以下步骤：获得有关此前确定的TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3相对表达水平的信息；鉴定患有TGFβ1阳性(优选地，TGFβ1显性)疾病的受试者；和向所述受试者施用包含亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂的组合物。在一些实施方式中，此类受试者患有对疗法(如癌症疗法)具有抗性的疾病(如癌症)。在一些实施方式中，此类受试者表现出对疗法的不耐受性，因此已经或可能终止所述疗法。将TGFβ1抑制剂添加到治疗方案中可以减少第一种疗法的剂量并仍然能够在组合中获得临床获益。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可以推迟或减小手术需求。
可以通过基于RNA的测定和/或基于蛋白的测定确定亚型的相对水平，其是本领域所熟知的。在一些实施方式中，施用步骤还可以包括另一种疗法，如免疫检查点抑制剂，或本文其他地方提供的其他药剂。此类方法可以任选地包括通过在两个或更多个时间点监测TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的相对水平的变化来评价治疗应答的步骤。在一些实施方式中，在施用之前和之后收集临床样品(如活检)。在一些实施方式中，在治疗后多次收集临床样品(如活检)以评估随着时间的推移的体内效用。
除了上述询问以外，第三次询问的询问涉及在特定疾病中TGFβ1功能的广度。这可以由TGFβ1背景的数量来表示，即，其中一种或多种呈递分子介导与疾病相关的TGFβ1功能。TGFβ1特异性、宽范围抑制剂(如不依赖于背景的抑制剂)对于治疗涉及TGFβ1功能的ECM组分和免疫组分两者的疾病是有利的。此类疾病可能与ECM中的失调以及免疫细胞功能或免疫应答紊乱相关。因此，本文所述的TGFβ1抑制剂能够靶向ECM相关的TGFβ1(例如，由LTBP1或LTBP3呈递)以及免疫细胞相关的TGFβ1(例如，由GARP或LRRC33呈递)。此类抑制剂抑制全部四个治疗靶点(例如，“不依赖于背景”的抑制剂)：GARP相关的前/潜在TGFβ1；LRRC33相关的前/潜在TGFβ1；LTBP1相关的前/潜在TGFβ1；和，LTBP3相关的前/潜在TGFβ1，以便在这些背景下广泛抑制TGFβ1的功能。
可以通过评估从患者中收集的临床样品中呈递分子的表达性质来评估患者的特定病症是否涉及或由TGFβ1功能的多个方面驱动。各种测定是本领域公知的，包括基于RNA的测定和基于蛋白的测定，可以进行这些测定以获得表达性质。样品中LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33的相对表达水平(和/或其变化/改变)可以指示与该病况相关的TGFβ1活性的来源和/或背景。例如，从实体瘤中获得的活检样品可以表现出全部四种呈递分子的高表达。例如，LTBP1和LTBP3可能在肿瘤基质内的CAF中高表达，而GARP和LRRC33可能分别由肿瘤相关的免疫细胞(如Treg和白细胞浸润)高表达。
因此，本发明包括一种用于确定(例如，检测或确证)相对于TGFβ2和TGFβ3，疾病中涉及TGFβ1的方法。在一些实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤：鉴定疾病相关TGFβ1的来源(或背景)。在一些实施方式中，通过确定在从患者中采集的临床样品中TGFβ呈递分子(例如，LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33)的表达评估来源/背景。在一些实施方式中，此类方法以事后回溯的方式进行。
对于LRRC33阳性细胞，本公开的申请人已经认识到LRRC33的RNA表达和蛋白表达之间可能存在显著差异。特别地，虽然某些细胞类型似乎在RNA水平上表达LRRC33，但此类细胞只有一部分在细胞表面上表达LRRC33蛋白。可以预期的是，例如，就质膜插入和快速内化而言，LRRC33表达可以通过蛋白运输/定位而受到高度调控。因此，在优选的实施方式中，LRRC33蛋白表达可用作与富含例如激活的/M2样巨噬细胞和MDSC的疾病组织(如肿瘤和纤维化组织)相关的标志物。
TGFβ1相关适应症
TGFβ1相关适应症的一般特性
亚型选择性TGFβ1抑制剂，例如本文所述的那些，可用于治疗与人受试者中TGFβ1失调相关的多种疾病、病症和/或病况(即TGFβ1相关适应症)。如本文所用，“与TGFβ1失调相关疾病(病症或病况)”或“TGFβ1相关适应症”意指与TGFβ的表达、活性和/或代谢相关的任何疾病、病症和/或病况，或可能从TGFβ1活性和/或水平的抑制中受益的任何疾病、病症和/或病况。
因此，本发明包括在用于治疗人受试者中与TGFβ1失调相关的疾病的方法中使用亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂。这样的抑制剂通常配制成还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。有利地，所述抑制剂在体内靶向ECM相关的TGFβ1和免疫细胞相关的TGFβ1两者，但不靶向TGFβ2或TGFβ3。在一些实施方式中，抑制剂抑制TGFβ1的激活步骤。疾病的特征在于以下属性中的至少两种的失调或损伤：a)调节性T细胞(Treg)；b)效应T细胞(Teff)增殖或功能；c)骨髓细胞增殖或分化；d)单核细胞募集或分化；e)巨噬细胞功能；f)上皮间质转化(EMT)和/或内皮间质转化(EndMT)；g)选自以下的一种或多种标志物基因中的基因表达：PAI-1、ACTA2、CCL2、Col1a1、Col3a1、FN-1、CTGF和TGFβ1；h)ECM组分或功能；i)成纤维细胞分化。将治疗有效量的这样的抑制剂施用至患有或被诊断患有所述疾病的受试者。
在一些实施方式中，所述疾病涉及包含显示出增加的I型胶原蛋白的沉积的ECM组分或功能的失调或损伤。在一些实施方式中，ECM失调包括基质硬度增加。在一些实施方式中，ECM失调涉及纤连蛋白和/或原纤蛋白。
在一些实施方式中，成纤维细胞分化的失调或损伤包含增加的肌成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞。在一些实施方式中，肌成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞是癌症相关的成纤维细胞(CAF)。在一些实施方式中，CAF与肿瘤基质相关并可产生CCL2/MCP-1和/或CXCL12/SDF-1。在一些实施方式中，肌成纤维细胞或肌成纤维细胞样细胞定位于纤维化组织。
在一些实施方式中，调节性T细胞的失调或损伤包含增加的Treg活性。
在一些实施方式中，效应T细胞(Teff)增殖或功能的失调或损伤包含受抑制的CD4+/CD8+细胞的增殖。
在一些实施方式中，骨髓细胞增殖或分化的失调或损伤包含增加的骨髓祖细胞的增殖。所述增加的骨髓祖细胞的增殖可能发生在骨髓中。
在一些实施方式中，单核细胞分化的失调或损伤包含在疾病部位增加的骨髓来源和/或组织驻留单核细胞向巨噬细胞的分化，例如，纤维化组织和/或实体瘤。
在一些实施方式中，单核细胞募集的失调或损伤包含在疾病部位(例如TME)增加的骨髓来源的单核细胞募集，导致增加的巨噬细胞分化和M2极化，随后是增加的TAM。
在一些实施方式中，巨噬细胞功能的失调或损伤包含增加的巨噬细胞向M2表型的极化。
在一些实施方式中，骨髓细胞增殖或分化的失调或损伤包含增加数量的Treg、MDSC和/或TAN。
TGFβ相关适应症可包括其包含免疫排除疾病微环境的病症，例如肿瘤或癌组织，其通过排除效应免疫细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)部分抑制机体的正常防御机制/免疫。在一些实施方式中，这样的免疫排除条件与对治疗(例如，癌症疗法)的差响应性相关。患者对其具有较差应答的癌症疗法的非限制性实例包括但不限于：检查点抑制剂疗法、癌症疫苗、化学疗法和放射疗法。无意受特定理论的束缚，可以预期的是TGFβ抑制剂，例如本文所述的那些，可通过促进T细胞扩增和/或浸润至肿瘤帮助对抗肿瘤通过恢复免疫细胞(例如，T细胞(例如，CD8+细胞))和巨噬细胞(例如，F4/80+细胞、M1极化的巨噬细胞)获得而排除抗癌免疫力的能力。
因此，TGFβ抑制可以通过释放和恢复效应T细胞通路和细胞毒性效应功能在免疫排除疾病环境(如TME)中克服治疗抗性(例如，免疫检查点抗性、癌症疫苗抗性、CAR-T抗性、化学疗法抗性、放射疗法抗性等)。TGFβ抑制的此类作用可以进一步提供例如由CD8+T细胞介导的长期免疫记忆。
在一些实施方式中，肿瘤的免疫原性较差(例如，“沙漠”或“冷”肿瘤)。患者可以从触发新抗原或促进免疫应答的癌症疗法中获益。此类疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、溶瘤病毒疗法、溶瘤肽、酪氨酸激酶抑制剂、新表位疫苗、抗CTLA4、不稳定诱导剂、DDR剂、NK细胞激活剂，以及诸如TLR配体/激动剂的各种佐剂。可以将TGFβ1抑制剂(如本文所述的那些)联合使用，以增强癌症疗法的效果。TGFβ1抑制剂的一种作用模式可以是使MHC表达正常化或恢复，从而促进T细胞免疫。
TGFβ相关适应症的非限制性实例包括：纤维化，包括器官纤维化(例如，肾纤维化、肝纤维化、心脏/心血管纤维化、肌纤维化、皮肤纤维化、子宫纤维化/子宫内膜异位和肺纤维化)，硬皮病，Alport综合征，癌症(包括但不限于：血癌如白血病、骨髓纤维化、多发性骨髓瘤、结肠癌、肾癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、胶质母细胞瘤)，与实体肿瘤相关的纤维化(如癌症发育不全、如促纤维增生性黑色素瘤、胰腺癌相关的结缔组织病和乳腺癌发育不良)，间质纤维化(如乳腺间质纤维化)，放射性纤维化(如放射性纤维化综合征)，促进化疗后快速造血，骨愈合，伤口愈合，痴呆，骨髓纤维化，骨髓增生异常(如，骨髓增生异常综合征或MDS)，肾脏疾病(例如，终末期肾病或ESRD)，单侧输尿管闭塞(UUO)，牙齿脱落和/或变性，内皮增殖症，哮喘和过敏，胃肠功能紊乱，衰老贫血，主动脉瘤，孤儿适应症(如马凡氏综合征和进行性骨干发育不良)，肥胖，糖尿病，关节炎，多发性硬化，肌营养不良，骨并在，肌萎缩侧索硬化(ALS)，帕金森病，骨质疏松症，骨关节炎，骨质减少，代谢综合征，营养障碍，器官萎缩，慢性阻塞性肺病(COPD)和厌食症。
有证据表明，胞外核苷酸酶CD39和CD73可能至少部分导致疾病条件下腺苷水平的升高。值得注意的是，CD39/CD73-TGFβ轴可能在调节涉及TGFβ信号传导的免疫细胞(包括Treg和MDSC)中发挥作用。调节性T细胞(Treg)和骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)通常都表现出免疫抑制性表型。在很多病理状况(例如，癌症、纤维化)下，这些细胞在疾病部位富集，并且可能有助于建立和/或维持免疫抑制环境。这可能至少部分地由胞外腺苷酸酶CD39和CD73介导，其一起参与ATP分解为核苷腺苷，导致疾病环境(如肿瘤微环境和纤维化环境)中腺苷的局部浓度升高。腺苷可以结合至在靶细胞(如T细胞和NK细胞)上表达的其受体，从而抑制这些靶细胞的抗肿瘤功能。
具有异常基因表达的疾病；生物标志物
已经观察到，在各种疾病状况中TGFβ1信号转导通路的异常激活与多种标志物的基因表达的改变相关。这些基因表达标志物(例如，通过mRNA测量)包括但不限于：Serpine1(编码PAI-1)、MCP-1(也称为CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、ACTA2(编码α-SMA)、SNAI1(通过下调钙粘蛋白(Cdh1)驱动纤维化和转移中的EMT)、MMP2(与EMT相关的基质金属蛋白酶)、MMP9(与EMT相关的基质金属蛋白酶)、TIMP1(与EMT相关的基质金属蛋白酶)、FOXP3(Treg诱导的标志物)、CDH1(由TGFβ下调的E钙粘蛋白(上皮细胞的标志物))和CDH2(由TGFβ上调的N钙粘蛋白(间叶细胞的标志物))。有趣的是，许多这些基因涉及在多种疾病状况中发挥作用，包括各种类型的器官纤维化，以及许多癌症，包括骨髓纤维化。实际上，已经提出了纤维化病症与异常细胞增殖、肿瘤发生和转移之间的病理生理学联系。参见，例如，Cox和Erler(2014)Clinical Cancer Research20(14):3637-43“Molecular pathways:connecting fibrosis and solid tumor metastasis”；Shiga等，(2015)Cancers 7:2443-2458“Cancer-associated fibroblasts:their characteristics and their roles intumor growth”；Wynn和Barron(2010)Semin.Liver Dis.30(3):245-257“Macrophages:master regulators of inflammation and fibrosis”，其内容各自通过引用并入本文。无意受特定理论的束缚，本公开的发明人考虑到TGFβ1信号传导通路实际上可能是这些广泛病理之间的关键联系。
趋化性细胞因子(或趋化因子)介导白细胞募集(例如，单核细胞/巨噬细胞)至受伤或疾病组织的能力在疾病进展中具有至关重要的作用。C-C趋化因子家族的成员，如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，也称为CCL2，巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)，也称为CCL3，和MIP-1β，也称为CCL4，和MIP-2α，也称为CXCL2已牵涉到这一过程中。
例如，MCP-1/CCL2被认为在纤维化和癌症两者中发挥作用。MCP-1/CCL2的特征在于作为促纤维化趋化因子，并且是单核细胞化学引诱物，并且证据表明其可能参与癌症的启动和进展两者。在纤维化中，MCP-1/CCL2已显示在纤维化的炎症阶段中起重要作用。例如，MCP-1的中和导致肾小球新月体形成和I型胶原沉积的显著减少。类似地，使用抗MCP-1或抗MIP-1α抗体进行的被动免疫疗法显示出显著减少博来霉素攻击小鼠的单核吞噬细胞累积，表明MIP-1α和MCP-1有助于肺部炎症应答过程中白细胞的募集(Smith,BiolSignals.1996Jul-Aug；5(4):223-31,“Chemotactic cytokines mediate leukocyterecruitment in fibrotic lung disease”)。据报道，囊性纤维化和多发性骨髓瘤患者的MIP-1α水平升高(参见，例如：Mrugacz等，J Interferon Cytokine Res.2007Jun；27(6):491-5)，这支持了MIP-1α与局部或全身炎症应答相关的观点。
有证据表明，C-C趋化因子参与了肿瘤的进展/转移。例如，肿瘤来源的MCP-1/CCL2可以促进巨噬细胞中的“前癌”表型。例如，在肺癌中，已显示MCP-1/CCL2由基质细胞产生并促进转移。在人胰腺癌中，肿瘤分泌CCL2，免疫抑制性CCR2阳性巨噬细胞浸润这些肿瘤。具有显示出高CCL2表达/低CD8 T细胞浸润的肿瘤患者存活率显著降低。不希望受到特定理论的束缚，可以预期募集到受伤或患病组织环境中的单核细胞随后可响应于局部诱因(cue)(如对肿瘤衍生的细胞因子的应答)而极化，从而进一步导致疾病进展。这些M2样巨噬细胞可能通过抑制效应细胞(如CD4+和CD8+T细胞)来促进免疫逃逸。在一些实施方式中，这一过程部分地由激活的巨噬细胞表达的LRRC33-TGFβ1介导。在一些实施方式中，该过程部分地由Treg表达的GARP-TGFβ1介导。
类似地，在某些癌症中，如乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)，已证实CXCL2/CCL22介导的MDSC募集可促进血管生成和转移(参见，例如，Kumar等，(2018)J Clin Invest128(11):5095-5109)。因此，预期这一过程至少部分地由TGFβ1(LRRC33-TGFβ1)所介导。而且，因为诸如MMP9的蛋白酶与基质重塑过程有关，从而有助于肿瘤侵袭和转移，所以相同或重叠的信号通路也可能在纤维化中起作用。
PAI-1/Serpine1的参与涉及多种纤维化病况、癌症、血管生成、炎症、以及神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)。肿瘤和/或血清中PAI-1的表达升高与各种癌症(例如，乳腺癌和膀胱癌(例如，移行细胞癌))以及骨髓纤维化的不良预后(例如，存活更短、转移增加)相关。在纤维化状况的背景下，PAI-1已被认为是TGFβ1诱导的纤维化的重要的下游效应物，并且在各种形式的组织纤维化中观察到PAI-1表达增加，包括肺纤维化(例如IPF)、肾纤维化、肝纤维化和硬皮病。在一些实施方式中，该过程部分地由ECM相关的TGFβ1介导，例如通过LTBP1-proTGFβ1和/或LTBP3-proTGFβ1。
在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂疗法的体内效果可通过测量适宜基因标志物表达水平中的变化来评估。合适的标志物包括TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)。适合的标志物还可以包括针对TGFβ(例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的一种或多种呈递分子，如LTBP1、LTBP3、GARP(或LRRC32)和LRRC33。在一些实施方式中，合适的标志物包括间充质转化基因(例如，AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN和/或FAP)、免疫抑制基因(例如，IL10、VEGFA、VEGFC)、单核细胞和巨噬细胞趋化基因(例如，CCL2、CCL3、CCL4、CCL7、CCL8、CCL13和CCL22)，和/或本文讨论的各种纤维化标志物。优选的标志物是血浆/血清标志物。
如本文实例中所示，本文所述的TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂在已经显示是TGFβ1依赖型的机制的动物模型(例如UUO)中可以减少许多这些标志物的表达水平。因此，这样的抑制剂可用于治疗以一种或多种基因表达标志物的异常表达(例如，过表达/上调或低表达/下调)为特征的疾病或病症。
因此，在一些实施方式中，TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂可用于治疗与以下中一种或多种过表达相关的疾病：PAI-1(也称为Serpine1)、MCP-1(也称为CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、α-SMA、ITGA11和ACTA2，其中所述治疗包括将抑制剂以有效量施用至患有疾病的受试者以治疗该疾病。在一些实施方式中，抑制剂用于治疗与PAI-1、MCP-1/CCL2、CTGF和/或α-SMA过表达相关的疾病。在一些实施方式中，疾病是骨髓纤维化。在一些实施方式中，疾病是癌症，例如包含实体瘤的癌症。在一些实施方式中，疾病是器官纤维化，例如，肝脏(例如，与NASH相关)、肾脏、肺、肌肉、皮肤和/或心脏或心血管组织的纤维化。
TGFβ1通路参与控制ECM和免疫组分两者的关键方面可能解释了以下观察结果：在广泛的病理学(如增殖性病症和纤维化病症)中，共享大量失调的基因。这支持了这样的观点，即涉及TGFβ1信号传导的基因中异常的表达模式很可能是普遍现象。这些标志物基因可以分为以下几类，如：参与基质转化(例如，EndMT和EMT)的基因；参与血管生成的基因；参与缺氧的基因；参与伤口愈合的基因；以及参与组织损伤触发的炎症应答的基因。
由Hugo等进行的全面研究(Cell,165(1):35-44)优雅地证实了在转移性黑色素瘤中这些类别标志物的差异基因表达模式与对检查点阻断疗法(CBT)的响应之间的相关性。作者发现，具有“IPRES标记”的基因集合的共富集不仅在黑色素瘤中而且在所分析的所有主要常见人类恶性肿瘤中都定义了转录组。实际上，这项工作将肿瘤细胞的表型可塑性(即，间质转化)与由此产生的对微环境的影响(例如，ECM重塑、细胞粘附以及免疫抑制性伤口愈合的血管生成特性)与CBT抗性联系起来。
认识到每种这些IPRES基因类别均与涉及TGFβ失调的疾病有关，申请人此前预期TGFβ1亚型尤其可以在疾病状况下介导这些过程(参见，例如，WO 2017/156500)。本文中公开的工作进一步支持了这一观点(例如，实施例11；图37A)，进一步证实了选择性靶向TGFβ1(相对于非选择性替代方案)的疗法可以在功效和安全性均提供优势。
因此，本公开包括选择或鉴定可能对TGFβ1抑制疗法有应答的候选患者或患者人群，并且向所述患者施用有效量的TGFβ1高亲和性亚型选择性抑制剂的方法/过程。观察到患者对CBT的响应不足(例如，抗性)，可能表明所述患者是本文所述的TGFβ1抑制疗法的候选人。因此，可以将TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂(如本文公开的那些)用于在受试者中治疗癌症，其中所述受试者对CBT的响应较差。所述受试者可以患有晚期癌症，如局部晚期实体瘤或转移性癌症。当在预期足以显示特定疗法的有意义的治疗效果的一段时间之后，不存在或几乎不存在所达到的有意义的治疗效果(例如，根据标准指南，如RECIST和iRECIST，不符合部分缓解或完全缓解的标准)时，则将患者称为“响应较差”。通常，无论有无其他疗法(如化学疗法)，CBT治疗的这种持续时间至少约为3个月。可以将此类患者称为“无应答者”。如果此类患者对初始CBT的响应较差，则可以将所述患者称为“原发性无应答者”。此类癌症(或患有此类癌症的患者)的特征可能在于对CBT具有“原发性抗性”。在一些实施方式中，所述受试者在接受至少约3个月CBT治疗后是原发性无应答者，其中任选地，在接受至少约4个月CBT治疗后。在一些实施方式中，所述受试者还接受与CBT联用的其他疗法，如化学疗法。
在鉴定受试者为CBT无应答者后，可以将TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂与CBT联合向受试者施用，所述CBT可以包含也可以不包含与受试者未能对其产生应答的第一CBT相同的检查点抑制剂。可以使用任何适宜的免疫检查点抑制剂，例如已获批的检查点抑制剂。在一些实施方式中，TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂与包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的CBT联合向受试者施用。TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂旨在通过使癌症对CBT更加敏感来克服抗性。
选择或鉴定可能对TGFβ1抑制疗法产生应答的候选患者或患者人群的方法可以包括以下步骤：针对本文所讨论的一种或多种标志物的表达，对从患者(或患者人群)收集的生物样品(如活检样品)进行检测。类似地，可以将此类遗传标志物用于监测患者对疗法的响应的目的。监测可以包括检测从患者中收集的两种或更多种生物样品，例如，在治疗施用之前和之后，以及在一段时间内进行治疗方案的过程中收集的，以评价指示治疗应答或功效的一个或多个标志物的基因表达水平的变化。在一些实施方式中，可以使用液体活检。
在一些实施方式中，选择可能对TGFβ1抑制疗法产生应答的候选患者或患者人群的方法可以包括以下步骤：鉴定此前针对遗传标志物(如本文所述的那些)检测显示出其异常表达的患者或患者人群。这些相同的方法也适用于以后确证患者对治疗的应答或与其相关。
在一些实施方式中，异常标志物表达包括下述中至少一种的水平升高：TGFβ1、LRRC33、GARP、LTBP1、LTBP3、CCL2、CCL3、PAI-1/Serpine1。在一些实施方式中，患者或患者人群(例如，从其收集的生物样品)显示出升高的TGFβ1激活、磷酸化-Smad2/3或其组合。在一些实施方式中，患者或患者人群(例如，从其收集的生物样品)显示出升高的MDSC。在一些实施方式中，此类患者或患者人群患有癌症，其可以包括TGFβ1阳性的实体瘤。实体瘤可以是TGFβ1显性肿瘤，其中相对于其他亚型，TGFβ1是在肿瘤中表达的主要亚型。在一些实施方式中，实体瘤可以是TGFβ1共显性肿瘤，其中TGFβ1是在肿瘤中表达的共显性亚型，例如，TGFβ1+/TGFβ3+。在一些实施方式中，此类患者或患者人群显示出对癌症疗法的抗性，如化学疗法、放射疗法和/或免疫检查点疗法，例如，抗PD-1(例如，派姆单抗和纳武单抗)、抗PD-L1(例如，阿特朱单抗)、抗CTLA4(例如，伊匹单抗)、工程化的免疫细胞疗法(例如，CAR-T)和癌症疫苗等。根据本发明，高亲和性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂(如本文公开的那些)通过解除对免疫抑制的阻断，以使得效应细胞能够接近癌细胞来克服抗性，从而实现了抗肿瘤效应。因此，TGFβ1抑制剂疗法可以促进效应细胞在肿瘤中的浸润和/或扩增。此外，TGFβ1抑制剂疗法可以降低肿瘤中免疫抑制免疫细胞(如Treg和MDSC)的频率。
在一些实施方式中，异常标志物表达包括以下一组或多组基因：间质转化标志物(例如，AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN、FAP)；免疫抑制基因(例如，IL10、VEGFA、VEGFC)；单核细胞和巨噬细胞趋化基因(例如，CCL2、CCL7、CCL8、CCL13)；参与血管生成和伤口愈合的基因(例如，T细胞抑制性)；细胞粘附标志物；ECM重塑；骨骼系统和骨骼发育标志物；以及参与组织损伤触发的炎症应答的基因。
在一些实施方式中，可以将MHC表达(如1类MHC)的缺乏或下调用作TGFβ1相关病况的生物标志物，对于所述病况，本公开涵盖的抗体或抗原结合片段可以用作治疗。MHC水平降低可能表示免疫逃逸，这可能与患者对免疫疗法(如CBT)的响应较差有关。因此，TGFβ1的选择性抑制可以至少部分地恢复效应细胞功能。
涉及间质转化的疾病
间质转化是细胞(如上皮细胞和内皮细胞)向间质表型(如肌成纤维细胞)的表型转变的过程。指示间质转化的遗传标志物的实例包括AXL、ROR2、WNT5、LOXL2、TWIST2、TAGLN和FAP。在癌症中，例如，间质转化(例如，EndMT和EMT标记增加)表明肿瘤细胞表型的可塑性。因此，TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制剂(如本文所述的那些)可以用于治疗由间质转化(如EMT和EndMT)起始或驱动的疾病。
EMT(上皮间质转化)是具有紧密连接的上皮细胞转化为间质特性(表型)如松散的细胞-细胞接触的过程。所述过程在许多正常生物过程以及病理情况中观察到，包括胚胎发生、伤口愈合、癌症转移和纤维化(例如，Shiga等，(2015)“Cancer-AssociatedFibroblasts:Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth.”Cancers,7:2443-2458中的综述)。通常，认为EMT信号主要由TGFβ诱导。例如，许多类型的癌症似乎涉及细胞向间质表型(例如肌成纤维细胞和CAF)的转分化，其与较差的预后相关。因此，TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂，例如本文所述的那些，可用于治疗由EMT引发或驱动的疾病。实际上，本文示例的数据(例如，图7-9)显示这样的抑制剂具有在体内抑制肌成纤维细胞/CAF标志物表达的能力，例如α-SMA、LOXL2、Col1(I型胶原蛋白)和FN(纤连蛋白)。因此，可以将TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制剂(如本文所述的那些)用于治疗以EMT为特征的疾病。抑制剂的治疗有效量可以是足以降低诸如α-SMA/ACTA2、LOXL2Col1(I型胶原蛋白)和FN(纤连蛋白)的标志物的表达的量。在一些实施方式中，疾病是纤维化病症。在一些实施方式中，疾病是增殖性病症，如癌症。
类似地，TGFβ也是在正常发育(如心脏形成)中观察到的内皮间质转化(EndMT)的关键调节物。然而，在许多疾病相关组织中也观察到相同或类似的现象，例如癌基质和纤维化部位。在一些疾病过程中，内皮标志物如CD31在TGFβ1暴露后下调，并且反而诱导间质标志物如FSP-1、α-SMA/ACTA2和纤连蛋白的表达。实际上，基质CAF可以源自血管内皮细胞。因此，TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制剂，例如本文所述的那些，可用于治疗以EndMT为特征的疾病。抑制剂的治疗有效量可以是足以降低诸如FSP-1、α-SMA/ACTA2和纤连蛋白的标志物的表达的量。在一些实施方式中，疾病是纤维化病症。在一些实施方式中，疾病是增殖性病症，如癌症。
涉及基质硬化和重塑的疾病
各种TGFβ1相关适应症(如纤维化状况和癌症)的进展涉及沉积到ECM和/或ECM的维持/重塑中的基质组分水平增加。据报道，ECM组分(如胶原)的沉积增加能够改变ECM的机械物理性质(例如，基质/基底的硬度)，并且该现象与TGFβ1信号传导相关。申请人此前使用转染了proTGFβ1和LTBP1并在具有确定的硬度(例如，5kPa、15kPa或100kPa)的硅基基底上生长的原代成纤维细胞证明了基质硬度在整联蛋白依赖性TGFβ激活中的作用。如在WO2018/129329中所公开的，具有更大硬度的基质增强TGFβ1激活，并且这可以通过TGFβ1的亚型特异性抑制剂来抑制。这些观察结果表明TGFβ1影响ECM特性(例如硬度)，这反过来可以进一步诱导TGFβ1激活，反映疾病进展。
因此，TGFβ1的高亲和性、亚型特异性抑制剂(例如本文所述的那些)可用于阻断该过程以抵抗涉及ECM改变的疾病进展，例如纤维化、肿瘤生长、侵袭、转移和增生。这样的抑制剂的LTBP臂可直接阻断由LTBP1和/或LTBP3呈递的ECM相关前/潜在TGFβ1复合物，从而防止从疾病生态位中的复合物中激活/释放生长因子。在一些实施方式中，高亲和性、亚型特异性TGFβ1抑制剂可以使ECM的硬度正常化，以治疗涉及整联蛋白依赖性信号传导的疾病。在一些实施方式中，整联蛋白包含α11链、β1链或者两者。ECM的架构(例如，ECM组分和组织结构)也可以通过基质相关蛋白酶来改变。
如Lampi和Reinhart-King(Science Translational Medicine,10(422):eaao0475,“Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease:Frommolecular mechanisms to clinical trials”)所综述的，在癌症、纤维化和心血管疾病的病理进展期间出现了组织ECM的硬度增加。与该过程相关的机械性质涉及表型转化成肌成纤维细胞、TGFβ和基质交联。在癌症和纤维化疾病期间ECM硬度增加的主要原因是由已去分化成肌成纤维细胞(例如，CAF和FAF)的激活的成纤维细胞引起的基质合成和重塑失调。肿瘤基质和器官纤维化的重塑表现出与伤口愈合应答的惊人相似之处，除了在病理状态下应答是持续的以外。肌成纤维细胞是异质性细胞群，其病理特异性前体细胞来自多种细胞来源，如骨髓来源和组织驻留细胞。常用的肌成纤维细胞标志物包括α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。如本文所示，在体内研究中，高亲和性、亚型特异性TGFβ1抑制剂能够降低ACTA2表达(其编码)α-SMA、胶原以及FN(纤连蛋白)。纤连蛋白对于在将LTBP相关的proTGFβ1复合物锚定到基质结构上是重要的。
众所周知，TGFβ通路在ECM调节中的重要性。由于TGFβ1(和TGFβ3)能够被某些整联蛋白(例如，αv整联蛋白)机械激活，因而整联蛋白-TGFβ1相互作用已成为治疗靶点。例如，目前正在研究针对αvβ6的单克隆抗体用于特发性肺纤维化。然而，这种方法也可能会干扰具有相同整联蛋白结合基序RGD的TGFβ3信号传导，并且此外，这种抗体将无法有效阻断通过其他模式(如蛋白酶诱导的激活)激活的TGFβ1。相比之下，高亲和性、亚型特异性TGFβ1抑制剂能够阻断TGFβ1的蛋白酶依赖性激活(图5A和图5B)，以及TGFβ1的整联蛋白依赖性激活(图1-4和图33B)。因此，TGFβ1的高亲和性亚型选择性抑制剂可以提供优越的属性。本文提供的数据以及申请人此前的工作支持TGFβ1的高亲和性亚型选择性抑制剂可以有效治疗与ECM硬化相关的疾病。
因此，本发明包括TGFβ1的高亲和性亚型选择性抑制剂在受试者中治疗与基质硬化相关的疾病，或用于降低基质硬度的方法中的治疗用途。此类用途包括施用治疗有效量的TGFβ1的高亲和性亚型选择性抑制剂。
涉及蛋白酶的疾病
TGFβ从其潜在复合物中的激活可以由整联蛋白以外力依赖性方式和/或通过蛋白酶触发。证据表明某些类型的蛋白酶可能参与该过程，包括但不限于Ser/Thr蛋白酶，如激肽释放酶、趋化蛋白、弹性蛋白酶、纤溶酶，以及MMP家族的锌金属蛋白酶，如MMP-2、MMP-9和MMP-13，和Adam家族的蛋白酶，如Adam10和Adam17。MMP-2降解基底膜中最丰富的成分，胶原蛋白IV，提高了它在ECM相关的TGFβ1调节中起作用的可能性。已表明MMP-9在肿瘤进展、血管生成、基质重塑和转移(包括在癌症，如乳腺癌)中起重要作用。因此，TGFβ1在ECM中的蛋白酶依赖性激活对于治疗癌症可能是重要的。
激肽释放酶(KLK)是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其包括血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。所述ECM作为结构和信号传导支架和抑制恶性生长的屏障在组织稳态中起作用。KLK可能在降解ECM蛋白和其他可能促进肿瘤扩张和侵袭的成分中发挥作用。例如，KLK1在某些乳腺癌中高度上调，并且可以激活前MMP-2和前MMP-9。KLK2激活潜在TGFβ1，使得与成纤维细胞相邻的前列腺癌允许癌症生长。KLK3作为前列腺癌(PSA)的诊断标志物已被广泛研究。KLK3可以通过将纤溶酶原加工成纤溶酶直接激活TGFβ1，所述纤溶酶通过蛋白水解切割LAP，从而引起TGFβ1生长因子从潜在复合物中释放。KLK6可能是阿尔茨海默病的潜在标志物。
而且，实施例8中提供的数据表明，这样的蛋白酶可以是激肽释放酶。因此，本发明包括在治疗与激肽释放酶或激肽释放酶样蛋白酶相关的疾病的方法中使用TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂是Ab3、Ab6或其衍生物。
已知的TGFβ1激活剂，例如纤溶酶、TSP-1和αVβ6整联蛋白，都与LAP直接相互作用。据推测，LAP的蛋白水解切割可能使LAP-TGFβ相互作用不稳定，从而释放活性的TGFβ1。有人提出，含有54-LSKLRL-59的区域对于维持TGFβ1潜伏状态非常重要。因此，稳定相互作用或阻断LAP蛋白水解切割的试剂(例如，抗体)可能阻止TGFβ激活。
与病况状况(例如，癌症)相关的很多这些蛋白酶通过不同的作用机制起作用。因此，特定蛋白酶或蛋白酶的组合的靶向抑制可以为涉及蛋白酶-TGFβ轴的病况的治疗提供治疗获益。因此，可以预期的是，选择性抑制蛋白酶诱导的TGFβ1激活的抑制剂(例如，TGFβ1抗体)在治疗此类疾病(例如，癌症)中可能是有利的。类似地，取决于所治疗的病况，通过一种蛋白酶而非另一种蛋白对TGFβ1活性的选择性抑制也可能是优选的。
纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，以称为纤溶酶原的前体形式产生。释放后，纤溶酶进入循环并因此在血清中被检测到。血清纤溶酶水平升高似乎与癌症进展相关，可能是通过涉及破坏细胞外基质(例如，基底膜和基质屏障)的机制促进肿瘤细胞运动、侵袭和转移。纤溶酶还可能影响粘附、增殖、凋亡、癌症营养、供氧、血管形成和VEGF激活(Didiasova等，Int.J.Mol.Sci,2014,15,21229-21252)。此外，纤溶酶可以促进巨噬细胞迁移进入肿瘤微环境(Philips等，Cancer Res.2011Nov1；71(21):6676-83和Choong等，Clin.Orthop.Relat.Res.2003,415S,S46-S58)。实际上，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过其促进肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成的能力是良好表征的肿瘤发生的驱动物。
纤溶酶活性主要与ECM的破坏相关。然而，越来越多的证据表明，纤溶酶还调节下游的MMP和TGFβ激活。具体而言，已提议纤溶酶通过蛋白水解酶切割潜在相关肽(LAP)来激活TGFβ，所述肽衍生至TGFβ基因产物的N末端区域(Horiguchi等，J Biochem.2012Oct；152(4):321-9)，导致活性生长因子的释放。由于TGFβ1可能促进癌症进展，因而这增加了纤溶酶诱导的TGFβ激活可能至少部分地介导这一过程的可能性。
TGFβ1还显示出调控uPA的表达，uPA是纤溶酶原转化成纤溶酶的关键因素(Santibanez,Juan F.,ISRN Dermatology,2013:597927)。uPA通过与其细胞表面受体(uPAR)结合并促进纤溶酶原转化成纤溶酶而独立地显示出可促进癌症进展(例如，粘附、增殖和迁移)。而且，研究表明，uPA和/或纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达可预测结直肠癌(D.Q.Seetoo等，Journal of Surgical Oncology,vol.82,no.3,pp.184–193,2003)、乳腺癌(N.Harbeck等，Clinical Breast Cancer,vol.5,no.5,pp.348–352,2004)和皮肤癌(Santibanez,Juan F.,ISRN Dermatology,2013:597927)的不良预后。因此，不希望受到特定理论的束缚，纤溶酶、TGFβ1和uPA之间的相互作用可能会产生一个正反馈环，从而促进癌症进展。因此，选择性抑制剂纤溶酶依赖性TGFβ1激活的抑制剂可能特别适合治疗依赖于纤溶酶/TGFβ1信号传导轴的癌症。
在本发明的一个方面中，本文所述的TGFβ1的亚型特异性抑制剂包括能够抑制TGFβ1的蛋白酶依赖性激活的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂能够以不依赖于整联蛋白的方式抑制蛋白酶依赖性TGFβ1激活。在一些实施方式中，此类抑制剂能够不考虑激活方式而抑制TGFβ1激活，例如，抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和蛋白酶依赖性激活。在一些实施方式中，蛋白酶选自以下：丝氨酸蛋白酶，如激肽释放酶、化学胰蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶以及锌金属蛋白酶(MMP家族)，如MMP-2、MMP-9和MMP-13。
在一些实施方式中，抑制剂能够抑制纤溶酶诱导的TGFβ1激活。在一些实施方式中，抑制剂能够抑制纤溶酶和整联蛋白诱导的TGFβ1激活。在一些实施方式中，抗体是特异性结合proTGFβ1的单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体结合潜在proTGFβ1，从而抑制成熟生长因子从潜在复合物中释放。在一些实施方式中，适于在抑制TGFβ1的纤溶酶依赖性激活的方法中使用的TGFβ1激活的高亲和性、不依赖于背景的抑制剂是Ab6或者其衍生物或变体。
在一些实施方式中，抑制剂(例如，TGFβ1抗体)抑制癌细胞迁移。在一些实施方式中，抑制剂抑制巨噬细胞迁移。在一些实施方式中，抑制剂抑制TAM的累积。
在另一个方面中，本文提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的TGFβ1抑制剂(例如，TGFβ1抗体)，其中所述抑制剂抑制TGFβ1的蛋白酶诱导的激活(例如，纤溶酶)，从而在受试者中治疗癌症。
在另一个方面中，本文提供了一种用于在有需要的受试者中减少肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的TGFβ1抑制剂(例如，TGFβ1抗体)，其中所述抑制剂抑制TGFβ1的蛋白酶诱导的激活(例如，纤溶酶)，从而在受试者中减少肿瘤生长。
癌症/恶性肿瘤
各种癌症涉及TGFβ1活性和可与本发明的抗体和/或组合物来治疗。如本文所用，术语“癌症”是指与TGFβ1阳性细胞相关的各种恶性肿瘤中的任何一种。此类恶性肿瘤的特征在于倾向于侵入周围组织并转移至新的身体部位的间变性细胞的增殖，并且还指以这种恶性肿瘤生长为特征的病理状况。TGFβ1的来源可以变化，并且可以包括恶性肿瘤(癌细胞)细胞本身，以及其周围或支持细胞/组织，包括，例如，细胞外基质、各种免疫细胞及其任何组合。
进行本文所述的治疗方法不需要将癌症确定地鉴定为“TGFβ1阳性”。通常，基于可靠的证据，某些癌症类型已知或疑似与TGFβ1信号传导相关。
癌症可以是局部的(例如，实体瘤)或全身性的。在本公开的上下文中，术语“局部化”(如在“局部肿瘤”中)是指解剖学上分离的或可分离的异常/损伤，例如实体恶性肿瘤，与全身性疾病相反(例如，也称为液体肿瘤或血癌)。某些癌症，例如某些白血病(例如，骨髓纤维化)和多发性骨髓瘤，例如可能具有疾病的局部组分(例如骨髓)和全身组分(例如循环血细胞)。在一些实施方式中，癌症可以是全身性的，例如血液恶性肿瘤。可根据本公开治疗的癌症是TGFβ1阳性的并且包括但不限于所有类型的淋巴瘤/白血病，癌和肉瘤，例如在肛门、膀胱、胆管、骨、脑、乳腺、子宫颈、结肠/直肠、子宫内膜、食道、眼、胆囊、头颈部、肝脏、肾脏、喉、肺、纵隔(胸部)、口腔、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、小肠、胃、脊髓、尾骨、睾丸、甲状腺和子宫中发现的癌症或肿瘤。在一些实施方式中，癌症可以是晚期癌症，如局部晚期实体瘤和转移性癌症。
可以将本公开涵盖的抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症，包括但不限于：骨髓纤维化、黑色素瘤、辅助黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、膀胱癌、结直肠癌(CRC)、结肠癌、直肠癌、肛门癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、HER2阴性乳腺癌、BRCA突变的乳腺癌、血液系统恶性肿瘤、非小细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、扩散期小细胞肺癌(ES-SCLC)、淋巴瘤(经典霍奇金氏和非霍奇金氏)、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、组织细胞肉瘤、滤泡树突状细胞肉瘤、指突状树突状细胞肉瘤、骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、头颈癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌、梅克尔细胞皮肤癌、具有高微卫星不稳定度(MSI-H)的癌症、具有错配修复缺陷(dMMR)的癌症、间皮瘤、胃癌、胃食道结合癌(GEJ)、胃腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道基质肿瘤(GIST)、胃贲门腺癌、肾癌、胆道癌、胆管癌、胰腺癌、前列腺癌、腺癌、鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、宫颈癌、腹膜癌、胃癌、脑癌、恶性胶质瘤、胶质母细胞瘤、胶质肉瘤、神经母细胞瘤、甲状腺癌、肾上腺皮质癌、口腔上皮内赘生物、食道癌、鼻腔和副鼻窦鳞状细胞癌、鼻咽癌、唾液腺癌、肝癌和肝细胞癌(HCC)。然而，如通过例如活检所确定的，其中TGFβ1过表达或至少是主要亚型的任何癌症(例如，患有此类癌症的患者)可以用根据本公开的TGFβ1的亚型选择性抑制剂治疗。
