BR112021000353A2 - inibidores de tgfb1 de alta afinidade, isoforma-seletivos, e seus usos - Google Patents

Abstract

INIBIDORES DE TGF?1 DE ALTA AFINIDADE, ISOFORMA-SELETIVOS, E SEUS USOS. São revelados nesse relatório descritivo anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação ao antígeno destes capazes de inibir seletivamente TGFß1 com alta potência. Também são reveladas composições, métodos e uso terapêutico relacionados.

Description

INIBIDORES DE TGFΒ1 DE ALTA AFINIDADE, ISOFORMA-SELETIVOS, E

SEUS USOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse Pedido reivindica o benefício de prioridade para os Pedidos U.S. Provisórios 62/696.752, depositado em 11 de julho de 2018; 62/718.196, depositado em 13 de agosto de 2018; 62/737.534, depositado em 27 de setembro de 2018; 62/758.180, depositado em 9 de novembro de 2018; 62/810.263, depositado em 25 de fevereiro de 2019, e 62/827.552, depositado em 1º de abril de 2019, cada um intitulado “High- Affinity, Context-Independent TGFβ1 Inhibitors and Use Thereof”, cujo conteúdo de cada um deles é expressamente incorporado nesse relatório descritivo por referência na totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 11 de julho de 2019, é denominada 127036-03520_SL.txt e tem 261.252 bytes de tamanho.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O fator de transformação de crescimento beta 1 (TGFβ1) é um membro da superfamília TGFβ de fatores de crescimento, juntamente com duas outras isoformas estruturalmente relacionadas, especificamente, TGFβ2 e TGFβ3, cada uma das quais codificada por um gene separado. Essas isoformas de TGFβ funcionam como citocinas pleiotrópicas que regulam proliferação celular, diferenciação, imunomodulação (por exemplo, resposta imune adaptiva), e outros processos biológicos diversos tanto em homeostasia quanto em contextos de doença. As três isoformas de TGFβ sinalizam por meio dos mesmos receptores da superfície celular e desencadeiam eventos de transdução de sinal canônicos a jusante similares que incluem a via de SMAD2/3. No entanto, estudos de knockout gênico em camundongos mostram fenótipos diversos, sugerindo que cada isoforma desempenha um papel distinto in vivo. Isso pode ser obtido, em parte, por padrões de expressão diferencial das três isoformas.

[004] Dentro do sistema imune, células T são reconhecidas como um alvo direto importante para TGFβ. A sinalização de TGFβ é importante na proliferação de célula efetoras, bem como na regulação da diferenciação de células T efetoras e reguladoras. Por exemplo, TGFβ é um supressor potente de células T efetoras Th1 e Th2. Também foi demonstrado que as funções efetoras de células T citotóxicas são suprimidas por TGFβ por vários mecanismos. Além disso, evidências mostram que outros tipos de células do sistema imune, por exemplo, células dendríticas, por exemplo, células de Langerhans e células natural killer (NK), também são reguladas pela via de sinalização de TGFβ. A desregulação de TGFβ foi associada com diversas condições de doença, por exemplo, câncer, fibrose e distúrbios imunes.

[005] Muitos processos biológicos nos quais a matriz extracelular participa estão associados com sinalização de TGFβ. Para citar apenas alguns, TGFβ foi implicado na cicatrização de feridas, invasão e metástase de tumores, bem como na progressão de fibrose.

[006] Por essas e outras razões, TGFβ tem sido um alvo terapêutico atraente para o tratamento de distúrbios imunes,

vários distúrbios proliferativos e condições fibróticas. No entanto, observações de estudos pré-clínicos, incluindo em ratos e cães, revelaram toxicidades sérias associadas à inibição sistêmica de TGFβs in vivo. Além disso, embora vários inibidores de TGFβ tenham sido desenvolvidos até hoje, a maioria dos programas clínicos que visam TGFβ foi suspensa em decorrência do risco de efeitos colaterais sérios (resumidos, por exemplo, em WO 2017/156500). Dessa forma, apesar de linhas de evidências diretas e indiretas que apontam para o envolvimento da sinalização de TGFβ na progressão de doenças como, por exemplo, câncer e fibrose, não há terapêuticas de TGFβ disponíveis no mercado até hoje que sejam consideradas seguras e eficazes.

[007] Previamente, o Requerente descreveu uma classe de anticorpos monoclonais que funciona com um novo mecanismo de ação para modular a sinalização do fator de crescimento (veja, por exemplo, WO 2014/182676). Esses anticorpos foram projetados para explorar o fato de que TGFβ1 é expresso como complexo de pró-proteína latente formado por pró-domínio e fator de crescimento, que exige uma etapa de ativação que libera o fator de crescimento do complexo latente. Ao invés de utilizar a abordagem tradicional de alvejar diretamente o próprio fator de crescimento maduro pós-ativação (por exemplo, anticorpos neutralizantes), a nova classe de anticorpos inibidores alveja especificamente o próprio complexo pró-pró-proteína inativo de modo a bloquear preventivamente a etapa de ativação, a montante da interação ligante-receptor. Foi fundamentado que esse mecanismo de ação único deve fornecer vantagens para a obtenção de benefícios tanto espaciais quanto temporais, na medida em que atuam como a fonte, ou seja, por direcionamento ao complexo pró-TGFβ1 latente dentro de um microambiente de doença antes que a ativação ocorra.

[008] Com o uso dessa abordagem, anticorpos monoclonais que se ligam especificamente e inibem a etapa de ativação de TGFβ1 (ou seja, liberação de fator de crescimento maduro pelo complexo latente) de uma forma isoforma-seletiva foram gerados (veja, WO 2017/156500). Dados apresentados naquele documento dão suporte à noção de que a inibição isoforma- específica (ao contrário da pan-inibição) de TGFβ pode gerar perfis de segurança aprimorados do antagonismo de TGFβ in vivo. Levando isso em consideração, o Requerente então buscou desenvolver inibidores de TGFβ1 que sejam tanto i) isoforma- específicos; quanto ii) capazes de alvejar amplamente múltiplos complexos de sinalização de TGFβ1 que estão associados com moléculas apresentadoras diferentes, como agentes terapêuticos para condições dirigidas por efeitos multifacetados de TGFβ1 e desregulação deste.

[009] Esses anticorpos foram subsequentemente descritos em PCT/US2018/012601 (depositado em 5 de janeiro de 2018). Na verdade, os agentes inibidores isoforma-específicos descritos naquele documento foram capazes de alvejar tanto TGFβ1 associado à ECM quanto TGFβ1 associado às células imunes bloqueando, dessa forma, múltiplas fontes de TGFβ1 em múltiplos contextos biológicos mantendo, ao mesmo tempo, a especificidade de isoforma. Dados de diversos modelos in vivo que mostram eficácia e segurança de inibidores isoforma- seletivos da ativação de TGFβ1 foram revelados, demonstrando que tais inibidores são úteis para o tratamento de doenças que envolvem a desregulação tanto de TGFβ1 associado à ECM quanto de TGFβ1 associado às células imunes in vivo.

[0010] Embora o trabalho anterior citado acima demonstrasse a utilidade de anticorpos capazes de alvejar cada um dos complexos pró-TGFβ1 e atividades inibidoras conhecidas, inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos aprimorados com potência in vivo são desejáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A presente revelação fornece uma nova classe de anticorpos isoforma-seletivos, de alta afinidade, capazes de inibir a ativação de TGFβ1 com alta potência. Esses incluem anticorpos (incluindo imunoglobulinas e fragmentos de ligação ao antígeno ou porções destes, e moléculas modificadas geneticamente que incorporam esses fragmentos) que são capazes de alvejar múltiplos complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 (denominados “complexos latentes grandes” ou “LLCs”) com afinidades elevadas. Esses anticorpos retêm seletividade e perfis de segurança extraordinários, e demonstraram que obtêm eficácia in vivo aumentada em vários modelos pré-clínicos com traduzibilidade para condições humanas. Esses atributos dos inibidores de TGFβ1 abrem oportunidades para o desenvolvimento de terapêuticas de TGFβ1 seguras e eficazes para o tratamento de doenças que envolvem desregulação de TGFβ1.

[0012] Os critérios de seleção seguintes foram levados em consideração na geração dos anticorpos contra pró-TGFβ1 da presente revelação: 1) seletividade de isoforma; 2) afinidades elevadas para LLCs humanos, por exemplo, LTBP1- pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró- TGFβ1; 3) potência inibidora robusta; 4) perfis de segurança/toxicologia in vivo favoráveis; e, 5) eficácia in vivo em um modelo pré-clínico que recapitula doença humana. Adicionalmente, na avaliação da eficácia de inibidores de TGFβ1 usados como terapia combinada (por exemplo, terapia complementar), a habilidade para obter efeitos sinérgicos (ao contrário de meros efeitos aditivos) deve ser ponderada. Com base nesses critérios, os inventores da presente revelação identificaram uma classe de anticorpos monoclonais de alta afinidade e fragmentos destes, capazes de alvejar especificamente complexos pró-TGFβ1 e bloquear potentemente a ativação de TGFβ1. Em algumas modalidades, os novos anticorpos revelados nesse relatório descritivo exibem afinidades elevadas através de todos os LLCs-alvo (por exemplo, KD de faixa nanomolar a subnanomolar). Em modalidades preferidas, esse anticorpo é imparcial através de complexos pró-TGFβ1 diferentes, de modo que o anticorpo possui afinidades equivalentes para todos os complexos-alvo. Composições relacionadas, uso terapêutico, preparações, formulações, processos e métodos são englobados pela invenção.

[0013] Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção inclui um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno deste que é capaz de ligação a cada um dos seguintes complexos LLC humanos com uma KD de ≤ 10 nM, como medida por titulação de solução em equilíbrio: LTBP1- pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró- TGFβ1. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a cada um dos complexos LTBP1-pró-TGFβ1 humanos e LTBP3-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 1 nM. De preferência, o anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para cada um dos quatro LLCs humanos.

[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga ao Laço de Latência, ou uma porção deste, de pró- TGFβ1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento ainda se liga a uma porção (ou porções) do domínio do fator de crescimento, por exemplo, Finger-1 e Finger-2. Por exemplo, o anticorpo ou o fragmento pode se ligar a um epitopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos do Laço de Latência. Opcionalmente, o epitopo pode ainda compreender um ou mais resíduos de aminoácidos do domínio do fator de crescimento. Esse epitopo, portanto, pode ser um epitopo combinatório. Em modalidades preferidas, o anticorpo não se liga ao fator de crescimento TGFβ1 livre que não está em associação com um complexo pró-TGFβ1.

[0015] Os inibidores de TGFβ1 da invenção são anticorpos funcionais, na medida em que possuem atividades inibidoras contra TGFβ1. A potência desses anticorpos é isoforma- específica, como medido por ensaios de potência in vitro adequados, por exemplo, ensaios-repórteres à base de células descritos nesse relatório descritivo. Dessa forma, o anticorpo não se liga ou inibe TGFβ2 ou contrapartes de TGFβ3.

[0016] Os inibidores de TGFβ1 da invenção são capazes de bloquear a liberação de fator de crescimento maduro por complexos LLC latentes. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 podem inibir a ativação de TGFβ1 integrina-dependente e/ou a ativação de TGFβ1 protease- dependente. Em algumas modalidades, a protease é Calicreína, Plasmina ou uma MMP protease. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 bloqueiam a ativação de TGFβ1 integrina- dependente sem bloquear a ligação de integrina aos LLCs.

[0017] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção podem funcionar por meio de modos de ação inibidores duplos contra LLCs associados às células (por exemplo, GARP- pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1). Em um mecanismo, esses inibidores bloqueiam a etapa de ativação de TGFβ1 associada à GARP ancorada à membrana e/ou LRRC33. Em um segundo mecanismo, esses inibidores podem, mediante engajamento com o alvo, induzir internalização anticorpo-dependente (e, dessa forma, remoção) dos LLCs da superfície celular reduzindo, dessa forma, a sinalização de TGFβ1 no nicho. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo sensível ao pH, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de liga a um complexo pró-TGFβ1 com afinidade maior em um pH neutro do que em um pH ácido.

[0018] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para reduzir a expressão de genes associados a doenças, por exemplo, TGFB1, Acta2, Col1a1, Col3a1, Fn1, Itga11, Lox, Loxl2, CCL2 e Mmp2.

[0019] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para reduzir a fosforilação do SMAD2/3 efetor a jusante in vivo.

[0020] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para tratar indicações relacionadas ao TGFβ1. Essas indicações incluem doenças que envolvem expressão gênica anormal, doenças que envolvem desregulação da ECM, doenças caracterizadas por células imunossupressoras aumentadas (por exemplo, Tregs, MDSCs e/ou macrófagos M2), doenças que envolvem transição mesenquimal, doenças que envolvem proteases, doenças relacionadas à proliferação e/ou diferenciação anormais de células-tronco etc., embora essas categorias de doenças não visem ser mutualmente exclusivas.

Em algumas modalidades, a indicação relacionada ao TGFβ1 é um distúrbio proliferativo, por exemplo, um distúrbio mieloproliferativo e câncer com um tumor sólido. Em algumas modalidades, a indicação relacionada ao TGFβ1 é um distúrbio fibrótico, por exemplo, fibrose de órgão. O câncer pode ser um câncer avançado, que inclui um tumor/câncer localmente avançado e câncer metastático.

[0021] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção podem reduzir o número de populações de células imunossupressoras em um local de doença, por exemplo, microambiente tumoral e microambiente fibrótico. Em algumas modalidades, as populações de células imunossupressoras podem incluir macrófagos-M2 polarizados e/ou MDSCs.

[0022] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para obter controle tumoral (por exemplo, Resposta Parcial e Resposta Completa), em que o tumor é opcionalmente um fenótipo imunossupressor (por exemplo, imuno-excluído). Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 podem obter efeitos antitumorais sinérgicos quando usados em conjunto com uma terapia de câncer, por exemplo, terapia de bloqueio do ponto de verificação, quimioterapia e radioterapia. A terapia de bloqueio do ponto de verificação pode compreender, por exemplo, anticorpo (ou anticorpos) anti-PD-(L)1. Nessas terapias combinadas, os inibidores de TGFβ1 podem superar resistência ao tratamento (por exemplo, resistência primária) tornando, dessa forma, o câncer mais suscetível à terapia do câncer. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 podem ser usados para o tratamento de câncer, que compreende um tumor imunossupressor em um indivíduo. O indivíduo pode ser i) um não-responsivo primário a uma terapia de câncer, por exemplo, um inibidor do ponto de verificação; ou, ii) diagnosticado com um câncer para o qual pelo menos um inibidor do ponto de verificação é aprovado por uma autoridade reguladora como terapia. As taxas de resposta (responsivos parciais e completos combinados entre aqueles que receberam uma terapia) para o câncer para o qual pelo menos um inibidor do ponto de verificação é aprovado são menores do que 100%. Tipicamente, as taxas de resposta estão entre cerca de 10-60%. Os inibidores de TGFβ1 podem aumentar as taxas de resposta entre uma população de pacientes. Além disso, dentro de um grupo de resposta parcial entre os responsivos primários, os inibidores de TGFβ1 podem fornecer benefícios clínicos aumentados. Em algumas modalidades, entre um grupo de responsivos primários, os inibidores de TGFβ1 podem reduzir a taxa de resistência adquirida à terapia de câncer. O tumor imunossupressor pode ser um câncer/tumor localmente avançado ou um câncer metastático. Em algumas modalidades, a terapia de câncer pode incluir, por exemplo, terapia com inibidor do ponto de verificação, quimioterapia e/ou radioterapia.

[0023] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para obter benefício de sobrevida em indivíduos com um tumor sólido, em que o tumor sólido é opcionalmente um câncer localmente avançado ou metastático.

[0024] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para obter efeitos antitumorais duráveis por indução de função de memória de células T. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 podem reduzir ou retardar a recorrência da doença.

[0025] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para obter efeitos antitumorais em tumores que expressam predominantemente TGFB1 e/ou TGFB3. Em algumas modalidades, o tumor que co-expressa TGFβ1 e TGFβ3 é um carcinoma.

[0026] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são capazes de superar a resistência primária do tumor a uma terapia de câncer. Em algumas modalidades, esse tumor está infiltrado com tipos de células imunossupressoras, por exemplo, células T reguladoras, macrófagos do tipo M2, e/ou células supressoras derivadas do sistema mielóide (MDSCs). Mediante tratamento, há uma redução no número de células imunossupressoras associadas ao tumor, e um aumento correspondente no número de células T efetoras antitumorais.

[0027] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção promovem infiltração de células efetoras em tumores. Em algumas modalidades, as células efetoras podem entrar no tumor por meio da vasculatura do tumor. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção promovem expansão de células efetoras (por exemplo, proliferação). Isso pode ser, pelo menos em parte, mediado por inibição de células T reguladoras GARP-positivas.

[0028] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para tratar mielofibrose. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 obtêm efeitos antifibróticos da medula óssea de indivíduos com mielofibrose. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 são eficazes para normalizar certos parâmetros hematológicos.

[0029] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são eficazes para obter efeitos antifibróticos in vivo. Os efeitos antifibróticos podem incluir a reversão de fibrose estabelecida, que pode ser reversão parcial ou reversão completa.

[0030] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção são bem tolerados em estudos pré-clínicos de segurança/toxicologia em doses de até 100, 200 ou 300 mg/kg, quando dosados semanalmente por pelo menos 4 semanas. Esses estudos podem ser realizados em modelos animais que são sabidamente sensíveis à inibição de TGFβ, por exemplo, ratos e primatas não humanos. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção não causam toxicidades observáveis associadas com pan-inibição de TGFβ, por exemplo, toxicidades cardiovasculares (por exemplo, valvulopatia) e hiperplasia epitelial e outras toxicidades conhecidas na técnica.

[0031] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da invenção obtêm janela terapêutica suficiente, na medida em que quantidades eficazes dos inibidores mostradas por estudos de eficácia in vivo estão bem abaixo (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 6 vezes ou pelo menos 10 vezes) das quantidades ou concentrações que causam toxicidades observáveis. Em algumas modalidades, as quantidades terapeuticamente eficazes dos inibidores estão entre cerca de 1 mg/kg e cerca de 30 mg/kg por semana.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] A FIG. 1 é um gráfico que mostra a inibição da ativação de LTBP1-pró-TGFβ em um ensaio de LN229.

[0033] A FIG. 2 é um gráfico que mostra a inibição da ativação de complexo pró-TGFβ1 em um ensaio de LN229.

[0034] A FIG. 3 é um gráfico que mostra a inibição da ativação de GARP-pró-TGFβ1 em um ensaio de SW480β6.

[0035] A FIG. 4 é um gráfico que mostra a inibição da ativação de LRRC33-pró-TGFβ1 em um ensaio de SW480β6.

[0036] A FIG. 5A mostra os efeitos inibidores de Ab3 e Ab6 sobre a ativação de TGFβ1 induzida por Calicreína in vitro.

[0037] A FIG. 5B mostra os efeitos inibidores de Ab3 e Ab6 sobre a ativação de TGFβ1 induzida por plasmina in vitro.

[0038] A FIG. 6 fornece um gráfico que mostra a internalização rápida de LRRC33-pró-TGFB1 mediante ligação de Ab6 em células heterólogas transfectadas com LRRC33 e pró-TGFβ1.

[0039] A FIG. 7 fornece dois gráficos que mostram o efeito de Ab6 ou Ab3 sobre a expressão de genes de colágeno (Col1a1 e Col3a1) em camundongos UUO. Os camundongos foram tratados com 3, 10 ou 30 mg/kg/semana de Ab3 ou 3 ou 10 mg/kg/semana de Ab6. IgG isoladamente foi usada como controle.

[0040] A FIG. 8 fornece dois gráficos que mostram o efeito de Ab3 ou Ab6 sobre a expressão de genes Fn1 e Loxl2 em camundongos UUO. Os camundongos foram tratados com 3, 10 ou 30 mg/kg/semana de Ab3 ou 3 ou 10 mg/kg/semana de Ab6. IgG isoladamente foi usada como controle.

[0041] A FIG. 9 resume a significância estatística das alterações na expressão gênica (vs. UUO + IgG) após tratamento no modelo de UUO.

[0042] A FIG. 10 é um gráfico que mostra a sobrevida percentual ao longo do tempo (dias) no modelo de melanoma

Cloudman S91, após administração de Ab3 a 30 mg/kg ou 10 mg/kg, em combinação com anti-PD-1. Anti-PD-1 isoladamente, anti-SR-AB3, e foi usado como um controle.

[0043] A FIG. 11A fornece cinco gráficos que mostram a alteração no crescimento tumoral (volume tumoral em mm3) expressa como progressão tumoral mediana no modelo de melanoma Cloudman S91, medida ao longo do tempo (dias) após administração de Ab3 ou Ab6 a 30 mg/kg ou 10 mg/kg, cada um em combinação com anti-PD-1. Anti-PD-1 isoladamente foi usado como um controle. Linhas tracejadas representam animais que tiveram que ser sacrificados antes de atingirem os critérios de desfecho de 2.000 mm3 em decorrência de ulceração do tumor.

[0044] A FIG. 11B fornece dois gráficos que mostram os volumes medianos do tumor Cloudman S91 em função do tempo após administração de Ab3 (esquerda) ou Ab6 (direita) a 30 mg/kg ou 10 mg/kg, em combinação com anti-PD-1. Anti-PD-1 isoladamente, Ab3 isoladamente, Ab6 isoladamente e IgG isoladamente foram usados como controles.

[0045] A FIG. 11C fornece seis gráficos que mostram alterações no volume do tumor S91 em função do tempo em camundongos tratados com (1) IgG de controle; (2) somente Ab6; (3) somente anti-PD1; (4) anti-PD1/Ab6 (3 mg/kg); (5) anti-PD1/Ab6 (10 mg/kg); e (6) anti-PD1/Ab6 (30 mg/kg). O volume tumoral do desfecho de 2.000 mm3 é indicado na linha pontilhada superior; e o volume limiar de 25% de 500 mm3 é mostrado na linha pontilhada inferior. Responsivos foram definidos como aqueles que obtiveram tamanho tumoral de menos do que 25% do volume de desfecho.

[0046] A FIG. 11D fornece três gráficos que mostram alterações no volume do tumor S91 em função do tempo em camundongos tratados com combinação de anti-PD-1 e Ab6 em 3 níveis de dosagem (3, 10 e 30 mg/kg). Efeitos antitumorais duráveis são mostrados pós-tratamento.

[0047] A FIG. 11E fornece um gráfico que resume os dados, expressos como volume tumoral mediano, da FIG. 11C.

[0048] A FIG. 11F fornece um gráfico que mostra a sobrevida de animais em cada grupo de tratamento ao longo do tempo da FIG. 11C.

[0049] A FIG. 12 é um gráfico que mostra proporções de SMAD2/3 fosforilado-para-total (pSMAD/SMAD) no modelo de câncer da bexiga MBT2. Os animais foram tratados da seguinte forma: (1) Somente anticorpo anti-PD-1; (2) Ab5 (3 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1; (3) Ab5 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1; (4) Ab3 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1; (5) Ab3 (30 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1.

[0050] As FIGS. 13A e 13B fornecem dois conjuntos de cinco gráficos que mostram a alteração no crescimento de tumor MBT2 (volume tumoral em mm3) medida ao longo do tempo (dias) após administração de Ab3 a 30 mg/kg ou 10 mg/kg, ou Ab6 a 3 mg/kg ou 10 mg/kg, em combinação com anti-PD-1. Anti- PD-1 isoladamente foi usado como um controle. Alterações no volume tumoral em função do tempo são representadas em uma escala log (FIG. 13A) e em uma linear escala (FIG. 13B). Linhas tracejadas representam animais que tiveram que ser sacrificados antes de atingirem os critérios de desfecho de

1.200 mm3 em decorrência de ulceração do tumor.

[0051] A FIG. 13C fornece gráficos que mostram os volumes tumorais medianos em função do tempo após administração de

Ab3 (superior esquerda) a 30 mg/kg ou 10 mg/kg ou Ab6 (superior direita) a 10 mg/kg ou 3 mg/kg, em combinação com anti-PD-1 em um modelo de câncer da bexiga singênico MBT2. Anti-PD-1 isoladamente, Ab3 isoladamente, Ab6 isoladamente e IgG isoladamente foram usados como controles. O volume tumoral mediano no dia 15 está resumido no gráfico inferior.

[0052] A FIG. 13D fornece cinco gráficos que mostram efeitos de Ab6 em combinação com anti-PD-1 no modelo de câncer da bexiga singênico MBT2. Responsivos são definidos como aqueles que obtiveram tamanho tumoral de menos do que 25% do volume de desfecho ao final do estudo.

[0053] A FIG. 14 é um gráfico que mostra sobrevida percentual ao longo do tempo (dias) após administração de Ab3 a 10 mg/kg ou Ab6 a 3 mg/kg ou 10 mg/kg, em combinação com anti-PD-1, em um modelo de câncer da bexiga singênico MBT2. Anti-PD-1 isoladamente foi usado como um controle.

[0054] A FIG. 15 fornece um conjunto de gráficos que mostra a alteração no crescimento tumoral (volume tumoral em mm3) medida ao longo do tempo (dias) em um estudo de re- desafio tumoral. Animais tratados previamente com anti-PD- 1/Ab3 ou anti-PD-1/Ab6 que tiveram os tumores depurados (responsivos completos que obtiveram regressão completa) foram re-desafiados com células de tumor MBT2. Animais naïve, não tratados, foram usados como um controle. Linhas tracejadas representam animais que tiveram que ser sacrificados antes de atingirem os critérios de desfecho de

1.200 mm3 em decorrência de ulceração do tumor.

[0055] A FIG. 16 é um mapa de calor que mostra resultados de ligação de Fab de Ab5 em proteção de HDX em regiões (Região 1 e Região 2) de pró-TGFβ1.

[0056] A FIG. 17 ilustra as regiões do complexo pró-TGFβ1 que estão protegidas de troca de solvente como medido por HDX (veja a FIG. 16) mediante ligação a Ab5.

[0057] A FIG. 18A é um mapa de calor que mostra efeitos de proteção de ligação de Fab de Ab6 a pró-TGFβ1 (C4S). Regiões afetadas pela interação anticorpo-antígeno estão indicadas por caixas vermelhas (1, 2a, 2b, 2c, 3, 4, 5a, 5b, 6a e 6b).

[0058] A FIG. 18B fornece dados de HDX sobrepostos à estrutura cristal de TGFβ1. São mostradas as regiões identificadas na FIG. 18A.

[0059] A FIG. 19A ilustra identificação de três regiões de ligação (Região 1, Região 2 e Região 3) após análises estatísticas. A Região 1 se sobrepõe com o denominado “Laço de Latência” dentro do pró-domínio de pró-TGFβ1, enquanto as Regiões 2 e 3 estão dentro do domínio do fator de crescimento.

[0060] A FIG. 19B retrata vários domínios e motivos de pró-TGFβ1, em relação às três regiões de ligação envolvidas na ligação de Ab6. Também é fornecido o alinhamento de sequências entre as três isoformas.

[0061] As FIGS. 20A-20D mostram a expressão relativa de RNA de isoformas de TGFβ em vários tecidos e células. A FIG. 20A mostra expressão da isoforma de TGFβ em vários tecidos de câncer humano vs. comparador normal (por tipo de câncer). FIG. 20B mostra a frequência de expressão da isoforma de TGFβ por tipo de câncer humano com base em análises de mais de 10.000 amostras de 33 tipos de tumor. A FIG. 20C mostra a expressão da isoforma de TGFβ em amostras de tumor individuais, por tipo de câncer. A FIG. 20D mostra a expressão da isoforma de TGFβ em linhagens de modelo singênico de célula de câncer em camundongo.

[0062] A FIG. 20E fornece 4 painéis de expressão gênica que mostram que todas as moléculas apresentadoras (LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33) estão altamente expressas na maioria dos tipos de câncer humano.

[0063] A FIG. 20F fornece análises de expressão de TGFβ e genes da via de sinalização relacionados dos modelos singênicos de tumor em camundongo, Cloudman S91, MBT-2 e EMT-6.

[0064] A FIG. 20G fornece três gráficos que comparam expressões de proteína por ELISA de 3 isoformas de TGFβ nos modelos de tumor Cloudman S91, MBT-2 e EMT-6.

[0065] A FIG. 20H fornece um gráfico que compara a expressão de nível de RNA por qPCR de lisado do tumor inteiro de moléculas apresentadoras nos modelos de tumor Cloudman S91, MBT-2 e EMT-6.

[0066] A FIG. 21A retrata achados microscópicos cardíacos de um anticorpo pan-TGFβ de um estudo de toxicologia de 1 semana. A FIG. 21B retrata achados microscópicos cardíacos de Ab3 comparado com um inibidor de ALK5 ou anticorpo pan- TGFβ de um estudo de toxicologia em ratos de 4 semanas. A FIG. 21C retrata achados microscópicos de Ab6 comparado com um inibidor de ALK5 ou anticorpo pan-TGFβ de um estudo de toxicologia em ratos de 4 semanas.

[0067] A FIG. 22 fornece um gráfico que mostra os volumes medianos de tumor S91 em função do tempo. Os braços da combinação representam quatro inibidores de TGFβ1 contexto- independentes, isoforma-seletivos, diferentes, em dois níveis de dose, cada um em combinação com tratamento com anti-PD-1.

[0068] As Figs. 23A-23B fornecem cortes de imunoistoquímica representativos de tumores S91, corados com um marcador de célula CD8+. A FIG. 23A é um corte de tumor de um animal tratado com anti-PD-1 isoladamente. A FIG. 23B é um corte de tumor de um animal tratado tanto com anti-PD- 1 quanto com um inibidor de TGFβ1 contexto-independente representativo.

[0069] As FIGS. 24A-24D fornecem cortes de imunoistoquímica representativos de tumores S91, corados com marcadores de macrófago. A FIG. 24A é um corte de tumor de um animal tratado com anti-PD-1 isoladamente. A FIG. 24B é um corte de tumor de um animal tratado tanto com anti-PD-1 quanto com um inibidor de TGFβ1 contexto-independente representativo. A FIG. 24C é um corte de tumor de um animal tratado com anti-PD-1 e Ab3 (30 mg/kg), usando anti-F4/80 como um marcador de macrófago. A FIG. 24D é um corte que usa anti-CD163 como um marcador de macrófago M2, que mostra que a maioria das células é CD163-negativa.

[0070] A FIG. 25 é um gráfico que mostra a razão de alteração log2 em genes de linfócito T CD8+ (CD8α, Perforina e Granzima B) após tratamento por 1 semana com anti-PD-1/Ab3 em tumores MBT2, comparado com animais tratados com anti-PD- 1 isoladamente.

[0071] A FIG. 26A fornece FACS dados que mostram supra- regulação de GARP induzida por CD3/CD28 em células T reguladoras humanas periféricas.

[0072] A FIG. 26B é um gráfico que mostra os efeitos de Ab3 ou Ab6 sobre a inibição da proliferação de Teff mediada por Treg. IgG foi usada como um controle.

[0073] A FIG. 27A mostra estratégia de gating para separação de subpopulações de células T em tumores MBT2.

[0074] A FIG. 27B fornece um conjunto de gráficos que mostram subpopulações de células T no dia 13, expressas como percentual de células CD45+.

[0075] A FIG. 28A fornece estratégia de gating para separação de subpopulações mielóides em tumores MBT2.

[0076] A FIG. 28B fornece um conjunto de gráficos que mostram subpopulações de células mielóides no dia 13.

[0077] A FIG. 28C fornece dados de FACS que mostram que macrófagos associados ao tumor em MBT-2 expressam LRRC33 da superfície celular.

[0078] A FIG. 28D mostra que MDSCs infiltrantes no tumor MBT-2 expressam LRRC33 da superfície celular.

[0079] As FIGS. 29A-29C fornecem dados de análises por FACS adicionais, que mostram efeitos de tratamento com Ab6 e anti-PD-1 em tumores MBT2.

[0080] As FIGS. 30A-30D fornecem imagens de IHC de cortes de tumor MBT2 que representativos mostram células T CD8- positivas intratumorais.

[0081] A FIG. 30E fornece a quantificação dos dados de IHC das FIGS. 30A-30D, expressa como fração de células CD8- positivas em cada grupo tratado. Regiões necróticas dos cortes foram excluídas da análise.

[0082] A FIG. 30F fornece análises imunoistoquímicas do efeito do tratamento com Ab6 e anti-PD-1 em tumores MBT2. Cortes do tumor foram visualizados for fosfo-SMAD3 (painéis superiores) ou CD8 e CD31 (painéis inferiores) em animais de três grupos de tratamento, como mostrado.

[0083] A FIG. 30G fornece dados que demonstram que Ab6 e anti-PD-1 em combinação parecem desencadear mobilização e infiltração de células T CD8+ em tumores MBT2 de vaso CD31+.

[0084] As FIGS. 31A-31D fornecem a expressão gênica de marcadores de resposta imune, Ptprc (FIG. 31A); CD8a (FIG. 31B); CD4 (FIG. 31C) e Foxp3 (FIG. 31D) coletados de tumores MBT2 dos 4 grupos de tratamento, como mostrado.

[0085] As FIGS. 32A-32C fornecem a expressão gênica de marcadores de função efetora, Ifng (FIG. 32A); Gzmb (FIG. 32B); e Prf1 (FIG. 32C) no dia 10 e/ou dia 13, como indicado.

[0086] A FIG. 32D fornece um conjunto de gráficos que mostram a expressão de quatro marcadores gênicos (Granzima B, Perforina, IFNγ e Klrk1) como medidos por qPCR em amostras de tumor MBT2 no dia 10. Cada gráfico fornece a razão de alteração (“fold change”) da expressão nos três grupos de tratamento: anti-PD-1 isoladamente (esquerda); Ab6 isoladamente (centro); e combinação de anti-PD-1 e Ab6 (direita).

[0087] A FIG. 33A mostra a ligação in vitro de Ab6 contra quatro complexos latentes grandes, como mostrado, como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio (MSD-SET). Valores da KD medidos (em picomolar) são mostrados à direita.

[0088] A FIG. 33B ilustra ensaio baseado em células da potência de LN229 e fornece um gráfico que mostra a potência concentração-dependente de Ab6 contra quatro complexos latentes grandes, como indicado. Também mostra que Ab6 não inibe pró-TGFβ3.

[0089] A FIG. 34A fornece um conjunto de nine gráficos que mostram o efeito de Ab6 em combinação com ou sem anti- PD1 e/ou anti-TGFβ3 sobre o crescimento/regressão tumoral ao longo do tempo em EMT6 (Estudo 1). A linha pontilhada superior dentro de cada gráfico representa o volume tumoral de desfecho de 2.000 mm3, enquanto a linha pontilhada inferior em cada gráfico representa 25% do volume de desfecho (ou seja, 500 mm3).

[0090] A FIG. 34B fornece um gráfico que mostra sobrevida percentual ao longo do tempo (dias após início do tratamento) em EMT6 (Estudo 1). Grupos de tratamento que incluíam tanto anti-PD-1 quanto Ab6 mostraram benefício de sobrevida significante comparados com anti-PD-1 isoladamente.

[0091] A FIG. 34C fornece dados que mostram sobrevida percentual ao longo do tempo (dias após início do tratamento) em EMT6 (Estudo 2). Grupos de tratamento que incluem tanto anti-PD-1 quanto Ab6 demonstraram benefício de sobrevida significante comparados com anti-PD-1 isoladamente, e os efeitos antitumorais são duráveis após o término do tratamento.

[0092] FIG. 34D fornece efeitos de combinação de anti- PD-1 e Ab6 sobre a sobrevida no modelo de câncer de mama EMT6.

[0093] A FIG. 35 fornece dois gráficos que mostram a expressão relativa das três isoformas de TGFβ em tumores EMT6 como medido em níveis de mRNA (esquerda) e níveis de proteína (direita).

[0094] A FIG. 36A fornece um conjunto de imagens de histologia que mostram coloração com prata de reticulina como um marcador de um fenótipo fibrótico da medula óssea em um modelo murídeo de distúrbio mieloproliferativo.

[0095] A FIG. 36B fornece dois gráficos que mostram análise histopatológica de fibrose da medula óssea e efeito da inibição de TGFβ1 em camundongos MPLW515L com alta carga de doença de dois estudos repetidos separado.

[0096] A FIG. 36C fornece um conjunto de gráficos que mostram parâmetros hematológicos em camundongos MPLW515L tratados com Ab6 ou IgG de controle.

[0097] A FIG. 36D fornece um conjunto de gráficos que mostram parâmetros hematológicos adicionais em camundongos MPLW515L tratados com Ab6 ou IgG de controle.

[0098] A FIG. 37A fornece uma análise de variação de conjunto de genes (GSVA) que mostra correlação entre expressão da isoforma de TGFβ e conjunto de genes IPRES.

[0099] A FIG. 37B fornece uma análise de variação de conjunto de genes (GSVA) que mostra correlação entre expressão da isoforma de TGFβ e conjunto de genes Plasari. A expressão da isoforma TGFB1 se correlaciona com ativação da via de TGFβ. O conjunto de genes Plasari de genes TGFβ- responsivos se correlaciona significantemente e fortemente com expressão de RNA da isoforma TGFB1 através de muitos tipos de tumor anotados em TCGA. Correlação de mRNA de TGFB1 e assinatura da sinalização de TGFβ.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES Definições

[00100] A fim de que a revelação possa ser mais prontamente compreendida, primeiro certos termos serão definidos. Essas definições devem ser lidas à luz do restante da revelação e como subentendidas por aqueles habilitados na técnica. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

[00101] Câncer avançado, malignidade avançada: O termo “câncer avançado” ou “malignidade avançada”, como usado nesse relatório descritivo, possui o significado subentendido na técnica pertinente, por exemplo, como subentendido por oncologistas no contexto de diagnóstico ou tratamento de indivíduos/pacientes com câncer. Malignidade avançada com um tumor sólido pode ser localmente avançada ou metastática. O termo “câncer localmente avançado” é usado para descrever um câncer (por exemplo, tumor) que cresceu fora do órgão onde começou, mas ainda não se espalhou para partes distantes do corpo. Dessa forma, o termo inclui câncer que se espalhou de onde ele começou para tecido ou linfonodos próximos. Em contraste, “câncer metastático” é um câncer que se espalhou da parte do corpo onde começou (o local primário) para outras partes (por exemplo, partes distantes) do corpo.

[00102] Afinidade: Afinidade é a força de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) ao seu ligante (por exemplo, um antígeno). Ela é tipicamente medida e relatada pela constante de dissociação em equilíbrio (KD). No contexto de interações anticorpo-antígeno, KD é a proporção da taxa de dissociação de anticorpo (“off rate” ou Koff), quão rapidamente ele se dissocia de seu antígeno, para a taxa de associação ao anticorpo (“on rate” ou Kon) do anticorpo, quão rapidamente ele se liga ao seu antígeno. Por exemplo, um anticorpo com uma afinidade de ≤ 5 nM possui um valor da KD que é 5 nM ou menor (ou seja, 5 nM ou afinidade maior) determinada por um ensaio de ligação in vitro adequado. Ensaios in vitro adequados podem ser usados para medir valores da KD de um anticorpo para seu antígeno, por exemplo,

Interferometria de Biocamada (BLI) e Titulação de Solução em Equilíbrio (por exemplo, MSD-SET).

[00103] Anticorpo: O termo “anticorpo” engloba qualquer estrutura de imunoglobulina de ocorrência natural, recombinante, modificada ou modificada por engenharia genética ou do tipo imunoglobulina, ou fragmento de ligação ao antígeno ou porção desta, ou derivado desta, como adicionalmente descrito em outra parte nesse relatório descritivo. Dessa forma, o termo se refere a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno- alvo e inclui, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e biespecíficos. Um anticorpo intacto geralmente compreenderá pelo menos duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, mas, em alguns casos, pode incluir menos cadeias como, por exemplo, anticorpos que ocorrem naturalmente em camelídeos que podem compreender somente cadeias pesadas. Anticorpos podem ser liberados exclusivamente por uma única fonte, ou podem ser “quiméricos”, ou seja, porções diferentes do anticorpo podem ser derivadas de dois anticorpos diferentes. Anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, podem ser produzidos em hibridomas, por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. O termo “anticorpos”, como usado nesse relatório descritivo, inclui anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minibodies, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes denominados nesse relatório descritivo “miméticos de anticorpo”), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpo

(algumas vezes denominadas nesse relatório descritivo “conjugados de anticorpo”), respectivamente. Em algumas modalidades, o termo também engloba peptibodies.

[00104] Antígeno: O termo “antígeno” inclui amplamente quaisquer moléculas que compreendem um determinante antigênico dentro de uma região (ou regiões) de ligação à qual um anticorpo ou um fragmento se liga especificamente. Um antígeno pode ser uma molécula de unidade única (por exemplo, um monômero ou um fragmento de proteína) ou um complexo formado por múltiplos componentes. Um antígeno fornece um epitopo, por exemplo, uma molécula ou uma porção de uma molécula, ou um complexo de moléculas ou porções de moléculas, capazes de serem unidas por um agente de ligação seletivo, por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno (incluindo, por exemplo, um anticorpo). Dessa forma, um agente de ligação seletivo pode se ligar especificamente a um antígeno que é formado por dois ou mais componentes em um complexo. Em algumas modalidades, o antígeno é capaz de ser usado em um animal para produzir anticorpos capazes de ligação àquele antígeno. Um antígeno pode possuir um ou mais epitopos que são capazes de interagir com diferentes proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos. No contexto da presente revelação, um antígeno adequado é um complexo (por exemplo, complexo multimérico formado por múltiplos componentes em associação) que contém um dímero de pró-TGF em associação com uma molécula apresentadora. Cada monômero do dímero de pró-TGF compreende um pró-domínio e um domínio do fator de crescimento, separados por uma sequência de clivagem de furina. Dois desses monômeros formam o complexo de dímero de pró-TGF (veja a FIG. 19). Esse, por sua vez, está associado covalentemente com uma molécula apresentadora por meio de ligações dissulfeto, que envolvem um resíduo de cisteína presente perto do terminal-N de cada um dos monômeros de pró-TGF. Esse multicomplexo formado por um dímero de pró-TGF ligado a uma molécula apresentadora é geralmente referido como um complexo latente grande. Um complexo de antígenos adequado para avaliação de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, por exemplo, inclui um componente de molécula apresentadora de um complexo latente grande. Esse componente de molécula apresentadora pode ser uma molécula apresentadora de comprimento total ou um fragmento (ou fragmentos) desta. Porções necessárias mínimas da molécula apresentadora tipicamente contêm pelo menos 50 aminoácidos, mas, mais preferivelmente, pelo menos 100 aminoácidos do polipeptídeo da molécula apresentadora, que compreende dois resíduos de cisteína capazes de formar ligações covalentes com o dímero de pró-TGFβ1.

[00105] Porção/fragmento de ligação ao antígeno: Os termos “porção de ligação ao antígeno” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo, como usados nesse relatório descritivo, se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade para se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, TGFβ1). Porções de ligação ao antígeno incluem, sem limitação, qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente modificado, que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Em algumas modalidades, uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser derivada, por exemplo, de moléculas de anticorpo inteiras usando quaisquer técnicas padronizadas adequadas como, por exemplo, digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante que envolvem a manipulação e expressão de DNA que codifica domínios variáveis e, opcionalmente, constantes, de anticorpo.

Exemplos não limitantes de porções de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) fragmentos Fd que consistem nos domínios VH e CH1; (iv) fragmentos Fv que consistem nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) moléculas Fv de cadeia única (scFv) (veja, por exemplo, Bird e cols. (1988) Science 242: 423-426; e Huston e cols. (1988) Proc.

Nat’l.

Acad.

Sci.

U.S.A. 85: 5.879-5.883); (vi) fragmentos dAb (veja, por exemplo, Ward e cols. (1989) Nature 341: 544-546); e (vii) unidades de reconhecimento mínimas que consistem nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada). Outras formas de anticorpos de cadeia única, por exemplo, diabodies, também estão englobadas.

O termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo inclui um “fragmento Fab de cadeia única”, de outro modo conhecido como um “scFab”, que compreende um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio constante de anticorpo 1 (CH1), um domínio variável da cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante da cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante possuem uma das seguintes ordens na direção do terminal-N para o terminal-C: a) VH-CH1-ligante-VL-CL, b) VL-CL- ligante-VH-CH1, c) VH-CL-ligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1- ligante-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, preferivelmente entre 32 e 50 aminoácidos.

[00106] Viés: No contexto da presente revelação, o termo “viés” se refere uma afinidade tendenciosa ou desigual para ou contra um subconjunto de antígenos ao qual um anticorpo é capaz de se ligar especificamente. Por exemplo, um anticorpo é dito que tem viés quando a afinidade para um complexo de antígenos e a afinidade para outro complexo de antígenos não são equivalentes. Os anticorpos contexto- independentes de acordo com a presente revelação possuem afinidades equivalentes para esses complexos de antígenos (ou seja, imparciais).

[00107] Região de ligação: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “região de ligação” é uma porção de um antígeno que, quando ligada a um anticorpo ou um fragmento deste, pode formar uma interface da interação anticorpo- antígeno. Mediante ligação ao anticorpo, uma região de ligação se torna protegida da exposição de superfície, o que pode ser detectado por técnicas adequadas, por exemplo, HDX- MS. A interação anticorpo-antígeno pode ser mediada por meio de múltiplas (por exemplo, duas ou mais) regiões de ligação. Uma região de ligação pode compreender um determinante antigênico, ou epitopo.

[00108] Interferometria de Biocamada (BLI): BLI é uma tecnologia sem marcador para medir opticamente interações biomoleculares, por exemplo, entre um ligante imobilizado na superfície da ponta do biossensor e um analito em solução.

BLI fornece a habilidade para monitorar a especificidade de ligação, taxas de associação e dissociação, ou concentração, com precisão e exatidão. Os instrumentos da plataforma BLI estão disponíveis comercialmente, por exemplo, por ForteBio, e são comumente chamados o Sistema Octet®.

[00109] Câncer: O termo “câncer”, como usado nesse relatório descritivo, se refere à condição fisiológica em eucariotas multicelulares que é tipicamente caracterizada por proliferação celular desregulada e malignidade. O termo engloba amplamente malignidades sólidas e líquidas, incluindo tumores, cânceres sanguíneos (por exemplo, leucemias, linfomas e mielomas), bem como mielofibrose.

[00110] Pró-TGFβ1 associado à célula: O termo se refere a TGFβ1 ou seu complexo de sinalização (por exemplo, TGFβ1 pró/latente) que está ligado à membrana (por exemplo, atado à superfície celular). Tipicamente, essa célula é uma célula imune. TGFβ1 que é apresentado por GARP ou LRRC33, é um TGFβ1 associado à célula. GARP e LRRC33 são moléculas apresentadoras transmembrana que são expressas na superfície celular de certas células. Complexos GARP- e LRRC33-pró- TGFβ1 podem ser coletivamente referidos como complexos pró- TGFβ1 “associados à célula” (ou à “superfície celular”), que medeiam ativação/sinalização de TGFβ1 associada ao pró-TGFβ1 da célula (por exemplo, associada à célula imune). O termo também inclui complexos GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1 recombinantes, purificados em solução (por exemplo, ensaios in vitro) que não estão fisicamente anexados às membranas celulares. Os valores médios da KD de um anticorpo (ou seu fragmento) para um complexo GARP-pró-TGFβ1 e um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 podem ser calculados para representar coletivamente afinidades para complexos pró-TGFβ1 associados à célula (por exemplo, associados à célula imune). Veja, por exemplo, a Tabela 8, coluna (G). A contraparte humana de uma molécula apresentadora ou complexo de moléculas apresentadoras pode ser indicada por um “h” que precede a proteína ou complexo de proteínas, por exemplo, “hGARP”, “hGARP-pró-TGFβ1”, hLRRC33” e “hLRRC33-pró-TGFβ1”. Além do bloqueio da liberação de fator de crescimento TGFβ1 ativo pelos complexos atados à célula, pró-TGFβ1 associado à célula pode ser um alvo para internalização (por exemplo, endocitose) e/ou morte celular como, por exemplo, ADCC, ADCP, ou depleção mediada por ADC das células-alvo que expressam esses complexos da superfície celular.

[00111] Inibidor de checkpoint: No contexto dessa revelação, inibidores do ponto de verificação se referem aos inibidores do ponto de verificação imune e carregam o significado como compreendido na técnica. Tipicamente, o alvo é uma molécula receptora em células T ou células NK, ou ligante da superfície celular correspondente em células apresentadoras de antígeno (APCs) ou células tumorais. Os pontos de verificação imunes são ativados em células imunes para evitar a imunidade inflamatória que se desenvolve contra o “auto”. Portanto, a alteração do equilíbrio do sistema imune por meio da inibição do ponto de verificação deve permitir que ele seja totalmente ativado para detectar e eliminar o câncer. Os melhores receptores inibidores conhecidos implicados no controle da resposta imune são o antígeno de linfócito-T citotóxico-4 (CTLA-4), proteína de morte celular programada 1 (PD-1), PD-L1, domínio de imunoglobulina de célula T e domínio de mucina-3 (TIM3),

gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), receptor de célula killer imunoglobulina-like (KIR), receptor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticóide (GITR) e supressor de ativação de célula T contendo imunoglobulina (Ig) de domínio-V (VISTA). Exemplos não limitantes de inibidores do ponto de verificação incluem: Nivolumab, Pembrolizumab, BMS-936559, Atezolizumab, Avelumab, Durvalumab, Ipilimumab, Tremelimumab, IMP-321, BMS-986016 e Lirilumab. Keytruda® é um exemplo de inibidores de PD-1. Terapias que empregam um ou mais de inibidores do ponto de verificação imune podem ser referidas como terapias de bloqueio do ponto de verificação (CBT).

[00112] Benefício clínico: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “benefícios clínicos” visa incluir tanto eficácia quanto segurança de uma terapia. Dessa forma, o tratamento terapêutico que obtém um benefício clínico desejável é tanto eficaz (por exemplo, obtém efeitos terapeuticamente benéficos) quanto seguro (por exemplo, com níveis toleráveis ou aceitáveis de toxicidades ou eventos adversos).

[00113] Terapia combinada: O termo “terapia combinada” se refere aos regimes de tratamento para uma indicação clínica que compreendem dois ou mais agentes terapêuticos. Dessa forma, o termo se refere a um regime terapêutico no qual uma primeira terapia que compreende uma primeira composição (por exemplo, ingrediente ativo) é administrada em conjunto com uma segunda terapia que compreende uma segunda composição (ingrediente ativo) a um paciente, destinadas a tratar a mesma doença ou condição clínica ou uma doença ou condição clínica sobreposta. A primeira e segunda composições podem, ambas, atuar no mesmo alvo celular, ou em alvos celulares distintos. A frase “em conjunto com”, no contexto de terapias combinadas, significa que os efeitos terapêuticos de uma primeira terapia se sobrepõem temporariamente e/ou espacialmente com efeitos terapêuticos de uma segunda terapia no indivíduo que recebe a terapia combinada. Dessa forma, as terapias combinadas podem ser formuladas como uma formulação única para administração concomitante, ou como formulações separadas, para administração sequencial das terapias. Quando um indivíduo que foi tratado com uma primeira terapia para tratar uma doença é administrado com uma segunda terapia para tratar a mesma doença, a segunda terapia pode ser referida como uma terapia complementar ou terapia auxiliar.

[00114] Epitopo combinatório: Um epitopo combinatório é um epitopo que é reconhecido e ligado por um anticorpo combinatório em um sítio (ou seja, determinante antigênico) formado por porções não contíguas de um componente ou componentes de um antígeno, que, em uma estrutura tridimensional, se aproximam intimamente para formar o epitopo. Dessa forma, os anticorpos da invenção podem se ligar a um epitopo formado por dois ou mais componentes (por exemplo, porções ou segmentos) de um complexo de TGFβ1 pró/latente. Um epitopo combinatório pode compreender resíduo (ou resíduos) de aminoácido de um primeiro componente do complexo, e resíduo (ou resíduos) de aminoácido de um segundo componente do complexo, e assim por diante. Cada componente pode ser de uma única proteína ou de duas ou mais proteínas de um complexo antigênico. Um epitopo combinatório é formado com contribuições estruturais de dois ou mais componentes (por exemplo, porções ou segmentos, por exemplo, resíduos de aminoácidos) de um antígeno ou complexo de antígenos.

[00115] Competição ou competição cruzada bloqueio cruzado: O termo “competir”, quando usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste) que compete pelo mesmo epitopo, significa competição entre proteínas de ligação ao antígeno, como determinada por um ensaio no qual a proteína de ligação ao antígeno que está sendo testada evita ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência a um antígeno comum (por exemplo, TGFβ1 ou um fragmento deste). Vários tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outra, por exemplo: imunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche; EIA direto de biotina-avidina em fase sólida; ensaio direto marcado em fase sólida, e ensaio em sanduíche direto marcado em fase sólida. Normalmente, quando uma proteína de ligação ao antígeno em competição está presente em excesso, ela inibirá (por exemplo, reduzirá) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência a um antígeno comum por pelo menos 40-45%, 45- 50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou mais. Em alguns casos, a ligação é inibida por pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, ou 97% ou mais. Em algumas modalidades, um primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste e um segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste “bloqueiam de forma cruzada” entre eles com relação ao mesmo antígeno, por exemplo, como testado por Biacor ou Octet®, usando condições de teste padronizadas, por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, ligação testada em temperatura ambiente, aproximadamente 20-25°C).

[00116] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento deste e o segundo anticorpo ou fragmento deste podem ter o mesmo epitopo. Em outras modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento deste e o segundo anticorpo ou fragmento deste podem ter epitopos não idênticos, mas sobrepostos. Ainda em modalidades adicionais, o primeiro anticorpo ou fragmento deste e o segundo anticorpo ou fragmento deste podem ter epitopos separados (diferentes) que estão nas proximidades em um espaço tridimensional, de modo que a ligação do anticorpo seja bloqueada de forma cruzada por meio de impedimento estérico. O termo “bloqueio cruzado” significa que a ligação do primeiro anticorpo a um antígeno evita a ligação do segundo anticorpo ao mesmo antígeno e, similarmente, a ligação do segundo anticorpo a um antígeno evita a ligação do primeiro anticorpo ao mesmo antígeno.

[00117] A compartimentalização de anticorpo (algumas vezes denominada compartimentalização de epitopo ou mapeamento de epitopo) pode ser realizada para caracterizar e classificar um conjunto (por exemplo, “uma biblioteca”) de anticorpos monoclonais feitos contra uma proteína ou complexo de proteínas-alvo (ou seja, antígeno). Esses anticorpos contra o mesmo alvo são testados contra todos os outros anticorpos na biblioteca em pares para avaliar se os anticorpos bloqueiam a ligação ao antígeno um do outro. Perfis de compartimentalização intimamente relacionados indicam que os anticorpos possuem o mesmo epitopo ou epitopos intimamente relacionados (por exemplo, sobrepostos) e estão “compartimentalizados” juntos. A compartimentalização fornece perfis de estrutura-função de anticorpos úteis que compartilham regiões de ligação similares dentro do mesmo antígeno, pois as atividades biológicas (por exemplo, intervenção; potência) efetuadas por ligação de um anticorpo ao seu alvo provavelmente é realizada em relação ao outro anticorpo no mesmo compartimento. Dessa forma, entre anticorpos dentro do mesmo compartimento de epitopo, aqueles com afinidades maiores (KD menor) tipicamente possuem potência maior.

[00118] Região determinante de complementaridade: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “CDR” se refere à região determinante de complementaridade dentro de sequências variáveis de anticorpo. Há três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. O termo “conjunto de CDR”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma região variável única que podem se ligar ao antígeno. Os limites exatos dessas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat e cols. (1987; 1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (“National Institutes of Health”, Bethesda, Md.) não apenas fornece um sistema de numeração de resíduos inequívoco aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites precisos de resíduos que definem as três CDRs. Essas CDRs podem ser referidas como CDRs de Kabat. Chothia e colaboradores (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; e Chothia e cols. (1989) Nature 342: 877-883) verificaram que certas subporções dentro das CDRs de Kabat adotam conformações de arcabouço peptídico quase idênticas, apesar de terem maior diversidade no nível de sequência de aminoácidos. Essas subporções foram designadas como L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3, ou L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 ou H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3, em que o “L” e o “H” designam as regiões da cadeia leve e da cadeia pesada, respectivamente. Essas regiões podem ser referidas como CDRs de Chothia, que possuem limites que se sobrepõem com as CDRs de Kabat. Outros limites que definem CDRs que se sobrepõem com as CDRs de Kabat foram descritos por Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 e MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262 (5): 732-45. Ainda outras definições dos limites de CDR podem não seguir rigorosamente um dos sistemas desse relatório descritivo, mas irão, no entanto, se sobrepor com as CDRs de Kabat, embora possam ser abreviados ou alongados à luz da predição ou achados experimentais que resíduos ou grupos de resíduos particulares ou até mesmo CDRs inteiras não impactam significantemente a ligação ao antígeno (veja, por exemplo: Lu X e cols., MAbs., janeiro de 2019; 11 (1): 45-57). Os métodos usados nesse relatório descritivo podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades utilizem as CDRs definidas por Kabat ou Chothia.

[00119] Epitopo conformacional: Um epitopo conformacional é um epitopo que é reconhecido e ligado por um anticorpo conformacional em uma conformação tridimensional, mas não em um peptídeo não enovelado da mesma sequência de aminoácidos. Um epitopo conformacional pode ser referido como um epitopo conformação-específico, epitopo conformação-dependente ou epitopo conformação-sensível. Um anticorpo ou fragmento deste correspondente que se liga especificamente a um epitopo desse tipo pode ser referido como anticorpo conformação-específico, anticorpo conformação-seletivo ou anticorpo conformação-dependente. A ligação de um antígeno a um epitopo conformacional depende da estrutura tridimensional (conformação) do antígeno ou complexo de antígenos.

[00120] Região constante: Um domínio constante de imunoglobulina se refere a um domínio constante da cadeia pesada ou leve. Sequências de aminoácidos do domínio constante da cadeia pesada e da cadeia leve de IgG humana são conhecidas na técnica.

[00121] Influenciado pelo contexto: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpos influenciados pelo contexto” se refere a um tipo de anticorpos conformacionais que se ligam a um antígeno com afinidades diferenciais quando o antígeno está associado com (ou seja, ligado ou anexado a) uma proteína interagente ou um fragmento desta. Dessa forma, um anticorpo influenciado pelo contexto que se liga especificamente a um epitopo dentro de pró-TGFβ1 pode se ligar a LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1 com afinidades diferentes. Por exemplo, um anticorpo é dito como sendo “influenciado pela matriz” se ele possui afinidades maiores para complexos pró-TGFβ1 associados à matriz (por exemplo, LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3- pró-TGFβ1) do que para complexos pró-TGFβ1 associados à célula (por exemplo, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1). As afinidades relativas de [complexos associados à matriz]: [complexos associados à célula] podem ser obtidas tomando- se os valores médios da KD do primeiro, tomando os valores médios da KD do último, e calculando a proporção dos dois, como exemplificado nesse relatório descritivo.

[00122] Contexto-independente: De acordo com a presente revelação, “um anticorpo contexto-independente” que se liga a pró-TGFβ1 possui afinidades equivalentes através dos quatro complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 conhecidos, especificamente, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró- TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Os anticorpos contexto-independentes revelados no presente pedido também podem ser caracterizados como imparciais. Tipicamente, anticorpos contexto-independentes exibem afinidades equivalentes (ou seja, um viés de, no máximo, cinco vezes), de modo que as proporções relativas de valores medidos da KD entre complexos associados à matriz e complexos associados à célula não sejam maiores do que 5, como medidas por um ensaio de ligação in vitro adequado, por exemplo, ressonância de plásmon de superfície, Interferometria de Biocamada (BLI) e/ou titulação de solução em equilíbrio (por exemplo, MSD- SET).

[00123] TGFβ1/pró-TGFβ1 associado à ECM: O termo se refere a TGFβ1 ou seu complexo de sinalização (por exemplo, TGFβ1 pró/latente) que é um componente (por exemplo, depositado na) da matriz extracelular. TGFβ1 que é apresentado por LTBP1 ou LTBP3 é um TGFβ1 associado à ECM, especificamente, LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1, respectivamente. LTBPs são críticos para deposição correta e subsequente biodisponibilidade de TGFβ na ECM, onda se acredita que fibrilina (Fbn) e fibronectina (FN) sejam as principais proteínas da matriz responsáveis pela associação de LTBPs com a ECM. Esses complexos latentes associados à matriz estão enriquecidos em tecidos conjuntivos, bem como certos tecidos associados a doenças, por exemplo, estroma tumoral e tecidos fibróticos. A contraparte humana de uma molécula apresentadora ou complexo de moléculas apresentadoras pode ser indicada por um “h” que precede a proteína ou complexo de proteínas, por exemplo, “hLTBP1”, “hLTBP1-pró-TGFβ1”, hLTBP3” e “hLTBP3-pró-TGFβ1”.

[00124] Quantidade eficaz: Uma “quantidade eficaz” (ou quantidade terapeuticamente eficaz, ou dose terapêutica) é uma dosagem ou regime de dosagem que obtém benefícios clínicos estatisticamente significantes em uma população de pacientes. Por exemplo, Ab6 demonstrou ser eficaz em doses de apenas 3 mg/kg e tão altas quanto 30 mg/kg em modelos pré-clínicos. Dessa forma, pode ser dito que uma quantidade eficaz para Ab6 está entre cerca de 3-30 mg/kg.

[00125] Controle tumoral eficaz: O termo “controle tumoral eficaz” pode ser usado para se referir a um grau de regressão tumoral obtido em resposta ao tratamento, em que, por exemplo, o tumor é regredido por uma fração definida (por exemplo, < 25%) de um volume tumoral de desfecho. Por exemplo, em um modelo particular, se o volume tumoral de desfecho é ajustado em 2.000 mm3, o controle tumoral eficaz é obtido se o tumor é reduzido para menos do que 500 mm3 supondo o limiar de < 25%. Portanto, o controle tumoral eficaz engloba a regressão completa. Clinicamente, o controle tumoral eficaz inclui resposta parcial (PR) e resposta completa (CR) com base em critérios reconhecidos na técnica, por exemplo, RECIST 1.1 e iRECIST correspondente. Em algumas modalidades, o controle tumoral eficaz em cenários clínicos também inclui doença estável, em que os tumores que tipicamente se espera que cresçam em certas taxas são impedidos desse crescimento pelo tratamento, embora seu encolhimento não seja obtido.

[00126] Células T efetoras: O termo “células T efetoras”, como usado nesse relatório descritivo, se refere aos linfócitos T que respondem ativamente imediatamente a um estímulo, por exemplo, coestimulação, e incluem, sem limitação, células T CD4+ (também denominadas células T helper ou Th) e células T CD8+ (também denominadas células T citotóxicas). As células Th ajudam a outras células sanguíneas brancas em processos imunológicos, incluindo maturação de células B em células plasmáticas e células B de memória, e ativação de células T citotóxicas e macrófagos. Essas células também são conhecidas como células T CD4+, pois expressam a glicoproteína CD4 em suas superfícies. Células T helper ficam ativadas quando são apresentadas com antígenos peptídicos por moléculas MHC classe II, que são expressas na superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs). Uma vez ativadas, elas se dividem rapidamente e secretam pequenas proteínas denominadas citocinas que regulam ou ajudam na resposta imune ativa. Essas células podem se diferenciar em um de vários subtipos, incluindo Th1, Th2, Th3, Th17, Th9 ou TFh, que secretam diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respostas imunes. A sinalização pela APC direciona as células T em subtipos particulares. Citotóxicas (Killer). Células T citotóxicas (células TC, CTLs, células T-killer, células T killer), por outro lado, destroem células infectadas por vírus e células de câncer, e também estão implicadas em rejeição de transplantes. Essas células também são conhecidas como células T CD8+, na medida em que expressam a glicoproteína CD8 em suas superfícies. Essas células reconhecem seus alvos por ligação ao antígeno associado com moléculas MHC classe I, que estão presentes na superfície de todas as células nucleadas. Células efetoras citotóxicas (por exemplo, células CD8+) incluem, por exemplo, perforina e granzima B.

[00127] Epitopo: O termo “epitopo”, que também pode chamado de um determinante antigênico, é um determinante molecular (por exemplo, determinante de polipeptídeo) que pode se ligar especificamente a um agente de ligação, imunoglobulina ou receptor de célula T. Determinantes de epitopo incluem agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativos, por exemplo, aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforil ou sulfonil e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epitopo reconhecido por um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo é um elemento estrutural de um antígeno que interage com CDRs (por exemplo, o sítio complementar) do anticorpo ou do fragmento. Um epitopo pode ser formado por contribuições de vários resíduos de aminoácidos, que interagem com as CDRs do anticorpo para produzir especificidade. Um fragmento antigênico pode conter mais de um epitopo. Em certas modalidades, um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando ele reconhece seu antígeno-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Por exemplo, anticorpos são ditos que “se ligam ao mesmo epitopo” se os anticorpos competem de forma cruzada (um evita o efeito de ligação ou modulação do outro).

[00128] Afinidade equivalente: No contexto da presente revelação, o termo “afinidade/afinidades equivalentes” visa significar que: i) o anticorpo se liga um complexos pró- TGFB1 associados à matriz e complexos pró-TGFB1 associados à célula com um viés de menos do que cinco vezes em afinidade, como medido por ensaios de ligação in vitro adequados, por exemplo, titulação de solução em equilíbrio (por exemplo, MSD-SET), Interferometria de Biocamada (por exemplo, Octet®) ou ressonância de plásmon de superfície (por exemplo, Biacore System; e/ou, ii) as afinidades relativas do anticorpo para os quatro complexos são uniformes pelo fato de que: a menor afinidade (o maior valor numérico da KD) que o anticorpo mostra entre os quatro complexos de antígenos é, no máximo, cinco vezes menos do que o valor médio calculado das três afinidades restantes; ou, a maior afinidade (o menor valor numérico da KD) que o anticorpo mostra entre os quatro complexos de antígenos é, no máximo, cinco vezes maior do que a média calculada das três afinidades restantes. Anticorpos com afinidades equivalentes podem obter efeitos inibidores mais uniformes, independentemente da molécula apresentadora particular associada com o complexo pró-TGFβ1 (e, dessa forma, “contexto-independente”). Em modalidades particularmente preferidas, o viés observado em afinidades médias entre complexos associados à matriz e complexos associados à célula é de, no máximo, três vezes.

[00129] Laço de Latência Estendido: O termo “Laço de Latência Estendido”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma porção do pró-domínio que compreende Laço de Latência e Hélice Alfa-2, por exemplo, LASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTR (ID. DE SEQ. N°: 154). Em algumas modalidades, o Laço de Latência Estendido ainda compreende uma porção de Hélice Alfa-1, por exemplo, LVKRKRIEA (ID. DE SEQ. N°: 159) ou uma porção desta.

[00130] Fibrose: O termo “fibrose” ou “condição/distúrbio fibrótico” se refere ao processo ou manifestação caracterizada pelo acúmulo patológico de componentes da matriz extracelular (ECM), por exemplo, colágenos, dentro de um tecido ou órgão.

[00131] Microambiente fibrótico: O termo “microambiente fibrótico” se refere a um nicho de doença local dentro de um tecido, no qual ocorre fibrose in vivo. O microambiente fibrótico pode compreender assinatura molecular associada à doença (um conjunto de quimiocinas, citocinas etc.), populações de células associadas à doença (por exemplo, macrófagos ativados, MDSCs etc.), bem como ambientes da ECM associados à doença (alterações em componentes e/ou estrutura da ECM). Acredita-se que o microambiente fibrótico dê suporte à transição de fibroblasto para miofibroblasto actina-positivo de músculo liso-α de uma forma TGFβ- dependente. O microambiente fibrótico pode ainda ser caracterizado pela infiltração de certas células imunes (por exemplo, macrófagos e MDSCs).

[00132] Finger-1 (de Fator de Crescimento TGFβ1): Como usado nesse relatório descritivo, o termo “Finger-1” é um domínio dentro do domínio do fator de crescimento TGFβ1. Em sua forma não mutada, Finger-1 de pró-TGFβ1 humano contém a seguinte sequência de aminoácidos: CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFC (ID. DE SEQ. N°: 151). Na estrutura 3D, o domínio de Finger-1 (uma porção é mostrada como região “5a” nas FIGS. 18 e 19) está muito próxima do Laço de Latência.

[00133] Finger-2 (de Fator de Crescimento TGFβ1): Como usado nesse relatório descritivo, o termo “Finger-2” é um domínio dentro do domínio do fator de crescimento TGFβ1. Em sua forma não mutada, Finger-2 de pró-TGFβ1 humano contém a seguinte sequência de aminoácidos: CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (ID. DE SEQ. N°: 152). Finger-2 inclui a “região de ligação 6” (ou seja, “6a” e “6b”) retratada nas FIGS. 18 e 19, que se situa espacialmente muito próximo do Laço de Latência.

[00134] Complexo GARP-pró-TGFβ1: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “complexo GARP-TGFβ1” se refere a um complexo de proteínas que compreende uma forma de pró-proteína ou forma latente de uma proteína do fator de transformação de crescimento-β1 (TGFβ1) e uma proteína predominante de repetições de glicoproteína-A (GARP) ou fragmento ou variante desta. Em algumas modalidades, uma forma de pró-proteína ou forma latente de proteína de TGFβ1 pode ser chamada de “proteína de TGFβ1 pró/latente”. Em algumas modalidades, um complexo GARP-TGFβ1 compreende GARP ligada covalentemente com TGFβ1 pró/latente por meio de uma ou mais ligações dissulfeto. Na natureza, essas ligações covalentes são formadas com resíduos de cisteína presentes perto do terminal-N (por exemplo, posição de aminoácido 4) de um dímero de complexo pró-TGFβ1. Em outras modalidades,

um complexo GARP-TGFβ1 compreende GARP ligada não- covalentemente com TGFβ1 pró/latente. Em algumas modalidades, um complexo GARP-TGFβ1 é um complexo de ocorrência natural, por exemplo, um complexo GARP-TGFβ1 em uma célula. O termo “hGARP” significa GARP humano.

[00135] Alta-afinidade: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alta afinidade” como em “um anticorpo de alta afinidade contra pró-TGFβ1” se refere às atividades de ligação in vitro que possuem um valor da KD de ≤ 5 nM, mais preferivelmente ≤ 1 nM. Dessa forma, um anticorpo de alta afinidade, contexto-independente, contra pró-TGFβ1 englobado pela invenção nesse relatório descritivo possui um valor da KD de ≤ 5 nM, mais preferivelmente ≤ 1 nM, para cada um dos seguintes complexos de antígenos: LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1.

[00136] Anticorpo humano: O termo “anticorpo humano”, como usado nesse relatório descritivo, visa incluir anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da presente revelação podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo “anticorpo humano”, como usado nesse relatório descritivo, não visa incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie mamífera, por exemplo, um camundongo, foram enxertadas em sequências framework humanas.

[00137] Anticorpo humanizado: O termo “anticorpo humanizado” se refere aos anticorpos que compreendem sequências da região variável da cadeia pesada e leve de uma espécie não humana (por exemplo, um camundongo), mas nos quais pelo menos uma porção da sequência de VH e/ou VL foi alterada para ser mais “humana-like”, ou seja, mais similar às sequências variáveis da linhagem germinativa humana. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo com CDR enxertada, no qual sequências de CDR humana são introduzidas em sequências de VH e VL não humanas para substituir as sequências de CDR não humanas correspondentes. Além disso, um “anticorpo humanizado” é um anticorpo, ou uma variante, derivado, análogo ou fragmento deste, que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região FR que possui substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região CDR que possui substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “substancialmente”, no contexto de uma CDR, se refere a uma CDR que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente tudo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (ou seja, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região Fc de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, de dobradiça, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém somente uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém somente uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém somente um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada.

[00138] Espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS): HDX-MS é uma técnica bem conhecida empregada para interrogar confirmação de proteína e interações proteína-proteína em solução por medição do grau de acessibilidade de solvente. Veja, por exemplo, Wei e cols., (2014) Drug Discov Today 19(1): 95-102. “Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Probing Higher Order Structure of Protein Therapeutics: Methodology and applications”. A técnica de HDX-MS pode ser empregada para determinar uma região ou regiões de um antígeno ligadas por um anticorpo (ou seja, “região (ou regiões) de ligação”). Dessa forma, essa região (ou regiões) de ligação pode conter ou formar um epitopo.

[00139] Tumor imuno-excluído: Como usados nesse relatório descritivo, tumores caracterizados como “imuno- excluídos” são desprovidos ou substancialmente desprovidos de linfócitos antitumorais intratumorais. Por exemplo, tumores com células T pobremente infiltradas podem ter células T que circundam o tumor, por exemplo, nos perímetros externos de uma massa tumoral e/ou perto das vizinhanças das vasculaturas (“perivasculares”) de um tumor que, no entanto, não conseguem habitar eficazmente dentro do tumor para exercer função citotóxica contra células de câncer. Em outras situações, os tumores não conseguem provocar uma resposta imune forte (os chamados tumores “frios” ou “deserto imune”), de modo que poucas células T estão presentes perto e no ambiente tumoral. Em contraste com tumores imuno-excluídos, tumores que estão infiltrados com linfócitos antitumorais são algumas vezes caracterizados como tumores “quentes” ou “inflamados”; esses tumores tendem a ser mais responsivos e, portanto, são o alvo de terapias imunes de bloqueio do ponto de verificação (“CBTs”). Tipicamente, no entanto, somente uma fração de pacientes responde a uma CBT devido à exclusão imune que torna o tumor resistente à CBT.

[00140] Imunossupressão, imunossupressor: Os termos se referem à habilidade para suprimir células imunes, por exemplo, células T, células NK e células B. O padrão-ouro para avaliação da função imunossupressora é a inibição de atividade de célula T, o que pode incluir supressão antígeno- específica e supressão não específica. Células T reguladoras (Tregs) e MDSCs podem ser consideradas células imunossupressoras. Macrófagos polarizados-M2 (por exemplo, macrófagos localizados na doença, por exemplo, TAMs e FAMs) também podem ser caracterizados como imunossupressores.

[00141] Memória imunológica: Memória imunológica se refere à habilidade do sistema imune para reconhecer rapidamente e especificamente um antígeno que o corpo encontrou previamente e iniciar uma resposta imune correspondente. Geralmente, há respostas imunes secundárias, terciárias e outras respostas imunes subsequentes ao mesmo antígeno. A memória imunológica é responsável pelo componente adaptivo do sistema imune, células T e B especiais — as chamadas células T e B de memória. Células T naïve para o antígeno se expandem e diferenciam em células T de memória e efetoras após encontrarem seu antígeno cognato dentro do contexto de uma molécula MHC na superfície de uma célula apresentadora de antígeno profissional (por exemplo, uma célula dendrítica). O tema unificador único para todos os subtipos de célula T de memória é que elas têm vida longa e podem expandir rapidamente até grandes números de células T efetoras mediante reexposição aos seus antígenos cognatos. Por esse mecanismo elas fornecem ao sistema imune “memória” contra patógenos encontrados previamente. Células T de memória podem ser CD4+ ou CD8+ e normalmente expressam CD45RO. Em um cenário pré-clínico, a memória imunológica pode ser testada em um paradigma de re-desafio tumoral.

[00142] Isoforma-específico: O termo “especificidade de isoforma” se refere à habilidade de um agente para discriminar uma isoforma em relação a outras isoformas estruturalmente relacionadas (ou seja, seletividade). Um inibidor de TGFβ isoforma-específico exerce sua atividade inibidora em direção a uma isoforma de TGFβ, mas não às outras isoformas de TGFβ em certa concentração. Por exemplo, um anticorpo isoforma TGFβ1-específico se liga seletivamente a TGFβ1. Um inibidor TGFβ1-específico (anticorpo) visa preferencialmente (se liga e, dessa forma, inibe) a isoforma

TGFβ1 em relação a TGFβ2 ou TGFβ3 com afinidade substancialmente maior. Por exemplo, a seletividade nesse contexto pode se referir uma diferença de pelo menos 500-

1.000 vezes nas respectivas afinidades, como medidas por um ensaio de ligação in vitro como, por exemplo, Octet® e Biacor. Em algumas modalidades, a seletividade é tal que o inibidor, quando usado em uma dosagem eficaz para inibir TGFβ1 in vivo, não inibe TGFβ2 e TGFβ3. Para que um inibidor desse tipo seja útil como um produto terapêutico, a dosagem para obter efeitos desejáveis (por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes) deve cair dentro da janela na qual o inibidor pode inibir eficazmente a isoforma TGFβ1, sem inibir TGFβ2 ou TGFβ3.

[00143] Isolado: Um anticorpo “isolado”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos que possuem especificidades antigênicas diferentes. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos indesejados.

[00144] Complexo Latente Grande: O termo “complexo latente grande” (“LLC”) no contexto da presente revelação se refere a um complexo formado por um dímero de pró-TGFβ1 ligado a uma denominada molécula apresentadora. Dessa forma, um complexo latente grande é um complexo molécula apresentadora-pró-TGFβ1, por exemplo, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Esses complexos podem ser formados in vitro com o uso de componentes recombinantes, purificados, capazes de formar o complexo. Para fins de avaliação, as moléculas apresentadoras usadas para a formação desses LLCs não precisam ser polipeptídeos de comprimento total; no entanto, a porção da proteína capaz de formar ligações dissulfeto com o dímero de complexo pró-TGFβ1 por meio dos resíduos de cisteína perto de suas regiões do terminal-N é tipicamente necessária.

[00145] Peptídeo associado à latência (LAP): LAP é denominado o “pró-domínio” de pró-TGFβ1. Como descrito em mais detalhe nesse relatório descritivo, LAP é composto pelo domínio “Straight Jacket” e o domínio do “Braço”. O Straight Jacket propriamente dito é ainda dividido nos domínios de Hélice Alfa-1 e de Laço de Latência.

[00146] Laço de Latência: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “Laço de Latência”, algumas vezes também denominado Alça de Latência, é um domínio flanqueado por Hélice Alfa-1 e pelo Braço dentro do pró-domínio de pró- TGFB1. Em sua forma não mutada, o Laço de Latência de pró- TGFβ1 humano compreende a sequência de aminoácidos: LASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 153) e substancialmente corresponde às regiões “2a” e “2b” mostradas nas FIGS. 18A e é transposto pela Região 1 identificada na FIG. 19A. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “região do Laço de Latência Estendido” se refere ao Laço de Latência junto com seu motivo do terminal-C imediato denominado Hélice Alfa-2 (Hélice-α2) do pró-domínio. O resíduo de prolina que está no terminal-C do Laço de Latência fornece a “curva” perpendicular como um “cotovelo” que conecta a alça do laço à Hélice-α2. O Laço de Latência Estendido compreende as regiões mostradas como “2a”, “2b” e “2c” nas FIGS. 18 e 19. Certos inibidores da ativação de TGFβ1 de alta afinidade se ligam pelo menos em parte ao Laço de Latência ou a uma porção deste para conferir a potência inibidora (por exemplo, a habilidade para bloquear a ativação), em que, opcionalmente, a porção do Laço de Latência é ASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 266). Em algumas modalidades, os anticorpos da presente revelação se ligam a um complexo pró-TGFβ1 em ASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 266) ou uma a porção desta. Certos inibidores da ativação de TGFβ1 de alta afinidade se ligam pelo menos em parte ao Laço de Latência Estendido ou a uma porção deste para conferir a potência inibidora (por exemplo, a habilidade para bloquear a ativação), em que, opcionalmente, a porção do Laço de Latência Estendido é KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 169).

[00147] Localizado: No contexto da presente revelação, o termo “localizado” (como em “tumor localizado”, “doença localizada” etc.) se refere às anormalidades anatomicamente isoladas ou isoláveis, por exemplo, malignidades sólidas, ao contrário de doença sistêmica. Certas leucemias, por exemplo, podem ter tanto um componente localizado (por exemplo, a medula óssea) quanto um componente sistêmico (por exemplo, células sanguíneas circulantes) para a doença.

[00148] Complexo LRRC33-pró-TGFβ1: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “complexo LRRC33-TGFβ1” se refere a um complexo entre uma forma de pró-proteína ou forma latente de proteína do fator de transformação de crescimento- β1 (TGFβ1) e uma Proteína que Contém Repetição Rica em Leucina 33 (LRRC33; também conhecida como Regulador Negativo de Espécies Reativas ao Oxigênio ou NRROS) ou fragmento ou variante deste. Em algumas modalidades, um complexo LRRC33- TGFβ1, compreende LRRC33 ligada covalentemente com TGFβ1 pró/latente por meio de uma ou mais ligações dissulfeto. Na natureza, essas ligações covalentes são formadas com resíduos de cisteína presentes perto do terminal-N (por exemplo, posição de aminoácido 4) de um dímero de complexo pró-TGFβ1. Em outras modalidades, um complexo LRRC33-TGFβ1, compreende LRRC33 ligada não-covalentemente com TGFβ1 pró/latente. Em algumas modalidades, um complexo LRRC33- TGFβ1 é um complexo de ocorrência natural, por exemplo, um complexo LRRC33-TGFβ1 em uma célula. O termo “hLRRC33” significa LRRC33 humano. In vivo, LRRC33 e complexos que contêm LRRC33 na superfície celular podem ser internalizados. LRRC33 é expressa em um subconjunto de células mielóides, incluindo macrófagos-M2 polarizados (por exemplo, TAMs) e MDSCs.

[00149] Complexo LTBP1-pró-TGFβ1: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “complexo LTBP1-TGFβ1” se refere a um complexo de proteínas que compreende uma forma de pró-proteína ou forma latente de proteína do fator de transformação de crescimento-β1 (TGFβ1) e uma proteína de ligação a TGF-beta latente 1 (LTBP1) ou fragmento ou variante desta. Em algumas modalidades, um complexo LTBP1-TGFβ1 compreende LTBP1 ligada covalentemente com TGFβ1 pró/latente por meio de uma ou mais ligações dissulfeto. Na natureza, essas ligações covalentes são formadas com resíduos de cisteína presentes perto do terminal-N (por exemplo, posição de aminoácido 4) de um dímero de complexo pró-TGFβ1. Em outras modalidades, um complexo LTBP1-TGFβ1 compreende LTBP1 ligada não-covalentemente com TGFβ1 pró/latente. Em algumas modalidades, um complexo LTBP1-TGFβ1 é um complexo de ocorrência natural, por exemplo, um complexo LTBP1-TGFβ1 em uma célula. O termo “hLTBP1” significa LTBP1 humano.

[00150] Complexo LTBP3-pró-TGFβ1: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “complexo LTBP3-TGFβ1” se refere a um complexo de proteínas que compreende uma forma de pró-proteína ou forma latente de proteína do fator de transformação de crescimento-β1 (TGFβ1) e uma proteína de ligação a TGF-beta latente 3 (LTBP3) ou fragmento ou variante desta. Em algumas modalidades, um complexo LTBP3-TGFβ1 compreende LTBP3 ligada covalentemente com TGFβ1 pró/latente por meio de uma ou mais ligações dissulfeto. Na natureza, essas ligações covalentes são formadas com resíduos de cisteína presentes perto do terminal-N (por exemplo, posição de aminoácido 4) de um dímero de complexo pró-TGFβ1. Em outras modalidades, um complexo LTBP3-TGFβ1 compreende LTBP1 ligada não-covalentemente com TGFβ1 pró/latente. Em algumas modalidades, um complexo LTBP3-TGFβ1 é um complexo de ocorrência natural, por exemplo, um complexo LTBP3-TGFβ1 em uma célula. O termo “hLTBP3” significa LTBP3 humano.

[00151] Macrófago M2 ou M2-like: Macrófagos M2 representam um subconjunto de macrófagos ativados ou polarizados e incluem macrófagos associados à doença em microambientes tanto fibróticos quanto tumorais. Marcadores da superfície celular para macrófagos-M2 polarizados tipicamente incluem CD206 e CD163 (ou seja, CD206+/CD163+). Macrófagos polarizados-M2 também podem expressar LRRC33 da superfície celular. A ativação de macrófagos M2 é promovida principalmente por IL-4, IL-13, IL-10 e TGFβ; eles secretam as mesmas citocinas que os ativam (IL-4, IL-13, IL-10 e TGFβ). Essas células possuem capacidade fagocítica elevada e produzem componentes da ECM, fatores angiogênicos e quimiotáticos. A liberação de TGFβ por macrófagos pode perpetuar a ativação de miofibroblastos, indução de EMT e EndMT nos tecidos doentes, por exemplo, tecido fibrótico e estroma tumoral. Por exemplo, macrófagos M2 são essenciais para fibrose pulmonar dirigida por TGFβ e também estão enriquecidos em diversos tumores.

[00152] pró-TGFβ1 associado à matriz: LTBP1 e LTBP3 são moléculas apresentadoras que são componentes da matriz extracelular (ECM). LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1 podem ser coletivamente referidos como complexos pró-TGFβ1 “associados à ECM” (ou “associados à matriz”), que medeiam a ativação/sinalização de TGFβ1 associado à ECM. O termo também inclui complexos LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1 recombinantes, purificados, em solução (por exemplo, ensaios in vitro) que não estão fisicamente anexados a uma matriz ou substrato.

[00153] Dose maximamente tolerada (MTD): O termo MTD geralmente se refere, no contexto de considerações de segurança/toxicologia, à maior quantidade de um artigo de teste (por exemplo, um inibidor de TGFβ1) avaliado com nível de efeito adverso não observado (NOAEL). Por exemplo, o NOAEL para Ab6 em ratos foi a maior dose avaliada (100 mg/kg), sugerindo que a MTD para Ab6 é > 100 mg/kg, com base em um estudo de toxicologia de quatro semanas. O NOAEL para Ab6 em primatas não humanos foi a maior dose avaliada (300 mg/kg), sugerindo que a MTD para Ab6 nos primatas não humanos é > 300 mg/kg, com base em um estudo de toxicologia de quatro semanas.

[00154] Descoberta de Mesoescala: “Descoberta de Mesoescala” ou “MSD” é um tipo de imunoensaios que emprega eletroquimioluminescência (ECL) como uma técnica de detecção. Tipicamente, eletrodos de carbono de alta ligação são usados para capturar proteínas (por exemplo, anticorpos). Os anticorpos podem ser incubados com antígenos particulares, cuja ligação pode ser detectada com anticorpos secundários que são conjugados a marcadores eletroquimioluminescentes. Mediante um sinal elétrico, a intensidade luminosa pode ser medida para quantificar analitos na amostra.

[00155] Mielofibrose: “Mielofibrose”, também conhecida como osteomielofibrose, é um distúrbio proliferativo da medula óssea relativamente raro (por exemplo, câncer), que pertence a um grupo de doenças denominadas distúrbios mieloproliferativos. A mielofibrose é classificada no ramo de neoplasias mieloproliferativas cromossomo Filadélfia- negativas (-). A mielofibrose é caracterizada pela proliferação de um clone anormal de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea e em outros locais e resulta em fibrose, ou na substituição da medula com tecido cicatricial. O termo “mielofibrose” engloba mielofibrose primária (PMF), também denominada mielofibrose idiopática crônica (cIMF) (os termos “idiopática” e “primária” significam que, nesses casos, a doença é de origem desconhecida ou espontânea), bem como tipos secundários de mielofibrose, por exemplo, mielofibrose que se desenvolve secundária à policitemia vera (PV) ou trombocitemia essencial (ET). A mielofibrose é uma forma de metaplasia mielóide, que se refere a uma alteração no tipo de célula no tecido formador de sangue da medula óssea, e frequentemente os dois termos são usados sinonimamente. Os termos metaplasia mielóide agnogênica e mielofibrose com metaplasia mielóide (MMM) também são usados para se referirem à mielofibrose primária. A mielofibrose é caracterizada por mutações que causam supra-regulação ou hiperativação da via de JAK a jusante.

[00156] Células mielóides: Na hematopoiese, as células mielóides são células sanguíneas que surgem de uma célula progenitora para granulócitos, monócitos, eritrócitos ou plaquetas (o progenitor mielóide comum, ou seja, CMP ou CFU- GEMM) ou, em um sentido mais restrito também frequentemente usado, especificamente da linhagem do mieloblasto (os mielócitos, monócitos, e seus tipos-filhas), em contraste com células linfóides, ou seja, linfócitos, que vêem de células linfóides progenitoras comuns que dão origem às células B e células T. Certos tipos de células mielóides, sua morfologia geral, marcadores da superfície celular típicos e sua habilidade imunossupressora tanto em camundongos quanto em humanos, estão resumidos abaixo. Células Morfologia Fenótipo de Supressão mielóides típica superfície imune selecionado Camundongo Neutrófilos Formato CD11b+Ly6Ghi Ly6Clo redondo com - um núcleo segmentado Monócitos Formato CD11b+ Ly6G− Ly6Chi redondo com - um núcleo indentado

Macrófagos Formato CD11b+ F4/80hi Ly6G− redondo com Ly6Clo CD80+ - pseudopodia (M1) F4/80+ CD206+ CD163+ - (M2) Células Formato CD11b+ CD11c+ Ly6G− dendríticas dendrítico Ly6C−/lo - com (clássico) polipoidia CD11b− CD11c+ Ly6G− Ly6C− - (clássico) CD11b− CD11clo Ly6G− Ly6C+ PDCA-1+ - (plasmocitóide) Fibrócitos Fusiforme CD11b+ ColI+ Ly6G− - Ly6C+ G-MDSCs Formato CD11b+ Ly6G+ Ly6Clo (PMN-MDSCs) redondo com + um núcleo em bandas M-MDSCs Formato CD11b+ Ly6G− Ly6Chi redondo com + um núcleo indentado Humano Neutrófilos Formato CD11b+ CD14− CD15+ redondo com CD66b+ LOX-1− - um núcleo segmentado Monócitos Formato CD14+ CD15− CD16− -

redondo com HLA-DR+ um núcleo (clássico) indentado CD14+ CD15− CD16+ HLA-DR+ - (intermediário) CD14− CD15− CD16+ HLA-DR+ - (não clássico) Macrófagos Formato CD15− CD16+ CD80+ redondo com HLA-DR+ CD33+ - pseudopodia (M1) CD11b+ CD15− CD206+ CD163+ HLA-DR+ +/- (M2) Células Formato CD14− CD16− CD1C+ dendríticas dendrítico CD83+ - com (clássico) polipoidia CD14− CD16− CD141+ CD83+ - (clássico) CD14− CD16− CD303+ CD83+ - (plasmocitóide) Fibrócitos Fusiforme CD11b+ ColI+ CD13+ - CD34+ CD45RO+ HLA-DR+ G-MDSCs Formato CD11b+ CD33+ CD14− (PMN-MDSCs) redondo com CD15+ CD66b+ LOX-1+ + um núcleo anular M-MDSCs Formato CD11b+ CD33+ CD14+ + redondo com CD15− HLA-DR−/lo um núcleo indentado

[00157] Célula supressora da linhagem mielóide: Células supressoras da linhagem mielóide (MDSCs) são uma população heterogênea de células gerada durante várias condições patológicas e que supostamente representa um estado patológico de ativação de monócitos e neutrófilos relativamente imaturos. MDSCs incluem pelo menos duas categorias de células denominadas i) “granulocíticas” (G- MDSC) ou polimorfonucleares (PMN-MDSC), que são fenotipicamente e morfologicamente similares aos neutrófilos; e ii) monocíticas (M-MDSC), que são fenotipicamente e morfologicamente similares aos monócitos. MDSCs são caracterizadas por um conjunto distinto de características genômicas e bioquímicas, e podem ser distinguidas por moléculas de superfície específicas. Por exemplo, G-MDSCs/PMN-MDSCs humanas tipicamente expressam os marcadores da superfície celular CD11b, CD33, CD15 e CD66. Além disso, G-MDSCs/PMN-MDSCs humanas também podem expressar HLA-DR e/ou Arginase. Por comparação, M-MDSCs humanas tipicamente expressam os marcadores da superfície celular CD11b, CD33 e CD14. Além disso, M-MDSCs humanas também podem expressar HLA-DR. Além desses marcadores da superfície celular, MDSCs são caracterizadas pela habilidade para suprimir células imunes, por exemplo, células T, células NK e células B. funções imunossupressoras de MDSCs podem incluir a inibição da função antígeno-não-específica e inibição de função antígeno-específica. MDSCs podem expressar LRRC33 e/ou LRRC33-pró-TGFβ1 da superfície celular.

[00158] Miofibroblasto: Miofibroblastos são células com certos fenótipos de fibroblastos e células de músculo liso e geralmente expressam vimentina, alfa-actina de músculo liso (α-SMA; gene ACTA2 humano) e paladina. Em muitas condições de doença que envolvem desregulações da matriz extracelular (por exemplo, rigidez da matriz aumentada), células de fibroblastos normais se tornam desdiferenciadas em miofibroblastos de uma forma TGFβ-dependente. A superexpressão aberrante de TGFβ é comum entre patologias dirigidas por miofibroblasto. TGFβ sabidamente promove diferenciação de miofibroblastos, proliferação celular e produção de matriz. Miofibroblastos ou células do tipo miofibroblasto dentro do microambiente fibrótico podem ser chamados de fibroblastos associados à fibrose (ou “FAFs”), e miofibroblastos ou células do tipo miofibroblasto dentro do microambiente tumoral podem ser chamados de fibroblastos associados ao câncer (ou “CAFs”).

[00159] Inibidor pan-TGFβ/pan-inibição de TGFβ: O termo “inibidor pan-TGFβ” se refere a qualquer agente que seja capaz de inibir ou antagonizar todas as três isoformas de TGFβ. Um inibidor desse tipo pode ser um inibidor de pequena molécula de isoformas de TGFβ, por exemplo, aqueles conhecidos na técnica. O termo inclui anticorpo pan-TGFβ, que se refere a qualquer anticorpo capaz de se ligar a cada uma das isoformas de TGFβ, ou seja, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3. Em algumas modalidades, um anticorpo pan-TGFβ se liga e neutraliza atividades de todas as três isoformas, ou seja, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3. O anticorpo 1D11 (ou o análogo humano Fresolimumab (GC1008)) é um exemplo bem conhecido de um anticorpo pan-TGFβ que neutraliza todas as três isoformas de

TGFβ. Exemplos de inibidores pan-TGFβ de pequena molécula incluem galunisertib (monoidrato de LY2157299), que é um agonista para o TGFβ receptor I quinase/ALK5 que medeia a sinalização de todas as três isoformas de TGFβ.

[00160] Perivascular (infiltração): O prefixo “peri-” significa “em torno” “circundante” ou “perto” e, dessa forma, “perivascular” literalmente se traduz em torno dos vasos sanguíneos. Como usado nesse relatório descritivo no contexto de infiltrados de células tumorais, o termo “infiltração perivascular” se refere a um modo de entrada para células imunes infiltrantes no tumor (por exemplo, linfócitos) por meio da vasculatura de um tumor sólido.

[00161] Potência: O termo “potência”, como usado nesse relatório descritivo, se refere à atividade de um fármaco, por exemplo, um anticorpo inibidor (ou fragmento) que possui atividade inibidora, com relação à concentração ou quantidade do fármaco para produzir um efeito definido. Por exemplo, um anticorpo capaz de produzir certos efeitos em certa dosagem é mais potente do que outro anticorpo que exige o dobro da quantidade (dosagem) para produzir efeitos equivalentes. A potência pode ser medida em ensaios baseados em células, por exemplo, ensaios de ativação/inibição de TGFβ, pelos quais o grau de ativação de TGFβ, por exemplo, ativação desencadeada por ligação de integrina, pode ser medida na presença ou ausência de artigo de teste (por exemplo, anticorpos inibidores) em um sistema baseado em células. Tipicamente, entre aqueles capazes de ligação às mesmas regiões de ligação ou a regiões de ligação sobrepostas de um antígeno (por exemplo, anticorpos de bloqueio cruzado), anticorpos com afinidades maiores (valores menores da KD)

tendem a exibir potência maior do que anticorpos com afinidades menores (valores da KD maiores).

[00162] Molécula apresentadora: O termo “moléculas apresentadoras” no contexto da presente revelação se refere às proteínas que formam ligações covalentes com pró- proteínas latentes (por exemplo, pró-TGFβ1) e atam (“apresentam”) o complexo inativo a um nicho extracelular (por exemplo, ECM ou superfície da célula imune) mantendo, dessa forma, sua latência até que ocorra um evento de ativação ocorre. Moléculas apresentadoras conhecidas para pró-TGFβ1 incluem: LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33, cada um deles podendo formar um complexo molécula apresentadora-pró-TGFβ1 (ou seja, LLC), especificamente, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró- TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1, respectivamente. Na natureza, LTBP1 e LTBP3 são componentes da matriz extracelular (ECM); portanto, LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró- TGFβ1 podem ser coletivamente referidos como complexos pró- TGFβ1 “associados à ECM” (ou “associados à matriz”), que medeiam sinalização/atividades de TGFβ1 associadas à ECM. GARP e LRRC33, por outro lado, são proteínas transmembrana expressas na superfície celular de certas células; portanto, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1 podem ser coletivamente referidos como complexos pró-TGFβ1 “associados à célula” (ou “superfície celular”), que medeiam sinalização/atividades de TGFβ1 associados à célula (por exemplo, associadas às células imunes).

[00163] Proteção (de exposição ao solvente): No contexto da avaliação baseada em HDX-MS de interações proteína- proteína, por exemplo, ligação antígeno-anticorpo, o grau pelo qual uma proteína (por exemplo, uma região de uma proteína que contém um epitopo) é exposta a um solvente permitindo, dessa forma, a ocorrência de troca de prótons, se correlaciona inversamente com o grau de ligação/interação. Portanto, quando um anticorpo descrito nesse relatório descritivo se liga a uma região de um antígeno, a região de ligação é “protegida” de ser exposta ao solvente, pois a interação proteína-proteína impede que a região de ligação esteja acessível ao solvente circundante. Dessa forma, a região protegida é indicativa de um sítio de interação. Tipicamente, solventes adequados são tampões fisiológicos.

[00164] Pró-TGFβ1: O termo “pró-TGFβ1”, como usado nesse relatório descritivo, visa englobar formas precursoras de complexo TGFβ1 inativo que compreende uma sequência do pró- domínio de TGFβ1 dentro do complexo. Dessa forma, o termo pode incluir formas pró, bem como as formas latentes de TGFβ1. A expressão “TGFβ1 pró/latente” pode ser usada de forma intercambiável. A forma “pró” de TGFβ1 existe antes da clivagem proteolítica no sítio de furina. Uma vez clivada, a forma resultante é dita como sendo a forma “latente” de TGFβ1. O complexo “latente” permanece associado não- covalentemente até um gatilho adicional da ativação, por exemplo, um evento de ativação dirigido por integrina. O complexo pró-TGFβ1 é composto por polipeptídeos diméricos da pró-proteína de TGFβ1, ligados com ligações dissulfeto. O complexo dimérico latente está ligado covalentemente a uma única molécula apresentadora por meio do resíduo de cisteína na posição 4 (Cys4) de cada um dos polipeptídeos de pró- TGFβ1. O adjetivo “latente” pode ser usado geralmente/amplamente para descrever o estado “inativo” de

TGFβ1, antes do evento de ativação mediado por integrina ou outros eventos de ativação. O polipeptídeo de pró-TGFβ1 contém um pró-domínio (LAP) e um domínio do fator de crescimento (ID. DE SEQ. N°: 146).

[00165] Regressão (regressão tumoral): A regressão tumoral ou do crescimento tumoral pode ser usada como uma medida de eficácia in vivo. Por exemplo, em cenários pré- clínicos, usando o volume tumoral mediano (MTV) e Critérios para Respostas de Regressão ao Tratamento, a eficácia pode ser determinada a partir dos volumes tumorais de animais que permanecem no estudo no último dia. A eficácia do tratamento também pode ser determinada pela incidência e magnitude de respostas de regressão observadas durante o estudo. O tratamento pode causar regressão parcial (PR) ou regressão completa (CR) do tumor em um animal. A regressão completa obtida em resposta à terapia (por exemplo, administração de um fármaco) pode ser chamada de “resposta completa” e o indivíduo que obtém resposta completa pode ser chamada do um “responsivo completo”. Dessa forma, resposta completa exclui regressão completa espontânea. Em algumas modalidades de modelos pré-clínicos de tumor, uma resposta PR é definida como o volume tumoral que é 50% ou menos de seu volume do Dia 1 por três medições consecutivas durante a evolução do estudo, e igual ou maior do que 13,5 mm3 para uma ou mais dessas três medições. Em algumas modalidades, uma resposta CR é definida como o volume tumoral que é menor do que 13,5 mm3 por três medições consecutivas durante a evolução do estudo. No modelo pré-clínico, um animal com uma resposta CR no término de um estudo pode ser adicionalmente classificado como sobrevivente livre de tumor (TFS). O termo “controle tumoral eficaz” pode ser usado para se referir a um grau de regressão tumoral obtido em resposta ao tratamento, em que, por exemplo, o volume tumoral é reduzido até < 25% do volume tumoral de desfecho em resposta ao tratamento. Por exemplo, em um modelo particular, se o volume tumoral de desfecho é de 2.000 mm3, o controle tumoral eficaz é obtido se o tumor é reduzido para menos do que 500 mm3. Portanto, o controle tumoral eficaz engloba regressão completa, bem como regressão parcial que alcança a redução limiar.

[00166] Células T reguladoras: “Células T reguladoras”, ou Tregs, são caracterizadas pela expressão dos biomarcadores CD4, FOXP3 e CD25. Tregs são algumas vezes denominadas células T supressoras e representam uma subpopulação de células T que modulam o sistema imune, mantêm a tolerância a autoantígenos, e evitam doença autoimune. Tregs são imunossupressoras e geralmente suprimem ou infra- regulam a indução e proliferação de células T efetoras (Teff). Tregs podem se desenvolver no timo (as denominadas Tregs CD4+ Foxp3+ “naturais”) ou se diferenciam a partir de células T CD4+ naïve na periferia, por exemplo, após exposição ao TGFβ ou ácido retinóico. Tregs podem expressar GARP-pró-TGFβ1 da superfície celular.

[00167] Resistência (à terapia): A resistência a uma terapia particular (por exemplo, CBT) pode ser causada pelas características inatas da doença, por exemplo, câncer (“resistência primária”), ou causada por fenótipos adquiridos que se desenvolvem ao longo do tempo após o tratamento (“resistência adquirida”). Pacientes que não apresentam resposta terapêutica a uma terapia (por exemplo, aqueles que são não-responsivos ou poucos responsivos à terapia) são ditos como tendo resistência primária à terapia. Pacientes que inicialmente exibem resposta terapêutica a uma terapia, mas mais tardem perdem os efeitos (por exemplo, progressão ou recorrência, apesar da terapia continuada) são ditos como tendo resistência adquirida à terapia.

[00168] Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST) e iRECIST: RECIST é um conjunto de regras publicadas que definem quando os tumores em pacientes com câncer melhoram (“respondem”), continuam os mesmos (“estabilizam”), ou pioram (“progridem”) durante o tratamento. Os critérios foram publicados em fevereiro de 2000 por uma colaboração internacional que inclui a “European Organisation for Research and Treatment of Cancer” (EORTC), “National Cancer Institute of the United States” e o “National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group”. Subsequentemente, uma versão revisada das diretrizes da RECIST (RECIST v 1.1) foi amplamente adaptada (veja: Eisenhauera e cols. (2009), “New Answer Avaluation Criteria in Solid Tumours: Revised RECIST Guideline (version 1.1)” Eur. J. Cancer 45: 228-247, incorporado nesse relatório descritivo).

[00169] Os critérios de resposta são os seguintes: Resposta completa (CR): Desaparecimento de todas as lesões- alvo; Resposta parcial (PR): Uma diminuição de pelo menos 30% na soma da LD de lesões-alvo, tomando como referência a soma de LD na linha de base; Doença estável (SD): Sem encolhimento suficiente para qualificar para PR nem aumento suficiente para qualificar para PD, tomando como referência a menor soma de LD desde o início do tratamento; Doença progressiva (PD): Um aumento de pelo menos 20% na soma da LD de lesões-alvo, tomando como referência a menor soma de LD registrada desde o início do tratamento ou o aparecimento de uma ou mais lesões novas.

[00170] Por outro lado, iRECIST fornece um conjunto de critérios modificados que leva em conta resposta relacionada ao sistema imune (veja: www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5648544/ cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência). Os critérios de RECIST e iRECIST são padronizados, podem ser revisados de tempos em tempos à medida que mais dados se tornem disponíveis, e são bem compreendidos na técnica.

[00171] Tumor sólido: O termo “tumor sólido” se refere aos distúrbios proliferativos que resultam em um crescimento anormal ou massa anormal de tecido que normalmente não contém cistos ou áreas líquidas. Tumores sólidos podem ser benignos (não cancerosos) ou malignos (cancerosos). Tumores sólidos incluem tumores de malignidades avançadas, por exemplo, tumores sólidos localmente avançados e câncer metastático. Tumores sólidos são tipicamente formados por vários tipos de células incluindo, sem limitação, células cancerosas (malignas), células estromais, por exemplo, CAFs, e leucócitos infiltrantes, por exemplo, macrófagos, MDSCs e linfócitos. Os tumores sólidos a serem tratados com um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, são tipicamente tumores TGFβ1-positivos (TGFβ1+), que podem incluir vários tipos de células que produzem TGFβ1. Em certas modalidades, o tumor TGFβ1+ também pode co-expressar TGFβ3 (ou seja, TGFβ3-positivo). Por exemplo, certos tumores são TGFβ1/3- codominantes. Em algumas modalidades, esses tumores são causados por câncer de células epiteliais, por exemplo, carcinoma.

[00172] Titulação de Solução em Equilíbrio (SET): A SET é um ensaio pelo qual a ligação entre duas moléculas (por exemplo, um antígeno e um anticorpo que se liga ao antígeno) pode ser medida em equilíbrio em uma solução. Por exemplo, SET baseada em Descoberta de Mesoescala (“MSD”), ou MSD-SET, é um modo útil de determinação de constantes de dissociação para interações proteína-proteína de afinidade particularmente alta em equilíbrio, por exemplo, a ligação de anticorpos de afinidade picomolar aos seus antígenos (veja, por exemplo: Ducata e cols. (2015) J. Biomolecular Screening 20 (10): 1.256-1.267). Os ensaios baseados em SET são particularmente úteis para determinação de valores da KD de anticorpos com afinidades subnanomolares (por exemplo, picomolar).

[00173] Ligação específica: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligação específica” ou “se liga especificamente” significa que a interação do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, com um antígeno é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epitopo). Por exemplo, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, se liga a uma proteína específica ao invés de às proteínas de forma geral. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, se liga especificamente a um alvo, por exemplo, TGFβ1, se o anticorpo possui uma KD para o alvo de pelo menos cerca de 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10- 11 M, 10-12 M, ou menos. Em algumas modalidades, o termo “ligação específica a um epitopo de pró-TGFβ1”, “se liga especificamente a um epitopo de pró-TGFβ1”, “ligação específica ao TGFβ1”, ou “se liga especificamente ao pró- TGFβ1”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga ao pró-TGFβ1 e possui uma constante de dissociação (KD) de 1,0 x 10-8 M ou menos, como determinado por ensaios de ligação in vitro adequados, por exemplo, ressonância de plasmônio de superfície e Interferometria de Biocamada (BLI). Em uma modalidade, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, pode se ligar especificamente a ortólogos tanto humanos quanto não humanos (por exemplo, de camundongo) de pró-TGFβ1.

[00174] Indivíduo: O termo “indivíduo”, no contexto de aplicações terapêuticas, se refere a um indivíduo que recebe cuidados ou intervenção clínica, por exemplo, tratamento, diagnóstico etc. Indivíduos adequados incluem vertebrados incluindo, sem limitação, mamíferos (por exemplo, mamíferos humanos e não humanos). Quando o indivíduo é um indivíduo humano, o termo “paciente” pode ser usado de forma intercambiável. Em um contexto clínico, o termo “uma população de pacientes” ou “subpopulação de pacientes” é usado para se referir a um grupo de indivíduos que se enquadra dentro de um conjunto de critérios, por exemplo, critérios clínicos (por exemplo, apresentações de doença, estágios de doença, suscetibilidade a certas condições, responsividade à terapia etc.), história médica, estado de saúde, sexo, faixa etária, critérios genéticos (por exemplo, portador de certa mutação, polimorfismo, duplicações de genes, repetições de sequência de DNA etc.) e fatores ligados ao estilo de vida (por exemplo, tabagismo, consumo de álcool,

exercícios etc.).

[00175] Ressonância de plásmon de superfície (SPR): Ressonância de plásmon de superfície é um fenômeno óptico que permite a detecção de interagentes não marcados em tempo real. Os biossensores baseados em SPR, tais como aqueles disponíveis comercialmente por Biacore, podem ser empregados para medir interações biomoleculares, incluindo interações proteína-proteína, por exemplo, ligação antígeno-anticorpo. A tecnologia é amplamente conhecida na técnica e é útil para a determinação de parâmetros como, por exemplo, afinidades de ligação, constantes da taxa cinética e termodinâmica.

[00176] Indicação relacionada ao TGFβ1: Uma “indicação relacionada ao TGFβ1” é um distúrbio associado ao TGFβ1 e significa qualquer doença ou distúrbio, e/ou condição, na qual pelo menos parte da patogênese e/ou progressão é atribuível à sinalização de TGFβ1 ou sua desregulação. Certos distúrbios associados ao TGFβ1 são dirigidos predominantemente pela isoforma TGFβ1. Indivíduos que possuem uma indicação relacionada ao TGFβ1 podem se beneficiar da inibição da atividade e/ou níveis de TGFβ1. Certas indicações relacionadas ao TGFβ1 são dirigidas predominantemente pela isoforma TGFβ1. Indicações relacionadas ao TGFβ1 incluem, sem limitação: condições fibróticas (por exemplo, fibrose de órgão, e fibrose de tecidos que envolve inflamação crônica), distúrbios proliferativos (por exemplo, câncer, por exemplo, tumores sólidos e mielofibrose), doença associada à desregulação da ECM (por exemplo, condições que envolvem enrijecimento e remodelagem da matriz), doença que envolve transição mesenquimal (por exemplo, EndMT e/ou EMT), doença que envolve proteases, doença com expressão gênica aberrante de certos marcadores descritos nesse relatório descritivo. Essas categorias de doenças não visam ser mutualmente exclusivas.

