KR20210121174A - TGFβ의 LTBP 복합체-특이적 억제제 및 그의 용도 - Google Patents

TGFβ의 LTBP 복합체-특이적 억제제 및 그의 용도 Download PDF

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저스틴 더블유. 잭슨
조지 코리코르
아비셰크 다타
스테판 바버시크
크리스토퍼 리틀필드
애덤 포겔
프레데릭 주니어 슈트라이히
케이틀린 스테인
줄리아 맥크리어리
매튜 살로토
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스칼러 락, 인크.
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Abstract

LTBP1-TGFβ 및/또는 LTBP3-TGFβ의 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예컨대 항체 및 그의 항원-결합 부분이 본원에 개시된다. 본 출원은 또한, 예를 들어 TGFβ 활성화를 억제하고, TGFβ-관련 장애, 예컨대 섬유화 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 이들 억제제의 사용 방법을 제공한다. 콘텍스트-의존성 또는 콘텍스트-비의존성 이소형-특이적 TGFβ 억제제의 선택을 필요로 하는 대상체를 위해 상기 억제제를 선택하는 방법이 또한 제공된다.

Description

TGFβ의 LTBP 복합체-특이적 억제제 및 그의 용도
관련 출원
본 국제 출원은 2019년 1월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/798,927을 우선권 주장하며, 이의 내용은 명백하게 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 슈퍼패밀리의 성장 인자는 세포 성장의 억제, 조직 항상성, 세포외 매트릭스 (ECM) 재형성, 내피에서 중간엽으로의 이행, 세포 이동 및 침습, 및 면역 조정/억제, 뿐만 아니라 중간엽에서 상피로의 이행을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 생물학적 과정을 조절하는 다수의 신호전달 캐스케이드에 수반된다. ECM 재형성과 관련하여, TGFβ 신호전달은 섬유모세포 집단 및 ECM 침착 (예를 들어, 콜라겐)을 증가시킬 수 있다. 면역계에서, TGFβ 리간드는 T 조절 세포 기능 및 면역 전구체 세포 성장 및 항상성의 유지를 조정한다. 정상 상피 세포에서, TGFβ는 강력한 성장 억제제 및 세포 분화의 프로모터이다. 그러나, 종양이 발생하고 진행함에 따라, 이들은 종종 TGFβ에 대한 그의 음성 성장 반응을 상실한다. 이러한 상황에서, TGFβ는 혈관신생을 자극하고, 기질 환경을 변경시키고, 국부 및 전신 면역억제를 유도하는 그의 능력으로 인해 종양 발생의 촉진제가 될 수 있다. 이들 및 다른 이유로, TGFβ는 다수의 임상 적응증에 대한 치료 표적이었다. 다수의 그룹에 의해 지금까지 이루어진 많은 노력에도 불구하고, TGFβ 치료제의 임상 개발은 어려웠다.
래트 및 개에서의 것을 포함한 전임상 연구로부터의 관찰은 생체내 TGFβ의 억제와 연관된 특정 독성을 밝혀냈다. 더욱이, 여러 TGFβ 억제제가 지금까지 개발되었지만, TGFβ를 표적화하는 대부분의 임상 프로그램은 부작용 또는 독성의 위험으로 인해 중단되었다.
예를 들어, 문헌 [Anderton et al. (Toxicology Pathology, 39: 916-24, 2011)]은 TGFβ 유형 I (ALK5) 수용체의 소분자 억제제가 전임상 동물 모델에서 판막 간질 세포의 출혈, 염증, 변성 및 증식을 특징으로 하는 심장 판막 병변을 유도하였다는 것을 보고하였다. 모든 심장 판막에서 시험된 모든 용량에서 독성이 관찰되었다. 문헌 [Frazier et al. (Toxicology Pathology, 35: 284-295, 2007)]은 TGFβ 유형 I (ALK5) 수용체의 소분자 억제제인 GW788388의 투여가 래트에서 성장판 이형성증을 유도하였다는 것을 보고하였다.
문헌 [Stauber et al. (J. Clin. Practice 4:3, 2014)]은 특정 암 치료에 대해 조사되고 있는 TGFβ 수용체 I 키나제의 억제제인 LY2157299의 만성 (≥ 3개월) 투여가 래트 및 개에서 심혈관, 위장, 면역, 골/연골, 생식계 및 신장계를 포함하는 다중 기관 독성을 유발하였다는 것을 보고하였다.
TGFβ의 모든 인간 이소형을 중화시킬 수 있는 "범" TGFβ 항체인 프레솔리무맙 (GC1008)은 시노몰구스 마카크를 사용한 연구에서 다중 투여 후에 치은, 방광 및 비갑개 상피의 상피 증식증을 유도하는 것으로 보고되었다 (Lonning et al., Current Pharmaceutical Biotechnology 12: 2176-89, 2011). 유사하게, 임상 시험에서 다중 용량의 약물 투여 후에 다양한 피부 발진/병변, 치은 출혈 및 피로가 보고되었다. 프레솔리무맙에 대한 가장 주목할만한 유해 반응은 인간 암 환자에서 피부 각화극세포종 및/또는 편평 세포 암종의 유도를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Lacouture et al., 2015, Cancer Immunol Immunother, 64: 437-46; Stevenson et al., 2013, OncoImmunology, 2:8, e26218; 및 Lonning et al., 2011] 참조). 임상 시험으로부터의 추가의 증거는 일부 경우에 이 항체가 종양 진행을 가속화할 수 있다는 것을 시사한다 (Stevenson et al., 2013, OncoImmunology, 2:8, e26218).
따라서, 예를 들어 암, 섬유증 및 염증을 포함한, TGFβ를 수반하는 질환 및 장애를 효과적으로 및 안전하게 치료하는데 사용될 수 있는, TGFβ 신호전달을 조정하기 위한 새로운 방법 및 조성물이 필요하다.
TGFβ의 광범위한 억제와 연관된 잠재적으로 위험한 유해 효과의 인식이 증가함에 따라, 다수의 그룹은 보다 최근에 이소형의 하위세트 (모두는 아님)를 표적화하면서 여전히 충분한 효능을 보유하는 억제제를 확인하는 것으로 방향을 돌렸다. 예를 들어, WO 2016/161410은 TGFβ1 및 TGFβ2 둘 다에 결합하는 중화 항체 (즉, TGFβ1/2 억제제)를 개시한다. WO 2006/116002는 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다에 결합하는 중화 항체 (즉, TGFβ1/3 억제제) (전자에 대해 우선적이긴 하지만)를 제공한다. 전통적인 모노클로날 항체에 추가로, 일부 그룹은 소위 "리간드 트랩"으로서 기능하는 조작된 융합 단백질을 개발하고 있으며 (예를 들어, WO 2018/158727, WO 2018029367 및 WO 2018129331 참조), 이들 중 적어도 일부는 TGFβ1/3에 대해 선택적일 수 있다. TGFβ1/3 억제제의 또 다른 부류는 알파-V (αν) 인테그린의 억제제, 예컨대 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다 (즉, TGFβ1/3)를 활성화시키는 것으로 공지된 인테그린인 ανβ6에 대한 항체를 포함한다. 또 다른 것은 모든 3종의 이소형을 억제하는 "보다 우수한" 범-억제제 (즉, TGFβ1/2/3 또는 범-억제제)를 계속 추구한다 (예를 들어, WO 2018/134681 참조).
그러나, 효능 관점에서, 관련 분야의 지배적인 견해는 TGFβ의 다수의 이소형을 억제하여 치료 효과를 달성하고 이를 수용하는 것이 유리한 것으로 남아있으며, "주의깊은 투여 요법"에 의한 독성 관리가 해결책으로서 제안된다 (Brennan et al. (2018) mAbs, 10:1, 1-17).
최근에, 본 출원인은 동물 모델에서 안전하면서도 효과적인 것으로 입증된 이소형-선택적 TGFβ1 억제제를 기재하였으며 (예를 들어, WO 2017/156500 및 WO 2018/129329 (참조로 포함됨) 참조), 이는 TGFβ1 이소형을 선택적으로 표적화하는 것이, 모든 TGFβ 이소형을 광범위하게 길항하는 것과 대조적으로, 허용되는 독성 하에 효능을 달성하는데 유리한 접근법을 제공할 수 있다는 개념을 지지한다.
생체내에서 효과적인 것으로 밝혀진 용량의 TGFβ1의 선택적 억제에 의해 달성된 관찰된 안전성 프로파일은 임상 적용을 위한 TGFβ1 억제제를 개발하는데 유망한 단계이지만, TGFβ1 효과의 한정된 하위세트에 선택적으로 영향을 미칠 수 있는 TGFβ1 억제제 (예를 들어, LTBP-제시된 복합체에 대해 선택적인 TGFβ 억제제)의 확인은 여전히 달성하기 힘들다. 보다 최근에, 본 출원인은 이러한 "LTBP 콘텍스트(context)-특이적" 억제제가 본 출원인에 의해 이전에 기재된 방법 (예를 들어, WO 2014/074532 및 WO 2014/182676 참조)을 사용하여 생성될 수 있다는 것을 입증하였다 (WO 2019/023661 (본원에 참조로 포함됨)). 그러나, 상기 언급된 국제 공개에 기재된 LTBP-선택적 TGFβ1 억제제는 준최적 교차-종 반응성과 함께 보통의 친화도 및 억제 활성을 나타냈다.
본 개시내용은 매트릭스-연관 프로TGFβ 복합체, 예컨대 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1을 선택적으로 표적화할 수 있는 개선된 TGFβ 억제제를 제공한다.
이들 억제제는 LTBP1- 및/또는 LTBP3-제시된 프로TGFβ에 높은 친화도 (적어도 나노몰 범위)로 결합하고 이를 억제하지만, 면역 세포-연관 TGFβ, 예를 들어 GARP- 및/또는 LRRC33-제시된 프로TGFβ1에 결합하고 이를 억제하지는 않거나, 또는 결합이 의미있는 수준 미만 (예를 들어, GARP 또는 LRRC33 복합체에 비해 LTBP 복합체에 대해 적어도 50배 친화도)이다. 따라서, 이들 억제제는 이들이 ECM과 연관된 TGFβ 신호전달 축에 선택적으로 결합하여 그를 억제하도록, TGFβ의 활성화를 콘텍스트-의존성 방식으로 선택적으로 억제할 수 있다. 특히, 본 개시내용은 매트릭스-연관 (예를 들어, LTBP1 및/또는 LTBP3-연관) TGFβ 활성화의 선택적 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 LTBP1 및/또는 LTBP3과 회합된 TGFβ의 특정한 이소형 (예를 들어, 프로TGFβ1, 프로TGFβ2 및/또는 프로TGFβ3)에 특이적으로 결합하고, 따라서 또한 TGFβ 이소형 특이성을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 억제제는 LTBP1/3-프로TGFβ1에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 임의의 실시양태에서, 이러한 억제제는 GARP 및/또는 LRRC33에 의해 매개되는 면역 세포 기능과 연관된 TGFβ1의 활성화는 억제하지 않는다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 개선된 항체는 적어도 나노몰 범위 (즉, 1 x 10-9M 내지 10 x 10-9M)의 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 적어도 나노몰 범위 (즉, 1 x 10-9M 내지 10 x 10-9M)의 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 뮤린 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 친화도를 갖는다.
조절 T 세포 상의 GARP-프로TGFβ1 복합체를 표적화하지 않는 TGFβ1 억제제의 치료 용도에 대한 근거는 적어도 3가지이다:
첫째로, 조절 T 세포는 자기-항원에 대한 면역 관용을 유지하고 자가면역 질환을 예방하는데 중요한 역할을 한다. Treg는 일반적으로 이펙터 T 세포의 유도 및 증식을 억제하거나, 약화시키거나, 하향조절하기 때문에, 이러한 기능의 전신 억제는 Treg 세포에 의해 정상적으로 제공되는 "파괴"를 불능화함으로써 숙주에서의 과활성 또는 과장된 면역 반응으로 이어질 수 있다. 따라서, 본원에서 취해진 접근법 (예를 들어, Treg 기능을 불능화하지 않는 TGFβ1 억제)은 자가면역이 도출될 위험을 피하는 것을 목표로 한다. 추가로, 이미 과민성 면역 반응 또는 자가면역이 발생하는 경향을 갖는 환자는 특히 정상 Treg 기능의 이용가능성 없이 이러한 상태를 촉발하거나 악화시킬 위험이 있을 수 있고; 따라서, 매트릭스 TGFβ1을 선택적으로 표적화하는 억제제가 유리하게 이러한 위험을 최소화할 수 있다.
둘째로, 증거는 Th17/Treg 비의 변경이 섬유화유발 Th17 시토카인의 불균형으로 이어지며, 이는 섬유증, 예컨대 간 섬유증의 중증도와 상관관계가 있다는 것을 시사한다 (예를 들어, 문헌 [Shoukry et al. (2017) J Immunol 198 (1 Supplement): 197.12] 참조). 본 발명자들은 TGFβ1 기능의 GARP 아암의 교란이 섬유화 상태를 직접적으로 또는 간접적으로 악화시킬 수 있는 것으로 추론하였다.
셋째로, 조절 T 세포는 면역 항상성 및 자가면역의 예방에 필수적이다. 특히 장기간 또는 만성 투여를 위해 의도된 TGFβ1 억제 요법의 경우에, 면역 항상성을 유지하는데 있어서 정상 Treg 기능의 교란으로부터 기인하는 잠재적 부작용을 피하는 것이 바람직할 것으로 추론되었다 (예를 들어, 문헌 [Richert-Spuhler and Lund (2015) Prog Mol Biol Transl Sci. 136: 217-243]에서 검토됨). 이러한 전략은 적어도 부분적으로, 특히 감염에 대항하기 위해 요구되는 정상적인 면역 기능을 보존하는 것을 목표로 한다.
이를 위해, 본 개시내용의 발명자들은 매트릭스-연관 TGFβ1 활성화를 선택적으로 표적화하지만 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화는 표적화하지 않는 TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-선택적 억제제를 생성하는 것을 제시하였다.
지금까지 존재하는 기술적 과제는 생체내 다양한 콘텍스트 (또는 "함요(niche)")에 존재하는 이들 TGFβ1의 하위풀을 식별하고 선택적으로 조정하는 제한된 능력을 포함한다.
이러한 과제를 다루기 위한 노력으로, 본 발명자들은 잠복 TGFβ2 또는 TGFβ3에 대한 검출가능한 결합 없이 잠복 TGFβ1 프로도메인에 결합하고, 본원에 기재된 바와 같이 콘텍스트-의존성으로 시험관내 잠복 TGFβ1의 인테그린-매개 활성화를 억제하는 이소형-특이적 모노클로날 항체를 확인하였다. 이러한 항체의 발견 및 특징화는, 적어도 부분적으로, TGFβ1 활성화의 콘텍스트-의존성 세포-기반 검정의 개발에 의해 가능해졌다. 이러한 신규 검정 개발 및 검증의 과정에서, αVβ6 인테그린과 같이, αVβ8이 또한 LTBP1-프로TGFβ1을 활성화시킬 수 있는 것으로 입증되었다. LTBP1 복합체와 유사하게, LTBP3-프로TGFβ1이 αVβ6에 의해 활성화될 수 있는 것으로 추가로 입증되었다. 이들 검정에서 스크리닝에 의해 발견된 항체는 LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시된 경우에만 TGFβ1에 결합하고 이를 억제하는 항체의 부류를 밝혀냈다. 이러한 LTBP-특이적 항체는 면역-연관 TGFβ1 제시자인 GARP 및 LRRC33의 콘텍스트에서의 TGFβ1은 억제하지 않는다. 이러한 항체는, 예를 들어 섬유화 상태를 포함한 장애의 치료를 위한 치료 후보이고, TGFβ-관련 면역계 활성화를 피할 만성 투여를 가능하게 할 수 있다. 다양한 섬유화 상태를 위한 콘텍스트-특이적 또는 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 선택하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 KD ≤ 50 nM로 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이소형-특이적 TGFβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 KD ≤ 25 nM로 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이소형-특이적 TGFβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 KD ≤ 10 nM로 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이소형-특이적 TGFβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 하기 표적: (a) LTBP1 단독; (b) 프로TGFβ1 단독; (c) GARP-프로TGFβ1 복합체; 및 (d) LRRC33-프로TGFβ1 복합체 중 1종 이상에는 결합하지 않는다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 KD < 5 nM로 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이소형-특이적 TGFβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 LTBP1/3-제시된 프로TGFβ 잠복 복합체에 선택적으로 결합하는, 세포외 매트릭스-연관 TGFβ 활성화의 억제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 억제제는 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화, 예를 들어 GARP-제시된 프로TGFβ1 잠복 복합체의 활성화로부터 유발되는 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화는 억제하지 않는다. 예시적 실시양태에서, 억제제는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다.
다른 측면에서, 본 발명은 LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 TGFβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 LTBP1-TGFβ1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 및 뮤린 대응물 둘 다에 결합한다.
한 측면에서, 본 발명은 LTBP1-프로TGFβ 잠복 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ 잠복 복합체에 선택적으로 결합하여 잠복 복합체로부터의 성숙 TGFβ 성장 인자의 방출을 조정하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 성숙 TGFβ1 단독 또는 GARP-프로TGFβ1 잠복 복합체에는 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 결합하지 않는다. 대안적으로, 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-프로TGFβ1 잠복 복합체에 특이적이다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP3-프로TGFβ1 잠복 복합체에 특이적이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적어도 약 10-8 M의 해리 상수 (KD)로 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
본 개시내용은 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하고, 1개 이상의 추가의 유리한 특성을 갖는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 추가로 제공한다. 실제로, 본 발명자들은 놀랍게도, 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 높은 친화도 및 유리하게는 느린 해리율로 결합하면서, 또한 마우스 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및 마우스 LTBP3-프로TGFβ 복합체와 교차-반응성이고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체 (또는 실제로 인간 LRRC33-프로TGFβ 복합체)에 대한 유의한 결합을 나타내지 않는 이러한 항체가 제공될 수 있다는 것을 발견하였다.
추가로, 본원에 개시된 항체 (상기 언급된 유리한 특성 중 1개 이상 또는 심지어 모두를 갖는 항체 포함)는 세포-기반 검정에서 TGFβ1 신호전달의 강력한 억제를 나타내고, 다수의 섬유증 동물 모델에서 섬유증 및 TGFβ 신호전달의 마커를 유의하게 감소시킨다.
따라서, 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하고, 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
i) 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체와 교차-반응성임;
ii) 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체와 교차-반응성임;
iii) BLI에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합함;
iv) BLI에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합함;
v) 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합함;
vi) 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않음;
vii) 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 복합체 (예를 들어, 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체)에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않음.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (i)-(v) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (i)-(iv) 및 (vi) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (i), (iii) 및 (v) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (ii), (iv) 및 (v) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (i), (iii) 및 (vi) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (ii), (iv) 및 (vi) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (i)-(iii) 및 (v) 및 임의로 (vii)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 상기 특성 (i)-(iii) 및 (vi) 및 임의로 (vii)을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하고, 상기 특성 (i)-(vii) 모두를 갖는다.
항체 또는 항원-결합 단편은 LTBP1/3-제시된 프로TGFβ 잠복 복합체에 선택적으로 결합하고 세포외 매트릭스-연관 TGFβ 활성화를 억제할 수 있다.
추가로, TGFβ1 활성화의 추가의 유리한 이소형-선택적 억제제는 느린 해리율 (즉, 오프-레이트, kOFF)을 나타내는 모노클로날 항체 (이뮤노글로불린 및 그의 항원-결합 단편 또는 부분 포함)를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 이러한 항체의 해리율에 반영될 수 있는 우수한 지속성을 갖는 억제제가 만성 및 진행성 질환, 예컨대 섬유증의 치료에 요구될 수 있다는 인식에 기초한다.
항체의 그의 항원에 대한 친화도는 전형적으로 평형 해리 상수 또는 KD로서 측정된다. 실험적으로 측정된 오프- 및 온-레이트의 비 (kOFF/kON)는 KD 값을 계산하는데 사용될 수 있다. kOFF 값은 항체가 그의 항원으로부터 얼마나 빨리 해리되는지를 나타내는 항체 해리율을 나타내며, 한편 kON 값은 항체가 그의 항원에 얼마나 빨리 결합하는지를 제공하는 항체 회합률을 나타낸다. 후자는 전형적으로 농도-의존성이며, 한편 전자는 농도-비의존성이다. KD 값은 항체의 농도 (특정한 실험에 필요한 항체의 양)에 관한 것이고, 따라서 KD 값이 낮을수록 (농도가 낮을수록) 항체의 친화도는 높아진다. 참조 항체에 관하여, 보다 높은 친화도 항체는 보다 낮은 kOFF 레이트, 보다 높은 kON 레이트, 또는 둘 다를 가질 수 있다.
kOFF 및 kON 레이트 둘 다는 특정한 항체의 그의 항원에 대한 전체 친화도에 기여하고, 각각의 성분의 상대적 중요성 또는 영향은 항체의 작용 메카니즘에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 성숙 성장 인자 (예를 들어, 잠복 복합체로부터 유리된 가용성의 일시적 TGFβ1 리간드)에 결합하는 중화 항체는 생체내 리간드 결합에 대해 내인성 고친화도 수용체와 경쟁하여야 한다. 리간드-수용체 상호작용이 국부 사건이기 때문에 및 리간드가 수명이 짧기 때문에, 이러한 항체는 리간드가 조직에서 그의 세포 수용체를 발견하기 전에 가용성 성장 인자를 신속하게 표적화 및 격리할 수 있어야 하며 - 이에 의해 TGFβ1 신호전달 경로를 활성화시킨다. 따라서, 리간드-표적화 중화 항체가 강력하기 위해, 표적 성장 인자에 신속하게 결합하는 능력, 즉 높은 회합률 (kON)이 특히 중요할 수 있다.
대조적으로, 본 출원인은 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 활성화 (예를 들어, 방출)를 방지함으로써 TGFβ1 신호전달을 억제하는 항체 ("활성화 억제제")는 이러한 항체가 표적 항원 (예를 들어, 프로TGFβ1 복합체)과 결속될 때 느린 해리율을 갖는 것으로부터 우선적으로 이익을 얻을 수 있는 것으로 추론하였다. 중화 항체와 달리, 이러한 항체는 세포 수용체와 직접적으로 경쟁하지 않고; 오히려, 이들은 조직 환경 내 휴면상태로 남아있는 불활성 전구체 형태 (예를 들어, 잠복 프로TGFβ1 복합체)를 표적화하여 TGFβ1의 활성화를 선제적으로 방지함으로써 신호전달의 상류에서 작용한다. 이러한 항체는 성숙 성장 인자가 잠복 복합체로부터 유리되는 것을 방지함으로써 그의 억제 활성을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 활성 성장 인자를 불활성 (예를 들어, "잠복") 상태로 유지하기 위해 프로도메인 케이지 구조에 잠그는 "클램프"와 같이 기능할 수 있다. 실제로, 에피토프 맵핑을 포함한 구조적 분석은 TGFβ1 활성화를 차단하는 이들 항체의 능력을 강조하는 분자 메카니즘에 대한 통찰을 제공하였다. 이와 관련하여, 프로도메인의 잠복성 라쏘 영역이 특히 유용한 표적일 수 있다.
표적 결속시, 표적에 결합된 채로 남아있을 수 있는 (예를 들어, 잠복 복합체로부터 매우 천천히 해리될 수 있는) 항체는 증진된 효과 지속성 및/또는 결합력으로 인해 우수한 생체내 효력을 달성하는데 유리할 것으로 예상된다. 이러한 인식에 기초하여, 본 개시내용의 출원인은 이전에 기재된 항체와 비교하여 특히 낮은 kOFF 값을 갖는 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제를 확인하고자 하였다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직한 항체는 빠른 회합률 (kON)과는 대조적으로, 주로 느린 해리율 (kOFF)에 기인하는 높은 친화도를 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하고, 하기 특성 중 1개 이상 (이는 상기 제시된 특성 (i)-(vii) 중 1개 또는 그의 조합에 추가일 수 있음)을 갖는다:
(viii) 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하는 경우에, ≤ 5 x 10-4 (1/s)의 낮은 해리율 (kOFF) (예를 들어, 적합한 시험관내 결합/동역학 검정에 의해, 예컨대 BLI, 예를 들어 옥텟(Octet)-기반 시스템에 의해 측정시); 및/또는
(ix) 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합된 경우에, ≥ 45분의 긴 절반-결합 시간 (t½) (예를 들어, SPR에 의해 측정시).
일부 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 6개의 CDR을 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTFRSYVMH를 포함하는 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 VISHEGS(X1)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 X1은 L 또는 G인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)PRIAARRGGFG(X2)를 포함하며, 여기서 X1은 V, R 또는 L이고; X2는 Y, S 또는 T인 CDR-H3;
d) 아미노산 서열 TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 H이고; X2는 N, L, S 또는 A이고; X3은 N, D 또는 Y인 CDR-L1;
e) 아미노산 서열 ED(X1)(X2)RPS를 포함하며, 여기서 X1은 N, F 또는 A이고; X2는 Q, I 또는 V인 CDR-L2; 및
f) 아미노산 서열 Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 S, F, Y, D, H 또는 W이고; X3은 N, D 또는 S이고; X4는 N, A, L, E 또는 T이고; X5는 G, R, A 또는 L인 CDR-L3.
일부 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호(SEQ ID NO): 318에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 (예를 들어, Ab42)와 경쟁 또는 교차-경쟁한다. 항체는 서열식별번호: 318에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 319에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 일부 바람직한 실시양태에서, 하기 6개의 CDR (예를 들어, Ab42의 것)을 포함할 수 있다:
아미노산 서열 FTFRSYVMH (서열식별번호: 166)를 포함하는 CDR-H1;
아미노산 서열 VISHEGSLKYYADSVKG (서열식별번호: 167)를 포함하는 CDR-H2;
아미노산 서열 ARPRIAARRGGFGY (서열식별번호: 168)를 포함하는 CDR-H3;
아미노산 서열 TRSSGNIDNNYVQ (서열식별번호: 169)를 포함하는 CDR-L1;
아미노산 서열 EDNQRPS (서열식별번호: 170)를 포함하는 CDR-L2; 및
아미노산 서열 QSYDYDTQGVV (서열식별번호: 171)를 포함하는 CDR-L3.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 318에 대해 적어도 95% 동일한 (임의로 적어도 98% 동일한) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 319에 대해 적어도 95% 동일한 (임의로 적어도 98% 동일한) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
일부 대안적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR을 포함한다:
a) 아미노산 서열 GSIRSSSYYWG를 포함하는 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSATTYY를 포함하는 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)DPSYDS(X2)AGM(X3)V를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 D 또는 Q인 CDR-H3;
d) 아미노산 서열 RAS(X1)(X2)IS(X3)YLN을 포함하며, 여기서 X1은 K 또는 Q이고; X2는 V 또는 S이고; X3은 S 또는 Y인 CDR-L1;
e) 아미노산 서열 (X1)AS(X2)(X3)QS를 포함하며, 여기서 X1은 Y, A 또는 S이고; X2는 S 또는 N이고; X3은 L 또는 R인 CDR-L2;
f) 아미노산 서열 QQ(X1)(X2)D(X3)P(X4)T를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 F 또는 N이고; X3은 W 또는 F이고; X4는 F 또는 L인 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 360에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 361에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 (예를 들어, Ab63)와 경쟁 또는 교차-경쟁한다. 항체는 서열식별번호: 360에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 361에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR (예를 들어, Ab63의 것)을 포함할 수 있다:
아미노산 서열 GSIRSSSYYWG (서열식별번호: 292)를 포함하는 CDR-H1;
아미노산 서열 SISYSATTYY (서열식별번호: 293)를 포함하는 CDR-H2;
아미노산 서열 AGDPSYDSIAGMQV (서열식별번호: 294)를 포함하는 CDR-H3;
아미노산 서열 RASQSISSYLN (서열식별번호: 295)을 포함하는 CDR-L1;
아미노산 서열 AASNLQS (서열식별번호: 296)를 포함하는 CDR-L2; 및
아미노산 서열 QQSFDWPLT (서열식별번호: 297)를 포함하는 CDR-L3.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 360에 대해 적어도 95% 동일한 (임의로 적어도 98% 동일한) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 361에 대해 적어도 95% 동일한 (임의로 적어도 98% 동일한) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 섬유화 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며, 여기서 a) 섬유화 장애는 만성 염증을 포함하고/거나; b) 대상체는 면역 억제로부터 이익을 얻고/거나; c) 대상체는 자가면역 질환을 갖거나 자가면역 질환이 발생할 위험이 있고/거나; d) 대상체는 동종이식편 이식에 대한 후보이거나 동종이식편 이식을 받았고/거나; e) 대상체는 상승된 Th17/Treg 비를 갖고/거나; f) 대상체는 TGFβ1 억제제의 장기간 또는 만성 투여를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 대사 장애를 갖거나 대사 장애가 발생할 위험이 있다 (그리고 대상체는 임의로 a)-f) 중 1개 이상에 따른 대상체임). 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이소형-특이적 LTBP1-프로TGFβ1 억제제 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 억제제이다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 대상체에서 섬유화 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 섬유화 장애는 만성 염증을 포함할 수 있다. 대상체는 면역 억제로부터 이익을 얻을 수 있다. 대상체는 자가면역 질환을 갖거나 자가면역 질환이 발생할 위험이 있을 수 있다. 대상체는 동종이식편 이식에 대한 후보일 수 있거나 동종이식편 이식을 받았을 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 대상체는 상승된 Th17/Treg 비를 가질 수 있다. 대상체는 TGFβ1 억제제의 장기간 또는 만성 투여를 필요로 할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 대상체는 대사 장애를 갖거나 대사 장애가 발생할 위험이 있을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며, TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 또는 TGFβ3은 억제하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 제조 방법이며, i) LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1을 포함하는 적어도 1종의 항원을 제공하는 단계; ii) 단계 (i)의 적어도 1종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 풀을 선택하여 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1의 특이적 결합제를 제공하는 단계; iii) TGFβ1의 활성화를 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제2 풀을 선택하여 TGFβ1 활성화의 특이적 억제제를 생성하는 단계; iv) 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제약 조성물로 제제화하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 풀로부터, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1, 성숙 TGFβ1, GARP-프로TGFβ2, LRRC33-프로TGFβ2, 성숙 TGFβ2, GARP-프로TGFβ3, LRRC33-프로TGFβ3, 성숙 TGFβ3 또는 그의 임의의 조합에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 단계 (ii) 및/또는 (iii)에서 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이소형-특이성을 결정하거나 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 인간 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 그의 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙/최적화는 항체의 제1 풀 및/또는 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 셔플링에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙/최적화는 항체의 제1, 제2 및/또는 제3 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 CDR H1/H2 다양화에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙/최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 CDR-H3 돌연변이유발에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙/최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 CDR 돌연변이유발에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙/최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 CDR L1/L2 다양화에 적용하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 항체의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 100 nM, > 50 nM, > 25 nM 또는 > 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 제1 및/또는 제2 풀로부터, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 100 nM, > 50 nM 또는 > 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하지 않는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 적합한 기능적 시험관내 세포-기반 검정, 예컨대 caga 검정에 의해 측정하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 IC50을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 세포-기반 검정 (예컨대 caga 검정)에 의해 측정시 100 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM 또는 5 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 내인성 LTBP caga 검정에 의해 측정시 50 nM 또는 10 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 인간 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 50 nM, 25 nM, 10 nM 또는 5 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
치료 용도에 적합한 TGFβ1-선택적 억제제를 확인하거나 선택하는 과정 및 방법은 TGFβ1-선택적 억제제를 포함하는 조성물의 제조 방법과 같이 본 발명에 포괄된다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1 억제제 (예를 들어, 선택된 억제제)는 i) 각각의 인간 LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체에 대한 높은 친화도 (예를 들어, KD < 5 nM) 및 ii) 낮은 해리율 (kOFF), 예를 들어 적합한 시험관내 결합/동역학 검정, 예컨대 BLI, 예를 들어 옥텟-기반 시스템에 의해 측정시, ≤ 5 x 10-4 (1/s)를 특징으로 하는 특히 유리한 동역학 기준을 갖는 1종 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 낮은 해리율 기준은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체로부터의 긴 절반 해리 시간 (t½), 예를 들어 ≥ 45분에 반영될 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스-연관 복합체(들)에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 긴 절반 해리 시간은 세포-연관 복합체, 예를 들어 인간 GARP-프로TGFβ1 및/또는 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 관한 짧은 절반 해리 시간과 커플링된다. 특히, 바람직한 항체 또는 단편은 10분 이하, 보다 바람직하게는 5분 이하의 t½로 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체로부터 해리된다. 마찬가지로, 본원에 기재된 바와 같은 TGFβ1-선택적 억제제를 포함하는 조성물의 제조 방법은 이러한 항체를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택된 항체 또는 복수의 항체는 적합한 전임상 모델을 사용하여, 효능 연구 및 독성학/안전성 연구를 포함하는 전임상 연구에서 평가된다. 효능 연구에서 결정된 항체 또는 항체들의 유효량은 독성학/안전성 연구에서 결정된 바람직하지 않은 독성을 유발하는 수준 미만이다. 바람직하게는, 적어도 3배, 6배, 보다 바람직하게는 10배의 치료 범위를 갖는 항체 또는 항체들이 선택된다. 본 개시내용에 따른 항체의 유효량은 매주 투여되는 경우에 약 0.1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 최대 내약 용량 (MTD)은 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 >100 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 전임상 독성학 연구에서, 항체는 >100 mg/kg/주, >200 mg/kg/주 또는 >300 mg/kg/주의 NOAEL을 나타내며, 여기서 임의로 독성학 연구는 4-주 연구, 8-주 연구 또는 12-주 연구이다. 예를 들어, NOAEL은 건강한 마우스 또는 래트에서 12-주 아만성 투여 요법에서 >100 mg/kg/주이다.