在癌症中，TGFβ(例如，TGFβ1)可以是生长促进剂或生长抑制剂。例如，在胰腺癌中，SMAD4野生型肿瘤可响应于TGFβ而经历抑制的生长，但随着疾病的进展，通常存在组成型激活的II类受体。另外，存在SMAD4缺失的胰腺癌。在一些实施方式中，设计本公开的抗体、其抗原结合部分和/或组合物以选择性地靶向在一种或多种形式的癌症中独特地起作用的TGFβ信号传导通路的组分。白血病，或以白细胞(即白血球)异常增殖为特征的血液或骨髓癌可分为四种主要类型，包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病骨髓性白血病或急性髓性白血病(AML)带有第10和11号染色体之间[t(10，11)]、第8和21号染色体之间[t(8；21)]、染色体15和17之间[t(15；17)]易位的和第16号染色体反转[inv(16)]的AML；多线性发育不良的AML，其包括患有转变为AML的既往骨髓增生异常综合征(MDS)或骨髓增生性疾病的患者；治疗相关的AML和骨髓增生异常综合征(MDS)，其类别包括先前已接受过化疗和/或放疗并随后发生AML或MDS的患者；d)未另行分类的AML，其包括不属于上述类别的AML亚型；和e)模糊谱系的急性白血病，其当白血病细胞不能被分类为骨髓细胞或淋巴样细胞或存在两种类型的细胞时发生；和慢性粒细胞白血病(CML)。
在一些实施方式中，上述提及的TGFβ1阳性癌症中的任何一种也可以是TGFβ3阳性的。在一些实施方式中，TGFβ1阳性和TGFβ3阳性的肿瘤可以是TGFβ1/TGFβ3共显性的。在一些实施方式中，此类癌症是包括实体瘤的癌瘤。在一些实施方式中，此类肿瘤是乳腺癌。在一些实施方式中，乳腺癌可以是三阴性基因型(三阴性乳腺癌)。在一些实施方式中，患有TGFβ1阳性癌症的受试者具有升高的MDSC水平。例如，此类肿瘤可以包含募集至肿瘤部位的MDSC，导致MDSC浸润物数量增加。在一些实施方式中，患有乳腺癌的受试者显示出升高的C反应蛋白(CRP)水平，这是一种与复发和预后较差相关的炎症标志物。在一些实施方式中，患有乳腺癌的受试者显示出升高的IL-6水平。
本发明的亚型选择性TGFβ1抑制剂可以用于治疗患有慢性髓性白血病的患者，这是一种干细胞疾病，其中认为BCR/ABL癌蛋白对于赘生性细胞的异常生长和累积是必需的。伊马替尼是一种治疗这种病况的已获批疗法；然而，相当一部分髓性白血病患者显示出伊马替尼抗性。由抑制剂(如本文所述的那些)实现的TGFβ1抑制可增强再增殖/扩增，以抵抗BCR/ABL驱动的赘生性细胞的异常生长和累积，从而提供临床获益。
如本文所述的那些TGFβ1的亚型特异性抑制剂可用于治疗多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是在骨髓中发展和扩展，导致破坏性骨损伤(即，溶骨性病变)的B淋巴细胞(例如，浆细胞、浆母细胞、记忆B细胞)的癌症。通常，该疾病表现出增强的破骨细胞骨吸收，抑制成骨细胞分化(例如，分化停滞)和骨形成受损，其部分特征在于溶骨性病变、骨质减少、骨质疏松症、高钙血症，以及浆细胞瘤、血小板减少症、中性粒细胞减少症和神经病。本文所述的TGFβ1选择性、不依赖于背景的抑制剂疗法可有效改善患者中的一种或多种这样的临床表现或症状。TGFβ1抑制剂可以施用至接受另外的一种或多种疗法以治疗多发性骨髓瘤的患者，包括本文其他地方列出的那些。在一些实施方式中，可以用TGFβ1抑制剂(例如亚型特异性不依赖于背景的抑制剂)与肌肉生长抑制素抑制剂或IL-6抑制剂组合治疗多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可以与传统的多发性骨髓瘤疗法联合使用，例如硼替佐米、来那度胺、卡非佐米、泊马度胺、沙利度胺、多柔比星、皮质类固醇(例如，地塞米松和泼尼松)、化学疗法(例如，美法仑)、放射疗法、干细胞移植、plitidepsin、艾洛珠单抗、伊沙佐米、马赛替尼和/或帕比司他。
可通过本发明的方法治疗的癌的类型包括但不限于，乳头状瘤/癌、绒毛膜癌、内胚窦瘤、畸胎瘤、腺瘤/腺癌、黑色素瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、胶质瘤、淋巴瘤/白血病、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、基底细胞癌和鼻腔鼻窦未分化癌。
肉瘤的类型包括但不限于，软组织肉瘤，例如肺泡软组织肉瘤、血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、增生性小圆细胞瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤(原始神经外胚层肿瘤)、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软骨肉瘤。
如本文所述的那些亚型选择性、不依赖于背景的TGFβ1激活的抑制剂可适用于治疗涉及神经嵴来源的细胞恶性肿瘤。神经嵴谱系的癌症(即神经嵴衍生肿瘤)包括但不限于：黑色素瘤(黑素细胞癌)、神经母细胞瘤(交感神经肾上腺癌)、神经节细胞瘤(周围神经系统神经节癌)、延髓甲状腺癌(甲状腺C细胞癌)、嗜铬细胞瘤(肾上腺髓质嗜铬细胞癌)和MPNST(雪旺氏细胞癌)。在一些实施方式中，本公开的抗体和方法可用于治疗一种或多种类型的癌症或癌症相关病症，其可包括但不限于结肠癌、肾癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤和成胶质细胞瘤(Schlingensiepen等，2008；Ouhtit等，2013)。
在正常情况下，调节性T细胞(Treg)代表总体CD4阳性淋巴细胞群的一小部分，并在维持内稳态免疫系统方面发挥关键作用。然而，在几乎所有癌症中，Treg的数量显著增加。尽管Treg在抑制健康个体的免疫应答中起着重要作用，但癌症中Treg数量的增加与不良预后相关。癌症中升高的Treg可能会削弱宿主的抗癌免疫力，并可能导致肿瘤进展、转移、肿瘤复发和/或治疗抗性。例如，人卵巢癌腹水被Foxp3+GARP+Treg浸润(Downs-Canner等，Nat Commun.2017,8:14649)。类似地，Treg与晚期肝细胞癌中更具免疫抑制和更具侵袭性的表型正相关(Kalathil等，Cancer Res.2013,73(8):2435-44)。Treg能够抑制效应T细胞的增殖(图26B)。此外，Treg通过产TGFβ1对免疫细胞(例如，初始CD4+T细胞)进行接触依赖性抑制(参见例如图26A)。因此，为对抗肿瘤，抑制Treg是有利的，因此足够的效应T细胞可用于发挥抗肿瘤作用。
越来越多的证据揭示巨噬细胞在肿瘤/癌症进展中的作用。本发明包括这样的观点，即这是由疾病环境例如TME中的TGFβ1激活部分地介导的。为响应于肿瘤来源的细胞因子/趋化因子(如CCL2、CCL3和CCL4)，骨髓来源的单核细胞(例如，CD11b+)被募集到肿瘤位点，单核细胞在这里经历分化和极化以获得前癌表型(例如，M2偏向的或M2样巨噬细胞，TAM)。如此前所证实的(WO 2018/129329)，从人PBMC分离的单核细胞可以被诱导以极化成巨噬细胞的不同的亚型，例如，M1(促纤维化、抗癌)和M2(前癌)。许多肿瘤中的大多数TAM是M2偏向的。在M2样巨噬细胞中，发现M2c和M2d亚型而非M1，在细胞表面上表达升高的LRRC33。而且，巨噬细胞可通过某些细胞因子暴露(如M-CSF)进一步偏向或激活，导致LRRC33表达的显著增加，其与TGFβ1表达一致。患有骨髓增生性疾病(例如，骨髓纤维化)的患者中也观察到增加的循环M-CSF(即，血清M-CSF浓度)。通常，具有高巨噬细胞(TAM)和/或MDSC浸润的肿瘤与不良预后相关。类似地，升高的M-CSF水平也表明预后不良。因此，可以将高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂(如本文中涵盖的那些)用于治疗其特征为前癌巨噬细胞和/或MDSC水平升高的癌症。抑制剂的LRRC33臂可以至少部分地介导其对疾病相关的免疫抑制髓样细胞(例如，M2巨噬细胞和MDSC)的抑制作用。
在本文所述的小鼠同系肿瘤模型中再现了与肿瘤相关的M2巨噬细胞的高流行率。在MBT-2肿瘤中，例如，近40％的从已建立的肿瘤中分离出的CD45阳性细胞是M2巨噬细胞(图28B)。在用高亲和性、亚型选择性TGFβ1和抗PD-1的组合治疗的动物中，其减少一半。相比之下，在相同动物中未观察到肿瘤相关的M1巨噬细胞数量的显著变化。像M2巨噬细胞一样，肿瘤相关的MDSC在已建立的肿瘤中也升高(占CD45+细胞的约10-12％)，并且通过在治疗的动物中同时抑制PD-1和TGFβ1而显著减少(至可忽略的水平)(图28B)。如本文所公开的，大多数肿瘤浸润的M2巨噬细胞和MDSC表达细胞表面LRRC33和/或LRRC33-proTGFβ1复合物(图28和图28D)。有趣的是，LRRC33(或LRRC33-proTGFβ1复合物)的细胞表面表达似乎受到高度调控。高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂Ab6能够在表达LRRC33和proTGFβ1的细胞中迅速内化，并且Ab6所实现的内化速率明显高于识别细胞表面LRRC33的参照抗体(图6)。从原代人巨噬细胞中获得了相似结果。这些观察结果表明，Ab6在结合其靶点LRRC33-proTGFβ1时可以促进内化，从而从细胞表面除去含LRRC33的复合物。因此，高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂(如Ab6)的靶点接合可以诱导靶蛋白(例如，细胞相关的proTGFβ1复合物)的抗体依赖性下调。在疾病位点，这可能会降低可激活的潜在LRRC33-proTGFβ1水平的可用性。因此，亚型选择性TGFβ1抑制剂可以通过双重作用机制抑制TGFβ1的LRRC33臂：i)阻断成熟生长因子从潜在复合物中释放；和，ii)通过内化从细胞表面除去LRRC33-proTGFβ1复合物。在肿瘤微环境中，抗体可以靶向细胞相关的潜在proTGFβ1复合物，加强对靶细胞的抑制作用，如M2巨噬细胞(例如，TAM)、MDSC和Treg。在表型上，这些是免疫抑制细胞，有助于免疫抑制肿瘤微环境，其至少部分地由TGFβ1通路介导。鉴于很多肿瘤都富含这些细胞，因此能够靶向TGFβ1功能的多个臂的抗体应具有功能优势。
与健康对照相比，已知很多人类癌症会引起患者中MDSC水平的升高(例如，在Elliott等，(2017)“Human tumor-infiltrating myeloid cells:phenotypic andfunctional diversity”Frontiers in Immunology,Vol.8,Article 86中综述)。这些人类癌症包括但不限于：膀胱癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑色素瘤、NSCL、卵巢癌、胰腺癌和肾细胞癌。可以在生物样品中检测到MDSC水平升高，如外周血单核细胞(PBMC)和组织样品(例如，肿瘤活检)。例如，可以使用适宜的细胞表面标志物(表型)将MDSC数量的频率或变化测量为：总PBMC的百分比(％)、CD14+细胞的百分比(％)、CD45+细胞的百分比(％)；单核细胞的百分比(％)、总细胞的百分比(％)、CD11b+细胞的百分比(％)、单核细胞的百分比(％)、非淋巴细胞MNC的百分比(％)、KLA-DR细胞的百分比(％)。
另一方面，浸润到肿瘤中的巨噬细胞也可以表示治疗的疗效。如在图23、图24和图27B中所示例的，在使用检查点抑制剂和不依赖于背景的TGFβ1抑制剂的组合治疗后，肿瘤被效应T细胞(例如，CD8+T细胞)有效穿透。瘤内效应T细胞会引起清除细胞碎片的吞噬单核细胞/巨噬细胞的募集。
如从图23清楚可见，与单独的抗PD-1治疗相比，抗PD-1和TGFβ1抑制剂的组合可导致整个肿瘤中强劲的CD8 T细胞内流/扩增。相应地，可以通过联合治疗实现CD8效应基因的显著增加。因此，本发明的TGFβ1抑制剂可以用于促进效应T细胞浸润到肿瘤中。
此外，观察到F4/80阳性巨噬细胞对肿瘤的广泛浸润/扩增(见图24)。这可能表明M1(抗肿瘤)巨噬细胞清除了由细胞毒性细胞产生的癌细胞碎片，并且可能是TGFβ1抑制的直接结果。如在本文的实施例中更加详细描述的，这些肿瘤浸润巨噬细胞主要由于缺乏CD163表达而被鉴定为非M2巨噬细胞，表明在检查点抑制剂和TGFβ1抑制剂治疗后，循环单核细胞被募集到肿瘤部位并分化为M1巨噬细胞，并且该观察结果伴随着CD8+T细胞显著流入肿瘤部位。因此，本发明的TGFβ1抑制剂可以用于增加与肿瘤相关的非M2巨噬细胞。
最近，检查点阻断疗法(CBT)已成为治疗多种癌症类型的标准治疗(参见，例如，图20B)。尽管癌症免疫疗法取得了长足进步，但对CBT的原发性抗性仍是患者主要的未满足的需求；大多数患者的癌症仍无法对PD-(L)1抑制产生应答。最近对尿路上皮癌和黑色素瘤肿瘤的回顾性分析表明，TGFβ激活是原发性抗性的潜在驱动因素，其很可能是通过多种机制，包括从肿瘤中排除细胞毒性T细胞以及其在肿瘤微环境中的扩增(免疫排除)。这些观察结果和随后的临床前验证已表明，TGFβ通路抑制是克服对CBT的原发性抗性的有希望的途径。然而，剂量限制的临床前心脏毒性已经阻碍了TGFβ通路的治疗性靶向，这很可能是由于抑制了一个或多个TGFβ亚型的信号传导所致。
很多肿瘤缺乏对CBT的原发性应答。在这种情形下，通常将CD8+T细胞排除在肿瘤实质之外，这表明肿瘤可能会共同利用TGFβ信号传导的免疫调节功能来产生免疫抑制微环境。回顾性临床肿瘤样本分析的这些观点为研究TGFβ信号传导在对CBT的原发性抗性中的作用提供了理论依据。
基于本研究的结果，可以得出几个关键结论。首先，TCGA数据的基因表达分析表明，TGFβ1是大多数人类肿瘤类型中最普遍的亚型，因此是这些肿瘤中TGFβ信号传导的最可能的驱动物，因而是免疫抑制的罪魁祸首。
其次，TGFβ1激活的选择性抑制似乎足以克服对CBT的原发性抗性。通过靶向潜在TGFβ1的前结构域，TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂在所有已知的分子环境中均可以实现出色的亚型特异性并抑制潜在TGFβ1激活。在同系肿瘤模型中对一种此类抗体的药理学评价表明，用这种抗体进行治疗足以使抗PD-1抗性肿瘤对检查点阻断疗法敏感。重要的是，在三种不同肿瘤类型中显示了抗PD-1/TGFβ1抑制剂组合的抗肿瘤功效，包括其中TGFβ1并不是肿瘤中存在的唯一TGFβ亚型的一个模型。这表明，在肿瘤微环境中，TGFβ1可能具有免疫调节作用，而其他亚型可能与该生物学作用无关。该观察结果揭示了选择性TGFβ1抑制可能具有治疗潜力，可以在广泛的癌症谱中克服对CBT的原发性抗性，而与其他TGFβ亚型的表达无关。
第三，与所有亚型活性的广泛抑制相比，TGFβ1驱动通路活性的选择性抑制可显著提高临床前安全性。与广泛TGFβ通路抑制相关的多效性效应阻碍了TGFβ通路的治疗靶向。迄今为止，大多数试验性治疗药物(例如，戈鲁色尼(galunisertib)、LY3200882、夫苏木单抗(fresolimumab))对单一TGFβ亚型缺乏选择性，可能会导致在非临床和临床研究中发现剂量限制性毒性。来自TGFβ2或TGFβ3基因的基因敲除小鼠和人类功能丧失突变的遗传数据表明，使用非特异性TGFβ抑制剂观察到的心脏毒性可能是由于TGFβ2或TGFβ3的抑制所致。本公开教导了使用这种抗体对TGFβ1激活的选择性抑制具有改善的安全性性质，并且当与PD-1阻断组合时足以引起显著的抗肿瘤应答，从而能够在临床可治疗剂量水平上评价TGFβ1抑制剂的功效。
为了剖析TGFβ1抑制剂/抗PD-1联合治疗期间与抗肿瘤免疫相关的免疫学过程，对MBT-2膀胱癌模型中的应答进行了更详细的分析。同时阻断PD-1和TGFβ1活性可导致肿瘤内免疫环境发生显著变化，这主要是由CD8+T细胞增加10倍引起的。这些CD8+T细胞可能参与了肿瘤细胞的杀伤，通过联合治疗，关键细胞溶解基因穿孔素和颗粒酶B在肿瘤中也被上调。值得注意的是，考虑到TGFβ信号传导对于维持外周Treg的重要性，通过与抗PD-1/TGFβ1抑制剂联合治疗而显著富集Treg细胞是有些出人意料的。然而，随着Treg细胞被募集到炎症部位，可以将其数量的增加解释为是强大免疫应答的标志物。尽管如此，尽管Treg细胞数量增加，但是CD8+T细胞仍能采用激活的表型，并引发强烈的抗肿瘤应答。一个潜在的解释可能是Treg细胞对免疫抑制MBT-2肿瘤微环境没有显著贡献，而其他抑制性免疫细胞群体(例如髓样细胞)起着更重要的作用。或者，并且鉴于TGFβ1是Treg驱动的免疫抑制的关键介质，因此并不排除这种可能性，尽管Treg数量增加，但TGFβ1抑制剂的存在也可能会消除这种活性。
本文提供的令人吃惊的发现包括CD8+T细胞与CD31+肿瘤脉管系统具有紧密联系的组织学观察结果。这种富集模式支持以下假设：T细胞进入肿瘤的关键途径是通过肿瘤脉管系统，一旦细胞从肿瘤血管中渗出，细胞便开始径向向外迁移到肿瘤中。Mariathasan等发现，在EMT-6乳腺癌模型的肿瘤前沿，CD8+T细胞似乎沿着胶原蛋白基质和富含成纤维细胞的层堆积，从而推测该基质有助于T细胞排除。而与该观察结果相反的是，不可能一致地检测到MBT-2肿瘤前缘附近的致密成纤维细胞区域。申请人对紧邻脉管系统的T细胞富集的观察结果(例如，血管周围富集)表明，除了与癌症相关的成纤维细胞层外，TGFβ1反应性血管内皮细胞或紧邻内皮细胞的其他细胞也可能产生免疫排除。与TGFβ1信号传导可能影响内皮功能的可能性一致，申请人的观察结果包括，在对照肿瘤中磷酸-SMAD3染色在看似肿瘤血管内皮细胞的细胞核中最强。这种染色对选择性TGFβ1抑制很敏感，表明这些细胞对TGFβ1有应答，这可能是增强免疫排除的关键，也许是通过调节血管屏障完整性来影响T细胞外渗。此外，还已经描述了与肿瘤相关的巨噬细胞与肿瘤脉管系统非常接近，并且可以通过激活TGFβ1或通过释放其他免疫抑制表明蛋白或在脉管系统附近分泌的因子来参与产生免疫排除的肿瘤微环境。T细胞进入肿瘤的多种途径可能正在发挥作用，并且更好地了解这些机制将有助于鉴定新的治疗靶点或揭示可能的肿瘤耐药机制。
除了预期的和观察到的对肿瘤内细胞毒性T细胞分布的影响之外，TGFβ1抑制剂/抗PD-1联合治疗还有益地影响了免疫抑制髓样区室。在未治疗的MBT-2肿瘤中，CD11b+髓样细胞占免疫浸润物的近80％，但在联合治疗后，其表达降至低于40％。这完全是由M2样免疫抑制巨噬细胞的丧失和MDSC更大幅度的减少所致，而促炎性M1样巨噬细胞的表达保持不变。联合治疗驱动免疫抑制性髓样细胞特异性减少的机制尚不清楚，因为TGFβ1信号传导在肿瘤微环境中募集、发育或维持这些细胞的作用也不清楚。众所周知，除了其他因素以外，TGFβ信号传导使巨噬细胞极化成M2样。此外，有证据表明，TGFβ部分地负责MDSC发育和抑制功能的获得。此外，分泌IFNγ的T细胞内流与改变的肿瘤微环境配对可能有助于重新极化和减少免疫抑制性髓样细胞的运输。不管潜在机制是什么，作为作为肿瘤免疫治疗方法的一部分，都希望减少肿瘤内免疫抑制性髓样细胞，因为这种细胞群的存在与患者预后不良和对检查点阻断疗法的抗性有关。因此，包括靶向这些重要免疫抑制细胞类型的治疗策略可能比靶向肿瘤微环境中单一免疫抑制细胞类型(即，仅Treg细胞)具有更好的效果。因此，本发明的TGFβ1抑制剂可以用于减少肿瘤相关的免疫抑制细胞，如M2巨噬细胞和MDSC。
如此前所述，重要的是需要注意，TGFβ1可能在肿瘤微环境中由多种细胞类型表达，包括Treg细胞、抑制性髓样细胞、成纤维细胞以及肿瘤细胞。这些细胞来源的每一种均在不同LLC中产生TGFβ1：激活的Treg细胞在其表面上表达GARP LLC；抑制性髓样细胞在其表面上表达LRRC33 LLC，以及成纤维细胞可能表达LTBP LLC并将其沉积到周围的细胞外基质中。这些“可激活的”TGFβ1来源均可能在促进肿瘤中的免疫排除和免疫抑制中发挥作用，并且每种来源的相对贡献可能因不同的肿瘤类型而异。有趣的是，对在这些研究中使用的MBT-2和EMT6肿瘤的mRNA性质分析表明，LRRC33和LTBP1是表达最高的LLC组分，而CloudmanS91肿瘤似乎仅表达LRRC33(图20H)。因此，在这些模型中，TGFβ1选择性抑制剂/抗PD-1的组合具有更强的抗肿瘤作用，以及本文所揭示的TGFβ1抑制剂在所有已知LLC背景下有效阻断TGFβ1激活的能力，强烈暗示了特定LLC(例如，在Treg细胞上的GARP)的选择性抑制可能不足以在某些肿瘤中产生最大的抗肿瘤应答。
因此，本文提供的临床前研究和结果表明，对TGFβ1激活的高度特异性抑制使宿主免疫系统能够克服对检查点阻断疗法的原发性抗性的关键机制，同时避免了此前公认的更广泛的TGFβ抑制作用所产生的毒性，而这种毒性已成为临床应用的关键限制。本文公开的结果表明，用高亲和性TGFβ1抑制剂治疗可以有意义地扩大可受益于检查点阻断疗法的患者人数。
因此，如本文实施例所示例的，TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂能够用于对抗对CBT的原发性抗体，从而使肿瘤/癌症对CBT更加敏感。这种作用可适用于治疗广谱的恶性肿瘤类型，其中癌症/肿瘤是TGFβ1阳性的。在一些实施方式中，此类肿瘤/癌症可以进一步表达其他亚型，如TGFβ3。后者的非限制性实例可以包括某些类型的癌症，如乳腺癌。
因此，本发明提供了优选的选择标准，用于鉴定或选择TGFβ1的高亲和性、不依赖于背景的抑制剂可能实现临床获益的患者或患者群体/亚群。在一些实施方式中，人肿瘤的适宜表型包括：i)已显示对CBT具有响应的一个或多个子集(例如，PD-(L)1轴阻断)；ii)有免疫排除的证据；和/或，iii)有TGFB1表达和/或TGFβ信号传导的证据。各种癌症类型都适合这种情况，包括，例如，黑色素瘤和膀胱癌。
如上所述，TGFβ1激活的不依赖于背景的抑制剂可在黑色素瘤的治疗中使用。可用这样的抑制剂治疗的黑色素瘤类型包括但不限于：恶性黑色素；恶性雀斑样痣黑色素瘤；浅表性黑色素瘤；肢端黑色素瘤；粘膜黑色素瘤；结节性黑色素瘤；息肉样黑色素瘤和促纤维增生性黑色素瘤。在一些实施方式中，黑色素瘤是转移性黑色素瘤。
最近，免疫检查点抑制剂已被用于有效地治疗晚期黑色素瘤患者。特别地，抗程序性死亡(PD)-1抗体(例如，纳武单抗和派姆单抗)现已成为对某些类型癌症的治疗标准，如晚期黑色素瘤，其已经证实显著活性和持久响应，具有可管理的毒性特征。然而，PD-1拮抗剂的有效临床应用受到高比率(约60-70％)的先天性抗性的阻碍(参见Hugo等，(2016)Cell165:35-44)，说明持续的挑战继续包括患者的选择和响应与抵抗的预测因子以及优化组合策略的问题(Perrot等，(2013)Ann Dermatol25(2):135-144)。而且，研究表明，最初对抗PD-1疗法有响应的黑色素瘤患者中大约有25％最终产生获得性抗性(Ribas等，(2016)JAMA315:1600-9)。
表达PD-1和/或CTLA-4的肿瘤浸润性CD8+T细胞的数量似乎是检查点抑制成功的关键指标，并且PD-1和CTLA-4两者的阻断均可增加浸润性T细胞。然而，在具有较高肿瘤相关巨噬细胞的患者中，CD8细胞的抗癌作用可能被抑制。
可以预期，LRRC33表达细胞(例如髓样细胞，包括骨髓前体、MDSC和TAM)可以通过抑制T细胞(例如，T细胞耗尽)，例如CD4和/或CD8 T细胞创建或支持免疫抑制环境(如TME和骨髓纤维化骨髓)，其可以至少部分地强化在某些患者群体中观察到的抗PD-1抗性。实际上，证据表明抗PD-1单一疗法的抗性表现为未能积累CD8+细胞毒性T细胞和恢复Teff/Treg比率。值得注意的是，本发明的发明人已经认识到某些癌症患者中存在分歧，如黑色素瘤患者群体，在LRRC33表达水平方面：一组表现出高LRRC33表达(LRRC33高)，而另一组显示出相对低的LRRC33表达(LRRC33低)。因此，本发明包括以下观点：LRRC33高患者群体可代表对免疫检查点抑制剂治疗响应差或对其具有抗性的那些人。因此，例如本文所述的那些抑制LRRC33的试剂可特别有益于治疗对检查点抑制剂治疗具有抗性的癌症(例如，抗PD-1)，例如黑色素瘤、淋巴瘤和骨髓增生性疾病。
在一些实施方式中，癌症/肿瘤先天地抵抗或不响应免疫检查点抑制剂(例如，原发性抗性)。仅举一例，某些淋巴瘤似乎对免疫检查点抑制(如抗PD-1治疗)的响应差。类似地，已知黑色素瘤患者群体的子集显示出对免疫检查点抑制剂的抗性。无意受特定理论的束缚，本公开的发明人考虑到这可能至少部分地归因于TGFβ1信号传导通路的上调，其可能产生检查点抑制剂在这里不能发挥其作用的免疫抑制微环境。TGFβ1抑制可以使这种癌症对检查点抑制剂疗法更具响应性。可以从免疫检查点抑制剂和TGFβ1抑制剂的组合中受益的癌症类型的非限制性实例包括：骨髓纤维化、黑色素瘤、肾细胞瘤、膀胱癌、结肠癌、恶性血液病、非小细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤(经典霍奇金和非霍奇金)、头颈部癌、膀胱上皮癌、直肠癌的高微不稳定、癌错配修复缺陷、胃癌、肾癌和肝细胞癌。然而，其中TGFβ1是过表达的或者是超过TGFβ2/3的主导亚型的任何癌症(例如，患有这样的癌症的患者)，如通过例如活检确定，可以按照本公开的TGFβ1的亚型选择性抑制剂进行治疗。
在一些实施方式中，癌症/肿瘤随时间变得具有抗性。这种现象称为获得性抗性或适应性抗性。与固有抗性一样，在一些实施方式中，获得性抗性至少部分由TGFβ1依赖性途径介导，本文所述的亚型特异性TGFβ1抑制剂在这些病例中可有效恢复抗癌免疫力。本发明的TGFβ1抑制剂可以用于减少肿瘤复发。本发明的TGFβ1抑制剂可以用于增强癌症疗法(如CBT)的持久性。在疗法的背景下使用的术语“持久性”指临床效应(例如，肿瘤控制)和肿瘤再生长(例如，复发)之间的时间。据推测，持久性和复发可能与继发性或获得性耐药相关，在这种情况下，患者最初对其产生应答的疗法停止起作用。因此，本发明的TGFβ1抑制剂可以用于增强癌症疗法仍有效的持续时间。本发明的TGFβ1抑制剂可以用于降低在该疗法的应答者中产生获得性抗性的可能性。本发明的TGFβ1抑制剂可以用于增强患者的无进展生存期。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ1抑制剂可以用于改善癌症质粒的应答者中完全缓解对比部分缓解的比例或比率。通常，即使在对癌症疗法(如CBT)的应答率较高(例如，≥35％)的癌症类型中，CR率也相当低。因此，本发明的TGFβ1抑制剂用于增强应答者人群中完全应答者的分数。
此外，抑制剂也可以有效增强或放大部分应答者中部分缓解的程度。
在一些实施方式中，其包含免疫检查点抑制剂和LRRC33抑制剂(如本文所述)的联合疗法对治疗这样的癌症有效的。此外，高LRRC33阳性细胞浸润的肿瘤，或者具有异常细胞增殖的位点/组织，可以用作宿主的免疫抑制和免疫检查点抗性的生物标志物。类似地，效应T细胞可以从限制了机体对抗癌症的能力的免疫抑制性生态位中排除。而且，如下文实施例部分所示，表达GARP呈递的TGFβ1的Treg抑制效应T细胞增殖。总之，TGFβ1可能是产生和维护免疫抑制性疾病微环境(如TME)中的关键驱动，并且多种TGFβ1呈递背景与肿瘤相关。在一些实施方式中，联合疗法可以实现更有利的Teff/Treg比率。
在一些实施方式中，特异性结合本文所述的GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分可在治疗有此需要的受试者的癌症的方法中使用，所述方法包括将抗体或其抗原结合部分施用至受试者以治疗癌症。在某些实施方式中，癌症是结肠癌。在某些实施方式中，癌症是黑色素瘤。在某些实施方式中，癌症是膀胱癌。在某些实施方式中，癌症是头颈癌。在某些实施方式中，癌症是肺癌。
在一些实施方式中，特异性地结合本文所述的GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物，和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分可在治疗实体瘤的方法中使用。在一些实施方式中，实体瘤可以是通常是致密的并且难以使治疗性分子穿透的增生性肿瘤。通过靶向这样的肿瘤的ECM组分，这样的抗体可“松散”致密肿瘤组织以使其崩解，促进治疗途径以发挥其抗癌作用。因此，可以组合使用其他治疗剂，例如任何已知的抗肿瘤药物。
另外地或可替代地，如本文中公开的那些能够抑制TGFβ1激活的亚型特异性、不依赖于背景的抗体或其片段可与嵌合抗原受体T细胞(“CAR-T”)技术共同使用作为基于细胞的免疫疗法，例如用于抵抗癌症的癌症免疫疗法。
在一些实施方式中，如本文所述的特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分可在患有实体瘤的受试者中用于抑制或减少实体瘤生长的方法中使用，所述方法包括将抗体或其抗原结合部分施用至受试者，从而使实体瘤生长得到抑制或减少。在某些实施方式中，实体瘤是结肠癌肿瘤。在一些实施方式中，可用于治疗癌症的抗体或其抗原结合部分是TGFβ1激活的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂。在一些实施方式中，此类抗体靶向GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和LRRC33-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，此类抗体靶向GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物和LTBP3-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，此类抗体靶向LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和LRRC33-TGFβ1复合物。在一些实施方式中，此类抗体靶向GARP-TGFβ1复合物和LRRC33-TGFβ1复合物。
本发明包括在治疗受试者中包含实体瘤的癌症中使用不依赖于背景的、亚型特异性的TGFβ1抑制剂。在一些实施方式中，这样的不依赖于背景的、亚型特异性抑制剂可抑制TGFβ1的激活。在优选的实施方式中，这样的激活抑制剂是结合proTGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分。当复合物与任何一种呈递分子例如LTBP1、LTBP3、GARP或LRRC33相关时，可以发生结合，从而抑制成熟TGFβ1生长因子从复合物中释放。在一些实施方式中，实体瘤的特征在于具有富含CD8+T细胞的基质，其与CAF和胶原蛋白纤维直接接触。这样的肿瘤可产生免疫抑制环境，其阻止抗肿瘤免疫细胞(例如，效应T细胞)有效地浸润所述肿瘤，限制机体抵抗癌症的能力。相反，这样的细胞可能在肿瘤基质内或附近积聚。这些特征可能使这样的肿瘤对免疫检查点抑制剂疗法响应差。如下文中更详细讨论的，本文公开的TGFβ1抑制剂可以解除抑制，从而允许效应细胞到达并杀死癌细胞，例如，与免疫检查点抑制剂共同使用。
TGFβ1预期在肿瘤微环境中发挥多方面作用，包括肿瘤生长、宿主免疫抑制、恶性细胞增生、血管、血管生成、迁移、侵入、转移和化疗抗性。因此，环境中TGFβ1呈递的每个“背景”可以参与疾病进展的调节(或失调)。例如，GARP轴在调节效应T细胞应答用于介导宿主免疫应答以抵抗癌细胞的Treg应答中尤其重要。LTBP1/3轴可调节ECM，包括基质，其中癌相关成纤维细胞(CAF)在癌症的发病机制和进展中起作用。LRRC33轴可能在将循环单核细胞募集至肿瘤微环境中，随后分化成肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，并且渗入肿瘤组织和疾病恶化的过程中起关键作用。
在一些实施方式中，表达TGFβ1的细胞浸润肿瘤产生免疫抑制的局部环境。观察到这样的浸润的程度可能与较差的预后相关。在一些实施方式中，较高的浸润指示对另一种癌症疗法(例如免疫检查点抑制剂)的较差的治疗响应。在一些实施方式中，肿瘤微环境中表达TGFβ1的细胞包含Treg和/或髓样细胞。在一些实施方式中，髓样细胞包括但不限于：巨噬细胞、单核细胞(组织驻留或骨髓衍生的)和MDSC。
在一些实施方式中，TME中表达LRRC33的细胞是髓系抑制性细胞(MDSC)。MDSC浸润(例如，实体肿瘤浸润)可以通过产生宿主的抗肿瘤免疫细胞被排除在外的免疫抑制性生态位来强调至少一种免疫逃逸机制。证据表明，MDSC通过炎症相关信号动员，例如肿瘤相关炎症因子。动员后，MDSC可通过损害抵抗疾病的细胞(如CD8+T细胞和NK细胞)来影响免疫抑制作用。此外，MDSC可通过分泌TGFβ和IL-10诱导Treg分化。因此，可以向患有免疫逃避(例如，免疫监视受损)的患者施用亚型特异性TGFβ1抑制剂，例如本文所述的那些，以重新引发或增强身体抵抗疾病(例如，肿瘤)的能力。如本文中更详细描述的，这可以进一步增强(例如，恢复或加强)机体对另一种疗法(例如癌症疗法)的响应性或敏感性。
在一些实施方式中，患者中循环MDSC频率(例如，数量)的升高预示着对检查点阻断疗法(如PD-1拮抗剂和PD-L1拮抗剂)响应差。例如，生物标志物研究显示，循环的预治疗HLA-DR lo/CD14+/CD11b+髓系抑制性细胞(MDSC)与进展和更差的OS相关(p＝0.0001和0.0009)。此外，在发炎的头颈癌(HNC)中对PD-1检查点阻断的抗性与GM-CSF和髓系抑制性细胞(MDSC)标志物的表达相关。该观察结果表明消耗MDSC的策略(例如化学疗法)应该考虑与抗-PD-1组合或顺序。由于在免疫抑制性骨髓细胞上的选择性表达，LRRC33或LRRC33-TGFβ复合物代表了癌症免疫疗法的新靶标。因此，无意受特定理论的束缚，靶向这种复合物可能增强患者群体中标准护理检查点抑制剂疗法的功效。
本发明因此提供了本文所述的高亲和性亚型特异性TGF-β1抑制剂用于治疗包含实体瘤的癌症的治疗中的用途。这样的治疗包括将TGF-β1抑制剂以有效治疗癌症的量施用至诊断患有包括至少一种局部肿瘤(实体瘤)的癌症的受试者。优选地，使用癌症疗法对受试者进行进一步治疗，如CBT、化学疗法和/或放射疗法。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可增加原发性应答者患者人群对癌症疗法的发生率/分数。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可提高原发性应答者对癌症疗法的反应程度。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂增加对癌症疗法的完全缓解者与部分缓解者的比例。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂增加癌症疗法的持久性，从而延长了复发之前和/或癌症疗法无效之前的持续时间。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可减少原发性应答者中对癌症疗法的获得性抗性的发生或可能性。
证据表明癌症进展(例如，肿瘤增殖/生长、侵袭、血管生成和转移)可能至少部分地由肿瘤-基质相互作用驱动。特别地，CAF可通过各种细胞因子和生长因子的分泌和ECM的重塑有助于这一过程。涉及该过程的因素包括但不限于基质细胞衍生因子1(SCD-1)、MMP2、MMP9、MMP3、MMP-13、TNF-α、TGFβ1、VEGF、IL-6、M-CSF。此外，CAF可通过将例如CCL2/MCP-1和SDF-1/CXCL12等因子分泌至肿瘤部位来募集TAM；随后，在TAM优先附着的地方产生pro-TAM生态位(例如，富含透明质酸的基质区域)。由于已经提出TGFβ1促进正常成纤维细胞激活变成肌成纤维细胞样CAF，因此施用如本文所述的那些亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂可有效计数CAF的促癌活性。实际上，本文提供的数据表明，阻断TGFβ1激活的亚型特异性、不依赖于背景的抗体可抑制UUO诱导也与许多癌症有关的标志基因例如CCL2/MCP-1、α-SMA.FN1和Col1的上调。
在某些实施方式中，如本文所述，特异性地结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分单独或与其他药剂例如抗PD-1抗体(例如，抗PD-1拮抗剂)组合施用至患有癌症或肿瘤的受试者。包括在本发明中的其他联合疗法是施用本文所述的抗体或其抗原结合部分与放射(放射疗法)或化学治疗剂(化学疗法)。示例性的其他药剂包括但不限于PD-1拮抗剂、PDL1拮抗剂、PD-L1或PDL2融合蛋白、CTLA4拮抗剂、GITR激动剂、抗ICOS抗体、抗ICOSL抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗OX40抗体(OX40激动剂)、抗CD27抗体、抗CD70抗体、抗CD47抗体、抗-41BB抗体、抗PD-1抗体、抗CD20抗体、CDK抑制剂、溶瘤病毒和PARP抑制剂。有用的溶瘤病毒的实例包括腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹、新城疫病毒，塞内卡病毒、肠病毒和牛痘病毒。在优选的实施方式中，溶瘤病毒是针对肿瘤选择性而设计的。
在一些实施方式中，确定或选择适合特定癌症类型或患者群体的联合疗法的治疗方法可能涉及以下内容：a)关于有可用的标准护理疗法(例如，已批准的适应症的免疫疗法)的癌症类型的考量；b)关于治疗抗性亚群体(例如，免疫排除/冷肿瘤)的考量；和c)关于至少部分是“TGFβ1途径活性”或者至少部分地是TGFβ1依赖性(例如，抑制TGFβ1敏感)的癌症/肿瘤的考量。例如，许多癌症样本显示TGFβ1是主要的亚型，例如通过TCGA RNAseq分析。在一些实施方式中，来自针对TGFβ1亚型表达是阳性的每种肿瘤类型的超过50％(例如，超过50％、60％、70％、80％和90％)的样本的TGFβ1亚型表达呈阳性。在一些实施方式中，“TGFβ1途径活性”或者至少部分地是TGFβ1依赖性(例如，TGFβ1抑制敏感性)的癌症/肿瘤含有至少一个Ras突变，例如K-ras、N-ras和/或H-ras中的突变。在一些实施方式中，癌症/肿瘤包含至少一种K-ras突变。
TGFβ1抑制疗法的前提不是从患者收集的临床样本(例如，活检样品)中确证TGFβ1的表达，因为通常已知或怀疑这种特殊情况涉及TGFβ通路。
在一些实施方式中，亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂与检查点抑制剂疗法联合施用至诊断患有癌症的患者，其中一种或多种检查点抑制剂疗法已获得批准或显示出效果。这些包括但不限于：膀胱尿路上皮癌、鳞状细胞癌(例如头颈部)、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、皮肤皮肤黑色素瘤和胃腺癌。在优选的实施方式中，这样的患者对检查点抑制剂治疗响应差或无响应。在优选的实施方式中，在一些实施方式中，较差的响应是由于原发性抗性造成的。在一些实施方式中，检查点阻断具有抗性的癌症显示出TCF7表达下调。在一些实施方式中，TCF7在检查点抑制抗性肿瘤中的下调可能与肿瘤内CD8+T细胞数量较少有关。
可以将亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂用于治疗化学疗法或放射疗法抗性的癌症。因此，在一些实施方式中，向诊断为癌症的患者施用亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂，所述患者针对所述癌症接受或已接受了化学疗法和/或放射疗法。特别地，当癌症(患者)对此类疗法具有抗性时，使用TGFβ1抑制剂是有利的。在一些实施方式中，此类癌症包括静息的肿瘤增殖癌细胞(TPC)，其中TGFβ信号传导控制其可逆地进入生长阻滞状态，从而保护TPC免于化学疗法或放射疗法。预期在药理学上抑制TGFβ1后，受损的TPC不能进入静息状态，因而呈现出对化学疗法和/或放射疗法易感。此类癌症包括各种癌症，例如鳞状细胞癌。参见，例如，Brown等，(2017)“TGF-β-Induced Quiescence MediatesChemoresistance of Tumor-Propagating Cells in Squamous Cell Carcinoma.”CellStem Cell.21(5):650-664。
在一些实施方式中，拟用TGFβ1抑制剂治疗的TGFβ1阳性癌症也是TGFβ3阳性的(即，TGFβ1+/TGFβ3+癌症)，其特征在于疾病组织(例如，肿瘤)共表达这两种亚型。在一些实施方式中，此类肿瘤是TGFβ1和TGFβ3亚型共显性的。因此，本发明包括将亚型选择性TGFβ1抑制剂与亚型选择性TGFβ3抑制剂联合使用在治疗此类病况中的用途。TGFβ1+/TGFβ3+癌症的非限制性实例包括但不限于：乳腺癌(例如，侵袭性乳腺癌)、胆管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、胰腺腺癌、前列腺腺癌、肉瘤、胸腺瘤和子宫癌。
骨髓增生性病症/骨髓纤维化
本公开提供了TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂(如本文公开的那些)在治疗骨髓增生性病症中的治疗用途。这些包括，例如，骨髓增生异常综合征(MDS)和骨髓纤维化(例如，原发性骨髓纤维化和继发性骨髓纤维化)。
骨髓纤维化，也称为骨髓纤维瘤，是一种比较少见的骨髓增殖性病症(癌症)，其属于被称为骨髓增生性病症的一组疾病。骨髓纤维化分类为骨髓增生性肿瘤的费城染色体阴性(-)分支。骨髓纤维化的特征在于克隆性骨髓增生、异常细胞因子生产、髓外造血和骨髓纤维化。骨髓和其他部位中造血干细胞的异常克隆的增殖导致纤维化，或以瘢痕组织替代骨髓。除非另有说明，否则术语骨髓纤维化是指原发性骨髓纤维化(PMF)。这也可以称为慢性特发性骨髓纤维化(cIMF)(术语特发性和原发性意为在这些情况下所述疾病是未知的或自发的起源)。这与由真性红细胞增多症或原发性血小板增多症继发的骨髓纤维化形成对比。骨髓纤维化是骨髓化生的一种形式，其意指骨髓的血液形成组织中细胞类型的变化，并且通常这两个术语同义使用。术语原因不明的骨髓化生和具有骨髓化生的骨髓纤维化(MMM)也用于指原发性骨髓纤维化。在一些实施方式中，可根据本发明治疗的血液学增殖性疾病包括骨髓增生性病症，例如骨髓纤维化。所谓的BCR-ABL(Ph)阴性慢性骨髓增生性病症“经典”组包括原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)和原发性骨髓纤维化(PMF)。
骨髓纤维化破坏了机体正常的血细胞生成。其结果是在骨髓中广泛形成瘢痕，导致严重的贫血症、虚弱、疲劳和经常的脾脏肿大。通过异常造血细胞克隆(特别是巨核细胞)产生细胞因子如成纤维细胞生长因子导致由结缔组织通过胶原纤维化取代骨髓的造血组织。造血组织的减少损害了患者产生新的血细胞的能力，导致进行性全血细胞减少，即所有血细胞类型的短缺。然而，成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的沉积被认为是次要现象，并且成纤维细胞本身可能不是异常细胞克隆的一部分。
骨髓纤维化可能是由骨髓中的异常血液干细胞引起的。所述异常干细胞产生成熟和分化不良的细胞，这些细胞快速生长并接管骨髓，导致纤维化(瘢痕组织形成)和慢性炎症两者。
原发性骨髓纤维化与Janus激酶2(JAK2)、血小板生成素受体(MPL)和钙网蛋白(CALR)的突变有关，其可导致骨髓发生JAK-STAT通路的组成型激活、进行性瘢痕形成或纤维化。患者可能发生髓外造血，即在骨髓以外的部位发生血细胞形成，因为血细胞被迫迁移到其他区域，特别是肝脏和脾脏。这导致这些器官的增大。在肝脏中，大小异常被称为肝肿大。增大的脾脏称为脾肿大，其也有助于引起全血细胞减少症，特别是血小板减少症和贫血症。髓外造血的另一个并发症是粒细胞增多症，或存在异常形状的红细胞。
在骨髓纤维化中髓外造血的主要部位是脾脏，其在患有骨髓纤维化的患者中通常显著地增大。由于脾脏的大量增大，脾脏中经常发生多被膜下梗塞，这意味着由于脾脏的供氧中断，部分或完全的组织发生死亡。在细胞水平上，脾脏含有红细胞前体、粒细胞前体和巨核细胞，其中巨核细胞的数量和异常形状显著。巨核细胞可能参与导致在这种状况下看到的二次纤维化。
有人提出TGFβ可能参与骨髓纤维化发病机理的纤维化方面(参见，例如，Agarwal等，“Bone marrow fibrosis in primary myelofibrosis:pathogenic mechanisms andthe role of TGFβ”(2016)Stem Cell Investig 3:5)。原发性骨髓纤维化中的骨髓病理学特征在于纤维化、新生成和骨硬化，并且所述纤维化与沉积在ECM中的胶原蛋白的产生增加有关。
许多改变指示或与该疾病相关的生物标志物已被描述。在一些实施方式中，生物标志物是细胞标志物。这样的疾病相关生物标志物可用于诊断和/或监测疾病进展以及疗法的功效(例如，患者对所述疗法的响应性)。这些生物标志物包括许多纤维化标志物，以及细胞标志物。例如，在肺癌中，据报道肺癌患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的TGFβ1浓度显著高于良性疾病患者(～2+倍增加)，其也可作为用于诊断和/或监测肺癌的进展或治疗效果的生物标志物。