[00177] Inibidor de TGFβ: O termo “inibidor de TGFβ” se refere a qualquer agente capaz do antagonismo de atividades biológicas, sinalização ou função do fator de crescimento TGFβ (por exemplo, TGFβ1, TGFβ2 e/ou TGFβ3). O termo não visa limitar seu mecanismo de ação e inclui, por exemplo, inibidores neutralizantes, antagonistas de receptor, armadilhas de ligante solúvel e inibidores da ativação de TGFβ. Inibidores de TGFβ também incluem anticorpos que são capazes de reduzir a disponibilidade de pró-TGFβ latente que pode ser ativado no nicho, por exemplo, por indução de citotoxicidade mediada por células anticorpo-dependente (ADCC), e/ou fagocitose celular anticorpo-dependente (ADPC), além de anticorpos que resultam em internalização de complexo da superfície celular que compreende pró-TGFβ latente removendo, dessa forma, o precursor da membrana plasmática sem depleção das células propriamente ditas. A internalização pode ser um mecanismo de ação adequado para complexos de proteínas que contêm LRRC33 (por exemplo, LRRC33-pró-TGFβ1 humano) que resulta em níveis reduzidos de células que expressam complexos de proteínas que contêm LRRC33 na superfície celular.

[00178] A “família TGFβ” é uma classe dentro da superfamília TGFβ e, em humanos, contém três membros: TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3, que são estruturalmente similares. Os três fatores de crescimento sabidamente sinalizam por meio dos mesmos receptores.

[00179] Câncer/tumor TGFβ1-positivo: O termo, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um câncer/tumor com expressão aberrante de TGFβ1 (superexpressão). Muitos tipos de câncer/tumor humano exibem expressão predominante da isoforma TGFβ1 (observe que “TGFB” é algumas vezes usado para se referir ao gene, ao contrário de proteína). Em alguns casos, esse câncer/tumor pode exibir expressão codominante de outra isoforma, por exemplo, TGFβ3. Diversos cânceres epiteliais (por exemplo, carcinoma) podem co-expressar TGFβ1 e TGFβ3. Dentro do ambiente tumoral de tumores TGFβ1- positivos, TGFβ1 pode surgir de múltiplas fontes incluindo, por exemplo, células de câncer, macrófagos associados ao tumor (TAMs), fibroblastos associados ao câncer (CAFs), células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSCs), e da matriz extracelular circundante (ECM). No contexto da presente revelação, modelos pré-clínicos de câncer/tumor que recapitulam condições humanas são cânceres/tumores TGFβ1-positivos.

[00180] Janela terapêutica: O termo “janela terapêutica” se refere a uma faixa de dosagem que produz resposta terapêutica sem causar efeito adverso significante/observável /inaceitável (por exemplo, dentro de efeitos adversos que são aceitáveis ou toleráveis) em indivíduos. A janela terapêutica pode ser calculada como uma proporção entre concentrações eficazes mínimas (MEC) para as concentrações tóxicas mínimas (MTC). Para ilustrar, um inibidor de TGFβ1 que obtém eficácia in vivo na dosagem de 10 mg/kg e mostra tolerabilidade ou toxicidades aceitáveis a 100 mg/kg fornece uma janela terapêutica de pelo menos 10 vezes (por exemplo, 10x). Em contraste, um inibidor pan-TGFβ que é eficaz a 10 mg/kg, mas causa efeitos adversos em uma doe menor do que a dose eficaz é dito que tem “toxicidades limitantes da dose”. Geralmente, a dose maximamente tolerada (MTD) pode definir o limite superior da janela terapêutica.

[00181] Por exemplo, Ab6 demonstrou ser eficaz em uma dosagem que varia entre cerca de 3-30 mg/kg/semana e demonstrou ser livre de toxicidades observáveis associadas à pan-inibição de TGFβ na dosagem de pelo menos 100 ou 300 mg/kg/semana por 4 semanas em ratos ou primatas não humanos. Com base nisso, Ab6 mostra uma janela terapêutica mínima de

3.3 vezes e até 100 vezes.

[00182] Toxicidade: Como usado nesse relatório descritivo, o termo “toxicidade” ou “toxicidades” se refere aos efeitos indesejados in vivo em indivíduos (por exemplo, pacientes) associados a uma terapia administrada indivíduos (por exemplo, pacientes), por exemplo, efeitos colaterais e eventos adversos indesejáveis. “Tolerabilidade” se refere a um nível de toxicidades associado a uma terapia ou regime terapêutico, que pode ser razoavelmente tolerado pelos pacientes, sem suspender a terapia em consequência das toxicidades. Tipicamente, são realizados estudos de toxicidade/toxicologia em um ou mais modelos pré-clínicos antes do desenvolvimento clínico para avaliar os perfis de segurança de um candidato a fármaco (por exemplo, terapia com anticorpo monoclonal). Estudos de toxicidade/toxicologia podem ajudar a determinar o “nível de efeito adverso não observado (NOAEL)” e a “dose maximamente tolerada (MTD)” de um artigo de teste, com base nestes uma janela terapêutica pode ser deduzida. De preferência, uma espécie que se mostrou sensível à intervenção particular deve ser escolhida como um modelo animal pré-clínico no qual um estudo de segurança/toxicidade deve ser realizado. Em caso de inibição de TGFβ, espécies adequadas incluem ratos, cães e símios. Camundongos são relatados como sendo menos sensíveis à inibição farmacológica de TGFβ e podem não revelar toxicidades que são potencialmente perigosas em outras espécies, incluindo humanos, embora certos estudos relatem toxicidades observadas com pan-inibição de TGFβ em camundongos. Para ilustrar, no contexto da presente revelação, o NOAEL para Ab6 em ratos foi a maior dose avaliada (100 mg/kg), sugerindo que a MTD é > 100 mg/kg, com base em um estudo de toxicologia de quatro semanas. A MTD de Ab6 em primatas não humanos é de > 300 mg/kg com base em um estudo de toxicologia de quatro semanas.

[00183] Para a determinação de NOAELs e MTDs, preferivelmente, uma espécie que mostrou ser sensível à intervenção particular deve ser escolhida como um modelo animal pré-clínico no qual o estudo de segurança/toxicologia deve ser realizado. Em caso de inibição de TGFβ, espécies adequadas incluem, sem limitação, ratos, cães e símios. Camundongos são relatados como sendo menos sensíveis à inibição farmacológica de TGFβ e podem não revelar toxicidades que são potencialmente sérias ou perigosas em outras espécies, incluindo humanos.

[00184] Traduzibilidade: No contexto de descoberta e desenvolvimento clínico de fármacos, o termo “traduzibilidade” ou “traduzível” se refere a certa qualidade ou propriedade de modelos ou dados pré-clínicos que recapitulam condições humanas. Como usado nesse relatório descritivo, um modelo pré-clínico que recapitula uma indicação de TGFβ1 tipicamente mostra expressão predominante de TGFB1 (ou TGFβ1), em relação a TGFB2 (ou TGFβ2) e TGFB3 (ou TGFβ3). Em paradigmas de terapia combinada, por exemplo, a traduzibilidade pode exigir os mesmos mecanismos de ação subjacentes que a combinação de ativos visa efetuar no modelo. Como um exemplo, muitos tumores humanos são imuno-excluídos, tumores TGFβ1-positivos que exibem resistência primária a uma terapia de bloqueio do ponto de verificação (CBT). Uma segunda terapia (por exemplo, inibidores de TGFβ1) pode ser usada em combinação para superar a resistência à CBT. Nesse cenário, modelos pré- clínicos traduzíveis adequados incluem tumores TGFβ1- positivos que exibem resistência primária a uma terapia de bloqueio do ponto de verificação (CBT).

[00185] Tratar/tratamento: O termo “tratar” e “tratamento” inclui tratamentos terapêuticos, tratamentos profiláticos, e aplicações nas quais se reduz o risco de que um indivíduo desenvolverá um distúrbio ou outro fator de risco. Dessa forma, o termo significa amplamente: causar benefícios terapêuticos em um paciente, por exemplo, por aumento ou reforço da imunidade do corpo; reduzir ou reverter supressão imune; reduzir, remover ou erradicar células ou substâncias danosas do corpo; reduzir a carga da doença (por exemplo, carga tumoral); evitar a recorrência ou recidiva; prolongar um período refratário e/ou, de algum outro modo, aumentar a sobrevida. O termo inclui tratamentos terapêuticos, tratamentos profiláticos, e aplicações nas quais se reduz o risco de que um indivíduo desenvolverá um distúrbio ou outro fator de risco. O tratamento não exige a cura completa de um distúrbio e engloba modalidades nas quais se reduz os sintomas ou fatores de risco subjacentes. No contexto de terapia combinada, o termo também pode ser referir: i) à habilidade de uma segunda terapêutica para reduzir a dosagem eficaz de uma primeira terapêutica, de modo a reduzir os efeitos colaterais e aumentar a tolerabilidade; ii) a habilidade de uma segunda terapia para tornar o paciente mais responsivo a uma primeira terapia; e/ou iii) a habilidade para efetuar benefícios clínicos aditivos ou sinérgicos.

[00186] Macrófago associado ao tumor (TAM): TAMs são macrófagos polarizados/ativados com fenótipos pró-tumorais (macrófagos do tipo M2). TAMs podem ser monócitos/macrófagos originados da medula recrutados para o local de tumor ou macrófagos residentes no tecido que são derivados de progenitores eritromielóides. A diferenciação de monócitos/macrófagos em TAMs é influenciada por diversos fatores, incluindo sinais químicos locais como, por exemplo, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e outras moléculas que atuam como ligantes, bem como interações célula-célula entre os monócitos/macrófagos que estão presentes no nicho (microambiente tumoral). Geralmente, monócitos/macrófagos podem ser polarizados nos denominados subtipos “M1” ou “M2”, o último estando associado com fenótipo mais pró-tumoral. Em um tumor sólido, até 50% da massa tumoral podem corresponder a macrófagos, que são preferencialmente M2-polarizados. Entre populações de monócitos e células mielóides associados ao tumor, macrófagos M1 tipicamente expressam HLA-DR, CD68 e CD86 da superfície celular, enquanto macrófagos M2 tipicamente expressam HLA-DR, CD68, CD163 e CD206 da superfície celular. Macrófagos do tipo M2 associados ao tumor (por exemplo,

subtipos M2c e M2d) podem expressar LRRC33 e/ou LRRC33-pró- TGFβ1 da superfície celular.

[00187] Microambiente tumoral: O termo “microambiente tumoral (TME)” se refere a um nicho de doença local, no qual um tumor (por exemplo, tumor sólido) reside in vivo. O TME pode compreender assinatura molecular associada à doença (um conjunto de quimiocinas, citocinas etc.), populações de células associadas à doença (por exemplo, TAMs, CAFs, MDSCs etc.), bem como ambientes da ECM associados à doença (alterações em componentes e/ou estrutura da ECM).

[00188] Região variável: O termo “região variável” ou “domínio variável” se refere a uma porção das cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo, incluindo tipicamente aproximadamente os 120 a 130 aminoácidos do terminal amino na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos do terminal amino na cadeia leve. Em certas modalidades, as regiões variáveis de anticorpos diferentes diferem intensamente em termos de sequência de aminoácidos, até mesmo entre anticorpos da mesma espécie. A região variável de um anticorpo tipicamente determina a especificidade de um anticorpo particular por seu alvo.

[00189] Exceto nos exemplos operacionais, ou quando indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação usados nesse relatório descritivo devem ser subentendidos como modificados em todas as ocorrências pelo termo “cerca de”. O termo “cerca de”, quando usado em conexão com percentagens, pode significar ± 1%.

[00190] Os artigos indefinidos “um” e “uma”, como aqui usados e no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que indicado claramente o contrário, devem ser subentendidos como significando “pelo menos um”.

[00191] A frase “e/ou”, como aqui usada e no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser subentendido como significando “um ou ambos” dos elementos assim coligados, ou seja, elementos que estão conjuntamente presentes em alguns casos e separadamente presentes em outros casos. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados pela cláusula “e/ou”, estejam ou não relacionados àqueles especificamente identificados, a menos que indicado claramente o contrário. Dessa forma, como um exemplo não limitante, uma referência a “A e/ou B”, quando usada em conjunto com linguagem em aberto como, por exemplo, “que compreende”, pode se referir, em uma modalidade, a A sem B (incluindo opcionalmente elementos diferentes de B); em outra modalidade, a B sem A (incluindo opcionalmente elementos diferentes de A); ainda em outra modalidade, tanto A quanto B (incluindo opcionalmente outros elementos); etc.

[00192] Como usada aqui e no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase “pelo menos um”, em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser subentendida como significando pelo menos um elemento selecionado de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não incluindo necessariamente pelo menos um de cada e todos os elementos especificamente listados dentro da lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Essa definição também permite que elementos possam opcionalmente estar presentes além dos elementos especificamente identificados dentro da lista de elementos à qual a frase “pelo menos um” se refere, estejam ou não relacionados àqueles elementos especificamente identificados. Dessa forma, como um exemplo não limitante, “pelo menos um de A e B” (ou, equivalentemente, “pelo menos um de A ou B” ou, equivalentemente “pelo menos um de A e/ou B”) pode se referir, em uma modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A, sem B presente (e incluindo opcionalmente elementos diferentes de B); em outra modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, B, sem A presente (e incluindo opcionalmente elementos diferentes de A); ainda em outra modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A, e pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, B (e incluindo opcionalmente outros elementos); etc.

[00193] O uso de termos ordinais como, por exemplo, “primeiro”, “segundo”, “terceiro” etc., nas reivindicações para modificar um elemento da reivindicação não significa, por si só, nenhuma prioridade, precedência ou ordem de um elemento da reivindicação em relação a outro ou a ordem temporal na qual ações de um método são realizadas, mas são usados simplesmente como marcadores para distinguir um elemento da reivindicação que possui certo nome de outro elemento que possui um mesmo nome (mas para uso do termo ordinal) para distinguir os elementos da reivindicação.

[00194] Subentende-se que faixas fornecidas nesse relatório descritivo são uma forma abreviada para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, subentende-se que uma faixa de 1 a 50 inclui qualquer número, combinação de números, ou subfaixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50, por exemplo, 10-20, 1-10, 30-40 etc. Fator de Transformação de Crescimento-beta (TGFβ)

[00195] As atividades do Fator de Transformação de Crescimento-beta (TGFβ) e subsequente purificação parcial dos fatores de crescimento solúveis foram descritas primeiro no final da década de 1970 e no início da década de 1980 e, portanto, o campo do TGFβ começou há aproximadamente 40 anos. Até hoje, foram identificados 33 produtos gênicos que constituem a grande superfamília TGFβ. A superfamília TGFβ pode ser categorizada em pelo menos três subclasses por similaridades estruturais: TGFβs, Fatores de Diferenciação do Crescimento (GDFs) e Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs). A subclasse TGFβ é composta por três isoformas altamente conservadas, especificamente, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3, que são codificadas por três genes separados em humanos.

[00196] Acredita-se que os TGFβs desempenhem papéis cruciais em diversos processos, por exemplo, inibição da proliferação celular, remodelagem da matriz extracelular (ECM) e homeostasia imune. A importância de TGFβ1 para a homeostasia de células T é demonstrada pela observação de que camundongos TGFβ1-/- sobrevivem apenas 3-4 semanas, sucumbindo a falências múltiplas em decorrência de ativação imune maciça (Kulkarni, A.B., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993. 90 (2): páginas 770-4; Shull, M.M., e cols., Nature, 1992. 359 (6397): páginas 693-9). Os papéis de TGFβ2 e TGFβ3 são menos claros. Embora as três isoformas de TGFβ tenham padrões temporais e espaciais de expressão distintos, elas sinalizam por meio dos mesmos receptores, TGFβRI e TGFβRII, embora, em alguns casos, por exemplo, para sinalização de TGFβ2, receptores do tipo III como, por exemplo, beta-glicano, também sejam necessários (Feng, X.H. e R. Derynck, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 2005. 21: páginas 659-93; Massague, J., Annu. Rev. Biochem., 1998. 67: páginas 753-91). A oligomerização induzida por ligante de TGFβRI/II desencadeia a fosforilação de fatores de transcrição de SMAD, resultando na transcrição de genes-alvo, por exemplo, Col1a1, Col3a1, ACTA2 e SERPINE1 (Massague, J., J. Seoane, e D. Wotton, Genes Dev., 2005. 19 (23): páginas 2.783-810). Também foram descritas vias de sinalização de TGFβ SMAD- independentes, por exemplo, no câncer ou nas lesões aórticas de camundongos com Marfan (Derynck, R. e Y.E. Zhang, Nature,

2003. 425 (6958): páginas 577-84; Holm, T.M., e cols., Science, 2011. 332 (6027): páginas 358-61).

[00197] A importância biológica da via de TGFβ em humanos foi validada por doenças genéticas. A doença de Camurati- Engelman resulta em displasia óssea em função de uma mutação autossômica dominante no gene de TGFB1, levando à ativação constitutiva da sinalização de TGFβ1 (Janssens, K., e cols., J. Med. Genet., 2006. 43 (1): páginas 1-11). Pacientes com síndrome de Loeys/Dietz carregam mutações autossômicas dominantes em componentes da via de sinalização de TGFβ, que causam aneurisma aórtico, hipertelorismo e úvula bífida (Van Laer, L., H. Dietz, e B. Loeys, Adv. Exp. Med. Biol., 2014. 802: páginas 95-105). As via de desregulação de TGFβ foram implicadas em várias doenças, vários fármacos que alvejam a via de TGFβ foram desenvolvidos e testados em pacientes, mas com sucesso limitado.

[00198] A desregulação da sinalização de TGFβ foi associada a uma ampla gama de doenças humanas. Na verdade, em diversas condições de doença, essa desregulação pode envolver várias facetas da função de TGFβ. Tecido doente, por exemplo, tecidos e tumores fibróticos e/ou inflamados, podem criar um ambiente local no qual a ativação de TGFβ pode causar exacerbação ou progressão da doença, que é, pelo menos em parte, mediada por interações entre várias células responsivas ao TGFβ, que são ativadas de uma forma autócrina e/ou parácrina, junto com várias outras citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento que desempenham um papel em um quadro de doença particular.

[00199] Por exemplo, um microambiente tumoral (TME) contém vários tipos de células que expressam TGFβ1, por exemplo, fibroblastos miofibroblasto-like ativados, células estromais, macrófagos infiltrantes, MDSCs e outras células imunes, além de células de câncer (ou seja, malignas). Dessa forma, o TME representa uma população heterogênea de células que expressam e/ou responsivas ao TGFβ1, mas em associação com mais de um tipo de moléculas apresentadoras, por exemplo, LTBP1, LTBP3, LRRC33 e GARP, dentro do nicho.

[00200] Avanços em imunoterapia transformaram a paisagem de tratamento eficaz para um número crescente de pacientes com câncer. As mais proeminentes são as terapias de bloqueio do ponto de verificação (CBT), que agora se tornaram parte dos regimes de padrão de cuidados para um número crescente de cânceres. Embora tenham sido observadas respostas profundas e duráveis à CBT através de um número crescente de tipos de câncer, está agora claro que uma fração significante de tumores parece ser refratária à CBT, até mesmo no início do tratamento e, dessa forma, apontando para a resistência primária como um desafio importante para habilitar os sistemas imunes de muitos pacientes para alvejar e eliminar células tumorais. Foram feitos esforços para compreender e abordar os mecanismos subjacentes que conferem resistência primária à CBT a fim de ampliar a eficácia do tratamento para um número maior de pacientes. No entanto, esse entusiasmo foi freado por resultados medíocres do experimento clínico e insucessos quando se combinam CBTs com agentes que sabidamente afetam o mesmo tipo de tumor ou para modular componentes aparentemente relevantes do sistema imune. Uma razão provável é que uma lógica mecanística nítida para certa combinação frequentemente não está consolidada em dados derivados clinicamente e, dessa forma, levaram a desfechos incertos e confusos em experimentos destinados a aprimorar terapias com agente único aprovadas. Ficou nítido que o design de imunoterapia combinada deve ser enraizado em evidências cientificas de relevância para o tumor subjacente e biologia do sistema imune.

[00201] Recentemente, um fenômeno denominado “exclusão imune” foi cunhado para descrever um ambiente tumoral do qual células T efetoras antitumorais (por exemplo, células T CD8+) são mantidas afastadas (e, dessa forma, “excluídas”) por pistas imunossupressoras locais. Mais recentemente, diversas análises retrospectivas de tumores derivados clinicamente implicaram a ativação da via de TGFβ na mediação de resistência primária à CBT. Por exemplo, o perfilamento transcricional e a análise de biópsias de melanoma pré- tratamento revelaram um enriquecimento de vias e processos biológicos associados ao TGFβ em tumores que são não-

responsivos à CBT anti-PD-1. Em um tumor imuno-excluído, células efetoras, que de outro modo seriam capazes de atacar células de câncer por reconhecimento de antígenos tumorais da superfície celular, são impedidas de ganhar acesso ao local de células de câncer. Dessa forma, células de câncer evadem da imunidade do hospedeiro e de terapêuticas imuno- oncológicas, por exemplo, inibidores do ponto de verificação, que exploram e se baseiam nessa imunidade. Na verdade, esses tumores exibem resistência à inibição do ponto de verificação, por exemplo, anticorpos anti-PD-1 e anti-PD- L1, presumivelmente porque células-alvo T são bloqueadas de entrar no tumor e, desse modo, não exercem efeitos anticâncer.

[00202] Diversas análises retrospectivas de tumores derivados clinicamente apontam para a ativação da via de TGFβ na mediação de resistência primária à CBT. Por exemplo, o perfilamento transcricional e a análise de biópsias de melanoma pré-tratamento revelaram um enriquecimento de vias e processos biológicos associados ao TGFβ em tumores que são não-responsivos à CBT anti-PD-1. Mais recentemente, análises similares de tumores de pacientes com câncer urotelial metastático revelaram que a ausência de resposta ao bloqueio de PD-L1 com atezolizumab estava associada com assinaturas transcricionais de sinalização de TGFβ, particularmente em tumores nos quais células T CD8+ parecem ser excluídas da entrada no tumor. O papel crucial da sinalização de TGFβ na mediação de exclusão imune que resulta em resistência a anti- PD-(L)1 foi verificado no modelo em camundongo singênico de câncer de mama EMT-6. Embora os tumores EMT-6 sejam fracamente responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-

PD-L1, a combinação desse inibidor do ponto de verificação com 1D11, um anticorpo que bloqueia a atividade de todas as isoformas de TGFβ, resultou em um aumento profundo na frequência de respostas completas, quando comparado com o tratamento com inibidores individuais. É proposto que a atividade antitumoral sinérgica seja causada por uma alteração no fenótipo de fibroblasto associado ao câncer (CAF) e uma quebra do fenótipo imuno-excluído, resultando em infiltração de células T CD8+ ativadas nos tumores. Resultados similares foram encontrados em um modelo murídeo de câncer cólon-retal e metástase usando uma combinação de um anticorpo anti-PD-L1 com galunisertib, um inibidor de pequena molécula do receptor de TGFβ tipo I ALK5 quinase. Coletivamente, esses achados sugerem que a inibição da via de TGFβ em tumores resistentes à CBT poderia ser uma abordagem promissora para aprimorar ou aumentar o número de respostas clínicas à CBT. Embora trabalho recente tenha implicado um relacionamento entre ativação da via de TGFβ e resistência primária à CBT, a sinalização de TGFβ há muito foi ligada às características da patogênese do câncer. Como um fator imunossupressor potente, TGFβ impede a atividade antitumoral de célula T e promove macrófagos imunossupressores. Células malignas frequentemente se tornam resistentes à sinalização de TGFβ como um mecanismo para evadir seu crescimento e efeitos tumor-supressores. TGFβ ativa CAFs, induzindo produção da matriz extracelular e promoção de progressão tumoral. Finalmente, TGFβ induz EMT dando suporte, dessa forma, à invasão do tecido e metástases do tumor.

[00203] Mamíferos possuem genes distintos que codificam e expressam os três fatores de crescimento TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3, todos sinalizando por meio do mesmo complexo receptor de TGFβ heteromérico. Apesar da via de sinalização comum, cada isoforma de TGFβ parece ter funções biológicas distintas, como evidenciado pelos fenótipos não sobrepostos em camundongo de knockout de TGFβ. Todas as três isoformas de TGFβ são expressas como complexos inativos pró-domínio- fator de crescimento, nos quais o pró-domínio de TGFβ, também denominado peptídeo associado à latência (LAP), envolve seu fator de crescimento e o mantém em um estado latente, não- sinalizador. Além disso, TGFβ latente é co-expresso com proteínas de ligação ao TGFβ latente e forma complexos latentes grandes (LLCs) por meio de ligação dissulfeto. A associação de TGFβ latente com Proteína de Ligação ao TGFβ Latente-1 (LTBP1) ou LTBP3 permite a adesão à matriz extracelular, enquanto associação às proteínas transmembrana GARP ou LRRC33 permite a elaboração na superfície de Tregs ou macrófagos, respectivamente. In vivo, TGFβ1 latente e TGFβ3 latente são ativados por um subconjunto de integrinas αV, que se ligam a uma sequência RGD de consenso em LAP, desencadeando uma alteração conformacional para liberar o fator de crescimento. O mecanismo pelo qual TGFβ2 latente é ativado é menos nítido, na medida em que ele não possui um motivo RGD de consenso. A liberação de TGFβ1 por clivagem proteolítica de LAP também foi implicada como um mecanismo de ativação, mas sua relevância biológica é menos nítida.

[00204] Embora o papel patogênico da ativação de TGFβ seja claro em vários estados de doença, é igualmente claro que o direcionamento terapêutico da via de TGFβ foi desafiador devido aos efeitos pleiotrópicos que resultam da inibição ampla e sustentada da via. Por exemplo, diversos estudos demonstraram que a inibição mediada por pequena molécula do receptor de TGFβ tipo I quinase ALK5 (TGFΒR1) ou o bloqueio de todos os três fatores de crescimento TGFβ altamente relacionados com um anticorpo de alta afinidade resultou em valvulopatias cardíacas severas em camundongos, ratos e cães. Essas abordagens “pan”-TGFβ que bloqueiam a sinalização de todos os TGFβ, portanto, possuem uma janela terapêutica muito estreita, que provou ser um impedimento para o tratamento de diversos processos relevantes para doença com necessidade médica não atendida muito alta. Nenhuma terapia direcionada ao TGFβ foi aprovada até hoje e os resultados do experimento clínico com essas modalidades foram em grande parte desapontadores, provavelmente em decorrência do uso do que se provaram regimes de dosagem ineficazes que eram necessários a fim de acomodar preocupações de segurança.

[00205] As preocupações de segurança que surgem com a inibição ampla de TGFβ, junto com as evidências convincentes para um papel crucial para essa via em vários processos de doença, sugerem que uma melhor compreensão dos papéis específicos desempenhados por um ou mais membros da família TGFβ na patologia da doença pode levar a uma avenida viável para intervenção terapêutica. Com relação ao TGFβ e às respostas à CBT, nesse relatório descritivo observamos a expressão prevalente de TGFβ1 em muitos tumores humanos, sugerindo que esse membro da família pode ser o condutor crucial da contribuição dessa via para a resistência primária.

[00206] Como mencionado acima, evidências crescentes sugerem que TGFβ pode ser o participante primário na criação e/ou manutenção de imunossupressão em tecidos doentes, incluindo no ambiente tumoral imuno-excluído.

Portanto, a inibição de TGFβ pode desbloquear a imunossupressão e permitir que as células T efetoras (particularmente células T citotóxicas CD8+) acessem e matem células de câncer-alvo.

Além da infiltração tumoral, a inibição de TGFβ também pode promover expansão de células T CD8+. Essa expansão pode ocorrer nos linfonodos e/ou no tumor (intratumoral). Embora o mecanismo exato subjacente a esse processo ainda precise ser elucidado, é contemplado que a imunossupressão é, pelo menos em parte, mediada por ativação de TGFβ1 associada às células imunes que envolvem células T reguladoras e macrófagos ativados.

Foi relatado que TGFβ promove diretamente a expressão de Foxp3 em células T CD4+ convertendo-as, dessa forma, em um fenótipo regulador (imunossupressor) (ou seja, Treg). Além disso, Tregs suprimem a proliferação de células T efetoras (veja, por exemplo, a FIG. 26B) reduzindo, dessa forma, respostas imunes.

Esse processo mostrou ser TGFβ1-dependente e provavelmente envolve sinalização de TGFβ1 associada à GARP.

Observações tanto em humanos quanto em modelos animais indicaram que um aumento em Tregs no TME está associado com prognóstico pobre em vários tipos de câncer.

Além disso, o Requerente demonstrou previamente que macrófagos-M2 polarizados expostos a fatores derivados do tumor como, por exemplo, M-CSF, supra-regulam dramaticamente a expressão na superfície celular de LRRC33, que é uma molécula apresentadora para TGFβ1 (veja, por exemplo: PCT/US2018/031759). Acredita-se que esses chamados macrófagos associados ao tumor (ou TAMs) contribuam para a imunossupressão TGFβ1-dependente observada em TMEs e promovem crescimento tumoral.

[00207] Diversos tumores sólidos são caracterizados por terem estroma tumoral enriquecido com miofibroblastos ou células do tipo miofibroblasto. Essas células produzem matriz colagenosa que circunda ou enclausura o tumor (por exemplo, desmoplasia), o que, pelo menos em parte, pode ser causado por sinalização hiperativa de TGFβ1. É contemplado que a ativação de TGFβ1 é mediada por meio de moléculas apresentadoras associadas à ECM, por exemplo, LTBP1 e LTBP3, no estroma tumoral.

[00208] O Requerente revelou previamente anticorpos capazes de inibir a ativação de TGFβ1 em muitos desses contextos biológicos que mostraram efeitos promissores tanto in vitro quanto in vivo (veja, por exemplo, PCT/US2018/012601). O desafio permanece, no entanto, para: i) o desenvolvimento de um anticorpo aprimorado que mostre menos viés em afinidades para vários complexos de antígenos a fim de assegurar efeitos inibidores uniformemente através de diferentes contextos ou nichos biológicos nos quais TGFβ1 associado à doença reside, e/ou, ii) o desenvolvimento de um anticorpo desse tipo forneça potência ainda maior do que a contraparte descrita previamente.

[00209] Para o trabalho apresentado nesse relatório descritivo, foi contemplado que anticorpos aprimorados devem incorporar todas ou a maioria das seguintes características: 1) seletividade contra TGFβ1 deve ser mantida para minimizar toxicidades indesejadas associadas à pan-inibição (“isoforma-seletividade”) (veja, por exemplo,

PCT/US2017/021972); 2) devem exibir atividades de ligação amplas através de vários contextos biológicos, ou tanto para categorias associadas à matriz quanto para categorias associadas à célula (“contexto-independente”); 3) devem obter afinidades mais iguais ou imparciais através de múltiplos complexos de antígenos (“uniformidade”); 4) devem exibir atividades de ligação fortes para cada um dos complexos de antígenos, (“alta afinidade”); e, 5) devem ter atividades inibidoras robustas para cada contexto (“potência”). Além disso, o mecanismo de ação preferido é inibir a etapa de ativação, de modo que o inibidor possa alvejar um complexo TGFβ1 latente, ligado ao tecido, de modo a evitar preventivamente eventos de ativação a jusante para obter efeitos duráveis, ao invés de alvejarem diretamente fatores de crescimento solúveis/livres (“durabilidade”). Como revelado em mais detalhe nesse relatório descritivo, os inibidores aprimorados de TGFβ1, inéditos, da presente revelação são inibidores altamente potentes e altamente seletivos da ativação de TGFβ1 latente.

Dados apresentados nesse relatório descritivo demonstram, inter alia, que esse mecanismo de inibição isoforma-específica é suficiente para superar a resistência primária ao anti-PD-1 em modelos em camundongo singênico que recapitulam intimamente algumas das características de resistência primária à CBT encontrada em cânceres humanos.

Junto com o perfil de segurança pré-clínico aprimorado desses anticorpos, comparados com inibidores “pan”-TGFβ, esses dados de eficácia fornecem uma lógica para exploração do uso terapêutico da inibição seletiva de TGFβ1 para aumentar e ampliar as respostas clínicas ao bloqueio do ponto de verificação na imunoterapia do câncer, bem como para tratar diversas indicações adicionais relacionadas ao TGFβ1. Novos anticorpos de pró-TGFβ1, de alta afinidade, isoforma-seletivos Características gerais

[00210] São revelados nesse relatório descritivo inibidores aprimorados de TGFβ1, de alta afinidade, caracterizados pelo fato de que, comparados com inibidores TGFβ1-seletivos de revelações anteriores, esses anticorpos possuem propriedades de ligação aprimoradas, potência inibidora aumentada, e mantêm os perfis desejáveis de segurança e seletividade de isoforma. Esses inibidores TGFβ1-seletivos da presente revelação são anticorpos monoclonais (por exemplo, imunoglobulinas, moléculas do tipo imunoglobulina modificadas geneticamente, fragmentos de ligação ao antígeno ou porções destes) que se ligam especificamente a pelo menos uma porção do pró-domínio (algumas vezes denominado “LAP”) de um complexo pró-TGFβ1 latente e possuem atividade inibidora isoforma-seletiva contra TGFβ1 (veja “Propriedades Centrais” da Tabela 1).

[00211] As propriedades de ligação aprimoradas dos anticorpos de acordo com a presente revelação incluem afinidades aumentadas, como medida em equilíbrio. Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para pelo menos um dos complexos LLC humanos (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e/ou hLRRC33-pró-TGFβ1), como medida por MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para dois dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró- TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por

MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para três dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em modalidades preferidas, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para cada um dos complexos LLC humanos: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró- TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD-SET. De acordo com a presente revelação, anticorpos de alta afinidade podem ter um valor da KD para um antígeno particular (por exemplo, complexo de antígenos) que é de 1 nM ou menos, por exemplo, ≤ 1 nM, ≤ 0,5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM e ≤ 100 pM, em equilíbrio.

[00212] A presente invenção também inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes que são capazes de se ligar especificamente a cada um dos complexos LLC humanos (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1) com uma KD de ≤ 10 nM (por exemplo, ≤ 10 nM, ≤ 9 nM, ≤ 8 nM, ≤ 7 nM, ≤ 6 nM, ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,5 nM e ≤ 0,1 nM) como medida em equilíbrio, por exemplo, MSD-SET. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a cada um dos complexos LLC mencionados anteriormente com uma KD de ≤ 5 nM, como medida por um método baseado em titulação de solução em equilíbrio. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a cada um dos complexos LLC mencionados anteriormente com uma KD de ≤ 1 nM, como medida por um método baseado em titulação de solução em equilíbrio.

[00213] Para uso terapêutico para tratar uma indicação relacionada ao TGFβ1 que envolve tanto a desregulação da matriz extracelular quanto um componente imune, é vantajoso selecionar um anticorpo que possui uma alta afinidade (por exemplo, KD de ≤ 1 nM) para pelo menos um dos complexos pró- TGFβ1 associados à ECM (hLTBP1-pró-TGFβ1 e/ou hLTBP3-pró- TGFβ1) e, adicionalmente, pelo menos um dos complexos pró- TGFβ1 associados à célula (hGARP-pró-TGFβ1 e/ou hLRRC33-pró- TGFβ1), de modo a exercer efeitos inibidores em ambos os contextos (por exemplo, na ECM e até nas células imunes). Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma alta afinidade (por exemplo, KD de ≤ 1 nM) tanto para hLTBP1-pró-TGFβ1 quanto para hLTBP3-pró-TGFβ1 e, adicionalmente, pelo menos um dos complexos pró-TGFβ1 associados à célula (hGARP-pró- TGFβ1 ou hLRRC33-pró-TGFβ1). Ainda em outras modalidades, o anticorpo possui uma alta afinidade (por exemplo, KD de ≤ 1 nM) para cada um dos complexos mencionados anteriormente (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1). Em modalidades preferidas, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 200 pM para cada um dos complexos humanos, por exemplo, ≤ 100 pM, como medida por um método baseado em titulação de solução em equilíbrio, por exemplo, MSD-SET.

[00214] Modalidades da presente revelação incluem anticorpos de alta afinidade contexto-independentes. Esses anticorpos são capazes de ligação com afinidades equivalentes aos quatro complexos molécula apresentadora- pró-TGFβ1 conhecidos, especificamente, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Afinidades equivalentes podem significar, a menor afinidade (o maior valor numérico da KD) que o anticorpo mostra entre os quatro complexos de antígenos é, no máximo, cinco vezes menos do que o valor médio calculado das três afinidades restantes; ou, a maior afinidade (o menor valor numérico da

KD) que o anticorpo mostra entre os quatro complexos de antígenos é, no máximo, cinco vezes maior do que a média calculada das três afinidades restantes. Em algumas modalidades, quando a proporção de valores médios da KD dos dois complexos associados à ECM e valores médios da KD dos dois complexos associados à célula é de, no máximo, três vezes, esses anticorpos podem ser ditos como tendo afinidades equivalentes.

[00215] Anticorpos com afinidades equivalentes podem obter efeitos inibidores mais uniformes (por exemplo, imparciais), independentemente da molécula apresentadora particular associada com o complexo pró-TGFβ1 (e, dessa forma, “contexto-independente”). Em modalidades particularmente preferidas, o anticorpo é um anticorpo contexto-independente de alta afinidade, na medida em que a afinidade para cada um dos quatro LLCs humanos é de 1 nM ou menos (por exemplo, 200 pM ou menos) como medida por um método baseado em titulação de solução em equilíbrio, e o anticorpo possui afinidades equivalentes para todos os quatro LLCs humanos discutidos acima. Por exemplo, o viés observado em afinidades médias entre complexos associados à matriz e complexos associados à célula é de, no máximo, três vezes.

[00216] Em algumas modalidades, esse anticorpo se liga especificamente a cada um dos complexos mencionados anteriormente (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP- pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1) com uma KD de ≤ 10 nM (por exemplo, ≤ 10 nM, ≤ 9 nM, ≤ 8 nM, ≤ 7 nM, ≤ 6 nM, ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,5 nM e ≤ 0,1 nM) como medida por um método baseado em titulação de solução em equilíbrio, por exemplo, MSD-SET.

[00217] Qualquer um dos anticorpos inibidores englobados nesse relatório descritivo podem se ligar a cada um dos complexos latentes grandes mencionados anteriormente (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1) na região (ou regiões) de ligação que inclui pelo menos uma porção do Laço de Latência dentro do pró-domínio do complexo pró-TGFβ1. Essas regiões de ligação podem ainda incluir pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento. Em modalidades particularmente preferidas, esses anticorpos se ligam a cada um dos complexos LTBP1-pró- TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1 com um valor da KD de ≤ 200 pM (por exemplo, ≤ 150 pM e ≤ 100 pM) em regiões de ligação dentro do complexo LLC que incluem pelo menos uma porção do Laço de Latência e pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento.

[00218] Em algumas modalidades, o anticorpo contexto- independente de alta afinidade, capaz de inibir seletivamente TGFβ1, pode inibir TGFβ1 ativado independentemente do modo de ativação. Por exemplo, certas integrinas sabidamente se ligam diretamente aos motivos RGD dentro do pró-domínio de LLCs e mecanicamente “abrem” a estrutura do pró-domínio do tipo gaiola fazendo, dessa forma, com que o fator de crescimento TGFβ1 seja desatado do complexo latente. Separadamente, foi demonstrado que certas proteases presentes no ambiente extracelular ativam TGFβ1 de uma forma integrina-independente. Um anticorpo que alveja diretamente o motivo RGD interferindo, dessa forma, com a ligação de integrina pode não inibir a ativação de TGFβ1 protease-dependente. Inversamente, um anticorpo que alveja diretamente um ou mais dos sítios de reconhecimento ou de clivagem de protease pode não inibir a ativação de TGFβ1 integrina-dependente. Em contraste, em modalidades preferidas da presente invenção, o anticorpo contexto- independente de alta afinidade, é capaz de inibir a ativação de TGFβ1 integrina-dependente e a ativação de TGFβ1 protease- dependente.

[00219] Embora a ligação de alta afinidade às proteínas humanas-alvo seja uma característica essencial para uma terapêutica com anticorpo, a habilidade para também reagir de forma cruzada com contrapartes de espécies adicionais é vantajosa. Em particular, considerando que a maioria dos modelos pré-clínicos de farmacologia é em roedores, a reatividade cruzada de espécies para proteínas murídeas/de rato fornece ferramentas convenientes como anticorpos substitutos para pesquisa pré-clínica. Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos de alta afinidade da presente revelação reagem vantajosamente de forma cruzada com outras contrapartes mamíferas, por exemplo, camundongo, rato e/ou primatas não humanos.

[00220] Entre os novos anticorpos englobados pela presente revelação, classes particularmente preferidas de anticorpos e suas características são categorizadas e discutidas abaixo. Características preferidas

[00221] Em algumas modalidades, além das características da Propriedade Central, os anticorpos preferidos revelados nesse relatório descritivo ainda atendem aos Critérios para Anticorpo de uma ou mais das Categorias 1-5 como apresentadas na Tabela 1 nesse relatório descritivo.

[00222] Em algumas modalidades, critérios adicionais exigidos dos anticorpos da presente invenção são definidos por suas propriedades de ligação, por exemplo, afinidade do anticorpo contra antígenos. Os “antígenos” nesse contexto incluem pelo menos quatro complexos de proteínas, especificamente, complexos latentes grandes humanos (LLCs) de TGFβ1, denominados complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3- pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1. De acordo com a invenção da presente revelação, os anticorpos são capazes de ligação a cada um desses complexos em certas afinidades, tipicamente medidas como valores da KD. Os anticorpos da Categoria 1 e da Categoria 2 se enquadram nessas modalidades. Para fins de definição dos critérios com base em propriedades de ligação (por exemplo, Categorias 1 e 2), a afinidade dos anticorpos é determinada em equilíbrio, e não por um ensaio cinético (por exemplo, BLI).

[00223] Adicionalmente ou alternativamente, critérios adicionais exigidos dos anticorpos da presente invenção são definidos por suas sequências de aminoácidos. Os anticorpos da Categoria 3 e da Categoria 4 são definidos pelas sequências de CDR dos anticorpos, embora os anticorpos da Categoria 5 sejam definidos por suas sequências do domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve. Tabela 1. Características preferidas dos novos inibidores TGFβ1-seletivos, de alta afinidade, da invenção.

Anticorpos Categoria Critérios para Anticorpo exemplares

Propriedades Centrais: - Presente - Inibe seletivamente a revelação sinalização de TGFβ1, em relação à - WO sinalização de TGFβ2 e TGFβ3 2018/129329 - Se liga especificamente a cada (Ab3) um de: complexos LTBP1-pró-TGFβ1, - WO LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e 2017/156500 (Todas) LRRC33-pró-TGFβ1 (humanos e/ou murídeos) - A ligação envolve pelo menos uma porção do pró-domínio de pró-TGFβ1 - Perfis aprimorados e segurança/toxicologia, comparado com inibidores pan-TGFβ

Critérios adicionais exigidos definidos por perfis de ligação (como determinados por titulação de solução em equilíbrio)

O anticorpo atende às Propriedades - Ab6 Centrais; e, - Ab22 se liga a cada um dos seguintes - Ab24 complexos humanos com uma KD de ≤ - Ab26 200 pM: - Ab29 1 - hLTBP1-pró-TGFβ1; - Ab30 - hLTBP3-pró-TGFβ1; - Ab31 - hGARP-pró-TGFβ1; e, - Ab32 - hLRRC33-pró-TGFβ1 - Ab33

Anticorpos Categoria Critérios para Anticorpo exemplares O anticorpo atende às Propriedades Pelo menos Centrais; e, Ab5 e Ab6 se liga a cada um dos seguintes complexos humanos com uma KD de ≤ 1 nM: - hLTBP1-pró-TGFβ1;

2 - hLTBP3-pró-TGFβ1;

- hGARP-pró-TGFβ1; e,

- hLRRC33-pró-TGFβ1; e,

a região de ligação compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência, como determinada por HD- X ou cristalografia

Critérios adicionais exigidos definidos por sequências de anticorpo O anticorpo atende às Propriedades - Ab5 Centrais; e, - Ab6 H-CDR1 possui uma sequência de - Ab21 aminoácidos representada por - Ab22 FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5), - Ab23 em que opcionalmente: X1 = S, G ou - Ab24 3 A; X2 = S ou F; X3 = F ou Y; X4 = S - Ab25 ou A; e/ou, X5 = D, N ou Y (ID.

DE - Ab26 SEQ.

N°: 143); - Ab27 H-CDR2 possui uma sequência de - Ab28 aminoácidos representada por - Ab29 YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG, - Ab30 em que, opcionalmente: X1 = S ou - Ab31

Anticorpos Categoria Critérios para Anticorpo exemplares H; X2 = P ou S; X3 = S ou D; X4 = D - Ab32 ou S; e/ou, X5 = D ou G (ID.

DE - Ab34 SEQ.

N°: 144); H-CDR3 possui uma sequência de aminoácidos representada por (X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P, em que opcionalmente: X1 = A ou V; X2 = G ou A; X3 = V ou T; X4 = L ou W; X5 = Y ou M; e/ou, X6 = M ou D (ID.

DE SEQ.

N°: 145); L-CDR1 possui uma sequência de aminoácidos QASQDITNYLN, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: 105); L-CDR2 possui uma sequência de aminoácidos DASNLET, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: 106); e, L-CDR3 possui uma sequência de aminoácidos QQADNHPPWT, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: 12). O anticorpo atende às Propriedades - Ab4 Centrais; e, - Ab5 4 H-CDR1 possui uma sequência de - Ab6 aminoácidos FTFSSFSMD, - Ab21

Anticorpos Categoria Critérios para Anticorpo exemplares com opcionalmente até 4 alterações - Ab22 de aminoácidos, ou até 2 - Ab23 alterações de aminoácidos (ID.

DE - Ab24 SEQ.

N°: 107); ou, FTFSSFSMN, com - Ab25 opcionalmente até 4 alterações de - Ab26 aminoácidos, ou até 2 alterações - Ab27 de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: - Ab28 114); - Ab29 H-CDR2 possui uma sequência de - Ab30 aminoácidos YISPDASTIYYADSVKG, - Ab31 com opcionalmente até 4 alterações - Ab32 de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: - Ab33 111); - Ab34 H-CDR3 possui uma sequência de aminoácidos ARGVLDYGDMLDP, com opcionalmente até 3 alterações de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: 110); L-CDR1 possui uma sequência de aminoácidos QASQDITNYLN, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: 105); L-CDR2 possui uma sequência de aminoácidos DASNLET, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID.

DE SEQ.

N°: 106); e,

Anticorpos Categoria Critérios para Anticorpo exemplares L-CDR3 possui uma sequência de aminoácidos QQADNHPPWT, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 12). O anticorpo atende às Propriedades - Ab4 Centrais; e, - Ab5 compreende: - Ab6 um domínio variável da cadeia - Ab21 pesada (VH) que possui pelo menos - Ab22 90% de identidade de sequência - Ab23 para: - Ab24 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSS - Ab25 FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYAD - Ab26 SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY - Ab27 5 YCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSS (ID. DE - Ab28 SEQ. N°: 13) - Ab29 um domínio variável da cadeia leve - Ab30 (VL) que possui pelo menos 90% de - Ab31 identidade de sequência para: - Ab32 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN - Ab33 WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS - Ab34

GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 15)

[00224] Modalidades não limitantes de cada uma das categorias são fornecidas abaixo. Anticorpos da Categoria 1

[00225] Anticorpos revelados nesse relatório descritivo são anticorpos isoforma-seletivos, de alta afinidade, capazes de alvejar especificamente complexos grandes latentes humanos de TGFβ1.

[00226] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a cada um dos seguintes LLCs humanos com uma KD de ≤ 200 pM: complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró- TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, em que a afinidade é medida em equilíbrio com o uso de ensaios adequados como, por exemplo, ensaios baseados em titulação de solução em equilíbrio.

[00227] Esse anticorpo ou o fragmento pode se ligar a cada um dos complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 150 pM, como medida por titulação de solução em equilíbrio. Mais preferivelmente, esse anticorpo ou o fragmento pode se ligar a cada um dos complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 100 pM, como medida por titulação de solução em equilíbrio. Quaisquer ensaios de afinidade in vitro adequados que são capazes de determinação de valores da KD do anticorpo em equilíbrio podem ser empregados, incluindo por exemplo, MSD-SET, que é descrito em mais detalhe em outro local nesse relatório descritivo. Exemplos não limitantes de anticorpos revelados nesse relatório descritivo que atendem aos Critérios para Anticorpo de anticorpos preferidos da Categoria 1 incluem: Ab6, Ab22, Ab24, Ab26, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32 e Ab33.

[00228] O anticorpo também pode se ligar com alta especificidade e afinidades elevadas aos LLCs correspondentes de espécies adicionais. Em modalidades preferidas, o anticorpo mostra reatividade cruzada de espécies para contrapartes murídeas. Anticorpos da Categoria 2

[00229] Anticorpos revelados nesse relatório descritivo são anticorpos isoforma-seletivos, de alta afinidade, capazes de alvejar especificamente complexos grandes latentes humanos de TGFβ1.

[00230] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a cada um dos seguintes LLCs humanos com uma KD de ≤ 1 nM: complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, em que a afinidade é medida em equilíbrio com o uso de ensaios adequados como, por exemplo, ensaios baseados em titulação de solução em equilíbrio, e em que o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência. Laço de Latência é um domínio de proteína que forma uma parte do chamado “Straight Jacket” do pró-domínio. Em sua forma nativa, Laço de Latência do polipeptídeo de pró-TGFβ1 humano possui a sequência de aminoácidos LASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 153). Qualquer técnica adequada pode ser empregada para determinar se um anticorpo se liga a um LLC de TGFβ1 humano em uma região que inclui pelo menos uma porção do Laço de Latência. Por exemplo, ensaios de competição que utilizam polipeptídeos correspondentes podem ser realizados. Em algumas modalidades, regiões de ligação podem ser determinadas por HD-X ou cristalografia de Raios-X.

[00231] Em algumas modalidades, esse anticorpo ou o fragmento pode se ligar a cada um dos complexos hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 500 pM (opcionalmente ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM ou ≤ 100 pM), como medida por titulação de solução em equilíbrio, em que o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência. Exemplos não limitantes de anticorpos revelados nesse relatório descritivo que atendem aos Critérios para Anticorpo de anticorpos preferidos da Categoria 2 incluem: Ab5 e Ab6.

[00232] Em algumas modalidades, esse anticorpo pode ainda se ligar aos LLCs humanos em uma região ou regiões de ligação adicionais que compreendem pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento dentro do complexo pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, a ligação adicional ocorre somente no contexto do complexo de latência, de modo que o anticorpo não se ligue especificamente ao fator de crescimento livre que não está em associação com o complexo de pró-domínio. A região ou regiões de ligação adicional dentro do domínio do fator de crescimento do LLC podem incluir pelo menos parte dos domínios de proteína denominados “Finger-1” e/ou “Finger-2”. Portanto, esse anticorpo pode se ligar a um epitopo combinatório que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido do Laço de Latência e pelo menos um resíduo de aminoácido do domínio do fator de crescimento.

[00233] O anticorpo também pode se ligar com alta especificidade e afinidades elevadas aos LLCs correspondentes de espécies adicionais. Em modalidades preferidas, o anticorpo mostra reatividade cruzada de espécies para contrapartes murídeas.

Anticorpos da Categoria 3

[00234] Anticorpos revelados nesse relatório descritivo são anticorpos isoforma-seletivos, de alta afinidade, capazes de alvejar especificamente complexos grandes latentes humanos de TGFβ1.

[00235] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende uma H-CDR1, uma H-CDR2, uma H-CDR3, uma L-CDR1, uma L-CDR2 e uma L-CDR3, em que a CDR-H1 possui uma sequência de aminoácidos representada por FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5) (ID. DE SEQ. N°: 143). Em algumas modalidades, X1 pode ser S, G ou A; X2 pode ser S ou F; X3 pode ser F ou Y; X4 pode ser S ou A; e/ou, X5 pode ser D, N ou Y, em qualquer combinação. Em algumas modalidades nas quais a H-CDR1 contém pelo menos uma substituição de aminoácido, a posição X1 pode ser substituída com um S; a posição X2 pode ser substituída com um S; a posição X3 pode ser substituída com um F; a posição X4 pode ser substituída com um S; e/ou a posição X5 pode ser substituída com um D.

[00236] A CDR-H2 do anticorpo possui uma sequência de aminoácidos representada por YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG (ID. DE SEQ. N°: 144). Em algumas modalidades, X1 pode ser S ou H; X2 pode ser P ou S; X3 pode ser S ou D; X4 pode ser D ou S; e/ou, X5 pode ser D ou G, em qualquer combinação. Em algumas modalidades nas quais a H-CDR2 contém pelo menos uma substituição de aminoácido, a posição X1 pode ser substituída com um S; a posição X2 pode ser substituída com um P; a posição X3 pode ser substituída com um D; a posição X4 pode ser substituída com um S; e/ou a posição X5 pode ser substituída com um D.

[00237] A CDR-H3 do anticorpo possui uma sequência de aminoácidos representada por (X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P (ID. DE SEQ. N°: 145). Em algumas modalidades, X1 pode ser A ou V; X2 pode ser G ou A; X3 pode ser V ou T; X4 pode ser L ou W; X5 pode ser Y ou M; e/ou, X6 pode ser M ou D, em qualquer combinação. Em algumas modalidades nas quais a H- CDR3 contém pelo menos uma substituição de aminoácido, a posição X1 pode ser substituída com um A; a posição X2 pode ser substituída com um G; a posição X3 pode ser substituída com um V; a posição X4 pode ser substituída com um L; a posição X5 pode ser substituída com um Y; e/ou a posição X6 pode ser substituída com um D.

[00238] A CDR-L1 possui uma sequência de aminoácidos QASQDITNYLN (ID. DE SEQ. N°: 105), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos.

[00239] A CDR-L2 possui uma sequência de aminoácidos DASNLET (ID. DE SEQ. N°: 106), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos.

[00240] A CDR-L3 possui uma sequência de aminoácidos QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos.

[00241] Exemplos não limitantes de anticorpos revelados nesse relatório descritivo que atendem aos Critérios para Anticorpo de anticorpos preferidos da Categoria 3 incluem: Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32 e Ab34.

[00242] A Tabela 2 abaixo resume as sequências de consenso de CDR dos anticorpos da Categoria 3. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de CDR pode opcionalmente conter uma ou mais das substituições de aminoácidos apresentadas abaixo. Tabela 2. Sequências de consenso de CDR da cadeia pesada e da cadeia leve e substituições de aminoácidos preferidas. Sequências de consenso de CDR CDRH1 FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5), em que, opcionalmente: X1 = S, G ou A; X2 = S ou F; X3 = F ou Y; X4 = S ou A; e/ou, X5 = D, N ou Y (ID. DE SEQ. N°: 143) CDRH2 YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG, em que, opcionalmente: X1 = S ou H; X2 = P ou S; X3 = S ou D; X4 = D ou S; e/ou, X5 = D ou

G (ID. DE SEQ. N°: 144) CDRH3 (X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P, em que, opcionalmente: X1 = A ou V; X2 = G ou A; X3 = V ou T; X4 = L ou W; X5 = Y ou M; e/ou, X6 = M ou D (ID. DE SEQ. N°: 145) CDRL1 QASQDITNYLN, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 105) CDRL2 DASNLET, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 106) CDRL3 QQADNHPPWT, com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 12)

[00243] Em algumas modalidades, o anticorpo da Categoria 3 ou fragmento de ligação ao antígeno deste se liga especificamente a cada um dos seguintes LLCs humanos com uma KD de ≤ 1 nM: complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, em que a afinidade é medida em equilíbrio com o uso de ensaios adequados como, por exemplo, ensaios baseados em titulação de solução em equilíbrio.

[00244] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência. Laço de Latência é um domínio de proteína que forma uma parte do chamado “Straight Jacket” do pró-domínio. Em sua forma nativa, Laço de Latência do polipeptídeo de pró-TGFβ1 humano possui a sequência de aminoácidos LASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 153). Qualquer técnica adequada pode ser empregada para determinar se um anticorpo se liga a um LLC de TGFβ1 humano em uma região que inclui pelo menos uma porção do Laço de Latência. Por exemplo, ensaios de competição que utilizam polipeptídeos correspondentes podem ser realizados. Em algumas modalidades, regiões de ligação podem ser determinadas por HD-X ou cristalografia de Raios-X.

[00245] Em algumas modalidades, esse anticorpo ou o fragmento pode se ligar a cada um dos complexos hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 500 pM (opcionalmente ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM ou ≤ 100 pM), como medida por titulação de solução em equilíbrio, em que o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência.

[00246] Em algumas modalidades, esse anticorpo pode ainda se ligar aos LLCs humanos em uma região ou regiões de ligação adicionais que compreendem pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento dentro do complexo pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, a ligação adicional ocorre somente no contexto do complexo de latência, de modo que o anticorpo não se ligue especificamente ao fator de crescimento livre que não está em associação com o complexo de pró-domínio. A região ou regiões de ligação adicional dentro do domínio do fator de crescimento do LLC podem incluir pelo menos parte dos domínios de proteína denominados “Finger-1” e/ou “Finger-2”. Portanto, esse anticorpo pode se ligar a um epitopo combinatório que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido do Laço de Latência e pelo menos um resíduo de aminoácido do domínio do fator de crescimento.

[00247] O anticorpo também pode se ligar com alta especificidade e afinidades elevadas aos LLCs correspondentes de espécies adicionais. Em modalidades preferidas, o anticorpo mostra reatividade cruzada de espécies para contrapartes murídeas.

[00248] Estão incluídos nesse relatório descritivo anticorpos de bloqueio cruzado ou fragmentos de ligação ao antígeno destes. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento deste bloqueia de forma cruzada ou compete de forma cruzada com um dos anticorpos da Categoria 3, em que o anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para pelo menos um dos complexos LLC humanos (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e/ou hLRRC33-pró-TGFβ1), como medida por MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para dois dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para três dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró- TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em modalidades preferidas, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para cada um dos complexos LLC humanos: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD- SET. De acordo com a presente revelação, anticorpos de alta afinidade podem ter um valor da KD para um antígeno particular (por exemplo, complexo de antígenos) que é de 1 nM ou menos, por exemplo, ≤ 1 nM, ≤ 0,5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM e ≤ 100 pM, em equilíbrio. Anticorpos da Categoria 4

[00249] Anticorpos revelados nesse relatório descritivo são anticorpos isoforma-seletivos, de alta afinidade, capazes de alvejar especificamente complexos grandes latentes humanos de TGFβ1.

[00250] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende uma H-CDR1, uma H-CDR2, uma H-CDR3, uma L-CDR1, uma L-CDR2 e uma L-CDR3, em que: a H-CDR1 compreende FTFSSFSMD (ID. DE SEQ. N°: 107) ou FTFSSFSMN (ID. DE SEQ. N°: 114), em que, opcionalmente, cada uma pode conter até 4 alterações de aminoácidos (opcionalmente até 4, até 3, até 2 ou 1 alteração de aminoácido); a H-CDR2 compreende YISPDASTIYYADSVKG (ID. DE SEQ. N°: 111), em que, opcionalmente, a H-CDR2 pode conter até 4 alterações de aminoácidos (opcionalmente até 4, até 3, até 2 ou 1 alteração de aminoácido), a H-CDR3 compreende ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. N°: 110), em que, opcionalmente, a H-CDR3 pode conter até 3 alterações de aminoácidos (opcionalmente até 3, até 2 ou 1 alteração de aminoácido); a L-CDR1 QASQDITNYLN (ID. DE SEQ. N°: 105), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos; a L-CDR2 compreende DASNLET (ID. DE SEQ. N°: 106), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos; e a L-CDR3 compreende QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos.

[00251] Exemplos não limitantes de anticorpos revelados nesse relatório descritivo que atendem aos Critérios para Anticorpo de anticorpos preferidos da Categoria 4 incluem: Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 e Ab34.

[00252] A Tabela 3 abaixo resume as sequências de CDR dos anticorpos da Categoria 4. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de CDR pode opcionalmente conter uma ou mais das substituições de aminoácidos apresentadas abaixo. Tabela 3. Sequências de CDR e variantes, CDRs e Variants i) FTFSSFSMD, com opcionalmente até 4 alterações de aminoácidos ou até 2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. CDRH1 N°: 107; ou, ii) FTFSSFSMN, com opcionalmente até 4 alterações de aminoácidos, ou até 2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 114) YISPDASTIYYADSVKG, com opcionalmente até CDRH2 4 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 111)

ARGVLDYGDMLDP, com opcionalmente até 3 CDRH3 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 110) QASQDITNYLN, com opcionalmente 1 ou 2 CDRL1 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 105) DASNLET, com opcionalmente 1 ou 2 CDRL2 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 106) QQADNHPPWT, com opcionalmente 1 ou 2 CDRL3 alterações de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 12)

[00253] Em algumas modalidades, o anticorpo da Categoria 4 ou fragmento de ligação ao antígeno deste se liga especificamente a cada um dos seguintes LLCs humanos com uma KD de ≤ 1 nM: complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, em que a afinidade é medida em equilíbrio com o uso de ensaios adequados como, por exemplo, ensaios baseados em titulação de solução em equilíbrio.

[00254] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência. Laço de Latência é um domínio de proteína que forma uma parte do chamado “Straight Jacket” do pró-domínio. Em sua forma nativa, Laço de Latência do polipeptídeo de pró-TGFβ1 humano possui a sequência de aminoácidos LASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 153). Qualquer técnica adequada pode ser empregada para determinar se um anticorpo se liga a um LLC de TGFβ1 humano em uma região que inclui pelo menos uma porção do

Laço de Latência. Por exemplo, ensaios de competição que utilizam polipeptídeos correspondentes podem ser realizados. Em algumas modalidades, regiões de ligação podem ser determinadas por HD-X ou cristalografia de Raios-X.

[00255] Em algumas modalidades, esse anticorpo ou o fragmento pode se ligar a cada um dos complexos hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 500 pM (opcionalmente ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM ou ≤ 100 pM), como medida por titulação de solução em equilíbrio, em que o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência.

[00256] Em algumas modalidades, esse anticorpo pode ainda se ligar aos LLCs humanos em uma região ou regiões de ligação adicionais que compreendem pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento dentro do complexo pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, a ligação adicional ocorre somente no contexto do complexo de latência, de modo que o anticorpo não se ligue especificamente ao fator de crescimento livre que não está em associação com o complexo de pró-domínio. A região ou regiões de ligação adicional dentro do domínio do fator de crescimento do LLC podem incluir pelo menos parte dos domínios de proteína denominados “Finger-1” e/ou “Finger-2”. Portanto, esse anticorpo pode se ligar a um epitopo combinatório que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido do Laço de Latência e pelo menos um resíduo de aminoácido do domínio do fator de crescimento.

[00257] O anticorpo também pode se ligar com alta especificidade e afinidades elevadas aos LLCs correspondentes de espécies adicionais. Em modalidades preferidas, o anticorpo mostra reatividade cruzada de espécies para contrapartes murídeas.

[00258] Estão incluídos nesse relatório descritivo anticorpos de bloqueio cruzado ou fragmentos de ligação ao antígeno destes. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento deste bloqueia de forma cruzada ou compete de forma cruzada com um dos anticorpos da Categoria 4, em que o anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para pelo menos um dos complexos LLC humanos (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e/ou hLRRC33-pró-TGFβ1), como medida por MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para dois dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para três dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró- TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em modalidades preferidas, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para cada um dos complexos LLC humanos: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD- SET. De acordo com a presente revelação, anticorpos de alta afinidade podem ter um valor da KD para um antígeno particular (por exemplo, complexo de antígenos) que é de 1 nM ou menos, por exemplo, ≤ 1 nM, ≤ 0,5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM e ≤ 100 pM, em equilíbrio. Anticorpos da Categoria 5

[00259] Anticorpos revelados nesse relatório descritivo são anticorpos isoforma-seletivos, de alta afinidade, capazes de alvejar especificamente complexos grandes latentes humanos de TGFβ1.

[00260] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que possui pelo menos 90% de identidade de sequência para:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIY

YADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTV SS (ID. DE SEQ. N°: 13); e, um domínio variável da cadeia leve (VL) que possui pelo menos 90% de identidade de sequência para:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVP SRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 15).

[00261] Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência VH apresentada no ID. DE SEQ. N°: 13.

[00262] Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo é pelo menos 95% idêntico à sequência VH acima.

[00263] Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência VL apresentada no ID. DE SEQ. N°: 15.

[00264] Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve do anticorpo é pelo menos 95% idêntico à sequência VL acima.

[00265] Exemplos não limitantes de anticorpos revelados nesse relatório descritivo que atendem aos Critérios para Anticorpo de anticorpos preferidos da Categoria 5 incluem:

Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 e Ab34.

[00266] Em algumas modalidades, o anticorpo da Categoria 5 ou fragmento de ligação ao antígeno deste se liga especificamente a cada um dos seguintes LLCs humanos com uma KD de ≤ 1 nM: complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, em que a afinidade é medida em equilíbrio com o uso de ensaios adequados como, por exemplo, ensaios baseados em titulação de solução em equilíbrio.

[00267] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga aos LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência. Laço de Latência é um domínio de proteína que forma uma parte do chamado “Straight Jacket” do pró-domínio. Em sua forma nativa, Laço de Latência do polipeptídeo de pró-TGFβ1 humano possui a sequência de aminoácidos LASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 153). Qualquer técnica adequada pode ser empregada para determinar se um anticorpo se liga a um LLC de TGFβ1 humano em uma região que inclui pelo menos uma porção do Laço de Latência. Por exemplo, ensaios de competição que utilizam polipeptídeos correspondentes podem ser realizados. Em algumas modalidades, regiões de ligação podem ser determinadas por HD-X ou cristalografia de Raios-X.

[00268] Em algumas modalidades, esse anticorpo ou o fragmento pode se ligar a cada um dos complexos hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 500 pM (opcionalmente ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM ou ≤ 100 pM), como medida por titulação de solução em equilíbrio, em que o anticorpo ou o fragmento se liga aos

LLCs humanos em uma região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência.

[00269] Em algumas modalidades, esse anticorpo pode ainda se ligar aos LLCs humanos em uma região ou regiões de ligação adicionais que compreendem pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento dentro do complexo pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, a ligação adicional ocorre somente no contexto do complexo de latência, de modo que o anticorpo não se ligue especificamente ao fator de crescimento livre que não está em associação com o complexo de pró-domínio. A região ou regiões de ligação adicional dentro do domínio do fator de crescimento do LLC podem incluir pelo menos parte dos domínios de proteína denominados “Finger-1” e/ou “Finger-2”. Portanto, esse anticorpo pode se ligar a um epitopo combinatório que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido do Laço de Latência e pelo menos um resíduo de aminoácido do domínio do fator de crescimento.

[00270] O anticorpo também pode se ligar com alta especificidade e afinidades elevadas aos LLCs correspondentes de espécies adicionais. Em modalidades preferidas, o anticorpo mostra reatividade cruzada de espécies para contrapartes murídeas.

[00271] Estão incluídos nesse relatório descritivo anticorpos de bloqueio cruzado ou fragmentos de ligação ao antígeno destes. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento deste bloqueia de forma cruzada ou compete de forma cruzada com um dos anticorpos da Categoria 5, em que o anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para pelo menos um dos complexos LLC humanos (hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e/ou hLRRC33-pró-TGFβ1), como medida por

MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para dois dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em algumas modalidades, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para três dos complexos LLC humanos selecionados de: hLTBP1-pró- TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró- TGFβ1, como medida por MSD-SET. Em modalidades preferidas, esse anticorpo possui uma KD de ≤ 1 nM para cada um dos complexos LLC humanos: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1, como medida por MSD- SET. De acordo com a presente revelação, anticorpos de alta afinidade podem ter um valor da KD para um antígeno particular (por exemplo, complexo de antígenos) que é de 1 nM ou menos, por exemplo, ≤ 1 nM, ≤ 0,5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM e ≤ 100 pM, em equilíbrio. Anticorpos da invenção exemplares

[00272] Anticorpos exemplares e sequências de ácidos nucleicos correspondentes que codificam esses anticorpos úteis para realização da presente invenção incluem uma ou mais das sequências de aminoácidos de CDR mostradas nas Tabelas 4 e 5. Cada conjunto das H-CDRs (H-CDR1, H-CDR2 e H- CDR3) listadas na Tabela 5 pode ser combinado com as L-CDRs (L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3) fornecidas na Tabela 5.

[00273] Dessa forma, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende seis CDRs (por exemplo, uma H-CDR1, uma H-CDR2, uma H-CDR3, uma L-CDR1, uma L-CDR2 e uma L-CDR3), em que, a H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 são selecionadas dos conjuntos de H- CDRs dos anticorpos listados na Tabela 4, e em que a L-CDR1 compreende QASQDITNYLN (ID. DE SEQ. N°: 105), a L-CDR2 compreende DASNLET (ID. DE SEQ. N°: 106) e a L-CDR3 compreende QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12), em que, opcionalmente, a H-CDR1 pode compreender FTFSSFSMD (ID. DE SEQ. N°: 107); a H-CDR-2 pode compreender YISPSADTIYYADSVKG (ID. DE SEQ. N°: 103); e/ou a H-CDR3 pode compreender ARGVLDYGDMLMP (ID. DE SEQ. N°: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento compreende H-CDR1 que possui a sequência de aminoácidos FTFSSFSMD (ID. DE SEQ. N°: 107), H- CDR2 que possui a sequência de aminoácidos YISPSADTIYYADSVKG (ID. DE SEQ. N°: 103), e H-CDR-3 que possui a sequência de aminoácidos ARGVLDYGDMLMP (ID. DE SEQ. N°: 6); L-CDR1 que possui a sequência de aminoácidos QASQDITNYLN (ID. DE SEQ. N°: 105), L-CDR2 que possui a sequência de aminoácidos DASNLET (ID. DE SEQ. N°: 106), e L-CDR3 que possui a sequência de aminoácidos QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12). Tabela 4. Regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada de anticorpos exemplares, como determinadas usando o esquema de numeração descrito em Lu e cols.

Ab H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3

FTFSSYSMN YISSSSSTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab4 N°: 108) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 109)

FTFSSFSMD YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab5 N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111)

FTFSSFSMD YISPSADTIYYADSV ARGVLDYGDMLMP Ab6 (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ.

N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 6) N°: 103)

FTFSSFSMD YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab21 N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111)

FTFGSFSMN YIHSDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab22 N°: 112) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 113)

FTFSSFSMN YISPSADTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab23 N°: 114) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 103)

FTFSSFAMY YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab24 N°: 115) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111)

FTFGSFSMD YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab25 N°: 116) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111)

FTFSSFSMD YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab26 N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111)

FTFSFYAMN YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab27 N°: 117) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111)

FTFSSFSMD YISPDASTIYYADSV VRGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab28 N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 118) N°: 111)

FTFSSFAMN YISPDASTIYYAGSV VRAVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab29 N°: 119) (ID. DE SEQ. N°: 121) N°: 120)

FTFSSFSMD YISPDASTIYYADSV ARGTLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab30 N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 122) N°: 111)

FTFSSFSMD YISPDASTIYYADSV ARAVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab31 N°: 107) (ID. DE SEQ. N°: 123) N°: 111)

FTFSSFSMN YISPSADTIYYADSV ARGVWDMGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab32 N°: 114) (ID. DE SEQ. N°: 124) N°: 103)

FTFSSFSMN YISPSADTIYYADSV AHGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab33 N°: 114) (ID. DE SEQ. N°: 125) N°: 103)

FTFAFYSMN YISPDASTIYYADSV ARGVLDYGDMLDP (ID. DE SEQ. KG (ID. DE SEQ. Ab34 N°: 126) (ID. DE SEQ. N°: 110) N°: 111) Tabela 5. Regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve de anticorpos exemplares, como determinadas usando o esquema de numeração de Kabat ou o sistema de numeração de Lu e cols. L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3

QASQDITNYLN DASNLET QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. (ID. DE SEQ. N°: (ID. DE SEQ. N°: N°: 105) 106) 12)

[00274] A determinação de sequências de CDR dentro de um anticorpo depende do esquema de numeração particular que está sendo empregado. Sistemas comumente usados incluem, sem limitação: sistema de numeração de Kabat, sistema de numeração IMTG, sistema de numeração de Chothia, e outros como, por exemplo, o esquema de numeração descrito por Lu e cols. (Lu X. e cols., MAbs. Janeiro de 2019; 11 (1): 45-57). Para ilustrar, 6 sequências de CDR de Ab6 como definidas por quatro sistemas de numeração diferentes são exemplificadas abaixo. Qualquer sistema de numeração de CDR reconhecido na técnica pode ser usado para definir sequências de CDR dos anticorpos da presente revelação. Tabela 6. Seis CDRs de um anticorpo exemplar (Ab6) com base em quatro esquemas de numeração. Numeração Numeração Numeração Sistema de IMTG de Kabat de Chothia Lu e cols.

H-CDR1 GFTFSSFS SFSMD GFTFSSF FTFSSFSMD (ID. DE (ID. DE (ID. DE (ID. DE SEQ. N°: 2) SEQ. N°: SEQ. N°: SEQ. N°: 102) 233) 107) H-CDR2 ISPSADTI YISPSADTIYY SPSADT YISPSADTIYY (ID. DE ADSVKG (ID. DE ADSVKG SEQ. N°: 4) (ID. DE SEQ. N°: (ID. DE SEQ. N°: 234) SEQ. N°:

103) 103) H-CDR3 ARGVLDYGDML GVLDYGDMLMP GVLDYGDMLMP ARGVLDYGDML MP (ID. DE (ID. DE MP (ID. DE SEQ. N°: SEQ. N°: (ID. DE SEQ. N°: 6) 104) 104) SEQ. N°: 6) L-CDR1 QDITNY QASQDITNYLN QASQDITNYLN QASQDITNYLN (ID. DE (ID. DE (ID. DE (ID. DE SEQ. N°: 8) SEQ. N°: SEQ. N°: SEQ. N°: 105) 105) 105) L-CDR2 DAS DASNLET DASNLET DASNLET (ID. DE (ID. DE (ID. DE (ID. DE SEQ. N°: SEQ. N°: SEQ. N°: SEQ. N°: 10) 106) 106) 106) L-CDR3 QQADNHPPWT QQADNHPPWT QQADNHPPWT QQADNHPPWT (ID. DE (ID. DE (ID. DE (ID. DE SEQ. N°: SEQ. N°: SEQ. N°: SEQ. N°: 12) 12) 12) 12)

[00275] Sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e do domínio variável da cadeia leve de anticorpos exemplares da presente revelação são fornecidas na Tabela 7. Dessa forma, em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, da presente revelação pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) e um domínio variável da cadeia leve (VL), em que as sequências VH e as sequências VL são selecionadas de qualquer um dos conjuntos de sequências VH e VL listados na Tabela 7 abaixo.

Tabela 7. Domínios variáveis da cadeia pesada e domínios variáveis da cadeia leve de anticorpos exemplares. Domínio variável da cadeia pesada (VH) Domínio variável da cadeia leve (VL)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

YSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab4 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 127) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab5 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 128) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab6 SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 13) (ID. DE SEQ. N°: 15) Ab21 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 129) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMNWVRQAPGKGLEWVSYIHSDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab22 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 130) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMNWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab23 SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 131) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FAMYWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab24 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 132) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab25 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 133) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab26 SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 134) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

YAMNWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab27 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 135) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab28

SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG YCVRGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK

(ID. DE SEQ. N°: 136) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FAMNWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAG WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab29 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCVRAVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 137) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab30 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGTLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 138) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPDASTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab31 SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARAVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 139) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN Ab32 FSMNWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS

SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVWDMGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 140) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

FSMNWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab33 SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCAHGVLDYGDMLDPWGQGTLVTVSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 141) (ID. DE SEQ. N°: 15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLN

YSMNWVRQAPGKGLEWVSYISPDAST IYYAD WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGS Ab34 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGG

YCARGVLDYGDMLDPWGQGTLVT VSS GTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 142) (ID. DE SEQ. N°: 15)

[00276] Dessa forma, a invenção fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada possui pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% e 100%) de identidade de sequência com qualquer uma das sequências selecionadas do grupo que consiste em: Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, e Ab34; e, em que o domínio variável da cadeia leve possui pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das sequências selecionadas de Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, e Ab34, em que, opcionalmente, o domínio variável da cadeia pesada pode opcionalmente ter pelo menos 95% de identidade de sequência, e/ou, o domínio variável da cadeia leve pode ter pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% 99% e 100%) de identidade de sequência.

Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento possui pelo menos 90% de identidade de sequência com o ID.

DE SEQ.

N°: 13, e em que, opcionalmente, o domínio variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento possui pelo menos 90% de identidade de sequência com o ID.

DE SEQ.

N°: 15. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento possui pelo menos 95% de identidade de sequência com o ID.

DE SEQ.

N°: 13, e em que, opcionalmente, o domínio variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento possui pelo menos 95% de identidade de sequência com o ID.

DE SEQ.

N°: 15. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento possui pelo menos 98% de identidade de sequência com o ID. DE SEQ. N°: 13, e em que, opcionalmente, o domínio variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento possui pelo menos 98% de identidade de sequência com o ID. DE SEQ. N°: 15. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento possui 100% de identidade de sequência com o ID. DE SEQ. N°: 13, e em que, opcionalmente, o domínio variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento possui 100% de identidade de sequência com o ID. DE SEQ. N°: 15.

[00277] Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para a sequência de ácidos nucleicos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 14, e uma sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para a sequência de ácidos nucleicos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 16. Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste, compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 14, e uma sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 16.

[00278] Em alguns exemplos, qualquer um dos anticorpos da revelação que se ligam especificamente a um complexo GARP- TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 incluem qualquer anticorpo (incluindo porções de ligação ao antígeno deste) que possui uma ou mais sequências de CDR (por exemplo, CDRH ou CDRL) substancialmente similares à CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e/ou CDRL3. Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma ou mais sequências de CDR como mostradas na Tabela 4 que contêm até 5, 4, 3, 2 ou 1 variações de resíduos de aminoácidos, comparado com a região correspondente CDR em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 6, 12, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126. Em algumas modalidades, uma ou mais das seis sequências de CDR contêm até três (3) alterações de aminoácidos, comparadas com as sequências fornecidas na Tabela 4. Essas variantes de anticorpo que compreendem até 3 alterações de aminoácidos por CDR são englobadas pela presente invenção. Em algumas modalidades, esses anticorpos variantes são gerados pelo processo de otimização, por exemplo, maturação de afinidade. As sequências de aminoácidos completas para a região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve dos anticorpos listados na Tabela 7 (por exemplo, Ab6), bem como as sequências de ácidos nucleicos que codificam a região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve de certos anticorpos são fornecidas abaixo:

[00279] Ab3 – Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada

[00280] EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDF

DYWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 95)

[00281] Ab6 – Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada

[00282] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEW

VSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDM LMPWGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 13)

[00283] Ab6 – Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve

[00284] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLL

IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVE IK (ID. DE SEQ. N°: 15)

[00285] Ab6 – Sequência de aminoácidos da cadeia pesada

[00286] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEW

VSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDM LMPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGP PCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ

PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (ID. DE SEQ. N°: 17)

[00287] Ab6 – Sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada

[00288] GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG

GTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTTCAGCATGGACT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTCCCAGTGCA GACACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGC CAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACT ACTGCGCCAGAGGGGTGCTCGACTACGGAGACATGTTAATGCCATGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTG CTCCCGGTCCACCTCCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCC CTGAGCCTGTGACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTC CCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTC CTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCA AGGTGGACAAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCT GAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCTG AGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCT CGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCAGCAACAAGGGCCTGCCCTCCT CCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACC CTGCCTCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTGAA GGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCAGAGAACA ACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAGG

CTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGGC (ID. DE SEQ. N°: 18)

[00289]

[00290] Ab6 – Sequência de aminoácidos da cadeia leve

[00291] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLL

IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVE

IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (ID. DE SEQ. N°: 19)

[00292] Ab6 – Sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve (kappa humana)

[00293] GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGG

AGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTACCAACTATTTAAATTGGT ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAA ACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCAT CAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGGCCGACAATCACC CTCCTTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGT GTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACG CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA

CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT (ID. DE SEQ. N°: 20)

[00294] Em algumas modalidades, a “identidade percentual” de duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.264-68, 1990, modificado como em Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5.873-77, 1993. Um algoritmo desse tipo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, e cols. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Pesquisas de proteína por BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína de interesse. Quando existirem lacunas entre duas sequências, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e cols., Nucleic Acids Res. 25 (17): 3.389-3.402, 1997. Quando são utilizados os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros-padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.

[00295] Em qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos nesse relatório descritivo, uma ou mais mutações conservativas podem ser introduzidas nas CDRs ou sequências framework em posições onde os resíduos provavelmente não estão envolvidos em uma interação anticorpo-antígeno. Em algumas modalidades, essa mutação (mutações) conservativa pode ser introduzida nas CDRs ou sequências framework em uma posição (ou posições) onde os resíduos provavelmente não estão envolvidos na interação com um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e um complexo LRRC33-TGFβ1, como determinado com base na estrutura cristal. Em algumas modalidades, a interface provável (por exemplo, resíduos envolvidos em uma interação antígeno-anticorpo) pode ser deduzida a partir de informação estrutural conhecida em outro antígeno que compartilha similaridades estruturais.

[00296] Como usada nesse relatório descritivo, uma “substituição de aminoácido conservativa” se refere a uma substituição de aminoácido que não altera as características relativas de carga ou tamanho da proteína na qual a substituição de aminoácido é feita. Variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alteração de sequências de polipeptídeos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, bem como os que podem ser encontrados em referências que compilam esses métodos, por exemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, J. Sambrook, e cols., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989, ou “Current Protocols in Molecular Biology”, F.M. Ausubel, e cols., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova York. Substituições de aminoácidos conservativas incluem substituições feitas entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; e (g) E, D.

[00297] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste relatório descritivo compreendem mutações que conferem propriedades desejáveis aos anticorpos. Por exemplo, para evitar complicações potenciais em função da troca do braço de Fab, que sabidamente ocorre com mAbs IgG4 nativos, os anticorpos fornecidos neste relatório descritivo podem compreender uma mutação estabilizadora ‘Adair’ (Angal e cols., “A Single Amino Acid Substitution Abolishes the Heterogeneity of Chimeric Mouse/Human (IgG4) Antibody”, Mol. Immunol. 30, 105-108; 1993), em que serina 228 (numeração de EU; resíduo 241 na numeração de Kabat) é convertida em prolina resultando em uma sequência de dobradiça IgG1-like (CPPCP (ID. DE SEQ. Nº: 54)). Consequentemente, qualquer um dos anticorpos pode incluir uma mutação estabilizadora ‘Adair’ ou a sequência de aminoácidos CPPCP (ID. DE SEQ. Nº: 54).

[00298] Os inibidores de TGFβ1 contexto-independentes, isoforma-específico, da presente revelação podem opcionalmente compreender regiões constantes de anticorpo ou partes destas. Por exemplo, um domínio VL pode ser anexado em sua extremidade do terminal-C a um domínio constante da cadeia leve como Cκ ou Cλ. Similarmente, um domínio VH ou porção deste pode ser anexado a toda ou parte de uma cadeia pesada como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e qualquer subclasse de isótipo. Anticorpos podem incluir regiões constantes adequadas (veja, por exemplo, Kabat e cols., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, No. 91-3242, “National Institutes of Health Publications”, Bethesda, Md. (1991)). Portanto, anticorpos dentro do escopo dessa revelação incluem domínios VH e VL, ou uma porção de ligação ao antígeno destes, combinados com quaisquer regiões constantes adequadas.

[00299] Adicionalmente ou alternativamente, esses anticorpos podem ou não incluir a região framework dos anticorpos dos IDS. DE SEQ. Nos: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 e 15. Em algumas modalidades, anticorpos que se ligam especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1- TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 são anticorpos murídeos e incluem sequências da região framework murídeas.

[00300] Em algumas modalidades, esses anticorpos se ligam a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 com afinidade relativamente alta, por exemplo, com uma KD menor do que 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M ou menos. Por exemplo, esses anticorpos podem se ligar a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 com uma afinidade entre 5 pM e 1 nM, por exemplo, entre 10 pM e 1 nM, por exemplo, entre 10 pM e 100 pM. A revelação também inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que competem com qualquer um dos anticorpos descritos nesse relatório descritivo pela ligação a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 e que possuem um valor da KD de 1 nM ou menor (por exemplo, 1 nM ou menor, 500 pM ou menor, 100 pM ou menor). A afinidade e cinética de ligação dos anticorpos que se ligam especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1- TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 podem ser testadas usando qualquer método adequado incluindo, sem limitação, tecnologia baseada em biossensor

(por exemplo, OCTET® ou BIACORE) e tecnologia baseada em titulação de solução em equilíbrio (por exemplo, MSD-SET).

[00301] Em algumas modalidades, inibidores de TGFβ1 associado à célula (por exemplo, TGFβ1 apresentado por GARP e TGFβ1 apresentado por LRRC33) de acordo com a invenção incluem anticorpos ou fragmentos destes que se ligam especificamente a esse complexo (por exemplo, GARP-TGFβ1 pró/latente e LRRC33-TGFβ1 pró/latente) e desencadeiam a internalização do complexo. Esse modo de ação causa a remoção ou depleção dos complexos de TGFβ1 inativos (por exemplo, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1) da superfície celular (por exemplo, Treg, macrófagos etc.) e, dessa forma, reduz TGFβ1 disponível para ativação. Em algumas modalidades, esses anticorpos ou fragmentos destes se ligam ao complexo- alvo de uma forma pH-dependente, de modo que a ligação ocorra em pH neutro ou fisiológico, mas o anticorpo se dissocia de seu antígeno em um pH ácido; ou, as taxas de dissociação são maiores em pH ácido do que em pH neutro. Esses anticorpos ou fragmentos destes podem funcionar como anticorpos de reciclagem. Anticorpos que competem com anticorpos inibidores de TGFβ, de alta afinidade, isoforma-específicos

[00302] Aspectos da revelação estão relacionados a anticorpos que competem ou competem de forma cruzada com qualquer um dos anticorpos fornecidos neste relatório descritivo. O termo “compete”, como usado nesse relatório descritivo com relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo se liga a um epitopo (por exemplo, um epitopo de um complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1- pró-TGFβ1, um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 e/ou um complexo

LRRC33-pró-TGFβ1) de uma forma suficientemente similar ou sobreposta à ligação de um segundo anticorpo, de modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epitopo é diminuída de forma detectável na presença do segundo anticorpo, comparada com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, em que a ligação do segundo anticorpo ao seu epitopo também é diminuída de forma detectável na presença do primeiro anticorpo, pode, não necessariamente, ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epitopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epitopo. No entanto, quando cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo com seu epitopo ou ligante, seja na mesma extensão, em uma extensão maior ou menor, considera-se que os anticorpos “competem de forma cruzada” entre eles pela ligação de seu(s) respectivo(s) epitopo(s). Anticorpos que competem e que competem de forma cruzada estão dentro do escopo dessa revelação. Independentemente do mecanismo pelo qual essa competição ou competição cruzada ocorre (por exemplo, impedimento estérico, alteração conformacional, ou ligação a um epitopo comum, ou porção deste), aqueles habilitados na técnica observariam que esses anticorpos que competem e/ou que competem de forma cruzada estão englobados e podem ser úteis para os métodos e/ou composições fornecidas neste relatório descritivo. O termo “bloqueio cruzado” pode ser usado de forma intercambiável.

[00303] Dois anticorpos monoclonais diferentes (ou fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam ao mesmo antígeno podem ser capazes de se ligar simultaneamente ao antígeno se os sítios de ligação estão suficientemente afastados no espaço tridimensional, de modo que cada ligação não interfira com a outra ligação. Em contraste, dois anticorpos monoclonais diferentes podem ter regiões de ligação de um antígeno que são as mesmas ou sobrepostas, quando então a ligação do primeiro anticorpo pode evitar que o segundo anticorpo seja capaz de se ligar ao antígeno, ou vice-versa. No último caso, diz-se que os dois anticorpos “bloqueiam de forma cruzada” ente eles com relação ao mesmo antígeno.

[00304] Experimentos de “compartimentalização” de anticorpo são úteis para a classificação de múltiplos anticorpos que são feitos contra o mesmo antígeno em vários “compartimentos” com base nas atividades relativas de bloqueio cruzado. Cada “compartimento”, portanto, representa uma região (ou regiões) de ligação distinta do antígeno. Anticorpos no mesmo compartimento por definição bloqueiam de forma cruzada entre eles. A compartimentalização pode ser examinada por ensaios de ligação in vitro padronizados, por exemplo, Biacor ou Octet®, usando condições de teste padronizadas, por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, ligação testada em temperatura ambiente, aproximadamente 20-25°C).

[00305] Aspectos da revelação estão relacionados aos anticorpos que competem ou competem de forma cruzada com qualquer um dos anticorpos específicos, ou porções de ligação ao antígeno destes, como fornecidos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, se liga no mesmo epitopo ou perto dele que qualquer um dos anticorpos fornecidos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, se liga perto de um epitopo se ele se liga dentro de 15 ou menos resíduos de aminoácidos do epitopo. Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos, ou porção de ligação ao antígeno destes, como fornecidos neste relatório descritivo, se liga dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos de um epitopo que é ligado por qualquer um dos anticorpos fornecidos neste relatório descritivo.

[00306] Em outra modalidade, é fornecido nesse relatório descritivo um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, que compete ou compete de forma cruzada pela ligação a qualquer um dos antígenos fornecidos nesse relatório descritivo (por exemplo, um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1) com uma constante de dissociação em equilíbrio, KD, entre o anticorpo e a proteína de menos do que 10-8 M. Em outras modalidades, um anticorpo compete ou compete de forma cruzada pela ligação a qualquer um dos antígenos fornecidos nesse relatório descritivo com uma KD em uma faixa de 10-12 M a 10-9 M. Em algumas modalidades, é fornecido nesse relatório descritivo um anticorpo anti- TGFβ1, ou porção de ligação ao antígeno deste que compete pela ligação com um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, é fornecido nesse relatório descritivo um anticorpo anti-TGFβ1, ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo.

[00307] Qualquer um dos anticorpos fornecidos neste relatório descritivo pode ser caracterizado usando quaisquer métodos adequados. Por exemplo, um método é identificar o epitopo ao qual o antígeno se liga, ou “mapeamento de epitopo”. Há muitos métodos adequados para mapeamento e caracterização da localização de epitopos em proteínas, incluindo a solução da estrutura cristal de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmento de gene e ensaios baseados em peptídeo sintético, como descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, “Using Antibodies, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,

1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epitopo pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo se liga. O epitopo pode ser um epitopo linear, ou seja, contido em um trecho único de aminoácidos, ou um epitopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que podem não estar necessariamente contidos em um trecho único (sequência da estrutura primária linear). Em algumas modalidades, o epitopo é um epitopo de TGFβ1 que só está disponível para ligação pelo anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo, quando o TGFβ1 está em um complexo GARP-pró- TGFβ1, um complexo LTBP1-pró-TGFβ1, um complexo LTBP3-pró- TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-pró-TGFβ1. Peptídeos de comprimentos variáveis (por exemplo, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente) e usados para ensaios de ligação com um anticorpo. Em outro exemplo, o epitopo ao qual o anticorpo se liga pode ser determinado em uma avaliação sistemática por utilização de peptídeos sobrepostos derivados da sequência do antígeno-alvo e determinação da ligação pelo anticorpo.

De acordo com os ensaios de expressão de fragmento de gene, o quadro de leitura aberta que codifica o antígeno-alvo é fragmentado aleatoriamente ou por construções genéticas específicas e a reatividade dos fragmentos expressos do antígeno com o anticorpo a ser testado é determinada.

Os fragmentos de gene podem ser produzidos, por exemplo, por PCR e depois transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos.

A ligação do anticorpo aos fragmentos de antígeno marcados radioativamente é então determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel.

Certos epitopos também podem ser identificados por utilização de grandes bibliotecas de sequências peptídicas aleatórias exibidas na superfície de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos peptídicos sobrepostos pode ser testada para a ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples.

Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação ao antígeno, experimentos de troca de domínios e mutagênese por varredura de alanina podem ser realizados para identificar resíduos exigidos, suficientes e/ou necessários para ligação do epitopo.

Por exemplo, experimentos de troca de domínios podem ser realizados usando um mutante de um antígeno-alvo no qual vários fragmentos do complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1-pró-TGFβ1, um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 foram substituídos (trocados) com sequências de uma proteína intimamente relacionada, mas antigenicamente distinta, por exemplo, outro membro da família de proteína TGFβ (por exemplo, GDF11).

[00308] Alternativamente, podem ser realizadas ensaios de competição usando outros anticorpos que sabidamente se ligam ao mesmo antígeno para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epitopo que os outros anticorpos. Ensaios de competição são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00309] Em algumas modalidades, a invenção inclui anticorpos (por exemplo, imunoglobulinas, fragmentos de ligação ao antígeno etc.) que bloqueiam de forma cruzada (competem de forma cruzada) com qualquer um dos anticorpos da Categoria 1, Categoria 2, Categoria 3, Categoria 4 e/ou Categoria 5. Dessa forma, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser feita pelo processo que compreende uma etapa de: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que compete de forma cruzada com um anticorpo da Categoria 1; e, formulação do anticorpo em uma composição farmacêutica.

[00310] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser feita pelo processo que compreende uma etapa de: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que compete de forma cruzada com um anticorpo da Categoria 2; e, formulação do anticorpo em uma composição farmacêutica.

[00311] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser feita pelo processo que compreende uma etapa de: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que compete de forma cruzada com um anticorpo da Categoria 3; e, formulação do anticorpo em uma composição farmacêutica.

[00312] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser feita pelo processo que compreende uma etapa de: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que compete de forma cruzada com um anticorpo da Categoria 4; e, formulação do anticorpo em uma composição farmacêutica.

[00313] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser feita pelo processo que compreende uma etapa de: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que compete de forma cruzada com um anticorpo da Categoria 5; e, formulação do anticorpo em uma composição farmacêutica.

[00314] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser feita pelo processo que compreende uma etapa de: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que compete de forma cruzada com o anticorpo selecionado do grupo que consiste em Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 e Ab34; e, formulação em uma composição farmacêutica.

[00315] De preferência, o anticorpo selecionado pelo processo é um ligante de alta afinidade caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a cada um dos LLCs humanos (por exemplo, hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1) com uma KD de ≤ 5 nM, como medida por titulação de solução em equilíbrio. Em algumas modalidades, o anticorpo atende aos critérios de uma ou mais da Categoria

1, Categoria 2, Categoria 3, Categoria 4 e Categoria 5. Esses anticorpos que competem de forma cruzada podem ser usados no tratamento de indicações relacionadas ao TGFβ1 em um indivíduo de acordo com a presente revelação. Diversas modificações e variações de anticorpos

[00316] Variações, modificações e características não limitantes de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes englobados pela presente revelação são brevemente discutidas abaixo. Modalidades de métodos analíticos relacionados, também são fornecidas.

[00317] Unidades estruturais de anticorpo de ocorrência natural tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada um desses tetrâmeros tipicamente é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia “leve” de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 50-70 kDa). A porção do terminal amino de cada cadeia tipicamente inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que tipicamente é responsável pelo reconhecimento de antígeno. A porção do terminal carbóxi de cada cadeia tipicamente define uma região constante que pode ser responsável pela função efetora. Cadeias leves de anticorpo humano tipicamente são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. As cadeias pesadas são tipicamente classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isótipo do anticorpo. Um anticorpo pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgM, IgD, IgG, IgA, IgY e IgE) e classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 e IgA2). Dentro das cadeias leves e pesadas de comprimento total, tipicamente, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região “D” de cerca de mais 10 aminoácidos (veja, por exemplo, “Fundamental Immunology”, Capítulo 7 (Paul, W., ed., 2ª Edição, Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referência em sua totalidade)). As regiões variáveis de cada par de cadeias leves/pesadas tipicamente formam um sítio de ligação ao antígeno.

[00318] As regiões variáveis tipicamente exibem a mesma estrutura geral de regiões framework (FR) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par tipicamente são alinhadas pelas regiões framework, o que pode permitir a ligação a um epitopo específico. Do terminal-N para o terminal-C, ambas as regiões variáveis da cadeia leve e pesada tipicamente compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos para cada domínio está tipicamente de acordo com as definições de “Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest” (“National Institutes of Health”, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia e cols. (1989) Nature 342: 878-883. As CDRs de uma cadeia leve também podem ser referidas como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, e as CDRs de uma cadeia pesada também podem ser referidas como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3. Em algumas modalidades, um anticorpo pode compreender um pequeno número de deleções de aminoácidos da extremidade carbóxi da cadeia (ou cadeias) pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma cadeia pesada que possui 1-5 deleções de aminoácidos na extremidade carbóxi da cadeia pesada. Em certas modalidades, a delineação definitiva de uma CDR e a identificação de resíduos que compreendem o sítio de ligação de um anticorpo é obtida por solução da estrutura do anticorpo e/ou solução da estrutura do complexo anticorpo- ligante. Em certas modalidades, isso pode ser obtido por qualquer uma de diversas metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, cristalografia de raios-X. Em algumas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as regiões CDR. Exemplos desses métodos incluem, sem limitação, a definição de Kabat, a definição de Chothia, a definição de AbM e a definição de contato.

[00319] Um anticorpo com “afinidade maturada” é um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs deste, que resultam em um aumento na afinidade do anticorpo pelo antígeno, comparado com um anticorpo parental, que não possui aquela alteração (ou alterações). Anticorpos com afinidade maturada exemplares terão afinidades nanomolares ou até mesmo picomolares pelo antígeno-alvo. Anticorpos com afinidade maturada são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks e cols. (1992) Bio/Technology 10: 779-783 descreve a maturação da afinidade por embaralhamento do domínio VH e VL. A mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos framework é descrita por Barbas, e cols. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3.809-3.813; Schier e cols. (1995) Gene 169: 147-155; Yelton e cols., (1995) J. Immunol. 155: 1.994-2.004; Jackson e cols. (1995) J. Immunol. 154 (7): 3.310-9; e Hawkins e cols. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; e a mutação seletiva em posições de mutagênese seletivas, posições de contato ou hipermutação com um resíduo de aminoácido que aumenta a atividade é descrita na Patente U.S. Nº 6.914.128. Tipicamente, um anticorpo parental e sua prole com afinidade maturada (por exemplo, derivados) retêm a mesma região de ligação dentro de um antígeno, embora certas interações no nível molecular possam ser alteradas em função da alteração (ou alterações) de resíduo de aminoácido introduzida por maturação de afinidade.

[00320] O termo “anticorpo com CDR enxertada” se refere aos anticorpos que compreendem sequências da região variável da cadeia pesada e leve de uma espécie, mas nos quais as sequências de uma ou mais das regiões CDR de VH e/ou VL são substituídas com sequências de CDR de outra espécie, por exemplo, anticorpos que possuem regiões variáveis da cadeia pesada e leve murídeas nas quais uma ou mais das CDRs murídeas (por exemplo, CDR3) foram substituídas com sequências de CDR humana.

[00321] O termo “anticorpo quimérico” se refere aos anticorpos que compreendem sequências da região variável da cadeia pesada e leve de uma espécie e sequências da região constante de outra espécie, tais como anticorpos que possuem regiões variáveis da cadeia pesada e leve murídeas ligadas a regiões constantes humanas.

[00322] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “framework” ou “sequência framework” se refere às sequências restantes de uma região variável menos as CDRs. Como a definição exata de uma sequência de CDR pode ser determinada por sistemas diferentes, consequentemente o significado de uma sequência framework está sujeito a diferentes interpretações. As seis CDRs (CDR-L1, -L2 e -L3 da cadeia leve e CDR-H1, -H2 e -H3 da cadeia pesada) também dividem as regiões framework na cadeia leve e na cadeia pesada em quatro subregiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, nas quais CDR1 está posicionada entre FR1 e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as subregiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FR4, uma região framework, como referida por outros, representa as FRs combinadas dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina de ocorrência natural. Como usada nesse relatório descritivo, uma FR representa uma das quatro subregiões, e FRs representam duas ou mais das quatro subregiões que constituem uma região framework.

[00323] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia pesada 1 (H-FR1) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (ID. DE SEQ. N°: 174). Por exemplo, o resíduo Gly na posição 16 pode ser substituído com um Arg (R); e/ou, o resíduo Ala na posição 23 pode ser substituído com um Thr (T).

[00324] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia pesada 2 (H-FR2) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: WVRQAPGKGLEWVS (ID. DE SEQ. N°: 175).

[00325] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia pesada 3 (H-FR3) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC (ID. DE SEQ. N°:

176). Por exemplo, o resíduo Ser na posição 12 pode ser substituído com um Thr (T).

[00326] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia pesada 4 (H-FR4) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: WGQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 177).

[00327] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia leve 1 (L-FR1) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (ID. DE SEQ. N°: 178).

[00328] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia leve 2 (L-FR2) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: WYQQKPGKAPKLLIY (ID. DE SEQ. N°: 179).

[00329] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia leve 3 (L-FR3) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (ID. DE SEQ. N°: 180).

[00330] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende uma região framework da cadeia leve 4 (L-FR4) que possui a seguinte sequência de aminoácidos com opcionalmente 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos: FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 181).

[00331] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, compreende um domínio constante de da cadeia pesada de imunoglobulina de um domínio constante de IgM humana, um domínio constante de IgG humana, um domínio constante de IgG1 humana, um domínio constante de IgG2 humana, um domínio constante de IgG2A humana, um domínio constante de IgG2B humana, um domínio constante de IgG2 humana, um domínio constante de IgG3 humana, um domínio constante de IgG3 humana, um domínio constante de IgG4 humana, um domínio constante de IgA humana, um domínio constante de IgA1 humana, um domínio constante de IgA2 humana, um domínio constante de IgD humana ou um domínio constante de IgE humana. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, compreende um domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina de um domínio constante de IgG1 humana ou um domínio constante de IgG4 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, compreende um domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina de um domínio constante de IgG4 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, compreende um domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina de um domínio constante de IgG4 humana que possui uma substituição do arcabouço de Ser para Pro que produz uma dobradiça IgG1-like e permite a formação de ligações dissulfeto intercadeias.

[00332] Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste, ainda compreende um domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina que compreende um domínio constante lambda de Ig humana ou um domínio constante kappa de Ig humana.

[00333] Em algumas modalidades, o anticorpo é uma IgG que possui quatro cadeias polipeptídicas que são duas cadeias pesadas e duas cadeias leves.

[00334] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado, um diabody ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um framework que possui uma sequência de aminoácidos da linhagem germinativa humana.

[00335] Em algumas modalidades, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento scFab ou um fragmento scFv.

[00336] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “gene de anticorpo de linhagem germinativa” ou “fragmento gênico” se refere a uma sequência de imunoglobulina codificada por células não linfóides que não passou pelo processo de maturação que leva ao rearranjo genético e mutação para expressão de uma imunoglobulina particular (veja, por exemplo, Shapiro e cols. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22 (3): 183-200; Marchalonis e cols. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30). Uma das vantagens fornecidas por várias modalidades da presente revelação é decorrente do reconhecimento de que genes de anticorpo da linhagem germinativa têm maior probabilidade de que genes de anticorpo maduro conservem estruturas de sequência de aminoácidos essenciais características de indivíduos na espécie e, dessa forma, maior probabilidade de serem reconhecidos como de uma fonte estranha, quando usados terapeuticamente naquela espécie.

[00337] Como usado nesse relatório descritivo, o termo

“neutralizante” se refere à ação contrária à atividade biológica de um antígeno quando uma proteína de ligação se liga especificamente ao antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação neutralizante se liga ao antígeno/alvo, por exemplo, citocina, quinase, fator do crescimento, proteína da superfície celular, proteína solúvel, fosfatase ou ligante de receptor, e reduz sua atividade biológica por pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em algumas modalidades, um anticorpo neutralizante para um fator de crescimento se liga especificamente a um fator de crescimento solúvel maduro que foi liberado por um complexo latente impedindo, dessa forma, sua habilidade para se ligar ao seu receptor para provocar sinalização a jusante. Em algumas modalidades, o fator de crescimento maduro é TGFβ1 ou TGFβ3.

[00338] O termo “proteína de ligação”, como usado nesse relatório descritivo, inclui qualquer polipeptídeo que se liga especificamente a um antígeno (por exemplo, TGFβ1) incluindo, sem limitação, um anticorpo, ou porções de ligação ao antígeno deste, um DVD-IgTM, um TVD-Ig, um RAb-Ig, um anticorpo biespecífico e um anticorpo específico duplo.

[00339] O termo “anticorpo monoclonal” ou “mAb”, quando usado em um contexto de uma composição que compreende o mesmo, pode se referir a uma preparação de anticorpo obtida de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único antígeno. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes (epitopos) diferentes, cada mAb é dirigido contra um único determinante no antígeno. O modificador “monoclonal” não deve ser considerado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular.

[00340] O termo “anticorpo humano recombinante”, como usado nesse relatório descritivo, visa incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, por exemplo, anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrita com mais detalhe na Seção II C, abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpo humano, recombinante (Hoogenboom, H.R. (1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy, H. e Highsmith, W.E. (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo, J.V. e Larrick, J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom, H. e Chames, P. (2000) Immunol. Today 21: 371-378, incorporados nesse relatório descritivo por referência), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (veja, Taylor, L. D. e cols. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6.287-6.295; Kellermann, S-A. e Green, L.L. (2002) Cur. Opin. in Biotechnol. 13: 593-597; Little, M. e cols. (2000) Immunol. Today 21: 364-370) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por outros meios que envolvem splicing de sequências do gene de imunoglobulina humana com outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, esses anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, dessa forma, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas às sequências de VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.

[00341] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “Imunoglobulina de Domínio Variável Duplo” ou “DVD-IgTM” e semelhantes incluem proteínas de ligação que compreendem um polipeptídeo de DVD da cadeia pesada e um polipeptídeo de DVD da cadeia leve pareados, com cada cadeia pesada e leve pareada fornecendo dois sítios de ligação ao antígeno. Cada sítio de ligação inclui um total de 6 CDRs envolvidas na ligação ao antígeno por sítio de ligação ao antígeno. Um DVD-IgTM tipicamente possui dois braços ligados entre eles, pelo menos em parte, por dimerização dos domínios CH3, com cada braço do DVD sendo biespecífico, fornecendo uma imunoglobulina com quatro sítios de ligação. DVD-IgTM são fornecidos nas Publicações de Patente U.S. Nos 2010/0260668 e 2009/0304693, cada uma delas incorporada nesse relatório descritivo por referência, incluindo listagens de sequências.

[00342] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “Imunoglobulina de Domínio Variável Triplo” ou “TVD-Ig” e semelhantes são proteínas de ligação que compreendem um polipeptídeo de proteína de ligação TVD da cadeia pesada e um polipeptídeo de proteína de ligação TVD da cadeia leve pareados com cada cadeia pesada e leve pareada fornecendo três sítios de ligação ao antígeno. Cada sítio de ligação inclui um total de 6 CDRs envolvidas na ligação ao antígeno por sítio de ligação ao antígeno. Uma proteína de ligação TVD pode ter dois braços ligados entre eles, pelo menos em parte, por dimerização dos domínios CH3, com cada braço da proteína de ligação TVD sendo triespecífico, fornecendo uma proteína de ligação com seis sítios de ligação.

[00343] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “Imunoglobulina de Receptor-Anticorpo” ou “RAb-Ig” e semelhantes são proteínas de ligação que compreendem um polipeptídeo RAb da cadeia pesada e um polipeptídeo RAb da cadeia leve, que juntos formam três sítios de ligação ao antígeno no total. Um sítio de ligação ao antígeno é formado por pareamento dos domínios variáveis pesados e leves de anticorpo presentes em cada um do polipeptídeo RAb da cadeia pesada e do polipeptídeo RAb da cadeia leve para formar um único sítio de ligação com um total de 6 CDRs, que fornecem um primeiro sítio de ligação ao antígeno. Cada um do polipeptídeo RAb da cadeia pesada e do polipeptídeo RAb da cadeia leve inclui uma sequência receptora que se liga independentemente a um ligante fornecendo o segundo e terceiro sítios de ligação ao “antígeno”. Um RAb-Ig tipicamente possui dois braços ligados entre eles, pelo menos em parte, por dimerização dos domínios CH3, com cada braço do RAb-Ig sendo triespecífico, fornecendo uma imunoglobulina com seis sítios de ligação. RAb-Igs são descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº 2002/0127231, cujo conteúdo total, incluindo listagens de sequências, é incorporado nesse relatório descritivo por referência).

[00344] O termo “anticorpo biespecífico”, como usado nesse relatório descritivo, e como diferenciado de uma “proteína de ligação biespecífica half-Ig” ou “proteína de ligação biespecífica (half-Ig)”, se refere aos anticorpos de comprimento total que são gerados pela tecnologia de quadroma (veja Milstein, C. e Cuello, A.C. (1983) Nature 305 (5934): páginas 537-540), por conjugação química de dois anticorpos monoclonais diferentes (veja Staerz, U.D. e cols. (1985) Nature 314 (6012): 628-631), ou por abordagens knob-into- hole ou similares, que introduzem mutações na região Fc que não inibem a dimerização CH3-CH3 (veja Holliger, P. e cols. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (14): 6.444-6.448), resultando em múltiplas espécies de imunoglobulina diferentes, das quais somente uma é o anticorpo biespecífico funcional. Por função molecular, um anticorpo biespecífico se liga a um antígeno (ou epitopo) em um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC), e se liga a um antígeno (ou epitopo) diferente em seu segundo braço (um par de HC/LC diferente). Por essa definição, um anticorpo biespecífico possui dois braços de ligação ao antígeno distintos (em termos de especificidade e sequências de CDR), e é monovalente para cada antígeno ao qual se liga.

[00345] O termo “anticorpo específico duplo”, como usado nesse relatório descritivo, e como diferenciado de uma proteína de ligação biespecífica half-Ig ou uma proteína de ligação biespecífica, se refere aos anticorpos de comprimento total que podem se ligar a dois antígenos (ou epitopos) diferentes em cada um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC) (veja a Publicação PCT Nº WO 02/02773). Consequentemente, uma proteína de ligação específica dupla possui dois braços de ligação ao antígeno idênticos, com especificidade idêntica e sequências de CDR idênticas, e é bivalente para cada antígeno ao qual se liga.

[00346] O termo “Kon”, como usado nesse relatório descritivo, visa se referir à constante da taxa on para associação de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) ao antígeno para formar, por exemplo, o complexo antígeno/anticorpo, como é conhecido na técnica. A “Kon” também é conhecida pelos os termos “constante da taxa de associação”, ou “ka”, como usado de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Esse valor que indica a taxa de ligação de um anticorpo ao seu antígeno-alvo ou a taxa de formação de complexo entre um anticorpo e antígeno também é mostrado pela equação: Anticorpo (“Ab”) + Antígeno (“Ag”) → Ab-Ag.