본 개시내용은 또한 TGFβ3-선택적 억제제에 의한 TGFβ3의 억제가 마우스에서 섬유화유발 효과를 생성한다는 놀라운 발견을 포함한다. 유사하게, TGFβ1-선택적 억제제 및 TGFβ3-선택적 억제제의 조합에 의한 동일한 모델에서의 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다의 공동 억제는 TGFβ1 억제제의 약화된 항섬유화 효과를 유발하였다. 이들 관찰은 비-선택적 TGFβ 억제제 (예컨대 범-억제제 및 TGFβ1/3 억제제)가 사실상 섬유증을 악화시킬 수 있다는 가능성을 제기한다. 유리하게는, 본원에 개시된 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 Ab42 및 그의 변이체)는 이들이 잠복 TGFβ1 복합체를 특이적으로 표적화하고 낮은 해리율로 그렇게 한다는 점에서 이소형-선택적이다. 따라서, 본 발명은 섬유화 상태 (예를 들어, ECM 조절이상을 수반하는 질환)를 갖는 환자에 대해 특정한 TGFβ 억제제를 선택하는 경우에, ECM 조절이상을 악화시킬 위험을 피하도록 이소형 선택성이 주의깊게 고려되어야 한다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 섬유화 상태 (본원에 기재된 바와 같은 바람직한 섬유화 상태 포함)를 갖는 대상체를 치료하기 위해 TGFβ3을 억제하지 않는 TGFβ 억제제를 선택하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본원에 사용된 이소형-선택적 LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체-선택적 억제제는 일부 실시양태에서 Ab31, Ab34, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab62, Ab63 및 Ab64 (임의로 Ab42 또는 Ab63) (즉, 본원에 제공된 바와 같은 상응하는 Ab의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편), 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자로부터 선택될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체-선택적 억제제 억제제는 Ab42, 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다. 바람직한 실시양태에서, LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체-선택적 억제제는 Ab42 또는 그의 항원-결합 단편이다.
도 1은 잠복 형태의 TGFβ1의 표적화가 이소형 및 콘텍스트 특이성을 제공한다는 것을 그래프로 도시한다.
도 2a-2b는 잠복 TGFβ1의 이소형-특이적 및 LTBP 복합체-특이적 결합제의 확인을 입증한다. 도 2a는 SR-AB1이 제시 분자에 비의존성으로 잠복 TGFβ1에 결합한다는 것을 입증한다. SR-AB1은 잠복 TGFβ2, TGFβ3 또는 성숙 TGFβ1에 대한 검출가능한 결합 없이, 잠복 TGFβ1에 선택적으로 결합하는, 효모 디스플레이에 의해 발견된 인간 모노클로날 항체이다. SR-AB1은 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 단백질과 교차-반응하고, 모든 4종의 잠복 TGFβ1 복합체에 결합한다. 도 2b는 항-LTBP1-프로TGFβ1 항체인 SR-AB2가 GARP-프로TGFβ1 또는 성숙 TGFβ1에 결합하지 않는다는 것을 입증한다. SR-AB2는 설치류 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응한다.
도 3a-3b는 활성화된 재조합 잠복 TGFβ1의 억제를 검출하기 위한 기능적 검정 (효력 검정)을 입증한다. 도 3a는 세포외 매트릭스 (ECM)에 침착된 잠복 TGFβ1의 활성화를 도시한다. 이 검정에서, 제시 분자는 인테그린-발현 세포에서 프로TGFβ1와 함께 공동-형질감염된다. 일시적으로 형질감염된 세포는 억제제의 존재 하에 검정 플레이트에 시딩된다. 잠복 LTBP-프로TGFβ1 복합체는 ECM에 포매된다. 이어서 TGFβ 리포터 세포가 시스템에 첨가되며; 유리 성장 인자 (인테그린에 의해 방출됨)는 신호를 전달하여 루시페라제 검정에 의해 검출된다. 도 3b는 세포 표면 상에 제시된 잠복 TGFβ1의 활성화를 도시한다. 제시 분자는 인테그린-발현 세포에서 프로TGFβ1과 함께 공동-형질감염된다. 잠복 TGFβ1은 GARP 또는 LRRC33에 의해 세포 표면 상에서 발현된다. 이어서 TGFβ 리포터 세포 및 억제제가 시스템에 첨가되며; 유리 성장 인자 (인테그린에 의해 방출됨)는 신호를 전달하여 루시페라제 검정에 의해 검출된다.
도 4a-4b는 재조합 기능적 검정의 최적화를 도시한다. 도 4a는 제시 분자 및 프로TGFβ1의 공동-형질감염시 제시 분자 및/또는 프로TGFβ1 활성화의 상대 기여를 도시한다. 도 4b는 공동-형질감염의 최적화: 제시 분자 및 프로TGFβ1에 대한 플라스미드 DNA의 비를 도시한다. 등가량의 각각의 플라스미드가 공동-형질감염에 최적이었다.
도 5는 피브로넥틴이 LTBP-제시된 잠복 TGFβ1의 인테그린 활성화를 촉진한다는 것을 입증한다. 검정 플레이트를 인간 혈장으로부터 정제된 피브로넥틴으로 사전-코팅하였다. 피브로넥틴은 LTBP1 및/또는 LTBP3에 의해 제시된 잠복 TGFβ1의 인테그린-매개 활성화를 증가시킨다.
도 6은 SR-AB1이 TGFβ1 활성화의 콘텍스트-비의존성 억제제라는 것을 입증하는 그래프이다. SR-AB1은 제시 분자에 비의존성으로 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화를 억제하는 것으로 나타났다.
도 7a, 7b 및 7c는 TGFβ1 대형 잠복 복합체 (LLC)의 LTBP-선택적 억제를 확인하는 데이터를 제시한다. 도 7a는 SR-AB2가 LTBP-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하며; 프로TGFβ1 또는 LTBP1 단독에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다. SR-AB2는 또한 GARP-프로TGFβ1에 결합하지 않는다. 도 7b는 SR-AB2가 LTBP1-프로TGFβ1 (인간 및 마우스 복합체)의 인테그린 활성화를 억제한다는 것을 도시한다. 도 7c는 SR-AB2가 LTBP3-프로TGFβ1의 인테그린 활성화를 억제한다는 것을 도시한다.
도 8은 SR-AB2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 (출현 순서로 각각 서열식별번호: 7-8)을 제시한다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 밑줄표시된다.
도 9는 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대한 SR-AB2의 결합 특이성을 입증하는 그래프이다.
도 10a-10b는 SR-AB2에 의한 매트릭스-연관 TGFβ1 활성화의 콘텍스트-선택적 억제를 보여주는 데이터를 제공한다. 도 10a는 SR-AB2가 LTBP-프로TGFβ를 억제한다는 것을 입증하며, 여기서 형질감염된 프로TGFβ1은 내인성 LTBP1/3에 의해 제시된다. 도 10b는 SR-AB2가 GARP-제시된 TGFβ1 활성화를 억제하지 않는다는 것을 입증한다. 이들 검정은 높은 LTBP3 mRNA, 낮은 LTBP1 mRNA, 검출불가능한 GARP 및 검출불가능한 LRRC33을 발현하는 LN229 세포에서 수행하였다. 비히클에 대해 정규화된 TGFβ 활성이 y-축에 제시된다.
도 11은 LTBP 복합체-특이적 항체 SR-AB10, SR-AB2 및 SR-13에 대한 결합 프로파일 및 친화도 데이터를 제시한다.
도 12a 및 12b는 최적화된 LTBP 복합체-특이적 항체의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다. 도 12a는 세포-기반 TGFβ 리포터 검정에 의해 측정시 SR-AB14 (최적화된 SR-AB10)의 개선된 억제 효력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 12b는 세포-기반 TGFβ 검정에 의해 측정시 SR-AB15 (최적화된 SR-AB13)의 개선된 억제 효력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 13a 및 13b는 세포-기반 TGFβ 리포터 검정에 의해 측정시 CDR-H3 돌연변이유발 후 최적화된 LTBP 복합체-특이적 항체 (즉, SR-AB20, SR-AB21, SR-AB22 및 SR-AB23)의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다.
도 14a 및 14b는 세포-기반 TGFβ 리포터 검정에 의해 측정시 CDR-H3 돌연변이유발 후 최적화된 LTBP 복합체-특이적 항체 (즉, SR-AB24, SR-AB25, SR-AB26, SR-AB27, SR-AB28 및 SR-AB29)의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다.
도 15는 친화도 성숙 항체가 LTBP-프로TGFβ1 복합체에 대한 특이적 결합을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 16은 세포-기반 TGFβ 리포터 검정에 의해 측정시 항체 최적화의 제1주기, 제2주기 및 제3주기 후 최적화된 LTBP 복합체-특이적 항체의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다.
도 17은 항체 다중특이성을 시험하는, 바큘로바이러스 (BV) 입자에 대한 항체 결합을 보여주는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)의 결과를 도시한다.
도 18은 항체 자기-상호작용을 시험하는, 친화도-포획 자기-상호작용 나노입자 분광분석법 (AC-SINS) 검정의 결과를 도시한다. 증가된 플라즈몬 파장이 자기-상호작용을 나타낸다.
도 19는 SR-AB42 및 SR-AB31로의 처리가 콜린-결핍 고 지방 식이 (CDHFD)를 받는 동물의 간 조직에서 히드록시프롤린 (HYP) (μg/mg 조직)의 증가를 억제하였다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 20a는 알포트(Alport) 마우스 모델에서 인산화 대 총 (인산화 및 비인산화) Smad2/3 (pSMAD2/3:tSMAD2/3)의 상대비를 보여주는 그래프이다. SR-AB42 또는 SR-AB63의 단일 용량은 전체 신장 용해물에서 pSmad2/3 신호전달을 유의하게 억제하기에 충분하였다. 도 20b는 ELISA에 의해 결정시 인산화 SMAD2/3 (pSMAD2/3)의 양을 보여주는 그래프이고, 도 20c는 ELISA에 의해 결정시 총 SMAD2/3 (tSMAD2/3) 단백질의 양을 보여주는 그래프이다. 도 20b 및 도 20c에 제시된 바와 같이, pSMAD의 감소는 도 20a에 제시된 비의 변화에 기여한다.
도 21은 리드 제3주기 항체가 LTBP-TGFβ3 검정에서 억제를 나타내지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 22는 대조군들, 참조 Ab, TGFβ3 억제제 또는 둘 다로 처리된 CDHFD 마우스로부터의 5개의 대표적인 PSR-염색된 영상을 제공한다 (좌측). 대조군과 비교하여 참조 Ab, TGFβ3 억제제 또는 둘 다로 처리된 CDHFD 마우스의 간 절편에서 피크로시리우스 레드 면적 (%)을 보여주는 그래프가 또한 제공된다 (우측).
도 23은 LTBP-복합체 항체, 예컨대 SR-AB63이 고도로 특이적이고 피코몰 1가 친화도를 갖는다는 것을 보여준다.
도 24는 LTBP-복합체 항체, 예컨대 SR-AB42가 고도로 특이적이고 피코몰 1가 친화도를 갖는다는 것을 보여준다.
본 발명은 TGFβ의 활성화를 감소시키는데 유용한 조성물을 제공한다. 성장 인자-수용체 상호작용의 상류에서 잠복 프로TGFβ 복합체를 표적화하는 억제제는 일반적으로 TGFβ의 활성화 억제제로 지칭된다.
지금까지, TGFβ에 대한 4종의 제시 분자가 확인되었다: 잠복 TGF 베타-결합 단백질 1 ("LTBP1"), 잠복 TGF 베타-결합 단백질 3 ("LTBP3"), 당단백질 A 반복 우세형 ("GARP") 및 류신-풍부 반복부-함유 단백질 33 ("LRRC33"). 각각의 이들 제시 분자는 TGFβ 전구체, 즉 프로TGFβ의 동종이량체 전구단백질 복합체와 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 프로TGFβ 복합체는 활성화 사건이 복합체로부터 가용성 성장 인자의 방출을 촉발할 때까지 각각의 세포외 함요 (예를 들어, ECM 및 면역 세포 표면)에서 휴면 (잠복)상태로 유지된다.
광범위하게 발현되는 TGFβ 성장 인자 및 수용체와 비교하여, 제시 분자는 보다 제한적 또는 선택적 (예를 들어, 조직-특이적) 발현 패턴을 나타내어, 회합에 의한 TGFβ 활성의 기능적 구획화를 일으킨다. 따라서, 4종의 제시 분자-프로TGFβ 복합체, 즉 LTBP1-프로TGFβ, LTBP3-프로TGFβ, GARP-프로TGFβ 및 LRRC33-프로TGFβ는 제시 분자가 발현되는 조직 내에 TGFβ 신호전달의 별개의 "콘텍스트"를 제공한다. 이들 콘텍스트는 2개의 광범위한 카테고리로 나뉠 수 있다: i) ECM과 연관된 TGFβ 신호전달 (예를 들어, 매트릭스-연관 TGFβ 기능); 및 ii) 세포와 연관된 TGFβ 신호전달 (특히 특정 면역 세포 기능). LTBP1-프로TGFβ 및 LTBP3-프로TGFβ 복합체는 제1 카테고리에 속하는 반면, GARP-프로TGFβ 및 LRRC33-프로TGFβ 복합체는 제2 카테고리에 속한다. 따라서, ECM과 연관된 TGFβ의 활성화를 선택적으로 억제할 수 있는 TGFβ의 억제제가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 억제제는 또한 특정한 TGFβ 이소형 (예를 들어, 프로TGFβ1, 프로TGFβ2 및/또는 프로TGFβ3)에 대해 선택적이다.
예시적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 LTBP 단백질, 예를 들어 LTBP1 및/또는 LTBP3 단백질의 콘텍스트에서의 TGFβ1의 활성화를 선택적으로 감소시키는데 유용하다. 이러한 조성물은 유리하게는 면역-연관 TGFβ1 제시 분자인 GARP 및 LRRC33의 콘텍스트에서의 TGFβ1은 억제하지 않으면서, 세포외 매트릭스-연관 TGFβ1의 활성화를 억제한다. 본원에 기재된 조성물은 TGFβ1 활성화와 연관된 장애, 예를 들어 섬유화 장애를 치료하는데 유용하다. 따라서, 실시양태에서, 본 발명은 TGFβ1의 활성화를 감소시키기 위한 조성물, 그의 사용 방법, 제조 방법 및 치료 방법을 제공한다. 섬유화 장애의 증상을 나타내는 대상체를 위한 TGFβ1 억제제를 선택하는 방법이 또한 제공된다.
정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 이들 정의는 본 개시내용의 나머지에 비추어 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 해석되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
친화도: 친화도는 분자 (예컨대 항체)의 그의 리간드 (예컨대 항원)에 대한 결합의 강도이다. 이는 전형적으로 평형 해리 상수 (KD)에 의해 측정 및 보고된다. KD는 항체가 그의 항원으로부터 얼마나 빨리 해리되는지인 항체 해리율 ("오프 레이트" 또는 Koff) 대 항체가 그의 항원에 얼마나 빨리 결합하는지인 항체 회합률 ("온 레이트" 또는 Kon)의 비이다. 예를 들어, ≤ 1 μM의 친화도를 갖는 항체는 적합한 시험관내 결합 검정에 의해 결정시 1 μM 이하인 KD 값 (즉, 1 μM 이상의 친화도)을 갖는다. 적합한 시험관내 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (예를 들어, 옥텟) 또는 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어(Biacore) 시스템)을 사용하여 널리 공지된 방법에 기초하여 KD 값에 의해 측정된 바와 같은 친화도를 평가할 수 있다.
친화도 성숙: 친화도 성숙은 항체 최적화의 유형이고, 항체 또는 단편의 그의 항원에 대한 친화도를 개선시키는 과정이며, 전형적으로 항체 또는 단편의 아미노산 서열에 1개 이상의 변화를 만들어 보다 큰 친화도를 달성하는 것을 수반한다. 전형적으로, 모 항체 및 친화도-성숙 대응물은 동일한 에피토프를 보유한다. 친화도 성숙은 1개 이상의 CDR 서열의 다양화 및/또는 돌연변이유발을 포함할 수 있다.
항체: 용어 "항체"는 본원의 다른 곳에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 자연 발생, 재조합, 변형된 또는 조작된 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린-유사 구조 또는 그의 항원-결합 단편 또는 부분 또는 그의 유도체를 포괄한다. 따라서, 상기 용어는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭하고, 예를 들어 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이적 항체를 포함한다. 달리 반대로 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 항원-결합 단편 및 그의 변이체를 포괄할 것이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타류 내 자연 발생 항체와 같이 보다 적은 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터만 유래될 수 있거나, 또는 "키메라"일 수 있고, 즉 항체의 상이한 부분들이 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 본원에 사용된 용어 항체는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 접합체"로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 펩티바디를 포괄한다.
항원: 용어 "항원"은 항체 또는 단편이 특이적으로 결합하는 결합 영역(들) 내의 항원 결정기를 포함하는 임의의 분자를 광범위하게 포함한다. 항원은 단일-단위 분자 (예컨대 단백질 단량체 또는 단편) 또는 다중 성분으로 구성된 복합체일 수 있다. 항원은 선택적 결합제, 예컨대 항원-결합 단백질 (예를 들어, 항체 포함)에 의해 결합될 수 있는 에피토프, 예를 들어 분자 또는 분자의 부분, 또는 분자 또는 분자의 부분의 복합체를 제공한다. 따라서, 선택적 결합제는 복합체 내의 2개 이상의 성분에 의해 형성되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 그 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 에피토프를 소유할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 적합한 항원은 프로TGF 이량체를 함유하는 복합체 ("소형 잠복 복합체" 또는 SLC), 바람직하게는 제시 분자와 회합된 프로TGF 이량체를 함유하는 복합체 (함께 "대형 잠복 복합체" 또는 LLC) (예를 들어, 회합된 다중 성분으로 구성된 다량체 복합체)이다. 프로TGF 이량체의 각각의 단량체는 푸린 절단 서열에 의해 분리되는 프로도메인 및 성장 인자 도메인을 포함한다. 2개의 이러한 단량체는 프로TGF 이량체 복합체를 형성한다. 이는 차례로 각각의 프로TGF 단량체의 N-말단 근처에 존재하는 시스테인 잔기를 수반하는 디술피드 결합을 통해 제시 분자와 공유 회합된다. 제시 분자에 결합된 프로TGF 이량체에 의해 형성된 이러한 다중-복합체는 일반적으로 대형 잠복 복합체로 지칭된다. 항체 또는 항원-결합 단편을 스크리닝하는데 적합한 항원 복합체는, 예를 들어 대형 잠복 복합체의 제시 분자 성분을 포함한다. 이러한 제시 분자 성분은 전장 제시 분자 또는 그의 단편(들)일 수 있다. 제시 분자의 최소 요구 부분은 전형적으로, 프로TGFβ1 이량체와 공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 제시 분자 폴리펩티드의 적어도 50개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산을 함유한다.
항원-결합 부분/단편: 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"은 항원 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항원-결합 부분은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체의 항원-결합 부분은, 예를 들어 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 단백질분해적 소화 또는 재조합 유전자 조작 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 부분의 비제한적 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일-쇄 Fv (scFv) 분자 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883] 참조); (vi) dAb 단편 (예를 들어, 문헌 [Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546] 참조); 및 (vii) 항체의 초가변 영역 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR))을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다. 용어 항체의 항원-결합 부분은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커를 포함하는, 달리 "scFab"로 공지된 "단일 쇄 Fab 단편"을 포함하며, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 갖고; 상기 링커는 적어도 30개의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개의 아미노산의 폴리펩티드이다.
진행성 섬유증: 본원에 사용된 바와 같이, 대상체가 진행 병기의 섬유화 장애, 특히 기관 섬유증을 갖는 경우에 대상체는 진행성 섬유증을 앓고 있으며, 이로써 환자는 동종이식편 이식을 받기 위한 또는 그를 필요로 하는 후보가 된다.
필요에 따라: 투여 요법과 관련하여, 용어 "필요에 따라"는 미리 결정된 투여 스케줄에 기초하는 것이 아니라, 대신에 치료 동안 주기적으로 측정 또는 모니터링되는 1종 이상의 파라미터 또는 마커에 기초하여, 추가의 용량이 대상체/환자에게 유익할 것인지 여부에 관한 정보 또는 지침을 제공하는 투여 요법을 지칭한다. 예를 들어, TGFβ 억제제, 예컨대 TGFβ1/2/3 억제제 ("범" 억제제), TGFβ1/2 억제제 및 TGFβ1/3 억제제를 포함하는 제약 조성물은 임상 이익 (예를 들어, 섬유증의 1종 이상의 임상 마커의 감소)을 달성하고/거나 유지하기에 충분한 치료 유효량으로 "필요에 따라" 간헐적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1/3-복합체 선택적 TGFβ 억제제, 예컨대 본원에 개시된 항체 중 어느 하나 (예를 들어, Ab31, Ab34, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab62, Ab63 또는 Ab64 (임의로 Ab42))의 투여는 치료 효능을 결정 또는 모니터링하는 방법과 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1/3-복합체 선택적 TGFβ 억제제는 TGFβ 억제제의 추가의 용량으로부터의 임상 이익이 예상되는 경우에만 환자에서 투여된다. 독성을 관리하기 위해, 간헐적 또는 "필요에 따른" 투여 요법이 TGFβ1-선택적 억제제, 예컨대 본원에 개시된 것과 비교하여 TGFβ의 이소형-비-선택적 억제제에서 더 빈번하게 요구될 수 있는 것으로 고려된다.
편향: 본 개시내용과 관련하여, 용어 "편향"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 하위세트를 향한 또는 그에 대한 편중된 또는 고르지 않은 친화도를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 하나의 항원 복합체에 대한 친화도 및 또 다른 항원 복합체에 대한 친화도가 등가이지 않은 경우 (예를 들어, 친화도의 5배 초과의 차이) 편향을 갖는 것으로 언급된다. "비편향"을 특징으로 하는 항체는 상기 항원 복합체들에 대해 대략 등가인 친화도 (예를 들어, 친화도의 5배 미만의 차이)를 갖는다. 본 개시내용의 항체는 EMC-연관 복합체 (LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ)에 "선택적으로" 결합한다. 이러한 선택적 결합은 일부 실시양태에서 매트릭스-연관 복합체 중 적어도 1종과 세포-연관 복합체 (GARP-프로TGFβ1 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체) 중 적어도 1종 (바람직하게는 둘 다) 사이의 상대 친화도가 50배 초과이도록 하는 결합을 포함할 수 있다.
생물층 간섭측정법 (BLI): BLI는, 예를 들어 바이오센서 팁 표면 상에 고정화된 리간드와 용액 중 분석물 사이의 생체분자 상호작용을 광학적으로 측정하기 위한 무표지 기술이다. BLI는 결합 특이성, 회합률 및 해리율 또는 농도를 정밀성 및 정확성 있게 모니터링하는 능력을 제공한다. BLI 플랫폼 기기는, 예를 들어 포르테바이오(ForteBio)로부터 상업적으로 입수가능하고, 통상적으로 옥텟® 시스템으로 지칭된다. BLI는 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 결합 검정을 수행하는데 사용될 수 있다.
자가면역 질환: 자가면역 질환은 정상 신체 부분에 대한 비정상적 또는 과활성 면역 반응으로부터 일어나는 상태이다. 이러한 자가면역 상태를 갖는 환자에게 투여되는 면역자극제는 상태를 악화시킬 수 있다.
세포-연관 프로TGFβ1: 이 용어는 막-결합된 (예를 들어, 세포 표면에 테더링된) TGFβ1 또는 그의 신호전달 복합체 (예를 들어, 프로/잠복 TGFβ1)를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 세포는 면역 세포이다. GARP 또는 LRRC33에 의해 제시되는 TGFβ1은 세포-연관 TGFβ1이다. GARP 및 LRRC33은 특정 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 막횡단 제시 분자이다. GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1은 세포-연관 (예를 들어, 면역 세포-연관) TGFβ1 활성화/신호전달을 매개하는 "세포-연관" (또는 "세포-표면") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다.
만성 염증: 본 개시내용과 관련하여, 만성 염증을 수반하는 섬유화 장애는 초기 손상 후 정상 치유로 해소되지 않도록 하는 조직에 대한 연속적 또는 지속적 손상을 특징으로 한다. 만성 염증은 염증 부위 (예를 들어, 섬유화 조직)에 존재하는 세포 유형의 점진적인 변화를 수반하는 장기간의 염증 반응을 지칭한다. 이는 염증 과정으로부터 동시의 조직 파괴 및 복구를 특징으로 한다. 이는 염증의 급성 형태를 따를 수 있거나 또는 장기간의 저등급 형태일 수 있다.
임상 이익: 본원에 사용된 용어 "임상 이익"은 요법의 효능 및 안전성 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 바람직한 임상 이익을 달성하는 치유적 치료는 효과적이면서도 안전하다 (예를 들어, 내약성 있거나 또는 허용되는 독성 또는 유해 사건).
조합 또는 조합적 에피토프: 조합 에피토프는 항원의 성분 또는 성분들의 비-인접 부분에 의해 형성된 부위 (즉, 항원 결정기)에서 조합 항체에 의해 인식되고 결합되는 에피토프이며, 이는 3차원 구조에서 함께 매우 근접하여 에피토프를 형성한다. 따라서, 본 발명의 항체는 프로/잠복 TGFβ1 복합체의 2종 이상의 성분 (예를 들어, 부분 또는 절편)에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있다. 조합 에피토프는 복합체의 제1 성분으로부터의 아미노산 잔기(들) 및 복합체의 제2 성분으로부터의 아미노산 잔기(들) 등을 포함할 수 있다. 각각의 성분은 단일 단백질의 것 또는 항원 복합체의 2종 이상의 단백질의 것일 수 있다. 조합 에피토프는 항원 또는 항원 복합체의 2종 이상의 성분 (예를 들어, 부분 또는 절편, 예컨대 아미노산 잔기)으로부터의 구조적 기여로 형성된다.
상보성 결정 영역: 본원에 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 3개의 CDR이 있으며, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의된다. 카바트 (Kabat et al. (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.))에 의해 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 각각의 중쇄 및 경쇄 상의 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다.
입체형태적 에피토프: 입체형태적 에피토프는 해당 아미노산 서열의 언폴딩된 펩티드로가 아니라 3차원 입체형태로의 입체형태적 항체에 의해 인식되고 결합되는 에피토프이다. 입체형태적 에피토프는 입체형태-특이적 에피토프, 입체형태-의존성 에피토프 또는 입체형태-감수성 에피토프로 지칭될 수 있다. 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 상응하는 항체 또는 그의 단편은 입체형태-특이적 항체, 입체형태-선택적 항체 또는 입체형태-의존성 항체로 지칭될 수 있다. 입체형태적 에피토프에 대한 항원의 결합은 항원 또는 항원 복합체의 3차원 구조 (입체형태)에 좌우된다.
콘텍스트-특이적: 본 발명의 콘텍스트-특이적 (또는 콘텍스트-선택적) 항체는 ("콘텍스트-비의존성" 항체와 대조적으로) 특정한 생물학적 콘텍스트와 연관된 프로TGFβ1 복합체의 하위세트 (모두는 아님)에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 매트릭스-선택적 표적화는 ECM과 연관된 TGFβ1 기능의 특이적 억제를 가능하게 한다. ECM-선택적 억제는 ECM 성분, LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1을 선택적으로 표적화하는 항체 또는 그의 단편의 사용에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 항체 및 단편은 콘텍스트-특이적 항체의 부류를 나타낸다. TGFβ1 활성화의 LTBP1-특이적 및 LTBP3-특이적 억제제는 또한 콘텍스트-특이적 항체이다.
교차-차단/교차-차단하는: 제1 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어 생물층 간섭측정법 (예컨대 옥텟) 또는 표면 플라즈몬 공명 (예컨대 비아코어 시스템)에 의해, 표준 시험 조건을 사용하여, 예를 들어 제조업체의 지침서에 따라 측정하여 검정된 바와 같이 (예를 들어, 결합은 실온, ~20-25℃에서 검정됨), 동일한 항원에 관하여 서로 교차-차단한다. 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 동일한 에피토프를 가질 수 있거나; 비-동일하지만 중첩되는 에피토프를 가질 수 있거나; 또는 3차원 공간에서 매우 근접한 별개의 (상이한) 에피토프를 가질 수 있어, 항체 결합이 입체 장애를 통해 교차-차단된다. "교차-차단"은 항원에 대한 제1 항체의 결합이 동일한 항원에 대한 제2 항체의 결합을 방지하고, 유사하게, 항원에 대한 제2 항체의 결합이 동일한 항원에 대한 제1 항체의 결합을 방지한다는 것을 의미한다.
해리율: 본원에 사용된 용어 해리율은 리간드 (예를 들어, 항체 또는 단편)가 그의 결합 표적 (예를 들어, 항원)으로부터 얼마나 빨리/느리게 해리되는지에 의해 측정된 동역학 파라미터를 지칭하는 것으로, 관련 기술분야 (예를 들어, 항체 기술)의 통상의 기술자에 의해 이해되는 의미를 갖는다. 해리율은 또한 "오프" 레이트 ("kOFF")로 지칭된다. 항체와 그의 항원 사이의 상대 온/오프 레이트 (즉, kON 및 kOFF)는 상호작용의 전체 강도 또는 전형적으로 해리 상수 또는 KD로서 표현되는 친화도를 결정한다. 따라서, 등가의 친화도 (예를 들어, KD 값)는 빠른 회합 (높은 kON), 느린 해리 (낮은 kOFF), 또는 둘 다의 인자로부터의 기여를 가짐으로써 달성될 수 있다. 1가 상호작용은 1가 항원-결합 분자/단편, 예컨대 fAb (Fab)의 사용에 의해 측정될 수 있는 반면, 2가 상호작용은 2가 항원-결합 분자, 예컨대 전체 이뮤노글로불린 (예를 들어, IgG)의 사용에 의해 측정될 수 있다. 해리 동역학은 항체 분자 (예를 들어, mAb, Fab 등)의 수의 절반이 결합된 항원으로부터 해리되는데 걸리는 시간의 지속기간으로서 정의되는 절반 해리 시간 (때때로 절반 결합 시간으로 지칭됨) 또는 t½의 용어로 표현될 수 있다. 따라서, 해리율이 느린 항체는 긴 절반 해리 시간을 갖고, 해리율이 빠른 항체는 짧은 절반 해리 시간을 갖는다.
투여량: 본원에 사용된 본 발명의 항체의 전형적인 치료 투여량은 용량당 약 1-30 mg/kg 범위이다. 전형적인 투여 요법은 1주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 1개월 1회, 6주마다 등을 포함할 수 있다.
ECM-연관 (또는 "매트릭스-연관") TGFβ1: 이 용어는 세포외 매트릭스의 성분인 (예를 들어, 그 내에 침착된) TGFβ1 또는 그의 신호전달 복합체 (예를 들어, 프로/잠복 TGFβ1)를 지칭한다. LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시되는 TGFβ1은 ECM-연관 TGFβ1이다.
유효량: "유효량" (또는 치료 유효량)은 환자 집단에서 통계적으로 유의한 임상 이익을 달성하는 투여량 또는 투여 요법량이다.
섬유화 장애: 용어 "섬유증" 또는 "섬유화 상태/장애"는 조직 또는 기관 내의 세포외 매트릭스 (ECM) 성분, 예컨대 콜라겐의 병리학적 축적을 특징으로 하는 과정 또는 징후를 지칭한다. 섬유증은 원발성 섬유증, 뿐만 아니라 질환 또는 장애와 연관된 속발성 섬유증을 포함할 수 있다.
GARP-프로TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "GARP-프로TGFβ1"은 당단백질-A 반복 우세형 단백질 (GARP) 또는 그의 단편 또는 변이체와 회합된 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질의 전구단백질 형태 또는 잠복 형태를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 프로TGFβ1 동종이량체는 디술피드 결합을 통해 GARP의 단일 분자와 공유 회합을 형성할 수 있다. 용어 "GARP-TGFβ1"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. GARP-프로TGFβ1 발현은 특정 세포 유형, 예컨대 조절 T 세포 (Treg)로 제한된다.
인간 항체: 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 인간 항체는, 예를 들어 CDR, 특히 CDR3 (예를 들어, CDR-H3 또는 CDR-L3 돌연변이유발)에 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
인간화 항체: 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 한 부분이 보다 "인간-유사"하도록, 즉 인간 배선 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 한 유형은 CDR-그라프팅된 항체이다.
면역 억제/면역억제: 용어 면역억제는 신체의 면역계의 강도의 억제 또는 감소를 지칭한다. "면역억제로부터 이익을 얻는" 환자는 진행 병기의 기관 섬유증을 갖고, 이식을 위한, 이식이 고려되는 후보이거나 또는 이식을 받은 환자를 포함한다.
이소형-특이적: 용어 "이소형 특이성"은 하나의 이소형을 다른 구조적으로 관련된 이소형과 구별하는 작용제의 능력 (즉, 선택성)을 지칭한다. 이소형-특이적 TGFβ 억제제는 TGFβ의 하나의 이소형에 대해 그의 억제 활성을 발휘하지만, 주어진 농도에서 TGFβ의 다른 이소형에 대해서는 그렇지 않다. 예를 들어, 이소형-특이적 TGFβ1 항체는 TGFβ1에 선택적으로 결합한다. TGFβ1-특이적 억제제 (항체)는 TGFβ2 또는 TGFβ3에 비해 TGFβ1 이소형을 실질적으로 더 큰 친화도로 우선적으로 표적화한다 (결합하여 억제한다). 예를 들어, 이와 관련하여 선택성은 시험관내 결합 검정, 예컨대 옥텟 및 비아코어에 의해 측정시 각각의 친화도의 적어도 500-1000배 차이를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택성은 억제제가 생체내 TGFβ1을 억제하는데 효과적인 투여량으로 사용되는 경우에 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않도록 하는 것이다. 본 개시내용의 콘텍스트-특이적 억제제는 또한 이소형-특이적이다.
단리된: 본원에 사용된 "단리된" 항체는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 다른 의도되지 않은 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다.
장기간 또는 만성 투여: 본원에 사용된 6개월에 걸친 치료를 수반하는 치료 요법은 장기간으로 간주된다. 일부 환자 집단에서, 장기간 치료 요법은 무기한의 지속기간 동안 약물 (예컨대 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제제)의 투여를 수반한다.
LRRC33-프로TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "LRRC33-TGFβ1 복합체"는 전구단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질과 류신-풍부 반복부-함유 단백질 33 (LRRC33; 반응성 산소 종의 음성 조절제 또는 NRROS로도 공지됨) 또는 그의 단편 또는 변이체 사이의 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 LRRC33을 포함한다. 다른 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 LRRC33을 포함한다. 일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 자연 발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 LRRC33-TGFβ1 복합체이다.
LTBP1-TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "LTBP1-TGFβ1 복합체" (또는 "LTBP1-프로TGFβ1 복합체")는 전구단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 (본원에서 "프로TGFβ1"로 지칭될 수 있음) 및 잠복 TGF-베타 결합 단백질 1 (LTBP1) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 다른 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 자연 발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 LTBP1-TGFβ1 복합체이다. 예시적인 LTBP1-TGFβ1 복합체가 도 3에 제시된다.