由于原发性骨髓纤维化与异常的巨核细胞发育相关，巨核细胞的某些细胞标志物以及它们的干细胞系的祖细胞可以用作标志物来诊断和/或监测疾病的进展以及疗法的功效。在一些实施方式中，有用的标志物包括但不限于：分化的巨核细胞的细胞标志物(例如，CD41、CD42和Tpo R)、巨核细胞-红细胞祖细胞的细胞标志物(例如，CD34、CD38和CD45RA-)、常见骨髓祖细胞的细胞标志物(如IL-3α/CD127、CD34、SCFR/c-kit和Flt-3/Flk-2)，以及造血干细胞的细胞标志物(如CD34、CD38-、Flt-3/Flk-2)。在一些实施方式中，有用的生物标志物包括纤维化标志物。这些包括但不限于：TGFβ1/TGFB1、PAI-1(也称为Serpine1)、MCP-1(也称为CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、CTGF、α-SMA、ACTA2、Timp1、Mmp8和Mmp9。在一些实施方式中，有用的生物标志物是血清标志物(例如，在血清样品中发现和检测到的蛋白质或片段)。
基于TGFβ是白血病骨髓生态位的组分的发现，可以预期用TGFβ抑制剂靶向与骨髓微环境可能是一个有前景的方法，以在受影响组织中减少表达调节局部TGFβ可用性的呈递分子的白血病细胞。
实际上，由于病理学的多面性本质，其显现出在骨髓增生和纤维化两者中的TGFβ依赖性失调(作为术语“骨髓纤维化”自身所表明的)，例如本文所述的那些TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂可以为患有骨髓纤维化的患者提供特别有利的治疗效果。预期这种抑制剂的LTBP臂可以靶向骨髓中的ECM相关TGFβ1复合物，而抑制剂的LRRC33臂可以阻断骨髓细胞相关TGFβ1。此外，与骨髓纤维化相关的异常巨核细胞生物学可能涉及GARP和LTBP两者介导的TGFβ1活性。TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂能够靶向这样的复合物，从而抑制生态位中活性TGFβ1的释放。
因此，这样的TGFβ1抑制剂可用于治疗对其他(或标准治疗)治疗(例如羟基脲和JAK抑制剂)响应不足或不耐受的患有真性红细胞增多症的患者。这样的抑制剂还可用于治疗患有中度或高风险骨髓纤维化(MF)的患者，包括原发性MF、真性红细胞增多症MF和原发性血小板增多症MF。
因此，本发明的一个方面涉及用于治疗原发性骨髓纤维化的方法。所述方法包括向患有原发性骨髓纤维化的患者施用治疗有效量的包含导致TGFβ可用性降低的TGFβ抑制剂的组合物。在一些实施方式中，向患有骨髓纤维化的患者施用TGFβ1激活的亚型特异性、不依赖于背景的单克隆抗体抑制剂。这样的抗体可以以剂量范围为0.1至100mg/kg之间施用，例如1至30mg之间，例如，1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、30mg/kg等。例如，适宜的给药方案包括每周施用1-30mg/kg之间。在一些实施方式中，以每周约10mg/kg给予TGFβ1抑制剂。任选地，例如，在初始阶段之后，可以将施用频率从约每周一次(在初始阶段)调整到每月一次(在维持阶段)。
包含抗体的药物组合物的优选施用途径时静脉内或皮下施用。当组合物以静脉内施用时，可以在合适的时间段内给予患者治疗，例如，每次治疗约30-120分钟(例如，30min、60min、75min、90min和120min)，然后每隔几周重复一次，例如每3周、4周、6周等，共几个周期，例如，4个周期、6个周期、8个周期、10个周期、12个周期等。在一些实施方式中，患者通过静脉内施用接受剂量水平为1至10mg/kg(例如，每剂1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)的包含抑制性抗体的组合物每28天(4周)一次持续6个周期或12个周期的治疗。在一些实施方式中，这样的治疗作为慢性(长期)疗法施用(例如，只要被认为是有益的，则无限期地继续)以代替在一定数量的施用周期后中断。
虽然骨髓纤维化可以被认为是白血病的一种，但是它的特点在于纤维化的表现。因为已知TGFβ调节ECM内稳态的方面，其失调可导致组织纤维化，预期在一些实施方式中，期望抑制与ECM相关的TGFβ活性。因此，本发明包括结合并抑制由LTBP(例如LTBP1和LTBP3)呈递的proTGFβ的抗体或其片段。在一些实施方式中，适合于治疗骨髓纤维化的抗体或其片段是“不依赖于背景的”，因为它们可以结合proTGFβ复合物的多种背景，例如与LRRC33、GARP、LTBP1、LTBP3相关的那些或其任何组合。在一些实施方式中，这样的抗体是TGFβ激活的不依赖于背景的抑制剂，其特征在于抗体可结合并抑制任何以下潜在复合物：LTBP1-proTGFβ、LTBP3-proTGFβ、GARP-proTGFβ和LRRC33-proTGFβ。在一些实施方式中，这样的抗体是亚型特异性抗体，其结合并抑制包含一种TGFβ亚型但不包含TGFβ的其他亚型的潜在复合物。这些包括例如LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。在一些实施方式中，这样的抗体是以高亲和性优选地结合并抑制TGFβ1信号传导的亚型选择性抗体。
早期体内数据表明，TGFβ1的亚型选择性不依赖于背景的抑制剂(如本文所述的那些)可以用于在原发性骨髓纤维化的可翻译的小鼠模型中治疗骨髓纤维化。与当前的标准治疗JAK2抑制剂(其仅提供症状缓解，但不提供临床或生存获益)不同，TGFβ1的亚型选择性、不依赖于背景的抑制剂在患病小鼠的骨髓中具有显著的抗纤维化作用，并且还可以延长存活，支持了TGFβ1抑制剂可以在人类患者中有效治疗骨髓增生性病症的观点。
可以用本文所述的组合物和方法治疗的合适的骨髓增生性肿瘤的患者群体可包括但不限于：a)其是费城(+)的患者群体；b)其是费城(-)的患者群体；c)被归类为“经典”(PV、ET和PMF)的患者群体；d)携带突变JAK2V617F(+)的患者群体；e)携带JAK2V617F(-)的患者群体；f)具有JAK2外显子12(+)的患者群体；g)具有MPL(+)的患者群体；h)具有CALR(+)的患者群体。
在一些实施方式中，患者群体包括具有中度-2或高风险的骨髓纤维化。在一些实施方式中，患者群体包含具有对现有治疗方案不耐受或不适合的骨髓纤维化的受试者。在一些实施方式中，受试者具有的血小板计数在100-200×109/L之间。在一些实施方式中，受试者在接受治疗之前具有的血小板计数>200×109/L。
在一些实施方式中，接受(和可能受益于接受)亚型特异性、不依赖于背景的TGF-β1抑制疗法的受试者被诊断为患有中度-1或更高级的原发性骨髓纤维化(PMF)，或继发真性红细胞增多/原发性血小板增多症骨髓纤维化(post-PV/ETMF)。在一些实施方式中，受试者在治疗之前有骨髓纤维化记录。在一些实施方式中，受试者在治疗之前通过欧洲共识分级评分被评估为MF-2或更高，通过改良的Bauermeister分级评分被评估为3级或更高。在一些实施方式中，受试者在治疗之前具有1的ECOG表现状态。在一些实施方式中，受试者在治疗之前具有5至120的白细胞计数(109/L)。在一些实施方式中，受试者具有范围为10％至100％的JAK2V617F等位基因负担。
在一些实施方式中，接受(和可能受益于接受)亚型特异性、背景许可性TGF-β1抑制疗法的受试者是输血依赖性(在治疗之前)，其特征在于受试者在上个月内具有至少两个单位的红细胞输血历史，因为与临床明显出血无关的血红蛋白水平低于8.5g/dL。
在一些实施方式中，接受(和可能受益于接受)亚型特异性、背景许可性TGF-β1抑制疗法的受试者之前接收过用于治疗骨髓纤维化的疗法。在一些实施方式中，受试者已经用一种或多种疗法进行治疗，包括但不限于：AZD1480、帕比司他、EPO、IFNα、羟基脲、聚乙二醇化干扰素、沙利度胺、泼尼松和JAK2抑制剂(例如，来他替尼、CEP-701)。
在一些实施方式中，患者具有髓外造血。在一些实施方式中，髓外造血是在肝、肺、脾和/或淋巴结中。在一些实施方式中，本发明的药物组合物局部施用至疾病表现的一个或多个局部部位。
亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂以有效治疗骨髓纤维化的量施用至患者。治疗有效量是足以缓解患者中骨髓纤维化的一种或多种症状和/或并发症的量，包括但不限于：骨髓基质中ECM的过度沉积(骨髓纤维化)、新血管生成、骨硬化、脾肿大、血肿、贫血、出血、骨痛和其他骨相关的患病状态、髓外造血、血小板增多症、白细胞减少症、恶病质、感染、血栓形成和死亡。因此，包含本文公开的抗体或抗原结合片段的TGFβ1抑制疗法可以实现临床获益，尤其包括抗纤维化作用和/或血细胞计数正常化。此类疗法可以延长生存期和/或减少对骨髓移植的需求。
在一些实施方式中，所述量有效降低患者中TGFβ1表达和/或分泌(例如巨核细胞的)。因此，这样的抑制剂可降低被治疗患者中的TGFβ1mRNA水平。在一些实施方式中，这样的抑制剂降低骨髓中的TGFβ1mRNA水平，例如在单核细胞中。PMF患者通常表现出升高的血浆TGFβ1水平，高于～2,500pg/mL，例如高于3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000和10,000pg/mL(相比之下，通过ELISA测量的正常范围为～600-2,000pg/mL)(参见，例如，Mascaremhas等，(Leukemia&Lymphoma,2014,55(2):450-452))。Zingariello(Blood,2013,121(17):3345-3363)对PMF患者和对照个体的血浆中的生物活性和总TGFβ1含量进行了量化。根据该参考文献，PMF患者中生物活性TGFβ1的中值为43ng/mL(其范围为4-218ng/mL)和总TGFβ1为153ng/mL(32-1000ng/mL)，而在相应的对照中，其数值分别为18(0.05-144)和52(8-860)。因此，基于这些报道，与对照或健康血浆样品相比，PMF患者中的血浆TGFβ1含量升高数倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍等。用所述抑制剂治疗，例如，施用4至12个周期(例如，2、4、6、8、10、12个周期)或慢性或长期治疗，例如每4周一次，剂量为0.1-100mg/kg，例如，1-30mg/kg本文所述的单克隆抗体可相比于相应基线(治疗前)减少至少10％的血浆TGFβ1水平，例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％和50％。
一些治疗效果可以在开始治疗后被相对快速地观察到，例如，1周、2周、3周、4周、5周或6周之后。例如，抑制剂可能在1-8周内有效地增加用抑制剂治疗的患者的骨髓内干细胞和/或前体细胞的数量。这些包括造血干细胞和血液前体细胞。可以进行骨髓活组织检查以评估骨髓细胞的频率/数量的变化。相应地，患者可能表现出改善的症状，例如骨痛和疲劳。
患有骨髓增生性疾病(例如，骨髓纤维化)的受试者可能表现出升高的白细胞计数水平(例如，白血病)。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂的治疗有效量是有效使血细胞计数正常化的量。在一些实施方式中，与治疗前相比，该量有效降低受试者的总白细胞计数。在一些实施方式中，与治疗前相比，该量有效降低受试者的总血小板计数。在一些实施方式中，与治疗前相比，该量有效增加(例如，正常化或恢复)受试者的血红蛋白水平。在一些实施方式中，与治疗前相比，该量有效增加(例如，正常化或恢复)受试者的红细胞比容水平。
骨髓纤维化的形态学标志之一是骨髓中(例如，骨髓基质)的纤维化，其特征部分地在于异常ECM。在一些实施方式中，所述量有效减少过量的胶原蛋白沉积，例如通过间充质基质细胞。在一些实施方式中，与未接受治疗的对照受试者相比，抑制剂有效减少治疗受试者中CD41-阳性细胞(例如巨核细胞)的数量。在一些实施方式中，由随机选择分区法测定的PMF骨髓中巨核细胞的基线频率的范围可以是每平方毫米(mm2)200至700个细胞，和PMF脾脏中每平方毫米(mm2)40至300个巨核细胞。相反，正常供体的骨髓和脾脏中的巨核细胞频率分别小于140和小于10。用抑制剂治疗可以减少骨髓和/或脾脏中巨核细胞的数量(例如，频率)。在一些实施方式中，用抑制剂治疗可导致下游效应子信号传导水平降低，例如SMAD2/3的磷酸化。在一些实施方式中，抑制剂有效降低纤维化标志物(如本文所述的那些)的表达水平。
骨髓纤维化患者可能患有脾脏肿大。因此，可以通过监测脾脏大小的变化来评估治疗剂的临床效果。脾脏大小可以通过已知技术检查，例如通过触诊评估脾脏长度和/或通过超声评估脾脏体积。在一些实施方式中，待用亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂治疗的受试者具有5cm或更大的基线脾长度(治疗前)，例如，通过触诊评估为5至30cm范围内。在一些实施方式中，通过超声波评估的待用TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂治疗的受试者具有300mL或更高的基线脾脏体积(治疗前)，例如，范围为300至1500mL。用抑制剂治疗，例如施用4至12个周期(例如，2、4、6、8、10、12个周期)，例如每4周一次，剂量为0.1至30mg/kg本文所述的单克隆抗体可以减少受试者的脾脏大小。在一些实施方式中，抑制剂的有效量足以减少接受抑制剂治疗的患者群体中的脾脏大小，相对于相应的基线值至少减少10％、20％、30％、35％、40％、50％和60％。例如，与安慰剂对照相比，通过MRI或CT扫描测量，治疗对于在12至24周内实现脾脏体积相对于基线减少≥35％是有效的。在一些实施方式中，与最佳可用疗法对照相比，通过MRI或CT扫描测量，治疗对于在24至48周内实现脾脏体积相对于基线减少≥35％是有效的。最佳可用疗法可包括羟基脲、糖皮质激素，以及无药物治疗、阿那格雷，依伯汀α、沙利度胺、来那度胺、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、达那唑、聚乙二醇干扰素α-2a、干扰素-α、美法仑、乙酰水杨酸、阿糖胞苷和秋水仙碱。
在一些实施方式中，患者群体用本文所述的那些亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂治疗，显示出统计学改善的治疗响应，如通过例如国际骨髓纤维化研究与治疗工作组(IWG-MRT)标准评估，骨髓纤维化等级的变化程度通过改良的Bauermeister评分和欧洲共识分级系统(例如，4、6、8或12个周期)测量，症状响应使用骨髓增生性肿瘤症状评估表格(MPN-SAF)。
在一些实施方式中，用本文所述的那些亚型特异性、背景许可性TGFβ1抑制剂的治疗实现了统计学改善的治疗响应，如通过例如改进的骨髓纤维化症状评估表(MFSAF)进行评估，其中通过MFSAF工具(如2.0)测量症状，一种使用0至10分级捕获骨髓纤维化的衰弱的症状(腹部不适、早饱、下左侧肋骨疼痛、瘙痒、盗汗和骨/肌肉疼痛)的daukt日记，其中0表示不存在，10表示可以想象的最差情况。在一些实施方式中，治疗有效地在例如12至24周内实现总MFSAF评分从基线降低≥50％。在一些实施方式中，与服用安慰剂的患者相比，接受治疗的相当一部分患者实现总症状评分≥50％的改善。例如，达到≥50％的患者池的比率可以超过40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方式中，抑制剂的治疗有效量是足以达到临床改善的量，其通过贫血响应评估。例如，改善的贫血反应可包括在4至12个周期(例如6个周期)的治疗之后不依赖输血的更长持续时间，例如8周或更长。
在一些实施方式中，抑制剂的治疗有效量是足以在一段时间内保持稳定的病情的量，例如，6周、8周、12周、6个月等。在一些实施方式中，疾病的进展可以通过总体骨髓细胞性的变化、网状蛋白或胶原蛋白纤维化的程度，和/或JAK2V617F等位基因负荷的变化来评估。
在一些实施方式中，用本文所述的那些亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂治疗的患者群体与未接受治疗的对照群体相比，显示出统计学改善的生存。例如，在对照组中，PMF患者的中位生存期约为6年(在高风险患者中约为16个月)，并且预计有不到20％的患者在诊断后存活10年或更长时间。用本文所述的那些亚型特异性、背景许可性TGFβ1抑制剂治疗可以将存活时间延长至少6个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月或48个月。在一些实施方式中，与接受安慰剂的患者相比，治疗有效地在26周、52周、78周、104周、130周、144周或156周实现改善的总体存活。
可能在具有或不具有新发作贫血的患者中看出治疗的临床益处，如上述例举的那些。
亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂相比于缺乏选择性的常规TGFβ拮抗剂的一个优越特征是它们保持通过亚型选择性实现的改善的安全特性。因此，与用常规TGFβ拮抗剂治疗的同等患者群体相比，预期用本文所述的那些亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂的治疗可以在不良事件的频率和/或严重程度方面减少患者群体中的不良事件。因此，亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂可以提供关于治疗剂量和/或持续时间的更大治疗窗口。
不良事件可以由本领域公认的合适的方法分级，例如不良事件通用术语标准(CTCAE)版本4。此前报道的接受TGFβ拮抗剂(如GC1008)的人类患者中的不良事件包括：白细胞增多(3级)、疲劳(3级)、缺氧(3级)、心搏停止(5级)、白细胞减少(1级)、复发、短暂、皮肤红斑、结节性皮肤病变、化脓性皮炎和带状疱疹。
与骨髓纤维化患者中的JAK抑制剂疗法相比，亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂疗法可引起频率较少和/或程度较轻的不良事件(副作用)，例如、贫血、血小板减少、中性粒细胞减少、高胆固醇血症、丙氨酸转氨酶升高(ALT)、天冬氨酸转氨酶升高(AST)、瘀伤、头晕和头痛，从而提供更安全的治疗选择。
可以预期，TGFβ1信号传导的抑制剂可以与用于治疗骨髓纤维化的一种或多种治疗剂结合使用作为联合(例如，“加用”)疗法。在一些实施方式中，本文所述的TGFβ1激活抑制剂施用至已接受JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂的患有骨髓纤维化的患者。在一些实施方式中，这样的患者对JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂疗法有响应，而在其他实施方式中，这样的患者对JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂疗法的响应性差或不响应。在一些实施方式中，使用本文所述的TGFβ1的亚型特异性抑制剂可使得对JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂疗法响应差或不响应的那些患者更具响应性。在一些实施方式中，使用本文所述的TGFβ1的亚型特异性抑制剂可以允许减少JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂的剂量，其仍然在患者中产生同等的临床功效但是药物相关毒性或者不良事件(如上面列出的那些)的程度较少或较低。在一些实施方式中，用本文所述的TGFβ1激活抑制剂的疗法与用JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂的疗法联合使用可以在患者中产生协同或另外的治疗效果。在一些实施方式中，用本文所述的TGFβ1激活抑制剂的治疗可以增强JAK1抑制剂、JAK2抑制剂或JAK1/JAK2抑制剂或用于治疗骨髓纤维化的其他疗法的益处。在一些实施方式中，患者可另外接受治疗剂以治疗与骨髓纤维化相关的贫血症。
纤维化病况
响应于由于物理损伤/创伤、有毒物质和/或感染引起的组织损伤，开始自然修复过程，其涉及若干细胞类型，包括成纤维细胞、几种不同类型的免疫细胞以及驻留的上皮和内皮细胞。然而，如果任其发展，这一过程可能导致细胞外基质(ECM)过多累积和纤维化，进而导致组织功能的逐步丧失和器官衰竭(Caja等，Int.J.Mol.Sci.2018,19,1294)。
纤维化可能发生在很多器官，包括肺、肾、肝、心脏和皮肤。不依赖于器官，纤维化应答的特征是炎症、上皮-间质相互作用改变和成纤维细胞增殖。纤维化的标志之一是成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，这极大地导致了ECM的失调。然而，还已提出肌成纤维细胞来自其他细胞来源(例如，内皮细胞、上皮细胞和间充质干细胞)(Kim,K.K.等，Cold SpringHarb.Perspect.Biol.,2017；Okabe,H.Histol.Histophathol.,2016,31,141-148；和Li,C等，Nat Commun.,2016,7,11455和)。而且，免疫细胞通过分泌促进肌成纤维细胞分化、刺激ECM沉积并向受损组织募集更多免疫细胞的细胞因子和趋化因子而在这一过程中发挥重要作用(Caja等，Int.J.Mol.Sci.2018,19,1294)。
与纤维化组织类似，与肿瘤相关的成纤维细胞能够在肿瘤环境中激活，从而产生过量的ECM。ECM提供了用于其他细胞(例如，促肿瘤原性免疫细胞)的浸润的支架，和用于细胞迁移的基底。在其他情况下，过多的ECM可能会成为抗肿瘤原性免疫细胞的屏障。
TGFβ被认为是纤维化应答的中央协调器。TGFβ能够促进肌成纤维细胞分化、募集免疫细胞，以及影响上皮和内皮细胞分化。特别地，TGFβ上调ECM和基底膜蛋白的产生，如纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、肌腱蛋白、弹性蛋白、核心蛋白聚糖。TGFβ诱导的肌成纤维细胞分化可导致ECM蛋白的进一步沉积，基质金属蛋白酶(MMP)的分泌以及肌成纤维细胞的增殖(Fabregat等，FEBS J.2016,283,2219-2232；Meng等，Nat.Rev.Nephrol.2016,12,325-338；和Kulkarni等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2016,54,751-760)。此外，TGFβ介导影响血管平滑肌细胞(VSCM)中收缩蛋白和胶原I的表型变化，并可激活肌成纤维细胞和其他基质细胞，以增强胶原交联蛋白的合成，例如赖氨酰氧化酶(LOX)家族的基质重塑酶(Busnadiego等，Mol.Cell.Biol.2013,33,2388-2401)。而且，已经显示出TGFβ同时调节EMT和EndMT，这有助于促纤维化细胞类型的分化，如肌成纤维细胞和CAF。而且，TGFβ已显示出诱导上皮细胞凋亡，可促进其他组织中的肺和肝纤维化(Barbas-Filho等，J.Clin.Pathol.2001,54,132-138；和Wang等，Dev.Dyn.2017,247,492-508)。
无论是先天的还是经募集的，巨噬细胞在对组织损伤和修复的应答中起重要作用。然而，在某些信号后，其会变得促纤维化。除其他细胞因子外，TGFβ还显示可激活促炎性的M2巨噬细胞。激活后，这些巨噬细胞会分泌其自己的细胞因子，包括TGFβ、ECM组分、血管生成因子和趋化因子。已显示M2巨噬细胞对TGFβ驱动的肺纤维化至关重要(Murray等，Int.J.Biochem.Cell Biol.2011,43,154-162)。
因此，根据本发明，如本文所述的那些TGFβ1的亚型特异性抑制剂用于受试者中纤维化(例如，纤维化指征、纤维化状况)的治疗。用于实施本发明的合适的抑制剂包括可用于改变或改善纤维化的根据本发明的抗体和/或组合物。更具体地，这样的抗体和/或组合物是TGFβ1的选择性拮抗剂，其能够靶向由各种类型的呈递分子呈递的TGFβ1。
靶向TGFβ的抗体在许多临床前模型中减少纤维化。这样的抗体和/或基于抗体的化合物包括LY2382770(Eli Lilly,Indianapolis,IN)。还包括在美国专利号US6,492,497、US 7,151,169、US 7,723,486和美国专利申请公开号2011/0008364中描述的那些，其全部内容各自通过引用并入本文。现有技术的TGFβ拮抗剂包括，例如，靶向和阻断整联蛋白依赖性TGFβ激活的药剂。
然而，证据表明，这样的现有技术的试剂可能不介导亚型特异性的抑制，并且可能通过无意中阻断TGFβ2和/或TGFβ3的正常功能造成不良影响。实际上，申请人此前注意到正常(未患病)肺部组织含有相对低但可测量的TGFβ2和TGFβ3水平，但TGFβ1显著较少。相比之下，在某些疾病状况如纤维化中，TGFβ1相对于其他亚型变得优选地上调(WO 2018/129329)。优选地，在这类状况的治疗中使用的TGFβ拮抗剂仅针对所述疾病引起的或疾病相关的亚型发挥其抑制活性，同时保持在组织中正常表达以介导强直性信号传导的其它亚型的功能。现有技术的抑制剂(LY2109761，小分子TGFβ受体拮抗剂和靶向αVβ6整联蛋白的单克隆抗体)均显示在非患病大鼠BAL中抑制TGFβ下游的强直性信号传导，提高了这些抑制剂可能引起不必要的副作用的可能性。或者或另外地，靶向和阻断TGFβ的整联蛋白依赖性激活可能能够在由各种细胞类型表达并在发病机理中起作用的大量的整联蛋白类型中只阻断负责疾病相关TGFβ1激活的整联蛋白的子集。此外，即使这样的拮抗剂可能选择性地阻断整联蛋白介导的TGFβ1亚型的激活，它可能在阻断由其他模式触发的TGFβ1激活(例如蛋白酶依赖性激活)方面无效。相反，如本文所述的那些TGFβ1的亚型特异性、不依赖于背景的抑制剂旨在阻止TGFβ1的激活步骤而不管特定的激活模式，同时保持亚型的选择性。
进一步预期亚型特异性TGFβ3抑制剂可以在特定疾病状态下提供治疗益处。例如，拟使用TGFβ1抑制剂治疗的某些纤维化疾病也可以是TGFβ3阳性的(即，TGFβ1+/TGFβ3+纤维化组织)，其特征是该疾病组织(例如，纤维化组织)表达这两种亚型。因此，本发明包括将亚型选择性TGFβ1抑制剂与亚型选择性TGFβ3抑制剂联合使用在治疗此类病况中的用途。此类TGFβ3抑制剂可以是不依赖于背景的，也可以是背景偏倚的。
对于本发明的抗体和/或组合物可用于治疗的纤维化适应症包括但不限于肺适应症(例如特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性哮喘、急性肺损伤、嗜酸性粒细胞性食管炎、肺动脉高压和化学性气体损伤)，肾适应症(例如，糖尿病肾小球硬化、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、慢性肾脏疾病(CKD)、与肾移植相关的纤维化和慢性排斥反应、IgA肾病，和溶血性尿毒症综合征)，肝纤维化(例如，与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关或由其引起的、慢性病毒性肝炎、寄生虫血症、先天性代谢紊乱、毒素介导的纤维化如酒精性纤维化、非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌(NASH-HCC)、原发性胆汁性肝硬化和硬化性胆管炎)，心血管纤维化(例如，心肌病、肥厚性心肌病、动脉粥样硬化和再狭窄)，系统性硬化症，皮肤纤维化(例如，系统性硬化症中的皮肤纤维化、弥漫性皮肤系统性硬化症、硬皮病、病理性皮肤瘢痕、瘢痕疙瘩、手术后瘢痕形成、瘢痕修复手术、放射诱导瘢痕形成和慢性伤口)，与眼相关的病况，如视网膜下纤维化、葡萄膜炎综合征、与特发性腹膜后纤维化相关的葡萄膜盐、眼外肌纤维化、与主要组织相容性复合物(I类MHC)或组织相容性抗原相关的眼部疾病、黄斑变性的视网膜下纤维化(例如，年龄相关的黄斑变性)和癌症或继发性纤维化(例如，骨髓纤维化、头颈癌、M7急性巨核细胞白血病和粘膜炎)。可以使用本公开的化合物和/或组合物治疗的与纤维化相关的其他疾病、病症或状况(包括退行性病症)包括但不限于子宫腺肌症、子宫内膜异位症、马凡氏综合征、皮肤僵硬综合征、硬皮病、类风湿性关节炎、骨髓纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、肌营养不良(如DMD)，帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、杜普瑞氏挛缩、卡穆拉蒂-恩格尔曼病、神经瘢痕、痴呆、增生性玻璃体视网膜病变、角膜损伤、青光眼引流术后并发症和多发性硬化症(MS)。
很多纤维化适应症还与一个或多个受累组织的炎症相关，提示了免疫组分的参与。此类炎症可能伴随异常免疫细胞群，如Th17细胞数量增加、Treg细胞数量减少和/或两者。在每种情况下，受累患者可能显示出Th17/Treg细胞比例增加。亚型选择性抗体的GARP-和/或LRRC33靶向活性可以提供在这些背景下的抑制性作用。
在一些实施方式中，可以用本文描述的组合物和/或方法治疗的纤维化适应症包括器官纤维化，例如肺的纤维化(例如，IPF)、肾的纤维化(例如，与CKD相关的纤维化)、肝的纤维化(例如，与NASH相关或由其导致)、心或心脏组织的纤维化、皮肤的纤维化(例如，硬皮病)、子宫的纤维化(例如，子宫内膜、子宫肌层)，肌肉的纤维化(例如，骨骼肌)和骨髓的纤维化。在一些实施方式中，这样的疗法可能减少或延迟患者器官移植的需要。在一些实施方式中，这样的疗法可能延长患者的存活期。
为了治疗IPF，可能从治疗中受益的患者包括具有家族性IPF的那些和具有分散性IPF的那些。施用治疗有效量的TGFβ1亚型特异性抑制剂可以减少肺组织中的肌成纤维细胞积聚、减少胶原蛋白沉积、减少IPF症状、改善或维持肺功能，并延长存活。在一些实施方式中，抑制剂阻断IPF的纤维化环境内ECM相关TGFβ1(例如，由LTBP1/3呈递的前/潜在TGFβ1)的激活。抑制剂可任选地进一步阻断巨噬细胞相关的TGFβ1(例如，由LRRC33呈递的前/潜在TGFβ1)的激活，例如，肺泡巨噬细胞。其结果是，抑制剂可能抑制纤连蛋白释放和其他纤维化相关因子。在一些实施方式中，抑制剂阻断肝星形细胞的激活。
众所周知，肝星状细胞(HSC)的激活是肝损伤中纤维化的主要驱动力。在这一过程中，静息的、储存维生素A的细胞转分化为增殖性的、纤维化的肌成纤维细胞(细胞外基质(ECM)蛋白累积的主要来源)。然而，已证明该过程是由很多不同的通路介导的，包括自噬、内质网应激、氧化应激、视黄醇和胆固醇代谢、表观遗传学和受体介导的信号。而且，包括巨噬细胞、肝细胞、肝窦内皮细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、血小板和B细胞在内的炎症细胞也已被证明可调节HSC激活(Tsuchida和Friedman,Nature ReviewsGastroenterology&Hepatology第14卷，第397–411页(2017))。仅在一个特定实例中，Seki等证明了TLR4(其识别由细菌提供的LPS)的激活导致趋化因子分泌的上调并诱导了枯否细胞的趋化性，并且还使HSC对TGFβ诱导的信号敏感，并允许不受限制的激活枯否细胞(Seki等，Nature Medicine volume 13,pages 1324–1332(2007))。
众所周知，炎症在肝纤维化的发生和进展中起关键作用。具体而言，肝损伤导致炎症和单核细胞/巨噬细胞(以及淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞)的募集，其产生包括TGFβ在内的促纤维化因子。而且，研究表明，肝组织驻留巨噬细胞(枯否细胞)和骨髓来源的募集巨噬细胞在肝纤维化进程中均起重要作用，并且TGFβ通路能够促进肝纤维化过程中巨噬细胞的极化和促纤维化功能。实际上，已经发现，枯否细胞和募集的巨噬细胞两者均能够激活HSC，并通过旁分泌机制(包括TGFβ)诱导其转分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞继而产生并沉积导致纤维化的ECM组分(Fabregat和Caballero-Diaz,Front Oncol.2018；8:357)。
然而，肌成纤维细胞也可能来源于其他来源，包括门静脉和驻留成纤维细胞、骨髓来源的纤维细胞、经历EMT的肝上皮细胞、经历EndMT的内皮细胞、以及血管平滑肌细胞和周细胞。实际上，还已证明TGFβ调节EndMT和EMT，从而导致肌成纤维细胞增加，其驱动肝纤维化。(Pardali等，Int J Mol Sci.2017Oct；18(10):2157)。因此，靶向TGFβ已经是用于治疗纤维化病况的有吸引力的治疗靶点。
已经证明TGFβ在肝纤维化和疾病进展中起很多作用。例如，已经证明TGFβ负责激活HSC为肌成纤维细胞。还已经证明，TGFβ可介导肝细胞上皮-间质转化(EMT)，这可能有助于增加肌成纤维细胞群。而且，TGFβ已显示可诱导肿瘤细胞可塑性改变(Fabregat和Caballero-Diaz,Front Oncol.2018；8:357)。
尽管TGFβ可存在于纤维化和/或肿瘤微环境中的很多不同细胞来源上，由此表明通过多种不同呈递分子(例如，LTBP1、LTBP3、GARP和/或LRRC33)进行TGFb呈递，但在某些情况下，相对于其他靶向TGFβ的特定来源可以说是有益的。例如，Henderson等人发现，在HSC中缺失αv整联蛋白可保护小鼠免于CCL4诱导的肝纤维化(Henderson等，Nat.Med.2013,19,1617-16-24)。由于整联蛋白是LTBP呈递的TGFβ的主要激活剂，因而该结果表明，靶向LTBP呈递的TGFβ可能足以在某些情况下治疗纤维化。然而，由于免疫细胞在纤维化应答中具有重要作用，因而靶向由大多数或所有呈递分子TGFβ复合物呈递的TGFβ的TGFβ抑制剂可能是有益的。
近年来，由于肝纤维化的治疗在世界范围内日益普及，因而对其的治疗已成为人们越来越感兴趣的领域。例如，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)与代谢异常相关，如肥胖、胰岛素抵抗、空腹高血糖、血脂异常和脂肪因子性质改变。NAFLD的特征是肝细胞中过量脂质累积，且为从肝脂肪变性(肝细胞中脂质/脂肪滴累积)进展成非酒精性脂肪变性肝炎(NASH)、肝纤维化且在最严重情况下最终进展成肝硬化的一系列疾病。伴随纤维化或硬化的NASH增加罹患肝细胞癌(HCC)的风险(Starley BQ,等，Hepatology 2010；51:1820–1832)。已提出从脂肪变性到NASH的发展受到“多重打击”模型的调控，其中第一个打击是胰岛素抵抗和代谢紊乱，其导致肝脂肪变性，其次是氧化应激、促炎性细胞因子介导的肝细胞损伤、由游离脂肪酸介导的脂质分配改变和肝脏毒性、异常肝内胆固醇负荷、高胰岛素血症、高脂血症和低脂联蛋白血症(Tilg H,Moschen AR,Hepatology 2010；52:1836–1846；和Yilmaz Y.,Aliment Pharmacol Ther 2012；36:815–823)。
尽管已经开发了很多用于研究肝纤维化的动物模型，但是可以采用任何适宜的临床前模型。例如，小鼠高脂饮食已被证明可以模拟人NAFLD的组织病理学和发病机制。而且，一些遗传模型还显示了人类代谢综合征和NAFLD的特征，如db/db和ob/ob小鼠模型。还有一些用于研究NASH的动物模型，其主要由各种饮食诱导的模型构成，包括但不限于甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(MCD)、高胆固醇饮食(HCD)、胆碱缺乏的高脂饮食(CDHFD)、胆碱缺乏的L-氨基酸缺乏的饮食、胆碱缺乏的L-氨基酸缺乏的饮食+四氯化碳、高脂饮食+链脲菌素、高脂+高胆固醇饮食(HFHC)、高果糖饮食(HFD)和高果糖高脂饮食(HFHF)。用于研究NASH的遗传小鼠模型包括但不限于foz/foz小鼠、肝细胞特异性PTEN-缺陷型小鼠、Db/db小鼠+二乙基亚硝胺(DEN)和db/db小鼠+MCD。在Jennie Ka Ching Lau等，J Pathol 2017；241:36–44中概述了所有这些模型(包括每个模型的优缺点)的细节；其内容均通过引用并入本文。
可用于检测亚型选择性TGFβ抑制剂在肝纤维化中的功效的另一个模型包括四氯化碳(CCL4)模型。可用于检测亚型选择性TGFβ抑制剂在肝纤维化中的功效的另一个模型包括胆管结扎(BDL)模型(参见，例如，Tag等，J Vis Exp.2015；(96):52438)。
如本文提供的那些亚型特异性TGFβ1抑制剂可用于治疗肝脏的纤维化状况，如脂肪肝(例如，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH))。脂肪肝可能是或可能不是炎症状态。由于脂肪肝(即脂肪性肝炎)导致的肝脏炎症可能发展成瘢痕形成(纤维化)，然后往往发展为肝硬化(扭曲肝脏结构并损害其功能的瘢痕形成)。因此，抑制剂可用于治疗这些状况。在一些实施方式中，抑制剂阻断肝脏纤维化环境内ECM相关TGFβ1(例如，由LTBP1/3呈递的前/潜在TGFβ1)的激活。抑制剂任选地进一步阻断巨噬细胞相关TGFβ1(例如，由LRRC33呈递的前/潜在TGFβ1)的激活，例如，枯否细胞(也称为星状巨噬细胞)以及浸润的单核细胞衍生的巨噬细胞和MDSC。其结果是，抑制剂可能抑制纤维化相关因子(例如，本文所述的纤维化标志物)。在具有这样的状况的受试者中施用抑制剂与未用抑制剂治疗的对照群体相比可能减轻一种或多种症状、预防或延缓疾病的进展、减少或稳定肝脏中的脂肪积累、减少与疾病相关的生物标志物(例如血清胶原蛋白片段)、减少肝脏瘢痕形成、降低肝硬度和/或在使用抑制剂治疗的患者群体中产生的临床上有意义的结果。在一些实施方式中，效量的抑制剂可能在NASH患者中实现肝脏脂肪降低和纤维化(例如，瘢痕形成)减少两者。在一些实施方式中，有效量的抑制剂可能通过至少一个阶段的脂肪性肝炎无恶化在NASH患者中实现纤维化的改善。在一些实施方式中，有效量的抑制剂可能降低NASH患者中肝衰竭和/或肝癌的发生率。
在一些实施方式中，有效量的抑制剂与对照相比可使多种炎症或纤维化的血清生物标志物的水平正常化，如在治疗开始后(例如，12-36周)进行评估。在一些实施方式中，可以将炎症或纤维化生物标志物用于评估NAFLD的严重程度(通过测量肝脂肪变性的水平)、选择要治疗的患者和/或监测疾病进展或治疗应答。例如，血液生物标志物和组合(pannel)可以包括但不限于：
i)脂肪肝指数(BMI、腰围、血清甘油三酯和γ-谷氨酰转移酶(GGT))；
ii)肝硬化指数(血清天冬氨酸转氨酶(AST)：丙氨酸转氨酶(ALT)之比、BMI、性别和是否存在糖尿病)；
i)NAFLD肝脂肪评分(血清ALT、HDL胆固醇、甘油三酯、血红蛋白A1c和白细胞计数)；
ii)SteatoTest(BioPredictive)(总胆红素的血清水平、GGT、α2-巨球蛋白、触珠蛋白、ALT、载脂蛋白AI、总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖(根据年龄和性别调整)和BMI)；和
iii)NAFLD脊评分(ALT的血清水平、HDL胆固醇、甘油三酯、血红蛋白A1c、白细胞计数以及合并症数据(和是否存在高血压))。
在一些实施方式中，可以将成像生物标志物用于评估肝脂肪变性的水平。例如，成像生物标志物可以包括但不限于：超声检查、受控衰减参数(CAP)、MRI-估计的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)和磁共振光谱分析(MRS)。
肝脏活检是目前诊断NASH的标准，然而，病理学家之间的差异限制了这种诊断方法的效用。因此，脂肪肝进展抑制(FLIP)算法(包括组织学脂肪变性、活性和纤维化评分)的使用可用于提高活检对NASH诊断的一致性。而且，很多无创生物标志物也可以用于诊断和监测疾病。因此，在一些实施方式中，可以将炎症或纤维化生物标志物用于评估NASH的严重程度、选择用于治疗的患者和/或监测疾病进展或治疗应答。血液生物标志物可以包括：
i)凋亡标志物，如CK18片段、总细胞角蛋白和sFAS；
ii)炎症标志物，如CRP、TNF、IL-8和CXCL10；
iii)脂质氧化产物，如11-HETE、9-HODE、13-HODE、12-oxo-ODE、LA-13-HODE(oxNASHscore)和11,12-diHETrE；
iv)溶酶体酶，如组织蛋白酶D；和
v)组合组(panel)，如NASHTest(BioPredictive)和NASH诊断组(包括，糖尿病的存在情况、性别、BMI、和血清甘油三酯水平、CK18片段和总CK18)。
在一些实施方式中，可以将生物标志物和相关组用于诊断纤维化和/或硬化的程度、选择用于治疗的患者和/或监测疾病进展或治疗应答。例如，肝纤维化和肝硬化的无创检测包括但不限于：AST:ALT比率、AST:血小板比率指数、纤维化-4指数(年龄、AST、ALT和血小板计数)、NAFLD纤维化评分(年龄、BMI、空腹血糖受损和/或糖尿病、AST ALT、血小板计数和白蛋白)、BARD评分(AST、ALT、BMI和糖尿病)。
特异性的纤维化标志物和组也可能是有用的，并且包括但不限于：透明质酸；PIIPNP；Pro-C3；TIMP1；层粘连蛋白；增强的肝纤维化(ELF)组(PIINP、透明质酸、TIMP1)；FibroTest(GGT、总胆红素、α2m、载脂蛋白AI和触珠蛋白)；和FibroMeter NAFLD(体重、凝血酶原指数、ALT、AST、铁蛋白和空腹血糖)。用于肝纤维化的成像生物标志物可以包括但不限于：FibroScan(TE)、点剪切波弹性成像(pSWE)(又称为超声辐射力脉冲(ARFI))、2D-3DSWE、磁共振弹性成像(MRE)和多参数MRI。
在一些实施方式中，遗传和基因组生物标志物在评估NAFLD风险和严重程度中可能是有用的，其包括评估多种SNP、无细胞ncRNA和miRNA。对已知的遗传和基因组生物标志物，以及上文讨论的血液生物标志物、组、成像标志物和检测的全面综述总结在VWS Wong等，Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2018Aug；15(8):461-478中；其内容通过引用并入本文。
在NASH患者的一些实施方式中，可以在接受一种或多种另外的疗法的患者中施用TGFβ1抑制剂，所述另外的疗法包括但不限于肌肉生长抑制素抑制剂，其通常可以增强具有代谢综合征(包括NASH和NAFLD)的临床表现的患者的代谢调节。
在一些实施方式中，另外的疗法可以包括TGFβ3抑制剂。在一些实施方式中，TGFβ3抑制剂是亚型特异性TGFβ3抑制剂。在一些实施方式中，TGFβ3抑制剂是不依赖于背景的或背景偏倚的TGFβ3抑制剂。在一些实施方式中，NASH患者具有TGFβ1阳性和TGFβ3阳性纤维化组织。在一些实施方式中，NASH患者是或已确定将对TGFβ1抑制剂疗法具有部分应答。
在一些实施方式中，在NASH患者中，可以在接受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(ACCi)(例如，firsocostat(GS-0976)或PF-05221304)的患者中施用亚型特异性TGFβ1抑制剂。可以与本文所述的改进的亚型特异性TGFβ1抑制剂联合使用的其他治疗剂包括但不限于：GLP-1受体激动剂或类似物(例如，索马鲁肽)、法尼醇X受体(FXR)激动剂(例如，GS-9674；又称为Cilofexor)、ASK1抑制剂(例如，司隆色替)；奥贝胆酸，PPAR激动剂(例如，GFT505；又称为elafibranor)；硝唑尼特，己酮糖激酶(KHK)抑制剂(例如，PF-06835919)；和/或二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)抑制剂(例如，PF-06865571)。在一些实施方式中，可以将上文提及的任何一种或多种治疗剂与本公开的亚型特异性TGFβ1抑制剂联用，例如，例如，将亚型特异性TGFβ1抑制剂与FXR激动剂、ACC抑制剂和/或GLP-1类似物联用。在一些实施方式中，可以将亚型选择性TGFβ1抑制剂与肌肉生长抑制素抑制剂联用，如肌肉生长抑制素激活抑制剂(例如，SRK-015，例如，WO 2016/073853和WO 2017/049011)。在一些实施方式中，可以将亚型选择性TGFβ1抑制剂与GDF11抑制剂联用，如GDF11激活抑制剂(例如，WO 2017/015622)。