[00347] O termo “Koff”, como usado nesse relatório descritivo, visa se referir à constante da taxa off para dissociação de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo), por exemplo, do complexo antígeno/anticorpo, como é conhecido na técnica. A “Koff” também é conhecida pelos termos “constante da taxa de dissociação” ou “kd”, como usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Esse valor indica a taxa de dissociação de um anticorpo de seu antígeno-alvo ou separação do complexo Ag-Ab ao longo do tempo em anticorpo e antígeno livres, como mostrado pela equação: Ab + Ag ← Ab-Ag.

[00348] Os termos “constante de dissociação de equilíbrio” ou “KD”, como usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo, se referem ao valor obtido em uma medição de titulação no equilíbrio, ou por divisão da constante da taxa de dissociação (koff) pela constante da taxa de associação (kon). A constante da taxa de associação, a constante da taxa de dissociação e a constante de dissociação de equilíbrio são usadas para representar a afinidade de ligação de uma proteína de ligação, por exemplo, anticorpo, a um antígeno. Métodos para determinação das constantes da taxa de associação e de dissociação são bem conhecidos na técnica. O uso de técnicas baseadas em fluorescência oferece alta sensibilidade e a habilidade para examinar amostras em tampões fisiológicos no equilíbrio. Outras abordagens experimentais e instrumentos, por exemplo, um ensaio BIAcore® (análise de interação biomolecular), podem ser usados (por exemplo, instrumento disponível por BIAcore International AB, a GE Healthcare Company, Uppsala, Suécia). Adicionalmente, um ensaio KinExA® (Ensaio de Exclusão Cinética), disponível por Sapidyne Instruments (Boise, Idaho), também pode ser usado.

[00349] Os termos “cristal” e “cristalizada”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo), ou porção de ligação ao antígeno desta, que existe na forma de um cristal. Cristais são uma forma do estado sólido da matéria, que é distinta de outras formas como, por exemplo, o estado sólido amorfo ou o estado cristalino líquido. Cristais são compostos por arranjos tridimensionais regulares, repetitivos, de átomos, íons, moléculas (por exemplo, proteínas como, por exemplo, anticorpos), ou montagens moleculares (por exemplo, complexos antígeno/anticorpo). Esses arranjos tridimensionais estão dispostos de acordo com relacionamentos matemáticos específicos que são bem compreendidos no campo.

A unidade fundamental, ou bloco modular, que é repetida em um cristal é denominada a unidade assimétrica.

A repetição da unidade assimétrica em um arranjo que se adapta a certa simetria cristalográfica bem definida fornece a “célula unitária” do cristal.

A repetição da célula unitária por translações regulares em todas as três dimensões fornece o cristal.

Veja Giege, R. e Ducruix, A.

Barrett, “Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach”, 2ª Edição, páginas 201-16, Oxford University Press, Nova York, Nova York, (1999). O termo “ligante” é usado para designar polipeptídeos que compreendem dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e são usados para ligar uma ou mais porções de ligação ao antígeno.

Esses polipeptídeos ligantes são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Holliger, P. e cols. (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 90: 6.444-6.448; Poljak, R.J. e cols. (1994) Structure 2: 1.121-1.123). Ligantes exemplares incluem, sem limitação, ASTKGPSVFPLAP (ID.

DE SEQ.

N°: 55), ASTKGP (ID.

DE SEQ.

N°: 56); TVAAPSVFIFPP (ID.

DE SEQ.

N°: 57); TVAAP (ID.

DE SEQ.

N°: 58); AKTTPKLEEGEFSEAR (ID.

DE SEQ.

N°: 59); AKTTPKLEEGEFSEARV (ID.

DE SEQ.

N°: 60); AKTTPKLGG (ID.

DE SEQ.

N°: 61); SAKTTPKLGG (ID.

DE SEQ.

N°: 62); SAKTTP (ID.

DE SEQ.

N°: 63); RADAAP (ID.

DE SEQ.

N°: 64); RADAAPTVS (ID.

DE SEQ.

N°: 65); RADAAAAGGPGS (ID.

DE SEQ.

N°: 66); RADAAAA(G4S)4 (ID.

DE SEQ.

N°: 67); SAKTTPKLEEGEFSEARV (ID.

DE SEQ.

N°: 68); ADAAP (ID.

DE SEQ.

N°: 69); ADAAPTVSIFPP (ID.

DE SEQ.

N°: 70); QPKAAP (ID.

DE SEQ.

N°: 71); QPKAAPSVTLFPP (ID.

DE SEQ.

N°: 72); AKTTPP

(ID. DE SEQ. N°: 73); AKTTPPSVTPLAP (ID. DE SEQ. N°: 74); AKTTAP (ID. DE SEQ. N°: 75); AKTTAPSVYPLAP (ID. DE SEQ. N°: 76); GGGGSGGGGSGGGGS (ID. DE SEQ. N°: 77); GENKVEYAPALMALS (ID. DE SEQ. N°: 78); GPAKELTPLKEAKVS (ID. DE SEQ. N°: 79); GHEAAAVMQVQYPAS (ID. DE SEQ. N°: 80); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (ID. DE SEQ. N°: 81); e ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (ID. DE SEQ. N°: 82).

[00350] Os termos “marcador” e “marcador detectável” ou “porção detectável” significam uma porção anexada a um parceiro de ligação específico, por exemplo, um anticorpo ou um analito, por exemplo, para tornar a reação entre membros de um par de ligação específico, por exemplo, um anticorpo e um analito, detectável, e o parceiro de ligação específico, por exemplo, anticorpo ou analito, assim marcado é chamado “marcado de forma detectável”. Dessa forma, o termo “proteína de ligação marcada”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma proteína com um marcador incorporado que permite a identificação da proteína de ligação. Em uma modalidade, o marcador é um marcador detectável que pode produzir um sinal que é detectável por meios visuais ou instrumentais, por exemplo, incorporação de um aminoácido radiomarcado ou adesão a um polipeptídeo de porções de biotinil que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou uma atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, sem limitação, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho e 153Sm); cromógenos; marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina e lantanídeo fósforos); marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, luciferase e fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos biotinil; epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal e tags de epitopo); e agentes magnéticos, por exemplo, quelatos de gadolínio. Exemplos representativos de marcadores comumente empregados para imunoensaios incluem porções que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e porções que produzem fluorescência, por exemplo, fluoresceína. Outros marcadores são descritos nesse relatório descritivo. A esse respeito, a própria porção pode não ser marcada de forma detectável, mas pode se tornar detectável mediante reação com ainda outra porção. O uso do termo “marcado de forma detectável” visa englobar o último tipo de marcação detectável.

[00351] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, a um antígeno (por exemplo, complexo de proteína), por exemplo, complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1, é determinada com o uso de um ensaio Octet. Em algumas modalidades, um ensaio Octet é um ensaio que determina um ou mais parâmetros cinéticos indicativos de ligação entre um anticorpo e antígeno. Em algumas modalidades, um sistema Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) é usado para determinar a afinidade de ligação de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, a complexos molécula apresentadora-pró- TGFβ1. Por exemplo, afinidades de ligação de anticorpos podem ser determinadas usando o sistema de ensaio “forteBio Octet

QKe Dip and Read Label Free” que utiliza interferometria de biocamadas. Em algumas modalidades, os antígenos são imobilizados a biossensores (por exemplo, biossensores revestidos com estreptavidina) e os anticorpos e complexos (por exemplo, complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 biotinilados) são apresentados em solução em concentração alta (50 µg/mL) para mediar interações de ligação. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação de um anticorpo, ou porção de ligação a complexo molécula apresentadora-pró- TGFβ1 é determinada usando o protocolo descrito nesse relatório descritivo. Caracterização dos novos anticorpos de pró-TGFβ1 contexto- Independentes, de alta afinidade Perfis de ligação

[00352] Os anticorpos revelados nesse relatório descritivo possuem atividades de ligação aprimoradas. É incluída uma classe de anticorpos contexto-independentes, de alta afinidade, capazes de inibir seletivamente a ativação de TGFβ1. Observe que o termo “contexto independente” é usado nesse relatório descritivo com um grau maior de rigor comparado com o uso geral mais geral prévio. De acordo com a presente revelação, o termo confere um nível de uniformidade em afinidades relativas (ou seja, imparcialidade) que o anticorpo pode exercer para diferentes complexos de antígenos. Dessa forma, o anticorpo contexto- independente da presente invenção é capaz de alvejar vários tipos de complexos precursores de TGFβ1 (por exemplo, complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1) e de se ligar a cada um desses complexos com afinidades equivalentes (ou seja, diferenças de no máximo três vezes em afinidades relativas através dos complexos) com valores da KD menores do que 10 nM, preferivelmente menores do que 5 nM, mais preferivelmente menores do que 1 nM, ainda mais preferivelmente menores do que 100 pM, como medidas, por exemplo, por MSD-SET. Como apresentado abaixo, muitos anticorpos englobados pela invenção possuem valores da KD em uma faixa subnanomolar.

[00353] Dessa forma, os anticorpos são capazes de se ligar especificamente a cada um dos complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 humano (algumas vezes denominados “Complexo de Latência Grande”, que é um complexo ternário formado por um dímero de pró-TGFβ1 acoplado a uma única molécula apresentadora), especificamente, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Tipicamente, complexos de proteínas purificados, produzidos recombinantemente, são usados como antígenos (por exemplo, complexos de antígenos) para avaliar ou confirmar a habilidade de um anticorpo para se ligar aos complexos de antígenos em ensaios de ligação in vitro adequados. Esses ensaios são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, ensaios baseados em Interferometria de Biocamada (BLI)- (por exemplo, Octet®) e ensaios baseados em titulação de solução em equilíbrio (por exemplo, MSD-SET).

[00354] Ensaios de ligação baseados em BLI são amplamente usados na técnica para a medição de afinidades e cinética de anticorpos para antígenos. Ela é uma tecnologia sem marcador na qual interações biomoleculares são analisadas com base na interferência óptica. Uma das proteínas, por exemplo, um anticorpo que está sendo testado, pode ser imobilizada na ponta do biossensor. Quando a outra proteína em solução, por exemplo, um antígeno, se torna ligada ao anticorpo imobilizado, ela causa uma mudança no padrão de interferência, que pode ser medida em tempo real. Isso permite o monitoramento da especificidade de ligação, das taxas de associação e dissociação, bem como da dependência da concentração. Dessa forma, BLI é uma medida cinética que revela a dinâmica do sistema. Devido à sua facilidade de uso e resultados rápidos, ensaios baseados em BLI, tais como o sistema Octet® (disponível por ForteBio/Molecular Devices, Fremont Califórnia), são particularmente convenientes quando usados como um método de triagem inicial para identificar e separar um pool de “ligantes” de um pool de “não ligantes” ou “ligantes fracos” no processo de triagem.

[00355] Ensaios de ligação baseados em BLI revelaram que os novos anticorpos são caracterizados como anticorpos “contexto-equilibrados/contexto-independentes” quando a afinidade de ligação é medida por Octet®. Como pode ser observado na Tabela 8 que resume perfis de ligação baseados em BLI de exemplos não limitantes de anticorpos, esses anticorpos exibem valores da KD relativamente uniformes em uma faixa subnanomolar através dos quatro complexos-alvo, com diferenciais matriz-para-célula relativamente baixos (um viés de no máximo cinco vezes) (veja a coluna (H)). Isso pode ser contrastado contra o anticorpo identificado previamente Ab3, fornecido como um anticorpo de referência, que mostra afinidades relativas significantemente maiores para complexos associados à matriz (viés de 27+ vezes) em relação aos complexos associados à célula.

[00356] A Tabela 8 abaixo fornece exemplos não limitantes de anticorpos contexto-independentes, de alta afinidade,

contra pró-TGFβ1, englobados pela presente invenção. A tabela fornece resultados representativos de ensaios de ligação in vitro, como medidos por Octet®. Resultados similares também são obtidos por uma técnica baseada em SPR (Biacore System).

[00357] A Coluna (A) da tabela lista anticorpos monoclonais com sequências de aminoácidos distintas. Ab3 (mostrado em negrito) é um anticorpo de referência identificado previamente, que demonstrou ser potente em ensaios baseados em células; eficaz em vários modelos animais; e, com um perfil de toxicologia limpo (revelado em: PCT/US2018/012601). As Colunas (B), (D), (E) e (F) fornecem afinidades de cada um dos anticorpos listados, medidas em KD. A Coluna (B) mostra a afinidade para um complexo LTBP1- pró-TGFβ1 humano recombinante; a coluna (C) mostra a afinidade para um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 humano recombinante; (E) mostra a afinidade para um complexo GARP- pró-TGFβ1 humano recombinante; e (F) mostra a afinidade para um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 humano recombinante, de cada um dos anticorpos. Os valores médios da KD de (B) e (C) são mostrados na coluna correspondente (D), que representa coletivamente afinidades dos anticorpos para complexos pró- TGFβ1 associados à ECM ou à matriz. Similarmente, os valores médios da KD de (E) e (F) são mostrados na coluna correspondente (G), que representa coletivamente afinidades dos anticorpos para complexos pró-TGFβ1 associados à superfície celular ou à célula. Finalmente, as proporções relativas entre os valores médios da KD das colunas (D) e (G) são expressos como “razão de viés” na coluna (H). Dessa forma, quanto maior o número da coluna (H), maior será o viés para o anticorpo particular, quando se comparam as preferências de ligação do anticorpo para complexos associados à matriz e complexos da superfície celular.

Essa é uma forma de representar e comparar quantitativamente viés inerentes de anticorpos para os seus complexos-alvo.

Essas análises podem ser úteis para guiar o processo de seleção para um anticorpo candidato para um uso terapêutico particular.

Tabela 8. Exemplos não limitantes de anticorpos para TGFβ1 contexto-independentes e valores da KD medidos por BLI. (A) pró-TGFB1 associado à matriz pró-TGFB1 associado à célula (H) Ab de (B) (C) (D) (E) (F) (G) G/D referência hLTBP1 hLTBP3 MÉDIA da hGARP hLRRC33 MÉDIA (razão de matriz (nM) Célula (nM) viés)

Ab3 4,70E-10 4,59E-10 0,4645 1,73E-08 8,52E-09 12,91 27,79 Ab21 2,25E-10 2,68E-10 0,2465 8,33E-10 4,55E-10 0,644 2,613 Ab22 3,18E-10 3,29E-10 0,3235 9,74E-10 4,15E-10 0,6945 2,147 Ab23 4,17E-10 4,68E-10 0,4425 1,34E-09 4,55E-10 0,8975 2,028 Ab24 2,46E-10 1,98E-10 0,222 6,65E-10 4,10E-10 0,5375 2,421 Ab25 2,17E-10 1,52E-10 0,1845 4,88E-10 4,09E-10 0,4485 2,431 Ab26 2,21E-10 1,73E-10 0,197 6,25E-10 3,60E-10 0,4925 2,500 Ab27 1,78E-10 2,38E-10 0,208 4,24E-10 2,99E-10 0,3615 1,738 Ab28 3,40E-10 3,16E-10 0,328 7,97E-10 4,09E-10 0,603 1,838 Ab29 1,89E-10 1,21E-10 0,155 3,07E-10 3,02E-10 0,3045 1,965 AB30 3,32E-10 2,61E-10 0,2965 8,33E-10 5,35E-10 0,684 2,307 Ab31 2,36E-10 1,81E-10 0,2085 5,81E-10 4,10E-10 0,4955 2,376 Ab6 2,07E-10 1,23E-10 0,165 4,04E-10 3,36E-10 0,37 2,242

Ab32 2,69E-10 2,15E-10 0,242 4,96E-10 6,98E-10 0,597 2,467 Ab33 1,79E-10 1,11E-10 0,145 2,65E-10 3,39E-10 0,302 2,083

[00358] A invenção fornece uma classe de anticorpos contexto-independentes, de alta afinidade, cada um dos quais capaz de se ligar com afinidades equivalentes a cada um dos quatro complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 conhecidos, especificamente, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró- TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a cada um dos complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 com afinidades equivalentes ou maiores, comparado com o anticorpo de referência descrito previamente, Ab3. De acordo com a invenção, esse anticorpo se liga especificamente a cada um dos complexos mencionados anteriormente com uma afinidade (determinada por KD) de ≤ 5 nM, como medida por um ensaio de ligação in vitro adequado, por exemplo, Interferometria de Biocamada e ressonância de plásmon de superfície. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo LTBP1-pró-TGFβ1 humano com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM ou ≤ 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 humano com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM ou ≤ 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo GARP-pró-TGFβ1 humano com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM ou ≤ 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 humano com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM ou ≤ 0,5 nM.

[00359] Em modalidades preferidas, esse anticorpo é reativo de forma cruzada com humanos e murídeos. Dessa forma, em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo LTBP1-pró-TGFβ1 murídeo com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM ou ≤ 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 murídeo com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM ou ≤ 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo GARP-pró-TGFβ1 murídeo com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM ou ≤ 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento se liga a um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 murídeo com uma afinidade de ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM ou ≤ 0,5 nM.

[00360] Como mostrado, os anticorpos contra pró-TGFβ1 da presente revelação possuem afinidades particularmente elevadas para complexos pró-TGFβ1 associados à matriz. Em algumas modalidades, o valor médio da KD dos complexos associados à matriz (ou seja, LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró- TGFβ1) é ≤ 1 nM ou ≤ 0,5 nM.

[00361] Como mostrado, os anticorpos contra pró-TGFβ1 da presente revelação possuem afinidades elevadas para complexos pró-TGFβ1 associados à célula. Em algumas modalidades, o valor médio da KD dos complexos associados à célula (ou seja, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1) é ≤ 2 nM ou ≤ 1 nM.

[00362] Os anticorpos de alta afinidade contra pró-TGFβ1 da presente revelação são caracterizadas por suas afinidades uniformes (imparciais) para todos os quatro complexos de antígenos (compare, por exemplo, com Ab3). Nenhum complexo de antígenos isolado entre os quatro complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 conhecidos descritos nesse relatório descritivo se desvia significantemente em KD. Em outras palavras, foram obtidas atividades de ligação mais uniformes pela presente revelação em relação aos anticorpos contra pró-TGFβ1 descritos previamente (incluindo Ab3), pelo fato de que cada um desses anticorpos mostra afinidades equivalentes através dos quatro complexos de antígenos. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento mostra perfis de ligação imparciais ou uniformes, caracterizados pelo fato de que a diferença (ou faixa) de afinidades do anticorpo ou dos fragmentos através dos quatro complexos pró-TGFβ1 de antígenos é no máximo cinco vezes entre os menores e os maiores valores da KD. Em algumas modalidades, a diferença relativa (ou faixa) de afinidades é de, no máximo, três vezes.

[00363] O conceito de “uniformidade” ou ausência de viés é ainda ilustrado na Tabela 8. Os valores médios da KD entre os dois complexos associados à matriz e associados à célula são calculados, respectivamente (veja as colunas (D) e (G)). Esses valores médios da KD podem então ser usados para indagar se existe viés nas atividades de ligação entre complexos associados à matriz vs. complexos associados à superfície celular (por exemplo, células imunes). O viés pode ser expresso como “razão da diferença” nos valores médios da KD, como ilustrado na Tabela 8. Quando comparados com o anticorpo descrito previamente, Ab3, os anticorpos contexto-independentes, de alta afinidade, contra pró-TGFβ1, englobados pela presente revelação, são acentuadamente imparciais, pelo fato de que exibe diferença de no máximo três vezes nos valores médios da KD entre complexos associados à matriz e complexos associados à célula (compare isso com razão de viés 25+ em Ab3).

[00364] Consequentemente, é fornecida uma classe de anticorpos monoclonais contexto-independentes ou fragmentos, cada um dos quais capaz de se ligar com afinidades equivalentes a cada um dos seguintes complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 com uma afinidade de ≤ 1 nM, como medida por Interferometria de Biocamada ou ressonância de plásmon de superfície: LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Esse anticorpo se liga especificamente a cada um dos complexos mencionados anteriormente com uma afinidade de ≤ 5 nM, como medida por Interferometria de Biocamada ou ressonância de plásmon de superfície, em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento mostra um viés de no máximo três vezes em afinidade para qualquer um dos complexos acima em relação aos outros complexos, e em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento inibe a liberação de fator de crescimento TGFβ1 maduro de cada um dos complexos pró-TGFβ1, mas não de complexos pró- TGFβ2 ou pró-TGFβ3.

[00365] Embora a cinética de perfis de ligação (por exemplo, taxas “on” e “off”) que podem ser obtidos de ensaios baseados em BLI forneçam informação útil, o Requerente da presente revelação contemplou que, com base no mecanismo de ação dos inibidores da ativação revelados nesse relatório descritivo, ou seja, anticorpos que funcionam por ligação a um alvo atado (por exemplo, localizado em tecido) inativo (por exemplo, latente) evitando, dessa forma, que ele seja ativado, as propriedades de ligação medidas em equilíbrio talvez reflitam com mais precisão seu comportamento e potência in vivo. Para que isso seja colocado em perspectiva, como um exemplo, anticorpos com taxa “on” (“Kon”) rápida, o que seria refletido nas medições de ligação obtidas por BLI, poderiam fornecer parâmetros relevantes para a avaliação de anticorpos neutralizantes (por exemplo, anticorpos que alvejam diretamente e devem sequestrar rapidamente o próprio fator de crescimento solúvel, ativo, para que eles funcionem como inibidores eficazes). No entanto, o mesmo não se aplica necessariamente para anticorpos que funcionam como inibidores da ativação, tais como aqueles revelados nesse relatório descritivo. Como descrito, o mecanismo de ação dos novos inibidores de TGFβ1 da presente invenção é por meio da inibição da etapa de ativação, o que é obtido alvejando o complexo atado latente tecido/célula, ao contrário do sequestro de fator de crescimento pós-ativação, solúvel. Isso ocorre porque o inibidor da ativação de TGFβ1 alveja o precursor inativo localizado nos respectivos tecidos (por exemplo, dentro da ECM, superfície da célula imune etc.) impedindo preventivamente, dessa forma, que o fator de crescimento maduro seja liberado pelo complexo. Acredita-se que esse mecanismo de ação permita que o inibidor obtenha saturação do alvo (por exemplo, equilíbrio) in vivo, sem a necessidade de competir rapidamente para moléculas transitórias de fator de crescimento contra receptores endógenos, como é necessário por inibidores neutralizantes convencionais.

[00366] Levando em consideração essa diferença no mecanismo de ação, foi realizada uma avaliação adicional das propriedades de ligação pelo uso de outro modo de ensaios de ligação in vitro que permite a determinação de afinidade em equilíbrio

[00367] Em vista disso, é contemplado que ensaios que medem afinidades de ligação desses anticorpos em equilíbrio podem representar mais precisamente o modo de engajamento com o alvo in vivo. Dessa forma, ensaios de ligação baseados em MSD-SET (ou outros ensaios adequados) podem ser realizados, como exemplificado na Tabela 9 abaixo.

[00368] A titulação de solução em equilíbrio (“SET”) é um ensaio pelo qual a ligação entre duas moléculas (por exemplo, um antígeno e um anticorpo que se liga ao antígeno) pode ser medida em equilíbrio em uma solução. Por exemplo, SET baseada em Descoberta de Mesoescala (“MSD”), ou MSD-SET, é um modo útil de determinação de constantes de dissociação para interações proteína-proteína de afinidade particularmente alta em equilíbrio (veja, por exemplo: Ducata e cols. (2015) J. Biomolecular Screening 20 (10):

1.256-1.267). Os ensaios baseados em SET são particularmente úteis para determinação de valores da KD de anticorpos com afinidades subnanomolares (por exemplo, picomolares).

Tabela 9. Exemplos não limitantes anticorpos para TGFβ1 de alta afinidade contexto-independentes (hIgG4) e valores da KD medidos por MSD-SET (“h” significa complexo humano). (A) pró-TGFβ1 associado à matriz pró-TGFβ1 associado à célula (H) Ab de (B) (C) (D) (E) (F) (G) G/D (razão referência hLTBP1 hLTBP3 MÉDIA da hGARP hLRRC33 MÉDIA de viés) matriz (nM) Célula (nM) C1 3,30E-08 1,40E-08 23,2 5,10E-09 2,20E-09 3,65 0,16 C2 2,10E-08 1,20E-08 16,5 8,80E-09 6,10E-09 7,45 0,48 Ab3 1,30E-08 1,62E-08 14,6 2,80E-08 3,50E-08 31,5 2,16

Ab6 1,8E-11 2,9E-11 0,024 2,7E-11 6,3E-11 0,045 1,88 Ab22 5,00E-11 3,30E-11 0,042 2,70E-11 2,00E-10 0,114 2,71 Ab24 2,40E-11 2,10E-11 0,023 1,90E-11 1,80E-10 0,100 4,35 AB26 2,80E-11 2,30E-11 0,026 1,40E-11 1,30E-10 0,072 2,77 Ab29 1,20E-11 1,10E-11 0,012 5,50E-12 4,30E-11 0,024 2,00 Ab30 3,10E-11 2,60E-11 0,029 2,20E-11 1,40E-10 0,081 2,80 Ab31 1,90E-11 1,40E-11 0,017 1,90E-11 9,60E-11 0,058 3,41 Ab32 3,70E-11 2,60E-11 0,032 1,50E-11 8,70E-11 0,051 1,60 Ab33 1,10E-11 7,00E-12 0,009 7,80E-12 4,60E-11 0,027 3,00 Ab4 4,6E-9 5,5E-9 5,05 2,5E-9 2,1E-9 2,3 0,42

[00369] A Tabela 9 também inclui três anticorpos seletivos para TGFβ1 descritos previamente (C1, C2 e Ab3) como anticorpos de referência. C1 e C2 foram revelados primeiro em PCT/US2017/021972 publicado como WO 2017/156500, e Ab3 foi descrito em PCT/US2018/012601 publicado como WO 2018/129329.

[00370] Como pode ser observado a partir dos dados de afinidade fornecidos na Tabela 9, as atividades de ligação dos novos anticorpos de acordo com a presente revelação são significantemente maiores do que dos anticorpos de referência identificados previamente. Além disso, os novos anticorpos contra TGFβ1 são “contexto-independentes”, pelo fato de que se ligam a cada um dos complexos LLC humanos com afinidades equivalentes (por exemplo, faixa aproximadamente subnanomolar, por exemplo, com KD de < 1 nM). Os perfis de ligação contexto-independentes, de alta afinidade, sugerem que esses anticorpos podem ser vantajosos para uso no tratamento de indicações relacionadas ao TGFβ1 que envolvem desregulação de componentes tanto relacionados à ECM quanto imunes, por exemplo, câncer.

[00371] Para ensaios de ligação baseados em titulação de solução em equilíbrio, complexos de proteínas que compreendem uma das moléculas apresentadoras, tais como aquelas mostradas acima, podem ser empregados como antígeno (complexo molécula apresentadora-TGFβ1, ou um LLC). Permite- se que os anticorpos de teste formem complexo antígeno- anticorpo em solução. Misturas de reação antígeno-anticorpo são incubadas para permitir que seja alcançado um equilíbrio; a quantidade do complexo antígeno-anticorpo presente nas reações de ensaio pode ser medida por meios adequados bem conhecidos na técnica. Quando comparados com ensaios baseados em BLI, ensaios baseados em SET são menos afetados por taxas on/off do complexo antígeno-anticorpo, permitindo detecção sensível de interações de afinidade muito alta. Como mostrado na Tabela 9, na presente revelação, inibidores de TGFβ1 de alta afinidade preferidos exibem uma faixa subnanomolar (por exemplo, picomolar) de afinidades através de todos os complexos latentes grandes testados, como determinado por ensaios baseados em SET.

[00372] Consequentemente, é fornecida uma classe de anticorpos monoclonais contexto-independentes ou fragmentos, cada um dos quais capaz de se ligar com afinidades equivalentes a cada um dos seguintes complexos molécula apresentadora-pró-TGFβ1 humano com uma KD de ≤ 1 nM, como medida por um ensaio de titulação de solução em equilíbrio, por exemplo, MSD-SET: hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1. Esse anticorpo se liga especificamente a cada um dos complexos mencionados anteriormente com uma KD de ≤ 1 nM, como medida por MSD-SET, e em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento inibe a liberação de fator de crescimento TGFβ1 maduro de cada um dos complexos pró-TGFβ1, mas não de complexos pró-TGFβ2 ou pró-TGFβ3. Em modalidades preferidas, esse anticorpo ou o fragmento se liga a cada um dos complexos mencionados anteriormente com uma KD de 500 pM ou menos (ou seja, ≤ 500 pM), 250 pM ou menos (ou seja, ≤ 250 pM), ou 200 pM ou menos (ou seja, ≤ 200 pM). Ainda mais preferivelmente, esse anticorpo ou o fragmento se liga a cada um dos complexos mencionados anteriormente com uma KD de 100 pM ou menos (ou seja, ≤ 100 pM). Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento não se liga ao fator de crescimento TGFβ1 livre que não está associado com o complexo de pró-domínio. Isso pode ser testado ou confirmado por ensaios de ligação in vitro adequados conhecidos na técnica, por exemplo, interferometria de biocamada.

[00373] Em modalidades preferidas adicionais, esses anticorpos ou os fragmentos também reagem de forma cruzada com contrapartes murídeas (por exemplo, rato e/ou camundongo) e/ou de primata não humano (por exemplo, símios). Apenas como exemplo, Ab6 é capaz de se ligar com alta afinidade a cada um dos complexos latentes grandes de várias espécies, incluindo: humanos, murídeos, de rato e macaco Cynomolgus, como exemplificado na Tabela 10 e Exemplo 9 abaixo.

Tabela 10. Exemplo não limitante de anticorpo para TGFβ1 de alta afinidade contexto-independente com reatividades cruzadas entre espécies como medido por MSD-SET (“h” significa humano; “m” significa murídeo) hLTBP1- hLTBP3- hGARP- hLRRC33- mLTBP1- mLTBP3- mGARP- mLRRC33- Complexo pró- pró- pró- pró- pró- pró- pró- pró- de Ag TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 Ab6 1,80E-11 2,90E-11 2,70E-11 6,30E-11 2,40E-11 2,80E-11 2,10E-11 4,80E-11

Potência

[00374] Os anticorpos revelados nesse relatório descritivo podem ser amplamente caracterizados como “anticorpos funcionais” quanto à sua habilidade para inibir a sinalização de TGFβ1. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “um anticorpo funcional” confere uma ou mais atividades biológicas em virtude de sua habilidade para se ligar a uma proteína-alvo (por exemplo, antígeno), de forma a modular sua função. Anticorpos funcionais, portanto, incluem amplamente aqueles capazes de modular a atividade/função de moléculas-alvo (ou seja, antígeno). Esses anticorpos moduladores incluem anticorpos de inibição (ou anticorpos inibidores) e anticorpos de ativação. A presente revelação se dirige aos anticorpos que podem inibir um processo biológico mediado por sinalização de TGFβ1 associada com múltiplos contextos de TGFβ1. Agentes inibidores usados para a realização da presente invenção, por exemplo, os anticorpos descritos nesse relatório descritivo, visam ser TGFβ1-seletivos e não alvejam ou interferem com TGFβ2 e TGFβ3 quando administrados em uma dose terapeuticamente eficaz (dose na qual eficácia suficiente é obtida dentro de níveis de toxicidade aceitáveis). Os novos anticorpos da presente revelação possuem atividades inibidoras (potência) aumentadas, comparados com inibidores da ativação de TGFβ1 identificados previamente.

[00375] Em algumas modalidades, a potência de um anticorpo inibidor pode ser medida em ensaios baseados em células adequados, por exemplo, ensaios de célula repórter CAGA descritos nesse relatório descritivo. Geralmente,

células cultivadas, por exemplo, células heterólogas e células primárias, podem ser usadas para realização de ensaios de potência baseados em células.

Células que expressam TGFβ1 endógeno e/ou uma molécula apresentadora de interesse, por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33, podem ser usadas.

Alternativamente, ácidos nucleicos exógenos que codificam proteína(s) de interesse, por exemplo, TGFβ1, e/ou uma molécula apresentadora de interesse, por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33, podem ser introduzidos nessas células para expressão, por exemplo, por transfecção (por exemplo, transfecção estável ou transfecção transitória) ou por infecção baseada em vetor viral.

Em algumas modalidades, células LN229 são empregadas para esses ensaios.

As células que expressam TGFβ1 e uma molécula apresentadora de interesse (por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP ou LRRC33) são crescidas em cultura, que “apresentam” o complexo latente grande na superfície celular (quando associado com GARP ou LRRC33) ou depositam na ECM (quando associado com um LTBP). A ativação de TGFβ1 pode ser desencadeada por integrina, expressa na superfície de outra célula.

As células que expressam integrina podem ser as mesmas células que co-expressam o complexo latente grande ou um tipo de célula separado.

Células repórteres são adicionadas ao sistema de ensaio, que incorpora um elemento responsivo ao TGFβ.

Dessa forma, o grau de ativação de TGFβ pode ser medido por detecção do sinal das células repórteres (por exemplo, genes repórteres responsivos ao TGFβ, por exemplo, luciferase, acoplados a um elemento promotor TGFβ-responsivo) mediante ativação de TGFβ.

Com o uso desses sistemas de ensaio baseado em células, as atividades inibidoras dos anticorpos podem ser determinadas por medição da alteração (redução) ou diferença no sinal do repórter (por exemplo, atividades de luciferase como medidas por leituras de fluorescência) na presença ou ausência de anticorpos de teste. Esses ensaios são exemplificados no Exemplo 2 nesse relatório descritivo.

[00376] Dessa forma, em algumas modalidades, a potência inibidora (IC50) dos novos anticorpos da presente revelação calculada com base em ensaios-repórteres à base de células para a medição de ativação de TGFβ1 (por exemplo, ensaios de células LN229 descritos em outro local nesse relatório descritivo) pode ser de 5 nM ou menos, medida contra cada um dos complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró- TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, os anticorpos possuem uma IC50 de 2 nM ou menos (ou seja, ≤ 2 nM) medida contra cada um dos LLCs. Em modalidades preferidas, a IC50 do anticorpo medida contra cada um dos complexos LLC é de 1 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma IC50 de menos do que 1 nM contra cada um dos complexos hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP- pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1. Tabela 11. Potências inibidoras (em IC50) de anticorpos selecionados como medidas por ensaios de célula repórter. Ab de IC50 (nM) referência hLTBP1- hLTBP3- hGARP- hLRRC33- pró-TGFβ1 pró-TGFβ1 pró-TGFβ1 pró-TGFβ1 Ab3 24,29 10,42 0,981 0,8578 Ab4 5,222 5,647 0,8221 3,499 Ab5 1,288 1,004 0,14 0,6158 Ab6 2,741 0,8214 0,324 0,4953 Ab21 1,607 0,7647 0,4005 0,5958

Ab23 0,8353 0,8788 0,2639 0,5793 Ab25 6,081 0,538 0,4418 0,6529 Ab26 0,7131 0,7164 0,2619 0,3406 Ab29 0,4711 0,803 0,2637 0,458 Ab33 1,56 1,112 0,1981 0,7383

[00377] A ativação de TGFβ1 pode ser desencadeada por um mecanismo integrina-dependente ou um mecanismo protease- dependente. As atividades inibidoras (por exemplo, potência) dos anticorpos de acordo com a presente revelação podem ser avaliadas quanto à habilidade para bloquear a ativação de TGFβ1 induzida por um ou ambos os modos de ativação. Os ensaios de célula repórter descritos acima são projetados para medir a habilidade dos anticorpos para bloquear ou inibir a ativação integrina-dependente da ativação de TGFβ1. A potência inibidora pode ser avaliada por medição da habilidade dos anticorpos para bloquear ativação de TGFβ1 induzida por protease. O Exemplo 3 da presente revelação fornece modalidades não limitantes desses ensaios. Os resultados estão resumidos nas FIGS. 5A e 5B. Consequentemente, em algumas modalidades da invenção, o inibidor isoforma-seletivo de acordo com a presente revelação é capaz de inibir a ativação de TGFβ1 integrina- dependente e a ativação de TGFβ1 protease-dependente. Esse inibidor pode ser usado para tratar uma indicação relacionada ao TGFβ1 caracterizada por desregulação de EDM que envolve atividades de protease. Por exemplo, essa indicação relacionada ao TGFβ1 pode estar associada com miofibroblastos elevados, rigidez aumentada da ECM, deposição de colágeno em excesso ou anormal, ou qualquer combinação destes. Essas condições incluem, por exemplo,

distúrbios fibróticos e câncer que compreende um tumor sólido (por exemplo, carcinoma metastático) ou mielofibrose.

[00378] Em algumas modalidades, a potência pode ser avaliada em modelos in vivo adequados como uma medida de eficácia e/ou efeitos farmacodinâmicos. Por exemplo, se o primeiro anticorpo é eficaz em um modelo in vivo em certa concentração, e o segundo anticorpo é igualmente eficaz em uma concentração menor do que o primeiro no mesmo modelo in vivo, e depois o segundo anticorpo pode ser considerado mais potente do que o primeiro anticorpo. Quaisquer modelos de doença adequados conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar as potências relativas de inibidores de TGFβ1, dependendo da indicação de interesse particular, por exemplo, modelos de câncer e modelos de fibrose. De preferência, várias doses ou concentrações de cada anticorpo de teste estão incluídas nesses estudos.

[00379] Similarmente, os efeitos farmacodinâmicos (PD) podem ser medidos para determinar potências relativas de anticorpos inibidores. Medições de PD comumente usadas para a via de sinalização de TGFβ incluem, sem limitação, fosforilação de SMAD2/3 e expressão de genes efetores a jusante, cuja transcrição é sensível à ativação de TGFβ, tais como aqueles com um elemento promotor TGFβ-responsivo (por exemplo, elementos de ligação a Smad). Em algumas modalidades, os anticorpos da presente revelação são capazes de bloquear completamente a fosforilação de SMAD2/3 induzida por doença em modelos pré-clínicos de fibrose quando os animais são administrados em uma dose de 3 mg/kg ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente revelação são capazes de suprimir significantemente a expressão induzida por fibrose de um painel de genes marcadores que incluem Acta2, Col1a1, Col3a1, Fn1, Itga11, Lox, Loxl2, quando os animais são administrados em uma dose de 10 mg/kg ou menos no modelo de UUO de fibrose renal.

[00380] Em algumas modalidades, o processo de seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste para uso terapêutico pode, portanto, incluir a identificação de um anticorpo ou fragmento que mostre potência inibidora suficiente. Por exemplo, o processo de seleção pode incluir uma etapa de realização de um ensaio baseado em células de ativação de TGFβ1 para medir a potência (por exemplo, IC50) de um ou mais anticorpos de teste ou fragmentos destes, e seleção de um anticorpo candidato ou fragmento deste que mostra potência desejável. Em algumas modalidades, a IC50 para cada um dos LLCs humanos é de 5 nM ou menos. O anticorpo ou o fragmento selecionado pode então ser usado no tratamento de uma indicação relacionada ao TGFβ1 descrita nesse relatório descritivo. Regiões de ligação

[00381] No contexto da presente revelação, “região (ou regiões) de ligação” de um antígeno fornece uma base estrutural para a interação anticorpo-antígeno. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “região de ligação” se refere às áreas de interface entre o anticorpo e o antígeno, de modo que, quando ligado ao complexo pró-TGFβ1 (“antígeno”) em uma solução fisiológica, o anticorpo ou o fragmento protege a região de ligação da exposição ao solvente, como determinado por técnicas adequadas, por exemplo, espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS). A identificação de regiões de ligação é útil na compreensão da interação antígeno-anticorpo e do mecanismo de ação para o anticorpo particular. A identificação de anticorpos adicionais com regiões de ligação similares ou sobrepostas pode ser facilitada por experimentos de bloqueio cruzado que permitem a compartimentalização de epitopo. Opcionalmente, cristalografia de Raios-X pode ser empregada para identificar os resíduos de aminoácidos exatos do epitopo que medeiam interações antígeno-anticorpo.

[00382] A técnica está familiarizada com HDX-MS, que é uma técnica amplamente usada para exploração da conformação de proteínas ou interações proteína-proteína em solução. Esse método se baseia na troca de hidrogênios na amida do arcabouço da proteína com deutério presente na solução. Por medição das taxas de troca hidrogênio-deutério, pode-se obter informação sobre a dinâmica e conformação de proteínas (revisado em: Wei e cols. (2014) “Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Probing Higher Order Structure of Protein Therapeutics: Methodology and applications”. Drug Disco Today. 19 (1): 95-102; incorporado por referência). A aplicação dessa técnica se baseia na premissa de que, quando se forma um complexo antígeno- anticorpo, a interface entre os parceiros de ligação pode obstruir o solvente reduzindo ou impedindo, dessa forma, a taxa de troca em decorrência de exclusão estérica de solvente.

[00383] A presente revelação inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes que se ligam a um LLC humano em uma região (“região de ligação”) que compreende o Laço de Latência ou uma porção deste. O Laço de Latência é um módulo de proteína dentro do pró-domínio. É contemplado que muitos inibidores potentes da ativação podem se ligar a essa região de um complexo pró-TGFβ1, de tal forma que a ligação ao anticorpo iriar “travar” o fator de crescimento evitando, dessa forma, sua liberação. Curiosamente, essa é a seção do complexo onde as regiões alongadas do tipo borboleta do fator de crescimento (por exemplo, que corresponde, por exemplo, ao Finger-1 e Finger-2) interagem intimamente com a estrutura do tipo gaiola do pró-domínio.

[00384] Como retratado na FIG. 18B, o Laço de Latência inclui as regiões rotuladas como 2a e uma parte de 2b, que são parte do pró-domínio. Observe que imediatamente adjacente ao Laço de Latência, a região rotulada como 5a corresponde ao denominado Finger-1 dentro do domínio do fator de crescimento, e a região rotulada como 6b em torno do lado oposto, é parte de Finger-2 dentro do domínio do fator de crescimento. Com base nisso, não é difícil prever que um anticorpo que envolvesse firmemente essas regiões poderia evitar eficazmente que o complexo pró-TGFβ1 se desengatasse bloqueando, dessa forma, a ativação.

[00385] Usando a técnica de HDX-MS, regiões de ligação de pró-TGFβ1 podem ser determinadas. Em algumas modalidades, uma porção em pró-TGFβ1 identificada como sendo importante na ligação a um anticorpo ou fragmento inclui pelo menos uma porção do pró-domínio e pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento. Anticorpos ou fragmentos que se ligam a uma primeira região de ligação (“Região 1” na FIG. 19A) que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência são preferíveis. Mais preferivelmente, esses anticorpos ou fragmentos ainda se ligam a uma segunda região de ligação (“Região 2” na FIG. 19A) que compreende pelo menos uma porção do domínio do fator de crescimento em Finger-1 do domínio do fator de crescimento. Esses anticorpos ou fragmentos podem ainda se ligar a uma terceira região de ligação (“Região 3” na FIG. 19A) que compreende pelo menos uma porção de Finger- 2 do domínio do fator de crescimento.

[00386] Regiões adicionais dentro do pró-TGFβ1 também podem contribuir, diretamente ou indiretamente, para a interação de alta afinidade desses anticorpos revelados nesse relatório descritivo. Regiões que são consideradas importantes para mediação da ligação de alta afinidade do anticorpo ao complexo pró-TGFβ1 (veja a FIG. 18A) podem incluir, sem limitação: LVKRKRIEA (ID. DE SEQ. N°: 159); LASPPSQGEVP (ID. DE SEQ. N°: 160); PGPLPEAV (ID. DE SEQ. N°: 161); LALYNSTR (ID. DE SEQ. N°: 162); REAVPEPVL (ID. DE SEQ. N°: 163); YQKYSNNSWR (ID. DE SEQ. N°: 164); RKDLGWKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 165); LGPCPYIWS (ID. DE SEQ. N°: 166); ALEPLPIV (ID. DE SEQ. N°: 167); e, VGRKPKVEQL (ID. DE SEQ. N°: 168) (com base na sequência nativa de pró- TGFβ1 humano).

[00387] Entre as regiões que podem contribuir para a interação anticorpo-antígeno, em algumas modalidades, o anticorpo de alta afinidade da presente revelação pode se ligar a um epitopo que compreende pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (“Região 1”) (ID. DE SEQ. N°: 169).

[00388] Em algumas modalidades, o anticorpo de alta afinidade da presente revelação pode se ligar a um epitopo que compreende pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos RKDLGWKWIHEPKGYHANF (“Região 2”) (ID. DE SEQ. N°: 165).

[00389] Em algumas modalidades, o anticorpo de alta afinidade da presente revelação pode se ligar a um epitopo que compreende pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos VGRKPKVEQL (“Região 3”) (ID. DE SEQ. N°: 168).

[00390] Em algumas modalidades, o anticorpo de alta afinidade da presente revelação pode se ligar a um epitopo que compreende pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (“Região 1”) (ID. DE SEQ. N°: 169) e pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos RKDLGWKWIHEPKGYHANF (“Região 2”) (ID. DE SEQ. N°: 165).

[00391] Em algumas modalidades, o anticorpo de alta afinidade da presente revelação pode se ligar a um epitopo que compreende pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (“Região 1”) (ID. DE SEQ. N°: 169) e pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos VGRKPKVEQL (“Região 3”) (ID. DE SEQ. N°: 168).

[00392] Em algumas modalidades, o anticorpo de alta afinidade da presente revelação pode se ligar a um epitopo que compreende pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (“Região 1”) (ID. DE SEQ. N°: 169), pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos RKDLGWKWIHEPKGYHANF (“Região 2”) (ID. DE SEQ. N°: 165), e, pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos VGRKPKVEQL (“Região 3”) (ID. DE SEQ. N°: 168).

[00393] Além de contribuições das Regiões 1, 2 e/ou 3, esse epitopo pode ainda incluir pelo menos um resíduo de aminoácido de uma sequência selecionada do grupo que consiste em: LVKRKRIEA (ID. DE SEQ. N°: 159); LASPPSQGEVP (ID. DE SEQ. N°: 160); PGPLPEAV (ID. DE SEQ. N°: 161); LALYNSTR (ID.

DE SEQ. N°: 162); REAVPEPVL (ID. DE SEQ. N°: 163); YQKYSNNSWR (ID. DE SEQ. N°: 164); RKDLGWKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 165); LGPCPYIWS (ID. DE SEQ. N°: 166); ALEPLPIV (ID. DE SEQ. N°: 167); e VGRKPKVEQL (ID. DE SEQ. N°: 168).

[00394] Notavelmente, foi constatado que muitas das regiões de ligação identificadas em estudos estruturais com o uso de quatro anticorpos contra TGFβ1 isoforma-seletivos representativos estão sobrepostos, apontando para certas regiões dentro do complexo pró-TGFβ1 que podem ser particularmente importantes na manutenção de latência do complexo pró-TGFβ1. Dessa forma, vantajosamente, anticorpos ou fragmentos destes podem ser selecionados, pelo menos em parte, com base em sua região (ou regiões) de ligação que inclui as porções sobrepostas identificadas através de múltiplos inibidores descritos nesse relatório descritivo. Essas porções sobrepostas de regiões de ligação incluem, por exemplo, SPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 201), WKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 202) e PGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 203). Dessa forma, o inibidor de TGFβ1 isoforma- seletivo, de alta afinidade, de acordo com a presente revelação, pode se ligar a um complexo pró-TGFβ1 (por exemplo, LLCs humanos) em um epitopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de SPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 201), WKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 202) e/ou PGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 203).

[00395] Dessa forma, qualquer um dos anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno englobados pela presente revelação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos das Categorias 1 a 5 reveladas nesse relatório descritivo, pode se ligar a uma ou mais das regiões de ligação identificadas nesse relatório descritivo. Esses anticorpos podem ser usados no tratamento de uma indicação de TGFβ1 em um indivíduo como descrita nesse relatório descritivo. Consequentemente, a seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste adequado para uso terapêutico de acordo com a presente revelação pode incluir a identificação ou seleção de um anticorpo ou um fragmento deste que se liga a SPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 201), WKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 202), PGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 203), ou qualquer porção (ou porções) destas.

[00396] Exemplos não limitantes de domínios de proteína ou motivos de pró-TGFβ1 humano como descritos previamente (WO 2014/182676) são fornecidos na Tabela 12.

Tabela 12. Domínios/motivos de proteína selecionados de polipeptídeos relacionados ao TGFβ1 humano. Domínio/ módulo de TGFβ1 Sequência de aminoácido ID. DE SEQ. Nº humano Peptídeo Associado à LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLP 146 Latência (LAP) EAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNE (pró-domínio) IYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKV

EQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLS RGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMN

RPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRR (“Primeira região de ligação” está sublinhada) Straight Jacket LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLP 147 (“Laço de Latência” está sublinhado) Domínio do fator de ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCL 148 crescimento GPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVY

YVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (“Finger-1” e “Finger-2” estão sublinhados, respectivamente)

Fastener resíduos 74-76, YYA n/a Sítio de clivagem de RHRR 149 furina Braço EAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNE 150

IYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKV EQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLS RGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMN

RPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRR Finger-1 CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFC 151 (“Segunda região de ligação” está sublinhada) Finger-2 CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS 152 (“Terceira região de ligação” está sublinhada) Resíduo para associação à Cys 4 n/a molécula apresentadora Laço de Latência LASPPSQGEVPPGPL 153 (Porção das regiões de ligação compartilhada através de 4 anticorpos contra pró-TGFβ1 isoforma-seletivos diferentes está sublinhada) Laço de Latência Estendido LASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTR 154 (Porção das regiões de ligação compartilhada através de 4 anticorpos contra pró-TGFβ1 isoforma-seletivos diferentes está sublinhada) Hélice Alfa-1 LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLR 155 Hélice Alfa-2 AVLALYNSTR 156 Trigger Loop NGFTTGRRGDLATIHGMNRP 157 Ligação à integrina Resíduos 215-217, RGD n/a Bowtie CSCDSRDNTLQVD 158

Segurança/toxicologia

[00397] Inibidores pan-TGFβ convencionais capazes do antagonismo de múltiplas isoformas sabidamente causam diversas toxicidades incluindo, por exemplo, toxicidades cardiovasculares (lesões cardíacas, mais notavelmente valvulopatia) relatadas através de várias espécies, incluindo cães e ratos. Estas incluem, hiperplasia na válvula aórtica, válvula AV direita e válvula AV esquerda; inflamação na válvula aórtica, válvula AV esquerda e aorta ascendente; hemorragia na aorta ascendente, válvula aórtica e válvula AV esquerda; degeneração do tecido conjuntivo na aorta ascendente (veja, por exemplo, Strauber e cols. (2014) “Nonclinical Safety Evaluation of a Transforming Growth Factor β Receptor I Kinase Inhibitor in Fischer 344 Rats and Beagle Dogs” J. Clin. Pract. 4 (3): 1000196). Veja também a FIG. 21A.

[00398] Além disso, anticorpos neutralizantes que se ligam a todas as três isoformas de TGFβ foram associados com certas toxicidades epiteliais observadas através de várias espécies, algumas das quais estão resumidas abaixo.

Tabela 13. Toxicidades epiteliais associadas com inibidores pan-TGFβ.

Camundongos Símios Humanos Toxicidades - Hiperplasia e - Hiperplasia da - Sangramento gengival inflamação da língua, gengiva, epitélio - Epistaxe gengiva e esôfago. nasal e bexiga - Cor de cabeça - Achados não - Anemia leva à - Fatigue reversíveis cessação do - Vários distúrbios (recuperação de 12 tratamento cutâneos, incluindo semanas) - Alterações eram ceratoacantomas (KA), reversíveis (exceto hiperceratose, SCC bexiga) cutâneo e carcinoma de célula basal Fármaco / 1D11 GC1008 GC1008 Dose / Dosagem: 50 mg/kg Dosagem: 10 e 50 mg/kg Dose: 0.1, 0.3, 1, 3, 10, Duração (3x/semana) Duração: 6 meses 15 mg/kg Duração: 9-12 semanas Duração: 4 doses mensais Exposição Concentração sérica = Não revelado Meia-vida: 21,7 d 1-2 mg/mL (ao longo de DN Cmax aproximadamente

4-12 semanas) (350 ng/mL)mg

*Vitsky e cols.

Am.

J Pathology vol. 174, 2009; e Lonning e cols.

Current Pharmaceutical Biotech, 2011

[00399] Com base no reconhecimento prévio pelo requerente da presente revelação (veja PCT/US2017/021972) de que a ausência de especificidade de isoforma de antagonistas de TGFβ convencionais pode estar subjacente à fonte de toxicidades associadas à inibição de TGFβ, os presentes inventores buscaram obter inibição de TGFβ1 de amplo espectro para o tratamento de várias doenças que manifestam desregulação de TGFβ1 multifacetada mantendo, ao mesmo tempo, o aspecto de segurança/tolerabilidade de inibidores isoforma-seletivos.

[00400] No cenário clínico, o benefício terapêutico é obtido apenas quando as concentrações eficazes mínimas (MEC) de um fármaco (por exemplo, anticorpo monoclonal) estão abaixo das concentrações tóxicas mínimas (MTC) do fármaco. Isso não foi obtido com a maioria, se não todos, os inibidores pan-TGFβ convencionais, que, na verdade, pareciam causar toxicidades limitantes da dose. Trabalho prévio do requerente descreveu inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos que exibiam perfil de segurança acentuadamente aprimorado, comparados com pan-inibidores convencionais, por exemplo, antagonistas de receptor de pequena molécula e anticorpos neutralizantes. WO 2017/156500 revelou um inibidor isoforma- seletivo da ativação de TGFβ1, que, quando administrado em uma dose de até 100 mg/kg por semana por 4 semanas em ratos, nenhuma toxicidade relacionada ao artigo de teste foi observada, estabelecendo o NOAEL para o anticorpo como a maior dose testada, ou seja, 100 mg/kg. Trabalho subsequente do requerente também mostrou que um anticorpo com função aprimorada também mostrou perfis de segurança equivalentes. Aqui, um dos objetivos foi identificar anticorpos com afinidades e potências ainda maiores, mas com pelo menos os mesmos níveis de segurança ou níveis de segurança equivalentes.

[00401] Os resultados de estudos de toxicologia em ratos de quatro semanas são fornecidos nas FIGS. 21B e 21C. Dois inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos (Ab3 e Ab6) foram testados em estudos separados, juntos com um inibidor de pequena molécula de ALK5 e um anticorpo monoclonal neutralizante como controle. Nenhuma toxicidade relacionada ao artigo de teste foi observada com qualquer dos anticorpos isoforma-seletivos, enquanto os inibidores não seletivos, como esperado, causaram diversos eventos adversos, consistente com estudos publicados. Além disso, Ab6 demonstrou ser seguro (por exemplo, sem eventos adversos observados) em um nível de dose tão alto quanto 300 mg/kg em macacos Cynomolgus quando dosados semanalmente por 4 semanas. Como Ab6 demonstrou ser eficaz em diversos modelos in vivo em uma dose de apenas 3 mg/kg, isso equivale até 100 vezes de uma janela terapêutica. Notavelmente, isso demonstra que alta potência não significa necessariamente maior risco de toxicidade. Sem se prender a uma teoria particular, é contemplado que a natureza altamente seletiva dos anticorpos revelados nesse relatório descritivo provavelmente é responsável pela ausência de toxicidades observadas.

[00402] Dessa forma, em algumas modalidades, o novo anticorpo de acordo com a presente revelação possui a dose maximamente tolerada (MTD) de > 100 mg/kg quando dosado semanalmente por pelo menos 4 semanas. Em algumas modalidades, o novo anticorpo de acordo com a presente revelação possui o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) de até 100 mg/kg quando dosado semanalmente por pelo menos 4 semanas. Modelos animais adequados para serem usados para a realização de estudos de segurança/toxicologia para inibidores de TGFβ e inibidores de TGFβ1 incluem, sem limitação: ratos, cães, símios e camundongos. Em modalidades preferidas, a quantidade eficaz mínima do anticorpo com base em um estudo pré-clínico de eficácia adequado é abaixo do NOAEL. Mais preferivelmente, a quantidade eficaz mínima do anticorpo é cerca de um terço ou menos do NOAEL. Em modalidades particularmente preferidas, a quantidade eficaz mínima do anticorpo é cerca de um sexto ou menos do NOAEL. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz mínima do anticorpo é cerca de um décimo ou menos do NOAEL.

[00403] Em algumas modalidades, a invenção engloba um anticorpo isoforma-seletivo capaz de inibir a sinalização de TGFβ1, que, quando administrado a um indivíduo, não causa toxicidades cardiovasculares ou epiteliais conhecidas em uma dose eficaz para tratar uma indicação relacionada ao TGFβ1. Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma quantidade eficaz mínima de cerca de 3-10 mg/kg administrada semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente. De preferência, o anticorpo não causa nenhuma toxicidade ou causa toxicidades mínimas em uma dose que é pelo menos seis vezes a quantidade eficaz mínima (por exemplo, uma janela terapêutica de seis vezes). Mais preferivelmente, o anticorpo não causa nenhuma toxicidade ou causa toxicidades mínimas em uma dose que é pelo menos dez vezes a quantidade eficaz mínima (por exemplo, uma janela terapêutica de dez vezes). Ainda mais preferivelmente, o anticorpo não causa nenhuma toxicidade ou causa toxicidades mínimas em uma dose que é pelo menos quinze vezes a quantidade eficaz mínima (por exemplo, uma janela terapêutica de quinze vezes).

[00404] Dessa forma, a seleção de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste para uso terapêutico pode incluir: seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que atende aos critérios de uma ou mais das Categorias 1-5 descritas nesse relatório descritivo; realização de um estudo de eficácia in vivo em um modelo pré-clínico adequado para determinar uma quantidade eficaz do anticorpo ou do fragmento; realização de um estudo de segurança/toxicologia in vivo em um modelo adequado para determinar uma quantidade do anticorpo que seja segura ou tóxica (por exemplo, MTD, NOAEL, ou quaisquer parâmetros reconhecidos na técnica para a avaliação de segurança/toxicidade); e seleção do anticorpo ou do fragmento que fornece pelo menos uma janela terapêutica de três vezes (preferivelmente uma janela terapêutica de 6 vezes, mais preferivelmente uma janela terapêutica de 10 vezes, ainda mais preferivelmente uma janela terapêutica de 15 vezes). Em modalidades preferidas, o estudo de eficácia in vivo é realizado em dois ou mais modelos pré-clínicos adequados que recapitulam condições humanas. Em algumas modalidades, esses modelos pré-clínicos compreendem câncer TGFβ1-positivo, que pode opcionalmente compreender um tumor imunossupressor. O tumor imunossupressor pode ser resistente a uma terapia de câncer, por exemplo, CBT, quimioterapia e radioterapia. Em algumas modalidades, os modelos pré- clínicos são selecionados de modelos de tumor MBT-2, Cloudman S91 e EMT6.

[00405] O anticorpo ou o fragmento selecionado pode ser usado na fabricação de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou o fragmento. Essa composição farmacêutica pode ser usada no tratamento de uma indicação de TGFβ1 em um indivíduo como descrita nesse relatório descritivo. Por exemplo, a indicação de TGFβ1 pode ser um distúrbio proliferativo e/ou um distúrbio fibrótico. Mecanismo de ação

[00406] Anticorpos da presente invenção que são úteis como terapêuticos são anticorpos inibidores de TGFβ1. Além disso, os anticorpos são inibidores da ativação, ou seja, os anticorpos bloqueiam a etapa de ativação de TGFβ1, ao invés de perseguir diretamente fator de crescimento já ativado.

[00407] Em um sentido amplo, o termo “anticorpo de inibição” se refere a um anticorpo que antagoniza ou neutraliza a função-alvo, por exemplo, atividade do fator de crescimento. Vantajosamente, os anticorpos inibidores preferidos da presente revelação são capazes de inibir a liberação de fator de crescimento maduro de um complexo latente reduzindo, dessa forma, a sinalização do fator de crescimento. Anticorpos de inibição incluem anticorpos que alvejam qualquer epitopo que reduza a liberação ou atividade do fator de crescimento quando associados com esses anticorpos. Esses epitopos podem estar em pró-domínios de proteínas TGFβ (por exemplo, TGFβ1), fatores de crescimento ou outros epitopos que levam a atividade reduzida do fator de crescimento quando ligado por anticorpo. Os anticorpos de inibição da presente invenção incluem, sem limitação, anticorpos de inibição de TGFβ1. Em algumas modalidades, anticorpos inibidores da presente revelação especificamente se ligam a um epitopo combinatório, ou seja, um epitopo formado por dois ou mais componentes/porções de um antígeno ou complexo de antígenos. Por exemplo, um epitopo combinatório pode ser formado por contribuições de múltiplas porções de uma única proteína, ou seja, resíduos de aminoácidos de mais de um segmento não contíguo da mesma proteína. Alternativamente, um epitopo combinatório pode ser formado por contribuições de múltiplos componentes de proteína de um complexo de antígenos. Em algumas modalidades, os anticorpos inibidores da presente revelação se ligam especificamente a um epitopo conformacional (ou epitopo conformação-específico), por exemplo, um epitopo que é sensível à estrutura tridimensional (ou seja, conformação) de um antígeno ou complexo de antígenos.

[00408] As abordagens tradicionais para o antagonismo da sinalização de TGFβ têm sido: i) neutralizar diretamente o fator de crescimento maduro após ele já ter se tornado ativo de modo a depletar ligantes livres (por exemplo, liberado de seu complexo precursor latente) que estão disponíveis para ligação ao receptor; ii) empregar fragmentos de receptor solúvel capaz de sequestrar ligantes livres (por exemplo, as chamadas armadilhas de ligante); ou, iii) alvejar seu receptor (ou receptores) da superfície celular para bloquear interações ligante-receptor. Cada uma dessas abordagens convencionais exige que o antagonista compita contra contrapartes endógenas. Além disso, as duas primeiras abordagens (i e ii) acima alvejam o ligante ativo, que é uma espécie transitória. Portanto, esse antagonista deve ser capaz de vencer cineticamente a competição com o receptor endógeno durante uma breve janela temporal. A terceira abordagem pode fornecer um efeito mais durável em comparação, mas inadvertidamente resulta em efeitos inibidores indesejados (e, dessa forma, possíveis toxicidades), pois muitos fatores de crescimento (por exemplo, até aproximadamente 20) sinalizam por meio do mesmo receptor (ou receptores).

[00409] Para fornecer soluções para essas desvantagens, e ainda para habilitar uma seletividade maior e ação localizada, o mecanismo de ação preferido subjacente aos anticorpos inibidores, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, atua a montante da ativação de TGFβ1 e interação ligante-receptor. Dessa forma, é contemplado que inibidores de TGFβ1 contexto-independentes, de alta afinidade, isoforma-específicos, adequados para realização da presente invenção devem alvejar preferivelmente o TGFβ1 do complexo precursor, inativo (por exemplo, latente) (por exemplo, um complexo que compreende TGFβ1 pró/latente) antes de sua ativação, a fim de bloquear a etapa de ativação em sua fonte (por exemplo, em um microambiente de doença, por exemplo, TME). De acordo com modalidades preferidas da invenção, esses inibidores alvejam com afinidades equivalentes complexos atados de TGFβ1 pró/latente associados tanto à ECM quanto à superfície celular, ao invés de ligantes livres que estão transitoriamente disponíveis para ligação ao receptor.

[00410] As vantagens de alvejar localmente complexo atado ao tecido/célula na fonte, ao contrário de espécies ativas solúveis (ou seja, fatores de crescimento maduros após serem liberados da fonte), são ainda apoiadas por um estudo recente. Ishihara e cols. (Sci. Transl. Med. 11, eaau3259

(2019) “Targeted Antibody and Cytokine Cancer Immunotherapies Through Collagen Affinity”) relataram que, quando fármacos administrados sistemicamente eram direcionados aos locais de tumor por conjugação com uma porção de ligação ao colágeno, eles foram capazes de aumentar a imunidade antitumoral e reduzir toxicidades relacionadas ao tratamento, comparado com contrapartes não direcionadas.

[00411] O mecanismo de ação obtido pelos anticorpos da presente revelação pode ainda contribuir para durabilidade aumentada do efeito, bem como maior potência e segurança globais.

[00412] Curiosamente, esses anticorpos podem exercer atividades inibidoras adicionais para TGFβ1 associado à célula (LRRC33-pró-TGFβ1 e GARP-pró-TGFβ1). O Requerente verificou que anticorpos de ligação ao LRRC33 tendem a se tornar internalizados mediante ligação ao LRRC33 da superfície celular. Se a internalização é induzida ativamente por ligação ao anticorpo ou, alternativamente, se esse fenômeno resulta de atividades endocíticas naturais (por exemplo, passive) de macrófagos é incerto. No entanto, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, Ab6, é capaz de se tornar rapidamente internalizado em células transfectadas com LRRC33 e pró-TGFβ1, e a taxa de internalização obtida com Ab6 é significantemente maior do que com um anticorpo de referência que reconhece LRRC33 da superfície celular (FIG. 6). Resultados similares são obtidos de macrófagos humanos primários. Essas observações despertam a possibilidade de que Ab6 pode induzir internalização mediante ligação ao seu alvo, LRRC33-pró- TGFβ1 removendo, dessa forma, os complexos que contêm LRRC33 da superfície celular. Nos locais de doença, isso pode reduzir a disponibilidade dos níveis de LRRC33-pró-TGFβ1 latente ativável. Portanto, os inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos podem inibir o braço de LRRC33 de TGFβ1 por meio de dois mecanismos de ação paralelos: i) bloqueio da liberação de fator de crescimento maduro do complexo latente; e, ii) remoção de complexos LRRC33-pró-TGFβ1 da superfície celular por meio de internalização. É possível que mecanismos de ação inibidores similares possam ser aplicados a GARP- pró-TGFβ1.

[00413] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo sensível ao pH que se liga ao seu antígeno com afinidade maior em um pH neutro (por exemplo, pH em torno de 7) do que em um pH ácido (por exemplo, pH em torno de 5). Esses anticorpos podem ter taxas de dissociação maiores em condições ácidas do que em condições neutras ou fisiológicas. Por exemplo, a proporção entre as taxas de dissociação medidas em um pH ácido e as taxas de dissociação medidas em pH neutro (por exemplo, Koff em pH 5 em relação à Koff em pH 7) pode ser pelo menos 1,2. Opcionalmente, a proporção é pelo menos 1,5. Em algumas modalidades, a proporção é pelo menos 2. Esses anticorpos sensíveis ao pH podem ser úteis como anticorpos de reciclagem. Mediante engajamento com o alvo na superfície celular, o anticorpo pode desencadear internalização anticorpo-dependente de (e, dessa forma, remoção de) complexos pró-TGFβ1 ligados à membrana (associados com LRRC33 ou GARP). Subsequentemente, em um compartimento intracelular ácido como, por exemplo, lisossomo, o complexo antígeno-anticorpo se dissocia, e o anticorpo livre pode ser transportado de volta para o domínio extracelular.

[00414] Dessa forma, em algumas modalidades, a seleção de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno para uso terapêutico pode ser, em parte, baseada na habilidade para induzir internalização anticorpo-dependente e/ou pH- dependência do anticorpo. Complexos de antígenos e componentes destes

[00415] Os novos anticorpos da presente revelação se ligam especificamente a cada um dos quatro complexos de latência grandes humanos conhecidos (por exemplo, hLTBP1- pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró-TGFβ1 e hLRRC33-pró- TGFβ1), inibem seletivamente a ativação de TGFβ1. Anticorpos preferidos ainda satisfazem aos critérios de uma ou mais das Categorias 1-5 apresentadas na Tabela 1.

[00416] A avaliação (por exemplo, identificação e seleção) desses anticorpos envolve o uso de complexos de antígenos adequados, que são tipicamente produzidos recombinantemente. São fornecidos componentes de proteína úteis que podem compreender esses complexos de antígenos, incluindo isoformas de TGFβ e polipeptídeos, fragmentos e variantes relacionados, moléculas apresentadoras (por exemplo, LTBPs, GARP, LRRC33) e polipeptídeos, fragmentos e variantes relacionados. Esses componentes podem ser expressos, purificados e permitido que formem um complexo de proteínas (por exemplo, complexos latentes grandes), que podem ser usados no processo de avaliação de anticorpo. A avaliação pode incluir seleção positiva, na qual ligantes desejáveis são selecionados de um pool ou biblioteca de ligantes e não-ligantes, e seleção negativa, na qual ligantes indesejáveis são removidos do pool. Tipicamente, pelo menos um complexo associado à matriz (por exemplo, LTBP1-pró-TGFβ1 e/ou LTBP1-pró-TGFβ1) e pelo menos um complexo associado à célula (por exemplo, GARP-pró-TGFβ1 e/ou LRRC33-pró-TGFβ1) são incluídos para avaliação positiva para assegurar que os ligantes que estão sendo selecionados possuem afinidades para ambos esses contextos biológicos.

[00417] Em algumas modalidades, o TGFβ1 compreende uma sequência de aminoácidos de mamíferos de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o TGFβ1 compreende uma sequência de aminoácidos humana de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o TGFβ1 compreende uma sequência de aminoácidos humana, de macaco, de rato ou de camundongo. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo não se liga especificamente ao TGFβ2. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo não se liga especificamente ao TGFβ3. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo não se liga especificamente ao TGFβ2 ou TGFβ3. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo se liga especificamente a um TGFβ1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 34. As sequências de aminoácidos de TGFβ2 e a sequência de aminoácidos de TGFβ3 são apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 38 e 32, respectivamente. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo se liga especificamente a um TGFβ1 que compreende uma sequência de aminoácidos de ocorrência não natural (de outro modo denominada nesse relatório descritivo um TGFβ1 de ocorrência não natural). Por exemplo, um TGFβ1 de ocorrência não natural pode compreender uma ou mais mutações geradas recombinantemente em relação a uma sequência de aminoácidos de TGFβ1 de ocorrência natural. Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 compreende a sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 24-35, como mostrado na Tabela 14. Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 compreende a sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 36-43, como mostrado na Tabela 15.

[00418] TGFβ1 (pró-domínio + domínio do fator de crescimento)

LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRV AGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEP VLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQ WLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPL ERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLG

PCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMI VRSCKCS (ID. DE SEQ. N°: 24)

[00419] TGFβ2 (pró-domínio + domínio do fator de crescimento)

SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLL QEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAM EKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEG EWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDG TSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQ

DNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPE ASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS (ID. DE SEQ. N°: 28)

[00420] TGFβ3 (pró-domínio + domínio do fator de crescimento)

SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTREL LEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSS VEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTA EWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNE DDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCFRNLEENC

CVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASA SPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS (ID. DE SEQ. N°: 32) Tabela 14. Sequências de aminoácidos de TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 exemplares. Proteína Sequência ID. DE SEQ. Nº pró-TGFβ1 LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLAS 24

PPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESA EPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRL LRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAP SDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSA HCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGM NRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYC FSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGY HANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPG ASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSN

MIVRSCKCS pró-TGFβ1 C4S LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLAS 25

PPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESA EPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRL LRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAP SDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSA HCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGM NRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYC FSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGY HANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPG ASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSN

MIVRSCKCS pró-TGFβ1 D2G LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLAS 26

PPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESA EPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRL LRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAP SDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSA HCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGM NRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHGALDTNYCF SSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYH ANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGA SAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNM

IVRSCKCS pró-TGFβ1 C4S LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLAS 27 D2G PPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESA

EPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRL LRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAP SDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSA HCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGM NRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHGALDTNYCF SSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYH ANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGA SAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNM

IVRSCKCS pró-TGFβ2 SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLT 28

SPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKAS RRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSE NAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKA EFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTS PTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWL HHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKS EELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNS GKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAA YCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPK GYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTIN PEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQL

SNMIVKSCKCS pró-TGFβ2 C5S SLSTSSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLT 29

SPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKAS RRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSE NAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKA EFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTS PTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWL HHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKS EELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNS GKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAA YCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPK GYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTIN PEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQL

SNMIVKSCKCS pró-TGFβ2 C5S SLSTSSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLT 30 D2G SPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKAS

RRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSE NAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKA EFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTS PTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWL HHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKS EELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNS GKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKGALDAAY CFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKG YNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINP EASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLS

NMIVKSCKCS pró-TGFβ2 D2G SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLT 31

SPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKAS RRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSE NAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKA EFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTS PTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWL HHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKS EELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNS GKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKGALDAAY CFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKG YNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINP EASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLS

NMIVKSCKCS pró-TGFβ3 SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLR 32

LTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMH GEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAE HNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFR AEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHI AKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWL LRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHE VMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNP HLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCF RNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYY ANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEA SASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNM

VVKSCKCS pró-TGFβ3 C7S SLSLSTSTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLR 33

LTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMH GEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAE HNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFR AEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHI AKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWL LRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHE VMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNP HLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCF RNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYY ANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEA SASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNM

VVKSCKCS pró-TGFβ3 C7S SLSLSTSTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLR 34 D2G LTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMH

GEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAE HNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFR AEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHI AKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWL LRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHE VMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNP HLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKGALDTNYCFR NLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYA NFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEAS ASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMV

VKSCKCS pró-TGFβ3 D2G SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLR 35

LTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMH GEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAE HNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFR AEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHI AKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWL LRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHE VMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNP HLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKGALDTNYCFR NLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYA NFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEAS ASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMV

VKSCKCS Tabela 15. Sequências de aminoácidos não humanas exemplares. Proteína Espécie Sequência ID. DE SEQ. Nº pró- Camundongo LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 36 TGFβ1 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY

NSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKE VTRVLMVDRNNAIYEKTKDISHSIYM FFNTSDIREAVPEPPLLSRAELRLQR LKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNR LLTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQG DGIQGFRFSAHCSCDSKDNKLHVEIN GISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHRRALDTNYCFSST EKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPK GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLA LYNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIV

YYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS pró- Símios LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 37 TGFβ1 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY

NSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKE VTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYM FFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLR LKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNR LLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRG GEIEGFRLSAHCSCDSKDNTLQVDIN GFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSST EKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPK GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLA LYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIV

YYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS TGFβ1 Camundongo LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 38 LAP C4S KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY

NSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKE VTRVLMVDRNNAIYEKTKDISHSIYM FFNTSDIREAVPEPPLLSRAELRLQR LKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNR LLTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQG DGIQGFRFSAHCSCDSKDNKLHVEIN GISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT

PLERAQHLHSSRHRR TGFβ1 Símios LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 39 LAP C4S KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY

NSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKE VTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYM FFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLR LKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNR LLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRG GEIEGFRLSAHCSCDSKDNTLQVDIN GFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT

PLERAQHLQSSRHRR pró- Camundongo LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 40 TGFβ1 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY C4S D2G NSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKE

VTRVLMVDRNNAIYEKTKDISHSIYM FFNTSDIREAVPEPPLLSRAELRLQR LKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNR LLTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQG DGIQGFRFSAHCSCDSKDNKLHVEIN GISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHGALDTNYCFSSTE KNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKG YHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLAL YNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIVY

YVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS pró- Camundongo LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 41 TGFβ1 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY C4S NSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKE

VTRVLMVDRNNAIYEKTKDISHSIYM FFNTSDIREAVPEPPLLSRAELRLQR LKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNR LLTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQG DGIQGFRFSAHCSCDSKDNKLHVEIN GISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMAT PLERAQHLHSSRHRRALDTNYCFSST EKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPK GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLA LYNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIV

YYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS pró- Símios LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 42 TGFβ1 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY C4S NSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKE

VTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYM FFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLR LKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNR LLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRG GEIEGFRLSAHCSCDSKDNTLQVDIN GFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSST EKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPK GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLA LYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIV

YYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS pró- Símios LSTSKTIDMELVKRKRIEAIRGQILS 43 TGFβ1 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALY C4S D2G NSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKE

VTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYM FFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLR LKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNR LLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRG GEIEGFRLSAHCSCDSKDNTLQVDIN GFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMAT PLERAQHLQSSRHGALDTNYCFSSTE KNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKG YHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLAL YNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVY

YVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS LTBP3 Símios GPAGERGAGGGGALARERFKVVFAPV 44

ICKRTCLKGQCRDSCQQGSNMTLIGE NGHSTDTLTGSGFRVVVCPLPCMNGG QCSSRNQCLCPPDFTGRFCQVPAGGA GGGTGGSGPGLSRAGALSTGALPPLA PEGDSVASKHAIYAVQVIADPPGPGE GPPAQHAAFLVPLGPGQISAEVQAPP PVVNVRVHHPPEASVQVHRIESSNAE GAAPSQHLLPHPKPSHPRPPTQKPLG RCFQDTLPKQPCGSNPLPGLTKQEDC CGSIGTAWGQSKCHKCPQLQYTGVQK PGPVRGEVGADCPQGYKRLNSTHCQD INECAMPGVCRHGDCLNNPGSYRCVC PPGHSLGPSRTQCIADKPEEKSLCFR LVSPEHQCQHPLTTRLTRQLCCCSVG KAWGARCQRCPADGTAAFKEICPAGK GYHILTSHQTLTIQGESDFSLFLHPD GPPKPQQLPESPSQAPPPEDTEEERG VTTDSPVSEERSVQQSHPTATTSPAR PYPELISRPSPPTMRWFLPDLPPSRS AVEIAPTQVTETDECRLNQNICGHGE CVPGPPDYSCHCNPGYRSHPQHRYCV DVNECEAEPCGPGRGICMNTGGSYNC HCNRGYRLHVGAGGRSCVDLNECAKP HLCGDGGFCINFPGHYKCNCYPGYRL KASRPPVCEDIDECRDPSSCPDGKCE NKPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDV NECAEGSPCSPGWCENLPGSFRCTCA QGYAPAPDGRSCVDVDECEAGDVCDN GICTNTPGSFQCQCLSGYHLSRDRSH CEDIDECDFPAACIGGDCINTNGSYR CLCPQGHRLVGGRKCQDIDECTQDPG LCLPHGACKNLQGSYVCVCDEGFTPT QDQHGCEEVEQPHHKKECYLNFDDTV FCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDH CEIYPCPVYSSAEFHSLCPDGKGYTQ DNNIVNYGIPAHRDIDECMLFGAEIC KEGKCVNTQPGYECYCKQGFYYDGNL LECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGG YRCACTPPAEYSPAQRQCLSPEEMDV DECQDPAACRPGRCVNLPGSYRCECR PPWVPGPSGRDCQLPESPAERAPERR DVCWSQRGEDGMCAGPQAGPALTFDD CCCRQGRGWGAQCRPCPPRGAGSQCP TSQSESNSFWDTSPLLLGKPRRDEDS SEEDSDECRCVSGRCVPRPGGAVCEC PGGFQLDASRARCVDIDECRELNQRG LLCKSERCVNTSGSFRCVCKAGFARS

RPHGACVPQRRR LTBP3 Camundongo GPAGERGTGGGGALARERFKVVFAPV 45

ICKRTCLKGQCRDSCQQGSNMTLIGE NGHSTDTLTGSAFRVVVCPLPCMNGG QCSSRNQCLCPPDFTGRFCQVPAAGT GAGTGSSGPGLARTGAMSTGPLPPLA PEGESVASKHAIYAVQVIADPPGPGE GPPAQHAAFLVPLGPGQISAEVQAPP PVVNVRVHHPPEASVQVHRIEGPNAE GPASSQHLLPHPKPPHPRPPTQKPLG RCFQDTLPKQPCGSNPLPGLTKQEDC CGSIGTAWGQSKCHKCPQLQYTGVQK PVPVRGEVGADCPQGYKRLNSTHCQD INECAMPGNVCHGDCLNNPGSYRCVC PPGHSLGPLAAQCIADKPEEKSLCFR LVSTEHQCQHPLTTRLTRQLCCCSVG KAWGARCQRCPADGTAAFKEICPGKG YHILTSHQTLTIQGESDFSLFLHPDG PPKPQQLPESPSRAPPLEDTEEERGV TMDPPVSEERSVQQSHPTTTTSPPRP YPELISRPSPPTFHRFLPDLPPSRSA VEIAPTQVTETDECRLNQNICGHGQC VPGPSDYSCHCNAGYRSHPQHRYCVD VNECEAEPCGPGKGICMNTGGSYNCH CNRGYRLHVGAGGRSCVDLNECAKPH LCGDGGFCINFPGHYKCNCYPGYRLK ASRPPICEDIDECRDPSTCPDGKCEN KPGSFKCIACQPGYRSQGGGACRDVN ECSEGTPCSPGWCENLPGSYRCTCAQ YEPAQDGLSCIDVDECEAGKVCQDGI CTNTPGSFQCQCLSGYHLSRDRSRCE DIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCL CPLGHRLVGGRKCKKDIDECSQDPGL CLPHACENLQGSYVCVCDEGFTLTQD QHGCEEVEQPHHKKECYLNFDDTVFC DSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHCE IYPCPVYSSAEFHSLVPDGKRLHSGQ QHCELCIPAHRDIDECILFGAEICKE GKCVNTQPGYECYCKQGFYYDGNLLE CVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYR CACTPPAEYSPAQAQCLIPERWSTPQ RDVKCAGASEERTACVWGPWAGPALT FDDCCCRQPRLGTQCRPCPPRGTGSQ CPTSQSESNSFWDTSPLLLGKSPRDE DSSEEDSDECRCVSGRCVPRPGGAVC ECPGGFQLDASRARCVDIDECRELNQ RGLLCKSERCVNTSGSFRCVCKAGFT RSRPHGPACLSAAADDAAIAHTSVID

HRGYFH LTBP1S Símios NHTGRIKVVFTPSICKVTCTKGSCQN 46

SCEKGNTTTLISENGHAADTLTATNF RVVLCHLPCMNGGQCSSRDKCQCPPN FTGKLCQIPVHGASVPKLYQHSQQPG KALGTHVIHSTHTLPLTVTSQQGVKV KFPPNIVNIHVKHPPEASVQIHQVSR IDGPTGQKTKEAQPGQSQVSYQGLPV QKTQTIHSTYSHQQVIPHVYPVAAKT QLGRCFQETIGSQCGKALPGLSKQED CCGTVGTSWGFNKCQKCPKKPSYHGY NQMMECLPGYKRVNNTFCQDINECQL QGVCPNGECLNTMGSYRCTCKIGFGP DPTFSSCVPDPPVISEEKGPCYRLVS SGRQCMHPLSVHLTKQLCCCSVGKAW GPHCEKCPLPGTAAFKEICPGGMGYT VSGVHRRRPIHHHVGKGPVFVKPKNT QPVAKSTHPPPLPAKEEPVEALTFSR EHGPGVAEPEVATAPPEKEIPSLDQE KTKLEPGQPQLSPGISTIHLHPQFPV VIEKTSPPVPVEVAPEASTSSASQVI APTQVTEINECTVNPDICGAGHCINL PVRYTCICYEGYKFSEQQRKCVDIDE CTQVQHLCSQGRCENTEGSFLCICPA GFMASEEGTNCIDVDECLRPDVCGEG HCVNTVGAFRCEYCDSGYRMTQRGRC EDIDECLNPSTCPDEQCVNSPGSYQC VPCTEGFRGWNGQCLDVDECLEPNVC TNGDCSNLEGSYMCSCHKGYTRTPDH KHCKDIDECQQGNLCVNGQCKNTEGS FRCTCGQGYQLSAAKDQCEDIDECQH HHLCAHGQCRNTEGSFQCVCDQGYRA SGLGDHCEDINECLEDKSVCQRGDCI NTAGSYDCTCPDGFQLDDNKTCQDIN ECEHPGLCGPQGECLNTEGSFHCVCQ QGFSISADGRTCEDIDECVNNTVCDS HGFCDNTAGSFRCLCYQGFQAPQDGQ GCVDVNECELLSGVCGEAFCENVEGS FLCVCADENQEYSPMTGQCRSRTSTD LDVEQPKEEKKECYYNLNDASLCDNV LAPNVTKQECCCTSGAGWGDNCEIFP CPVLGTAEFTEMCPKGKGFVPAGESS SEAGGENYKDADECLLFGQEICKNGF CLNTRPGYECYCKQGTYYDPVKLQCF DMDECQDPSSCIDGQCVNTEGSYNCF CTHPMVLDASEKRCIRPAESNEQIEE TDVYQDLCWEHLSDEYVCSRPLVGKQ TTYTECCCLYGEAWGMQCALCPMKDS DDYAQLCNIPVTGRRQPYGRDALVDF SEQYAPEADPYFIQDRFLNSFEELQA EECGILNGCENGRCVRVQEGYTCDCF DGYHLDTAKMTCVDVNECDELNNRMS LCKNAKCINTEGSYKCLCLPGYVPSD

KPNYCTPLNTALNLEKDSDLE LTBP1S Camundongo NHTGRIKVVFTPSICKVTCTKGNCQN 47

SCQKGNTTTLISENGHAADTLTATNF RVVICHLPCMNGGQCSSRDKCQCPPN FTGKLCQIPVLGASMPKLYQHAQQQG KALGSHVIHSTHTLPLTMTSQQGVKV KFPPNIVNIHVKHPPEASVQIHQVSR IDSPGGQKVKEAQPGQSQVSYQGLPV QKTQTVHSTYSHQQLIPHVYPVAAKT QLGRCFQETIGSQCGKALPGLSKQED CCGTVGTSWGFNKCQKCPKKQSYHGY TQMMECLQGYKRVNNTFCQDINECQL QGVCPNGECLNTMGSYRCSCKMGFGP DPTFSSCVPDPPVISEEKGPCYRLVS PGRHCMHPLSVHLTKQICCCSVGKAW GPHCEKCPLPGTAAFKEICPGGMGYT VSGVHRRRPIHQHIGKEAVYVKPKNT QPVAKSTHPPPLPAKEEPVEALTSSW EHGPRGAEPEVVTAPPEKEIPSLDQE KTRLEPGQPQLSPGVSTIHLHPQFPV VVEKTSPPVPVEVAPEASTSSASQVI APTQVTEINECTVNPDICGAGHCINL PVRYTCICYEGYKFSEQLRKCVDIDE CAQVRHLCSQGRCENTEGSFLCVCPA GFMASEEGTNCIDVDECLRPDMCRDG RCINTAGAFRCEYCDSGYRMSRRGYC EDIDECLKPSTCPEEQCVNTPGSYQC VPCTEGFRGWNGQCLDVDECLQPKVC TNGSCTNLEGSYMCSCHRGYSPTPDH RHCQDIDECQQGNLCMNGQCRNTDGS FRCTCGQGYQLSAAKDQCEDIDECEH HHLCSHGQCRNTEGSFQCVCNQGYRA SVLGDHCEDINECLEDSSVCQGGDCI NTAGSYDCTCPDGFQLNDNKGCQDIN ECAQPGLCGSHGECLNTQGSFHCVCE QGFSISADGRTCEDIDECVNNTVCDS HGFCDNTAGSFRCLCYQGFQAPQDGQ GCVDVNECELLSGVCGEAFCENVEGS FLCVCADENQEYSPMTGQCRSRVTED SGVDRQPREEKKECYYNLNDASLCDN VLAPNVTKQECCCTSGAGWGDNCEIF PCPVQGTAEFTEMCPRGKGLVPAGES SYDTGGENYKDADECLLFGEEICKNG YCLNTQPGYECYCKQGTYYDPVKLQC FDMDECQDPNSCIDGQCVNTEGSYNC FCTHPMVLDASEKRCVQPTESNEQIE ETDVYQDLCWEHLSEEYVCSRPLVGK QTTYTECCCLYGEAWGMQCALCPMKD SDDYAQLCNIPVTGRRRPYGRDALVD FSEQYGPETDPYFIQDRFLNSFEELQ AEECGILNGCENGRCVRVQEGYTCDC FDGYHLDMAKMTCVDVNECSELNNRM SLCKNAKCINTEGSYKCLCLPGYIPS

DKPNYCTPLNSALNLDKESDLE GARP Camundongo ISQRREQVPCRTVNKEALCHGLGLLQ 48

VPSVLSLDIQALYLSGNQLQSILVSP LGFYTALRHLDLSDNQISFLQAGVFQ ALPYLEHLNLAHNRLATGMALNSGGL GRLPLLVSLDLSGNSLHGNLVERLLG ETPRLRTLSLAENSLTRLARHTFWGM PAVEQLDLHSNVLMDIEDGAFEALPH LTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLQVLD LSCNSIEAFQTAPEPQAQFQLAWLDL RENKLLHFPDLAVFPRLIYLNVSNNL IQLPAGLPRGSEDLHAPSEGWSASPL SNPSRNASTHPLSQLLNLDLSYNEIE LVPASFLEHLTSLRFLNLSRNCLRSF EARQVDSLPCLVLLDLSHNVLEALEL GTKVLGSLQTLLLQDNALQELPPYTF ASLASLQRLNLQGNQVSPCGGPAEPG PPGCVDFSGIPTLHVLNMAGNSMGML RAGSFLHTPLTELDLSTNPGLDVATG ALVGLEASLEVLELQGNGLTVLRVDL PCFLRLKRLNLAENQLSHLPAWTRAV SLEVLDLRNNSFSLLPGNAMGGLETS LRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQG RVDVDATQDLICRFGSQEELSLSLVR PEDCEKGGLKNVNLILLLSFTLVSAI

VLTTLATICFLRRQKLSQQYKA sGARP Camundongo ISQRREQVPCRTVNKEALCHGLGLLQ 49

VPSVLSLDIQALYLSGNQLQSILVSP LGFYTALRHLDLSDNQISFLQAGVFQ ALPYLEHLNLAHNRLATGMALNSGGL GRLPLLVSLDLSGNSLHGNLVERLLG ETPRLRTLSLAENSLTRLARHTFWGM PAVEQLDLHSNVLMDIEDGAFEALPH LTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLQVLD LSCNSIEAFQTAPEPQAQFQLAWLDL RENKLLHFPDLAVFPRLIYLNVSNNL IQLPAGLPRGSEDLHAPSEGWSASPL SNPSRNASTHPLSQLLNLDLSYNEIE LVPASFLEHLTSLRFLNLSRNCLRSF EARQVDSLPCLVLLDLSHNVLEALEL GTKVLGSLQTLLLQDNALQELPPYTF ASLASLQRLNLQGNQVSPCGGPAEPG PPGCVDFSGIPTLHVLNMAGNSMGML RAGSFLHTPLTELDLSTNPGLDVATG ALVGLEASLEVLELQGNGLTVLRVDL PCFLRLKRLNLAENQLSHLPAWTRAV SLEVLDLRNNSFSLLPGNAMGGLETS LRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQG RVDVDATQDLICRFGSQEELSLSLVR PEDCEKGGLKNVN

[00421] Em algumas modalidades, complexos de proteínas antigênicos (por exemplo, um complexo LTBP-TGFβ1) podem compreender uma ou mais moléculas apresentadoras, por exemplo, proteínas LTBP (por exemplo, LTBP1, LTBP2, LTBP3 e LTBP4), proteínas GARP, proteínas LRRC33, ou fragmentos destas. Tipicamente, um fragmento necessário mínimo adequado para realização das modalidades reveladas nesse relatório descritivo inclui pelo menos 50 aminoácidos, preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos, de uma proteína de molécula apresentadora, que compreende pelo menos dois resíduos de cisteína capazes de formar ligações dissulfeto com um complexo pró-TGFβ1. Especificamente, esses resíduos de Cys formam ligações covalentes com o resíduo de Cys presente perto do terminal-N de cada monômero do complexo pró-TGFβ1. Na estrutura tridimensional de um dímero de complexo pró- TGFβ1, a denominada “Hélice Alfa-1” do terminal-N de cada monômero está muito próxima umas das outras (veja, por exemplo, a FIG. 18B, as duas hélices perto da parte inferior da estrutura em cinza), definindo a distância entre os dois resíduos de cisteína (um de cada hélice) necessários para formar ligações covalentes produtivas com um par de cisteínas correspondente presente em uma molécula apresentadora (veja, por exemplo, Cuende e cols. (2015) Sci. Trans. Med. 7: 284ra56). Portanto, quando um fragmento de uma molécula apresentadora é usado para formar um LLC no processo de avaliação (por exemplo, imunização, avaliação, identificação e seleção de biblioteca), esse fragmento deve incluir os resíduos de cisteína separados pela distância correta, o que permitirá a formação adequada de ligação dissulfeto com um complexo pró-TGFβ1 a fim de preservar a conformação correta do LLC resultante. LTBPs (por exemplo, LTBP1, LTBP3 e LTBP4), por exemplo, podem conter “domínios ricos em cisteína” para mediar interações covalentes com pró-TGFβ1.

[00422] Um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, como descrito nesse relatório descritivo, é capaz de se ligar a um complexo LTBP1-TGFβ1. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 é uma proteína de ocorrência natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 é uma proteína de ocorrência não natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 é uma proteína recombinante. Essa proteína LTBP1 recombinante pode compreender LTBP1, alternativamente variantes de splicing desta e/ou fragmentos desta. Proteínas LTBP1 recombinantes também podem ser modificadas para compreender um ou mais marcadores detectáveis. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 compreende uma sequência-líder (por exemplo, uma sequência-líder nativa ou não nativa). Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 não compreende uma sequência- líder (ou seja, a sequência-líder foi processada ou clivada). Esses marcadores detectáveis podem incluir, sem limitação, marcadores de biotina, tags de polihistidina, tags de myc, tags de HA e/ou tags fluorescentes. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 é uma proteína LTBP1 de mamífero. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 é uma proteína LTBP1 humana, de macaco, de camundongo ou de rato. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 46 e 47 na Tabela 15. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. N°: 50 na Tabela 17.

[00423] Um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, como descrito nesse relatório descritivo, é capaz de se ligar a um complexo LTBP3-TGFβ1. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 é uma proteína de ocorrência natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 é uma proteína de ocorrência não natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 é uma proteína recombinante. Essa proteína LTBP3 recombinante pode compreender LTBP3, alternativamente variantes de splicing desta e/ou fragmentos desta. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 compreende uma sequência-líder (por exemplo, uma sequência-líder nativa ou não nativa). Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 não compreende uma sequência- líder (ou seja, a sequência-líder foi processada ou clivada). Proteína LTBP3 recombinantes também podem ser modificadas para compreender um ou mais marcadores detectáveis. Esses marcadores detectáveis podem incluir, sem limitação, marcadores de biotina, tags de polihistidina, tags de myc, tags de HA e/ou tags fluorescentes. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 é uma proteína LTBP3 de mamífero. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 é uma proteína LTBP3 humana, de macaco, de camundongo ou de rato. Em algumas modalidades, a proteína LTBP3 compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 44 e 45 na Tabela 15. Em algumas modalidades, a proteína LTBP1 compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. N°: 51 na Tabela 17.

[00424] Um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, como descrito nesse relatório descritivo, é capaz de se ligar a um complexo GARP-TGFβ1. Em algumas modalidades, a proteína GARP é uma proteína de ocorrência natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína GARP é uma proteína de ocorrência não natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína GARP é uma proteína recombinante. Essa GARP pode ser recombinante, denominada nesse relatório descritivo GARP recombinante. Algumas GARPs recombinantes podem compreender uma ou mais modificações, truncamentos e/ou mutações, comparadas com GARP do tipo selvagem. GARPs recombinantes podem ser modificadas para serem solúveis. Em algumas modalidades, a proteína GARP compreende uma sequência-líder (por exemplo, uma sequência- líder nativa ou não nativa). Em algumas modalidades, a proteína GARP não compreende uma sequência-líder (ou seja, a sequência-líder foi processada ou clivada). Em outras modalidades, GARPs recombinantes são modificadas para compreender um ou mais marcadores detectáveis. Em modalidades adicionais, esses marcadores detectáveis podem incluir, sem limitação, marcadores de biotina, tags de polihistidina, tags de flag, tags de myc, tags de HA e/ou tags fluorescentes. Em algumas modalidades, a proteína GARP é uma proteína GARP de mamífero. Em algumas modalidades, a proteína GARP é uma proteína GARP humana, de macaco, de camundongo ou de rato. Em algumas modalidades, a proteína GARP compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 48-49 na Tabela 15. Em algumas modalidades, a proteína GARP compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 52 e 53 na Tabela 18. Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, descritos nesse relatório descritivo não se ligam ao TGFβ1 de uma forma contexto-dependente, por exemplo, a ligação ao TGFβ1 só ocorreria quando a molécula de TGFβ1 estivesse complexada com uma molécula apresentadora específica, por exemplo, GARP. Ao invés disso, os anticorpos, e porções de ligação ao antígeno destes, se ligam ao TGFβ1 de uma forma contexto-independente. Em outras palavras, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, se ligam ao TGFβ1 quando ligados a qualquer molécula apresentadora: GARP, LTBP1, LTBP3 e/ou LRCC33.

[00425] Um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, como descrito nesse relatório descritivo, é capaz de se ligar a um complexo LRRC33-TGFβ1. Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 é uma proteína de ocorrência natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 é uma proteína de ocorrência não natural ou fragmento desta. Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 é uma proteína recombinante. Essa LRRC33 pode ser recombinante, denominada nesse relatório descritivo LRRC33 recombinante. Algumas proteínas LRRC33 recombinantes pode compreender uma ou mais modificações, truncamentos e/ou mutações, comparada com tipo selvagem LRRC33. Proteínas LRRC33 recombinantes podem ser modificadas para serem solúveis. Por exemplo, em algumas modalidades, o ectodomínio de LRRC33 pode ser expresso com um tag-His do terminal-C a fim de expressar proteína LRRC33 solúvel (sLRRC33; veja, por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 84). Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 compreende uma sequência-líder (por exemplo, uma sequência-líder nativa ou não nativa). Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 não compreende uma sequência-líder (ou seja, a sequência-líder foi processada ou clivada). Em outras modalidades, proteínas LRRC33 recombinantes são modificadas para compreender um ou mais marcadores detectáveis. Em modalidades adicionais, esses marcadores detectáveis podem incluir, sem limitação, marcadores de biotina, tags de polihistidina, tags de flag, tags de myc, tags de HA e/ou tags fluorescentes. Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 é uma proteína LRRC33 de mamífero. Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 é uma proteína LRRC33 humana, de macaco, de camundongo ou de rato. Em algumas modalidades, a proteína LRRC33 compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada nos IDS. DE SEQ. Nos: 83, 84 e 101 na Tabela 18. Tabela 17. Sequências de aminoácidos de LTBP exemplares. Proteína Sequência ID. DE SEQ. Nº LTBP1S NHTGRIKVVFTPSICKVTCTKGSCQNSCEKGNTT 50

TLISENGHAADTLTATNFRVVICHLPCMNGGQCS SRDKCQCPPNFTGKLCQIPVHGASVPKLYQHSQQ PGKALGTHVIHSTHTLPLTVTSQQGVKVKFPPNI VNIHVKHPPEASVQIHQVSRIDGPTGQKTKEAQP GQSQVSYQGLPVQKTQTIHSTYSHQQVIPHVYPV AAKTQLGRCFQETIGSQCGKALPGLSKQEDCCGT VGTSWGFNKCQKCPKKPSYHGYNQMMECLPGYKR VNNTFCQDINECQLQGVCPNGECLNTMGSYRCTC KIGFGPDPTFSSCVPDPPVISEEKGPCYRLVSSG RQCMHPLSVHLTKQLCCCSVGKAWGPHCEKCPLP GTAAFKEICPGGMGYTVSGVHRRRPIHHHVGKGP VFVKPKNTQPVAKSTHPPPLPAKEEPVEALTFSR EHGPGVAEPEVATAPPEKEIPSLDQEKTKLEPGQ PQLSPGISTIHLHPQFPVVIEKTSPPVPVEVAPE ASTSSASQVIAPTQVTEINECTVNPDICGAGHCI NLPVRYTCICYEGYRFSEQQRKCVDIDECTQVQH LCSQGRCENTEGSFLCICPAGFMASEEGTNCIDV DECLRPDVCGEGHCVNTVGAFRCEYCDSGYRMTQ RGRCEDIDECLNPSTCPDEQCVNSPGSYQCVPCT EGFRGWNGQCLDVDECLEPNVCANGDCSNLEGSY MCSCHKGYTRTPDHKHCRDIDECQQGNLCVNGQC KNTEGSFRCTCGQGYQLSAAKDQCEDIDECQHRH LCAHGQCRNTEGSFQCVCDQGYRASGLGDHCEDI NECLEDKSVCQRGDCINTAGSYDCTCPDGFQLDD NKTCQDINECEHPGLCGPQGECLNTEGSFHCVCQ QGFSISADGRTCEDIDECVNNTVCDSHGFCDNTA GSFRCLCYQGFQAPQDGQGCVDVNECELLSGVCG EAFCENVEGSFLCVCADENQEYSPMTGQCRSRTS TDLDVDVDQPKEEKKECYYNLNDASLCDNVLAPN VTKQECCCTSGVGWGDNCEIFPCPVLGTAEFTEM CPKGKGFVPAGESSSEAGGENYKDADECLLFGQE ICKNGFCLNTRPGYECYCKQGTYYDPVKLQCFDM DECQDPSSCIDGQCVNTEGSYNCFCTHPMVLDAS EKRCIRPAESNEQIEETDVYQDLCWEHLSDEYVC SRPLVGKQTTYTECCCLYGEAWGMQCALCPLKDS DDYAQLCNIPVTGRRQPYGRDALVDFSEQYTPEA DPYFIQDRFLNSFEELQAEECGILNGCENGRCVR VQEGYTCDCFDGYHLDTAKMTCVDVNECDELNNR MSLCKNAKCINTDGSYKCLCLPGYVPSDKPNYCT

PLNTALNLEKDSDLE LTBP3 GPAGERGAGGGGALARERFKVVFAPVICKRTCLK 51

GQCRDSCQQGSNMTLIGENGHSTDTLTGSGFRVV VCPLPCMNGGQCSSRNQCLCPPDFTGRFCQVPAG GAGGGTGGSGPGLSRTGALSTGALPPLAPEGDSV ASKHAIYAVQVIADPPGPGEGPPAQHAAFLVPLG PGQISAEVQAPPPVVNVRVHHPPEASVQVHRIES SNAESAAPSQHLLPHPKPSHPRPPTQKPLGRCFQ DTLPKQPCGSNPLPGLTKQEDCCGSIGTAWGQSK CHKCPQLQYTGVQKPGPVRGEVGADCPQGYKRLN STHCQDINECAMPGVCRHGDCLNNPGSYRCVCPP GHSLGPSRTQCIADKPEEKSLCFRLVSPEHQCQH PLTTRLTRQLCCCSVGKAWGARCQRCPTDGTAAF KEICPAGKGYHILTSHQTLTIQGESDFSLFLHPD GPPKPQQLPESPSQAPPPEDTEEERGVTTDSPVS EERSVQQSHPTATTTPARPYPELISRPSPPTMRW FLPDLPPSRSAVEIAPTQVTETDECRLNQNICGH GECVPGPPDYSCHCNPGYRSHPQHRYCVDVNECE AEPCGPGRGICMNTGGSYNCHCNRGYRLHVGAGG RSCVDLNECAKPHLCGDGGFCINFPGHYKCNCYP GYRLKASRPPVCEDIDECRDPSSCPDGKCENKPG SFKCIACQPGYRSQGGGACRDVNECAEGSPCSPG WCENLPGSFRCTCAQGYAPAPDGRSCLDVDECEA GDVCDNGICSNTPGSFQCQCLSGYHLSRDRSHCE DIDECDFPAACIGGDCINTNGSYRCLCPQGHRLV GGRKCQDIDECSQDPSLCLPHGACKNLQGSYVCV CDEGFTPTQDQHGCEEVEQPHHKKECYLNFDDTV FCDSVLATNVTQQECCCSLGAGWGDHCEIYPCPV YSSAEFHSLCPDGKGYTQDNNIVNYGIPAHRDID ECMLFGSEICKEGKCVNTQPGYECYCKQGFYYDG NLLECVDVDECLDESNCRNGVCENTRGGYRCACT PPAEYSPAQRQCLSPEEMDVDECQDPAACRPGRC VNLPGSYRCECRPPWVPGPSGRDCQLPESPAERA PERRDVCWSQRGEDGMCAGPLAGPALTFDDCCCR QGRGWGAQCRPCPPRGAGSHCPTSQSESNSFWDT SPLLLGKPPRDEDSSEEDSDECRCVSGRCVPRPG GAVCECPGGFQLDASRARCVDIDECRELNQRGLL CKSERCVNTSGSFRCVCKAGFARSRPHGACVPQR

RR Tabela 18. Sequências de aminoácidos GARP e LRRC33 exemplares. Proteína Sequência ID. DE SEQ. Nº GARP AQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDT 52

ETLDLSGNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEI SFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNRLAMATALSAGG LGPLPRVTSLDLSGNSLYSGLLERLLGEAPSLHT LSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDLHSNVLMD IEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLR VLDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKL LHFPDLAALPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKG IHAPSEGWSALPLSAPSGNASGRPLSQLLNLDLS YNEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRNCLRTFEAR RLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRTL LLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPC GGPDEPGPSGCVAFSGITSLRSLSLVDNEIELLR AGAFLHTPLTELDLSSNPGLEVATGALGGLEASL EVLALQGNGLMVLQVDLPCFICLKRLNLAENRLS HLPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSAMGGLET SLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDAT QDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNINLI

IILTFILVSAILLTTLAACCCVRRQKFNQQYKA sGARP AQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDT 53

ETLDLSGNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEI SFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNRLAMATALSAGG LGPLPRVTSLDLSGNSLYSGLLERLLGEAPSLHT LSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDLHSNVLMD IEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLR VLDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKL LHFPDLAALPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKG IHAPSEGWSALPLSAPSGNASGRPLSQLLNLDLS YNEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRNCLRTFEAR RLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRTL LLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPC GGPDEPGPSGCVAFSGITSLRSLSLVDNEIELLR AGAFLHTPLTELDLSSNPGLEVATGALGGLEASL EVLALQGNGLMVLQVDLPCFICLKRLNLAENRLS HLPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSAMGGLET SLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDAT

QDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNIN LRRC33 MELLPLWLCLGFHFLTVGWRNRSGTATAASQGVC 83 (também KLVGGAADCRGQSLASVPSSLPPHARMLTLDANP conhecida LKTLWNHSLQPYPLLESLSLHSCHLERISRGAFQ como NRROS; EQGHLRSLVLGDNCLSENYEETAAALHALPGLRR Nº de Acesso LDLSGNALTEDMAALMLQNLSSLRSVSLAGNTIM em Uniprot RLDDSVFEGLERLRELDLQRNYIFEIEGGAFDGL Q86YC3) AELRHLNLAFNNLPCIVDFGLTRLRVLNVSYNVL

EWFLATGGEAAFELETLDLSHNQLLFFPLLPQYS KLRTLLLRDNNMGFYRDLYNTSSPREMVAQFLLV DGNVTNITTVSLWEEFSSSDLADLRFLDMSQNQF QYLPDGFLRKMPSLSHLNLHQNCLMTLHIREHEP PGALTELDLSHNQLSELHLAPGLASCLGSLRLFN LSSNQLLGVPPGLFANARNITTLDMSHNQISLCP LPAASDRVGPPSCVDFRNMASLRSLSLEGCGLGA LPDCPFQGTSLTYLDLSSNWGVLNGSLAPLQDVA PMLQVLSLRNMGLHSSFMALDFSGFGNLRDLDLS GNCLTTFPRFGGSLALETLDLRRNSLTALPQKAV SEQLSRGLRTIYLSQNPYDCCGVDGWGALQHGQT VADWAMVTCNLSSKIIRVTELPGGVPRDCKWERL DLGLLYLVLILPSCLTLLVACTVIVLTFKKPLLQ

VIKSRCHWSSVY * Peptídeo sinalizador nativo é retratado com fonte em negrito. LRRC33 MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLGWRNRSGTATAAS 84 solúvel QGVCKLVGGAADCRGQSLASVPSSLPPHARMLTL (sLRRC33) DANPLKTLWNHSLQPYPLLESLSLHSCHLERISR

GAFQEQGHLRSLVLGDNCLSENYEETAAALHALP GLRRLDLSGNALTEDMAALMLQNLSSLRSVSLAG NTIMRLDDSVFEGLERLRELDLQRNYIFEIEGGA FDGLAELRHLNLAFNNLPCIVDFGLTRLRVLNVS YNVLEWFLATGGEAAFELETLDLSHNQLLFFPLL PQYSKLRTLLLRDNNMGFYRDLYNTSSPREMVAQ FLLVDGNVTNITTVSLWEEFSSSDLADLRFLDMS QNQFQYLPDGFLRKMPSLSHLNLHQNCLMTLHIR EHEPPGALTELDLSHNQLSELHLAPGLASCLGSL RLFNLSSNQLLGVPPGLFANARNITTLDMSHNQI SLCPLPAASDRVGPPSCVDFRNMASLRSLSLEGC GLGALPDCPFQGTSLTYLDLSSNWGVLNGSLAPL QDVAPMLQVLSLRNMGLHSSFMALDFSGFGNLRD LDLSGNCLTTFPRFGGSLALETLDLRRNSLTALP QKAVSEQLSRGLRTIYLSQNPYDCCGVDGWGALQ HGQTVADWAMVTCNLSSKIIRVTELPGGVPRDCK

WERLDLGLHHHHHH * Peptídeo sinalizador da cadeia leve kappa humana modificado é retratado com fonte em negrito. ** Tag de histidina está sublinhado. Quimera de MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLGWRNRSGTATAAS 101 LRRC33-GARP QGVCKLVGGAADCRGQSLASVPSSLPPHARMLTL humana DANPLKTLWNHSLQPYPLLESLSLHSCHLERISR

GAFQEQGHLRSLVLGDNCLSENYEETAAALHALP GLRRLDLSGNALTEDMAALMLQNLSSLRSVSLAG NTIMRLDDSVFEGLERLRELDLQRNYIFEIEGGA FDGLAELRHLNLAFNNLPCIVDFGLTRLRVLNVS YNVLEWFLATGGEAAFELETLDLSHNQLLFFPLL PQYSKLRTLLLRDNNMGFYRDLYNTSSPREMVAQ FLLVDGNVTNITTVSLWEEFSSSDLADLRFLDMS QNQFQYLPDGFLRKMPSLSHLNLHQNCLMTLHIR EHEPPGALTELDLSHNQLSELHLAPGLASCLGSL RLFNLSSNQLLGVPPGLFANARNITTLDMSHNQI SLCPLPAASDRVGPPSCVDFRNMASLRSLSLEGC GLGALPDCPFQGTSLTYLDLSSNWGVLNGSLAPL QDVAPMLQVLSLRNMGLHSSFMALDFSGFGNLRD LDLSGNCLTTFPRFGGSLALETLDLRRNSLTALP QKAVSEQLSRGLRTIYLSQNPYDCCGVDGWGALQ HGQTVADWAMVTCNLSSKIIRVTELPGGVPRDCK WERLDLGLLIIILTFILVSAILLTTLAACCCVRR

QKFNQQYKA * Peptídeo sinalizador da cadeia leve kappa humana modificado é retratado com fonte em negrito. ** ectodomínio de LRRC33 está sublinhado. # Domínio transmembrana de GARP está em itálico. ## Cauda intracelular de GARP está com sublinhado duplo. Composições e formulações farmacêuticas

[00426] A invenção ainda fornece composições farmacêuticas usadas como um medicamento adequado para administração em indivíduos humanos e não humanos. Um ou mais anticorpos contexto-independentes, de alta afinidade, englobados pela invenção podem ser formulados ou misturados com um carreador (excipiente) farmaceuticamente aceitável incluindo, por exemplo, um tampão, para formar uma composição farmacêutica. Essas formulações podem ser usadas para o tratamento de uma doença ou distúrbio que envolve sinalização de TGFβ. Em modalidades particularmente preferidas, essas formulações podem ser usadas para aplicações em imuno-

oncologia.