LTBP3-TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "LTBP3-TGFβ1 복합체" (또는 "LTBP3-프로TGFβ1 복합체")는 전구단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 (본원에서 "프로TGFβ1"로 지칭될 수 있음) 및 잠복 TGF-베타 결합 단백질 3 (LTBP3) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 LTBP3을 포함한다. 다른 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 자연 발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 LTBP3-TGFβ1 복합체이다. 예시적인 LTBP3-TGFβ1 복합체가 도 3에 제시된다.
대식세포: 대식세포는 면역계의 백혈구의 유형이고, 골수 세포의 불균질한, 표현형적으로 다양한 하위집단을 포함한다. 일부 대식세포는 골수-유래, 순환 단핵구로부터 분화하는 반면, 다른 것은 특정한 해부학적 또는 조직 위치 내에 상주하는 조직-특이적 대식세포 ("상주" 대식세포)이다. 조직-특이적 대식세포는 지방 조직 대식세포; 쿠퍼 세포 (간); 동 조직구 (림프절); 폐포 대식세포 (또는 먼지 세포, 폐의 폐포); 거대 세포로 이어지는 조직 대식세포 (조직구) (결합 조직); 랑게르한스 세포 (피부 및 점막); 소교세포 (중추 신경계); 호프바우어 세포 (태반); 사구체내 혈관간 세포 (신장); 파골세포 (골); 상피양 세포 (육아종); 적색 속질 대식세포 (또는 동모양 내층 세포, 비장의 적색 속질); 복막 대식세포 (복막강); 및 리소맥(LysoMac) (파이어 판)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대식세포, 예를 들어 골수 유래 단핵구는 특정 자극 (예컨대 시토카인)에 의해 활성화되어 분극화된 표현형, 예를 들어 M1 및 M2를 생성할 수 있다. M2-편향된 활성화된 대식세포는 여러 표현형적으로 별개인 하위유형, 예컨대 M2a, M2b, M2c (예를 들어, 섬유화유발) 및 M2d (종양유발 또는 TAM-유사)로 추가로 분류된다.
매트릭스-연관 프로TGFβ1: LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분인 제시 분자이다. LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1은 ECM-연관 TGFβ1 활성화/신호전달을 매개하는 "ECM-연관" (또는 "매트릭스-연관") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다.
최대 내약 용량 (MTD): 용어 MTD는 일반적으로 안전성/독성학 고려사항과 관련하여 무 관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)으로 평가되는 시험 물품 (예컨대 TGFβ1 억제제)의 가장 높은 양을 지칭한다. 예를 들어, 래트에서의 Ab2에 대한 NOAEL은 평가된 최고 용량 (100 mg/kg)이었으며, 이는 4-주 독성학 연구에 기초하여 Ab2에 대한 MTD가 >100 mg/kg이라는 것을 시사한다.
골수-유래 억제 세포: 골수-유래 억제 세포 (MDSC)는 다양한 병리학적 상태 동안 생성되고 단핵구 및 비교적 미성숙한 호중구의 활성화의 병리학적 상태를 나타내는 것으로 생각되는 세포의 불균질한 집단이다. MDSC는 i) 호중구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사한 "과립구" (G-MDSC) 또는 다형핵 (PMN-MDSC); 및 ii) 단핵구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사한 단핵구 (M-MDSC)로 명명되는 적어도 2종의 카테고리의 세포를 포함한다. MDSC는 별개의 세트의 게놈 및 생화학적 특색을 특징으로 하고, 특이적 표면 분자에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 인간 G-MDSC/PMN-MDSC는 전형적으로 세포-표면 마커 CD11b, CD33, CD15 및 CD66을 발현한다. 추가로, 인간 G-MDSC/PMN-MDSC는 또한 HLA-DR 및/또는 아르기나제를 발현할 수 있다. 비교로, 인간 M-MDSC는 전형적으로 세포 표면 마커 CD11b, CD33 및 CD14를 발현한다. MDSC는 또한 CD39 및 CD73을 발현하여 기관 섬유증 (예컨대 간 섬유증 및 폐 섬유증), 암 및 골수섬유증에 수반되는 아데노신 신호전달을 매개할 수 있다. 추가로, 인간 M-MDSC는 또한 HLA-DR을 발현할 수 있다. 이러한 세포-표면 마커에 추가로, MDSC는 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 억제하는 능력을 특징으로 한다. MDSC의 면역 억제 기능은 항원-비-특이적 기능의 억제 및 항원-특이적 기능의 억제를 포함할 수 있다. MDSC는 세포 표면 LRRC33 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1을 발현할 수 있다.
근섬유모세포: 근섬유모세포는 섬유모세포 및 평활근 세포의 특정 표현형을 갖는 세포이고, 일반적으로 비멘틴, 알파-평활근 액틴 (α-SMA; 인간 유전자 ACTA2) 및 팔라딘을 발현한다. 세포외 매트릭스 조절이상 (예컨대 증가된 매트릭스 강성)을 수반하는 많은 질환 상태에서, 정상 섬유모세포 세포는 TGFβ-의존성 방식으로 근섬유모세포로 탈분화된다.
오프 레이트 (kOFF): 오프 레이트는 항체 (예컨대 mAb) 또는 항원-결합 단편 (예컨대 fAb)이 그의 항원으로부터 얼마나 빨리 또는 얼마나 느리게 해리되는지의 동역학 파라미터이고, 해리율로도 지칭될 수 있다. 해리율은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI (옥텟®)- 및/또는 SPR (비아코어)-기반 시스템에서 실험적으로 측정될 수 있다. 항체-항원 결합 동역학과 관련하여, 용어 "절반-결합-시간" (T1/2) 또는 "절반 해리 시간"은 항체 분자 (예를 들어, mAb, Fab)의 수의 반이 결합된 항원 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1)으로부터 해리되는데 요구되는 시간의 지속기간을 지칭한다. 따라서, 그의 항원으로부터 천천히 해리되는 (즉, 낮은 오프 레이트) 항체는 긴 T1/2을 갖는다. 반대로, 그의 항원으로부터 신속하게 해리되는 (즉, 높은 오프 레이트) 항체는 짧은 T1/2을 갖는다.
범-TGFβ 억제제/TGFβ의 범-억제: 용어 "범-TGFβ 억제제"는 TGFβ의 모든 3종의 이소형을 억제 또는 길항할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 이러한 억제제는 TGFβ 이소형의 소분자 억제제일 수 있다. 상기 용어는 각각의 TGFβ 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합할 수 있는 임의의 항체를 지칭하는 범-TGFβ 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 범-TGFβ 항체는 모든 3종의 이소형의 활성, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 활성에 결합하고 이를 중화시킨다.
효력: 본원에 사용된 용어 "효력"은 정의된 효과를 생성하는 약물의 농도 또는 양에 관하여, 억제 활성을 갖는 약물, 예컨대 기능적 항체 (또는 단편)의 활성을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 투여량에서 특정 효과를 생성할 수 있는 항체는 등가의 효과를 생성하기 위해 2배의 양 (투여량)이 요구되는 또 다른 항체보다 더 효력이 있다. 효력은 세포-기반 검정, 예컨대 TGFβ 활성화/억제 검정에서 측정될 수 있다. 일부 경우에, TGFβ 활성화, 예컨대 인테그린 결합에 의해 촉발된 활성화의 정도는 세포-기반 시스템에서 시험 물품 (예를 들어, 억제 항체)의 존재 또는 부재 하에 측정될 수 있다. 전형적으로, 더 높은 친화도를 갖는 항체는 더 낮은 친화도를 갖는 항체보다 더 높은 효력을 나타내는 경향이 있다.
제시 분자: 제시 분자는 잠복 전구단백질 (예를 들어, 프로TGFβ1)과 공유 결합을 형성하고, 불활성 복합체를 세포외 함요 (예컨대 ECM 또는 면역 세포 표면)에 "제시"함으로써, 활성화 사건이 발생할 때까지 그의 잠복성을 유지하는 단백질이다. 프로TGFβ1에 대한 공지된 제시 분자는 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33을 포함하며, 이들은 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 즉 각각 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1을 형성할 수 있다. LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분이고; 따라서, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1은 ECM-연관 TGFβ1 신호전달/활성을 매개하는 "ECM-연관" (또는 "매트릭스-연관") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다. GARP 및 LRRC33은, 다른 한편으로는, 특정 세포의 세포 표면 상에서 발현된 막횡단 단백질이고; 따라서, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1은 세포-연관 (예를 들어, 면역 세포-연관) TGFβ1 신호전달/활성을 매개하는 "세포-연관" (또는 "세포-표면") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다.
프로TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "프로TGFβ1"은 복합체 내에 TGFβ1의 프로도메인 서열을 포함하는 불활성 TGFβ1 복합체의 전구체 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 용어는 TGFβ1의 잠복-형태뿐만 아니라 프로-형태를 포함할 수 있다. 표현 "프로/잠복 TGFβ1"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. TGFβ1의 "프로" 형태는 푸린 부위에서의 단백질분해적 절단 전에 존재한다. 절단되면, 생성된 형태는 TGFβ1의 "잠복" 형태인 것으로 언급된다. "잠복" 복합체는 추가의 활성화, 예컨대 인테그린-유도된 활성화 사건이 촉발될 때까지 회합된 채로 유지된다. 프로TGFβ1 복합체는 디술피드 결합으로 연결된 이량체 TGFβ1 전구단백질 폴리펩티드로 구성된다. 잠복 이량체 복합체는 각각의 프로TGFβ1 폴리펩티드의 위치 4에서의 시스테인 잔기 (Cys4)를 통해 단일 제시 분자에 공유 연결된다. 형용사 "잠복"은 일반적으로 인테그린-매개 또는 다른 활성화 사건 전 TGFβ1의 "불활성" 상태를 기재하는데 사용될 수 있다. 프로TGFβ1 폴리펩티드는 프로도메인 (LAP) 및 성장 인자 도메인 (서열식별번호: 12)을 함유한다.
조절 T 세포 (Treg): "조절 T 세포" 또는 Treg는 바이오마커, CD4, 포크헤드 박스 P3 (FOXP3) 및 CD25, 뿐만 아니라 STAT5의 발현을 특징으로 하는 면역 세포의 유형이다. Treg는 때때로 억제 T 세포로서 지칭되며, 면역계를 조정하고, 자기-항원에 대한 관용을 유지하고, 자가면역 질환을 예방하는 T 세포의 하위집단을 나타낸다. Treg는 면역억제성이고, 일반적으로 이펙터 T (Teff) 세포의 유도 및 증식을 억제 또는 하향조절한다. Treg는 흉선에서 발생할 수 있거나 (소위 CD4+ Foxp3+ "천연" Treg), 또는 항원-제시 세포 (APC)에 의한 나이브 CD4+ T 세포의 프라이밍시, 예를 들어 TGFβ 또는 레티노산에의 노출 후 말초에서 분화될 수 있다. Treg 세포는 IL-10 및 TGFβ1을 포함한 시토카인을 생산하고 분비한다. 일반적으로, Treg 및 Th17 세포의 분화는 음의 상관관계가 있다.
특이적 결합: 본원에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 항원의 상호작용이 특정한 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 일반적 단백질보다는 특이적 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 표적, 예를 들어 TGFβ1에, 항체가 표적에 대해 적어도 약 10-6 M의 KD를 갖는 경우에, 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체의 측정된 KD 값은 10-100 nM 범위이다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체의 측정된 KD 값은 0.1-10 nM 범위이다.
대상체: 치료 용도와 관련하여 용어 "대상체"는 임상 관리 또는 개입, 예컨대 치료, 진단 등을 받는 개체를 지칭한다. 적합한 대상체는 포유동물 (예를 들어, 인간 및 비-인간 포유동물)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 척추동물을 포함한다. 대상체가 인간 대상체인 경우에, 용어 "환자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 임상 상황에서, 용어 "환자 집단" 또는 "환자 하위집단"은 일련의 기준, 예컨대 임상 기준 (예를 들어, 질환 제시, 질환 병기, 특정 상태에 대한 감수성, 요법에 대한 반응성 등), 의료 병력, 건강 상태, 성별, 연령 군, 유전적 기준 (예를 들어, 특정 돌연변이, 다형성, 유전자 중복, DNA 서열 반복부 등의 보인자) 및 생활방식 인자 (예를 들어, 흡연, 알콜 소비, 운동 등) 내에 속하는 개체의 군을 지칭하는데 사용된다.
TGFβ 억제제: 용어 "TGFβ 억제제"는 TGFβ 성장 인자 (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및/또는 TGFβ3)의 생물학적 활성 또는 기능을 길항할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 상기 용어는 그의 작용 메카니즘을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 예를 들어 TGFβ의 중화 억제제, 수용체 길항제, 가용성 리간드 트랩 및 활성화 억제제를 포함한다.
T 헬퍼 17 세포: T 헬퍼 17 세포 (Th17)는 마커 STAT3 및 RORγt, 및 인터류킨 17 (IL-17A/F) 및 IL-22를 포함한 시토카인의 생산을 특징으로 하는 염증유발 T 헬퍼 세포의 하위세트이다. Th17 세포는 나이브 T 세포가 TGFβ 및 IL-6에 노출되는 경우에 분화된다. Th17 세포는 일반적으로 조직 염증, 자가면역 및 특정 병원체의 클리어런스와 연관된다. Th17 세포 및 Treg 세포의 분화는 일반적으로 역 관계가 있다. Th17-대-Treg 비 (예를 들어, "Th17/Treg")의 불균형은 다수의 병리상태, 예컨대 섬유화 상태 및 자가면역 상태에 연루되어 왔다.
Th17/Treg 비: Th17-대-Treg 비는 관심 조직 또는 샘플 내 Th17 세포의 수 대 Treg 세포의 수의 측정된 비 (상대 비율)를 지칭한다. 전형적으로, 공지된 세포 마커가 세포 유형을 확인, 분류 또는 단리하는데 사용된다. 이러한 마커는 특정한 세포 유형 상에 발현된 세포-표면 분자; 특정한 세포 유형에 의해 생산된 (예를 들어, 분비된) 시토카인 또는 시토카인의 패널, 및/또는 특정한 세포 유형의 시그너쳐/프로파일로서의 역할을 하는 특정 유전자 마커의 mRNA 발현을 포함한다. 예를 들어, Th17/Treg 비 1은 평가될 조직 또는 샘플 내에 각각의 세포 유형이 동일한 또는 동등한 수로 존재한다는 것을 의미한다. Th17/Treg 비 2는 조직 또는 샘플 내에 Treg 세포와 비교하여 Th17 세포가 대략 2배의 수로 존재한다는 것을 의미한다. 상승된 Th17/Treg 비는 Th17 세포의 증가된 수, Treg 세포의 감소된 수 또는 그의 조합으로부터 일어날 수 있다.
치료 범위: 용어 "치료 범위"는 대상체에서 유의한 / 관찰가능한 / 허용되지 않는 유해 효과를 유발하지 않으면서 (예를 들어, 허용되거나 또는 내약성 있는 유해 효과 내에서) 치료 반응을 생성하는 용량 / 농도의 범위를 지칭한다. 치료 범위는 최소 유효 농도 (MEC) 대 최소 독성 농도 (MTC) 사이의 비로서 계산될 수 있다. 예시하자면, 10 mg/kg에서 생체내 효능을 달성하고 100 mg/kg에서 내약성 또는 허용되는 독성을 나타내는 TGFβ1 억제제는 적어도 10배 (예를 들어, 10x)의 치료 범위를 제공한다. 대조적으로, 10 mg/kg에서 효과적이지만 5 mg/kg에서 유해 효과를 유발하는 TGFβ의 범-억제제는 "용량-제한 독성"을 갖는 것으로 언급된다. 예를 들어, 본 출원인은 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 항체가 약 <3 내지 30 mg/kg/주 범위의 투여량에서 효과적이고, 전임상 모델, 예컨대 래트에서 4주 동안 적어도 100 mg/kg/주에서 TGFβ의 범-억제와 연관된 관찰가능한 독성이 없다는 것을 발견하였다. 이에 기초하여, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 항체는 최소 3.3배 내지 최대 33배의 치료 범위를 나타낸다.
독성: 본원에 사용된 용어 "독성" 또는 "독성들"은 환자에게 투여되는 요법과 연관된 환자에서의 원치않는 생체내 효과, 예컨대 바람직하지 않은 부작용 및 유해 사건을 지칭한다. "내약성"은 독성으로 인해 요법을 중단하지 않으면서 (즉, 독성의 허용되는 수준), 환자에 의해 합리적으로 내약성이 있을 수 있는, 요법 또는 치료 요법과 연관된 독성의 수준을 지칭한다. 전형적으로, 독성/독성학 연구는 약물 후보 (예를 들어, 모노클로날 항체 요법)의 안전성 프로파일을 평가하는 임상 개발 전에 1종 이상의 전임상 모델에서 수행된다. 독성/독성학 연구는 시험 물품의 "무 관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)" 및 "최대 내약 용량 (MTD)"을 결정하는 것을 도울 수 있으며, 이에 기초하여 치료 범위가 추론될 수 있다. 바람직하게는, 특정한 개입에 감수성인 것으로 나타난 종이 안전성/독성 연구가 수행될 전임상 동물 모델로서 선택될 것이다. TGFβ 억제의 경우에, 적합한 종은 래트, 개 및 시노를 포함한다. 마우스는 TGFβ의 약리학적 억제에 덜 감수성인 것으로 보고되고, 특정 연구가 마우스에서 TGFβ의 범-억제로 관찰된 독성을 보고하기도 하지만, 인간을 포함한 다른 종에서 잠재적으로 위험한 독성을 밝혀내지 못할 수 있다. 예시하자면, 래트에서 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 항체에 대한 NOAEL은 평가된 최고 용량 (100 mg/kg)이었으며, 이는 MTD가 4-주 독성학 연구에 기초하여 1주에 >100 mg/kg이라는 것을 시사한다.
치료하다/치료: 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 대상체에서 장애 또는 다른 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 치유적 치료, 예방적 치료 및 적용을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 광범위하게 다음을 의미하는 것으로 의도된다: 예를 들어 신체의 면역을 증진시키거나 부스팅함으로써 환자에서 치료 이익을 유발하는 것; 면역 억제를 감소시키거나 역전시키는 것; 신체로부터 유해 세포 또는 물질을 감소시키거나, 제거하거나, 근절시키는 것; 질환 부담 (예를 들어, 종양 부담)을 감소시키는 것; 재발생 또는 재발을 예방하는 것; 불응성 기간을 연장시키고/거나 달리 생존을 개선시키는 것. 치료는 장애의 완전한 치유를 요구하지 않고, 증상 또는 기저 위험 인자를 감소시키는 실시양태를 포괄한다. 조합 요법과 관련하여, 상기 용어는 또한 i) 제2 치료제가 제1 치료제의 유효 투여량을 감소시켜 부작용을 감소시키고 내약성을 증가시킬 수 있다는 것; ii) 제2 요법이 환자를 제1 요법에 보다 반응성이게 할 수 있다는 것; 및/또는 iii) 상가적 또는 상승작용적 임상 이익을 가져올 수 있다는 것을 지칭할 수 있다.
가변 영역: 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 전형적으로 중쇄에 대략 아미노-말단 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에 약 100 내지 110개의 아미노 말단 아미노산을 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체들 사이에서도 아미노산 서열이 광범위하게 상이하다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 특정한 항체의 그의 표적에 대한 특이성을 결정한다.
TGFβ1
포유동물에서, 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ) 슈퍼패밀리는 적어도 33개의 유전자 생성물로 구성된다. 이들은 골 형태발생 단백질 (BMP), 액티빈, 성장 및 분화 인자 (GDF), 및 TGFβ 패밀리의 3종의 이소형: TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 포함한다. TGFβ는 다양한 과정, 예컨대 세포 증식의 억제, 세포외 매트릭스 (ECM) 재형성 및 면역 항상성에서 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. T 세포 항상성을 위한 TGFβ1의 중요성은 TGFβ1-/- 마우스가 대량 면역 활성화로 인한 다기관 부전에 굴복하여 3-4주만 생존한다는 관찰에 의해 입증된다 (Kulkarni, A.B., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): p. 770-4; Shull, M.M., et al., Nature, 1992. 359(6397): p. 693-9). TGFβ2 및 TGFβ3의 역할은 덜 명확하다. 3종의 TGFβ 이소형이 별개의 시간적 및 공간적 발현 패턴을 갖지만, 이들은 동일한 수용체인 TGFβRI 및 TGFβRII를 통해 신호를 전달하며, 일부 경우에, 예를 들어 TGFβ2 신호전달의 경우에는, 유형 III 수용체, 예컨대 베타글리칸이 요구되기도 한다 (Feng, X.H. and R. Derynck, Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. 21: p. 659-93; Massague, J., Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 753-91). TGFβRI/II의 리간드-유도된 올리고머화는 SMAD 전사 인자의 인산화를 촉발시켜, 표적 유전자, 예컨대 Col1a1, Col3a1, ACTA2 및 SERPINE1의 전사를 유발한다 (Massague, J., J. Seoane, and D. Wotton, Genes Dev, 2005. 19(23): p. 2783-810). SMAD-비의존성 TGFβ 신호전달 경로는 또한, 예를 들어 마르팡 마우스의 암 또는 대동맥 병변에서 기재되었다 (Derynck, R. and Y.E. Zhang, Nature, 2003. 425(6958): p. 577-84; Holm, T.M., et al., Science, 2011. 332(6027): p. 358-61).
인간에서의 TGFβ 경로의 생물학적 중요성은 유전 질환에 의해 검증되었다. 카무라티-엥겔만병은 TGFB1 유전자 내의 상염색체 우성 돌연변이로 인해 골 이형성증을 유발하여, TGFβ1 신호전달의 구성적 활성화로 이어진다 (Janssens, K., et al., J Med Genet, 2006. 43(1): p. 1-11). 로이스/디에츠 증후군을 갖는 환자는 TGFβ 신호전달 경로의 성분에 상염색체 우성 돌연변이를 보유하며, 이는 대동맥류, 양안과다격리증 및 이분구개수를 유발한다 (Van Laer, L., H. Dietz, and B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: p. 95-105). TGFβ 경로 조절이상이 다수의 질환에 연루됨에 따라, TGFβ 경로를 표적화하는 여러 약물이 개발되고 환자에서 시험되었으나, 성공은 제한적이었다. 지금까지 기재된 대부분의 TGFβ 억제제는 하기에 간략하게 요약된 바와 같이 이소형 특이성이 결여되어 있다.
TGFβ의 모든 3종의 이소형에 결합하고 이를 억제하는 인간화 모노클로날 항체인 프레솔리무맙은 초점성 분절성 사구체경화증, 악성 흑색종, 신세포 암종 및 전신 경화증을 갖는 환자에서 임상 시험되었다 (Rice, L.M., et al., J Clin Invest, 2015. 125(7): p. 2795-807; Trachtman, H., et al., Kidney Int, 2011. 79(11): p. 1236-43; Morris, J.C., et al., PLoS One, 2014. 9(3): p. e90353). 추가의 회사가 TGFβ 이소형에 대한 다양한 정도의 선택성을 갖는, TGFβ 성장 인자에 대한 모노클로날 항체를 개발하였다. 이러한 작용제는 TGFβ1 이외의 다른 TGFβ 패밀리 구성원에 대한 잔류 활성을 통해 생체내 독성을 도출할 가능성이 있다. 이러한 이소형 특이성의 결여는 이소형들 사이의 높은 정도의 서열 동일성으로 인한 것일 수 있다.
TGFβ 경로를 표적화하기 위한 다른 접근법은 액셀레론(Acceleron)으로부터의 가용성 TGFβRII-Fc 리간드 트랩인 ACE-1332 (Yung, L.M., et al., A Am J Respir Crit Care Med, 2016. 194(9): p. 1140-1151), 또는 ALK5 키나제의 소분자 억제제, 예컨대 일라이 릴리(Eli Lilly)의 갈루니세르팁을 포함한다. ACE-1332는 TGFβ1 및 TGFβ3에 동일하게 높은 친화도로 결합하고 (Yung, L.M., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2016. 194(9): p. 1140-1151), ALK5 억제제는 TGFR1을 통해 신호를 전달하는 모든 성장 인자의 활성을 차단한다. ALK5 억제제를 사용한 전임상 연구에서 상당한 독성이 발견되었고 (Anderton, M.J., et al., Toxicol Pathol, 2011. 39(6): p. 916-24; Stauber, A., et al., Clinical Toxicology, 2014. 4(3): p. 1-10), 유해 사건을 감소시키면서 효능을 유지하는데 정교한 임상 투여 계획이 요구된다 (Herbertz, S., et al., Drug Des Devel Ther, 2015. 9: p. 4479-99). 사실상, TGFβ 신호전달 특이성 및 공지된 TGFβ 억제제에서 관찰된 독성에 대한 그의 가능한 효과의 의문은 TGFβ를 차단하려고 시도한 후보 약물의 대부분 (모두는 아님)에서 제기되지 않았다. 예를 들어, 어느 정도의 독성이 TGFβ2 및/또는 TGFβ3에 비해 TGFβ1의 억제로 인한 것인지가 다루어지지 않았다. 유사하게, TGFβ 신호전달을 길항하는 방식을 설계 또는 개발함에 있어서 TGFβ 활성화 방식은 고려되지 않았다.
TGFβ1의 활성화 메카니즘에 대한 최근의 구조적 통찰 (Shi, M., et al., Nature, 2011. 474(7351): p. 343-9)은 TGFβ 억제에 대한 보다 구체적인 접근법을 가능하게 하였다 (예를 들어, PCT/US2017/21972 참조, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 다른 시토카인과 달리, TGFβ 슈퍼패밀리 구성원은 활성 성장 인자로서 분비되는 것이 아니라, N-말단 프로도메인 및 C-말단 성장 인자 도메인으로 이루어진 이량체 전구단백질로서 분비된다. 푸린 프로테아제에 의한 프로TGFβ1의 절단은 동종이량체 성장 인자 도메인을, 잠복성 연관 펩티드 (LAP)로도 지칭되는 그의 프로도메인으로부터 분리한다. 그러나, 성장 인자 및 LAP는 비공유적으로 회합된 채로 남아 잠복 복합체를 형성하며, 이는 그의 수용체에 결합하여 신호전달을 유도할 수 없다. 번역 동안, 소형 잠복 복합체 (SLC)로도 불리는 잠복 TGFβ1은 디술피드 가교를 통해 "제시 분자"에 연결되어 대형 잠복 복합체 (LLC)를 형성한다. 이들 분자는 프로TGFβ1이 특이적 세포 또는 조직 콘텍스트에서 제시되도록 한다. 잠복 TGFβ1의 N-말단 근처의 2개의 시스테인은 제시 분자 상에 적절하게 위치한 시스테인에 연결된다. 제시 분자의 정체는 잠복 TGFβ1을 생산하는 환경 및 세포 유형에 좌우된다. 예를 들어, 섬유모세포는 잠복 TGFβ-결합 단백질 (LTBP)에 테더링된 잠복 TGFβ1을 분비하고, 이는 이어서 세포외 매트릭스 (ECM) 내의 단백질 (즉, 피브로넥틴, 피브릴린-1)과 회합하여 잠복 TGFβ를 ECM에 연결한다 (Robertson et al. Matrix Biol 47: 44-53 (2015)) (도 2a). 활성화된 조절 T 세포의 표면 상에서 잠복 TGFβ1은 막횡단 단백질 GARP (당단백질-A 반복 우세형 단백질 (GARP))에 공유 연결되고, GARP와 밀접하게 관련된 단백질인 LRRC33 (류신-풍부 반복부-함유 단백질 33)은 단핵구, 대식세포 및 소교세포의 표면 상에서 TGFβ1에 대한 제시 분자로서 작용한다 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): p. 1129-39 및 T.A. Springer, Int. BMP Conference 2016).
다수의 연구가 TGFβ1 활성화의 메카니즘을 밝혀냈다. 3종의 인테그린인 αVβ6, αVβ8 및 αVβ1은 잠복 TGFβ1의 주요 활성화제인 것으로 입증되었다 (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(288): p. 288ra79; Travis, M.A. and D. Sheppard, Annu Rev Immunol, 2014. 32: p. 51-82; Munger, J.S., et al., Cell, 1999. 96(3): p. 319-28). αV 인테그린은 TGFβ1 및 TGFβ1 LAP에 존재하는 RGD 서열에 높은 친화도로 결합한다 (Dong, X., et al., Nat Struct Mol Biol, 2014. 21(12): p. 1091-6). 인테그린 결합을 방지하지만 분비는 방지하지 않는, TGFβ1 RGD 부위 내의 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 마우스는 TGFβ1-/- 마우스로 표현형모사된다 (Yang, Z., et al., J Cell Biol, 2007. 176(6): p. 787-93). β6 및 β8 인테그린 둘 다가 결여된 마우스는 다기관 염증 및 구개열을 포함한, TGFβ1 및 TGFβ3 녹아웃 마우스의 모든 본질적인 표현형을 재현하여, 발생 및 항상성에서 TGFβ1 활성화에 대한 이들 2종의 인테그린의 본질적인 역할을 확인시켜 준다 (Aluwihare, P., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 2): p. 227-32). 잠복 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화에 대한 핵심은 제시 분자에 대한 공유 테더이고; 돌연변이유발에 의한 GARP와 TGFβ1 LAP 사이의 디술피드 결합의 파괴는 복합체 형성을 손상시키지는 않지만, αVβ6에 의한 TGFβ1 활성화를 완전히 폐지한다 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): p. 1129-39). 잠복 TGFβ1의 최근 구조는 인테그린이 어떻게 잠복 복합체로부터의 활성 TGFβ1의 방출을 가능하게 하는지를 조명한다: 잠복 TGFβ1의 그의 제시 분자에 대한 공유 연결은 잠복 TGFβ1을 LTBP를 통해 ECM에, 또는 GARP 또는 LRRC33을 통해 세포골격에 앵커링시킨다. RGD 서열에 대한 인테그린 결합은 LAP 구조의 힘-의존성 변화를 유발하여, 활성 TGFβ1이 방출되고 근처 수용체에 결합하도록 한다 (Shi, M., et al., Nature, 2011. 474(7351): p. 343-9). 질환에서의 인테그린-의존성 TGFβ1 활성화의 중요성이 또한 잘 검증되어 있다. αVβ1의 소분자 억제제는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 및 사염화탄소-유도된 간 섬유증을 막고 (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(288): p. 288ra79), 항체에 의한 αVβ6 차단 또는 인테그린 β6 발현의 상실은 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 및 방사선-유도된 섬유증을 억제한다 (Munger, J.S., et al., Cell, 1999. 96(3): p. 319-28; Horan, G.S., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(1): p. 56-65). 인테그린에 추가로, 트롬보스폰딘-1 및 프로테아제, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 카텝신 D 또는 칼리크레인에 의한 활성화를 포함한 TGFβ1 활성화의 다른 메카니즘이 연루되었다. 그러나, 이들 연구의 대다수는 정제된 단백질을 사용하여 시험관내 수행되었고; 생체내 연구로부터의 이들 분자의 역할에 대한 증거는 더 적다. 트롬보스폰딘-1의 녹아웃은 일부 조직에서 TGFβ1-/- 표현형의 일부 측면을 재현하지만, TGFβ-의존성인 것으로 공지되어 있는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증에서는 보호성이지 않다 (Ezzie, M.E., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2011. 44(4): p. 556-61). 추가적으로, 후보 프로테아제의 녹아웃은 TGFβ1 표현형을 유발하지 않았다 (Worthington, J.J., J.E. Klementowicz, and M.A. Travis, Trends Biochem Sci, 2011. 36(1): p. 47-54). 이는 중복에 의해 또는 발생 및 항상성보다는 특정 질환에서 중요한 이들 메카니즘에 의해 설명될 수 있다.
TGFβ는 섬유증, 면역-조정 및 암 진행을 포함한 다수의 생물학적 과정에 연루되었다. TGFβ1은 TGFβ 슈퍼패밀리의 단백질 중 최초로 확인된 구성원이었다. TGFβ 슈퍼패밀리의 다른 구성원과 같이, TGFβ1 및 이소형 TGFβ2 및 TGFβ3은 초기에 불활성 전구체 전구단백질 형태 (프로TGFβ로 지칭됨)로서 발현된다. TGFβ 단백질 (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)은 전구단백질 컨버타제 (예를 들어, 푸린)에 의해 단백질분해적으로 절단되어 잠복 형태 (잠복 TGFβ로 지칭됨)를 생성한다. 일부 실시양태에서, 전구단백질 형태 또는 잠복 형태의 TGFβ 단백질 (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)은 "프로/잠복 TGFβ 단백질"로 지칭될 수 있다. TGFβ1은, 예를 들어 GARP (GARP-TGFβ1 복합체를 형성함), LRRC33 (LRRC33-TGFβ1 복합체를 형성함), LTBP1 (LTBP1-TGFβ1 복합체를 형성함) 및/또는 LTBP3 (LTBP3-TGFβ1 복합체를 형성함)을 포함한 다수의 분자와 복합체로 다른 분자에 제시될 수 있다. 이들 복합체에 존재하는 TGFβ1은 잠복 형태 (잠복 TGFβ1) 또는 전구체 형태 (프로TGFβ1)로 존재할 수 있다.
TGF 억제제의 이소형 선택성 및 작용 메카니즘
안전성 관점에서, 이소형에 걸친 TGFβ의 광범위한 억제가 관찰된 독성의 원인일 수 있다는 인식이 점점 증가하고 있으며, 이는 TGFβ 억제제가 지금까지 성공적으로 개발되지 않았다는 사실을 강조한다. 잠재적으로 위험한 유해 효과를 피하기 위해, 다수의 그룹은 최근에 이소형의 하위세트 (모두는 아님)를 표적화하면서 여전히 효능을 보유하는 억제제를 확인하는 것으로 방향을 돌렸다. 그러나, 효능 관점에서, 관련 분야의 지배적인 견해는 TGFβ의 다수의 이소형을 억제하여 치료 효과를 달성하고 이를 수용하는 것이 유리한 것으로 남아있으며, "주의깊은 투여 요법"에 의한 독성 관리가 해결책으로서 제안된다 (Brennan et al. (2018) mAbs, 10:1, 1-17). 이러한 전제와 일치하게, 수많은 그룹이 1종 초과의 이소형을 표적화하는 TGFβ 억제제를 개발하고 있다. 이들은 TGFβ 수용체의 저분자량 길항제, 예를 들어 ALK5 길항제, 예컨대 갈루니세르팁 (LY2157299 1수화물); 모든 3종의 이소형을 억제하는 모노클로날 항체 (예컨대 중화 항체) ("범-억제제" 항체) (예를 들어, WO 2018/134681 참조); 3종의 이소형 중 2종을 우선적으로 억제하는 모노클로날 항체 (예를 들어, TGFβ1/2에 대한 항체 (예를 들어 WO 2016/161410) 및 TGFβ1/3에 대한 항체 (예를 들어 WO 2006/116002)); 및 조작된 분자 (예를 들어, 융합 단백질), 예컨대 리간드 트랩 (예를 들어, WO 2018/029367; WO 2018/129331 및 WO 2018/158727)을 포함한다. 유사하게, 인테그린, 예컨대 αVβ6의 억제제는 또한 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다의 인테그린-의존성 활성화를 차단하고, 따라서 TGFβ 신호전달의 이소형-비-선택적 억제제로서 간주될 수 있다. 추가로, TGFβ1 및 TGFβ2 둘 다에 선택적으로 결합하고 이를 중화시키는 항체 (즉, TGFβ1/2 억제제)의 예는 XOMA 089 (또는 NIS793) 및 변이체를 포함한다 (예를 들어, WO 2016/161410 참조).