在一些实施方式中，如通过MRI-PDFF所测量的，单独使用亚型特异性TGFβ1抑制剂或与一种或多种另外的治疗剂联合治疗减少肝脏脂肪。在一些实施方式中，肝脏脂肪减少至少20％，例如≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％或≥50％。在一些实施方式中，单独使用亚型特异性TGFβ1抑制剂或与一种或多种另外的治疗剂联合治疗使血清ALT和/或GGT减少至少20％，例如≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％或≥50％。在一些实施方式中，单独使用亚型特异性TGFβ1抑制剂或与一种或多种另外的治疗剂联合治疗减少胆汁酸合成。
在一些实施方式中，NASH患者可能患有晚期肝纤维化(F3/F4期)。在一些实施方式中，此类患者患有F3期晚期肝纤维化。在一些实施方式中，此类患者患有以肝硬化为特征的F4期肝纤维化。在一些实施方式中，NASH患者发展成或处于发展成肝细胞癌和/或食管静脉曲张的风险中。
根据非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络病理委员会得出的分类，非酒精性脂肪肝疾病的纤维化分期如下：
纤维化表现 纤维化分期
窦周或门静脉周纤维化 1
轻度窦周纤维化(3区) 1A
中度窦周纤维化(3区) 1B
门静脉/门静脉周纤维化 1C
窦周和门静脉/门静脉周纤维化 2
桥接纤维化 3
肝硬化 4
为了实现评估治疗过程中的各种组织学特征并涵盖整个NAFLD系列，NASH临床研究网络(CRN)病理委员会针对NASH中观察到的不同组织学特征与根据病理学委员会的NASH诊断之间的相关性进行了一项彻底的单变量和多变量分析。结果为NASH活性(等级)和胶原蛋白沉积外加架构重塑(分期)的评分系统。分级系统，NASH活性评分(NAS)是三种组织学组分的未加权总和：脂肪变性(0-3)、小叶炎症(0-3)和球囊变性(0-2)。范围从0至8。NAS包括可能是可逆的活性损伤的特征。此外，进一步开发出Brunt等的纤维化分期系统。在NASHCRN系统中，将1期纤维化评分细分为微细(1A)和致密(1B)的窦周纤维化，而将1C期定义为不伴有窦周纤维化的门静脉纤维化(由
Figure BDA0002970630990001261
World J Gastroenterol.2015Oct 21；21(39):11077–11087综述，其通过引用并入本文)。
如本文提供的那些亚型特异性TGFβ1抑制剂可用于治疗肾脏的纤维化状况，例如以细胞外基质积聚为特征的疾病(IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化、新月体性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和糖尿病肾病)，其中已观察到肾小球和肾小管间质中TGFβ的表达显著增加。虽然由TGFβ、纤连蛋白EDA+和PAI-1诱导的两种基质组分的肾小球和肾小管间质沉积在具有基质累积的所有疾病中显著升高，相关性分析已揭示主要与TGFβ1亚型存在密切关联。因此，所述亚型特异性TGFβ1抑制剂可用作其中TGFβ与细胞外基质的病理积累相关的人肾小球病症谱的治疗剂。
在一些实施方式中，肾的纤维化状况与慢性肾病(CKD)相关。CKD主要由高血压或糖尿病引起，每年夺去超过一百万人的生命。CKD患者需要终身医疗护理，从严格的饮食和药物到透析和移植。在一些实施方式中，本文所述的TGFβ1抑制剂疗法可减少或延迟透析和/或移植的需要。在一些实施方式中，这样的疗法可减少其他治疗的需要(例如，剂量、频率)。在一些实施方式中，亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂可以在接受一种或多种其他疗法的患者中施用，包括但不限于肌肉生长抑制素抑制剂，其通常可以增强CKD患者的代谢调节。
可以使用本公开的TGFβ1抑制剂治疗的纤维化病况涉及纤维化和/或慢性炎症。此类病况可以是神经肌肉病症，包括但不限于杜兴氏肌营养不良(DMD)，以及其他遗传病症，如多发性硬化症(MS)和囊性纤维化(CF)。通过抑制ECM和免疫细胞相关的TGFβ1臂两者，认为如本文所述的那些TGFβ1抑制剂抑制纤维化进展并恢复M1/M2巨噬细胞极化。
用于研究CKD和肾纤维化的模型包括但不限于NZB/W、MRL/lpr和BXSB小鼠品系，抗GBM模型，抗Thy1模型，5/6肾切除术，放射性肾病，嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN)和阿霉素肾病，叶酸肾病，CyA肾病，DOCA-盐肾病，HIV相关肾病(HIVAN)转基因小鼠模型，自发性高血压大鼠(SHR)，布法罗/mna大鼠，慕尼黑Wistar
Figure BDA0002970630990001271
(MWF)大鼠，单侧输尿管梗阻(UUO)，Col4A敲除小鼠(Alport综合征)(参见，Yang等，Drug Discov Today Dis Models.2010；7(1-2):13–19；其内容通过引用并入本文)。
可用本文提供的方法治疗的器官纤维化包括心脏(例如，心血管)纤维化。在一些实施方式中，心脏纤维化与心力衰竭相关，例如慢性心力衰竭(CHF)。在一些实施方式中，心力衰竭可能与心肌疾病和/或代谢疾病有关。在一些实施方式中，亚型特异性TGFβ1抑制剂可以在接受一种或多种其他疗法的患者中施用，包括但不限于涉及心脏纤维化和代谢紊乱的心脏功能障碍患者中的肌肉生长抑制素抑制剂。
可以用于研究心脏纤维化的遗传模型包括但不限于心肌细胞特异性FAK-KO小鼠，基因修饰的SR-BI/apoE双KO(dKO)小鼠、多配体聚糖-1缺陷型小鼠、EC-SOD过表达小鼠、PKC-δ敲除小鼠。用于研究心脏纤维化的手术小鼠模型包括但不限于冠状动脉结扎、缺血再灌注模型(开放和闭合胸腔)、慢性缺血模型、缺血预处理的缺血再灌注模型、Langendorff模型、横向主动脉缩窄(TAC)、升主动脉缩窄、腹主动脉缩窄、肺主动脉束带、左前冠状动脉远端结扎的TAC、主动脉腔瘘(ACF)模型和主动脉功能不全模型(参见Rai等，Mol CellBiochem.2017Jan；424(1-2):123–145；其内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，可用本文所述的组合物和/或方法治疗的纤维化状况包括结缔组织。结缔组织可能发生在赘生物周围，导致所述肿瘤(例如，促纤维母细胞瘤)周围的致密纤维化，或腹部手术后腹部内的瘢痕组织。在一些实施方式中，结缔组织与恶性肿瘤相关。由于其围绕恶性肿瘤的致密形成，常规的抗癌疗法(例如，化学疗法)可能无法有效地穿透以到达癌细胞的临床效果。例如本文所述的那些TGFβ1的亚型特异性抑制剂可用于破坏所述结缔组织，从而可以松散纤维化形成以有助于抗癌疗法的效果。在一些实施方式中，TGFβ1的亚型特异性抑制剂可以用作单一疗法(更多描述见下文)。
在一些实施方式中，患者患有纤维化实体瘤(例如，结缔组织增生)，并且被排除或已经被排除在外科手术候选池之外，因为该纤维化实体瘤被认为是不可切除或不可手术的。此类患者可以是接受本公开的TGFβ1抑制疗法的候选人。本发明的TGFβ1抑制剂可以使肿瘤在给药后变得可切除或可手术，使得患者可以成为手术切除的候选人。
为了治疗具有纤维化状况的患者，TGFβ1亚型特异性抑制剂以有效治疗纤维化的量施用至受试者。这样的抗体的有效量是在受试者中实现治疗功效和临床安全性两者的有效量。在一些实施方式中，抑制剂是可以阻断定位(例如，连接)于ECM中的LTBP介导的TGFβ1和定位(例如，连接在)于免疫细胞上的GARP介导的TGFβ1两者的抗体。在一些实施方式中，抗体是可以阻断定位于ECM中的LTBP介导的TGFβ1和定位于(例如，拴系在)单核细胞/巨噬细胞上的LRRC33介导的TGFβ1的激活的抗体。在一些实施方式中，LTBP是LTBP1和/或LTBP3。在一些实施方式中，靶向和抑制由纤维化微环境中的原纤维化M2样巨噬细胞上的LRRC33呈递的TGFβ1可能是有益的。
在确定本公开所述抗体和/或组合物改变纤维化的功效中有用的测定包括但不限于：用于计数成纤维细胞的组织学测定法和在本领域中熟知的基本免疫组化的分析。
在一些实施方式中，可以将循环LAP片段用作纤维化发生的血清标志物。可以将特异性识别此类片段的切割末端的抗体用于检测血液样品中的LAP片段。参见，例如，美国专利号8,198,412，其内容通过引用并入本文。
TGFβ在糖尿病中的作用
胰腺中胰岛素分泌性β细胞的丢失是2型糖尿病的主要机制。最近的研究表明TGFβ家族配体在调节β细胞功能和葡萄糖稳态中的作用。这些配体可能会影响成人中β细胞的增殖和/或来自祖细胞的新β细胞的掺入。据报道，通过胰岛素启动子进行基因操作以引起TGF-β转基因过表达，可导致外分泌胰腺和胰岛发育减少，维持血糖控制。类似地，据报道，通过胰高血糖素启动子的TGF-β转基因过表达导致B细胞发育不全，胰岛素分泌减少，葡萄糖耐量降低(例如，在Trends Endocrinol Metab.2010Jul；21(7):441–448中进行了综述)。胰腺β细胞的扩增和更新对于胰腺的正常发育和成年胰岛功能的维持都是至关重要的。最近，一些研究已经确定了发育中的胰腺中TGFβ信号传导的一些关键作用。具体而言，TGFβ信号传导促进祖细胞的内分泌作用及其随后的成熟。过度表达TGFβII型受体Tulachan等的显性阴性形式的小鼠在受体水平抑制TGFβ信号传导，并发现内分泌前体的数量增加，以及内分泌细胞增殖。在成人胰岛中，所有三种TGFβ亚型在内分泌细胞中均以弥漫性模式表达。然而，在胰岛阳性细胞中TGFβ2和TGFβ3的强度更高。在外分泌胰腺中，大多数腺泡细胞针对TGFβ1呈阳性，而所有三种配体似乎在导管细胞中均等表达。成年β细胞具有非常低的更新(turnover)和较低增殖率。如本文所涵盖的那些亚型选择性TGFβ1抑制剂可以用于在治疗或预防糖尿病和/或葡萄糖不耐受中促进胰腺β细胞复制。因为β细胞的复制是响应不断变化的胰岛素需求而维持和扩增β细胞团块的主要机制，而这种适应性扩增失败会导致糖尿病(参见，例如，Dhawan等，Diabetes.2016May；65(5):1208–1218)，亚型选择性TGFβ1抑制剂可有利地改善糖尿病，而不会引起与TGFβ信号传导的泛抑制有关的有害副作用。在一些实施方式中，亚型选择性TGFβ1抑制剂可以用于与肌肉生长抑制素(例如，选择性结合前/潜在肌肉生长抑制素/GDH8，从而抑制肌肉生长抑制素激活的抗体)联合使用，如例如在PCT/US2015/059468和PCT/US2016/052014中所描述的，用于治疗或预防糖尿病或葡萄糖不耐受。在一些实施方式中，糖尿病是2型糖尿病。
与糖尿病相关的病况包括糖尿病性肾病(DN)，也称为糖尿病性肾脏疾病。糖尿病性肾病是1型糖尿病和2型糖尿病的一种严重的肾脏相关并发症。多达40％的糖尿病患者最终会患上肾脏疾病。随着时间的推移，DN可能导致肺水肿、心血管疾病和终末期肾病，最终需要透析或进行肾脏移植才能生存。
人DN的主要临床特征包括蛋白尿、GFR的进行性降低和高血压，以及心血管疾病风险增加。DN的发病机制与肾小球血管生成和超滤相关。此外，在DN患者中观察到肾小球基底膜增厚，肾小球膜细胞扩张，肾小球硬化和肾小管间质纤维化。在实验性和人糖尿病性肾病两者中TGFβ1及其受体上调。据报道，响应于肾小球细胞中的高糖，出现TGFβ1受体的表达、TGFβ1的生物活性以及对外源性TGFβ1的响应增强，并且提示细胞外腺苷在这一过程中发挥了作用(参见，例如，Roa等，(2009)“Adenosine mediates transforming growth factor-beta 1release in kidney glomeruli of diabetic rats”FEBS Let 583(19):3192-3198)。在一些实施方式中，DN包括腺苷生物合成或信号传导的失调。在一些实施方式中，失调涉及CD39和/或CD73。
TGFβ在肌肉骨骼病况中的作用
在由骨骼、肌肉、软骨、肌腱、韧带、关节和支撑并将组织和器官结合在一起的其他结缔组织组成的肌肉骨骼系统中，TGFβ起着多种作用，包括抑制增殖和分化、诱导萎缩和纤维化的发展。TGFβ减少卫星细胞增殖并阻止分化(通过抑制MyoD和肌细胞生成素)(Allen,R.E.和L.K.J Cell Physiol,1987.133(3):p.567-72；Brennan,T.J.等，Proc Natl AcadSci U S A,1991.88(9):p.3822-6；Massague,J.等，Proc Natl Acad Sci U S A,1986.83(21):p.8206-10；Olson,E.N.等，J Cell Biol,1986.103(5):p.1799-805)。在这些早期论文中没有指定TGFβ的亚型(即TGFβ1、2或3)，但推测其为TGFβ1。TGFβ也有助于肌肉纤维化；直接注射重组TGFβ1导致骨骼肌纤维化，并且泛TFGβ抑制减少急性和慢性损伤肌肉中的纤维化(Li,Y.等，Am J Pathol,2004.164(3):p.1007-19；Mendias,C.L.等，Muscle Nerve,2012.45(1):p.55-9；Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21)。TGFβ1由骨骼肌内的肌纤维、巨噬细胞、调节性T细胞、成纤维细胞和纤维细胞表达(Li,Y.等，Am JPathol,2004.164(3):p.1007-19；Lemos,D.R.等，Nat Med,2015.21(7):p.786-94；Villalta,S.A.等，Sci Transl Med,2014.6(258):p.258ra142；Wang,X.等，J Immunol,2016.197(12):p.4750-4761)；并且在损伤和疾病条件下表达增加(Li,Y.等，Am J Pathol,2004.164(3):p.1007-19；Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21；Bernasconi,P.等，J Clin Invest,1995.96(2):p.1137-44；Ishitobi,M.等，Neuroreport,2000.11(18):p.4033-5)。TGFβ2和TGFβ3也在mdx肌肉中上调(在mRNA水平上)，尽管程度小于TGFβ1(Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21；Zhou,L.等，NeuromusculDisord,2006.16(1):p.32-8)。Pessina等人最近使用谱系示踪实验来证明营养不良肌肉中多种来源的细胞通过TGFβ依赖性途径采取纤维化去向(Pessina,P.等，Stem CellReports,2015.4(6):p.1046-60)。
骨骼是机体内TGFβ的最大贮藏库。实际上，认为TGFβ途径至少部分地通过调节成骨细胞的分化和/或破骨细胞的骨吸收在骨骼内稳态和重塑中起重要作用。该过程涉及在正常和异常情况两者，当失调时，其可能会导致或加剧疾病，例如骨相关状况和癌症。因此，例如本文所述的那些TGFβ1选择性抑制剂可用于治疗这样的状况。在一些实施方式中，施用这样的抑制剂可有效恢复或正常化骨形成-再吸收平衡。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂与另一种疗法(例如肌肉生长抑制素抑制剂和/或骨增强剂)作为联合疗法共同施用至受试者。
骨状况(例如，骨骼疾病)包括骨质疏松症、异型增生和骨癌。除了起源于骨骼的原发性骨癌外，已知许多恶性肿瘤转移至骨骼；这些包括但不限于，乳腺癌、肺癌(例如，鳞状细胞癌)、甲状腺癌、睾丸癌、肾细胞癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤。
在与骨相关的病况中，成骨不全症是一种遗传疾病，通常是由影响I型胶原蛋白编码基因的突变引起的，并导致脆弱的骨骼极易折断。目前，几乎没有治疗选择，其中双膦酸酯类药物仍是标准治疗。可以将选择性抑制TGFβ1激活的抗原或抗原结合片段单独作为单一疗法或与旨在治疗该疾病的其他疗法联合用于治疗成骨不全症。
可以使用适宜的生物标志物监测如本文所述的那些TGFβ1抑制剂的治疗作用，如骨形成(碱性磷酸酶活性)或吸收(抗酒石酸盐的酸性磷酸酶)的血清标志物。
在一些实施方式中，这样的状况与肌无力相关联。
在一些实施方式中，肌肉骨骼病况涉及与肌肉骨骼系统相关的成肌和非成肌干细胞/祖细胞(如卫星细胞)的失调。可以将亚型选择性TGFβ1抑制剂用于促进成肌和非成肌干细胞/祖细胞的扩增/分化。
TGFβ1可能在受影响组织的伴随慢性炎症纤维化病症中起作用，例如人肌营养不良。杜氏肌营养不良症(DMD)是由缺乏肌营养不良蛋白引起的严重、进行性和最终致命的疾病(Bushby,K.等，Lancet Neurol,2010.9(1):p.77-93)。肌营养不良蛋白的缺乏导致对收缩诱导的损伤的易感性增加，导致持续的肌肉退化(Petrof,B.J.等，Proc Natl Acad SciU S A,1993.90(8):p.3710-4；Dellorusso,C.等，J Muscle Res Cell Motil,2001.22(5):p.467-75；Pratt,S.J.等，Cell Mol Life Sci,2015.72(1):p.153-64)。重复的修复有助于慢性炎症、纤维化、卫星细胞池的耗尽，最终丧失活动性和死亡(Bushby,K.等，LancetNeurol,2010.9(1):p.77-93；McDonald,C.M.,et al.,Muscle Nerve,2013.48(3):p.343-56)。在DMD患者中TGFβ1的表达显著增加，并且与在这些患者中观察到的纤维化程度相关(Bernasconi,P.等，J Clin Invest,1995.96(2):p.1137-44；Chen,Y.W.等，Neurology,2005.65(6):p.826-34)。过量的ECM沉积对肌肉的收缩性质具有不利影响，并且由于肌纤维从其血液供应中分离，可限制营养的获取(Klingler,W.等，Acta Myol,2012.31(3):p.184-95)。最近，更多的数据进一步表明TGFβ1在肌营养不良症中的作用。已发现LTBP4中的变体可改变小鼠和人的疾病严重程度。在小鼠中，LTBP4的变体在缺乏肌营养不良蛋白或γ-肌聚糖的小鼠中具有保护作用(Coley,W.D.等，Hum Mol Genet,2016.25(1):p.130-45；Heydemann,A.等，J Clin Invest,2009.119(12):p.3703-12)。在人中，两个研究组独立地确定了LTBP4的变体在DMD中是保护性的，将转移的丧失延迟了几年(Flanigan,K.M.等，AnnNeurol,2013.73(4):p.481-8；van den Bergen,J.C.等，J Neurol NeurosurgPsychiatry,2015.86(10):p.1060-5)。虽然小鼠和人的遗传变异的性质不同，但在两个物种中，保护性变体均导致TGFβ信号传导减少(Heydemann,A.等，J Clin Invest,2009.119(12):p.3703-12)；Ceco,E.等，Sci Transl Med,2014.6(259):p.259ra144)。已经从将纯化的活性生长因子注射到动物中或添加到在培养的细胞的实验中推断出TGFβ1在骨骼肌生物学中的许多功能(Massague,J.等，Proc Natl Acad Sci U S A,1986.83(21):p.8206-10；Li,Y.等，Am J Pathol,2004.164(3):p.1007-19；Mendias,C.L.等，Muscle Nerve,2012.45(1):p.55-9)。鉴于细胞背景对TGFβ1特定功能的重要性(参见，例如，Hinck等，Cold SpringHarb.Perspect.Biol,2016.8(12))，在这些实验中观察到的一些效应可能不反映细胞因子在体内的内源作用。例如，用重组TGFβ1、肌肉生长抑制素或GDF11处理人皮肤成纤维细胞导致这些细胞中基因表达几乎相同的变化，尽管在体内这些蛋白质的作用是完全不同的(Tanner,J.W.,Khalil,A.,Hill,J.,Franti,M.,MacDonnell,S.M.,GrowthDifferentiation Factor 11Potentiates Myofibroblast Activation,in Fibrosis:From Basic Mechanisms to Targeted therapies.2016:Keystone,CO)。
多名研究人员已使用TGFβ抑制剂来阐明生长因子在体内的作用。用泛TFGβ中和抗体1D11治疗mdx小鼠，明显导致纤维化减少(通过组织学和羟脯氨酸含量)、减少肌肉损伤(血清肌酸激酶减少和肌纤维密度增加)，并改善肌肉功能(通过体积描记法，分离EDL肌肉的力生成和前肢握力的增加)(Nelson,C.A.等，Am J Pathol,2011.178(6):p.2611-21；Andreetta,F.等，J Neuroimmunol,2006.175(1-2):p.77-86；Gumucio,J.P.等，J ApplPhysiol(1985),2013.115(4):p.539-45)。此外，显性阴性的TGFβII型受体的肌纤维特异性表达可在心脏毒素损伤后和在δ-肌聚糖-/-小鼠中防止肌肉损伤(Accornero,F.等，HumMol Genet,2014.23(25):p.6903-15)。在骨骼肌中含量丰富并抑制TGFβ活性的蛋白多糖核心蛋白聚糖在mdx小鼠中减少肌肉纤维化和随后的撕裂损伤(Li,Y.等，Mol Ther,2007.15(9):p.1616-22；Gosselin,L.E.等，Muscle Nerve,2004.30(5):p.645-53)。其他具有TGFβ抑制活性的分子，如苏拉明(一种抗肿瘤药)和氯沙坦(一种血管紧张素受体阻滞剂)，可在小鼠的损伤、马凡氏综合征和肌营养不良症模型中有效改善肌肉病理学并且减少纤维化(Spurney,C.F.等，J Cardiovasc Pharmacol Ther,2011.16(1):p.87-95；Taniguti,A.P.等，Muscle Nerve,2011.43(1):p.82-7；Bedair,H.S.等，Am J Sports Med,2008.36(8):p.1548-54；Cohn,R.D.等，Nat Med,2007.13(2):p.204-10)。虽然上述所有治疗剂都抑制TGFβ1或其信号传导，但它们都不是对TGFβ1亚型特异的。例如，1D11结合并抑制TGFβ1、2和3亚型(Dasch,J.R.等，J Immunol,1989.142(5):p.1536-41)。除TGFβ1外，苏拉明还抑制多种生长因子结合至其受体的能力，包括PDGF、FGF和EGF(Hosang,M.,J Cell Biochem,1985.29(3):p.265-73；Olivier,S.等，Eur J Cancer,1990.26(8):p.867-71；Scher,H.I.和W.D.Heston,Cancer Treat Res,1992.59:p.131-51)。核心蛋白聚糖还通过直接结合和通过肌生成抑制蛋白抑制剂卵泡抑素的上调两者来抑制肌生成抑制蛋白活性(Miura,T.等，Biochem Biophys Res Commun,2006.340(2):p.675-80；Brandan,E.,C.Cabello-Verrugio和C.Vial,Matrix Biol,2008.27(8):p.700-8；Zhu,J.等，J Biol Chem,2007.282(35):p.25852-63)。氯沙坦通过其对肾素-血管紧张素-醛固酮系统的影响影响其他的信号传导通路，包括IGF-1/AKT/mTOR途径(Burks,T.N.等，Sci Transl Med,2011.3(82):p.82ra37；Sabharwal,R.和M.W.Chapleau,Exp Physiol,2014.99(4):p.627-31；McIntyre,M.等，Pharmacol Ther,1997.74(2):p.181-94)。因此，所有这些疗法都抑制可能有助于其治疗效果以及毒性的其他分子。
考虑到TGFβ在肌肉内稳态、修复和再生中的作用，药剂，例如如本文所述选择性调节TGFβ1信号传导的单克隆抗体可能对治疗受损肌肉纤维(例如在慢性/遗传性肌营养不良和急性肌肉损伤中)有效，而没有与迄今为止开发的更广泛作用的TGFβ抑制剂相关的毒性。
因此，本发明提供了使用优选地调节体内TGFβ效应的子集而非全部的药剂用于治疗受损肌肉纤维的方法。这样的药剂可以选择性地调节TGFβ1信号传导(“亚型特异性调节”)。
慢性肌肉疾病中肌肉纤维的修复
本发明包括通过限制纤维化并促进肌肉的形态和功能的正常化来改善在DMD患者肌肉质量和功能的方法。由于TGFβ1也抑制肌细胞生成，TGFβ1阻断可促进营养不良肌肉的再生，进一步增加治疗益处。TGFβ1抑制剂可以与肌营养不良蛋白上调疗法组合使用，例如Exondys 51(Eteplirsen)。鉴于TGFβ1抑制在肌营养不良中的潜在治疗益处，至关重要的是：(1)区分TGFβ1与TGFβ2和TGFβ3的作用，和(2)澄清TGFβ1抑制在哪种分子背景中最有益。如前所述，泛TFGβ抑制剂与显著的毒性相关，限制了这些化合物的临床应用(Anderton,M.J.等，Toxicol Pathol,2011.39(6):p.916-24；Stauber,A.等，Clinical Toxicology,2014.4(3):p.1-10)。目前尚不清楚哪种TGFβ亚型引起这些毒性。一些毒性可能是由于免疫系统中的TGFβ1抑制。例如，虽然1D11显著降低膈肌中的纤维化水平，但治疗也增加了肌肉中CD4+和CD8+T细胞的数量，表明泛TFGβ抑制条件下炎症反应增加，其可能在长期治疗中有害(Andreetta,F.等，J Neuroimmunol,2006.175(1-2):p.77-86)。实际上，肌肉中T细胞的消耗改善了mdx小鼠的肌肉病理学，表明T细胞介导的炎症反应对营养不良肌肉有害(Spencer,M.J.等，Clin Immunol,2001.98(2):p.235-43)。施用1D11的条件下T细胞数量的增加可能是由于TGFβ1对调节性T(Treg)细胞的作用。Treg通过GARP在其细胞表面呈递TGFβ1，并且从该复合物释放TGFβ1，增强Treg抑制活性，从而限制T细胞介导的炎症(Wang,R.等，Mol Biol Cell,2012.23(6):p.1129-39；Edwards,J.P.,A.M.Thornton和E.M.Shevach,JImmunol,2014.193(6):p.2843-9；Nakamura,K.等，J Immunol,2004.172(2):p.834-42；Nakamura,K.,A.Kitani和W.Strober,J Exp Med,2001.194(5):p.629-44)。实际上，使用PC61抗体消耗Treg，导致mdx小鼠膈肌炎症和肌肉损伤增加，而Treg数量和活性的增加减少肌肉损伤(Villalta,S.A.等，Sci Transl Med,2014.6(258):p.258ra142)。有趣的是，最近已鉴定出免疫抑制性T细胞的其他群体，Tr1细胞。这些细胞产生大量的抑制活性所必需的TGFβ3(Gagliani,N.等，Nat Med,2013.19(6):p.739-46；Okamura,T.等，Proc Natl AcadSci U S A,2009.106(33):p.13974-9；Okamura,T.等，Nat Commun,2015.6:p.6329)。虽然Tr1细胞在骨骼肌中的作用尚不清楚，但存在这样的可能性：1D11对TGFβ1和TGFβ3两者的抑制可通过抑制Treg和Tr1细胞两者而具有累加的促炎作用。
上述关于TGFβ1的潜伏和激活的结构见解允许特异性靶向TGFβ1药物发现的新方法(Shi,M.等，Nature,2011.474(7351):p.343-9)。三种成熟TGFβ生长因子之间所具有的高度序列同一性不被潜在复合物所共享，从而允许发现对proTGFβ1精准特异的抗体。使用抗体发现的专有方法，本发明人已经鉴定了与proTGFβ1特异性结合的抗体(Ab1、Ab2和Ab3)。使用体外共培养系统，证实这些抗体抑制整联蛋白介导的TGFβ1释放。在该系统中，来源于人皮肤或小鼠骨骼肌的成纤维细胞是潜在TGFβ1的来源，表达αVβ6的细胞系允许释放活性TGFβ1，然后使用表达SMAD2/3响应性荧光素酶报告基因的第三细胞系测量(图12)。已经在体内测试了这些抗体之一Ab1，并且在UUO(单侧输尿管闭塞)小鼠肾纤维化模型中显示出功效。在该模型中，以9mg/kg/周的Ab1处理小鼠(n＝10)，阻止TGFβ1响应基因的上调，并且减少损伤后纤维化的程度(通过天狼星红染色)。与泛TFGβ抑制剂相比，TGFβ1特异性疗法可具有改善的功效和安全性，这是对于将在DMD群体中长期使用的治疗剂的关键方面。TGFβ1抑制性抗体可用于确定特异性TGFβ1抑制是否具有作为DMD或其他肌肉疾病的治疗剂的潜力，并阐明TGFβ1在骨骼肌再生中的作用。
慢性和急性肌纤维损伤以及最佳疗法的选择
在急性损伤(例如对原本健康的肌肉或运动神经元的创伤性损伤)后的正常但可再生的肌肉中，认为炎性巨噬细胞的初始浸润对于清除受损组织并分泌卫星细胞激活所必需的因子(例如，细胞因子)是必需的。随后，这些细胞切换(switch)到M2表型以驱动伤口愈合。
相比之下，在慢性病症中，例如DMD等疾病中，促炎性巨噬细胞始终占主导地位，并且不会发生切换至M2(或至少不够有效)，并且促炎性巨噬细胞继续存在以驱动炎症和肌肉损害。在DMD中，NFkB途径永久活跃，导致组成型炎症。因此，在一些实施方式中，可以向DMD患者施用NFkB抑制剂以减少慢性炎症。
因此，在例如DMD的慢性病症中，治疗焦点可以是肌肉修复而不是肌肉再生。这是因为DMD肌纤维有缺陷但没有被毁坏——它们被膜中的泪液、钙瞬变的失调和来自巨噬细胞的ROS损害所损害。相比之下，在健康肌肉受伤的情况下，治疗重点可能是再生。例如，在心脏毒素模型中，肌肉纤维被杀死并且必须再生。这模拟了创伤性损伤后的恢复过程，例如挤压损伤。
证据表明LRRC33在巯基乙酸盐诱导的具有M2样表型(特征在于它们表达高水平的精氨酸酶，无iNOS和高水平的CD206)的腹膜巨噬细胞中表达。
在LRRC33主要在M2细胞上表达并且其TGFβ1的呈递(“背景”)对这些细胞的促伤口愈合作用很重要的情况下，激活LRRC33介导的TGFβ1以促进修复和/或肌细胞生成(myogenesis)可能是有益的。另一方面，在LRRC33也在促炎M1细胞上表达的情况下，鉴于炎症驱动纤维化，特别是在营养不良的情况下，例如DMD，抑制LRRC33介导的TGFβ1可能是有益的。因此，鉴定疾病相关TGFβ1的来源/背景可能是选择TGFβ信号传导的正确调节剂的重要步骤，这将告知应考虑何种水平的选择性(例如，异构体特异性、背景允许的TGFβ1调节剂、或者背景特异性TGFβ1调节剂；TGFβ1抑制剂或激活剂等)。
除了慢性炎症外，DMD的标志是过度的、进行性的纤维化。在晚期疾病中，纤维化是如此严重以至于它实际上可以将个体肌纤维与其血液供应隔离。它还会改变肌肉的收缩特性。在人类患者中，TGFβ1上调的程度与纤维化之间存在很强的相关性，并且纤维化程度与负迁移结果之间存在密切关联。因此，在一些实施方式中，LTBP-proTGFβ1抑制剂可以施用于营养不良患者，用于预防和/或减少纤维化，以选择性地靶向疾病中ECM相关的TGFβ1效应。在一些实施方式中，本文所述的各种亚型和/或背景选择性药剂可用于实现TGFβ1信号传导的抑制以阻止纤维化和促进肌生成，但不会对免疫系统产生不希望的影响(例如，通过GARP或LRRC33)。
涉及MHC下调或突变的病况
TGFβ相关适应症还可以包括I类主要组织相容性复合物(MHC)缺失或缺乏(例如，下调)的病况。此类病况包括其中MHC介导的信号传导的一个或多个组分受损的遗传病症，以及其中MHC表达被其他因素(如癌症、感染、纤维化和药物)改变的病况。
例如，在肿瘤中MHC I下调与肿瘤从免疫监视逃逸相关。实际上，旨在避免T细胞识别的免疫逃逸策略(包括肿瘤I类MHC表达的丧失)在恶性细胞中通常被发现。已观察到肿瘤免疫逃逸对癌症免疫疗法(包括使用阻断免疫检查点分子的抗体进行治疗)的临床结局具有负面影响(综述在，例如：Garrido等，(2017)Curr Opin Immunol 39:44-51.“The urgentneed to recover MHC class I in cancers for effective immunotherapy”，其通过引用并入本文)。因此，本公开涵盖的亚型选择性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂可以作为单药疗法或与另一疗法(如检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法等)联合施用，以释放或增强抗癌免疫和/或增强对另一疗法的应答或另一疗法的疗效。
在一些实施方式中，MHC下调与对癌症疗法(如CBT)的获得性抗性相关。可以预期的是，TGFβ1的高亲和性、亚型选择性抑制剂可以用于治疗作为癌症疗法(如CBT)的原发性应答者的患者，以降低产生获得性抗性的可能性。因此，在使用TGFβ1抑制剂治疗的癌症疗法的原发性应答者中，可以减少随着时间的推移对癌症疗法的继发性或获得性耐药的发生。
I类MHC蛋白的下调还与某些感染性疾病相关，包括病毒感染，如HIV。参见，例如，Cohen等，(1999)Immunity 10(6):661-671.“The selective downregulation of class Imajor histocompatibility complex proteins by HIV-1protects HIV-infected cellsfrom NK Cells”，其通过引用并入本文。因此，本公开涵盖的亚型选择性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂可以作为单药疗法或与另一疗法(如抗病毒疗法、蛋白酶抑制剂疗法等)联合施用，以释放或增强宿主免疫和/或对另一疗法的应答或另一疗法的疗效。
涉及干细胞自我更新、组织再生和干细胞再增殖的病况
有证据表明，TGFβ1在调节各种干细胞群体的稳态及其在组织内的分化/再增殖中发挥作用。在内稳态期间，组织特异性干细胞主要保持静息，但在一定压力下会触发进入细胞周期。认为TGFβ1在严格调控的干细胞分化和重建过程中起着“断裂”的作用，而触发进入细胞周期的压力与消除“断裂”的TGFβ1抑制作用相吻合。因此，可以预期的是，可以将如本文所述的那些TGFβ1的亚型选择性抑制剂用于偏移(skew)或校正细胞周期以及干细胞/祖细胞G0进入特定组织内的决定。
因此，本公开的发明人考虑在下述条件下使用亚型选择性TGFβ1抑制剂，其中：i)干细胞/祖细胞的分化/重建由于疾病而停止或受到干扰，或作为治疗/调节的副作用而被诱导；ii)患者处于导致健康细胞被杀死或耗竭的治疗或调节中；iii)患者可以从干细胞/祖细胞分化/重建增加中获益；iv)疾病与异常干细胞分化或重建相关。
在自我更新的组织，如骨髓(血细胞产生)和表皮中，增殖和分化过程之间的平衡受到最严格的调控，以确保在整个生命周期中维持干细胞群体。由D’Arcangel等，(2017)Int.J Mol Sci.18(7):1591综述。TGFβ1部分通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p15/INK4b、p21和p57充当细胞周期和肿瘤抑制因子的有效负向调节剂。有证据表明，TGFβ1有助于诱导p16/INK4a和p19/ARF介导某些细胞类型的生长阻滞和衰老。因此，在一些实施方式中，TGFβ1激活的高亲和性亚型选择性抑制剂(如本文所述的那些)用于调节各种干细胞群中p16/INK4a依赖性的细胞衰老和干细胞动力学。
例如，间充质基质/干细胞(MSC)是大多数成人结缔组织(如骨髓、脂肪组织和脐带血)中存在的一小部分基质细胞。MSC在体内处于相对静息状态，但是响应于各种生理和病理刺激，其能够增殖，然后分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或其他中胚层型谱系样平滑肌细胞(SMC)和心肌细胞。多种信号传导网络协调MSC分化成功能性间充质谱系，在该过程中TGF-β1成为主要参与者(例如，由Zhao&Hantash(2011.Vitam Horm 87:127-41综述)。
类似地，终生血细胞生产均需要造血干细胞；以防止耗竭，大部分造血干细胞在稳态造血期间保持静息。然而，在血液学应激期间，这些细胞迅速募集进入细胞周期，并进行广泛的自我更新和分化，以满足不断增加的造血需求。TGFβ1可以作为“开关”来控制静息-再增殖过渡/平衡。
因此，可以将TGFβ1的亚型选择性抑制剂用于治疗涉及造血干细胞缺陷和骨髓衰竭的疾病。在一些实施方式中，造血干细胞储库的耗竭或受损会导致造血功能衰竭或血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，此类病况是其特征为进行性骨髓衰竭的DNA修复病症。在一些实施方式中，此类病况是由干细胞和祖细胞损耗(attrition)引起的。在一些实施方式中，此类病况与贫血相关。在一些实施方式中，此类病况是范科尼贫血(FA)。在一些实施方式中，此类病况的特征在于TGFβ通路过度活跃，该通路可抑制DNA损伤后某些细胞类型的存活。因此，可以预期的是，可以将TGFβ1的亚型选择性抑制剂用于挽救患有FA的受试者中FA造血干细胞的增殖缺陷和/或骨髓衰竭。参见，例如，zhang等，(2016),Cell Stem Cell,18:668-681,“TGF-βinhibition rescues hematopoietic stem cell defects and bonemarrow failure in Fanconi Anemia”。
涉及治疗引起的造血功能失调的病况
公认的是，设计用于治疗各种疾病状况的某些药物常常在所治疗的患者中诱发或加剧贫血(例如，治疗或药物诱导的贫血，如化学疗法诱导的贫血或放射疗法诱导的贫血)。在一些实施方式中，患者接受了骨髓移植药物治疗，所述药物可能引起包括贫血在内的副作用。此类患者可能会从药理学TGFβ1抑制中获益，以促进造血作用。在一些实施方式中，TGFβ1抑制剂可以通过阻止其进入静息状态来促进患者的造血作用。在一些实施方式中，患者可以接受G-CSF疗法(例如，非格司亭)。
因此，本发明包括向接受骨髓抑制疗法(例如，具有包括骨髓移植作用在内的副作用的疗法)的患者施用TGFβ1的亚型选择性抑制剂(如本文公开的那些)的用途。骨髓抑制疗法的实例包括但不限于：聚乙二醇干扰素α-2a、干扰素α-n3、聚乙二醇干扰素α-2b、阿地白介素、吉妥单抗、集成干扰素-1、利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、L-苯丙氨酸、硼替佐米、克拉屈滨、卡莫斯汀、氨苯磺酸、苯丁酸氮芥、雷莫曲塞、丝裂霉素、贝沙罗汀、长春地辛、氟尿苷、硫鸟嘌呤、长春瑞滨、右雷佐生、索拉非尼、链脲菌素、吉西他滨、替尼泊苷、表柔比星、氯霉素、来那度胺、六甲蜜胺、齐多夫定、顺铂、奥沙利铂、环磷酰胺、氟尿嘧啶、丙基硫氧嘧啶、喷司他丁、甲氨蝶呤、卡马西平、长春花碱、利奈唑胺、伊马替尼、氯法拉滨、培美曲塞、道诺霉素、伊立替康、甲巯咪唑、依托泊苷、达卡巴嗪、替莫唑胺、他克莫司、西罗莫司、氮芥、阿扎胞苷、卡铂、放线菌素D、阿糖胞苷、阿霉素、羟基脲、白消安、拓扑替康、巯嘌呤、沙利度胺、美法仑、氟达拉滨、氟胞嘧啶、卡培他滨、丙卡巴肼、三氧化二砷、伊达比星、异环磷酰胺、米托蒽醌、洛莫司丁、紫杉醇、多西他赛、达沙替尼、地西他滨、奈拉滨、依维莫司、伏立诺他、塞替哌、伊沙匹隆、尼罗替尼、贝利司他、曲贝替定、曲妥珠单抗emtansine、替西罗莫司、博舒替尼、苯达莫司汀、卡巴他赛、艾瑞布林、鲁索替尼、卡非佐米、托法替尼、帕纳替尼、泊马度胺、奥比妥单抗、磷酸泰地唑胺、博纳吐单抗、依鲁替尼、帕博西尼、奥拉帕尼、地那昔单抗和秋水仙碱。
其他TGFβ相关适应症可以包括在美国专利公开号2013/0122007、美国专利号8,415,459或国际公开号WO 2011/151432中公开的那些的任一者，其每一个内容的全部内容通过引用并入本文。
在优选的实施方式中，本公开的抗体、其抗原结合部分和组合物可以用于治疗与TGFβ1信号传导相关的多种疾病、病症和/或病况。在一些实施方式中，与其他亚型相比，靶组织/细胞优先表达TGFβ1亚型。因此，本发明包括使用包含本文所述的抗体或其抗原结合部分的药物组合物治疗与TGFβ1表达相关的病况(例如，TGFβ1信号传导失调和/或TGFβ1表达上调)的方法。
在一些实施方式中，疾病涉及与多种细胞来源相关(例如，呈递在其上或沉积于其中)的TGFβ1。在一些实施方式中，此类疾病涉及TGFβ1功能的免疫组分和ECM组分。在一些实施方式中，此类疾病涉及：i)ECM失调(ECM组分(如胶原和蛋白酶)的过量产生/沉积；ECM基底的硬度改变；成纤维细胞(如肌成纤维细胞、纤维细胞和CAF)的异常或病理激活或分化)；ii)由于Treg增加和/或效应T细胞(Teff)抑制引起的免疫抑制，例如Treg/Teff的比例升高；引起CD4和/或CD8 T细胞抑制的白细胞浸润(例如，巨噬细胞和MDSC)增加；和/或iii)髓样细胞，如巨噬细胞(例如，骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞和组织驻留的巨噬细胞)、单核细胞、髓系来源的抑制细胞(MDSC)、中性粒细胞、树突状细胞和NK细胞的异常或病理激活、分化和/或募集。
在一些实施方式中，病况涉及由一种以上呈递分子(例如，GARP、LRRC33、LTBP1和/或LTBP3的两种或更多种)呈递的TGFβ1。在一些实施方式中，受累组织/器官/细胞包括来自多种细胞来源的TGFβ1。仅举一个例子，实体瘤(其还可以包括涉及骨髓的增殖性疾病，例如，骨髓纤维化和多发性骨髓瘤)可以包含来自多种来源的TGFβ1，如癌细胞、基质细胞、周围健康细胞和/或浸润性免疫细胞(例如，CD45+白细胞)，其涉及不同类型的呈递分子。相关免疫细胞包括但不限于髓样细胞和淋巴样细胞，例如，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞(例如，B细胞、T细胞和NK细胞)和单核细胞。TGFβ1的不依赖于背景的抑制剂可以用于治疗此类病况。
下文中提供了可以使用TGFβ1的亚型特异性不依赖于背景的抑制剂(如本文所述的抗体或其片段)治疗的病况或病症的非限制性实例。
治疗方案，施用
为了实施本文所公开的方法，有效量的前文所述的药物组合物可以通过合适的途径施用给需要治疗的受试者(例如，人)，例如静脉内施用，例如，通过肌肉注射、腹膜内注射、脑脊髓内注射、皮下注射、关节内注射、滑膜内注射、鞘内注射、口服、吸入或局部途径推注(bolus)或连续输注一段时间。用于液体制剂的市售喷雾器，包括喷射雾化器和超声雾化器，可用于施用。液体制剂可以直接雾化，并且冻干粉末可以在重构后雾化。或者，特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体或其抗原结合部分可以使用碳氟化合物制剂和计量剂量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。
本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有TGFβ相关适应症、处于TGFβ相关适应症的风险或怀疑具有TGFβ相关适应症的人类患者，例如前文提到的那些。患有TGFβ相关适应症的受试者可通过常规医学检查鉴定，例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波。怀疑患有任何这样的适应症的受试者可能显示该适应症的一种或多种病症。患有适应症的风险的受试者可以是患有该适应症的一种或多种风险因素的受试者。
如本文所用，术语“有效量”和“有效剂量”是指足以实现其预期目的(在组织或受试者中以可接受的益处/风险比率的期望的生物或药物应答)的化合物或组合物的任何量或剂量。例如，在本发明的某些实施方式中，预期目的可以是抑制体内TGFβ-1激活，以实现与TGFβ-1抑制相关的临床上有意义的结果。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重、治疗持续时间、同时治疗的性质(如果有的话)、特定的施用途径以及健康从业者的知识和专业知识中的相似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用个体组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，出于医学原因，心理原因或实际上任何其他原因，患者可坚持较低剂量或可耐受剂量。
经验考虑，例如半衰期，通常将有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体，例如人源化抗体或完全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于TGFβ相关适应症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在本公开的范围内。