[00427] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas aos pacientes para o alívio de uma indicação relacionada ao TGFβ (por exemplo, fibrose, distúrbios imunes e/ou câncer). “Aceitável” significa que o carreador é compatível com o ingrediente ativo da composição (e, preferivelmente, capaz de estabilizar o ingrediente ativo) e não deletério ao indivíduo a ser tratado. Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis (carreadores), incluindo tampões, seriam evidentes àqueles habilitados na técnica e foram descritos previamente. Veja, por exemplo, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20ª Edição (2000) Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K. E. Hoover. Em um exemplo, uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo contém mais de um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1-pró-TGFβ1, um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-pró-TGFβ1, em que os anticorpos reconhecem epitopos/resíduos do complexo.

[00428] As composições farmacêuticas a serem usadas nos presentes métodos podem compreender carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas (“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20ª Edição (2000) Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações usadas, e podem compreender tampões como, por exemplo, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (por exemplo, cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como, por exemplo, metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, por exemplo, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos como, por exemplo, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextranas; agentes quelantes como, por exemplo, EDTA; açúcares como, por exemplo, sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal como, por exemplo, sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como, por exemplo, TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos nesse relatório descritivo.

[00429] A invenção também inclui composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00430] Dessa forma, o anticorpo ou uma molécula que compreende um fragmento de ligação ao antígeno desse anticorpo pode ser formulado em uma composição farmacêutica adequada para administração humana.

[00431] A formulação farmacêutica pode incluir um ou mais excipientes. Em algumas modalidades, o excipiente (ou excipientes) pode ser selecionado da lista fornecida em: https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm?e vento=browseByLetter.page&Letter=A

[00432] A composição farmacêutica é tipicamente formulada para que uma concentração final do biológico ativo (por exemplo, anticorpo monoclonal, molécula de ligação modificada geneticamente que compreende um fragmento de ligação ao antígeno etc.) seja entre cerca de 2 mg/mL e cerca de 200 mg/mL. Por exemplo, a concentração final (p/vol) das formulações pode variar entre cerca de 2-200, 2-180, 2-160, 2-150, 2-120, 2-100, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 5-200, 5- 180, 5-160, 5-150, 5-120, 5-100, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5- 40, 10-200, 10-180, 10-160, 10-150, 10-120, 10-100, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 20-200, 20-180, 20-160, 20-150, 20-120, 20-100, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 30-200, 30-180, 30-160, 30-150, 30-120, 30-100, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50, 30-40, 40-200, 40-180, 40-160, 40-150, 40-120, 40- 100, 40-80, 40-70, 40-60, 40-50, 50-200, 50-180, 50-160, 50- 150, 50-120, 50-100, 50-80, 50-70, 50-60, 60-200, 60-180, 60-160, 60-150, 60-120, 60-100, 60-80, 60-70, 70-200, 70- 180, 70-160, 70-150, 70-120, 70-100, 70-80 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração final do biológico na formulação é cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mg/mL.

[00433] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferivelmente formuladas com tampões adequados. Tampões adequados incluem, sem limitação: tampão fosfato, tampão de ácido cítrico e tampão de histidina.

[00434] O pH final da formulação está tipicamente entre pH 5,0 e 8,0. Por exemplo, o pH da composição farmacêutica pode ser cerca de 5,0, 5,2, 5,5, 6,0, 6,2, 6,5, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,5, 7,6 ou 7,8.

[00435] A composição farmacêutica da presente revelação pode compreender um tensoativo, por exemplo, detergente não iônico, aprovado para o uso em formulações farmacêuticas. Esses tensoativos incluem, por exemplo, polissorbatos, por exemplo, Polissorbato 20 (Tween-20), Polissorbato 80 (Tween- 80) e NP-40.

[00436] A composição farmacêutica da presente revelação pode compreender um estabilizante. Para preparações líquidas de proteína, a estabilidade pode ser aumentada por seleção de sais de tamponamento do pH, e frequentemente aminoácidos também podem ser usados. Frequentemente são interações na interface líquido/ar ou na interface líquido/sólido (com a embalagem) que levam à agregação após adsorção e desenovelamento da proteína. Estabilizantes adequados incluem, sem limitação: sacarose, maltose, sorbitol, além de certos aminoácidos como, por exemplo, histidina, glicina, metionina e arginina.

[00437] A composição farmacêutica da presente revelação pode conter uma ou quaisquer combinações dos seguintes excipientes: fosfato de sódio, arginina, sacarose, cloreto de sódio, trometamina, manitol, álcool benzílico, histidina, sacarose, Polissorbato 80, citrato de sódio, glicina, Polissorbato 20, Trehalose, Poloxâmero 188, metionina, Trehalose, rh-Hialuronidase, succinato de sódio, fosfato de potássio, edetato dissódico, cloreto de sódio, cloreto de potássio, maltose, acetato de histidina, sorbitol, ácido pentético, albumina sérica humana, ácido pentético.

[00438] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente revelação pode conter um conservante.

[00439] A composição farmacêutica da presente revelação é tipicamente apresentada como um líquido ou uma forma liofilizada. Tipicamente, os produtos podem ser apresentados em um frasco (por exemplo, frasco de vidro). Produtos disponíveis em seringas, canetas ou auto-injetores podem ser apresentados como líquidos pré-preenchidos nesses sistemas de recipiente/fechamento.

[00440] Em alguns exemplos, a composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo compreende lipossomos que contêm um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1-pró-TGFβ1, um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 e um complexo LRRC33-pró-TGFβ1, que podem ser preparados por qualquer método adequado, por exemplo, como descrito em Epstein e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3.688 (1985); Hwang e cols. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 4.030 (1980); e Patentes U.S. Nos 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com tempo de circulação aumentado são revelados na Patente U.S. Nº 5.013.556. Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeos que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomos são extrusados por meio de filtros de tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado.

[00441] Em algumas modalidades, lipossomos com propriedades de direcionamento são selecionados para liberar ou localizar preferencialmente a composição farmacêutica em certos tipos de tecidos ou de células. Por exemplo, certos carreadores baseados em nanopartícula com propriedades de direcionamento à medula óssea podem ser empregados, por exemplo, nanopartículas ou lipossomos baseados em lipídeos. Veja, por exemplo, Sou (2012) “Advanced Drus Carriers Targeting Bone Marrow”, publicação ResearchGate 232725109.

[00442] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção podem compreender ou podem ser usadas em conjunto com um adjuvante. É contemplado que certos adjuvantes podem reforçar as respostas imunes do indivíduo a, por exemplo, antígenos tumorais, e facilitar a função efetora de célula T, diferenciação de DC a partir de monócitos, captação de antígeno e apresentação por APCs aumentadas etc. Adjuvantes adequados incluem, sem limitação, adjuvantes baseados em ácido retinóico e derivados deste, adjuvantes baseados em emulsão óleo-em-água, por exemplo, MF59, e outros adjuvantes que contêm esqualeno, ligantes do receptor Toll-like (TRL) (por exemplo, CpGs), α-tocoferol (vitamina E) e derivados deste.

[00443] Os anticorpos descritos nesse relatório descritivo também podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas coloidais de liberação de fármacos (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Técnicas exemplares foram descritas previamente; veja, por exemplo, “Remington, The Science and Practice of Pharmacy”, 20ª Edição, Mack

Publishing (2000).

[00444] Em outros exemplos, a composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo pode ser formulada em formato de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente U.S. Nº

3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7-etil-L- glutamato, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico como, por exemplo, o LUPRON DEPOTTM (microesferas injetáveis formadas por copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), acetato isobutirato de sacarose e ácido poli- D-(-)-3-hidroxibutírico.

[00445] As composições farmacêuticas a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéril. As composições de anticorpo terapêutico são geralmente colocadas em um recipiente que possui uma entrada de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00446] As composições farmacêuticas descritas nesse relatório descritivo podem estar em formas de dosagem unitária como, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, para administração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insuflação.

[00447] Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não iônicos, por exemplo, polioxietilenossorbitanos (por exemplo, TweenTM 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, SpanTM 20, 40, 60, 80 ou 85). Composições com um agente tensoativo convenientemente compreenderão entre 0,05 e 5% de agente tensoativo, e pode estar entre 0,1 e 2,5%. Será observado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.

[00448] Emulsões adequadas podem ser preparadas com o uso de emulsões de gordura comercialmente disponíveis, por exemplo, IntralipidTM, LiposynTM, InfonutrolTM, LipofundinTM e LipiphysanTM. O ingrediente ativo pode estar dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou, alternativamente, pode estar dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de açafroa, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amêndoas) e uma emulsão formada por misturação com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolipídeos do ovo, fosfolipídeos da soja ou lecitina de soja) e água. Será observado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões adequadas tipicamente conterão até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%.

[00449] As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas por misturação de um anticorpo da invenção com IntralipidTM ou os componentes destes (óleo de soja,

fosfolipídeos do ovo, glicerol e água). Kits para uso na detecção, monitoramento ou alívio de uma indicação relacionada ao TGFβ

[00450] A presente revelação também fornece kits para uso no alívio de doenças/distúrbios associados com uma indicação relacionada ao TGFβ. Esses kits podem incluir um ou mais recipientes que compreendem um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, por exemplo, qualquer um daqueles descritos nesse relatório descritivo.

[00451] Em algumas modalidades, o kit pode compreender instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos descritos nesse relatório descritivo. As instruções incluídas podem compreender uma descrição da administração do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 para tratar, retardar o surgimento ou aliviar uma doença-alvo, tais como aquelas descritas nesse relatório descritivo. O kit pode ainda compreender uma descrição da seleção de um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação se aquele indivíduo tem a doença-alvo. Ainda em outras modalidades, as instruções compreendem uma descrição da administração de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, a um indivíduo em risco da doença- alvo.

[00452] As instruções relacionadas ao uso de anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, que se ligam especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-

TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 geralmente incluem informação quanto à dosagem, posologia de dosagem e via de administração para o tratamento desejado. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidoses) ou doses subunitárias. As instruções fornecidas nos kits da revelação são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis.

[00453] O rótulo ou bula indica que a composição é usada para o tratamento, retardo do surgimento e/ou alívio de uma doença ou distúrbio associado a uma indicação relacionada ao TGFβ. Podem ser fornecidas instruções para a prática de qualquer um dos métodos descritos nesse relatório descritivo.

[00454] Os kits dessa revelação estão em uma embalagem adequada. Uma embalagem adequada inclui, sem limitação, frascos, garrafas, jarras, embalagem flexível (por exemplo, bolsas de Mylar ou plásticas lacradas), e semelhantes. Também são contempladas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, por exemplo, um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão como, por exemplo, uma minibomba. Um kit pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 como aqueles descritos nesse relatório descritivo.

[00455] Os kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais como, por exemplo, tampões e informação interpretativa. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula (s) sobre ou associado ao recipiente. Em algumas modalidades, a revelação fornece artigos manufaturados que compreendem o conteúdo dos kits descritos acima. Processo de avaliação, identificação e fabricação de inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, de alta afinidade

[00456] A invenção engloba métodos de avaliação/seleção, métodos de produção e processos de fabricação de anticorpos ou fragmentos destes capazes de se ligar a cada um de: um complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1-pró-TGFβ1, um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 e um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 com afinidades equivalentes, e composições farmacêuticas e kits relacionados que compreendem os mesmos. Para fins de avaliação, é preferível que pelo menos um dos complexos LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1 e pelo menos um dos complexos GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1 seja incluído para maximizar a chance de identificação de anticorpos desejáveis com especificidades de ligação ampla tanto para complexos associados à ECM quanto para complexos associados à célula. Anticorpos ou fragmentos destes identificados no processo de avaliação são preferivelmente adicionalmente testados para confirmar sua habilidade para se ligar a cada um dos LLCs de interesse com alta afinidade.

[00457] Vários métodos podem ser usados para obtenção de anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno destes, da revelação. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos usando métodos de DNA recombinante. Anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por geração de hibridomas (veja, por exemplo, Kohler e Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) de acordo com métodos conhecidos. Hibridomas formados dessa forma são então avaliados usando métodos-padrão, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e análise por ressonância de plasmônio de superfície (por exemplo, OCTET® ou BIACORE), para identificar um ou mais hibridomas que produzem um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno especificado. Qualquer forma do antígeno especificado pode ser usada como o imunógeno, por exemplo, antígeno recombinante, formas de ocorrência natural, quaisquer variantes ou fragmentos deste, bem como peptídeo antigênico deste (por exemplo, qualquer um dos epitopos descritos nesse relatório descritivo como um epitopo linear ou dentro de um arcabouço como um epitopo conformacional). Um método exemplar de produção de anticorpos inclui a avaliação das bibliotecas de expressão de proteínas que expressam anticorpos ou fragmentos destes (por exemplo, scFv), por exemplo, bibliotecas de exibição em fago ou ribossomo. A exibição em fago é descrita, por exemplo, em Ladner e cols., Patente U.S. Nº 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1.315-1.317; Clackson e cols. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks e cols. (1991) J. Mol. Biol.,

222: 581-597; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809.

[00458] Além do uso de bibliotecas de exibição, o antígeno especificado (por exemplo, complexos molécula apresentadora-TGFβ1) pode ser usado para imunizar um hospedeiro não humano, por exemplo, coelho, porquinho-da- índia, rato, camundongo, hamster, carneiro, cabra, galinha, camelídeo, bem como hospedeiros não mamíferos como, por exemplo, um tubarão. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo.

[00459] A imunização de um hospedeiro não humano pode ser realizada com o uso de um complexo de proteína recombinante purificada como um imunógeno, por exemplo, pró-TGFβ1 com ou sem uma molécula apresentadora (ou fragmento desta) associada a ele. Estes incluem, sem limitação: LTBP1-pró- TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. A molécula apresentadora associada não precisa ser a contraparte de comprimento total, mas preferivelmente inclui os dois resíduos de cisteína que formam ligações covalentes com o dímero de complexo pró-TGFβ1.

[00460] Alternativamente, a imunização de um hospedeiro não humano pode ser realizada com o uso de um antígeno à base de células. O termo “antígeno à base de células” se refere às células (por exemplo, células heterólogas) que expressam o complexo de proteínas pró-TGFβ1. Isso pode ser obtido por superexpressão de pró-TGFβ1, opcionalmente com co-expressão de uma molécula apresentadora preferida. Em algumas modalidades, uma contraparte(s) endógena(s) pode ser utilizada como antígeno à base de células. A expressão na superfície celular das proteínas que formam o complexo de proteínas que contém pró-TGFβ1 pode ser confirmada por métodos bem conhecidos como, por exemplo, FACS. Mediante imunização do hospedeiro com essas células (um antígeno à base de células), são provocadas respostas imunes ao antígeno no hospedeiro, permitindo a produção de anticorpo e avaliação subsequente. Em algumas modalidades, animais com knockout adequados são usados para facilitar respostas imunes mais fortes ao antígeno. Alternativamente, diferenças estruturais entre espécies diferentes podem ser suficientes para desencadear a produção de anticorpo no hospedeiro.

[00461] Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal é obtido a partir do animal não humano, e depois modificado, por exemplo, quimérico, usando técnicas adequadas de DNA recombinante. Diversas abordagens para a produção de anticorpos quiméricos foram descritas. Veja, por exemplo, Morrison e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6.851, 1985; Takeda e cols., Nature 314: 452, 1985, Cabilly e cols., Patente U.S. Nº 4.816.567; Boss e cols., Patente U.S. Nº

4.816.397; Tanaguchi e cols., Publicação de Patente Européia EP171496; Publicação de Patente Européia 0173494, Patente do Reino Unido GB 2177096B.

[00462] Para técnicas adicionais de produção de anticorpo, veja “Antibodies: A Laboratory Manual”, eds. Harlow e cols., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. A presente revelação não está necessariamente limitada a qualquer fonte, método de produção ou outras características especiais de um anticorpo.

[00463] Alguns aspectos da presente revelação estão relacionados às células hospedeiras transformadas com um polinucleotídeo ou vetor. Células hospedeiras podem ser uma célula procariótica ou eucariótica. O polinucleotídeo ou vetor que está presente na célula hospedeira pode ser integrado no genoma da célula hospedeira ou pode ser mantido de forma extracromossômica. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica, por exemplo, uma célula bacteriana, de inseto, fúngica, de planta, animal ou humana. Em algumas modalidades, células fúngicas são, por exemplo, aquelas do gênero Saccharomyces, em particular aquelas da espécie S. cerevisiae. O termo “procariótica” inclui todas as bactérias que possam ser transformadas ou transfectadas com um DNA ou moléculas de RNA para a expressão de um anticorpo ou das cadeias de imunoglobulina correspondentes. Hospedeiros procarióticos podem incluir bactérias gram-negativas, bem como gram-positivas como, por exemplo, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. O termo “eucariótica” inclui células de leveduras, plantas superiores, insetos e vertebrados, por exemplo, de células de mamíferos, por exemplo, células NSO e CHO. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os anticorpos ou cadeias de imunoglobulina codificados pelo polinucleotídeo podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Anticorpos ou as cadeias de imunoglobulina correspondentes também podem incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.

[00464] Em algumas modalidades, após um vetor ter sido incorporado em um hospedeiro apropriado, o hospedeiro pode ser mantido sob condições adequadas para expressão em nível elevado das sequências de nucleotídeos e, como desejado, a coleta e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesada de imunoglobulina ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ao antígeno ou outras formas de imunoglobulina podem ocorrer; veja, Beychok, “Cells of Immunoglobulin Synthesis”, Academic Press, N.Y., (1979). Dessa forma, polinucleotídeos ou vetores são introduzidos nas células que, por sua vez, produzem o anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno. Além disso, animais transgênicos, preferivelmente mamíferos, que compreendem as células hospedeiras mencionadas anteriormente podem ser usadas para a produção em larga escala do anticorpo ou fragmentos de anticorpo.

[00465] As células hospedeiras transformadas podem ser desenvolvidas em fermentadores e cultivadas com o uso de quaisquer técnicas adequadas para obter crescimento celular ótimo. Uma vez expressos, os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias leves e pesadas individuais, outras formas de imunoglobulina, ou fragmentos de ligação ao antígeno, podem ser purificados de acordo com procedimentos padronizados da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes; veja, Scopes, “Protein Purification”, Springer Verlag, N.Y. (1982). O anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno podem então ser isolados do meio de crescimento, lisados celulares ou frações da membrana celular. O isolamento e purificação, por exemplo, dos anticorpos expressos de forma microbiana, ou fragmentos de ligação ao antígeno, podem ser por qualquer meio convencional como, por exemplo, separações cromatográficas preparativas e separações imunológicas, tais como aquelas que envolvem o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos, por exemplo, contra a região constante do anticorpo.

[00466] Aspectos da revelação estão relacionados a um hibridoma, que fornece uma fonte de anticorpos monoclonais indefinidamente prolongada. Como uma alternativa para a obtenção de imunoglobulinas diretamente a partir da cultura de hibridomas, células de hibridoma imortalizadas podem ser usadas como uma fonte de loci rearranjados de cadeia pesada e cadeia leve para expressão e/ou manipulação genética subsequente. Genes de anticorpo rearranjados podem ser transcritos de forma reversa a partir de mRNAs apropriados para produzir cDNA. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada pode ser trocada por aquela de um isótipo diferente ou totalmente eliminada. As regiões variáveis podem ser ligadas para codificar regiões Fv de cadeia única. Múltiplas regiões Fv podem ser ligadas para conferir habilidade de ligação a mais de um alvo ou combinações quiméricas de cadeia pesada e leve podem ser empregadas. Qualquer método apropriado pode ser usado para clonagem de regiões variáveis de anticorpo e geração de anticorpos recombinantes.

[00467] Em algumas modalidades, um ácido nucleico apropriado que codifica regiões variáveis de uma cadeia pesada e/ou leve é obtido e inserido em um vetor de expressão que pode ser transfectado em células hospedeiras recombinantes padronizadas. Várias dessas células hospedeiras podem ser usadas. Em algumas modalidades, células hospedeiras de mamíferos podem ser vantajosas para processamento e produção eficientes. Linhagens de células de mamíferos típicas úteis para essa finalidade incluem células CHO, células 293 ou células NSO. A produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser efetuada por cultivo de um hospedeiro recombinante modificado sob condições de cultura adequadas ao crescimento das células hospedeiras e à expressão das sequências codificadoras. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser recuperados por seu isolamento da cultura. Os sistemas de expressão podem ser projetados para incluir peptídeos sinalizadores de modo que os anticorpos resultantes sejam secretados no meio; no entanto, a produção intracelular também é possível.

[00468] A revelação também inclui um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina dos anticorpos descritos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a região variável codificada pelo polinucleotídeo compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da VH e/ou VL da região variável do anticorpo produzida por qualquer um dos hibridomas descritos acima.

[00469] Polinucleotídeos que codificam anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser, por exemplo, DNA, cDNA, RNA ou DNA ou RNA produzido sinteticamente ou uma molécula de ácido nucleico quimérica produzida recombinantemente que compreende qualquer um daqueles polinucleotídeos isoladamente ou em combinação. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo é parte de um vetor. Esses vetores podem compreender genes adicionais como, por exemplo, genes marcadores, que permitem a seleção do vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas.

[00470] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo é ligado operativamente às sequências de controle de expressão que permitem a expressão em células procarióticas ou eucarióticas. A expressão do polinucleotídeo compreende a transcrição do polinucleotídeo em um mRNA traduzível. Elementos regulatórios que asseguram a expressão em células eucarióticas, preferivelmente células de mamíferos, são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Eles podem incluir sequências reguladoras que facilitam a iniciação da transcrição e, opcionalmente, sinais poli-A que facilitam a terminação da transcrição e estabilização do transcrito. Elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores da transcrição, bem como intensificadores da tradução, e/ou regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas. Elementos reguladores possíveis que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas incluem, por exemplo, o promotor PL, Lac, Trp ou Tac em E. coli, e exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOX1 ou GAL1 em leveduras ou o promotor de CMV, promotor de SV40, promotor de RSV (vírus do sarcoma de Rous), intensificador de CMV, intensificador de SV40 ou um íntron de globina em células de mamíferos e outras células animais.

[00471] Além de elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição, esses elementos reguladores também podem incluir sinais de terminação da transcrição, por exemplo, o sítio SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão empregado, sequências-líderes capazes de dirigir o polipeptídeo para um compartimento celular ou sua secreção no meio podem ser adicionadas à sequência codificadora do polinucleotídeo e foram descritas previamente. A sequência- líder (ou sequências) é montada em fase apropriada com sequências de iniciação e terminação da tradução e, preferivelmente, uma sequência-líder capaz de dirigir a secreção da proteína traduzida, ou uma porção desta, por exemplo, no meio extracelular. Opcionalmente, pode ser usada uma sequência de polinucleotídeos heteróloga que codifica uma proteína de fusão que inclui um peptídeo de identificação do terminal-C ou -N que transmite características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso.

[00472] Em algumas modalidades, polinucleotídeos que codificam pelo menos o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada podem codificar os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina ou de apenas uma. Da mesma forma, polinucleotídeos podem estar sob o controle do mesmo promotor ou podem ser controlados separadamente para expressão. Além disso, alguns aspectos estão relacionados aos vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos, usados convencionalmente em engenharia genética que compreendem um polinucleotídeo que codifica um domínio variável de uma cadeia de imunoglobulina de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; opcionalmente em combinação com um polinucleotídeo que codifica o domínio variável da outra cadeia de imunoglobulina do anticorpo.

[00473] Em algumas modalidades, sequências de controle de expressão são fornecidas como sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas sequências de controle para hospedeiros procarióticos também podem ser usadas. Vetores de expressão derivados de vírus como, por exemplo, retrovírus, vírus da vaccínia, vírus adenoassociado, vírus do herpes ou vírus do papiloma bovino, podem ser usados para liberação dos polinucleotídeos ou vetor na população de células visada (por exemplo, para modificar geneticamente uma célula para expressar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno). Diversos métodos apropriados podem ser usados para a construção de vetores virais recombinantes. Em algumas modalidades, polinucleotídeos e vetores podem ser reconstituídos em lipossomos para liberação às células-alvo. Os vetores contendo os polinucleotídeos (por exemplo, o domínio variável (ou domínios) pesado e/ou leve das sequências que codificam cadeias de imunoglobulina e sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos adequados, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular.

[00474] Os métodos de avaliação podem incluir uma etapa de avaliação ou confirmação de atividades desejadas do anticorpo ou fragmento deste. Em algumas modalidades, a etapa compreende a seleção quanto à habilidade para inibir uma função-alvo, por exemplo, inibição da liberação de fator de crescimento maduro/solúvel (por exemplo, TGFβ1) por um complexo latente. Em modalidades preferidas, essa etapa compreende um ensaio baseado em células de potência, no qual as atividades inibidoras de anticorpo ou anticorpos de teste são testadas por medição do nível de fator de crescimento liberado no meio (por exemplo, solução de ensaio) mediante ativação, quando o complexo pró-TGFβ é expresso na superfície celular. O nível de fator de crescimento liberado no meio/solução pode ser testado, por exemplo, por medição das atividades de TGFβ. Exemplos não limitantes de ensaios de potência baseados em células úteis são descritos no Exemplo 2 nesse relatório descritivo.

[00475] Em algumas modalidades, a etapa de avaliação de anticorpos desejáveis ou fragmentos compreende a seleção por anticorpos ou fragmentos destes que promovem internalização e subsequente remoção de complexos antígeno-anticorpo da superfície celular. Em algumas modalidades, a etapa compreende a seleção de anticorpos ou fragmentos destes que induzem ADCC. Em algumas modalidades, a etapa compreende a seleção de anticorpos ou fragmentos destes que se acumulam em um local (ou locais) desejado in vivo (por exemplo, tipo de célula, tecido ou órgão). Em algumas modalidades, a etapa compreende a seleção de anticorpos ou fragmentos destes com a habilidade para atravessar a barreira hematencefálica. Os métodos podem opcionalmente incluir uma etapa de otimização de um ou mais anticorpos ou fragmentos destes para fornecer contrapartes variantes que possuem perfis desejáveis, como determinados por critérios como, por exemplo, estabilidade, afinidade de ligação, funcionalidade (por exemplo, atividades inibidoras, função de Fc etc.), imunogenicidade, sensibilidade ao pH e capacidade de desenvolvimento (por exemplo, solubilidade elevada, auto-associação baixa etc.).

[00476] O processo para a produção de uma composição que compreende um anticorpo ou um fragmento de acordo com a invenção pode incluir a otimização de um anticorpo ou anticorpos que são identificados como possuindo propriedades de ligação e funcionais (por exemplo, inibidoras)

desejáveis. A otimização pode compreender a maturação de afinidade de um anticorpo ou fragmento deste. Etapas de otimização adicionais podem ser realizadas para fornecer propriedades físico-químicas que são vantajosas para composições terapêuticas. Essas etapas podem incluir, sem limitação, mutagênese ou modificação por engenharia genética para fornecer solubilidade aumentada, ausência de auto- agregação, estabilidade, sensibilidade ao pH, função de Fc, e assim por diante. O anticorpo otimizado resultante é preferivelmente um anticorpo totalmente humano ou anticorpo humanizado adequado para administração humana.

[00477] O processo de fabricação para uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento desse tipo deste pode compreender as etapas de purificação, formulação, filtração estéril, empacotamento etc. Certas etapas como, por exemplo, filtração estéril, por exemplo, são realizadas de acordo com as diretrizes definidas órgãos reguladores relevantes como, por exemplo, o FDA (“Food and Drug Administration” - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos). Essas composições podem estar disponíveis em uma forma de recipientes de uso único, por exemplo, seringas pré-preenchidas, ou recipientes multidosagem, por exemplo, frascos. Modificações

[00478] Anticorpos da revelação, ou porções de ligação ao antígeno destes, podem ser modificados com um marcador detectável ou porção detectável incluindo, sem limitação, uma enzima, grupo prostético, material fluorescente, material luminescente, material bioluminescente, material radioativo, metal emissor de pósitron, íon metálico paramagnético não radioativo e marcador de afinidade para detecção e isolamento de um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1- TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33- TGFβ1. A substância ou porção detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente aos polipeptídeos da revelação ou indiretamente, por meio de um intermediário (como, por exemplo, um ligante (por exemplo, um ligante clivável)) usando técnicas adequadas.

Exemplos não limitantes de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose oxidase, ou acetilcolinesterase; exemplos não limitantes de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos não limitantes de materiais fluorescentes adequados incluem biotina, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos não limitantes de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aquorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem um íon de metal radioativo, por exemplo, emissores alfa ou outros radioisótopos, por exemplo, iodo (131I, 125I, 123I, 121I),

carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115mIn, 113mIn,

112In, 111In) e tecnécio (99Tc, 99mTc), tálio (201T1), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F) 153Sm, Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho,

90Y, 47Sc, 86R, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P,

153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se e estanho (113Sn, 117Sn). Em algumas modalidades, o radiomarcador pode ser selecionado do grupo que consiste em: 11C, 13N, 15O, 68Ga, 177Lu, 18F e 89Zr. Em algumas modalidades, marcadores úteis são isótopos emissores de pósitron, que podem ser detectados por tomografia por emissão de pósitron. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente aos anticorpos da revelação que se ligam especificamente a um complexo GARP- TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, ou indiretamente, por meio de um intermediário (como, por exemplo, um ligante) usando técnicas adequadas. Qualquer um dos anticorpos fornecidos nesse relatório descritivo que são conjugados a uma substância detectável pode ser usado para quaisquer ensaios diagnósticos adequados, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo.

[00479] Além disso, anticorpos da revelação, ou porções de ligação ao antígeno destes, também podem ser modificados com um fármaco. O fármaco pode ser acoplado ou conjugado diretamente ao polipeptídeos da revelação, ou indiretamente, por meio de um intermediário (como, por exemplo, um ligante (por exemplo, um ligante clivável)) usando técnicas adequadas. Agentes de direcionamento

[00480] Em algumas modalidades, os métodos da presente revelação compreendem o uso de um ou mais agentes de direcionamento para direcionar um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, como revelado nesse relatório descritivo, a um local particular em um indivíduo para fins de modulação da liberação de TGFβ maduro por um complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1-pró-TGFβ1, um complexo

LTBP3-pró-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-pró-TGFβ1. Por exemplo, complexos LTBP1-TGFβ1 e LTBP3-TGFβ1 estão tipicamente localizados na matriz extracelular. Dessa forma, em algumas modalidades, os anticorpos revelados nesse relatório descritivo podem ser conjugados a agentes de direcionamento à matriz extracelular para fins de localização dos anticorpos nos locais onde os complexos associados a LTBP-TGFβ1 residem. Nessas modalidades, o direcionamento seletivo de anticorpos leva à modulação seletiva de complexos LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, o direcionamento seletivo de anticorpos leva à inibição seletiva de complexos LTBP1-TGFβ1 e/ou LTBP3- TGFβ1 (por exemplo, para fins de tratamento de fibrose). Em algumas modalidades, os agentes de direcionamento à matriz extracelular incluem agentes de ligação à heparina, agentes de ligação à metaloproteinase da matriz, domínios de ligação de lisil oxidase, agentes de ligação à fibrilina, agentes de ligação ao ácido hialurônico, e outros.

[00481] Similarmente, complexos GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33- pró-TGFβ1 estão tipicamente localizados e ancorados na superfície das células. O primeiro é expresso em células T reguladoras (Tregs) FOXP3+ ativadas, enquanto o último é expresso em certas células mielóides e algumas células de câncer, por exemplo, AML. Dessa forma, em algumas modalidades, os anticorpos revelados nesse relatório descritivo podem ser conjugados a agentes de ligação à célula imune (por exemplo, célula Treg, macrófagos ativados etc.) para fins de localização dos anticorpos nos locais onde esses complexos pró-TGFβ1 associados à célula residem. Nessas modalidades, o direcionamento seletivo de anticorpos leva à modulação seletiva de complexos GARP-TGFβ1. Em algumas modalidades, o direcionamento seletivo de anticorpos leva à inibição seletiva de complexos pró-TGFβ1 (por exemplo, inibição seletiva da liberação de TGFβ1 maduro para fins de modulação imune, por exemplo, no tratamento de câncer). Nessas modalidades, agentes de direcionamento à célula imune podem incluir, por exemplo, proteínas CCL22 e CXCL12 ou fragmentos destas.

[00482] Em algumas modalidades, podem ser usados anticorpos biespecíficos que possuem uma primeira porção que se liga seletivamente a um complexo pró-TGFβ1 e uma segunda porção que se liga seletivamente a um componente de um local- alvo, por exemplo, um componente da ECM (por exemplo, fibrilina) ou um componente de uma célula Treg (por exemplo, CTLA-4).

[00483] Como adicionalmente detalhado nesse relatório descritivo, a presente invenção contempla que inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para promoção ou restauração de hematopoiese na medula óssea. Consequentemente, em algumas modalidades, uma composição que compreende um inibidor desse tipo (por exemplo, inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade) pode ser direcionada à medula óssea. Um modo de obtenção de direcionamento à medula óssea é o uso de certos carreadores que alvejam preferencialmente a localização ou acúmulo na medula óssea. Por exemplo, certos carreadores baseados em nanopartícula com propriedades de direcionamento à medula óssea podem ser empregados, por exemplo, nanopartículas ou lipossomos baseados em lipídeos. Veja, por exemplo, Sou

(2012) “Advanced Drus Carriers Targeting Bone Marrow”, publicação ResearchGate 232725109.

[00484] Em algumas modalidades, agentes de direcionamento incluem potencializadores imunes, por exemplo, adjuvantes que compreendem esqualeno e/ou α- tocoferol, e adjuvantes que compreendem um ligante/agonista de TLR (por exemplo, ligantes/agonistas de TLR3). Por exemplo, um adjuvante que contém esqualeno pode preferencialmente alvejar certas células imunes, por exemplo, monócitos, macrófagos e células apresentadoras de antígeno, para potencializar a sensibilização, processamento de antígeno e/ou diferenciação de células imunes para reforçar a imunidade do hospedeiro. Em algumas modalidades, esses adjuvantes podem estimular as respostas imunes do hospedeiro aos neoepitopos para ativação de célula T. Alvos terapêuticos e mecanismos de ação in vivo

[00485] Consequentemente, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, revelados nesse relatório descritivo podem ser usados para inibir TGFβ1 em quaisquer sistemas biológicos adequados, por exemplo, sistemas in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Métodos relacionados podem compreender o contato de um sistema biológico com o inibidor de TGFβ1. O sistema biológico pode ser um sistema de ensaio, uma amostra biológica, uma cultura de células, e assim por diante. Em alguns casos, esses métodos incluem a modificação do nível de fator de crescimento livre no sistema biológico.

[00486] Consequentemente, essas composições e formulações farmacêuticas podem ser usadas para alvejar complexos latentes que contêm TGFβ acessíveis pelos inibidores in vivo. Dessa forma, o anticorpo da invenção se destina a direcionar os seguintes complexos para um local de doença (por exemplo, TME) onde ele se liga preventivamente ao complexo latente evitando, dessa forma, que o fator de crescimento seja liberado: i) pró-TGFβ1 apresentado por GARP; ii) pró-TGFβ1 apresentado por LRRC33; iii) pró-TGFβ1 apresentado por LTBP1; e iv) pró-TGFβ1 apresentado por LTBP3. Tipicamente, complexos (i) e (ii) acima estão presentes na superfície celular, pois tanto GARP quanto LRRC33 são proteínas transmembrana capazes de ancorar ou atar pró-TGFβ1 latente na face extracelular da célula que expressa LRRC33, embora complexos (iii) e (iv) sejam componentes da matriz extracelular. Dessa forma, os inibidores incorporados nesse relatório descritivo não precisam de ligação completa com receptores endógenos de alta afinidade para que exerçam efeitos inibidores. Além disso, o direcionamento a montante da interação ligante/receptor pode habilitar efeitos mais duráveis, na medida em que a janela de acessibilidade ao alvo é mais longa e mais localizada em tecidos relevantes do que inibidores convencionais que alvejam fatores de crescimento solúveis, transitórios, somente após ele ter sido liberado do complexo latente. Dessa forma, o direcionamento do complexo latente atado a certos nichos pode facilitar engajamento aumentado com o alvo in vivo, comparado com anticorpos neutralizantes convencionais que têm que competir pela ligação com receptores endógenos durante sua meia-vida curta como um fator de crescimento solúvel (livre), por exemplo, de aproximadamente dois minutos, após ter sido liberado do complexo latente.

[00487] Diversos estudos esclareceram os mecanismos de ativação de TGFβ1. Foi demonstrado que três integrinas, αVβ6, αVβ8 e αVβ1, são ativadores cruciais de TGFβ1 latente (Reed, N.I., e cols., Sci. Transl. Med., 2015. 7 (288): páginas 288ra79; Travis, M.A. e D. Sheppard, Annu. Rev. Immunol.,

2014. 32: páginas 51-82; Munger, J.S., e cols., Cell, 1999. 96 (3): páginas 319-28). As integrinas αV se ligam à sequência RGD presente em LAPs de TGFβ1 e TGFβ1 com alta afinidade (Dong, X., e cols., Nat. Struct. Mol. Biol., 2014. 21 (12): páginas 1.091-6). Camundongos transgênicos com uma mutação no sítio de RGD de TGFβ1 que evita a ligação de integrina, mas não a secreção, são uma fenocópia do camundongo TGFβ1-/- (Yang, Z., e cols., J. Cell. Biol., 2007. 176 (6): páginas 787-93). Camundongos que não possuem as integrinas β6 e β8 recapitulam todos os fenótipos essenciais de camundongos com knockout de TGFβ1 e TGFβ3, incluindo inflamação multiórgãos e fenda palatina, confirmando o papel essencial dessas duas integrinas para ativação de TGFβ1 no desenvolvimento e homeostasia (Aluwihare, P., e cols., J. Cell. Sci., 2009. 122 (Parte 2): páginas 227-32). Crucial para a ativação de TGFβ1 latente integrina-dependente é a adesão covalente às moléculas apresentadoras; a ruptura das ligações dissulfeto entre LAP de GARP e TGFβ1 por mutagênese não prejudica a formação de complexo, mas abole completamente a ativação de TGFβ1 por αVβ6 (Wang, R., e cols., Mol. Biol. Cell., 2012. 23 (6): páginas 1.129-39). A estrutura recente de TGFβ1 latente ilumina como as integrinas habilitam a liberação de TGFβ1 ativo pelo complexo latente: a ligação covalente de TGFβ1 latente à sua molécula apresentadora ancora TGFβ1 latente à ECM por meio de LTBPs, ou ao citoesqueleto por meio de GARP ou LRRC33. A ligação de integrina à sequência RGD resulta em uma alteração força- dependente na estrutura de LAP, permitindo que TGFβ1 ativo seja liberado e se ligue aos receptores próximos (Shi, M., e cols., Nature, 2011. 474 (7351): páginas 343-9). A importância da ativação de TGFβ1 integrina-dependente na doença também foi bem validada. Um inibidor de αVβ1 de pequena molécula protege contra fibrose pulmonar induzida por bleomicina e fibrose hepática induzida por tetracloreto de carbono (Reed, N.I., e cols., Sci. Transl. Med, 2015. 7 (288): páginas 288ra79), e o bloqueio de αVβ6 com um anticorpo ou a perda da expressão de integrina β6 suprime a fibrose pulmonar induzida por bleomicina e a fibrose induzida por radiação (Munger, J.S., e cols., Cell, 1999. 96 (3): páginas 319-28); Horan, G.S., e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2008. 177 (1): páginas 56-65).

[00488] Além das integrinas, outros mecanismos de ativação de TGFβ1 foram implicados, incluindo trombospondina-1 e ativação por proteases como, por exemplo, metaloproteinases da matriz (MMPs, por exemplo, MMP2, MMP9 e MMP12), catepsina D ou calicreína, e a família ADAMs de zinco proteases (por exemplo, ADAM10, ADAM12 e ADAM17). O knockout de trombospondina-1 recapitula alguns aspectos do fenótipo TGFβ1-/- em alguns tecidos, mas não é protetor na fibrose pulmonar induzida por bleomicina, sabidamente TGFβ- dependente (Ezzie, M.E., e cols., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 2011. 44 (4): páginas 556-61). Adicionalmente, o knockout de proteases candidatas não resultou em um fenótipo de TGFβ1 (Worthington, J.J., J.E. Klementowicz, e M.A. Travis, Trends Biochem. Sci., 2011. 36 (1): páginas 47-54). Isso poderia ser explicado por redundâncias ou por esses mecanismos serem cruciais em doenças específicas, e não no desenvolvimento e homeostasia.

[00489] Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, de alta afinidade, descritos nesse relatório descritivo incluem inibidores que funcionam por prevenção da etapa de ativação de TGFβ1. Em algumas modalidades, esses inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 integrina- dependente (por exemplo, mecânica ou dirigida por força). Em algumas modalidades, esses inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 protease-dependente ou induzida por protease. O último inclui inibidores que inibem a etapa de ativação de TGFβ1 de uma forma integrina-independente. Em algumas modalidades, esses inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 independentemente do modo de ativação, por exemplo, inibem tanto a ativação integrina-dependente quanto a ativação de TGFβ1 protease-dependente. Exemplos não limitantes de proteases que podem ativar TGFβ1 incluem serina proteases, por exemplo, Calicreínas, Quimotripsina, Tripsina, Elastases, Plasmina, bem como metaloproteases de zinco (família MMP), por exemplo, MMP-2, MMP-9 e MMP-13. Calicreínas incluem Calicreínas plasmáticas e Calicreínas teciduais, por exemplo, KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14 e KLK15. Dados apresentados nesse relatório descritivo demonstram exemplos de inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, capazes de inibir a ativação de TGFβ1 calicreína-dependente in vitro. Em algumas modalidades, os inibidores da presente invenção evitam a liberação ou dissociação de fator de crescimento TGFβ1 ativo (maduro) do complexo latente. Em algumas modalidades, esses inibidores podem funcionar por estabilização da conformação inativa (por exemplo, latente) do complexo. Os dados demonstram ainda que um inibidor de TGFβ1 contexto-independente, de alta afinidade (Ab6) também pode inibir a ativação de TGFβ1 plasmina-dependente. Surpreendentemente, no entanto, um inibidor de TGFβ1 com viés de contexto (Ab3) não conseguiu inibir esse processo. Both Ab3 e Ab6 possuem afinidades similares por complexos pró-TGFβ1 associados à matriz. No entanto, Ab3 possui uma afinidade de ligação significantemente mais fraca por complexos pró-TGFβ1 associados à célula. A diferença relativa entre as duas categorias é de mais do que 20 vezes (“viés”). Por comparação, Ab6 mostra afinidades equivalentes elevadas para ambas as categorias dos complexos de antígenos. Uma explicação possível é que a diferença funcional observada pode ser decorrência da característica de viés de Ab3. Outra explicação possível é que ela seja mediada por diferenças em epitopos ou regiões de ligação.

[00490] A invenção é particularmente útil para uso terapêutico para certas doenças que estão associados com múltiplos papéis biológicos da sinalização de TGFβ1 que não estão limitados a um único contexto da função de TGFβ1. Nessas situações, pode ser benéfico inibir efeitos de TGFβ1 através de múltiplos contextos. Dessa forma, a presente revelação fornece métodos para o direcionamento e inibição de TGFβ1 de um modo isoforma-específico, e não de um modo contexto-específico. Esses agentes podem ser chamados de moduladores de TGFβ1 “isoforma-específicos, contexto- independentes”.

[00491] Um corpo de evidências dá suporte à noção de que muitas doenças manifestam perturbações complexas da sinalização de TGFβ, que provavelmente envolvem participação de tipos de células heterogêneos que conferem efeitos diferentes da função de TGFβ, que são mediados por suas interações com as denominadas moléculas apresentadoras. Foram identificadas pelo menos quatro dessas moléculas apresentadoras, que podem “apresentar” TGFβ em vários nichos extracelulares para permitir sua ativação em resposta a estímulos locais. Em uma categoria, TGFβ está depositado na ECM em associação com moléculas apresentadoras associadas à ECM, por exemplo, LTBP1 e LTBP3, que medeiam atividades de TGFβ associadas à ECM. Em outra categoria, TGFβ está aderido na superfície de células imunes, por meio de moléculas apresentadoras como, por exemplo, GARP e LRRC33, que medeiam algumas funções imunes. Essas moléculas apresentadoras exibem expressão, localização e/ou função diferencial em vários tecidos e tipos de células, indicando que o desencadeamento de eventos e o resultado final de ativação de TGFβ irão variar, dependendo do microambiente. Com base na noção de que muitos efeitos de TGFβ podem interagir e contribuir para a progressão de doença, agentes terapêuticos que possam antagonizar várias facetas da função de TGFβ podem fornecer maior eficácia.

[00492] A lógica para o uso vantajoso de inibidores de TGFβ1 inibidores de TGFβ1 contexto-independentes em relação aos inibidores de TGFβ1 com viés de contexto como um produto terapêutico para tratar certas doenças (como descrito em mais detalhes nesse relatório descritivo) inclui o seguinte:

[00493] Trabalho revelado nesse relatório descritivo confirma o envolvimento de complexos TGFβ1 heterogêneos em um ambiente de doença e estende a compreensão dos mecanismos subjacentes, fornecendo informações para uma abordagem terapêutica aprimorada para diversas doenças.

[00494] Foi reconhecido que várias doenças envolvem populações heterogêneas de células como fontes de TGFβ1 que coletivamente contribuem para a patogênese e/ou progressão da doença. Mais de um tipo de complexos que contêm TGFβ1 (“contextos”) provavelmente coexiste dentro do mesmo microambiente de doença. Em particular, essas doenças podem envolver tanto um componente da ECM (ou “matriz) da sinalização de TGFβ1 quanto um componente imune da sinalização de TGFβ1. Nessas situações, o direcionamento seletivo de um único contexto de TGFβ1 (por exemplo, TGFβ1 associado com um tipo de molécula apresentadora) pode oferecer alívio limitado. Dessa forma, antagonistas de TGFβ1 amplamente inibidores são desejáveis para uso terapêutico. Anticorpos inibidores descritos previamente que alvejavam amplamente múltiplos complexos latentes de TGFβ1 exibiam perfis de ligação tendenciosos entre os complexos-alvo. Os inventores, portanto, começaram a identificar anticorpos mais uniformemente inibidores que inibem seletivamente a ativação de TGFβ1, independentemente da molécula apresentadora particular ligada a eles. Foi fundamentado que, particularmente para aplicações em imuno-oncologia, é vantajoso inibir potentemente tanto TGFβ1 associado à matriz quanto TGFβ1 associado às células imunes.

[00495] Segundo, são observadas similaridades notáveis em características teciduais/celulares entre o estroma tumoral e tecidos fibróticos, realçando mecanismos comuns subjacentes a várias indicações, indicando comunicação cruzada entre: i) fenótipos pró-fibróticos TGFβ1-

dependentes; ii) fenótipos pró-tumorais TGFβ1-dependentes; e, iii) fenótipos imunossupressores TGFβ-dependentes, observados em diversas condições patológicas. Dessa forma, o uso de inibidores contexto-independentes que atuam amplamente sobre muitos desses constituintes com potência equivalente pode fornecer efeitos terapêuticos ótimos através de tipos diversos de condições de doença. Por exemplo, manifestações clínicas de mielofibrose primária incluem proliferação anormal de certas populações de células e fibrose na medula óssea.

[00496] Terceiro, linhas de evidências sugeriram a possibilidade de que TGFβ 1 pode ser, pelo menos em parte, responsável por resistência farmacológica às terapias anticâncer (por exemplo, inibidores do ponto de verificação imune, vacinas contra o câncer, terapia com células imunes modificadas geneticamente, quimioterapia, radioterapia etc.) observada em muitos tipos de câncer (pacientes com câncer). Em alguns casos, essa resistência parece intrínseca ao tipo de câncer/tumor particular contra o nível de base do paciente (tipicamente denominada resistência inata, resistência primária, resistência intrínseca ou resistência inerente; esses termos são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo). Essa resistência pode estar representada em um subconjunto de pacientes pouco responsivos às terapias de câncer, por exemplo, inibidores do ponto de verificação imune, e possivelmente refletem ambiente imuno-excluído. Isso provavelmente é mediado, pelo menos em parte, por uma via TGFβ1-dependente. Dessa forma, o inibidor isoforma-seletivo descrito nesse relatório descritivo pode tornar os cânceres resistentes mais responsivos a essas terapias. Em particular, em situações nas quais a resistência à terapia está associada com exclusão imune em um local de doença (por exemplo, tumor), a inibição de TGFβ1 pode desbloquear a imunossupressão e permitir que as células efetoras acessem seu alvo (por exemplo, células de câncer). O mesmo mecanismo de ação é aplicável em diversos paradigmas terapêuticos nos quais os efeitos de uma terapia devem entrar em contato com os tecidos doentes ou segurados a serem tratados. Acredita-se que os inibidores de TGFβ1 contexto-independentes de alta afinidade da presente invenção facilitem esses processos ao atuarem em vários braços da função de TGFβ1, por exemplo, inibição de Tregs, modulação de macrófagos e regulação de ECM superando, dessa forma, a resistência farmacológica.

[00497] Alternativamente, a resistência pode se desenvolver ao longo do tempo, de tal modo que pacientes que exibem responsividade clínica material a um tratamento se tornam pouco responsivos ao longo do tempo (ou seja, resistência adaptiva ou adquirida). Por exemplo, foi relatado que a terapia com PD-1 pode levar à resistência adaptiva que está correlacionada com a supra-regulação de outros antígenos de célula T (por exemplo, componentes de TCR), sugerindo que células de câncer evoluem para evadir ao bloqueio de PD-1 por meio de outro mecanismo. Subsequentemente, um segundo inibidor do ponto de verificação que alveja um componente diferente do receptor de célula T como, por exemplo, TIM3, pode restaurar a responsividade à imunoterapia. Essas observações sugerem que o bloqueio de múltiplas vias para se contrapor às respostas adaptivas de células de câncer pode reduzir a probabilidade da habilidade de células de câncer para fugir da imunidade do hospedeiro. Inibidores de TGFβ1 que são capazes de alvejar múltiplos contextos de TGFβ1 podem vantajosamente contornar a resistência farmacológica adquirida por fornecimento de bloqueio em vários pontos da função de TGFβ1.

[00498] E, finalmente, com base na noção de que a expressão de várias moléculas apresentadoras pode variar ao longo do tempo, por exemplo, em resposta às pistas locais (por exemplo, citocinas, quimiocinas, ambiente da ECM etc.) e/ou com alterações em um microambiente de doença, é fundamentado que inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para resistir a essa plasticidade e fornecer efeitos inibidores duráveis, amplos, até mesmo quando ocorrem alterações anormais na expressão das moléculas apresentadoras.

[00499] Em qualquer um desses cenários, os inibidores de TGFβ1 contexto-independentes se destinam vantajosamente a alvejar as formas pró/latentes de TGFβ1 em associação com várias moléculas apresentadoras, todas as quais ou combinações diferentes destas estando presentes em um microambiente(s) de doença. Mais especificamente, em uma modalidade, o inibidor alveja TGFβ1 associado à ECM (complexos LTBP1/3-TGFβ1). Em outra modalidade, o inibidor alveja TGFβ1 associado às células imunes. Isso inclui TGFβ1 apresentado por GARP, por exemplo, complexos GARP-TGFβ1 expressos em células Treg e complexos LRRC33-TGFβ1 expressos em macrófagos e outras células mielóides/linfóides, bem como certas células de câncer.

[00500] Esses anticorpos incluem inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos que se ligam e evitam a ativação (ou liberação) de fator de crescimento TGFβ1 maduro por um complexo de TGFβ1 pró/latente de uma forma contexto- independente, de modo que os anticorpos possam inibir a ativação (ou liberação) de TGFβ1 associado com vários tipos de moléculas apresentadoras. Em particular, a presente invenção fornece anticorpos capazes de bloquear associado à ECM (complexos apresentados por LTBP e/ou apresentado por LTBP3) e TGFβ1 associado à célula (complexos apresentados por GARP e/ou apresentado por LRRC33).

[00501] Foram sugeridas várias condições de doença que envolvem a desregulação de sinalização de TGFβ como um fator contribuinte. Na verdade, a patogênese e/ou progressão de certas condições humanas parecem ser predominantemente dirigidas ou dependente de atividades de TGFβ1. Em particular, muitas dessas doenças e distúrbios envolvem tanto um componente da ECM quanto um componente imune da função de TGFβ1, sugerindo que a ativação de TGFβ1 em múltiplos contextos (por exemplo, mediada por mais de um tipo de moléculas apresentadoras) esteja envolvida. Além disso, é contemplado que há uma comunicação cruzada entre células responsivas ao TGFβ1. Em alguns casos, a interconexão entre atividades multifacetadas do eixo de TGFβ1 pode levar à progressão, ao agravamento e/ou à supressão de doença da habilidade do hospedeiro para combater a doença. Por exemplo, certos microambientes de doença, por exemplo, o microambiente tumoral (TME) e o microambiente fibrótico (FME), podem estar associados com TGFβ1 apresentado por várias moléculas apresentadoras diferentes, por exemplo, LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1, LRRC33-

pró-TGFβ1, e quaisquer combinações destes. As atividades de TGFβ1 de um contexto podem, por sua vez, regular ou influenciar atividades de TGFβ1 de outro contexto, despertando a possibilidade de que, quando desreguladas, isso possa resultar na exacerbação de condições de doença. Portanto, é desejável inibir amplamente através de vários modos a função de TGFβ1 (ou seja, múltiplos contextos) limitando-se seletivamente, ao mesmo tempo, esses efeitos inibidores à isoforma TGFβ1. O objetivo é não perturbar a sinalização de TGFβ homeostática mediada pelas outras isoformas, incluindo TGFβ3, que desempenha um papel importante na cicatrização de feridas.

[00502] Os componentes imunes das atividades de TGFβ1 são em grande parte mediados por TGFβ1 associado à célula (por exemplo, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1). Ambos os braços de GARP e LRRC33 da função de TGFβ1 estão associados com características imunossupressoras que contribuem para a progressão de muitas doenças. Dessa forma, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, pode ser usado para inibir TGFβ1 associado com células imunossupressoras. As células imunossupressoras incluem células T reguladoras (Tregs), macrófagos M2 e MDSCs. Dessa forma, o inibidor de TGFβ1 pode inibir ou reverter o fenótipo imunossupressor em um local de doença, por exemplo, TME e FME in vivo.

[00503] Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 inibe TGFβ1 associado com uma célula que expressa o complexo GARP- TGFβ1 ou o complexo LRRC33-TGFβ1, em que, opcionalmente, a célula pode ser uma célula T, um fibroblasto, um miofibroblasto, um macrófago, um monócito, uma célula dendrítica, uma célula apresentadora de antígeno, um neutrófilo, uma célula supressora derivada da linhagem mielóide (MDSC), um linfócito, um mastócito ou uma microglia. A célula T pode ser uma célula T reguladora (por exemplo, célula T imunossupressora). O neutrófilo pode ser um neutrófilo ativado. O macrófago pode ser um macrófago ativado (por exemplo, polarizado), incluindo macrófagos pró- fibróticos e/ou associados ao tumor (TAM), por exemplo, macrófagos subtipo M2c e subtipo M2d. Em algumas modalidades, macrófagos são expostos aos fatores derivados do tumor (por exemplo, citocinas, fatores de crescimento etc.) que podem ainda induzir fenótipos pró-câncer em macrófagos. Em algumas modalidades, esse fator derivado do tumor é CSF-1/M-CSF.

[00504] Em algumas modalidades, a célula que expressa o complexo GARP-TGFβ1 ou o complexo LRRC33-TGFβ1 é uma célula de câncer, por exemplo, células de câncer circulantes e células tumorais. GARP-pró-TGFβ1 como alvo

[00505] Células T reguladoras (Tregs) representam um pequeno subconjunto de linfócitos T CD4-positivos e desempenham um papel importante de atuação como uma “quebra” no amortecimento de respostas imunes para manter a homeostasia. Em condições de doença (por exemplo, câncer), são relatados níveis elevados de Tregs, e isso está associado com prognóstico mais pobre. Tregs humanas isoladas de células do sangue periférico de doadores podem ser ativadas por estimulação com CD3/CD28. Foi demonstrado que a ativação de Treg induz um aumento acentuado na expressão de GARP-pró- TGFβ1 na superfície celular (FIG. 26A). Como relatado previamente, Tregs exercem atividades imunossupressoras, que incluem supressão poderosa da proliferação de células T efetoras (Teff). Como mostrado nesse relatório descritivo (FIG. 26B), sob as condições experimentais nas quais a maioria das Teffs passa por divisão celular, Tregs cocultivadas reduzem isso a uma simples fração. E essa inibição por Treg da proliferação de Teff pode ser eficazmente superada (ou seja, desinibição) por tratamento da cocultura de Teffs e Tregs com inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, demonstrando que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos revelados nesse relatório descritivo são eficazes na inibição do braço de GARP da função de TGFβ1. Em ambientes de doença (por exemplo, microambiente tumoral e ambiente fibrótico), isso se traduziria na habilidade desses inibidores para bloquear a imunossupressão mediada por Treg. Isso levaria, por sua vez, à proliferação aumentada de células T efetoras para reforçar a imunidade. O braço de GARP dos inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos pode alvejar essa faceta da função de TGFβ1. Em algumas modalidades, os anticorpos, ou as porções de ligação ao antígeno destes, como descrito nesse relatório descritivo, pode reduzir a atividade supressora de células T reguladoras (Tregs). LRRC33-pró-TGFβ1 como alvo

[00506] LRRC33 é expresso em tipos seletivos de células, em particular àquelas da linhagem mielóide, incluindo monócitos e macrófagos. Monócitos se originam de progenitores na medula óssea e circulam na corrente sanguínea e alcançam tecidos periféricos. Monócitos circulantes podem então migrar para dentro de tecidos onde ficam expostos ao ambiente local (por exemplo, tecido-específicos, associados à doença etc.) que inclui um painel de vários fatores, por exemplo, citocinas e quimiocinas, desencadeando a diferenciação de monócitos em macrófagos, células dendríticas etc. Esses incluem, por exemplo, macrófagos alveolares no pulmão, osteoclastos na medula óssea, microglia no sistema nervoso central (SNC), histiócitos em tecidos conjuntivos, células de Kupffer no fígado, e macrófagos de tecido adiposo marrom em tecidos adiposos marrons. Em um tumor sólido, macrófagos infiltrados podem ser macrófagos associados a tumores (TAMs), neutrófilos associados a tumores (TANs), e células supressoras de derivação mielóide (MDSCs) etc. Esses macrófagos podem ativar e/ou estarem associados com fibroblastos ativados, por exemplo, fibroblastos carcinoma-associados (ou câncer- associados) (CAFs) e/ou ao estroma. Dessa forma, os inibidores da ativação de TGFβ1 descritos nesse relatório descritivo que inibem a liberação de TGFβ1 maduro por complexos que contêm LRRC33 podem alvejar qualquer uma dessas células que expressam LRRC33-pró-TGFβ1 na superfície da célula. Em um microambiente fibrótico, células que expressam LRRC33 podem incluir macrófagos M2, macrófagos residentes em tecidos e/ou MDSCs.

[00507] Em algumas modalidades, o complexo LRRC33-TGFβ1 está presente na superfície externa de macrófagos pró- fibróticos (M2-like). Em algumas modalidades, os macrófagos pró-fibróticos (M2-like) estão presentes no microambiente fibrótico. Em algumas modalidades, o direcionamento ao complexo LRRC33-TGFβ1 na superfície externa de macrófagos pró-fibróticos (M2-like) fornece um efeito superior comparado exclusivamente com o direcionamento aos complexos LTBP1-TGFβ1 e/ou complexos LTBP1-TGFβ1. Em algumas modalidades, macrófagos do tipo M2 são ainda polarizados em vários subtipos com fenótipos diferenciais, por exemplo, macrófagos M2c e M2d TAM-like.

Em algumas modalidades, macrófagos se tornam ativados por vários fatores (por exemplo, fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas e moléculas de remodelagem da ECM) presentes no microambiente tumoral incluindo, sem limitação, TGFβ1, CCL2 (MCP-1), CCL22, SDF-1/CXCL12, M-CSF (CSF-1), IL-6, IL-8, IL-10, IL- 11, CXCR4, VEGF, PDGF, agentes reguladores de prostaglandina como, por exemplo, ácido araquidônico e ciclooxigenase-2 (COX-2), proteína relacionada ao hormônio da paratireóide (PTHrP), RUNX2, HIF1α e metaloproteinases.

Exposições a um ou mais desses fatores podem ainda conduzir monócitos/macrófagos a fenótipos pró-tumorais.

Apenas como exemplo, foi demonstrado que a co-expressão de CCL2 e VEGF em tumores está correlacionada com TAM aumentado e diagnóstico pobre.

Por sua vez, essas células associadas a tumores ativadas também podem facilitar o recrutamento e/ou diferenciação de outras células em células pró-tumorais, por exemplo, CAFs, TANs, MDSCs e semelhantes.

Células estromais também respondem à ativação de macrófagos e afetam a remodelagem da ECM e, por fim, a vascularização, invasão e metástase.

Por exemplo, CCL2 não apenas funciona como um atraente de monócitos, mas também promove adesão celular por supra-regulação de MAC-1, que é um receptor para ICAM-1, expresso no endotélio ativado.

Isso pode levar à arteriogênese CCL2-dependente e progressão de câncer.

Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 descritos nesse relatório descritivo podem ser usados em um método para inibição de arteriogênese por interferência com o eixo de sinalização de CCL2.

[00508] Um subconjunto de células mielóides expressa LRRC33 da superfície celular, incluindo macrófagos-M2 polarizados e células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSCs), ambos tendo fenótipos imunossupressores e estando enriquecidos em ambientes de doença (por exemplo, TME e FME). Monócitos circulantes derivados da medula óssea não parecem expressar LRRC33 da superfície celular.

A expressão restritiva de LRRC33 o torna um alvo terapêutico particularmente interessante.

Embora a maioria dos estudos disponíveis na literatura tenha se concentrado na biologia da célula T efetora (por exemplo, células citotóxicas CD8+) no câncer, evidências crescentes (por exemplo, dados apresentados nesse relatório descritivo) apontam para papéis importantes de populações de células mielóides supressoras em doenças.

Notavelmente, os anticorpos inibidores de TGFβ1 altamente seletivos revelados nesse relatório descritivo são capazes de alvejar esse braço da função de TGFβ1 in vivo.

Mais especificamente, dados apresentados nesse relatório descritivo mostram que macrófagos M2 associados ao tumor e MDSCs expressam LRRC33 da superfície celular, com uma forte correlação com progressão de doença.

Os anticorpos seletivos para TGFβ1, de alta afinidade, revelados nesse relatório descritivo são capazes de superar resistência primária à terapia de bloqueio do ponto de verificação (CBT) de tumores em múltiplos modelos farmacológicos.

Na verdade, a eficácia antitumoral coincide com uma diminuição significante nos níveis de macrófagos associados ao tumor e MDSC, sugerindo que o direcionamento dessa faceta da função de TGFβ1 pode contribuir para efeitos terapeuticamente benéficos.

Isso provavelmente é aplicável a outras doenças nas quais essas células imunossupressoras estão enriquecidas. Diversas condições fibróticas também estão associadas com frequências locais elevadas dessas populações de células. Dessa forma, espera-se que os anticorpos seletivos para TGFβ1, de alta afinidade, exerçam efeitos similares in vivo nessas indicações. LTBP1/3-pró-TGFβ1 como alvo

[00509] A matriz extracelular é o local no qual eventos de sinalização complexos nos níveis celular, tecidual, orgânico e sistêmico são orquestrados. A desregulação da ECM é observada em diversas patologias. Um reservatório de fator de crescimento TGFβ1 está presente na ECM na forma de complexo pró-TGFβ1 latente. Complexos pró-TGFβ1 latentes estão ancorados à matriz por meio de interações covalentes com os componentes da ECM, LTBP1 e/ou LTBP3. Acredita-se que outras proteínas da ECM como, por exemplo, fibronectina e fibrilinas (por exemplo, fibrilina-1), sejam importantes na mediação da deposição de ECM e localização de LTBPs. O direcionamento de LLCs à ECM é uma etapa essencial no processo de ativação de TGFβ1. Como a maioria, senão todas, as indicações relacionadas ao TGFβ1 provavelmente envolvem alguns aspectos da função da ECM que são TGFβ1-dependentes, é imperativo que inibidores de TGFβ considerados para terapêutica devam ser capazes de alvejar esse pool de sinalização de TGFβ1. Na verdade, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, de acordo com a presente revelação mostram afinidades e potência acentuadamente elevadas para complexos LTBP1/3-pró-TGFβ1 humano. Como esses anticorpos alvejam diretamente os complexos localizados na ECM em seu estado pré-ativação,

esse mecanismo de ação não precisaria competir com receptores endógenos de alta afinidade pela ligação ao ligante. Além disso, como as atividades inibidoras desses anticorpos estão localizadas no local de doença associado com ativação de TGFβ1 aumentada (por exemplo, nicho desregulado dentro da ECM), é contemplado que esses anticorpos devem obter eficácia aumentada limitando, ao mesmo tempo, efeitos colaterais.

[00510] Em algumas modalidades, o complexo LTBP1-TGFβ1 ou o complexo LTBP3-TGFβ1 é um componente da matriz extracelular. O terminal-N de LTBPs pode ser ligado covalentemente à ECM por meio de uma ligação isopeptídica, cuja formação pode ser catalisada por transglutaminases. Acredita-se que a integridade estrutural da ECM seja importante na mediação da atividade de TGFβ1 associada ao LTBP. Por exemplo, a rigidez da matriz pode afetar significantemente a ativação de TGFβ1. Além disso, a incorporação de fibronectina e/ou fibrilina no arcabouço pode aumentar significantemente a ativação de TGFβ1 mediada por LTBP. Similarmente, a presença de fibronectina e/ou fibrilina em ensaios de LTBP (por exemplo, ensaios de potência baseados em células) pode aumentar a janela de um ensaio. Em algumas modalidades, a matriz extracelular compreende fibrilina e/ou fibronectina. Em algumas modalidades, a matriz extracelular compreende uma proteína que compreende um motivo RGD.

[00511] Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos, de alta afinidade, fornecidos nesse relatório descritivo habilitam a inibição potente de cada um dos contextos biológicos da função de TGFβ1, especificamente, o braço de GARP, o braço de LRRC33 e o braço de LTBP1/3.

Seleção de indicações terapêuticas e/ou indivíduos que provavelmente respondem a uma terapia que compreende a agente que inibe amplamente TGFβ1 de forma seletiva, de alta afinidade.

[00512] Três perguntas podem ser feita quanto à identificação/avaliação/seleção de indicações e/ou populações de pacientes adequadas para as quais inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, de alta afinidade, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, provavelmente tenham benefícios terapêuticos vantajosos: i) se a doença é dirigida ou é dependente predominantemente da isoforma TGFβ1 em relação a outras isoformas em humanos (ou pelo menos codominante); ii) se a condição (ou tecido afetado) está associada com um fenótipo imunossupressor; e, iii) se a doença envolve função do TGFβ1 tanto associada à matriz quanto associada à célula.

[00513] A expressão diferencial das três isoformas conhecidas de TGFβ, especificamente, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3, foi observada sob condições normais (saudáveis; homeostáticas), bem como sob condições de doença em vários tecidos. No entanto, o conceito de seletividade de isoforma não foi totalmente explorado nem obtido com abordagens convencionais que favorecem a pan-inibição de TGFβ através de múltiplas isoformas. Além disso, os padrões de expressão das isoformas podem ser regulados diferencialmente, não apenas em condições normais (homeostáticas) vs. condições anormais (patológicas), mas também em diferentes subpopulações de pacientes. Como a maioria dos estudos pré- clínicos é realizada em um número limitado de modelos em animais, que podem ou não recapitular condições humanas, os dados obtidos com o uso desses modelos podem ser tendenciosos, resultando em interpretações errôneas de dados ou conclusões equivocadas quanto à traduzibilidade para fins de desenvolvimento de produtos terapêuticos.

[00514] Consequentemente, a presente invenção inclui o reconhecimento de que a expressão diferencial de isoformas de TGFβ em modelos animais pré-clínicos deve ser levada em conta na predição de eficácia de candidatos a fármaco particulares (por exemplo, inibidores de TGFβ1), bem como na interpretação de dados pré-clínicos quanto à traduzibilidade em condições humanas.

[00515] Análises prévias de amostras de tumor humano implicaram a sinalização de TGFβ como um contribuinte importante para resistência primária à progressão de doença e resposta ao tratamento, incluindo terapia de bloqueio do ponto de verificação (“CBT”) para vários tipos de malignidades. Estudos relatados na literatura revelaram que a expressão do gene de TGFB pode ser particularmente relevante para a resistência ao tratamento, sugerindo que a atividade dessa isoforma pode ser condutora da sinalização de TGFβ nessas doenças. Como detalhado no exemplo 11, através da maioria dos tipos de tumores humanos perfilados no “The Cancer Genome Atlas” (TCGA), a expressão de TGFB1 parece ser a mais prevalente, sugerindo que a seleção de modelos pré- clínicos que recapitulam mais intimamente padrões de expressão de isoformas de TGFβ em doença humana pode ser benéfica.

[00516] Como exemplificado nesse relatório descritivo, TGFβ1 e TGFβ3 são codominantes (co-expressos em níveis similares) em certos modelos murídeos singênicos de câncer

(por exemplo, EMT-6 e 4T1) que são amplamente usados em estudos pré-clínicos (veja a FIG. 20D). Em contraste, vários outros modelos de câncer (por exemplo, S91, B16 e MBT-2) expressam quase exclusivamente TGFβ1, similar àquele observado em muitos tumores humanos, nos quais TGFβ1 parece ser mais frequentemente a isoforma dominante em relação a TGFβ2/3 (veja as FIGS. 20B e 20C). Além disso, a isoforma (ou isoformas) de TGFβ predominantemente expressa sob condições homeostáticas pode não ser a isoforma (ou isoformas) associada à doença. Por exemplo, em tecidos pulmonares normais em ratos saudáveis, a sinalização tônica de TGFβ parece ser mediada principalmente por TGFβ3. No entanto, TGFβ1 parece ficar acentuadamente supra-regulado em condições de doença, por exemplo, fibrose pulmonar. Considerados em conjunto, embora não sejam um pré-requisito, pode ser benéfico testar ou confirmar a expressão relativa de isoformas de TGFβ em amostras clínicas de modo a selecionar terapêuticas adequadas às quais o paciente provavelmente responderá. Em algumas modalidades, a determinação da expressão relativa de isoforma pode ser feita pós-tratamento. Nessas circunstâncias, a responsividade dos pacientes (por exemplo, resposta/benefício clínico) em resposta à terapia com inibição de TGFβ1 pode ser correlacionada com os níveis de expressão relativa de isoformas de TGFβ. Em algumas modalidades, a superexpressão da isoforma TGFβ1 mostrada ex post facto se correlaciona com responsividade maior ao tratamento.

[00517] Como descrito nesse relatório descritivo, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos são particularmente vantajosos para o tratamento de doenças nas quais a isoforma

TGFβ1 é expressa predominantemente em relação às outras isoformas (por exemplo, chamadas TGFβ1-dominantes). Como exemplo, uma lista não limitante de amostras clínicas de câncer humano com níveis de expressão relativa de TGFB1 (esquerda), TGFB2 (centro) e TGFB3 (direita) é fornecida nas FIGS. 20B e 20C. Cada linha horizontal através das três isoformas representa um único paciente. Como pode ser observado, a expressão global de TGFβ1 (TGFB1) é significantemente maior na maioria desses tumores/cânceres humanos do que as duas isoformas através de muito tipos de tumor/câncer, sugerindo que a inibição TGFβ1-seletiva pode ser benéfica nesses tipos de doenças. Consideradas em conjunto, essas linhas de evidências dão suporte à noção de que a inibição seletiva da atividade de TGFβ1 pode superar a resistência primária à CBT. A geração de inibidores de TGFβ1 altamente seletivos também permitirá a avaliação de se uma abordagem desse tipo atenderá a questões de segurança cruciais observadas com a pan-inibição de TGFβ, o que será importante para avaliação de sua utilidade terapêutica.

[00518] Certas exceções devem ser observadas, no entanto. Primeiro, essa tendência nem sempre é aplicável em certos pacientes individuais dentro do tipo de doença. Ou seja, até mesmo em um tipo de câncer que mostra quase uniformemente dominância de TGFβ1 em relação a TGFβ2/3 no geral, há alguns indivíduos que não seguem essa regra geral, como representado na FIG. 20C. Pacientes que se enquadram na subpopulação minoritária, portanto, podem não responder a uma terapia com inibidor isoforma TGFβ1-específico da forma que funciona para a maioria de pacientes. Segundo, há alguns tipos de câncer nos quais TGFβ1 é codominante com outra isoforma ou nos quais a expressão de TGFβ2 e/ou TGFβ3 é significantemente maior do que TGFβ1. Nessas situações, inibidores TGFβ1- seletivos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, provavelmente não serão eficazes usados isoladamente. Ao invés disso, inibidores adicionai adequados que alvejam outra(s) isoforma(s) podem ser empregados em conjunto (veja, por exemplo, WO 2016/201282). Para gerenciar toxicidades potencialmente sérias, no entanto, os inibidores pan-TGFβ, bem como inibidores que antagonizam tanto TGFβ2 quanto TGFβ3, devem ser evitados.

[00519] Por exemplo, em doenças (por exemplo, certos tipos de carcinoma e sarcoma) ou pacientes individuais nos quais TGFβ1 é codominante (por exemplo, co-expresso em níveis similares) com TGFβ3 (por exemplo, como mostrado por análise de biópsia), um regime terapêutico adequado pode incluir tanto um inibidor de TGFβ1 quanto um inibidor de TGFβ3. De preferência, cada um dos inibidores é um inibidor isoforma- seletivo, de modo a evitar efeitos colaterais indesejados ou toxicidades associadas à pan-inibição de todas as isoformas de TGFβ. Em algumas modalidades, um ou ambos os inibidores isoforma-seletivos inibem a etapa de ativação da isoforma de TGFβ (por exemplo, TGFβ1 e/ou TGFβ3). Em modalidades preferidas, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo é um inibidor contexto-independente, de alta afinidade, da ativação, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ3 isoforma-seletivo é um inibidor contexto-independente da ativação de TGFβ3, feito pelo processo que compreende a etapa de seleção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um complexo pró-TGFβ3.

Tipicamente, um processo desse tipo ainda inclui a seleção ou confirmação do anticorpo ou fragmento quanto à habilidade para se ligar a múltiplos complexos de antígenos, por exemplo, LTBP1-pró-TGFβ3, LTBP3-pró-TGFβ3, GARP-pró-TGFβ3 e/ou LRRC33-pró-TGFβ3. De preferência, um processo desse tipo ainda inclui a seleção ou confirmação do anticorpo ou fragmento quanto à habilidade para inibir a liberação do fator de crescimento (TGFβ3) do complexo latente (ou seja, inibição da ativação).

[00520] Quando regimes terapêuticos adequados incluem dois inibidores de TGFβ isoforma-seletivos, por exemplo, TGFβ1 e TGFβ3 (como no exemplo acima), essa terapia pode compreender uma única formulação que inclui inibidores tanto de TGFβ1 quanto de TGFβ3. Essa formulação pode conter, por exemplo, 10-50 mg/mL de cada inibidor e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00521] Alternativamente, essa terapia pode compreender o uso de duas formulações separadas, cada uma compreendendo um único inibidor para administração a um paciente ou população de pacientes. Isso oferece flexibilidade adicionada no ajuste das proporções das duas dosagens de inibidor a serem administradas ao paciente ou população de pacientes, dependendo dos (e ajustadas para) níveis de expressão relativa (acima de níveis saudáveis) das duas isoformas de TGFβ que demonstraram estar presentes em uma ou mais amostras biológicas coletadas do paciente ou população de pacientes. Por exemplo, para uso no tratamento de câncer/tumores TGFβ1-positivos de TGFβ3-positivos (por exemplo, câncer de mama), nos quais a primeira é a isoforma dominante associada à doença em relação à última, o inibidor de TGFβ1 pode ser usado em uma dose maior e/ou por uma duração mais longa como parte dos regimes terapêuticos.

[00522] Portanto, é benéfico testar ou confirmar os níveis de expressão relativa das três isoformas de TGFβ (ou seja, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3) em amostras clínicas coletadas de pacientes individuais. Essa informação pode fornecer uma predição melhor quanto à eficácia de uma terapia particular em pacientes ou populações de pacientes individuais, o que pode ajudar a assegurar a seleção do regime de tratamento apropriado (por exemplo, tratamento individualizado/personalizado) a fim de aumentar a probabilidade de uma resposta clínica.

[00523] Mais recentemente, os inventores do presente pedido fizeram um achado inesperado de que um inibidor TGFβ1- seletivo, de alta afinidade (por exemplo, Ab6), usado em conjunto com um inibidor do ponto de verificação (por exemplo, anticorpo anti-PD-1), é capaz de causar regressão tumoral significante no modelo de EMT-6, que sabidamente expressa tanto TGFβ1 quanto TGFβ3 em níveis similares. A codominância foi confirmada tanto por medições de RNA quanto por ensaios ELISA (veja a FIG. 35). Essa observação é surpreendente, pois foi formulada previamente a hipótese de que, a fim de obter eficácia material em tumores TGFβ1- positivos e TGFβ3-positivos em um contexto de bloqueio do ponto de verificação, ambas as isoformas codominantes teriam que ser especificamente inibidas. Inesperadamente, no entanto, um inibidor TGFβ1-seletivo isoladamente (em conjunto com anti-PD-1), sem um inibidor TGFβ3-seletivo, é suficiente para superar a resistência primária à CBT e obter eficácia in vivo na redução do volume tumoral e aumentando o benefício de sobrevida (veja o Exemplo 18). Sem se prender a uma teoria em particular, isso pode ser decorrente do fato que TGFβ1 é a isoforma verdadeiramente condutora da doença, embora TGFβ3 seja co-expressa no tumor. Outra possibilidade é que a inibição de TGFβ1 causa infra-regulação de TGFβ3 a jusante. Também é possível que as duas isoformas estejam sujeitas à regulação temporal e/ou espacial diferencial. Por exemplo, as duas isoformas podem estar localizadas em compartimentos celulares ou teciduais distintos. Adicionalmente ou alternativamente, permanece possível que um inibidor potente do TGFβ1, usado em conjunto com um inibidor do ponto de verificação, possa ser suficiente para superar o limiar imunossupressor. Consequentemente, a invenção inclui o uso de inibidor de TGFβ1 para promoção de regressão tumoral, quando o tumor é TGFβ1+/TGFβ3+. Um tumor desse tipo pode incluir, por exemplo, cânceres de origem epitelial, ou seja, carcinoma (por exemplo, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula renal, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma ductal invasivo e adenocarcinoma). Em algumas modalidades, TGFβ1 é predominantemente a isoforma associada à doença, embora TGFβ3 dê suporte à função homeostática no tecido, por exemplo, epitélios.

[00524] Certos tumores, por exemplo, vários carcinomas, podem ser caracterizados como tumores com carga mutacional baixa (MBTs). Esses tumores são frequentemente pobremente imunogênicos e não conseguem provocar resposta de células T suficiente. As terapias do câncer que incluem quimioterapia, radioterapia, vacinas contra o câncer e/ou vírus oncolítico podem ser úteis para provocar imunidade de célula T nesses tumores. Portanto, a terapia com inibição de TGFβ1 detalhada nesse relatório descritivo pode ser usada em conjunto com uma ou mais dessas terapias de câncer para aumentar os efeitos antitumorais. Basicamente, essa terapia combinada visa converter tumores “frios” (por exemplo, tumores pobremente imunogênicos) em tumores “quentes” por promoção de neoantígenos e facilitando que células efetoras ataquem o tumor. Exemplos desses tumores incluem câncer de mama, câncer ovariano e câncer pancreático, por exemplo, adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Consequentemente, qualquer um ou mais dos anticorpos ou fragmentos destes descritos nesse relatório descritivo podem ser usados para tratar um tumor pobremente imunogênico (“tumor frio”) sensibilizado com uma terapia de câncer que visa promover imunidade de célula T.

[00525] Em tumores imuno-excluídos nos quais células T efetoras são mantidas afastadas do local de tumor (e, dessa forma, “excluídas”), o ambiente imunossupressor do tumor pode ser mediado de uma forma TGFβ1-dependente. Estes são tumores são tipicamente imunogênicos; no entanto, células T não podem infiltrar, proliferar e provocar seus efeitos citotóxicos suficientemente em função do ambiente imunossuprimido. Tipicamente, esses tumores são pouco responsivos às terapias de câncer, por exemplo, CBTs. Como os dados fornecidos nesse relatório descritivo sugerem, uma terapia auxiliar que compreende um inibidor de TGFβ1 pode superar o fenótipo imunossupressor, permitindo a infiltração, proliferação e função antitumoral de células T tornando, dessa forma, esse tumor mais responsivo à terapia de câncer, por exemplo, CBT.

[00526] Dessa forma, a segunda pergunta é dirigida à identificação ou seleção de pacientes que possuem tumores imunossupressores, que provavelmente se beneficiarão de uma terapia com inibidor de TGFβ1. A presença ou o grau de frequências de células T efetoras em um tumor são indicativos de imunidade antitumoral. Portanto, a detecção de células antitumorais, por exemplo, células CD8+, em um tumor fornece informação útil para avaliar se o paciente pode se beneficiar de uma CBT e/ou terapia com inibidor de TGFβ1.

[00527] A detecção pode ser realizada por métodos conhecidos como, por exemplo, análise imunoistoquímica de amostras de biópsia tumoral. Mais recentemente, estão sendo desenvolvidos métodos não invasivos de imageamento que permitirão a detecção de células de interesse (por exemplo, células T citotóxicas) in vivo. Veja, por exemplo, http://www.imaginab.com/technology/; Tavare e cols. (2014) PNAS, 111 (3): 1.108-1.113; Tavare e cols. (2015) J. Nucl. Med. 56 (8): 1.258-1.264; Rashidian e cols. (2017) J. Exp. Med. 214 (8): 2.243-2.255; Beckford Vera e cols. (2018) PLoS ONE 13 (3): e0193832; e Tavare e cols. (2015) Cancer Res. 76 (1): 73-82, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência. Tipicamente, anticorpos ou moléculas do tipo anticorpo modificadas geneticamente com uma porção de detecção (por exemplo, radiomarcador) pode ser infundida em um paciente, que então será distribuída e localizada em locais do marcador particular (por exemplo CD8+). Dessa forma, é possível determinar se o tumor possui um fenótipo imuno-excluído. Se o tumor é determinado como tendo um fenótipo imuno-excluído, a terapia de câncer (por exemplo, CBT) isoladamente pode não ser eficaz, pois o tumor não possui células citotóxicas suficientes dentro do ambiente tumoral. A terapia auxiliar com um inibidor de TGFβ1, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode reduzir a imunossupressão tornando, dessa forma, o tumor resistente à terapia de câncer mais responsivo a uma terapia de câncer.

[00528] As técnicas não invasivas de imageamento in vivo podem ser aplicadas em diversos métodos adequados para fins de diagnóstico de pacientes; seleção ou identificação de pacientes que provavelmente se beneficiarão de terapia com inibidor de TGFβ1; e/ou, monitoramento de pacientes quanto à resposta terapêutica mediante tratamento. Quaisquer células com um marcador da superfície celular conhecidos podem ser detectadas/localizadas em virtude do emprego de um anticorpo ou moléculas similares que se ligam especificamente ao marcador celular. Tipicamente, as células a serem detectadas pelo uso dessas técnicas são células imunes, por exemplo, linfócitos T citotóxicos, células T reguladoras, MDSCs, macrófagos associados ao tumor, células NK, células dendríticas e neutrófilos. Anticorpos ou moléculas do tipo anticorpo modificadas geneticamente que reconhecem esses marcadores podem ser acopladas a uma porção de detecção.

[00529] Exemplos não limitantes de marcadores de célula imune adequados incluem marcadores de monócitos, marcadores de macrófagos (por exemplo, marcadores de macrófagos M1 e/ou M2), marcadores de CTL, marcadores de células imunes supressoras, marcadores de MDSC (por exemplo, marcadores para MDSCs G e/ou M), incluindo, sem limitação: CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD206, CD68, CD14, CD15, CD66, CD34, CD25 e CD47.

[00530] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende rastreamento de células T, por exemplo, células citotóxicas T CD8-positivas. Consequentemente, qualquer um dos inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, da presente revelação pode ser usado no tratamento de câncer em um indivíduo com um tumor sólido, em que o tratamento compreende: i) realização de uma análise de imageamento in vivo para detectar células T no indivíduo, em que, opcionalmente, as células T são células T CD8+, e se o tumor sólido é determinado como sendo um tumor imuno-excluído sólido com base na análise de imageamento in vivo da etapa (i), então, administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de TGFβ1 isoforma- seletivo, de alta afinidade. Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu uma CBT, em que, opcionalmente, o tumor sólido é resistente à CBT. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com uma CBT em conjunto com o inibidor de TGFβ1, como uma terapia combinada. A combinação pode compreender a administração de uma única formulação que compreende tanto um inibidor do ponto de verificação quanto um inibidor de TGFβ1. Alternativamente, a terapia combinada pode compreender a administração de uma primeira formulação que compreende um inibidor do ponto de verificação e uma segunda formulação que compreende um inibidor de TGFβ1.

[00531] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende rastreamento de MDSC, por exemplo, G-MDSCs (também conhecidos como PMN-MDSCs) e M-MDSCs. Por exemplo, MDSCs podem estar enriquecidas em um local de doença (por exemplo, tecidos fibróticos e tumores sólidos) na linha de base. Mediante terapia (por exemplo, terapia com inibidor de TGFβ1), menos MDSCs podem ser observadas, como medido por intensidade reduzida do marcador (por exemplo, radioisótopo e fluorescência), indicativa de efeitos terapêuticos.

[00532] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende rastreamento ou localização de células LRRC33- positivas. Células LRRC33-positivas incluem, por exemplo, MDSCs e macrófagos do tipo M2 ativados (por exemplo, TAMs e macrófagos ativados associados com tecidos fibróticos). Por exemplo, células LRRC33-positivas podem estar enriquecidas em um local de doença (por exemplo, tecidos fibróticos e tumores sólidos) na linha de base. Mediante terapia (por exemplo, terapia com inibidor de TGFβ1), menos células que expressam LRRC33 da superfície celular podem ser observadas, como medido por intensidade reduzida do marcador (por exemplo, radioisótopo e fluorescência), indicativa de efeitos terapêuticos.

[00533] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende o uso de PET-SPECT, MRI e/ou fluorescência/bioluminescência óptica a fim de detectar o alvo de interesse (por exemplo, moléculas ou entidades que podem estar ligadas pelo reagente marcado, por exemplo, células e tecidos que expressam marcador (ou marcadores) apropriado).

[00534] Em algumas modalidades, a marcação de anticorpos ou moléculas do tipo anticorpo com uma porção de detecção pode compreender marcação direta ou marcação indireta.

[00535] Em algumas modalidades, a porção de detecção pode ser um traçador. Em algumas modalidades, o traçador pode ser um radioisótopo, em que, opcionalmente, o radioisótopo pode ser um isótopo emissor de pósitron. Em algumas modalidades, o radioisótopo é selecionado do grupo que consiste em: 18F, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 177Lu, 18F e 89Zr.

[00536] Dessa forma, esses métodos podem ser empregados para a realização de imageamento in vivo com o uso de anticorpos marcados em imuno-PET.

[00537] Em algumas modalidades, esse imageamento in vivo é realizado para o monitoramento de uma resposta terapêutica à terapia com inibição de TGFβ1 no indivíduo. Por exemplo, a resposta terapêutica pode compreender a conversão de um tumor imuno-excluído em um tumor inflamado, o que se correlaciona com infiltração aumentada de células imunes em um tumor. Isso pode ser visualizado por frequência de células imunes intratumorais ou grau de sinais de detecção aumentados, por exemplo, radiomarcação e fluorescência.

[00538] Consequentemente, a invenção inclui um método para o tratamento de câncer que pode compreender as seguintes etapas: i) seleção de um paciente diagnosticado com câncer que compreende um tumor sólido, em que o tumor sólido é ou é suspeito de ser um tumor imuno-excluído; e, ii) administração ao paciente de um anticorpo ou o fragmento englobado nesse relatório descritivo em uma quantidade eficaz para tratar o câncer. Em algumas modalidades, o paciente recebeu, ou é um candidato para receber, uma terapia de câncer, por exemplo, terapias imunes de inibição do ponto de verificação (por exemplo, anticorpos contra PD-(L)1), quimioterapias, radioterapias, terapias com células imunes modificadas geneticamente e terapias com vacina contra o câncer. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende a detecção de células imunes ou de um ou mais marcadores destas, em que, opcionalmente, a detecção compreende uma análise de biópsia tumoral, análise de marcador sérico e/ou imageamento in vivo.

[00539] Em algumas modalidades, o paciente é diagnosticado com câncer para o qual uma CBT foi aprovada, em que, opcionalmente, estatisticamente uma população similar de pacientes com o câncer particular mostra taxas de resposta relativamente baixas à CBT aprovada, por exemplo, abaixo de 25%. Por exemplo, as taxas de resposta para a CBT podem estar entre cerca de 10-25%, por exemplo, cerca de 10- 15%. Esse câncer pode incluir, por exemplo, câncer ovariano, câncer gástrico e câncer de mama triplo-negativo. Os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, da presente revelação podem ser usados no tratamento desses cânceres, quando o indivíduo ainda não recebeu uma CBT. O inibidor de TGFβ1 pode ser administrado ao indivíduo em combinação com uma CBT. Em algumas modalidades, o indivíduo pode receber ou pode ter recebido terapia de câncer adicional, por exemplo, quimioterapia e radioterapia.

[00540] As técnicas de imageamento in vivo descritas acima podem ser empregadas para detectar, localizar e/ou rastrear certas MDSCs em um paciente diagnosticado com uma doença associada ao TGFβ1, por exemplo, câncer e fibrose. Indivíduos saudáveis possuem uma frequência baixa ou ausente de MDSCs em circulação. Com o surgimento ou a progressão de uma doença desse tipo, níveis elevados de MDSCs circulantes e/ou localizadas em doenças podem ser detectados. Por exemplo, foi relatado que M-MDSCs CCR2-positivas se acumulam em tecidos com inflamação e podem causar progressão de fibrose no tecido (por exemplo, fibrose pulmonar), e foi mostrado que isso se correlaciona com expressão de TGFβ1. Similarmente, MDSCs estão enriquecidas em diversos tumores sólidos (incluindo câncer de mama triplo-negativo) e em parte contribuem para o fenótipo imunossupressor do TME. Portanto, a resposta ao tratamento à terapia com inibição de TGFβ1 de acordo com a presente revelação pode ser monitorada por localização ou rastreamento de MDSCs. A redução ou a frequência baixa de MDSCs detectáveis é tipicamente indicativa de benefícios terapêuticos ou prognóstico melhor.

[00541] Dessa forma, o inibidor contexto-independente, de alta afinidade, da ativação de TGFβ1 pode ser usado no tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer é caracterizado por supressão imune, em que o câncer opcionalmente compreende um tumor sólido que é TGFβ1- positivo e TGFβ3-positivo. Esse indivíduo pode ser diagnosticado com carcinoma. Em algumas modalidades, o carcinoma é carcinoma de mama, em que, opcionalmente, o carcinoma de mama é câncer de mama triplo-negativo (TNBC). Esse tratamento pode ainda compreender uma terapia de câncer, incluindo, sem limitação, quimioterapias, radioterapias, vacinas contra o câncer, terapias com células imunes modificadas geneticamente (por exemplo, CAR-T) e terapias imunes de bloqueio do ponto de verificação, por exemplo, anticorpos anti-PD(L)-1.

[00542] Em algumas modalidades, é identificado um tumor frio, no qual poucas células efetoras estão presentes ou é sabidamente um tipo de câncer caracterizado como pobremente imunogênico. Um indivíduo/paciente com um tumor desse tipo é tratado com uma terapia de câncer por imunossensibilização, por exemplo, quimioterapia, radioterapia, terapia viral oncolítica e vacina contra o câncer, a fim de despertar uma resposta de células T mais forte aos antígenos tumorais (por exemplo, neoantígenos). Essa etapa pode converter o tumor frio em um tumor “imuno-excluído”. O indivíduo opcionalmente ainda recebe uma CBT, por exemplo, anti-PD-(L)1. O indivíduo é ainda tratado com um inibidor de TGFβ1, por exemplo, os anticorpos revelados nesse relatório descritivo. Isso pode converter o tumor frio ou imuno-excluído em um tumor “inflamado” ou “quente”, o que confere responsividade à imunoterapia. Exemplos não limitantes de cânceres pobremente imunogênicos incluem câncer de mama (por exemplo, TNBC), câncer de próstata (por exemplo, câncer de próstata resistente à castração (CRPC)) e câncer pancreático (por exemplo, adenocarcinoma pancreático (PDAC)).

[00543] Como mostrado na FIG. 5B, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, da presente invenção, por exemplo, Ab6, podem inibir a ativação de TGFβ1 induzida por plasmina. O eixo plasmina-plasminogênio foi implicado em certa tumorigênese, invasão e/ou metástase, de vários tipos de câncer, carcinoma em particular, por exemplo, câncer de mama. Portanto, é possível que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, possam exercer os efeitos inibidores por meio desse mecanismo em tumores ou modelos de tumor, por exemplo, EMT6, que envolvem os epitélios. Na verdade, destruição ou remodelagem plasmina- dependente de epitélios pode contribuir para a patogênese de condições que envolvem lesões epiteliais e invasão/disseminação de carcinoma. Esse último pode ser desencadeado por transição de epitelial para mesenquimal

(“EMT”). Foi relatado que a ativação de plasminogênio e a invasão plasminogênio-dependente eram mais proeminentes em células do tipo epitelial e eram parcialmente ditadas pela expressão de S100A10 e PAI-1 (Bydoun e cols. (2018) Scientific Reports, 8: 14.091).

[00544] A invenção inclui um método para a seleção de uma população de pacientes ou um indivíduo que tem probabilidade de responder a uma terapia que compreende um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente. Esse método pode compreender as etapas de: fornecimento de uma amostra biológica (por exemplo, amostra clínica) coletada de um indivíduo, determinação (por exemplo, medição ou testagem) dos níveis relativos de TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 na amostra, e, administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto- independente, se TGFβ1 for a isoforma dominante em relação a TGFβ2 e TGFβ3; e/ou, se TGFβ1 está significantemente superexpresso ou supra-regulado, comparado com controle. Em algumas modalidades, esse método compreende as etapas de: a obtenção de informação sobre os níveis de expressão relativa de TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 que foram determinados previamente; identificação de um indivíduo como tendo doença TGFβ1- positiva, preferivelmente TGFβ1-dominante; e, administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente. Em algumas modalidades, esse indivíduo possui uma doença (por exemplo, câncer) que é resistente a uma terapia (por exemplo, terapia de câncer). Em algumas modalidades, esse indivíduo mostra intolerância à terapia e, portanto, suspendeu ou tem probabilidade de suspender a terapia. A adição do inibidor de TGFβ1 ao regime terapêutico pode permitir a redução da dosagem da primeira terapia e até a obtenção dos benefícios clínicos em combinação. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 pode retardar ou reduzir a necessidade de cirurgias.

[00545] Os níveis relativos das isoformas podem ser determinados por ensaios baseados em RNA e/ou ensaios baseados em proteína, que são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a etapa de administração também pode incluir outra terapia, por exemplo, inibidores do ponto de verificação imune, ou outros agentes fornecidos em outro local nesse relatório descritivo. Esses métodos podem opcionalmente incluir uma etapa de avaliação de uma resposta terapêutica por monitoramento de alterações nos níveis relativos de TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 em dois ou mais pontos do tempo. Em algumas modalidades, amostras clínicas (por exemplo, biópsias) são coletadas antes e depois da administração. Em algumas modalidades, amostras clínicas (por exemplo, biópsias) são coletadas várias vezes após tratamento para avaliar os efeitos in vivo ao longo do tempo.

[00546] Além das indagações acima, a terceira pergunta interroga a amplitude da função de TGFβ1 envolvida em uma doença particular. Isso pode ser representado pelo número de contextos de TGFβ1, especificamente, qual molécula (moléculas) apresentadora medeia a função de TGFβ1 associado à doença. Inibidores de contexto amplo, TGFβ1-específicos, por exemplo, inibidores contexto-independentes, são vantajosos para o tratamento de doenças que envolvem tanto um componente da ECM quanto um componente imune da função de TGFβ1. Essa doença pode estar associada com desregulação na ECM, bem como uma perturbação na função da célula imune ou resposta imune. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 descritos nesse relatório descritivo são capazes de visar TGFβ1 associado à ECM (por exemplo, apresentado por LTBP1 ou LTBP3), bem como TGFβ1 associado às células imunes (por exemplo, apresentado por GARP ou LRRC33). Esses inibidores inibem todos os quatro alvos terapêuticos (por exemplo, inibidores “contexto-independente”): TGFβ1 pró/latente associado à GARP; TGFβ1 pró/latente associado à LRRC33; TGFβ1 pró/latente associado à LTBP1; e, TGFβ1 pró/latente associado à LTBP3, de modo a inibir amplamente a função de TGFβ1 nesses contextos.

[00547] Se uma condição particular de um paciente envolve ou é dirigida ou não por múltiplos aspectos da função de TGFβ1 pode ser avaliado por avaliação de perfis de expressão das moléculas apresentadoras, em uma amostra clínica coletada do paciente. Vários ensaios são conhecidos na técnica, incluindo ensaios baseados em RNA e ensaios baseados em proteína, que podem ser realizados para obter perfis de expressão. Os níveis de expressão relativa (e/ou mudanças/alterações destes) de LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33 na amostra (ou amostras) podem indicar a fonte e/ou contexto de atividades de TGFβ1 associadas à condição. Por exemplo, uma amostra de biópsia retirada de um tumor sólido pode exibir expressão elevada de todas as quatro moléculas apresentadoras. Por exemplo, LTBP1 e LTBP3 podem estar altamente expressas em CAFs dentro do estroma tumoral, enquanto GARP e LRRC33 podem estar altamente expressas por células imunes associadas ao tumor, por exemplo, Tregs e infiltrado de leucócitos, respectivamente.

[00548] Consequentemente, a invenção inclui um método para determinação (por exemplo, testagem ou confirmação) do envolvimento de TGFβ1 na doença, em relação a TGFβ2 e TGFβ3. Em algumas modalidades, o método ainda compreende uma etapa de: identificação de uma fonte (ou contexto) de TGFβ1 associado à doença. Em algumas modalidades, a fonte/contexto é avaliada por determinação da expressão de moléculas apresentadoras de TGFβ, por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33, em uma amostra clínica retirada de pacientes. Em algumas modalidades, esses métodos são realizados ex post facto.

[00549] Com relação às células LRRC33-positivas, o Requerente da presente revelação reconheceu que pode haver uma discrepância significante entre expressão de RNA e expressão de proteína LRRC33. Em particular, embora tipos de células selecionados pareçam expressar LRRC33 no nível de RNA, apenas um subconjunto dessas células expressa a proteína LRRC33 na superfície celular. É contemplado que a expressão de LRRC33 pode ser altamente regulada por meio de tráfico/localização da proteína, por exemplo, em termos de inserção na membrana plasmática e internalização rápida. Portanto, em modalidades preferidas, a expressão da proteína LRRC33 pode ser usada como um marcador associado com um tecido doente (por exemplo, tecidos tumorais e fibróticos) enriquecido, por exemplo, com macrófagos do tipo M2 ativados e MDSCs. Indicações relacionadas ao TGFβ1 Características gerais de indicações relacionadas ao TGFβ1

[00550] Inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para tratar uma ampla variedade de doenças, distúrbios e/ou condições que estão associados com desregulação de TGFβ1 (ou seja, “indicações relacionadas ao TGFβ1”) em indivíduos humanos. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “doença (distúrbio ou condição) associada com desregulação de TGFβ1” ou “indicação relacionada ao TGFβ1” significa qualquer doença, distúrbio e/ou condição relacionada à expressão, atividade e/ou metabolismo de um TGFβ1 ou qualquer doença, distúrbio e/ou condição que possa se beneficiar da inibição da atividade e/ou níveis TGFβ1.

[00551] Consequentemente, a presente invenção inclui o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto- independente em um método para o tratamento de uma indicação relacionada ao TGFβ1 em um indivíduo humano. Esse inibidor é tipicamente formulado em uma composição farmacêutica que ainda compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Vantajosamente, o inibidor alveja tanto TGFβ1 associado à ECM quanto TGFβ1 associado às células imunes, mas não alveja TGFβ2 ou TGFβ3 in vivo. Em algumas modalidades, o inibidor inibe a etapa de ativação de TGFβ1. A doença pode ser caracterizada por desregulação ou deficiência em pelo menos dois dos seguintes atributos: a) células T reguladoras (Treg); b) proliferação ou função de células T efetoras (Teff); c) proliferação ou diferenciação de células mielóides; d) recrutamento ou diferenciação de monócitos; e) função de macrófagos; f) transição de epitelial-para- mesenquimal (EMT) e/ou transição de endotelial-para- mesenquimal (EndMT); g) expressão gênica em um ou mais de genes marcadores selecionados do grupo que consiste em: PAI-

1, ACTA2, CCL2, Col1a1, Col3a1, FN-1, CTGF, e TGFB1; h) componentes ou função da ECM; i) diferenciação de fibroblastos. Uma quantidade terapeuticamente eficaz desse inibidor é administrada ao indivíduo que sofre ou diagnosticado com a doença.

[00552] Em algumas modalidades, a doença que envolve desregulação ou deficiência de componentes ou função da ECM compreende exibição aumentada deposição de colágeno I. Em algumas modalidades, a desregulação da ECM inclui rigidez aumentada da matriz. Em algumas modalidades, a desregulação da ECM envolve fibronectina e/ou fibrilina.

[00553] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de diferenciação de fibroblastos compreende miofibroblastos ou células do tipo miofibroblasto aumentados. Em algumas modalidades, os miofibroblastos ou células do tipo miofibroblasto são fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Em algumas modalidades, os CAFs estão associados com um estroma tumoral e podem produzir CCL2/MCP- 1 e/ou CXCL12/SDF-1. Em algumas modalidades, os miofibroblastos ou células do tipo miofibroblasto estão localizados em um tecido fibrótico.

[00554] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de células T reguladoras compreende aumentada atividade de Treg.

[00555] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de proliferação ou função de células T efetoras (Teff) compreende proliferação suprimida de células CD4+/CD8+.

[00556] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de proliferação ou diferenciação de células mielóides compreende proliferação aumentada de células progenitoras mielóides. A proliferação aumentada de células mielóides pode ocorrer em uma medula óssea.

[00557] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de diferenciação de monócitos compreende diferenciação aumentada de monócitos derivados da medula óssea e/ou residentes no tecido em macrófagos em um local de doença, por exemplo, um tecido fibrótico e/ou um tumor sólido.

[00558] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de recrutamento de monócitos compreende recrutamento aumentado de monócitos derivados da medula óssea em um local de doença, por exemplo, TME, levando à diferenciação de macrófagos e polarização M2 aumentadas, seguidas por TAMs aumentados.

[00559] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de função de macrófagos compreende polarização aumentada dos macrófagos em fenótipos M2.

[00560] Em algumas modalidades, a desregulação ou deficiência de proliferação ou diferenciação de células mielóides compreende um número aumentado de Tregs, MDSCs e/ou TANs.

[00561] Indicações relacionadas ao TGFβ podem incluir condições que compreendem um microambiente de doença imuno- excluído, por exemplo, tumor ou tecido canceroso, que suprime o mecanismo de defesa/imunidade normal do corpo, em parte por exclusão de células imunes efetoras (por exemplo, células T CD4+ e/ou CD8+). Em algumas modalidades, essas condições imunoexcludentes estão associadas com baixa responsividade ao tratamento (por exemplo, terapia de câncer). Exemplos não limitantes das terapias de câncer, às quais os pacientes são pouco responsivos, incluem, sem limitação: terapia com inibidor do ponto de verificação, vacinas contra o câncer, quimioterapia e radioterapia. Sem se prender a uma teoria em particular, é contemplado que os inibidores de TGFβ, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem se opor à habilidade do tumor para evadir ou excluir a imunidade anticâncer por restauração do acesso de células imunes, por exemplo, célula T (por exemplo, células CD8+) e do acesso de macrófagos (por exemplo, células F4/80+, macrófagos-M1 polarizados) por promoção de expansão e/ou infiltração de células T no tumor.

[00562] Dessa forma, a inibição de TGFβ pode superar resistência ao tratamento (por exemplo, resistência ao ponto de verificação imune, resistência a vacinas contra o câncer, resistência à CAR-T, resistência à quimioterapia, resistência à radioterapia etc.) em um ambiente de doença imuno-excluído (por exemplo, TME) por desbloqueio e restauração do acesso de células T efetoras e funções efetoras citotóxicas. Esses efeitos da inibição de TGFβ podem ainda fornecer memória imunológica duradoura mediada, por exemplo, por células T CD8+.

[00563] Em algumas modalidades, o tumor é pobremente imunogênico (por exemplo, tumores “desérticos” ou “frios”). Os pacientes podem se beneficiar da terapia de câncer que desencadeia neoantígenos ou promove respostas imunes. Essas terapias incluem, sem limitação, quimioterapia, radioterapia, terapia viral oncolítica, peptídeos oncolíticos, inibidores de tirosina quinase, vacinas de neoepitopo, anti-CTLA4, indutores de instabilidade, agentes de DDR, ativadores de células NK, e vários adjuvantes como, por exemplo, ligantes/agonistas de TLR. Os inibidores de TGFβ1, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados em conjunto para reforçar os efeitos de terapias de câncer. Um modo de ação para os inibidores de TGFβ1 pode ser para normalizar ou restaurar a expressão de MHC e, portanto, promoção de imunidade de célula T.

[00564] Exemplos não limitantes de indicações relacionadas ao TGFβ incluem: fibrose, incluindo fibrose de órgão (por exemplo, fibrose renal, fibrose hepática, fibrose cardíaca/cardiovascular, fibrose muscular, fibrose cutânea, fibrose uterina/endometriose e fibrose pulmonar), esclerodermia, síndrome de Alport, câncer (incluindo, sem limitação: cânceres sanguíneos como, por exemplo, leucemia, mielofibrose, mieloma múltiplo, câncer do cólon, câncer renal, câncer de mama, melanoma maligno, glioblastoma), fibrose associada com tumores sólidos (por exemplo, desmoplasia de câncer, por exemplo, melanoma desmoplásico, desmoplasia associada ao câncer pancreático e desmoplasia do carcinoma de mama), fibrose estromal (por exemplo, fibrose estromal da mama), fibrose induzida por radiação (por exemplo, síndrome de fibrose por radiação), facilitação da hematopoiese rápida após quimioterapia, cicatrização óssea, cicatrização de feridas, demência, mielofibrose, mielodisplasia (por exemplo, síndromes mielodisplásicas ou MDS), uma doença renal (por exemplo, doença renal em estágio final ou ESRD), obstrução ureteral unilateral (UUO), perda e/ou degeneração dentária, síndromes de proliferação endotelial, asma e alergia, distúrbios gastrintestinais,

anemia do envelhecimento, aneurisma aórtico, indicações órfãs (por exemplo, síndrome de Marfan e doença de Camurati- Engelmann), obesidade, diabetes, artrite, esclerose múltipla, distrofia muscular, distúrbios ósseos, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Parkinson, osteoporose, osteoartrite, osteopenia, síndromes metabólicas, distúrbios nutricionais, atrofia de órgãos, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e anorexia.

[00565] Evidências sugerem que as ectonucleotidases CD39 e CD73 podem, pelo menos em parte, contribuir para níveis elevados de adenosina em condições de doença. Notavelmente, o eixo CD39/CD73-TGFβ pode participar na modulação de células imunes implicadas na sinalização de TGFβ, incluindo Tregs e MDSCs. Tanto células T reguladoras (Tregs) quanto células supressoras derivadas do sistema mielóide (MDSCs) geralmente exibem fenótipos imunossupressores. Em muitas condições patológicas (por exemplo, câncer, fibrose), essas células estão enriquecidas em locais de doença e podem contribuir para a criação e/ou manutenção de um ambiente imunossupressor. Isso pode ser, pelo menos em parte, mediado pelas ectonucleotidases CD39 e CD73 que, juntas, participam na degradação de ATP em nucleosídeo adenosina, levando a concentrações locais elevadas de adenosina no ambiente de doença, por exemplo, microambiente tumoral e ambiente fibrótico. A adenosina pode se ligar aos seus receptores expressos em células-alvo, por exemplo, células T e célula NK, o que, por sua vez, suprime a função antitumoral dessas células-alvo. Doenças com expressão gênica aberrante; biomarcadores

[00566] Foi observado que a ativação anormal da via de transdução de sinal de TGFβ1 em várias condições de doença está associada com expressão gênica alterada de diversos marcadores.

Esses marcadores da expressão gênica (por exemplo, como medidos por mRNA) incluem, sem limitação: Serpina 1 (que codifica PAI-1), MCP-1 (também conhecido como CCL2), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF e ACTA2 (que codifica α-SMA), SNAI1 (dirige EMT em fibrose e metástase por infra- regulação de E-caderina (Cdh1), MMP2 (metaloprotease da matriz associada com EMT), MMP9 (metaloprotease da matriz associada com EMT), TIMP1 (metaloprotease da matriz associada com EMT), FOXP3 (marcador de indução de Treg), CDH1 (caderina E (marcador de células epiteliais) que é infra-regulada por TGFβ) e CDH2 (caderina N (marcador de células mesenquimais) que é supra-regulada por TGFβ). Curiosamente, muitos desses genes estão implicados na participação em um conjunto diverso de condições de doença, incluindo vários tipos de fibrose de órgãos, bem como em muitos cânceres, que incluem mielofibrose.