이전에, 본 출원인은 TGFβ1 단독의 억제가 심지어 TGFβ1/3 둘 다가 공동-발현되는 종양에서도 체크포인트 억제제 요법에 대해 면역억제 종양을 감작화시키기에 충분하였다는 것을 입증하였다 (PCT/US2019/041373). 유사하게, TGFβ1-선택적 억제제는 면역조직화학에 의해 관찰된 바와 같이, 비록 별개의 세포 유형이긴 하지만, 섬유화 조직에서 TGFβ1/3 이소형 둘 다가 공동-발현되는 마우스 간 섬유증 모델을 포함한 전임상 모델에서 섬유증을 완화시키는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 이제 제시됨). 놀랍게도, TGFβ3의 억제는 섬유화유발 표현형을 촉진하였다. TGFβ3 억제제가 단독으로 사용되는 경우에 섬유증의 악화가 관찰된다. 추가로, TGFβ3 억제제는, TGFβ1-선택적 억제제와 조합되어 사용되는 경우에, 섬유화 간에서의 증가된 콜라겐 축적에 의해 입증된 바와 같이 TGFβ1-선택적 억제제의 항섬유화 효과를 약화시켰다. 이들 결과는 TGFβ3에 대한 억제 효력이 섬유증이 우려되는 상황에서 요법으로 사용되는 TGFβ 억제제의 바람직하지 않은 특색일 수 있다는 가능성을 제기한다.
섬유증 상황을 넘어서, 섬유화유발 표현형 (예를 들어, ECM 내로의 증가된 콜라겐 침착)은 섬유증뿐만 아니라 암 진행의 측면, 예컨대 종양 침습 및 이행과 연관되기 때문에, 이러한 예상외의 발견에 대한 보다 넓은 암시가 존재한다. 예를 들어, 문헌 [Chakravarthy et al. (Nature Communications, (2018) 9:4692. "TGF-β-associated extracellular matrix genes link cancer-associated fibroblasts to immune evasion and immunotherapy failure")]을 참조한다. 다양한 종양 유형의 섬유화 조직 및 기질을 포함한, 조절이상 ECM을 갖는 이환 조직은 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현할 수 있다. 오늘날, 다수의 그룹은 이들 이소형 둘 다를 표적화하는 TGFβ 억제제, 예컨대 리간드 트랩, 중화 항체 및 인테그린 억제제를 개발하기 위해 노력하고 있다. 그러나, 본원에 제시된 발견은 이러한 접근법이 사실상 질환을 악화시킬 (예를 들어, 더 나쁘게 할) 수 있다는 것을 경고한다.
따라서, 본 개시내용은 ECM 조절이상을 수반하는 장애, 예컨대 섬유증 및 암의 치료를 위해, TGFβ3을 특이적으로 표적화하지 않는 TGFβ 억제제가 선택되어야 한다는 교시를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 억제제는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제, 예컨대 LTBP1/3-연관 TGFβ1 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같음)을 선택적으로 표적화하는 억제제이다. 관련 방법은 대상체에서 섬유화 장애의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제를 선택하는 방법을 포함하며, 여기서 방법은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하는 능력에 대한 1종 이상의 후보 억제제의 효력을 시험하는 단계 및 치료 용도를 위해 TGFβ1을 억제하지만 TGFβ3은 억제하지 않는 억제제를 선택하는 단계를 포함한다. 관련 치료 방법은 대상체에게 TGFβ1을 억제하지만 TGFβ3은 억제하지 않는 억제제를 섬유화 장애를 치료하기에 또는 섬유화 장애를 갖거나 섬유화 장애가 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 선택된 억제제는 LTBP1- 및/또는 LTBP3-연관 TGFβ1 신호전달 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같음)을 선택적으로 억제하는 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 섬유화 장애가 발생할 위험이 있는 대상체는 대사 장애, 예컨대 당뇨병, 비만 및 NASH를 앓고 있을 수 있다. 제안된 환자의 하위집단의 배제는 섬유화유발 효과를 촉발, 촉진 또는 악화시킬 위험을 감소시키는 것을 목표로 한다.
상기 다루어진 TGFβ3 억제에 대한 가능한 우려에 추가로, 문헌 [Takahashi et al. (Nat Metab. 2019, 1(2): 291-303)]은 최근에 대사를 조절하는데 있어서 TGFβ2의 유익한 역할을 보고하였다. 저자들은 TGFβ2를 운동-유도된 아디포카인으로서 확인하였으며, 이는 시험관내 글루코스 및 지방산 흡수, 뿐만 아니라 생체내 조직 글루코스 흡수를 자극하고; 비만 마우스에서 대사를 개선시키고; 고 지방 식이-유도된 염증을 감소시켰다. 더욱이, 저자들은 운동 동안 근육으로부터 방출된 대사물인 락테이트가 인간 지방세포에서 TGFβ2 발현을 자극하였으며, 락테이트-저하제가 순환 TGFβ2 수준을 감소시키고, 운동-자극된 글루코스 내성의 개선을 감소시켰다는 것을 관찰하였다. 이들 관찰은 TGFβ2 이소형에 대한 억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제의 치료 용도가 적어도 대사 측면에서 유해할 수 있다는 것을 시사한다.
특정한 이론에 얽매이지는 않지만, 대사 질환, 예컨대 NASH와 연관된 간 섬유증의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제로서 TGFβ1-선택적 억제제를 선택하는 것이 유리한 것으로 고려된다. 바람직한 실시양태에서, 대사 질환의 치료에 사용하기 위해 선택된 TGFβ1-선택적 억제제, 예컨대 본원에 개시된 항체 및 단편은 LTBP1/3-연관 TGFβ1을 선택적으로 억제한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서의 대사 질환의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제를 포함하며, 여기서 치료는 TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2는 억제하지 않는 TGFβ 억제제의 선택 (임의로 여기서 억제제는 TGFβ1-선택적임) 및 대사 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 억제제의 투여를 포함한다. 대사 질환은 임의로 비만 및/또는 제2형 당뇨병을 동반한, 간 질환, 예컨대 간 섬유증, NASH, NAFLD일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 매트릭스-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1)을 선택적으로 표적화하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 본원에 개시된 것이다.
바람직한 실시양태에서, 섬유화 장애의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제는 생체내 매트릭스-연관 TGFβ1-함유 잠복 복합체를 표적화할 수 있는 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 (예컨대 본원에 개시된 낮은 kOFF 또는 긴 t½을 갖는 신규 항체)이다.
본 개시내용의 항체는 TGFβ1 활성화의 단계를 방지함으로써 작용한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 TGFβ1의 인테그린-의존성 (예를 들어, 기계적 또는 힘-유도된) 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 또는 프로테아제-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 후자는 인테그린-비의존성 방식으로 TGFβ1 활성화 단계를 억제하는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 활성화 방식과 무관하게 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있으며, 예를 들어 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 프로테아제-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다. TGFβ1을 활성화시킬 수 있는 프로테아제의 비제한적 예는 세린 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 트롬빈, 뿐만 아니라 아연 메탈로프로테아제 (MMP 패밀리), 예컨대 MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13 및 ADAM 프로테아제 (예를 들어, ADAM10 및 ADAM17)를 포함한다. 칼리크레인은 혈장-칼리크레인 및 조직 칼리크레인, 예컨대 KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14 및 KLK15를 포함한다.
잠복 TGFβ-결합 단백질 (LTBP)
포유동물에서, 4종의 공지된 LTBP인 LTBP1-4가 존재하며, 이들은 각각 다수의 스플라이스 변이체를 갖는다 (Robertson, I.B., et al., Matrix Biol, 2015. 47: p. 44-53). LTBP2는 잠복 TGFβ와 회합하지 않는 유일한 LTBP이다 (Saharinen, J. and J. Keski-Oja, Mol Biol Cell, 2000. 11(8): p. 2691-704). LTBP1 또는 LTBP3과 잠복 TGFβ1 사이의 회합이 잘 검증되어 있지만, TGFβ 제시에 있어서 LTBP4의 역할은 덜 명확하다. LTBP4 및 잠복 TGFβ1을 갖는 복합체는, 잠재적으로 LTBP4의 TGFβ-결합 도메인 내의 여러 음으로 하전된 잔기의 부재로 인해, 훨씬 덜 효율적으로 형성되는 것으로 보인다 (Saharinen, J. and J. Keski-Oja, Mol Biol Cell, 2000. 11(8): p. 2691-704; Chen, Y., et al., J Mol Biol, 2005. 345(1): p. 175-86). LTBP4S-/- 마우스 및 LTBP4에 널 돌연변이를 갖는 어반-리프킨-데이비스 증후군 환자 둘 다는 파괴된 탄성 섬유 조립을 앓고 있다 (Urban, Z., et al., Am J Hum Genet, 2009. 85(5): p. 593-605; Dabovic, B., et al., J Cell Physiol, 2015. 230(1): p. 226-36). 추가적으로, LTBP4S-/- 마우스는 폐 중격형성 결손 및 탄력섬유생성(elastogenesis) 결손을 갖지만, 잠복 TGFβ1과 복합체를 형성할 수 없는 LTBP4를 갖는 트랜스제닉 마우스는 어떠한 명백한 표현형도 갖지 않는다 (Dabovic, B., et al., J Cell Physiol, 2015. 230(1): p. 226-36). LTBP4가 제시 분자로서 기능함으로써 잠복 TGFβ1의 조절에 직접적으로 수반되는지 여부는 불명확하며; LTBP4는 대신에 ECM에서의 탄성 원섬유의 적절한 형성에 요구될 수 있고, 그의 상실은 ECM에서의 결손을 통해 잠복 TGFβ1 활성화에 간접적으로 영향을 미친다.
한 측면에서, 본 발명은 TGFβ 전구단백질 및 LTBP 단백질 (예를 들어, LTBP1 또는 LTBP3)을 함유하는 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 이뮤노글로불린, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ 단백질은 TGFβ1이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 결합 분자는 프로/잠복 TGFβ1 및 LTBP1 또는 LTBP3을 함유하는 복합체에 선택적으로 결합한다. 이러한 결합 분자는 TGFβ1 활성이 콘텍스트-의존성 방식으로, 즉 다른 제시 분자 (예를 들어, GARP 및/또는 LRRC33)와 복합체화된 TGFβ1의 활성은 조정하지 않으면서 LTPB 단백질의 콘텍스트에서의 TGFβ1을 조정함으로써 선택적으로 조정되도록 할 수 있다.
LTBP-매개 TGFβ 활성화를 선택적으로 억제하는 항체
본 발명은 매트릭스- 또는 ECM-연관 TGFβ 활성을 선택적으로 표적화하는 신규 TGFβ 억제제를 제공한다. 보다 구체적으로, 이러한 억제제는 ECM 환경 내 잠복 형태의 TGFβ1 (예를 들어, 프로TGFβ1 복합체)에 특이적으로 결합하고 그 함요에서 복합체로부터 성숙 성장 인자의 방출을 방지하는 TGFβ1 활성화의 이소형-특이적, 콘텍스트-선택적 억제제를 포함한다. 이러한 매트릭스-표적화 억제제는 이들이 ECM 제시 분자, 즉 LTBP1 및/또는 LTBP3과 회합된 프로TGFβ1에 선택적으로 결합한다는 점에서 콘텍스트-특이적이다. 따라서, LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 존재하는 에피토프인 반면 GARP-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에는 존재하지 않는 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체 및 그의 단편이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 옥텟에서 각각 < 5 nM의 친화도 (측정된 KD 값)로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 옥텟에서 각각 < 5 nM의 친화도 (측정된 KD 값)로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-프로TGFβ1 둘 다에 결합한다. 다른 한편으로는, 이들 콘텍스트-특이적 항체는 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 어떠한 검출가능한 결합도 나타내지 않는다. 바람직하게는, 이러한 항체 또는 단편은 각각의 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 1 nM 미만의 KD로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제는 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다. 어느 것도 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 임의의 검출가능한 결합을 나타내지 않는다.
관련 기술분야는, 예를 들어 항체-항원 상호작용 (예를 들어, 결합 동역학)을 측정하는데 사용될 수 있는 BLI-기반 검정, 예컨대 옥텟 및 SPR-기반 검정, 예컨대 비아코어를 포함한 적합한 시험관내 결합 검정에 친숙하다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들과 관련하여 "결합 부재"는 특정한 검정에 의한 검출가능한 결합이 부재한다는 것을 지칭할 수 있으며, 예를 들어 결합 (존재한다면)은 검정의 민감도 미만이다. 일부 실시양태에서, "결합 부재"는 특정한 검정 시스템에 의해 측정시 의미있는 것으로 간주되는데 요구되는 최소 수준을 정의하는 컷오프에 의해 설정된, "의미있는 결합 부재"를 지칭할 수 있다. 예를 들어, BLI (옥텟) 검정에서, 미리 결정된 분석물 (예를 들어, 표적 항원) 농도 (예를 들어, 100 nM, 200 nM 등)에서 측정된 0.1 nm의 광학 이동은 의미있는 결합을 나타낼 수 있으며, 그 미만에서는 결합이 부재하는 것으로 간주될 수 있다 (예를 들어, 실시예 9 참조). 유사하게, 전형적인 SPR (비아코어) 검정에서, 컷오프 수준은 0.2 RU (공명 단위)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 0 nM 항체에서의 신호 (예를 들어, 배경 잡음)는 더 높은 농도에서 수득된 모든 센서그램으로부터 차감된다. 이들 조건 하에 SPR (비아코어)을 사용시, 0.2 RU가 적합한 컷오프일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제는 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않으면서 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제는 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 BLI 또는 SPR에 의해 결정된 바와 같다. 일부 실시양태에서, KD는 SPR에 의해 결정된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제는 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않으면서 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제는 동일한 검정 조건 하에 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 BLI 또는 SPR에 의해 결정된 바와 같다. 일부 실시양태에서, KD는 SPR에 의해 결정된 바와 같다.
본 발명은 바람직한 항체 (예를 들어, 이뮤노글로불린 및 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, 뿐만 아니라 이러한 단편이 혼입된 조작된 구축물)가 그의 표적/항원 (예를 들어, 인간 LTBP1-프로TGFβ1, 인간 LTBP3-TGFβ1)에 결합되면 항원으로부터 천천히 해리된다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 발명의 신규 항체는 그의 높은 전체 친화도 (예컨대 5 nM 이하의 KD) 뿐만 아니라 특히 그의 낮은 해리율로 선택된다. 본 개시내용에 따르면, 이러한 항체는 BLI에 의해 측정시 (예를 들어, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 결합하는 경우), ≤ 5 x 10-4 (1/s)의 해리율을 갖는다. 항체 또는 항원-결합 단편의 이러한 ≤ 5 x 10-4 (1/s)의 해리율은 1가 해리율 또는 2가 해리율일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1로부터, 바람직하게는 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및 인간 LTBP3-TGFβ1 둘 다에 대해, SPR에 의해 측정시 적어도 45분 (예를 들어, ≥ 45, 60, 75, 90분)의 1가 절반 해리 시간 (t½)으로 천천히 해리된다. 다른 한편으로는, 인간 GARP-프로TGFβ1 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 대한 결합이 검출가능할 경우, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1 및/또는 인간 LRRC33-TGFβ1 복합체(들), 특히 인간 GARP-프로TGFβ1로부터 신속하게 해리된다. 일부 실시양태에서, 항체는 SPR에 의해 측정시 5분 미만의 t½로 인간 GARP-프로TGFβ1로부터 해리된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 단편은 종 교차-반응성을 나타내어 이들이 뮤린 대응물에 동등한 친화도로 결합한다.
이들 복합체에 존재하는 TGFβ1은 잠복 형태 (잠복 TGFβ1) 또는 전구체 형태 (프로TGFβ1)로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 억제제는 LTBP1 단독 (예를 들어, TGFβ1과 복합체화되지 않은 경우)에는 유의하게 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 LTBP3 단독 (예를 들어, TGFβ1과 복합체화되지 않은 경우)에는 유의하게 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1 단독 (예를 들어, LTBP1 또는 LTBP3과 복합체화되지 않은 프로 또는 잠복 TGFβ1 또는 성숙 TGFβ1)에는 유의하게 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제는 TGFβ1 및 또 다른 제시 분자를 함유하는 복합체, 예를 들어 GARP-TGFβ1 복합체 (예를 들어, 프로- 또는 잠복 TGFβ1에 복합체화된 GARP) 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체 (예를 들어, 프로- 또는 잠복 TGFβ1에 복합체화된 LRRC33)에는 유의하게 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, LTBP1/3-TGFβ1에 선택적으로 결합하는 억제제는 하기: LTBP1 단독, TGFβ1 단독, GARP-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체 중 1종 이상 (예를 들어, 2종 이상, 3종 이상 또는 모든 4종)에는 유의하게 결합하지 않는다. 추가로, 일부 실시양태에서, 억제제는 LTBP3 단독에는 유의하게 결합하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "억제제"는 TGFβ1 신호전달을 차단 또는 길항할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 이러한 작용제는 TGFβ1의 소분자 길항제 및 TGFβ1의 생물학적 길항제 (예를 들어, 단백질 단편 및 항체)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 항체 (그의 단편, 예컨대, 예를 들어 미국 특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 및 6,696,245에 기재된 바와 같은 도메인 항체 (dAb) 포함), 소분자 억제제, 애드넥틴, 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 베르사바디 또는 유전자 요법일 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 억제제의 용도는 또한 항체 모방체, 예컨대 모노바디 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 모노바디는 전형적으로 분자 스캐폴드로서 피브로넥틴 유형 III 도메인 (FN3)을 사용하는 합성 결합 단백질이다. 모노바디는 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인에 기초하는 애드넥틴(Adnectin)™을 포함한다.
일부 측면에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 GARP-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체 상에는 존재하지 않는, LTBP1/3-TGFβ1 복합체 상에 존재하는 에피토프에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1/3 및 TGFβ1이 복합체를 형성하는 경우에 발생하는 LTBP1/3 및/또는 TGFβ1에서의 입체형태적 변화로 인해 이용가능하다. 이러한 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1/3 또는 TGFβ1이 복합체로 회합되지 않는 경우에는 이러한 단백질에 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 에피토프는 TGFβ1이 LTBP1 또는 LTBP3과의 복합체로 존재하는 경우에 TGFβ1 상에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1이 TGFβ1과의 복합체로 존재하는 경우에 LTBP1 상에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP3이 TGFβ1과의 복합체로 존재하는 경우에 LTBP3 상에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1 및 TGFβ1 둘 다로부터의 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP3 및 TGFβ1 둘 다로부터의 잔기를 포함한다.
놀랍게도, 본원에 개시된 LTBP1/3 복합체-선택적 항체 중 일부 (예를 들어, Ab14, Ab20, Ab21-23, Ab17 및 Ab24-29)는 제시 분자 (예를 들어, LTBP1/3)의 부재 하에 소형 잠복 복합체 (프로TGFβ1 C4S)에 결합할 수 있지만 콘텍스트-선택성을 발휘한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 발견은 항체 (및 그의 변이체 또는 교차-경쟁 항체)가 LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체 및 프로TGFβ1 단독에서 이용가능하나 LRRC-유형의 제시 분자 (GARP 또는 LRRC33)가 존재하는 경우에는 이용가능하지 않은 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 시사한다. 에피토프는 전적으로 잠복 TGFβ1 상에 있을 수 있지만, GARP 또는 LRRC33이 복합체화된 경우에는 (직접적으로 또는 간접적으로) 폐쇄된다.
대안적으로, 본 개시내용에 따른 LTBP-선택적 억제제는 LTBP1 또는 LTBP3의 1개 이상의 아미노산 잔기 및 프로TGFβ1의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 조합 에피토프에 결합할 수 있으며, 이는 GARP/LRRC33-결합된 복합체에 비해 LTBP-결합된 복합체에 대한 콘텍스트-선택성을 부여한다. 이들 실시양태에서, 이소형 (TGFβ1) 뿐만 아니라 콘텍스트 (ECM)에 대한 선택성은 항원 복합체의 둘 다의 요소로부터의 조합된 기여에 기인한다.
일부 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 이소형에 대해 선택적이다. 이러한 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ2 및/또는 TGFβ3에는 결합하지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하지만, TGFβ2 또는 TGFβ2를 함유하는 복합체에는 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하지만, TGFβ3 또는 TGFβ3을 함유하는 복합체에는 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1이 인테그린에 결합하는 것을 방지하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1의 인테그린-결합 부위를 차폐하지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 TGFβ1 활성을 조정하는 기능적 억제제, 예를 들어 항체를 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 TGFβ1의 기능 또는 활성을 억제하는 억제 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체로부터의 TGFβ1의 활성화 (방출)를 억제한다. 본 개시내용은, 예시적 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 "콘텍스트-특이적" 또는 "콘텍스트-선택적" 억제제를 제공한다. 이러한 억제제는 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 결합하고, LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시된 TGFβ1의 활성화를 억제할 수 있으며, GARP 및/또는 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ1의 활성화는 억제하지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하지만, GARP-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출은 억제하지 않는다. LTBP, GARP 및 LRRC33의 차등 국재화로 인해, 본 발명에 의해 제공된 TGFβ1의 콘텍스트-특이적 억제제는 생체내 TGFβ1 활성의 특정한 하위세트를 차단할 수 있다. 한 실시양태에서, LTBP1/3-TGFβ1을 억제하지만 GARP-TGFβ1 또는 LRRC33-TGFβ1은 억제하지 않는 본원에 제공된 콘텍스트-특이적 항체는 세포외 매트릭스에 국재화된 TGFβ1을 억제하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 항체는 TGFβ1-연관 면역 활성 또는 면역 반응을 조정하지 않으면서 TGFβ1을 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 항체는 조혈 세포와 연관된 TGFβ1 활성을 조정하지 않으면서 세포외 매트릭스와 연관된 TGFβ1 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 콘텍스트-특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같이 GARP 및/또는 LRRC33의 콘텍스트에서의 TGFβ1 활성화가 바람직하지 않은 적용에서 LTBP1/3-연관 TGFβ1 활성을 억제하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, TGFβ1은 자연 발생 포유동물 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 자연 발생 인간 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 인간, 원숭이, 래트 또는 마우스 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TGFβ1 단백질 및 LTBP1 또는 LTBP3을 포함하는 복합체에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 비-자연 발생 TGFβ1 아미노산 서열 (달리 본원에서 비-자연 발생 TGFβ1로 지칭됨)을 포함하는 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합한다. 예를 들어, 비-자연 발생 TGFβ1은 자연 발생 TGFβ1 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 재조합적으로 생성된 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ2 및/또는 TGFβ3, 또는 TGFβ2 및/또는 TGFβ3을 함유하는 단백질 복합체에 결합하지 않는다. 예시적인 TGFβ2 및 TGFβ3 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 10 및 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3 아미노산 서열은 표 1에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 12-23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 아미노산 서열은 표 2에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 24-31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
TGFβ1
LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (서열식별번호: 9)
TGFβ2
SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS (서열식별번호: 10)
TGFβ3
SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS (서열식별번호: 11)
표 1. 예시적인 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 아미노산 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
표 2. 예시적인 비-인간 TGFβ1 아미노산 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 단백질 복합체 (예를 들어, LTBP-TGFβ1 복합체)는 하기: LTBP1, LTBP2, LTBP3 및 LTBP4로부터 선택된 LTBP 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 자연 발생 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 비-자연 발생 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 재조합 LTBP1 단백질은 LTBP1, 그의 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 재조합 LTBP1 단백질은 또한 1종 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열이 프로세싱되거나 절단되었음). 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 포유동물 LTBP1 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트 LTBP1 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 3의 서열식별번호: 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 3의 서열식별번호: 33 또는 서열식별번호: 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 자연 발생 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 비-자연 발생 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 재조합 LTBP3 단백질은 LTBP3, 그의 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열은 프로세싱되거나 절단되었음). 재조합 LTBP3 단백질은 또한 1종 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 포유동물 LTBP3 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트 LTBP3 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 서열식별번호: 36 또는 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
표 3. 예시적인 LTBP 아미노산 서열.
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예시적 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP3-TGFβ1에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 및 GARP 또는 LRRC33을 함유하는 복합체에는 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39에 제시된 서열을 갖는 GARP 단백질에 결합하지 않고, 상기 GARP 단백질을 함유하는 복합체에 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 40 또는 서열식별번호: 41에 제시된 서열을 갖는 GARP 단백질에 결합하지 않고, 상기 GARP 단백질을 함유하는 복합체에 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 42 또는 서열식별번호: 43에 제시된 서열을 갖는 LRRC33 단백질에 결합하지 않고, 상기 LRRC33 단백질을 함유하는 복합체에 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 GARP/LRRC33 키메라, 예를 들어 서열식별번호: 44에 제시된 GARP/LRRC33 키메라에 결합하지 않는다.
표 4 - 예시적인 GARP 및 LRRC33 아미노산 서열.
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Figure pct00017
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또 다른 측면에서, 본 발명은 LTBP1 및/또는 LTBP3의 콘텍스트에서의 TGFβ1 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체, 억제제, 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및/또는 본원에 기재된 제약 조성물을 노출시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 억제제는 LTBP1/3-제시된 프로TGFβ1 잠복 복합체에 선택적으로 결합하는, 세포외 매트릭스-연관 TGFβ1 활성화의 억제제이다. 한 실시양태에서, 억제제는 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화, 예를 들어 GARP-제시된 프로TGFβ1 잠복 복합체의 활성화로부터 유발되는 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화를 억제하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-프로TGFβ1 잠복 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 잠복 복합체에 선택적으로 결합하여, 잠복 복합체로부터의 성숙 TGFβ1 성장 인자의 방출을 조정하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 성숙 TGFβ1 단독 또는 GARP-프로TGFβ1 잠복 복합체에는 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 GARP-프로TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출은 억제하지 않는다.
한 실시양태에서, 방법은 시험관내 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 생체내 수행된다. 한 실시양태에서, LTBP1-프로TGFβ1 복합체 또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체는 세포외 매트릭스에 있다. 세포외 매트릭스는, 예를 들어 피브릴린 및/또는 피브로넥틴을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 RGD 모티프를 포함하는 단백질을 포함한다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 면역 이펙터 세포를 자극하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하고, GARP-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출은 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본 개시내용의 억제제, 예를 들어 항체는 복합체에 비교적 높은 친화도로, 예를 들어 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 그 미만보다 더 낮은 해리 상수 (KD)로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 약 10-8 M, 약 10-9 M, 약 10-10 M, 약 10-11 M, 약 10-12 M 또는 약 10-13 M의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 예를 들어, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 복합체에 5 pM 내지 500 nM, 예를 들어 10 pM 내지 100 nM, 예를 들어 50 pM 내지 50 nM의 친화도로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 약 300 nm 미만, 예를 들어 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 500 pM 이하 또는 약 5 pM 이하의 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 약 1 nm 내지 약 350 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 15 nm 내지 약 250 nm, 약 20 nm 내지 약 200 nm, 약 1 nm, 약 20 nm, 약 25 nm, 약 50 nm, 약 100 nm, 약 150 nm, 약 200 nm, 약 250 nm, 약 300 nm 또는 약 500 pm의 친화도로 결합할 수 있다.
본 개시내용은 또한 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 본원에 기재된 임의의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 복합체에 대한 50 nM 이하 (예를 들어, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 500 pM 이하, 50 pM 이하 또는 5 pM 이하)의 친화도를 갖는다. LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)의 친화도 및 결합 동역학은 바이오센서 기술 (예를 들어, 옥텟 또는 비아코어)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 항체 SR-Ab1과 경쟁하지 않는다.
본 개시내용의 측면은 본원에 제공된 임의의 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체에 관한 것이다. 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는, 제1 항체가 에피토프 (예를 들어, LTBP1-TGFβ1 복합체의 에피토프 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 에피토프)에 제2 항체의 결합과 충분히 유사한 방식으로 결합하여, 제1 항체와 그의 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되도록 하는 것을 의미한다. 제2 항체와 그의 에피토프와의 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 또 다른 방식도 이 경우에 해당될 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 즉, 제2 항체가 제1 항체의 그의 각각의 에피토프에 대한 결합을 억제하지 않으면서 제1 항체가 제2 항체의 그의 에피토프에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 에피토프 또는 리간드의 결합을 동일한 정도로든, 더 큰 정도로든 또는 더 적은 정도로든 검출가능하게 억제하는 경우에, 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 다는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 부분에 대한 결합)과 관계없이, 통상의 기술자는 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 본원에 제공된 방법 및/또는 조성물에 포괄되고 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 개시내용의 측면은 본원에 제공된 바와 같은 임의의 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 표 5에 제시된 1개 이상의 CDR 서열 (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열)을 갖는 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 표 5에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3을 포함하는 중쇄 CDR 서열 및/또는 표 5에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6을 포함하는 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열식별번호: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 본원에 제공된 임의의 항체와 동일한 에피토프에 또는 그 근처에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 에피토프의 15개 이하의 아미노산 잔기 내에 결합하는 경우에 에피토프 근처에 결합한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 본원에 제공된 임의의 항체에 의해 결합되는 에피토프의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 잔기 내에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항원 (예를 들어, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체)에의 결합에 대해 10-6 M 미만의 항체와 단백질 사이의 평형 해리 상수 KD로 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다. 다른 실시양태에서, 항체는 본원에 제공된 임의의 항원에의 결합에 대해 10-11 M 내지 10-6 M 범위의 KD로 경쟁 또는 교차-경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟®에 의해 결정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 표 6에 제시된 바와 같은 Ab42의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열 (예를 들어, 각각 서열식별번호: 318 및 319)을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁한다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁할 수 있다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁할 수 있다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI (예를 들어, 옥텟)에서 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 임의의 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다. 항체는 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체 또는 항원-결합 부분은 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (및 임의로 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합 (예를 들어, 선택적으로 결합)할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 표 6에 제시된 바와 같은 Ab63의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열 (예를 들어, 각각 서열식별번호: 360 및 361)을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁한다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁할 수 있다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁할 수 있다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예를 들어 BLI, 예컨대 옥텟에 의해 결정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI (예를 들어, 옥텟)에서 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 임의의 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다. 항체는 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체 또는 항원-결합 부분은 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (및 임의로 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합 (예를 들어, 선택적으로 결합)할 수 있다.
추가 실시양태에서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체가 200nM의 농도일 경우 BLI 검정 (예를 들어, 옥텟)에서 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 노출시 의미있는 결합을 나타내지 않을 수 있다 (예를 들어, 0.1 유닛 (nm) 초과의 반응을 나타내지 않을 수 있음).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 결합에 대해 경쟁하는 항-TGFβ1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 동일한 에피토프에 결합하는 항-TGFβ1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 항체는 임의의 적합한 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항원이 결합하는 에피토프를 확인하는 것 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]의 챕터 11에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조를 해석하는 것, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하는 많은 적합한 방법이 존재한다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프일 수 있으며, 즉 아미노산의 단일 스트레치에 함유될 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 (1차 구조 선형 서열)에 함유될 필요는 없을 수 있는, 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 TGFβ1이 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체로 존재하는 경우에만 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 의한 결합에 이용가능한 TGFβ1 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1/3-TGFβ1 복합체 상에 존재하고, GARP-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체 상에는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1/3 및 TGFβ1이 복합체를 형성하는 경우에 발생하는 LTBP1/3 및/또는 TGFβ1에서의 입체형태적 변화로 인해 이용가능하다. 이러한 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1/3 또는 TGFβ1이 복합체로 회합되지 않는 경우에는 이러한 단백질에 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 에피토프는 TGFβ1이 LTBP1 또는 LTBP3과의 복합체로 존재하는 경우에 TGFβ1 상에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1이 TGFβ1과의 복합체로 존재하는 경우에 LTBP1 상에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP3이 TGFβ1과의 복합체로 존재하는 경우에 LTBP3 상에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP1 및 TGFβ1 둘 다로부터의 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 LTBP3 및 TGFβ1 둘 다로부터의 잔기를 포함한다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)가 단리 또는 합성되어 (예를 들어, 재조합적으로), 항체와의 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크린에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 표적 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 무작위로 또는 특이적 유전자 구축에 의해 단편화되고, 발현된 항원 단편과 시험될 항체의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 생성된 다음, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어서 방사성 표지된 항원 단편에 대한 항체의 결합이 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용함으로써 또한 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 정의된 라이브러리는 간단한 결합 검정에서 시험 항체에의 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예에서, 항원-결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 에피토프 결합에 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 LTBP1-TGFβ1 복합체 또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 다양한 단편이 밀접하게 관련되지만 항원적으로 별개인 단백질, 예컨대 TGFβ 단백질 패밀리의 또 다른 구성원 (예를 들어, GDF11)으로부터의 서열로 대체 (스와핑)된 표적 항원의 돌연변이체를 사용하여 수행될 수 있다. LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 돌연변이체에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
대안적으로, 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체를 사용하여 항체가 상기 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 경쟁 검정이 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
추가로, 본원에 제공된 임의의 항체와 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체 내의 1개 이상의 잔기의 상호작용은 상용 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 결정 구조가 결정될 수 있고, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체 내의 잔기와 항체 내의 1개 이상의 잔기 사이의 거리가 그에 따라 결정될 수 있다. 이러한 거리에 기초하여, LTBP1/3-TGFβ1 복합체 내의 특정 잔기가 항체 내의 1개 이상의 잔기와 상호작용하는지 여부가 결정될 수 있다. 추가로, 후보 항체의 우선적인 결합을 결정하기 위해 적합한 방법, 예컨대 경쟁 검정 및 표적 돌연변이유발 검정이 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 표 5에 제시된 상보성 결정 영역 (CDR) 중 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5에 제시된 CDR 서열 중 1개 이상을 코딩한다.