在一个实例中，抗体的剂量如本文所述可以在已经给予一次或多次抗体施用的个体上凭经验确定。向个体给予增量剂量的拮抗剂。为了评估功效，可以遵循TGFβ相关适应症的指标。例如，用于测量肌纤维损伤、肌纤维修复、肌肉中的炎症水平和/或肌肉中的纤维化水平的方法是本领域普通技术人员所公知的。
本发明包括这样的认识：能够以亚型特异性方式调节TGFβ的激活步骤的药剂当作为药物使用时，可以提供改进的安全性概况。因此，本发明包括特异性结合和抑制TGFβ1激活但不抑制TGFβ2或TGFβ3激活的抗体及其抗原结合片段，从而赋予体内TGFβ1信号传导的特异性抑制，同时最小化影响TGFβ2和/或TGFβ3信号传导的不需要的副作用。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分当施用于受试者时没有毒性。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分在施用于受试者时表现出与特异性结合TGFβ1和TGFβ2的抗体相比降低的毒性。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分在施用于受试者时表现出与特异性结合TGFβ1和TGFβ3的抗体相比降低的毒性。在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分在施用至受试者时表现出与特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抗体相比降低的毒性。
通常，对于任何本文所述的抗体的施用，初始候选剂量可以是每次施用约1-20mg/kg，例如，每周、每2周、每3周、每月等。例如，患者可以每1周、每2周、每3周或每4周等以约1-10mg/kg接受注射，以有效量治疗疾病(例如，癌症)，其中所述量是耐受良好的(在可接受的毒性或不良事件范围内)。
出于本公开的目的，典型的日剂量(每次施用，如注射和输注)可以为约0.1mg/kg至30mg/kg的范围，取决于前文提到的因素。对于数天或更长时间的重复给药，取决于病症，持续治疗直至出现所期望的症状抑制或直至达到足够的治疗水平以减轻TGFβ相关适应症或其症状。例如，Ab6的适宜有效剂量可以在1mg/kg和30mg/kg之间(例如，1-10mg/kg、1-15mg/kg、3-20mg/kg、5-30mg/kg等)，每周两次、每周一次、每两周一次、每4周一次或每月一次给药。Ab6的适宜有效剂量包括约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg，例如，每周给药一次。
示例性给药方案包括施用初始剂量，随后施用一个或多个维持剂量。例如，初始剂量可以是约1和30mg/kg之间，例如，一周一次或一周两次。此后，可以给予一个或多个维持剂量，例如，约0.1和20mg/kg之间，例如，一周一次、隔周一次、一个月一次等。然而，取决于从业者希望实现的药代动力学衰变的模式，其他剂量方案可能是有用的。药代动力学实验已显示本文公开的抗体(例如，Ab3)的血清浓度在施用于临床前动物模型(例如，小鼠模型)后保持稳定至少7天。不希望受任何特定理论的束缚，施用后的这种稳定性可能是有利的，因为可以较不频繁地施用抗体，同时在施用抗体的受试者(例如，人受试者)中维持临床有效的血清浓度。在一些实施方式中，给药频率是每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次、或每3个月或更长时间一次。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。给药方案(包括使用的抗体)可随时间变化。
在一些实施方式中，对于正常体重的成年患者，可以施用约0.3至5.00mL/kg的剂量范围。具体的剂量方案，例如剂量、时间和重复，将取决于具体的个体和该个体的病史以及个体药剂的性质(例如药剂的半衰期、以及其他相关的考虑因素)。
根据本公开，治疗上有效治疗TGFβ1相关适应症的高亲和性亚型选择性抗体的血清浓度可以是至少约10μg/mL，例如，约10μg/mL至1.0mg/mL之间。在一些实施方式中，如通过血清浓度测量的抗体的有效量是约20-400μg/mL。在一些实施方式中，如通过血清浓度测量的抗体的有效量是约100-800μg/mL。在一些实施方式中，如通过血清浓度测量的，抗体的有效量是至少约20μg/mL，例如，至少约50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL或200μg/mL。如在本文的实施例12中所详细描述的，在非人灵长类动物中，在保持血清浓度水平约2,000-3,000μg/mL至少8周后，没有观察到与Ab6相关的毒性(例如：无心脏毒性、增生和炎症、牙齿和牙龈发现)。因此，可以达到约10-100倍的治疗窗。
出于本公开的目的，特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体的适当剂量将取决于使用的特异性抗体(或其组合物)、适应症的类型和严重程度、抗体是否用于预防或治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对拮抗剂的响应以及主治医师的判断。在一些实施方式中，临床医生将施用特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体直至剂量达到实现所期望的结果。特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受体的生理状况、给药的目的是治疗性的还是预防性的、以及技术人员已知的其他因素。特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体的施用可以在预选的一段时间内基本连续，或者可以是一系列的间隔剂量，例如，在发展TGFβ相关适应症之前、期间或之后。
如本文所用，术语“治疗”是指出于治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响适应症、适应症的症状或朝向适应症的倾向的目的，将包含一种或多种活性药剂的组合物应用或施用至具有TGFβ-相关适应症、适应症的症状或朝向适应症的倾向的受试者。
使用特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体缓解TGFβ相关适应症包括延迟适应症的发展或进展、或减少适应症的严重程度。缓解适应症并不一定需要治愈效果。如其中所使用的，“延迟”与TGFβ相关适应症相关的适应症的发展意味着推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推后适应症的进展。该延迟可以具有不同的时间长度，取决于适应症的历史和/或被治疗的个体。“延迟”或缓解适应症的发展或延迟适应症的开始的方法是与不使用该方法相比在给定时间范围内降低发展适应症的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内减轻症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的许多受试者。
DBA2/J小鼠在LTBP4等位基因中具有40bp的缺失。与潜在TGFb1相关的ECM的失调可能暴露Ab1结合的表位。可能存在其中Ab1结合的表位暴露的疾病，并且如果指示TGFb1抑制，那些疾病可能是Ab1的治疗机会。
联合疗法
本公开还包括作为联合疗法用于治疗可以从体内TGFβ抑制受益的受试者的药物组合物和相关方法。在任何这些实施方式中，这样的受试者可以接受联合疗法，所述联合疗法包括含有至少一种TGFβ抑制剂的第一组合物，例如本文所述的抗体或其抗原结合部分，以及包含至少一种用于治疗相同或重叠的疾病或临床病症的另外的治疗剂的第二组合物。第一和第二组合物两者可以作用于相同的细胞靶标或离散的细胞靶标。在一些实施方式中，第一和第二组合物可以治疗或减轻疾病或临床病症的症状或方面的相同或重叠组。在一些实施方式中，第一和第二组合物可以治疗或减轻疾病或临床病症的症状或方面的单独组。仅举一个实例，第一组合物可以治疗与TGFββ信号传导有关的疾病或病症，而第二组合物可以治疗与同一疾病有关的炎症或纤维化等。这样的联合疗法可以相互结合给药。在联合疗法的上下文中，短语“与...组合”意指在接受联合疗法的受试者中第一疗法的治疗效果暂时和/或空间地与第二疗法的治疗效果重叠。因此，联合疗法可以配制成用于同时施用的单一制剂，或者配制成用于疗法的顺序施用的单独制剂。
在优选的实施方式中，联合疗法在疾病的治疗中产生协同效应。术语“协同”是指大于每种单一疗法总计的累加效应(例如，更高的功效)的效应。
在一些实施方式中，包含本文所述的药物组合物的联合疗法产生整体相当于由另一种疗法产生的(例如第二药剂的单一疗法)功效，但与第二药剂的单一疗法相比与较少的不希望的第二药剂的不利影响或较不严重的第二药剂的毒性相关联。在一些实施方式中，这样的联合疗法允许较低剂量的第二药剂但保持总体功效。这样的联合疗法可能特别适用于需要长期治疗和/或涉及儿科患者的患者群体。
因此，如本文所述，本发明提供在用于减少TGFβ1蛋白激活和治疗或预防与TGFβ1信号传导相关的疾病或病症的联合疗法中使用的药物组合物和方法。因此，该方法或药物组合物还包含第二疗法。在一些实施方式中，第二疗法可用于治疗或预防与TGFβ1信号传导相关的疾病或病症。第二疗法可以减少或治疗与靶疾病相关的至少一种症状。第一和第二疗法可以通过相似或不相关的作用机制发挥其生物学作用；或者，第一和第二疗法中的一种或两种可以通过多种作用机制发挥其生物学作用。
应当理解的是，本文所述的药物组合物可含有在相同的药学上可接受的载体中或在对各个所述的实施方式不同的药学上可接受的载体中的第一和第二疗法。还应当理解，第一和第二疗法可在所述实施方式中同时或顺序施用。
本发明的一种或多种抗TGFβ抗体、或其抗原结合部分可以与一种或多种另外的治疗剂组合。可以与本发明的抗TGFβ抗体一起使用的另外的治疗剂的实例包括但不限于：癌症疫苗，工程化的免疫细胞疗法，化学疗法，放射疗法，TGFβ超家族成员的调节剂，例如肌肉生长抑制素抑制剂和GDF11抑制剂；VEGF激动剂；IGF1激动剂；FXR激动剂；CCR2抑制剂；CCR5抑制剂；双CCR2/CCR5抑制剂；CCR4抑制剂，赖氨酰氧化酶样-2抑制剂；ASK1抑制剂；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂；p38激酶抑制剂；吡非尼酮；尼达尼布(Nintedanib)；M-CSF抑制剂(例如，M-CSF受体拮抗剂和M-CSF中和剂)；MAPK抑制剂(例如，Erk抑制剂)、免疫检查点激动剂或拮抗剂；IL-11拮抗剂；和IL-6拮抗剂等。可以与TGFβ抑制剂一起使用的另外的治疗剂的实例包括但不限于，吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制剂、精氨酸酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、Ser/Thr激酶抑制剂、双特异性激酶抑制剂。在一些实施方式中，这样的药剂可以是PI3K抑制剂、PKC抑制剂或JAK抑制剂。
在一些实施方式中，另外的药剂是检查点抑制剂。在一些实施方式中，另外的药剂选自PD-1拮抗剂、PDL1拮抗剂、PD-L1或PDL2融合蛋白、CTLA4拮抗剂、GITR激动剂、抗ICOS抗体、抗ICOSL抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗OX40抗体(OX40激动剂)、抗CD27抗体、抗CD70抗体、抗CD47抗体、抗41BB抗体、抗PD-1抗体、溶瘤病毒和PARP抑制剂。在一些实施方式中，本文公开的高亲和性、不依赖于背景的TGFβ1激活抑制剂用于在受试者中治疗癌症，所述受试者是检查点抑制疗法(如本文所列的那些)的较差应答者或无应答者。
在一些实施方式中，另外的药剂结合T细胞共刺激分子，例如抑制性共刺激分子和激活性共刺激分子。在一些实施方式中，另外的药剂选自抗CD40抗体、抗CD38抗体、抗KIR抗体、抗CD33抗体、抗CD137抗体和抗CD74抗体。
在一些实施方式中，另外的疗法是放射。在一些实施方式中，另外的药剂是化学治疗剂。在一些实施方式中，化学治疗剂是紫杉醇。在一些实施方式中，另外的药剂是抗炎剂。在一些实施方式中，另外的药剂抑制单核细胞/巨噬细胞募集和/或组织浸润的过程。在一些实施方式中，另外的药剂是肝星状细胞激活的抑制剂。在一些实施方式中，另外的药剂是趋化因子受体拮抗剂，例如CCR2拮抗剂和CCR5拮抗剂。在一些实施方式中，这样的趋化因子受体拮抗剂是双特异性拮抗剂，例如CCR2/CCR5拮抗剂。在一些实施方式中，作为联合疗法施用的另外的药剂是或包含TGFβ生长因子超家族的成员或其调节剂。在一些实施方式中，这样的药剂选自GDF8/肌肉生长抑制素和GDF11的调节剂(例如，抑制剂和激活剂)。在一些实施方式中，这样的药剂是GDF8/肌肉生长抑制素信号传导的抑制剂。在一些实施方式中，这样的药剂是单克隆抗体，其特异性结合前体/潜在的肌肉生长抑制素复合物并阻断肌肉生长抑制素的激活。在一些实施方式中，特异性结合前体/潜在肌肉生长抑制素复合物并阻断肌肉生长抑制素激活的单克隆抗体不结合游离的成熟的肌肉生长抑制素。
在一些实施方式中，另外的疗法包括细胞疗法，如CAR-T疗法。
在一些实施方式中，另外的疗法是癌症疫苗。很多检测基于肽的癌症疫苗的临床试验针对的是血液系统恶性肿瘤(血液癌症)、黑色素瘤(皮肤癌)、乳腺癌、头颈癌、胃食道癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌。抗原包括来自HER2、端粒酶(TERT)、存活素(BIRC5)和Wilms肿瘤1(WT1)的肽。一些试验还使用了12-15个不同肽段的“个体化”混合物。也就是说，其含有来自患者肿瘤的肽混合物，患者对其表现出免疫应答。一些试验针对实体瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、以及乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和非小细胞肺癌，并且包括来自MUC1、IDO1(吲哚胺2,3-双加氧酶)、CTAG1B、和两种VEGF受体FLT1和KDR的抗原。值得注意的是，在患有黑色素瘤，联用免疫检查点抑制剂伊匹单抗和BRAF(基因)抑制剂维罗非尼的患者中对IDO1疫苗进行了检测。
用作癌症疫苗的肿瘤抗原的非限制性实例包括：NY-ESO-1、HER2、HPV16 E7(乳头瘤病毒科#E7)、CEA(癌胚抗原)、WT1、MART-1、gp100、酪氨酸酶、URLC10、VEGFR1、VEGFR2、存活、MUC1和MUC2。
然而，可以部分地通过TGFβ1依赖性机制从TME中排除由此类癌症疫苗初免激活的免疫细胞。为了克服免疫抑制，可以考虑使用本公开的高亲和性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂，以释放疫苗的潜力。
本文考虑的组合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免了与各种单用疗法相关的可能的毒性或并发症。在一些实施方式中，使用本文所述的TGFβ1的亚型特异性抑制剂可以使那些对疗法(例如，标准治疗)应答较差或不应答的人具有更高的应答性。在一些实施方式中，使用本文所述的TGFβ1的亚型特异性抑制剂可以降低疗法(例如，标准治疗)的剂量，其在患者中仍产生同等的临床功效，但更少或程度更低的药物相关毒性或不良事件。
在一些实施方式中，本文考虑的TGFβ1的亚型选择性抑制剂可以与TGFβ3的亚型选择性抑制剂联合使用(例如，联合疗法、加用疗法等)。此类用途可以进一步包括另外的疗法，如癌症疗法，例如，免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、放射疗法和/或化学疗法。
在一些实施方式中，本文考虑的TGFβ1的亚型选择性抑制剂可以与肌生长抑制素(GDF8)的选择性抑制剂联合使用(例如，联合疗法、加用疗法等)。
诊断、患者选择、监测
包括TGFβ1抑制疗法的治疗方法可以包括TGFβ1适应症的诊断和/或可能对此类疗法产生应答的患者的选择。此外，可以监测接受TGFβ1抑制剂治疗的患者的治疗效果，其通常包括测量一种或多种适宜的参数，这些参数可以指示病况，并且可以在治疗前后进行测量(例如，测定)，并评估治疗相关的参数改变。例如，此类参数可以包括在从患者收集的生物样品中存在的生物标志物的水平。生物标志物可以是基于RNA的、基于蛋白的、基于细胞的和/或基于组织的。B例如，可以将在某些疾病条件下过表达的基因用作诊断和/或监测疾病或对疗法的应答的生物标志物。可以将疾病相关细胞群的细胞表面蛋白作为生物标志物。此类方法可以包括直接测量指示特定疾病程度的疾病参数，如肿瘤尺寸/体积。可以使用任何适宜的取样方法，如血清/血液样品、活检和成像。活检可以包括组织活检(如肿瘤)和液体活检。
尽管传统上活检是诊断和监测各种疾病，如纤维化(例如，器官纤维化)和增殖性病症(例如，癌症)的标准，但创伤性较小的替代方法可能是首选的。例如，很多无创体内成像技术可以用于诊断、监测和选择要治疗的患者。因此，本发明包括在患者或受试者中诊断和/或监测疾病的体内成像技术的用途。在一些实施方式中，患者或受试者正在接受如本文所述的亚型特异性TGFβ1抑制剂。在其他实施方式中，可以用于选择使用亚型选择性TGFβ1抑制剂治疗的患者的体内成像技术。在一些实施方式中，此类技术可以用于确定患者是否对疗法(例如，TGFβ1抑制疗法)产生应答或者应答如何。
用于所述方法的示例性体内成像技术包括但不限于X射线射线照相术、磁共振成像(MRI)、医学超声成像或超声、内窥镜检查、弹性成像、触觉成像、热成像、医学摄影。其他成像技术包括核医学功能成像，例如正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。进行这些技术和分析结果的方法是本领域公知的。
通常用于诊断和监测癌症的无创成像技术包括但不限于：磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、超声、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、荧光反射成像(FRI)和荧光介导的断层扫描(FMT)。混合成像平台也可以用于诊断和监测癌症。例如，混合技术包括但不限于：PET-CT、FMT-CT、FMT-MRI和PET-MRI。动态对比增强MRI(DCE-MRI)是另一种通常用于检测乳腺癌的成像技术。进行这些技术和分析结果的方法是本领域公知的。
通常用于诊断和监测纤维化的无创成像技术包括但不限于：超声(例如，常规超声或对比增强超声)、超声弹性成像(例如，瞬时弹性成像、点剪切波弹性成像和2D剪切波弹性成像)、CT扫描(例如，常规CT或CT灌注成像)、磁共振成像(MRI)(例如，常规MRI、磁共振弹性成像、弥散加权磁共振成像、钆塞酸二钠和磁共振灌注成像)。
在一些实施方式中，将无创成像技术用于评估肝纤维化或肝脂肪变性的水平。例如，特别地用于评估肝纤维化的成像技术可以包括但不限于：FibroScan(瞬时弹性成像；TE)、点剪切波弹性成像(pSWE；又称为声辐射力脉冲(ARFI))、2D-3D SWE、磁共振弹性成像(MRE)和多参数MRI。对于评估肝脂肪变性特别有用的成像技术可以包括但不限于：超声检查、受控衰减参数(CAP)弹性成像、MRI估计的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)和磁共振波谱(MRS)。在一些实施方式中，将体内成像技术用于评估肝脏硬度。在一些实施方式中，将体内成像技术用于检测和评估肝内甘油三酯水平。在一些实施方式中，将体内成像技术用于评估肝脏表面结节(LSN；又称为“肝脏评分”)、肝脏硬度和/或肝脏节段体积比(LSVR)，这些均对肝纤维化分期和肝硬化亚分期有益。进行这些技术和分析结果的方法是本领域公知的。
最近，正在开发无创成像方法，其将允许在体内检测目标细胞(例如，细胞毒性T细胞、巨噬细胞和癌细胞)。参见，例如，www.imaginab.com/technology/；Tavare等，(2014)PNAS,111(3):1108-1113；Tavare等，(2015)J Nucl Med 56(8):1258-1264；Rashidian等，(2017)J Exp Med 214(8):2243-2255；Beckford Vera等，(2018)PLoS ONE13(3):e0193832；和Tavare等，(2015)Cancer Res 76(1):73-82，其每一个均通过引用并入本文。所谓的“T细胞追踪”旨在在体内检测和定位抗肿瘤效应T细胞。这可能为了解实体瘤的免疫抑制表型提供有用的见解。细胞毒性T细胞充分浸润的肿瘤(“发炎”或“热”肿瘤)可能对癌症治疗(如检查点阻断疗法(CBT))产生应答。另一方面，即使存在抗肿瘤免疫应答，具有免疫抑制表型的肿瘤也往往具有较差的T细胞浸润。这些所谓的“免疫排除”肿瘤可能无法对癌症疗法(如CBT)产生应答。T细胞追踪技术可以揭示这些不同表型，并提供信息以指导将可能对患者有益的治疗方法。例如，具有“免疫排除”肿瘤的患者可能从TGFβ1抑制剂疗法中获益，以帮助逆转免疫抑制表型。可以预期的是，可以将相似技术用于诊断和监测其他疾病(例如，纤维化)。通常，可以将使用检测部分(例如，放射性标记、荧光等)工程化改造的抗体或抗体样分子输注入患者体内，然后将其分布并定位在特定标志物(例如CD8+和M2巨噬细胞)的位点。
可以将无创体内成像技术以各种适宜的方法应用于诊断患者的目的；选择或鉴定可能从TGFβ1抑制剂疗法从获益的患者；和/或，监测患者治疗后的治疗应答。具有已知细胞表面标志物的任何细胞都可以通过使用特异性结合细胞标志物的抗体或类似分子来检测/定位。通常，通过使用此类技术检测的细胞是免疫细胞，如细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、MDSC、疾病相关的巨噬细胞(M2巨噬细胞，如TAM和FAM)、NK细胞、树突状细胞和中性粒细胞。
适宜免疫细胞标志物的非限制性实例包括单核细胞标志物、巨噬细胞标志物(例如，M1和/或M2巨噬细胞标志物)、CTL标志物、抑制性免疫细胞标志物、MDSC标志物(例如，针对G-和/或M-MDSC的标志物)，包括但不限于：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD206、CD68、CD14、CD15、CD66、CD34、CD25和CD47。
可以采用上述体内成像技术来检测、定位和/或追踪被诊断出患有TGFβ1相关疾病(如癌症和纤维化)的患者中的某些MDSC。健康个体在循环中不具有或具有较低频率的MDSC。随着这种疾病的发作或进展，可以检测到升高水平的循环和/或疾病相关的MDSC。例如，已报道，CCR2阳性的M-MDSC会累积到炎症组织中，并可能导致组织中纤维化(如肺纤维化)的进展，并且这与TGFβ1表达相关。类似地，在很多实体瘤(包括三阴性乳腺癌)中富含MDSC，并且其部分有助于TME的免疫抑制表型。因此，可以通过定位或追踪MDSC监测对根据本公开的TGFβ1抑制疗法的治疗应答。可检测的MDSC的减少或频率降低通常指示具有治疗获益或更好的预后。
与健康对照相比，已知很多人类癌症在患者中会引起MDSC水平升高(例如，在Elliott等，(2017)“Human tumor-infiltrating myeloid cells:phenotypic andfunctional diversity”Frontiers in Immunology,Vol.8,Article 86中进行了综述)这些人类癌症包括但不限于：膀胱癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑色素瘤、NSCL、卵巢癌、胰腺癌和肾细胞癌。可以在诸如外周血单核细胞(PBMC)和组织样品(例如，肿瘤活检)的生物学样品中检测到MDSC水平升高。例如，MDSC的频率或数量变化可以测量为：总PBMC的百分比(％)、CD14+细胞的百分比(％)、CD45+细胞的百分比(％)；单核细胞的百分比(％)、总细胞的百分比(％)、CD11b+细胞的百分比(％)、单核细胞的百分比(％)、非淋巴细胞MNC的百分比(％)、KLA-DR细胞的百分比(％)，使用适宜的细胞表面标志物(表型)。
此外，使用免疫细胞标志物，在癌症的情况下，可以确定肿瘤是否具有免疫排除表型。如果确定肿瘤具有免疫排除表型，则单独的癌症疗法(如CBT)可能是无效的，因为肿瘤在肿瘤环境中缺乏足够的细胞毒性细胞。因此，使用TGFβ1抑制剂(如本文所述的那些)的加用疗法可以降低免疫抑制，从而使癌症疗法抗性肿瘤对癌症疗法更加敏感。可以预期的是，免疫标志物还能够用于在纤维化背景下追踪免疫细胞，和/或确定纤维化组织的免疫细胞组分(例如，以追踪巨噬细胞和/或肌成纤维细胞的存在情况)。
因此，本发明还包括一种用于治疗TGFβ1相关疾病或病况的方法，所述方法可以包括以下步骤：i)选择诊断为患有TGFβ1相关疾病或病况的患者；和，ii)以有效治疗所述疾病或病况的量向所述患者施用本文涵盖的抗体或片段。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括检测疾病标志物(例如，如本文所述的纤维化或癌症标志物)，其中任选地检测包括活检分析、血清标志物分析和/或体内成像。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括如本文所述的体内成像技术。
在一些实施方式中，TGFβ1相关的疾病或病况是纤维化病况。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括检测肌成纤维细胞，或其一种或多种标志物。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括检测肝脂肪变性、肝甘油三酯、免疫细胞和/或肌成纤维细胞。在一些实施方式中，检测包括活检分析、血清标志物分析和/或体内成像。在一些实施方式中，体内成像包括超声、超声弹性成像、CT扫描、MRI、PET-SPECT、光学荧光/生物发光FibroScan(TE)、pSWE、2D-3D SWE、MRE、超声成像、CAP、MRI-PDFF和/或MRS。在一些实施方式中，体内成像包括直接或间接标记结合免疫细胞的细胞表面标志物的免疫细胞或抗体。在一些实施方式中，体内成像包括使用示踪剂。
在一些实施方式中，体内成像技术可测量肝脂肪变性、肝甘油三酯、免疫细胞(例如，如下文所述)和/或肌成纤维细胞。在一些实施方式中，治疗降低病变组织中的甘油三酯、脂肪变性、肝表面结节、炎症和/或巨噬细胞。在一些实施方式中，治疗可将肝内甘油三酯含量降低至≤5.5％。在一些实施方式中，治疗减少病变组织中的MDSC。在一些实施方式中，治疗减少病变组织中的巨噬细胞。在一些实施方式中，治疗有效量是从0.1mg/kg至30mg/kg，优选地3mg/kg至30mg/kg。在一些实施方式中，所述方法还包括监测受试者的如本文所述的治疗应答(例如，甘油三酯降低、脂肪变性减少、肝表面结节减少、炎症减少、巨噬细胞减少和/或肝脏评分降低)。
本发明还包括一种用于治疗癌症的方法，所述方法可以包括以下步骤：i)选择被诊断为患有包括实体瘤在内的癌症的患者，其中所述实体瘤是或者疑似是免疫排除肿瘤；和，ii)以治疗癌症的有效量向所述患者施用本文涵盖的抗体或片段。优选地，患者已接受或者是接受癌症疗法的候选人，如免疫检查点抑制疗法(例如，PD-(L)1抗体)、化学疗法、放射疗法、工程化免疫细胞疗法和癌症疫苗疗法。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括检测免疫细胞或其一种或多种标志物，其中任选地检测包括肿瘤活检分析、血清标志物分析和/或体内成像。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括如本文所述的体内成像技术。在一些实施方式中，所述方法还包括监测如本文所述的治疗应答。
在一些实施方式中，进行体内成像用于检测在受试者中对TGFβ1抑制疗法的治疗应答。体内成像可以包括任何一种本文所述的成像技术，和测量任何一种本文所述的标志物和/或参数。例如，在肝纤维化的情况下，治疗应答可以包括减少肝脂肪变性、降低甘油三酯含量、减少ECM沉积/纤维化、减少肝硬化和/或减少疾病进展。在一些实施方式中，如通过MRI所测量的，使用如本文所述的亚型特异性TGFB1抑制剂治疗可将肝内甘油三酯含量降低至≤5.5％。在癌症的情况下，治疗应答可以包括将免疫排除肿瘤转变为发炎的肿瘤(这与免疫细胞向肿瘤的浸润增加有关)，缩小肿瘤尺寸和/或减小肿瘤进展。通过增加肿瘤内免疫细胞的频率或检测信号的程度(如放射性标记和荧光)，可以看到免疫细胞浸润增加。
在一些实施方式中，用于诊断、选择、治疗或监测患者的体内成像包括MDSC跟踪，如G-MDSC(也称为PMN-MDSC)和M-MDSC。例如，在基线时MDSC可能在疾病部位(如纤维化组织和实体瘤)富集。治疗(例如，TGFβ1抑制剂疗法)后，可以观察到更少的MDSC，如通过标记(如放射性同位素和荧光)强度降低所测量的，提示治疗作用。
在一些实施方式中，体内成像包括追踪或定位LRRC33阳性细胞。LRRC33阳性细胞包括例如MDSC和激活的M2样巨噬细胞(例如，TAM和与纤维化组织相关的激活的巨噬细胞)。例如，在基线时LRRC33阳性细胞可能在疾病部位(如纤维化组织和实体瘤)富集。治疗(例如，TGFβ1抑制剂疗法)后，可以观察到更少细胞表达细胞表面LRRC33，如通过标记(如放射性同位素和荧光)强度降低所测量的，提示治疗作用。
在一些实施方式中，本文所述的体内成像技术可以包括使用PET-SPECT、MRI和/或光学荧光/生物发光，以检测目标细胞。
在一些实施方式中，用检测部分标记抗体或抗体样分子可以包括直接标记或间接标记。
在一些实施方式中，检测部分可以是示踪剂。在一些实施方式中，示踪剂可以是放射性同位素，其中任选地所述放射性同位素可以是正电子发射同位素。在一些实施方式中，放射性同位素选自以下：18F、11C、13N、15O、68Ga、177Lu、18F和89Zr。
因此，此类方法可用于在免疫PET中使用标记的抗体进行体内成像。
因此，本发明还包括一种用于在受试者中治疗TGFβ1适应症的方法，所述方法包括使用成像技术诊断、患者选择和/或监测治疗效果的步骤。在一些实施方式中，根据本公开的高亲和性、亚型选择性TGFβ1抑制剂用于治疗TGFβ1适应症，其中所述治疗包括施用有效量的TGFβ1抑制剂以治疗适应症，并且进一步包括通过体内成像在受试者中检测治疗效果的步骤。任选地，使用包括体内成像的诊断或选择步骤，可以选择受试者作为接受TGFβ1抑制剂疗法的候选人。TGFβ1适应症可以是增殖性病症(如实体瘤和骨髓纤维化的癌症)或纤维化病症(如器官纤维化)。
在一些实施方式中，受试者患有癌症，其中所述方法包括以下步骤：i)选择被诊断为患有包括实体瘤在内的癌症的患者，其中所述实体瘤是或疑似是免疫排除的肿瘤；和，ii)以治疗癌症的有效量向所述患者施用本文涵盖的抗体或片段。优选地，患者已接受或者是接受癌症疗法的候选人，如免疫检查点抑制疗法(例如，PD-(L)1抗体)、化学疗法、放射疗法、工程化免疫细胞疗法和癌症疫苗疗法。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括检测免疫细胞或其一种或多种标志物，其中任选地所述检测包括肿瘤活检分析、血清标志物分析和/或体内成像。在一些实施方式中，选择步骤(i)包括如本文所述的体内成像技术。在一些实施方式中，所述方法还包括监测如本文所述的治疗应答。
用于检测大型潜在复合物(LLC)的测定
在一些实施方式中，本文提供的方法和组合物涉及用于检测从受试者获得的样品的GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物、和/或LRRC33-TGFβ1复合物的方法。如本文所用，“受试者”是指个体生物，例如个体哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物。在一些实施方式中，受试者是绵羊、山羊、牛、家禽、猫或狗。在一些实施方式中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、苍蝇或线虫。在一些实施方式中，受试者是研究动物。在一些实施方式中，受试者是基因工程化的，例如基因工程化的非人受试者。受试者可以是任一性别和任何发育阶段。在一些实施方式中，受试者是患者或健康志愿者。
在一些实施方式中，用于检测从受试者获得的样品的GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的方法涉及：(a)在适合抗体与抗原结合的条件下，使特异性结合GARP-TGFβ1复合物、LTBP1-TGFβ1复合物、LTBP3-TGFβ1复合物和/或LRRC33-TGFβ1复合物的抗体与样品接触，如果抗原存在于样品中，则由此形成结合复合物；和(b)确定与抗原结合的抗体水平(例如，确定结合复合物的水平)。
在一个实施方式中，筛选测定利用固定在表面上的生物素化的潜在TGFβ1复合物，这允许通过系链由整联蛋白激活潜在TGFβ1。其他非整联蛋白也可以在该系统中测试。读取结果可以通过报告细胞或其他TGFβ依赖性细胞响应。
用于测量TGFβ激活的基于细胞的测定
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来测量TGFβ的激活(和TGFβ测试抑制剂例如抗体对其的抑制)。例如，整联蛋白介导的TGFβ激活可用于基于细胞的测定，例如本文更详细描述的“CAGA12”报告子(例如，荧光素酶)测定。如所示，这样的测定系统可包含以下组分：i)TGFβ来源(重组、内源或转染)；ii)激活子来源，例如整联蛋白(重组、内源或转染)；iii)响应于TGFβ激活的报告系统，例如表达能够响应于TGFβ的TGFβ受体并将信号转化为可读输出(例如，CAGA12细胞或其他报告细胞系中的荧光素酶活性)的细胞。在一些实施方式中，报告细胞系包含在TGFβ响应性启动子(例如PAI-1启动子)控制下的报告基因(例如，荧光素酶基因)。在一些实施方式中，赋予敏感性的某些启动子元件可以整合到报告系统中。在一些实施方式中，这样的启动子元件是CAGA12元件。已经描述了可用于测定的报告细胞系，例如，Abe等，(1994)Anal Biochem.216(2):276-84，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，前述测定组分中各自由相同的来源(例如，相同的细胞)提供。在一些实施方式中，前述测定组分中的两种由相同的来源提供，并且第三测定组分由不同的来源提供。在一些实施方式中，所有三种测定组分均由不同的来源提供。例如，在一些实施方式中，整联蛋白和潜在TGFβ复合物(proTGFβ和呈递分子)由相同的来源(例如，相同的转染细胞系)提供用于测定。在一些实施方式中，整联蛋白和TGF由单独的来源(例如，两种不同的细胞系、纯化的整联蛋白和转染的细胞的组合)提供用于测定。当细胞用作一种或多种测定组分的来源时，测定的这样的组分可以是细胞内源的、在细胞中稳定表达的、瞬时转染或其任何组合。
本领域技术人员可以容易地将这样的测定适应于各种合适的配置。例如，可以考虑多种TGFβ来源。在一些实施方式中，TGFβ来源是表达和沉积TGFβ的细胞(例如，原代细胞、增殖细胞、永生化细胞或细胞系等)。在一些实施方式中，使用合适的方法纯化TGFβ来源和/或将重组TGFβ固定在测定系统中。在一些实施方式中，固定在测定系统中的TGFβ呈递于具有或不具有去细胞化的测定板上的细胞外基质(ECM)组合物中，模拟成纤维细胞来源的TGFβ。在一些实施方式中，TGFβ呈递于测定中使用的细胞的细胞表面上。另外，选择的呈递分子可以被包括在测定系统中以提供合适的潜在TGFβ复合物。本领域普通技术人员可以容易地确定哪些呈递分子可以在某些细胞或细胞类型中存在或表达。使用这样的测定系统，可以容易地测量在存在或不存在测试试剂(如抗体)的情况下TGFβ激活的相对变化以评价测试试剂对体外TGFβ激活的影响。来自示例性的基于细胞的测定的数据在下文的实施例部分中提供。
这样的基于细胞的测定可以依赖于正在研究的TGFβ亚型、潜在复合物的类型(例如，呈递分子)等以许多方式被修改或者定制。在一些实施方式中，已知表达能够激活TGFβ的整联蛋白的细胞可用作测定中整联蛋白的来源。这样的细胞包括SW480/β6细胞(例如，克隆1E7)。在一些实施方式中，表达整联蛋白的细胞可以与编码感兴趣的呈递分子(例如GARP、LRRC33、LTBP(例如，LTBP1或LTBP3)等)的质粒和编码感兴趣的TGFβ亚型(例如proTGFβ1)的前体形式的质粒共转染。转染后，将细胞孵育足够的时间以允许转染基因的表达(例如，约24小时)，洗涤细胞，并与连续稀释的测试试剂(例如抗体)一起孵育。然后，将报告细胞系(例如，CAGA12细胞)加入到测定系统中，然后进行适当的孵育时间以允许TGFβ信号传导。在加入测试试剂后的孵育期(例如，约18-20小时)后，使用合适的方法(例如，对于表达荧光素酶的报告细胞系，可以使用Bright-Glo试剂(Promega))检测信号/读取结果(例如，荧光素酶活性)。在一些实施方式中，可以使用具有自动增益(autogain)设置的BioTek(Synergy H1)平板读数器检测荧光素酶荧光。
数据表明，本发明的示例性抗体能够以不依赖于背景的方式选择性地抑制TGFβ1的激活。
核酸
在一些实施方式中，本公开的抗体、其抗原结合部分和/或本发明的组合物可以由核酸分子编码。这样的核酸分子包括但不限于DNA分子、RNA分子、多核苷酸、寡核苷酸、mRNA分子、载体、质粒等。在一些实施方式中，本公开可包含编程或产生以表达编码本公开的化合物和/或组合物的核酸分子的细胞。在一些情况下，本公开的核酸包括密码子优化的核酸。产生密码子优化的核酸的方法是本领域已知的，并且可以包括但不限于美国专利号5,786,464和6,114,148中描述的那些，其全部内容各自通过引用并入本文。
某些实施方式的列表
下文中列出了本公开的非限制性实施方式：
1.一种抗体或其抗原结合片段，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或其抗原结合片段以≤10nM(任选地≤5nM)的KD结合下述抗原复合物中的每一者：
i)hLTBP1-proTGFβ1；
ii)hLTBP3-proTGFβ1；
iii)hGARP-proTGFβ1；和，
iv)hLRRC33-proTGFβ1；
其中所述抗体或其片段是全人或人源化抗体或其片段。
2.根据实施方式1所述的抗体或抗原结合片段，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或抗原结合片段以≤5nM的KD结合所述i)hLTBP1-proTGFβ1和所述ii)hLTBP3-proTGFβ1复合物的每一者，其中任选地，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或片段以≤1nM的KD结合所述复合物的每一者
3.一种抗体或其抗原结合片段，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或其抗原结合片段以≤200pM(任选地≤100pM)的KD结合下述抗原复合物中的每一者：
i)hLTBP1-proTGFβ1；
ii)hLTBP3-proTGFβ1；
iii)hGARP-proTGFβ1；和，
iv)hLRRC33-proTGFβ1；
其中所述抗体或其片段是全人或人源化抗体或其片段。
4.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
所述CDR-H1具有以FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5)表示的氨基酸序列，其中任选地，X1是S、G或A；X2是S或F；X3是F或Y；X4是S或A；和/或，X5是D、N或Y(SEQ ID NO:143)；
所述CDR-H2具有以YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG表示的氨基酸序列，其中任选地，X1是S或H；X2是P或S；X3是S或D；X4是D或S；和/或，X5是D或G(SEQ ID NO:144)；
所述CDR-H3具有以(X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P表示的氨基酸序列，其中任选地，X1是A或V；X2是G或A；X3是V或T；X4是L或W；X5是Y或M；和/或，X6是M或D(SEQ ID NO:145)；
所述CDR-L1具有氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO:105)，其任选地具有1或2个氨基酸改变；
所述CDR-L2具有氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:106)，其任选地具有1或2个氨基酸改变；和
所述CDR-L3具有氨基酸序列QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)，其任选地具有1或2个氨基酸改变。
5.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
所述CDR-H1具有氨基酸序列FTFSSFSMD(SEQ ID NO:107)，其任选地具有至多4个氨基酸改变，或至多2个氨基酸改变；
所述CDR-H2具有氨基酸序列YISPSADTIYYADSVKG(SEQ ID NO:103)，其任选地具有至多4个氨基酸改变；
所述CDR-H3具有氨基酸序列ARGVLDYGDMLMP(SEQ ID NO:6)，其任选地具有至多3个氨基酸改变；
所述CDR-L1具有氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO:105)，其任选地具有1或2个氨基酸改变；
所述CDR-L2具有氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO:106)，其任选地具有1或2个氨基酸改变；和，
所述CDR-L3具有氨基酸序列QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)，其任选地具有1或2个氨基酸改变。
6.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，
其中所述CDR-H1包含GFTFSSFS(SEQ ID NO:2)；所述CDR-H2包含ISPSADTI(SEQ IDNO:4)；所述CDR-H3包含ARGVLDYGDMLMP(SEQ ID NO:6)；和CDR-L1包含QDITNY(SEQ ID NO:8)；所述CDR-L2包含DAS(SEQ ID NO:10)；和，所述CDR-L3包含QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)。
7.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其结合表位，所述表位包含潜伏套索的一个或多个氨基酸残基，其中任选地所述表位是组合表位，其中进一步任选地，所述组合表位包含生长因子结构域的指-1和/或指-2的一个或多个氨基酸残基。
8.根据实施方式7所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQ ID NO:169)的一个或多个氨基酸残基，和其中任选地所述表位还包含RKDLGWKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:165)和/或VGRKPKVEQL(SEQ ID NO:168)的一个或多个氨基酸残基。
9.根据实施方式8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQ ID NO:169)的一个或多个氨基酸残基，和RKDLGWKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:165)的一个或多个氨基酸残基。
10.根据实施方式8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQ ID NO:169)的一个或多个氨基酸残基和VGRKPKVEQL(SEQID NO:168)的一个或多个氨基酸残基。
11.根据实施方式7所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL(SEQ ID NO:169)的一个或多个氨基酸残基，RKDLGWKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:165)的一个或多个氨基酸残基和VGRKPKVEQL(SEQ IDNO:168)的一个或多个氨基酸残基。