Na verdade, foi sugerida uma ligação fisiopatológica entre condições fibróticas e proliferação celular anormal, tumorigênese e metástases.

Veja, por exemplo, Cox e Erler (2014) Clinical Cancer Research 20 (14): 3637-43 “Molecular Pathways: Connecting Fibrosis and Solid Tumor Metastasis”; Shiga e cols. (2015) Cancers 7: 2.443-2.458 “Cancer-Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth”; Wynn e Barron (2010) Semin.

Liver Dis. 30 (3): 245- 257 “Macrophages: Master Regulators of Inflammation and Fibrosis”, cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência.

Sem se prender a uma teoria em particular, os inventores da presente revelação contemplam que a via de sinalização de TGFβ1 pode, na verdade, ser uma ligação crucial entre essas patologias amplas.

[00567] A habilidade de citocinas quimiotáticas (ou quimiocinas) para mediar o recrutamento de leucócitos (por exemplo, monócitos/macrófagos) para tecidos lesionados ou doentes possui consequências cruciais na progressão de doença. Membros da família de quimiocinas C-C, por exemplo, proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), também conhecida como CCL2, proteína inflamatória de macrófagos 1- alfa (MIP-1α), também conhecida como CCL3, e MIP-1β, também conhecida como CCL4, e MIP-2α, também conhecida como CXCL2, foram implicados nesse processo.

[00568] Por exemplo, acredita-se que MCP-1/CCL2 participa tanto na fibrose quanto no câncer. MCP-1/CCL2 é caracterizada como uma quimiocina pró-fibrótica e é quimioatraente de monócitos, e evidências sugerem que possa estar envolvida tanto na iniciação quanto na progressão de câncer. Na fibrose, foi demonstrado que MCP-1/CCL2 desempenha um papel importante na fase inflamatória da fibrose. Por exemplo, a neutralização de MCP-1 resultou em uma diminuição dramática na formação de crescente glomerular e deposição de colágeno do tipo I. Similarmente, verificou- se que a imunoterapia passiva com anticorpos anti-MCP-1 ou anti-MIP-1-alfa reduz significantemente o acúmulo de fagócitos mononucleares em camundongos desafiados com bleomicina, sugerindo que MIP-1 alfa e MCP-1 contribuem para o recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória pulmonar (Smith, Biol. Signals. Julho-Agosto de 1996; 5 (4): 223-31, “Chemotactic Cytokines Mediate Leukocyte Recruitment in Fibrotic Lung Disease”). Níveis elevados de MIP-1-alfa em pacientes com fibrose cística e mieloma múltiplo foram relatados (veja, por exemplo: Mrugacz e cols., J. Interferon Cytokine Res. Junho de 2007; 27 (6): 491-5), dando suporte à noção de que MIP-1α está associada com respostas inflamatórias localizadas ou sistêmicas.

[00569] Linhas de evidências apontam para o envolvimento de quimiocinas C-C na progressão/metástase tumoral. Por exemplo, MCP-1/CCL2 derivada de tumor pode promover fenótipos “pró-câncer” em macrófagos. Por exemplo, no câncer de pulmão, foi demonstrado que MCP-1/CCL2 é produzida por células estromais e promovem metástase. No câncer pancreático humano, tumores secretam CCL2, e macrófagos imunossupressores CCR2-positivos infiltram esses tumores. Pacientes com tumores que exibem expressão elevada de CCL2/infiltrado baixo de células T CD8 possuem sobrevida significantemente diminuída. Sem se prender a uma teoria em particular, é contemplado que monócitos que são recrutados para um ambiente de tecido lesionado ou doente podem subsequentemente se tornarem polarizados em resposta às pistas locais (por exemplo, em resposta às citocinas derivadas do tumor) contribuindo ainda mais, dessa forma, para progressão de doença. Esses macrófagos do tipo M2 provavelmente contribuem para a evasão imune por supressão de células efetoras, por exemplo, células T CD4+ e CD8+. Em algumas modalidades, esse processo é, em parte, mediado por LRRC33-TGFβ1 expresso por macrófagos ativados. Em algumas modalidades, o processo é, em parte, mediado por GARP-TGFβ1 expresso por Tregs.

[00570] Similarmente, em certos carcinomas, por exemplo, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo-negativo),

foi demonstrado que o recrutamento de MDSCs mediado por CXCL2/CCL22 promove angiogênese e metástase (veja, por exemplo, Kumar e cols. (2018) J. Clin. Invest. 128 (11):

5.095-5.109). É, portanto, contemplado que esse processo é, pelo menos em parte, mediado por TGFβ1, por exemplo, LRRC33- TGFβ1. Além disso, como proteases como, por exemplo, MMP9, estão implicadas no processo de remodelagem da matriz que contribui para invasão e metástase de tumores, as mesmas vias de sinalização ou vias de sinalização sobrepostas também podem participar na fibrose.

[00571] O envolvimento de PAI-1/Serpina 1 foi implicado em diversas condições fibróticas, cânceres, angiogênese, inflamação, bem como em doenças neurodegenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer). A expressão elevada de PAI-1 no tumor e/ou soro está correlacionada com prognóstico ruim (por exemplo, sobrevida mais curta, metástase aumentada) em vários cânceres, por exemplo, câncer de mama e câncer da bexiga (por exemplo, carcinoma de célula transicional), bem como mielofibrose. No contexto de condições fibróticas, PAI- 1 foi reconhecido como um efetor a jusante importante de fibrose induzida por TGFβ1, e a expressão de PAI-1 aumentada foi observada em várias formas de fibrose tecidual, incluindo fibrose pulmonar (por exemplo, IPF), fibrose renal, fibrose hepática e esclerodermia. Em algumas modalidades, o processo é, em parte, mediado por TGFβ1 associado à ECM, por exemplo, por meio de LTBP1-pró-TGFβ1 e/ou LTBP3-pró-TGFβ1.

[00572] Em algumas modalidades, os efeitos in vivo da terapia com inibidor de TGFβ1 podem ser avaliados por medição das alterações nos níveis de expressão de marcadores gênicos adequados. Marcadores adequados incluem TGFβ (por exemplo,

TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3). Marcadores adequados também podem incluir uma ou mais moléculas apresentadoras para TGFβ (por exemplo, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3), por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP (ou LRRC32) e LRRC33. Em algumas modalidades, marcadores adequados incluem genes de transição mesenquimal (por exemplo, AXL, ROR2, WNT5A, LOXL2, TWIST2, TAGLN e/ou FAP), genes imunossupressores (por exemplo, IL10, VEGFA, VEGFC), genes quimiotáticos de monócito e macrófago (por exemplo, CCL2, CCL7, CCL8 e CCL13), e/ou vários marcadores fibróticos discutidos nesse relatório descritivo. Marcadores preferidos são marcadores plasmáticos/séricos.

[00573] Como mostrado no Exemplo nesse relatório descritivo, inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, contexto-independentes, descritos nesse relatório descritivo podem ser usados para reduzir os níveis de expressão de muitos desses marcadores em modelos pré-clínicos adequados, incluindo modelos animais mecanísticos, por exemplo, UUO, que demonstrou ser TGFβ1-dependente. Portanto, esses inibidores podem ser usados para tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por expressão anormal (por exemplo, superexpressão/supra-regulação ou subexpressão/infra- regulação) de um ou mais dos marcadores de expressão gênica da doença.

[00574] Dessa forma, em algumas modalidades, um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente é usado no tratamento de uma doença associada com superexpressão de um ou mais dos seguintes: PAI-1 (codificado por Serpina 1), MCP-1 (também conhecida como CCL2), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFB1, CTGF, α-SMA, ITGA11 e ACTA2, em que o tratamento compreende a administração do inibidor a um indivíduo que sofre da doença em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, o inibidor é usado para tratar uma doença associada com superexpressão de PAI-1, MCP-1/CCL2, CTGF e/ou α-SMA. Em algumas modalidades, a doença é mielofibrose. Em algumas modalidades, a doença é câncer, por exemplo, câncer que compreende um tumor sólido. Em algumas modalidades, a doença é fibrose de órgão, por exemplo, fibrose do fígado (por exemplo, associada com NASH), do rim, do pulmão, do músculo, da pele e/ou do tecido cardíaco ou cardiovascular.

[00575] O envolvimento da via de TGFβ1 no controle de facetas cruciais tanto da ECM quanto de componentes imunes pode explicar as observações de que um número marcante de genes desregulados é compartilhado através de uma ampla gama de patologias como, por exemplo, distúrbios proliferativos e distúrbios fibróticos. Isso dá suporte à noção de que o padrão de expressão aberrante nos genes que envolvem a sinalização de TGFβ1 é provavelmente um fenômeno generalizável. Esses genes marcadores podem ser classificados em várias categorias, por exemplo: genes envolvidos na transição mesenquimal (por exemplo, EndMT e EMT); genes envolvidos na angiogênese; genes envolvidos em hipóxia; genes envolvidos na cicatrização de feridas; e genes envolvidos na resposta inflamatória desencadeada por lesão tecidual.

[00576] Um estudo abrangente realizado por Hugo e cols. (Cell, 165 (1): 35-44) demonstrou elegantemente a correlação entre padrões diferenciais de expressão gênica dessas classes de marcadores e a responsividade à terapia de bloqueio do ponto de verificação (CBT) no melanoma metastático. Os autores encontraram coenriquecimento do conjunto de genes chamado “assinaturas de IPRES” que definia um subconjunto transcriptômico dentro não somente no melanoma, mas também em todas as malignidades humanas comuns importantes analisadas. Na verdade, o trabalho liga a plasticidade fenotípica da célula tumoral (ou seja, transição mesenquimal) e os impactos resultantes sobre o microambiente (por exemplo, remodelagem da ECM, adesão celular e características de angiogênese de cicatrização de feridas imunossupressora) à resistência à CBT.

[00577] Com o reconhecimento de que cada uma dessas categorias de genes IPRES foi implicada em doenças que envolvem desregulação de TGFβ, o Requerente contemplou previamente que a isoforma TGFβ1 em particular pode mediar esses processos em condições de doença (veja, por exemplo, WO 2017/156500). Trabalho revelado nesse relatório descritivo dá ainda mais suporte a essa noção (por exemplo, Exemplo 11; FIG. 37A), confirmando ainda mais que terapias que alvejam seletivamente TGFβ1 (ao contrário de alternativas não seletivas) podem oferecer uma vantagem tanto com relação à eficácia quanto à segurança.

[00578] Consequentemente, a presente revelação inclui um método/processo de seleção ou identificação de um paciente candidato ou população de pacientes candidatos com probabilidade de responder a uma terapia com inibição de TGFβ1, e administração ao paciente (ou pacientes) de uma quantidade eficaz de um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo de alta afinidade. A observação da ausência de responsividade de um paciente a uma CBT (por exemplo, resistência) pode indicar que o paciente é um candidato para a terapia com inibição de TGFβ1 descrita nesse relatório descritivo. Dessa forma, um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, tais como aqueles revelados nesse relatório descritivo, pode ser usado no tratamento de câncer em um indivíduo, em que o indivíduo é pouco responsivo a uma CBT. O indivíduo pode ter câncer avançado, por exemplo, um tumor sólido localmente avançado ou câncer metastático. Um paciente é considerado como sendo “pouco responsivo” quando não há ou há poucos efeitos terapêuticos significativos obtidos (por exemplo, não atendem aos critérios de resposta parcial ou resposta completa com base em diretrizes padronizadas, por exemplo, RECIST e iRECIST) após uma duração de tempo que se espera que seja suficiente para exibir efeitos terapêuticos significativos da terapia particular. Tipicamente, essa duração de tempo para CBTs é pelo menos cerca de 3 meses de tratamento, com ou sem terapias adicionais como, por exemplo, quimioterapia. Esses pacientes podem ser chamados de “não-responsivos”. Quando esses pacientes são pouco responsivos à CBT inicial, os pacientes podem ser chamados de “não-responsivo primários”. O câncer (ou pacientes com esses cânceres) nessa categoria pode ser caracterizado como tendo “resistência primária” à CBT. Em algumas modalidades, o indivíduo é um não-responsivo primário após receber pelo menos cerca de 3 meses do tratamento com CBT, em que, opcionalmente, após pelo menos cerca de 4 meses do tratamento com CBT. Em algumas modalidades, o indivíduo também recebeu terapia adicional em combinação com a CBT, por exemplo, quimioterapia.

[00579] Mediante identificação do indivíduo como um não- responsivo a uma CBT, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo,

de alta afinidade, pode ser administrado ao indivíduo em conjunto com uma CBT, que pode ou não compreender o mesmo inibidor do ponto de verificação que a primeira CBT à qual o indivíduo não respondeu. Qualquer inibidor do ponto de verificação imune adequado pode ser usado, por exemplo, inibidores do ponto de verificação aprovados. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, é administrado ao indivíduo em conjunto com uma CBT que compreende um anticorpo anti-PD-1 ou anticorpo anti- PD-L1. O inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, visa superar a resistência ao tornar o câncer mais suscetível à CBT.

[00580] O processo de seleção ou identificação de um paciente candidato ou população de pacientes candidatos com probabilidade de responder a uma terapia com inibição de TGFβ1 pode compreender uma etapa de testagem de uma amostra biológica coletada do paciente (ou população de pacientes), por exemplo, amostras de biópsia, para a expressão de um ou mais dos marcadores discutidos nesse relatório descritivo. Similarmente, esse marcador (ou marcadores) genético pode ser usado para fins de monitoramento da responsividade do paciente a uma terapia. O monitoramento pode incluir a testagem de duas ou mais amostras biológicas coletadas do paciente, por exemplo, antes e depois da administração de uma terapia, e durante o curso de um regime terapêutico ao longo do tempo, para avaliar alterações nos níveis de expressão gênica de um ou mais dos marcadores, indicativas de resposta ou eficácia terapêutica. Em algumas modalidades, uma biópsia de líquido pode ser usada.

[00581] Em algumas modalidades, um método de seleção de um paciente candidato ou população de pacientes candidatos com probabilidade de responder a uma terapia com inibição de TGFβ1 pode compreender uma etapa de identificação de um paciente ou população de pacientes testada previamente para o marcador (ou marcadores) genético, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, que mostrou expressão aberrante deste. Esses mesmos métodos também são aplicáveis à confirmação ou correlação posterior com a resposta à terapia dos pacientes.

[00582] Em algumas modalidades, a expressão aberrante de marcadores inclui níveis elevados de pelo menos um dos seguintes: TGFβ1, LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3, CCL2, CCL3, PAI-1/Serpina 1. Em algumas modalidades, o paciente ou população de pacientes (por exemplo, amostras biológicas deles coletadas) mostra ativação elevada de TGFβ1, fosfo- SMAD2/3, ou combinação destes. Em algumas modalidades, o paciente ou população de pacientes (por exemplo, amostras biológicas deles coletadas) mostra MDSCs elevadas. Em algumas modalidades, esse paciente ou população de pacientes possui câncer, que pode compreender um tumor sólido que é TGFβ1-positivo. O tumor sólido pode ser um tumor TGFβ1- dominante, no qual TGFβ1 é a isoforma predominante expressa no tumor, em relação às outras isoformas. Em algumas modalidades, o tumor sólido pode ser um tumor TGFβ1- codominante, no qual TGFβ1 é a isoforma codominante expressa no tumor, por exemplo, TGFβ1+/ TGFβ3+. Em algumas modalidades, esses pacientes ou população de pacientes exibe resistência a uma terapia de câncer, por exemplo, quimioterapia, radioterapia e/ou terapia do ponto de verificação imune, por exemplo, anti-PD-1 (por exemplo,

Pembrolizumab e Nivolumab), anti-PD-L1 (por exemplo, Atezolizumab), anti-CTLA4 (por exemplo, Ipilimumab), terapia com células imunes modificadas geneticamente (por exemplo, CAR-T) e vacinas contra o câncer etc. De acordo com a invenção, o inibidor de TGFβ1 contexto-independente, de alta afinidade, tais como aqueles revelados nesse relatório descritivo, supera a resistência por desbloqueio da imunossupressão, de modo a permitir que as células efetoras ganhem acesso às células de câncer obtendo, dessa forma, efeitos antitumorais. A terapia com inibidor de TGFβ1 pode, portanto, promover infiltração e/ou expansão de células efetoras no tumor. Adicionalmente, a terapia com inibidor de TGFβ1 pode reduzir a frequência de células imunes imunossupressoras, por exemplo, Tregs e MDSCs, no tumor.

[00583] Em algumas modalidades, a expressão aberrante de marcadores inclui um ou mais painéis de genes: marcadores de transição mesenquimal (por exemplo, AXL, ROR2, WNT5A, LOXL2, TWIST2, TAGLN, FAP); genes imunossupressores (por exemplo, IL10, VEGFA, VEGFC); genes quimiotáticos de monócitos e macrófagos (por exemplo, CCL2, CCL7, CCL8, CCL13); genes envolvidos na angiogênese e cicatrização de feridas (por exemplo, célula T supressora); marcadores da adesão celular; remodelagem da ECM; marcadores do desenvolvimento do sistema esquelético e ósseo; e genes envolvidos na resposta inflamatória desencadeada por lesão tecidual.

[00584] Em algumas modalidades, a ausência ou a infra- regulação da expressão de MHC (por exemplo, MHC classe 1) pode servir como um biomarcador para condições associadas ao TGFβ1 para as quais os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno englobados pela presente revelação podem ser usados como terapia. Níveis de MHC reduzidos podem sinalizar escape imune, que podem ser correlacionar com baixa responsividade dos pacientes às imunoterapias, por exemplo, CBT. A inibição seletiva de TGFβ1, portanto, pode, pelo menos em parte, restaurar a função da célula efetora. Doenças que envolvem transição mesenquimal

[00585] A transição mesenquimal é um processo de mudança fenotípica de células, por exemplo, células epiteliais e células endoteliais, para um fenótipo mesenquimal (por exemplo, miofibroblastos). Exemplos de marcadores genéticos indicativos de transição mesenquimal incluem AXL, ROR2, WNT5, LOXL2, TWIST2, TAGLN e FAP. No câncer, por exemplo, a transição mesenquimal (por exemplo, assinaturas aumentadas de EndMT e EMT) indica plasticidade fenotípica da célula tumoral. Dessa forma, inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, de alta afinidade, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para tratar uma doença que é iniciada ou dirigida por transição mesenquimal, por exemplo, EMT e EndMT.

[00586] EMT (transição epitelial-mesenquimal) é o processo pelo qual células epiteliais com junções aderentes mudam para propriedades (fenótipos) mesenquimais, por exemplo, contatos célula-célula frouxos. O processo é observado em vários processos biológicos normais, bem como em situações patológicas, incluindo embriogênese, cicatrização de feridas, metástases de câncer e fibrose (revisado, por exemplo, em Shiga e cols. (2015) “Cancer- Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth”. Cancers, 7: 2.443-2.458). Geralmente, acredita-se que sinais de EMT sejam induzidos principalmente por TGFβ. Muitos tipos de câncer, por exemplo, parecem envolver a transdiferenciação de células em direção ao fenótipo mesenquimal (por exemplo, miofibroblastos e CAFs), o que se correlaciona com prognóstico mais pobre. Dessa forma, inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, contexto-independentes, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para tratar uma doença que é iniciada ou dirigida por EMT. Na verdade, dados exemplificados nesse relatório descritivo (por exemplo, FIGS. 7-9) mostram que esses inibidores possuem a habilidade para suprimir a expressão de marcadores de miofibroblasto/CAF in vivo, por exemplo, α-SMA, LOXL2, Col1 (colágeno do Tipo I), e FN (fibronectina). Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, de alta afinidade, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para o tratamento de uma doença caracterizada por EMT. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor pode ser uma quantidade suficiente para reduzir a expressão de marcadores como, por exemplo, α- SMA/ACTA2, LOXL2Col1 (colágeno do Tipo I), e FN (fibronectina). Em algumas modalidades, a doença é um distúrbio fibrótico. Em algumas modalidades, a doença é um distúrbio proliferativo, por exemplo, câncer.

[00587] Similarmente, TGFβ também é um regulador crucial da transição endotelial-mesenquimal (EndMT) observada no desenvolvimento normal, por exemplo, na formação do coração. No entanto, o mesmo fenômeno ou fenômeno similar também é observado em muitas doenças, por exemplo, estroma de câncer e locais fibróticos. Em alguns processos de doença, marcadores endoteliais como, por exemplo, CD31, ficam infra-

regulados mediante exposição ao TGFβ1 e, ao invés disso, a expressão de marcadores mesenquimais como, por exemplo, FSP- 1, α-SMA e fibronectina, se torna induzida. Na verdade, CAFs estromais podem ser derivados de células endoteliais vasculares. Dessa forma, inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, de alta afinidade, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para o tratamento de uma doença caracterizada por EndMT. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor pode ser uma quantidade suficiente para reduzir a expressão de marcadores como, por exemplo, FSP-1, α-SMA/ACTA2 e fibronectina. Em algumas modalidades, a doença é um distúrbio fibrótico. Em algumas modalidades, a doença é um distúrbio proliferativo, por exemplo, câncer. Doenças que envolvem enrijecimento e remodelagem da matriz

[00588] A progressão várias indicações relacionadas ao TGFβ1, por exemplo, condições fibróticas e câncer, envolve níveis aumentados de componentes da matriz depositados na ECM e/ou manutenção/remodelagem da ECM. Foi relatado que a deposição aumentada de componentes da ECM como, por exemplo, colágenos, pode alterar as propriedades físico-mecânicas da ECM (por exemplo, a rigidez da matriz/substrato) e esse fenômeno está associado à sinalização de TGFβ1. Requerente demonstraram previamente o papel de rigidez da matriz sobre a ativação de TGFβ integrina-dependente, usando fibroblastos primários transfectados com pró-TGFβ e LTBP1, e desenvolvidos em substratos baseados em silício com rigidez definida (por exemplo, 5 kPa, 15 kPa ou 100 kPa). Como revelado em WO 2018/129329, matrizes com rigidez maior aumentam a ativação de TGFβ1, e isso pode ser suprimido por inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos. Essas observações sugerem que TGFβ1 influencia as propriedades da ECM (por exemplo, rigidez), o que, por sua vez, pode induzir ainda mais a ativação de TGFβ1, refletiva da progressão de doença.

[00589] Dessa forma, inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, de alta afinidade, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para bloquear esse processo para se opor à progressão de doença que envolve alterações da ECM, por exemplo, fibrose, crescimento tumoral, invasão, metástase e desmoplasia. O braço de LTBP desses inibidores pode bloquear diretamente complexos associados à ECM de TGFβ1 pró/latente que são apresentados por LTBP1 e/ou LTBP3 evitando, dessa forma, ativação/liberação do fator de crescimento pelo complexo no nicho da doença. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, de alta afinidade, podem normalizar a rigidez da ECM para tratar uma doença que envolve sinalização integrina-dependente. Em algumas modalidades, a integrina compreende uma cadeia α11, cadeia β1, ou ambas. A arquitetura da ECM, por exemplo, componentes e organização da ECM, também pode ser alterada por proteases associadas à matriz.

[00590] Como revisado em Lampi e Reinhart-King (Science Translational Medicine, 10 (422): eaao0475, “Targeting Extracellular Matrix Stiffness to Attenuate Disease: From Molecular Mechanisms to Clinical Trials”), a rigidez aumentada de ECMs do tecido ocorre durante progressão patológica de câncer, fibrose e doença cardiovascular. As propriedades mecânicas associadas ao processo envolvem miofibroblastos fenotipicamente convertidos, TGFβ e reticulação da matriz. Uma causa importante de rigidez aumentada da ECM durante o câncer e doenças fibróticas consiste em síntese e remodelagem desreguladas da matriz por fibroblastos ativados que foram desdiferenciados em miofibroblastos (por exemplo, CAFs e FAFs). A remodelagem do estroma tumoral e de fibrose de órgão exibem similaridades impressionantes com a resposta de cicatrização de feridas, exceto que no estado patológico a resposta é sustentada. Miofibroblastos são uma população heterogênea de células com células precursoras patologia-específicas que se originam de várias fontes de células, por exemplo, células derivadas da medula óssea e residentes no tecido. Marcadores de miofibroblastos comumente usados incluem alfa-actina de músculo liso (α-SMA). Como mostrado nesse relatório descritivo, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, de alta afinidade, são capazes de reduzir a expressão de ACTA2 (que codifica α-SMA), colágenos, bem como as FN (fibronectina) em estudos in vivo. A fibronectina é importante na ancoragem de complexos pró-TGFβ1 associados à LTBP sobre a estrutura da matriz.

[00591] A importância da via de TGFβ na regulação da ECM está bem estabelecida. Como TGFβ1 (e TGFβ3) pode ser mecanicamente ativado por certas integrinas (por exemplo, integrinas αv), a interação integrina-TGFβ1 se tornou um alvo terapêutico. Por exemplo, um anticorpo monoclonal para αvβ6 está sendo investigado para fibrose pulmonar idiopática. No entanto, essa abordagem também pode interferir com a sinalização de TGFβ3, que compartilha o mesmo motivo de ligação à integrina, RGD e, além disso, esse anticorpo não será eficaz no bloqueio de TGFβ1 ativado por meio de outros modos, por exemplo, ativação induzida por protease. Em comparação, os inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, de alta afinidade, podem bloquear a ativação de TGFβ1 protease-dependente (FIGS. 5A e 5B), bem como a ativação de TGFβ1 integrina-dependente (FIGS. 1-4 e 33B). Portanto, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos de alta afinidade podem fornecer atributos superiores. Dados apresentados nesse relatório descritivo, em conjunto com trabalho prévio do Requerente, dão suporte à noção de que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos de alta afinidade podem ser eficazes no tratamento de doenças associadas ao enrijecimento da ECM.

[00592] Dessa forma, a invenção inclui o uso terapêutico dos inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos de alta afinidade no tratamento de uma doença associada com enrijecimento da matriz, ou em um método para redução da rigidez da matriz, em um indivíduo. Esse uso compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo de alta afinidade. Doenças que envolvem proteases

[00593] A ativação de TGFβ de seu complexo latente pode ser desencadeada por integrina de um modo força-dependente, e/ou por proteases. Evidências sugerem que certas classes de proteases podem estar envolvidas no processo incluindo, sem limitação, Ser/Thr proteases como, por exemplo, Calicreínas, quimotripsina, elastases, plasmina, bem como metaloproteases de zinco da família MMP, por exemplo, MMP-2, MMP-9 e MMP-13, e a família Adam de proteases, por exemplo, Adam10 e Adam17. MMP-2 degrada o componente mais abundante da membrana basal, Colágeno IV, despertando a possibilidade de que pode participar da regulação de TGFβ1 associada à ECM. MMP-9 foi implicado em ter um papel central na progressão, angiogênese, remodelagem estromal e metástase tumorais. Dessa forma, a ativação de TGFβ1 protease-dependente na ECM pode ser importante para o tratamento de câncer.

[00594] Calicreínas (KLKs) são serina proteases tripsina- ou quimotripsina-like que incluem Calicreínas plasmáticas e Calicreínas teciduais. A ECM participa da homeostasia tecidual atuando como um arcabouço e barreira estrutural e de sinalização para suprimir o crescimento maligno excessivo. KLKs pode participar da degradação de proteínas da ECM e outros componentes que podem facilitar a expansão e invasão do tumor. Por exemplo, KLK1 está altamente supra-regulada em certos cânceres de mama e pode ativar pró- MMP-2 e pró-MMP-9. KLK2 ativa TGFβ1 latente, tornando o câncer de próstata adjacente a fibroblastos permissivos ao crescimento do câncer. KLK3 foi amplamente estudada como um marcador diagnóstico para o câncer de próstata (PSA). KLK3 pode ativar diretamente TGFβ1 por processamento de plasminogênio em plasmina, que cliva proteoliticamente LAP fazendo com que, dessa forma, o fator de crescimento TGFβ1 seja liberado do complexo latente. KLK6 pode ser um marcador potencial para a doença de Alzheimer.

[00595] Além disso, dados fornecidos no Exemplo 8 indicam que essas proteases podem ser uma Calicreína. Dessa forma, a invenção engloba o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico contexto-independente em um método para o tratamento de uma doença associada com Calicreína ou com uma protease do tipo Calicreína. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 é Ab3, Ab6, ou derivados destes.

[00596] Ativadores de TGFβ1 conhecidos, por exemplo, plasmina, TSP-1 e αVβ6 integrina, todos interagem diretamente com LAP. Postula-se que a clivagem proteolítica de LAP possa desestabilizar a interação LAP-TGFβ liberando, dessa forma, TGFβ1 ativo. Foi sugerido que a região que contém 54-LSKLRL-59 é importante para a manutenção da latência de TGFβ1. Dessa forma, agentes (por exemplo, anticorpos) que estabilizam a interação, ou bloqueiam a clivagem proteolítica de LAP, podem evitar a ativação de TGFβ.

[00597] Muitas dessas proteases associadas com condições patológicas (por exemplo, câncer) funcionam por meio de mecanismos de ação distintos. Dessa forma, a inibição alvejada de proteases particulares, ou combinações de proteases, pode fornecer benefícios terapêuticos para o tratamento de condições que envolvem o eixo protease-TGFβ. Consequentemente, é contemplado que inibidores (por exemplo, anticorpos contra TGFβ1) que inibem seletivamente a ativação de TGFβ1 induzida por protease podem ser vantajosos no tratamento dessas doenças (por exemplo, câncer). Similarmente, a inibição seletiva da ativação de TGFβ1 por uma protease em relação a outra protease também pode ser preferida, dependendo da condição que está sendo tratada.

[00598] A plasmina é uma serina protease produzida como uma forma precursora denominada Plasminogênio. Mediante liberação, Plasmina entra na circulação e, portanto, é detectada no soro. Níveis elevados de plasmina sérica parecem se correlacionar com progressão de câncer, possivelmente por meio de mecanismos que envolvem a ruptura da matriz extracelular (por exemplo, membrana basal e barreiras estromais) o que facilita a motilidade, invasão e metástase da célula tumoral. Plasmina também pode afetar a adesão, proliferação, apoptose, nutrição do câncer, suprimento de oxigênio, formação de vasos sanguíneos e ativação de VEGF (Didiasova e cols., Int. J. Mol. Sci, 2014, 15, 21.229-

21.252). Além disso, plasmina pode promover a migração de macrófagos para dentro do microambiente tumoral (Philips e cols., Cancer Res., 1º de novembro de 2011; 71 (21): 6.676- 83 e Choong e cols., Clin. Orthop. Relat. Res. 2003, 415S, S46-S58). Na verdade, macrófagos associados ao tumor (TAMs) são condutores bem caracterizados da tumorigênese por meio de sua habilidade para promover crescimento, invasão, metástase e angiogênese tumorais.

[00599] As atividades plasmina foram ligadas primariamente à ruptura da ECM. No entanto, há evidências crescentes de que plasmina também regula MMP a jusante e ativação de TGFβ. Especificamente, foi sugerido que plasmina causa ativação de TGFβ por meio de clivagem proteolítica do Peptídeo Associado à Latência (LAP), que é derivado da região do terminal-N do produto do gene de TGFβ (Horiguchi e cols., J Biochem. Outubro de 2012; 152 (4): 321-9), resultando na liberação de fator de crescimento ativo. Como TGFβ1 pode promover progressão de câncer, isso desperta a possibilidade de que a ativação de TGFβ induzida por plasmina possa, pelo menos em parte, mediar esse processo.

[00600] Também foi demonstrado que TGFβ1 regula a expressão de uPA, que é um participante crítico na conversão de plasminogênio em Plasmina (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597-927). uPA demonstrou independentemente que promove a progressão de câncer (por exemplo, adesão, proliferação e migração) por ligação ao seu receptor da superfície celular (uPAR) e promoção da conversão de plasminogênio em plasmina. Além disso, estudos demonstraram que a expressão de uPA e/ou inibidor do ativador de plasminogênio-1 (PAI-1) são preditores de prognóstico pobre no câncer cólon-retal (D.Q. Seetoo, e cols., Journal of Surgical Oncology, vol. 82, Nº 3, páginas 184–193, 2003), câncer de mama (N. Harbeck e cols., Clinical Breast Cancer, vol. 5, Nº 5, páginas 348–352, 2004), e câncer de pele (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597-927). Dessa forma, sem se prender a uma teoria em particular, a interação entre plasmina, TGFβ1 e uPA pode criar uma alça de feedback positivo para a promoção de progressão de câncer. Consequentemente, inibidores que inibem seletivamente ativação de TGFβ1 plasmina-dependente podem ser particularmente adequados para o tratamento de cânceres baseados no eixo plasmina/sinalização de TGFβ1.

[00601] Em um aspecto da invenção, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos descritos nesse relatório descritivo incluem inibidores que podem inibir a ativação de TGFβ1 protease-dependente. Em algumas modalidades, os inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 protease-dependente de uma forma integrina-independente. Em algumas modalidades, esses inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 independentemente do modo de ativação, por exemplo, inibir tanto a ativação integrina-dependente quanto a ativação de TGFβ1 protease-dependente. Em algumas modalidades, a protease é selecionada do grupo que consiste em: serina proteases, por exemplo, Calicreínas, quimotripsina, tripsina, elastases, plasmina, bem como metaloproteases de zinco (família MMP), por exemplo, MMP-2, MMP-9 e MMP-13.

[00602] Em algumas modalidades, os inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 induzida por plasmina. Em algumas modalidades, os inibidores podem inibir a ativação de TGFβ1 induzida por plasmina e integrina. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a pró-TGFβ1 latente inibindo, dessa forma, a liberação de fator de crescimento maduro pelo complexo latente. Em algumas modalidades, o inibidor contexto- independente, de alta afinidade, da ativação de TGFβ1 adequado para uso no método de inibição da ativação de TGFβ1 plasmina-dependente é Ab6 ou a derivado ou variante deste.

[00603] Em algumas modalidades, o inibidor (por exemplo, anticorpo contra TGFβ1) inibe a migração da célula de câncer. Em algumas modalidades, o inibidor inibe a migração de macrófagos. Em algumas modalidades, o inibidor inibe o acúmulo de TAMs.

[00604] Em outro aspecto, é fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de câncer em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um inibidor de TGFβ1 (por exemplo, anticorpo contra TGFβ1), em que o inibidor inibe a ativação de TGFβ1 induzida por protease (por exemplo, plasmina) tratando, dessa forma, o câncer no indivíduo.

[00605] Em outro aspecto, é fornecido nesse relatório descritivo um método de redução do crescimento tumoral em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um inibidor de TGFβ1 (por exemplo, anticorpo contra TGFβ1), em que o inibidor inibe a ativação de TGFβ1 induzida por protease (por exemplo, plasmina) reduzindo, dessa forma, o crescimento tumoral no indivíduo. Câncer / malignidades

[00606] Vários cânceres envolvem atividades de TGFβ1 e podem ser tratados com anticorpos e/ou composições da presente revelação. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “câncer” se refere a qualquer uma das várias neoplasias malignas associadas com células TGFβ1-positivas. Essas neoplasias malignas são caracterizadas pela proliferação de células anaplásicas que tendem a invadir tecido circundante e liberar metástases para novos locais do corpo, e também se refere à condição patológica caracterizada por esses crescimentos neoplásicos malignos. A fonte de TGFβ1 pode variar e pode incluir as próprias células malignas (câncer), bem como suas células/tecidos circundantes ou de suporte incluindo, por exemplo, a matriz extracelular, várias células imunes, e quaisquer combinações destes.

[00607] A identificação afirmativa de câncer como “TGFβ1- positivo” não é necessária para realização dos métodos terapêuticos descritos nesse relatório descritivo. Tipicamente, certos tipos de câncer estão comprovadamente ou são suspeitos, com base em evidências críveis, de estarem associados com a sinalização de TGFβ1.

[00608] Os cânceres podem ser localizados (por exemplo, tumores sólidos) ou sistêmicos. No contexto da presente revelação, o termo “localizado” (como em “tumor localizado”) se refere às anormalidades/lesões anatomicamente isoladas ou isoláveis, por exemplo, malignidades sólidas, ao contrário de doença sistêmica (por exemplo, os denominados tumores líquidos ou cânceres sanguíneos). Certos cânceres, por exemplo, certos tipos de leucemia (por exemplo, mielofibrose) e mieloma múltiplo, por exemplo, podem ter tanto um componente localizado (por exemplo, a medula óssea) quanto um componente sistêmico (por exemplo, células sanguíneas circulantes) para a doença. Em algumas modalidades, os cânceres os podem ser sistêmicos, por exemplo, malignidades hematológicas. Os cânceres que podem ser tratados de acordo com a presente revelação são TGFβ1- positivos e incluem, sem limitação, todos os tipos de linfomas/leucemias, carcinomas e sarcomas, tais como aqueles cânceres ou tumores encontrados no ânus, bexiga, ducto biliar, osso, cérebro, mama, cérvice, cólon/reto, endométrio, esôfago, olho, vesícula biliar, cabeça e pescoço, fígado, rim, laringe, pulmão, mediastino (tórax), boca, ovários, pâncreas, pênis, próstata, pele, intestino delgado, estômago, medula espinhal, cóccix, testículos, tireóide e útero. Em algumas modalidades, o câncer pode ser um câncer avançado, por exemplo, um tumor sólido localmente avançado e câncer metastático.

[00609] Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes englobados pela presente revelação podem ser usados no tratamento de câncer, incluindo, sem limitação: mielofibrose, melanoma, melanoma adjuvante, carcinoma de célula renal (RCC), câncer da bexiga, câncer cólon-retal (CRC), câncer do cólon, câncer retal, câncer anal, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo (TNBC), câncer de mama HER2-negativo, câncer de mama com BRCA mutado, malignidades hematológicas, carcinoma de célula não pequena, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), câncer de pulmão de pequena célula (SCLC), câncer de pulmão de pequena célula em estágio extensivo (ES-SCLC), linfoma (de Hodgkin clássico e não-Hodgkin), linfoma de célula B grande mediastinal primário (PMBCL), linfoma de célula T, linfoma de célula B grande difuso, sarcoma histiocítico, sarcoma de célula dendrítica folicular, sarcoma de célula dendrítica interdigitante, mieloma, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielóide aguda (AML), linfoma linfocítico pequeno (SLL), câncer da cabeça e pescoço, câncer urotelial, carcinoma de célula de Merkel, câncer de pele de célula de Merkel, câncer com alta instabilidade microssatélite (MSI- H), câncer com deficiência de reparo de erro de pareamento (dMMR), mesotelioma, câncer gástrico, câncer da junção gastroesofágica (GEJ), adenocarcinoma gástrico, tumores neuroendócrinos, tumores estromais gastrintestinais (GIST), adenocarcinoma da cárdia gástrica, câncer renal, câncer biliar, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer de próstata, adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula não escamosa, carcinoma cutâneo de célula escamosa (CSCC), câncer ovariano, câncer endometrial, câncer da trompa de Falópio, câncer cervical, câncer peritoneal, câncer do estômago, cânceres do cérebro, glioma maligno, glioblastoma, gliossarcoma, neuroblastoma, câncer da tireóide, carcinoma adrenocortical, neoplasia intraepitelial oral, câncer esofágico, carcinoma de célula escamosa da cavidade nasal e seios paranasais, carcinoma do nasofaringe, câncer da glândula salivar, câncer do fígado e câncer hepatocelular (HCC). No entanto, qualquer câncer (por exemplo, pacientes com esse câncer) no qual TGFβ1 está superexpresso ou é pelo menos a isoforma predominante, como determinado por, por exemplo, biópsia, pode ser tratado com um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo de acordo com a presente revelação.

[00610] No câncer, TGFβ (por exemplo, TGFβ1) pode ser promotor de crescimento ou inibidor de crescimento. Como exemplo, em cânceres pancreáticos, tumores com SMAD4 do tipo selvagem podem apresentar crescimento inibido em resposta ao TGFβ, mas à medida que a doença progride, receptor do tipo II constitutivamente ativado está tipicamente presente. Adicionalmente, há cânceres pancreáticos SMAD4-null. Em algumas modalidades, anticorpos, porções de ligação ao antígeno destes, e/ou composições da presente revelação são projetados para alvejar seletivamente componentes de vias de sinalização de TGFβ que funcionam singularmente em uma ou mais formas de câncer. Leucemias, ou cânceres do sangue ou medula óssea que são caracterizados por uma proliferação anormal de células sanguíneas brancas, ou seja, leucócitos, podem ser divididas em quatro classificações principais que incluem leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielógena aguda ou leucemia mielóide aguda (AML) (AML com translocalizações entre o cromossomo 10 e 11 [t10, 11)], cromossomo 8 e 21 [t(8;21)], cromossomo 15 e 17 [t(15;17)], e inversões no cromossomo 16 [inv(16)]; AML com displasia multilinhagens, que inclui pacientes que tiveram uma síndrome mielodisplásica (MDS) ou doença mieloproliferativa prévia que se transforma em AML; AML e síndrome mielodisplásica (MDS), relacionada à terapia, cuja categoria inclui pacientes que tiveram quimioterapia e/ou radiação prévia e subsequentemente desenvolvem AML ou MDS; d) AML não categorizada de outra forma, que inclui subtipos de AML que não se enquadram nas categorias acima; e e) leucemias agudas de linhagem ambígua, que ocorrem quando as células leucêmicas não podem ser classificadas como células mielóides ou linfóides, ou quando ambos os tipos de células estão presentes); e leucemia mielógena crônica (CML).

[00611] Em algumas modalidades, qualquer um dos cânceres TGFβ1-positivos citados acima também pode ser TGFβ3- positivo. Em algumas modalidades, tumores que são tanto TGFβ1-positivos quanto TGFβ3-positivos podem ser TGFβ1/TGFβ3 codominantes. Em algumas modalidades, esse câncer é carcinoma que compreende um tumor sólido. Em algumas modalidades, esses tumores são carcinomas de mama. Em algumas modalidades, o carcinoma de mama pode ser do genótipo triplo- negativo (câncer de mama triplo-negativo). Em algumas modalidades, indivíduos com câncer TGFβ1-positivo possuem níveis elevados de MDSCs. Por exemplo, esses tumores podem compreender MDSCs recrutadas para o local de tumor resultando em um número aumentado de infiltrados de MDSC. Em algumas modalidades, indivíduos com câncer de mama exibem níveis elevados de Proteína C-Reativa (CRP), um marcador inflamatório associado com recorrência e prognóstico pobre. Em algumas modalidades, indivíduos com câncer de mama exibem níveis elevados de IL-6.

[00612] Os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos da invenção podem ser usados para tratar pacientes que sofrem de leucemia mielóide crônica, que é uma doença de célula- tronco, na qual a oncoproteína BCR/ABL é considerada essencial para o crescimento anormal e acúmulo de células neoplásticas. Imatinib é uma terapia aprovada para tratar essa condição; no entanto, uma fração significante de pacientes com leucemia mielóide exibe resistência ao Imatinib. A inibição de TGFβ1 obtida pelo inibidor, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode potencializar a repopulação/expansão para se opor ao crescimento anormal dirigido por BCR/ABL e acúmulo de células neoplásticas fornecendo, dessa forma, benefício clínico.

[00613] Inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para tratar mieloma múltiplo. O mieloma múltiplo é um câncer de linfócitos B (por exemplo, células plasmáticas, plasmoblastos, células B de memória) que se desenvolve e expande na medula óssea, causando lesões ósseas destrutivas (ou seja, lesão osteolítica). Tipicamente, a doença apresenta reabsorção óssea osteoclástica aumentada, diferenciação de osteoblasto suprimida (por exemplo, parada da diferenciação) e formação óssea defeituosa, caracterizada, em parte, por lesões osteolíticas, osteopenia, osteoporose, hipercalcemia, bem como plasmocitoma, trombocitopenia, neutropenia e neuropatia. A terapia com inibidor contexto-independente, TGFβ1-seletivo, descrita nesse relatório descritivo pode ser eficaz para melhorar uma ou mais dessas manifestações clínicas ou sintomas em pacientes. O inibidor de TGFβ1 pode ser administrado aos pacientes que recebem terapia ou terapias adicionais para tratar mieloma múltiplo, incluindo aquelas listadas em qualquer outro local nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, mieloma múltiplo pode ser tratado com um inibidor de TGFβ1 (por exemplo, um inibidor isoforma-

específico contexto-independente) em combinação com um inibidor de miostatina ou um inibidor de IL-6. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 pode ser usado em conjunto com terapias tradicionais para mieloma múltiplo, por exemplo, bortezomib, lenalidomida, carfilzomib, pomalidomida, talidomida, doxorrubicina, corticosteróides (por exemplo, dexametasona e prednisona), quimioterapia (por exemplo, melfalan), radioterapia, transplante de célula- tronco, plitidepsina, Elotuzumab, Ixazomib, Masitinib e/ou Panobinostat.

[00614] Os tipos de carcinomas que podem ser tratados pelos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, papiloma/carcinoma, coriocarcinoma, tumor do seio endodérmico, teratoma, adenoma/adenocarcinoma, melanoma, fibroma, lipoma, leiomioma, rabdomioma, mesotelioma, angioma, osteoma, condroma, glioma, linfoma/leucemia, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula pequena, carcinomas indiferenciados de célula grande, carcinoma de célula basal e carcinoma sinonasal indiferenciado.

[00615] Os tipos de sarcomas incluem, sem limitação, sarcoma de tecido mole como, por exemplo, sarcoma alveolar de partes moles, angiossarcoma, dermatofibrossarcoma, tumor desmóide, tumor desmoplásico de célula redonda pequena, condrossarcoma extraesquelético, osteossarcoma extraesquelético, fibrossarcoma, hemangiopericitoma, hemangiossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiossarcoma, linfossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, neurofibrossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma sinovial e tumor de Askin, sarcoma de Ewing (tumor neuroectodérmico primitivo),

hemangioendotelioma maligno, schwanoma maligno, osteossarcoma e condrossarcoma.

[00616] Inibidores isoforma-seletivos contexto- independentes da ativação de TGFβ1, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser adequados para o tratamento de malignidades que envolvem células originárias da crista neural. Cânceres da linhagem da crista neural (ou seja, tumores derivados da crista neural) incluem, sem limitação: melanoma (câncer de melanócitos), neuroblastoma (câncer de precursores simpáticos/adrenais), ganglioneuroma (câncer de gânglios do sistema nervoso periférico), carcinoma medular da tireóide (câncer de células C da tireóide), feocromocitoma (câncer de células de cromafina da medula adrenal) e MPNST (câncer das células de Schwann). Em algumas modalidades, os anticorpos e métodos da revelação podem ser usados para tratar um ou mais tipos de câncer ou condições relacionadas ao câncer que podem incluir, sem limitação, câncer do cólon, câncer renal, câncer de mama, melanoma maligno e glioblastomas (Schlingensiepen e cols., 2008; Ouhtit e cols., 2013).

[00617] Sob condições normais, células T reguladoras (Tregs) representam um pequeno subconjunto da população global de linfócitos CD4-positivos e desempenham papéis cruciais para a manutenção do sistema imune em homeostasia. Em quase todos os cânceres, no entanto, o número de Tregs está acentuadamente aumentado. Embora Tregs desempenhem um papel importante no amortecimento de respostas imunes em indivíduos saudáveis, um número elevado de Tregs no câncer foi associado com prognóstico pobre. Tregs elevadas no câncer podem amortecer a imunidade anticâncer do hospedeiro e podem contribuir para a progressão tumoral, metástase, recorrência do tumor e/ou resistência ao tratamento. Por exemplo, ascites do câncer ovariano humano estão infiltradas com Tregs Foxp3+ GARP+ (Downs-Canner e cols., Nat. Commun. 2017, 8: 14649). Similarmente, Tregs se correlacionaram positivamente com um fenótipo mais imunossupressor e mais agressivo no carcinoma hepatocelular avançado (Kalathil e cols., Cancer Res. 2013, 73 (8): 2.435-44). Tregs pode suprimir a proliferação de células T efetoras (FIG. 26B). Além disso, Tregs exercem inibição de células imunes contato-dependente (por exemplo, células T naïve CD4+) por meio da produção de TGFβ1 (veja, por exemplo, a FIG. 26A). Para combater um tumor, portanto, é vantajoso inibir Tregs, de modo que células T efetoras suficientes possam estar disponíveis para exercer efeitos antitumorais.

[00618] Linhas de evidência crescentes sugerem o papel de macrófagos na progressão de tumores/câncer. A presente invenção engloba a noção de que isso é, em parte, mediado por ativação de TGFβ1 no ambiente da doença, por exemplo, TME. Monócitos derivados da medula óssea (por exemplo, CD11b+) são recrutados para os locais de tumor em resposta às citocinas/quimiocinas derivadas do tumor (por exemplo, CCL2, CCL3 e CCL4), onde monócitos passam por diferenciação e polarização para adquirir fenótipo pró-câncer (por exemplo, com tendência a M2 ou macrófagos do tipo M2, TAMs). Como demonstrado previamente (WO 2018/129329), monócitos isolados de PBMCs humanas podem ser induzidos a polarizar em subtipos de macrófagos diferentes, por exemplo, M1 (pró- fibrótico, anticâncer) e M2 (pró-câncer). A maioria dos TAMs em muitos tumores tem tendência a M2. Entre os macrófagos do tipo M2, foi verificado que os subtipos M2c e M2d, mas não M1, expressam LRRC33 elevado na superfície da célula. Além disso, macrófagos podem ainda ser inclinados ou ativados por exposição a certa citosina, por exemplo, M-CSF, resultando em um aumento acentuado na expressão de LRRC33, que coincide com a expressão de TGFβ1. Níveis aumentados de M-CSF circulante (ou seja, concentrações séricas de M-CSF) em pacientes com doença mieloproliferativa (por exemplo, mielofibrose) também foi observada. Geralmente, tumores com alto infiltrado de macrófagos (TAM) e/ou MDSC estão associados com um prognóstico ruim. Similarmente, níveis elevados de M-CSF também são indicativos de prognóstico ruim. Dessa forma, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, tais como aqueles englobados nesse relatório descritivo, podem ser usados no tratamento de câncer que é caracterizado por níveis elevados de macrófagos e/ou MDSCs pró-câncer. O braço de LRRC33 do inibidor pode, pelo menos em parte, mediar seus efeitos inibidores contra células mielóides imunossupressoras associadas à doença, por exemplo, macrófagos-M2 e MDSCs.

[00619] A alta prevalência de macrófagos do tipo M2 associados a tumores é recapitulada em modelos murídeos singênicos de tumor descritos nesse relatório descritivo. Em tumores MBT-2, por exemplo, quase 40% de células CD45- positivas isoladas de um tumor estabelecido são macrófagos M2 (FIG. 28B). Isso é reduzido pela metade em animais tratados com uma combinação de inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos de alta afinidade e anti-PD-1. Por comparação, nenhuma alteração significante no número de macrófagos M1 associados a tumores é observada nos mesmos animais. Como os macrófagos M2, MDSCs associados a tumores também estão elevados em tumores estabelecidos (cerca de 10-12% de células CD45+), e estão acentuadamente reduzidos (até níveis desprezíveis) por inibição tanto de PD-1 quanto de TGFβ1 nos animais tratados (FIG. 28B). Como revelado nesse relatório descritivo, a maioria dos macrófagos M2 e MDSCs que infiltram o tumor expressa LRRC33 da superfície celular e/ou complexo LRRC33-pró-TGFβ1 (FIGS. 28C & 28D). Curiosamente, a expressão na superfície celular de LRRC33 (ou complexo LRRC33-pró-TGFβ1) parece ser altamente regulada.

O inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, Ab6, é capaz de se tornar rapidamente internalizado em células que expressam LRRC33 e pró-TGFβ1, e a taxa de internalização obtida com Ab6 é significantemente maior do que com um anticorpo de referência que reconhece LRRC33 da superfície celular (FIG. 6). Resultados similares são obtidos de macrófagos humanos primários.

Essas observações mostram que Ab6 pode promover internalização mediante ligação ao seu alvo, LRRC33-pró-TGFβ1, removendo, dessa forma, os complexos que contêm LRRC33 da superfície celular.

Dessa forma, o engajamento com o alvo por um inibidor de TGFβ1 isoforma- seletivo, de alta afinidade (por exemplo, Ab6) pode induzir infra-regulação anticorpo-dependente da proteína-alvo (por exemplo, complexos pró-TGFβ1 associados à célula). Nos locais de doença, isso pode reduzir a disponibilidade dos níveis de LRRC33-pró-TGFβ1 latente ativável.

Portanto, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos podem inibir o braço de LRRC33 de TGFβ1 por meio de mecanismos de ação duplos: i) bloqueio da liberação de fator de crescimento maduro do complexo latente; e, ii) remoção de complexos LRRC33-pró-

TGFβ1 da superfície celular por meio de internalização. No microambiente tumoral, os anticorpos podem alvejar complexos pró-TGFβ1 latentes associados à célula-alvo, aumentando os efeitos inibidores sobre as células-alvo, por exemplo, macrófagos M2 (por exemplo, TAMs), MDSCs e Tregs. Fenotipicamente, essas são células imunossupressoras, que contribuem para o microambiente tumoral imunossupressor, que é, pelo menos em parte, mediado pela via de TGFβ1. Considerando que muitos tumores estão enriquecidos com essas células, os anticorpos que são capazes de alvejar vários braços da função de TGFβ1 devem fornecer uma vantagem funcional.

[00620] Muitos cânceres humanos sabidamente causam níveis elevados de MDSCs em pacientes, comparados com controle saudável (revisado, por exemplo, em Elliott e cols. (2017) “Human Tumor-Infiltrating Myeloid Cells: Phenotypic and Functional Diversity” “Frontiers in Immunology”, Vol. 8, Artigo 86). Esses cânceres humanos incluem, sem limitação: câncer da bexiga, câncer cólon-retal, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, NSCL, câncer ovariano, câncer pancreático e carcinoma de célula renal. Níveis elevados de MDSCs podem ser detectados em amostras biológicas, por exemplo, célula mononuclear do sangue periférico (PBMC) e amostras de tecido (por exemplo, biópsia tumoral). Por exemplo, a frequência ou alterações no número de MDSCs podem ser medidas como: percentual (%) de PBMCs totais, percentual (%) de células CD14+, percentual (%) de células CD45+; percentual (%) de células mononucleares, percentual (%) de células totais,

percentual (%) de células CD11b+, percentual (%) de monócitos, percentual (%) de MNCs não linfocíticas, percentual (%) de células KLA-DR, usando marcadores da superfície celular adequados (fenótipo).

[00621] Por outro lado, a infiltração de macrófagos em um tumor também pode significar eficácia de uma terapia. Como exemplificado nas FIGS. 23, 24 e 27B, em tumores que são eficazmente penetrados por células T efetoras (por exemplo, células T CD8+) após o tratamento com uma combinação de um inibidor do ponto de verificação e um inibidor de TGFβ1 contexto-independente, células T efetoras intratumorais podem levar ao recrutamento de monócitos/macrófagos fagocíticos que limpam os restos de células.

[00622] Como fica nítido na FIG. 23, a combinação de anti-PD-1 e um inibidor de TGFβ1 resultou em influxo/expansão robusta de célula T CD8 por todo o tumor, comparado com tratamento com anti-PD-1 isoladamente. Analogamente, um aumento robusto em genes efetores de CD8 pode ser obtido pelo tratamento combinado. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para promover infiltração de células T efetoras em tumores.

[00623] Além disso, é observada infiltração/expansão intensa do tumor por macrófagos F4/80-positivos (veja a FIG. 24). Isso pode ser indicativo de macrófagos M1 (antitumorais) que limpam restos de células de câncer gerados por células citotóxicas e é presumivelmente uma consequência direta da inibição de TGFβ1. Como descrito em mais detalhe nos Exemplos nesse relatório descritivo, esses macrófagos que infiltram o tumor são identificados predominantemente como macrófagos não-M2 por sua ausência de expressão de CD163, indicando que monócitos circulantes são recrutados para o local de tumor mediante tratamento com inibidor do ponto de verificação e inibidor de TGFβ1 e se diferenciam em macrófagos M1, e essa observação é acompanhada por um influxo acentuado de células T CD8+ no local de tumor. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para aumentar macrófagos não-M2 associados ao tumor.

[00624] Recentemente, a terapia de bloqueio do ponto de verificação (CBT) se tornou um padrão de cuidados para o tratamento de vários tipos de câncer (veja, por exemplo, FIG. 20B). Apesar dos avanços profundos na imunoterapia do câncer, a resistência primária à CBT permanece uma necessidade não atendida importante para os pacientes; a maioria dos cânceres dos pacientes ainda não responde à inibição de PD-(L)1. Uma análise retrospectiva de câncer urotelial e tumores de melanoma implicou recentemente a ativação de TGFβ como um condutor potencial da resistência primária, muito provavelmente por meio de vários mecanismos, incluindo exclusão de células T citotóxicas do tumor, bem como sua expansão dentro do microambiente tumoral (exclusão imune). Essas observações e a validação pré-clínica subsequente apontaram para a inibição da via de TGFβ como uma avenida promissora para superação da resistência primária à CBT. No entanto, o direcionamento terapêutico da via de TGFβ foi impedido por cardiotoxicidades pré-clínicas dose-limitantes, muito provavelmente em função da inibição da sinalização de uma ou mais isoformas de TGFβ.

[00625] Muitos tumores não apresentam resposta primária à CBT. Nesse cenário, células T CD8+ são comumente excluídas do parênquima do tumor, sugerindo que tumores podem cooptar as funções imunomoduladoras da sinalização de TGFβ para gerar um microambiente imunossupressor. Essas informações de análises retrospectivas de amostras clínicas de tumores forneceram a lógica para investigação do papel da sinalização de TGFβ na resistência primária à CBT.

[00626] Várias conclusões cruciais podem ser tiradas com base nos resultados do presente estudo. Primeiro, a análise da expressão gênica de dados de TCGA indica que TGFβ1 é a isoforma mais prevalente na maioria dos tipos de tumores humanos e é, portanto, o condutor mais provável da sinalização de TGFβ e, dessa forma, o culpado imunossupressor que dirige a resistência primária à CBT, nesses tumores.

[00627] Segundo, a inibição seletiva da ativação de TGFβ1 parece suficiente para superar a resistência primária à CBT. Por direcionamento ao pró-domínio de TGFβ1 latente, um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, obtém especificidade de isoforma extraordinária e inibe a ativação de TGFβ1 latente em todos os contextos moleculares conhecidos. A avaliação farmacológica de um anticorpo desse tipo em modelos singênicos de tumor demonstrou que o tratamento com esse anticorpo é suficiente para tornar tumores resistentes ao anti-PD-1 sensíveis à terapia de bloqueio do ponto de verificação. Notavelmente, a eficácia antitumoral da combinação anti-PD-1/inibidor de TGFβ1 foi demonstrada em três tipos de tumores diferentes, incluindo um modelo no qual TGFβ1 não era a única isoforma de TGFβ presente no tumor. Isso sugere que, dentro do microambiente tumoral, TGFβ1 está provavelmente posicionado para desempenhar um papel imunomodulador, enquanto outras isoformas podem não ser relevantes para essa biologia. Essa observação abre a possibilidade de que a inibição seletiva de TGFβ1 possa ter potencial terapêutico na superação de resistência primária à CBT através de um amplo espectro de cânceres independentemente da expressão de outras isoformas de TGFβ.

[00628] Terceiro, a inibição seletiva da atividade da via dirigida por TGFβ1 resulta em segurança pré-clínica significantemente aumentada versus inibição ampla da atividade de todas as isoformas. Efeitos pleiotrópicos associados à inibição ampla da via de TGFβ têm impedido o direcionamento terapêutico da via de TGFβ. A maioria das terapêuticas experimentais até hoje (por exemplo, galunisertib, LY3200882, fresolimumab) é desprovida de seletividade para uma isoforma de TGFβ única, contribuindo potencialmente para as toxicidades limitantes da dose observadas em estudos não clínicos e clínicos. Dados genéticos de camundongos com knockout e mutações humanas de perda-de-função nos genes de TGFβ2 ou TGFβ3 sugerem que as toxicidades cardíacas observadas com inibidores de TGFβ não específicos podem ser decorrentes da inibição de TGFβ2 ou TGFβ3. A presente revelação ensina que a inibição seletiva da ativação de TGFβ1 com um anticorpo desse tipo possui um perfil de segurança aprimorado e é suficiente para provocar respostas antitumorais robustas quando combinado com bloqueio de PD-1, permitindo a avaliação da eficácia do inibidor de TGFβ1 em níveis de dose clinicamente tratáveis.

[00629] Para dissecar os processos imunológicos associados à imunidade antitumoral durante tratamento combinado de inibidor de TGFβ1/anti-PD-1, foi feita uma análise mais detalhada de respostas no modelo de câncer da bexiga MBT-2. O bloqueio simultâneo da atividade de PD-1 e de TGFβ1 induziu uma alteração profunda no encadeamento imune intratumoral, em grande parte dirigida por um aumento de 10 vezes em células T CD8+. Essas células T CD8+ estavam provavelmente engajadas na morte da célula tumoral, na medida em que os genes citolíticos cruciais, perforina e granzima B, também estavam supra-regulados em tumores pelo tratamento combinado. Notavelmente, o enriquecimento significante de células Treg pelo tratamento combinado com anti-PD- 1/inibidor de TGFβ1 foi um tanto inesperado, considerando a importância da sinalização de TGFβ para a manutenção de Tregs periféricas. No entanto, as células Treg são recrutadas para locais de inflamação, e seu aumento numérico pode ser interpretado como um marcador para uma resposta imune robusta. Contudo, células T CD8+ eram capazes de adotar um fenótipo ativado e provocar uma resposta antitumoral forte, apesar de um aumento nos números de células Treg. Uma explicação potencial poderia ser que células Treg não contribuem significantemente para o microambiente tumoral imunossupressor de MBT-2 e que outras populações de células imunes supressoras, por exemplo, células mielóides, desempenham um papel importante. Alternativamente, e não mutualmente exclusivo dessa possibilidade, considerando que TGFβ1 é um mediador crucial da imunossupressão dirigida por Tregs, a presença do inibidor de TGFβ1 também pode abolir essa atividade, apesar do aumento nos números de Tregs.

[00630] Um achado surpreendente fornecido nesse relatório descritivo inclui a observação histológica de uma associação próxima de células T CD8+ com a vasculatura tumoral CD31+. Esse padrão de enriquecimento dá suporte à hipótese de que uma via crítica para a entrada de células T no tumor é através da vasculatura tumoral, e que as células começam a migrar para fora radialmente para dentro do tumor após terem extravasado dos vasos sanguíneos tumorais.

Mariathasan e cols. verificaram que os números de células T CD8+ parecem aumentar ao longo da matriz colagenosa e da camada rica em fibroblastos na porção frontal do tumor no modelo de câncer de mama EMT-6, levando à especulação de que essa matriz contribuiria para a exclusão de células T.

Em contraste com essa observação, não foi possível detectar consistentemente uma área fibroblástica densa perto da porção frontal de tumores MBT-2. A observação do Requerente do enriquecimento de células T muito próximo da vasculatura (por exemplo, enriquecimento perivascular) sugere que, além da camada de fibroblastos associados ao câncer, a exclusão imune talvez também seja imposta por células endoteliais vasculares responsivas ao TGFβ1 ou por outras células muito próximas do endotélio.

Consistente com a possibilidade que a sinalização de TGFβ1 possa estar influenciando a função endotelial, a observação do Requerente inclui que a coloração de fosfo-SMAD3 em tumores de controle foi mais forte em núcleos do que parecem ser células endoteliais vasculares tumorais.

Essa coloração era sensível à inibição seletiva de TGFβ1, sugerindo que essas células estão respondendo ao TGFβ1 e podem ser cruciais no reforço da exclusão imune, talvez por meio do extravasamento de células T influenciador por meio de regulação do desempenho da integridade da barreira vascular.

Além disso, macrófagos associados ao tumor também foram descritos como estando muito próximos da vasculatura tumoral e podem estar envolvidos na geração de um microambiente tumoral imuno-excluído, por ativação de TGFβ1 ou por liberação de outras proteínas de superfície imunossupressoras ou fatores secretados na vasculatura ou perto dela. É provável que existam múltiplas vias para que células T entrem em um tumor, e uma melhor compreensão desses mecanismos ajudará na identificação de novos alvos terapêuticos ou informará sobre possíveis mecanismos de resistência do tumor.

[00631] Além do impacto esperado e observado sobre a disposição de células T citotóxicas dentro de tumores, o tratamento combinado de inibidor de TGFβ1/anti-PD-1 também impacta beneficamente o compartimento mielóide imunossupressor. Células mielóides CD11b+ formavam quase 80% do infiltrado imune em tumores MBT-2 não tratados, mas sua representação era reduzida para menos do que 40% mediante tratamento combinado. Isso era inteiramente dirigido por uma perda de macrófagos imunossupressores do tipo M2 e uma redução ainda mais profunda em MDSCs, enquanto a população macrófagos pró-inflamatórios do tipo M1 permanecia inalterada em termos de representação. O mecanismo pelo qual o tratamento combinado dirige a redução específica de células mielóides imunossupressoras é incerto, bem como é incerto o papel da sinalização de TGFβ1 no recrutamento, desenvolvimento ou manutenção dessas células no microambiente tumoral. Sabe-se que a que sinalização de TGFβ, entre outros fatores, polariza macrófagos em um tipo M2. Adicionalmente, há evidências para sugerir que TGFβ é parcialmente responsável por desenvolvimento de MDSC e aquisição de funções supressoras. Além disso, é provável que o influxo de células T secretoras de IFNγ pareado com o microambiente tumoral alterado contribuísse tanto para a repolarização quanto para a redução do tráfico de células mielóides imunossupressoras. Independentemente do mecanismo subjacente, uma redução de células mielóides imunossupressoras intratumorais seria altamente desejada como parte de uma abordagem de imunoterapia tumoral, na medida em que a presença dessa população de células está correlacionada com prognóstico pobre do paciente e resistência à terapia de bloqueio do ponto de verificação. Portanto, uma estratégia terapêutica que inclui o direcionamento desses tipos importantes de células imunossupressoras pode ter um efeito maior do que o direcionamento a um único tipo de célula imunossupressora (ou seja, somente células Treg) no microambiente tumoral. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para reduzir células imunossupressoras associadas ao tumor, por exemplo, macrófagos M2 e MDSCs.

[00632] Como mencionado previamente, é importante observar que TGFβ1 é provavelmente expresso por vários tipos de células no microambiente tumoral, incluindo células Treg, células mielóides supressoras, fibroblastos, bem como células tumorais. Cada uma dessas fontes celulares produz TGFβ1 em LLCs diferentes: Células Treg ativadas expressam LLCs GARP em sua superfície; células mielóides supressoras expressam LLCs LRRC33 em sua superfície, e fibroblastos provavelmente expressam e depositam LLCs LTBP na matriz extracelular circundante. É provável que cada uma dessas fontes de TGFβ1 “ativável” pudesse participar na promoção de exclusão imune e supressão imune no tumor, e que as contribuições relativas de cada fonte poderiam variar através de diferentes tipos de tumor. Curiosamente, o perfilamento de mRNA dos tumores MBT-2 e EMT6 usados nesses estudos indicou que LRRC33 e LTBP1 são os componentes de LLC mais altamente expressos, e os tumores Cloudman S91 parecem expressar exclusivamente LRRC33 (FIG. 20H). Dessa forma, os efeitos antitumorais profundos da combinação de inibidor TGFβ1-seletivo/anti-PD-1 nesses modelos, juntamente com a habilidade demonstrada do inibidor de TGFβ1 revelado nesse relatório descritivo para bloquear potentemente a ativação de TGFβ1 em todos os contextos de LLC conhecidos, sugerem fortemente que a inibição seletiva de LLCs específicos (por exemplo, GARP em células Treg) possa não ser suficiente para a criação de uma resposta antitumoral máxima em alguns tumores.

[00633] Dessa forma, os estudos pré-clínicos e os resultados apresentados nesse relatório descritivo demonstram que a inibição altamente específica da ativação de TGFβ1 permite que o sistema imune do hospedeiro supere um mecanismo crucial de resistência primária à terapia de bloqueio do ponto de verificação evitando, ao mesmo tempo, as toxicidades previamente reconhecidas da inibição mais ampla de TGFβ que têm sido uma limitação importante para aplicação clínica. Os resultados revelados nesse relatório descritivo sugerem que o tratamento com um inibidor de TGFβ1 de alta afinidade pode expandir significativamente o número de pacientes que se beneficiariam de terapias de bloqueio do ponto de verificação.

[00634] Consequentemente, como demonstrado nos Exemplos nesse relatório descritivo, inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos, de alta afinidade, podem ser usados para se oporem à resistência primária à CBT tornando, dessa forma, o tumor/câncer mais suscetível à CBT. Esses efeitos podem ser aplicáveis ao tratamento de um amplo espectro de tipos de malignidades, nos quais o câncer/tumor é TGFβ1-positivo. Em algumas modalidades, esse tumor/câncer pode ainda expressar uma isoforma adicional, por exemplo, TGFβ3. Exemplos não limitantes do último podem incluir certos tipos de carcinoma, por exemplo, câncer de mama.

[00635] Consequentemente, a invenção fornece critérios de seleção preferidos para a identificação ou seleção de um paciente ou populações/subpopulações de pacientes para os quais os inibidores de TGFβ1 contexto-independentes de alta afinidade têm probabilidade de obter benefício clínico. Em algumas modalidades, fenótipos adequados de tumores humanos incluem: i) um subconjunto (ou subconjuntos) demonstrou ser responsivo à CBT (por exemplo, bloqueio do eixo de PD-(L)1); ii) evidências de exclusão imune; e/ou, iii) evidências de expressão de TGFB1 e/ou sinalização de TGFβ. Vários tipos de câncer se ajustam a esse perfil incluindo, por exemplo, melanoma e câncer da bexiga.

[00636] Como mencionado acima, inibidores contexto- independentes de ativação de TGFβ1 podem ser usados no tratamento de Melanoma. Os tipos de melanoma que podem ser tratados com esses inibidores incluem, sem limitação: lentigo maligno; melanoma-lentigo maligno; melanoma com disseminação superficial; melanoma lentiginoso acral; melanoma mucoso; melanoma nodular; melanoma polipóide e melanoma desmoplásico. Em algumas modalidades, o melanoma é um melanoma metastático.

[00637] Mais recentemente, inibidores do ponto de verificação imune têm sido usados para tratar eficazmente pacientes com melanoma avançado. Em particular, anticorpos anti-morte programada (PD)-1 (por exemplo, nivolumab e pembrolizumab) se tornaram agora o padrão de cuidados para certos tipos de câncer como, por exemplo, melanoma avançado, que demonstraram atividade significante e resposta durável com um perfil de toxicidade gerenciável. No entanto, a aplicação clínica eficaz de antagonistas de PD-1 é sobrecarregada por uma alta taxa de resistência inata (aproximadamente 60-70%) (veja Hugo e cols. (2016) Cell 165: 35-44), ilustrando que desafios permanentes continuam a incluir as questões de seleção de pacientes e preditores de resposta e resistência, bem como otimização de estratégias de combinação (Perrot e cols. (2013) Ann. Dermatol. 25(2): 135-144). Além disso, estudos sugeriram que aproximadamente 25% dos pacientes de melanoma que inicialmente responderam a uma terapia anti-PD-1 eventualmente desenvolveram resistência adquirida (Ribas e cols. (2016) JAMA 315: 1.600- 9).

[00638] O número de células T CD8+ infiltrantes no tumor que expressam PD-1 e/ou CTLA-4 parece ser um indicador crucial do sucesso com a inibição checkpoint, e o bloqueio tanto de PD-1 quanto de CTLA-4 pode aumentar as células T infiltrantes. Em pacientes com presença de macrófagos associados ao tumor maior, no entanto, os efeitos anticâncer das células CD8 podem ser suprimidos.

[00639] É contemplado que células que expressam LRRC33, por exemplo, células mielóides, incluindo precursores mielóides, MDSCs e TAMs, podem criar ou dar suporte a um ambiente imunossupressor (por exemplo, TME e medula óssea mielofibrótica) por inibição de células T (por exemplo, depleção de células T), por exemplo, células T CD4 e/ou CD8, o que pode, pelo menos em parte, estar subjacente à resistência anti-PD-1 observada em certas populações de pacientes. Na verdade, evidências sugerem que a resistência à monoterapia anti-PD-1 era marcada por incapacidade de acumular células T citotóxica CD8+ e resgatar a proporção Teff/Treg. Notavelmente, os presentes inventores reconheceram que há uma bifurcação entre certos pacientes com câncer, por exemplo, uma população de pacientes com melanoma, com relação aos níveis de expressão LRRC33: um grupo exibe expressão elevada de LRRC33 (LRRC33high), enquanto o outro grupo exibe expressão relativamente baixa de LRRC33 (LRRC33low). Dessa forma, a invenção inclui a noção de que a população de pacientes LRRC33high pode representar aqueles que são poucos responsivos ou resistentes à imunoterapia com inibidor do ponto de verificação. Consequentemente, agentes que inibem LRRC33, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser particularmente benéficos para o tratamento de câncer como, por exemplo, melanoma, linfoma e distúrbios mieloproliferativos, que é resistente à terapia com inibidor do ponto de verificação (por exemplo, anti-PD-1).

[00640] Em algumas modalidades, o câncer/tumor é intrinsecamente resistente ou não responsivo a um inibidor do ponto de verificação imune (por exemplo, resistência primária). Apenas como exemplo, certos linfomas parecem pouco responsivos à inibição do ponto de verificação imune como, por exemplo, terapia anti-PD-1. Similarmente, um subconjunto da população de pacientes com melanoma sabidamente exibe resistência aos inibidores do ponto de verificação imune. Sem se prender a uma teoria em particular, os inventores da presente revelação contemplam que isso pode ser, pelo menos parcialmente, causado por supra-regulação de vias de sinalização de TGFβ1, o que pode criar um microambiente imunossupressor onde inibidores do ponto de verificação não exercem seus efeitos. A inibição de TGFβ1 pode tornar esse câncer mais responsivo à terapia com inibidor do ponto de verificação. Exemplos não limitantes dos tipos de câncer que podem ser beneficiar de uma combinação de um inibidor do ponto de verificação imune e um inibidor de TGFβ1 incluem: mielofibrose, melanoma, carcinoma de célula renal, câncer da bexiga, câncer do cólon, malignidades hematológicas, carcinoma de célula não-pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), linfoma (de Hodgkin clássico e não-Hodgkin), câncer da cabeça e pescoço, câncer urotelial, câncer com instabilidade microssatélite elevada, câncer com deficiência do reparo de erro de pareamento, câncer gástrico, câncer renal e câncer hepatocelular. No entanto, qualquer câncer (por exemplo, pacientes com esse câncer) no qual TGFβ1 está superexpresso ou é a isoforma dominante em relação a TGFβ2/3, como determinado, por exemplo, por biópsia, pode ser tratado com um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo de acordo com a presente revelação.

[00641] Em algumas modalidades, um câncer/tumor se torna resistente ao longo do tempo. Esse fenômeno é referido como resistência adquirida. Como a resistência primária, em algumas modalidades, a resistência adquirida é, pelo menos em parte, mediada por vias de TGFβ1-dependentes, e inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos descritos nesse relatório descritivo podem ser eficazes na restauração da imunidade anticâncer nesses casos. Os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para reduzir a recorrência de tumor. Os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para aumentar a durabilidade da terapia de câncer, por exemplo, CBT. O termo “durabilidade”, usado no contexto de terapias, se refere ao tempo entre os efeitos clínicos (por exemplo, controle tumoral) e recrescimento do tumor (por exemplo, recorrência). Presumivelmente, durabilidade e recorrência podem se correlacionar com resistência secundária ou adquirida, em que a terapia à qual o paciente inicialmente respondeu pára de funcionar. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para aumentar a duração de tempo na qual a terapia de câncer permanece eficaz. Os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência adquirida entre os responsivos à terapia. Os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para aumentar a sobrevida livre de progressão em pacientes.

[00642] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 da presente invenção podem ser usados para aumentar as taxas ou proporções de respostas completas versus respostas parciais entre os responsivos de uma terapia de câncer. Tipicamente, até mesmo em tipos de câncer nos quais as taxas de resposta a uma terapia de câncer (por exemplo, CBT) são relativamente altas (por exemplo, ≥ 35%), as taxas de CR são bem baixas. Os inibidores de TGFβ1 da presente invenção são usados, portanto, para aumentar a fração de responsivos completos dentro da população de responsivos.

[00643] Além disso, os inibidores também podem ser eficazes para intensificar ou aumentar o grau de respostas parciais entre os responsivos parciais.

[00644] Em algumas modalidades, a terapia combinada que compreende um inibidor do ponto de verificação imune e um inibidor de LRRC33 (por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo) pode ser eficaz para tratar esse câncer. Além disso, infiltrados de células altamente LRRC33- positivas em tumores, ou de algum outro modo locais/tecidos com proliferação celular anormal, podem servir como um biomarcador para imunossupressão do hospedeiro e resistência ao ponto de verificação imune. Similarmente, células T efetoras podem ser excluídas do nicho imunossupressor que limita a habilidade do corpo para combater o câncer. Além disso, como demonstrado na seção de Exemplos abaixo, Tregs que expressam TGFβ1 apresentado por GARP suprimem a proliferação de células T efetoras. Em conjunto, TGFβ1 é provavelmente um condutor crucial na geração e manutenção de um microambiente de doença inibidor imune (por exemplo, TME), e vários contextos de apresentação de TGFβ1 são relevantes para tumores. Em algumas modalidades, a terapia combinada pode obter proporções Teff/Treg mais favoráveis.

[00645] Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, que se ligam especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, como descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados em métodos para o tratamento de câncer em um indivíduo necessitado, o referido método compreendendo a administração do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, ao indivíduo, de modo que o câncer é tratado. Em certas modalidades, o câncer é câncer do cólon. Em certas modalidades, o câncer é melanoma. Em certas modalidades, o câncer é câncer da bexiga. Em certas modalidades, o câncer é câncer da cabeça e pescoço. Em certas modalidades, o câncer é câncer de pulmão.

[00646] Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, que se ligam especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, como descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados em métodos para o tratamento de tumores sólidos. Em algumas modalidades, tumores sólidos podem ser tumores desmoplásicos, que são tipicamente densos e duros para que moléculas terapêuticas penetrem. Ao visar o componente da ECM desses tumores, esses anticorpos podem “afrouxar” o tecido denso do tumor para que se desintegre, facilitando o acesso do produto terapêutico para exercer seus efeitos anticâncer. Dessa forma, produtos terapêuticos adicionais, tais como quaisquer fármacos antitumorais conhecidos, podem ser usados em combinação.

[00647] Adicionalmente ou alternativamente, anticorpos isoforma-específicos, contexto-independentes, ou fragmentos destes que são capazes de inibir a ativação de TGFβ1, por exemplo, aqueles revelados nesse relatório descritivo, podem ser usados em conjunto com a tecnologia de célula T de receptor de antígeno quimérico (“CAR-T”) como imunoterapia baseada em células, por exemplo, imunoterapia do câncer para o combate ao câncer.

[00648] Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, que se ligam especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, como descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados em métodos para inibição ou diminuição do crescimento de tumores sólidos em um indivíduo que possui um tumor sólido, o referido método compreendendo a administração do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, ao indivíduo, de modo que o crescimento de tumor sólido seja inibido ou diminuído. Em certas modalidades, o tumor sólido é um tumor de carcinoma do cólon. Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, úteis para o tratamento de um câncer é um inibidor isoforma-específico contexto-independente da ativação de TGFβ1. Em algumas modalidades, esses anticorpos visam um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e um complexo LRRC33-TGFβ1. Em algumas modalidades, esses anticorpos visam um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1- TGFβ1 e um complexo LTBP3-TGFβ1. Em algumas modalidades, esses anticorpos visam um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e um complexo LRRC33-TGFβ1. Em algumas modalidades, esses anticorpos visam um complexo GARP-TGFβ1 e um complexo LRRC33-TGFβ1.

[00649] A invenção inclui o uso de inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos contexto-independentes no tratamento de câncer, que compreende um tumor sólido em um indivíduo. Em algumas modalidades, esse inibidor de TGFβ1 isoforma- específico contexto-independente pode inibir a ativação de TGFβ1. Em modalidades preferidas, esse inibidor da ativação é um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga a um complexo pró-TGFβ1. A ligação pode ocorrer quando o complexo está associado com qualquer uma das moléculas apresentadoras, por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP ou LRRC33 inibindo, dessa forma, a liberação de fator de crescimento TGFβ1 maduro pelo complexo. Em algumas modalidades, o tumor sólido é caracterizado por ter estroma enriquecido com células T CD8+ que fazem contato direto com CAFs e fibras de colágeno. Esse tumor pode criar um ambiente imunossupressor que evita que células imunes antitumorais (por exemplo, células T efetoras) infiltrem eficazmente o tumor, limitando a habilidade do corpo para combater o câncer. Ao invés disso, essas células podem se acumular dentro ou perto do estroma tumoral. Essas características podem tornar esses tumores pouco responsivos a uma imunoterapia com inibidor do ponto de verificação. Como discutido em mais detalhe abaixo, os inibidores de TGFβ1 revelados nesse relatório descritivo podem desbloquear a supressão de modo a permitir que células efetoras alcancem e matem células de câncer, por exemplo, usadas em conjunto com um inibidor do ponto de verificação imune.

[00650] É contemplado que TGFβ1 desempenha papéis multifacetados em um microambiente tumoral, incluindo crescimento tumoral, supressão imune do hospedeiro, proliferação celular maligna, vascularidade, angiogênese, migração, invasão, metástase e quimiorresistência. Cada “contexto” de apresentação de TGFβ1 no ambiente pode, portanto, participar na regulação (ou desregulação) de progressão de doença. Por exemplo, o eixo de GARP é particularmente importante na resposta de Treg que regula a resposta de célula T efetora para mediação da resposta imune do hospedeiro para combater células de câncer. O eixo de LTBP1/3 pode regular a ECM, incluindo o estroma, onde fibroblastos associados ao câncer (CAFs) participam na patogênese e progressão do câncer. O eixo de LRRC33 pode desempenhar um papel crucial no recrutamento de monócitos circulantes para o microambiente tumoral, diferenciação subsequente em macrófagos associados a tumores (TAMs), infiltração no tecido tumoral e exacerbação da doença.

[00651] Em algumas modalidades, células que expressam TGFβ1 infiltram o tumor, criando ou contribuindo para um ambiente local imunossupressor. O grau pelo qual essa infiltração é observada pode se correlacionar com um prognóstico pior. Em algumas modalidades, uma infiltração maior é indicativa de resposta ao tratamento mais pobre a outra terapia de câncer, por exemplo, inibidores do ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, células que expressam TGFβ1 no microambiente tumoral compreendem células imunes imunossupressoras, por exemplo, Tregs e/ou células mielóides. Em algumas modalidades, as células mielóides incluem, sem limitação: macrófagos, monócitos (residentes no tecido ou derivados da medula óssea), e MDSCs.

[00652] Em algumas modalidades, células que expressam LRRC33 no TME são células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSCs). A infiltração de MDSC (por exemplo, infiltrado de tumor sólido) pode estar subjacente a pelo menos um mecanismo de escape imune, por criação de um nicho imunossupressor do qual as células imunes antitumorais do hospedeiro ficam excluídas. Evidências sugerem que MDSCs são mobilizadas por sinais associados à inflamação como, por exemplo, fatores inflamatórios associados ao tumor. Mediante mobilização, MDSCs podem influenciar efeitos imunossupressores por prejudicarem células que combatem doenças, por exemplo, células T CD8+ e células NK. Além disso, MDSCs podem induzir a diferenciação de Tregs por secreção de TGFβ e IL-10, que adicionalmente se somam aos efeitos imunossupressores. Dessa forma, um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode ser administrado a pacientes com evasão imune (por exemplo, vigilância imune comprometida) para restaurar ou reforçar a habilidade do corpo para combater a doença (por exemplo, tumor). Como descrito em mais detalhe nesse relatório descritivo, isso pode aumentar ainda mais (por exemplo, restaurar ou potencializar) a responsividade ou sensibilidade do corpo a outra terapia, por exemplo, terapia de câncer.

[00653] Em algumas modalidades, frequências elevadas (por exemplo, número) de MDSCs circulantes em pacientes são preditivas de baixa responsividade às terapias de bloqueio do ponto de verificação, por exemplo, antagonistas de PD-1 e antagonistas de PD-L1. Por exemplo, estudos de biomarcadores mostraram que células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSC) HLA-DR lo/CD14+/CD11b+ circulantes pré-tratamento estavam associadas com progressão e OS pior (p = 0,0001 e 0,0009). Além disso, a resistência ao bloqueio de PD-1 do ponto de verificação em carcinoma da cabeça e pescoço inflamado (HNC) se associa com expressão de marcadores de GM-CSF e células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSC). Essa observação sugeria que estratégias para depletar MDSCs, por exemplo, quimioterapia,

deve ser considerada em combinação ou sequencialmente com anti-PD-1. Complexos LRRC33 ou LRRC33-TGFβ representam um novo alvo para imunoterapia do câncer em função da expressão seletiva em células mielóides imunossupressoras. Portanto, sem se prender a uma teoria em particular, ter esse complexo como alvo pode aumentar a eficácia de terapias de padrão de cuidados com inibidor do ponto de verificação na população de pacientes.

[00654] A invenção, portanto, fornece o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico de alta afinidade descrito nesse relatório descritivo para o tratamento de câncer que compreende um tumor sólido. Esse tratamento compreende a administração do inibidor de TGFβ1 a um indivíduo diagnosticado com câncer que inclui pelo menos um tumor localizado (sólido tumor) em uma quantidade eficaz para tratar o câncer. De preferência, o indivíduo é adicionalmente tratado com uma terapia de câncer, por exemplo, CBT, quimioterapia e/ou radioterapia. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 aumenta a taxa/fração de uma população de pacientes responsivos primários à terapia de câncer. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 aumenta o grau de responsividade de responsivos primários à terapia de câncer. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 aumenta a proporção de responsivos completos para responsivos parciais à terapia de câncer. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 aumenta a durabilidade da terapia de câncer, de modo que a duração antes de recorrência e/ou antes que a terapia de câncer se torne ineficaz é prolongada. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 reduz ocorrências ou probabilidade de resistência adquirida à terapia de câncer entre responsivos primários.

[00655] Evidências sugerem que a progressão do câncer (por exemplo, proliferação/crescimento, invasão, angiogênese e metástase do tumor) pode ser, pelo menos em parte, dirigida pela interação tumor-estroma. Em particular, CAFs podem contribuir para esse processo por secreção de várias citocinas e fatores de crescimento e remodelagem da ECM. Fatores envolvidos no processo incluem, sem limitação, fator derivado de célula estromal 1 (SCD-1), MMP2, MMP9, MMP3, MMP-13, TNF-α, TGFβ1, VEGF, IL-6, M-CSF. Além disso, CAFs podem recrutar TAMs por secreção de fatores como, por exemplo, CCL2/MCP-1 e SDF-1/CXCL12 em um local de tumor; subsequentemente, é criado um nicho pró-TAM (por exemplo, áreas estromais enriquecidas em hialuronano) onde TAMs preferencialmente se aderem. Como foi sugerido que TGFβ1 promove a ativação de fibroblastos normais em CAFs do tipo miofibroblasto, a administração de um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode ser eficaz para se opor às atividades promotoras de câncer de CAFs. Na verdade, dados apresentados nesse relatório descritivo sugerem que um anticorpo isoforma-específico contexto- independente que bloqueia a ativação de TGFβ1 pode inibir a supra-regulação induzida por UUO de genes marcadores como, por exemplo, CCL2/MCP-1, α-SMA. FN1 e Col1, que também estão implicados em muitos cânceres.

[00656] Em certas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, que se ligam especificamente a um complexo GARP-pró-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, como descritos nesse relatório descritivo, são administrados a um indivíduo que possui câncer ou um tumor, isoladamente ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um antagonista anti-PD-1). Outras terapias combinadas que estão incluídas na invenção são a administração de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo, com radiação (radioterapia) ou um quimioterápico (quimioterapia). Agentes adicionais exemplares incluem, sem limitação, um antagonista de PD-1, um antagonista de PDL1, uma proteína de fusão de PD-L1 ou PDL2, um antagonista de CTLA4, um agonista de GITR, um anticorpo anti-ICOS, um anticorpo anti-ICOSL, um anticorpo anti-B7H3, um anticorpo anti-B7H4, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-LAG3, um anticorpo anti-OX40 (agonista de OX40), um anticorpo anti- CD27, um anticorpo anti-CD70, um anticorpo anti-CD47, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-CD20, um inibidor de CDK, um vírus oncolítico e um inibidor de PARP. Exemplos de vírus oncolíticos úteis incluem, adenovírus, reovírus, sarampo, herpes simples, vírus da doença de Newcastle, senecavírus, enterovírus e vaccínia. Em modalidades preferidas, o vírus oncolítico é modificado geneticamente para seletividade de tumor.

[00657] Em algumas modalidades, a determinação ou seleção da abordagem terapêutica para terapia combinada que se adequa a tipos de câncer ou população de pacientes particulares pode envolver o seguinte: a) considerações em relação aos tipos de câncer para os quais uma terapia de padrão de cuidados está disponível (por exemplo, indicações com imunoterapia aprovada); b) considerações em relação às subpopulações resistentes ao tratamento (por exemplo, tumores imuno-excluídos/frios); e c) considerações em relação a cânceres/tumores que são ou são geralmente suspeito de serem “via de TGFβ1-ativos” ou, de outro modo, pelo menos em parte TGFβ1-dependentes (por exemplo, sensíveis à inibição de TGFβ1). Por exemplo, muitas amostras de câncer mostram que TGFβ1 é a isoforma predominante por, por exemplo, análise TCGA RNAseq. Em algumas modalidades, mais de 50% (por exemplo, mais de 50%, 60%, 70%, 80% e 90%) de amostras de cada tipo de tumor são positivas para expressão da isoforma TGFβ1. Em algumas modalidades, os cânceres/tumores que são “via de TGFβ1-ativos” ou, de algum outro modo, pelo menos em parte TGFβ1-dependentes (por exemplo, sensíveis à inibição de TGFβ1) contêm pelo menos uma mutação em Ras, por exemplo, mutações em K-ras, N-ras e/ou H-ras. Em algumas modalidades, o câncer/tumor compreende pelo menos uma mutação em K-ras.

[00658] A confirmação da expressão de TGFβ1 em amostras clínicas coletadas de pacientes (por exemplo, amostras de biópsia) não é pré-requisito para a terapia com inibição de TGFβ1, quando a condição particular é geralmente sabidamente ou suspeita de envolver a via de TGFβ.

[00659] Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente é administrado em conjunto com uma terapia com inibidor do ponto de verificação aos pacientes diagnosticados com câncer para os quais uma ou mais terapias com inibidor do ponto de verificação são aprovadas ou se mostraram eficazes. Esses incluem, sem limitação: carcinoma urotelial da bexiga, carcinoma de célula escamosa (por exemplo, cabeça e pescoço), carcinoma de célula renal clara, carcinoma renal de célula papilar, carcinoma hepatocelular do fígado, adenocarcinoma pulmonar, melanoma cutâneo da pele e adenocarcinoma do estômago. Em modalidades preferidas, esses pacientes são pouco responsivos ou não responsivos à terapia com inibidor do ponto de verificação. Em algumas modalidades, a baixa responsividade é causada por resistência primária. Em algumas modalidades, o câncer que é resistente ao bloqueio do ponto de verificação mostra infra-regulação da expressão de TCF7. Em algumas modalidades, a infra-regulação de TCF7 no tumor resistente à inibição do ponto de verificação pode ser correlacionada com um número baixo de células T CD8+ intratumorais.

[00660] O inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente pode ser usado no tratamento de cânceres resistentes à quimioterapia ou radioterapia. Dessa forma, em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 isoforma- específico contexto-independente é administrado aos pacientes diagnosticados com câncer para o qual eles recebem ou receberam quimioterapia e/ou radioterapia. Em particular, o uso do inibidor de TGFβ1 é vantajoso quando o câncer (paciente) é resistente a essa terapia. Em algumas modalidades, esse câncer compreende células de câncer de propagação de tumor (TPCs) quiescentes, no qual a sinalização de TGFβ controla sua entrada reversível e um estado de crescimento interrompido, o que protege TPCs da quimioterapia ou radioterapia. É contemplado que, mediante inibição farmacológica de TGFβ1, TPCs comprometidas não entram em quiescência e, dessa forma, são tornadas suscetíveis à quimioterapia e/ou radioterapia. Esse câncer inclui vários carcinomas, por exemplo, carcinomas de célula escamosa. Veja, por exemplo, Brown e cols. (2017) “TGF-β- Induced Quiescence Mediates Chemoresistance of Tumor- Propagating Cells in Squamous Cell Carcinoma.” Cell Stem Cell. 21 (5): 650-664.

[00661] Em algumas modalidades, o câncer TGFβ1-positivo a ser tratado com o inibidor de TGFβ1 também é TGFβ3-positivo (ou seja, câncer TGFβ1+/ TGFβ3+), caracterizado pelo fato de que o tecido doente (por exemplo, tumor) co-expressa ambas as isoformas. Em algumas modalidades, esses tumores são codominantes com ambas as isoformas TGFβ1 e TGFβ3. Consequentemente, a invenção inclui o uso de inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo em conjunto com um inibidor de TGFβ3 isoforma-seletivo no tratamento dessas condições. Exemplos não limitantes de cânceres TGFβ1+/ TGFβ3+ incluem, sem limitação: carcinoma de mama (por exemplo, carcinoma invasivo da mama), colangiocarcinoma, glioblastoma multiforme, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, carcinoma de célula clara renal, carcinoma do pulmão de célula escamosa, mesotelioma, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma da próstata, sarcoma, timoma e carcinossarcoma uterino. Distúrbios mieloproliferativos / mielofibrose

[00662] A presente revelação fornece uso o terapêutico de inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, tais como aqueles revelados nesse relatório descritivo, no tratamento de distúrbios mieloproliferativos. Esses incluem, por exemplo, síndrome mielodisplásica (MDS) e mielofibrose (por exemplo, mielofibrose primária e mielofibrose secundária).

[00663] Mielofibrose, também conhecida como osteomielofibrose, é um distúrbio proliferativo da medula óssea relativamente raro (câncer), que pertence a um grupo de doenças denominadas distúrbios mieloproliferativos.

A mielofibrose é classificada no ramo de Filadélfia cromossomo-negativo (-) de neoplasias mieloproliferativas.

Mielofibrose é caracterizada por mieloproliferação clonal, produção aberrante de citocinas, hematopoiese extramedular e fibrose da medula óssea.

A proliferação de um clone anormal de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea e em outros locais e resulta em fibrose, ou na substituição da medula com tecido cicatricial.

O termo “mielofibrose”, salvo especificação em contrário, se refere à mielofibrose primária (PMF). Isso também pode ser referido como mielofibrose idiopática crônica (cIMF) (os termos “idiopática” e “primária” significam que, nesses casos, a doença é de origem desconhecida ou espontânea). Isso está em contraste com mielofibrose, que se desenvolve secundariamente à policitemia vera ou trombocitopenia essencial.

A mielofibrose é uma forma de metaplasia mielóide, que se refere a uma alteração no tipo de célula no tecido que forma o sangue da medula óssea, e frequentemente os dois termos são usados de forma sinônima.

Os termos metaplasia mielóide agnogênica e mielofibrose com metaplasia mielóide (MMM) também são usados para se referir à mielofibrose primária.

Em algumas modalidades, os distúrbios proliferativos hematológicos que podem ser tratados de acordo com a presente invenção incluem distúrbios mieloproliferativos, por exemplo, mielofibrose.

O denominado grupo “clássico” de distúrbios mieloproliferativos crônicos

BCR-ABL (Ph)-negativos inclui trombocitemia essencial (ET), policitemia vera (PV) e mielofibrose primária (PMF).

[00664] A mielofibrose rompe a produção normal de células sanguíneas do corpo. O resultado é cicatrização extensa na medula óssea, levando à anemia severa, fraqueza, fadiga e frequentemente a um baço aumentado. A produção de citocinas como, por exemplo, fator de crescimento de fibroblastos, pelo clone anormal de células hematopoiéticas (particularmente por megacariócitos) leva à substituição do tecido hematopoiético da medula óssea por tecido conjuntivo por meio de fibrose por colágeno. A diminuição no tecido hematopoiético prejudica a habilidade do paciente para gerar novas células sanguíneas, resultando em pancitopenia progressiva, uma diminuição de todos os tipos de células sanguíneas. No entanto, acredita-se que a proliferação de fibroblastos e a deposição de colágeno sejam um fenômeno secundário, e os fibroblastos propriamente ditos podem não ser parte do clone de células anormal.

[00665] A mielofibrose pode ser causada por células- tronco sanguíneas anormais na medula óssea. As células- tronco anormais produzem células maduras e pouco diferenciadas que crescem rapidamente e assumem a medula óssea, causando tanto fibrose (formação de tecido cicatricial) quanto inflamação crônica.

[00666] A mielofibrose primária está associada com mutações em Janus quinase 2 (JAK2), receptor de trombopoietina (MPL) e calreticulina (CALR), o que pode levar à ativação constitutiva da via de JAK-STAT, e ocorre cicatrização progressiva, ou fibrose, da medula óssea. Os pacientes podem desenvolver hematopoiese extramedular, ou seja, formação de células sanguíneas que ocorre em locais diferentes da medula óssea, na medida em que as células hematopoiéticas são forçadas a migrar para outras áreas, particularmente para o fígado e baço. Isso causa um aumento desses órgãos. No fígado, o tamanho anormal é denominado hepatomegalia. O aumento do baço é denominado esplenomegalia, que também contribui para causar pancitopenia, particularmente trombocitopenia e anemia. Outra complicação da hematopoiese extramedular é a poiquilocitose, ou a presença de células sanguíneas vermelhas com formato anormal.

[00667] O local principal de hematopoiese extramedular na mielofibrose é o baço, que normalmente está acentuadamente aumentado em pacientes que sofrem de mielofibrose. Como resultado do aumento acentuado do baço, frequentemente ocorrem múltiplos infartos subcapsulares no baço, o que significa que, em função do fornecimento de oxigênio interrompido para o baço, ocorre morte parcial ou completa de tecido. No nível celular, o baço contém precursores de células sanguíneas vermelhas, precursores de granulócitos e megacariócitos, com os megacariócitos proeminentes em seu número e em seus formatos anormais. Megacariócitos podem estar envolvidos na produção da fibrose secundária observada nessa condição.

[00668] Foi sugerido que TGFβ pode estar envolvido no aspecto fibrótico da patogênese da mielofibrose (veja, por exemplo, Agarwal e cols., “Bone Marrow Fibrosis in Primary Myelofibrosis: Pathogenic Mechanisms and the Role of TGFβ” (2016) Stem Cell Investig. 3:5). A patologia da medula óssea na mielofibrose primária é caracterizada por fibrose,

neoangiogênese e osteoesclerose, e a fibrose está associada a um aumento na produção de colágenos depositados na ECM.

[00669] Foram descritos diversos biomarcadores, cujas variações são indicativas ou se correlacionam com a doença. Em algumas modalidades, os biomarcadores são marcadores celulares. Esses biomarcadores associados à doença são úteis para o diagnóstico e/ou monitoramento da progressão da doença, bem como da eficácia da terapia (por exemplo, responsividade dos pacientes à terapia). Esses biomarcadores incluem diversos marcadores fibróticos, bem como marcadores celulares. No câncer de pulmão, por exemplo, relata-se que as concentrações de TGFβ1 no fluido de lavagens broncoalveolares (BAL) este significantemente maiores em pacientes com câncer de pulmão, comparados com pacientes com doenças benignas (um aumento de aproximadamente 2 vezes), o que também pode servir como um biomarcador para diagnóstico e/ou monitoramento da progressão ou do tratamento dos efeitos do câncer de pulmão.

[00670] Como a mielofibrose primária está associada ao desenvolvimento de megacariócito anormal, certos marcadores celulares de megacariócitos, bem como seus progenitores da linhagem da célula-tronco, podem servir como marcadores para diagnosticar e/ou monitorar a progressão da doença, bem como a eficácia da terapia. Em algumas modalidades, marcadores úteis incluem, sem limitação: marcadores celulares de megacariócitos diferenciados (por exemplo, CD41, CD42 e Tpo R), marcadores celulares de células progenitoras eritróides de megacariócitos (por exemplo, CD34, CD38, e CD45RA-), marcadores celulares de células progenitoras mielóides comuns (por exemplo, IL-3α/CD127, CD34, SCF R/c-kit e Flt-

3/Flk-2), e marcadores celulares de células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, CD34, CD38-, Flt-3/Flk-2). Em algumas modalidades, biomarcadores úteis incluem marcadores fibróticos. Esses incluem, sem limitação: TGFβ1, PAI-1 (também conhecido como Serpina 1), MCP-1 (também conhecido como CCL2), Col1a1, Col3a1, FN1, CTGF, α-SMA, ACTA2, Timp1, Mmp8 e Mmp9. Em algumas modalidades, biomarcadores úteis são marcadores séricos (por exemplo, proteínas ou fragmentos encontrados e detectados em amostras de soro).

[00671] Com base no achado de que TGFβ é um componente do nicho da medula óssea leucêmica, é contemplado que o direcionamento ao microambiente da medula óssea de inibidores de TGFβ pode ser uma abordagem promissora para reduzir células leucêmicas que expressam moléculas apresentadoras que regulam a disponibilidade local de TGFβ no tecido afetado.

[00672] Na verdade, em função da natureza multifacetada da patologia que se manifesta na desregulação TGFβ- dependente em aspectos tanto mieloproliferativos quanto fibróticos (como o próprio termo “mielofibrose” sugere), inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, contexto- independentes, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem fornecer efeitos terapêuticos particularmente vantajosos para pacientes que sofrem de mielofibrose. É contemplado que o braço de LTBP desse inibidor pode visar o complexo de TGFβ1 associado à ECM na medula óssea, enquanto o braço de LRRC33 do inibidor pode bloquear TGFβ1 associado à célula mielóide. Além disso, a biologia anormal de megacariócitos associada à mielofibrose pode envolver atividades de TGFβ1 mediadas tanto por GARP quanto por LTBP. O inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente é capaz de visar esses complexos inibindo, dessa forma, a liberação de TGFβ1 ativo no nicho.

[00673] Dessa forma, esses inibidores de TGFβ1 são úteis para o tratamento de pacientes com mielofibrose primária e secundária, que tiveram uma resposta inadequada ou são intolerantes a outros tratamentos (ou ao padrão de cuidados), por exemplo, hidroxiuréia e inibidores de JAK. Esses inibidores também são úteis para o tratamento de pacientes com mielofibrose (MF) intermediária ou de alto risco, incluindo MF primária, MF pós-policitemia vera e MF pós- trombocitemia essencial.

[00674] Consequentemente, um aspecto da invenção está relacionado aos métodos para o tratamento de mielofibrose primária. O método compreende a administração a um paciente que sofre de mielofibrose primária de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um inibidor de TGFβ que causa disponibilidade de TGFβ reduzida. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal inibidor da ativação de TGFβ1 isoforma-específico, contexto- independente, é administrado aos pacientes com mielofibrose. Esse anticorpo pode ser administrado em dosagens que variam entre 0,1 e 100 mg/kg, por exemplo, entre 1 e 30 mg, por exemplo, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg etc. Por exemplo, regimes de dosagem adequados incluem entre 1-30 mg/kg administrados semanalmente. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 é dosado a cerca de 10 mg/kg por semana. Opcionalmente, a frequência de administração pode ser ajustada após a fase inicial, por exemplo, de cerca de uma vez por semana (durante uma fase inicial) até uma vez por mês (durante uma fase de manutenção).

[00675] Vias de administração preferidas de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo é a administração intravenosa ou subcutânea. Quando a composição é administrada por via intravenosa, o paciente pode receber o produto terapêutico ao longo de uma duração de tempo adequada, por exemplo, aproximadamente 30-120 minutos (por exemplo, 30 min, 60 min, 75 min, 90 min e 120 min), por tratamento, e depois repetida a cada várias semanas, por exemplo, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas etc., por um total de vários ciclos, por exemplo, 4 ciclos, 6 ciclos, 8 ciclos, 10 ciclos, 12 ciclos etc. Em algumas modalidades, os pacientes são tratados com uma composição que compreende o anticorpo inibidor em um nível dose de 1-10 mg/kg (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg por dosagem) por meio de administração intravenosa a cada 28 dias (4 semanas) por 6 ciclos ou 12 ciclos. Em algumas modalidades, esse tratamento é administrado como uma terapia crônica (de longo prazo) (por exemplo, para ser continuada indefinidamente, desde que considerada benéfica), ao invés de suspender após um número definido de ciclos de administração.

[00676] Embora a mielofibrose seja considerada um tipo de leucemia, ela é caracterizada pela manifestação de fibrose. Como TGFβ sabidamente regula aspectos da homeostasia da ECM, cuja desregulação pode levar à fibrose tecidual, é desejável inibir atividades de TGFβ associadas à ECM. Consequentemente, anticorpos ou fragmentos destes que se ligam e inibem pró-TGFβ apresentado por LTBPs (por exemplo, LTBP1 e LTBP3) são englobados por essa invenção. Em algumas modalidades, anticorpos ou fragmentos destes adequados ao tratamento de mielofibrose são “contexto- independentes”, na medida em que podem se ligar a múltiplos contextos do complexo de pró-TGFβ, tais como aqueles associados com LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, esse anticorpo é um inibidor da ativação de TGFβ contexto-independente, caracterizado pelo fato de que o anticorpo pode se ligar e inibir qualquer um dos seguintes complexos latentes: LTBP1- pró-TGFβ, LTBP3-pró-TGFβ, GARP-pró-TGFβ e LRRC33-pró-TGFβ. Em algumas modalidades, um anticorpo desse tipo é um anticorpo isoforma-específico que se liga e inibe esses complexos latentes que compreendem uma, mas não as outras isoformas de TGFβ. Esses incluem, por exemplo, LTBP1-pró- TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1. Em algumas modalidades, esse anticorpo e um anticorpo isoforma-seletivo que preferencialmente se liga com alta afinidade e inibe a sinalização de TGFβ1.

[00677] Dados in vivo iniciais indicam que um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo contexto-independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode ser usado para tratar mielofibrose em um modelo murídeo traduzível de mielofibrose primária. Diferentemente do padrão de cuidados atual, inibidor de JAK2, que só fornece alívio sintomático, mas não fornece benefícios clínicos ou de sobrevida, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo contexto-independente obtém efeitos antifibróticos significantes na medula óssea dos camundongos doentes e também pode prolongar a sobrevida, dando suporte à noção de que o inibidor de TGFβ1 pode ser eficaz para tratar distúrbios mieloproliferativos em pacientes humanos.

[00678] Populações de pacientes de neoplasias mieloproliferativas adequadas que podem ser tratadas com as composições e métodos descritos nesse relatório descritivo podem incluir, sem limitação: a) uma população de pacientes que é Philadelphia (+); b) uma população de pacientes que é Philadelphia (-); c) uma população de pacientes que é categorizada como “clássica” (PV, ET e PMF); d) uma população de pacientes que carrega a mutação JAK2V617F(+); e) uma população de pacientes que carrega JAK2V617F(-); f) uma população de pacientes com éxon JAK2 12(+); g) uma população de pacientes com MPL(+); e h) uma população de pacientes com CALR(+).

[00679] Em algumas modalidades, a população de pacientes inclui pacientes com mielofibrose intermediária-2 ou de alto risco. Em algumas modalidades, a população de pacientes compreende indivíduos com mielofibrose que são refratários ou não candidatos à terapia disponível. Em algumas modalidades, o indivíduo possui contagens de plaquetas entre 100-200 x 109/l. Em algumas modalidades, o indivíduo possui contagens de plaquetas > 200 x 109/l antes de receber o tratamento.

[00680] Em algumas modalidades, um indivíduo para receber a administração (e que pode se beneficiar da administração) de uma terapia com inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente é diagnosticado com mielofibrose primária (PMF) intermediária-1 ou superior, ou mielofibrose essencial pós-policitemia vera/trombocitemia (MF pós-PV/ET). Em algumas modalidades, o indivíduo possui fibrose documentada da medula óssea antes do tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo possui MF-2 ou superior, como avaliada pela pontuação de graduação de consenso européia e grau 3 ou superior pela escala de Bauermeister modificada antes do tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo possui o estado de desempenho da ECOG de 1 antes do tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo possui contagem de leucócitos (109/l) que varia entre 5 e 120 antes do tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo possui a carga do alelo JAK2V617F que varia entre 10-100%.

[00681] Em algumas modalidades, um indivíduo para receber a administração (e que pode se beneficiar da administração) de uma terapia com inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente é transfusão-dependente (antes do tratamento), caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui uma história de pelo menos duas unidades de transfusões de células sanguíneas vermelhas no último mês para um nível de hemoglobina menor do que 8,5 g/dl que não está associado com sangramento clinicamente manifesto.

[00682] Em algumas modalidades, um indivíduo para receber a administração (e que pode se beneficiar da administração) de uma terapia com inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente recebeu previamente uma terapia para tratar mielofibrose. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado com uma ou mais terapias incluindo, sem limitação: AZD1480, panobinostat, EPO, IFNα, hidroxiuréia, interferon peguilado, talidomida, prednisona e inibidor de JAK2 (por exemplo, Lestaurtinib, CEP-701).

[00683] Em algumas modalidades, o paciente possui hematopoiese extramedular. Em algumas modalidades, a hematopoiese extramedular é no fígado, pulmão, baço e/ou linfonodos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada localmente a um ou mais dos locais localizados de manifestação da doença.

[00684] O inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente é administrado aos pacientes em uma quantidade eficaz para tratar mielofibrose. A quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para aliviar um ou mais sintomas e/ou complicações de mielofibrose em pacientes incluindo, sem limitação: deposição excessiva de ECM no estroma da medula óssea (fibrose da medula óssea), neoangiogênese, osteoesclerose, esplenomegalia, hepatomegalia, anemia, sangramento, dor óssea e outra morbidade relacionada aos ossos, hematopoiese extramedular, trombocitose, leucopenia, caquexia, infecções, trombose e morte. Dessa forma, terapias com inibição de TGFβ1 que compreendem os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da revelação podem obter benefícios clínicos, que incluem, inter alia, efeitos antifibróticos e/ou normalização de contagens de células sanguíneas. Essa terapia pode prolongar a sobrevida e/ou reduzir a necessidade por transplante de medula óssea.