표 5. 카바트 넘버링 스킴을 사용하여 결정된 바와 같은 SR-AB2, SR-AB10, SR-AB13, SR-AB22, SR-AB23, SR-AB31, SR-AB34, SR-AB37 및 SR-AB38 내지 SR-AB64의 중쇄 (CDRH) 및 경쇄 (CDRL)의 상보성 결정 영역.
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일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 본 발명의 항체는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 또는 그의 조합을 포함하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다.
본 발명은 또한 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 또는 그의 조합을 포함하는 분자를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인은 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에서 특히 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 또는 이들 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자는 적어도 표 5에 제시된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 측면은 LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하고, 6개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 표 5에 제시된 항체 중 1종 (예를 들어, Ab42)의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 1; CDR-H2: 서열식별번호: 2; CDR-H3: 서열식별번호: 3; CDR-L1: 서열식별번호: 4; CDR-L2: 서열식별번호: 5; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 6으로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 최대 1개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 각각의 CDR에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 표 5에 제시된 항체 SR-AB2에 대해서와 같이), LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 및 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 (예를 들어, SR-AB2)의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 94에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 95에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 96에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 94; CDR-H2: 서열식별번호: 95; CDR-H3: 서열식별번호: 96; CDR-L1: 서열식별번호: 97; CDR-L2: 서열식별번호: 98; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 99로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 최대 1개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 각각의 CDR에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 표 5에 제시된 항체 SR-AB10에 대해서와 같이), LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 94에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열식별번호: 95에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열식별번호: 96에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 및 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 96의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 (예를 들어, SR-AB10)의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 100에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 101에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 102에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 103에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 104에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 100; CDR-H2: 서열식별번호: 101; CDR-H3: 서열식별번호: 102; CDR-L1: 서열식별번호: 103; CDR-L2: 서열식별번호: 104; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 105로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 최대 1개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 각각의 CDR에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 표 5에 제시된 항체 SR-AB13에 대해서와 같이), LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 100에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열식별번호: 101에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열식별번호: 102에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 서열식별번호: 103에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열식별번호: 104에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 및 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 105의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 (예를 들어, SR-AB13)의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 124에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 125에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 126에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 128에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 129에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 124; CDR-H2: 서열식별번호: 125; CDR-H3: 서열식별번호: 126; CDR-L1: 서열식별번호: 127; CDR-L2: 서열식별번호: 128; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 129로부터 선택된 적어도 3개 (임의로 모든 6개)의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 최대 1개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 각각의 CDR에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 표 5에 제시된 항체 SR-AB31에 대해서와 같이), LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 124에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열식별번호: 125에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열식별번호: 126에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열식별번호: 128에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 및 서열식별번호: 129에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 126의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 129의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 125의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 128의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 124의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 127의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 (예를 들어, SR-AB31)의 HCVR 및 LCVR의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 166에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 167에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 168에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 169에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 170에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 171에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 166; CDR-H2: 서열식별번호: 167; CDR-H3: 서열식별번호: 168; CDR-L1: 서열식별번호: 169; CDR-L2: 서열식별번호: 170; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 171로부터 선택된 적어도 3개 (임의로 모든 6개)의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 최대 1개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 각각의 CDR에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 표 5에 제시된 항체 SR-AB42에 대해서와 같이), LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 166에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열식별번호: 167에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열식별번호: 168에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 서열식별번호: 169에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열식별번호: 170에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 및 서열식별번호: 171에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 168의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 171의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 167의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 170의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 166의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 (예를 들어, SR-AB42)의 HCVR 및 LCVR의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 292에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 293에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 294에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 295에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 296에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 297에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 292; CDR-H2: 서열식별번호: 293; CDR-H3: 서열식별번호: 294; CDR-L1: 서열식별번호: 295; CDR-L2: 서열식별번호: 296; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 297로부터 선택된 적어도 3개 (임의로 모든 6개)의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 최대 1개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 각각의 CDR에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서 (예를 들어, 표 5에 제시된 항체 SR-AB63에 대해서와 같이), LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 292에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열식별번호: 293에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열식별번호: 294에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 서열식별번호: 295에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열식별번호: 296에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 및 서열식별번호: 297에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 294의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 297의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 293의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 296의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 292의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 295의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 (예를 들어, SR-AB63)의 HCVR 및 LCVR의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다.
LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고 LTBP1/3의 콘텍스트에서 제시된 성숙 TGFβ의 방출을 억제하는 10종의 추가의 항체 (Ab3-Ab12)를 개발하였다. 표 6은 또한 표 5에서 언급된 항체의 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열에 추가로, 이들 추가의 LTBP 콘텍스트-특이적 항체의 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열을 제공한다.
표 6. LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
본 발명의 측면은 LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하고, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 6에 제시된 가변 영역 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 92 또는 서열식별번호: 106에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 93 또는 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 8에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 74에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 74에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 74에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 75에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 76에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 77에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 76에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 77에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 76에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 77에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 78에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 79에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 78에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 79에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 78에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 79에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 80에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 81에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 80에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 81에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 80에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 81에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 82에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 83에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 82에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 83에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 82에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 83에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 84에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 84에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 84에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 85에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 86에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 87에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 86에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 87에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 86에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 87에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 88에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 88에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 88에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 89에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 90에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 91에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 90에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 91에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 90에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 91에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 92에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 93에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 92에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 93에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 92에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 93에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 106에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 106에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 106에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체는 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 선택적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않을 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 6에 제시된 가변 영역 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일성 수준은 적어도 95% (임의로 적어도 98%)이다.
따라서, 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 318에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 319에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 318에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 319에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 318에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 319에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 360에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 361에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 360에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 361에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 360에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 361에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 서열은 본원에 제공된 임의의 CDR 서열 내에서 달라지지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 서열 변이의 정도 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)는 본원에 제공된 임의의 CDR 서열을 제외한 중쇄 가변 및/또는 경쇄 가변 아미노산 서열 내에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 318에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 319에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 제공된 Ab42의 임의의 CDR 서열 내에서 달라지지 않는다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 360에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 361에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 제공된 Ab63의 임의의 CDR 서열 내에서 달라지지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 표 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 표 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 319에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 319에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 319에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 360에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 361에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 360에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열식별번호: 361에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 360에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 361에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
표 5에 제시된 항체 SR-AB2의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
SR-AB2 - 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAPLGNFDSWGQGTMVTVSS (서열식별번호: 7)
SR-AB2 - 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNHPVVFGGGTKLTVL (서열식별번호: 8)
표 5에 제시된 항체 SR-AB10의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
SR-AB10 - 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFNNYPIHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGINKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 88)
SR-AB10 - 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL (서열식별번호: 89)
표 5에 제시된 항체 SR-AB13의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
SR-AB13 - 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDPSYDSIAGMDVWGQGTTVTVSS (서열식별번호: 106)
SR-AB13 - 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFDFPFTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 107)
표 5에 제시된 항체 SR-AB42의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
SR-AB42 - 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 318)
63 - 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDYDTQGVVFGGGTKLTVL (서열식별번호: 319)
표 5에 제시된 항체 SR-AB63의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
SR-AB63 - 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSATTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGDPSYDSIAGMQVWGQGTTVTVSS (서열식별번호: 360)
SR-AB63 - 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFDWPLTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 361)
일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3과 실질적으로 유사한 1개 이상의 CDR 서열을 갖는다. 예를 들어, 항체는 서열식별번호: 1-6, 서열식별번호: 94-99 또는 서열식별번호: 100-105 중 어느 하나 내의 상응하는 CDR 영역과 비교하여 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 변이를 함유하는, 표 5에 제시된 1개 이상의 CDR 서열 (서열식별번호: 1-6, 서열식별번호: 94-99 또는 서열식별번호: 100-105)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 1; CDR-H2: 서열식별번호: 2; CDR-H3: 서열식별번호: 3; CDR-L1: 서열식별번호: 4; CDR-L2: 서열식별번호: 5; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 6으로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 6개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 94; CDR-H2: 서열식별번호: 95; CDR-H3: 서열식별번호: 96; CDR-L1: 서열식별번호: 97; CDR-L2: 서열식별번호: 98; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 99로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 6개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 100; CDR-H2: 서열식별번호: 101; CDR-H3: 서열식별번호: 102; CDR-L1: 서열식별번호: 103; CDR-L2: 서열식별번호: 104; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 105로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 6개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 166; CDR-H2: 서열식별번호: 167; CDR-H3: 서열식별번호: 168; CDR-L1: 서열식별번호: 169; CDR-L2: 서열식별번호: 170; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 171로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 6개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기: CDR-H1: 서열식별번호: 292; CDR-H2: 서열식별번호: 293; CDR-H3: 서열식별번호: 294; CDR-L1: 서열식별번호: 295; CDR-L2: 서열식별번호: 296; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 297로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 6개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 CDR-H1: 서열식별번호: 1; CDR-H2: 서열식별번호: 2; 및 CDR-H3: 서열식별번호: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR-L1: 서열식별번호: 4; CDR-L2: 서열식별번호: 5; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 CDR-H1: 서열식별번호: 94; CDR-H2: 서열식별번호: 95; 및 CDR-H3: 서열식별번호: 96을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR-L1: 서열식별번호: 97; CDR-L2: 서열식별번호: 98; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 99를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 CDR-H1: 서열식별번호: 100; CDR-H2: 서열식별번호: 101; 및 CDR-H3: 서열식별번호: 102를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR-L1: 서열식별번호: 103; CDR-L2: 서열식별번호: 104; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 105를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 CDR-H1: 서열식별번호: 166; CDR-H2: 서열식별번호: 167; 및 CDR-H3: 서열식별번호: 168을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR-L1: 서열식별번호: 169; CDR-L2: 서열식별번호: 170; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 171을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, CDR 내에 변화가 있는 경우, CDR당 1개 이하의 변화가 있을 수 있다. 모든 6개의 CDR에 걸쳐 2개 이하의 변화가 존재할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 CDR-H1: 서열식별번호: 292; CDR-H2: 서열식별번호: 293; 및 CDR-H3: 서열식별번호: 294를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR-L1: 서열식별번호: 295; CDR-L2: 서열식별번호: 296; 및 CDR-L3: 서열식별번호: 297을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변화 (예를 들어, 2개 이하)를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, CDR 내에 변화가 있는 경우, CDR당 1개 이하의 변화가 있을 수 있다. 모든 6개의 CDR에 걸쳐 2개 이하의 변화가 존재할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 특정한 아미노산 변화를 갖는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본원에 사용된 어구 "아미노산 변화" 또는 "아미노산 잔기의 변화"는 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CDR 및/또는 가변 영역 중 어느 하나를 갖는 아미노산 잔기에 대해 1개 이상의 변화가 존재한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 1개의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 2개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 3개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 4개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 5개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변화는 7개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 1을 포함하며, 단 서열식별번호: 1의 위치 4에서의 트레오닌 잔기가 히스티딘, 리신, 페닐알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 1을 포함하며, 단 서열식별번호: 1의 위치 5에서의 세린 잔기가 류신으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 1을 포함하며, 단 서열식별번호: 1의 위치 9에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 1을 포함하며, 단 (i) 서열식별번호: 1의 위치 4에서의 트레오닌 잔기가 히스티딘, 리신, 페닐알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나; (ii) 서열식별번호: 1의 위치 5에서의 세린 잔기가 류신으로 치환될 수 있고/거나; (iii) 서열식별번호: 1의 위치 9에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H2: 서열식별번호: 2를 포함하며, 단 서열식별번호: 2의 위치 3에서의 세린 잔기가 아스파르테이트 또는 아스파라긴으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H2: 서열식별번호: 2를 포함하며, 단 서열식별번호: 2의 위치 5에서의 티로신 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H2: 서열식별번호: 2를 포함하며, 단 서열식별번호: 2의 위치 6에서의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H2: 서열식별번호: 2를 포함하며, 단 서열식별번호: 2의 위치 8에서의 아스파라긴 잔기가 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 티로신, 아스파르테이트 또는 세린으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H2: 서열식별번호: 2를 포함하며, 단 서열식별번호: 2의 위치 10에서의 아스파라긴 잔기가 아스파르테이트 또는 알라닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H2: 서열식별번호: 2를 포함하며, 단 (i) 서열식별번호: 2의 위치 3에서의 세린 잔기가 아스파르테이트 또는 아스파라긴으로 치환될 수 있고/거나; (ii) 서열식별번호: 2의 위치 5에서의 티로신 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나; (iii) 서열식별번호: 2의 위치 6에서의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환될 수 있고/거나; (iv) 서열식별번호: 2의 위치 8에서의 아스파라긴 잔기가 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 티로신, 아스파르테이트 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나; (v) 서열식별번호: 2의 위치 10에서의 아스파라긴 잔기가 아스파르테이트 또는 알라닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 1, 단
i. 서열식별번호: 1의 위치 4에서의 트레오닌 잔기가 히스티딘, 리신, 페닐알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 1의 위치 5에서의 세린 잔기가 류신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 1의 위치 9에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 2, 단
i. 서열식별번호: 2의 위치 3에서의 세린 잔기가 아스파르테이트 또는 아스파라긴으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 2의 위치 5에서의 티로신 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 2의 위치 6에서의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 2의 위치 8에서의 아스파라긴 잔기가 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 티로신, 아스파르테이트 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 2의 위치 10에서의 아스파라긴 잔기가 아스파르테이트 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 1, 단
i. 서열식별번호: 1의 위치 4에서의 트레오닌 잔기가 히스티딘, 리신, 페닐알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 1의 위치 5에서의 세린 잔기가 류신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 1의 위치 9에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 2, 단
i. 서열식별번호: 2의 위치 3에서의 세린 잔기가 아스파르테이트 또는 아스파라긴으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 2의 위치 5에서의 티로신 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 2의 위치 6에서의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 2의 위치 8에서의 아스파라긴 잔기가 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 티로신, 아스파르테이트 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 2의 위치 10에서의 아스파라긴 잔기가 아스파르테이트 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 3;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 4;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 5; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 CDR-L3: 서열식별번호: 6.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체 또는 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체를 제공하며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 1, 단
i. 서열식별번호: 1의 위치 4에서의 트레오닌 잔기가 히스티딘, 리신, 페닐알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 1의 위치 5에서의 세린 잔기가 류신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 1의 위치 9에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 2, 단
i. 서열식별번호: 2의 위치 3에서의 세린 잔기가 아스파르테이트 또는 아스파라긴으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 2의 위치 5에서의 티로신 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 2의 위치 6에서의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 2의 위치 8에서의 아스파라긴 잔기가 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 티로신, 아스파르테이트 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 2의 위치 10에서의 아스파라긴 잔기가 아스파르테이트 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 3;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 4;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 5; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 CDR-L3: 서열식별번호: 6.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제하며 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다는 점에서 이소형-특이적이다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 94를 포함하며, 단 (i) 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나; (ii) 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나; (iii) 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나; (iv) 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나; (v) 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나; (vi) 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나; (vii) 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 94, 단
i. 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나;
vi. 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나;
vii. 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 95; 및
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 96.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 94, 단
i. 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나;
vi. 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나;
vii. 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 95;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 96;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 97;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 98; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 99.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 94, 단
i. 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나;
vi. 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나;
vii. 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 95;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 96;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 97;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 98; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 99.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 또한 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적이다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 R이다. 일부 실시양태에서, X2는 G이다. 일부 실시양태에서, X2는 S이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 (X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 S 또는 G이고; X3은 F 또는 L인 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 V이다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X2는 S이다. 일부 실시양태에서, X2는 G이다. 일부 실시양태에서, X3은 F이다. 일부 실시양태에서, X3은 L이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 (X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, V, G 또는 K이고; X3은 R, H 또는 L이고; X4는 I, V 또는 G이고; X5는 A, S 또는 L이고; X6은 A 또는 V이고; X7은 F 또는 Y이고; X8은 D, G, R 또는 S이고; X9는 Y, G, R, L, V, A 또는 K인 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 A이다. 일부 실시양태에서, X1은 V이다. 일부 실시양태에서, X2는 R이다. 일부 실시양태에서, X2는 V이다. 일부 실시양태에서, X2는 G이다. 일부 실시양태에서, X2는 K이다. 일부 실시양태에서, X3은 R이다. 일부 실시양태에서, X3은 H이다. 일부 실시양태에서, X3은 L이다. 일부 실시양태에서, X4는 I이다. 일부 실시양태에서, X4는 V이다. 일부 실시양태에서, X4는 G이다. 일부 실시양태에서, X5는 A이다. 일부 실시양태에서, X5는 S이다. 일부 실시양태에서, X5는 L이다. 일부 실시양태에서, X6은 A이다. 일부 실시양태에서, X6은 V이다. 일부 실시양태에서, X7은 F이다. 일부 실시양태에서, X7은 Y이다. 일부 실시양태에서, X8은 D이다. 일부 실시양태에서, X8은 G이다. 일부 실시양태에서, X8은 R이다. 일부 실시양태에서, X8은 S이다. 일부 실시양태에서, X9는 Y이다. 일부 실시양태에서, X9는 G이다. 일부 실시양태에서, X9는 R이다. 일부 실시양태에서, X9는 L이다. 일부 실시양태에서, X9는 V이다. 일부 실시양태에서, X9는 A이다. 일부 실시양태에서, X9는 K이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 S 또는 G이고; X3은 F 또는 L인 CDR-H2; 및
c) 아미노산 서열 (X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, V, G 또는 K이고; X3은 R, H 또는 L이고; X4는 I, V 또는 G이고; X5는 A, S 또는 L이고; X6은 A 또는 V이고; X7은 F 또는 Y이고; X8은 D, G, R 또는 S이고; X9는 Y, G, R, L, V, A 또는 K인 CDR-H3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 S 또는 G이고; X3은 F 또는 L인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 (X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, V, G 또는 K이고; X3은 R, H 또는 L이고; X4는 I, V 또는 G이고; X5는 A, S 또는 L이고; X6은 A 또는 V이고; X7은 F 또는 Y이고; X8은 D, G, R 또는 S이고; X9는 Y, G, R, L, V, A 또는 K인 CDR-H3;
d) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
e) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 S 또는 G이고; X3은 F 또는 L인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 (X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, V, G 또는 K이고; X3은 R, H 또는 L이고; X4는 I, V 또는 G이고; X5는 A, S 또는 L이고; X6은 A 또는 V이고; X7은 F 또는 Y이고; X8은 D, G, R 또는 S이고; X9는 Y, G, R, L, V, A 또는 K인 CDR-H3;
d) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
e) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 또한 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적이다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 R이다. 일부 실시양태에서, X2는 G이다. 일부 실시양태에서, X2는 S이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 (X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 F 또는 L인 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 V이다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X3은 F이다. 일부 실시양태에서, X3은 L이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R 또는 V이고; X2는 A 또는 L인 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 R이다. 일부 실시양태에서, X1은 V이다. 일부 실시양태에서, X2는 A이다. 일부 실시양태에서, X2는 L이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 F 또는 L인 CDR-H2; 및
c) 아미노산 서열 A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R 또는 V이고; X2는 A 또는 L인 CDR-H3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 F 또는 L인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R 또는 V이고; X2는 A 또는 L인 CDR-H3;
d) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
e) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEGS(X2)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 S이고; X2는 F 또는 L인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)PRI(X2)ARRGGFGY를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R 또는 V이고; X2는 A 또는 L인 CDR-H3;
d) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
e) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 또한 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적이다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 100을 포함하며, 단 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 100을 포함하며, 단 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 100을 포함하며, 단 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 100을 포함하며, 단 (i) 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나; (ii) 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나; (iii) 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 101을 포함하며, 단 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 101을 포함하며, 단 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 101을 포함하며, 단 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR-H1: 서열식별번호: 101을 포함하며, 단 (i) 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나; (ii) 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나; (iii) 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 100, 단
i. 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 101, 단
i. 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 102.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 103에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 104에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 100, 단
i. 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 101, 단
i. 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 102;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 100, 단
i. 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 101, 단
i. 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 102;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 또한 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적이다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 P이다. 일부 실시양태에서, X2는 S이다. 일부 실시양태에서, X2는 H이다. 일부 실시양태에서, X2는 R이다. 일부 실시양태에서, X3은 S이다. 일부 실시양태에서, X3은 G이다. 일부 실시양태에서, X4는 G이다. 일부 실시양태에서, X4는 I이다. 일부 실시양태에서, X4는 N이다. 일부 실시양태에서, X4는 V이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 T이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, S 또는 G이고; X3은 P, Y, R, V, I, H, T 또는 E이고; X4는 S, D, E 또는 N이고; X5는 D, A 또는 T이고; X6은 S, G, T 또는 A이고; X7은 I, A, R, Q 또는 V이고; X8은 A, E, K, G 또는 T이고; X9는 M 또는 I이고; X10은 D, L, Q, V, N 또는 G이고; X11은 V, R, N, E 또는 K인 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 A이다. 일부 실시양태에서, X1은 V이다. 일부 실시양태에서, X2는 R이다. 일부 실시양태에서, X2는 S이다. 일부 실시양태에서, X2는 G이다. 일부 실시양태에서, X3은 P이다. 일부 실시양태에서, X3은 Y이다. 일부 실시양태에서, X3은 R이다. 일부 실시양태에서, X3은 V이다. 일부 실시양태에서, X3은 I이다. 일부 실시양태에서, X3은 H이다. 일부 실시양태에서, X3은 T이다. 일부 실시양태에서, X3은 E이다. 일부 실시양태에서, X4는 S이다. 일부 실시양태에서, X4는 D이다. 일부 실시양태에서, X4는 E이다. 일부 실시양태에서, X4는 N이다. 일부 실시양태에서, X5는 D이다. 일부 실시양태에서, X5는 A이다. 일부 실시양태에서, X5는 T이다. 일부 실시양태에서, X6은 S이다. 일부 실시양태에서, X6은 G이다. 일부 실시양태에서, X6은 T이다. 일부 실시양태에서, X6은 A이다. 일부 실시양태에서, X7은 I이다. 일부 실시양태에서, X7은 A이다. 일부 실시양태에서, X7은 R이다. 일부 실시양태에서, X7은 Q이다. 일부 실시양태에서, X7은 V이다. 일부 실시양태에서, X8은 A이다. 일부 실시양태에서, X8은 E이다. 일부 실시양태에서, X8은 K이다. 일부 실시양태에서, X8은 G이다. 일부 실시양태에서, X8은 T이다. 일부 실시양태에서, X9는 M이다. 일부 실시양태에서, X9는 I이다. 일부 실시양태에서, X10은 D이다. 일부 실시양태에서, X10은 L이다. 일부 실시양태에서, X10은 Q이다. 일부 실시양태에서, X10은 V이다. 일부 실시양태에서, X10은 N이다. 일부 실시양태에서, X10은 G이다. 일부 실시양태에서, X11은 V이다. 일부 실시양태에서, X11은 R이다. 일부 실시양태에서, X11은 N이다. 일부 실시양태에서, X11은 E이다. 일부 실시양태에서, X11은 K이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2; 및
c) 아미노산 서열(X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, S 또는 G이고, X3은 P, Y, R, V, I, H, T 또는 E이고; X4는 S, D, E 또는 N이고; X5는 D, A 또는 T이고; X6은 S, G, T 또는 A이고; X7은 I, A, R, Q 또는 V이고; X8은 A, E, K, G 또는 T이고; X9는 M 또는 I이고; X10은 D, L, Q, V, N 또는 G이고; X11은 V, R, N, E 또는 K인 CDR-H3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 103에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 104에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 (X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, S 또는 G이고, X3은 P, Y, R, V, I, H, T 또는 E이고; X4는 S, D, E 또는 N이고; X5는 D, A 또는 T이고; X6은 S, G, T 또는 A이고; X7은 I, A, R, Q 또는 V이고; X8은 A, E, K, G 또는 T이고; X9는 M 또는 I이고; X10은 D, L, Q, V, N 또는 G이고; X11은 V, R, N, E 또는 K인 CDR-H3;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 (X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, S 또는 G이고, X3은 P, Y, R, V, I, H, T 또는 E이고; X4는 S, D, E 또는 N이고; X5는 D, A 또는 T이고; X6은 S, G, T 또는 A이고; X7은 I, A, R, Q 또는 V이고; X8은 A, E, K, G 또는 T이고; X9는 M 또는 I이고; X10은 D, L, Q, V, N 또는 G이고; X11은 V, R, N, E 또는 K인 CDR-H3;
d) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 103에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
e) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 104에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 또한 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적이다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 H 또는 R이고; X3은 G, I 또는 N인 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 P이다. 일부 실시양태에서, X2는 H이다. 일부 실시양태에서, X2는 R이다. 일부 실시양태에서, X3은 G이다. 일부 실시양태에서, X3은 I이다. 일부 실시양태에서, X3은 N이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 T이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R, S 또는 G이고, X2는 P 또는 V이고; X3은 S 또는 A이고; X4는 A, R, I 또는 V이고; X5는 D, Q 또는 G이고; X6은 V 또는 R인 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X1은 R이다. 일부 실시양태에서, X1은 S이다. 일부 실시양태에서, X1은 G이다. 일부 실시양태에서, X2는 P이다. 일부 실시양태에서, X2는 V이다. 일부 실시양태에서, X3은 S이다. 일부 실시양태에서, X3은 A이다. 일부 실시양태에서, X4는 A이다. 일부 실시양태에서, X4는 R이다. 일부 실시양태에서, X4는 I이다. 일부 실시양태에서, X4는 V이다. 일부 실시양태에서, X5는 D이다. 일부 실시양태에서, X5는 Q이다. 일부 실시양태에서, X5는 G이다. 일부 실시양태에서, X6은 V이다. 일부 실시양태에서, X6은 R이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 H 또는 R이고; X3은 G, I 또는 N인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2; 및
c) 아미노산 서열 A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R, S 또는 G이고, X2는 P 또는 V이고; X3은 S 또는 A이고; X4는 A, R, I 또는 V이고; X5는 D, Q 또는 G이고; X6은 V 또는 R인 CDR-H3.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 103에 제시된 바와 같은 CDR-L1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 104에 제시된 바와 같은 CDR-L2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 H 또는 R이고; X3은 G, I 또는 N인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R, S 또는 G이고, X2는 P 또는 V이고; X3은 S 또는 A이고; X4는 A, R, I 또는 V이고; X5는 D, Q 또는 G이고; X6은 V 또는 R인 CDR-H3;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며; 여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고; 여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고; 여기서 항체는 하기 6개의 CDR 중 적어도 3개를 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)SSSYYW(X3)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 H 또는 R이고; X3은 G, I 또는 N인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)D(X2)SYD(X3)(X4)AGM(X5)(X6)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R, S 또는 G이고, X2는 P 또는 V이고; X3은 S 또는 A이고; X4는 A, R, I 또는 V이고; X5는 D, Q 또는 G이고; X6은 V 또는 R인 CDR-H3;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105.
일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 또한 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하고/거나; 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1에는 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-선택적 항체는 또한 LTBP1/3과 회합된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적이다.
또한, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 보다 높은 친화도 및 결합 특성의 추가의 유리한 조합으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR을 포함한다:
a) 아미노산 서열 FTFRSYVMH를 포함하는 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 VISHEGS(X1)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 X1은 L 또는 G인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)PRIAARRGGFG(X2)를 포함하며, 여기서 X1은 V, R 또는 L이고; X2는 Y, S 또는 T인 CDR-H3;
d) 아미노산 서열 TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 H이고; X2는 N, L, S 또는 A이고; X3은 N, D 또는 Y인 CDR-L1;
e) 아미노산 서열 ED(X1)(X2)RPS를 포함하며, 여기서 X1은 N, F 또는 A이고; X2는 Q, I 또는 V인 CDR-L2; 및
f) 아미노산 서열 Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 S, F, Y, D, H 또는 W이고; X3은 N, D 또는 S이고; X4는 N, A, L, E 또는 T이고; X5는 G, R, A 또는 L인 CDR-L3.
일부 실시양태에서, CDR-H3 내에서: X1은 R 또는 L이다. CDR-L3 내에서: X2는 Y일 수 있다. CDR-L3 내에서: X3은 D일 수 있고; X4는 T일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, CDR-H3 내에서: X1은 R 또는 L (임의로 R)이고, CDR-L3 내에서: X2는 Y이고; CDR-L3 내에서: X3은 D이고; X4는 T이다.
대안적 실시양태에서, CDR-H3 내에서: X1은 R 또는 L (임의로 R)이고, CDR-L3 내에서: X2는 Y이고, CDR-L3 내에서: X3은 D이고; X4는 N이고; X5는 A이다.
일부 실시양태에서, CDR-L1 내에서: X1은 S 또는 H이고; X2는 N 또는 A이고; X3은 N, D 또는 Y이고; CDR-L2 내에서: X1은 N 또는 F이고; X2는 Q 또는 V이고; CDR-L3 내에서: X1은 S 또는 G이고; X2는 S, Y, D 또는 W이고; X3은 D 또는 S이고; X4는 N, L 또는 T이고; X5는 G, R, A 또는 L이다. 일부 실시양태에서, CDR-L1 내에서: X1은 S이고; X2는 N이고; X3은 N 또는 Y이고; CDR-L2 내에서: X1은 N이고; X2는 Q 또는 V이고; CDR-L3 내에서: X1은 S 또는 G이고; X2는 S, Y 또는 W이고; X3은 D이고; X4는 N 또는 T이고; X5는 G, R 또는 A이다. 일부 실시양태에서, CDR-L3 내에서: X1은 S이고; X2는 S 또는 Y이고; X3은 D이고; X4는 N 또는 T이고; X5는 G, R 또는 A이다. 일부 실시양태에서, CDR-L3 내에서: X1은 S이고; X2는 Y이고; X3은 D이고; X4는 N 또는 T이고; X5는 G 또는 A이다. 일부 바람직한 실시양태에서, CDR-L3 내에서: X1은 S이고; X2는 Y이고; X3은 D이고; X4는 T이고; X5는 G이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 Ab42의 CDR, 예를 들어 아미노산 서열 FTFRSYVMH (서열식별번호: 166)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열 VISHEGSLKYYADSVKG (서열식별번호: 167)를 포함하는 CDR-H2; 아미노산 서열 ARPRIAARRGGFGY (서열식별번호: 168)를 포함하는 CDR-H3; 아미노산 서열 TRSSGNIDNNYVQ (서열식별번호: 169)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열 EDNQRPS (서열식별번호: 170)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열 QSYDYDTQGVV (서열식별번호: 171)를 포함하는 CDR-L3을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 318에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 319에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI에 의해 측정시 < 1 nM의 KD로 인간 LTBP1- 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, KD는 BLI 또는 SPR에 의해 결정된 바와 같다. 일부 실시양태에서, KD는 SPR에 의해 결정된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, KD는 BLI 또는 SPR에 의해 결정된 바와 같다. 일부 실시양태에서, KD는 SPR에 의해 결정된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
추가 실시양태에서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체가 200nM의 농도일 경우 BLI 검정 (예를 들어, 옥텟)에서 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 노출시 의미있는 결합을 나타내지 않을 수 있다 (예를 들어, 0.1 유닛 (nm) 초과의 반응을 나타내지 않을 수 있음).
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR을 포함한다:
a) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 SISYS(X1)(X2)TYY를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 G 또는 A이고; X2는 S 또는 T인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)DPSYDS(X2)AGM(X3)V를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R, S 또는 G이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 D 또는 Q인 CDR-H3;
d) 아미노산 서열 RAS(X1)(X2)IS(X3)YLN을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 K 또는 Q이고; X2는 V 또는 S이고; X3은 S 또는 Y인 CDR-L1;
e) 아미노산 서열 (X1)AS(X2)(X3)QS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 Y, A 또는 S이고; X2는 S 또는 N이고; X3은 L 또는 R인 CDR-L2;
f) 아미노산 서열 QQ(X1)(X2)D(X3)P(X4)T를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 G이고; X2는 F 또는 N이고; X3은 W 또는 F이고; X4는 F 또는 L인 CDR-L3.
일부 실시양태에서, CDR-H1 내에서: X1은 S이고; X2는 S 또는 R이고; X3은 S이고; X4는 G이고; CDR-H2 내에서: X1은 G 또는 A이고; X2는 S 또는 T이고; CDR-H3 내에서: X1은 R, S 또는 G이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 D 또는 Q이고; CDR-L1 내에서: X1은 K 또는 Q이고; X2는 V 또는 S이고; X3은 S 또는 Y이고; CDR-L2 내에서: X1은 Y, A 또는 S이고; X2는 S 또는 N이고; X3은 L 또는 R이고; CDR-L3 내에서: X1은 S 또는 G이고; X2는 F 또는 N이고; X3은 W 또는 F이고; X4는 F 또는 L이다.
일부 실시양태에서: CDR-H1은 아미노산 서열 GSIRSSSYYWG를 포함하고; CDR-H2는 아미노산 서열 SISYSATTYY를 포함하고; CDR-H3 내에서: X1은 S 또는 G이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 D 또는 Q이고; CDR-L1 내에서: X1은 K 또는 Q이고; X2는 V 또는 S이고; X3은 S 또는 Y이고; CDR-L2 내에서: X1은 Y, A 또는 S이고; X2는 S 또는 N이고; X3은 L 또는 R이고; CDR-L3 내에서: X1은 S 또는 G이고; X2는 F 또는 N이고; X3은 W 또는 F이고; X4는 F 또는 L이다.
일부 실시양태에서: CDR-H1은 아미노산 서열 GSIRSSSYYWG (서열식별번호: 292)를 포함하고; CDR-H2는 아미노산 서열 SISYSATTYY (서열식별번호: 293)를 포함하고; CDR-H3은 아미노산 서열 AGDPSYDSIAGMQV (서열식별번호: 294)를 포함하고; CDR-L1은 아미노산 서열 RASQSISSYLN (서열식별번호: 295)을 포함하고; CDR-L2는 아미노산 서열 AASNLQS (서열식별번호: 296)를 포함하고; CDR-L3은 아미노산 서열 QQSFDWPLT (서열식별번호: 297)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 360에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 361에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI에 의해 측정시 < 5 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI에 의해 측정시 < 1 nM의 KD로 인간 LTBP1- 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, KD는 BLI 또는 SPR에 의해 결정된 바와 같다. 일부 실시양태에서, KD는 SPR에 의해 결정된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 잠복 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 검정 조건 하에 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 (예를 들어, 적어도 75배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은) KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, KD는 BLI 또는 SPR에 의해 결정된 바와 같다. 일부 실시양태에서, KD는 SPR에 의해 결정된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BLI에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.