12.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段是全人或人源化抗体或抗原结合片段。
13.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段与人和小鼠proTGFβ1复合物交叉反应。
14.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段是人IgG4或IgG1亚型。
15.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段包含产生IgG1样铰链的Ser至Pro的骨架取代。
16.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，如通过基于细胞的报告子测定所测量的，其针对下述复合物的每一者均具有≤2nM的IC50：
i)hLTBP1-proTGFβ1；
ii)hLTBP3-proTGFβ1；
iii)hGARP-proTGFβ1；和，
iv)hLRRC33-proTGFβ1。
17.一种分离的单克隆抗体或其片段，如通过生物层干涉法或表明等离子体共振所测量的，所述单克隆抗体或其片段以≤1nM的亲和性特异性结合下述抗原的每一者：
a)人LTBP1-proTGFβ1复合物；
b)人LTBP3-proTGFβ1复合物；
c)人GARP-proTGFβ1复合物；和，
d)人LRRC33-proTGFβ1复合物，
其中，所述单克隆抗体显示出对上述复合物中的任一者的亲和性相对于其他复合物不超过三倍的偏倚，和，
其中所述单克隆抗体抑制成熟TGFβ1生长因子从所述proTGFβ1复合物的每一者而非从proTGFβ2或proTGFβ3复合物释放。
18.一种分离的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段在具有氨基酸序列PGPLPEAV(SEQ ID NO:161)或其一部分的结合区特异性结合proTGFβ1复合物，
其特征在于，当在溶液中结合至所述proTGFβ1复合物时，如通过氢氘交换质谱(HDX-MS)所确定的，所述抗体或所述片段保护所述结合区免于溶剂暴露；和
其中，如通过生物层干涉法或表面等离子体共振所测量的，所述抗体或所述片段以≤5nM的亲和性特异性结合以下复合物的每一者：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。
19.一种分离的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段在具有氨基酸序列LVKRKRIEA(SEQ ID NO:159)或其一部分的结合区特异性结合proTGFβ1复合物，
其特征在于，当在溶液中结合至所述proTGFβ1复合物时，如通过氢氘交换质谱(HDX-MS)所确定的，所述抗体或所述片段保护所述结合区免于溶剂暴露；和，
其中，如通过生物层干涉法或表面等离子体共振所测量的，所述抗体或所述片段以≤5nM的亲和性特异性结合以下复合物的每一者：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1。
20.一种分离的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段在以下区域特异性结合proTGFβ1复合物：
i)第一结合区，其包含潜伏套索(SEQ ID NO:153)的至少一部分；和
ii)第二结合区，其包含指-1(SEQ ID NO:151)的至少一部分；
其特征在于，当在溶液中结合至所述proTGFβ1复合物时，如通过氢氘交换质谱(HDX-MS)所确定的，所述抗体或所述片段保护所述结合区免于溶剂暴露。
21.根据权利要求45所述的抗体或片段，其中所述第一结合区包含PGPLPEAV(SEQID NO:161)或其一部分和所述第二结合区包含RKDLGWKW(SEQ ID NO:170)或其一部分。
22.根据前述任一个实施方式所述的抗体或片段，其中所述抗体是不依赖于背景的抗体，如通过生物层干涉法或表面等离子体共振所测量的，使得其以小于五倍偏倚的亲和性结合基质相关proTGFβ1复合物和细胞相关proTGFb1复合物。
23.根据权利要求43-47中任一项所述的抗体或片段，所述抗体或片段以≤1nM的亲和性特异性结合以下复合物的每一者：mLTBP1-proTGFβ1、mLTBP3-proTGFβ1、mGARP-proTGFβ1和mLRRC33-proTGFβ1。
24.根据前述任一个实施方式所述的抗体或片段，所述抗体或片段在一个或多个下述结合区或其一部分结合所述proTGFβ1复合物：
LVKRKRIEA(SEQ ID NO:159)；
LASPPSQGEVPPGPL(SEQ ID NO:153)；
PGPLPEAV(SEQ ID NO:161)；
LALYNSTR(SEQ ID NO:162)；
REAVPEPVL(SEQ ID NO:163)；
YQKYSNNSWR(SEQ ID NO:164)；
RKDLGWKWIHE(SEQ ID NO:171)；
HEPKGYHANF(SEQ ID NO:172)；
LGPCPYIWS(SEQ ID NO:166)；
ALEPLPIV(SEQ ID NO:167)；和，
VGRKPKVEQL(SEQ ID NO:168)。
25.根据前述任一个实施方式所述的抗体或片段，其具有选自以下的CDR序列：
GFTFSSFS(SEQ ID NO:2)
ISPSADTI(SEQ ID NO:4)
ARGVLDYGDMLMP(SEQ ID NO:6)
QDITNY(SEQ ID NO:8)
DAS和(SEQ ID NO:10)
QQADNHPPWT(SEQ ID NO:12)。
26.根据实施方式25所述的抗体，其包含所有所述CDR。
27.一种抗体或其抗原结合片段，其结合以下抗原的每一者：
hLTBP1-proTGFβ1
hLTBP3-proTGFβ1
hGARP-proTGFβ1；和，
hLRRC33-proTGFβ1；
其中，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或所述片段以≤1nM的KD结合所述hLTBP1-proTGFβ1和hLTBP3-proTGFβ1的每一者；
其中所述抗体或所述片段结合表位，所述表位包含LRLASPPSQGEVPPGPLPEAV(SEQID NO:173)的一个或多个氨基酸残基，和任选地所述表位还包含RKDLGWKWIHEPKGYHANF(SEQ ID NO:165)的一个或多个氨基酸残基。
28.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或所述片段以≤1nM的亲和性结合LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1的每一者；和
其中所述抗体或所述片段以比细胞相关proTGFβ1复合物高至少10倍的亲和性结合基质相关proTGFβ1复合物。
29.根据前述实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述IC50是≤5nM，其中任选地所述IC50是≤1nM。
30.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段能够抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活。
31.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段能够抑制TGFβ1的蛋白酶依赖性激活。
32.根据前述任一个实施方式所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段能够抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和TGFβ1的蛋白酶依赖性激活。
33.根据前述任一个实施方式所述的抗体或其片段，其不特异性结合proTGFβ2或proTGFβ3。
34.根据前述任一个实施方式所述的抗体或其片段，其不特异性结合游离TGFβ1生长因子，所述游离TGFβ1生长因子不与proTGFβ1复合物相关联。
35.一种抗体或其抗原结合片段，其与前述任一个实施方式所述的抗体或片段交叉阻断。
36.一种试剂盒，其包含根据前述任一个实施方式所述的抗体或片段。
37.一种组合物，其包含根据前述任一个实施方式所述的抗体或片段，和药学上可接受的赋形剂。
38.根据实施方式37所述的组合物，其用于在受试者中治疗TGFβ相关适应症的疗法。
39.根据实施方式38所述的组合物，其中所述TGFβ相关适应症是癌症、骨髓纤维化、干细胞病症和/或纤维化病症。
40.根据实施方式38所述的组合物，其中所述TGFβ相关适应症选自以下：
i)其中TGFβ1过表达或TGFβ1信号传导失调的疾病；
ii)与异常干细胞分化或再增殖相关的疾病，其任选地是：
a)干细胞/祖细胞的分化/重建由于疾病而停止或受到干扰，或被诱导作为治疗/调节的副作用；
b)患者处于导致健康细胞被杀死或耗竭的治疗或调节中；
c)患者可以从干细胞/祖细胞分化/重建增加中获益；
d)疾病与异常干细胞分化或重建相关
iii)涉及造血功能失调的病况，如治疗引起的造血功能失调；
iv)具有一种或多种选自以下的基因的异常基因表达的疾病：
Serpine 1(编码PAI-1)、MCP-1(又称为CCL2)、CCL3、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFB1、CTGF、ACTA2(编码α-SMA)、ITGA11、SNAI1、MMP2、MMP9、TIMP1、FOXP3、CDH1(E钙粘蛋白)和CDH2；
v)涉及蛋白酶的疾病
vi)涉及间质转化的疾病，如上皮至间质转化(EMT)和/或内皮至间质转化(EndMT)；
vii)涉及免疫抑制的疾病，其中任选地所述免疫抑制包括增加疾病部位的免疫抑制细胞，其中进一步任选地所述免疫抑制细胞是M2巨噬细胞和/或MDSC；
viii)涉及基质硬化和重塑的疾病；任选地包括ECM硬化；
ix)器官纤维化，任选地晚期器官纤维化
x)原发性和继发性骨髓纤维化
xi)恶性肿瘤/癌症
a)实体瘤，任选地晚期实体瘤或转移性肿瘤；
b)血液癌症。
41.根据实施方式40所述的组合物，其中所述癌症包括实体瘤，或者，其中所述癌症是血液癌症。
42.根据实施方式41所述的组合物，其中所述实体瘤对癌症疗法具有较差的响应，其中任选地所述癌症疗法是检查点抑制剂疗法、癌症疫苗、化学疗法、放射疗法、溶瘤病毒疗法、IDO抑制剂疗法和/或工程化的免疫细胞疗法。
43.根据实施方式41所述的组合物，其中所述实体瘤是免疫排除肿瘤。
44.根据实施方式41所述的组合物，其中所述实体瘤包含Treg、瘤内M2巨噬细胞和/或MDSC。
45.根据实施方式41所述的组合物，其中所述实体瘤包含富含CAF和/或肌成纤维细胞的基质。
46.根据实施方式41所述的组合物，其中所述受试者正在接受或是接受选自以下的癌症疗法的候选人：化学疗法、放射疗法、CAR-T、癌症疫苗、溶瘤病毒疗法和检查点抑制剂疗法。
47.根据实施方式41所述的组合物，其中所述癌症的特征是对所述癌症疗法具有获得的抗性或原发性抗性。
48.根据实施方式38-47中任一项所述的组合物，其中癌症的所述治疗包括施用治疗有效量的所述组合物，以减少所述实体瘤的所述生长，其中任选地所述组合物的所述施用增加存活。
49.根据实施方式38-48中任一项所述的组合物，其中所述治疗包括以1-30mg/kg之间的剂量范围施用所述组合物。
50.一种选择可能对TGFβ1抑制疗法产生应答的受试者的方法，其包括以下步骤：
鉴别被诊断为患有癌症的受试者，其中，i)所述癌症是已知易于对癌症疗法产生抗性的一类癌症，和/或，ii)所述受试者对癌症疗法具有抗性，其中任选地所述受试者是对所述癌症疗法的原发性无应答者；
其中任选地所述癌症疗法是化学疗法、放射疗法和/或免疫检查点抑制疗法；和，
选择所述受试者作为TGFβ1抑制疗法的候选人。
51.一种治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
i)选择被诊断为患有包含实体瘤的癌症的患者，其中所述实体瘤是或疑似是免疫排除的肿瘤；
ii)以治疗所述癌症的有效量向所述患者施用根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段，
其中(a)所述患者已接受，或者是接受选自以下的癌症疗法的候选人：免疫检查点抑制疗法(CBT)、化学疗法、放射疗法、工程化免疫细胞疗法和癌症疫苗疗法；或，(b)所述患者患有统计学上具有较低主要缓解率的癌症，和其中所述患者尚未接受CBT。
52.根据权利要求25所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
53.根据权利要求26所述的方法，其中选择步骤(i)包括检测免疫细胞或其一个或多个标志物。
54.根据权利要求27所述的方法，其中所述检测包括肿瘤活检分析、血清标志物分析和/或体内成像。
55.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述免疫细胞选自以下：细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、MDSC、肿瘤相关巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞和中性粒细胞。
56.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞标志物选自以下：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD68、CD14、CD34、CD25、CD47。
57.根据权利要求28所述的方法，其中所述体内成像包括T细胞追踪。
58.根据权利要求28或权利要求31所述的方法，其中所述体内成像包括使用PET-SPECT、MRI和/或光学荧光/生物发光。
59.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述体内成像包括直接或间接标记免疫细胞或结合免疫细胞的细胞表面标志物的抗体。
60.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中所述体内成像包括使用示踪剂。
61.根据权利要求34所述的方法，其中所述示踪剂是放射性同位素。
62.根据权利要求35所述的方法，其中所述放射性同位素是正电子发射同位素。
63.根据权利要求36所述的方法，其中所述放射性同位素选自以下：18F、11C、13N、15O、68Ga、177Lu、18F和89Zr。
64.根据权利要求28-37中任一项所述的方法，其中所述体内成像包括在免疫-PET中使用标记的抗体。
65.根据权利要求28-38中任一项所述的方法，其中进行所述体内成像以监测所述受试者对TGFβ1抑制疗法的治疗应答。
66.根据权利要求39所述的方法，其中所述治疗应答包括将免疫排除的肿瘤转化成发炎的肿瘤。
67.一种鉴定用于治疗用途的TGFβ1激活的亚型选择性抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
i)选择抗体或抗原结合片段的库，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或抗原结合片段的库在体外能够以≤10nM的KD结合以下每一者：hLTBP1-proTGFβ1；hLTBP3-proTGFβ1；hGARP-proTGFβ1；和hLRRC33-proTGFβ1；
ii)选择能够抑制TGFβ激活的抗体或抗原结合片段的库，任选地在基于细胞的测定中；
iii)在体内功效研究中检测来自步骤i)和ii)的一个或多个抗体或其抗原结合片段；
iv)在体内毒理学/安全性研究中检测来自步骤i)-iii)的一个或多个抗体或其抗原结合片段；和，
v)鉴定来自步骤i)-iv)的一个或多个抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段显示的在体内功效研究中确定的有效剂量低于在体内毒理学/安全性研究中确定的NOAEL。
68.根据实施方式1-15中任一个的抗体或片段在制备用于治疗TGFβ1适应症的药物中的用途。
69.根据实施方式68所述的用途，还包括对包含所述抗体或所述片段的制剂进行无菌过滤的步骤。
70.根据实施方式68或实施方式69所述的用途，还包括灌装和/或包装到小瓶或注射器中的步骤。
71.一种制备包含亚型选择性TGFβ1抑制剂的药物组合物的方法，所述方法包括：
i)提供能够以1nM或更低的KD结合以下中的每一者的抗体：hLTBP1-proTGFβ1、hLTBP3-proTGFβ1、hGARP-proTGFβ1和hLRRC33-proTGFβ1，
ii)进行体内功效研究，其中向临床前模型施用步骤(i)的所述抗体以确定有效量，
iii)使用已知对TGFβ抑制敏感的动物模型进行毒理学研究，以确定观察到不希望的毒性的量；
iv)基于步骤(ii)和(iii)确定或确认足够的治疗窗；和，
v)制备包含所述抗体的药物组合物。
72.一种制备根据实施方式1-35中任一项所述的抗体或片段的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供抗原，所述抗原包含proTGFβ1复合物，任选地包含以下至少两者：LTBP1、LTBP3、GARP、LRRC33或其片段，
ii)针对结合步骤(i)的抗原的能力选择抗体或片段的库；
iii)任选地从所述库中除去显示出不希望的结合性质的抗体或片段；
iv)针对抑制TGFβ1的能力选择选自步骤(ii)和/或(iii)的抗体或片段的库；
v)任选地产生全人或人源化抗体或抗体的片段，抗体或片段选自步骤(iv)，以提供人源或人源化的抑制剂；
vi)进行体外结合测定以确定针对以下的亲和性：LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1，
vii)进行功能性测定以确定或确认抑制剂针对TGFβ1和任选地TGFβ2和/或TGFβ3的活性。
73.根据实施方式72所述的方法，其还包括在临床前动物模型中的体内功效研究和体内毒理学研究中评估候选抗体或其片段，从而确定显示出有效和安全或可耐受两者的有效量的步骤。
74.根据实施方式72或实施方式73所述的方法，还包括配制成药物组合物的步骤。
75.根据实施方式74所述的组合物，其用于在人类受试者中治疗纤维化的治疗用途。
76.根据实施方式74所述的组合物，其用于在人类受试者中治疗骨髓纤维化的治疗用途。
77.根据实施方式74所述的组合物，其用于在人类受试者中治疗癌症的治疗用途。
78.根据实施方式77所述的组合物，其中所述癌症包括实体瘤。
79.根据实施方式78所述的组合物，其中所述实体瘤是局部晚期实体瘤。
80.根据实施方式77-79中任一项所述的组合物，其中所述癌症对癌症疗法具有较差的响应，其中任选地所述癌症疗法是检查点抑制剂疗法、癌症疫苗、化学疗法、放射疗法、IDO抑制剂疗法和/或工程化的免疫细胞疗法。
81.根据实施方式80所述的组合物，其中所述癌症的特征是具有获得性抗性或原发性抗体。
82.根据实施方式81所述的组合物，其中所述肿瘤的特征是免疫排除的。
83.根据实施方式78-82中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤包含瘤内M2巨噬细胞和/或MDSC。
84.根据实施方式78-82中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤包含富含CAF的基质。
85.根据实施方式80所述的组合物，其中所述受试者正在接受或是接受选自以下的癌症疗法的候选人：化学疗法、放射疗法、CAR-T、癌症疫苗、溶瘤病毒疗法和检查点抑制剂疗法。
86.根据实施方式中任一项所述的组合物，其中使用TGFβ3抑制剂对受试者进行进一步治疗。
87.根据实施方式70所述的组合物，其中所述受试者患有TGFβ1阳性和TGFβ3阳性癌症，并且其中所述受试者已接受、正在接受或者是接受检查点抑制剂疗法的候选人。
88.根据实施方式77-84中任一项所述的组合物，其中所述受试者不是进行肿瘤手术切除的候选人。
89.根据实施方式37所述的组合物，其用于在人类受试者中增强宿主免疫力，
其中所述受试者患有癌症，和
其中所述免疫应答包括抗癌免疫力。
90.根据实施方式89所述的组合物，其中所述增强宿主免疫力包括减少来自肿瘤的免疫排除或促进免疫细胞浸润至肿瘤。
91.根据实施方式89所述的组合物，其中所述增强宿主免疫力包括抑制TGFβ1的纤溶酶依赖性激活。
92.根据实施方式37所述的组合物，其中所述受试者处于发展成细胞因子风暴的风险中。
93.根据实施方式37所述的组合物，其中所述受试者正在接受或者是接受工程化的免疫细胞疗法的候选人。
94.根据权利要求37所述的组合物，其中所述受试者正在接受或者是接受癌症疫苗的候选人。
95.根据实施方式76-94中任一项所述的组合物，其中所述受试者正在接受或者是接受免疫检查点抑制剂疗法的候选人，其中任选地所述受试者对免疫检查点抑制剂疗法具有较差的响应。
96.根据实施方式37所述的组合物，其用于在人类受试者中预防细胞因子释放综合征(例如，细胞因子风暴或败血症)，其中任选地所述受试者患有感染或MS。
97.根据权利要求37所述的组合物，其用于在受试者中抑制TGFβ1的纤溶酶依赖性激活的方法中。
98.一种在受试者中治疗TGFβ1适应症的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用治疗有效量的亚型选择性TGFβ1抑制剂以治疗适应症，其中，所述亚型选择性TGFβ1抑制剂是单克隆抗体，如通过溶液平衡滴定所测量的，所述单克隆抗体以≤10nM的KD特异性结合以下的每一者：hLTBP1-proTGFβ1；hLTBP3-proTGFβ1；hGARP-proTGFβ1；和hLRRC33-proTGFβ1。
99.根据实施方式98所述的方法，其中，如通过溶液平衡滴定所测量的，所述抗体以≤1nM的KD结合以下的每一者：hLTBP1-proTGFβ1和hLTBP3-proTGFβ1，其中任选地，所述抗体以以≤1nM的KD结合以下的每一者：hLTBP1-proTGFβ1；hLTBP3-proTGFβ1；hGARP-proTGFβ1；和，hLRRC33-proTGFβ1复合物。
100.根据实施方式98或实施方式99所述的方法，其中所述抗体结合潜伏套索或其一部分。
101.根据实施方式100所述的方法，其中所述抗体还结合指-1、指-2或其一个或多个部分。
102.根据实施方式98-101中的任一项所述的方法，其中所述TGFβ1适应症是选自以下的增殖性病症：癌症和骨髓增生性病症。
103.根据实施方式102所述的方法，其中所述受试者是癌症疗法的较差应答者，其中任选地所述癌症疗法包括检查点抑制疗法、化学疗法和/或放射疗法。
104.根据实施方式102所述的方法，其中进一步使用癌症疗法联合亚型选择性TGFβ1抑制剂对所述受试者进行治疗。
本发明通过以下实施例进一步说明，不应将这些实施例解释为是限制性的。
实施例
实施例1：体外结合性质
1)基于BLI的测定：
通过
Figure BDA0002970630990001541
测定在人proTGFβ1细胞上测量Ab4、Ab5、Ab6和Ab3的亲和性，同时通过CAGA12报告细胞检测人proTGFβ1抑制来测量活性。用于测量抗体对本文提供的复合物的亲和性的方案总结在下表19中，且本公开的示例性抗体亲和性性质的总结列表提供在本文的表8中。
表19：用于进行
Figure BDA0002970630990001552
结合测定的示例性方案
Figure BDA0002970630990001551
Figure BDA0002970630990001561
例如，使用聚苯乙烯96孔黑色半面积平板(Greiner Bio-One)在FortéBio OctetRed384上使用生物层干涉法测量Ab6与TGFβ抗原的结合。根据生产厂商的说明书，使用胺反应性二代(AR2G)试剂盒(FortéBio)，在将抗原与胺反应性二代(AR2G)生物传感器(FortéBio)偶联后，进行Ab6与人成熟TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3生长因子以及人潜在TGFβ1的结合。在实验开始之前，首先将AR2G生物传感器在水中离线脱水至少10分钟。在开始实验后，将AR2G吸头在水中平衡1分钟。然后，将吸头移入新制备的活化溶液(18份水、1份400mM EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和1份200mM磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺))中5分钟。将重组TGFβ蛋白(10ug/mL，在10mM乙酸钠缓冲液pH 5中)与活化的吸头偶联3分钟，随后使用乙醇胺pH 8.5淬灭15分钟。将偶联的吸头在EKB缓冲液(补充了2％BSA(Sigma)、0.5M NaCl和0.09％吐温-20(Sigma)的动力学缓冲液(FortéBio))中孵育20min确定基线。然后，使吸头在含15ug/mL Ab6的EKB溶液中结合10分钟，之后在EKB中解离10分钟。在将Ab6固化至抗人Fc捕获生物传感器(FortéBio)表面(在EKB中1ug/mL)5分钟后，测量Ab6与人大型潜在复合物的结合情况。随后，再进行1分钟基线，之后进行LTBP1-proTGFβ1、LTBP1-proTGFβ2或LTBP1-proTGFβ3(在EKB中100nM)的结合十分钟。最后，进行解离十分钟。
2)基于溶液平衡滴定的测定：
MSD-SET是一种充分表征的技术，可以将其用于确定溶液相平衡KD。基于溶液的平衡测定(如MSD-SET)基于动力学排斥原理，其中通过测量平衡时的游离配体结合而不是实时结合和解离的速率来测定亲和性。
进行MSD-SET测定以测量平衡时抗体的亲和性。简言之，将每种检测抗体稀释3-5倍，并在48孔培养皿中将样品与生物素化的抗原混合。将SET样品在室温下平衡20-24小时。同时，用IgG(20nM)包被捕获板，并在4℃下孵育过夜或在室温下孵育30分钟，随后使用5％BSA进行封闭步骤。在洗涤捕获板3次后，加入SET样品并孵育150秒。洗涤板一次以除去未结合的复合物。加入250ng/ml SA-磺基标签，然后洗涤3次。加入2X读取缓冲液，并使用QuickPlexTM SQ 120仪器读取标记的结合复合物的信号。
在本文的表9和表10中提供了通过MSD-SET测量的本文公开的示例性抗体的亲和性性质的总结列表。
例如，在室温下使用20nM单克隆抗体在PBS中的溶液包被MSD标准板(MSD)30分钟或在4℃下过夜。然后，将用于包被的增加浓度的相同单克隆抗体与生物素化的抗原(针对结合至Ab6，在50至400pM之间；针对结合至Ab4，在0.8至1.6nM之间)混合，在室温下过夜而不进行振荡。平衡20-24小时后，使用封闭缓冲液A(MSD)将抗体包被的板在室温下封闭30分钟，并使用洗涤缓冲液(PBS、0.1％BSA、0.05％吐温-20)洗涤，随后在精确的2.5分钟向板中加入平衡的抗体-抗原复合物。再次洗涤板，随后加入含250ng/ml SULFO-TAG-标记的链霉亲和素二抗试剂(MSD)的含0.1％BSA的PBS。使用洗涤缓冲液洗涤后，使用MESO QuickPlexSQ 120(MSD)在MSD读取缓冲液(MSD)中读板。通过在Prism 7软件(Graphpad)中的非线性曲线拟合来处理结合数据，以计算平衡结合KD值。
实施例2：测量潜在TGFβ1激活的抑制的功能性测定
在WO 2019/023661中描述了TGFβ1激活的新型背景依赖性基于细胞的效力测定的开发，其全部内容通过引用并入本文。此前的测定形式无法区分由内源性呈递分子呈递的proTGFβ1的激活和由外源性LTBP呈递的proTGFβ1的激活。通过直接转染表达整联蛋白的细胞，在WO 2019/023661中公开并在本文中使用的新型测定在内源性呈递蛋白proTGFβ1活性与外源性LTBP-proTGFβ1活性之间建立了窗口。由于LTBP-proTGFβ1复合物是嵌入细胞外基质中的，因而测定板的包被也是测定的重要组成部分。使用包被ECM蛋白纤连蛋白的高结合板，使LTBP测定更加可靠。
为了确定Ab4、Ab5、Ab6和Ab3抗体是否是功能性的(例如，具有抑制效力)，开发了基于细胞的测定，其中测量了TGFβ1生长因子从大型潜在复合物(LLC)中的αVβ整联蛋白依赖性释放。每种测定均是特异性针对包含LTBP1、LTBP3、GARP或LRRC33的LLC的每一者的。通过测定研发和优化的过程，确定了纤连蛋白是整联蛋白依赖性LTBP呈递的proTGFβ1的体外激活的关键ECM蛋白。
测定I：在ECM中沉积的潜在TGFβ1的激活
对于图1和图2中描述的测定，开发了以下方案。该测定最适用于测量TGFβ1从ECM相关的潜在proTGFβ1复合物(LTBP1-proTGFβ1或LTBP3-proTGFβ1)的整联蛋白依赖性释放。
材料：
·MvLu1-CAGA12细胞(克隆4A4)
·SW480/β6细胞(克隆1E7)(αV亚基是以高水平内源性表达的；β6亚基是稳定过表达的)
·LN229细胞系(高水平的内源性αVβ8整联蛋白)
·Costar白壁经TC处理的96孔测定板#3903
·Greiner Bio-One高结合白色不透明96孔测定板#655094
·人纤连蛋白(Corning#354008)
·P200多通道移液器
·针对每一个均具有无菌过滤吸头的P20、P200和P1000移液器
·无菌微量离心管和支架
·无菌试剂储存器
·0.4％台盼蓝
·2mL、5mL、10mL和25mL无菌移液器
·组织培养物处理的100mm或150mm培养板
·70％乙醇
·Opti-MEM还原性血清培养基(Life Tech#31985-070)
·Lipofectamine 3000(Life Tech#L3000015)
·Bright-Glo荧光素酶测定试剂(Promega#E2620)
·0.25％胰蛋白酶+0.53mM EDTA
·proTGFβ1表达质粒，人类
·LTBP1S表达质粒，人类
·LTBP3表达质粒，人类
·LRRC32(GARP)表达质粒，人类
·LRRC33表达质粒，人类
设备：
·BioTek Synergy H1读板器
·TC罩(hood)
·台式离心机
·CO2培养箱37℃，5％CO2
·37℃水/珠浴
·振荡摇床
·显微镜
·血球计数器/countess
定义：
·CAGA12 4A4细胞：MvLu1细胞(貂肺上皮细胞)的衍生物，其使用CAGA12合成启动子稳定转染，驱动荧光素酶基因表达
·DMEM-0.1％BSA：测定培养基；基础培养基为DMEM(Gibco目录号11995-065)，培养基还含有稀释至0.1％w/v的BSA、青霉素/链霉素和4mM谷氨酰胺
·D10：DMEM 10％FBS、P/S、4mM谷氨酰胺、1％NEAA、1X GlutaMAX(Gibco目录号35050061)
·SW480/β6培养基：D10+1000ug/mL G-418
·CAGA12(4A4)培养基：D10+0.75ug/mL嘌呤霉素
程序：
在第0天，接种细胞用于转染。用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5分钟)SW480/β6(克隆1E7)。将细胞沉淀重悬在D10培养基中并计数每ml的活细胞。以5.0x 106个细胞/12ml/100mm组织培养皿接种细胞。对于CAGA12细胞，将细胞以每个T75培养瓶100万的密度传代，用于第3天的测定。将培养物在37℃和5％CO2下孵育。
在第1天，转染表达整联蛋白的细胞。使用
Figure BDA0002970630990001581
3000试剂根据生产厂商的方案转染。简言之，将以下稀释到OptiMEMTM I中，每孔125μl：7.5μg DNA(呈递分子)+7.5μg DNA(proTGFβ1)，30ul P3000和使用OptiMEM I至125μl。通过一起吹打DNA在在孔中混合，然后加入OptiMEM。加入P3000，通过吹打将孔中的所有物质混合。制备Lipofectamine3000的预混液，待添加到DNA混合物中：对于LTBP1测定：每孔15μl Lipofectamine3000，使用OptiMEM I至125μl；对于LTBP3测定：每孔45μl Lipofectamine3000，使用OptiMEM I至125μl。将稀释的Lipofectamine3000加入DNA中，通过吹打混合好，并在室温下孵育15min。孵育后，通过吹打几次将溶液混合，且然后每皿滴加250μl DNA:Lipofectamine3000(2x 125μl)。轻轻转动各皿以进行混合，并将皿放回组织培养箱中培养～24小时。
在第1-2天，使用人纤连蛋白包被测定板。具体而言，将冻干的纤连蛋白在超纯蒸馏水(无菌)中稀释至1mg/ml。在PBS(无菌)中将1mg/ml储备溶液稀释至19.2μg/ml。以50μl/孔加入测定板(高结合)并在组织培养箱(37℃和5％CO2)中孵育过夜。终浓度为3.0μg/cm2。
在第2天，将转染细胞铺板用于测定和添加抑制剂。首先，通过向已经存在于测定板中的纤连蛋白溶液中添加200μl/孔PBS来洗涤纤连蛋白涂层。使用多通道移液器手动清除洗涤物。重复洗涤，共洗涤两次。在加入细胞之前，将板在室温下干燥并盖上盖子。然后，通过使用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5min)，将细胞铺板。将沉淀重悬在测定培养基中，并计数每ml中的活细胞。对于LTBP1测定，将细胞稀释成0.10x 106个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔5,000个细胞)。对于LTBP3测定，将细胞稀释成0.05x 106个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔2,500个细胞)。为制备功能性抗体稀释液，将抗体在载剂中预先稀释至恒定工作浓度。将储备抗体在载剂中连续稀释(PBS是最佳选择，避免使用柠檬酸钠缓冲液)。将连续稀释的每个点稀释到测定培养基中，以得到4X终浓度的抗体。每孔添加25μl的4X抗体，并在37℃和5％CO2下孵育培养物～24小时。
在第3天，加入TGFβ报告细胞。使用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5min)CAGA12(克隆4A4)细胞，以供测定。将沉淀重悬在测定培养基中，并计数每ml中的活细胞。将细胞稀释成0.4x 106个细胞/ml，并以每孔50μl接种(每孔20,000个细胞)。将细胞放回培养箱中。
在第4天，读取测定结果(抗体和/或报告细胞加入后16-20小时)。读取前，使Bright-GloTM试剂和测试板达到室温。使用TMLC_std方案设置
Figure BDA0002970630990001591
SynergyTM H1的读取设置-此方法具有自动增益设置。选择阳性对照孔用于自动标定(高)。每孔加入100μlBright-Glo试剂。在室温下振荡孵育2分钟，避光保护板。在BioTek Synergy H1上读板。
在LN229报告测定中测量Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或对照IgG对LTBP1-proTGBβ1激活的抑制(图1)。
在LN229报告测定中测量Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或对照IgG对LTBP3-proTGBβ1激活的抑制(图2)。
测定II：在细胞表面上呈递的潜在TGFβ1的激活
对于图3和图4中所描述的测定，开发了以下方案。该测定或“直接转染”方案是最适于测量TGFβ1从细胞相关的潜在proTGBβ1复合物(GARP-proTGBβ1或LRRC33-proTGBβ1)的整联蛋白依赖性释放(激活)。
材料：
·MvLu1-CAGA12细胞(克隆4A4)
SW480/β6细胞(克隆1E7)(αV亚基是以高水平内源性表达的；β6亚基是稳定过表达的)
·LN229细胞系(高水平的内源性αVβ8整联蛋白)
·Costar白壁经TC处理的96孔测定板#3903
·Greiner Bio-One高结合白色不透明6孔测定板#655094
·人纤连蛋白(Corning#354008)
·P200多通道移液器
·针对每一个均具有无菌过滤吸头的P20、P200和P1000移液器
·无菌微量离心管和支架
·无菌试剂储存器
·0.4％台盼蓝
·2mL、5mL、10mL和25mL无菌移液器
·组织培养物处理的100mm或150mm培养板
·70％乙醇
·Opti-MEM还原性血清培养基(Life Tech#31985-070)
·Lipofectamine 3000(Life Tech#L3000015)
·Bright-Glo荧光素酶测定试剂(Promega#E2620)
·0.25％胰蛋白酶+0.53mM EDTA
·proTGFβ1表达质粒，人类
·LTBP1S表达质粒，人类
·LTBP3表达质粒，人类
·LRRC32(GARP)表达质粒，人类
·LRRC33表达质粒，人类
设备：
·BioTek Synergy H1读板器
·组织培养罩
·台式离心机
·CO2培养箱，37℃，5％CO2
·37℃水/珠浴
·振荡摇床
·显微镜
·血球计数器/countess
定义：
·CAGA12 4A4细胞：MvLu1细胞(貂肺上皮细胞)的衍生物，其使用CAGA12合成启动子稳定转染，驱动荧光素酶基因表达
·DMEM-0.1％BSA：测定培养基；基础培养基为DMEM(Gibco目录号11995-065)，培养基还含有稀释至0.1％w/v的BSA、青霉素/链霉素和4mM谷氨酰胺
·D10：DMEM 10％FBS、P/S、4mM谷氨酰胺、1％NEAA、1X GlutaMAX(Gibco目录号35050061)
·SW480/β6培养基：D10+1000ug/mL G-418
·CAGA12(4A4)培养基：D10+0.75ug/mL嘌呤霉素
方法：
在第0天，接种表达整联蛋白的细胞用于转染。用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5分钟)细胞。将细胞沉淀重悬在D10培养基中并计数每ml的活细胞。将细胞稀释至0.1e6个细胞/ml并在测定培养板中每孔接种100ul(每孔10,000个细胞)。对于CAGA12细胞，将细胞以每个T75培养瓶150万的密度传代，用于第2天的测定。将培养物在37℃和5％CO2下孵育。
在第1天，转染细胞。使用
Figure BDA0002970630990001601
3000试剂根据生产厂商的方案转染。简言之，将以下稀释到OptiME I中，每孔5μl：0.1μg DNA(呈递分子)+0.1μg DNA(proTGFβ1)，0.4ul P3000和使用OptiMEM I至5μl。通过一起吹打DNA在在孔中混合，然后加入OptiMEM。加入P3000，通过吹打将孔中的所有物质混合。制备Lipofectamine3000的预混液，待添加到DNA混合物中：每孔0.2μl Lipofectamine3000，使用OptiMEM I至5μl。将稀释的Lipofectamine3000加入DNA中，通过吹打混合好，并在室温下孵育15min。孵育后，通过吹打几次将溶液混合，且然后每皿加入10μl DNA:Lipofectamine3000(2x 5μl)。将细胞培养板放回组织培养箱中培养～24hr。
第2天，加入抗体和TGFβ报告细胞。为制备功能性抗体稀释液，将储备抗体在载剂中连续稀释(PBS是最佳选择)。然后，将每个点稀释到测定培养基中，以得到2X终浓度的抗体。制备抗体后，用测定培养基通过抽吸(真空吸气器)然后加入100μl/孔测定培养基洗涤细胞板两次。第二次洗涤后，用每孔50μl的2×抗体替换测定培养基。将细胞板放回培养箱中约15-20分钟。
为了制备用于测定的CAGA12(克隆4A4)细胞，用胰蛋白酶分离和沉淀(以200x g离心5分钟)细胞。将沉淀重悬于测定培养基中，计数每毫升的活细胞。将细胞稀释至0.3e6个细胞/ml，并且每孔接种50μl(每孔15,000个细胞)。将细胞放回培养箱。
在第3天，在加入抗体和/或报告细胞后约16-20小时，读取该测定。在读数之前，使Bright-GloTM试剂和测试板达到室温。使用TMLC_std方案设置
Figure BDA0002970630990001611
SynergyTM H1的读取设置-此方法具有自动增益设置。设置阳性对照孔用于自动标定(高)。每孔加入100uLBright-Glo试剂。在室温下振荡孵育2分钟；避光保护板。在BioTek Synergy H1上读板。
在SW480β6测定中测量Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或IgG对照对GARP-proTGBβ1激活的抑制(图3)。
在SW480β6测定中测量Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或对照IgG对LRRC33-proTGBβ1激活的抑制(图4)。
用于获得图33B中提供的体外效力数据的基于细胞的报告测定如下所示：
测定前两天，将每孔12,500个LN229细胞接种到白壁96孔组织培养物处理的测定板中。次日使用Lipofectamine 3000，使用编码proTGFβ1(LTBP测定)、proTGFβ1加GARP(GARP测定)或proTGFβ1加LRRC33(与GARP跨膜和胞质结构域融合的LRRC33胞外域的嵌合构建体)的质粒转染LN229细胞。作为TGFβ1亚型特异性的对照，使用proTGFβ3转染LN229细胞，proTGFβ3由于其前结构域中存在RGD序列也被αV整联蛋白激活。约24h后，连续稀释Ab6，并将其与悬浮在DMEM+0.1％BSA中的CAGA12报告细胞(每孔15,000个细胞)一起添加到转染子中。设置共培养后约16-20小时，使用BrightGlo试剂将测定显示2min，并在酶标仪上读取发光情况。将抗体载剂存在下的荧光素酶活性确定为100％活性，将存在167nM(25μg/ml)高亲和性泛TGFβ抗体12.7条件下的信号设定为0％活性。
使用Prism 7将剂量-应答活性非限制性拟合至三参数log抑制剂对比应答模型，并计算最佳拟合IC50值。
为检测对蛋白水解TGFβ1激活的抑制作用，将CAGA12报告细胞接种到白壁96孔发光测定板中(每孔12,500个细胞)。二十四小时后，使用测定培养基(DMEM+0.1％BSA)洗涤细胞，并将Ab6(2.5μg/ml)和小潜在复合物proTGFβ1C4S(1.5ng/ml)在测定培养基中加入CAGA细胞中。将该混合物在37℃下孵育4h以使得抗体结合。在此孵育后，以500ng/ml终浓度加入重组人血浆激肽释放酶蛋白酶(EMD Millipore)。将测定混合物与CAGA细胞孵育约18小时，随后如上文所述通过生物发光读取TGFβ1激活。
实施例3：TGFβ1特异性、不依赖于背景的抗体在体外对蛋白酶诱导的TGFβ1激活的影响
此前，申请人发现，Ab3(一种亚型选择性、背景偏倚的TGFβ1抑制剂)能够在体外和在基于细胞的/CAGA测定中抑制TGFβ1的整联蛋白依赖性激活和激肽释放酶依赖性激活两者。
为了检测Ab6(一种亚型选择性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂)抑制蛋白酶依赖性TGFβ1激活的能力，以及进一步比较Ab3和Ab6的作用，建立了两项基于细胞的/CAGA测定：i)激肽释放酶依赖性TGFβ1激活以及Ab3和Ab6的作用；和ii)纤溶酶依赖性TGFβ1激活以及Ab3和Ab6的作用。
简言之，在测定开始前24小时接种CAGA报告细胞。将ProTGFβ1-C4S滴定到CAGA细胞上。以如所示的固定浓度添加蛋白酶(血浆-KLK或纤溶酶)。将测定混合物孵育约18小时。TGFβ激活通过荧光素酶测定测量。
在第一项研究中，在KLK存在的条件下，proTGFβ1被激活(阳性对照)。该TGFβ激活通过加入Ab3被有效地抑制，证实了此前的结果。类似地，Ab6也抑制激肽释放酶诱导的TGFβ1激活。这些结果表明，除了TGFβ1的整联蛋白依赖性激活以外，亚型特异性、不依赖于背景的抑制性抗体(偏倚和非偏倚两者)能够在体外阻断TGFβ1的KLK依赖性激活(图5A)。
在第二项研究中，在存在重组人纤溶酶存在的条件下，proTGFβ1被激活(阳性对照)。令人吃惊的是，该TGFβ激活仅被AB6而非Ab3有效抑制。这些结果揭示了，在背景偏倚的抑制剂(Ab3)与背景非偏倚的抑制剂(Ab6)之间出人意料的功能性差异(图5B)。
实施例4：在急性肾纤维化的单侧输尿管闭塞(UUO)模型中抗TGFβ1抗体Ab3和Ab6对急性纤维化的抑制