[00685] Em algumas modalidades, a quantidade é eficaz para reduzir a expressão e/ou secreção de TGFβ1 (por exemplo, de células megacariocíticas) em pacientes. Esse inibidor pode, portanto, reduzir os níveis de mRNA de TGFβ1 em pacientes tratados. Em algumas modalidades, esse inibidor reduz os níveis de mRNA de TGFβ1 na medula óssea, por exemplo, em células mononucleares. Os pacientes com PMF tipicamente exibem níveis plasmáticos de TGFβ1 elevados acima de aproximadamente 2.500 pg/mL, por exemplo, acima de

3.000, 3,500, 4.000, 4,500, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 e 10.000 pg/mL (em contraste com faixas normais de aproximadamente 600-2.000 pg/mL, como medidas por ELISA) (veja, por exemplo, Mascaremhas e cols. (Leukemia & Lymphoma, 2014, 55 (2): 450-452)). Zingariello (Blood, 2013, 121 (17):

3.345-3.363) quantificaram os teores de TGFβ1 bioativo e total no plasma de pacientes com PMF e em indivíduos de controle. De acordo com essa referência, o TGFβ1 bioativo mediano em pacientes com PMF foi de 43 ng/mL (variando entre 4-218 ng/mL) e TGFβ1 total foi de 153 ng/mL (32-1.000 ng/mL), enquanto nas contrapartes de controle, os valores foram de 18 (0,05-144) e 52 (8-860), respectivamente. Dessa forma, com base nesses relatos, os teores plasmáticos de TGFβ1 em pacientes com PMF estão elevados por várias vezes, por exemplo, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes etc., quando comparados com amostras de plasma de controle ou saudáveis. O tratamento com o inibidor, por exemplo, após 4-12 ciclos de administração (por exemplo, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ciclos) ou tratamento crônico ou de longo prazo, por exemplo, a cada 4 semanas, na dosagem de 0,1-100 mg/kg, por exemplo, 1-30 mg/kg de anticorpo monoclonal) descrito nesse relatório descritivo pode reduzir os níveis plasmáticos de TGFβ1 por pelo menos 10% em relação ao nível de base correspondente (pré- tratamento), por exemplo, pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% e 50%.

[00686] Alguns dos efeitos terapêuticos podem ser observados de forma relativamente rápida após o início do tratamento, por exemplo, após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas,

4 semanas, 5 semanas ou 6 semanas. Por exemplo, o inibidor pode aumentar eficazmente o número de células-tronco e/ou de células precursoras dentro da medula óssea de pacientes tratados com o inibidor dentro de 1-8 semanas. Essas incluem células-tronco hematopoiéticas e células precursoras sanguíneas. Uma biópsia da medula óssea pode ser realizada para avaliar alterações nas frequências/número de células da medula. De forma correspondente, o paciente pode exibir sintomas melhorados como, por exemplo, dor óssea e fadiga.

[00687] Indivíduos que sofrem de um distúrbio mieloproliferativo (por exemplo, mielofibrose) podem manifestar um nível elevado de contagens de células sanguíneas brancas (por exemplo, leucêmicas). Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de TGFβ1 é uma quantidade que é eficaz para normalizar as contagens de células sanguíneas. Em algumas modalidades, a quantidade é eficaz para reduzir as contagens de células brancas totais no indivíduo, comparado com pré- tratamento. Em algumas modalidades, a quantidade é eficaz para reduzir contagens de plaquetas totais no indivíduo, comparado com pré-tratamento. Em algumas modalidades, a quantidade é eficaz para aumentar (por exemplo, normalizar ou restaurar) os níveis de hemoglobina no indivíduo, comparado com pré-tratamento. Em algumas modalidades, a quantidade é eficaz para aumentar (por exemplo, normalizar ou restaurar) os níveis de hematócrito no indivíduo, comparado com pré-tratamento.

[00688] Uma das marcas registradas morfológicas típicas de mielofibrose é a fibrose na medula óssea (por exemplo, no estroma da medula) caracterizada, em parte, por ECM aberrante. Em algumas modalidades, a quantidade é eficaz para reduzir deposição de colágeno excessiva, por exemplo, por células estromais mesenquimais. Em algumas modalidades, o inibidor é eficaz para reduzir o número de células CD41- positivas, por exemplo, megacariócitos, em indivíduos tratados, comparados com indivíduos de controle que não recebem o tratamento. Em algumas modalidades, as frequências no nível de base de megacariócitos na medula óssea com PMF podem variar entre 200-700 células por milímetro quadrado (mm2), e entre 40-300 megacariócitos por milímetro quadrado (mm2) no baço com PMF, como determinado com cortes escolhidos aleatoriamente. Em contraste, as frequências de megacariócitos na medula óssea e baço de doadores normais não menores do que 140 e menores do que 10, respectivamente. O tratamento com o inibidor pode reduzir o número (por exemplo, frequências) de megacariócitos na medula óssea e/ou no baço. Em algumas modalidades, os tratamentos com o inibidor podem causar níveis reduzidos de sinalização efetora a jusante, por exemplo, fosforilação de SMAD2/3. Em algumas modalidades, o inibidor é eficaz para reduzir os níveis de expressão de marcadores fibróticos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo.

[00689] Pacientes com mielofibrose podem sofrer de baço aumentado. Dessa forma, os efeitos clínicos de um produto terapêutico podem ser avaliados monitorando-se as alterações no tamanho do baço. O tamanho do baço pode ser examinado por técnicas conhecidas, por exemplo, avaliação do comprimento do baço por palpação e/ou avaliação do volume do baço por ultra-som. Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado com um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-

independente possui um comprimento do baço no nível de base (antes do tratamento) de 5 cm ou maior, por exemplo, variando entre 5 e 30 cm, como avaliado por palpação.

Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado com um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente possui um volume do baço no nível de base (antes do tratamento) de 300 ml ou maior, por exemplo, variando entre 300-1.500 ml, como avaliado por ultra-som.

O tratamento com o inibidor, por exemplo, após 4-12 ciclos de administração (por exemplo, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ciclos), por exemplo, a cada 4 semanas, na dosagem de 0,1-30 mg/kg de anticorpo monoclonal) descrito nesse relatório descritivo pode reduzir o tamanho do baço no indivíduo.

Em algumas modalidades, a quantidade eficaz do inibidor é suficiente para reduzir o tamanho do baço em uma população de pacientes que recebe o tratamento com inibidor por pelo menos 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 50% e 60%, em relação aos valores no nível de base correspondentes.

Por exemplo, o tratamento é eficaz para obter uma redução ≥ 35% no volume do baço desde o nível de base em 12-24 semanas, como medido por MRI (imageamento por ressonância nuclear magnética) ou varredura por TC (tomografia computadorizada), comparado com controle de placebo.

Em algumas modalidades, o tratamento é eficaz para obter uma redução ≥ 35% no volume do baço desde o nível de base em 24-48 semanas, como medido por MRI ou varredura por TC, comparado com a melhor terapia de controle disponível.

A melhor terapia disponível pode incluir hidroxiuréia, glicocorticóides, bem como nenhuma medicação, anagrelida, epoetina alfa, talidomida, lenalidomida, mercaptopurina, tioguanina, danazol, peginterferon alfa-2a, interferon-α, melfalan, ácido acetilsalicílico, citarabina e colchicina.

[00690] Em algumas modalidades, uma população de pacientes tratados com um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico contexto-independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, mostra uma resposta ao tratamento estatisticamente aumentada, como avaliado, por exemplo, pelos critérios do “International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment” (IWG-MRT), grau de alteração no grau de fibrose da medula óssea medido pela escala de Bauermeister modificada e pelo “European Consensus Grading System” após tratamento (por exemplo, 4, 6, 8 ou 12 ciclos), a resposta de sintomas usando o “Myeloproliferative Neoplasm Symptom Assessment Form” (MPN-SAF).

[00691] Em algumas modalidades, o tratamento com um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, obtém uma resposta ao tratamento estatisticamente aumentada, como avaliado, por exemplo, pelo “Myelofibrosis Symptom Assessment Form” (MFSAF) modificado, no qual os sintomas são medidos pela ferramenta MFSAF (por exemplo, Versão 2.0), um diário que captura os sintomas debilitantes de mielofibrose (desconforto abdominal, saciedade precoce, dor sob o gradil costal esquerdo, prurido, suores noturnos e dor óssea/muscular) usando uma escala de 0 a 10, em que 0 é ausente e 10 é a pior imaginável. Em algumas modalidades, o tratamento é eficaz para obter uma redução ≥ 50% na pontuação total de total MFSAF desde o nível de base em, por exemplo, 12-24 semanas. Em algumas modalidades, uma fração significante de pacientes que recebem a terapia obtém uma melhora de ≥ 50% na Pontuação Total de Sintomas, comparados com pacientes que recebem placebo. Por exemplo, a fração do pool de pacientes para obter ≥ 50% de melhora pode ser de mais de 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80%.

[00692] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor é uma quantidade suficiente para obter melhora clínica, como avaliada por uma resposta da anemia. Por exemplo, uma resposta da anemia melhorada pode incluir durações mais longas de independência de transfusão, por exemplo, 8 semanas ou mais, após o tratamento de 4-12 ciclos, por exemplo, 6 ciclos.

[00693] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor é uma quantidade suficiente para manter doença estável por uma duração de tempo, por exemplo, 6 semanas, 8 semanas, 12 semanas, seis meses etc. Em algumas modalidades, a progressão da doença pode ser avaliada por alterações na celularidade global da medula óssea, pelo grau de fibrose de reticulina ou colágeno, e/ou a alteração na carga do alelo JAK2V617F.

[00694] Em algumas modalidades, uma população de pacientes tratados com um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico contexto-independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, mostra sobrevida estatisticamente aumentada (prolongada), comparada com uma população de controle que não recebe o tratamento. Por exemplo, em grupos de controle, a sobrevida mediana de pacientes com PMF é de aproximadamente seis anos (aproximadamente 16 meses em pacientes de alto risco), e espera-se que menos de 20% dos pacientes sobrevivam 10 anos ou mais pós-diagnóstico. O tratamento com o inibidor de TGFβ1 isoforma-específico contexto-independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode prolongar o tempo de sobrevida por pelo menos 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses, 36 meses ou 48 meses. Em algumas modalidades, o tratamento é eficaz para obter sobrevida global aumentada em 26 semanas, 52 semanas, 78 semanas, 104 semanas, 130 semanas, 144 semanas ou 156 semanas, comparado com pacientes que recebem placebo.

[00695] Os benefícios clínicos da terapia, tais como aqueles exemplificados acima, podem ser observados em pacientes com ou sem anemia de surgimento recente.

[00696] Uma das características vantajosas dos inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, contexto- independentes, é que eles mantêm perfis de segurança aprimorados gerados pela seletividade de isoforma, quando comparados com antagonistas de TGFβ convencionais que não possuem a seletividade. Portanto, antecipa-se que o tratamento com um inibidor isoforma-específico, contexto- independente, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, possa reduzir eventos adversos em uma população de pacientes, em comparação com populações de pacientes equivalentes tratadas com antagonistas de TGFβ convencionais, com relação à frequência e/ou gravidade desses eventos. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, contexto-independentes, podem fornecer uma janela terapêutica maior quanto à dosagem e/ou duração de tratamento.

[00697] Os eventos adversos podem ser graduados por métodos adequados reconhecidos na técnica, por exemplo, “Common Terminology Criteria for Adverse Events” (CTCAE), versão 4. Eventos adversos relatados previamente em pacientes humanos que receberam antagonistas de TGFβ, por exemplo, GC1008, incluem: leucocitose (grau 3), fadiga (grau 3), hipóxia (grau 3), assistolia (grau 5), leucopenia (grau 1), lesões nodulares eritematosas da pele recorrentes, transitórias, sensíveis, dermatite supurativa e herpes zoster.

[00698] A terapia com inibidor de TGFβ1 isoforma- específico contexto-independente pode causar eventos adversos (efeitos colaterais) menos frequentes e/ou menos severos, comparada com a terapia com inibidor de JAK em pacientes com mielofibrose, com relação, por exemplo, à anemia, trombocitopenia, neutropenia, hipercolesterolemia, alanina transaminase (ALT) elevada, aspartato transaminase (AST) elevada, contusões, tonteiras e dor de cabeça oferecendo, dessa forma, uma opção de tratamento mais segura.

[00699] É contemplado que os inibidores da sinalização de TGFβ1 podem ser usados em conjunto com um ou mais produtos terapêuticos para o tratamento de mielofibrose como uma terapia combinada (por exemplo, “suplementar”). Em algumas modalidades, um inibidor da ativação de TGFβ1 descrito nesse relatório descritivo é administrado aos pacientes que sofrem de mielofibrose, que receberam um inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de JAK1/JAK2. Em algumas modalidades, esses pacientes são responsivos à terapia com inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de inibidor de JAK1/JAK2, enquanto, em outras modalidades, esses pacientes são pouco responsivos ou não responsivos à terapia com inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de JAK1/JAK2. Em algumas modalidades, o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico descrito nesse relatório descritivo pode tornar aqueles que são pouco responsivos ou não responsivos à terapia com inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de JAK1/JAK2 mais responsivos. Em algumas modalidades, o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico descrito nesse relatório descritivo pode permitir dosagem reduzida do inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de JAK1/JAK2, que ainda produz eficácia ou benefícios clínicos equivalentes ou significativos em pacientes, mas menos ou graus menores de toxicidades ou eventos adversos relacionados ao fármaco (por exemplo, aqueles listados acima). Em algumas modalidades, o tratamento com o inibidor da ativação de TGFβ1 descrito nesse relatório descritivo usado em conjunto com terapia com inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de inibidor de JAK1/JAK2 pode produzir efeitos terapêuticos sinérgicos ou aditivos nos pacientes. Em algumas modalidades, o tratamento com o inibidor da ativação de TGFβ1 descrito nesse relatório descritivo pode reforçar os benefícios da terapia com inibidor de JAK1, inibidor de JAK2 ou inibidor de JAK1/JAK2 ou outra terapia dada para tratar mielofibrose. Em algumas modalidades, os pacientes podem adicionalmente receber um produto terapêutico para tratar a anemia associada à mielofibrose. Condições fibróticas

[00700] Em resposta à lesão tecidual em decorrência de dano físico/trauma, substâncias tóxicas, e/ou infecção, começa um processo reparador natural que envolve vários tipos de células, incluindo fibroblastos, vários tipos diferentes de células imunes, e células epiteliais e endoteliais residentes. No entanto, se deixado sem controle, esse processo pode levar ao acúmulo excessivo de matriz extracelular (ECM) e fibrose, o que, por sua vez, pode levar à perda progressiva da função do tecido e falência do órgão (Caja e cols., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).

[00701] A fibrose pode ocorrer em diversos órgãos, incluindo pulmão, rim, fígado, coração e pele. Independente do órgão, a resposta fibrótica é caracterizada por inflamação, interações epitelial-mesenquimal alterada e proliferação de fibroblastos. Uma das marcas registradas da fibrose é a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos, que contribui acentuadamente para a desregulação da ECM. No entanto, também foi proposto que miofibroblastos vêm de outras fontes celulares (por exemplo, células endoteliais, células epiteliais e células-tronco mesenquimais (Kim, K.K. e cols., Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2017; Okabe, H. Histol. Histophathol., 2016, 31, 141- 148; e Li, C e cols., Nat. Commun., 2016, 7, 11455 e). Além disso, células imunes desempenham um papel importante no processo por secreção de citocinas e quimiocinas que promovem a diferenciação de miofibroblastos, estimulam a deposição de ECM e recrutam células imunes adicionais para o tecido danificado (Caja e cols., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).

[00702] Similar ao tecido fibrótico, a ativação de fibroblastos associados ao câncer pode ocorrer no ambiente tumoral, que produz quantidades excessivas de ECM. A ECM fornece um arcabouço para a infiltração de outras células (por exemplo, células imunes pró-tumorigênicas) e um substrato para migração celular. Em outros casos, ECM excessiva pode atuar como uma barreira contra células imunes antitumorigênicas.

[00703] TGFβ é reconhecido como o orquestrador central da resposta fibrótica. TGFβ pode promover diferenciação de miofibroblastos, recrutar células imunes e afetar a diferenciação das células epiteliais e endoteliais. Particularmente, TGFβ supra-regula a produção de ECM e proteínas da membrana basal, por exemplo, fibronectina, colágeno, laminina, osteopontina, tenascina, elastina, decorina. A diferenciação de miofibroblastos induzida por TGFβ pode levar à deposição adicional de proteínas da ECM, secreção de metaloproteinases da matriz (MMPs) e proliferação de miofibroblastos (Fabregat e cols., FEBS J. 2016, 283, 2.219-2.232; Meng e cols., Nat. Rev. Nephrol. 2016, 12, 325-338; e Kulkarni e cols., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2016, 54, 751-760). Adicionalmente, TGFβ medeia alterações fenotípicas que afetam proteínas contráteis e colágeno I em células vasculares de músculo liso (VSCM), e pode ativar miofibroblastos e outras células estromais para aumentar a síntese de proteínas de reticulação de colágeno, por exemplo, lisil oxidase (LOX) da família de enzimas de remodelagem da matriz (Busnadiego e cols., Mol. Cell. Biol. 2013, 33, 2.388-2.401). Além disso, foi demonstrado que TGFβ regula tanto EMT quanto EndMT, o que contribui para a diferenciação de tipos de células pró-fibróticas, por exemplo, miofibroblastos e CAFs. Além disso, foi demonstrado que TGFβ induz apoptose epitelial, o que pode promover fibrose do pulmão e fígado, entre outros tecidos (Barbas- Filho e cols., J. Clin. Pathol. 2001, 54, 132-138; e Wang e cols., Dev. Dyn. 2017, 247, 492-508).

[00704] Sejam eles inatos ou recrutados, os macrófagos desempenham um papel importante na resposta ao reparo e dano teciduais. No entanto, mediante certos sinais, eles podem se tornar pró-fibróticos. Foi demonstrado que TGFβ, entre outras citocinas, ativa macrófagos M2, que são pró- inflamatórios. Mediante ativação, esses macrófagos secretam suas próprias citocinas, incluindo TGFβ, componentes da ECM, fatores angiogênicos e fatores quimiotáticos. Foi constatado que macrófagos M2 são essenciais para a fibrose pulmonar dirigida por TGFβ (Murray e cols., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, 43, 154-162).

[00705] Dessa forma, de acordo com a invenção, inibidores TGFβ1 isoforma-específicos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, são usados no tratamento de fibrose (por exemplo, indicações fibróticas, condições fibróticas) em um indivíduo. Inibidores adequados para a realização da presente invenção incluem anticorpos e/ou composições de acordo com a presente revelação que podem ser úteis para alteração ou melhora de fibrose. Mais especificamente, esses anticorpos e/ou composições são antagonistas seletivos de TGFβ1 que são capazes de visar TGFβ1 apresentado por vários tipos de moléculas apresentadoras.

[00706] Anticorpos que visam TGFβ diminuem fibrose em numerosos modelos pré-clínicos. Esses anticorpos e/ou compostos à base de anticorpo incluem LY2382770 (Eli Lilly, Indianapolis, IN). Também são incluídos aqueles descritos nas Patentes U.S. Números US 6.492.497, US 7.151.169, US

7.723.486 e Publicação de Pedido U.S. Nº 2011/0008364, cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Antagonistas de TGFβ da técnica estabelecida incluem, por exemplo, agentes que visam e bloqueiam a ativação de TGFβ integrina-dependente.

[00707] No entanto, evidências sugerem que esses agentes da técnica estabelecida podem não mediar a inibição isoforma- específica e podem causar efeitos indesejados por bloquearem inadvertidamente a função normal de TGFβ2 e/ou TGFβ3. Na verdade, o Requerente observou previamente que tecidos pulmonares normais (não doentes) contêm níveis relativamente baixos, mas mensuráveis, de TGFβ2 e TGFβ3, mas notavelmente menos TGFβ1. Em comparação, em certas condições de doença como, por exemplo, fibrose, TGFβ1 se torna preferencialmente supra-regulado em relação às outras isoformas (WO 2018/129329). De preferência, antagonistas de TGFβ para uso no tratamento dessas condições exercem suas atividades inibidoras somente contra a isoforma induzida na doença ou associada à doença preservando, ao mesmo tempo, a função das outras isoformas que são normalmente expressas para mediar a sinalização tônica no tecido.

Os inibidores da técnica estabelecida (LY2109761, um antagonista do receptor de TGFβ de pequena molécula, e um anticorpo monoclonal que visa integrina αVβ6) inibem, ambos, a sinalização tônica de TGFβ a jusante em BAL de rato não doente, despertando a possibilidade de que esses inibidores possam causar efeitos colaterais indesejados.

Alternativamente ou adicionalmente, agentes que visam e bloqueiam a ativação de TGFβ integrina- dependente podem ser capazes de bloquear somente um subconjunto de integrinas responsável pela ativação de TGFβ1 associada à doença, entre vários tipos de integrina que são expressos por vários tipos de células e participam na patogênese.

Além disso, até mesmo quando esses antagonistas podem bloquear seletivamente a ativação mediada por integrina da isoforma TGFβ1, eles podem ser ineficazes no bloqueio da ativação de TGFβ1 desencadeada por outros modos, por exemplo, ativação protease-dependente. Em contraste, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo visam evitar a etapa de ativação de TGFβ1 independentemente do modo de ativação particular mantendo, ao mesmo tempo, a seletividade de isoforma.

[00708] É ainda contemplado que inibidores de TGFβ3 isoforma-específicos podem oferecer um benefício terapêutico em estados de doença particulares. Por exemplo, certas doenças fibróticas a serem tratadas com um inibidor de TGFβ1 também podem ser TGFβ3-positivas (ou seja, tecido fibrótico TGFβ1+/TGFβ3+), caracterizadas pelo fato de que o tecido doente (por exemplo, tecido fibrótico) expressa ambas as isoformas. Consequentemente, a invenção inclui o uso de inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo em conjunto com um inibidor de TGFβ3 isoforma-seletivo no tratamento dessas condições. Esses inibidores de TGFβ3 podem ser contexto- independentes ou com viés de contexto.

[00709] Indicações fibróticas para as quais os anticorpos e/ou composições da presente revelação podem ser usados terapeuticamente incluem, sem limitação, indicações pulmonares (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática (IPF), distúrbio pulmonar obstrutivo crônico (DPOC), asma alérgica, lesão pulmonar aguda, esofagite eosinofílica, hipertensão arterial pulmonar e lesão por gás químico), indicações renais (por exemplo, glomeruloesclerose diabética, glomeruloesclerose segmentar focal (FSGS), doença renal crônica (CKD), fibrose associada com transplante renal e rejeição crônica, nefropatia por IgA, e síndrome urêmica hemolítica), fibrose hepática (por exemplo, esteatohepatite não alcoólica (NASH), hepatite viral crônica, parasitemia, erros inatos de metabolismo, fibrose mediada por toxinas, por exemplo, fibrose alcoólica, esteatohepatite não alcoólica-carcinoma hepatocelular (NASH-HCC), cirrose biliar primária e colangite esclerosante), fibrose cardiovascular (por exemplo, cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, aterosclerose e reestenose), esclerose sistêmica, fibrose cutânea (por exemplo, fibrose cutânea na esclerose sistêmica, esclerose sistêmica cutânea difusa, esclerodermia, cicatrização cutânea patológica, quelóide, cicatrização pós-cirúrgica, cirurgia de revisão de cicatriz, cicatrização induzida por radiação e feridas crônicas), condições relacionadas aos olhos como, por exemplo, fibrose sub-retiniana, uveíte síndrome, uveíte associada com fibrose retroperitoneal idiopática, fibrose de músculo extra-ocular, doenças oculares associadas com o complexo de histocompatibilidade principal (MHC classe I) ou antígenos histocompatibilidade, fibrose sub-retiniana na degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade), e cânceres ou fibrose secundária (por exemplo, mielofibrose, câncer da cabeça e pescoço, leucemia megacarioblástica aguda M7 e mucosite). Outras doenças, distúrbios ou condições relacionadas à fibrose (incluindo distúrbios degenerativos) que podem ser tratadas usando compostos e/ou composições da presente revelação incluem, sem limitação, adenomiose, endometriose, síndrome de Marfan, síndrome da pele rígida, esclerodermia, artrite reumatóide, fibrose da medula óssea, doença de Crohn, colite ulcerativa, lúpus eritematoso sistêmico, distrofia muscular (por exemplo, DMD), doença de Parkinson, ALS, contratura de Dupuytren, doença de Camurati-Engelmann, cicatrização neural, demência, vitreorretinopatia proliferativa, lesão corneana, complicações após a cirurgia de drenagem de glaucoma e esclerose múltipla.

[00710] Muitas indicações fibróticas também estão associadas com inflamação do tecido (ou tecidos) afetado, indicando envolvimento de um componente imune. Essa inflamação pode ser acompanhada por populações de células imunes aberrantes, por exemplo, números aumentados de células Th17, números reduzidos de células Treg, e/ou ambos. Em cada caso, o paciente afetado pode exibir proporções de células Th17/Treg aumentadas. As atividades de direcionamento a GARP e/ou LRRC33 dos anticorpos isoforma- seletivos podem fornecer efeitos inibidores nesses contextos.

[00711] Em algumas modalidades, as indicações fibróticas que podem ser tratadas com as composições e/ou métodos descritos nesse relatório descritivo incluem fibrose de órgão, por exemplo, fibrose do pulmão (por exemplo, IPF), fibrose do rim (por exemplo, fibrose associada com CKD), fibrose do fígado (por exemplo, associada ou causada por NASH), fibrose do coração ou tecidos cardíacos, fibrose da pele (por exemplo, esclerodermia), fibrose do útero (por exemplo, endométrio, miométrio), fibrose de músculo (por exemplo, músculo esquelético) e fibrose da medula óssea. Em algumas modalidades, essa terapia pode reduzir ou retardar a necessidade de transplante de órgão em pacientes. Em algumas modalidades, essa terapia pode prolongar a sobrevida dos pacientes.

[00712] Para tratar IPF, pacientes que podem se beneficiar do tratamento incluem aqueles com IPF familiar e aqueles com IPF esporádica. A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico pode reduzir o acúmulo de miofibroblastos nos tecidos pulmonares, reduzir os depósitos de colágeno, reduzir os sintomas de IPF, melhorar ou manter a função pulmonar, e prolongar a sobrevida. Em algumas modalidades, o inibidor bloqueia a ativação de TGFβ1 associado à ECM (por exemplo, TGFβ1 pró/latente apresentado por LTBP1/3) dentro do ambiente fibrótico da IPF. O inibidor pode opcionalmente ainda bloquear a ativação de TGFβ1 associado a macrófagos (por exemplo, TGFβ1 pró/latente apresentado por LRRC33), por exemplo, macrófagos alveolares. Como resultado, o inibidor pode suprimir a liberação de fibronectina e outros fatores associados à fibrose. Em algumas modalidades, o inibidor bloqueia a ativação de célula estrelada hepática.

[00713] Está bem estabelecido que a ativação de células estreladas hepáticas (HSCs) é o condutor central de fibrose na lesão do fígado. Nesse processo, células de armazenamento de vitamina A quiescentes, transdiferenciadas em miofibroblastos fibrogênicos proliferativos (a fonte principal de acúmulo de proteína da matriz extracelular (ECM)). No entanto, foi demonstrado que esse processo é mediado por muitas vias diferentes, incluindo autofagia, estresse do retículo endoplasmático, estresse oxidativo, metabolismo de retinol e colesterol, epigenética e sinais mediados por receptor. Além disso, também foi demonstrado que células inflamatórias, incluindo macrófagos, hepatócitos, células endoteliais sinusoidais do fígado,

células natural killer, células T natural killer, plaquetas e células B, modulam a ativação de HSC (Tsuchida e Friedman, “Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology”, Volume 14, páginas 397–411 (2017)). Apenas um exemplo particular, Seki e cols. demonstraram que a ativação de TLR4 (que reconhece LPS apresentado por bactérias) leva à supra-regulação da secreção de quimiocina e induz quimiotaxia de células de Kupffer, e também sensibiliza HSCs aos sinais induzidos por TGFβ e permite a ativação irrestrita de células de Kupffer (Seki e cols. “Nature Medicine”, Volume 13, páginas 1.324–

1.332 (2007)).

[00714] É bem sabido que a inflamação desempenha um papel crucial no desenvolvimento e progressão da fibrose hepática. Especificamente, a lesão do fígado leva à inflamação e ao recrutamento de monócitos/macrófagos (bem como linfócitos, eosinófilos e células plasmáticas) que produzem fatores pró- fibróticos, incluindo TGFβ. Além disso, a pesquisa indica que macrófagos tanto hepáticos quanto residentes no tecido (células de Kupffer) e macrófagos recrutados derivados da medula óssea desempenham papéis importantes na progressão de fibrose hepática, e que a via de TGFβ pode promover a polarização e funções pró-fibróticas de macrófagos durante a fibrose hepática. Na verdade, foi demonstrado que tanto células de Kupffer quanto macrófagos recrutados podem ativar HSCs e induzir sua transdiferenciação em miofibroblastos por mecanismos parácrinos, incluindo TGFβ. Os miofibroblastos, por sua vez, produzem e depositam componentes da ECM que levam à fibrose (Fabregat e Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357).

[00715] No entanto, miofibroblastos também podem se originar de outras fontes, incluindo fibroblastos portais e residentes, fibrócitos derivados da medula óssea, células epiteliais do fígado que passam por EMT, células endoteliais que passam por EndMT, e células vasculares de músculo liso e pericitos. Na verdade, também foi demonstrado que TGFβ regula tanto EndMT quanto EMT, resultando em miofibroblastos aumentados, que dirigem a fibrose hepática (Pardali e cols., Int. J. Mol. Sci., outubro de 2017; 18 (10): 2157). Consequentemente, o direcionamento a TGFβ tem sido um alvo terapêutico atraente para o tratamento de condições fibróticas.

[00716] Foi demonstrado que TGFβ desempenha muitos papéis na fibrose hepática e progressão de doença. Por exemplo, foi demonstrado que TGFβ é responsável pela ativação HSCs em miofibroblastos. Também foi demonstrado que TGFβ medeia a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em hepatócitos, o que pode contribuir para aumentar a população de miofibroblastos. Além disso, foi demonstrado que TGFβ induz alterações na plasticidade da célula tumoral (Fabregat e Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357).

[00717] Embora TGFβ possa ser encontrado em muitas fontes celulares diferentes nos fibróticos e/ou microambiente tumoral o que sugere, dessa forma, que a apresentação de TGFB por várias moléculas apresentadoras diferentes (por exemplo, LTBP1, LTBP3, GARP e/ou LRRC33), pode ser benéfico, em certas situações, visar fontes particulares de TGFβ em relação a outras. Por exemplo, Henderson e cols., mostraram que a deleção de integrina αv em HSCs, protegia camundongos de fibrose hepática induzida por CCL4 (Henderson e cols., Nat. Med. 2013, 19, 1.617-1.624). Como as integrinas são os ativadores principais de TGFβ apresentado por LTBP, esse resultado sugere que o direcionamento a TGFβ apresentado por LTBP pode ser suficiente para tratar fibrose em certas situações. No entanto, como as células imunes desempenham um papel importante na resposta fibrótica, inibidores de TGFβ que visam TGFβ apresentado pela maioria ou todos os complexos molécula apresentadora-TGFβ podem ser benéficos.

[00718] Nos últimos anos, o tratamento de fibrose hepática se tornou uma área de interesse aumentado devido à sua prevalência crescente em todo o mundo. Por exemplo, a doença do fígado gorduroso não alcoólica (NAFLD) está associada com anormalidades metabólicas como, por exemplo, obesidade, resistência à insulina, hiperglicemia de jejum, dislipidemia e perfis de adipocina alterados. NAFLD é caracterizada por acúmulo excessivo de lipídeos nos hepatócitos e é um espectro de doenças que progride desde esteatose hepática (acúmulo de gotículas de lipídio/gordura nos hepatócitos) até a esteatohepatite não alcoólica (NASH), fibrose hepática, e eventualmente cirrose nos casos mais severos. NASH com fibrose ou cirrose aumenta o risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (HCC) (Starley B.Q., e cols. Hepatology 2010; 51: 1.820–1.832). Foi proposto que a progressão de esteatose até NASH é regulada por um modelo ‘multiple-hit’, no qual o primeiro hit é resistência à insulina e perturbação metabólica, que leva à esteatose hepática, seguido por estresse oxidativo, lesão de hepatócito mediada por citocinas pró-inflamatórias, divisão lipídica alterada e hepatotoxicidade mediada por ácidos graxos livres, carga de colesterol intra-hepático anormal, hiperinsulinemia, hiperleptinemia e hipoadiponectinemia

(Tilg H., Moschen A.R., Hepatology 2010; 52: 1.836–1.846; e Yilmaz Y., Aliment Pharmacol. Ther. 2012; 36: 815–823).

[00719] Embora muitos modelos animais tenham sido desenvolvidos para o estudo de fibrose hepática, qualquer modelo pré-clínico adequado pode ser empregado. Por exemplo, foi demonstrado que uma dieta rica em gordura em camundongos imita tanto a histopatologia quanto a patogênese da NAFLD humana. Além disso, alguns modelos genéticos também exibem características de síndrome metabólica e NAFLD humanas, por exemplo, modelos de camundongos db/db e ob/ob. Também há modelos animais para o estudo de NASH, que consistem principalmente em vários modelos induzidos por dieta incluindo, sem limitação, dieta deficiente em metionina e colina (MCD), dieta rica em colesterol (HCD), dieta rica em gordura deficiente em colina (CDHFD), dieta deficiente em colina/deficiente em aminoácido-L, dieta deficiente em colina/deficiente em aminoácido-L + tetracloreto de carbono, dieta rica em gordura + estreptozotocina, dieta rica em gordura + rica em colesterol (HFHC), rica em frutose dieta (HFD) e dieta rica em frutose rica em gordura (HFHF). Modelos genéticos em camundongos para o estudo de NASH incluem, sem limitação, camundongos foz/foz, camundongos deficientes em PTEN hepatócito-específico, camundongos Db/db + dietilnitrosamina (DEN), e camundongos db/db + MCD. Os detalhes de todos esses modelos, incluindo as vantagens e desvantagens de cada um deles, estão descritos em Jennie Ka Ching Lau e cols., J Pathol 2017; 241: 36–44; cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[00720] Outro modelo útil para testagem da eficácia de inibidores de TGFβ isoforma-específicos na fibrose hepática incluem o modelo de tetracloreto de carbono (CCL4). Outro modelo útil para testagem da eficácia de inibidores de TGFβ isoforma-específicos na fibrose hepática incluem o modelo de ligação do ducto biliar (BDL) (veja, por exemplo, Tag e cols., J. Vis. Exp. 2015; (96): 52.438).

[00721] Os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos tais como aqueles fornecidos nesse relatório descritivo podem ser usados para tratar condições fibróticas do fígado, por exemplo, fígado gorduroso (por exemplo, doença do fígado gorduroso não alcoólica (NAFLD) e esteatohepatite não alcoólica (NASH)). O fígado gorduroso pode ou não estar inflamado. A inflamação do fígado em consequência do fígado gorduroso (ou seja, esteatohepatite) pode se desenvolver em cicatrização (fibrose), que então frequentemente progride para cirrose (cicatrização que distorce a estrutura do fígado e prejudica sua função). O inibidor pode, portanto, ser usado para tratar essas condições. Em algumas modalidades, o inibidor bloqueia a ativação de TGFβ1 associado à ECM (por exemplo, TGFβ1 pró/latente apresentado por LTBP1/3) dentro do ambiente fibrótico do fígado. O inibidor pode opcionalmente ainda bloquear a ativação de TGFβ1 associado a macrófagos (por exemplo, TGFβ1 pró/latente apresentado por LRRC33), por exemplo, células de Kupffer (também conhecidas como macrófagos estrelados), bem como macrófagos derivados de monócitos e MDSCs infiltrantes. Como resultado, o inibidor pode suprimir fatores associados à fibrose (por exemplo, marcadores fibróticos descritos nesse relatório descritivo). A administração do inibidor em um indivíduo com essas condições pode reduzir um ou mais sintomas, evitar ou retardar a progressão da doença, reduzir ou estabilizar os acúmulos de gordura no fígado, reduzir biomarcadores associados à doença (por exemplo, fragmentos de colágeno do soro), reduzir a cicatrização do fígado, reduzir a rigidez do fígado, e/ou de algum outro modo produzir um desfecho clinicamente significativo em uma população de pacientes tratados com o inibidor, quando comparado com uma população de controle não tratada com o inibidor. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do inibidor pode obter tanto gordura hepática reduzida quanto fibrose hepática reduzida (por exemplo, cicatrização) em pacientes com NASH. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do inibidor pode obter melhora da fibrose por pelo menos um estágio sem piora da esteatohepatite em pacientes com NASH. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do inibidor pode reduzir a taxa de ocorrência de insuficiência hepática e/ou câncer do fígado em pacientes com NASH.

[00722] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do inibidor pode normalizar, comparado com o controle, os níveis de vários biomarcadores séricos inflamatórios ou fibróticos, como avaliados após o início da terapia, em, por exemplo, 12-36 semanas. Em algumas modalidades, biomarcadores inflamatórios ou fibróticos podem ser usados para avaliar a severidade de NAFLD (por medição dos níveis de esteatose hepática), selecionar pacientes para tratamento, e/ou monitorar progressão de doença ou resposta ao tratamento. Por exemplo, biomarcadores sanguíneos e painéis podem incluir, sem limitação: i) o Índice de fígado gorduroso (BMI, circunferência abdominal, triglicerídeos séricos e gama-glutamiltransferase (GGT);

ii) o Índice de esteatose hepática (proporção de aspartato aminotransferase (AST):alanina aminotransferase (ALT) séricas, BMI, sexo e presença de diabetes mellitus); i) a Pontuação de gordura do fígado de NAFLD (ALT sérica, HDL colesterol, triglicerídeos, hemoglobina A1c e contagem de leucócitos); ii) o SteatoTest (BioPredictive) (níveis séricos de bilirrubina total, GGT, α2-macroglobina, haptoglobina, ALT, apolipoproteína AI, colesterol total, triglicerídeos, glicose (ajustada para idade e sexo) e BMI); e iii) o ridge score de NAFLD (níveis séricos de ALT, HDL colesterol, triglicerídeos, hemoglobina A1c, contagem de leucócitos e dados de comorbidade (e a presença de hipertensão)).

[00723] Em algumas modalidades, biomarcadores de imageamento podem ser usados para avaliar os níveis de esteatose hepática. Por exemplo, biomarcadores de imageamento podem incluir, sem limitação: ultrassonografia, parâmetro de atenuação controlada (CAP), fração de gordura por densidade de próton estimada por MRI (MRI-PDFF) e espectroscopia por ressonância magnética (MRS).

[00724] Biópsias do fígado são o padrão atual para o diagnóstico NASH. no entanto, a variabilidade entre patologistas limita a eficácia desse método diagnóstico. Consequentemente, o uso do algoritmo “Fatty Liver Inhibition of Progression” (FLIP) (que compreende pontuações de esteatose histológica, atividade e fibrose) pode ser usado para aumentar a consistência do diagnóstico de NASH por biópsia. Além disso, muitos biomarcadores não invasivos também podem ser úteis para o diagnóstico e monitoramento da doença. Consequentemente, em algumas modalidades, biomarcadores inflamatórios ou fibróticos podem ser usados para avaliar a severidade de NASH, selecionar pacientes para tratamento e/ou monitorar progressão de doença ou resposta ao tratamento. Os biomarcadores sanguíneos podem incluir: i) apoptose marcadores, por exemplo, fragmentos CK18, citoqueratina total e sFAS; ii) marcadores inflamatórios, por exemplo, CRP, TNF, IL-8 e CXCL10; iii) produtos da oxidação de lipídeos, por exemplo, 11- HETE, 9-HODE, 13-HODE, 12-oxo-ODE, LA-13-HODE (oxNASHscore), e 11,12-diHETrE; iv) enzimas lisossomais, por exemplo, catepsina D; e v) painéis combinados, por exemplo, NASHTest (BioPredictive) e “NASH Diagnostics Panel” (que compreende a presença de diabetes mellitus, sexo, BMI e níveis séricos de triglicerídeo, fragmentos CK18 e CK18 total).

[00725] Em algumas modalidades, os biomarcadores e painéis relacionados podem ser úteis no diagnóstico de níveis de fibrose e/ou cirrose, seleção de pacientes para tratamento, e/ou monitoramento da progressão da doença ou resposta ao tratamento. Por exemplo, testes não invasivos de fibrose hepática e cirrose incluem, sem limitação: proporção AST:ALT, índice de proporção AST:plaqueta, índice de fibrose-4 (idade, AST, ALT e contagem de plaquetas), NAFLD pontuação de fibrose (idade, BMI, alteração da glicose de jejum e/ou diabetes, AST ALT, contagem de plaquetas e albumina), pontuação BARD (AST, ALT, BMI e diabetes).

[00726] Marcadores e painéis de fibrose específicos também podem ser úteis, e incluem, sem limitação: ácido hialurônico; PIIPNP; Pro-C3; TIMP1; Laminina; painel aprimorado de fibrose hepática (ELF) (PIINP, ácido hialurônico, TIMP1); FibroTest (GGT, bilirrubina total, α2m, apolipoproteína AI e haptoglobina); e FibroMeter NAFLD (peso corporal, índice de protrombina, ALT, AST, ferritina e glicose de jejum). Biomarcadores de imageamento para fibrose hepática podem incluir, sem limitação: FibroScan (TE), elastografia por onda de cisalhamento pontual (pSWE) (também denominada radiação acústica da força de impulso (ARFI)), SWE 2D-3D, elastografia por ressonância magnética (MRE) e MRI multiparamétrica.

[00727] Em algumas modalidades, biomarcadores genéticos e genômicos podem ser úteis na avaliação do risco e severidade de NAFLD, que incluem a avaliação de vários SNPs, ncRNAs livres de células e miRNAs. Uma revisão abrangente de biomarcadores genéticos e genômicos conhecidos, bem como dos biomarcadores sanguíneos, painéis, biomarcadores de imageamento e testes discutidos acima, está resumida em VWS Wong e cols., Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol., agosto de 2018; 15 (8): 461-478; cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[00728] Em algumas modalidades em pacientes com NASH, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos podem ser administrados em pacientes que recebem uma ou mais terapias adicionais incluindo, sem limitação, inibidores de miostatina, que podem geralmente melhorar a regulação metabólica em pacientes com manifestação clínica de síndrome metabólica, incluindo NASH e NAFLD.

[00729] Em algumas modalidades, a terapia adicional pode compreender um inibidor de TGFβ3. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ3 é um inibidor de TGFβ3 isoforma-específico. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ3 é um inibidor de TGFβ3 contexto-independente ou com viés de contexto. Em algumas modalidades, o paciente com NASH possui tecido fibrótico TGFβ1-positivo e TGFβ3-positivo. Em algumas modalidades, o paciente com NASH é ou foi determinado como sendo parcialmente responsivo à terapia com inibidor de TGFβ1.

[00730] Em algumas modalidades, em pacientes com NASH, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos podem ser administrados em pacientes que recebem um inibidor de Acetil CoA Carboxilase (ACCi) (por exemplo, firsocostat (GS-0976) ou PF-05221304). Outras terapêuticas que podem ser úteis em combinação com os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos aprimorados descritos nesse relatório descritivo, incluem, sem limitação: agonistas ou análogos do receptor de GLP-1 (por exemplo, semaglutida), receptor farnesóide X (FXR) agonistas (por exemplo, GS-9674; também denominado Cilofexor), inibidores de ASK1 (por exemplo, selonsertib); ácido obeticólico, agonistas de PPAR (por exemplo, GFT505; também denominado elafibranor); nitazoxanida, inibidores de cetohexoquinase (KHK) (por exemplo, PF-06835919); e/ou inibidores de Diacilglicerol O-Aciltransferase 2 (DGAT2) (por exemplo, PF-06865571). Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das terapêuticas mencionadas acima podem ser usadas em combinação com um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico da presente revelação, por exemplo, um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico em combinação com um agonista de FXR, um inibidor ACC e/ou um análogo de GLP-1. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos podem ser usados em combinação com um inibidor de miostatina, por exemplo, inibidores da ativação de miostatina (por exemplo, SRK-015, por exemplo, WO 2016/073853 e WO 2017/049011). Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos podem ser usados em combinação com um inibidor de GDF11, por exemplo, inibidores da ativação de GDF11 (por exemplo, WO 2017/015622).

[00731] Em algumas modalidades, o tratamento com os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos isoladamente ou em combinação com uma ou mais terapêuticas adicionais reduz gordura hepática, como medida por MRI-PDFF. Em algumas modalidades, a redução de gordura hepática é pelo menos 20%, por exemplo, ≥20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45% ou ≥ 50%. Em algumas modalidades, o tratamento com os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos isoladamente ou em combinação com uma ou mais terapêuticas adicionais reduz ALT e/ou GGT sérica por pelo menos 20%, por exemplo, ≥20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45% ou ≥ 50%. Em algumas modalidades, o tratamento com os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos isoladamente ou em combinação com uma ou mais terapêuticas adicionais reduz a síntese de ácido biliar.

[00732] Em algumas modalidades, os pacientes com NASH podem ter fibrose hepática avançada (estágio F3/F4). Em algumas modalidades, esses pacientes possuem fibrose hepática avançada em estágio F3. Em algumas modalidades, esses pacientes possuem fibrose hepática em estágio F4 caracterizada por cirrose. Em algumas modalidades, os pacientes com NASH desenvolvem ou estão em risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular e/ou varizes esofágicas.

[00733] O estadiamento de fibrose na doença do fígado gorduroso não alcoólica de acordo com a classificação derivada pelo “Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network Pathology Committee” é fornecida abaixo: Manifestação fibrótica Estágio de fibrose Fibrose perisinusoidal ou 1 periportal Fibrose perisinusoidal leve 1A (zona 3) Fibrose perisinusoidal 1B moderada (zona 3) Fibrose portal/periportal 1C Fibrose perisinusoidal e 2 portal/periportal Fibrose em ponte 3 Cirrose 4

[00734] Para permitir a avaliação das várias características histológicas durante terapia e englobar o espectro inteiro de NAFLD, o “NASH Clinical Research Network (CRN) Pathology Committee” realizou uma análise univariada e multivariada cuidadosa sobre as associações entre as diferentes características histológicas observadas em NASH e o diagnóstico de NASH de acordo com o “Pathology Committee”. O resultado foi um sistema de pontuação tanto da atividade de NASH (Grau), quanto da deposição de colágeno mais remodelagem arquitetônica (Estágio). O sistema de graduação, a Pontuação de Atividade de NASH (NAS), foi a soma não ponderada de três componentes histológicos: esteatose (0-3), inflamação lobular (0-3) e degeneração em balão (0-2). Ela variava de 0 a 8. NAS inclui as características de lesão ativa que são potencialmente reversíveis. Adicionalmente, o sistema de estadiamento de fibrose de Brunt e cols. foi adicionalmente desenvolvido. No sistema do CRN de NASH, a pontuação de fibrose para o estágio 1 foi subdividida em fibrose perisinusoidal delicada (1A) e densa (1B), enquanto o estágio 1C foi definido como fibrose portal sem fibrose perisinusoidal concomitante (revisado por Stål, World J. Gastroenterol., 21 de outubro de 2015; 21 (39): 11.077–11.087, incorporado por referência nesse relatório descritivo).

[00735] Os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos tais como aqueles fornecidos nesse relatório descritivo podem ser usados para tratar condições fibróticas do rim, por exemplo, doenças caracterizadas por acúmulo de matriz extracelular (nefropatia por IgA, glomeruloesclerose focal e segmentar, glomerulonefrite crescêntica, nefrite lúpica e nefropatia diabética) nas quais a expressão significantemente aumentada de TGFβ nos glomérulos e no interstício tubular foi observada. Embora a deposição glomerular e no interstício tubular de dois componentes da matriz induzida por TGFβ, fibronectina EDA+ e PAI-1, estivesse significantemente elevada em todas as doenças com acúmulo de matriz, a análise de correlação revelou um relacionamento íntimo primariamente com a isoforma TGFβ1. Consequentemente, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos são úteis como terapêutica para um espectro de distúrbios glomerulares humanos, nos quais TGFβ está associado com acúmulo patológico de matriz extracelular.

[00736] Em algumas modalidades, a condição fibrótica do rim está associada à doença renal crônica (CKD). CKD é causada primariamente por hipertensão arterial ou diabetes e causa mais de um milhão de mortes a cada ano. Os pacientes com CKD necessitam de cuidados médicos por toda a vida, que variam de dietas rigorosas e medicações até diálise e transplantes. Em algumas modalidades, a terapia com inibidor de TGFβ1 descrita nesse relatório descritivo pode reduzir ou retardar a necessidade de diálise e/ou transplante. Em algumas modalidades, essa terapia pode reduzir a necessidade (por exemplo, dosagem, frequência) de outros tratamentos. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos podem ser administrados em pacientes que recebem uma ou mais terapias adicionais incluindo, sem limitação, inibidores de miostatina, que podem geralmente melhorar a regulação metabólica em pacientes com CKD.

[00737] As condições fibróticas que podem ser tratadas com o inibidor de TGFβ1 da presente revelação incluem condições que envolvem fibrose e/ou inflamação crônica. Essas condições podem ser distúrbios neuromusculares incluindo, sem limitação, distrofia muscular de Duchenne (DMD), e outros distúrbios genéticos como, por exemplo, esclerose múltipla (MS) e fibrose cística (CF). Por meio da inibição de ambos os braços de TGFβ1 associado à ECM e às células imunes, acredita-se que o inibidor de TGFβ1, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo suprima a progressão fibrótica e restaure a polarização de macrófagos M1/M2.

[00738] Modelos úteis para o estudo de CKD e fibrose renal incluem, sem limitação, cepas de camundongos NZB/W, MRL/lpr e BXSB, modelos anti-GBM, modelos anti-Thy1,

nefrectomia 5/6, nefropatia por radiação, nefrose por aminonucleosídeo puromicina (PAN) e nefropatia por adriamicina, nefropatia por ácido fólico, nefropatia por CyA, nefropatia por DOCA-sal, modelo em camundongo transgênico de nefropatia associada ao HIV (HIVAN), ratos espontaneamente hipertensivos (SHR), ratos Buffalo/mna, rato Munich Wistar Frömter (MWF), obstrução ureteral unilateral (UUO), camundongos com knockout de Col4A (síndrome de Alport) (veja Yang e cols. Drug Discov. Today Dis. Models. 2010; 7 (1-2): 13–19; cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência).

[00739] A fibrose de órgão que pode ser tratada com os métodos fornecidos neste relatório descritivo inclui fibrose cardíaca (por exemplo, cardiovascular). Em algumas modalidades, a fibrose cardíaca está associada à insuficiência cardíaca, por exemplo, insuficiência cardíaca crônica (CHF). Em algumas modalidades, a insuficiência cardíaca pode estar associada a doenças miocárdicas e/ou doenças metabólicas. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos podem ser administrados em pacientes que recebem uma ou mais terapias adicionais incluindo, sem limitação, inibidores de miostatina em pacientes com disfunção cardíaca que envolve fibrose cardíaca e distúrbio metabólico.

[00740] Modelos genéticos úteis para o estudo de fibrose cardíaca incluem, sem limitação, camundongo cardíaco miócito-específico FAK-KO, camundongos geneticamente modificados com KO duplo (dKO) de SR-BI / apoE, camundongos sindecan-1 null, camundongos que superexpressam EC-SOD, camundongos com knockout de PKC-δ. Modelos cirúrgicos em camundongo úteis para o estudo de fibrose cardíaca incluem, sem limitação, ligação da artéria coronária, modelo de reperfusão isquêmico (peito aberto e fechado), modelo de isquemia crônica, modelo de isquemia–reperfusão com precondicionamento isquêmico, modelo de Langendorff, constrição aórtica transversal (TAC), constrição aórtica ascendente, constrição da aorta abdominal, cerclagem da artéria pulmonar, TAC com ligação distal da coronária anterior esquerda, modelo de fístula aortocava (ACF) e modelo de insuficiência aórtica (veja Rai e cols., Mol Cell. Biochem., janeiro de 2017; 424 (1-2): 123–145; cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência).

[00741] Em algumas modalidades, condições fibróticas que podem ser tratadas com as composições e/ou métodos descritos nesse relatório descritivo incluem desmoplasia. Desmoplasia pode ocorrer em torno de uma neoplasia, causando fibrose densa em torno do tumor (por exemplo, estroma desmoplásico), ou tecido cicatricial dentro do abdome após cirurgia abdominal. Em algumas modalidades, a desmoplasia está associada com tumor maligno. Em função de sua formação densa que circunda a malignidade, terapêuticas anticâncer convencionais (por exemplo, quimioterapia) podem não penetrar eficazmente até alcançar as células cancerosas para obter efeitos clínicos. Inibidores de TGFβ1 isoforma- específicos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo podem ser usados para romper a desmoplasia, de modo que a formação fibrótica possa ser desprendida para ajudar os efeitos da terapia anticâncer. Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos podem ser usados como monoterapia (mais abaixo).

[00742] Em algumas modalidades, um paciente possui um tumor sólido fibrótico (por exemplo, desmoplasia) e é ou foi excluído de um pool de candidatos cirúrgicos, de modo que a tumor sólido fibrótico é considerado como sendo não ressecável ou não cirúrgico. Esse paciente pode ser um candidato para receber uma terapia com inibição de TGFβ1 da presente revelação. O inibidor de TGFβ1 da presente invenção pode fazer com que o tumor se torne ressecável ou operável após administração, de modo que o paciente possa se tornar um candidato para ressecção cirúrgica.

[00743] Para tratar pacientes com condições fibróticas, inibidores isoforma TGFβ1-específicos são administrados a um indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar a fibrose. A quantidade eficaz de um anticorpo desse tipo é uma quantidade eficaz para obter tanto eficácia terapêutica quanto segurança clínica no indivíduo. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo que pode bloquear a ativação de um TGFβ1 mediado por LTBP localizado (por exemplo, atado) na ECM e TGFβ1 mediado por GARP localizado (por exemplo, atado em) em células imunes. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo que pode bloquear a ativação de um TGFβ1 mediado por LTBP localizado na ECM e TGFβ1 mediado por LRRC33 localizado (por exemplo, atado em) em monócitos/macrófagos. Em algumas modalidades, a LTBP é LTBP1 e/ou LTBP3. Em algumas modalidades, o direcionamento e a inibição de TGFβ1 apresentado por LRRC33 em macrófagos do tipo M2, pró- fibróticos, no microambiente fibrótico pode ser beneficial.

[00744] Ensaios úteis na determinação da eficácia dos anticorpos e/ou composições da presente revelação para a alteração de fibrose incluem, sem limitação, ensaios histológicos para a contagem de fibroblastos e análises imunoistoquímicas básicas conhecidas na técnica.

[00745] Em algumas modalidades, fragmentos de LAP circulantes podem ser usados como um marcador sérico de fibrogênese. Anticorpos que reconhecem especificamente as extremidades clivadas desses fragmentos podem ser usados para detectar fragmentos de LAP de amostras de soro. Veja, por exemplo, Patente U.S. 8.198.412, cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência. Papel do TGFβ no diabetes

[00746] A perda de células-β secretoras de insulina no pâncreas é um mecanismo primário do diabetes tipo 2. Estudos recentes sugerem um papel para os ligantes da família TGFβ na regulação da função de células-β e homeostasia da glicose. Esses ligantes podem influenciar a proliferação de células- β e/ou a incorporação de novas células-β a partir de progenitores em adultos. Foi relatado que a manipulação genética para causar superexpressão transgênica de TGF-β por meio do promotor de insulina causa desenvolvimento diminuído do pâncreas exócrino e ilhotas, e manutenção do controle da glicose. Similarmente, foi relatado que a superexpressão transgênica de TGF-β por meio do promotor de glucagon causa hipoplasia de célula B, secreção de insulina diminuída, tolerância à glicose alterada (revisado, por exemplo, em Trends Endocrinol. Metab., julho de 2010; 21 (7): 441–448). A expansão e renovação de células beta pancreáticas são cruciais tanto para o desenvolvimento normal do pâncreas quanto para a manutenção da função nas ilhotas adultas. Recentemente, vários estudos identificaram alguns dos papéis cruciais para sinalização de TGFβ no pâncreas em desenvolvimento.

Especificamente, a sinalização de TGFβ promove o comprometimento endócrino de células progenitoras e sua maturação subsequente.

Camundongos que superexpressam a forma negativa dominante do receptor de TGFβ do tipo II (Tulachan e cols.) inibiam a sinalização de TGFβ no nível de receptor e havia um aumento no número de precursores endócrinos, bem como a proliferação de células endócrinas.

Nas ilhotas adultas, todas as três isoformas de TGFβ são expressas nas células endócrinas em um padrão difuso.

No entanto, a intensidade era maior para TGFβ2 e TGFβ3 em células insulina-positivas.

No pâncreas exócrino, a maioria das células acinares era positiva para TGFβ1, enquanto todos os três ligantes pareceram ser igualmente expressos nas células ductais.

As células beta adultas possuem um turnover muito baixo e uma taxa de proliferação baixa.

O inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, tais como aqueles englobados nesse relatório descritivo, pode ser usado para promover replicação de células beta pancreáticas no tratamento ou prevenção de diabetes e/ou intolerância à glicose.

Como a replicação de células-β é o mecanismo primário para a manutenção e expansão da massa de células-β em resposta às demandas móveis de insulina, a insuficiência dessa expansão adaptiva pode resultar no diabetes (veja, por exemplo, Dhawan e cols., Diabetes.

Maio 2016; 65 (5): 1.208–1.218). O inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo pode ser vantajosamente usado para melhorar o diabetes, sem causar efeitos colaterais indesejados associados à pan-inibição da sinalização de TGFβ.

Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 isoforma- seletivo pode ser usado em conjunto com um inibidor miostatina-seletivo (por exemplo, anticorpos que se ligam seletivamente a miostatina pró/latente/GDH8 inibindo, dessa forma, a ativação de miostatina), como descrito, por exemplo, em PCT/US2015/059468 e PCT/US2016/052014, no tratamento ou prevenção de diabetes ou intolerância à glicose. Em algumas modalidades, o diabetes é diabetes tipo 2.

[00747] Condições relacionadas ao diabetes incluem nefropatia diabética (DN), que é também denominada doença renal diabética. A nefropatia diabética é uma complicação séria relacionada aos rins de diabetes tipo 1 e diabetes tipo 2. Até 40% das pessoas com diabetes eventualmente desenvolvem doença renal. Ao longo do tempo, a DN pode levar ao edema pulmonar, doença cardiovascular e doença renal em estágio final, o que eventualmente exige diálise ou a transplante renal para sobrevida.

[00748] As principais características clínicas de DN humana incluem albuminúria, redução progressiva de GFR e hipertensão, e risco aumentado para doenças cardiovasculares. A patogênese de DN está associada à angiogênese glomerular e hiperfiltração. Além disso, o espessamento da membrana basal glomerular, a expansão de células mesangiais, glomeruloesclerose e fibrose tubular intersticial são observados em pacientes com DN. TGFβ1 e seus receptores estão supra-regulados tanto na nefropatia diabética experimental quanto na humana. Foi relatado que há expressão aumentada de receptores de TGFβ1, bioatividade de TGFβ1 e responsividade ao TGFβ1 exógeno em resposta à glicose elevada em células glomerulares, e a adenosina extracelular está implicada como participante desse processo (veja, por exemplo, Roa e cols., (2009) “Adenosine Mediates Transforming Growth Factor-Beta 1 Release in Kidney

Glomeruli of Diabetic Rats” FEBS Let. 583 (19): 3.192-3.198). Em algumas modalidades, DN compreende desregulação da biossíntese ou sinalização de adenosina. Em algumas modalidades, a desregulação envolve CD39 e/ou CD73. Papel do TGFβ em condições musculoesqueléticas

[00749] No sistema musculoesquelético, que é formado pelos ossos do esqueleto, músculos, cartilagem, tendões, ligamentos, articulação e outros tecidos conjuntivos que dêem suporte e liguem tecidos e órgãos juntos, TGFβ desempenha diversos papéis, incluindo inibição da proliferação e diferenciação, indução de atrofia, e desenvolvimento de fibrose. TGFβ reduz a proliferação celular satélite e previne a diferenciação (por meio de inibição de MyoD e miogenina) (Allen, R.E. e L.K. J. Cell. Physiol., 1987. 133 (3): páginas 567-72; Brennan, T.J., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991. 88 (9): páginas

3.822-6; Massague, J., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986. 83 (21): páginas 8.206-10; Olson, E.N., e cols., J. Cell. Biol., 1986. 103 (5): páginas 1.799-805). A isoforma de TGFβ (ou seja, TGFβ1, 2 ou 3) não está especificada nesses trabalhos iniciais, mas supõe-se que seja TGFβ1. TGFβ também contribui para a fibrose muscular; a injeção direta de TGFβ1 recombinante resulta em fibrose muscular esquelética, e a pan-inibição de TGFβ diminui a fibrose no músculo lesado de forma aguda e cronicamente (Li, Y., e cols., Am. J. Pathol., 2004. 164 (3): páginas 1.007- 19; Mendias, C.L., e cols., Muscle Nerve, 2012. 45 (1): páginas 55-9; Nelson, C.A., e cols., Am. J. Pathol., 2011. 178 (6): páginas 2.611-21). TGFβ1 é expresso por miofibras, macrófagos, células T reguladoras, fibroblastos e fibrócitos dentro do músculo esquelético (Li, Y., e cols., Am. J. Pathol., 2004. 164 (3): páginas 1.007-19; Lemos, D.R., e cols., Nat. Med., 2015. 21 (7): páginas 786-94; Villalta, S.A., e cols., Sci. Transl. Med., 2014. 6(258): páginas 258ra142; Wang, X., e cols., J. Immunol., 2016. 197 (12): páginas 4.750-4.761); e a expressão é aumentada mediante lesão e em doença (Li, Y., e cols., Am. J. Pathol., 2004. 164 (3): páginas 1.007-19; Nelson, C.A., e cols., Am. J. Pathol., 2011. 178 (6): páginas 2.611-21; Bernasconi, P., e cols., J. Clin. Invest., 1995. 96 (2): páginas 1.137-44; Ishitobi, M., e cols., Neuroreport, 2000. 11 (18): páginas

4.033-5). TGFβ2 e TGFβ3 também estão supra-regulados (no nível de mRNA) em músculo mdx, embora em uma extensão menor do que TGFβ1 (Nelson, C.A., e cols., Am. J. Pathol., 2011. 178 (6): páginas 2.611-21; Zhou, L., e cols., Neuromuscul. Disord., 2006. 16 (1): páginas 32-8). Pessina, e cols., recentemente usaram experimentos de rastreamento de linhagem para mostrar que células de múltiplas origens dentro de músculo distrófico adotam a destino fibrogênico por meio de uma via TGFβ-dependente (Pessina, P., e cols., Stem Cell Reports, 2015. 4 (6): páginas 1.046-60).

[00750] O osso é o maior depósito de TGFβ no corpo. Na verdade, acredita-se que a via de TGFβ desempenhe um papel importante na homeostasia e remodelagem ósseas, pelo menos em parte por regulação da diferenciação de osteoblasto e/ou reabsorção óssea osteoclástica. Esse processo está envolvido em situações tanto normais quanto anormais que, quando desregulado, pode causar ou exacerbar doença, por exemplo, condições e câncer relacionados aos ossos. Dessa forma, inibidores TGFβ1-seletivos, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para tratar essas condições. Em algumas modalidades, a administração desses inibidores é eficaz para restaurar ou normalizar o equilíbrio de formação-reabsorção ósseas. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 é administrado aos indivíduos em conjunto com outra terapia, por exemplo, um inibidor de miostatina e/ou agentes de reforço ósseo, como terapia combinada.

[00751] Condições ósseas (por exemplo, doenças esqueléticas) incluem osteoporose, displasia, osteogênese imperfeita e câncer ósseo. Além do câncer ósseo primário que se origina no osso, muitas malignidades são conhecidas por metastizar para os ossos; essas incluem, sem limitação, câncer de mama, câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma de célula escamosa), câncer da tireóide, câncer testicular, carcinoma de célula renal, câncer de próstata e mieloma múltiplo.

[00752] Entre as condições relacionadas aos ossos, a osteogênese imperfeita é uma condição genética que é normalmente causada por mutações que afetam genes que codificam colágeno tipo I e causa ossos frágeis que se quebram muito facilmente. Atualmente, há poucas opções de tratamento, em que fármacos de bisfosfonato permanecem o padrão de cuidados. Antígenos ou fragmentos de ligação ao antígeno que inibem seletivamente a ativação de TGFβ1 podem ser usados para tratar osteogênese imperfeita isoladamente como monoterapia ou em conjunto com outra terapia destinada a tratar a doença.

[00753] Os efeitos terapêuticos de inibidores de TGFβ1, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo,

podem ser monitorados com o uso de biomarcadores adequados, por exemplo, marcadores séricos de formação (fosfatase alcalina atividade) ou reabsorção (fosfatase ácida resistente ao tartrato) ósseas.

[00754] Em algumas modalidades, essas condições estão associadas com fraqueza muscular.

[00755] Em algumas modalidades, a condição musculoesquelética envolve desregulação de células- tronco/progenitoras miogênicas e não miogênicas associadas ao sistema musculoesquelético, por exemplo, células satélites. O inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo pode ser usado para promover expansão/diferenciação de células- tronco/progenitoras miogênicas e não miogênicas.

[00756] TGFβ1 pode participar de condições fibróticas que acompanham inflamação crônica do tecido afetado, por exemplo, distrofias musculares humanas. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença grave, progressiva e por fim fatal causada pela ausência de distrofina (Bushby, K., e cols., Lancet Neurol., 2010. 9 (1): páginas 77-93). A ausência de distrofina resulta em suscetibilidade aumentada à lesão induzida por contração, levando à degeneração muscular contínua (Petrof, B.J., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993. 90 (8): páginas 3.710-4; Dellorusso, C., e cols., J. Muscle Res. Cell. Motil., 2001. 22 (5): páginas 467-75; Pratt, S.J., e cols., Cell. Mol. Life Sci., 2015. 72 (1): páginas 153-64). Rodadas repetidas de reparo contribuem para a inflamação crônica, fibrose, exaustão do pool de células satélite, eventual perda de mobilidade e morte (Bushby, K., e cols., Lancet Neurol., 2010. 9 (1): páginas 77-93; McDonald, C.M., e cols., Muscle Nerve, 2013. 48 (3):

páginas 343-56). A expressão de TGFβ1 está significantemente aumentada em pacientes com DMD e se correlaciona com a extensão de fibrose observada nesses pacientes (Bernasconi, P., e cols., J. Clin. Invest., 1995. 96 (2): páginas 1.137- 44; Chen, Y.W., e cols., Neurology, 2005. 65 (6): páginas 826-34). A deposição excessiva da ECM possui efeitos prejudiciais sobre as propriedades contráteis do músculo e pode limitar acesso à nutrição, na medida em que as miofibras são isoladas de sua irrigação sanguínea (Klingler, W., e cols., Acta Myol., 2012. 31 (3): páginas 184-95). Recentemente, dados adicionais implicaram ainda mais TGFβ1 nas distrofias musculares. Foi verificado que variantes em LTBP4 modificam a gravidade da doença em camundongos e humanos. Em camundongos, uma variante de LTBP4 é protetora em camundongos que não possuem distrofina ou γ-sarcoglicano (Coley, W.D., e cols., Hum. Mol. Genet., 2016. 25 (1): páginas 130-45; Heydemann, A., e cols., J. Clin. Invest.,

2009. 119 (12): páginas 3.703-12). Em humanos, dois grupos independentemente identificaram uma variante de LTBP4 como protetora na DMD, retardando a perda de deambulação por vários anos (Flanigan, K.M., e cols., Ann. Neurol., 2013. 73 (4): páginas 481-8; van den Bergen, J.C., e cols., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2015. 86 (10): páginas 1.060-5). Embora a natureza das variantes genéticas em camundongos e humanos difira, em ambas as espécies da variante protetora resultam em sinalização de TGFβ diminuída (Heydemann, A., e cols., J. Clin. Invest., 2009. 119 (12): páginas 3.703-12); Ceco, E., e cols., Sci. Transl. Med., 2014. 6 (259): página 259ra144). Muitas das funções de TGFβ1 na biologia do músculo esquelético foram deduzidas de experimentos nos quais o fator do crescimento ativo purificado é injetado em animais ou adicionado às células em cultura (Massague, J., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986. 83 (21): páginas 8.206- 10; Li, Y., e cols., Am. J. Pathol., 2004. 164 (3): páginas 1007-19; Mendias, C.L., e cols., Muscle Nerve, 2012. 45 (1): páginas 55-9). Considerando a importância do contexto celular para funções específicas de TGFβ1 (veja, por exemplo, Hinck e cols., Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2016. 8 (12)) é possível que alguns dos efeitos observados nesses experimentos não reflitam o papel (ou papéis) endógeno da citocina in vivo. Por exemplo, o tratamento de fibroblastos dérmicos humanos com TGFβ1 recombinante, miostatina ou GDF11 resulta em alterações quase idênticas na expressão gênica nessas células, embora os papéis in vivo dessas proteínas sejam bem diferentes (Tanner, J.W., Khalil, A., Hill, J., Franti, M., MacDonnell, S.M., “Growth Differentiation Factor 11 Potentiates Myofibroblast Activation, in Fibrosis: From Basic Mechanisms to Targeted Therapies”. 2016: Keystone, CO).

[00757] Vários pesquisadores usaram inibidores de TGFβ para esclarecer o papel do fator do crescimento in vivo. O tratamento de camundongos mdx com o anticorpo pan-TGFβ neutralizante 1D11 nitidamente resulta em fibrose reduzida (por histologia e teor de hidroxiprolina), dano muscular reduzido (creatina quinase sérica reduzida e densidade de miofibras maior), e função muscular melhorada (por pletismografia, a geração de força por músculos EDL isolados, e força de apreensão da pata dianteira aumentada) (Nelson, C.A., e cols., Am. J. Pathol., 2011. 178 (6): páginas 2.611- 21; Andreetta, F., e cols., J. Neuroimmunol., 2006. 175 (1-

2): páginas 77-86; Gumucio, J.P., e cols., J. Appl. Physiol. (1985), 2013. 115 (4): páginas 539-45). Além disso, a expressão miofibra-específica de um receptor de TGFβ do tipo II negativo dominante protege contra danos musculares após lesão por cardiotoxina e em camundongos δ-sarcoglicano-/- (Accornero, F., e cols., Hum. Mol. Genet., 2014. 23 (25): páginas 6.903-15). O proteoglicano decorina, que é abundante no músculo esquelético e inibe a atividade de TGFβ, diminui a fibrose muscular em camundongos mdx e após lesão por laceração (Li, Y., e cols., Mol. Ther., 2007. 15 (9): páginas

1.616-22; Gosselin, L.E., e cols., Muscle Nerve, 2004. 30 (5): páginas 645-53). Outras moléculas com atividade inibidora de TGFβy, por exemplo, suramina (um agente antineoplásico) e losartan (um bloqueador do receptor de angiotensina) foram eficazes na melhora da patologia muscular e na redução de fibrose em modelos em camundongo de lesão, síndrome de Marfan e distrofia muscular (Spurney, C.F., e cols., J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther., 2011. 16 (1): páginas 87-95; Taniguti, A.P., e cols., Muscle Nerve,

2011. 43 (1): páginas 82-7; Bedair, H.S., e cols., Am. J. Sports Med., 2008. 36 (8): páginas 1.548-54; Cohn, R.D., e cols., Nat. Med., 2007. 13 (2): páginas 204-10). Embora todos os agentes terapêuticos descritos acima realmente inibam TGFβ1 ou sua sinalização, nenhum deles é específico para a isoforma TGFβ1. Por exemplo, 1D11 se liga e inibe as isoformas de TGFβ1, 2 e 3 (Dasch, J.R., e cols., J. Immunol.,

1989. 142 (5): páginas 1.536-41). Suramina inibe a habilidade de vários fatores do crescimento de se ligar aos seus receptores, incluindo PDGF, FGF e EGF, além de TGFβ1 (Hosang, M., J. Cell. Biochem., 1985. 29 (3): páginas 265-73; Olivier,

S., e cols., Eur. J. Cancer, 1990. 26 (8): páginas 867-71; Scher, H.I. e W.D. Heston, Cancer Treat. Res., 1992. 59: páginas 131-51). Decorina também inibe a atividade de miostatina, tanto por ligação direta quanto por meio da supra-regulação de folistatina, um inibidor de miostatina (Miura, T., e cols., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006. 340 (2): páginas 675-80; Brandan, E., C. Cabello-Verrugio, e C. Vial, Matrix Biol., 2008. 27 (8): páginas 700-8; Zhu, J., e cols., J. Biol. Chem., 2007. 282 (35): páginas 25.852- 63). Losartan afeta vias de sinalização adicionais por meio de seus efeitos sobre o sistema renina-angiotensina- aldosterona, incluindo a via IGF-1/AKT/mTOR (Burks, T.N., e cols., Sci. Transl. Med., 2011. 3 (82): página 82ra37; Sabharwal, R. e M.W. Chapleau, Exp. Physiol., 2014. 99 (4): páginas 627-31; McIntyre, M., e cols., Pharmacol. Ther.,

1997. 74 (2): páginas 181-94). Portanto, todas essas terapias inibem moléculas adicionais que podem contribuir para seus efeitos terapêuticos, bem como toxicidades.

[00758] Considerando o papel de TGFβ postulado na homeostasia, reparo e regeneração musculares, agentes, por exemplo, anticorpos monoclonais descritos nesse relatório descritivo, que modulam seletivamente a sinalização de TGFβ1 podem ser eficazes para o tratamento de fibras musculares danificadas, por exemplo, em distrofias musculares crônicas/genéticas e lesões musculares agudas, sem as toxicidades associadas com os inibidores de TGFβ de ação mais ampla desenvolvidos até hoje.

[00759] Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de fibras musculares danificadas com o uso de um agente que modula preferencialmente um subconjunto, mas não todos, dos efeitos de TGFβ in vivo. Esses agentes podem modular seletivamente a sinalização de TGFβ1 (“modulação isoforma-específica”). Reparo de fibra muscular em doenças musculares crônicas

[00760] A invenção engloba métodos para aumentar a qualidade e função musculares em pacientes com DMD, por limitação de fibrose e contribuindo para uma normalização da morfologia e função musculares. Como TGFβ1 também inibe a miogênese, o bloqueio de TGFβ1 pode promover a regeneração no músculo distrófico, adicionando ainda mais benefício terapêutico. Os inibidores de TGFβ1 podem ser usados em combinação com terapias de supra-regulação de distrofina, por exemplo, Exondys 51 (Eteplirsen). Considerando os benefícios terapêuticos potenciais da inibição de TGFβ1 na distrofia muscular, é crucial (1) diferenciar o papel (ou papéis) de TGFβ1 daqueles de TGFβ2 e TGFβ3, e (2) esclarecer em qual contexto (ou contextos) molecular a inibição de TGFβ1 seria a mais benéfica. Como mencionado acima, pan-inibidores TGFβ foram associados com toxicidades significantes, que limitam o uso clínico desses compostos (Anderton, M.J., e cols., Toxicol Pathol., 2011. 39 (6): páginas 916-24; Stauber, A., e cols., Clinical Toxicology, 2014. 4 (3): páginas 1-10). É incerto quais das isoformas de TGFβ causam essas toxicidades. Algumas das toxicidades descritas podem ser causadas pela inibição de TGFβ1 no sistema imune. Por exemplo, embora 1D11 reduzisse significantemente os níveis de fibrose no diafragma, o tratamento também aumentou os números de células T CD4+ e CD8+ no músculo, sugerindo uma resposta inflamatória aumentada mediante pan-inibição de TGFβ que seria prejudicial com o tratamento de longo prazo

(Andreetta, F., e cols., J Neuroimmunol., 2006. 175 (1-2): páginas 77-86). Na verdade, a depleção de células T do músculo melhora a patologia muscular de camundongos mdx, sugerindo que respostas inflamatórias mediadas por célula T são prejudiciais ao músculo distrófico (Spencer, M.J., e cols., Clin. Immunol., 2001. 98 (2): páginas 235-43). Aumentos nos números de células T após administração de 1D11 são provavelmente causados pelos efeitos de TGFβ1 em células T reguladoras (Treg). Tregs apresentam TGFβ1 em sua superfície celular por meio de GARP, e a liberação de TGFβ1 por esse complexo aumenta a atividade supressiva de Treg limitando, dessa forma, a inflamação mediada por células T (Wang, R., e cols., Mol. Biol. Cell., 2012. 23 (6): páginas

1.129-39; Edwards, J.P., A.M. Thornton e E.M. Shevach, J. Immunol., 2014. 193 (6): páginas 2.843-9; Nakamura, K., e cols., J. Immunol., 2004. 172 (2): páginas 834-42; Nakamura, K., A. Kitani e W. Strober, J. Exp. Med., 2001. 194 (5): páginas 629-44). Na verdade, a depleção de Tregs usando o anticorpo PC61 resultou em inflamação e dano muscular aumentados no diafragma de camundongos mdx, enquanto o aumento dos números e atividade de Treg reduziu o dano muscular (Villalta, S.A., e cols., Sci. Transl. Med., 2014. 6 (258): página 258ra142). Curiosamente, uma população adicional de células T imunossupressoras, células Tr1, foi recentemente identificada. Essas células produzem quantidades maiores de TGFβ3, o que é necessário para sua atividade supressiva (Gagliani, N., e cols., Nat. Med., 2013. 19 (6): páginas 739-46; Okamura, T., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2009. 106 (33): páginas 13.974-9; Okamura, T., e cols., Nat. Commun., 2015. 6: página 6.329). Embora o papel de células Tr1 no músculo esquelético seja desconhecido, existe a possibilidade de que a inibição de TGFβ1 e de TGFβ3 por 1D11 poderia ter efeitos pró- inflamatórios aditivos por inibição de células Tregs e Tr1.

[00761] Os esclarecimentos estruturais descritos acima em relação à latência e ativação de TGFβ1 permitem novas abordagens para a descoberta de fármacos que visam especificamente a ativação de TGFβ1 (Shi, M., e cols., Nature, 2011. 474 (7.351): páginas 343-9). O alto grau de identidade de sequência compartilhado entre os três fatores do crescimento TGFβ maduros não é compartilhado pelos complexos latentes, permitindo a descoberta de anticorpos que são perfeitamente específicos para pró-TGFβ1. Com o uso de abordagens proprietárias para a descoberta de anticorpos, os presentes inventores identificaram anticorpos (Ab1, Ab2 e Ab3) que se ligam especificamente a pró-TGFβ1. Com o uso de um sistema de cocultura in vitro, foi demonstrado que esses anticorpos inibem a liberação de TGFβ1 mediada por integrina. Nesse sistema, fibroblastos derivados da pele humana ou de músculos esqueléticos de camundongos são a fonte de TGFβ1 latente, uma linhagem de células que expressam αVβ6 permite a liberação de TGFβ1 ativo, que é então medido com o uso de uma terceira linhagem de células que expressam um repórter de luciferase responsivo a SMAD2/3 (FIG. 12). Um desses anticorpos, Ab1, foi testado in vivo e demonstrou eficácia no modelo em camundongos de UUO (obstrução ureteral unilateral) de fibrose renal. Nesse modelo, o tratamento de camundongos (n = 10) com 9 mg/kg/semana de Ab1 evitou a supra-regulação de genes responsivos ao TGFβ1 e reduziu a extensão de fibrose após lesão (por coloração com Vermelho-

Picrosirius). Terapias TGFβ1-específicas podem ter eficácia e perfis de segurança aprimorados comparadas com inibidores pan-TGFβ, um aspecto crucial para uma terapêutica que seria usada a longo prazo como na população de DMD. Anticorpos inibidores de TGFβ1 podem ser usados para determinar se a inibição específica de TGFβ1 possui potencial como uma terapêutica para DMD ou outras doenças musculares, e para esclarecer o papel de TGFβ1 na regeneração do músculo esquelético. Lesões crônicas vs. agudas de miofibras e seleção de terapêuticas ótimas

[00762] No músculo normal, mas em regeneração após uma lesão aguda (por exemplo, lesão traumática a músculos ou neurônios motores de outro modo saudáveis), acredita-se que a infiltração inicial de macrófagos inflamatórios seja necessária para limpar o tecido danificado e secretar fatores (por exemplo, citocinas) necessários à ativação de células satélites. Subsequentemente, essas células mudam para o fenótipo M2 para dirigir a resolução da ferida.

[00763] Em contraste, em condições crônicas, por exemplo, doenças que incluem DMD, os macrófagos pró-inflamatórios predominavam em todos os momentos, e aquela mudança para M2 não ocorre (ou pelo menos não eficientemente o bastante), e os macrófagos pró-inflamatórios continuam a dirigir a inflamação e o dano muscular. Na DMD, a via de NFkB está perpetuamente ativa, resultando em inflamação constitutiva. Em algumas modalidades, portanto, um inibidor de NFkB pode ser administrado aos pacientes com DMD a fim de reduzir a inflamação crônica.

[00764] Dessa forma, em condições crônicas como, por exemplo, DMD, o foco terapêutico pode ser no reparo muscular, ao contrário de regeneração muscular. Isso porque as fibras musculares na DMD estão danificadas, mas não destruídas – elas são danificadas por rasgos na membrana, desregulação do transporte de cálcio e dano do ROS pelos macrófagos. Em comparação, em casos de lesões a músculos saudáveis, o foco terapêutico pode estar na regeneração. Por exemplo, em modelos de cardiotoxina, as fibras musculares são mortas e devem ser regeneradas. Isso simula o processo de recuperação após uma lesão traumática, por exemplo, lesão por esmagamento.

[00765] Evidências sugerem que LRRC33 é expresso em macrófagos peritoneais induzidos por tioglicolato, que possuem um fenótipo do tipo M2 (caracterizado pelo fato de que eles expressam altos níveis de Arginase, no iNOS, e altos níveis de CD206).

[00766] Em situações nas quais LRRC33 é expresso primariamente nas células M2 e nas quais sua apresentação de TGFβ1 (“contexto”) é importante para os efeitos de pró- cicatrização de feridas dessas células, pode ser benéfico ativar TGFβ1 mediado por LRRC33 para promover reparo e/ou miogênese. Por outro lado, em situações nas quais LRRC33 também é expresso nas células M1 pró-inflamatórias, então pode ser benéfico inibir TGFβ1 mediado por LRRC33, considerando que a inflamação dirige a fibrose, especialmente em um ambiente distrófico, por exemplo, DMD. Dessa forma, a identificação da fonte/contexto de TGFβ1 associado a doença pode ser uma etapa importante na seleção do modulador correto da sinalização de TGFβ, que informará qual nível de seletividade deve ser considerado (por exemplo,

moduladores de TGFβ1 contexto-independentes, isoforma- específicos, ou moduladores de TGFβ1 contexto-específicos; inibidores ou ativadores de TGFβ1 etc.).

[00767] Com exceção da inflamação crônica, a marca registrada da DMD é fibrose excessiva e progressiva. Na doença avançada, a fibrose é tão grave que ela pode, na verdade, isolar fibras musculares individuais de sua irrigação sanguínea. Ela também altera as propriedades contráteis do músculo. Em pacientes humanos, há uma forte correlação entre a extensão de supra-regulação de TGFβ1 e fibrose, e uma forte ligação entre a extensão de fibrose e desfechos negativos da mobilidade. Portanto, em algumas modalidades, inibidores de LTBP-pró-TGFβ1 podem ser administrados aos pacientes distróficos para a prevenção e/ou redução de fibrose para visar seletivamente os efeitos de TGFβ1 associados à ECM na doença. Em algumas modalidades, vários agentes isoforma- e/ou contexto-seletivos descritos nesse relatório descritivo podem ser empregados para obter a inibição da sinalização de TGFβ1 para evitar fibrose e promover a miogênese, mas sem que tenham efeitos indesejados sobre o sistema imune (por exemplo, por meio de GARP ou LRRC33). Condições que envolvem infra-regulação ou mutação de MHC

[00768] Indicações relacionadas ao TGFβ também podem incluir condições nas quais a classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) é deletada ou deficiente (por exemplo, infra-regulada). Essas condições incluem distúrbios genéticos nos quais um ou mais componentes da sinalização mediada por MHC estão defeituosos, bem como condições nas quais a expressão de MHC é alterada por outros fatores, por exemplo, câncer, infecções, fibrose e medicações.

[00769] Por exemplo, a infra-regulação de MHC I no tumor está associada com escape do tumor da vigilância imune. Na verdade, as estratégias de escape imune que visam evitar o reconhecimento de célula T, incluindo a perda de expressão de MHC classe I do tumor, são comumente encontradas em células malignas. Foi observado que o escape imune do tumor tem um efeito negativo sobre o desfecho clínico da imunoterapia do câncer, incluindo tratamento com anticorpos que bloqueiam moléculas do ponto de verificação imune (revisado, por exemplo, em: Garrido e cols. (2017) Curr. Opin. Immunol. 39: 44-51. “The Urgent Need to Recover MHC Class I in Cancers for Effective Immunotherapy”, incorporado por referência nesse relatório descritivo). Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 contexto-independentes, isoforma- seletivos, englobados pela presente revelação podem ser administrados como uma monoterapia ou em conjunto com outra terapia (por exemplo, inibidor do ponto de verificação, quimioterapia, radioterapia etc.) para desatar ou reforçar a imunidade anticâncer e/ou aumentar a responsividade ou a eficácia de outra terapia.

[00770] Em algumas modalidades, a infra-regulação de MHC está associada com resistência adquirida a uma terapia de câncer, por exemplo, CBT. É contemplado que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, de alta afinidade, podem ser usados para tratar pacientes que são responsivos primários de uma terapia de câncer, por exemplo, CBT, para reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência adquirida. Dessa forma, entre aqueles tratados com o inibidor de TGFβ1 que são responsivos primários da terapia de câncer, a ocorrência de resistência secundária ou adquirida à terapia de câncer ao longo do tempo pode ser reduzida.

[00771] A infra-regulação de proteínas de MHC classe I também está associada com certas doenças infecciosas, incluindo infecções virais, por exemplo, HIV. Veja, por exemplo, Cohen e cols. (1999) Immunity 10 (6): 661-671. “The Selective Downregulation of Class I Major Histocompatibility Complex Proteins by HIV-1 Protects HIV-Infected Cells from NK Cells”, incorporado nesse relatório descritivo por referência. Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 contexto- independentes, isoforma-seletivos, englobados pela presente revelação podem ser administrados como uma monoterapia ou em conjunto com outra terapia (por exemplo, terapia antiviral, terapia com inibidor de protease etc.) para desatar ou reforçar a imunidade do hospedeiro e/ou aumentar a responsividade ou eficácia de outra terapia. Condições que envolvem célula-tronco auto-renovação, regeneração tecidual e repopulação de células-tronco

[00772] Evidências sugerem que TGFβ1 participa na regulação da homeostasia de várias populações de células- tronco e sua diferenciação/repopulação dentro de um tecido. Durante homeostasia, células-tronco tecido-específicas são mantidas predominantemente quiescentes, mas são desencadeadas a entrar no ciclo celular mediante certo estresse. Acredita-se que TGFβ1 funcione como uma “pausa” durante o processo que regula firmemente a diferenciação e reconstituição de células-tronco, e o estresse que desencadeia a entrada no ciclo celular coincide com a inibição de TGFβ1 que remove a “pausa”. Dessa forma, é contemplado que inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados para desviar ou corrigir o ciclo celular e a decisão de entrada em G0 de células-tronco/células progenitoras dentro de um tecido particular.

[00773] Consequentemente, os inventores da presente revelação contemplam o uso de inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos em condições nas quais: i) a diferenciação/reconstituição de célula-tronco/célula progenitora é interrompida ou perturbada em decorrência de uma doença ou induzida como um efeito colateral de uma terapia/medicação; ii) os pacientes estão em uma terapia ou medicação que faz com que células saudáveis sejam mortas ou depletadas; iii) pacientes podem se beneficiar de diferenciação/reconstituição aumentada de célula- tronco/célula progenitora; iv) a doença está associada com diferenciação ou reconstituição anormal de células-tronco.

[00774] Na auto-renovação de tecidos, por exemplo, na medula óssea (produção de células sanguíneas) e na epiderme, o equilíbrio entre processos de proliferação e diferenciação é firmemente regulado para assegurar a manutenção da população de células-tronco durante o tempo de vida. Revisado por D’Arcangel e cols. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18 (7):

1.591. TGFβ1 atua como um regulador negativo potente do ciclo celular e supressor de tumor, em parte por meio da indução de inibidores de quinase ciclina-dependente, p15/INK4b, p21 e p57. Evidências sugerem que TGFβ1 contribui para a indução de p16/INK4a e p19/ARF para mediar parada do crescimento e senescência em certos tipos de células. Consequentemente, em algumas modalidades, um inibidor isoforma-seletivo de alta afinidade da ativação de TGFβ1, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo, é usado para regular senescência celular p16/INK4a-dependente e dinâmica de células-tronco em várias populações de células-tronco.

[00775] Por exemplo, células mesenquimais estromais/- tronco (MSCs) são uma pequena população de células estromais presentes na maioria dos tecidos conjuntivos do adulto, por exemplo, medula óssea, tecido gorduroso e sangue do cordão umbilical. MSCs são mantidas em um estado relativo de quiescência in vivo, mas, em resposta a diversos estímulos fisiológicos e patológicos, são capazes de proliferar e depois se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, adipócitos, ou outras linhagens do tipo mesoderma como células de músculo liso (SMCs) e cardiomiócitos. Várias redes de sinalização orquestram a diferenciação de MSCs em linhagens mesenquimais funcionais, entre as quais TGF-β1 emergiu como um participante crucial (revisado por exemplo, por Zhao & Hantash (2011. Vitam. Horm. 87: 127-41).

[00776] Similarmente, células-tronco hematopoiéticas são necessárias para produção duradoura de células sanguíneas; para evitar a exaustão, a maioria das células-tronco hematopoiéticas permanece quiescente durante a hematopoiese no estado de equilíbrio. Durante estresse hematológico, no entanto, essas células são rapidamente recrutadas no ciclo celular e passam por auto-renovação e diferenciação intensas para atender às demandas hematopoiéticas aumentadas. TGFβ1 pode funcionar como o “interruptor” para controlar a transição/equilíbrio quiescência-repopulação.

[00777] Dessa forma, os inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos podem ser usados no tratamento de condições que envolvem defeitos da célula-tronco hematopoiética e falência da medula óssea. Em algumas modalidades, a depleção ou deficiência do reservatório de células-tronco hematopoiéticas leva à falência hematopoiética ou a malignidades hematológicas. Em algumas modalidades, essas condições são distúrbios de reparo de DNA caracterizados por falência progressiva da medula óssea. Em algumas modalidades, essa condição é causada por atrito de célula- tronco e progenitora. Em algumas modalidades, essas condições estão associadas com anemia. Em algumas modalidades, essa condição é Anemia de Fanconi (FA). Em algumas modalidades, essas condições são caracterizadas por uma via de TGFβ hiperativa que suprime a sobrevida de certos tipos de células mediante dano de DNA. Dessa forma, é contemplado que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos podem ser usados para o resgate de defeitos de proliferação de células-tronco hematopoiéticas da FA e/ou falência da medula óssea em indivíduos com FA. Veja, por exemplo, Zhang e cols. (2016), Cell Stem Cell, 18: 668-681, “TGF-β Inhibition Rescues Hematopoietic Stem Cell Defects and Bone Marrow Failure in Fanconi Anemia”. Condições que envolvem desregulação hematopoiética induzida por tratamento

[00778] É reconhecido que certos fármacos que são projetados para tratar várias condições de doença, frequentemente induzem ou exacerbam anemia no paciente que está sendo tratado (por exemplo, anemia induzida por tratamento ou por fármacos, por exemplo, anemia induzida por quimioterapia e anemia induzida por radioterapia). Em algumas modalidades, o paciente é tratado com um fármaco mielossupressor que pode causar efeitos colaterais que incluem anemia. Esse paciente pode se beneficiar da inibição farmacológica de TGFβ1 a fim de reforçar a hematopoiese. Em algumas modalidades, o inibidor de TGFβ1 pode promover hematopoiese em pacientes por prevenção da entrada em um estado quiescente. Em algumas modalidades, o paciente pode receber uma terapia com G-CSF (por exemplo, Filgrastim).

[00779] Consequentemente, a invenção inclui o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, por exemplo, aqueles revelados nesse relatório descritivo, para ser administrado aos pacientes que recebem terapia mielossupressora (por exemplo, terapia com efeitos colaterais que incluem efeitos mielossupressores). Exemplos de terapias mielossupressoras incluem, sem limitação: peginterferon alfa-2a, interferon alfa-n3, peginterferon alfa-2b, aldesleucina, gemtuzumab ozogamicina, interferon alfacon-1, rituximab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab, alemtuzumab, bevacizumab, L- Fenilalanina, bortezomib, cladribina, carmustina, amsacrina, clorambucil, raltitrexed, mitomicina, bexaroteno, vindesina, floxuridina, tioguanina, vinorelbina, dexrazoxano, sorafenib, estreptozocina, gemcitabina, teniposida, epirrubicina, cloranfenicol, lenalidomida, altretamina, zidovudina, cisplatina, oxaliplatina, ciclofosfamida, fluoruracil, propiltiouracil, pentostatina, metotrexato, carbamazepina, vinblastina, linezolid, imatinib, clofarabina, pemetrexed, daunorrubicina, irinotecan, metimazol, etoposida, dacarbazina, temozolomida, tacrolimus, sirolimus, mecloretamina, azacitidina, carboplatina, dactinomicina, citarabina, doxorrubicina, hidroxiuréia, bussulfan, topotecan, mercaptopurina, talidomida, melfalan,

fludarabina, flucitosina, capecitabina, procarbazina, trióxido arsênico, idarrubicina, ifosfamida, mitoxantrona, lomustina, paclitaxel, docetaxel, dasatinib, decitabina, nelarabina, everolimus, vorinostat, tiotepa, ixabepilona, nilotinib, belinostat, trabectedina, trastuzumab entansina, temsirolimus, bosutinib, bendamustina, cabazitaxel, eribulina, ruxolitinib, carfilzomib, tofacitinib, ponatinib, pomalidomida, obinutuzumab, fosfato de tedizolida, blinatumomab, ibrutinib, palbociclib, olaparib, dinutuximab e colchicina.

[00780] Indicações relacionadas ao TGFβ adicionais podem incluir qualquer uma daquelas reveladas em Publicação U.S. Nº 2013/0122007, Patente U.S. Nº 8.415.459 ou Publicação International Nº WO 2011/151432, cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[00781] Em modalidades preferidas, anticorpos, porções de ligação ao antígeno destes, e composições da revelação podem ser usados para tratar uma ampla variedade de doenças, distúrbios e/ou condições associadas com sinalização de TGFβ1. Em algumas modalidades, tecidos/células-alvo preferencialmente expressam a isoforma TGFβ1 em relação às outras isoformas. Dessa forma, a invenção inclui métodos para o tratamento de uma condição desse tipo associada com expressão de TGFβ1 (por exemplo, desregulação de sinalização de TGFβ1 e/ou supra-regulação de expressão de TGFβ1) usando uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste descrito nesse relatório descritivo.

[00782] Em algumas modalidades, a doença envolve TGFβ1 associado com (por exemplo, apresentado ou depositado por) múltiplas fontes celulares. Em algumas modalidades, essa doença envolve tanto um componente imune quanto um componente da ECM de função de TGFβ1. Em algumas modalidades, essa doença envolve: i) desregulação da ECM (por exemplo, superprodução/deposição de componentes da ECM como, por exemplo, colágenos e proteases; rigidez alterada do substrato da ECM; ativação ou diferenciação anormal ou patológica de fibroblastos, por exemplo, miofibroblastos e CAFs); ii) supressão em consequência de Tregs aumentadas e/ou células T efetoras (Teff) suprimidas, por exemplo, proporções elevadas de Treg/Teff; infiltrado leucocitário aumentado (por exemplo, macrófagos e MDSCs) que causa supressão de células T CD4 e/ou CD8; e/ou iii) ativação, diferenciação, e/ou recrutamento anormal ou patológico de células mielóides, por exemplo, macrófagos (por exemplo, monócitos/macrófagos derivados da medula óssea e macrófagos residentes no tecido), monócitos, células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSCs), neutrófilos, células dendríticas e células NK.

[00783] Em algumas modalidades, a condição envolve TGFβ1 apresentado por mais de um tipo de moléculas apresentadoras (por exemplo, dois ou mais de: GAPR, LRRC33, LTBP1 e/ou LTBP3). Em algumas modalidades, tecidos/órgãos/células afetados incluem TGFβ1 de várias fontes celulares. Apenas como exemplo, um tumor sólido (que também pode incluir uma doença proliferativa que envolve a medula óssea, por exemplo, mielofibrose e mieloma múltiplo) pode incluir TGFβ1 de várias fontes, por exemplo, das células de câncer, células estromais, células saudáveis circundantes e/ou células imunes infiltrantes (por exemplo, leucócitos CD45+), que envolvem tipos diferentes de moléculas apresentadoras. Células imunes relevantes incluem, sem limitação, células mielóides e células linfóides, por exemplo, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos (por exemplo, células B, células T e células NK), e monócitos. Inibidores de TGFβ1 contexto-independentes podem ser úteis para o tratamento dessas condições.

[00784] Exemplos não limitantes de condições ou distúrbios que podem ser tratados com inibidores de TGFβ1 isoforma-específicos contexto-independentes, por exemplo, anticorpos ou fragmentos destes descritos nesse relatório descritivo, são fornecidos abaixo. Regime de tratamento, administração

[00785] Para a prática do método revelado nesse relatório descritivo, uma quantidade eficaz da composição farmacêutica descrita acima pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, um humano) que necessita do tratamento por meio de uma via adequada, por exemplo, administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intra-cérebro-espinhal, subcutânea, intra- articular, intra-sinovial, intratecal, oral, por inalação ou por via tópica. Nebulizadores disponíveis comercialmente para formulações líquidas, incluindo nebulizadores de jato e nebulizadores ultra-sônicos, são úteis para administração. Formulações líquidas podem ser nebulizadas diretamente e o pó liofilizado pode ser nebulizador após reconstituição. Alternativamente, anticorpos ou porções de ligação ao antígeno destes que se ligam especificamente a um complexo

GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 podem ser aerossolizados usando uma formulação de fluorcarbono e um inalador dosimetrado, ou inalados como um pó liofilizado e triturado.

[00786] O indivíduo a ser tratado pelos métodos descritos nesse relatório descritivo podem ser um mamífero, mais preferivelmente um humano. Mamíferos incluem, sem limitação, animais de criação, animais de esporte, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos. Um indivíduo humano que necessita do tratamento pode ser um paciente humano que possui, está em risco ou é suspeito de ter uma indicação relacionada ao TGFβ, tais como aquelas observadas acima. Um indivíduo que possui uma indicação relacionada ao TGFβ pode ser identificado por exame médico de rotina, por exemplo, testes laboratoriais, testes funcionais de órgãos, varreduras por TC, ou ultra-sons. Um indivíduo suspeito de ter qualquer indicação desse tipo pode exibir um ou mais sintomas da indicação. Um indivíduo em risco para a indicação pode ser um indivíduo que possui um ou mais dos fatores de risco para aquela indicação.

[00787] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “quantidade eficaz” e “dose eficaz” se referem a qualquer quantidade ou dose de um composto ou composição que é suficiente para atender seu objetivo (ou objetivos) desejado, ou seja, uma resposta biológica ou medicinal desejada em um tecido ou indivíduo em uma proporção risco/benefício aceitável. Por exemplo, em certas modalidades da presente invenção, o objetivo desejado pode ser inibir a ativação de TGFβ1 in vivo, para obter um resultado final clinicamente significativo associado à inibição de TGFβ1. As quantidades eficazes variam, como reconhecido por aqueles habilitados na técnica, dependendo da condição particular que está sendo tratada, da gravidade da condição, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição física, tamanho, sexo e peso, da duração do tratamento, da natureza da terapia atual (se houver), da via de administração específica e de fatores semelhantes dentro do conhecimento e experiência do profissional de saúde. Esses fatores são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem ser abordados com, no máximo, experimentação de rotina. Prefere-se geralmente que uma dose máxima dos componentes individuais ou combinações destes seja usada, ou seja, a maior dose segura de acordo com uma avaliação médica sólida. Será subentendido por aqueles habilitados na técnica, no entanto, que um paciente pode insistir em uma dose menor ou uma dose tolerável por razões médicas, razões fisiológicas ou por praticamente quaisquer outras razões.

[00788] Considerações empíricas, por exemplo, a meia- vida, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imune humano, por exemplo, anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo e para evitar que o anticorpo seja atacado pelo sistema imune do hospedeiro. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do ciclo de terapia, e é geralmente, mas não necessariamente, baseada no tratamento e/ou supressão e/ou melhora e/ou retardo de uma indicação relacionada ao TGFβ. Alternativamente, formulações de liberação sustentada contínua de um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 podem ser adequadas. Diversas formulações e dispositivos para obtenção de liberação sustentada seriam evidentes para aqueles habilitados na técnica e estão dentro do escopo dessa revelação.

[00789] Em um exemplo, dosagens para um anticorpo descrito nesse relatório descritivo podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações do anticorpo. Os indivíduos recebem dosagens incrementais do antagonista. Para avaliar a eficácia, um indicador da indicação relacionada ao TGFβ pode ser acompanhado. Por exemplo, métodos para medição de dano de miofibra, reparo de miofibra, níveis de inflamação no músculo e/ou níveis de fibrose no músculo são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00790] A presente invenção engloba o reconhecimento de que agentes capazes de modular a etapa de ativação de TGFβs de um modo isoforma-específico podem fornecer perfis de segurança aprimorados quando usados como um medicamento. Consequentemente, a invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno destes que se ligam e inibem especificamente a ativação de TGFβ1, mas não de TGFβ2 ou TGFβ3 conferindo, dessa forma, inibição específica da sinalização de TGFβ1 in vivo minimizando, ao mesmo tempo, os efeitos colaterais indesejados decorrentes da alteração da sinalização de TGFβ2 e/ou TGFβ3.

[00791] Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, como descritos nesse relatório descritivo, não são tóxicos quando administrados a um indivíduo. Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, como descritos nesse relatório descritivo, exibem toxicidade reduzida quando administrados a um indivíduo comparados com um anticorpo que se liga especificamente tanto ao TGFβ1 quanto ao TGFβ2. Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, como descritos nesse relatório descritivo, exibem toxicidade reduzida quando administrados a um indivíduo, comparados com um anticorpo que se liga especificamente tanto ao TGFβ1 quanto ao TGFβ3. Em algumas modalidades, os anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno destes, como descritos nesse relatório descritivo, exibem toxicidade reduzida quando administrados a um indivíduo, comparados com um anticorpo que se liga especificamente ao TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3.

[00792] Geralmente, para administração de qualquer um dos anticorpos descritos nesse relatório descritivo, uma dosagem candidata inicial pode ser cerca de 1-20 mg/kg por administração, por exemplo, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente etc. Por exemplo, os pacientes podem receber uma injeção de cerca de 1-10 mg/kg por 1 semana, por 2 semanas, por 3 semanas ou por 4 semanas etc., em uma quantidade eficaz para tratar uma doença (por exemplo, câncer) em que a quantidade é bem tolerada (dentro de toxicidades ou eventos adversos aceitáveis).

[00793] Para os objetivos da presente revelação, uma dosagem típica (por administração, por exemplo, uma injeção e infusão) pode variar de cerca de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que uma supressão desejada de sintomas ocorra ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam obtidos para aliviar uma indicação relacionada ao TGFβ, ou um sintoma desta. Por exemplo, uma dosagem eficaz adequada para Ab6 pode ser entre 1 mg/kg e 30 mg/kg (por exemplo, 1-10 mg/kg, 1-15 mg/kg, 3- 20 mg/kg, 5-30 mg/kg etc.) dosada duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada 4 semanas ou uma vez por mês. Uma dose eficaz adequada para Ab6 inclui cerca de 1 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, por exemplo, dosada semanalmente.

[00794] Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose inicial, seguida por uma ou mais doses manutenção. Por exemplo, uma dose inicial pode ser entre cerca de 1 e 30 mg/kg, por exemplo, uma vez por semana ou duas vezes por semana. A seguir, doses de manutenção podem ser administradas, por exemplo, entre cerca de 0,1 e 20 mg/kg, por exemplo, uma vez por semana, em semanas alternadas, uma vez por mês etc. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis, dependendo do padrão de queda farmacocinética que o profissional deseja obter. Experimentos de farmacocinética demonstraram que a concentração sérica de um anticorpo revelado nesse relatório descritivo (por exemplo, Ab3) permanece estável por pelo menos 7 dias após administração a um modelo animal pré- clínico (por exemplo, um modelo em camundongo). Sem se prender a uma teoria em particular, essa estabilidade pós- administração pode ser vantajosa, na medida em que o anticorpo pode ser administrado menos frequentemente mantendo, ao mesmo tempo, uma concentração sérica clinicamente eficaz no indivíduo ao qual o anticorpo é administrado (por exemplo, um indivíduo humano). Em algumas modalidades, a frequência de dosagem é de uma vez a cada semana, a cada 2 semanas, a cada 4 semanas, a cada 5 semanas, a cada 6 semanas, a cada 7 semanas, a cada 8 semanas, a cada 9 semanas ou a cada 10 semanas; ou uma vez a cada mês, a cada 2 meses ou a cada 3 meses, ou mais longa. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o anticorpo usado) pode variar ao longo do tempo.

[00795] Em algumas modalidades, para um paciente adulto de peso normal, doses que variam de cerca de 0,3 a 5,00 mg/kg podem ser administradas. O regime de dosagem particular, por exemplo, dose, momento e repetição, dependerá do indivíduo particular e da história médica daquele indivíduo, bem como das propriedades dos agentes individuais (por exemplo, da meia-vida do agente, e de outras considerações relevantes).

[00796] As concentrações séricas do anticorpo isoforma- seletivo de alta afinidade que são terapeuticamente eficazes para tratar uma indicação relacionada ao TGFβ1 de acordo com a presente revelação podem ser pelo menos cerca de 10 µg/mL, por exemplo, entre cerca de 10 µg/mL e 1,0 mg/mL. Em algumas modalidades, quantidades eficazes do anticorpo como medidas pelas concentrações séricas são cerca de 20-400 µg/mL. Em algumas modalidades, quantidades eficazes do anticorpo como medidas pelas concentrações séricas são cerca de 100-800 µg/mL. Em algumas modalidades, quantidades eficazes do anticorpo como medidas pelas concentrações séricas are pelo menos cerca de 20 µg/mL, por exemplo, pelo menos cerca de 50 µg/mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL ou 200 µg/mL. Como detalhado no Exemplo 12 nesse relatório descritivo, em primatas não humanos, não foram observadas toxicidades (por exemplo: nenhuma cardiotoxicidade, hiperplasia e inflamação, achados dentais e gengivais) associadas com Ab6 após manutenção de níveis de concentração sérica de cerca de 2.000-3.000 µg/mL por pelo menos 8 semanas. Portanto, uma janela terapêutica de cerca de 10-100 vezes pode ser obtida.

[00797] Para os objetivos da presente revelação, a dosagem apropriada de um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1- TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 dependerá do anticorpo específico (ou composições deste) empregado, do tipo e severidade da indicação, se o anticorpo é administrado para fins preventos ou terapêuticos, de terapia prévia, da história clínica e resposta do paciente ao antagonista, e a critério do médico assistente. Em algumas modalidades, um médico irá administrar um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1, até que seja obtida uma dosagem que obtenha o resultado desejado. A administração de um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do recebedor, se o objetivo da administração é terapêutico ou profilático, e de outros fatores conhecidos pelos profissionais habilitados. A administração do anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo

LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 pode ser basicamente contínua ao longo de um período de tempo pré- selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas, por exemplo, antes, durante ou depois do desenvolvimento de uma indicação relacionada ao TGFβ.

[00798] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “tratamento” se refere à aplicação ou administração de uma composição que inclui um ou mais agentes ativos a um indivíduo, que possui uma indicação relacionada ao TGFβ, um sintoma da indicação, ou uma predisposição para a indicação, com o objetivo de curar, cicatrizar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, aprimorar ou afetar a indicação, o sintoma da indicação, ou a predisposição para a indicação.

[00799] O alívio uma indicação relacionada ao TGFβ com um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP- TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 inclui o retardo do desenvolvimento ou progressão da indicação, ou a redução da gravidade da indicação. O alívio da indicação não exige necessariamente resultados curativos. Como usado nesse relatório descritivo, o “retardo” do desenvolvimento de uma indicação associada com uma indicação relacionada ao TGFβ significa postergar, impedir, tornar mais lenta, retardar, estabilizar e/ou adiar a progressão da indicação. Esse retardo pode ser de comprimentos de tempo variáveis, dependendo da história da indicação e/ou dos indivíduos que estão sendo tratados. Um método que “retarda” ou alivia o desenvolvimento de uma indicação, ou retarda o surgimento da indicação, é um método que reduz a probabilidade de desenvolvimento de um ou mais sintomas da indicação em certo intervalo de tempo e/ou reduz a extensão dos sintomas em certo intervalo de tempo, quando comparado com a não utilização do método. Essas comparações se baseiam tipicamente em estudos clínicos, usando um número de indivíduos suficiente para gerar um resultado estatisticamente significante.

[00800] Camundongos DBA2/J possuem uma deleção de 40 bp no alelo de LTBP4. A desregulação da ECM à qual TGFB1 latente está associado pode expor o epitopo ao qual Ab1 se liga. Pode haver doenças nas quais o epitopo ao qual Ab1 se liga fica exposto, e aquelas doenças podem ser oportunidades terapêuticas para Ab1 se a inibição de TGFB1 estiver indicada. Terapia combinada

[00801] A revelação ainda engloba composições farmacêuticas e métodos relacionados usados como terapias combinadas para o tratamento de indivíduos que podem se beneficiar da inibição de TGFβ in vivo. Em qualquer uma dessas modalidades, esses indivíduos podem receber terapias combinadas que incluem uma primeira composição que compreende pelo menos um inibidor de TGFβ, por exemplo, anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste, descrito nesse relatório descritivo, em conjunto com uma segunda composição que compreende pelo menos uma terapêutica adicional destinada a tratar a mesma doença ou condição clínica ou uma doença ou condição clínica sobreposta. A primeira e segunda composições podem, ambas, atuar no mesmo alvo celular, ou em alvos celulares distintos. Em algumas modalidades, a primeira e segunda composições podem tratar ou aliviar o mesmo conjunto de sintomas ou aspectos de uma doença ou condição clínica ou conjunto de sintomas ou aspectos de uma doença ou condição clínica sobrepostos. Em algumas modalidades, a primeira e segunda composições podem tratar ou aliviar um conjunto separado de sintomas ou aspectos de uma doença ou condição clínica. Apenas como exemplo, a primeira composição pode tratar uma doença ou condição associada à sinalização de TGFβ, enquanto a segunda composição pode tratar inflamação ou fibrose associada com a mesma doença etc. Essas terapias combinadas podem ser administradas em conjunto entre elas. A frase “em conjunto com”, no contexto de terapias combinadas, significa que os efeitos terapêuticos de uma primeira terapia podem se sobrepor temporariamente e/ou espacialmente com os efeitos terapêuticos de uma segunda terapia no indivíduo que recebe a terapia combinada. Dessa forma, as terapias combinadas podem ser formuladas como uma formulação única para administração concomitante, ou como formulações separadas, para administração sequencial das terapias.