추가 실시양태에서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체가 200nM의 농도일 경우 BLI 검정 (예를 들어, 옥텟)에서 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 노출시 의미있는 결합을 나타내지 않을 수 있다 (예를 들어, 0.1 유닛 (nm) 초과의 반응을 나타내지 않을 수 있음).
일부 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된다. BLAST 단백질 검색이 XBLAST 프로그램, 점수=50, 워드 길이=3으로 수행되어 관심 단백질 분자에 대해 상동인 아미노산 서열이 얻어질 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우에, 갭드(Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 단편에서, 1개 이상의 보존적 돌연변이는 잔기가 항체-항원 상호작용에 수반될 가능성이 없는 위치에서 CDR 또는 프레임워크 서열 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 보존적 돌연변이(들)는 결정 구조에 기초하여 결정된 바와 같이, 잔기가 LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체와의 상호작용에 수반될 가능성이 없는 위치(들)에서 CDR 또는 프레임워크 서열 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가능한 계면 (예를 들어, 항원-항체 상호작용에 수반되는 잔기)는 구조적 유사성을 공유하는 또 다른 항원에 대한 공지된 구조적 정보로부터 추론될 수 있다.
본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대 전하 또는 크기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예컨대 이는 이러한 방법을 컴파일링하는 참고문헌, 예를 들어 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 확인된다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 바람직한 특성을 항체에 부여하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 천연 IgG4 mAb에서 발생하는 것으로 공지된 Fab-아암 교환으로 인한 잠재적 합병증을 피하기 위해, 본원에 제공된 항체는 안정화 'Adair' 돌연변이를 포함할 수 있으며 (Angal et al., "A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody," Mol Immunol 30, 105-108; 1993), 여기서 세린 228 (EU 넘버링; 잔기 241 카바트 넘버링)이 프롤린으로 전환되어 IgG1-유사 (CPPCP (서열식별번호: 45)) 힌지 서열을 생성한다. 따라서, 임의의 항체는 안정화 'Adair' 돌연변이 또는 아미노산 서열 CPPCP (서열식별번호: 45)를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 IgG1-유사 힌지를 생성하고 쇄간 디술피드 결합의 형성을 허용하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 갖는 인간 IgG4의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다.
LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 본 개시내용의 항체는 임의로 항체 불변 영역 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C-말단에서 경쇄 불변 도메인, 예컨대 Cκ 또는 Cλ에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인 또는 그의 부분은 중쇄의 모두 또는 일부, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 및 임의의 이소형 하위부류에 부착될 수 있다. 항체는 적합한 불변 영역을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 따라서, 본 개시내용의 범주 내의 항체는 임의의 적합한 불변 영역과 조합된 VH 및 VL 도메인 또는 그의 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 불변 도메인의 모두 또는 부분을 함유하는 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 Ig 람다 불변 도메인 또는 인간 Ig 카파 불변 도메인의 모두 또는 부분을 함유하는 경쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 7 및 8의 항체의 프레임워크 영역을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 뮤린 항체이고, 뮤린 프레임워크 영역 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 완전 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 배선 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역을 포함한다.
본원에 기재된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 항원에 결합하기에 적합한 임의의 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 2개의 중쇄 가변 영역 및 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 1개의 중쇄 가변 영역 및 1개의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFab 단편, scFv 또는 디아바디이다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1 불변 도메인 또는 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인은 인간 IgG4 불변 도메인이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 조합 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 IgG1-유사 힌지를 생성하고 쇄간 디술피드 결합의 형성을 허용하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 갖는 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 Ig 람다 불변 도메인 또는 인간 Ig 카파 불변 도메인을 포함하는 경쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄인 4개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 IgG이다. 예시적 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 인간 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 배선 아미노산 서열을 갖는 프레임워크를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 항체 SR-Ab1과 경쟁하지 않는다.
신규 항체의 결합 동역학
본원에 개시된 신규 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab)은 증진된 결합 특성을 특징으로 한다. 항체 및 단편은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체 (또한 대형 잠복 복합체 (LLC)로 공지됨)에 선택적으로 결합할 수 있다. 재조합적으로 생산된, 정제된 단백질 복합체는 적합한 시험관내 결합 검정에서 항원 복합체에 결합하는 항체의 능력을 스크리닝, 평가 또는 확인하기 위한 항원 (예를 들어, 항원 복합체)으로서 사용될 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, BLI-기반 검정 (예컨대 옥텟®) 및 SPR-기반 검정 (예컨대 비아코어)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이전에, LLC에 대해 높은 친화도 (예를 들어, 나노몰 미만의 KD)를 나타내는 항체 및 단편이 확인되었다. 본원에서, 유리하게는, 특히 지속적인 억제 효과를 달성하는 것을 목표로 하는, 특히 느린 해리율을 갖는 항체 및 단편이 특이적으로 선택되었다.
따라서, 본 개시내용에 따른 방법 및 치료 용도를 수행하기 위한 적합한 TGFβ 억제제의 선택은 시험관내 결합 검정을 수행하여 결합 동역학을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에 기재된 바와 같이, hLTBP1-프로 TGFβ1 및/또는 hLTBP3-프로TGFβ1에 높은 친화도 및 낮은 해리율 kOFF로 결합한다. 바람직하게는, 항체 또는 단편은 뮤린 LLC 대응물, 즉 mLTBP1-프로TGFβ1 및/또는 mLTBP3-프로TGFβ1에 인간 LLC와 등가인 친화도로 추가로 결합한다. 시험관내 결합 동역학은 시험 항체 (예컨대 항원-결합 단편)와 적합한 항원, 예컨대 LLC 및 소형 잠복 복합체 (SLC)의 상호작용을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 결합 동역학의 파라미터를 결정하기 위한 시험관내 결합 검정에 적합한 방법은 BLI-기반 검정, 예컨대 옥텟 및 표면 플라즈몬 공명-기반 검정, 예컨대 비아코어 시스템을 포함한다. 옥텟-기반 시험관내 결합 검정의 예는 실시예 9 / 표 9에 제공된다. 여러 항체는 이 실험에서 ≤ 5 x 10-4 (1/s)인 "오프" 레이트 (kOFF)를 갖는 것으로 나타났다. 이들 결과는 심지어 동일한 옥텟 검정에 의해서도 hLTBP1-프로 TGFβ1 및/또는 hLTBP3-프로TGFβ1에 대한 결합이 검출될 수 없었던 Ab10에 대해 제시된 결과와 극명하게 대조적이다 (표 8). SPR-기반 시험관내 결합 검정의 예는 실시예 9에 제공된다. TGFβ1의 활성화 억제제인 Ab42, Ab63 및 Ab43의 Fab 단편이 이 실험에 사용되었다. 이 실시예에 예시된 바와 같이, 이들 항체는 나노몰 미만의 KD 및 ≤ 5 x 10-4 (1/s)인 "오프" 레이트를 갖는다. 따라서, 예를 들어 Ab42는 비교적 신속하게 항원으로부터 "떨어지는" (예를 들어, 해리되는) 훨씬 더 높은 "오프" 레이트를 갖는 항체보다 훨씬 더 긴 지속기간 (예를 들어, 더 큰 t1/2) 동안 항원에 결합된 상태로 유지될 수 있다. 따라서, 해리 동역학의 차이는 그의 전체 친화도 (KD)에서의 주목할 만한 차이에 주로 기여하며, 이는 증진된 효력을 유발할 수 있다. 따라서, 결합 동역학의 특징화는 효과의 잠재적 지속성 및 생체내 효력의 생성에 관한 유용한 정보를 제공한다.
따라서, 본 발명은 SPR에 의해 측정시 ≤ 5 x 10-4 (1/s)의 해리율을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택을 포함하는, 치료 용도를 위한 TGFβ 활성화 억제제를 선택하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 1 nM 미만 (즉, 나노몰 미만), 예를 들어 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM 또는 50 pM 미만의 친화도로 항원에 결합한다.
선택 방법은 적합한 수단, 예컨대 BLI-기반 검정 및 SPR-기반 검정에 의해 시험 항체의 절반 해리 시간 (절반 결합 시간 또는 t½로도 지칭됨)을 결정 또는 측정하는 것을 포함할 수 있다. 1가 또는 다가 (예를 들어, 2가) 시험 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편이 절반 해리 시간을 결정하는데 사용될 수 있는 적합한 1가 항체이다. 유사하게, 전장 이뮤노글로불린 (예를 들어, IgG)이 절반 해리 시간을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대해 45분 이상의 t½을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택을 포함한다. 바람직하게는, 항체 또는 단편은 각각의 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대해 45분 이상의 t½을 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체 또는 단편은 추가로 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 뮤린 LTBP3-프로TGFβ1에 대해 45분 이상의 t½을 갖는다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 단편은 각각의 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1 및 뮤린 LTBP3-프로TGFβ1에 대해 45분 이상의 t½을 갖는다. 방법은 인간 GARP-프로TGFβ1에 대해 5분 이하의 t½을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편의 선택을 추가로 포함할 수 있다. 유리한 절반 해리 시간을 갖는 임의의 이들 항체는 바람직하게는 BLI (예를 들어, 옥텟) 또는 SPR (예를 들어, 비아코어)에 의해 측정시 1 nM 미만의 KD를 가질 것이다. 바람직하게는, SPR 검정이 절반 해리 시간 (t½)을 결정하는데 사용된다.
폴리펩티드
본 개시내용의 일부 측면은 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 또는 그의 조합을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 예시적 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 또는 그의 조합 중 어느 하나에서의 상응하는 CDR 영역과 비교하여 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 변이를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 8을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 8은 임의로 링커 펩티드에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 7에 대해 적어도 75% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 75% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 6에 제시된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 92 또는 서열식별번호: 106을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 93 또는 서열식별번호: 107을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 318을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 319를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 360을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 361을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 6에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 6에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 92 또는 서열식별번호: 106) 및 표 6에 제시된 경쇄 가변 영역 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 93 또는 서열식별번호: 107)을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 8)은 임의로 링커 펩티드에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 92 또는 서열식별번호: 106에 대해 적어도 75% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 93 또는 서열식별번호: 107에 대해 적어도 75% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 318에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 360에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 361에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 318 및 서열식별번호: 319)은 링커 펩티드에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 318 또는 서열식별번호: 360에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 319 또는 서열식별번호: 361에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하다.
핵산
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원-결합 부분 및/또는 조성물은 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 핵산 분자는, 비제한적으로, DNA 분자, RNA 분자, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, mRNA 분자, 벡터, 플라스미드 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 코딩하는 핵산 분자를 발현하기 위해 프로그램화되거나 생성된 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 또는 그의 조합을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5에 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 또는 그의 조합 중 어느 하나 내의 상응하는 CDR 영역과 비교하여 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 변이를 함유할 수 있는 폴리펩티드를 코딩한다. 예시적 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 표 6에 제시된 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 표 6에 제시된 경쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 예시적 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 92 또는 서열식별번호: 106에 제시된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 93 또는 서열식별번호: 107에 제시된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 7에 제시된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호: 8에 제시된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예시적 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 318에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 319에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 360에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열식별번호: 361에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 318에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 360에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 361에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 318 및 서열식별번호: 319)은 링커 펩티드에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 중쇄 가변 도메인인 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 318 또는 서열식별번호: 360에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 경쇄 가변 도메인인 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 319 또는 서열식별번호: 361에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 318에 제시된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 360에 제시된 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호: 361에 제시된 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 핵산은 코돈-최적화된 핵산을 포함한다. 코돈-최적화된 핵산을 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148 (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 언급된 핵산(들) 중 임의의 것을 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.
LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 결합하는 항체의 생산
관련 기술분야는 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 수득하는데 사용될 수 있는 다양한 기술 및 방법에 친숙하다. 예를 들어, 항체는 재조합 DNA 방법, 하이브리도마 기술, 파지 또는 효모 디스플레이 기술, 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 제노마우스(XenoMouse)®) 또는 그의 일부 조합을 사용하여 생산될 수 있다.
면역화 및 하이브리도마
본원에 기재된 일부 방법에서, 명시된 항원 (예를 들어, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체)은 비-인간 동물 ("숙주"), 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 햄스터 또는 래트를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-인간 동물은 마우스이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주는 낙타류일 수 있다.
항원 노출 (예를 들어, 주사)의 단일 또는 다중 단계를 포함할 수 있는 면역화 후에, 비장세포가 동물로부터 수거되고, 연관된 B 세포는 불멸화 골수종 세포와 융합되어 항체 생산을 위한 하이브리도마를 형성한다. 하이브리도마는 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499] 참조). 이어서 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마는 표준 방법, 예컨대 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 생물층 간섭측정법 (BLI) 기술 (예를 들어, 옥텟) 및 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 분석을 사용하여 스크리닝되어, 명시된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마가 확인된다. 임의의 형태의 명시된 항원, 예를 들어 재조합 항원, 그의 자연 발생 형태, 임의의 변이체 또는 단편, 뿐만 아니라 그의 항원 펩티드 (예를 들어, 선형 에피토프로서 본원에 기재된 임의의 에피토프 또는 입체형태적 에피토프로서 스캐폴드 내의 것)가 면역원으로서 사용될 수 있다.
라이브러리/라이브러리들의 스크리닝
일부 실시양태에서, 항체를 제조하거나 확인하는 방법 또는 과정은 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, scFv)을 발현하는 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인간 조합 항체 또는 scFv 단편의 라이브러리를 파지 또는 효모 상에서 합성할 수 있고, 이어서 라이브러리를 관심 항원 또는 그의 항체-결합 부분으로 스크리닝하고, 항원에 결합하는 파지 또는 효모를 단리하고, 이로부터 항체 또는 면역반응성 단편을 수득할 수 있다 (Vaughan et al., 1996, PMID: 9630891; Sheets et al., 1998, PMID: 9600934; Boder et al., 1997, PMID: 9181578; Pepper et al., 2008, PMID: 18336206).
파지 디스플레이는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409 (Ladner et al.); 문헌 [Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; 및 WO 90/02809에 추가로 기재되어 있다. 효모 디스플레이는, 예를 들어 US 7,700,302 및 US 8,877,688에 추가로 기재되어 있다. 특정한 방법에서, 효모 디스플레이 라이브러리는 전장 항체를 발현한다 (예를 들어, 아디맙, 엘엘씨(Adimab, LLC)).
파지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약이 또한 존재한다 (US 5,223,409; WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 및 문헌 [Barbas et al., 1991, PMID: 1896445] 참조). 이러한 기술은 유리하게는 다수의 후보 항체의 스크리닝을 가능하게 한다.
어떻게 수득되든지, 항체 생산 세포 (예를 들어, 효모 콜로니, 하이브리도마 등)를 선택하고, 클로닝하고, 예를 들어 강건한 성장, 높은 항체 생산 및 바람직한 항체 특징, 예컨대 관심 항원에 대한 높은 친화도를 포함한 바람직한 특징에 대해 추가로 스크리닝할 수 있다. 콜로니 및/또는 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고, 확장시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 목적하는 항체가 확인되면, 관련 유전 물질을 통상의 관련 기술분야에서 인식되는 분자 생물학 및 생화학적 기술을 사용하여 단리, 조작 및 발현할 수 있다.
인간화
본 발명의 항체 또는 단편은 바람직하게는 완전 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 따라서, 공급원이 무엇이든, 방법은 하나 이상의 항체 또는 그의 단편을 인간화하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 인간 항체 서열은 관련 기술분야에 공지된 분자 조작 기술을 사용하여 제작되고 본원에 기재된 바와 같은 발현 시스템 및 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 이러한 비-천연의 재조합적으로 생산된 인간 항체 (및 대상 조성물)는 본 개시내용의 교시와 전적으로 상용성이고, 명백하게 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 여겨진다. 특정 선택 측면에서, 본 발명의 LTBP1-TGFβ1 복합체-결합 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체-결합 항체는 재조합적으로 생산된 인간 항체를 포함할 것이다.
친화도 성숙
일부 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 의해 생산된 항체는 중간 정도의 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Ka)를 가질 수 있다. 따라서, 항체 또는 그의 단편은 원하는 경우에 최적화의 일부로서 친화도 성숙의 과정에 적용될 수 있다. 용어 "친화도 성숙"은 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 의미를 가질 것이다. 간략하게, 이는 특이적 항원에 대한 개선된 결합 프로파일을 달성하기 위해 후보 항체 또는 단편 (종종 "모체"로 지칭됨)의 아미노산 서열을 추가로 변형시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 모 항체 및 친화도-성숙 대응물 (때때로 "자손" 또는 "자식"으로 지칭됨)은 동일한 에피토프를 보유한다. 적합한 시험관내 결합 검정을 수행하여 친화도 성숙 과정 동안 적절한 단계(들)에서 개선된 결합제에 대해 스크리닝할 수 있다. 임의로, 일부 실시양태에서, 기능적 검정 (예를 들어, 세포-기반 효력 검정)을 또한 수행하여 목적하는 기능성을 확인할 수 있다.
친화도 성숙은 전형적으로 서열 다양화 및/또는 돌연변이유발을 수반하며, 돌연변이를 도입하거나 생성하는 정확한 수단은 제한적이지 않다. 일부 실시양태에서, 돌연변이유발은 1개 이상의 CDR의 아미노산 잔기에 1개 이상의 변화 (예를 들어, 치환 또는 결실)를 도입하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VR 또는 CDR 서열은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VR 또는 CDR 서열은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VR 또는 CDR 서열은 1, 2, 3 또는 4개 이하의 결실을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 돌연변이유발은 가변 영역 또는 CDR의 소위 올리고-워킹(oligo-walking)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항체의 친화도 성숙은 무작위 돌연변이유발 (Gram H.,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89, 3576-3580 및 Hawkins R. E., et al. J. Mol. Biol. (1992) 226, 889-896), CDR 서열의 무작위 돌연변이유발, 예를 들어 CDR 워킹 (Yang W. P., et al., J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403), 잔기의 지정 돌연변이유발 (Ho M., et al., J. Biol. Chem. (2005) 280, 607-617 및 Ho M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 9637-9642), 및 시험관내에서 체세포 과다돌연변이 (SHM)를 재현하는 접근법 (Bowers P. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 20455-20460)을 포함한 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 영역에 대한 돌연변이유발을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 중쇄 CDR 또는 가변 경쇄 CDR 중 어느 하나에 대한 돌연변이유발을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 중쇄 CDR3에 대한 돌연변이유발 (예를 들어, CDR-H3 돌연변이유발)을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 중쇄 CDR2에 대한 돌연변이유발 (예를 들어, CDR-H2 돌연변이유발)을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 중쇄 CDR1에 대한 돌연변이유발 (예를 들어, CDR-H1 돌연변이유발)을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 경쇄 CDR3에 대한 돌연변이유발 (예를 들어, CDR-L3 돌연변이유발)을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 경쇄 CDR2에 대한 돌연변이유발 (예를 들어, CDR-L2 돌연변이유발)을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 가변 경쇄 CDR1에 대한 돌연변이유발 (예를 들어, CDR-L1 돌연변이유발)을 수행함으로써 친화도 성숙될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 3개의 경쇄 CDR (즉, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3) 중 일부 또는 모두에 대한 돌연변이유발을 개별적으로 수행하여 각각 3개의 CDR 중 1개에 고유한 돌연변이를 갖는 3개 이하의 상이한 항체 라이브러리를 생성함으로써 친화도 성숙 및/또는 최적화될 수 있다. 이어서 새로운 항체를 개선된 특성 (예를 들어, 항원-결합)에 대해 스크리닝할 수 있다. 이어서 추가의 친화도 개선을 원하는 경우에, 각각의 라이브러리로부터의 고유한 CDR을 혼합하고 매칭시켜 새로운 항체 라이브러리를 생성하고, 개선된 특성 (예를 들어, 항원-결합)에 대해 스크리닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도 성숙은 모 항체의 적어도 1개의 CDR과 조합될 수 있는 1개 이상의 CDR의 변이체 ("레퍼토리")를 포함하는 항체 라이브러리를 스크리닝하는 것을 수반한다. 이 과정은 때때로 CDR 셔플링 또는 CDR 다양화로 불린다. 일부 실시양태에서, 가변 중쇄 CDR3 (예를 들어, CDR-H3)을 사용하여 가변 중쇄 CDR1 및 CDR2 변이체 레퍼토리를 함유하는 라이브러리를 스크리닝할 수 있다 (일명, CDR-H1/H2 다양화). 일부 실시양태에서, 가변 경쇄 CDR3 (예를 들어, CDR-L3)을 사용하여 가변 경쇄 CDR1 및 CDR2 변이체 레퍼토리를 함유하는 라이브러리를 스크리닝할 수 있다 (일명, CDR-L1/L2 다양화).
일부 실시양태에서, 친화도 성숙은 모 항체의 중쇄와 조합될 수 있는 경쇄 변이체 ("레퍼토리")를 포함하는 항체 라이브러리를 스크리닝하는 것 (경쇄 셔플링)을 수반한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선택된 중쇄를 경쇄 변이체를 포함하는 항체 라이브러리 내로 도입하여, 새로운 항체 라이브러리를 생성하고, 이를 개선된 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자연 발생 가변 영역 변이체의 레퍼토리는 비면역화된 공여자로부터 수득될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 셔플링의 예는 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌 [Marks et al., (1992) Nature Biotech 10: 779-78; Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 255, 28-43; Park et al., (2000) BBRC. 275. 553-557; 및 Chames et al., (2002) J. Immunol 1110-1118]. 일부 실시양태에서, 경쇄 라이브러리는 람다 경쇄 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 라이브러리는 카파 경쇄 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 라이브러리는 람다 및 카파 경쇄 변이체 둘 다를 포함한다.
친화도 성숙을 위한 다양한 방법은 임의의 순서로 조합될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 선택 항체는 중쇄 CDR-H1/H2 다양화에 이어서 CDR-H3 돌연변이유발을 겪을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택 항체는 중쇄 CDR-H1/H2 다양화, 이어서 CDR-H3 돌연변이유발, 이어서 경쇄 셔플링을 겪을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택 항체는 중쇄 CDR-H1/H2 다양화, 이어서 경쇄 셔플링, 이어서 CDR-H3 돌연변이유발을 겪을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택 항체는 경쇄 셔플링, 이어서 중쇄 CDR-H1/H2 다양화, 이어서 CDR-H3 돌연변이유발을 겪을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택 항체는 경쇄 셔플링, 이어서 중쇄 CDR-H1/H2 다양화, 이어서 CDR-H3 돌연변이유발, 이어서 CDR-L3 돌연변이유발을 겪을 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택 항체는 경쇄 셔플링, 이어서 중쇄 CDR-H1/H2 다양화, 이어서 CDR-H3 돌연변이유발, 이어서 CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDRL3 돌연변이유발을 겪을 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택 항체는 중쇄 CDR-H1/H2 다양화, 이어서 CDR-H3 돌연변이유발, 이어서 CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDRL3 돌연변이유발을 겪을 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쇄 CDR 돌연변이유발을 3개의 경쇄 CDR (CDR-L1, CDR-L2 및 CDRL3) 중 일부 또는 모두에 대해 개별적으로 수행하여 3개 이하의 항체 라이브러리를 생성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 라이브러리로부터의 경쇄 CDR을 혼합하고 매칭시켜 경쇄 CDR 돌연변이의 고유한 조합을 갖는 새로운 항체 라이브러리를 생성한다.
상기 기재된 친화도 성숙을 위한 임의의 방법에서, 생성된 새로운 항체는 공지된 기술 (예를 들어, FACS)을 사용하여 표적 항원 (예를 들어, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체)에의 결합을 위해 선택될 수 있다. FACS를 사용한 결합 특이성 및 친화도는 항원 농도를 변화시키고/거나 비표지된 (저온) 항원에 대해 경쟁시킴으로써 시험될 수 있다. 결합 친화도는 관련 기술분야에 공지된 다른 기술, 예컨대 ELISA, BLI (예를 들어, 옥텟) 및 SPR (예를 들어, 비아코어)을 사용하여 추가로 평가될 수 있다.
상기 논의된 친화도 성숙 과정에 추가로, 추가의 최적화를 수행하여 목적하는 생성물 프로파일을 달성할 수 있다. 따라서, 항체를 추가로 최적화 단계에 적용할 수 있고, 유리한 특정 물리화학적 특성에 기초하여 선택할 수 있다. 치료 항체 (생물제제)의 경우, 평가될 수 있는 개발가능성에 대한 물리화학적 기준은 용해도, 안정성, 면역원성, 자기-연관 또는 응집의 결여, Fc 기능성, 내재화 프로파일, pH-감수성, 글리코실화 및 제조성, 예컨대 세포 생존율 및/또는 유전자 발현을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 최적화 과정은 불변 영역 내의 1개 이상의 아미노산 서열의 돌연변이유발을 수반한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에는 결합하지 않으며, TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 또는 TGFβ3은 억제하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 제조 방법이며, i) LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1을 포함하는 적어도 1종의 항원을 제공하는 단계; ii) 단계 (i)의 적어도 1종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 풀을 선택하여 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1의 특이적 결합제를 제공하는 단계; iii) TGFβ1의 활성화를 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제2 풀을 선택하여 TGFβ1 활성화의 특이적 억제제를 생성하는 단계; iv) 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제약 조성물로 제제화하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 풀로부터, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1, 성숙 TGFβ1, GARP-프로TGFβ2, LRRC33-프로TGFβ2, 성숙 TGFβ2, GARP-프로TGFβ3, LRRC33-프로TGFβ3, 성숙 TGFβ3 또는 그의 임의의 조합에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 단계 (ii) 및/또는 (iii)에서 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이소형-특이성을 결정하거나 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 인간 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체의 제1 풀 및/또는 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 그의 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 및/또는 최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 셔플링에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 및/또는 최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 CDR H1/H2 다양화에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 및/또는 최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 CDR-H3 돌연변이유발에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 및/또는 최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 CDR 돌연변이유발에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 및/또는 최적화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 CDR L1/L2 다양화에 적용하는 단계를 포함한다.
추가의 최적화 단계를 수행하여 치료 조성물에 유리한 물리화학적 특성을 제공할 수 있다. 이러한 단계는 개선된 용해도, 자기-응집의 결여, 안정성, pH 감수성, Fc 기능 등을 제공하기 위한 돌연변이유발 또는 조작을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 방법은 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 제1 및/또는 제2 항체 풀로부터의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI)에서 측정시 > 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하지 않는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 적합한 기능적 시험관내 세포-기반 검정, 예컨대 caga 검정에 의해 측정하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 IC50을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 caga 검정에 의해 측정시 50 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 caga 검정에 의해 측정시 25 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 caga 검정에 의해 측정시 10 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 caga 검정에 의해 측정시 5 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 내인성 LTBP caga 검정에 의해 측정시 100 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 내인성 LTBP caga 검정에 의해 측정시 50 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 내인성 LTBP caga 검정에 의해 측정시 25 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 내인성 LTBP caga 검정에 의해 측정시 10 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 내인성 LTBP caga 검정에 의해 측정시 5 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 인간 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 100 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 인간 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 50 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 인간 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 25 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 인간 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 10 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 인간 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 5 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 100 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 50 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 25 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 10 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 본원에 기재된 바와 같은 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정에 의해 측정시 5 nM 초과의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체는 비-인간 동물로부터 수득된 다음, 적합한 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형, 예를 들어 키메라로 제조된다. 키메라 항체를 제조하는 다양한 접근법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985], 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.); 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.); 유럽 특허 공개 EP171496 (Tanaguchi et al.); 유럽 특허 공개 0173494, 영국 특허 GB 2177096B를 참조한다.
추가의 항체 생산 기술에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조한다. 본 개시내용은 항체의 임의의 특정한 공급원, 생산 방법 또는 다른 특수한 특징에 반드시 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 일부 측면은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나 또는 염색체외에서 유지될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포, 예컨대 박테리아, 곤충, 진균, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진균 세포는, 예를 들어 사카로미세스(Saccharomyces) 속의 것, 특히 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 종의 것이다. 용어 "원핵"은 항체 또는 상응하는 이뮤노글로불린 쇄의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함한다. 원핵 숙주는 그람 음성 박테리아뿐만 아니라 그람 양성 박테리아, 예컨대, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 에스. 티피무리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 용어 "진핵"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예컨대 NSO 및 CHO 세포를 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 또는 이뮤노글로불린 쇄는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 항체 또는 상응하는 이뮤노글로불린 쇄는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현에 적합한 조건 하에 유지될 수 있고, 원하는 경우에, 이뮤노글로불린 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체, 항원-결합 단편 또는 다른 이뮤노글로불린 형태의 수집 및 정제가 이어질 수 있으며; 문헌 [Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)]을 참조한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 세포 내로 도입되고, 이는 차례로 항체 또는 항원-결합 단편을 생산한다. 추가로, 상기 언급된 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 포유동물이 항체 또는 항체 단편의 대규모 생산에 사용될 수 있다.
형질전환된 숙주 세포는 최적 세포 성장을 달성하기 위한 임의의 적합한 기술을 사용하여 발효기에서 성장되고 배양될 수 있다. 발현되면, 전체 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 다른 이뮤노글로불린 형태, 또는 항원-결합 단편은 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 관련 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있으며; 문헌 [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)]을 참조한다. 이어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 성장 배지, 세포 용해물 또는 세포 막 분획으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 미생물 발현된 항체 또는 항원-결합 단편의 단리 및 정제는 임의의 통상적인 수단, 예컨대, 예를 들어 정제용 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리, 예컨대, 예를 들어 항체의 불변 영역에 대해 지시된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용을 수반하는 것에 의할 수 있다.
본 개시내용의 측면은 모노클로날 항체의 무기한의 연장된 공급원를 제공하는 하이브리도마에 관한 것이다. 하이브리도마의 배양물로부터 직접적으로 이뮤노글로불린을 수득하는 것에 대한 대안으로서, 불멸화 하이브리도마 세포가 후속 발현 및/또는 유전자 조작을 위한 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 공급원로서 사용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소형의 것으로 교환될 수 있거나 또는 전적으로 제거될 수 있다. 가변 영역은 단일 쇄 Fv 영역을 코딩하도록 연결될 수 있다. 다수의 Fv 영역이 연결되어 1개 초과의 표적에 대한 결합 능력을 부여할 수 있거나 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 사용될 수 있다. 임의의 적절한 방법이 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 적절한 핵산이 수득되고 발현 벡터 내로 삽입되어 표준 재조합 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. 다양한 이러한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 효율적인 프로세싱 및 생산에 유리할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 전형적인 포유동물 세포주는 CHO 세포, 293 세포 또는 NSO 세포를 포함한다. 항체 또는 항원-결합 단편의 생산은 변형된 재조합 숙주를 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현에 적절한 배양 조건 하에 배양함으로써 착수될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 이들을 배양물로부터 단리함으로써 회수될 수 있다. 발현 시스템은 생성된 항체가 배지 내로 분비되도록 하는 신호 펩티드를 포함하도록 설계될 수 있지만; 세포내 생산도 또한 가능하다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항체의 이뮤노글로불린 쇄의 적어도 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 가변 영역은 상기 기재된 하이브리도마 중 어느 하나에 의해 생산된 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 1개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 DNA, cDNA, RNA 또는 합성적으로 생산된 DNA 또는 RNA, 또는 이들 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 재조합적으로 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 추가 유전자, 예컨대 적합한 숙주 세포에서 적합한 조건 하에 벡터를 허용하는 마커 유전자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현을 가능하게 하는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드의 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들은 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 서열 및 임의로 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 용이하게 하는 폴리-A 신호를 포함할 수 있다. 추가의 조절 요소는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서 및/또는 자연적으로 회합된 또는 이종 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는, 예를 들어 이. 콜라이에서의 PL, Lac, Trp 또는 Tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.
전사 개시를 담당하는 요소 이외에, 이러한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류의 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 추가로, 사용되는 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획으로 지시하거나 또는 이를 배지 내로 분비할 수 있는 리더 서열이 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 부가될 수 있고, 이전에 기재되었다. 리더 서열(들)은 적절한 단계에서 번역, 개시 및 종결 서열과 조립되고, 바람직하게는 리더 서열은 번역된 단백질 또는 그의 부분의, 예를 들어 세포외 배지 내로의 분비를 지시할 수 있다. 임의로, 목적하는 특징, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 C- 또는 N-말단 식별 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 쇄 둘 다 또는 단지 하나의 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 마찬가지로, 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있거나 또는 발현에 대해 개별적으로 제어될 수 있다. 추가로, 일부 측면은 항체 또는 항원-결합 단편의 이뮤노글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 임의로 항체의 다른 이뮤노글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 조합하여 포함하는, 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 발현 제어 서열이 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템으로서 제공되지만, 원핵 숙주에 대한 제어 서열이 또한 사용될 수 있다. 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단 내로 전달하는데 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하도록 세포를 조작하는데) 사용될 수 있다. 다양한 적절한 방법이 재조합 바이러스 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포솜 내로 재구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이뮤노글로불린 쇄의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들)을 코딩하는 서열 및 발현 제어 서열)를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 적합한 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
변형
본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체 또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 검출 및/또는 단리를 위한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온 및 친화성 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 표지 또는 검출가능한 모이어티로 변형될 수 있다. 검출가능한 물질 또는 모이어티는 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커))를 통해 간접적으로 적합한 기술을 사용하여 커플링 또는 접합될 수 있다. 적합한 효소의 비제한적 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 비제한적 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 비제한적 예는 비오틴, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 비제한적 예는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출체 또는 다른 방사성동위원소, 예컨대, 예를 들어 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc, 99mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 86R, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 및 주석 (113Sn, 117Sn)을 포함한다. 검출가능한 물질은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본 개시내용의 항체에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어 링커)를 통해 간접적으로 적합한 기술을 사용하여 커플링 또는 접합될 수 있다. 검출가능한 물질에 접합된 본원에 제공된 임의의 항체는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 진단 검정에 사용될 수 있다.
추가로, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또한 약물로 변형되어, 예를 들어 항체-약물 접합체를 형성할 수 있다. 약물은 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커))를 통해 간접적으로 적합한 기술을 사용하여 커플링 또는 접합될 수 있다.