在急性肾纤维化的单侧输尿管闭塞(UUO)模型中检测了抗TGFβ1抗体对急性纤维化的抑制作用。在该模型中，在研究的第0天通过永久性手术结扎左侧输尿管在雄性小鼠中诱发纤维化。在这些实验中，将接受手术但未阻塞其输尿管的假手术小鼠作为健康对照。
在研究第1天和第4天通过腹腔(i.p.)注射向小鼠施用对照(IgG)或待测抗体(Ab3，Ab6)。在手术后第5天研究结束时收集肾脏并从这些组织收集RNA。随后通过对一组纤维化相关的基因进行定量聚合酶链反应(qPCR)评估诱导纤维化的程度，包括胶原I(Col1a1)、胶原III(Col3a1)、纤连蛋白(Fn1)、赖氨酰氧化酶(Lox)、赖氨酰氧化酶样2(Loxl2)、平滑肌肌动蛋白(Acta2)、基质金属蛋白酶(Mmp2)和整联蛋白α11(Itga11)(Rolfe,Irvine,Grobbelaar,&Linge,2007)(Tamaki等，1994)(Bansal等2017)(Leaf&Duffield,2016)。
Ab3或Ab6治疗对胶原基因表达的影响
Col1a1和Col3a1是纤维化的关键驱动子。在阻塞的肾脏中，Col1a1被诱导10至40倍，和Col3a1上调5至25倍(P<0.005，假手术+IgG治疗小鼠与UUO+IgG组比较)。如图7中所示，与UUO+IgG相比，使用3、10或30mg/kg/wk的Ab3治疗的UUO小鼠显示出这两种胶原基因的表达降低(P<0.05)。使用3或10mg/kg/wk的Ab6治疗还抑制由UUO所致的纤维化基因诱导(P<0.05，与UUO+IgG相比)。总之，这些数据表明，使用Ab3或Ab6抑制TGFβ1可有效改善与UUO相关的胶原诱导。
Ab3或Ab6治疗对纤连蛋白和赖氨酰氧化酶样2基因表达的影响
Fn1和Loxl2编码的蛋白在纤维化中在细胞外基质的沉积和硬化中起作用。如图8中所示，UUO+IgG组的样品中这两个基因均上调(P<0.005，与假手术+IgG相比)，尽管这两个基因(尤其是Loxl2)的基因表达增加倍数比胶原基因低。在使用3、10或30mg/kg/wk的Ab3治疗的样品中，我们注意到Fn1和Loxl2降低的趋势(与UUO+IgG相比)，但是这种治疗作用仅在Loxl2表达上具有统计学意义，并且仅在3mg/kg/wk剂量下(Fn1在10mg/kg/wk剂量下接近具有统计学意义，其P＝0.07)。然而，使用3或10mg/kg/wk的Ab6治疗导致Fn1和Loxl2两者的抑制(P<0.05，与UUO+IgG相比)。
图9总结了在UUO模型中治疗后基因表达的具有统计学意义的改变(与UUO+IgG相比)。在所检测的所有剂量下，Ab3均显示Col1a1和Col3a1降低。在Itga11和Loxl2中还观察到具有统计学意义的改变(与UUO+IgG相比，这两个水平均降低)，但是仅在3mg/kg/wk剂量下。而相比之下，在使用10mg/kg/wk Ab6治疗后，除了Acta2以外，考察的所有基因在表达上均显示出具有统计学意义的改变(与UUO+IgG相比，所有剂量水平均降低)。此外，在使用3mg/kg/wk Ab6治疗的小鼠中，除了Acta2和Lox以外，考察的所有基因也显示出具有统计学意义的降低。
实施例5：在Cloudman S91黑色素瘤模型中Ab3和Ab6与抗PD-1抗体联用对肿瘤进展的影响
基于对很多人类肿瘤的特征在于具有以下表型的认识：i)某一子集对PD-(L)1轴阻断具有反应性；ii)免疫排除的证据；和，iii)TGFB1表达和TGFβ信号传导的证据，且进一步基于常用的同系免疫-肿瘤学小鼠模型不能再现TGFβ1偏倚或抗PD-(L)1抗性的观察结果，为了改善可转化性，发明人试图特别选择表现出与人类肿瘤具有相似特性的体内临床前模型(参见实施例11)。考虑到这些因素，选择适宜的体内模型进行功效研究，包括在这些研究中描述的Cloudman S91黑色素瘤模型。
为评价Ab3和Ab6与抗PD-1抗体联用降低黑色素瘤肿瘤进展的作用，使用了Cloudman S91小鼠黑色素瘤模型。
肿瘤细胞培养
克隆M3[Cloudman S91黑色素瘤](
Figure BDA0002970630990001631
CCL-53.1TM)细胞是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的，并且在CR Discovery Services在Kaighn改良的Ham F12培养基中作为以指数生长的悬浮培养物形式保存，所述培养基补充了2.5％胎牛血清、15％马血清、2mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素和25μg/mL庆大霉素。在潮湿的培养箱中于37℃下在5％CO2和95％空气的气氛中，将肿瘤细胞保持在组织培养瓶中。
体内植入和肿瘤生长
在肿瘤植入当天，在每只雌性DBA/2测试小鼠的腹侧(flank)皮下注射在50％matrihel中的5x 106个Cloudman S91细胞，并监测肿瘤生长。当肿瘤达到125-175mm3的体积时，将小鼠随机分成12组，每组具有相同的平均肿瘤体积，并开始给药。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并使用以下公式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝w2 x l/2
其中w＝肿瘤的宽度(mm)和l＝长度(mm)。可以假设1mg相当于1mm3肿瘤体积来估计肿瘤重量。
治疗
简言之，在第1天对携带皮下C91肿瘤(125-175mm3)的小鼠(n＝12)腹腔内(i.p.)给药，每周一次，给药60天，Ab3，10mg/kg，给药体积为10mL/kg；Ab3，30mg/kg，给药体积为10mL/kg；Ab6，3mg/kg，给药体积为10mL/kg；或Ab6，10mg/kg，给药体积为10mL/kg。i.p.给予大鼠抗小鼠PD-1抗体(RMP1-14-rIgG2a，BioXCel)，以10mg/kg每周两次，给药体积为10mL/kg，给药60天。
第1组仅接受抗PD-1抗体。第2组接受Ab3(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第3组接受Ab3(30mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第4组接受Ab6(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第5组接受Ab6(30mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。使用了未接受治疗的对照，数据未显示。
终点和肿瘤生长延迟(TGD)分析
每周两次使用卡尺测量肿瘤，并且当动物肿瘤达到2,000mm3终点体积或在研究结束时(第60天)(以较早发生者为准)动物各自安乐死。因为肿瘤体积终点退出研究的小鼠记录为因为肿瘤进展(TP)安乐死以及安乐死日期。根据WO 2018/129329中描述的方法计算每只小鼠的至终点(TTE)时间用于分析。
将肿瘤生长延迟百分比(％TGD)定义为与未经治疗的对照相比在治疗组中中位至终点时间的增加，以占对照的中位至终点时间(TTE)表示：
T＝治疗的中位TTE
C＝对照的中位TTE
％TGD＝((T-C)/C)*100
与同种型对照治疗相比，抗PD1治疗可产生25％的TGD。10mg/kg的抗PD1/Ab3具有14％TGD，而30mg/kg抗PD1/Ab3具有92％TGD。30mg/kg的抗PD1/Ab3的中位至终点时间为45.8天，而相比之下仅抗PD1治疗为29.8天。
在第二项S91研究中，与同种型对照治疗相比，抗PD-1治疗可产生48％的TGD。10mg/kg的抗PD-1/Ab3具有122％TGD，而30mg/kg抗PD-1/Ab3具有217％TGD。抗PD-1/Ab6(10mg/kg和30mg/kg两者下—)具有217％的TGD。针对抗PD-1的中位至终点时间为34.6天，抗PD-1/Ab3在10mg/kg下为51.7天和在30mg/kg下为直至74天研究终点时。抗PD-1/Ab6(10mg/kg和30mg/kg两者下)在74天研究结束时未达到中位存活。
研究结果表明，以30mg/kg给予Ab3联合抗PD-1延长了所治疗小鼠的存活。如图10中所示，为达到50％存活，以30mg/kg的抗PD-1/Ab3治疗的小鼠花费了约45天，而以10mg/kg的Ab3和单独的PD-1治疗的小鼠在少于约30天内达到50％存活，表明同时抑制PD-1和TGFβ1产生了存活获益。
如图11A中所示，以10mg/kg和30mg/kg施用Ab3或Ab5，联合抗PD1延迟了肿瘤生长。8只仅使用PD-1治疗的小鼠达到肿瘤体积2000mm3(如虚线所示)，而仅6只使用抗PD-1和10mg/kg Ab3治疗的小鼠和4只使用抗PD-1和30mg/kg Ab3治疗的小鼠达到肿瘤体积2000mm3。仅3只使用抗PD-1和10mg/kg Ab6治疗的小鼠和5只使用抗PD-1和30mg/kg Ab6治疗的小鼠达到肿瘤体积2000mm3。图11B显示了在使用Ab3或Ab6与抗PD-1抗体联合治疗后的中位肿瘤进展。
进行独立的S91研究，以评价通过将抗PD-1抗体和Ab6(在3、10和30mg/kg下)组合达到的有效肿瘤控制。为了对抗肿瘤应答进行定量，将响应于治疗的“有效肿瘤控制”定义为在每个测试组中研究结束时肿瘤体积达到小于2,000mm3存活阈值(例如，终点肿瘤体积)的25％的动物百分比。结果总结如下(见图11C、图11E和图11F)。
表20：Cloudman S91功效总结
治疗组 Cloudman S91肿瘤模型(有效肿瘤控制：％，N)
对照 0％(0/11)
抗PD1单药疗法 17％(2/12)
Ab6单药疗法 0％(0/12)
抗PD1/Ab6，3mg/kg 83％(10/12)
抗PD1/Ab6，10mg/kg 78％(7/9)
抗PD1/Ab6，30mg/kg 73％(8/11)
如图11C所示，尽管公认Cloudman S91模型对PD-1阻断单药疗法具有较差的反应性，但大多数接受所有三种剂量的联合治疗的动物(分别为83％、78％和73％)均达到了有效肿瘤控制(例如，肿瘤体积降至500mm3或更小)，表明Ab6具有强大的协同作用。因此，在反映对检查点阻断疗法(如抗PD-(L)1)的人原发性抗性的同系小鼠肿瘤模型中，使用Ab6治疗使Cloudman S91(黑色素瘤)肿瘤易于接受抗PD1疗法的治疗。使用Ab6(低至每周3mg/kg)与抗PD1抗体的联合治疗导致显著的肿瘤消退或有效肿瘤控制。这里达到协同肿瘤生长延迟表明，可以将亚型选择性TGFβ1抑制剂与检查点阻断疗法联用以治疗患有对检查点抑制具有抗性的TGFβ1阳性肿瘤的受试者。在联合治疗组中，所检测的所有剂量的Ab6(浅蓝色为3mg/kg；深蓝色为10mg/kg和紫色为30mg/kg)与抗PD-1联用均实现了显著的肿瘤控制(分别为9/12、4/9和8/11)。总的来说，有超过65％的这些动物达到了肿瘤体积减小为小于终点肿瘤体积的25％。结果还显示为中位肿瘤体积(图11E)。在所检测的剂量下，所有联合治疗组(在3、10或30mg/kg的Ab6)均显示出相似的抗肿瘤作用，表明在该模型中在低至3mg/kg下Ab6是有效的。这也反映在存活获益上(见图11F)。
通过在上述功效研究结束时停止治疗并在已实现显著肿瘤控制的那些动物中继续监测肿瘤体积的变化考察TGFβ1和PD-1联合抑制的持久抗肿瘤作用。对来自图11C的经历CloudmanS91肿瘤的应答者进行6周随访，但不给药(灰框)。如图11D所示，使用Ab6/抗PD-1组合实现了延长的肿瘤控制。报告的数量为在研究结束时具有受控制的肿瘤的动物数。
此外，在正在进行的S91肿瘤模型研究中，其中在已使用抗PD1治疗的动物中对Ab6(每剂量3mgk、10mgk或30mgk)进行了评价，联合治疗导致显著的存活获益，如图11F中所示。在第38天时，接受抗PD1/Ab6(30mgk)组合的所有动物均是存活的(例如，在30mgk剂量组中在第38天时为100％存活)，并且在联合组(3、10和30mgk)中没有动物已达到中位存活(研究在进行中)。在研究结束时，在联合治疗组中90％的动物存活。这些数据表明，可以将TGFβ1的亚型选择性抑制剂(如Ab6)用于在接受检查点阻断疗法的受试者中治疗检查点抑制抗性肿瘤以达到存活获益。对于图11C-11F：绿色＝IgG对照(每周30mg/kg)；橙色＝Ab6(每周30mg/kg)；红色＝抗PD1(5mg/kg，每周两次)；浅蓝色＝抗PD1+Ab6(3mg/kg)；深蓝色＝抗-PD1+Ab6(10mg/kg)；紫色＝抗PD1+Ab6(30mg/kg)。
实施例6：在MBT2同系膀胱癌模型中Ab3和Ab5与抗PD-1联用对TGFβ磷酸-SMAD2/3通路的抑制
选择MBT-2尿路上皮癌模型作为TGFβ1占主导的肿瘤，以检测TGFβ1特异性抑制与检查点抑制剂的组合。在药效学研究中，在MBT-2模型中评价了Ab3或Ab5与抗PD-1联用对下游TGFβ信号传导的影响。根据生产厂商的说明书通过ELISA(Cell SignalingTechnologies)进行了磷酸-SMAD2/3测定。
体内植入和肿瘤生长
在肿瘤植入当天，在每只雌性C3H/HeN测试小鼠的腹侧皮下注射在5x 105个MBT2肿瘤细胞，并监测肿瘤生长。当肿瘤达到40-80mm3的体积时，将小鼠随机分成10组，每组具有相同的平均肿瘤体积，并开始给药。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并使用以下公式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝w2 x l/2
其中w＝肿瘤的宽度(mm)和l＝长度(mm)。可以假设1mg相当于1mm3肿瘤体积来估计肿瘤重量。
治疗
简言之，在第1天对携带皮下MBT2肿瘤(40至80mm3)的小鼠(n＝10)腹腔内(i.p.)给药，在第1天和第8天时，Ab5，3mg/kg，给药体积10mL/kg，Ab5，10mg/kg，给药体积10mL/kg，Ab3，10mg/kg，给药体积10mL/kg或Ab3，30mg/kg，给药体积10mL/kg。在第1、4和8天，以10mg/kg i.p.施用大鼠抗小鼠PD-1抗体(RMP1-14-rIgG2a，BioXCel)，给药体积为10mL/kg。
第1组仅接受抗PD-1抗体。第2组接受Ab5(3mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第3组接受Ab5(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第4组接受Ab3(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第5组接受Ab3(30mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。使用了未接受治疗的对照，未显示。
SMAD 2/3信号传导的抑制
在第8天最后一次给药后8小时处死动物并切下肿瘤，并且快速冷冻。将肿瘤在干冰上粉碎，并加入掺有磷酸酶抑制剂的蛋白裂解物。
通过磷酸化与总SMAD2/3的比率对结果进行评估。如图12中所示，在使用Ab3或Ab5联合抗PD-1治疗的动物中，强直性SMAD2/3信号传导被显著抑制，其中Ab5(10mg/kg)显示出最显著的抑制。这些数据证明了TGFβ1激活抑制剂的有效靶点接合，导致下游信号传导的抑制。
实施例7：在MBT2同系膀胱癌小鼠模型中Ab3和Ab6与抗PD-1抗体联用对肿瘤进展的影响
为评价Ab3和Ab6与抗PD-1抗体的组合减少膀胱癌肿瘤进展的能力，使用了MBT2同系膀胱癌小鼠模型。这是一种具有非常高的侵袭性和快速生长的肿瘤模型，并且非常难以使用药物治疗解决肿瘤进展。
肿瘤细胞培养
MBT2是一种低分化鼠源性膀胱癌细胞系，来源于在雌性C3H/He小鼠中的可移植N-[4-(5-硝基-2-呋喃基)-2-噻唑基]甲酰胺诱导的膀胱癌。将细胞在含有10％胎牛血清和100μg/ml链霉素的洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)-1600培养基中在5％CO2气氛中在37℃下培养。每隔一天更换一次培养基，当细胞融合达到90％时进行传代培养。通过胰蛋白酶消化从亚融合培养物中收获细胞，并在无血清培养基中洗涤。通过台盼蓝拒染法确定单细胞悬液具有>90％的细胞活力。在注射前，将细胞重悬在磷酸盐缓冲液(PBS)中。
体内植入和肿瘤生长
在对数生长期收获用于植入的MBT2细胞，并将其重悬在磷酸盐缓冲液(PBS)中。在肿瘤植入当天，在每只测试小鼠的腹侧皮下注射在5x 105个细胞(0.1mL细胞悬液)，并监测肿瘤生长。当肿瘤达到平均40-80mm3之间时，将小鼠随机分成15组。
使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并使用以下公式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝w2 x l/2
其中w＝肿瘤的宽度(mm)和l＝长度(mm)。可以假设1mg相当于1mm3肿瘤体积来估计肿瘤重量。
治疗
简言之，在第1天对携带皮下MBT2肿瘤(40至80mm3)的小鼠(n＝15)腹腔内(i.p.)给药，每周一次，给药29天，Ab3，10mg/kg，给药体积10mL/kg，Ab3，30mg/kg，给药体积10mL/kg，Ab6，3mg/kg，给药体积10mL/kg或Ab6，10mg/kg，给药体积10mL/kg。以10mg/kg每周两次i.p.施用大鼠抗小鼠PD-1抗体(RMP1-14-rIgG2a，BioXCel)，给药体积为10mL/kg，给药29天。
第1组仅接受抗PD-1抗体。第2组接受Ab3(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第3组接受Ab3(30mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第4组接受Ab6(3mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。第5组接受Ab6(10mg/kg)与抗PD-1抗体的组合。使用了未接受治疗的对照，未显示。
终点和肿瘤生长延迟(TGD)分析
每周两次使用卡尺测量肿瘤，并且当动物肿瘤达到1,200mm3终点体积或在研究结束时将动物各自安乐死。因为肿瘤体积终点退出研究的小鼠记录为因为肿瘤进展(TP)安乐死以及安乐死日期。根据WO 2018/129329中描述的方法计算每只小鼠的至终点(TTE)时间用于分析。
10mg/kg的抗PD1/Ab3具有191％的TGD和30mg/kg具有196％的TGD。3mg/kg的抗PD1/Ab6具有68％的TGD和10mg/mk具有196％的TGD。将由治疗引起的部分缓解(PR)定义为：在研究过程中连续进行三次测量时，肿瘤体积为其第1天体积的50％或更低，对于这三次测量中的一次或多次，肿瘤体积等于或大于13.5mm3。在研究过程中，完全缓解(CR)的肿瘤体积为三次连续测量均小于13.5mm3。研究结束时，10mg/kg的抗PD-1/Ab3具有0个PR和4个CR。在研究结束时，30mg/kg的抗PD-1/Ab3具有1个PR和1个CR。3mg/kg的抗PD-1/Ab6具有0个PR和3个CR。10mg/kg的抗PD-1/Ab6具有0个PR和5个CR。
如图13A和图13B所示，施用Ab3(以10mg/kg和30mg/kg剂量两者)与抗PD-1的组合延迟肿瘤生长。一些动物显示出肿瘤完全消退。同样，施用Ab6(以3mg/kg和10mg/kg剂量两者)与抗PD-1的组合延迟肿瘤生长。一些动物显示出肿瘤完全消退。大部分使用PD-1单药治疗的小鼠在约第8天至第14天之间肿瘤体积达到了1024mm3(如虚线所示)，而使用10mg/kg的Ab3、30mg/kg的Ab3、3mg/kg的Ab6或10mg/kg的Ab6治疗的小鼠花了多达28天肿瘤体积才达到1024mm3。图13C显示了使用Ab3(左上)或Ab6(右上)联合抗PD-1抗体治疗后的中位肿瘤进展。下图总结了在施用Ab3或Ab6联合抗PD-1的小鼠中第15天时的中位肿瘤体积(mm3)。在使用Ab3(10mg/kg)、Ab3(30mg/kg)或Ab6(10mg/kg)联合抗PD-1治疗的小鼠中第15天时的中位肿瘤体积为约500mm3或更低，而在仅使用抗PD-1治疗的小鼠中在第15天时中位肿瘤体积为1000mm3或更高(下图)。
图13D突出显示了在MBT2中Ab6的功效。显示了五个治疗组的小鼠中的肿瘤进展。接受对照IgG、单独的Ab6或单独的抗PD-1的动物均未实现有效肿瘤控制，将有效肿瘤控制定义为肿瘤体积减小至终点体积的25％或更低(分别用下虚线和上虚线表示)。而相比之下，在接受Ab6/抗PD-1联合治疗的28只动物中共有12只(～43％)达到有效肿瘤控制，表明PD-1和TGFβ1通路的同时抑制能够显著减少(例如，延迟或消退)肿瘤生长。
而且，与仅使用抗PD-1相比，在所有三个治疗组中联合治疗均有效延长存活。如图14中所示，为达到50％存活，使用10mg/kg的Ab3或10mg/kg的Ab6治疗的小鼠花费了28天，而仅使用PD-1治疗的小鼠在约16天达到50％存活。总的来说，这些结果证明了联合疗法的生存获益。
结果总结和讨论
Ab6-抗PD-1对肿瘤生长的协同作用：Ab6的发现可以直接评价以下假设，TGFβ1激活的选择性抑制将足以克服肿瘤对CBT的原发性抗性。对于临床前测试，我们试图鉴定鼠源同系肿瘤模型，该模型重现对CBT显示出原发性抗性的人肿瘤的一些关键特征。模型选择的标准包括1)在其他同系肿瘤模型中显示出有效的剂量下几乎没有或未显示出对抗PD-(L)1单药治疗的应答，2)伴随浸润CD3+T细胞缺乏的免疫排除的证据，3)活性TGFβ信号传导的证据，和4)TGFβ亚型表达的证据。
探索肿瘤应答和肿瘤性质数据，包括公众可获得的全部肿瘤来源RNA的RNAseq数据集，从而选择了满足这些标准的3种肿瘤模型：MBT-2膀胱癌模型(MBT-2)、Cloudman S91(S91)黑色素瘤模型和EMT-6乳腺癌模型(EMT-6)。对全部肿瘤RNAseq数据的分析表明，指示TGFβ通路激活的TGFβ应答基因上调，且效应T细胞基因表达较低，这与免疫排除表型一致(图20F)。通过ELISA对全部肿瘤裂解物进行分析，以探测总TGFβ亚型蛋白表达，发现TGFβ1生长因子在所有三个模型中普遍存在。
为了在小鼠同系模型中评价Ab6，我们以嵌合抗体形式表达Ab6，将Ab6的人V结构域与小鼠IgG1/κ恒定结构域融合以最大程度地降低免疫原性。Ab6-mIgG1与全人Ab6具有相似的抑制性活性。我们证实了，MBT-2荷瘤动物对以治疗水平给予的抗PD-1(RMP1-14)以及单独的Ab6-mIgG1均具有抗性。然而，将抗PD-1与Ab6-mIgG1联用，后者无论是以每周3mg/kg还是以每周10mg/kg给予均导致肿瘤负荷显著降低，分别包括21％和36％的无瘤存活者，以及在每项研究期间均有显著的存活获益(图13D和图14)。总体而言，与抗PD-1单用的0/13相比，4/14的动物对抗PD-1/Ab6-mIgG1(每周3mg/kg)产生应答，和8/14对抗PD-1/Ab6-mIgG1(每周10mg/kg)产生应答。在轻度抗PD-1反应性CloudmanS91黑色素瘤模型中我们观察到了相似的应答。再次，在所有剂量水平下，抗PD-1/Ab6-mIgG1联合治疗导致了显著的肿瘤抑制，其缓解率可达75％，以及显著的存活优势(见实施例5)。
我们接下来在MBT-2无肿瘤存活者中评估了抗肿瘤应答的持久性。停止治疗并对动物进行7周的随访。我们在任何动物中均未观察到可检测的肿瘤复发(见实施例8)。
TGFβ信号传导驱动的免疫排除导致CBT功效受损的临床衍生的假设，以及此前报道的临床前结果表明，泛TGFβ抑制能够使免疫系统克服这种耐药机制并提供CBT的功效，这在一定程度上促使我们考察采用本发明的抗体是否能够观察到对应于肿瘤免疫状况的相关变化的显著肿瘤应答和生存获益。
为了研究抗PD-1或AB6-mIgG1治疗作为单药或联用的免疫作用，治疗开始后10天从小鼠体内收获了MBT-2肿瘤，然后对选定免疫细胞标志物进行免疫组织化学和流式细胞术分析。尽管流式细胞术分析显示CD45+免疫区室的总体百分比未随着治疗而改变，但与同种型对照抗体治疗相比，在该区室内抗PD-1与Ab6-mIgG1联用使得CD8+T细胞呈现增加十倍(平均值分别为34％对比3.5％)(图27B)。值得注意的是，用抗PD-1单药治疗似乎可以适度增加CD8+细胞呈现，但是在在本研究中观察到的增加并未达到显著水平。此外，对这些肿瘤衍生的RNA的分析显示，细胞毒性T细胞激活的标志物增加，其与CD8+细胞数量增加一致，并提示这些细胞的活跃效应功能(图32D)。值得注意的是，联合治疗还观察到CD4+FoxP3+Treg细胞的呈现显著增加。鉴于联合治疗观察到的显著抗肿瘤作用，在Treg细胞中这种增加的相关性尚不清楚。然而，Treg:CD8的比率未因联合治疗而改变。有趣的是，抗PD-1/Ab6-mIgG1联合治疗还诱导了MBT-2肿瘤中总体CD11b+细胞呈现的显著降低。这似乎是由于CD11b+CD206+和CD11b+Gr1+亚群的选择性降低所致，其分别对应于免疫抑制M2样巨噬细胞和髓系来源的抑制细胞(MDSC)。总的来说，在联合治疗后，这两个细胞群的呈现从CD45+细胞群的平均47％降至14％(图28B)。治疗后，M1样巨噬细胞亚群(CD11b+CD206-)似乎未改变，表明PD-1/TGFβ1阻断对肿瘤内免疫抑制环境有选择性但广泛的影响，其对淋巴和髓系区室均有益处。
尚不清楚PD-1和TGFβ1联合抑制导致显著CD8+T细胞进入和/或扩增进入肿瘤微环境的具体机制。因此，我们进行了更详细的组织学分析，以便进一步了解TGFβ通路活性与免疫排除之间的关系。首先，我们通过免疫组织化学分析确证了整个对照组MBT-2肿瘤中CD8+染色的显著增加，这与流式细胞术的数据一致(图30)。接下来，我们进行了磷酸-Smad3(pSmad3)的免疫组织化学分析，pSmad3是一种介导TGFβ反应性基因激活的转录因子，我们试图确定肿瘤微环境中的哪些细胞可能对激活的TGFβ1做出应答。
令人吃惊的是，在抗PD-1治疗和对照小鼠的肿瘤中，pSmad3染色似乎主要局限于肿瘤血管内皮细胞核，而使用Ab6-mIgG治疗后该信号大大减弱(图30F)。
为了进一步探讨血管周围TGFβ信号传导的相关性，我们共染色了CD8+T细胞和CD31+血管内皮。CD8+T细胞似乎在与CD31+肿瘤血管相邻的区域富集(图30F和图30G)。该观察结果增加了肿瘤脉管系统可以作为T细胞进入途径的可能性。尽管其他人已经报道了TGFβ信号传导与富含成纤维细胞的肿瘤周围基质的存在有关，该基质形成了T细胞进入肿瘤的屏障，但是我们的初步观察结果表明，另外地TGFβ1依赖性血管屏障在预防CD8+T细胞进入肿瘤中也可能发挥重要作用。
实施例8：在MBT-2、Cloudman S91和EMT-6的抗PD1/Ab3和抗PD-1/Ab6完全缓解者中产生的持久的、抗肿瘤适应性免疫记忆应答
1.在MBT-2肿瘤中的抗肿瘤记忆
为了确定此前已清除MBT2肿瘤的完全缓解者是否产生了有效而持久的适应性免疫应答，进行了肿瘤再攻击实验。
方法
将8-12周龄雌性C3H/HeN小鼠在腹侧皮下植入5x 105个MBT2肿瘤细胞。当肿瘤达到40-80mm3的平均尺寸时，将动物随机分配到治疗组以开始治疗。各组的初始平均肿瘤体积相等。抗PD1(RMP1-14)以10mg/kg i.p.每周两次给予；Ab3以10mg/kg或30mg/kg每周一次给予和Ab6以3mg/kg或10mg/kg给药5周。5周后，在至少3次连续测量中，肿瘤体积小于13.5mm3的所有使用抗PD1/Ab3和抗PD1/Ab6的动物均视为“完全缓解者(CR)”。每周进行两次测量。在仅接受抗PD1的小鼠中没有此类完全缓解者。对于再攻击实验，完全缓解的动物没有任何可测量的肿瘤(例如，0mm3)。随后对这些完全缓解者随访(例如，“静置”)7周，但不给药(“清洗”期)，以使其清除此前给予的化合物。在7周结束时，在对侧腹侧皮下注射给予完全缓解者和年龄匹配的初始对照动物5x105个MBT2肿瘤细胞。随访动物25天或直至肿瘤体积超过1200mm3，以先到者为准。将终点定义为肿瘤体积为1200mm3。在到达终点后，将动物处死。
结果
当将来自功效研究的完全缓解者在初始植入的对侧腹侧皮下再植入MBT-2细胞后，未经进一步治疗，在任何完全缓解小鼠中均未观察到可检测的肿瘤生长，而在对照、年龄匹配、初始给予肿瘤的小鼠组中，所有小鼠在植入三周内均出现可测量的肿瘤(图15)。
更具体地，肿瘤再攻击模型是证实免疫记忆和针对转移或肿瘤复发进行监视的一种手段。在这些情况下，将完全缓解者(对治疗产生应答，达到完全肿瘤消退的动物)重新植入肿瘤细胞，并将生长情况与年龄匹配的初始小鼠进行比较。到第25天(图15)，初始动物的肿瘤出现率为100％(12/12)，很多动物达到了终点标准。如上所述，来自图13A和图13B中研究的完全缓解者用MBT2细胞再次攻击，到研究结束时没有可检测的肿瘤(合并后，0/9个完全应答者)，表明100％的完全缓解者保持了对MBT2肿瘤细胞再攻击强大的免疫记忆。这些结果表明，在经历肿瘤的动物中产生了对肿瘤抗原持久和有效的记忆应答，并表明在初始暴露中的肿瘤清除与适应性免疫应答相关。这种适应性免疫应答足以破坏肿瘤细胞，防止肿瘤形成，并提示在这些动物中继续抑制转移或肿瘤复发。此外，这表明在原发性免疫应答中TGFβ1抑制不会干扰记忆淋巴细胞群的发展。
来自MBT-2肿瘤模型的这些再攻击结果表明，TGFβ1和PD-1的联合抑制足以在这些动物中建立持久和高效的抗肿瘤免疫记忆。
2.在CloudmanS91中持久的抗肿瘤作用
值得注意的是，尽管抗PD-1/Ab6组合组中的几只CloudmanS91荷瘤小鼠经历了完全缓解，但在剩余治疗期内一些动物负载较小但稳定的残留肿瘤块。我们试图像我们在MBT-2中所做的一样在该模型中再现肿瘤再攻击数据。然而，在该模型中，肿瘤携带率是可变的，使得该分析更具有挑战性。相反，我们选择停止治疗并随访动物数周。
停止治疗六周后，在停止治疗时无可测量肿瘤的小鼠仍保持无肿瘤。停止给药时可测量的肿瘤具有混合的应答，其中很多被清除，但少数保持稳定或过度生长(图11D)。这些数据强调保持治疗直至达到完全肿瘤清除的重要性(亦参见实施例5)。
3.在EMT-6中持久的抗肿瘤作用
令人惊讶的是，我们在EMT-6乳腺癌模型中观察到了对PD-1/Ab6-mIgG1组合的相似应答，联合治疗后的完全缓解率达到50％，并且与抗PD-1相比具有显著的生存优势(图34A和图34C)。与MBT-2和CloudmanS91(其中TGFβ1是主要表达的亚型)不同的是，EMT6在RNA和蛋白水平上表达相似水平的TGFβ1和TGFβ3。这种治疗组合比抗PD-1/泛TGFβ抑制更有效，表明即使在存在多种TGFβ亚型的情况下，TGFβ1仍是免疫排除以及因此原发性抗性的主要驱动者。在该模型中，我们停止治疗，并再次观察到停药六周后，完全缓解者仍没有肿瘤，再次证明了缓解的持久性(图34C，右图)。
实施例9：抗体筛选、选择方法和表征
考虑到成熟TGFβ1生长因子及其密切相关的家族成员TGFβ2和TGFβ3之间的高度序列和结构相似性，我们认为针对这种活性形式的TGFβ1生长因子的选择性和足够高亲和性的基于抗体的抑制剂的产生将被证明是具有挑战性的。最近报道的对潜在TGFβ1结构及其通过与某些整联蛋白相互作用激活的机制方面的观点指出，有可能将潜在TGFβ1复合物中的前结构域作为靶点，以将阻止潜在复合物激活作为作用机制。
在结合和激活抑制两者中实现亚型选择性将利用限制和使各自的生长因子同型二聚体失活的家族成员前结构域之间较低的序列相似性。鉴定TGFβ1激活的选择性抑制剂的另一个重要考虑因素是，潜在TGFβ1被组装成二硫键连接的大型潜在复合物(LLC)，从而使无活性的生长因子复合物沉积在细胞外基质上或其在细胞表面上修饰。考虑到可能在肿瘤微环境中表达多个TGFβ1LLC，分析了来自TCGA的RNAseq数据。基本上所有肿瘤类型均显示出四个proTGFβ1呈递分子LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33表达的证据(图20E)。因此，我们试图鉴定在所有这些局部背景下将结合并抑制潜在TGFβ1激活的特异性抗体。
在精心设计的基于酵母的初始人抗体展示文库的筛选中，设计、表达、纯化、表征和使用了每种TGFβ1LLC的可溶性鼠源和人的形式，并将其用于阳性选择步骤。为确保鉴定出选择的潜在TGFβ1结合剂，在阴性选择步骤中还使用了非复合的LLC呈递分子。
通过使用人和鼠源形式的TGFβ1LLC(LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1和GARP-proTGFβ1)作为阳性选择抗原并在人和鼠源LLC呈递分子(LTBP1、LTBP3和GARP)上进行反选择(counter-selecting)，来选择基于酵母的初始全人IgG抗体文库以鉴定亲本抗体。选择是一个多轮过程，包括两轮磁珠辅助细胞分选(MACS)和随后的几轮荧光激活细胞分选(FACS)。MACS轮次包括预清理(以除去非特异性结合物)、与生物素化抗原一起孵育、洗涤、洗脱和酵母扩增。FACS选择轮次包括与生物素化抗原一起孵育，洗涤和通过流式细胞术选择结合(针对阳性选择)或非结合(针对阴性选择或去选择)群，然后通过在适合的酵母生长培养基中生长所选择的酵母进行扩增。所有选择均在溶液相中进行。
将数百种独特的抗体表达为全长人IgG1agly(去糖基化Fc)单克隆抗体。然后，通过生物层干涉法表征这些抗体，以确定其结合人和鼠源LTBP1-proTGFβ1、LTBP3-proTGFβ1和GARP-proTGFβ1的能力。在基于细胞的效力筛选测定(LTBP-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1测定)中检测了与这些TGFβ1LLC结合的抗体并对其进行了排序。使用人IgG4sdk Fc(通过S228P突变稳定化铰链，Angal,1993)重组表达抑制性抗体，并在整联蛋白介导的TGFβ1激活测定(LTBP-proTGFβ1、GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1测定；见实施例2)中检测了其抑制性活性。在报告细胞测定中，几种抗体能够显著抑制proTGFβ1。基于其能够结合人和小鼠proTGFβ1复合物并且抑制整联蛋白介导的所有人和小鼠proTGFβ1LLC的激活，选择抗体Ab4作为前导抗体用于亲和性成熟。
在两个阶段中使用两种不同的抗体工程化策略完成了Ab4的亲和性成熟。在第一个阶段中，生成抗体分子文库，其中将亲代CDRH3与具有CDRH1和CDRH2变体(H1/H2打乱)的预制抗体文库组合。选择该文库以结合至人和小鼠proTGFβ1复合物。然后，将来自亲和性成熟活动这一阶段的最强结合物移动到亲和性成熟的第二个阶段，在该阶段中，使用引物二聚体步移方法(H3寡核苷酸突变)对亲本分子的重链CDR3进行诱变，并对产生的变体文库进行选择，以结合至人和小鼠proTGFβ1复合物。
再次检测了代表来自两个亲和性成熟阶段的先导抗体Ab4的亲和性优化后代的共计14种抗体的抗原结合和对潜在TGFβ1LLC的抑制。由于其针对全部四种潜在TGFβ1LCC均具有较高亲和性，对小鼠、大鼠和食蟹猴蛋白具有交叉反应性以及在基于细胞的测定中具有更高的效力，因而选择了Ab6。
为了进一步表征Ab6的结合性质，在MSD-SET测定中测量了体外结合活性。已证实Ab6对潜在TGFβ1复合物具有选择性(见图33A)；没有检测到与潜在TGFβ2或潜在TGFβ3复合物的有意义的结合。类似地，未检测到与前结构域无关的活性(成熟)生长因子本身的结合。如下所示，Ab6以高亲和性与大型潜在TGFβ1复合物(即，呈递分子+proTGFβ1)结合。此外，Ab6显示出具有理想的种属交叉反应性；其以高亲和性识别和结合大鼠和食蟹猴对应物。
表21：Ab6的交叉种属特异性
Figure BDA0002970630990001711
Figure BDA0002970630990001721
为检测Ab6抑制整联蛋白介导的潜在TGFβ1激活的能力，开发了一系列基于细胞的激活测定，其对应于能够实现TGFβ1呈递和激活的每个LLC背景。人LN229胶质母细胞瘤细胞表达αVβ8整联蛋白，其可以激活潜在TGFβ1复合物。这些细胞还内源性表达LTBP1和LTBP3(如通过qPCR测量的)，当用TGFβ1编码质粒转染时，其能够将这些TGFβ1LLC(LTBP1-proTGFβ1和LTBP3-proTGFβ1)生产并沉积到细胞外基质中。为了生产细胞相关的含GARP或LRRC33的TGFβ1LLC(GARP-proTGFβ1和LRRC33-proTGFβ1)，将LN229细胞(通过qPCR确定，其不表达这些基因)与编码这些呈递分子之一的表达构建体以及TGFβ1表达构建体共转染。一旦沉积到细胞外基质中或在LN229细胞的细胞表面上进行修饰(elaborated)，则TGFβ1LLC就能够被同一细胞表达的αVβ8整联蛋白激活。然后，通过整联蛋白激活从潜在复合物中释放的成熟(活性)TGFβ1生长因子可以自由地与其配对(cognate)受体接合到用CAGA12-荧光素酶启动子-报告子工程化的共培养细胞上，从而能够测量生长因子的活性。
所有TGFβ1LLC均易于在上文所述的测定条件下激活。将GARP或LRRC3共转染至表达潜在TGFβ1的LN229细胞中会导致显著更高的TGFβ信号，这与TGFβ1LLC在细胞表面上的形成和激活以及与内源性LTBP竞争一致。Ab6以浓度依赖性方式抑制所有复合物的激活，其IC50值在1.15至1.42nM之间。针对小鼠TGFβ1复合物的抑制效力相似，这与Ab6的种属交叉反应性一致。同Ab6与LTBP1-TGFβ3复合物缺乏显著结合一致，在相同设计的测定中观察到很少或没有抑制整联蛋白介导的LTBP-TGFβ3LLC激活，从而证明了抑制TGFβ1激活的选择性(图33B)。
值得注意的是，Ab6还抑制由人血浆激肽释放酶和纤溶酶介导的潜在TGFβ1的激活(见图5A和图5B)，表明该抗体可能抑制了多种推定的激活机制。
为了进一步评估Ab6抑制TGFβ1激活的生物学相关结果的能力，我们评估了该抗体抑制原代人Treg细胞关键抑制活性的能力。在T细胞受体刺激后，分选的CD4+CD25hiCD127loTreg细胞上调TGFβ1-GARP LLC的表面表达(图26A)。这些激活的Treg细胞抑制了自体效应CD4 T细胞的增殖，并且Ab6在低至1μg/ml的浓度下阻断了这种抑制性Treg的活性(图26B)。这些结果与Treg细胞利用TGFβ信号传导抑制T细胞的此前的观察结果一致。
实施例10：确定Ab5、Ab6和Ab3在proTGFβ复合物中的结合位点的表位定位(mapping)
为了初步了解TGFβ1激活的亚型选择性抑制剂的抑制作用机制，我们进行了氢氘交换质谱(H/DX-MS)分析，以鉴定潜在TGFβ1与抗体相互作用的可能位点。氢氘交换质谱(H/DX-MS)是探索溶液中蛋白构象的一种广泛使用的技术。在Wei等，Drug DiscovToday.2014January；19(1):95–102中描述了HDX-MS的方法学，其全部内容通过引用并入本文。简言之，HDX-MS依赖于溶液中氘与蛋白骨架酰胺氢的交换。涉及弱氢键或位于蛋白表面的骨架酰胺氢交换可能很快，而埋在内部的氢或涉及稳定氢键的那些交换速度则较慢。通过测量骨架酰胺氢的HDX速率，可以获得有关蛋白质动力学和构象的信息。
在相同缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.5)中制备潜在TGFβ1(15μM)和proTGFβ1/Ab Fab(摩尔比1:3)。在非氘代实验中，将每个样品在室温下与样品缓冲液(1:15，v/v)混合，然后在0℃下与1:1(v/v)淬灭缓冲液(100mM磷酸钠，4M盐酸胍，0.5M TCEP)混合。将淬灭后的样品立即注入使用HDX技术的nanoACQUITY UPLCTM系统(Waters Corp.,Milford,MA,USA)，进行柱上胃蛋白酶消化。将洗脱液导入
Figure BDA0002970630990001731
G2HDMS质谱仪(Waters Corp.,Milford,MA,USA)，以MSE模式进行分析。对于H/D交换实验，在25℃下将每个样品与标记缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl的二氧化氘溶液，pD 7.5)(1:15，v/v)混合，以开始标记反应。将每个样品的五个等分试样在不同时间间隔标记：10s、1min、10min、1h和2h。在每个标记时间点结束时，通过添加1：1(v/v)淬灭缓冲液淬灭反应，并将淬灭的样品注入Wat质量ers H/DX-MS系统进行分析。在每个样品运行之间，通过将胃蛋白酶洗涤缓冲液(1.5M盐酸胍，4％乙腈，0.8％甲酸)注入H/DX-MS系统，运行干净的空白样品。
使用不依赖于数据的采集模式(MSE)和ProteinLynx Global Server(PLGS)3.0软件(Waters Corp.,Milford,MA)进行精确质量分析和碰撞诱导解离，用于确定未经氘化的蛋白样品中的消化性肽段，该样品在用于H/DX-MS实验的同一UPLC-ESI-QToF系统上进行了分析。将从PLGS产生的消化性肽段导入DynamX 3.0(Waters Corp.,Milford,MA)，其肽质量阈值为MS1信号强度≥1000，最大质量误差为1ppm。手动检查自动化结果，以确保将各种电荷状态下的相应m/z和同位素分布正确分配给适当的消化肽。将DynamX 3.0用于产生每个消化肽的相对氘结合图和H/DX热图。通过在每个标记时间点从氘标记样品的同位素分布的重均质心质量减去未氘代对照样品的同位素分布的重均质心质量，可确定每种肽的相对氘掺入。所有比较均在相同实验条件下进行，因此在确定氘掺入量时无需进行反向交换校正。因此，H/D交换水平报告为相对水平。通过将每种消化性肽的相对氘吸收量除以其理论最大吸收量来计算相对氘吸收分数。所有H/DX-MS实验均一式两份进行，并按所述方法计算出平均相对氘摄取的不确定度的98％置信限。未结合的和与Fab结合的潜在TGFβ1之间的氘摄取差异超过0.5Da认为是显著的。
进行HDX-MS以确定在proTGFβ复合物中Ab5和Ab6的结合位点。在HDX-MS中，由于蛋白之间的相互作用，保护了与抗体紧密结合的抗原区域不发生质子交换，而暴露于溶剂的区域则很容易进行质子交换。基于此，鉴定了抗原的结合区。
热图显示了ProTGFβ1的区域(区域1和区域2)中HDX保护中的Ab5 Fab结合结果(图16)。图17描绘了proTGFβ1复合物的结构，其被Ab5结合的HDX保护区覆盖。值得注意的是，HDX-MS表明Ab5可能与ProTGFβ1的LAP/生长因子区域中的独特表位结合。
进行了类似的HDX研究，以鉴定参与Ab6与proTGFβ1结合的结合区。获得了约90％的极佳的肽覆盖率。分析揭示了潜在TGFβ1上的三个区域被Ab6 Fab结合保护免受氘交换。图18A中提供的热图显示了受Ab6与抗原相互作用影响的ProTGFβ1的某些区域。抗原的这些区域由图中显示的红色框表示。图18B显示了proTGFβ1复合物的结构，并且在图18A中鉴定的区域被相应地标记以显示proTGFβ1复合物内这些区域的空间关系。
如图18A中所示，发现带有星号(*)的受保护区域与针对Ab5鉴定的区域1相同。发现带有双星号(**)的受保护区域是针对Ab5鉴定的区域2的子集。这些数据表明，显示出有利的抑制性活性的优选抗体可以结合包含潜在复合物的潜伏套索(潜伏环)的一部分的表位。数据还表明，此类表位可能是由潜伏套索的一部分与生长因子结构域的一部分形成的组合表位，其可以有效“夹住”处于锁定状态的生长因子，从而防止其释放。
统计学分析显示proTGFβ1上的三个结合区受到Ab6 Fab结合的强烈保护而不进行氘交换(图19A)。区域1在潜在TGFβ1前结构域内，而区域2和区域3则定位在TGFβ1生长因子。有趣的是，区域1在很大程度上跨越了潜伏套索并且含有纤溶酶和激肽释放酶蛋白酶的蛋白水解切割位点；该区域的保护与我们的观察结果一致，即Ab6抑制激肽释放酶和纤溶酶介导的潜在TGFβ1的激活(图5A和图5B)。同样重要需要重申的是，Ab6不会以游离形式(例如，不与前结构域结合)结合三个TGFβ生长因子二聚体中的任何一个，这意味着与生长因子结构域上位点的任何潜在相互作用均取决于前结构域的相互作用。而且，Ab6和整联蛋白αVβ6能够同时结合至潜在TGFβ1。该观察结果提示了整联蛋白依赖性TGFβ1激活的变构抑制机制，因为抗体结合区位于携带整联蛋白识别位点的TGFβ1前结构域中触发环的远端(RGD；图19B)。此外，推定的表位区域1-3(特别是区域1和2)的序列比对揭示了三种TGFβ亚型之间的显著序列差异，这很可能解释了观察到的Ab6对proTGFβ1与proTGFβ2和proTGFβ3复合物的选择性(图19B)。
实施例11：TGFB1、TGFB2和TGFB3相对表达的生物信息学分析
此前对人类肿瘤样品的分析表明，TGFβ信号传导是对CBT原发性耐药的主要贡献者(Hugo等，2016)。这些研究之一揭示了在尿路上皮癌中TGFΒ1基因表达是与抗PD-L1治疗无应答者相关的得分最高的TGFβ通路之一，表明该亚型的活性可能正在驱动TGFβ信号传导。