[00802] Em modalidades preferidas, terapias combinadas produzem efeitos sinérgicos no tratamento de uma doença. O termo “sinérgico” se refere aos efeitos que são maiores do que efeitos aditivos (por exemplo, maior eficácia) de cada monoterapia individual.

[00803] Em algumas modalidades, terapias combinadas que compreendem uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo produzem eficácia que é equivalente, no geral, àquela produzida por outra terapia (por exemplo, monoterapia de um segundo agente), mas estão associadas com menos efeitos adversos indesejados ou toxicidade menos severa associada ao segundo agente, comparada com a monoterapia do segundo agente. Em algumas modalidades, essas terapias combinadas permitem uma dosagem menor do segundo agente, mas mantêm a eficácia global. Essas terapias combinadas podem ser particularmente adequadas para populações de pacientes nas quais um tratamento de longo prazo é recomendado e/ou que envolvem pacientes pediátricos.

[00804] Consequentemente, a invenção fornece composições farmacêuticas e métodos para uso em terapias combinadas para a redução da ativação da proteína de TGFβ1 e para o tratamento ou prevenção de doenças ou condições associadas com sinalização de TGFβ1, como descrito nesse relatório descritivo. Consequentemente, os métodos ou as composições farmacêuticas ainda compreendem uma segunda terapia. Em algumas modalidades, a segunda terapia pode ser útil no tratamento ou prevenção de doenças ou condições associadas à sinalização de TGFβ1. A segunda terapia pode diminuir ou tratar pelo menos um sintoma (ou sintomas) associado à doença visada. A primeira e segunda terapias podem exercer seus efeitos biológicos por mecanismos de ação similares ou não relacionados; ou uma ou tanto a primeira quanto a segunda terapia podem exercer seus efeitos biológicos por diversos mecanismos de ação.

[00805] Deve ser subentendido que as composições farmacêuticas descritas nesse relatório descritivo podem ter a primeira e segunda terapias no mesmo carreador farmaceuticamente aceitável ou em um carreador farmaceuticamente aceitável diferente para cada modalidade descrita. Deve ainda ser subentendido que a primeira e segunda terapias podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente dentro de modalidades descritas.

[00806] Os (um ou mais) anticorpos anti-TGFβ da invenção,

ou porções de ligação ao antígeno destes, podem ser usados em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Exemplos dos agentes terapêuticos adicionais que podem ser usados com um anticorpo anti-TGFβ da invenção incluem, sem limitação: vacinas contra o câncer, terapias com células imunes modificadas geneticamente, quimioterapias, radioterapias, um modulador de um membro da superfamília TGFβ, por exemplo, um inibidor de miostatina e um inibidor de GDF11; um agonista de VEGF; um agonista de IGF1; um agonista de FXR; um inibidor de CCR2; um inibidor de CCR5; um inibidor duplo de CCR2/CCR5; um inibidor de CCR4, um inibidor de lisil oxidase-like-2; um inibidor de ASK1; um inibidor de Acetil-CoA Carboxilase (ACC); um inibidor de p38 quinase; Pirfenidona; Nintedanib; um inibidor de M-CSF (por exemplo, antagonista do receptor de M-CSF e agentes neutralizantes de M-CSF); um inibidor de MAPK (por exemplo, inibidor de Erk), um agonista ou antagonista do ponto de verificação imune; um antagonista de IL-11; e um antagonista de IL-6 e semelhantes. Outros exemplos dos agentes terapêuticos adicionais que podem ser usados com os inibidores de TGFβ incluem, sem limitação, um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO), um inibidor de arginase, um inibidor de tirosina quinase, inibidor de Ser/Thr quinase, um inibidor de quinase duplo-específico. Em algumas modalidades, esse agente pode ser um inibidor de PI3K, um inibidor de PKC ou um inibidor de JAK.

[00807] Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor do ponto de verificação. Em algumas modalidades, o agente adicional é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de PD-1, um antagonista de PDL1, uma fusão proteína de PD-L1 ou PDL2, um antagonista de CTLA4, um agonista de GITR, um anticorpo anti-ICOS, um anticorpo anti- ICOSL, um anticorpo anti-B7H3, um anticorpo anti-B7H4, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-LAG3, um anticorpo anti-OX40 (agonista de OX40), um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD70, um anticorpo anti-CD47, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-PD-1, um vírus oncolítico e um inibidor de PARP. Em algumas modalidades, o inibidor contexto-independente, de alta afinidade, da ativação de TGFβ1 revelado nesse relatório descritivo é usado no tratamento de câncer em um indivíduo que é um responsivo pobre ou não-responsivo de uma terapia de inibição do ponto de verificação, por exemplo, aqueles listados nesse relatório descritivo.

[00808] Em algumas modalidades, o agente adicional se liga a uma molécula de coestimulação de célula T, por exemplo, moléculas de coestimulação inibidoras e moléculas de coestimulação ativadoras. Em algumas modalidades, o agente adicional é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD40, um anticorpo anti-CD38, um anticorpo anti-KIR, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-CD137 e um anticorpo anti-CD74.

[00809] Em algumas modalidades, a terapia adicional é radiação. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente quimioterápico. Em algumas modalidades, o agente quimioterápico é Taxol. Em algumas modalidades, o agente adicional é um agente antiinflamatório. Em algumas modalidades, o agente adicional inibe o processo de recrutamento e/ou infiltração tecidual de monócitos/macrófagos. Em algumas modalidades, o agente adicional é um inibidor da ativação da célula estrelada hepática. Em algumas modalidades, o agente adicional é um antagonista do receptor de quimiocina, por exemplo, antagonistas de CCR2 e antagonistas de CCR5. Em algumas modalidades, esse antagonista do receptor de quimiocina é um antagonista específico duplo, por exemplo, um antagonista de CCR2/CCR5. Em algumas modalidades, o agente adicional a ser administrado como terapia combinada é ou compreende um membro da superfamília TGFβ de fatores do crescimento ou reguladores destes. Em algumas modalidades, esse agente é selecionado de moduladores (por exemplo, inibidores e ativadores) de GDF8/miostatina e GDF11. Em algumas modalidades, esse agente é um inibidor da sinalização de GDF8/miostatina. Em algumas modalidades, esse agente é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um complexo de miostatina pró/latente e bloqueia a ativação de miostatina. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um complexo de miostatina pró/latente e bloqueia a ativação de miostatina não se liga à miostatina madura, livre.

[00810] Em algumas modalidades, uma terapia adicional compreende terapia com CAR-T.

[00811] Em algumas modalidades, uma terapia adicional é uma vacina contra o câncer. Diversos experimentos clínicos que testaram vacinas contra o câncer à base de peptídeo foram direcionados às malignidades hematológicas (cânceres do sangue), melanoma (câncer de pele), câncer de mama, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastroesofágico, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer ovariano e cânceres cólon-retais. Os antígenos incluíam peptídeos de HER2, telomerase (TERT), survivina (BIRC5) e tumor de Wilms 1 (WT1). Vários experimentos também usaram misturas “personalizadas” de 12-15 peptídeos distintos. Ou seja, elas contêm uma mistura de peptídeos do tumor do paciente contra os quais o paciente exibe uma resposta imune. Alguns experimentos se direcionam a tumores sólidos, glioma, glioblastoma, melanoma e cânceres de mama, cervical, ovariano, cólon-retal e de pulmão de célula não pequena, e incluem antígenos de MUC1, IDO1 (Indolamina 2,3- dioxigenase), CTAG1B, e dois receptores de VEGF, FLT1 e KDR. Notavelmente, a vacina de IDO1 é testada em pacientes com melanoma em combinação com o inibidor do ponto de verificação imune ipilimumab e o inibidor de BRAF (gene) vemurafenib.

[00812] Exemplos não limitantes de antígenos tumorais úteis como vacinas contra o câncer incluem: NY-ESO-1, HER2, HPV16 E7 (Papillomaviridae#E7), CEA (antígeno carcinoembrionário), WT1, MART-1, gp100, tirosinase, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, surviving, MUC1 e MUC2.

[00813] Células imunes ativadas sensibilizadas por essa vacina contra o câncer, no entanto, podem ser excluídas do TME, em parte por meio de mecanismos TGFβ1-dependentes. Para superar a imunossupressão, o uso de inibidores de TGFβ1 contexto-independentes de alta afinidade da presente revelação pode ser considerado de modo a desatar o potencial da vacina.

[00814] As terapias combinadas contempladas nesse relatório descritivo podem utilizar vantajosamente dosagens menores dos agentes terapêuticos administrados evitando, dessa forma, possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias. Em algumas modalidades, o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico descrito nesse relatório descritivo pode tornar aqueles que são pouco responsivos ou não responsivos a uma terapia (por exemplo, padrão de cuidados) mais responsivos. Em algumas modalidades, o uso de um inibidor de TGFβ1 isoforma- específico descrito nesse relatório descritivo pode permitir a dosagem reduzida da terapia (por exemplo, padrão de cuidados), que ainda produz eficácia clínica equivalente em pacientes, mas menos ou graus menores de toxicidades ou eventos adversos relacionados ao fármaco.

[00815] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos contemplados nesse relatório descritivo podem ser usados em conjunto com (por exemplo, terapia combinada, terapia complementar etc.) um inibidor de TGFβ3 isoforma-seletivo. Esse uso pode ainda compreender terapia adicional, por exemplo, terapia de câncer, por exemplo, inibidor do ponto de verificação imune, vacina contra o câncer, radioterapia e/ou quimioterapia.

[00816] Em algumas modalidades, os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos contemplados nesse relatório descritivo podem ser usados em conjunto com (por exemplo, terapia combinada, terapia complementar etc.) um inibidor seletivo de miostatina (GDF8). Diagnóstico, seleção de pacientes, monitoramento

[00817] Métodos terapêuticos que incluem terapia com inibição de TGFβ1 podem compreender o diagnóstico de uma indicação de TGFβ1 e/ou seleção de pacientes com probabilidade de responder a essa terapia. Adicionalmente, pacientes que recebem o inibidor de TGFβ1 podem ser monitorados quanto aos efeitos terapêuticos do tratamento, o que tipicamente envolve a mediação de um ou mais parâmetros adequados que são indicativos da condição e que podem ser medidos (por exemplo, testados) antes e depois do tratamento, e avaliação de alterações relacionadas ao tratamento nos parâmetros. Por exemplo, esses parâmetros podem incluir os níveis de biomarcadores presentes em amostras biológicas coletadas dos pacientes. Biomarcadores podem ser baseados em RNA, baseados em proteína, baseados em células e/ou baseados em tecidos. Por exemplo, genes que estão superexpressos em certas condições de doença podem servir como os biomarcadores para diagnosticar e/ou monitorar a doença ou resposta à terapia. Proteínas de superfície celular de populações de células associadas à doença podem servir como biomarcadores. Esses métodos podem incluir as medições diretas de parâmetros de doença indicativos da extensão da doença particular, por exemplo, tamanho/volume tumoral. Qualquer método de amostragem adequado pode ser empregado, por exemplo, amostras de soro/sangue, biópsias e imageamento. A biópsia pode incluir biópsias de tecido (por exemplo, tumor) e biópsias de líquido.

[00818] Embora biópsias tenham sido tradicionalmente o padrão para o diagnóstico e monitoramento de várias doenças, por exemplo, fibrose (por exemplo, fibrose de órgão) e distúrbios proliferativos (por exemplo, câncer), alternativas menos invasivas podem ser preferidas. Por exemplo, muitas técnicas não invasivas de imageamento in vivo podem ser usadas para diagnosticar, monitorar e selecionar pacientes para tratamento. Dessa forma, a invenção inclui o uso de técnicas de imageamento in vivo para diagnosticar e/ou monitorar doença em um paciente ou indivíduo. Em algumas modalidades, o paciente ou indivíduo está recebendo um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico como descrito nesse relatório descritivo. Em outras modalidades, uma técnica de imageamento in vivo pode ser usada para selecionar pacientes para o tratamento com um inibidor de TGFβ1 isoforma-específico. Em algumas modalidades, essas técnicas podem ser usadas para determinar se ou como os pacientes respondem a uma terapia, por exemplo, terapia com inibição de TGFβ1.

[00819] Técnicas de imageamento in vivo exemplares usadas para os métodos incluem, sem limitação, radiografia com Raios-X, imageamento por ressonância magnética (MRI), ultrassonografia ou ultrassom médico, endoscopia, elastografia, imageamento tátil, termografia, fotografia médica. Outras técnicas de imageamento incluem imageamento funcional por medicina nuclear, por exemplo, tomografia por emissão de pósitron (PET) e tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT). Métodos para a realização dessas técnicas e análise dos resultados são conhecidos na técnica.

[00820] Técnicas de imageamento não invasivas comumente usadas para diagnosticar e monitorar câncer incluem, sem limitação: imageamento por ressonância magnética (MRI), tomografia computadorizada (CT), ultrassom, tomografia por emissão de pósitron (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), imageamento por refletância de fluorescência (FRI) e tomografia mediada por fluorescência (FMT). Plataformas de imageamento híbridas também podem ser usadas para diagnosticar e monitorar câncer. Por exemplo, técnicas híbridas incluem, sem limitação: PET- CT, FMT-CT, FMT-MRI e PET-MRI. MRI aprimorada com contraste dinâmico (DCE-MRI) é outra técnica de imageamento comumente usada para detectar cânceres de mama. Métodos para a realização dessas técnicas e análise dos resultados são conhecidos na técnica.

[00821] Técnicas de imageamento não invasivas comumente usadas para diagnosticar e monitorar fibrose incluem, sem limitação: ultrassom (por exemplo, convencional ou ultrassom aprimorado com contraste), elastografia por ultrassom (por exemplo, elastografia transitória, elastografia por onda de cisalhamento pontual e elastografia 2D com onda de cisalhamento), varredura por CT (por exemplo, CT convencional ou imageamento por CT por perfusão), imageamento por ressonância magnética (MRI) (por exemplo, MRI convencional, elastografia por ressonância magnética, imageamento por ressonância magnética ponderada por difusão, ácido gadoxético dissódico e imageamento por ressonância magnética por perfusão).

[00822] Em algumas modalidades, técnicas não invasivas de imageamento são usadas para avaliar os níveis de fibrose hepática ou de esteatose hepática. Por exemplo, técnicas de imageamento particularmente úteis para avaliar fibrose hepática podem incluir, sem limitação: FibroScan (elastografia transitória; TE), elastografia por onda de cisalhamento pontual (pSWE; também denominada radiação acústica da força de impulso (ARFI)), SWE 2D-3D, elastografia por ressonância magnética (MRE) e MRI multiparamétrica. Técnicas de imageamento particularmente úteis para avaliar esteatose hepática podem incluir, sem limitação: ultrassonografia, elastografia com parâmetro de atenuação controlada (CAP), fração de gordura por densidade de próton estimada por MRI (MRI-PDFF) e espectroscopia por ressonância magnética (MRS). Em algumas modalidades, a técnica de imageamento in vivo é usada para avaliar a rigidez do fígado. Em algumas modalidades, a técnica de imageamento in vivo é usada para detectar e avaliar níveis intra-hepáticos de triglicerídeos. Em algumas modalidades, a técnica de imageamento in vivo é usada para avaliar a nodularidade da superfície do fígado (LSN; também denominada “pontuação hepática”), rigidez do fígado, e/ou proporção do volume segmentar do fígado (LSVR), que são, todas, benéficas no estadiamento da fibrose hepática e subestadiamento de cirrose. Métodos para a realização dessas técnicas e análise dos resultados são conhecidos na técnica.

[00823] Mais recentemente, estão sendo desenvolvidos métodos não invasivos de imageamento que permitirão a detecção de células de interesse (por exemplo, células T citotóxicas, macrófagos e células de câncer) in vivo. Veja, por exemplo, www.imaginab.com/technology/; Tavare e cols. (2014) PNAS, 111 (3): 1.108-1.113; Tavare e cols. (2015) J. Nucl. Med. 56 (8): 1.258-1.264; Rashidian e cols. (2017) J. Exp. Med. 214 (8): 2.243-2.255; Beckford Vera e cols. (2018) PLoS ONE 13 (3): e0193832; e Tavare e cols. (2015) Cancer Res. 76 (1): 73-82, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência. O denominado “rastreamento de células T” visa detectar e localizar células T efetoras antitumorais in vivo. Isso pode fornecer informações úteis para compreensão do fenótipo imunossupressor de tumores sólidos. Tumores que estão bem infiltrados com células T citotóxicas (tumores “inflamados” ou “quentes”) têm maior probabilidade de responder às terapias de câncer, por exemplo, terapia de bloqueio do ponto de verificação (CBT). Por outro lado, tumores com fenótipos imunossupressores tendem a ter infiltração de células T pobre, mesmo quando há uma resposta imune antitumoral. Esses denominados tumores “imuno-excluídos” provavelmente não respondem às terapias de câncer, por exemplo, CBT. As técnicas de rastreamento de células T podem revelar esses fenótipos diferentes e fornecer informação para guiar a abordagem terapêutica que provavelmente beneficiaria os pacientes. Por exemplo, pacientes com um tumor “imuno-excluído” têm probabilidade de se beneficiar de uma terapia com inibidor de TGFβ1 para ajudar a reverter o fenótipo imunossupressor. É contemplado que técnicas similares podem ser usadas para diagnosticar e monitorar outras doenças, por exemplo, fibrose. Tipicamente, anticorpos ou moléculas do tipo anticorpo modificadas geneticamente com uma porção de detecção (por exemplo, radiomarcador, fluorescência etc.) podem ser infundidas em um paciente, que então distribuirá e localizará para locais do marcador particular (por exemplo CD8+ e macrófagos M2).

[00824] As técnicas não invasivas de imageamento in vivo podem ser aplicadas em diversos métodos adequados para fins de diagnóstico de pacientes; seleção ou identificação de pacientes que provavelmente se beneficiarão de terapia com inibidor de TGFβ1; e/ou, monitoramento de pacientes quanto à resposta terapêutica mediante tratamento. Quaisquer células com um marcador da superfície celular conhecidos podem ser detectadas/localizadas em virtude do emprego de um anticorpo ou moléculas similares que se ligam especificamente ao marcador celular. Tipicamente, as células a serem detectadas pelo uso dessas técnicas são células imunes, por exemplo, linfócitos T citotóxicos, células T reguladoras, MDSCs, macrófagos associados à doença (macrófagos M2, por exemplo, TAMs e FAMs), células NK, células dendríticas e neutrófilos.

[00825] Exemplos não limitantes de marcadores de célula imune adequados incluem marcadores de monócitos, marcadores de macrófagos (por exemplo, marcadores de macrófagos M1 e/ou M2), marcadores de CTL, marcadores de células imunes supressoras, marcadores de MDSC (por exemplo, marcadores para MDSCs G e/ou M) incluindo, sem limitação: CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD206, CD68, CD14, CD15, CD66, CD34, CD25 e CD47.

[00826] As técnicas de imageamento in vivo descritas acima podem ser empregadas para detectar, localizar e/ou rastrear certas MDSCs em um paciente diagnosticado com uma doença associada ao TGFβ1, por exemplo, câncer e fibrose. Indivíduos saudáveis possuem uma frequência baixa ou ausente de MDSCs em circulação. Com o surgimento ou a progressão de uma doença desse tipo, níveis elevados de MDSCs circulantes e/ou associadas à doença podem ser detectados. Por exemplo, foi relatado que M-MDSCs CCR2-positivas se acumulam em tecidos com inflamação e podem causar progressão de fibrose no tecido (por exemplo, fibrose pulmonar), e foi mostrado que isso se correlaciona com expressão de TGFβ1. Similarmente, MDSCs estão enriquecidas em diversos tumores sólidos (incluindo câncer de mama triplo-negativo) e em parte contribuem para o fenótipo imunossupressor do TME. Portanto, a resposta ao tratamento à terapia com inibição de TGFβ1 de acordo com a presente revelação pode ser monitorada por localização ou rastreamento de MDSCs. A redução ou a frequência baixa de MDSCs detectáveis é tipicamente indicativa de benefícios terapêuticos ou prognóstico melhor.

[00827] Muitos cânceres humanos sabidamente causam níveis elevados de MDSCs em pacientes, comparados com controle saudável (revisado, por exemplo, em Elliott e cols. (2017) “Human Tumor-Infiltrating Myeloid Cells: Phenotypic and Functional Diversity”, “Frontiers in Immunology”, Vol. 8, Artigo 86). Esses cânceres humanos incluem, sem limitação: câncer da bexiga, câncer cólon-retal, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, NSCL, câncer ovariano, câncer pancreático, e carcinoma de célula renal. Níveis elevados de MDSCs podem ser detectados em amostras biológicas como, por exemplo, células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e amostras de tecido (por exemplo, biópsia tumoral). Por exemplo, a frequência ou alterações no número de MDSCs pode ser medida como: percentual (%) de PBMCs totais, percentual (%) de células CD14+, percentual (%) de células CD45+; percentual (%) de células mononucleares, percentual (%) de células totais, percentual (%) de células CD11b+, percentual (%) de monócitos, percentual (%) de MNCs não linfocíticas, percentual (%) de células KLA-DR, usando marcadores da superfície celular adequados (fenótipo).

[00828] Adicionalmente, usando marcadores de célula imune, no caso de câncer, é possível determinar se o tumor possui um fenótipo imuno-excluído. Se o tumor é determinado como tendo um fenótipo imuno-excluído, a terapia de câncer (por exemplo, CBT) isoladamente pode não ser eficaz, pois o tumor não possui células citotóxicas suficientes dentro do ambiente tumoral. Dessa forma, uma terapia complementar com um inibidor de TGFβ1, tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo, pode reduzir a imunossupressão tornando, dessa forma, o tumor resistente à terapia de câncer mais responsivo a uma terapia de câncer. É contemplado que marcadores imunes também poderiam ser usados para rastrear células imunes no contexto fibrótico, e/ou determinar a composição de células imunes de tecido fibrótico (por exemplo, para rastrear a presença de macrófagos e/ou miofibroblastos).

[00829] Consequentemente, a invenção também inclui um método para o tratamento de uma doença ou condição relacionada ao TGFβ1 que pode compreender as seguintes etapas: i) seleção de um paciente diagnosticado com uma doença ou condição relacionada ao TGFβ1; e, ii) administração ao paciente de um anticorpo ou o fragmento englobado nesse relatório descritivo em uma quantidade eficaz para tratar a doença ou condição. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende a detecção de marcadores de doença (por exemplo, marcadores de fibrose ou câncer, como descrito nesse relatório descritivo) em que, opcionalmente, a detecção compreende a análise de biópsia, análise de marcador sérico e/ou imageamento in vivo. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende uma técnica de imageamento in vivo, como descrito nesse relatório descritivo.

[00830] Em algumas modalidades, a doença ou condição relacionada ao TGFβ1 é uma condição fibrótica. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende a detecção de células de miofibroblastos, ou um ou mais marcadores destas. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende a detecção de esteatose hepática, triglicerídeos hepáticos, células imunes e/ou miofibroblastos. Em algumas modalidades, a detecção compreende a análise de biópsia, análise de marcador sérico e/ou imageamento in vivo. Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende ultrassom, ultrassom elastografia, varredura por CT, MRI, PET-SPECT, fluorescência/bioluminescência óptica FibroScan (TE), pSWE, SWE 2D-3D, MRE, ultrassonografia, CAP, MRI-PDFF e/ou MRS. Em algumas modalidades, imageamento in vivo compreende marcação direta ou indireta de células imunes ou anticorpo que se liga a um marcador da superfície celular de células imunes. Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende o uso de um traçador.

[00831] Em algumas modalidades, a técnica de imageamento in vivo mede esteatose hepática, triglicerídeos hepáticos, células imunes (por exemplo, como descrito abaixo), e/ou miofibroblastos. Em algumas modalidades, o tratamento reduz triglicerídeos, esteatose, nódulos da superfície do fígado, inflamação e/ou macrófagos, no tecido doente. Em algumas modalidades, o tratamento reduz o teor de triglicerídeos intra-hepáticos para ≤ 5,5%. Em algumas modalidades, o tratamento reduz MDSCs no tecido doente. Em algumas modalidades, o tratamento reduz macrófagos no tecido doente. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg, opcionalmente 3 mg/kg a 30 mg/kg. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o monitoramento do indivíduo para uma resposta terapêutica, como descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, triglicerídeos reduzidos, esteatose reduzida, nódulos da superfície do fígado reduzidos, inflamação reduzida, macrófagos reduzidos e/ou pontuação hepática reduzida).

[00832] A invenção também inclui um método para o tratamento de câncer que pode compreender as seguintes etapas: i) seleção de um paciente diagnosticado com câncer que compreende um tumor sólido, em que o tumor sólido é ou é suspeito de ser um tumor imuno-excluído; e, ii) administração ao paciente de um anticorpo ou o fragmento englobado nesse relatório descritivo em uma quantidade eficaz para tratar o câncer. De preferência, o paciente recebeu, ou é um candidato para receber, uma terapia de câncer, por exemplo, terapias imunes de inibição do ponto de verificação (por exemplo, anticorpos contra PD-(L)1), quimioterapias, radioterapias, terapias com células imunes modificadas geneticamente, e terapias com vacina contra o câncer. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende a detecção de células imunes ou de um ou mais marcadores destas em que, opcionalmente, a detecção compreende uma análise de biópsia tumoral, análise de marcador sérico e/ou imageamento in vivo. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende uma técnica de imageamento in vivo, como descrito nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o monitoramento para uma resposta terapêutica, como descrito nesse relatório descritivo.

[00833] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo é realizado para o monitoramento de uma resposta terapêutica à terapia com inibição de TGFβ1 no indivíduo. O imageamento in vivo pode compreender qualquer uma das técnicas de imageamento descritas nesse relatório descritivo e mede qualquer um dos marcadores e/ou parâmetros descritos nesse relatório descritivo. Por exemplo, no caso de fibrose hepática, a resposta terapêutica pode compreender esteatose hepática reduzida, teor de triglicerídeos reduzido, deposição reduzida de ECM/fibrose, cirrose reduzida e/ou progressão de doença reduzida. Em algumas modalidades, o tratamento com um inibidor de TGFB1 isoforma-específico como descrito nesse relatório descritivo reduz o teor de triglicerídeos intra-hepáticos para níveis de ≤ 5,5%, como medido por MRI. No caso de câncer, a resposta terapêutica pode compreender a conversão de um tumor imuno-excluído em um tumor inflamado (o que se correlaciona com infiltração aumentada de células imunes em um tumor), tamanho tumoral reduzido, e/ou progressão de doença reduzida. A infiltração aumentada de células imunes pode ser visualizada por frequência de células imunes intratumorais ou pelo grau de sinais de detecção aumentados, por exemplo, radiomarcação e fluorescência.

[00834] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo usado para o diagnóstico, seleção, tratamento ou monitoramento de pacientes compreende rastreamento de MDSC, por exemplo, G-MDSCs (também conhecidas como PMN-MDSCs) e M- MDSCs. Por exemplo, MDSCs podem estar enriquecidas em um local de doença (por exemplo, tecidos fibróticos e tumores sólidos) na linha de base. Mediante terapia (por exemplo, terapia com inibidor de TGFβ1), menos MDSCs podem ser observadas, como medido por intensidade reduzida do marcador (por exemplo, radioisótopo e fluorescência), indicativa de efeitos terapêuticos.

[00835] Em algumas modalidades, o imageamento in vivo compreende rastreamento ou localização de células LRRC33-

positivas. Células LRRC33-positivas incluem, por exemplo, MDSCs e macrófagos do tipo M2 ativados (por exemplo, TAMs e macrófagos ativados associados com tecidos fibróticos). Por exemplo, células LRRC33-positivas podem estar enriquecidas em um local de doença (por exemplo, tecidos fibróticos e tumores sólidos) na linha de base. Mediante terapia (por exemplo, terapia com inibidor de TGFβ1), menos células que expressam LRRC33 da superfície celular podem ser observadas, como medido por intensidade reduzida do marcador (por exemplo, radioisótopo e fluorescência), indicativa de efeitos terapêuticos.

[00836] Em algumas modalidades, as técnicas de imageamento in vivo descritas nesse relatório descritivo podem compreender o uso de PET-SPECT, MRI e/ou fluorescência/bioluminescência óptica a fim de detectar células de interesse.

[00837] Em algumas modalidades, a marcação de anticorpos ou moléculas do tipo anticorpo com uma porção de detecção pode compreender marcação direta ou marcação indireta.

[00838] Em algumas modalidades, a porção de detecção pode ser um traçador. Em algumas modalidades, o traçador pode ser um radioisótopo, em que, opcionalmente, o radioisótopo pode ser um isótopo emissor de pósitron. Em algumas modalidades, o radioisótopo é selecionado do grupo que consiste em: 18F, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 177Lu, 18F e 89Zr.

[00839] Dessa forma, esses métodos podem ser empregados para a realização de imageamento in vivo com o uso de anticorpos marcados em imuno-PET.

[00840] Consequentemente, a invenção também inclui um método para o tratamento de uma indicação de TGFβ1 em um indivíduo, que incorpora uma etapa de diagnóstico, seleção de pacientes, e/ou monitoramento de efeitos terapêuticos, que emprega uma técnica de imageamento. Em algumas modalidades, um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade de acordo com a presente revelação, é usado no tratamento de uma indicação de TGFβ1, em que o tratamento compreende a administração de uma quantidade eficaz do inibidor de TGFβ1 para tratar a indicação, e que ainda compreende uma etapa de monitoramento de efeitos terapêuticos no indivíduo por imageamento in vivo. Opcionalmente, o indivíduo pode ser selecionado como um candidato para receber a terapia com inibidor de TGFβ1, usando uma etapa diagnóstica ou de seleção que compreende imageamento in vivo. A indicação de TGFβ1 pode ser um distúrbio proliferativo (por exemplo, câncer com um tumor sólido e mielofibrose) ou um distúrbio fibrótico (por exemplo, fibrose de órgão).

[00841] Em algumas modalidades, o indivíduo possui câncer, em que o método compreende as seguintes etapas: i) seleção de um paciente diagnosticado com câncer que compreende um tumor sólido, em que o tumor sólido é ou é suspeito de ser um tumor imuno-excluído; e, ii) administração ao paciente de um anticorpo ou o fragmento englobado nesse relatório descritivo em uma quantidade eficaz para tratar o câncer. De preferência, o paciente recebeu, ou é um candidato para receber, uma terapia de câncer, por exemplo, terapias imunes de inibição do ponto de verificação (por exemplo, anticorpos contra PD-(L)1), quimioterapias, radioterapias, terapias com células imunes modificadas geneticamente, e terapias com vacina contra o câncer. Em algumas modalidades,

a etapa de seleção (i) compreende a detecção de células imunes ou de um ou mais marcadores destas, em que, opcionalmente, a detecção compreende uma análise de biópsia tumoral, análise de marcador sérico e/ou imageamento in vivo. Em algumas modalidades, a etapa de seleção (i) compreende uma técnica de imageamento in vivo como descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o monitoramento para uma resposta terapêutica, como descrito nesse relatório descritivo. Ensaios para a detecção de complexos Latentes Grandes (LLCs)

[00842] Em algumas modalidades, métodos e composições fornecidos nesse relatório descritivo estão relacionados a um método para a detecção de um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 em uma amostra obtida de um indivíduo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “indivíduo” se refere a um organismo individual, por exemplo, um mamífero individual. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um primata não humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um roedor. Em algumas modalidades, o indivíduo é um carneiro, uma cabra, gado, aves de criação, um gato ou um cão. Em algumas modalidades, o indivíduo é um vertebrado, um anfíbio, um réptil, um peixe, um inseto, uma mosca ou um nematódeo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal de pesquisa. Em algumas modalidades, o indivíduo é modificado geneticamente, por exemplo, um indivíduo não humano modificado geneticamente. O indivíduo pode ser de qualquer sexo e em qualquer estágio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente ou um voluntário saudável.

[00843] Em algumas modalidades, um método para a detecção de um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 em uma amostra obtida de um indivíduo envolve (a) contato da amostra com um anticorpo que se liga especificamente a um complexo GARP-TGFβ1, um complexo LTBP1-TGFβ1, um complexo LTBP3-TGFβ1 e/ou um complexo LRRC33-TGFβ1 sob condições adequadas à ligação do anticorpo ao antígeno, caso o antígeno esteja presente na amostra formando, dessa forma, complexos de ligação; e (b) determinação do nível do anticorpo ligado ao antígeno (por exemplo, determinação do nível dos complexos de ligação.

[00844] Em uma modalidade, um ensaio de triagem que utiliza complexos de TGFβ1 latente biotinilados imobilizados sobre uma superfície, o que permite a ativação de TGFβ latente por integrinas por fornecimento de uma amarra. Outros ativadores, não integrina, também poderiam ser testados naquele sistema. A leitura pode ser por meio de células repórteres ou outras respostas celulares TGFβ-dependentes. Ensaios baseados em células para medição da ativação de TGFβ

[00845] A ativação de TGFβ (e sua inibição por um inibidor de TGFβ de teste, por exemplo, um anticorpo) pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a ativação de TGFβ mediada por integrina pode ser utilizada em um ensaio de potência baseado em células, por exemplo, o ensaio repórter “CAGA12” (por exemplo, luciferase), descrito em mais detalhe nesse relatório descritivo. Como mostrado, um sistema de ensaio desse tipo pode compreender os seguintes componentes: i) uma fonte de

TGFβ (recombinante, endógena ou transfectada); ii) uma fonte de ativador, por exemplo, integrina (recombinante, endógena ou transfectada); e iii) um sistema-repórter que responde à ativação de TGFβ, por exemplo, células que expressam receptores de TGFβ capazes de responder ao TGFβ e traduzir o sinal em uma saída legível (por exemplo, atividade de luciferase em células CAGA12 ou outras linhagens de células repórteres). Em algumas modalidades, a linhagem de célula- repórter compreende um gene-repórter (por exemplo, um gene de luciferase) sob o controle de um promotor responsivo ao TGFβ (por exemplo, um promotor PAI-1). Em algumas modalidades, certos elementos promotores que conferem sensibilidade podem ser incorporados no sistema-repórter.

Em algumas modalidades, esse elemento promotor é o elemento de CAGA12. Linhagens de células repórteres que podem ser usadas no ensaio foram descritas, por exemplo, em Abe e cols. (1994) Anal Biochem. 216 (2): 276-84, incorporado nesse relatório descritivo por referência.

Em algumas modalidades, cada um dos componentes do ensaio mencionados anteriormente é fornecido da mesma fonte (por exemplo, na mesma célula). Em algumas modalidades, dois dos componentes do ensaio mencionados anteriormente são fornecidos pela mesma fonte, e um terceiro componente do ensaio é fornecido por uma fonte diferente.

Em algumas modalidades, todos os três componentes do ensaio são fornecidos por fontes diferentes.

Por exemplo, em algumas modalidades, a integrina e o complexo de TGFβ latente (pró-TGFβ e uma molécula apresentadora) são fornecidos para o ensaio pela mesma fonte (por exemplo, pela mesma linhagem de célula transfectada). Em algumas modalidades, a integrina e o TGF são fornecidos para o ensaio por fontes separadas (por exemplo, duas linhagens de células diferentes, uma combinação de integrina purificada e uma célula transfectada). Quando são usadas células como a fonte de um ou mais dos componentes do ensaio, esses componentes do ensaio podem ser endógenos à célula, expressos estavelmente na célula, transitoriamente transfectados, ou qualquer combinação destes.

[00846] Aqueles habilitados na técnica poderiam adaptar facilmente esses ensaios para várias configurações adequadas. Por exemplo, diversas fontes de TGFβ podem ser consideradas. Em algumas modalidades, a fonte de TGFβ é uma célula que expressa e deposita TGFβ (por exemplo, uma célula primária, uma célula propagada, uma célula ou linhagem de célula imortalizada etc.). Em algumas modalidades, a fonte de TGFβ é TGFβ purificado e/ou recombinante imobilizado no sistema de ensaio usando meios adequados. Em algumas modalidades, TGFβ imobilizado no sistema de ensaio é apresentado dentro de uma composição de matriz extracelular (ECM) na placa de ensaio, com ou sem descelularização, que simula TGFβ originado de fibroblasto. Em algumas modalidades, TGFβ é apresentado na superfície celular de uma célula usada no ensaio. Adicionalmente, uma molécula apresentadora de escolha pode ser incluída no sistema de ensaio para fornecer complexo TGFβ-latente adequado. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente determinar qual molécula (ou moléculas) apresentadora pode estar presente ou expressa em certas células ou tipos de células. Com o uso desses sistemas de ensaio, alterações relativas na ativação de TGFβ na presença ou ausência de um agente de teste (por exemplo, um anticorpo) podem ser facilmente medidas para avaliar os efeitos do agente de teste sobre a ativação de TGFβ in vitro. Dados de ensaios baseados em células exemplares são fornecidos na seção de Exemplos abaixo.

[00847] Esses ensaios baseados em células podem ser modificados ou ajustados de diversas formas, dependendo da isoforma de TGFβ que está sendo estudada, do tipo de complexo latente (por exemplo, molécula apresentadora), e semelhantes. Em algumas modalidades, uma célula que sabidamente expressa integrina capaz de ativar TGFβ pode ser usada como a fonte de integrina no ensaio. Essas células incluem células SW480/06 (por exemplo, clone 1E7). Em algumas modalidades, células que expressam integrina podem ser cotransfectadas com um plasmídeo que codifica uma molécula de apresentação de interesse (por exemplo, GARP, LRRC33, LTBP (por exemplo, LTBP1 ou LTBP3) etc.) e um plasmídeo que codifica uma pró-forma da isoforma de TGFβ de interesse (por exemplo, pró-TGFβ1). Após transfecção, as células são incubadas por tempo suficiente para permitir a expressão dos genes transfectados (por exemplo, cerca de 24 horas), as células são lavadas e incubadas com diluições seriais de um agente de teste (por exemplo, um anticorpo). A seguir, a linhagem de célula-repórter (por exemplo, células CAGA12) é adicionada ao sistema de ensaio, seguido por um tempo de incubação apropriado para permitir a sinalização de TGFβ. Após um período de incubação (por exemplo, cerca de 18-20 horas) após a adição do agente de teste, a leitura do sinal (por exemplo, atividade de luciferase) é detectada usando meios adequados (por exemplo, para linhagens de células repórteres que expressam luciferase, o reagente Bright-Glo (Promega) pode ser usado). Em algumas modalidades, a fluorescência de Luciferase pode ser detectada com o uso de uma leitora de placas BioTek (Synergy H1), com ajustes de autoganho.

[00848] Dados demonstram que anticorpos exemplares da invenção que são capazes de inibir seletivamente a ativação de TGFβ1 de uma forma contexto-independente. Ácidos nucleicos

[00849] Em algumas modalidades, anticorpos, porções de ligação ao antígeno destes e/ou composições da presente revelação podem ser codificados por moléculas de ácido nucleico. Essas moléculas de ácido nucleico incluem, sem limitação, moléculas de DNA, moléculas de RNA, polinucleotídeos, oligonucleotídeos, moléculas de mRNA, vetores, plasmídeos e semelhantes. Em algumas modalidades, a presente revelação pode compreender células programadas ou geradas para expressar moléculas de ácido nucleico que codificam compostos e/ou composições da presente revelação. Em alguns casos, os ácidos nucleicos da revelação incluem ácidos nucleicos códon-otimizados. Métodos de geração de ácidos nucleicos códon-otimizados são conhecidos na técnica e podem incluir, sem limitação, aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 5.786.464 e 6.114.148, cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Lista de algumas modalidades

[00850] Modalidades não limitantes da presente revelação são listadas abaixo:

1. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a cada um dos seguintes complexos de antígenos com uma KD de ≤ 10 nM, opcionalmente ≤ 5 nM, como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio: i) hLTBP1-pró-TGFβ1; ii) hLTBP3-pró-TGFβ1; iii) hGARP-pró-TGFβ1; e, iv) hLRRC33-pró-TGFβ1; em que o anticorpo ou o fragmento deste é um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou fragmento deste;

2. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a modalidade 1, que se liga a cada um dos complexos i) hLTBP1-pró-TGFβ1 e ii) hLTBP3-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 5 nM, como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio, em que, opcionalmente, o anticorpo ou o fragmento se liga a cada um dos complexos com uma KD de ≤ 1 nM como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio;

3. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a cada um dos seguintes complexos de antígenos com uma KD de ≤ 200 pM, opcionalmente ≤ 100 pM, como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio: i) hLTBP1-pró-TGFβ1; ii) hLTBP3-pró-TGFβ1; iii) hGARP-pró-TGFβ1; e, iv) hLRRC33-pró-TGFβ1; em que o anticorpo ou o fragmento deste é um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou fragmento deste;

4. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que compreende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3,

em que: a CDR-H1 possui uma sequência de aminoácidos representada por FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5), em que, opcionalmente, X1 é S, G ou A; X2 é S ou F; X3 é F ou Y; X4 é S ou A; e/ou, X5 é D, N ou Y (ID. DE SEQ. N°: 143); a CDR-H2 possui uma sequência de aminoácidos representada por YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG, em que, opcionalmente, X1 é S ou H; X2 é P ou S; X3 é S ou D; X4 é D ou S; e/ou, X5 é D ou G (ID. DE SEQ. N°: 144); a CDR-H3 possui uma sequência de aminoácidos representada por (X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P, em que, opcionalmente, X1 é A ou V; X2 é G ou A; X3 é V ou T; X4 é L ou W; X5 é Y ou M; e/ou, X6 é M ou D (ID. DE SEQ. N°: 145); a CDR-L1 possui uma sequência de aminoácidos QASQDITNYLN (ID. DE SEQ. N°: 105), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos; a CDR-L2 possui uma sequência de aminoácidos DASNLET (ID. DE SEQ. N°: 106), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos; e, a CDR-L3 possui uma sequência de aminoácidos QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos.

5. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que compreende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3, em que: A CDR-H1 possui uma sequência de aminoácidos FTFSSFSMD (ID. DE SEQ. N°: 107), com opcionalmente até 4 alterações de aminoácidos, ou até 2 alterações de aminoácidos; A CDR-H2 possui uma sequência de aminoácidos

YISPSADTIYYADSVKG (ID. DE SEQ. N°: 103), com opcionalmente até 4 alterações de aminoácidos; A CDR-H3 possui uma sequência de aminoácidos ARGVLDYGDMLMP (ID. DE SEQ. N°: 6), com opcionalmente até 3 alterações de aminoácidos; A CDR-L1 possui uma sequência de aminoácidos QASQDITNYLN (ID. DE SEQ. N°: 105), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos; A CDR-L2 possui uma sequência de aminoácidos DASNLET (ID. DE SEQ. N°: 106), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos; e, A CDR-L3 possui uma sequência de aminoácidos QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12), com opcionalmente 1 ou 2 alterações de aminoácidos;

6. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a CDR-H1 compreende GFTFSSFS (ID. DE SEQ. N°: 2); a CDR-H2 compreende ISPSADTI (ID. DE SEQ. N°: 4); a CDR-H3 compreende ARGVLDYGDMLMP (ID. DE SEQ. N°: 6); a CDR-L1 compreende QDITNY (ID. DE SEQ. N°: 8); a CDR-L2 compreende DAS (ID. DE SEQ. N°: 10); e, a CDR-L3 compreende QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12);

7. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que se liga a um epitopo que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos de Laço de Latência, em que, opcionalmente, o epitopo é um epitopo combinatório, em que, ainda opcionalmente, o epitopo combinatório compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de Finger-1 e/ou Finger-2 do domínio do fator de crescimento;

8. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 7, em que o epitopo compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 169), e em que, opcionalmente, o epitopo ainda compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de RKDLGWKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 165) e/ou VGRKPKVEQL (ID. DE SEQ. N°: 168);

9. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 8, em que o epitopo compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 169), e um ou mais resíduos de aminoácidos de RKDLGWKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 165);

10. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 8, em que o epitopo compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 169) e um ou mais resíduos de aminoácidos de VGRKPKVEQL (ID. DE SEQ. N°: 168);

11. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 7, em que o epitopo compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (ID. DE SEQ. N°: 169), um ou mais resíduos de aminoácidos de RKDLGWKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 165) e, um ou mais resíduos de aminoácidos de VGRKPKVEQL (ID. DE SEQ. N°: 168);

12. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou o fragmento de ligação ao antígeno;

13. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno reagir de forma cruzada com complexos pró-TGFβ1 humanos e de camundongo;

14. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é um subtipo de IgG4 ou IgG1 humana;

15. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma substituição no arcabouço de Ser para Pro que produz uma dobradiça do tipo IgG1;

16. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que possui uma IC50 de ≤ 2 nM para cada um dos seguintes complexos, como medida por um ensaio-repórter à base de células. i) hLTBP1-pró-TGFβ1; ii) hLTBP3-pró-TGFβ1; iii) hGARP-pró-TGFβ1; e, iv) hLRRC33-pró-TGFβ1;

17. Um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento deste que se liga especificamente a cada um dos seguintes antígenos com uma afinidade de ≤ 1 nM, como medida por Interferometria de Biocamada ou ressonância de plásmon de superfície: a) um complexo LTBP1-pró-TGFβ1 humano; b) um complexo LTBP3-pró-TGFβ1 humano; c) um complexo GARP-pró-TGFβ1 humano; e, d) um complexo LRRC33-pró-TGFβ1 humano; em que o anticorpo monoclonal mostra um viés de no máximo três vezes em afinidade para qualquer um dos complexos acima em relação aos outros complexos, e, em que o anticorpo monoclonal inibe a liberação de fator de crescimento TGFβ1 maduro de cada um dos complexos pró- TGFβ1, mas não de complexos pró-TGFβ2 ou pró-TGFβ3;

18. Um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento deste que se liga especificamente a um complexo pró-TGFβ1 em uma região de ligação que possui uma sequência de aminoácidos PGPLPEAV (ID. DE SEQ. N°: 161) ou uma porção deste, caracterizado pelo fato de que, quando ligado ao complexo pró-TGFβ1 em uma solução, o anticorpo ou o fragmento protege a região de ligação da exposição ao solvente, como determinado por espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS); e, em que o anticorpo ou o fragmento se liga especificamente a cada um dos seguintes complexos: LTBP1- pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró- TGFβ1, com uma afinidade de ≤ 5 nM, como medida por Interferometria de Biocamada ou ressonância de plásmon de superfície;

19. Um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento deste que se liga especificamente a um complexo pró-TGFβ1 em uma região de ligação que possui uma sequência de aminoácidos LVKRKRIEA (ID. DE SEQ. N°: 159) ou uma porção deste, caracterizado pelo fato de que, quando ligado ao complexo pró-TGFβ1 em uma solução, o anticorpo ou o fragmento protege a região de ligação da exposição ao solvente, como determinado por espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS); e, em que o anticorpo ou o fragmento se liga especificamente a cada um dos seguintes complexos: LTBP1- pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró- TGFβ1, com uma afinidade de ≤ 5 nM, como medida por Interferometria de Biocamada ou ressonância de plásmon de superfície;

20. Um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento deste que se liga especificamente a um complexo pró-TGFβ1 em: i) uma primeira região de ligação que compreende pelo menos uma porção do Laço de Latência (ID. DE SEQ. N°: 153); e ii) uma segunda região de ligação que compreende pelo menos uma porção de Finger-1 (ID. DE SEQ. N°: 151); caracterizado pelo fato de que, quando ligado ao complexo pró-TGFβ1 em uma solução, o anticorpo ou o fragmento protege as regiões de ligação da exposição ao solvente, como determinado por espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS);

21. O anticorpo ou o fragmento de acordo com a reivindicação 45, em que a primeira região de ligação compreende PGPLPEAV (ID. DE SEQ. N°: 161) ou uma porção deste e a segunda região de ligação compreende RKDLGWKW (ID. DE SEQ. N°: 170) ou uma porção deste;

22. O anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo é um anticorpo contexto-independente, de modo que ele se liga a complexos pró-TGFβ1 associados à matriz e complexos pró- TGFB1 associados à célula com um viés de menos do que cinco vezes em afinidade, como medido por Interferometria de Biocamada ou ressonância de plásmon de superfície;

23. O anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 43-47, que se liga especificamente a cada um dos seguintes complexos: mLTBP1-pró-TGFβ1, mLTBP3- pró-TGFβ1, mGARP-pró-TGFβ1 e mLRRC33-pró-TGFβ1, com uma afinidade de ≤ 1 nM;

24. O anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes que se liga ao complexo pró- TGFβ1 em uma ou mais das seguintes regiões de ligação ou uma porção destas: LVKRKRIEA (ID. DE SEQ. N°: 159); LASPPSQGEVPPGPL (ID. DE SEQ. N°: 153); PGPLPEAV (ID. DE SEQ. N°: 161); LALYNSTR (ID. DE SEQ. N°: 162); REAVPEPVL (ID. DE SEQ. N°: 163); YQKYSNNSWR (ID. DE SEQ. N°: 164); RKDLGWKWIHE (ID. DE SEQ. N°: 171); HEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 172); LGPCPYIWS (ID. DE SEQ. N°: 166); ALEPLPIV (ID. DE SEQ. N°: 167); e, VGRKPKVEQL (ID. DE SEQ. N°: 168);

25. O anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que possui uma sequência de CDR selecionada do grupo que consiste em: GFTFSSFS (ID. DE SEQ. N°: 2); ISPSADTI (ID. DE SEQ. N°: 4); ARGVLDYGDMLMP (ID. DE SEQ. N°: 6); QDITNY (ID. DE SEQ. N°: 8); DAS e (ID. DE SEQ. N°: 10); QQADNHPPWT (ID. DE SEQ. N°: 12);

26. O anticorpo de acordo com a modalidade 25, que compreende todas as CDRs;

27. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a cada um dos seguintes antígenos: hLTBP1-pró-TGFβ1 hLTBP3-pró-TGFβ1 hGARP-pró-TGFβ1; e, hLRRC33-pró-TGFβ1; em que o anticorpo ou o fragmento se liga a cada um dos hLTBP1-pró-TGFβ1 e hLTBP3-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 1 nM, como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio; em que o anticorpo ou o fragmento se liga a um epitopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de LRLASPPSQGEVPPGPLPEAV (ID. DE SEQ. N°: 173) e, opcionalmente, o epitopo ainda compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de RKDLGWKWIHEPKGYHANF (ID. DE SEQ. N°: 165);

28. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento se liga a cada um de LTBP1-pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1 com uma afinidade de ≤ 1 nM; e em que o anticorpo ou o fragmento se liga aos complexos pró-TGFβ1 associados à matriz com afinidades pelo menos 10 vezes maiores do que aos complexos pró-TGFβ1 associados à célula;

29. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a modalidade precedente, em que a IC50 é ≤ 5 nM, em que, opcionalmente, a IC50 é ≤ 1 nM;

30. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é capaz de inibir a ativação de TGFβ1 integrina-dependente;

31. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é capaz de inibir a ativação de TGFβ1 protease-dependente;

32. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é capaz de inibir a ativação de TGFβ1 integrina-dependente e ativação de TGFβ1 protease-dependente;

33. O anticorpo ou o fragmento deste de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que não se liga especificamente a pró-TGFβ2 ou pró-TGFβ3;

34. O anticorpo ou o fragmento deste de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, que não se liga especificamente ao fator de crescimento TGFβ1 livre que não está em associação com um complexo pró-TGFβ1;

35. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste que bloqueia de forma cruzada com o anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes;

36. A kit que compreende o anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes;

37. Uma composição que compreende o anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, e um excipiente farmaceuticamente aceitável;

38. A composição da modalidade 37 para uso em terapia no tratamento de uma indicação relacionada ao TGFβ em um indivíduo;

39. A composição para uso de acordo com a modalidade 38, em que a indicação relacionada ao TGFβ é câncer, mielofibrose, célula-tronco distúrbio e/ou distúrbio fibrótico;

40. A composição para uso de acordo com a modalidade 38, em que a indicação relacionada ao TGFβ é selecionada das seguintes: i) doença na qual TGFβ1 está superexpresso ou a sinalização de TGFβ1 está desregulada; ii) doença associada com diferenciação ou repopulação anormal de células-tronco, que é opcionalmente: a) diferenciação/reconstituição de célula- tronco/célula progenitora é interrompida ou perturbada em decorrência de uma doença ou induzida como um efeito colateral de uma terapia/medicação; b) os pacientes estão em uma terapia ou medicação que faz com que células saudáveis sejam mortas ou depletadas; c) pacientes podem se beneficiar da diferenciação/reconstituição aumentada de célula- tronco/célula progenitora; d) a doença está associada com diferenciação ou reconstituição anormal de células-tronco; iii) condições que envolvem desregulação hematopoiética, por exemplo, desregulação hematopoiética induzida por tratamento; iv) doenças com expressão gênica aberrante de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em: Serpina 1 (que codifica PAI-1), MCP-1 (também conhecida como CCL2), CCL3, Col1a1, Col3a1, FN1, TGFB1, CTGF, ACTA2 (que codifica α-SMA), ITGA11, SNAI1, MMP2, MMP9, TIMP1,

FOXP3, CDH1 (E caderina), e CDH2; v) doenças que envolvem proteases; vi) doenças que envolvem transição mesenquimal, por exemplo, Transição Epitelial-para-Mesenquimal (EMT) e/ou Transição Endotelial-para-Mesenquimal (EndMT); vii) doenças que envolvem imunossupressão, em que, opcionalmente, a imunossupressão compreende células imunossupressoras aumentadas no local de doença, em que, ainda opcionalmente, as células imunossupressoras são macrófagos M2 e/ou MDSCs; viii) doenças que envolvem rigidez e remodelagem da matriz; que compreendem, opcionalmente, rigidez da ECM; ix) fibrose de órgão, opcionalmente fibrose de órgão avançada; x) mielofibrose primária e secundária; xi) Malignidades/câncer; a) tumor sólido, opcionalmente tumor sólido avançado ou tumor metastático; b) câncer sanguíneo;

41. A composição para uso de acordo com a modalidade 40, em que o câncer compreende um tumor sólido, ou, em que o câncer é um câncer sanguíneo;

42. A composição para uso de acordo com a modalidade 41, em que o tumor sólido é pouco responsivo a uma terapia de câncer, em que, opcionalmente, a terapia de câncer é uma terapia com inibidor do ponto de verificação, vacina contra o câncer, quimioterapia, radioterapia, terapia com vírus oncolítico, terapia com inibidor de IDO e/ou uma terapia com células imunes modificadas geneticamente;

43. A composição para uso de acordo com a modalidade

41, em que o tumor sólido é um tumor imuno-excluído;

44. A composição para uso de acordo com a modalidade 41, em que o tumor sólido compreende Tregs, macrófagos M2 e/ou MDSCs intratumorais;

45. A composição para uso de acordo com a modalidade 41, em que o tumor sólido compreende estroma enriquecido com CAFs e/ou miofibroblastos;

46. A composição para uso de acordo com a modalidade 41, em que o indivíduo está recebendo ou é um candidato para receber uma terapia de câncer selecionada do grupo que consiste em: quimioterapia, radioterapia, CAR-T, vacina contra o câncer, terapia viral oncolítica e terapia com inibidor do ponto de verificação;

47. A composição para uso de acordo com a modalidade 41, em que o câncer é caracterizado por resistência adquirida ou resistência primária à terapia de câncer;

48. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 38-47, em que o tratamento de câncer compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição para reduzir o crescimento do tumor sólido, em que, opcionalmente, a administração da composição aumenta a sobrevida;

49. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 38-48, em que o tratamento compreende a administração da composição em uma dose que varia entre 1- 30 mg/kg;

50. Um método para a seleção de um indivíduo com probabilidade de responder a uma terapia com inibição de TGFβ1, que compreende a etapa de: identificação de um indivíduo diagnosticado com câncer,

em que, i) o câncer é um tipo de sabidamente suscetível à resistência a uma terapia de câncer, e/ou, ii) o indivíduo é resistente a uma terapia de câncer, em que, opcionalmente, o indivíduo é um não-responsivo primário à terapia de câncer; em que, opcionalmente, a terapia de câncer é quimioterapia, radioterapia e/ou terapia imune de inibição do ponto de verificação; e, seleção do indivíduo como um candidato para uma terapia com inibição de TGFβ1;

51. Um método para o tratamento de câncer, o método compreendendo as etapas de: i) seleção de um paciente diagnosticado com câncer que compreende um tumor sólido, em que o tumor sólido é ou é suspeito de ser um tumor imuno-excluído; ii) administração ao paciente o anticorpo ou o fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 em uma quantidade eficaz para tratar o câncer, em que (a) o paciente recebeu, ou é um candidato para receber, uma terapia de câncer selecionada do grupo que consiste em: terapias imunes de inibição do ponto de verificação (CBTs), quimioterapias, radioterapias, terapias com células imunes modificadas geneticamente e terapias com vacina contra o câncer; ou, (b) o paciente possui um câncer com estatisticamente taxas baixas de resposta primária, e em que o paciente não recebeu uma CBT;

52. O método da reivindicação 25, em que o inibidor do ponto de verificação imune é um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1;

53. O método da reivindicação 26, em que a etapa de seleção (i) compreende a detecção de células imunes ou de um ou mais marcadores destas;

54. O método da reivindicação 27, em que a detecção compreende uma análise de biópsia tumoral, análise de marcador sérico e/ou imageamento in vivo;

55. O método da reivindicação 27 ou 28, em que as células imunes são selecionadas do grupo que consiste em: linfócitos T citotóxicos, células T reguladoras, MDSCs, macrófagos associados ao tumor, células NK, células dendríticas e neutrófilos;

56. Método de qualquer uma das reivindicações 27-29, em que o marcador de célula imune é selecionado do grupo que consiste em: CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD68, CD14, CD34, CD25, CD47;

57. O método da reivindicação 28, em que o imageamento in vivo compreende rastreamento de células T;

58. O método da reivindicação 28 ou 31, em que o imageamento in vivo compreende o uso de PET-SPECT, MRI e/ou fluorescência/bioluminescência óptica;

59. O método da reivindicação 31 ou 32, em que o imageamento in vivo compreende marcação direta ou indireta de células imunes ou anticorpo que se liga a um marcador da superfície celular de células imunes;

60. Método de qualquer uma das reivindicações 28-33, em que o imageamento in vivo compreende o uso de um traçador;

61. O método da reivindicação 34, em que o traçador é um radioisótopo;

62. O método da reivindicação 35, em que o radioisótopo é um isótopo emissor de pósitron;

63. O método da reivindicação 36, em que o radioisótopo é selecionado do grupo que consiste em: 18F. 11C, 13N, 15O,

68Ga, 177Lu, 18F e 89Zr;

64. Método de qualquer uma das reivindicações 28-37, em que o imageamento in vivo compreende o uso de anticorpos marcados em imuno-PET;

65. Método de qualquer uma das reivindicações 28-38, em que o imageamento in vivo é realizado para o monitoramento de uma resposta terapêutica à terapia com inibição de TGFβ1 no indivíduo;

66. O método da reivindicação 39, em que a resposta terapêutica compreende conversão de um tumor imuno-excluído em um tumor inflamado;

67. Um método de identificação de um inibidor isoforma- seletivo da ativação de TGFβ1 para uso terapêutico, o método compreendendo as etapas de: i) seleção de um pool de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno capazes de se ligar a cada um de: hLTBP1- pró-TGFβ1; hLTBP3-pró-TGFβ1; hGARP-pró-TGFβ1; e, hLRRC33- pró-TGFβ1 in vitro com uma KD de ≤ 10 nM, como medida por um ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio; ii) seleção de um pool de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno capazes de inibição da ativação de TGFβ, opcionalmente em um ensaio baseado em células; iii) testagem de um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes das etapas i) e ii) em um estudo de eficácia in vivo; iv) testagem de um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes das etapas i) - iii) em um estudo de toxicologia/segurança in vivo; e, v) identificação de um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno das etapas i) – iv), em que os anticorpos ou os fragmentos exibem doses eficazes determinadas no estudo de eficácia in vivo que estão abaixo de um NOAEL determinado no estudo de toxicologia/segurança in vivo;

68. Uso do anticorpo ou do fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma indicação de TGFβ1;

69. O uso de acordo com a modalidade 68, que ainda compreende uma etapa de filtração estéril de uma formulação que compreende o anticorpo ou o fragmento;

70. O uso de acordo com a modalidade 68 ou 69, que ainda compreende uma etapa de enchimento e/ou embalagem em um frasco ou uma seringa;

71. Um método para a produção de uma composição farmacêutica que compreende um inibidor de TGFβ1 isoforma- seletivo, o método compreendendo: i) fornecimento de um anticorpo capazes de se ligar a cada um de hLTBP1-pró-TGFβ1, hLTBP3-pró-TGFβ1, hGARP-pró- TGFβ1 e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de 1 nM ou menos, ii) realização de um estudo de eficácia in vivo em que o anticorpo da etapa (i) é administrado a um modelo pré- clínico para determinar quantidades eficazes, iii) realização de um estudo de toxicologia usando um modelo animal sabidamente sensível à inibição de TGFβ, para determinar quantidades nas quais toxicidades indesejáveis são observadas; iv) determinação ou confirmação de uma janela terapêutica suficiente com base nas etapas (ii) e (iii); e, v) fabricação de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo;

72. Um método de fabricação do anticorpo ou do fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35, o método compreendendo as etapas de: i) fornecimento de um antígeno que compreende um complexo pró-TGFβ1, compreendendo opcionalmente pelo menos dois de: LTBP1, LTBP3, GARP, LRRC33 ou um fragmento destes, ii) seleção para um pool de anticorpos ou fragmentos quanto à habilidade para se ligar ao antígeno da etapa (i); iii) opcionalmente, remoção de anticorpos ou fragmentos do pool que exibem perfis de ligação indesejáveis; iv) seleção para um pool de anticorpos ou fragmentos selecionados da(s) etapa(s) (ii) e/ou (iii) quanto à habilidade para inibir TGFβ1; v) opcionalmente, geração de um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou fragmento de um anticorpo, anticorpos ou fragmentos selecionados da etapa (iv) de modo a fornecer um inibidor humano ou humanizado; vi) realização de um ensaio de ligação in vitro para determinar afinidades para LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1, vii) realização de ensaio funcional para determinar ou confirmar a atividade do inibidor contra TGFβ1 e opcionalmente TGFβ2 e/ou TGFβ3;

73. O método da modalidade 72, que ainda compreende uma etapa de avaliação de um anticorpo candidato ou um fragmento deste em um estudo de eficácia in vivo e um estudo de toxicologia in vivo em um modelo animal pré-clínico determinando, dessa forma, quantidades eficazes que demonstraram ser tanto eficazes quanto seguras ou toleráveis;

74. O método da modalidade 72 ou 73, que ainda compreende uma etapa de formulação em uma composição farmacêutica;

75. A composição de acordo com a modalidade 74 para uso terapêutico no tratamento de fibrose em um indivíduo humano;

76. A composição de acordo com a modalidade 74 para uso terapêutico no tratamento de mielofibrose em um indivíduo humano;

77. A composição de acordo com a modalidade 74 para uso terapêutico no tratamento de câncer em um indivíduo humano;

78. A composição para uso de acordo com a modalidade 77, em que o câncer compreende um tumor sólido;

79. A composição para uso de acordo com a modalidade 78, em que o tumor sólido é um tumor sólido localmente avançado;

80. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 77-79, em que o câncer é pouco responsivo a uma terapia de câncer, em que, opcionalmente, a terapia de câncer é uma terapia com inibidor do ponto de verificação, vacina contra o câncer, quimioterapia, radioterapia, terapia com inibidor de IDO e/ou uma terapia com células imunes modificadas geneticamente;

81. A composição para uso de acordo com a modalidade 80, em que o câncer é caracterizado por resistência adquirida ou resistência primária;

82. A composição para uso de acordo com a modalidade 81, em que o tumor é caracterizado por exclusão imune;

83. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 78-82, em que o tumor compreende macrófagos M2 e/ou MDSCs intratumorais;

84. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 78-82, em que o tumor compreende estroma enriquecido com CAFs;

85. A composição para uso de acordo com a modalidade 80, em que o indivíduo está recebendo ou é um candidato para receber uma terapia de câncer selecionada do grupo que consiste em: quimioterapia, radioterapia, CAR-T, vacina contra o câncer, terapia viral oncolítica e terapia com inibidor do ponto de verificação;

86. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades, em que o indivíduo é adicionalmente tratado com um inibidor de TGFβ3;

87. A composição para uso de acordo com a modalidade 70, em que o indivíduo possui câncer TGFβ1-positivo e TGFβ3- positivo e em que o indivíduo foi, está em ou é um candidato para receber uma terapia com inibidor do ponto de verificação;

88. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 77-84, em que o indivíduo não é um candidato para ser submetido à ressecção cirúrgica do tumor;

89. A composição de acordo com a modalidade 37 para uso no aumento da imunidade do hospedeiro em um indivíduo humano, em que o indivíduo possui câncer, e em que as respostas imunes compreendem imunidade anticâncer;

90. A composição para uso de acordo com a modalidade 89 em que o aumento da imunidade do hospedeiro inclui a redução de exclusão imune de um tumor ou a promoção de infiltrados de células imunes em um tumor;

91. A composição para uso de acordo com a modalidade

89, em que o aumento da imunidade do hospedeiro inclui a inibição da ativação de TGFβ1 plasmina-dependente;

92. A composição para uso de acordo com a modalidade 37, em que o indivíduo está em risco de desenvolvimento de uma tempestade de citocinas;

93. A composição para uso de acordo com a modalidade 37, em que o indivíduo está recebendo ou um candidato para receber uma terapia com células imunes modificadas geneticamente;

94. A composição para uso de acordo com a modalidade 37, em que o indivíduo está recebendo ou é um candidato para receber uma vacina contra o câncer;

95. A composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 76-94, em que o indivíduo está recebendo ou é um candidato para receber uma terapia imune com inibidor do ponto de verificação, em que, opcionalmente, o indivíduo é pouco responsivo à terapia imune com inibidor do ponto de verificação;

96. A composição de acordo com a modalidade 37 para uso na prevenção de uma síndrome de liberação de citocinas (por exemplo, tempestade de citocinas ou sépsis) em um indivíduo humano, em que, opcionalmente, o indivíduo sofre de uma infecção ou MS;

97. A composição de acordo com a reivindicação 37 para uso em um método para inibição de ativação de TGFβ1 plasmina- dependente em um indivíduo;

98. Um método para o tratamento de uma indicação de TGFβ1 em um indivíduo, o método compreendendo uma etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de TGFβ1 isoforma-

seletivo para tratar a indicação, em que, o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a cada um de hLTBP1-pró-TGFβ1; hLTBP3-pró- TGFβ1; hGARP-pró-TGFβ1; e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 10 nM, como medida por titulação de solução em equilíbrio;

99. O método da modalidade 98, em que o anticorpo se liga a cada um dos hLTBP1-pró-TGFβ1 e hLTBP3-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 1 nM, como medida por titulação de solução em equilíbrio, em que, opcionalmente, o anticorpo se liga a cada um dos complexos hLTBP1-pró-TGFβ1; hLTBP3-pró-TGFβ1; hGARP-pró-TGFβ1; e hLRRC33-pró-TGFβ1 com uma KD de ≤ 1 nM.

100. O método da modalidade 98 ou 99, em que o anticorpo se liga ao Laço de Latência ou a uma porção deste;

101. O método da modalidade 100, em que o anticorpo ainda se liga a Finger-1, Finger-2, ou uma porção (ou porções) destes;

102. O método de qualquer uma das modalidades 98-101, em que a indicação de TGFβ1 é um distúrbio proliferativo selecionado de câncer e distúrbios mieloproliferativos;

103. O método da modalidade 102, em que o indivíduo é um responsivo pobre a uma terapia de câncer, em que, opcionalmente, a terapia de câncer compreende uma terapia de inibição do ponto de verificação, quimioterapia e/ou radioterapia;

104. O método da modalidade 102, em que o indivíduo é adicionalmente tratado com uma terapia de câncer em conjunto com o inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo;

[00851] Essa invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos seguintes, que não devem ser considerados como limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Perfis de ligação in vitro 1) Ensaio baseado em BLI:

[00852] A afinidade de Ab4, Ab5, Ab6 e Ab3 foi medida pelo ensaio Octet® em células humanas pró-TGFβ1, enquanto a atividade foi medida por células repórteres CAGA12 que testam inibição de pró-TGFβ1 humano. O protocolo usado para medir a afinidade dos anticorpos para os complexos fornecidos nesse relatório descritivo está resumido na Tabela 19 abaixo, e uma lista resumida de perfis de afinidade de anticorpos exemplares da presente revelação é fornecida na Tabela 8 nesse relatório descritivo. Tabela 19. Protocolo exemplar para realização do ensaio de ligação Octet®. Materiais: - Placas pretas de polipropileno de 96 poços - Pontas revestidas com estreptavidina para Octet® - Tampão cinético 10x (diluído 1:10 em PBS)

1. Embeber a quantidade necessária de pontas com estreptavidina em tampão cinético 1X; colocar na máquina para equilibrar

2. Carregar a placa de amostra: - 200 µl de diluição de tampão ou anticorpo a cada poço a) Coluna 1 – linha de base (tampão) b) Coluna 2 – proteína biotinilada (por exemplo, sGARP- pró-TGFβ1 ou LTBP1-pró-TGFβ1); diluída até 5 µg/mL c) Coluna 3 - linha de base 2 (tampão) d) Coluna 4 - associação ao anticorpo para Ab e) Coluna 5 - associação ao anticorpo para Ab f) Coluna 6 - Ab de dissociação (tampão)

g) Coluna 7 - Ab de dissociação (tampão)

3. Fazer diluições na placa de 96 poços: a) Diluir ambos os anticorpos até 50 µg/mL em 300 µl de tampão 1x na fileira A. b) Adicionar 200 µl de tampão ao resto de cada coluna c) Transferir 100 µl à coluna para fazer diluições de 3 vezes

4. Colocar a placa de amostra na máquina perto da placa de pontas

5. Configurar o software a) Indicar tampão, carga, amostra (um ensaio por anticorpo testado) b) Indicar etapas do protocolo (linha de base, carga, associação, dissociação) para configurar a quantidades de tempo: Linha de base: 60 segundos Carga: 300 segundos Linha de base 2: 60 segundos Associação: 300 segundos Dissociação: 600 segundos

6. Analisar os dados a) Subtrair a linha de base do poço de referência b) Configurar normalização para durar cinco segundos da linha de base c) Alinhar para dissociação d) Analisar para associação e dissociação (modelo de ligação 1:1, ajustar as curvas) e) Determinar os melhores valores de R2; incluir concentrações com melhores valores de R2 f) Selecionar ajuste global g) Configurar cores de amostras por tipo de sensor h) Analisar Salvar a tabela e exportar

[00853] Como exemplo, a ligação de Ab6 aos antígenos de TGFβ foi medida por interferometria de biocamada em um FortéBio Octet Red384 usando placas pretas de meia-área de poliestireno de 96 poços (Greiner Bio-One). A ligação de Ab6 aos fatores de crescimento TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 humanos maduros, bem como ao TGFβ1 humano latente, foi feita após acoplamento dos antígenos aos biossensores de segunda geração (AR2G) reativos à amina (FortéBio) usando o kit de reagente de segunda geração (AR2G) reativo à amina (FortéBio) de acordo com as especificações do fabricante. Primeiro foi permitido que os biossensores AR2G se hidratassem em água offline por pelo menos 10 minutos antes do início do experimento. Após o início do experimento, as pontas de AR2G foram equilibradas em água por 1 minuto. A seguir, as pontas foram movidas para uma solução de ativação recém preparada (18 partes de água, 1 parte de 400 mM de EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida), e 1 parte de 200 mM sulfo-NHS (N-hidroxissulfossuccinimida)) por 5 minutos. Proteína TGFβ recombinante (10 µg/mL em 10 mM de tampão de acetato de sódio pH 5) foi acoplada às pontas ativadas por 3 minutos antes de extinção com etanolamina pH 8,5 por 15 minutos. A linha de base foi determinada com uma incubação de 20 min das pontas acopladas em tampão de EKB (Tampão cinético (FortéBio) suplementado com BSA 2% (Sigma), 0,5 M de NaCl, e Tween-20 0,09% (Sigma). Foi então permitido que as pontas se associassem em uma solução de 15 µg/mL de Ab6 em EKB por 10 minutos antes de 10 minutos de dissociação em EKB. A ligação de Ab6 aos complexos latentes grandes humanos foi medida após imobilização de Ab6 à superfície de biossensores de captura anti-Fc humano (FortéBio) (1 µg/mL em EKB) por 5 minutos. Uma linha de base adicional de 1 minuto foi então realizada antes da associação de LTBP1-pró- TGFβ1, LTBP1-pró-TGFβ2 ou LTBP1-pró-TGFβ3 (100 nM em EKB) por dez minutos. Finalmente, uma dissociação de dez minutos foi realizada. 2) Ensaio baseado em titulação de solução em equilíbrio:

[00854] MSD-SET é uma técnica bem caracterizada que pode ser usada para a determinação da KD em equilíbrio em fase de solução. Ensaios em equilíbrio à base de solução como, por exemplo, MSD-SET, se baseiam no princípio de exclusão cinética, no qual a ligação de ligante livre em equilíbrio, ao invés das taxas de associação e dissociação em tempo real, é medida para determinar a afinidade.

[00855] Ensaios de MSD-SET foram realizados para medir as afinidades dos anticorpos em equilíbrio. Resumidamente, cada anticorpo de teste foi diluído 3-5 vezes e as amostras foram misturadas com antígeno biotinilado em uma placa de 48 poços. As amostras de SET foram equilibradas por 20-24 horas em temperatura ambiente. Nesse ínterim, uma placa de captura foi revestida com IgG (20 nM) e incubada de um dia para o outro a 4°C ou 30 minutos em temperatura ambiente, seguido por uma etapa de bloqueio com BSA 5%. Após a placa de captura ter sido lavada três vezes, as amostras de SET foram adicionadas e incubadas por 150 segundos. A placa foi lavada uma vez para remover complexos não ligados. Duzentos e cinquenta ng/mL de SA-Sulfotag foram então adicionados e depois lavados 3 vezes. Tampão de leitura 2X foi adicionado,

e os sinais dos complexos ligados marcados foram lidos com o uso do instrumento QuickPlex™ SQ 120.

[00856] Listas de resumo de perfis de afinidade de anticorpos exemplares da presente revelação, como medidos por MSD-SET, são fornecidas nas Tabelas 9 e 10 nesse relatório descritivo.

[00857] Como exemplo, placas-padrão de MSD (MSD) foram revestidas com uma solução de 20 nM de anticorpo monoclonal em PBS por 30 min em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4°C. Concentrações crescentes do mesmo anticorpo monoclonal usado para o revestimento foram então misturadas com antígeno biotinilado (entre 50 e 400 pM para ligação ao Ab6; entre 0,8 e 1,6 nM para ligação ao Ab4) de um dia para o outro em temperatura ambiente sem agitação. Após 20-24 horas de equilíbrio, a placa revestida com anticorpo foi bloqueada com Tampão de Bloqueio A (MSD) por 30 minutos em temperatura ambiente e lavada com tampão de lavagem (PBS, BSA 0,1%, Tween-20 0,05%) antes da adição dos complexos antígeno-anticorpo equilibrados à placa por exatamente 2,5 minutos. A placa foi lavada novamente com tampão de lavagem antes da adição de 250 ng/mL de reagente secundário de estreptavidina (MSD) marcado com SULFO-TAG em PBS com BSA 0,1%. Após lavagem com tampão de lavagem, as placas foram lidas em tampão de leitura MSD (MSD) usando o MESO QuickPlex SQ 120 (MSD). Os dados de ligação foram processados por ajuste de curva não linear no software Prism 7 (Graphpad) para calcular valores da KD da ligação em equilíbrio. Exemplo 2: Ensaios funcionais para medir a inibição da ativação de TGFβ1 latente

[00858] O desenvolvimento de novos ensaios de potência baseados em células contexto-dependentes da ativação de TGFβ1 é descrido em WO 2019/023661, incorporado por referência em sua totalidade nesse relatório descritivo. Os formatos de ensaio prévios não podiam diferenciar entre a ativação de pró-TGFβ1 apresentado por moléculas apresentadoras endógenas e a ativação de pró-TGFβ1 apresentado por LTBPs exógenas. Por transfecção direta de células que expressam integrina, os novos ensaios revelados em WO 2019/023661, e usados nesse relatório descritivo, estabelecem uma janela entre atividade de apresentadora endógena-pró-TGFβ1 e atividade de LTBP exógena-pró-TGFβ1. Como complexos LTBP-pró-TGFβ1 estão embebidos na matriz extracelular, o revestimento da placa de ensaio também é um componente importante do ensaio. O uso de placas de alta ligação, revestidas com a proteína da ECM Fibronectina, tornou os ensaios de LTBP mais robustos.

[00859] Para determinar se os anticorpos Ab4, Ab5, Ab6 e Ab3 eram funcionais (por exemplo, se possuíam potência inibidora), foram desenvolvidos ensaios baseados em células, nos quais a liberação de fator de crescimento TGFβ1 αVβ integrina-dependente de complexos latentes grandes (LLCs) foi medida. Cada ensaio é específico para cada um dos LLCs que compreende LTBP1, LTBP3, GARP ou LRRC33. Pelo processo de desenvolvimento e otimização do ensaio, foi determinado que fibronectina é uma proteína da ECM crítica para a ativação in vitro integrina-dependente de pró-TGFβ1 apresentado por LTBP. Ensaio I. Ativação de TGFβ1 latente depositado na ECM

[00860] Para os ensaios retratados na FIG. 1 e FIG. 2, o seguinte protocolo foi desenvolvido. Esse ensaio é ótimo para a medição da liberação integrina-dependente de TGFβ1 de complexos pró-TGFβ1 latentes associados à ECM (LTBP1-pró- TGFβ1 ou LTBP3-pró-TGFβ1).

[00861] Materiais: - Células MvLu1-CAGA12 (Clone 4A4); - Células SW480/β6 (Clone 1E7) (a subunidade αV é expressa endogenamente em níveis altos; a subunidade β6 é superexpressa estavelmente); - Linhagem de célula LN229 (níveis elevados de integrina αVβ8 endógena); - Placa de ensaio de 96 poços tratada com TC de paredes brancas Costar #3903; - Placa de ensaio de 96 poços branca transparente Bio- One High Binding Greiner #655094; - Fibronectina Humana (Corning #354008); - Pipeta multicanais P200; - Pipetas P20, P200 e P1000 com pontas de filtro estéreis para cada; - Tubos e prateleira de microcentrífuga estéreis; - Reservatórios de reagente estéreis; - Azul tripano 0,4%; - Pipetas estéreis de 2 ml, 5 ml, 10 ml e 25 ml; - Placas de cultura de tecido tratadas de 100 mm ou 150 mm; - Etanol 70%; - Meio de soro reduzido Opti-MEM (Life Tech #31985-070); - Lipofectamina 3000 (Life Tech #L3000015); - Reagente de ensaio de luciferase Bright-Glo (Promega #E2620); - Tripsina 0,25% + 0,53 mM de EDTA;

- Plasmídeo de expressão de pró-TGFβ1, humano; - Plasmídeo de expressão de LTBP1S, humano; - Plasmídeo de expressão de LTBP3, humano; - Plasmídeo de expressão de LRRC32 (GARP), humano; - Plasmídeo de expressão de LRRC33, humano.

[00862] Equipamento: - Leitora de placas BioTek Synergy H1; - Coifa de TC; - Centrífuga de bancada; - Incubadora de CO2 37°C CO2 5%; - Banho de água/microesfera a 37°C; - Agitadora de plataforma; - Microscópio; - Hemocitômetro/contadores.

[00863] Definições: - Células CAGA12 4A4: Derivadas de células MvLu1 (Células Epiteliais do Pulmão de Marta), transfectadas estavelmente com promotor sintético de CAGA12, que dirige a expressão do gene de luciferase; - DMEM-BSA 0,1%: Meio de ensaio; meio de base é DMEM (Nº de Catálogo Gibco 11995-065), o meio também contém BSA diluída até 0,1% p/v, penicilina/estreptomicina, e 4 mM de glutamina; - D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4 mM de glutamina, NEAA 1%, 1X GlutaMAX (Nº de Catálogo Gibco 35050061); - Meio SW480/β6: D10 + 1.000 µg/mL de G-418; - Meio CAGA12 (4A4): D10 + 0,75 µg/mL de puromicina. Procedimento:

[00864] No Dia 0, as células foram semeadas para transfecção. As células SW480/β6 (clone 1E7) foram destacadas com tripsina e peletizadas (centrifugar por 5 min @ 200 x g). O pélete de células foi ressuspenso em meio D10 e as células viáveis por ml foram contadas. As células foram semeadas a 5,0 x 106 células/12 ml/placa de cultura de tecido de 100 mm. Para células CAGA12, as células foram repicadas em uma densidade de 1,0 milhão por frasco T75, para serem usadas para o ensaio no Dia 3. As culturas foram incubadas a 37°C e CO2 5%.

[00865] No Dia 1, células que expressam integrina foram transfectadas. O protocolo do fabricante para transfecção com reagente Lipofectamina® 3000 foi seguido. Resumidamente, os seguintes foram diluídos em OptiMEM™ I, para 125 μl por poço: 7,5 μg de DNA (molécula apresentadora) + 7,5 μg de DNA (pró-TGFβ1), 30 µl de P3000, e até 125 μl com OptiMEM I. O poço foi misturado por pipetagem de DNA junto, e depois OptiMEM foi adicionado. P3000 foi adicionado, e tudo foi bem misturado por pipetagem. Uma mistura principal de Lipofectamina 3000 foi feita, para ser adicionada às misturas de DNA: para o ensaio de LTBP1: 15 μl de Lipofectamina 3000, até 125 μl em OptiMEM I, por poço; para o ensaio de LTBP3: 45 μl de Lipofectamina 3000, até 125 µl em OptiMEM I, por poço. Lipofectamina 3000 diluída foi adicionada ao DNA, bem misturada por pipetagem, e incubada em temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, a solução foi misturada algumas vezes por pipetagem, e depois 250 μl de DNA:Lipofectamina 3000 (2 x 125 μl) por placa foi adicionado gota-a-gota. Cada placa foi gentilmente turbilhonada para misturar e a placa foi retornada à incubadora de cultura de tecido por aproximadamente 24 horas.

[00866] Nos Dias 1-2, as placas de ensaio foram revestidas com fibronectina humana. Especificamente, fibronectina liofilizada foi diluída até 1 mg/mL em água destilada ultrapura (estéril). Solução de estoque de 1 mg/mL foi diluída até 19,2 μg/mL em PBS (estéril). Foram adicionados 50 μl/poço à placa de ensaio (ligação elevada) e incubados de um dia para o outro em uma incubadora de cultura de tecido (37°C e CO2 5%). A concentração final foi de 3,0 μg/cm2.

[00867] No Dia 2, as células transfectadas foram plaqueadas para o ensaio e adição de inibidor. Primeiro, o revestimento de fibronectina foi lavado por adição de 200 μl/poço de PBS à solução fibronectina já na placa de ensaio. A lavagem foi removida manualmente com uma pipeta multicanais. A lavagem foi repetida por duas lavagens no total. Foi permitido que a placa secasse em temperatura ambiente sem a tampa antes da adição de células. As células foram então plaqueadas por descolamento com tripsina e peletizadas (centrifugar por 5 min @ 200 x g). O pélete foi ressuspenso em meio de ensaio e as células viáveis foram contadas por ml. Para o ensaio de LTBP1, as células foram diluídas até 0,10 x 106 células/mL e semeadas a 50 μl por poço (5.000 células por poço). Para o ensaio de LTBP3, as células foram diluídas até 0,05 x 106 células/mL e semeadas a 50 μl por poço (2.500 células por poço). Para preparar diluições do anticorpo funcional, os anticorpos foram pré- diluídos até uma concentração de trabalho consistente em veículo. Os anticorpos de estoque foram diluídos serialmente em veículo (PBS é ótimo, evitar tampão de citrato de sódio). Cada ponto da diluição serial foi diluído em meio de ensaio para uma concentração final de anticorpo de 4X. Foram adicionados 25 μl por poço de anticorpo 4X e as culturas incubadas a 37°C e CO2 5% por aproximadamente 24 horas.

[00868] No Dia 3, as células repórteres de TGFβ foram adicionadas. As células CAGA12 (clone 4A4) para o ensaio foram destacadas com tripsina e peletizadas (centrifugar por 5 min @ 200 x g). O pélete foi ressuspenso em meio de ensaio e as células viáveis contadas por ml. As células foram diluídas até 0,4 x 106 células/mL e semeadas a 50 μl por poço (20.000 células por poço). As células foram retornadas à incubadora.

[00869] No Dia 4, o ensaio foi lido (16-20 horas após adição de anticorpo e/ou célula repórter). Foi permitido que o reagente Bright-Glo™ e a placa de teste retornassem à temperatura ambiente antes da leitura. Os ajustes da leitura em BioTek® Synergy™ H1 foram configurados usando o protocolo TMLC_std – esse método possui um ajuste de auto-ganho. Foram selecionados poços de controle positivo para auto-escala (alta). Cem μl de reagente Bright-Glo foram adicionados por poço. Foram incubados por 2 minutos com agitação, em temperatura ambiente, a placa protegida da luz. A placa foi lida em BioTek Synergy H1.

[00870] A inibição da ativação de LTBP1-pró-TGBβ1 por Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 ou IgG de controle foi medida em um ensaio-repórter de LN229 (FIG. 1).

[00871] A inibição da ativação de LTBP3-pró-TGBβ1 por Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 ou IgG de controle foi medida em um ensaio-repórter de LN229 (FIG. 2). Ensaio II. Ativação de TGFβ1 latente apresentado na superfície celular

[00872] Para o ensaio retratado na FIG. 3 e FIG. 4, o seguinte protocolo foi desenvolvido. Esse ensaio, ou protocolo de “transfecção direta”, é ótimo para a medição da liberação integrina-dependente (ativação) de TGFβ1 de complexos de pró-TGBβ1 latente associados à célula (GARP- pró-TGBβ1 ou LRRC33- pró-TGBβ1).

[00873] Materiais: - Células MvLu1-CAGA12 (Clone 4A4); - Células SW480/β6 (Clone 1E7) (a subunidade αV é expressa endogenamente em níveis altos; a subunidade β6 é superexpressa estavelmente); - Linhagem de célula LN229 (níveis elevados de integrina αVβ8 endógena); - Placa de ensaio de 96 poços tratada com TC de paredes brancas Costar #3903; - Placa de ensaio de 96 poços branca transparente Bio- One High Binding Greiner #655094; - Fibronectina Humana (Corning #354008); - Pipeta multicanais P200; - Pipetas P20, P200 e P1000 com pontas de filtro estéreis para cada; - Tubos e prateleira de microcentrífuga estéreis; - Reservatórios de reagente estéreis; - Azul tripano 0,4%; - Pipetas estéreis de 2 ml, 5 ml, 10 ml e 25 ml; - Placas de cultura de tecido tratadas de 100 mm ou 150 mm; - Etanol 70%; - Meio de soro reduzido Opti-MEM (Life Tech #31985-070); - Lipofectamina 3000 (Life Tech #L3000015); - Reagente de ensaio de luciferase Bright-Glo (Promega

#E2620); - Tripsina 0,25% + 0,53 mM de EDTA; - Plasmídeo de expressão de pró-TGFβ1, humano; - Plasmídeo de expressão de LTBP1S, humano; - Plasmídeo de expressão de LTBP3, humano; - Plasmídeo de expressão de LRRC32 (GARP), humano; - Plasmídeo de expressão de LRRC33, humano.

[00874] Equipamento: - Leitora de placas BioTek Synergy H1; - Coifa de cultura de tecido; - Centrífuga de bancada; - Incubadora de CO2, 37°C, CO2 5%; - Banho de água/microesfera a 37°C; - Agitadora de plataforma a 37°C; – Microscópio; - Hemocitômetro/contadores.

[00875] Definições: - Células CAGA12 4A4: Derivadas de células MvLu1 (Células Epiteliais do Pulmão de Marta), transfectadas estavelmente com promotor sintético de CAGA12, que dirige a expressão do gene de luciferase; - DMEM-BSA 0,1%: Meio de ensaio; meio de base é DMEM (Nº de Catálogo Gibco 11995-065), o meio também contém BSA diluída até 0,1% p/v, penicilina/estreptomicina, e 4 mM de glutamina; - D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4 mM de glutamina, NEAA 1%, 1X GlutaMAX (Nº de Catálogo Gibco 35050061); - Meio SW480/β6: D10 + 1.000 µg/mL de G-418; - Meio CAGA12 (4A4): D10 + 0,75 µg/mL de puromicina. Métodos:

[00876] No Dia 0, as células que expressam integrina foram semeadas para transfecção. As células foram destacadas com tripsina e peletizadas (centrifugar por 5 min @ 200 x g). O pélete de células foi ressuspenso em meio D10 e as células viáveis contadas por ml. As células foram diluídas até 0,1e6 células/mL e semeadas a 100 µl por poço (10.000 células por poço) em uma placa de ensaio. Para células CAGA12, as células foram repicadas em uma densidade de 1,5 milhão por frasco T75, para serem usadas para o ensaio no Dia 2. As culturas foram incubadas a 37°C e CO2 5%.

[00877] No Dia 1, as células foram transfectadas. O protocolo do fabricante foi seguido para transfecção com reagente Lipofectamina 3000. Resumidamente, o seguinte foi diluído em OptiMEM I, para 5 µ por poço: 0,1 µg de DNA (molécula apresentadora) + 0,1 µg de DNA (pró-TGFβ1), 0,4 µl de P3000, e até 5 µ com OptiMEM I. O poço foi misturado por pipetagem de DNA junto, e depois adicionado OptiMEM. Adicionar P3000 e misturar bem tudo por pipetagem. A mistura principal foi feita com Lipofectamina 3000, a ser adicionada às misturas de DNA: 0,2 µl de Lipofectamina 3000, até 5 µ em OptiMEM I, por poço. Lipofectamina 3000 diluída foi adicionada ao DNA, bem misturada por pipetagem, e incubada em temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, a solução foi misturada algumas vezes por pipetagem, e depois 10 µl por poço de DNA:Lipofectamina 3000 (2 x 5 µ) foram adicionados. A placa de células foi retornada à incubadora de cultura de tecido por aproximadamente 24 horas.

[00878] No Dia 2, o anticorpo e as células repórteres de TGFβ foram adicionados. A fim de preparar diluições de anticorpo funcional, anticorpo de estoque em veículo (PBS é ótimo) foi diluído serialmente. A seguir, cada ponto foi diluído em meio de ensaio para uma concentração final de anticorpo de 2X. Após preparação dos anticorpos, a placa de células foi lavada duas vezes com meio de ensaio, por aspiração (aspirador a vácuo), seguido pela adição de 100 µl por poço de meio de ensaio. Após a segunda lavagem, o meio de ensaio foi substituído com 50 µl por poço de anticorpo 2X. A placa de células foi retornada à incubadora por aproximadamente 15-20 min.

[00879] A fim de preparar as células CAGA12 (clone 4A4) para o ensaio, as células foram destacadas com tripsina e peletizadas (centrifugar por 5 min @ 200 x g). O pélete foi ressuspenso em meio de ensaio e as células viáveis por ml foram contadas. As células foram diluídas até 0,3e6 células/mL e semeadas a 50 µl por poço (15.000 células por poço). As células foram retornadas à incubadora.

[00880] No Dia 3, o ensaio foi lido cerca de 16-20 horas após a adição do anticorpo e/ou da célula repórter. Foi permitido que o reagente Bright-Glo™ e a placa de teste chegassem até a temperatura ambiente antes da leitura. Os ajustes de leitura em BioTek® Synergy™ H1 foram configurados para usar o protocolo TMLC_std – esse método possui um ajuste de auto-ganho. Poços de controle positivo foram configurados para auto-escala (elevada). Cem µl de reagente Bright-Glo foram adicionados por poço. Incubar por 2 min com agitação, em temperatura ambiente, proteger a placa da luz. A placa foi lida em BioTek Synergy H1.

[00881] A inibição da ativação de GARP-pró-TGFβ1 por Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 ou controle de IgG foi medida no ensaio de SW480β6 (FIG. 3).

[00882] A inibição da ativação de LRRC33-pró-TGFβ1 por Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 ou controle de IgG foi medida no ensaio de SW480β6 (FIG. 4).

[00883] Os ensaios-repórteres à base de células usados para obter os dados de potência in vitro fornecidos na FIG. 33B são os seguintes:

[00884] Dois dias antes do ensaio, 12.500 células LN229 por poço foram plaqueadas em placas de ensaio de cultura de tecido tratadas de paredes brancas de 96 poços. As células LN229 foram transfectadas no dia seguinte com plasmídeos que codificam pró-TGFβ1 (ensaio de LTBP), pró-TGFβ1 mais GARP (ensaio de GARP), ou pró-TGFβ1 mais LRRC33 (uma construção quimérica de ectodomínio de LRRC33 fundido à GARP transmembrana e domínios citoplasmáticos usando Lipofectamina 3000. Como controle para a especificidade para isoforma TGFβ1, as células LN229 foram transfectadas com pró-TGFβ3, que também foi ativado por integrinas αV em função da presença de uma sequência RGD em seu pró-domínio. Cerca de 24 h mais tarde, Ab6 foi diluído serialmente e adicionado aos transfectantes juntos com células repórteres CAGA12 suspensas em DMEM + BSA 0,1% (15.000 células por poço). Cerca de 16-20 horas após configuração da cocultura, o ensaio foi desenvolvido por 2 min usando o reagente BrightGlo, e leitura da luminescência em uma leitora de placas. A atividade de luciferase na presença de anticorpo veículo determinou 100% de atividade, e o sinal na presença de 167 nM (25 µg/mL) do anticorpo pan-TGFβ de alta afinidade de 12,7 foi configurado como 0% de atividade.

[00885] As atividades de dose-resposta foram ajustadas não linearmente a um modelo de três parâmetros de log inibidor vs. resposta usando Prism 7 e os valores da IC50 com melhor ajuste calculados.

[00886] Para testar a inibição da ativação proteolítica de TGFβ1, células repórteres CAGA12 foram semeadas em de placas de ensaio de luminescência de paredes brancas de 96 poços (12.500 células por poço). Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram lavadas com meio de ensaio (DMEM + BSA 0,1%), e Ab6 (2,5 µg/mL) e complexo pró-TGFβ1 latente C4S pequeno (1,5 ng/mL) foram adicionados em meio de ensaio às células CAGA. Essa mistura foi incubada a 37°C por 4 h para permitir a ligação ao anticorpo. Após essa incubação, calicreína protease humana recombinante plasmática (EMD Millipore) foi adicionada em uma concentração final de 500 ng/mL. A mistura do ensaio foi incubada com células CAGA por aproximadamente 18 horas, e depois a ativação de TGFβ1 foi lida por bioluminescência como descrito acima. Exemplo 3: Efeitos de anticorpos TGFβ1-específicos, contexto-independentes sobre a ativação de TGFβ1 induzida por protease in vitro

[00887] Previamente, o Requerente mostrou que o Ab3 (um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo com viés de contexto) era capaz de inibição da ativação de TGFβ1 tanto integrina- dependente quanto calicreína-dependente in vitro e em ensaios baseados em células/CAGA.

[00888] Para testar a habilidade de Ab6 (um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo contexto-independente, de alta afinidade) para inibir a ativação de TGFβ1 protease- dependente, e para adicionalmente comparar os efeitos de Ab3 e Ab6, dois ensaios baseados em células/CAGA foram estabelecidos: i) ativação de TGFβ1 calicreína-dependente e efeitos de Ab3 e Ab6; e ii) ativação de TGFβ1 plasmina- dependente e efeitos de Ab3 e Ab6.

[00889] Resumidamente, células repórteres CAGA foram semeadas 24 horas antes do início do ensaio. Pró-TGFβ1-C4S foi titulado em células CAGA. Protease (Plasma-KLK ou plasmina) foi adicionada em uma concentração fixa como indicado. A mistura do ensaio foi incubada por aproximadamente 18 horas. A ativação de TGFβ foi medida por ensaio de Luciferase.

[00890] No primeiro estudo, na presença de KLK, pró-TGFβ1 foi ativado (controle positivo). Essa ativação de TGFβ era inibida eficazmente pela adição de Ab3, confirmando os resultados prévios. Similarmente, Ab6 também inibiu a ativação de TGFβ1 induzida por Calicreína. Esses resultados indicam que, além da ativação de TGFβ1 integrina-dependente, o anticorpo inibidor isoforma-específico, contexto- independente (tanto com viés quanto imparcial) pode bloquear a ativação de TGFβ1 KLK-dependente in vitro (FIG. 5A).

[00891] No segundo estudo, na presença de plasmina humana recombinante, pró-TGFβ1 foi ativado (controle positivo). Surpreendentemente, essa ativação de TGFβ era inibida eficazmente somente por AB6, mas não por Ab3. Esses resultados revelam diferenças funcionais inesperadas entre o inibidor com viés de contexto (Ab3) e o inibidor contexto- imparcial (Ab6) (FIG. 5B). Exemplo 4: Inibição de fibrose aguda por anticorpos anti-TGFβ1 Ab3 e Ab6 no modelo de obstrução ureteral unilateral (UUO) de fibrose renal aguda

[00892] A inibição de fibrose aguda por anticorpos anti- TGFβ1 foi testada no modelo de obstrução ureteral unilateral

(UUO) de fibrose renal aguda. Nesse modelo, fibrose é induzida em camundongos-machos por ligação cirúrgica permanente do ureter esquerdo no dia do estudo 0. Camundongos com tratamento simulado, que passaram por cirurgia, mas que não tiveram seus ureteres obstruídos, foram incluídos como um controle saudável nesses experimentos.

[00893] Anticorpos de controle (IgG) ou de teste (Ab3, Ab6) foram administrados aos camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) nos dias do estudo 1 e 4. Os rins foram coletados ao final do estudo, no dia 5 após cirurgia, e RNA foi coletado desses tecidos. O grau de indução de fibrose foi subsequentemente avaliado por reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) para um painel de genes associados à fibrose, incluindo Colágeno I (Col1a1), Colágeno III (Col3a1), Fibronectina 1 (Fn1), Lisil Oxidase (Lox), Lisil Oxidase-like 2 (Loxl2), Actina de músculo liso (Acta2), Metaloprotease da matriz (Mmp2) e Integrina alfa 11 (Itga11) (Rolfe, Irvine, Grobbelaar, & Linge, 2007) (Tamaki e cols., 1994)(Bansal e cols., 2017)(Leaf & Duffield, 2016). Efeito do tratamento com Ab3 ou Ab6 sobre a expressão de genes de colágeno

[00894] Col1a1 e Col3a1 são condutores cruciais de fibrose. Col1a1 está induzido 10 a 40 vezes em rins obstruídos e Col3a1 está supra-regulado 5 a 25 vezes (P < 0,005, comparar camundongos com tratamento simulado + IgG com grupo de UUO + IgG). Como mostrado na FIG. 7, camundongos UUO tratados com 3, 10 ou 30 mg/kg/semana de Ab3 mostraram expressão reduzida de ambos os genes de colágeno, comparado com o UUO + IgG (P < 0,05). Tratamento com 3 ou 10 mg/kg/semana de Ab6 também suprimiu a indução de genes fibróticos por UUO (P < 0,05, comparado com UUO + IgG). Considerados em conjunto, esses dados sugerem que a inibição de TGFβ1 com Ab3 ou Ab6 melhora potentemente a indução de colágeno associada ao UUO. Efeito de tratamento com Ab3 ou Ab6 sobre a expressão de genes de fibronectina e Lisil Oxidase-Like 2

[00895] Fn1 e Loxl2 codificam proteínas que participam da deposição e rigidez da matriz extracelular na fibrose. Como mostrado na FIG. 8, ambos os genes estão supra-regulados em amostras do grupo de UUO + IgG (P < 0,005 vs. Simulado + IgG), embora a razão de aumento na expressão gênica para ambos os genes, mas particularmente para Loxl2, seja menor do que para os genes de colágeno. Em amostras tratadas com 3, 10 ou 30 mg/kg/semana de Ab3, observamos uma tendência para Fn1 e Loxl2 reduzidos (vs. UUO + IgG), mas esse efeito do tratamento só é estatisticamente significante para expressão de Loxl2, e apenas na dose de 3 mg/kg/semana (Fn1 na dose de 10 mg/kg/semana se aproxima da significância estatística, com P = 0,07). O tratamento com 3 ou 10 mg/kg/semana de Ab6, no entanto, leva à inibição tanto de Fn1 quanto de Loxl2 (P < 0,05 vs. UUO + IgG).

[00896] A FIG. 9 resume a significância estatística das alterações na expressão gênica (vs. UUO + IgG) após tratamento no modelo de UUO. Ab3 mostrou redução em Col1a1 e Col3a1 em todas as doses testadas. Alterações estatisticamente significantes também foram observadas em Itga11 e Loxl2 (ambos os níveis eram reduzidos em relação a UUO + IgG), mas somente na dose de 3 mg/kg/semana. Em contraste, todos os genes examinados, exceto Acta2, mostraram uma alteração estatisticamente significante na expressão (todos os níveis reduzidos em relação a UUO + IgG) após tratamento com 10 mg/kg/semana de Ab6. Além disso, todos os genes examinados, exceto Acta2 e Lox, também mostraram uma redução estatisticamente significante em camundongos tratados com 3 mg/kg/semana de Ab6. Exemplo 5: Efeitos de Ab3 e Ab6 em combinação com anticorpo anti-PD-1 sobre a progressão tumoral no modelo de melanoma Cloudman S91

[00897] Com base no reconhecimento de que muitos tumores humanos são caracterizadas pelo fenótipo: i) um subconjunto é responsivo ao bloqueio do eixo de PD-(L)1; ii) evidências de exclusão imune; e, iii) evidências de expressão de TGFB1 e sinalização de TGFβ, e ainda com base nas observação que modelos em camundongos singênicos de imuno-oncologia comumente usados não recapitulam o viés de TGFβ1 ou resistência a anti-PD-(L)1, os inventores buscaram selecionar especificamente modelos pré-clínicos in vivo que exibem perfis similares aos tumores humanos para uma traduzibilidade aumentada (veja o Exemplo 11). Levando esses fatores em consideração, modelos in vivo adequados foram selecionados para a realização de estudos de eficácia, incluindo o modelo de melanoma Cloudman S91 descrito nesses estudos.

[00898] Para avaliar os efeitos de Ab3 e Ab6 em combinação com um anticorpo anti-PD-1 para diminuir a progressão tumoral do melanoma, o modelo em camundongo de melanoma Cloudman S91 foi usado. Cultura de célula tumoral

[00899] Células do clone M3 [melanoma Cloudman S91] (ATCC® CCL-53.1™) foram obtidas da “American Type Culture

Collection” (ATCC), e foram mantidas em CR Discovery Services como culturas em suspensão crescendo exponencialmente em Meio F12 de Ham modificado por Kaighn suplementado com 2,5% soro bovino fetal, soro de cavalo 15%, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 μg/mL de gentamicina. As células tumorais foram desenvolvidas em frascos de cultura de tecido em uma incubadora umidificada a 37°C, em uma atmosfera de CO2 5% e 95% de ar. Implantação in vivo e crescimento do tumor

[00900] No dia de implante do tumor, cada camundongo- fêmea DBA/2 de teste foi injetado por via subcutânea no flanco com 5 x 106 células Cloudman S91 em matrigel 50%, e o crescimento tumoral foi monitorado. Quando os tumores alcançavam um volume de 125-175 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de 12 com volumes tumorais médios idênticos e a dosagem começava. Os tumores foram medidos em duas dimensões usando compassos de calibre, e o volume foi calculado usando a fórmula: Volume do tumor (mm3) = w2 x l / 2 Em que w = largura e l = comprimento, em mm, do tumor. O peso do tumor pode ser estimado presumindo-se que 1 mg é equivalente a 1 mm3 de volume tumoral. Tratamento

[00901] Resumidamente, camundongos (n = 12) com tumores subcutâneos C91 (125-175 mm3) no Dia 1 foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) uma vez por semana por 60 dias de Ab3 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg; Ab3 a 30 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg; Ab6 a 3 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg; ou Ab6 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg. Anticorpo de rato anti- PD-1 de camundongo (RMP1-14-rIgG2a, BioXCel) foi administrado i.p. duas vezes por semana a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg por 60 dias.

[00902] Grupo 1 recebeu somente anticorpo anti-PD-1. Grupo 2 recebeu Ab3 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 3 recebeu Ab3 (30 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 4 recebeu Ab6 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 5 recebeu Ab6 (30 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Um controle não tratado foi usado, dados não mostrados. Análise de desfecho e retardo do crescimento do tumor (TGD)

[00903] Os tumores foram medidos usando compassos de calibre duas vezes por semana, e cada animal era sacrificado quando seu tumor alcançava o volume de desfecho de 2.000 mm3 ou no final do estudo (Dia 60), o que acontecesse primeiro. Camundongos que saíram do estudo por desfecho do volume tumoral foram documentados como sacrificados por progressão tumoral (TP), com a data do sacrifício. O tempo até desfecho (TTE) para análise foi calculado para cada camundongo de acordo com os métodos descritos em WO 2018/129329.

[00904] O percentual de retardo do crescimento tumoral (%TGD) é definido como o aumento no tempo mediano até desfecho em um grupo de tratamento, comparado com o controle não tratado, expresso como uma percentagem do tempo mediano até desfecho (TTE) do controle: T= TTE mediano para tratamento; C = TTE mediano para o controle; %TGD = ((T-C)/C)*100.

[00905] O tratamento com anti-PD1 resultou em 25% de TGD,

comparado com tratamento com controle de isótipo. Anti- PD1/Ab3 a 10 mg/kg teve 14% de TGD, enquanto Anti-PD1/Ab3 a 30 mg/kg teve 92% de TGD. O tempo mediano até desfecho para Anti-PD1/Ab3 a 30 mg/kg foi 45,8 dias comparado om 29,8 dias no tratamento com anti-PD1 isoladamente.

[00906] Em um segundo estudo com Cloudman S91, o tratamento com anti-PD-1 resultou em 48% de TGD, comparado com tratamento com controle de isótipo. Anti-PD-1/Ab3 a 10 mg/kg teve 122% de TGD, enquanto Anti-PD-1/Ab3 a 30 mg/kg teve 217% de TGD. Anti-PD-1/Ab6 tanto a 10 mg/kg quanto a 30 mg/kg teve 217% de TGD. O tempo mediano até desfecho para Anti-PD-1 foi de 34,6 dias, Anti-PD-1/Ab3 a 10 mg/kg foi de 51,7 dias e 30 mg/kg foi até o final do estudo em 74 dias. Anti-PD-1/Ab6 a 10 mg/kg e 30 mg/kg, ambos, não alcançaram sobrevida mediana ao final do estudo em 74 dias.

[00907] Os resultados do estudo mostram que a administração de Ab3 a 30 mg/kg, em combinação com anti-PD- 1, prolongou a sobrevida em camundongos tratados. Como mostrado na FIG. 10, até alcançar 50% de sobrevida, os camundongos tratados com anti-PD-1/Ab3 a 30 mg/kg levaram cerca de 45 dias, enquanto camundongos tratados com Ab3 a 10 mg/kg e PD-1 isoladamente alcançaram 50% de sobrevida em menos do que cerca de 30 dias, indicando que a inibição concomitante de PD-1 e TGFβ1 resultou em benefício de sobrevida.

[00908] Como mostrado na FIG. 11A, a administração de Ab3 ou Ab6 a 10 mg/kg e 30 mg/kg, em combinação com anti-PD1, retardou o crescimento tumoral. Oito camundongos tratados com PD-1 isoladamente alcançaram um volume tumoral de 2.000 mm3 (como indicado pela pontilhada), enquanto somente 6 camundongos tratados com anti-PD-1 e Ab3 a 10 mg/kg e 4 camundongos tratados com anti-PD-1 e Ab3 a 30 mg/kg alcançaram um volume tumoral de 2.000 mm3. Somente 3 camundongos tratados com anti-PD-1 e Ab6 a 10 mg/kg e 5 camundongos tratados com anti-PD-1 e Ab6 a 30 mg/kg alcançaram um volume tumoral de 2.000 mm3. A FIG. 11B mostra a progressão tumoral mediana após tratamento com Ab3 ou Ab6 em combinação com anticorpo anti-PD-1.

[00909] Um estudo de S91 separado foi realizado para avaliar controle tumoral eficaz obtido por uma combinação de anticorpo anti-PD-1 e Ab6 (a 3, 10 e 30 mg/kg). Para quantificar a resposta antitumoral, “controle tumoral eficaz” em resposta ao tratamento foi definido como a percentagem de animais dentro de cada grupo de teste que obtiveram um volume tumoral ao final do estudo de menos do que 25% do limiar de sobrevida de 2.000 mm3 (por exemplo, volume tumoral de desfecho). Os resultados estão resumidos abaixo (veja FIGS. 11C, 11E & 11F). Tabela 20. Resumo da eficácia de Cloudman S91. Grupo de tratamento Modelo de tumor Cloudman S91 (controle tumoral eficaz: %, N) Controle 0% (0/11) Monoterapia com anti-PD1 17% (2/12) Monoterapia com Ab6 0% (0/12) Anti-PD1/ Ab6, 3 mg/kg 83% (10/12) Anti-PD1/ Ab6, 10 mg/kg 78% (7/9) Anti-PD1/ Ab6, 30 mg/kg 73% (8/11)

[00910] Como mostrado na FIG. 11C, a maioria dos animais que receberam o tratamento combinado em todas as três doses (83%, 78% e 73%, respectivamente) obteve controle tumoral eficaz (por exemplo, volume tumoral é reduzido para 500 mm3 ou menos), embora o modelo Cloudman S91 seja reconhecido como pouco responsivo ao bloqueio de PD-1 como uma monoterapia, demonstrando efeitos sinérgicos robustos de Ab6. Dessa forma, em modelo singênico de tumor em camundongo que reflete a resistência primária humana à terapia de bloqueio do ponto de verificação (por exemplo, anti-PD- (L)1), o tratamento com Ab6 tornou os tumores Cloudman S91 (melanoma) vulneráveis à terapia com anti-PD1. O tratamento combinado com Ab6 (a apenas 3 mg/kg por semana) e um anticorpo anti-PD1 resultou em regressão tumoral significante ou controle tumoral eficaz.