표적화제
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 1종 이상의 표적화제(들)를 관심 함요에 풍부화 또는 국재화시킬 목적으로 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 대상체 내의 특정한 부위에 표적화시키는 상기 표적화제의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 표적화는 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ 방출을 조정하는 것을 달성할 수 있다. 예를 들어, LTBP1-TGFβ1 및 LTBP3-TGFβ1 복합체는 전형적으로 세포외 매트릭스에 국재화된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 LTBP1-TGFβ1 및 LTBP3-TGFβ1 복합체가 상주하는 부위에 항체를 국재화시킬 목적으로 세포외 매트릭스 표적화제에 접합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체의 선택적 표적화는 LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 선택적 조정으로 이어진다. 일부 실시양태에서, 항체의 선택적 표적화는 (예를 들어, 섬유증을 치료할 목적으로) LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 선택적 억제로 이어진다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스 표적화제는 헤파린 결합제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 결합제, 리실 옥시다제 결합 도메인, 피브릴린-결합제, 히알루론산 결합제 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 제1 부분 및 표적 부위의 성분, 예를 들어 ECM의 성분 (예를 들어, 피브릴린)에 선택적으로 결합하는 제2 부분을 갖는 이중특이적 항체가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 표적화제는 또 다른 작용제 또는 치료제에 커플링되어 복합체를 관심 함요에 운반 또는 국재화시킬 수 있다.
안전성/독성 고려사항
조직병리학, 독성학
상기 언급된 바와 같이, 모든 TGFβ 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 길항하는 공지된 범-억제제는 다수의 포유동물 종에 걸쳐 다양한 독성을 유발하는 것으로 기록되었다. 가장 주목할만한 공지된 독성은 심혈관 독성 (예컨대 판막병증) 및 상피 증식증, 피부 병변, 염증 및 출혈을 포함한다. 보다 구체적으로, 문헌에 보고된 범-TGFβ 억제제 (예를 들어, TGFβR의 소분자 길항제 및 비-선택적 중화 항체)와 연관된 관찰된 독성 중 일부는 하기를 포함한다.
TGFβ 억제와 연관된 심혈관 독성은 대동맥 판막, 우측 AV 판막 및 좌측 AV 판막에서의 증식증; 대동맥 판막, 좌측 AV 판막 및 상행 대동맥에서의 염증; 상행 대동맥, 대동맥 판막 및 좌측 AV 판막에서의 출혈; 상행 대동맥에서의 결합 조직 변성을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Strauber et al. (2014) "Nonclinical safety evaluation of a Transforming Growth Factor β receptor I kinase inhibitor in Fischer 344 rats and beagle dogs" J. Clin. Pract 4(3): 1000196] 참조).
추가로, 모든 3종의 TGFβ 이소형에 결합하는 중화 항체는 특정 상피 독성과 연관되었으며, 이는 하기 표에 요약된다.
1D11 및 GC1008에 대한 종에 걸친 상피 및 다른 독성
Figure pct00037
본 개시내용의 출원인은 잠복 프로TGFβ1 복합체를 표적화함으로써 TGFβ1의 활성화 단계를 선택적으로 차단하는 모노클로날 항체의 개선된 안전성 프로파일을 이전에 입증하였다 (예를 들어, WO 2017/156500 및 WO 2018/129329 참조). 상기 문헌에 기재된 래트 독성학 연구에서, 동물에게 4주 동안 1주에 100 mg/kg 이하의 억제제를 투여한 경우에 관찰가능한 시험 물품-관련 독성은 없었다.
통상적인 TGFβ 길항제의 이소형-특이성의 결여가 TGFβ 억제와 연관된 독성의 공급원의 기저를 이룰 수 있다는 본 개시내용의 출원인에 의한 초기 인식 (PCT/US2017/021972 참조)에 기초하여, 본 발명자들은 증진된 안전성/내약성을 갖는, TGFβ1 조절이상을 나타내는 다양한 질환, 특히 섬유화 상태를 치료하기 위한 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제를 추가로 달성하고자 하였다. 따라서, 본원에 제시된 연구는 고-친화도 억제제 중에서, 지속성을 개선시키기 위해 특히 낮은 해리율 (kOFF)을 갖는 항체의 하위세트를 추가로 제공하였다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 신규 항체는 적어도 4주 (예를 들어, 4, 6, 8, 10, 12주) 동안 매주 투여되는 경우에 >100 mg/kg의 최대 내약 용량 (MTD)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 신규 항체는 래트에서 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 100 mg/kg 이하의 무 관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스에서 4주 또는 12주 동안 투여되는 경우에 적어도 100 mg/kg/주의 NOAEL을 갖는다. TGFβ 억제제 및 TGFβ1 억제제에 대한 안전성/독성학 연구를 수행하는데 사용될 적합한 동물 모델은 래트, 개, 시노 및 마우스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 적합한 전임상 효능 연구에 기초한 항체의 최소 유효량은 NOAEL 미만이다. 보다 바람직하게는, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/3 이하이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/6 이하이다. 일부 실시양태에서, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/10 이하이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 투여되는 경우에 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 유효한 용량에서 심혈관 또는 기지의 상피 독성을 유발하지 않는, TGFβ1 신호전달을 억제할 수 있는 이소형-선택적 항체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 항체는 매주, 격주 또는 매월 투여되는 약 3-10 mg/kg의 최소 유효량을 갖는다. 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 6배인 용량 (예를 들어, 6배 치료 범위)에서 독성을 전혀 유발하지 않거나 최소의 독성을 유발한다. 보다 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 10배인 용량 (예를 들어, 10배 치료 범위)에서 독성을 전혀 유발하지 않거나 최소의 독성을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 15배인 용량 (예를 들어, 15배 치료 범위)에서 독성을 전혀 유발하지 않거나 최소의 독성을 유발한다.
따라서, 치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택은 다음을 포함할 수 있다: TGFβ 억제제 중 1종 이상의 기준을 충족하는 항체 또는 항원-결합 단편을 선택하는 것 (예컨대, 예를 들어 느린 해리율, 예를 들어 < 5 x 10-4 (1/s)의 kOFF를 갖는 것으로 선택된 모노클로날 항체 및 항원-결합 단편); 항체 또는 단편의 유효량을 결정하기 위해 적합한 전임상 모델에서 생체내 효능 연구를 수행하는 것; 안전하거나 독성인 항체의 양 (예를 들어, MTD, NOAEL 또는 안전성/독성을 평가하기 위한 임의의 관련 기술분야에서 인식되는 파라미터)을 결정하기 위해 적합한 모델에서 생체내 안전성/독성학 연구를 수행하는 것; 및 적어도 3배의 치료 범위 (바람직하게는 6배, 보다 바람직하게는 10배의 치료 범위, 보다 더 바람직하게는 15배의 치료 범위)를 제공하는 항체 또는 단편을 선택하는 것. 선택된 항체 또는 단편은 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서의 TGFβ1 적응증의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, TGFβ1 적응증은 섬유화 장애일 수 있다. 바람직하게는, 치료 용도 또는 대규모 제조를 위해 선택될 TGFβ 억제제는 적어도 4주, 예를 들어 8주 및 12주의 지속적인 노출 후에 치료된 동물에서 관찰가능한 유해 효과를 생성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직병리학적 분석에서 관찰된 특정 독성은 비-유해한 것으로 간주된다.
면역 안전성 평가
시토카인은 정상 면역 반응에서 중요한 역할을 하지만, 면역계가 과다활성이 되도록 촉발되는 경우에, 시토카인 생산의 양성 피드백 루프는, 과도한 시토카인 생산이 기관, 특히 폐 및 신장을 손상시킬 수 있는 면역 반응을 유발하여 심지어 사망에까지 이를 수 있는 상황인 "시토카인 폭풍" 또는 고시토카인혈증으로 이어질 수 있다. 이러한 상태는 혈청에서 현저하게 상승된 염증유발 시토카인을 특징으로 한다. 과거, 건강한 지원자에서의 항-CD28 모노클로날 항체 TGN1412의 1상 시험은 염증유발 시토카인의 예상외의 전신 및 급속 유도로부터 비롯된 생명 위협적 "시토카인 폭풍" 반응으로 이어졌다 (Suntharalingam G et al. N Engl J Med. 2006 Sep 7;355(10):1018-28). 이러한 사건은 T 세포의 약리학적 자극과 연관된 잠재적 위험에 대한 인식의 증대를 촉진하였다.
TGFβ-지정 요법은 특이적 T 세포 수용체 또는 그의 리간드를 표적화하지 않지만, 예를 들어 시험관내 시토카인 방출 검정, TGFβ 억제제로 처리된 비-인간 영장류의 혈장 샘플로부터의 생체내 시토카인 측정 및 인간 혈소판을 사용하는 혈소판 검정을 비롯한 면역 안전성 평가를 수행하는 것이 현명한 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 치료 용도 및/또는 대규모 생산을 위한 TGFβ 억제제의 선택은 TGFβ 억제제가 시토카인-생산 세포로부터 시토카인 방출을 촉발하는 능력의 평가를 포함한다. 이러한 평가에서, 시토카인 (예를 들어, 염증성 시토카인) IL-2, TNFα, IFNγ, IL-1β, CCL2 (MCP-1) 및 IL-6 중 1종 이상이 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인-생산 세포는 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 구성성분을 포함할 수 있다. 본원의 TGFβ 억제제 (예컨대 개시된 항체)에 대한 노출 후의 시토카인 반응은 시험될 TGFβ 억제제에 따라 대조군, 예를 들어 IgG 이소형 음성 대조군 또는 임의의 다른 적합한 대조군에 대한 노출 후의 방출과 비교될 수 있다. 시토카인 활성화는 플레이트-결합된 (예를 들어, 고정화된) 및/또는 가용성 검정 포맷으로 평가될 수 있다. IFNγ, IL-2, IL-1β, TNFα, IL-6 및 CCL2 (MCP-1)의 수준은 음성 대조군에서의 활성화의 10배, 예를 들어 8-, 6-, 4- 또는 2배를 초과하지 않아야 한다. 일부 실시양태에서, 또한 샘플에서, 예를 들어 PBMC에서 시토카인 활성화를 확인하는데 양성 대조군이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 시험관내 시토카인 방출 결과는 생체내에서, 예를 들어 동물 모델, 예컨대 원숭이 독성학 연구, 예를 들어 4-주 GLP 또는 비-GLP 반복-용량 원숭이 연구에서 추가로 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택은 다음을 포함할 수 있다: 본원에 기재된 것들 중 1종 이상의 기준을 충족시키는 항체 또는 항원-결합 단편을 확인하는 것; 항체 또는 단편의 유효량을 결정하기 위해 적합한 전임상 모델에서 생체내 효능 연구를 수행하는 것; 안전하거나 독성인 항체의 양 (예를 들어, MTD, NOAEL, 또는 안전성/독성을 평가하기 위한 임의의 관련 기술분야에서 인식된 파라미터)을 결정하기 위해 적합한 모델에서 생체내 안전성/독성학 연구를 수행하는 것; 및 적어도 3배 치료 범위 (바람직하게는 6배, 보다 바람직하게는 10배 치료 범위, 보다 더 바람직하게는 15배 치료 범위)를 제공하는 항체 또는 단편을 선택하는 것. 특정 실시양태에서, 생체내 효능 연구는 인간 상태를 재현하는 2종 이상의 적합한 전임상 모델에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 이러한 전임상 모델은 TGFβ1-양성 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전임상 모델은 간 섬유증 모델, 신장 섬유증 모델, 폐 섬유증 모델, 심장 (심장의) 섬유증 모델, 피부 섬유증 모델로부터 선택된다.
치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 확인은 시토카인 방출을 측정하는 것 및/또는 혈소판 결합, 활성화 및/또는 응집에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 영향을 결정하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 면역 안전성 검정을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시토카인 방출은 PBMC를 사용하여 시험관내에서 또는 전임상 모델, 예컨대 비-인간 영장류를 사용하여 생체내에서 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역 안전성 평가에서 IgG 대조군 샘플에서의 IL-6, IFNγ 및/또는 TNFα 수준과 비교하여 이러한 수준의 10배 초과의 방출을 유도하지 않는다. 특정 실시양태에서, 혈소판 결합, 활성화 및 응집의 평가는 PBMC를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역 안전성 평가에서 완충제 또는 이소형 대조군과 비교하여 혈소판 결합, 활성화 및/또는 응집의 10% 초과의 증가를 유도하지 않는다.
선택된 항체 또는 단편은 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서의 TGFβ 적응증의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, TGFβ 적응증은 섬유화 장애, 예컨대 기관 섬유증, 예를 들어 간 섬유증일 수 있다. 따라서, 본 발명은 시토카인 방출 검정을 포함하고 임의로 혈소판 검정을 추가로 포함하는 면역 안전성 평가에 의해 평가하여 면역 안전성에 대해 시험된 TGFβ 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, TGFβ 억제제를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 포함한다. 상기 방법에 의해 선택된 TGFβ 억제제는 대조군 (예컨대 IgG 대조군)과 비교하여 허용되지 않는 수준의 시토카인 방출을 촉발하지 않는다. 유사하게, 상기 방법에 의해 선택된 TGFβ 억제제는 허용되지 않는 수준의 혈소판 응집, 혈소판 활성화 및/또는 혈소판 결합을 유발하지 않는다. 이어서 이러한 TGFβ 억제제는 TGFβ 억제제를 포함하는 제약 조성물의 상업적 제조를 위해 대규모, 예를 들어 250L 이상, 예를 들어 1000L, 2000L, 3000L, 4000L 또는 그 초과로 제조된다.
제약 조성물
본 발명은 인간 및 비-인간 대상체에서의 투여에 적합한 의약으로서 사용되는 제약 조성물을 추가로 제공한다. LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 1종 이상의 항체는, 예를 들어 완충제를 포함한 제약상 허용되는 담체 (부형제)와 함께 제제화되거나 혼합되어 제약 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 제제는 TGFβ 신호전달 또는 그의 조절이상을 수반하는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ 신호전달과 연관된 이러한 질환 또는 장애는 1종 이상의 콘텍스트를 수반하며, 즉 TGFβ는 제시 분자의 특정한 유형 또는 유형들과 회합된다. 일부 실시양태에서, 이러한 콘텍스트는 세포 유형-특이적 및/또는 조직-특이적 방식으로 발생한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 TGFβ 신호전달의 이러한 콘텍스트-의존성 활성은 부분적으로 GARP, LRRC33, LTBP1 및/또는 LTBP3을 통해 매개된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 TGFβ의 단일 콘텍스트에 선택적으로 결합하여, 항체가 LTBP 제시 분자, 예를 들어 LTBP1 및/또는 LTBP3과의 복합체로 존재하는 TGFβ에 결합하도록 한다. 따라서, 이러한 제약 조성물은 LTBP1 및/또는 LTBP3으로부터의 TGFβ1 활성화/방출과 연관된 TGFβ-관련 적응증 (예를 들어, 섬유증)을 완화시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
제약상 "허용되는" 담체 (부형제)는 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성이고 (바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있고), 치료될 대상체에게 유해하지 않다는 것을 의미한다. 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제 (담체)의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이고, 이전에 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다. 한 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 1종 초과의 항체를 함유하며, 여기서 항체는 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체의 상이한 에피토프/잔기를 인식한다.
본 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
따라서, 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 분자는 인간 투여에 적합한 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
제약 제제는 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제(들)는 하기에 제공된 목록으로부터 선택될 수 있다: https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm?event=browseByLetter.page&Letter=A
제약 조성물은 전형적으로 활성 생물제제 (예를 들어, 모노클로날 항체, 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 결합 분자 등)의 최종 농도가 약 2 mg/mL 내지 약 200 mg/mL이도록 제제화된다. 예를 들어, 제제의 최종 농도 (wt/vol)는 약 2-200, 2-180, 2-160, 2-150, 2-120, 2-100, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 5-200, 5-180, 5-160, 5-150, 5-120, 5-100, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 10-200, 10-180, 10-160, 10-150, 10-120, 10-100, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 20-200, 20-180, 20-160, 20-150, 20-120, 20-100, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 30-200, 30-180, 30-160, 30-150, 30-120, 30-100, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50, 30-40, 40-200, 40-180, 40-160, 40-150, 40-120, 40-100, 40-80, 40-70, 40-60, 40-50, 50-200, 50-180, 50-160, 50-150, 50-120, 50-100, 50-80, 50-70, 50-60, 60-200, 60-180, 60-160, 60-150, 60-120, 60-100, 60-80, 60-70, 70-200, 70-180, 70-160, 70-150, 70-120, 70-100, 70-80 mg/mL 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 중 생물제제의 최종 농도는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 mg/mL이다.
일부 실시양태에 따르면, TGFβ 억제제는 약 3000 mg, 2400 mg, 1600 mg, 800 mg, 240 mg, 80 mg 또는 그 미만의 양으로 투여된다.
본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 적합한 완충제와 함께 제제화된다. 적합한 완충제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 포스페이트 완충제, 시트르산 완충제 및 히스티딘 완충제.
제제의 최종 pH는 전형적으로 pH 5.0 내지 8.0이다. 예를 들어, 제약 조성물의 pH는 약 5.0, 5.2, 5.5, 6.0, 6.2, 6.5, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.5, 7.6 또는 7.8일 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 제약 제제에 사용하기 위해 승인된 계면활성제, 예컨대 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는, 예를 들어 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 (트윈-20), 폴리소르베이트 80 (트윈-80) 및 NP-40을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 안정화제를 포함할 수 있다. 액체-단백질 제제의 경우, 안정성은 pH-완충 염의 선택에 의해 증진될 수 있고, 종종 아미노산이 또한 사용될 수 있다. 이는 종종 단백질의 흡착 및 언폴딩 후에 응집을 일으키는 액체/공기 계면 또는 액체/고체 계면 (패키징에 의함)에서의 상호작용이다. 적합한 안정화제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 수크로스, 말토스, 소르비톨, 뿐만 아니라 특정 아미노산, 예컨대 히스티딘, 글리신, 메티오닌 및 아르기닌.
본 개시내용의 제약 조성물은 하기 부형제 중 1종 또는 임의의 조합을 함유할 수 있다: 인산나트륨, 아르기닌, 수크로스, 염화나트륨, 트로메타민, 만니톨, 벤질 알콜, 히스티딘, 수크로스, 폴리소르베이트 80, 시트르산나트륨, 글리신, 폴리소르베이트 20, 트레할로스, 폴록사머 188, 메티오닌, 트레할로스, rh히알루로니다제, 숙신산나트륨, 인산칼륨, 에데트산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 말토스, 히스티딘 아세테이트, 소르비톨, 펜테트산, 인간 혈청 알부민, 펜테트산.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 전형적으로 액체 또는 동결건조 형태로 제공된다. 전형적으로, 생성물은 바이알 (예를 들어, 유리 바이알)에 제공될 수 있다. 시린지, 펜 또는 자가주사기에 이용가능한 생성물은 이들 용기/폐쇄 시스템에 사전-충전된 액체로 제공될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있는, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체를 함유하는 리포솜을 포함한다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정의된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.
일부 실시양태에서, 표적화 특성을 갖는 리포솜은 제약 조성물을 특정 조직 또는 세포 유형에 우선적으로 전달 또는 국재화하도록 선택된다. 예를 들어, 골수-표적화 특성을 갖는 특정 나노입자-기반 담체, 예를 들어 지질-기반 나노입자 또는 리포솜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sou (2012) "Advanced drug carriers targeting bone marrow", ResearchGate publication 232725109]을 참조한다.
LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체는 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 예시적인 기술은 이전에 기재되었으며, 예를 들어 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.
다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제약 조성물은 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.
본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로 존재할 수 있다.
적합한 표면-활성제는 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈(TWEEEN)™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스팬(SPAN)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5% 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요하다면, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(INTRALIPID)™, 리프신(LIPSYN)™, 인포누트롤(INFONUTROL)™, 리포푼딘(LIPOFUNDIN)™ 및 리피피산(LIPIPHYSAN)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해될 수 있거나 또는 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 중에 용해될 수 있고, 에멀젼은 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합시 형성될 수 있다. 에멀젼의 장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 20% 이하의 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다.
에멀젼 조성물은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제의 용도
LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 억제제, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 부분은 LTBP1 또는 LTBP3과 연관된 TGFβ1 활성의 조정이 요망되는 매우 다양한 적용에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체를 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 노출시킴으로써 TGFβ1 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험관내에서, 예를 들어 배양된 세포에서 TGFβ1 활성화를 억제하기 위해 수행될 수 있다. 상기 방법은 또한 생체내에서, 예를 들어 TGFβ1 억제를 필요로 하는 대상체에서 또는 TGFβ1 억제의 효과가 평가될 동물 모델에서 수행될 수 있다.
LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 임의의 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 이러한 항체를 포함하는 임의의 제약 조성물이 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하지만, LTBP1 단독, 성숙 TGFβ1 단독, GARP-TGFβ1 복합체, LRRC33-TGFβ1 복합체 및 그의 조합으로부터 선택된 1종 이상의 표적에는 결합하지 않는다. 예시적인 억제제, 예를 들어 항체는 GARP-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하지 않으면서, LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 일부 실시양태에서, LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 약 10-8 M 이하의 해리 상수 (KD)로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 약 10-9 M 이하의 KD 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 약 10-10 M 이하 (예를 들어, 약 10-11 M 이하)의 KD 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 BLI (예를 들어, 옥텟)에서 측정시, LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대해 < 10 nM, < 5 nM, < 1 nM의 KD 값을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 표 5에 제시된 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 중쇄 CDR 및/또는 표 5에 제시된 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3개)의 경쇄 CDR을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항체와 동일한 에피토프에 결합하고/거나 LTBP1/3-프로TGFβ1에의 결합에 대해 상기 항체와 경쟁하는 항체 및 그의 항원-결합 부분은 또한 본원에 기재된 방법에 유용하다. 본 발명의 방법을 실시하는데 적합한 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 추가의 특색이 본원에 기재된다.
한 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체를 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 접촉시키는 것은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제한다. 한 실시양태에서, 상기 접촉은 LTBP1 및 LTBP3 이외의 다른 제시 분자로부터의 성숙 TGFβ1의 방출은 억제하지 않는다. 예를 들어, GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를, LTBP1/3-TGFβ1에 선택적으로 결합하지만 GARP 또는 LRRC33의 콘텍스트에서의 TGFβ1에는 결합하지 않는 콘텍스트-특이적 억제제, 예를 들어 항체에 노출시키는 것은, GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하지 않을 것이다.
LTBP1 및 LTBP3은 일반적으로 세포외 매트릭스에 침착된다. 따라서, 한 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP3-TGFβ1을 포함하는 복합체는 세포외 매트릭스와 회합되며, 예를 들어 세포외 매트릭스에 결합된다. 일부 실시양태에서, LTBP1/3-TGFβ1 복합체는 피브릴린, 및/또는 RGD 모티프를 함유하는 단백질을 포함하는 세포외 매트릭스에 결합된다.
본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함으로써, 대상체에서 TGFβ1 활성화를 감소시키는 방법을 제공한다. LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 이러한 항체를 포함하는 임의의 제약 조성물이 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
예시적인 LTBP1/3 억제제, 예를 들어 항체는 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 결합하고, GARP 및/또는 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ1의 방출은 억제하지 않으면서 LTBP1 및 LTBP3에 의해 제시된 TGFβ1의 방출을 억제함으로써 콘텍스트-특이적 방식으로 TGFβ1 활성화를 억제한다. 이러한 항체는 생체내에서 TGFβ1 활성의 특정한 하위세트를 차단하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 본원에 제공된 콘텍스트-특이적 항체는 세포외 매트릭스에 국재화된 TGFβ1을 억제하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 항체는 주로 GARP 및 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ1에 의해 매개되는 TGFβ1-연관 면역 활성 또는 면역 반응을 조정하지 않으면서 TGFβ1을 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 항체는 조혈 세포, 예를 들어 GARP 및/또는 LRRC33을 발현하는 조혈 세포와 연관된 TGFβ1 활성을 조정하지 않으면서 세포외 매트릭스와 연관된 TGFβ1 활성 (예를 들어, LTBP1-연관 TGFβ1 활성 및 LTBP3-연관 TGFβ1 활성)을 억제하는데 사용될 수 있다.
임상 적용
출원인은 이전에 암 및 섬유증을 포함하나 이에 제한되지는 않는, TGFβ1 조절이상을 수반하는 다양한 질환 및 장애를 치료하는데 유용할 수 있는 TGFβ1의 소위 "콘텍스트-비의존성" 억제제 (예를 들어: PCT/US2017/021972 및 PCT/US2018/012601 참조)를 기재하였다. 전통적인 TGFβ1 길항제와 달리, 이들 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 TGFβ1 이소형을 선택적으로 표적화할 수 있다. 그러나, TGFβ1 이소형에 의해 유도되는 다면적인 생물학적 기능 내에서, 콘텍스트-비의존성 억제제는 조직-특이적 (따라서 콘텍스트-특이적) 프로TGFβ1 복합체를 구별하지 않으므로, 이러한 억제제는 임의의 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 결합하여 그로부터의 성숙 성장 인자의 방출 또는 활성화를 억제할 수 있다.
TGFβ 활성의 하위세트만을 표적화하는데 있어서 훨씬 더 큰 선택성을 제공하는 것이 유리할 수 있다는 인식에 적어도 부분적으로 기초하여, 본 개시내용의 콘텍스트-선택적 억제제가 생성되었다. TGFβ 기능을 억제하는 특정한 생물학적 콘텍스트를 추가로 좁힘으로써, 질환 상태 또는 환자 집단의 하위세트에서 보다 큰 안전성이 달성될 수 있는 것으로 고려된다. 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 특정 상태에서, 면역 조절의 전신 교란이 특히 바람직하지 않을 수 있다는 것을 인식하였다. TGFβ가 면역 반응을 매개하고 면역 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 콘텍스트-비의존성 방식으로 달성되는 TGFβ 활성의 광범위한 억제는 타당한 이익 없이 원치않는 부작용으로 이어질 수 있다. 이들 상황에서, TGFβ1 기능의 면역 성분을 억제하지 않는 콘텍스트-선택적 억제제, 예컨대 본원에 포괄된 것을 사용하여 매트릭스-연관 TGFβ 기능을 특이적으로 표적화하고 억제하는 것이 유리한 것으로 고려된다.
따라서, 콘텍스트-특이적 항체는 LTBP1 또는 LTBP3의 콘텍스트에서의 TGFβ 활성화가 바람직하고 GARP 및/또는 LRRC33의 콘텍스트에서의 TGFβ 활성화가 유해한 적용에서 LTBP1/3-연관 TGFβ 활성을 억제하는데 사용될 수 있다.
질환은 ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 장애를 수반할 수 있고, 증가된 콜라겐 침착을 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 장애는 증가된 강성 및/또는 ECM 재편성을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 장애는 질환 부위 내의 증가된 근섬유모세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM의 조절이상은 다양한 섬유화 상태 및 종양의 발병기전 및/또는 질환 진행에 연루되는 매트릭스의 증가된 강성을 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM의 조절이상은 피브로넥틴 및/또는 피브릴린을 수반한다.
GARP-연관 TGFβ를 억제하지 않는 매트릭스-표적화 TGFβ 억제제의 개발에 대한 근거
본 발명은 LTBP1-연관 및/또는 LTBP3-연관 TGFβ의 콘텍스트-특이적 억제제를 포함한다. 따라서, 이러한 억제제는 ECM-연관 잠복 TGFβ 복합체 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1)를 특이적으로 표적화함으로써 질환 환경, 예를 들어 섬유화 조직에서 잠복 복합체로부터의 성숙 TGFβ 성장 인자의 방출을 억제할 수 있다. 이러한 억제제는 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대해 어떠한 유의한 결합 활성도 나타내지 않음으로써, 원치않는 전신 면역 조정을 최소화한다. 이러한 항체는 ECM 조절이상을 갖는 상태, 예컨대 ECM의 비정상적 재형성 및/또는 강성의 치료에 사용하기에 유리할 수 있다.
본원에 제공된 콘텍스트-선택적 항체는 대상체의 면역 반응을 자극하는 것이 바람직하지 않은 상태의 치료에서 및/또는 대상체가 만성 상태, 예컨대 많은 유형의 섬유증을 관리하기 위한 장기간 TGFβ 억제 요법으로부터 이익을 얻을 것으로 예상되는 상황에서 사용될 수 있다.
조절 T 세포 상에서 발현된 GARP-프로TGFβ1 복합체를 표적화하지 않는 TGFβ 억제제의 잠재적 이익을 지지하기 위한 적어도 3가지 기초가 하기 논의된다.
첫째로, GARP-발현 T 조절 세포는 다른 세포의 면역 반응을 억제하거나 약화시키는 면역계의 성분이다. 이 개념은 "관용"으로 지칭될 수 있다. 이는 일부 상황에서 생명-위협적 상태, 예컨대 패혈증, 시토카인 방출 증후군 및 시토카인 폭풍을 유발할 수 있는 과도한 반응을 예방하기 위해 면역계 내로 구축된 중요한 "자기-점검"이다. 따라서, Treg-억제 효과를 발휘하는 TGFβ 억제 요법은 정상 Treg 기능이 특히 장기간의 지속기간 동안 손상되는 경우에, 예를 들어 6개월 이상의 치료 및 무기한의 기간 동안 투여되는 만성 치료를 수반하는 치료 요법의 경우에, 특정 위험을 제기할 수 있다. 이러한 이유로, 특히 자가면역을 도출할 위험을 피하기 위해 TGFβ 억제 요법을 필요로 하는 환자는 정상 Treg 기능을 직접적으로 교란시키지 않는 TGFβ1 억제제로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어, 장기간 TGFβ 억제 요법을 필요로 하는 환자 집단은 유전적 또는 선천적 상태, 예컨대 DMD, CF 등을 갖는 환자 집단을 포함할 수 있다. 추가로, 염증을 포함하는 상태를 앓고 있는 환자 집단은 기존 염증성 상태를 악화시킬 위험을 최소화하기 위해 GARP/Treg 기능을 교란시키지 않는 콘텍스트-특이적 억제제로부터 이익을 얻을 수 있다.
둘째로, 증가하는 증거는 불균등한 Th17/Treg 비와 염증 및/또는 섬유증을 수반하는 병리상태 사이의 연관성을 가리킨다. 2가지 세포 유형인 Th17 및 Treg의 분화는 역 관계로 음성적으로 조절된다는 것이 일반적으로 받아들여진다. TGFβ1이 이 과정의 마스터 게이트키퍼인 것으로 보이며, 따라서 TGFβ1 노출은 나이브 T 세포가 Foxp3+ Treg로 분화하는 것을 촉진하는 반면, IL-6과 조합된 TGFβ1은 나이브 T 세포가 대신 RORγt+ Th17 세포로 분화하는 것을 촉진한다. 추가로, 분화되면, 이들 세포 집단은 서로 음성적으로 조절된다.
일련의 증거는 Th17/Treg 비의 불균형이 만성 염증을 수반하는 섬유화 상태의 발병기전 및/또는 진행 또는 그의 중증도와 상관관계가 있다는 것을 시사한다.
예를 들어, 쇼크리(Shoukry) 등은 Th17 시토카인이 TGFβ 신호전달을 조절함으로써 간 섬유증을 유도한다고 보고하였다. 저자들은 간 생검 샘플에서 Th17 및 Treg 집단의 빈도를 생체외 조사하였고, 중등도 섬유증 또는 건강한 조직 샘플과 비교하여 증가된 Th17/Treg 비가 진행성 섬유증과 상관관계가 있다는 것을 발견하였다. 상기 관찰과 일치하게, Th17 시토카인, 특히 IL-22에 대한 강한 편향이 또한 섬유화 간에서 검출되었다. 이들 데이터는 증가된 Th17/Treg 비가 섬유화유발 Th17 시토카인의 불균형으로 이어지며, 이는 간 섬유증의 중증도와 상관관계가 있다는 것을 시사한다.
유사한 Th17 및 Treg 집단의 역 상관관계가 다른 질환에서 관찰된다.
예를 들어, 만성 염증을 나타내는 상태인 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)을 갖는 환자에서 IL-17의 증가된 근육 발현이 보고되었다. 문헌 [De Pasquale et al. (Neurology 78(17): 1309-14)]은 DMD 근육 생검 샘플이 대조군과 비교하여 더 높은 수준의 IL-17 (Th17 마커) 및 더 낮은 수준의 Foxp3 (Treg 마커) mRNA를 함유한다는 것을 발견하였다. 다른 염증유발 시토카인, 예컨대 TNF-α 및 MCP-1의 상승이 또한 관찰되었으며, 이는 환자의 악화된 임상 결과와 연관된 것으로 밝혀졌다. 저자들은 상기 데이터가 IL-17의 가능한 병원성 역할을 가리키는 것으로 결론지었다.
유사하게, 문헌 [Jamshidian et al. (J Neuroimmunol 2013, 262(1-2): 106-12)]은 재발성 다발성 경화증을 갖는 환자에서 염증성 표현형에 대한 조절로부터 벗어난 편향된 Treg/Th17 균형 및 그의 임상 증상의 중증도와의 상관관계를 보고하였다.
조절 T 세포의 역할은 또한 낭성 섬유증 (CF)의 발병기전에 연루된다. 특히, 질환에 의해 이환된 CF 폐는 전형적 염증성 표현형을 나타내는 과장된 Th17 및 Th2 세포 반응, 뿐만 아니라 Treg 세포의 수 또는 기능의 결핍 (즉, 장애)과 연관된다 (McGuire (2015) Am J Respir Crit Care Med 191(8): 866-8).
추가로, 문헌 [Zhuang et al. (Scientific Reports (2017) 7: 40141)]은 급성 전포도막염 (인간 부류 I 주요 조직적합성 복합체 양성인 전방부 안내 염증)을 갖는 환자에서 Th17/Treg 세포의 불균형을 발견하였으며, 여기서 Th17 세포의 현저한 증가 및 Treg 세포의 현저한 감소 둘 다가 관찰되었다.
종합하면, 본 개시내용의 발명자들은 상승된 Th17/Treg 비와 연관된 이들 다양한 질환에서의 공통 특색으로 보이는 것이 환자가 염증성 성분을 동반한 섬유화 상태를 앓고 있다는 것임을 인식하였다.
따라서, TGFβ 기능의 Treg/GARP-아암을 보존하는 TGFβ 억제 요법은 Th17/Treg 비의 상승된 수준을 특징으로 하는 질환의 유효 치료에 특히 유리할 수 있다는 것이 본 개시내용에서 고려된다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 TGFβ의 콘텍스트-선택적 억제제는 Treg 기능을 방해하여 환자에서 기존 섬유화/염증성 상태의 악화로 이어질 수 있는 TGFβ 억제의 보다 전신적인 효과를 피하는 것을 목표로 한다. 따라서, 본원에 기재된 매트릭스-표적화 TGFβ 억제제는 염증을 포함하는 섬유화 장애를 갖거나 이러한 섬유화 장애가 발생할 위험이 있는 환자를 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 환자는 상승된 Th17-대-Treg 세포 비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상승된 Th17/Treg 비는 Th17 세포의 증가된 수에 의해 우세하게 유발될 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 상승된 Th17/Treg 비는 환자 (또는 환자로부터 수집된 생물학적 샘플)에서 Treg 세포의 감소된 수에 의해 우세하게 유발될 수 있다. 추가 실시양태에서, 상승된 Th17/Treg 비는 Th17 세포의 증가된 수 및 Treg 세포의 감소된 수의 조합에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자에서 검출된 (또는 환자로부터 수집된 샘플에서 측정된) IL-17 및/또는 IL-22의 상승된 수준은 또한 만성 염증을 동반한 섬유화 상태를 나타낸다. 따라서, 이러한 환자는 본원에 개시된 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제제 요법을 받기 위한 후보로서 선택될 수 있다.