为了评估在癌症肿瘤中TGFβ亚型的表达，对来自公众可获得数据集的基因表达(RNAseq)数据进行了检查。使用公众可获得的在线界面工具(Firebrowse)检查CancerGenome Atlas(TCGA)中TGFβ亚型(TGFB1、TGFB2和TGFB3)的表达，首先检查在正常组织和癌症组织两者中编码TGFβ亚型的RNA的差异表达。评价了人类癌症类型人群以及单个肿瘤中TGFΒ1、TGFΒ2和TGFΒ3mRNA的表达。选择在TCGA数据库中的所有肿瘤RNAseq数据集(其有正常组织比较物)，并且对TGFB1、TGFB2和TGFB3基因的表达进行了检查(图20A)。来自Firebrowse界面的数据表示为每千碱基百万的读取结果的log2(RPKM)。
这些数据表明在大多数肿瘤类型(灰色)中，TGFB1是TGFβ亚型中表达最丰富的转录物，相对于TGFB2的0-2和相对于TGFB3的2-4，其log2(RPKM)值一般在4-6的范围内。我们还注意到，在几种肿瘤类型中，TGFB1和TGFB3两者表达的平均水平相对于正常比较样品(黑色)升高，表明这些TGFβ亚型的表达增加可能与癌细胞相关。由于TGFβ信号传导在抑制癌症微环境中的宿主免疫系统中的潜在作用，我们有兴趣注意到TGFB1转录物在癌症类型(其中抗PD-1或抗PDL1疗法被批准—这些适应症在图20A上标记为灰色)升高。
注意虽然RPKM>1通常被认为是与生物学相关的基因表达相关的最小值(Hebenstreit等，2011；Wagner等，2013)，但是对于后续分析，使用更严格的RPKM截止值(或相关测量FPKM(参见Conesa等，2016))>10或>30以避免假阳性。为了比较，在图20A中指示了所有这三个阈值。
图20A中的大的四分位数范围表明个体患者中TGFβ亚型表达的显著变化。为了鉴定其中至少患者群的子集具有差异表达TGFβ1亚型的肿瘤的癌症，对来自TCGA数据集中个别肿瘤样品的RNAseq数据进行分析，计算每千碱基百万(FPKM)片段的数目。RPKM和FPKM大致相同，尽管FPKM校正了相同转录物的相反两端的双重计数读取结果(Conesa等，2016)。如果转录物的FPKM值为>30，将肿瘤样品评分为TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3表达阳性，并且计算表达各TGFβ亚型的各癌症类型的患者的分数(fraction)(表示为％)(图20B)。
对来自Cancer Genome Atlas(TCGA)的RNAseq数据的比较分析表明，在这三个家族成员中，TGFΒ1表达似乎在大多数肿瘤类型中最普遍。值得注意的例外是乳腺癌、间皮瘤和前列腺癌，其中其他家庭成员(特别是TGFΒ3)的表达与TGFΒ1相比至少同样普遍。如图20B所示，大多数肿瘤类型表明是TGFβ1阳性的个体样品的显著百分比，一些癌症类型包括急性髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和头和颈部鳞状细胞癌在80％以上的所有肿瘤样本中表达TGFβ1。与图20A中的数据一致，较少的癌症类型对TGFβ2或TGFβ3呈阳性，尽管几种癌症显示相同或更高百分比的TGFβ3阳性的肿瘤样品，包括乳腺浸润癌、间皮瘤和肉瘤。这些数据表明癌症类型可以针对TGFβ亚型表达进行分层，并且这样的分层可用于鉴定用TGFβ亚型特异性抑制剂治疗的候选患者。
为了进一步研究此假设，来自个体肿瘤样本的子集的log2(FPKM)RNAseq数据在热图中绘制(图20C)，设置颜色的阈值以反映FPKM>30作为被评分为TGFβ亚型阳性的最小转录物水平。在7种CBT已获批的肿瘤类型中，单个肿瘤样品中TGFΒ1mRNA表达的排列顺序证实，与TGFΒ2和TGFΒ3相比，TGFΒ1mRNA的表达更高且更加频繁，但再次值得注意的是乳腺癌除外。这些以及此前发表的关于尿路上皮癌的观察结果表明，在大多数人类肿瘤中，TGFβ通路的活性很可能是由TGFβ1激活驱动的。
每个样品被表示为在热图的单个行，并且样品通过TGFβ1表达的水平排列(最高的表达水平在顶部)。与图20B中的分析一致，每种癌症类型中的大量样品对TGFB1表达呈阳性。然而，该表示还突出了许多肿瘤仅表达TGFB1转录物的事实，特别是在食管癌、膀胱尿路上皮、肺腺癌和皮肤黑色素瘤癌症类型中。有趣的是，这样的TGFB1倾斜不是所有癌症的特征，因为来自乳腺浸润癌的样品显示出比TGFB1阳性更多数量的TGFB3阳性样品。尽管如此，该分析表明β1亚型是主要的，并且在大多数情况下，是来自大量癌症患者的肿瘤中存在的唯一的TGFβ家族成员。与表明TGFβ信号传导在癌症微环境中的免疫抑制中起重要作用的数据一起，这些发现还指出TGFβ1特异性抑制在治疗这些肿瘤中的效用。
为了鉴定在其中测试TGFβ1特异性抑制作为癌症治疗剂的功效的小鼠模型，对来自在小鼠同系肿瘤模型中的各种细胞系的RNAseq数据的TGFβ亚型的表达进行了分析。对于该分析，生成了数据的两个表示。首先，我们生成了衍生自各细胞系的肿瘤的log2(FPKM)值的热图(图20D，左)。因为该分析用于鉴定将重现人肿瘤(TGFβ1占主导)的同系模型，我们主要关注避免假阴性，并且我们将我们的“阳性”阈值设为FPKM>1，远低于图20B和图20C中的表示。
如在图21D(左)中的数据所清楚显示，一些同系肿瘤包括MC-38、4T-1和EMT6通常共同表达显著水平的TGFβ1和TGFβ3两者。相反，A20和EL4模型几乎仅仅表达TGFβ1，并且S91和P815肿瘤显示出对TGFβ1表达的强烈偏向。
为了进一步评价TGFB1相对于TGFB2和/或TGFB3的差异表达，计算minΔTGFB1，定义为log2(FPKMTGFB1)-log2(FPKMTGFB2)或log2(FPKMTGFB1)-log2(FPKMTGFB3)的较小值。各模型的minΔTGFB1在图20D(右)中显示为热图，并且强调了图20D(左)的结论，即来自A20、EL4、S91和/或P815细胞系的同系肿瘤可以代表用于检测TGFβ1特异性抑制剂功效的优异模型。
为进一步确证TGFβ1表达而非TGFβ2或TGFβ3与对CBT的原发性抗性的关联，我们将亚型表达与先天性抗PD-1抗性标志(“IPRES”)相关联(Hugo等，Cell.2016Mar 24；165(1):35-44)。简言之，IPRES是26个转录组标志的集合，这些标志共同表明肿瘤对PD-1疗法的抗性。IPRES标志表明与间质转化、细胞粘附、ECM重塑、血管生成和伤口愈合相关的基因表达上调。在7种CBT已获批的肿瘤类型中，我们发现与其他两种TGFβ亚型的mRNA表达相比，TGFΒ1mRNA水平和IPRES评分之间存在更一致的正向和显著的相关性(图37A)。综上所述，这些数据表明对TGFβ1活性的选择性抑制可以克服对CBT的原发性抗性。
使用CBT已获批疗法对TCGA定义的肿瘤类型进行IPRES(先天抗PD-1抗性)转录标志的基因组变异分析(GSVA)与TGFβ1RNA丰度具有最强的和显著的相关性(皮尔逊系数)，对于表达的存在，截止值为FPKM≥30。综上所述，这些数据表明对TGFβ1活性的选择性抑制可以克服对CBT的原发性抗性。
使用CBT已获批疗法对TCGA定义的肿瘤类型进行IPRES(先天抗PD-1抗性)转录标志的基因组变异分析(GSVA)与TGFβ1RNA丰度具有最强的和显著的相关性(皮尔逊系数)，对于表达的存在，截止值为FPKM≥30。
为进一步评估TGFβ1表达与对CBT抗性的相关性，将TGFβ1RNA丰度与CDT已获批疗法在TCGA定义的肿瘤类型上的Plasari TGFβ通路(先天抗PD-1抗性)转录标志的基因组变异分析(GSVA)进行了比较。从mSigDB web门户网站(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)获得plasari基因集，并使用R中的GSVA软件包确定了基因集评分计算(Hanzelmann等，BMC Bioinformatics201314:7,2013；和Liberzon等，Bioinformatics.2011Jun 15；27(12):1739–1740)。如图37B中所示，GSVA与TGFβ1RNA丰度具有最强的和显著的相关性(皮尔逊系数)，对于表达的存在，截止值为FPKM≥30。
这些数据表明，在大多数人类肿瘤中，TGFβ通路的活性可能由TGFβ1激活所驱动。
将下述资源用于上文所述的生物信息学分析：
TGFβ亚型TCGA表达数据下载自UCSC Xena浏览器数据集资源(https:// xenabrowser.net/datapages/)。通过检查TGFβ亚型数据的FPKM值的分布确定了确定高表达的表达截止值。使用GraphPad Prism产生热图和散点图。从mSigDB web门户网站(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)获得plasari基因集，并使用R中的GSVA软件包确定了基因集评分计算。
实施例12：在安全性/毒理学研究中与ALK5激酶抑制剂LY2109761和泛TGFβ抗体相比TGFβ1选择性抑制剂显示出降低的毒性
为了评价Ab3和Ab6相比于小分子TGFβI型受体(ALK5)激酶抑制剂LY2109761和泛TGFβ抗体(hIgG4；中和)的毒性，在大鼠中进行了安全性/毒性研究。基于之前的报道即大鼠相比于小鼠对TGFβ抑制更敏感，选择大鼠作为该安全性研究的物种。在其他哺乳动物物种中也观察到在大鼠中观察到的类似毒性，例如狗、非人灵长类动物以及人类。
简言之，向雌性Fisher344大鼠(图21A和图21B)或Sprague Dawly大鼠(图21C)施用3mg/kg(1组，n＝5)，30mg/kg(1组，n＝5)或100mg/kg(1组，n＝5)的Ab3；10mg/kg(1组，n＝5)，30mg/kg(1组，n＝5)或100mg/kg(1组，n＝5)的Ab6；3mg/kg(1组，n＝5)，30mg/kg(1组，n＝5)或100mg/kg(1组，n＝5)的泛TGFβ抗体；200mg/kg(1组，n＝5)或300mg/kg(1组，n＝5)LY2109761；或PBS(pH 7.4)载剂对照(1组，n＝5)。
接受泛TGFβ抗体的动物以10mL/kg的体积静脉内给药一次(在第1天)，并且在第8天处死并进行尸检。接受Ab3或Ab6的动物以10mL/kg的体积每周一次i.v.给药，给药4周(在第1、8、15和22天)。接受LY2109761的动物通过灌胃给药，每天一次，给药5天或7天。在第29天处死动物并进行尸检。
每天两次进行动物的一般临床观察，并在给药后进行笼旁观察，以评估急性毒性。进行的其他观察包括每周进行一次食物消耗量评估和测量体重。这些还包括临床病理学(血液学、血清化学和凝血)和解剖病理学(大体和显微镜)评价。尸检时收集一整套组织用于显微镜评价。将组织保存在10％中性福尔马林缓冲液中，修剪，常规处理并包埋在石蜡中。对蜡块进行切片机切片，并用苏木精和伊红(H&E)对切片进行染色。特别地，通过沿垂直于肺动脉平面的平面纵向平分修剪心脏，以暴露右房室，左房室和主动脉瓣。两半均进行包埋。将每个心脏半切面均埋入石蜡中，切面朝下。将蜡块切片以获得至少三个心脏瓣膜。由美国兽医病理学家学会(ACVP)董事会认证成员通过光学显微镜检查组织切片。
如表20和图21所示，施用≥3mg/kg泛TGFβ抗体的动物显示出与如上所述施用LY2109761的动物中描述的类似的心脏瓣膜发现(即瓣膜病)。施用≥30mg/kg泛TGFβ抗体的动物表现出与施用LY2109761的动物中描述的类似的心房发现。施用100mg/kg泛TGFβ抗体的动物表现出与施用LY2109761的动物中描述的类似的心肌发现，并且施用30mg/kg泛TGFβ抗体的动物在心肌中具有出血。一只施用100mg/kg泛TGFβ抗体的动物具有伴有冠状动脉出血的中度壁内坏死，其与轻微的血管周围混合炎性细胞浸润有关。施用泛TGFβ抗体和LY2109761的动物的骨发现由肉眼可见的异常形状的胸骨和胸骨终板中的肥大区和股骨和胫骨的生理的微观增加的厚度组成；与泛TGFβ抗体相比，这些发现在施用LY2109761的动物中具有更高的发生率和/或严重性。
表22：接受泛TGFβ抗体的动物的显微心脏发现
Figure BDA0002970630990001771
Figure BDA0002970630990001781
如图21A中所示，施用泛TGFβ抗体的动物表现出与在施用LY2109761的动物中所描述的那些相似的毒性，如在PCT/US2018/012601中所述，其全部内容通过引用并入本文。具体而言，施用≥30mg/kg泛TGFβ抗体的动物表现出与施用LY2109761的动物中描述的那些相似的心脏瓣膜发现(例如，瓣膜病)。施用≥30mg/kg泛TGFβ抗体的动物表现出与施用LY2109761的动物中描述的那些相似的心房发现。施用100mg/kg泛TGFβ抗体的动物表现出与施用LY2109761的动物中描述的那些相似的心肌发现，并且施用30mg/kg泛TGFβ抗体的动物出现心肌出血。一只施用100mg/kg泛TGFβ抗体的动物具有伴有冠状动脉出血的中度壁内坏死，其与轻微的血管周围混合炎性细胞浸润有关。施用泛TGFβ抗体和LY2109761的动物的骨发现由肉眼可见的异常形状的胸骨和胸骨终板中的肥大区和股骨和胫骨的生理的微观增加的厚度组成。如图21B和图21C所示，随后使用LY2109761和泛TGFβ的研究也显示出相似的毒性。在使用TGFβ的泛抑制剂治疗的动物中观察到的心脏瓣膜病的特征是由于出血、内皮增生、混合性炎性细胞浸润和/或基质增生引起的心脏瓣膜增厚，这与此前报道的发现一致。
而相比之下，与给予泛TGFβ抗体或LY2109761的动物不同，使用TGFβ1选择性抑制剂(即Ab3或Ab6)的大鼠在这些研究中Ab6和Ab3两者的无可见不良效应水平(NOAEL)为每周给药100mg/kg，即所检测的最高剂量。如图21B中所示，仅在少数给予Ab3的动物中出现了最小或轻度的心脏瓣膜发现，且由于其发生率低(动物和动物中的心脏瓣膜数量)、缺乏剂量应答或相关性和/或缺乏并发的骨骼发现，因而认为这些发现不太可能与待测物相关。此外，在使用Ab6治疗的动物中未见任何发现(图21C)。
药代动力学分析表明，在以100mg/kg的剂量给药4周的动物中，Ab6的血清浓度达到2,300μg/ml。对于所评价的最高剂量100mg/kg，研究终止时(第29天)的平均Ab6血清浓度达到2.3mg/ml。这些结果表明，对TGFβ1激活的选择性抑制似乎可以避免关键的剂量限制性毒性，而该剂量远高于在多种体内模型中观察到治疗效果所需的剂量。
总之，在大鼠(已知对TGFβ抑制敏感的物种)中，在为期4周的一段时间内，以所检测的所有剂量(3mg/kg、30mg/kg或100mg/kg)的Ab3或Ab6给予动物在以下任何参数中均未显示出超过背景的毒性作用：心肌变性或坏死、心房出血、心肌出血、瓣膜出血、瓣膜内皮增生、瓣膜基质增生、心脏瓣膜混合炎性细胞浸润、矿化、冠状动脉坏死伴出血、动脉根部坏死伴炎症、心肌细胞坏死或炎性细胞浸润以及瓣膜病。因此，与给予泛TGFβ抑制剂(例如，ALK5激酶抑制剂LY2109761或泛TGFβ抗体)相比，给予TGFβ1激活的亚型特异性抑制剂令人吃惊地导致安全性性质显著改善，例如死亡率降低、心脏毒性降低、骨骼发现减少。
还在非人灵长类动物(食蟹猴)中进行了GLP毒理学研究，以评价高亲和性TGFβ1选择性抑制剂Ab6的安全性性质。该方案包括以每周30、100和300mg/kg进行为期4周的重复给药，然后恢复4周。
在30、100和300mg/kg/周下，Ab6具有良好的耐受性。在主要队列(cohort)和恢复队列中均未发现与Ab6相关的不良发现。在靶器官中没有发现与Ab6相关的发现，所述靶器官是泛TGFβ抑制剂观察到毒性的部位(例如，无心脏毒性、增生和炎症、牙齿和牙龈发现)。
在持续5周，每周给药300mg/kg后，Ab6血清浓度达到15,600μg/mL。在恢复期结束时，Ab6血清浓度水平保持较高，约为～2,000-3,000μg/mL。
基于这些数据，在食蟹猴中Ab6的NOAEL为300mg/kg/周，其是所检测的最高剂量。
实施例13：抗PD-1/Ab3的组合对瘤内免疫细胞的影响
此前的报道考察了在临床前动物模型中从免疫抑制肿瘤中排除效应T细胞。
然而，这些报道没有提供针对巨噬细胞的观点。为了评价在免疫抑制的同系肿瘤模型中巨噬细胞浸润与在该背景下TGFβ1抑制作用的关系，我们对在上述实施例7中使用抗PD1和30mg/kg的Ab3治疗的CloudmanS91肿瘤样品进行了免疫组织化学(见图24A-24D)。
在来自未接受抗PD1/Ab3组合的动物的对照肿瘤切片中，检测到一些F4/80阳性细胞，表明所述肿瘤中含有一些巨噬细胞，其可能是M2型(即所谓的肿瘤相关巨噬细胞)或TAM。相比之下，在由用抗PD1/Ab3组合治疗的动物制备的切片中，在肿瘤内观察到F4/80阳性细胞的数量显著增加(见图24A-24C)。与单独使用抗PD1相比，在使用抗PD-1/Ab3治疗的动物中，F4/80阳性巨噬细胞对肿瘤的广泛浸润表明，联合治疗而非单独使用抗PD1诱导大量细胞内流，这很可能是由于浸润到肿瘤中的循环单核细胞的募集。为了鉴定这些巨噬细胞的表型，将抗CD163用作M2巨噬细胞标志物。如图24D中所示，这些细胞中的大多数显示出CD163阴性，这表明响应于抗PD1/Ab3联合治疗而募集到肿瘤中的巨噬细胞可能是M1型的，因此是抗肿瘤亚型。这可能表明巨噬细胞清除了由细胞毒性细胞产生的癌细胞碎片，并且可能是TGFβ1抑制的直接结果。
实施例14：TGFβ1抑制剂对MBT2肿瘤中的细胞毒性细胞的影响
颗粒胞吐作用是细胞毒性T细胞参与并杀死驻留的肿瘤细胞的一种机制。激活后，颗粒与质膜融合并释放其内容物，包括细胞毒素，如穿孔素和颗粒酶B，从而导致肿瘤细胞消除。此外，CD8抗原(CD8a)是存在于大多数细胞毒性T细胞中的细胞表面糖蛋白，可作为T细胞受体的共受体。因此，在使用Ab3或Ab6治疗(分别与抗PD-1联用)的肿瘤中测量CD8a、穿孔素和颗粒酶B的水平，以评估效应T细胞活性。
方法
将5x105个MBT2肿瘤细胞植入8-12周龄C3H/HeN雌性小鼠的腹侧。在治疗开始之前，在平均肿瘤尺寸为40-80mm3时，将动物随机分配至给药组。抗PD1(RMP1-14)以10mg/kg每周给药两次。Ab3以30mg/kg每周给药一次。给药8天后，末次给药后8小时(抗PD1共给药三剂，Ab3共给药两剂)处死动物并切下肿瘤。对于Ab6，在治疗后第10天或第13天分析免疫构成。抗PD-1以10mkg每周给药两次。Ab6以10mkg每周给药一次。将肿瘤在液氮中快速冷冻，使用cryoPREP撞击器在Covaris袋中粉碎，并使用Trizol/氯仿提取RNA。使用Taqman FastAdvanced Master Mix生成cDNA，并将CDNA负载到定制的Taqman阵列卡片中，该卡片具有针对感兴趣基因的引物和探针。在Viia7热循环仪上进行qPCR。将每个样品的CTL基因表达均以HPRT归一化，并且以抗PD1/Ab3或抗PD1/Ab6对比抗PD1单独表示变化倍数。
结果
在肿瘤内，与单独使用抗PD1相比，抗PD1/Ab3的组合诱导与抗肿瘤应答相关的CTL基因的有效上调(见图25)。在MBT2肿瘤模型中，单独使用抗PD1几乎无法抑制肿瘤生长并且提供非常少的抗肿瘤免疫力。因此，这些结果表明，加入抗TGFβ抗体能够实现效应CD8 T细胞的完全激活和浸润。
实施例15：Ab3和Ab6在体外对Treg活性的影响
方法
使用Ficoll从健康供体血沉棕黄层(buffycoat)分离人PBMC。通过磁性选择选择CD4细胞，并且然后使用Biorad S3E将CD25+CD127lo Treg分选，克隆BC96(ThermoFisher)用于CD25hi和克隆HIL 7Rm21(BD Bioscience)用于CD127lo。在TexMacs培养基(Miltenyi)中使用与板结合的抗CD3(克隆OKT3，Biolegend)和可溶的抗CD28(克隆28.2，Biolegend)刺激分选的Treg 1周。在一些研究中，另外加入IL2，以上调GARP和pro-TGFβ表达。将Treg与使用Cell Trace Violet 9(Invitrogen)染色的自体CD4 T细胞1:1共培养，并再次用抗CD3/抗CD28刺激5天。5天后，通过流式细胞术(Attune流式细胞仪，ThermoFisher Scientific)测量细胞分裂，Cell Trace Violet染料的稀释物进行门控，并使用FlowJo(BD Bioscience)进行分析。
结果
培养5天后，效应CD4 T细胞(Teff)分裂了80％。Treg 1:1的添加将Teff分裂抑制到接近15％，而进一步添加10ug/ml的Ab3则完全抑制Treg介导的T效应子分裂的抑制(见图26A)。1μg/ml Ab3抑制Treg的抑制作用较弱。1μg/ml和10μg/ml Ab6均同样抑制Treg衍生的TGFβ。因此，Ab6似乎是Treg上GARP-proTGFβ1复合物的TGFβ1激活的更有效抑制剂。
实施例16：Ab6/抗PD-1组合治疗对MBT2肿瘤中的瘤内免疫细胞群/组织结构的影响
为了开始阐明可能介导在用抗PD-1和Ab6组合治疗的小鼠中观察到的肿瘤消退作用的各种免疫细胞群，将MBT2肿瘤模型用于FACS研究。研究设计总结如下。
表23：MBT2肿瘤免疫构成的研究设计
Figure BDA0002970630990001801
每个研究组含有12只具有如上所述的MBT2肿瘤的小鼠。Ab6治疗组在第1天和第8天以10mg/kg每周接受抗体。抗PD1治疗组每两周治疗一次，在第1、4、8和11天每次注射10mg/kg，每周共计20mg/kg。相应地给予每个对照IgG组抗PD1和Ab6匹配的IgG亚型。在第13天，如上所示从小鼠中收集肿瘤。
流式细胞术分析：还在MBT-2肿瘤中通过肿瘤流式细胞术分析了肿瘤相关的免疫细胞子集。简言之，切下肿瘤并称重，然后使用用于gentleMACS(Miltenyi)的肿瘤解离试剂盒进行解离。使样品过滤通过70μm细胞滤网以除去任何聚集物。FACS缓冲液洗涤Lve单(singlet)细胞，然后应用含有以下成分的染色混合物：MuTruStain FCX(Biolegend)、抗FcyRIV(Biolegend)、活/死(Thermofisher)、CD45-AF700克隆30-F11(Biolegend)、CD3-PE克隆17A2(Biolegend)、CD4-BUV395克隆GK1.5(BD Biosciences)、CD8-APC-H7克隆53-6.7(BD Biosciences)、CD11b-PerCP-Cy5.5克隆M1/70(Biolegend)、GR-1-FITC克隆RB6-8C5(Biolegend)、FoxP3-APC克隆FJK-16(ThermoFisher)、F4/80-PE-Dazzle克隆BM8(Biolegend)、CD206-BV421克隆C068C2(Biolegend)。在Attune NxT(ThermoFisher)上进行流式细胞术，并使用FlowJo(BD Bioscience)进行分析。
在图27A中提供了阐明在MBT2肿瘤中T细胞亚群的门控策略。结果总结在图27B中，其在治疗开始后第13天收集的肿瘤中测量。如所证明的，与抗PD1结合使用的Ab6能够通过使肿瘤中的CD8+T细胞浸润和扩增而克服免疫排除。具体而言，抗PD1/Ab6组合可显著增加肿瘤内CD8+T细胞的数量(频率)，而各治疗组之间未观察到CD45+细胞占总活细胞％的变化。与抗PD1治疗相比，抗PD1/Ab6组合导致Treg的显著增加；然而，CD8+:Treg比率无显著变化。
在图28A中提供了阐明髓样细胞亚群的门控策略。结果总结在图28B中，其在治疗开始后第13天收集的肿瘤中测量。第13天的髓样细胞浸润显示，各治疗组之间的总免疫细胞(例如，CD45+)的数量保持稳定。通过抗PD1/Ab6治疗，总髓样细胞(例如，CD11b+、F4/80lo -hi)的数量显著改变。具体而言，在对照组中，髓样部分几乎占肿瘤中巨噬细胞群的75％。在联合治疗组中，这一比例降低至不到一半，这与M2型促肿瘤巨噬细胞的数量(频率)显著降低以及该组中几乎完全消除了MDSC分数相吻合，而M1型巨噬细胞保持相对不变。
在细胞的髓样亚群中，MBT-2肿瘤相关的M2巨噬细胞显示出LRRC33的高细胞表面表达(图28C)。MDSC亚群也显示出较强的LRRC33表达。从MBT-2肿瘤分离的大部分(67.8％)G-MDSC亚型表达细胞表面LRRC，而从MBT-2肿瘤分离的约三分之一的M-MDSC亚型表达细胞表面LRRC33(图28D)。
此外，在抗PD1/Ab6治疗组中观察到CD8+T细胞：M2巨噬细胞的比率显著增加(见图29C)。总之，数据表明，当与检查点阻断疗法联合使用时，TGFβ1的亚型选择性抑制剂可用于克服肿瘤免疫排除。这可能至少部分是通过促进CD8+T细胞浸润和扩增，同时减少肿瘤环境中的促肿瘤巨噬细胞(M2)和免疫抑制MDSC。这些作用可能分别由TGFβ1的GARP臂和LRRC33臂介导。
对于免疫组织化学分析，将来自六只动物的肿瘤切成两半并固定。制备用于IHC的切片，并使用各种免疫细胞标志物染色。图30提供了在第10天或第13天的代表性图像。如所示的，在抗-PD1/Ab6联合治疗组中观察到肿瘤内CD8+T细胞的频率显著增加(图30D)。数据表明，可以将Ab6与检查点阻断疗法联用，以通过诱导细胞毒性T细胞浸润和扩增克服免疫排除。图30E提供了IHC数据的定量，以总核中CD8阳性细胞的％表示。在这种肿瘤模型中，几乎没有基线CD8+细胞存在(例如，“冷”肿瘤)。在仅使用Ab6或仅使用抗PD-1治疗的组中，观察到CD8+的百分比略有增加(各为～10％)。而相比之下，在联合治疗组中，肿瘤内CD8+细胞的频率出现显著增加，表明TGFβ1抑制与检查点抑制联用能够通过克服免疫排除协同激发抗肿瘤作用。数据表明，联用能够将“免疫排除”肿瘤有效转化成“发炎/热”肿瘤。
为确证与MBT2肿瘤中观察到的免疫应答相关的基因表达改变，进行了RNA表达分析。将来自第13天MBT2肿瘤的RNA制备物进行基于qPCR的基因表达分析。将从每组5-6只动物制备的RNA用于研究。分析包括用作指示标志物的以下基因的表达水平：Ptprc(CD45)；Cd8a(CD8 T细胞)；Cd8b1(CD8 T细胞)；Cd4(CD4T细胞)；Cd3e(T细胞)；Foxp3(Treg)；Ifng(Th1免疫)；Prf1(CTL蛋白)；Gzmb(CTL蛋白)；Gzma(CTL蛋白)；Klrk1(NK/CTL)；Adgre1(F4/80巨噬细胞)；Mrc1(M2巨噬细胞)；Cd163(M2巨噬细胞)；Cd80(APC co-stim/M1巨噬细胞)；Ptger2(肿瘤血管生成)；Nrros(LRRC33)；Tgfb1(免疫耐受)；18S(管家)；和Ppib(管家)。
图31A-31D分别提供了Ptprc、CD8a、CD4和Foxp3的免疫应答基因表达的变化。抗PD1/Ab6联合治疗诱导MBT2肿瘤中这些转录物水平的显著增加。这些观察结果证实，抗PD1/Ab6治疗激发了CD8+T细胞的大量内流，这些细胞带有细胞毒性效应蛋白，如穿孔素和颗粒酶。
图32提供了在第10天或第13天免疫标志物Ifng、Gzmb、Prf1和Klrk1的基因表达变化。如所示的，对这些标志物基因进行的pPCR分析表明，抗PD-1和TGFβ1抑制剂的联合治疗诱导了在肿瘤中溶细胞蛋白(颗粒酶B和穿孔素)、Th1免疫(IFNγ)标志物和CTL/NK细胞标志物(Klrk1)的基因表达。这些数据提供了进一步的证据支持介导抗肿瘤作用的检查点抑制和TGFβ1抑制的协同作用。
总之，这些结果共同表明了由检查点阻断和TGFβ1抑制激发的抗肿瘤免疫的强大动员。具体而言，尽管各治疗组的总体肿瘤浸润免疫细胞分数保持恒定，但是抗PD-1/Ab6组合可导致a)瘤内CD8+T细胞显著增加(*P<0.05，双侧T检验，对比抗PD-1组)；b)Treg显著增加(*P<0.05)，然而，CD8+:Treg的比率是不变的(n.s，不具有显著性，对比抗PD-1)；和，c)与任何其他组相比髓样细胞显著减少，其由免疫抑制性M2巨噬细胞和髓样来源的抑制性细胞(MDSC)群的减少驱动(*P<0.05，双侧T检验，对比抗PD-1组)。全部肿瘤裂解物的定量PCR分析证实了CD8效应基因的显著增加。类似地，抗PD-1与Ab6的组合诱导了肿瘤块内CD8+T细胞频率的显著增加，克服了免疫排除。
为了证实对TGFβ1下游信号传导的作用，进行了其他免疫组化分析，以检测和定位MBT2肿瘤中的磷酸化SMAD3。如图30F中所示，发现磷酸SMAD3在抗PD-1治疗的肿瘤内富集在血管内皮附近。Ab6的治疗消除了这一信号，支持了TGFβ1抑制作用可以促进肿瘤内免疫细胞浸润，从而将免疫排除的肿瘤转化为对检查点阻断有应答的发炎的肿瘤的观点。
抗PD-1治疗的动物显示出一些与肿瘤脉管系统(CD31染色；内皮标志物)密切相关的浸润的CD8+T细胞。联合治疗进一步支持T细胞浸润。CD8+T细胞与血管内皮的接近提示T细胞可能从肿瘤内的脉管系统浸润到肿瘤中。图30G中显示了肿瘤的CD8阳性区域与距CD31阳性脉管系统的距离之间的关系。直方图表明，联合治疗(TGFβ1抑制和检查点阻断)增加了CD8+区域的比例，尤其是在远离血管的区域，这表明TGFβ1抑制促进了CD8+细胞通过脉管系统浸润进入肿瘤，有效地克服或逆转了免疫抑制作用。
实施例17：亚型选择性不依赖于背景的TGFβ1抑制剂对骨髓增生性病症的MPL模型的影响
此前已描述了骨髓纤维化的临床前MPLW515L模型(参见，例如，Wen等，NatureMedicine第21卷，第1473–1480页(2015))。简言之，受体小鼠接受致死性照射，并且随后使用供体骨髓细胞移植，所述供体骨髓细胞使用在W515L具有组成型激活突变的人血小板生成素受体MPL转导(MPLW515L)。在该模型中，在2-3周内，受体小鼠将发展为白细胞增多、红细胞增多和血小板增多。
为了评价TGFβ1选择性抑制在骨髓纤维化的小鼠模型中的作用，在MPLW515L模型中检测了高亲和性、亚型特异性、不依赖于背景的TGFβ1抑制剂(Ab6)。简言之，将五十万个MPL+ckit+细胞移植到8-10周龄的雌性BALB/c小鼠中。3周后，以10或30mg/kg/周，每周i.p.注射给予受体小鼠Ab6，或阴性对照IgG(30mg/kg/周)，持续4周(总共5剂)。末次给药后24h处死小鼠。
如通过网状蛋白染色所评估的，进行了骨髓的组织病理学以评价Ab6的抗纤维化作用。初步数据表明，来自使用Ab6治疗动物的骨髓切片显示出抗纤维化作用。图36A提供了从代表性骨髓切片的网状蛋白染色中采集的图像。在每周接受10和30mg/kg Ab6的小鼠中观察到网状蛋白纤维(主要是胶原蛋白III)的明显减少。使用所检测的另一种TGFβ1选择性抑制剂抗体也观察到了相似但程度略低的抗纤维化作用(数据未显示)。
为了根据病理学家对骨髓切片进行的纤维化评分进行定量分析，使用WHO发布的分类系统对网状蛋白染色进行评分(Thiele J,Kvasnicka HM,Tefferi A等，Primarymyelofibrosis In:Swerdlow SH,Campo E,Harris NL等(编著)WHO Classifications ofTumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues 4th edn.IARC Press:Lyon,France,2008,pp 44–47)。简言之，使用四级制系统(MF-0、MF-1、MF-2和MF-3)对组织学切片进行评分。MF-0的评分表示散乱的线性网状蛋白，没有交叉点(交叉)，对应于正常骨髓。MF-1的评分表示网状蛋白的网状结构松散，且有很多交叉点，特别是在血管周围区域。MF-2的评分表示网状蛋白的弥漫性和致密性增加，并伴有广泛的交叉点，偶尔伴有胶原的局灶性束和/或局灶性硬化。MF-3的评分表示弥散性和致密性网状蛋白，具有广泛的交叉点和粗糙的胶原蛋白束，通常与骨硬化相关。
在图36B中提供了纤维化评分，表明与接收对照IgG的动物相比，Ab6具有剂量依赖性的抗纤维化作用。左图显示了来自第一项研究(研究1)的纤维化评分，其中如图所示，在治疗开始时用Ab6或对照IgG治疗了疾病负荷最高(>50％)的动物。对该研究进行了重复(研究2)。将来自相应队列的数据合并，并显示在右图中(研究1+2)。每周给予30mg/kg Ab6显著降低纤维化。
还使用标准技术对动物进行了各种血液学参数评价，例如，骨髓移植后的全血细胞计数(CBC)(包括白细胞(WBC)、血小板(Plt)、血红蛋白(HB)和红细胞比容(HCT))(图36C和图36D)。毫不奇怪，在开始治疗4周后，接受IgG对照治疗的MPL小鼠似乎表现出骨髓纤维化的血液学异常，包括WBC和Plt水平升高。与对照IgG动物相比，用Ab6治疗的动物表现出剂量依赖性的WBC、Plt和HB浓度正常化趋势，以及相比于基线的变化。此外，与对照IgG动物相比，使用Ab6治疗的动物显示出HCT浓度的统计学上显著的正常化，以及相比于基线的变化，其中到4周时Hct水平似乎恢复至基线。
实施例18：高亲和性TGFβ1抑制剂对EMT-6同系乳腺癌模型的影响
乳腺癌是美国女性中最常见的癌症，是导致癌症死亡的第四大原因。如图20D(左图)和图35中所示，与主要表达TGFβ1的很多肿瘤不同的是，EMT6肿瘤表达显著水平的TGFβ1和TGFβ3两者(例如，TGFβ1和TGFβ3共显性)。尚不清楚在这些肿瘤中TGFβ3对免疫排除和CBT抗性的贡献。
此前，已显示，如WO2018/129329中所述，Ab3(一种亚型选择性、背景偏倚的TGFβ1抑制剂)在该模型中显示出对肿瘤生长和存活的部分影响。
在这些研究中，在EMT6模型中评价了亚型选择性TGFβ1抑制剂与亚型选择性TGFβ3抑制剂的组合与免疫检查点抑制剂联合的作用。有理由认为，由于该肿瘤与TGFβ1和TGFβ3亚型是共显性的，因此这种联合疗法可能在肿瘤消退中显示出功效，而据推测单独的亚型选择性抑制剂(TGFβ1或TGFβ3)与检查点抑制剂联用应在抑制肿瘤生长方面产生部分作用。
皮下植入EMT6肿瘤。当EMT6肿瘤达到30-80mm3时开始治疗。抗PD-1以10mkg每周给药两次。Ab6以10mkg每周给药一次。抗TGFβ3中和抗体以30mkg每周给药一次。
将缓解者定义为在研究结束时肿瘤尺寸达到小于终点体积25％的那些。
令人吃惊的是，将Ab6(一种高亲和性、亚型选择性TGFβ1的抑制剂)用于与抗PD-1抗体联用足以在EMT6中克服检查点抑制抗性。图34A显示了Ab6和/或抗PD-1对肿瘤生长的作用。当单独使用时，两种抗体均未实现显著的肿瘤消退。然而，联用时，50％经治疗的动物(5/10)实现了显著的肿瘤消退(终点肿瘤体积降至25％或更低)。如通过完全缓解者或肿瘤生长延迟所证实的，在联合治疗组中这些数据显示出协同抗肿瘤功效。出乎意料的是，添加亚型选择性TGFβ3抑制剂未产生附加作用。即使存在瘤内TGFβ3，用Ab6抑制TGFβ1亚型也足以使肿瘤对抗PD-1敏感的观察支持以下假设：TGFβ1是驱动与疾病相关的TGFβ信号传导、免疫排除和对CBT的原发性抗性的亚型。
相应地，与单独使用抗PD-1相比，在治疗的动物中联合疗法(TGFβ1+抗PD-1)达到显著的生存获益(***，P<0.001对数秩检验)(见图34B)。治疗开始后56天，在联合治疗组中60％的动物存活，而在其他治疗组中，所有动物到第28天时均已死亡或需要安乐死。
另一项研究(研究2)还显示，在用Ab6和抗PD-1的组合治疗的患有TGFβ1/3阳性EMT6肿瘤的动物中存活得到显著改善，但在单独使用任一抗体的动物中，存活未得到显著改善(图34C)。在该模型中，我们停止治疗，并对EMT-6无肿瘤存活者随访6周而不进行给药(灰框)。给药停止后六周，完全缓解者保持无肿瘤，再次证明了应答的持久性(图34C，右图)。报告的数量是研究结束时没有可测量的肿瘤的动物数。与单独使用抗PD-1治疗的动物相比，联合治疗(Ab6+抗PD-1)观察到显著的生存获益(图34D)。
实施例19：重组蛋白表达
在使用含有感兴趣cDNA的pTT5质粒(NRC Canada)瞬时转染的Expi293FTM细胞(Thermo Fisher)中表达重组蛋白。通过使用编码proTGFβ1、proTGFβ2或proTGFβ3的质粒和编码LLC呈递蛋白的质粒共转染Expi293FTM细胞产生大型潜在TGFβ复合物。与全长LTBP相比(针对人LTBP1的E873至I1507；针对人LTBP3的D866至E1039)，将含有TGFβ结合TB3结构域和侧翼EGF样结构域的LTBP片段用于改善收率和蛋白质量。LTBP片段具有C末端His标签以便于纯化。制备表达C末端His标签的GARP或LRRC33胞外域的稳定Expi293细胞系。使用编码proTGFβ1的质粒瞬时转染这些稳定细胞，以产生具有潜在TGFβ1的GARP或LRRC33复合物。小型潜在TGFβ复合物表达有N末端His标签，而大型潜在复合物形成半胱氨酸突变为丝氨酸(TGFβ1中为C4S，TGFβ2中为C5S和TGFβ3前结构域中为C7S)。活性TGFβ生长因子购自R&DSystems。将转染子在Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher)中培养5天，然后收集条件化的上清液。通过Ni2+亲和层析法，随后通过体积排阻色谱法(SEC)纯化重组蛋白。通过SDSPAGE和分析SEC确证了蛋白质量和二硫键连接的复合物的形成。通过将Expi293FTM细胞与编码感兴趣重链和轻链的pTT5质粒共转染来表达抗体。通过蛋白A捕获，随后通过SEC纯化人IgG4和小鼠IgG1抗体。通过质谱法确证了用于动物模型的抗体的一致性。
实施例20：同系小鼠模型
根据IACUC，在Morrisville,NC的Charles River Discovery Lab制备小鼠模型。对于MBT-2模型，将8-12周龄的C3H/HeN(Charles River)雌性小鼠用异氟烷麻醉，以将5x105个MBT-2肿瘤细胞皮下植入腹侧。将平均肿瘤体积40-80mm3的动物分组，以使得所有组具有相等的初始体积平均值和范围。对于CloudmanS91，将8-12周龄的DBA/2(CharlesRiver)雌性小鼠用异氟烷麻醉，以将在50％matrigel中的5x105个CloudmanS91肿瘤细胞皮下植入腹侧。当平均肿瘤体积达到125-175mm3时，将动物分组，以使得所有组具有相等的初始体积平均值和范围。对于EMT-6模型，使用5x106个EMT-6肿瘤细胞皮下植入8-12周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)的腹侧。将平均初始体积在30-60mm3之间的动物分组，以使得所有组具有相等的初始体积平均值和范围。以10mg/kg每周两次给予对照HuNeg-rIgG1或抗PD-1(RMP1-14；BioXCell)。以所示剂量每周一次给予Ab6-mIgG1或对照抗体HuNeg-mIgG1。所有抗体均腹腔内给予。每周两次测量肿瘤体积，并且当肿瘤达到1,200mm3(MBT-2，EMT6)或2,000mm3(CloudmanS91)或溃疡后，通过CO2窒息处死动物。肿瘤体积根据mm3＝(w2 x l)/2计算。将缓解者或缓解率定义为肿瘤体积处于或低于该模型终点体积的25％。将完全缓解分类为对于三次或更多次连续测量肿瘤小于13.5mm3。无肿瘤存活者在研究结束时不具有可触及的肿瘤。根据IACUC，将由于坏死而处死的动物从分析中完全移除。
在选择可重现人类临床数据的临床前药理模型时，考虑了三种TGFβ亚型和呈递分子的相对表达。在MBT-2、S91和EMT6中，三种亚型的相对蛋白表达的ELISA分析提供在图20G中。在MBT-2和S91肿瘤两者中，TGFβ1是主要亚型，反映了大多数人类癌症。EMT-6仍显示出主要的TGFβ1表达，尽管程度较低，但也共表达TGFβ3，这与在某些人类癌症中观察到的更相近。
由RNA在MBT-2、S91和EMT-6肿瘤中表达所有四个呈递分子(LTBP1、LTBP3、GARP和LRRC33)(图20H)。
实施例21：LRRC33-proTGFβ1的抗体诱导的内化
我们观察到在表达LRRC33 RNA的细胞类型中，只有一个亚群似乎在细胞表面上表达LRRC33蛋白。我们假设LRRC33可能受到质膜蛋白运输的调控。为评估这种可能性，我们设计了内化测定。
产生了Expi293细胞系，其表达细胞表面LRRC33-proTGFβ1。使用Incucyte系统，测量了Ab6结合至细胞表面LRRC33-proTGFβ1后，LRRC33的内化作用。简言之，Incycyte系统使用pH敏感性检测标记，当靶点内化进入具有酸性pH的细胞内区室(例如，溶酶体)时，能够检测到该检测标记。在表达LRRC3和proTGFβ1的细胞中(图6)，而不是Expi293亲代细胞系中(数据未显示)，Ab6结合后可观察到LRRC33-proTGFβ1的迅速内化。此处观察到的内化与原代人巨噬细胞的内化相似。
LRRC33-proTGFβ1内化不是FcR介导的，因为Expi293细胞不具有Fc受体(数据未显示)。这些结果表明Ab6接合能够促进靶标下调。通过降低疾病部位(如TME和FME)的可用proTGFβ1的水平，这可以提供体内TGFβ1抑制的其他或替代机制。
在上文各个部分提到的本发明的各种特征和实施方式视情况而定加以必要的变更适用于其它部分。因此，一个部分中指定的特征视情况而定可以与其他部分中指定的特征组合。
本领域技术人员将认识到或能够通过不超过常规的实验确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。
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Claims (14)

1.一种抗体或其抗原结合片段，如通过基于溶液平衡滴定的测定所测量的，所述抗体或其抗原结合片段以≤10nM的KD结合下述抗原复合物中的每一者：
i)人LTBP1-proTGFβ1；
ii)人LTBP3-proTGFβ1；
iii)人GARP-proTGFβ1；和
iv)人LRRC33-proTGFβ1；
其中所述抗体或其所述片段是全人或人源化抗体或其片段，其中任选地，所述抗体或所述片段以≤1nM的KD结合。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其结合所述复合物的潜伏套索(Latency Lasso)，其中任选地，所述抗体或其抗原结合片段还结合生长因子结构域的一部分。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其是人IgG4或IgG1亚型。
4.一种组合物，其包含前述权利要求中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和赋形剂。
5.根据权利要求1-3所述的抗体或其抗原结合片段，或者根据权利要求4所述的组合物，其用于治疗受试者的TGFβ1适应症。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，或组合物，其中所述TGFβ1适应症是癌症。
7.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，或组合物，其中所述TGFβ1适应症是骨髓纤维化。
8.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，或组合物，其中所述受试者对癌症疗法的应答较差，其中任选地所述癌症疗法是检查点抑制疗法、化学疗法和/或放射疗法。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，或组合物，其中所述治疗包括施用权利要求4所述的组合物，联合选自以下的其他癌症疗法：检查点抑制剂、化学疗法和放射疗法和/或癌症疫苗。
10.一种用于筛选适于治疗性用途的亚型选择性TGFβ1抑制剂的方法，所述方法包括：
i)提供以≤1nM的KD特异性结合以下中的每一者的抗体：人LTBP1-proTGFβ1、人LTBP3-proTGFβ1、人GARP-proTGFβ1和人LRRC33-proTGFβ1复合物，
ii)进行体内功效研究，以确定在包含TGFβ1偏向表达的临床前模型中有效地取得功效的所述抗体的量；
iii)在已知对TGFβ抑制敏感的临床前模型中进行毒理学研究，以确定所述抗体的最大耐受量和/或最小毒性量；和
iv)基于步骤(ii)和(iii)，如果获得足够的治疗窗，则选择所述抗体作为治疗候选物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(ii)中有效地取得功效的所述量在约1至30mg/kg之间。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(iii)中所述最大耐受量或最小毒性量是至少100mg/kg。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述治疗窗是至少6倍。
14.一种制备药物组合物的方法，其包括：
i)提供通过根据权利要求10-13中任一项所述的方法选择的抗体；
ii)将所述抗体配制成包含亚型选择性TGFβ1抑制剂的药物组合物。
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