O retardo sinérgico do crescimento tumoral obtido aqui indica que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos podem ser usados em conjunto com terapia de bloqueio do ponto de verificação para o tratamento de indivíduos com tumor TGFβ1-positivo que é resistente à inibição do ponto de verificação.

Nos grupos de tratamento combinado, todas as doses de Ab6 testadas (3 mg/kg em azul claro; 10 mg/kg em azul escuro, e 30 mg/kg em violeta), em conjunto com anti-PD-1, obtiveram controle tumoral significante (9 de 12, 4 de 9, e 8 de 11, respectivamente). Coletivamente, mais de 65% desses animais obtiveram redução do volume tumoral que é menor do que 25% do volume tumoral de desfecho.

Os resultados também foram demonstrados como volume tumoral mediano (FIG. 11E). Todos os grupos de tratamento combinado (Ab6 a 3, 10 ou 30 mg/kg) mostraram efeitos antitumorais similares nas doses testadas, sugerindo que, nesse modelo, Ab6 é eficaz em apenas 3 mg/kg.

Isso também é refletido no benefício de sobrevida (veja a FIG. 11F).

[00911] Os efeitos antitumorais duráveis da inibição combinada de TGFβ1 e PD-1 foram examinados por cessação do tratamento ao final do estudo de eficácia descrito acima e estendendo para monitorar as alterações no volume tumoral naqueles animais que obtiveram controle tumoral significante. Os responsivos que apresentaram tumor Cloudman S91 da FIG. 11C foram acompanhados por seis semanas sem dosagem (caixa cinza). Como mostrado na FIG. 11D, foi obtido controle tumoral prolongado com combinação de Ab6/anti-PD-

1. O número relatado é o número de animais com tumores controlados ao final do estudo.

[00912] Além disso, em um estudo em andamento de modelo de tumor S91 no qual Ab6 (a 3 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg por dose) está sendo avaliado em animais que são tratados com anti-PD1, o tratamento combinado leva a um benefício de sobrevida significante, como mostrado na FIG. 11F. No dia 38, todos os animais que receberam a combinação de anti- PD1/Ab6 (30 mg/kg) sobreviveram (por exemplo, 100% de sobrevida no dia 38 no grupo de dose de 30 mg/kg), e nenhum dos animais nos grupos combinados (3, 10 e 30 mg/kg) alcançou sobrevida mediana (estudo em andamento). Ao final do estudo, 90% dos animais no grupo de tratamento combinado sobreviveram. Esses dados indicam que os inibidores isoforma-seletivos TGFβ1 como, por exemplo, Ab6, podem ser usados para tratar tumores resistentes à inibição do ponto de verificação em indivíduos que recebem uma terapia de bloqueio do ponto de verificação para obter benefícios de sobrevida. Para as FIGS. 11C-11F: verde = controle de IgG (30 mg/kg semanalmente); laranja = Ab6 (30 mg/kg semanalmente); vermelho = anti-PD1 (5 mg/kg duas vezes por semana); azul claro = anti-PD1 + Ab6 (3 mg/kg); azul escuro = anti-PD1 + Ab6 (10 mg/kg); violeta = anti-PD1 + Ab6 (30 mg/kg). Exemplo 6: Inibição da via de TGFβ fosfo-SMAD2/3 por Ab3 e Ab5 em combinação com anti-PD-1 em modelo de câncer da bexiga singênico MBT2

[00913] O modelo de câncer urotelial MBT-2 foi selecionado como um tumor predominado por TGFβ1 para testar inibição específica de TGFβ1 em combinação com um inibidor do ponto de verificação. Em um estudo farmacodinâmico, os efeitos de Ab3 ou Ab5 em combinação com anti-PD1 sobre a sinalização a jusante de TGFβ foram avaliados no modelo MBT-

2. Ensaios de fosfo-SMAD2/3 foram realizados por ELISA (Cell Signaling Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Implantação in vivo e crescimento do tumor

[00914] No dia de implante do tumor, cada camundongo- fêmea C3H/HeN de teste foi injetado por via subcutânea no flanco com 5 x 105 células de tumor MBT2, e o crescimento tumoral foi monitorado. Quando os tumores alcançavam um volume de 40-80 mm3 os camundongos foram randomizados em grupos de 10 com volumes tumorais médios idênticos e a dosagem começava. Os tumores foram medidos em duas dimensões usando compassos de calibre, e o volume foi calculado usando a fórmula: Volume do tumor (mm3) = w2 x l / 2; Em que w = largura e l = comprimento, em mm, do tumor.

[00915] O peso do tumor pode ser estimado presumindo-se que 1 mg é equivalente a 1 mm3 de volume tumoral. Tratamento

[00916] Resumidamente, camundongos (n = 10) com tumores subcutâneos MBT2 (40 a 80 mm3) no Dia 1 foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) nos Dias 1 e 8 Ab5 a 3 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg, Ab5 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg, Ab3 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg ou Ab3 a 30 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg. Anticorpo de rato anti-PD-1 de camundongo (RMP1-14-rIgG2a, BioXCel) foi administrado i.p. nos Dias 1, 4 e 8 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg.

[00917] Grupo 1 recebeu somente anticorpo anti-PD-1. Grupo 2 recebeu Ab5 (3 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 3 recebeu Ab5 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 4 recebeu Ab3 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 5 recebeu Ab3 (30 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Um controle não tratado foi usado, não mostrado. Supressão da sinalização de SMAD 2/3

[00918] Os animais foram sacrificados e os tumores removidos 8 horas após a última dose no dia 8 e congelados rapidamente. Os tumores foram pulverizados em gelo seco e lisados de proteína gerados com inibidores fosfatase adicionados.

[00919] Os resultados foram avaliados por proporções de SMAD2/3 fosforilado-para-total. Como mostrado na FIG. 12, sinalização tônica de SMAD2/3 foi significantemente suprimida em animais tratados tanto com Ab3 quanto com Ab5, em combinação com anti-PD-1, com Ab5 (10 mg/kg) mostrando a supressão mais significante. Esses dados demonstram engajamento eficaz com o alvo dos inibidores da ativação de

TGFβ1, resultando na supressão da sinalização a jusante. Exemplo 7: Efeitos de Ab3 e Ab6 em combinação com anticorpo anti-PD-1 sobre a progressão tumoral no modelo em camundongo singênico de câncer da bexiga MBT2

[00920] Para avaliar a habilidade de Ab3 e Ab6 em combinação com um anticorpo anti-PD-1 para diminuir a progressão tumoral de carcinoma da bexiga, o modelo em camundongo singênico de câncer da bexiga MBT2 foi usado. Esse é um modelo de tumor muito agressivo e de crescimento rápido, e é muito difícil superar a progressão tumoral com tratamento farmacológico. Cultura de célula tumoral

[00921] MBT2 é uma linhagem de células de câncer da bexiga murídeo pobremente diferenciadas derivadas de um câncer da bexiga induzido por N-[4-(5-nitro-2-furil)-2- tiazolil] formamida transplantável em um camundongo-fêmea C3H/He. As células foram cultivadas em meio de “Roswell Park Memorial Institute” (RPMI)-1600 com soro bovino fetal 10% e 100 µg/mL de estreptomicina em uma atmosfera de CO2 5% a 37°C. O meio de cultura foi trocado em dias alternados, e era realizada subcultura quando a confluência celular alcançava 90%. As células foram colhidas de culturas subconfluentes por tripsinização e foram lavadas em meio livre de soro. Suspensões de célula única com >90% de viabilidade celular foram determinadas por exclusão de Azul Tripano. As células foram ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da injeção. Implantação in vivo e crescimento do tumor

[00922] As células MBT2 usadas para implantação foram coletadas durante crescimento em fase log e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). No dia de implante do tumor, cada camundongo de teste foi injetado por via subcutânea no flanco com 5 x 105 células (suspensão de células de 0,1 ml), e o crescimento tumoral foi monitorado. Quando tumores alcançavam uma média entre 40-80 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de 15.

[00923] Os tumores foram medidos em duas dimensões usando compassos de calibre, e o volume foi calculado usando a fórmula: Volume do tumor (mm3) = w2 x l / 2 Em que w = largura e l = comprimento, em mm, do tumor.

[00924] O peso do tumor pode ser estimado presumindo-se que 1 mg é equivalente a 1 mm3 de volume tumoral. Tratamento

[00925] Resumidamente, camundongos (n = 15) com tumores subcutâneos MBT2 (40 a 80 mm3) no Dia 1 foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) uma vez por semana por 29 dias Ab3 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg, Ab3 a 30 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg, Ab6 a 3 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg ou Ab6 a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg. Anticorpo de rato anti-PD-1 de camundongo (RMP1-14-rIgG2a, BioXCel) foi administrado i.p. duas vezes por semana a 10 mg/kg em um volume de dosagem de 10 ml/kg for 29 dias.

[00926] Grupo 1 recebeu somente anticorpo anti-PD-1. Grupo 2 recebeu Ab3 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 3 recebeu Ab3 (30 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 4 recebeu Ab6 (3 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Grupo 5 recebeu Ab6 (10 mg/kg) em combinação com anticorpo anti-PD-1. Um controle não tratado foi usado, não mostrado. Análise de desfecho e retardo do crescimento do tumor (TGD)

[00927] Os tumores foram medidos usando compassos de calibre duas vezes por semana, e cada animal era sacrificado quando seu tumor alcançava o volume de desfecho de 1.200 mm3 ou no final do estudo. Camundongos que saíram do estudo por desfecho do volume tumoral foram documentados como sacrificados por progressão tumoral (TP), com a data do sacrifício. O tempo até desfecho (TTE) para análise foi calculado para cada camundongo de acordo com os métodos descritos em WO 2018/129329.

[00928] Anti-PD1/Ab3 a 10 mg/kg teve 191% de TGD e a 30 mg/kg foi de 196% de TGD. Anti-PD1/Ab6 a 3 mg/kg foi de 68% de TGD e a 10 mg/kg foi de 196% de TGD. Resposta parcial (PR) em decorrência do tratamento é definida como o volume tumoral de 50% ou menos de seu volume do Dia 1 por três medições consecutivas durante a evolução do estudo e igual ou maior do que 13,5 mm3 para uma ou mais dessas três medições. Em uma resposta completa (CR), o volume tumoral era menor do que 13,5 mm3 por três medições consecutivas durante a evolução do estudo. Anti-PD-1/Ab3 a 10 mg/kg teve 0 PR e 4 CR ao final do estudo. Anti-PD-1/Ab3 a 30 mg/kg teve 1 PR e 1 CR ao final do estudo. Anti-PD-1/Ab6 a 3 mg/kg teve 0 PR e 3 CR. Anti-PD-1/Ab6 a 10 mg/kg teve 0 PR e 5 CR.

[00929] Como mostrado nas FIGS. 13A e 13B, a administração de Ab3, nas doses tanto de 10 mg/kg quanto de 30 mg/kg, em combinação com anti-PD-1, retardou o crescimento tumoral. Alguns animais mostraram regressão completa do tumor. Além disso, a administração de Ab6, nas doses tanto de 3 mg/kg quanto de 10 mg/kg, em combinação com anti-PD-1,

retardou o crescimento tumoral. Alguns animais exibiram regressão completa do tumor. A maioria dos camundongos tratados com PD-1 isoladamente alcançou um volume tumoral de

1.024 mm3 (como indicado pela linha pontilhada) em torno do dia 8 e dia 14, enquanto camundongos tratados com Ab3 a 10 mg/kg, Ab3 a 30 mg/kg, Ab6 a 3 mg/kg, ou Ab6 a 10 mg/kg levaram até 28 dias para alcançar um volume tumoral de 1.024 mm3. A FIG. 13C mostra a progressão tumoral mediana após tratamento com Ab3 (superior esquerda) ou Ab6 (superior direita) em combinação com anticorpo anti-PD-1. O gráfico inferior resume o volume tumoral mediano (mm3) no dia 15 em camundongos administrados com Ab3 ou Ab6, em combinação com anti-PD-1. O volume tumoral mediano no dia 15 em camundongos tratados com Ab3 (10 mg/kg), Ab3 (30 mg/kg) ou Ab6 (10 mg/kg), em combinação com anti-PD-1, foi cerca de 500 mm3 ou menos, enquanto o volume tumoral mediano no dia 15 em camundongos tratados com anti-PD-1 isoladamente foi de 1.000 mm3 ou mais (gráfico inferior).

[00930] A FIG. 13D ressalta a eficácia de Ab6 em MBT2. A progressão tumoral em camundongos de cinco grupos de tratamento é mostrada. Nenhum dos animais que recebeu IgG de controle, Ab6 isoladamente ou anti-PD-1 isoladamente obteve controle tumoral eficaz, definido como volume tumoral reduzido por 25% ou menos do volume do desfecho (mostrado com linhas pontilhadas inferiores e superiores, respectivamente). Em contraste, uma combinação de 12 de 28 animais (aproximadamente 43%) que receberam tratamento combinado de Ab6/anti-PD-1 obteve control tumoral eficaz, indicando que a inibição concomitante das vias de PD-1 e TGFβ1 pode reduzir significantemente (por exemplo, retardar ou regredir) o crescimento tumoral.

[00931] Além disso, o tratamento combinado foi eficaz para prolongar a sobrevida em todos os três grupos tratados, comparado com anti-PD-1 isoladamente. Como mostrado na FIG. 14, até alcançarem 50% de sobrevida, camundongos tratados com Ab3 a 10 mg/kg ou Ab6 a 10 mg/kg levaram mais de 28 dias, enquanto camundongos tratados com PD-1 isoladamente alcançaram 50% de sobrevida em cerca de 16 dias. Coletivamente, esses resultados demonstram benefício de sobrevida da terapia combinada. Resumo dos resultados e discussão

[00932] Efeitos sinérgicos de Ab6-anti-PD-1 sobre o crescimento tumoral: A descoberta de que Ab6 permite a avaliação direta da hipótese de que a inibição seletiva da ativação de TGFβ1 será suficiente para superar resistência primária do tumor à CBT. Para testagem pré-clínica, buscamos identificar modelos murídeos singênicos de tumor que recapitulem algumas das características cruciais de tumores humanos que exibem resistência primária à CBT. Critérios para seleção do modelo incluíram 1) pouca ou nenhuma resposta ao tratamento com agente único com anti-PD-(L)1 nas doses que se mostraram eficazes em outros modelos singênicos de tumor, 2) evidência para exclusão imune com uma falta de células T CD3+ infiltrantes, 3) evidências de sinalização ativa de TGFβ, e 4) evidências de expressão da isoforma TGFβ1.

[00933] A exploração de dados de resposta do tumor e de perfilamento do tumor, incluindo conjuntos de dados de RNAseq disponíveis publicamente de RNA derivado do tumor inteiro, resultou na seleção de 3 modelos de tumor que atendiam a esses critérios: o modelo de câncer da bexiga MBT-2 (MBT-2), o modelo de melanoma Cloudman S91 (S91), e o modelo de câncer de mama EMT-6 (EMT-6). A análise de dados de RNAseq de tumor inteiro demonstrou supra-regulação de genes de resposta de TGFβ indicativa da ativação da via de TGFβ, e expressão baixa de genes de células T efetoras, consistente com um fenótipo imuno-excluído (FIG. 20F). A análise de lisados do tumor inteiro por ELISA para sondar a expressão de proteína total da isoforma de TGFβ verificou que o fator de crescimento TGFβ1 é prevalente em todos os três modelos.

[00934] A fim de avaliar Ab6 em modelos em camundongo singênicos, expressamos Ab6 como um anticorpo quimérico com os domínios V de Ab6 humano fundidos aos domínios constantes IgG1/kappa de camundongo para minimizar a imunogenicidade. Ab6-mIgG1 possui atividade inibidora similar ao Ab6 totalmente humano. Confirmamos que animais com tumor MBT-2- são resistentes ao anti-PD-1 (RMP1-14) quando dosado em níveis terapêuticos, bem como ao Ab6-mIgG1 isoladamente. No entanto, em combinação, anti-PD-1 e Ab6-mIgG1 dosados a 3 mg/kg por semana ou 10 mg/kg por semana resultaram em reduções significantes na carga tumoral, incluindo 21% e 36% de sobreviventes livres de tumor respectivamente, bem como benefício de sobrevida significante ao longo da duração de cada estudo (FIGS. 13D e 14). No total, 4/14 animais responderam ao anti-PD-1/Ab6-mIgG1 (3 mg/kg por semana) e 8/14 responderam ao anti-PD-1/Ab6-mIgG (10 mg/kg por semana), comparados com 0/13 em anti-PD-1 isoladamente. Observamos respostas similares no modelo de melanoma Cloudman S91 levemente responsivo ao anti-PD-1. Novamente, tratamento combinado de anti-PD-1/Ab6-mIgG1 resultou em supressão tumoral profunda com até 75% de taxa de resposta e uma vantagem de sobrevida significante em todos os níveis de dose (veja o Exemplo 5).

[00935] A seguir, avaliamos a durabilidade da resposta antitumoral em sobreviventes livres de tumor MBT-2. O tratamento foi suspenso e animais foram acompanhados por 7 semanas. Não observamos recorrência do tumor detectável em qualquer um dos animais (veja o Exemplo 8).

[00936] A hipótese derivada clinicamente de que a sinalização de TGFβ dirige a exclusão imune em detrimento da eficácia da CBT, bem como a demonstração pré-clínica previamente relatada que a pan-inibição de TGFβ pode habilitar o sistema imune a superar esse mecanismo de resistência e promover eficácia da CBT, em parte nos levou a examinar se as respostas tumorais e benefício de sobrevida significantes observados com os anticorpos da invenção podem corresponder a alterações relevantes no encadeamento imune do tumor.

[00937] Para estudar os efeitos imunes do tratamento com anti-PD-1 ou AB6-mIgG1 como agentes únicos ou em combinação, tumores MBT-2 foram colhidos de camundongos 10 dias após o início do tratamento e depois submetidos a análises imunoistoquímicas e por citometria de fluxo de marcadores de célula imune selecionados. Embora a análise por citometria de fluxo tenha revelado que a percentagem global do compartimento imune CD45+ não se alterou com tratamento, a combinação de anti-PD-1 e Ab6-mIgG1 causou um aumento de dez vezes na representação de células T CD8+ dentro desse compartimento, em relação ao tratamento com anticorpo de controle de isótipo (média de 34% versus 3,5%,

respectivamente (FIG. 27B). Significativamente, o tratamento com agente único com anti-PD-1 parece produzir aumentos modestos na representação de células CD8+, mas os aumentos observados não alcançaram significância nesse estudo.

Adicionalmente, análise de RNA derivado desses tumores mostrou aumentos em marcadores de ativação de células T citotóxicas que são consistentes com o aumento no número de células CD8+ e indicativa de função efetora ativa dessas células (FIG. 32D). É notável que um aumento significante na representação de células Treg CD4+FoxP3+ também foi observado com tratamento combinado.

A relevância desse aumento em células Treg é incerta, considerando os efeitos antitumorais significantes observados com o tratamento combinado.

No entanto, a proporção de Treg:CD8 não foi alterada em resposta ao tratamento combinado.

Curiosamente, o tratamento combinado de anti-PD-1/Ab6-mIgG1 também induziu uma redução significante na representação global de células CD11b+ dentro de tumores MBT-2. Isso parece ser causado por redução seletiva em subpopulações CD11b+CD206+ e CD11b+Gr1+, que correspondem aos macrófagos imunossupressores do tipo M2 e células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSC), respectivamente.

Coletivamente, a representação dessas duas populações de células é reduzida de uma média de 47% da população de células CD45+ para 14% após o tratamento combinado (FIG. 28B). A subpopulação de macrófagos do tipo M1 (CD11b+CD206-) parece que não se alterou com o tratamento, indicando que o bloqueio de PD-1/TGFβ1 tem um impacto seletivo, mas amplo, sobre o ambiente imunossupressor dentro de tumores, afetando beneficamente os compartimentos tanto linfóides quanto mielóides.

[00938] O mecanismo específico pelo qual a inibição combinada de PD-1 e de TGFβ1 resulta em entrada e/ou expansão significante de células T CD8+ no microambiente tumoral não está claro. Dessa forma, fizemos uma análise histológica mais detalhada a fim de obter informações adicionais sobre o relacionamento entre a via de atividade de TGFβ e exclusão imune. Primeiro, confirmamos por análise imunoistoquímica um aumento significante na coloração de CD8+ por todos os tumores MBT-2 do grupo de controle, em concordância com os dados de citometria de fluxo (FIG. 30). A seguir, realizamos análise imunoistoquímica de fosfo-Smad3 (pSmad3), um fator de transcrição que medeia a ativação de genes TGFβ- responsivos, em uma tentativa de determinar quais células no microambiente tumoral podem responder ao TGFβ1 ativado.

[00939] Surpreendentemente, em tumores de camundongos tratados com anti-PD-1 e de controle, a coloração de pSmad3 parece, em grande parte, confinada aos núcleos do endotélio vascular do tumor, e esse sinal era bem diminuído mediante tratamento com Ab6-mIgG (FIG. 30F).

[00940] Para explorar ainda mais a relevância da sinalização perivascular de TGFβ, fizemos a co-coloração de células T CD8+ e CD31+ dos endotélios vasculares. Células T CD8+ parecem estar enriquecidas em áreas adjacentes aos vasos sanguíneos CD31+ do tumor (FIGS. 30F & 30G). Essa observação desperta a possibilidade de que a vasculatura tumoral possa servir como uma via de entrada de células T. Embora outros tenham relatados que a sinalização de TGFβ está associada à presença de estroma peritumoral rico em fibroblastos que forma uma barreira para a entrada de células T no tumor, nossas observações preliminares sugerem que uma barreira vascular TGFβ1-dependente adicional também pode ter um papel proeminente na prevenção de entrada de células T CD8+ no tumor. Exemplo 8: Desenvolvimento de resposta imune adaptiva antitumoral de memória durável em responsivos completos a anti-PD1/Ab3 e anti-PD1/Ab6 em tumores MBT-2, Cloudman S91 e EMT-6

1. Memória antitumoral em tumor MBT-2

[00941] Para verificar se era gerada uma resposta imune adaptiva potente e durável em responsivos completos que tinham previamente depurados tumores MBT2, foi feito um experimento de re-desafio tumoral. Métodos

[00942] Camundongos-fêmeas C3H/HeN com 8-12 semanas de idade foram implantados por via subcutânea no flanco com 5 x 105 células de tumor MBT2. Os animais foram randomizados para grupos de tratamento quando os tumores alcançaram um tamanho médio de 40-80 mm3 para começar o tratamento. O volume tumoral médio de partida foi igual através dos grupos. Anti-PD1 (RMP1-14) foi dosado duas vezes por semana, i.p. a 10 mg/kg; Ab3 foi dosado uma vez por semana a 10 mg/kg ou 30 mg/kg e Ab6 foi dosado 3 mg/kg ou 10 mg/kg por 5 semanas. Após 5 semanas, animais em todos os grupos de anti-PD1/Ab3 e anti-PD1/Ab6 com volumes tumorais menores do que 13,5 mm3 por pelo menos 3 medições consecutivas foram considerados “responsivos completos (CR)”. Foram feitas medições duas vezes por semana. Não houve responsivos completos em camundongos que receberam anti-PD1 isoladamente. Para o experimento de re-desafio, animais responsivos completos não tinham tumores mensuráveis (por exemplo, 0 mm3). Esses responsivos completos foram acompanhados (por exemplo, “em repouso”) por 7 semanas sem dosagem (período de “lavagem”), de modo a permitir a remoção completa de compostos dosados previamente. Ao final de 7 semanas, animais responsivos completos e controles naïve com idades compatíveis foram injetados com 5 x 105 células de tumor MBT2 por via subcutânea no flanco contralateral. Os animais foram acompanhados por 25 dias ou até que o volume tumoral excedesse 1.200 mm3, o que acontecer primeiro. Desfecho foi definido como volume tumoral de 1.200 mm3. Após alcançarem o desfecho, os animais foram sacrificados. Resultados

[00943] Quando responsivos completos do estudo de eficácia foram reimplantados por via subcutânea com células MBT-2 no flanco contralateral à implantação original, sem tratamento adicional, não houve crescimento tumoral detectável observado em qualquer um dos camundongos responsivos completos, enquanto todos os camundongos em um grupo de camundongos tumor-naïve de controle, com idades compatíveis desenvolveram tumores mensuráveis dentro de três semanas da implantação (FIG. 15).

[00944] Mais especificamente, modelos de re-desafio tumoral são um meio para demonstração de memória e vigilância imunológicas contra metástases ou recorrência do tumor. Nesses casos, responsivos completos (animais que obtiveram regressão tumoral completa em resposta ao tratamento) foram reimplantados com células tumorais e o crescimento foi comparado com camundongos naïve com idades compatíveis. O aparecimento de tumor em animais naïve foi de 100% (12/12) por volta do dia 25 (FIG. 15), com diversos animais alcançando os critérios de desfecho. Responsivos completos do estudo nas FIGS. 13A e 13B, que foram re-desafiados com células MBT2 como descrito acima, não tiveram tumores detectáveis ao final do estudo (0/9 responsivos completos combinados), o que mostra que 100% dos responsivos completos retêm memória imune robusta ao re-desafio com tumor MBT2. Esses resultados indicam que uma resposta de memória durável e potente aos antígenos tumorais foi gerada em animais que tiveram tumor e sugere que a depuração do tumor na exposição inicial estava relacionada a uma resposta imune adaptiva. Essa resposta imune adaptiva é suficiente para destruir células tumorais, evitar estabelecimento do tumor e sugeriria supressão continuada de metástases ou recorrência do tumor nesses animais. Além disso, isso demonstra que a inibição de TGFβ1 durante a resposta imune primária não interfere com o desenvolvimento de populações de linfócitos de memória.

[00945] Esses resultados do re-desafio do modelo de tumor MBT-2 indicam que a inibição combinada de TGFβ1 e PD-1 é suficiente para estabelecer memória imunológica antitumoral durável e potente nesses animais.

2. Efeitos antitumorais duráveis em Cloudman S91

[00946] Notavelmente, enquanto vários camundongos com tumor Cloudman S91 nps grupos da combinação anti-PD-1/Ab6 apresentaram respostas completas, alguns animais mantiveram uma massa tumoral residual pequena, embora estável, ao longo do período de tratamento restante. Buscamos recapitular os dados do re-desafio tumoral nesse modelo, como fizemos em MBT-2. No entanto, a taxa de tumor é variável nesse modelo, tornando essa análise mais desafiadora. Ao invés disso,

escolhemos interromper o tratamento e acompanhar os animais por várias semanas.

[00947] Seis semanas após o término do tratamento, camundongos sem tumor mensurável ao término do tratamento permaneciam livres de tumor. Tumores mensuráveis ao término da dosagem tiveram respostas mistas, em que muitos foram depurados, mas alguns permaneceram estáveis ou cresceram (FIG. 11D). Esses dados enfatizam a importância da manutenção do tratamento até que seja obtida a depuração total do tumor (veja também o Exemplo 5).

3. Efeitos antitumorais duráveis em EMT-6

[00948] Significativamente, observamos respostas similares à combinação de anti-PD-1/Ab6-mIgG1 no modelo de carcinoma de mama EMT-6, com uma taxa de resposta completa de 50% após tratamento combinado e uma de vantagem de sobrevida significante em relação ao anti-PD-1 (FIGS. 34A & 34C). Em contraste com MBT-2 e Cloudman S91, nos quais TGFβ1 é a isoforma predominantemente expressa, EMT6 expressa níveis similares de TGFβ1 e TGFβ3 tanto no nível de RNA quanto de proteína. Essa combinação de tratamento foi mais eficaz do que anti-PD-1/pan-inibição de TGFβ, sugerindo que, até mesmo na presença de múltiplas isoformas de TGFβ, TGFβ1 é o condutor principal da exclusão imune e, dessa forma, da resistência primária. Nesse modelo, interrompemos o tratamento e novamente observamos que seis semanas pós- término da dosagem, responsivos completos permaneciam livres de tumor, demonstrando novamente a durabilidade da resposta (FIG. 34C, direita). Exemplo 9: Avaliação de anticorpo, metodologia de seleção e caracterização

[00949] Considerando a alta similaridade de sequência e estrutural entre fator de crescimento TGFβ1 maduro e seus membros da família intimamente relacionados, TGFβ2 e TGFβ3, ponderamos que a geração de inibidores de anticorpos seletivos e de afinidade suficientemente alta que visam essa forma ativa de fator de crescimento TGFβ1 se mostraria desafiadora. As informações relatadas recentemente sobre a estrutura de TGFβ1 latente e aspectos mecânicos de sua ativação por meio de interação com certas integrinas apontaram para a possibilidade do direcionamento ao pró- domínio em complexos TGFβ1 latentes para evitar a ativação do complexo latente como o mecanismo de ação.

[00950] A obtenção de seletividade de isoforma na inibição tanto da ligação quanto da ativação se beneficiaria da similaridade de sequência menor entre os pró-domínios de membros da família que confinam e tornam inativos os respectivos homodímeros de fator de crescimento. Uma consideração crucial adicional para a identificação de um inibidor seletivo da ativação de TGFβ1 é o fato de que TGFβ1 latente é montado em Complexos Latentes grandes (LLCs) ligados por dissulfeto que permitem a deposição dos complexos de fator de crescimento inativo na matriz extracelular ou sua elaboração na superfície celular. Considerando a plausibilidade de que múltiplos LLCs de TGFβ1 possam ser expressos no microambiente tumoral, dados de RNAseq de TCGA foram analisados. Basicamente todos os tipos de tumor mostram evidências de expressão das quatro moléculas apresentadoras de pró-TGFβ1, LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33 (FIG. 20E). Buscamos, portanto, identificar anticorpos específicos que se ligariam e inibiriam a ativação de TGFβ1 latente em todos esses contextos locais.

[00951] Formas solúveis murídeas e humanas de cada LLC de TGFβ1 foram projetadas, expressas, purificadas, caracterizadas e usadas para as etapas de seleção positiva em uma avaliação cuidadosamente projetada de uma biblioteca de exibição de anticorpos humanos naïve baseados em levedura. Para assegurar a identificação de ligantes seletivos de TGFβ1 latente, moléculas apresentadoras-LLC não complexadas também foram usadas em etapas de seleção negativa.

[00952] O anticorpo parental foi identificado por meio de seleção de uma biblioteca de anticorpos IgG totalmente humanos naïve baseados em levedura, usando formas humanas e murídeas de LLCs de TGFβ1 (LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1 e GARP-pró-TGFβ1) como antígenos de seleção positiva e contra-seleção nas moléculas apresentadoras-LLC humanas e murídeas (LTBP1, LTBP3 e GARP). A seleção foi um processo com várias rodadas, incluindo duas rodadas de “Magnetic Bead Assisted Cell Sorting” (MACS) e várias rodadas subsequentes de “Fluorescence Activated Cell Sorting” (FACS). As rodadas de MACS incluíram pré-limpeza (para remover ligantes não- específicos), incubação com antígeno biotinilado, lavagem, eluição e amplificação de levedura. As rodadas de seleção por FACS incluíram incubação com o antígeno biotinilado, lavagem e seleção de população de ligação (para seleção positiva) ou não ligação (para seleção negativa ou de- seleção) por citometria de fluxo, seguida por amplificação da levedura selecionada por crescimento em meios de crescimento de levedura apropriados. Todas as seleções foram realizadas em fase de solução.

[00953] Várias centenas de anticorpos únicos foram expressas como anticorpos monoclonais IgG1agly humanos de comprimento total (Fc aglicosilado). Esses anticorpos foram então caracterizados por interferometria de biocamada para determinar sua habilidade para se ligar a LTBP1-pró-TGFβ1, LTBP3-pró-TGFβ1 e GARP-pró-TGFβ1 humanos e murídeos. Anticorpos que se ligaram a esses LLCs de TGFβ1 foram testados e ordenados por classificação em ensaios de avaliação de potência baseados em células (ensaios de LTBP- pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1). Os anticorpos inibidores foram expressos recombinantemente com um Fc humano IgG4sdk (dobradiça estabilizada por mutação S228P; Angal, 1993) e sua atividade inibidora testada em ensaios de ativação mediada por integrina de TGFβ1 (ensaios de LTBP- pró-TGFβ1, GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1; veja o Exemplo 2). Vários anticorpos foram capazes de inibir significantemente pró-TGFβ1 no ensaio de célula repórter. O anticorpo Ab4 foi escolhido como o anticorpo-líder para maturação de afinidade com base em sua habilidade para se ligar a complexos pró-TGFβ1 humanos e de camundongo e inibir ativação mediada por integrina de todos os pró-LLCs de TGFβ1 humanos e de camundongo.

[00954] A maturação de afinidade de Ab4 foi feita em dois estágios usando duas estratégias de modificação genética de anticorpo diferentes. Na primeira fase, foi gerada uma biblioteca de moléculas de anticorpo na qual a CDRH3 parental foi combinada com uma biblioteca de anticorpos feita previamente com variantes de CDRH1 e CDRH2 (embaralhamento de H1/H2). Essa biblioteca foi selecionada para ligação aos complexos pró-TGFβ1 humanos e de camundongo. Os ligantes mais fortes dessa fase da campanha de maturação de afinidade foram então levados até a segunda fase de maturação de afinidade, na qual a CDR3 da cadeia pesada da molécula parental foi submetida à mutagênese usando uma abordagem de dímero iniciador móvel (mutação H3 óligo), e a biblioteca de variantes gerada foi selecionada para ligação aos complexos pró-TGFβ1 humanos e de camundongo.

[00955] Um total de 14 anticorpos que representam proles com afinidade otimizada do anticorpo-líder Ab4 de ambos os estágios de maturação de afinidade foram testados novamente para ligação ao antígeno e inibição de LLCs de TGFβ1 latente. Ab6 foi selecionado em função de sua alta afinidade para todos os quatro LLCs de TGFβ1 latente, reatividade cruzada com proteínas de camundongo, rato e macaco Cynomolgus, e potência aumentada em ensaios baseados em células.

[00956] Para caracterizar ainda mais as propriedades de ligação de Ab6, as atividades de ligação in vitro foram medidas em um ensaio de MSD-SET. Ab6 foi confirmado como sendo seletivo para complexos de TGFβ1 latente (veja a FIG. 33A); nenhuma ligação significativa foi detectada aos complexos de TGFβ2 latente ou TGFβ3 latente. Similarmente, nenhuma ligação foi detectada ao fator de crescimento TGFβ1 ativo (maduro) propriamente dito que não está em associação com um pró-domínio. Como mostrado abaixo, Ab6 se liga com alta afinidade a todos os complexos grandes de TGFβ1 latentes (ou seja, molécula apresentadora + pró-TGFβ1). Além disso, Ab6 demonstrou ter reatividade cruzada desejada entre espécies; ele reconhece e se liga com alta afinidade às contrapartes de rato e Cynomolgus. Tabela 21. Especificidade cruzada de espécies de Ab6.

Complexo Humano Camundongo Rato Símios

Latente KD (pM) KD (pM) KD (pM) KD (pM) Grande LTBP1-pró- 18 ± 0 24 ± 0 35 ± 2 39 ± 2 TGFβ1 LTBP3-pró- 29 ± 3 22 ± 0 n.d. n.d. TGFβ1 GARP-pró- 27 ± 2 21 ± 3 n.d. n.d. TGFβ1 LRRC33-pró- 63 ± 0 48 ± 0 86 ± 8 93 10 TGFβ1

[00957] Para testar a habilidade de Ab6 para inibir a ativação de TGFβ1 latente por integrinas, uma série de ensaios de ativação baseados em células foi desenvolvida, que correspondem a cada um dos contextos de LLC que habilitam a apresentação e ativação de TGFβ1. Células de glioblastoma humano LN229 expressam integrinas αVβ8, que podem ativar complexos TGFβ1 latentes. Essas células também expressam endogenamente LTBP1 e LTBP3 (como medido por qPCR) que, quando transfectadas com um plasmídeo que codifica TGFβ1, habilitam a produção e deposição desses LLCs de TGFβ1 (LTBP1- pró-TGFβ1 e LTBP3-pró-TGFβ1) na matriz extracelular. A fim de produzir LLCs de TGFβ1 associados à célula que contêm GARP ou LRRC33 (GARP-pró-TGFβ1 e LRRC33-pró-TGFβ1), células LN229 (que não expressam esses genes, por qPCR) foram co- transfectadas com construções de expressão que codificam uma dessas moléculas de apresentação juntamente com uma construção de expressão de TGFβ1. Uma vez depositados na matriz extracelular ou elaborados na superfície celular de células LN229, LLCs de TGFβ1 podem então ser ativados por integrina αVβ8 expressa pelas mesmas células. Fator de crescimento TGFβ1 maduro (ativo) que é liberado do complexo latente por ativação por integrina está então livre para engajar ao seu receptor cognato em células cocultivadas modificadas geneticamente com um promotor-repórter de CAGA12-luciferase que permite a medição da atividade do fator de crescimento.

[00958] Todos os LLCs de TGFβ1 foram prontamente ativados sob as condições de ensaio mencionadas acima. A cotransfecção de GARP ou LRRC33 em células LN229 que expressam TGFβ1 latente resultou em um sinal de TGFβ significantemente maior, consistente com a formação e ativação de LLCs de TGFβ1 na superfície celular e superar LTBPs endógenos. Ab6 inibiu a ativação de todos os complexos de uma forma concentração- dependente com valores de IC50 entre 1,15 e 1,42 nM. A potência inibidora para complexos de TGFβ1 de camundongo foi similar, em linha com a reatividade cruzada de espécies de Ab6. Consistente com a ausência de ligação significante de Ab6 ao complexo LTBP1-TGFβ3, pouca ou nenhuma inibição do complexo de ativação mediada por integrina de LTBP-TGFβ3 LLC foi observada em um ensaio projetado identicamente demonstrando, dessa forma, seletividade para inibição da ativação de TGFβ1 (FIG. 33B).

[00959] Notavelmente, Ab6 também inibiu a ativação de TGFβ1 latente por calicreína e plasmina plasmáticas humanas (veja as FIGS. 5A & 5B), indicando que vários supostos mecanismos da ativação podem ser inibidos por esse anticorpo.

[00960] Para avaliar ainda mais a habilidade de Ab6 para inibir uma consequência biologicamente relevante da ativação de TGFβ1, avaliamos a habilidade desse anticorpo para inibir uma atividade supressora crucial de células Treg primárias humanas. Células Treg CD4+CD25hiCD127lo supra-regulam a expressão de superfície de TGFβ1-GARP LLC mediante estimulação do receptor de célula T (FIG. 26A). Essas células Treg ativadas suprimiram a proliferação de células T efetoras CD4 autólogas, e Ab6 bloqueou essa atividade supressora de Treg em concentrações de apenas 1 µg/mL (FIG. 26B). Esses resultados são consistentes com observações prévias de que células Treg utilizam sinalização de TGFβ para suprimir células T. Exemplo 10. Mapeamento de epitopos para determinar onde no complexo pró-TGFβ Ab5, Ab6 e Ab3 estão se ligando

[00961] Para obter informações iniciais sobre o mecanismo de ação inibidor para os inibidores isoforma-seletivos da ativação de TGFβ1, realizamos análise por espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (H/DX-MS) para identificar possíveis locais da interação de TGFβ1 latente com o anticorpo. Espectrometria de massa por troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS) é uma técnica amplamente usada para exploração de conformação de proteína em solução. A metodologia de HDX-MS é descrita em Wei e cols., Drug Discov. Today. Janeiro de 2014; 19 (1): 95–102, incorporado por referência em sua totalidade nesse relatório descritivo. Resumidamente, HDX-MS se baseia na troca de hidrogênios de amida do arcabouço da proteína com deutério em solução. Os hidrogênios de amida do arcabouço envolvidos em ligações hidrogênio fracas ou localizados na superfície da proteína podem ser trocados rapidamente, enquanto aqueles enterrados no interior ou aqueles envolvidos na estabilização das ligações hidrogênio são trocados mais lentamente. Por medição das taxas de hidrogênios de amida do arcabouço por HDX, pode-se obter informação sobre a dinâmica e conformação de proteínas.

[00962] TGFβ1 latente (15 µM) e Fab pró-TGFβ1/Ab (proporção molar de 1:3) foram preparados em tampão de amostra (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7,5). Nos experimentos não deuterados, cada amostra foi misturada com tampão de amostra (1:15, v/v) em temperatura ambiente, e depois misturada com tampão de extinção 1:1 (v/v) (100 mM de fosfato de sódio, 4 M de HCl de guanidina, 0,5 M de TCEP) a 0°C. As amostras extintas foram imediatamente injetadas em um sistema nanoACQUITY UPLC™ com tecnologia HDX (Waters Corp., Milford, MA, EUA) para digestão com pepsina em coluna. O eluente foi direcionado em um espectrômetro de massa SYNAPT® G2 HDMS (Waters Corp., Milford, MA, EUA) para análise em modo MSE. Para experimentos de troca H/D, cada amostra foi misturada com tampão de marcação (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl em óxido de deutério, pD 7,5) (1:15, v/v) para iniciar as reações de marcação a 25°C. Cinco alíquotas de cada amostra foram marcadas em vários intervalos de tempo: 10 s, 1 min, 10 min, 1 h e 2 h. Ao final de cada ponto do tempo de marcação, a reação era extinta por adição de tampão de extinção 1:1 (v/v), e as amostras extintas foram injetadas no sistema H/DX-MS de Waters para análise. Entre cada processamento de amostra, um branco limpo era processado por injeção de tampão de lavagem de pepsina (1,5 M de HCl de guanidina, acetonitrila 4%, ácido fórmico 0,8%) no sistema de H/DX-MS.

[00963] A dissociação precisa induzida por massa e colisão em modo de aquisição de dados independente (MSE) e software ProteinLynx Global Server (PLGS) 3.0 (Waters Corp., Milford, MA) foram usados para determinar os peptídeos pépticos nas amostras de proteínas não deuteradas analisadas no mesmo sistema UPLC-ESI-QToF usado para experimentos de H/DX-MS.

Os peptídeos pépticos gerados por PLGS foram importados para DynamX 3.0 (Waters Corp., Milford, MA) com limiares de qualidade de peptídeo de intensidade de sinal MS1 ≥ 1.000, e erro de massa máximo de 1 ppm.

Os resultados automatizados foram inspecionados manualmente para assegurar que as distribuições m/z e isotópicas correspondentes em vários estados de carga fossem adequadamente atribuídas ao peptídeo péptico apropriado.

DynamX 3.0 foi usado para gerar o gráfico de incorporação relativa de deutério e mapa de calor por H/DX para cada peptídeo péptico.

A incorporação relativa de deutério de cada peptídeo foi determinada por subtração da massa centróide média-ponderada da distribuição isotópica de amostra de controle não deuterada daquela da massa centróide média-ponderada da distribuição isotópica de amostras marcadas com deutério em cada ponto do tempo de marcação.

Todas as comparações foram realizadas sob condições experimentais idênticas negando, dessa forma, a necessidade para retrocorreção de troca na determinação da incorporação de deutério.

Dessa forma, os níveis de troca H/D são relatados como relativos.

A captação de deutério relativa fracionada foi calculada por divisão da captação de deutério relativa de cada peptídeo péptico por sua captação teorética máxima.

Todos os experimentos de H/DX-MS foram realizados em duplicata e um limite de confiança de 98% para a incerteza da captação relativa média de deutério foi calculado como descrito. Diferenças na captação de deutério entre o TGFβ1 latente não ligado e ligado ao Fab que excedem 0,5 Da foram consideradas significantes.

[00964] HDX-MS foi realizada para determinar onde no complexo pró-TGFβ Ab5 e Ab6 estavam se ligando. Em HDX-MS, as regiões de um antígeno que estão firmemente ligadas por um anticorpo são protegidas da troca de prótons, em função da interação proteína-proteína, enquanto regiões que estão expostas ao solvente podem prontamente passar por troca de prótons. Com base nisso, foram identificadas regiões de ligação do antígeno.

[00965] Um mapa de calor mostra os resultados da ligação de Fab de Ab5 em proteção de HDX em regiões (Região 1 e Região 2) de Pró-TGFβ1 (FIG. 16). A FIG. 17 retrata a estrutura do complexo pró-TGFβ1, sobreposta com as regiões ligadas por Ab5 protegidas por HDX. Notavelmente, HDX-MS mostrou que Ab5 se liga potencialmente a um epitopo único na Região LAP/Fator de Crescimento de Pró-TGFβ1.

[00966] Estudos de HDX similares foram realizados para identificar as regiões de ligação envolvidas na ligação de Ab6 ao pró-TGFβ1. Uma cobertura de peptídeo excelente de aproximadamente 90% foi obtida. A análise revelou três regiões em TGFβ1 latente que estavam protegidas da troca de deutério por ligação de Fab de Ab6. O mapa de calor fornecido na FIG 18A mostra certas regiões de Pró-TGFβ1 afetadas pela interação de Ab6 com o antígeno. Essas áreas do antígeno foram ressaltadas por caixas vermelhas mostradas na figura. A FIG. 18B mostra a estrutura do complexo pró-TGFβ1, e as regiões identificadas na FIG. 18A foram marcadas de acordo para exibir o relacionamento espacial dessas áreas dentro do complexo pró-TGFβ1.

[00967] Como mostrado na FIG. 18A, a região protegida marcada com um asterisco (*) foi constatada como sendo a mesma que a Região 1 identificada para Ab5. A região protegida marcada com um asterisco duplo (**) foi constatada como sendo um subconjunto da Região 2 identificada para Ab5. Esses dados sugerem que anticorpos preferidos que exibem atividades inibidoras vantajosas podem ser ligar a um epitopo que inclui uma porção do Laço de Latência (Alça de Latência) do complexo latente. Os dados também sugerem que esse epitopo pode ser um epitopo combinatório que é formado por uma porção do Laço de Latência e uma porção do domínio do fator de crescimento, que pode “pinçar” eficazmente o fator de crescimento no estado “trancado” impedindo, dessa forma, sua liberação.

[00968] Análises estatísticas revelaram três regiões de ligação on pró-TGFβ1 que estavam fortemente protegidas da troca de deutério por ligação de Fab de Ab6 (FIG. 19A). A Região 1 está dentro do pró-domínio de TGFβ1 latente, enquanto as regiões 2 e 3 mapeiam para o fator de crescimento TGFβ1. Curiosamente, a região 1, em grande parte, transpõe o laço de latência e contém os sítios de clivagem proteolítica tanto para plasmina quanto calicreína proteases; a proteção dessa região é consistente com nossa observação de que Ab6 inibe a ativação de TGFβ1 latente mediada por calicreína e plasmina (FIGS. 5A & 5B). Isso também é importante para reiterar que Ab6 não se liga a qualquer um dos três dímeros de fator de crescimento TGFβ em forma livre (por exemplo, não em associação com o pró- domínio), o que implica em que quaisquer interações potenciais com sítios no domínio do fator de crescimento são dependentes de interações do pró-domínio. Além disso, Ab6 e integrina αVβ6 podem se ligar ao TGFβ1 latente simultaneamente. Essa observação sugere um mecanismo de inibição alostérica da ativação de TGFβ1 integrina- dependente, na medida em que as regiões de ligação do anticorpo estão distais à alça desencadeadora no pró-domínio de TGFβ1 que carrega o sítio de reconhecimento de integrina (RGD; FIG. 19B). Além disso, o alinhamento de sequências de supostas regiões de epitopo 1-3 (particularmente Regiões 1 & 2) revelou divergência de sequência significante através das três isoformas de TGFβ, o que provavelmente explica a seletividade observada de Ab6 para complexos pró-TGFβ1 versus complexos pró-TGFβ2 e pró-TGFβ3 (FIG. 19B). Exemplo 11: Análise por bioinformática de expressões relativas de TGFB1, TGFB2 e TGFB3

[00969] Análises prévias de amostras de tumor humano implicaram a sinalização de TGFβ como um contribuinte importante para resistência primária à CBT (Hugo e cols. 2016). Um desses estudos revelou que a expressão do gene de TGFΒ1 em cânceres uroteliais era um dos genes da via de TGFβ mais bem ranqueados associados com não-responsivos ao tratamento com anti-PD-L1 sugerindo que a atividade dessa isoforma pode estar dirigindo a sinalização de TGFβ.

[00970] Para avaliar a expressão de isoformas de TGFβ em tumores cancerosos, foram examinados dados de expressão gênica (RNAseq) de conjuntos de dados disponíveis publicamente. Usando uma ferramenta de interface online disponível publicamente (Firebrowse) para examinar a expressão de isoformas de TGFβ no “Cancer Genome Atlas”

(TCGA), primeiro foi examinada a expressão diferencial de RNA que codifica isoformas de TGFβ em tecido tanto normal quanto canceroso. A expressão de mRNA de TGFΒ1, TGFΒ2 e TGFΒ3 foi avaliada através de populações de tipos de câncer humano, bem como dentro de tumores individuais. Todos os conjuntos de dados tumorais de RNAseq na base de dados do TCGA para os quais havia comparadores com tecido normal foram selecionados, e a expressão dos genes de TGFB1, TGFB2 e TGFB3 foi examinada (FIG. 20A). Dados da interface Firebrowse estão representados como log2 de leituras por milhão de quilobases (RPKM).

[00971] Esses dados sugerem que, na maioria dos tipos de tumor (cinza), TGFB1 é o transcrito mais abundantemente expresso das isoformas de TGFβ, com valores de log2 (RPKM) geralmente na faixa de 4-6, vs. 0-2 para TGFB2 e 2-4 para TGFB3. Também observamos que, em vários tipos de tumor, o nível médio da expressão tanto de TGFB1 quanto de TGFB3 são elevados em relação a amostras normais comparadoras (preto), sugerindo que a expressão aumentada dessas isoformas de TGFβ pode estar associada com células cancerosas. Por causa do papel potencial da sinalização de TGFβ na supressão do sistema imune do hospedeiro no microambiente de câncer, estávamos interessados em observar que transcritos de TGFB1 estavam elevados em tipos de câncer para os quais terapias anti-PD1 ou anti-PDL1 são aprovadas – essas indicações estão rotuladas em cinza na FIG. 20A.

[00972] Observe que, enquanto RPKM > 1 é geralmente considerado como sendo o valor mínimo associado com expressão gênica biologicamente relevante (Hebenstreit e cols., 2011; Wagner e cols., 2013), no entanto, para análises subsequentes, foram usados valores de corte de RPKM mais rigorosos (ou da medição calculada de FPKM (veja Conesa e cols., 2016)) > 10 ou > 30 para evitar falso-positivos. Para comparação, todos os três daqueles limiares estão indicados na FIG. 20A.

[00973] As grandes faixas interquartis na FIG. 20A indicam variabilidade significante na expressão de isoforma de TGFβ entre pacientes individuais. Para identificar cânceres nos quais pelo menos um subconjunto da população de pacientes possui tumores que expressam diferencialmente a isoforma TGFB1, foram analisados dados de RNAseq de amostras de tumor individuais no conjunto de dados de TCGA, calculando o número de fragmentos por milhão de quilobases (FPKM). RPKM e FPKM são aproximadamente equivalentes, embora FPKM corrija leituras de contagem duplas em extremidades opostas do mesmo transcrito (Conesa e cols., 2016). Amostras de tumor foram pontuadas como positivas para expressão de TGFB1, TGFB2 ou TGFB3 se o valor FPKM do transcrito fosse >30 e a fração de pacientes (expressa como %) de cada tipo de câncer que expressava cada isoforma de TGFβ foi calculada (FIG. 20B).

[00974] Análise comparativa de dados de RNAseq do “The Cancer Genome Atlas” (TCGA) revelou que, entre os três membros da família, a expressão de TGFΒ1 pareceu ser a mais prevalente através da maioria dos tipos de tumor. Exceções notáveis são câncer de mama, mesotelioma e câncer de próstata, nos quais a expressão de outros membros da família, particularmente TGFΒ3, é pelo menos igualmente prevalente em comparação com TGFΒ1. Como mostrado na FIG. 20B, a maioria dos tipos de tumor mostra uma percentagem significante de amostras individuais que são TGFβ1-positivas, com alguns tipos de câncer, incluindo leucemia mielóide aguda, linfoma de célula B grande difuso e carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, expressando TGFβ1 em mais do que 80% de todas as amostras de tumor. Consistentes com os dados na FIG. 20A, menos tipos de câncer são positivos para TGFβ2 ou TGFβ3, embora vários cânceres exibam uma percentagem igual ou maior de amostras de tumor que são TGFβ3-positivas, incluindo carcinoma invasivo da mama, mesotelioma e sarcoma. Esses dados sugerem que tipos de câncer podem ser estratificados quanto à expressão da isoforma de TGFβ, e que essa estratificação pode ser útil na identificação de pacientes que são candidatos para o tratamento com inibidores de TGFβ isoforma-específicos.

[00975] Para investigar ainda essa mais hipótese, os dados de RNAseq de log2 (FPKM) de um subconjunto de amostras de tumor individuais foram tabulados em um mapa de calor (FIG. 20C), que configura o limiar de cor para refletir FPKM > 30 como um nível de transcrito mínimo para ser pontuado como TGFB isoforma-positivo. A classificação da expressão de mRNA de TGFΒ1 em amostras de tumor individuais entre sete tipos de tumor aprovados para CBT confirmou a expressão de mRNA de TGFΒ1 maior e mais frequente em comparação com TGFΒ2 e TGFΒ3, novamente com a exceção notável do carcinoma de mama. Essas observações e as observações publicadas previamente no câncer urotelial sugerem que a via de atividade de TGFβ é provavelmente dirigida por ativação de TGFβ1 na maioria dos tumores humanos.

[00976] Cada amostra é representada como uma fileira única no mapa de calor, e as amostras estão dispostas por nível de expressão de TGFB1 (os maiores níveis de expressão no topo). Consistente com a análise na FIG. 20B, um número significante de amostras em cada tipo de câncer é positivo para expressão de TGFB1. No entanto, essa representação também ressalta o fato de que muitos tumores expressam exclusivamente transcritos de TGFB1, particularmente nos tipos de câncer de carcinoma esofágico, urotelial da bexiga, adenocarcinoma pulmonar e melanoma cutâneo. Curiosamente, esse desvio para TGFB1 não é uma característica de todos os cânceres, já que amostras de carcinoma invasivo de mama mostram um número de amostras bem maior que são TGFB3- positivas do que são TGFB1-positivas. No entanto, essa análise indica que a isoforma β1 é o predominante e, na maioria dos casos, o único, membro da família TGFβ presente em tumores de um grande número de pacientes com câncer. Considerados em conjunto com dados que sugerem que a sinalização de TGFβ tem um papel significante na imunossupressão no microambiente de câncer, esses achados também apontam para a utilidade da inibição específica de TGFβ1 no tratamento desses tumores.

[00977] Para identificar modelos em camundongo nos quais pode ser testada a eficácia da inibição específica de TGFβ1 como uma terapêutica para o câncer, foi analisada a expressão da isoforma de TGFβ em dados de RNAseq de várias linhagens de células usadas em modelos singênicos de tumor em camundongos. Para essa análise, duas representações dos dados foram geradas. Primeiro, geramos um mapa de calor dos valores de log2 (FPKM) para tumores derivados de cada linhagem de célula (FIG. 20D, esquerda). Como essa análise foi usada para identificar modelos singênicos que recapitulariam tumores humanos (predominantemente TGFB1),

nos preocupamos primariamente em evitar falso-negativos, e configuramos nosso limiar “positivo” em FPKM > 1, bem abaixo daquele nas representações nas FIGS. 20B e 20C.

[00978] Como os dados representação na FIG. 20D (esquerda) deixam claro, diversos tumores singênicos, incluindo MC-38, 4T-1, e EMT6, comumente expressam níveis significantes tanto de TGFβ1 quanto de TGFβ3. Em contraste, os modelos A20 e EL4 expressam TGFβ1 quase exclusivamente, e os tumores S91 e P815 exibem uma forte tendência para expressão de TGFB1.

[00979] Para avaliar ainda mais a expressão diferencial de TGFB1 vs. TGFB2 e/ou TGFB3, o minΔTGFB1 foi calculado, definido como o menor valor de log2 (FPKMTGFB1) - log2 (FPKMTGFB2) ou log2 (FPKMTGFB1) - log2 (FPKMTGFB3). O minΔTGFB1 para cada modelo é mostrado como um mapa de calor na FIG. 20D (direita), e enfatiza a conclusão da FIG. 20D (esquerda) de que tumores singênicos das linhagens de células A20, EL4, S91 e/ou P815 podem representar modelos excelentes nos quais se testa a eficácia de inibidores TGFβ1-específicos.

[00980] Para confirmar ainda mais a associação da expressão de TGFβ1 com resistência primária à CBT em relação a TGFβ2 ou TGFβ3, correlacionamos a expressão de isoforma com a Assinatura de Resistência a Anti-PD-1 Inata (“IPRES”) (Hugo e cols., Cell., 24 de março de 2016; 165 (1): 35-44). EM resumo, IPRES é uma coleção de 26 assinaturas transcriptômicas, que coletivamente indicam resistência do tumor à terapia com anti-PD-1. A assinatura de IPRES indica a superexpressão de genes envolvidos na regulação de transição mesenquimal, adesão celular, remodelagem da ECM, angiogênese e cicatrização de feridas. Através de sete tipos de tumor aprovados para CBT encontramos mais consistentemente uma correlação positiva e significante entre níveis de mRNA de TGFΒ1 e pontuação de IPRES do que a expressão de mRNA das outras duas isoformas de TGFβ (FIG. 37A). Considerados em conjunto, esses dados sugerem que a inibição seletiva da atividade de TGFβ1 pode superar a resistência primária à CBT.

[00981] A análise de variação Geneset (GSVA) da assinatura transcricional IPRES (Resistência Inata a anti- PD-1) através de tipos de tumor definidos por TCGA com terapias CBT aprovadas se correlaciona (coeficiente de Pearson) mais fortemente e significantemente com abundância de RNA de TGFβ1, com valor de corte de FPKM ≥ 30 para presença de expressão. Considerados em conjunto, esses dados sugerem que a inibição seletiva de atividade de TGFβ1 pode superar a resistência primária à CBT.

[00982] A análise de variação Geneset (GSVA) da assinatura transcricional IPRES (Resistência Inata a anti- PD-1) através de tipos de tumor definidos por TCGA com terapias CBT aprovadas se correlaciona (coeficiente de Pearson) mais fortemente e significantemente com abundância de RNA de TGFβ1, com valor de corte de FPKM ≥ 30 para presença de expressão.

[00983] Para avaliar ainda mais a correlação da expressão de TGFβ1 com resistência à CBT, a abundância de RNA de TGFβ1 foi comparada com uma análise de variação de conjunto de genes (GSVA) assinatura transcricional (Resistência Inata a anti-PD-1) da via de TGFβ Plasari através de tipos de tumor definidos por TCGA com terapias CDT aprovadas. O conjunto de genes Plasari foi obtido do portal na web mSigDB

(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) e o cálculo de Gene Set Score foi determinado usando a suíte GSVA em R (Hanzelmann e cols., BMC Bioinformatics 201314: 7, 2013; e Liberzon e cols., Bioinformatics., 15 de junho de 2011; 27 (12): 1.739–1.740). Como mostrado na FIG. 37B, a GSVA se correlacionada (coeficiente de Pearson) mais fortemente e significantemente com abundância de RNA de TGFβ1, com valor de corte de FPKM ≥ 30 para presença de expressão.

[00984] Esses dados sugerem que a via de atividade de TGFβ é provavelmente dirigida por ativação de TGFβ1 na maioria dos tumores humanos.

[00985] Os seguintes recursos foram usados para as análises bioinformáticas descritas acima:

[00986] Os dados de expressão de TCGA da “TGFΒeta Isoform” foram baixados do recurso de conjuntos de dados UCSC Xena Browser (https://xenabrowser.net/datapages/). O valor de corte da expressão para determinar expressão elevada foi verificado por exame da distribuição de valores FPKM de dados “TGFΒeta Isoform”. Mapas de calor e diagramas de dispersão foram gerados usando GraphPad Prism. O conjunto de genes Plasari foi obtido do portal na web mSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) e o cálculo “Gene Set Score” foi determinado usando a suíte GSVA em R. Exemplo 12: Inibidores TGFβ1-seletivos exibem toxicidade reduzida comparados com o inibidor de ALK5 quinase LY2109761 e um anticorpo pan-TGFβ em estudos de segurança/toxicologia

[00987] Para avaliar a toxicidade in vivo potencial de Ab3 e Ab6, comparado com o inibidor de quinase de pequena molécula de receptor de TGF-β tipo I (ALK5) LY2109761 e com um anticorpo pan-TGFβ (hIgG4; neutralizante), foram realizados estudos de segurança/toxicologia em ratos. O rato foi selecionado, já que a seleção da espécie para esse estudo de segurança se baseava nos relatos prévios de que ratos são mais sensíveis à inibição de TGFβ, comparados com camundongos. Toxicidades similares observadas em ratos também foram observadas em outras espécies de mamíferos, por exemplo, cães, primatas não humanos, bem como humanos.

[00988] Resumidamente, fêmeas de ratos Fisher344 (FIGS 21A e 21B) ou de ratos Sprague Dawly (FIG. 21C) foram administradas com Ab3 a 3 mg/kg (1 grupo, n = 5), a 30 mg/kg (1 grupo, n = 5), ou a 100 mg/kg (1 grupo, n = 5); Ab6 a 10 mg/kg (1 grupo, n = 5), a 30 mg/kg (1 grupo, n = 5), ou a 100 mg/kg (1 grupo, n = 5); anticorpo pan-TGFβ a 3 mg/kg (1 grupo, n = 5), a 30 mg/kg (1 grupo, n = 5), ou a 100 mg/kg (1 grupo, n = 5); LY2109761 a 200 mg/kg (1 grupo, n = 5) ou 300 mg/kg (1 grupo, n = 5); ou controle de veículo de PBS (pH 7,4) (1 grupo, n = 5).

[00989] Animais que recebem anticorpo pan-TGFβ foram dosados uma vez por via intravenosa (no dia 1) em um volume de 10 ml/kg e sacrificados no dia 8 e necropsias realizadas. Animais que recebem Ab3 ou Ab6 foram dosados i.v. uma vez por semana por 4 semanas (nos Dia 1, 8, 15 e 22) em um volume de 10 ml/kg. Animais que recebem LY2109761 foram dosados por gavagem oral uma vez ao dia por cinco ou sete dias. Os animais foram sacrificados no Dia 29 e necropsias realizadas.

[00990] Foram realizadas observações clínicas gerais dos animais duas vezes ao dia e observações ao lado das gaiolas fora realizadas pós-dose para avaliar toxicidade aguda.

Outras observações realizadas incluíram uma avaliação de consumo de alimento e medição do peso corporal uma vez por semana. Essas também incluíram patologia clínica (hematologia, química sérica e coagulação) e avaliações de anatomia patológica (grosseira e microscópica). Um conjunto abrangente de tecidos foi coletado na necropsia para avaliação microscópica. Os tecidos foram preservados em formalina tamponada neutra 10%, aparados, processados rotineiramente, e embebidos em parafina. Os blocos de parafina foram passados em um micrótomo e os cortes corados com hematoxilina e eosina (H&E). Em particular, o coração foi aparado por bissecção longitudinal ao longo de um plano perpendicular ao plano da artéria pulmonar para expor as válvulas atrioventriculares direitas, atrioventriculares esquerdas e aórticas. Ambas as metades foram submetidas à embebição. Cada hemissecção do coração foi embebida em parafina com a superfície de corte para baixo. Os blocos foram cortados para obter pelo menos três válvulas cardíacas. Os cortes de tecido foram examinados por microscopia óptica por um membro certificado do “American College of Veterinary Pathologists” (ACVP).

[00991] Como mostrado na Tabela 20 e FIG. 21, animais administrados com ≥ 3 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ exibiam achados na válvula cardíaca (ou seja, valvulopatia) similares àqueles descritos em animais administrados com LY2109761. Animais administrados com ≥ 30 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ exibiam achados no átrio similares àqueles animais administrados com LY2109761. Animais administrados com 100 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ exibiam achados no miocárdio similares àqueles descritos em animais administrados com

LY2109761, e animais administrados com 30 mg/kg de anticorpo pan-TGFβ tinham hemorragia no miocárdio.

Um animal administrado com 100 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ teve necrose intramural moderada com hemorragia em uma artéria coronária, que foi associada com ligeiros infiltrados perivasculares de células inflamatórias mistas.

Os achados ósseos em animais administrados com o anticorpo pan-TGFβ e LY2109761 consistiram em esterno macroscópico modelado anormalmente e espessura microscópica aumentada da zona hipertrófica na placa terminal do esterno e atrofia do fêmur e tíbia; esses achados eram de incidência e/ou severidade maior em animais administrados com LY2109761 comparado com anticorpo pan- TGFβ.

Tabela 22. Achados cardíacos microscópicos em animais que recebem o anticorpo pan-TGFβ.

Anticorpo Pan-TGFβ Nível de dose 0 3 30 100 (mg/kg/dia) Coração Válvulas cardíacas Valvulopatia Mínima 0 2 0 0 Leve 0 2 4 5 Moderada 0 0 1 0 Átrio Infiltrado, células mistas Mínimo 0 0 1 2 Leve 0 0 1 1 Hiperplasia,

endotélio Mínimo 0 0 3 1 Hemorragia Mínima 0 0 1 0 Miocárdio Degeneração/necrose Leve 0 0 0 2 Hemorragia Mínima 0 0 2 1 Leve 0 0 1 1 Infiltrado, células mistas, base Slight 0 0 0 1 Artéria coronária Necrose com hemorragia Moderada 0 0 0 1 Infiltrado, células mistas, perivascular Leve 0 0 0 1

[00992] Como mostrado na FIG. 21A, animais administrados com anticorpo pan-TGFβ exibiam toxicidades similares àquelas descritos em animais administrados com LY2109761, como descrito em PCT/US2018/012601, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Especificamente, animais administrados com ≥ 3 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ exibiam achados na válvula cardíaca (por exemplo, valvulopatia) similares àqueles descritos nos animais administrados com LY2109761. Animais administrados com ≥ 30 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ exibiam achados no átrio similares àqueles descritos em animais administrados com LY2109761. Animais administrados com 100 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ exibiam achados no miocárdio similares àqueles descritos em animais administrados com LY2109761, e animais administrados com 30 mg/kg de anticorpo pan-TGFβ tiveram hemorragia no miocárdio. Um animal administrado com 100 mg/kg do anticorpo pan-TGFβ teve necrose intramural moderada com hemorragia em uma artéria coronária, que foi associada com ligeiros infiltrados perivasculares de células inflamatórias mistas. Os achados ósseos em animais administrados com o anticorpo pan-TGFβ e LY2109761 consistiram em esterno macroscópico modelado anormalmente e espessura microscópica aumentada da zona hipertrófica na placa terminal do esterno e atrofia do fêmur e tíbia. Estudos subsequente com LY2109761 e pan-TGFβ, como mostrado nas FIGS. 21B e 21C, também demonstraram toxicidades similares. As valvulopatias cardíacas observadas em animais tratados com inibidores pan- TGFβ eram caracterizadas por espessamento da válvula cardíaca em decorrência de hemorragia, hiperplasia endotelial, infiltrado de células inflamatórias mistas, e/ou hiperplasia estromal são consistentes com achados relatados previamente.

[00993] Em contraste, diferentemente de animais tratados com anticorpo pan-TGFβ ou LY2109761, ratos administrados com inibidores TGFβ1-seletivos, especificamente, Ab3 ou Ab6, o nível de nenhum-efeito adverso-observado (NOAEL) de Ab6 e Ab3 nesses estudos foi a dose de 100 mg/kg semanalmente, a maior dose testada. Como mostrado na FIG. 21B, ocorreram somente achados mínimos ou leves na válvula cardíaca em um pequeno número de animais tratados com Ab3, e esses achados foram considerados improvavelmente relacionados ao artigo de teste em função da baixa incidência (animal e número de válvulas cardíacas dentro de um animal), ausência de uma dose-resposta ou correlação com ela, e/ou ausência de achados ósseos concomitantes. Adicionalmente, não ocorreu nenhum achado em animais tratados com Ab6 (FIG. 21C).

[00994] A análise farmacocinética mostrou que concentrações séricas de Ab6 alcançavam 2.300 μg/mL em animais dosados a 100 mg/kg por 4 semanas. As concentrações séricas médias de Ab6 ao término do estudo (no Dia 29) alcançaram 2,3 mg/mL para a maior dose avaliada de 100 mg/kg. Esses resultados sugerem que a inibição seletiva da ativação de TGFβ1 parece evitar a toxicidade limitante da dose crucial em doses bem acima daquelas necessárias para o efeito terapêutico observado em vários modelos in vivo.

[00995] Em resumo, animais tratados com Ab3 ou Ab6 em todas as doses testadas (3 mg/kg, 30 mg/kg ou 100 mg/kg) ao longo de um período de 4 semanas em ratos (uma espécie sabidamente sensível à inibição de TGFβ) não exibiam efeitos tóxicos em relação ao nível de base em qualquer um dos seguintes parâmetros: degeneração ou necrose do miocárdio, hemorragia do átrio, hemorragia do miocárdio, hemorragia da válvula, hiperplasia do endotélio da válvula, hiperplasia do estroma da válvula, infiltrados de células inflamatórias mistas em válvulas cardíacas, mineralização, necrose com hemorragia na artéria coronária, necrose com inflamação na raiz aórtica, necrose ou infiltrado de células inflamatórias em cardiomiócitos e valvulopatia. Dessa forma, o tratamento com inibidores de ativação de TGFβ1 isoforma-específicos surpreendentemente resultou em perfis de segurança significantemente aprimorados, por exemplo, mortalidade reduzida, cardiotoxicidade reduzida e achados ósseos reduzidos, comparado com tratamento com inibidor pan-TGFβ (por exemplo, o inibidor de ALK5 quinase LY2109761 ou o anticorpo pan-TGFβ).

[00996] Um estudo de toxicologia GLP também foi realizado em primatas não humanos (macacos Cynomolgus) para avaliar os perfis de segurança do inibidor TGFβ1-seletivo, de alta afinidade, Ab6. O protocolo envolveu doses repetidas por 4 semanas a 30, 100 e 300 mg/kg por semana, seguidas por uma recuperação de 4 semanas.

[00997] Ab6 foi bem tolerado a 30, 100 e 300 mg/kg/semana. Nenhum achado adverso relacionado ao Ab6 foi observado nas coortes tanto principal quanto de recuperação. Nenhum achado adverso relacionado ao Ab6 foi observado em órgãos-alvo que são locais de toxicidades observadas com inibidores pan-TGFβ (por exemplo: nenhuma cardiotoxicidade, hiperplasia e inflamação, achados dentais e gengivais).

[00998] As concentrações séricas de Ab6 alcançaram 15.600 µg/mL após 5 doses semanais de 300 mg/kg. Ao final do tempo de recuperação, os níveis de concentração sérica de Ab6 permaneciam altos em aproximadamente 2.000 - 3.000 µg/mL.

[00999] Com base nesses dados, o NOAEL para Ab6 em macaco Cynomolgus é de 300 mg/kg/semana, que é a maior dose testada. Exemplo 13: Efeitos da combinação de anti-PD-1/Ab3 sobre células imunes intratumorais

[001000] Relatos prévios examinaram a exclusão de células T efetoras de tumores imunossuprimidos em modelos animais pré-clínicos.

[001001] No entanto, esses relatos ao forneciam informações em macrófagos. Para avaliar o relacionamento da infiltração de macrófagos em um modelo singênico de tumor imunossuprimido e os efeitos da inibição de TGFβ1 no contexto, imunoistoquímica foi realizada em amostras de tumor Cloudman S91 tratadas com anti-PD1 e Ab3 a 30 mg/kg do Exemplo 7 acima (veja as FIGS. 24A-24D).

[001002] Em cortes de tumor de controle de rom animais que não receberam a combinação de anti-PD1/Ab3, algumas células F4/80-positivas foram detectadas, indicando que o tumor contém alguns macrófagos, que provavelmente são do tipo M2, chamados macrófagos associados ao tumor, ou TAMs. Em comparação, em cortes preparados de animais que foram tratados com a combinação de anti-PD1/Ab3, foi observado um aumento acentuado no número de células F4/80-positivas dentro do tumor (veja FIGS. 24A-24C). Essa infiltração intensa do tumor por macrófagos F4/80-positivos em animais tratados com anti-PD-1/Ab3, comparado com anti-PD1 isoladamente, sugere que o tratamento combinado, mas não anti-PD1 isoladamente, induziu um grande influxo de células, presumivelmente em função do recrutamento de monócitos circulantes que infiltravam o tumor. Para identificar o fenótipo desses macrófagos, anti-CD163 foi usado como um marcador de macrófago M2. Como mostrado na FIG. 24D, a maioria dessas células demonstrou ser CD163-negativa, sugerindo que os macrófagos que foram recrutados para o tumor em resposta ao tratamento combinado de anti-PD1/Ab3 são provavelmente do tipo M1, dessa forma, um subtipo antitumoral. Isso pode ser indicativo de macrófagos que limpam restos de células de câncer gerados por células citotóxicas e é presumivelmente uma consequência direta da inibição de TGFβ1. Exemplo 14. Efeito dos inibidores de TGFβ1 sobre células citotóxicas em tumores MBT2

[001003] A exocitose granular é um mecanismo pelo qual células T citotóxicas se engajam e matam células tumorais residentes. Mediante ativação, os grânulos se fundem com a membrana plasmática e liberam seu conteúdo, incluindo citotoxinas, por exemplo, perforina e granzima B, o que resulta em eliminação da célula tumoral. Adicionalmente, antígeno CD8 (CD8a) é uma glicoproteína da superfície celular encontrada na maioria das células T citotóxicas que atua como um correceptor com o receptor de célula T. Consequentemente, níveis os CD8a, Perforina e Granzima B foram medidos em tumores tratados com Ab3 ou Ab6, cada um em combinação com anti-PD-1, para avaliar atividade da célula T efetora. Métodos

[001004] Camundongos-fêmeas C3H/HeN com 8-12 semanas de idade foram implantados com 5 x 105 células de tumor MBT2 no flanco. Os animais foram randomizados em grupos de dosagem com um tamanho tumoral médio de 40-80 mm3 antes do início do tratamento. Anti-PD1 (RMP1-14) foi dosado duas vezes por semana a 10 mg/kg. Ab3 foi dosado uma vez por semana a 30 mg/kg. Após 8 dias de dosagem, 8 horas após a dose final (três doses totais de anti-PD1, duas doses totais de Ab3) os animais foram sacrificados e os tumores excisados. Para Ab6, o encadeamento imune foi analisado no dia 10 ou dia 13 pós- tratamento. Anti-PD-1 foi dosado a 10 mg/kg duas vezes por semana. Ab6 foi dosado semanalmente a 10 mg/kg. Os tumores foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido, pulverizados em Covaris bolsas usando um cryoPREP Impactor e RNA foi extraído usando Trizol/Clorofórmio. cDNA foi gerado usando Taqman Fast Advanced Master Mix e CDNA foi carregado em um Taqman Array Card customizado com iniciadores e sondas dirigidas contra genes de interesse. qPCR foi executada em um termociclador Viia7. A expressão para genes de CTL foi normalizada para HPRT por cada amostra e a razão de alteração foi expressa em anti-PD1/Ab3 ou anti-PD1/Ab6 vs. anti-PD1 isoladamente. Resultados

[001005] A combinação de anti-PD1/Ab3 induziu supra- regulação potente de genes de CTL associados com resposta antitumoral em relação ao anti-PD1 isoladamente dentro do tumor (veja a FIG. 25). No modelo de tumor MBT2, anti-PD1 isoladamente gerou muito pouca supressão do crescimento tumoral e imunidade antitumoral. Dessa forma, esses resultados indicam que a adição de anticorpos anti-TGFβ permite a ativação completa e infiltração de células T efetoras CD8. Exemplo 15: Efeito de Ab3 e Ab6 sobre a atividade de Treg in vitro Métodos

[001006] PBMCs humanas foram isoladas da camada de células brancas de um doador saudável com Ficoll. Células CD4 foram selecionadas por meio de seleção magnética e depois Tregs CD25+CD127lo foram separadas e o Clone BC96 (ThermoFisher) foi usado para CD25hi e o clone HIL 7Rm21 (BD Bioscience) foi usado for CD127lo, usando um Biorad S3E. As Tregs separadas foram estimuladas 1 semana com anti-CD3 ligado à placa (clone OKT3, Biolegend) e anti-CD28 solúvel (clone 28.2, Biolegend) em meio TexMacs (Miltenyi). Em alguns estudos, IL2 foi adicionalmente acrescentada para supra- regular GARP e a expressão de pró-TGFβ. Tregs foram cocultivadas 1:1 com células T CD4 autólogas coradas com Cell Trace Violet 9 Invitrogen) e novamente estimuladas com anti-CD3/anti-CD28 por cinco dias. Após 5 dias, a divisão celular foi medida por citometria de fluxo (citômetro de fluxo Attune, ThermoFisher Scientific), que isola a diluição do corante Cell Trace Violet, e analisadas com FlowJo (BD Bioscience). Resultados

[001007] Ao longo de 5 dias em cultura, 80% das células T efetoras CD4 (Teffs) tinham se dividido. A adição de Tregs 1:1 suprimiu a divisão de Teff para quase 15% adição adicional de Ab3 a 10 µg/mL suprimiu completamente a inibição mediada por Treg da divisão de células T efetoras (veja a FIG. 26A). Um μg/mL de Ab3 inibiu menos potentemente a supressão de Treg. Um μg/mL e 10 μg/mL de Ab6 inibiram igualmente TGFβ derivada de Treg. Dessa forma, Ab6 parece ser um inibidor mais potente da ativação de TGFβ1 do complexo GARP-pró-TGFβ1 em Tregs. Exemplo 16: Efeitos do tratamento combinado de Ab6/anti-PD-1 sobre populações de células imunes intratumorais/encadeamento imune em tumores MBT2

[001008] Para começar a elucidar várias populações de células imunes que podem mediar os efeitos observados de regressão tumoral em camundongos tratados com uma combinação de anti-PD-1 e Ab6, o modelo de tumor MBT2 foi usado para estudos por FACS. O design do estudo está resumido abaixo.

Tabela 23. Design do estudo de encadeamento imune de tumor MBT2. Grupo Descrição do grupo Esquema de dosagem Coleta e análises de amostras IgG de Controle Mesmo que Grupos 2 & 3 Para cada Grupo: Anti-PD1 + (veja abaixo) i) Tumores inteiros de 6 1 IgG de Controle Ab6 animais para citometria de (n = 12) fluxo (FIGS. 27-29) Ab6 10 mg/kg nos Dias 1 e 8 para os 6 animais restantes: 2 (n = 12) (10 mg/kg/semana) ii) ½ tumor cada para análise Anti-PD1 10 mg/kg nos Dias 1, 4, de RNA (FIGS. 31 e 32) 3 (n = 12) 8 e 11 iii) ½ tumor cada para IHC

(20 mg/kg/semana) (FIGS. 30A-D e F)

Ab6 + anti-PD1 Mesmo que Grupos 2 & 3 4 (n = 12) (veja acima)

[001009] Cada grupo de estudo continha 12 camundongos com tumores MBT2, como descrito nesse relatório descritivo. O grupo com tratamento com Ab6- recebeu o anticorpo semanalmente, no dia 1 e dia 8, a 10 mg/kg. O grupo de tratamento com Anti-PD1 foi tratado quinzenalmente a 10 mg/kg por injeção, nos Dias 1, 4, 8 e 11, total de 20 mg/kg por semana. Cada grupo de IgG de controle foi tratado de acordo para combinar com o subtipo de IgG de anti-PD1 e Ab6. No Dia 13, os tumores foram coletados dos camundongos como mostrado acima.

[001010] Análise citométrica de fluxo: Subconjuntos de células imunes associadas ao tumor também foram analisados por citometria de fluxo do tumor em tumores MBT-2. Resumidamente, os tumores foram excisados e pesados antes da dissociação usando o Kit de Dissociação de Tumor para gentleMACS (Miltenyi). As amostras foram filtradas através de um coador de células de 70 µm para remover quaisquer agregados. Lve, células em singleto, foram lavadas com tampão de FACs antes da aplicação do coquetel de coloração contendo: MuTruStain FCX (Biolegend), Anti-FcyRIV (Biolegend), Live/Dead (Thermofisher), CD45-AF700 clone 30-F11 (Biolegend), CD3-PE clone 17A2 (Biolegend), CD4-BUV395 clone GK1.5 (BD Biosciences), CD8-APC-H7 clone 53-6.7 (BD Biosciences), CD11b-PerCP-Cy5.5 clone M1/70 (Biolegend), GR- 1-FITC clone RB6-8C5 (Biolegend), FoxP3-APC clone FJK-16s (ThermoFisher), F4/80-PE-Dazzle clone BM8 (Biolegend), CD206-BV421 clone C068C2 (Biolegend). A citometria de fluxo foi realizada em um Attune NxT (ThermoFisher) e analisada com FlowJo (BD Bioscience).

[001011] A estratégia gating para elucidar subpopulações de células T em tumores MBT2 é fornecida na FIG. 27A. Os resultados estão resumidos na FIG. 27B, medidos em tumores coletados no dia 13 após o início do tratamento. Como demonstrado, Ab6 usado em conjunto com anti-PD1 foi capaz de superar a exclusão imune por habilitação da infiltração e expansão de células T CD8+ em tumores. Especificamente, a combinação de anti-PD1/Ab6 induziu aumento significante no número (frequências) de células T CD8+ intratumorais, enquanto nenhuma alteração no % de células CD45+ de células vivas totais foi observada através dos grupos de tratamento. A combinação de Anti-PD1/Ab6 causou um aumento significante em Tregs; no entanto, a proporção CD8+:Treg não é alterada significantemente, em relação ao tratamento com anti-PD1.

[001012] A estratégia de gating para elucidar subpopulações de células mielóides é fornecida na FIG. 28A. Os resultados estão resumidos na FIG. 28B, medidos em tumores coletados no dia 13 após o início do tratamento. O infiltrado mielóide no Dia 13 mostra que o número de células imunes totais (por exemplo, CD45+) permanece estável através dos grupos de tratamento. O número de células mielóides totais (por exemplo, CD11b+, F4/80 lo-hi) foi significantemente alterado pelo tratamento com anti-PD1/Ab6. Especificamente, no grupo de controle, a fração mielóide constituía quase 75% das populações de macrófagos no tumor. Essa fração foi reduzida para menos da metade no grupo de tratamento com a combinação, que coincidiu com uma redução acentuada no número (frequências) de macrófagos pró-tumor tipo M2, bem como eliminação quase completa da fração de MDSC nesse grupo, enquanto macrófagos do tipo M1 permaneceram relativamente inalterados.

[001013] Entre as subpopulações de células mielóides, macrófagos M2 associados ao tumor MBT-2 mostraram expressão elevada na superfície celular de LRRC33 (FIG. 28C). As subpopulações de MDSC também mostraram forte expressão de LRRC33. A maior parte (67,8%) do subtipo de G-MDSC isolado do tumor MBT-2 expressava LRRC da superfície celular, enquanto cerca de um terço do subtipo M-MDSC isolado do tumor MBT-2 expressava LRRC33 da superfície celular (FIG. 28D).

[001014] Além disso, houve um aumento dramático na proporção de células T CD8+:macrófagos M2 observada no grupo de tratamento com anti-PD1/Ab6 (veja a FIG. 29C). Considerados em conjunto, os dados demonstram que os inibidores de TGFβ1 isoforma-seletivos podem ser usados para superar exclusão imune do tumor quando usado em conjunto com uma terapia de bloqueio do ponto de verificação. Isso pode ser, pelo menos em parte, mediado pela promoção de infiltração e expansão de células T CD8+, e redução concomitante de macrófagos pró-tumor (M2) e MDSCs imunossupressores no ambiente tumoral. É possível que esses efeitos possam de ser mediados pelo braço de GARP e pelo braço de LRRC33 de TGFβ1, respectivamente.

[001015] Para análise imunoistoquímica, tumores de seis animais foram cortados à metade e fixados. Foram preparados cortes para IHC e foram corados com vários marcadores de células imunes. FIG. 30 fornece imagens representativas no dia 10 ou dia 13. Como mostrado, foi observado aumento acentuado na frequência de células T CD8+ dentro do tumor no grupo tratado com a combinação de anti-PD1/Ab6 (FIG. 30D). Os dados indicam que Ab6 pode ser usado em conjunto com uma terapia de bloqueio do ponto de verificação para superar a exclusão imune por indução de infiltração e expansão de células T citotóxicas. FIG. 30E fornece a quantificação dos dados de IHC, mostrados % de células CD8-positivas de núcleos totais. Nesse modelo de tumor, poucas células CD8+ da linha de base estavam presentes (por exemplo, tumor “frio”). Nos grupos tratados com Ab6 isoladamente ou anti-PD-1 isoladamente, foi observado um ligeiro aumento na percentagem de CD8+ (cada um aproximadamente 10%). Em contraste, no grupo tratado com a combinação, foi obtido um aumento acentuado na frequência de células CD8+ dentro do tumor, indicando que a inibição de TGFβ1 em combinação com inibição do ponto de verificação pode provocar sinergicamente os efeitos antitumorais por superação da exclusão imune. Os dados sugerem que a combinação pode converter eficazmente um tumor “imuno-excluído” em um tumor “inflamados/quente”.

[001016] Para confirmar as alterações da expressão gênica que se correlaciona com a resposta imune observada em tumores MBT2, foi realizada a análise da expressão de RNA. Preparações de RNA de tumores MBT2 do dia 13 foram submetidas à análise da expressão gênica baseada em qPCR. RNA preparado de 5-6 animais por grupo foi usado para o estudo. As análises incluíram níveis de expressão dos seguintes genes, usados como o marcador indicado: Ptprc (CD45); Cd8a (célula T CD8); Cd8b1 (célula T CD8); Cd4 (célula T CD4); Cd3e (célula T); Foxp3 (Treg); Ifng (imunidade Th1); Prf1 (proteína de CTL); Gzmb (proteína de CTL); Gzma (proteína de CTL); Klrk1 (NK/CTL); Adgre1 (macrófago F4/80); Mrc1 (macrófago M2); Cd163 (macrófago M2); Cd80 (APC co-stim/macrófago M1); Ptger2 (angiogênese tumoral); Nrros (LRRC33); Tgfb1

(tolerância imune); 18S (manutenção); e, Ppib (manutenção).

[001017] As FIGS. 31A-31D fornecem alterações na expressão de genes da resposta imune Ptprc, CD8a, CD4 e Foxp3, respectivamente. O tratamento com a combinação de Anti-PD1/Ab6 induziu aumentos significantes no nível desses transcritos em tumores MBT2. Essas observações confirmam que o tratamento com anti-PD1/Ab6 provoca influxo maciço de células T CD8+, equipado com proteínas efetoras citotóxicas como, por exemplo, perforina e granzima.

[001018] A FIG. 32 fornece alterações da expressão gênica em marcadores imunes, Ifng, Gzmb, Prf1 e Klrk1 no dia 10 ou dia 13. Como mostrado, análises por pPCR desses genes marcadores demonstram que o tratamento combinado de anti-PD- 1 e inibidor de TGFβ1 induz expressão gênica de marcadores de proteínas citolíticas (Granzima B e Perforina), imunidade Th1 (IFNγ), e marcador de CTL/célula NK (Klrk1) no tumor. Esses dados fornecem evidências adicionais que dão suporte aos efeitos sinérgicos da inibição do ponto de verificação e inibição de TGFβ1 que medeiam efeitos antitumorais.

[001019] Na soma, esses resultados coletivamente mostram mobilização robusta de imunidade antitumoral despertada pelo bloqueio do ponto de verificação e inibição de TGFβ1. Especificamente, enquanto a fração global de células imunes que infiltram o tumor permanece constante através dos grupos de tratamento, a combinação de anti-PD-1/Ab6 causa a) aumento significante nas células T CD8+ intratumorais (* P < 0,05, teste T bicaudado vs. grupo de anti-PD-1); b) aumento significante em Tregs (* P < 0,05), no entanto, a proporção CD8+:Treg está inalterada (n.s., não significante vs. anti- PD-1); e, c) redução significante de células mielóides comparado com qualquer outro grupo, dirigida por uma redução da populações de macrófagos M2 imunossupressores e células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSC) (* P < 0,05, teste T bicaudado vs. grupo de anti-PD-1). A análise por PCR quantitativa de lisados do tumor inteiro confirma um aumento robusto em genes efetores de CD8. Similarmente, a combinação de anti-PD-1 e Ab6 induz um aumento acentuado na frequência de células T CD8+ dentro da massa tumoral, superando a exclusão imune.

[001020] Para confirmar os efeitos sobre a sinalização de TGFβ1 a jusante, análises imunoistoquímicas adicionais foram realizadas para detectar e localizar SMAD3 fosforilado em tumores MBT2. Como mostrado na FIG. 30F, foi verificado que FosfoSMAD3 está enriquecido perto do endotélio vascular dentro de tumores tratados com anti-PD-1. O tratamento com Ab6 aboliu esse sinal, dando suporte à noção de que a inibição de TGFβ1 pode promover infiltração de células imunes intratumorais convertendo, desse modo, um tumor imuno- excluído em um tumor inflamado que é responsivo ao bloqueio do ponto de verificação.

[001021] Animais tratados com Anti-PD-1 mostravam algumas células T CD8+ infiltrantes intimamente associadas com vasculatura tumoral (coloração de CD31; marcador endotelial). O tratamento combinado dá suporte a uma infiltração adicional de células T. A proximidade de células T CD8+ do endotélio vascular sugere que células T podem infiltrar o tumor a partir da vasculatura intratumoral. O relacionamento entre áreas CD8-positivas do tumor e a distância da vasculatura CD31-positiva é mostrado na FIG. 30G. O histograma demonstra que o tratamento combinado

(inibição de TGFβ1 e bloqueio do ponto de verificação) aumenta a área da fração de CD8+, especialmente em áreas que estão distantes de vasos sanguíneos, sugerindo que a inibição de TGFβ1 promove infiltração de células CD8+ no tumor por meio da vasculatura, superando ou revertendo eficazmente a imunossupressão. Exemplo 17: Efeitos de inibidores de TGFβ1 isoforma- seletivos contexto-independentes sobre o modelo de distúrbio mieloproliferativo MPL

[001022] O modelo pré-clínico de mielofibrose MPLW515L foi descrito previamente (veja, por exemplo, Wen e cols., Nature Medicine volume 21, páginas 1.473–1.480 (2015)). Resumidamente, camundongos receptores são irradiados letalmente e subsequentemente transplantados com células da medula óssea do doador transduzidas com receptor de trombopoietina humana MPL que possui uma mutação de ativação constitutiva em W515L (MPLW515L). camundongos receptores nesse modelo desenvolverão leucocitose, policitemia e trombocitose em 2–3 semanas.

[001023] Para avaliar efeitos da inibição TGFβ1-seletiva no modelo murídeo de mielofibrose, um inibidor de TGFβ1 contexto-independente de alta afinidade, isoforma-específico (Ab6) foi testado no modelo MPLW515L. Resumidamente, meio a um milhão de células MPL+ ckit+ foram transplantadas em camundongos-fêmeas BALB/c com 8-10 semanas de idade. Após 3 semanas, os camundongos receptores receberam injeções i.p. semanalmente de Ab6 a 10 ou 30 mg/kg/semana, ou IgG de controle negativo (30 mg/kg/semana) por 4 semanas (total de 5 doses). Os camundongos foram sacrificados 24 h após a última dose.

[001024] A histopatologia da medula óssea foi realizada para avaliar o efeito antifibrótico de Ab6, como avaliado por coloração de reticulina. Dados preliminares indicam que cortes da medula óssea retirados de animais tratados com Ab6 mostraram um efeito antifibrótico. Imagens coletadas de coloração de reticulina cortes representativos da medula óssea são fornecidas na FIG. 36A. Uma redução aparente de fibras de reticulina (principalmente colágeno III) foi observada em camundongos que receberam Ab6 a 10 e 30 mg/kg semanalmente. Um grau similar, mas menor, de efeitos antifibróticos também foi observada com um segundo anticorpo inibidor TGFβ1-seletivo testado (dados não mostrados).

[001025] Para análise quantitativa com base em pontuação de fibrose realizada por patologista de cortes da medula óssea, a coloração de reticulina foi pontuada usando um sistema de classificação publicado pela Organização Mundial de Saúde (Thiele J., Kvasnicka H.M., Tefferi A. e cols. “Primary Myelofibrosis” Em: Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., e cols. (eds). “WHO Classifications of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues”, 4ª Edição. IARC Press: Lyon, França, 2008, páginas 44–47). Resumidamente, cortes histológicos são pontuados usando um sistema de quatro níveis (MF-0, MF-1, MF-2, e MF-3). Uma pontuação de MF-0 indica reticulina linear dispersa sem intersecções (cruzamentos), que corresponde à medula óssea normal. Uma pontuação de MF- 1 indica uma rede frouxa de reticulina com muitas intersecções, especialmente nas áreas perivasculares. Uma pontuação de MF-2 indica um aumento difuso e denso em reticulina com intersecções extensas, ocasionalmente com feixes focais de colágeno e/ou osteosclerose focal. Uma pontuação de MF-3 indica reticulina difusa e densa com intersecções extensas e feixes grosseiros de colágeno, frequentemente associados com osteosclerose.

[001026] As pontuações de fibrose são fornecidas na FIG. 36B, indicando um efeito antifibrótico dose-dependente de Ab6, comparado com animais que receberam IgG de controle. O gráfico da esquerda mostra as pontuações de fibrose do primeiro estudo (Estudo 1), no qual os animais com alta carga de doença (> 50%) no início do tratamento foram tratados com Ab6 ou IgG de controle, como mostrado. O estudo foi repetido (Estudo 2). Dados de coortes correspondentes foram combinados e são apresentados no gráfico de direita (Estudos 1 + 2). Dosagem semanais de 30 mg/kg de Ab6 reduziram significantemente a fibrose.

[001027] Os animais foram também foram avaliados para vários parâmetros hematológicos, por exemplo, contagem sanguínea completa (CBC) após transplante de medula óssea (incluindo células sanguíneas brancas (WBC), plaquetas (Plt), hemoglobina (HB) e hematócrito (HCT)) usando técnicas padronizadas (FIGS. 36C e 36D). Não surpreendentemente, após 4 semanas do início do tratamento, camundongos MPL tratados com controle de IgG parecem manifestar anormalidades hematológicas características de mielofibrose, incluindo níveis aumentados de WBC e Plt. Animais tratados com Ab6 mostraram uma tendência dose-dependente para normalização das de WBC, Plt e HB, bem como alteração em relação à linha de base, comparados com animais de IgG de controle. Além disso, os animais tratados com Ab6 mostraram normalização estatisticamente significante das concentrações de HCT, bem como alteração em relação à linha de base, comparados com animais de IgG de controle, nos quais os níveis de Hct pareciam estar restaurados até a linha de base por volta de 4 semanas. Exemplo 18: Efeitos do inibidor de TGFβ1 de alta afinidade sobre o modelo singênico de carcinoma de mama EMT-6

[001028] O câncer de mama é o câncer mais comum entre mulheres nos Estados Unidos e é a quarta causa principal de morte por câncer. Como mostrado na FIG. 20D (esquerda) e FIG. 35, tumores EMT6 expressam níveis significantes tanto de TGFβ1 quanto de TGFβ3 (por exemplo, TGFβ1 e TGFβ3 codominantes), diferentemente de muitos tumores que expressam predominantemente TGFβ1. A contribuição de TGFβ3 nesses tumores para exclusão imune e resistência à CBT é incerto.

[001029] Previamente, foi demonstrado que Ab3 (um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo com viés de contexto) mostrou efeitos parciais sobre o crescimento tumoral e sobrevida nesse modelo, como descrito em WO 2018/129329.

[001030] Nesses estudos, os efeitos de uma combinação de um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo e um inibidor de TGFβ3 isoforma-seletivo foram avaliados no modelo EMT6, em conjunto com um inibidor do ponto de verificação imune. Foi fundamentado que, como esse tumor é codominante com ambas as isoformas, TGFβ1 e TGFβ3, essa terapia combinada pode mostrar eficácia na regressão tumoral, enquanto foi formulada a hipótese de que um dos inibidores isoforma-seletivos isoladamente (TGFβ1 ou TGFβ3) em conjunto com um inibidor do ponto de verificação, deve produzir um efeito parcial na inibição do crescimento tumoral.

[001031] Tumores EMT6 foram implantados por via subcutânea. O tratamento começava quando os tumores EMT6 alcançavam 30-80 mm3. Anti-PD-1 foi dosado a 10 mg/kg duas vezes por semana. Ab6 foi dosado uma vez por semana a 10 mg/kg. Anticorpo neutralizante Anti-TGFβ3 foi dosado a 30 mg/kg uma vez por semana.

[001032] Responsivos são definidos como aqueles que obtêm tamanho tumoral de < 25% do volume de desfecho ao final do estudo.

[001033] Surpreendentemente, Ab6, um inibidor de TGFβ1 isoforma-seletivo, de alta afinidade, usado em combinação com um anticorpo anti-PD-1, foi suficiente para superar a resistência à inibição do ponto de verificação em EMT6. A FIG. 34A mostra os efeitos de Ab6 e/ou anti-PD-1 sobre o crescimento tumoral. Nenhum dos anticorpos obteve regressão tumoral significante quando usados isoladamente. Em combinação, no entanto, 50% dos animais tratados (5 de 10) obtiveram regressão tumoral significante (redução até 25% ou menos do volume tumoral de desfecho). Esses dados mostram eficácia antitumoral sinérgica, como evidenciado por responsivos completos ou retardo do crescimento tumoral, em grupos de terapia combinada. Inesperadamente, a adição de um inibidor de TGFβ3 isoforma-seletivo não produziu efeitos adicionados. A observação de que a inibição da isoforma TGFβ1 com Ab6 era suficiente para sensibilizar os tumores ao anti- PD-1, até mesmo na presença de TGFβ3 intratumoral, dá suporte à hipótese de que TGFβ1 é a isoforma que dirige a sinalização de TGFβ associada à doença, exclusão imune e resistência primária à CBT.

[001034] Analogamente, a terapia combinada (TGFβ1 + anti- PD-1) obteve benefício de sobrevida significante nos animais tratados, comparado com anti-PD-1 isoladamente (***, P < 0,001 teste Log Rank) (veja a FIG. 34B). Cinquenta e seis dias após o início do tratamento, 60% dos animais estavam vivos no grupo da combinação, enquanto nos outros grupos de tratamento, todos os animais tinham morrido ou precisaram ser sacrificados por volta do dia 28.

[001035] Um estudo separado (Estudo 2), também mostrou aumento significante na sobrevida em animas com tumores EMT6 TGFβ1/3-positivos tratados com a combinação de Ab6 e anti- PD-1, mas não em animais com um dos anticorpos isoladamente (FIG. 34C). Nesse modelo, interrompemos o tratamento e os sobreviventes livres de tumor EMT-6 foram acompanhados por 6 semanas sem dosagem (caixa cinza). Seis semanas após o término da dosagem, responsivos completos permaneceram livres de tumor, demonstrando novamente a durabilidade da resposta (FIG. 34C, direita). O número relatado é o número de animais sem tumor mensurável ao final do estudo. Benefícios de sobrevida significantes do tratamento combinado (Ab6 + anti-PD-1) foram observados, comparados com animais tratados com anti-PD-1 isoladamente (FIG. 34D). Exemplo 19: Expressão de proteína Recombinante Proteínas recombinantes foram expressas em células Expi293F™ (Thermo Fisher) transfectadas transitoriamente com plasmídeos pTT5 (NRC Canadá) que contêm o cDNA de interesse. Complexos latentes grandes de TGFβ foram gerados por cotransfecção de células Expi293F™ com um plasmídeo que codifica pró-TGFβ1, pró-TGFβ2 ou pró-TGFβ3, e um plasmídeo que codifica uma proteína apresentadora de LLC. Fragmentos de LTBP que contêm o domínio de ligação ao TGFβ TB3 e que flanqueiam domínios do tipo EGF foram usados para aumentar os rendimentos e a qualidade da proteína em relação a LTBPs de comprimento total (E873 a I1507 para LTBP1 humano; D866 a E1039 para LTBP3 humano). Os fragmentos de LTBP tinham um tag-His do terminal-C para facilitar a purificação. Foram feitas linhagens de células Expi293 estáveis que expressavam GARP terminal-Cly His-tagged ou ectodomínios de LRRC33. Essas células estáveis foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo que codifica pró-TGFβ1 para gerar complexos de GARP ou LRRC33 com TGFβ1 latente. Os complexos latentes pequenos de TGFβ foram expressos com um tag-His do terminal- N e a cisteína formadora de complexo latente grande mutada para serina (C4S em TGFβ1, C5S em TGFβ2, e C7S em TGFβ3 pró- domínios). Os fatores de crescimento TGFβ ativos foram adquiridos de R&D Systems. Os transfectantes foram cultivados em meio Expi293™ Expression (Thermo Fisher) por 5 dias antes do sobrenadante condicionado ter sido coletado. Proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia por afinidade com Ni2+, seguida por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). A qualidade da proteína e a formação de complexos ligados por dissulfeto foram confirmadas por SDS PAGE e SEC analítica. Os anticorpos foram expressos por cotransfecção de células Expi293F™ com plasmídeos pTT5 que codificam cadeias pesadas e leves de interesse. Anticorpos IgG4 humanos e IgG1 de camundongo foram purificados por captura de Proteína A, seguida por by SEC. A identidade dos anticorpos que foram usados em modelos animais foi confirmada por espectrometria de massa. Exemplo 20: Modelos em camundongo singênicos

[001036] Modelos murídeos foram realizados em Charles River Descoberta Labs em Morrisville, NC de acordo com IACUC.

Para o modelo MBT-2, camundongos-fêmeas C3H/HeN com 8-12 semanas de idade (Charles River) foram anestesiados com isoflurano para implantar 5 x 105 células de tumores MBT-2 por via subcutânea no flanco. Os animais foram distribuídos em grupos de volumes tumorais médios de 40-80 mm3, de modo que todos os grupos tivessem médias e faixas de volume de partida iguais. Para Cloudman S91, camundongos-fêmeas DBA/2 com 8-12 semanas de idade (Charles River) foram anestesiados com isoflurano para implantar 5 x 105 células de tumor Cloudman S91 em matrigel 50% por via subcutânea no flanco. Os animais foram distribuídos em grupos quando o volume tumoral médio alcançava 125-175 mm3, de modo que todos os grupos tivessem médias e faixas de volume de partida iguais. Para o modelo de EMT-6, camundongos-fêmeas BALB/c com 8-12 semanas de idade (Charles River) foram implantados com 5 x 106 células tumorais EMT-6 por via subcutânea no flanco. Os animais foram distribuídos em grupos de volume médio de partida entre 30-60 mm3, de modo que todos os grupos tivessem médias e faixas de volume de partida iguais. HuNeg- rIgG1 ou anti-PD-1 (RMP1-14; BioXCell) de controle foram dosados a 10 mg/kg duas vezes por semana. Ab6-mIgG1 ou o anticorpo HuNeg- mIgG1 de controle foram dosados no nível de dose indicado uma vez por semana. Todos os anticorpos foram dosados por via intraperitoneal. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e os animais foram sacrificados por asfixia com CO2 quando os tumores alcançavam 1.200 mm3 (MBT-2, EMT6) ou

2.000 mm3 (Cloudman S91) ou mediante ulceração. O volume do tumor foi calculado como mm3 = (w2 x l)/2. Responsivos ou taxa de resposta foi definido como um volume tumoral igual ou abaixo de 25% do volume de desfecho para aquele modelo.

Resposta completa foi classificada como um tumor com menos do que 13,5 mm3 por três ou mais medições consecutivas. Sobreviventes livres de tumor não tinham tumor palpável ao final do estudo. Animais sacrificados em decorrência de necrose de acordo com IACUC foram removidos inteiramente da análise.

[001037] As expressões relativas de três isoformas de TGFβ e moléculas apresentadoras foram levadas em consideração para a seleção de modelos pré-clínicos de farmacologia que recapitulam dados clínicos humanos. Análises por ELISA de expressões relativas de proteína das três isoformas nos tumores MBT-2, S91 e EMT-6 são fornecidas na FIG. 20G. Em tumores tanto MBT-2 quanto S91, TGFβ1 é a isoforma dominante, que espelha a maioria dos cânceres humanos. EMT-6 ainda mostrou expressão predominante de TGFβ1, mas também co-expressava, embora em um grau menor, TGFβ3, que é mais similar ao que é observado em certos carcinomas humanos.

[001038] Todas as quatro moléculas apresentadoras (LTBP1, LTBP3, GARP e LRRC33) são expressas por RNA nos tumores MBT-2, S91 e EMT-6 (FIG. 20H). Exemplo 21: Internalização induzida por anticorpo de LRRC33- pró-TGFβ1

[001039] Observamos que, entre os tipos de células que expressam RNA de LRRC33, apenas um subconjunto parece expressar a proteína LRRC33 na superfície celular. Formulamos a hipótese de que LRRC33 pode ser regulada por tráfico de proteína na membrana plasmática. Para avaliar essa possibilidade, projetamos ensaios de internalização.

[001040] Foi gerada uma linhagem de células Expi293, que expressam LRRC33 da superfície celular-pró-TGFβ1. Usando o sistema Incucyte, a internalização de LRRC33 mediante ligação de Ab6 à LRRC33 da superfície celular-pró-TGFβ1 foi medida. Resumidamente, o sistema Incycyte emprega um marcador de detecção sensível ao pH que pode ser detectado quando o alvo é internalizado para dentro do compartimento intracelular com um pH ácido (por exemplo, lisossomo). A internalização rápida de LRRC33-pró-TGFβ1 mediante ligação a Ab6 em células que expressam LRRC33 e pró-TGFβ1 foi observada (FIG. 6), mas não na linhagem Expi293 parental (dados não mostrados). A internalização observada aqui era similar à internalização em macrófagos humanos primários.

[001041] A internalização de LRRC33-pró-TGFβ1 não é mediada por FcR, pois células Expi293 não possuem receptores Fc (dados não mostrados). Esses resultados indicam que o engajamento de Ab6 pode facilitar a infra-regulação do alvo. Isso pode fornecer um mecanismo de inibição de TGFβ1 in vivo adicional ou alternativo, por redução dos níveis disponíveis de pró-TGFβ1 no local de doença, por exemplo, TME e FME.

[001042] As várias características e modalidades da presente invenção referidas em seções individuais acima se aplicam, como apropriado, a outras seções, mutatis mutandis. Consequentemente, características especificadas em uma seção podem ser combinadas com características especificadas em outras seções, como apropriado.

[001043] Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando apenas experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas nesse relatório descritivo. Esses equivalentes visam ser englobados pelas reivindicações seguintes.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado por ser ligar a cada um dos seguintes complexos de antígenos com uma KD de ≤ 5 nM, como medida por interferometria biocamada: i) LTBP1-pró-TGFβ1 humanos; ii) LTBP3-pró-TGFβ1 humanos; iii) GARP-pró-TGFβ1 humanos; e, iv) LRRC33-pró-TGFβ1 humanos; em que o anticorpo ou o fragmento deste inibe a ativação de TGFβ1; em que o anticorpo ou o fragmento deste é um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou fragmento deste; em que o anticorpo ou o fragmento deste compreende: uma H-CDR1 representada pela fórmula FTF(X1)(X2)(X3)(X4)M(X5), em que: X1 é S, G ou A; X2 é S ou F; X3 é F ou Y; X4 é S ou A; e X5 é D, N ou Y (ID. DE SEQ. N°: 143); uma H-CDR2 representada pela fórmula YI(X1)(X2)(X3)A(X4)TIYYA(X5)SVKG, em que: X1 é S ou H; X2 é P ou S; X3 é S ou D; X4 é D ou S; e X5 é D ou G (ID. DE SEQ. N°: 144); uma H-CDR3 representada pela fórmula (X1)R(X2)(X3)(X4)D(X5)GDML(X6)P, em que: X1 é A ou V; X2 é G ou A; X3 é V ou T; X4 é L ou W; X5 é Y ou M; e X6 é M ou D (ID. DE SEQ. N°: 145); uma L-CDR1 apresentada no ID. DE SEQ. N°: 105; uma L-CDR2 apresentada no ID. DE SEQ. N°: 106; e uma L-CDR3 apresentada no ID. DE SEQ. N°: 12.

2. Anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado por ser ligar a cada um dos seguintes complexos de antígenos com uma KD de ≤ 0,5 nM, como medida por interferometria biocamada: i) LTBP1-pró-TGFβ1 humanos; ii) LTBP3-pró-TGFβ1 humanos; iii) GARP-pró-TGFβ1 humanos; e, iv) LRRC33-pró-TGFβ1 humanos; em que o anticorpo ou o fragmento deste inibe a ativação de TGFβ1; em que o anticorpo ou o fragmento deste é um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou fragmento deste; em que o anticorpo ou o fragmento deste compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que possui pelo menos 90% de identidade de sequência para o ID. DE SEQ. N°: 13 e um domínio variável da cadeia leve (VL) que possui pelo menos 90% de identidade de sequência para o ID. DE SEQ. N°: 15.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a H-CDR1 é ID. DE SEQ. N°: 107; a H-CDR2 é ID. DE SEQ. N°: 103; e a H-CDR3 é ID. DE SEQ. N°: 6.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado por se ligar a cada um dos complexos de antígenos com uma KD de ≤ 1 nM, opcionalmente ≤ 0,5 nM, como medida por interferometria biocamada.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se ligar a um epitopo que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 169.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno deste ainda se liga a uma porção do domínio do fator de crescimento.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por compreender uma VH de acordo com o ID. DE SEQ. N°: 13 e uma VL de acordo com o ID. DE SEQ. N°: 15.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ser do subtipo IgG4 ou IgG1 humana.

9. Composição caracterizada por compreender o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno deste, conforme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, e um excipiente.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste de acordo com as reivindicações 1-8, ou composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser usado no tratamento de a distúrbio proliferativo e/ou fibrótico em um indivíduo.

11. Anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno deste, ou composição para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é câncer.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, ou composição para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é mielofibrose.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, ou composição para uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui resistência primária ou adquirida a uma terapia de câncer, em que,

opcionalmente, a terapia de câncer é terapia de inibição do ponto de verificação, quimioterapia e/ou radioterapia.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, ou composição para uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende a administração da composição conforme definida na reivindicação 9, em conjunto com terapia de câncer adicional, selecionada do grupo que consiste em inibidor do ponto de verificação, quimioterapia e radioterapia e/ou vacina contra o câncer.

15. Método para a fabricação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender: i) fornecimento de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-8; ii) formulação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno deste em uma composição farmacêutica com um carreador farmaceuticamente aceitável.