TGFβ 억제 요법에서 GARP-TGFβ1 축을 무손상으로 유지하기 위한 제3의 이유는 정상 Treg 기능을 유지하는 이익과 관련된다. 언급된 바와 같이, GARP는 Treg의 세포 표면 상에서 발현되고, TGFβ-매개 면역조정에서 소정 역할을 하는 것으로 생각된다. Treg는 면역 항상성 및 자가면역의 예방에 필수적이기 때문에, 그의 불필요한 교란은 특정 환자 집단을, 예를 들어 보다 높은 감염 위험에 처하게 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Richert-Spuhler and Lund (2015) Prog Mol Biol Transl Sci. 136:217-243]에 의해 검토됨).
TGFβ 억제 요법에서 GARP-TGFβ1 축을 무손상으로 유지하기 위한 제3의 이유는 조절 T 세포가 과반응성 면역 반응을 조정하거나 약화시키는 "브레이크"로서 기능한다는 것이다. Treg 세포 발생 및 기능의 마스터 조절제로서의 Foxp3의 발견은 Treg 세포 생물학의 이해에 중요하였다. Foxp3에서의 불활성화 돌연변이는 마우스에서 까다로운 표현형을 갖는 중증 자가면역 및 인간에서 IPEX 증후군 ('면역 조절이상, 다발내분비병증, 장병증, X-연관')의 자발적 발생을 유발한다 (문헌 [Dominguez-Villear and Haler, Nature Immunology 19, 665-673, 2018] 참조). 따라서, 특히 장기간의 치료에서 TGFb 기능의 Treg/GARP 아암의 억제 효과를 도출하는 TGFb1 요법이 자가면역 반응을 유발하거나 악화시킬 수 있다는 가능성을 제기한다.
증가하는 증거는 Treg가 왕성한 이펙터 면역 반응을 약화시키는 작용을 할 뿐만 아니라, 병원체 클리어런스 및 부수적 손상으로부터의 숙주의 보호에 참여함으로써 병원체에 대한 적절한 면역 반응을 강화시키는 능력을 또한 갖는다는 것을 시사한다. Treg 세포의 이러한 다양한 기능은 외부 환경에 끊임없이 노출되어 이로부터의 다양한 병원체 및 다른 외래 성분 (예를 들어, 바이러스 병원체, 박테리아 병원체, 진균 병원체 및 알레르겐)이 숙주 세포에 접근할 수 있게 되는 폐와 같은 정교한 조직에서 특히 분명하다.
예를 들어, 인플루엔자 바이러스 감염은 풍부한 면역 세포 침윤과 함께 강한 염증유발 시토카인 반응을 도출한다. 급성 및/또는 중증 감염에서, 이러한 반응은 감수성 개체에서 심각한 후유증을 유발할 수 있다. Treg는 숙주에서 면역 반응의 규모를 제어함으로써 바이러스 감염-연관 병리상태를 약화시키는 메카니즘을 제공한다. 실제로, 병원체-노출된 Treg는 입양 전달에서 보호 효과를 보유한다. 더욱이, 프라이밍된 Treg의 이러한 입양 전달은 중증 면역손상 동물 모델에서 인플루엔자 바이러스-연관 이환율을 호전시키고 생존을 연장시키는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 대상체에서 매트릭스-연관 TGFβ 조절이상을 수반하는 질환의 치료를 위한 ECM-표적화, 콘텍스트-선택적 TGFβ 억제제 (예를 들어, TGFβ1 활성화의 LTBP1-선택적 억제제 또는 LTBP1/3-선택적 억제제)의 용도를 제공한다. 대상체는 감염을 앓고 있거나 또는 감염의 위험이 있다. 감염은 바이러스 감염 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 RSV, 인간 면역결핍 바이러스 또는 HIV, MARS, SARS, 단순 포진 바이러스 또는 HSV, A형 간염 바이러스 또는 HAV, B형 간염 바이러스 또는 HBV, C형 간염 바이러스 또는 HCV, CMV, 뎅기 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스), 박테리아 감염 (수막염, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 리스테리아 모노시토게네스, 시트로박터 로덴티움, 살모넬라 및 이. 콜라이), 및/또는 진균 감염 (예를 들어, 칸디다, 뉴모시스티스, 아스페르길루스, 크립토코쿠스 및 콕시디오이데스)일 수 있다.
전형적으로, 고위험 또는 위험이 있는 집단 (중증 감염 또는 감염-촉발된 반응에 특히 감수성인 것으로 간주되는 개체)은 소아 집단 (영아, 유아, 예를 들어 7세 미만의 인간 개체); 고령자 집단 (65세 이상인 개체); 의학적 상태, 건강 상태, 생활 방식, 예컨대 흡연 및/또는 면역억제 효과를 갖는 의약으로 인해 손상된 면역계를 갖는 집단 등을 포함한다.
예를 들어, 특정 의약, 예컨대 화학요법, 조혈 세포를 표적화하는 요법, 예컨대 CD33 요법, 스테로이드, 면역억제제 및 스타틴은 약화된 면역을 유발한다.
일부 실시양태에서, 고위험 또는 위험이 있는 집단은 기존 의학적 상태를 갖는 개체, 예컨대 만성 감염, 예컨대 HIV를 갖는 개체, 골수 이식을 받은 개체, 당뇨병전기 개체, 당뇨병 개체, 자가면역 장애, 예컨대 RA, 천식 및 알레르기를 갖는 개체이다.
따라서, 본원에 포괄된 매트릭스-표적화, 콘텍스트-선택적 TGFβ 억제제는 장기간 또는 만성 TGFβ 요법을 요구하는 환자를 치료하는데 특히 유리할 수 있으며, 이는 이들 시나리오에서, 상기 열거된 것과 같은 다양한 병원체에 의해 유발된 가능한 감염에 효과적으로 반응하는 능력을 제공하는 정상 면역 기능 및 면역 항상성의 장애를 피하는 것이 유익하기 때문이다.
따라서, LTBP-TGFβ (예를 들어, LTBP1-TGFβ1 및 LTBP3-TGFβ1)에 선택적으로 결합하고 면역-연관 TGFβ 제시자 GARP 및 LRRC33의 콘텍스트에서의 TGFβ는 억제하지 않는 항체는 섬유화 적응증, 예컨대 기관 섬유증의 치료를 위한 치료 후보이고, TGFβ-관련된 전반적 면역 활성화를 피하는 것을 목표로 한다. 한 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 항체는 TGFβ-매개 면역 억제가 유익한 적용에서, 예를 들어 이식을 받았거나, 이식을 받기 위한 후보이거나, 이식을 받을 것으로 예상되는 대상체에서 LTBP1/3-연관 TGFβ 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진행 병기 섬유증 및/또는 골수 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 장애를 갖거나 자가면역 장애가 발생할 위험이 있다.
상기 방법은 LTBP-연관 TGFβ 활성의 억제 또는 감소가 유익한 상태를 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 세포외 매트릭스-연관 TGFβ 활성이 연루된 장애를 갖거나 이러한 장애가 발생할 위험이 있을 수 있다.
세포외 매트릭스에서의 잠복 TGFβ의 인테그린-매개 활성화는 섬유증에 대한 주요 기여자이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, αVβ6 및 αVβ8을 포함한 인테그린은 LTBP1 및 LTBP3을 포함한 제시 분자로부터의 TGFβ의 방출을 촉발할 수 있는 것으로 현재 이해된다. 이러한 콘텍스트에서의 TGFβ의 방출 또는 활성화를 억제하는 것은 섬유증 및/또는 그와 연관된 증상을 감소 또는 제거할 수 있다.
기재된 바와 같이, LTBP1 및 LTBP3은 ECM의 성분으로서 생산되고 세포외 침착되며, 여기서 이들은 ECM 내에 프로TGFβ 복합체 (TGFβ1의 잠복, 불활성 전구체)를 "제시"할 수 있다. 자극시, LTBP1/3-프로TGFβ 복합체는 TGFβ 성장 인자 (활성, 성숙 형태의 성장 인자)를 방출시키고, 이는 차례로 국부 조직 미세환경, 예컨대 ECM 유지/재형성 및 섬유증의 과정의 조절에 수반되며, 가능하게는 다양한 시토카인, 케모카인 및 성장 인자에 반응함으로써 및 다른 ECM 성분, 예컨대 피브로넥틴, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴 및 매트릭스 메탈로펩티다제 (MMP)와 상호작용함으로써 그에 수반되는 것으로 생각된다.
손상에 반응하여 발생하는 정상적인 상처 치유 과정에서, 예를 들어 TGFβ는 과립상 조직 형성, 혈관신생 및 콜라겐 합성 및 생산을 용이하게 하는 것으로 생각된다. TGFβ 신호전달은 또한, 세포외 매트릭스 (ECM) 성분, 예컨대 콜라겐의 병리학적 축적을 특징으로 하는 수복 또는 반응성 과정에서의 기관 또는 조직 내 과량의 섬유성 결합 조직의 형성을 유발하는 비정상적 조직 섬유생성 (즉, 섬유증)에 연루된다. 이들 및 다른 상황에서, TGFβ 축은 추가 측면 (섬유화 측면에 추가로), 예컨대 염증, 다양한 세포 유형의 동원 및 표현형 전환에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 다른 제시 분자, 예컨대 GARP/LRRC32 및 LRRC33 중 1종 이상과의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 특정 경우에, 섬유증을 유도하는 ECM-연관 TGFβ가 선택적으로 억제되어야 하는 상황에서, TGFβ1 활성화의 다른 콘텍스트 중 1종 이상을 유의하게 억제하지 않으면서, TGFβ 활성화의 LTBP1/3-콘텍스트를 우선적으로 억제하는 것이 유리하다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 섬유화 장애를 갖거나 섬유화 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 LTBP1/3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함으로써, 상기 대상체에서 TGFβ 활성화를 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 LTBP1/3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함으로써 섬유화 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 섬유화 장애는 기관 섬유증이며, 여기서 임의로, 기관 섬유증은 진행성 기관 섬유증이다. 추가 실시양태에서, 기관 섬유증은 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 경피증, 근육 섬유증, 자궁 섬유증 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 만성 염증을 포함하는 섬유화 장애는 근육 이영양증, 다발성 경화증 (MS) 또는 낭성 섬유증 (CF)이다. 추가 실시양태에서, 근육 이영양증은 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)이다. 또 다른 추가 실시양태에서, MS는 혈관주위 섬유증을 포함한다. 추가 실시양태에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 갖는다.
예시적 실시양태에서, 섬유화 장애는 섬유증, 알포트 증후군, 유섬유종, 결합조직형성증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)이다.
한 실시양태에서, 대상체는 결합조직형성을 갖는다.
한 실시양태에서, 대상체는 기관 섬유증, 예를 들어 신장 섬유증 (예를 들어, 만성 신장 질환 (CKD)과 연관된 섬유증), 간 섬유증 (예를 들어, 비알콜성 지방간염 (NASH)과 연관된 섬유증), 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF)), 심장 섬유증 및/또는 피부 섬유증 (예를 들어, 경피증)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진행성 기관 섬유증을 가질 수 있다. 예를 들어, 대상체는 기관 이식을 필요로 할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 기관 이식을 필요로 할 수 있고, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 이식을 받은 후의 대상체에서 동종이식편 섬유증이 발생하는 것을 예방하기 위해 투여된다.
최근 연구는 인테그린 αVβ6을 억제하는 것이 신장 이식 후 TGFβ-매개 동종이식편 섬유증을 예방할 수 있는지 여부를 조사하였다 (Lo et al., Am. J. Transplant. (2013), 13:3085-3093). 놀랍게도, 억제 항-αVβ6 항체로 치료된 동물은 위약 동물과 비교하여 무거부 생존의 유의한 감소를 경험하였다. 저자들은 TGFβ의 면역억제 특성이 동종이식편 거부를 예방하는 것을 돕기 때문에, 상기 결과가 신장 이식에서의 TGFβ 억제에 대해 경고한다고 결론지었다. 본원에 기재된 억제제, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 부분은 유리하게는 세포외 매트릭스에서 LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시된 TGFβ의 활성화를 억제하지만, 면역 세포 상에서 GARP 또는 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ의 활성화는 억제하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 콘텍스트-특이적 LTBP1/3-TGFβ 억제제, 예를 들어 항체는 동종이식편 거부를 예방하는데 유용한 TGFβ의 면역억제 특성을 제거하지 않으면서 동종이식편 섬유증을 예방하거나 감소시킬 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 TGFβ 신호전달의 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 ECM-연관 TGFβ의 선택적 억제제이고; 여기서 대상체는 억제된 면역으로부터 이익을 얻는 것인, 대상체에서 섬유화 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 섬유화 상태를 갖고 동종이식편 이식으로부터 이익을 얻을 것이거나 또는 동종이식편 이식을 받았다.
본 개시내용의 항체 및/또는 조성물이 치료적으로 사용될 수 있는 추가의 섬유화 상태는 폐 적응증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD), 알레르기성 천식, 낭성 섬유증 (CF), 급성 폐 손상, 호산구성 식도염, 폐동맥 고혈압 및 화학적 기체-손상), 신장 적응증 (예를 들어, 당뇨병성 사구체경화증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 만성 신장 질환, 신장 이식 및 만성 거부와 연관된 섬유증, IgA 신병증, 및 용혈성 요독성 증후군), 간 섬유증 (예를 들어, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 만성 바이러스성 간염, 기생충혈증, 선천성 대사 이상, 독소-매개 섬유증, 예컨대 알콜 섬유증, 비-알콜성 지방간염-간세포성 암종 (NASH-HCC), 원발성 담즙성 간경변증, 및 경화성 담관염), 심혈관 섬유증 (예를 들어, 심근병증, 비대성 심근병증, 아테롬성동맥경화증 및 재협착), 전신 경화증, 피부 섬유증 (예를 들어, 전신 경화증에서의 피부 섬유증, 미만성 피부 전신 경화증, 경피증, 병리학적 피부 반흔형성, 켈로이드, 수술후 반흔형성, 반흔 교정 수술, 방사선-유도된 반흔형성 및 만성 상처), 눈-관련 상태, 예컨대 망막하 섬유증, 포도막염 증후군, 특발성 복막후 섬유증과 연관된 포도막염, 외안근 섬유증, 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 I) 또는 조직적합성 항원과 연관된 안질환, 황반 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)에서의 망막하 섬유증 및 암 또는 속발성 섬유증 (예를 들어, 골수섬유증, 두경부암, M7 급성 거핵모구성 백혈병 및 점막염)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 섬유증과 관련된 다른 질환, 장애 또는 상태는 마르팡 증후군, 강직 피부 증후군, 경피증, 류마티스 관절염, 골수 섬유증, 크론병, 궤양성 결장염, 전신 홍반성 루푸스, 근육 이영양증 (예컨대 DMD), 듀피트렌 구축, 카무라티-엥겔만병, 신경 반흔형성, 치매, 증식성 유리체망막병증, 각막 손상, 녹내장 배액 수술 후의 합병증 및 다발성 경화증 (MS)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 많은 이러한 섬유화 적응증은 또한 이환 조직(들)의 염증과 연관되며, 이는 면역 성분의 관여를 나타낸다. 이러한 염증은 이상 면역 세포 집단, 예컨대 증가된 수의 Th17 세포, 감소된 수의 Treg 세포 및/또는 둘 다를 동반할 수 있다. 각각의 경우에, 이환된 환자는 증가된 Th17/Treg 세포 비를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체로 치료될 질환은 대사 장애, 예컨대 대사 간 장애를 포함한다. 대사 장애의 비제한적 예는 NASH, NAFLD, 제2형 당뇨병 및 비만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체로 치료될 질환은 대동맥 협착이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 대상체가 섬유증 및 하기: (i) 염증; (ii) 면역 억제; (iii) 증식성 조절이상; (iv) 동종이식편 이식에 대한 필요; (v) 중증 감염의 위험이 있음; (vi) 장기간 TGFβ1 억제 요법을 필요로 함; 및 (vii) 자가면역 상태(들)의 징후 중 1종 이상을 포함한 임상 제시(clinical presentation)를 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 임상 제시에 기초하여 섬유화 장애의 치료를 위한 이소형-특이적, 콘텍스트-의존성 TGFβ1 억제제 또는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 대상체에서 섬유화 장애의 치료를 위한 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 선택하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 섬유화 장애를 갖는 대상체를 위해 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 포함하는 치료 요법을 선택하는 단계이며, 상기 선택은 (i) 섬유화 장애가 섬유증 및 하기: 염증, 면역 억제, 증식성 조절이상 및 동종이식편 이식에 대한 필요 중 1종 이상을 포함한 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 (ii) 단계 (i)에서 결정된 임상 제시에 기초하여 이소형-특이적, 콘텍스트-의존성 TGFβ1 억제제 또는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 포함하는 치료 요법을 선택하는 단계를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 대상체에게 선택된 치료 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 섬유화 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 측면의 한 실시양태에서, 섬유화 장애는 섬유증, 염증, 면역 억제 및 증식성 조절이상을 포함하는 임상 제시를 나타낸다. 예시적 실시양태에서, 섬유화 장애는 골수섬유증이고, 선택된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제이다.
또 다른 실시양태에서, 섬유화 장애는 섬유증, 염증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함하는 임상 제시를 나타낸다. 한 실시양태에서, 섬유화 장애는 섬유증 및 염증을 포함하는 임상 제시를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 섬유화 장애는 변성 질환이다.
한 실시양태에서, 섬유화 장애는 면역 억제 및 증식성 조절이상을 포함하는 임상 제시를 나타낸다. 예시적 실시양태에서, 섬유화 장애는 고형 종양과 연관되고, 선택된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 이소형-특이적 LTBP1/3-특이적 억제제 및/또는 GARP-선택적 억제제이다. 한 실시양태에서, 고형 종양은 악성 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 양성 종양이다. 한 실시양태에서, 대상체는 결합조직형성증, 예를 들어 췌장 결합조직형성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 유섬유종을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 섬유화 장애가 섬유증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함한 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 섬유화 장애가 섬유증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 나타내는 경우에 섬유화 장애를 갖는 대상체에게 유효량의 이소형-특이적, LTBP1/3-특이적 TGFβ1 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 섬유화 장애를 갖는 대상체를 이소형-특이적, LTBP1/3-특이적 TGFβ1 억제제로 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 섬유화 장애가 섬유증, 면역 억제 및/또는 증식성 조절이상을 포함한 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 섬유화 장애가 면역 억제 및/또는 증식성 조절이상과 함께 섬유증을 나타내는 경우에 섬유화 장애를 갖는 대상체에게 유효량의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 섬유화 장애를 갖는 대상체를 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제로 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 억제제, 예를 들어 항체는 섬유증을 치료하거나 그의 증상을 감소시키는데 유효한 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 억제제의 유효량은 대상체에서 치료 효능 및 임상 안전성 둘 다를 달성하는데 유효한 양이다. 한 실시양태에서, 유효량은 세포외 매트릭스에서 TGFβ1 활성을 감소시키는데 유효한 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 섬유증을 감소시키는데 유효한 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 TGFβ1-매개 면역 억제를 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제, 예를 들어 항체는 LTBP-함유, ECM-연관 TGFβ1에 의해 매개되는 TGFβ1의 활성화를 차단할 수 있는 콘텍스트-특이적 억제제이다. 일부 실시양태에서, LTBP는 LTBP1 및/또는 LTBP3이다. 섬유증의 변경을 위한 본 개시내용의 억제제, 예를 들어 항체 및/또는 조성물의 효능을 결정하는데 유용한 검정은 섬유모세포를 계수하기 위한 조직학적 검정 및 관련 기술분야에 공지된 기초 면역조직화학적 분석을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
프로테아제를 수반하는 질환:
TGFβ의 그의 잠복 복합체로부터의 활성화는 힘-의존성 방식으로의 인테그린에 의해 및/또는 프로테아제에 의해 촉발될 수 있다. 증거는 Ser/Thr 프로테아제, 예컨대 트롬빈, 칼리크레인, 케모트립신, 엘라스타제, 플라스민, 뿐만 아니라 ADAM 패밀리의 아연 메탈로프로테아제, 예컨대 ADAM 10 및 ADAM 17, 뿐만 아니라 MMP 패밀리, 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 부류의 프로테아제가 상기 과정에 수반될 수 있다는 것을 시사한다. MMP-2는 기저막의 가장 풍부한 성분인 콜라겐 IV를 분해하여, ECM-연관 TGFβ1 조절에서 소정 역할을 할 수 있는 가능성을 상승시킨다. MMP-9는 종양 진행, 혈관신생, 기질 재형성 및 전이에서 중추적 역할을 하는 것으로 연루되어 왔다. 따라서, ECM에서 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화는 암을 치료하는데 중요할 수 있다.
칼리크레인 (KLK)은 혈장 칼리크레인 및 조직 칼리크레인을 포함하는 트립신- 또는 키모트립신-유사 세린 프로테아제이다. ECM은 악성 성장을 억제하기 위한 구조적 및 신호전달 스캐폴드 및 장벽으로서 작용하는, 조직 항상성에서의 소정 역할을 한다. KLK는 종양 확장 및 침습을 용이하게 할 수 있는 ECM 단백질 및 다른 성분을 분해하는데 소정 역할을 할 수 있다. 예를 들어, KLK1은 특정 유방암에서 고도로 상향조절되고, 프로-MMP-2 및 프로-MMP-9를 활성화시킬 수 있다. KLK2는 잠복 TGFβ1을 활성화시켜, 섬유모세포에 인접한 전립선암이 암 성장에 허용적이도록 만든다. KLK3은 전립선암 (PSA)에 대한 진단 마커로서 널리 연구되어 왔다. KLK3은 플라스미노겐을 플라스민으로 프로세싱하여 이것이 LAP를 단백질분해적으로 절단함으로써 TGFβ1을 직접적으로 활성화시킬 수 있다. KLK6은 알츠하이머병에 대한 잠재적 마커일 수 있다.
TGFβ1의 공지된 활성화제, 예컨대 플라스민, TSP-1 및 αVβ6 인테그린은 모두 LAP와 직접적으로 상호작용한다. LAP의 단백질분해적 절단은 LAP-TGFβ 상호작용을 탈안정화시켜 활성 TGFβ1을 방출시킬 수 있는 것으로 상정된다. 54-LSKLRL-59를 함유하는 영역은 TGFβ1 잠복을 유지하는데 중요한 것으로 시사되었다. 따라서, 상호작용을 안정화시키거나 또는 LAP의 단백질분해적 절단을 차단하는 작용제 (예를 들어, 항체)는 TGFβ 활성화를 방지할 수 있다.
병리학적 상태 (예를 들어, 암)와 연관된 이들 프로테아제 중 다수는 별개의 작용 메카니즘을 통해 기능한다. 따라서, 특정한 프로테아제 또는 프로테아제의 조합의 표적화된 억제는 프로테아제-TGFβ 축을 수반하는 상태의 치료를 위한 치료 이익을 제공할 수 있다. 따라서, TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화를 선택적으로 억제하는 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)가 이러한 질환 (예를 들어, 암)의 치료에 유리할 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 치료될 상태에 따라, 또 다른 프로테아제에 비해 하나의 프로테아제에 의한 TGFβ1 활성화의 선택적 억제가 또한 바람직할 수 있다.
플라스민은 플라스미노겐으로 불리는 전구체 형태로서 생산된 세린 프로테아제이다. 방출시에, 플라스민은 순환에 진입하고, 따라서 혈청에서 검출된다. 상승된 수준의 플라스민은, 가능하게는 종양 세포 운동성, 침습 및 전이를 용이하게 하는 세포외 매트릭스 (예를 들어, 기저막 및 기질 장벽)의 파괴를 수반하는 메카니즘을 통해, 암 진행과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 플라스민은 또한 부착, 증식, 아폽토시스, 암 영양, 산소 공급, 혈관의 형성 및 VEGF의 활성화에 영향을 미칠 수 있다 (Didiasova et al., Int. J. Mol. Sci, 2014, 15, 21229-21252). 추가로, 플라스민은 대식세포의 종양 미세환경 내로의 이동을 촉진할 수 있다 (Philips et al., Cancer Res. 2011 Nov 1;71(21):6676-83 및 Choong et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 2003, 415S, S46-S58). 실제로, 종양-연관 대식세포 (TAM)는 종양 성장, 침습, 전이 및 혈관신생을 촉진하는 그의 능력을 통해 종양발생의 유도인자로 잘 특징화되어 있다.
플라스민 활성은 주로 ECM의 파괴와 관련이 있었다. 그러나, 플라스민이 또한 하류 MMP 및 TGF 베타 활성화를 조절한다는 증거가 증가하고 있다. 구체적으로, 플라스민은 TGF 베타 유전자 생성물의 N-말단 영역으로부터 유래된 잠복성 연관 펩티드 (LAP)의 단백질분해적 절단을 통해 TGF 베타의 활성화를 유발하여 (Horiguchi et al., J Biochem. 2012 Oct; 152(4):321-9), 활성 성장 인자의 방출을 유발하는 것으로 시사되었다. TGFβ1은 암 진행을 촉진할 수 있기 때문에, 이는 TGFb의 플라스민-유도된 활성화가 적어도 부분적으로 이 과정을 매개할 수 있는 가능성을 상승시킨다.
TGFβ1은 또한 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환에서 중요한 역할자인 uPA의 발현을 조절하는 것에 제시되었다 (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597927). uPA는 독립적으로 그의 세포 표면 수용체 (uPAR)에 결합하고 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 촉진함으로써 암 진행 (예를 들어, 부착, 증식 및 이동)을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 연구는 uPA 및/또는 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1)의 발현이 결장직장암 (D. Q. Seetoo, et al., Journal of Surgical Oncology, vol. 82, no. 3, pp. 184-193, 2003), 유방암 (N. Harbeck et al., Clinical Breast Cancer, vol. 5, no. 5, pp. 348-352, 2004) 및 피부암 (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597927)에서의 불량한 예후의 예측인자라는 것을 제시하였다. 따라서, 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 플라스민, TGFβ1 및 uPA 사이의 상호작용은 암 진행을 촉진하는 것에 대한 양성 피드백 루프를 생성할 수 있다. 따라서, 플라스민-의존성 TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 억제제는 플라스민/TGFβ1 신호전달 축에 의존하는 암의 치료에 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 인테그린-비의존성 방식으로 프로테아제-의존성 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 활성화 방식과 무관하게 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있으며, 예를 들어 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 프로테아제-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 세린 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 뿐만 아니라 아연 메탈로프로테아제 (MMP 패밀리), 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13.
일부 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1의 플라스민-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 플라스민- 및 인테그린-유도된 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 잠복 프로TGFβ1에 결합하여 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 방출을 억제한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 고친화도, LTBP-복합체 특이적 억제제는 TGFβ1의 플라스민-의존성 활성화를 억제하는 방법에 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 LTBP-복합체 특이적 억제제는 Ab31, Ab34, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab62, Ab63 및 Ab64 (임의로 Ab42 또는 Ab63) (즉, 본원에 제공된 바와 같은 상응하는 Ab의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편), 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 LTBP-복합체 특이적 억제제는 Ab42, 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 LTBP-복합체 특이적 억제제는 Ab42 또는 그의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)는 암 세포 이동을 억제한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 대식세포 이동을 억제한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 TAM의 축적을 억제한다.
또 다른 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화 (예를 들어, 플라스민)를 억제하고, 이에 의해 대상체에서 암을 치료하는 것인, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 종양 성장의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화 (예를 들어, 플라스민)를 억제하고, 이에 의해 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 것인, 상기 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
ECM 조절이상을 수반하는 질환
세포외 매트릭스는 세포를 둘러싸는 세포-분비 네트워크이고, 주로 프로테오글리칸 및 섬유성 단백질로 구성되며, 이들 중 가장 풍부한 것은 콜라겐이다. 본원에 개시된 신규 항체는 세포외 매트릭스 조절이상과 연관된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 세포외 매트릭스 조절이상과 연관된 질환은 전형적으로 근섬유모세포-유도된 병리상태이고, 암, 섬유증 및 심혈관 질환을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Lampi and Reinhart-King (2018) "Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease: From molecular mechanisms to clinical trials" Sci Tarnsl Med 10(422): eaao0475]에서 검토됨). 섬유화 상태의 진행은 ECM 내로 침착된 매트릭스 성분의 증가된 수준 및/또는 ECM의 유지/재형성을 수반한다. TGFβ1이 적어도 부분적으로 이 과정에 기여한다. 이는, 예를 들어 ECM 성분, 예컨대 콜라겐의 증가된 침착이 ECM의 기계물리적 특성 (예를 들어, 매트릭스/기질의 강성)을 변경시킬 수 있고, 이 현상이 TGFβ1 신호전달과 연관된다는 관찰에 의해 지지된다. TGFβ1의 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 이러한 과정을 차단하는데 사용되어 ECM 변경을 수반하는 질환 진행, 예컨대 섬유증에 대응할 수 있다. 이러한 억제제의 LTBP-아암은 LTBP1 및/또는 LTBP3에 의해 제시된 ECM-연관 프로/잠복 TGFβ 복합체를 직접적으로 차단함으로써, 질환 함요에서 복합체로부터의 성장 인자의 활성화/방출을 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 ECM 강성을 정상화하여 인테그린-의존성 신호전달을 수반하는 질환을 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린은 α11 쇄, β1 쇄 또는 둘 다를 포함한다.
따라서, 항체는 세포외 매트릭스 조절이상을 갖는 질환으로 진단된 대상체에게 질환을 치료하는데 유효한 양으로 투여될 수 있다. 항체의 치료 유효량은 근섬유모세포의 1종 이상의 마커, 예컨대 α-SMA의 발현을 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 양은 이환 조직 (예를 들어, 섬유화 조직)의 세포외 매트릭스의 강성을 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 양은 TGFβ1 하류 이펙터, 예컨대 SMAD2 및/또는 SMAD3의 인산화를 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab31, Ab34, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab62, Ab63 및 Ab64 (임의로 Ab42 또는 Ab63), 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab42 또는 그의 항원-결합 단편이다.
상피-중간엽 이행 (EMT)을 수반하는 질환:
EMT (상피 중간엽 이행)는 치밀 접합부를 갖는 상피 세포가 중간엽 특성 (표현형), 예컨대 느슨한 세포-세포 접촉으로 전환되는 과정이다. 상기 과정은 배아발생, 상처 치유, 암 전이 및 섬유증을 포함한, 수많은 정상 생물학적 과정뿐만 아니라 병리학적 상황에서 관찰된다 (예를 들어, 문헌 [Shiga et al. (2015) "Cancer-Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth." Cancers, 7: 2443-2458]에서 검토됨). 일반적으로, EMT 신호는 주로 TGFβ에 의해 유도되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 많은 유형의 암은 보다 불량한 예후와 상관관계가 있는 중간엽 표현형 (예컨대 CAF)을 향한 세포의 전환분화를 수반하는 것으로 보인다. 따라서, TGFβ1의 LTBP-특이적 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 EMT에 의해 개시 또는 유도되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 실제로, 본원 (예를 들어, 도 12 및 13)에 예시된 데이터는 이러한 억제제가 생체내 CAF 마커, 예컨대 α-SMA, Col1 (제I형 콜라겐) 및 FN (피브로넥틴)의 발현을 억제하는 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
매트릭스 강성화 및 재형성을 수반하는 질환
섬유화 상태의 진행은 ECM 내로 침착된 매트릭스 성분의 증가된 수준 및/또는 ECM의 유지/재형성을 수반한다. TGFβ1이 적어도 부분적으로 이 과정에 기여한다. 이는, 예를 들어 ECM 성분, 예컨대 콜라겐의 증가된 침착이 ECM의 기계물리적 특성 (예를 들어, 매트릭스/기질의 강성)을 변경시킬 수 있고, 이 현상이 TGFβ1 신호전달과 연관된다는 관찰에 의해 지지된다. 이러한 개념을 확인하기 위해, 본 발명자들은 프로TGFβ 및 LTBP1로 형질감염되고 한정된 강성 (예를 들어, 5 kPa, 15 kPa 또는 100 kPa)을 갖는 규소-기재 기질 상에서 성장된 1차 섬유모세포에서 TGFβ의 인테그린-의존성 활성화에 영향을 미치는데 있어서 매트릭스 강성의 역할을 평가하였다. 보다 큰 강성을 갖는 매트릭스는 TGFβ1 활성화를 증진시키며, 이는 LTBP1/3과 연관된 TGFβ1 활성화에 결합하여 그를 억제할 수 있는 항체 및 그의 항원-결합 부분에 의해 억제될 수 있다. 이들 관찰은 TGFβ1이 ECM 특성 (예컨대 강성)에 영향을 미치고, 이는 차례로 TGFβ1 활성화를 추가로 유도할 수 있으며, 이는 질환 진행을 반영한다는 것을 시사한다. 따라서, LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP3-TGFβ1의 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 부분, 예컨대 본원에 기재된 것은 이러한 과정을 차단하는데 사용되어 ECM 변경을 수반하는 질환 진행, 예컨대 섬유증, 종양 성장, 침습, 전이 및 결합조직형성에 대응할 수 있다. 이러한 억제제는 LTBP1 및/또는 LTBP3에 의해 제시되는 ECM-연관 프로/잠복 TGFβ 복합체를 직접적으로 차단함으로써, 질환 함요에서 복합체로부터의 성장 인자의 활성화/방출을 방지할 수 있다.
섬유증:
물리적 손상/외상, 독성 물질 및/또는 감염으로 인한 조직 손상 또는 만성 손상에 반응하여, 섬유모세포를 포함한 여러 세포 유형, 여러 상이한 유형의 면역 세포 및 상주 상피 및 내피 세포를 수반하는 자연 수복 과정이 시작된다. 그러나, 점검되지 않고 방치되면, 이러한 과정은 세포외 매트릭스 (ECM)의 과도한 축적 및 섬유증으로 이어질 수 있으며, 이는 차례로 조직 기능의 점진적 상실 및 기관 부전으로 이어질 수 있다 (Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).
섬유증은 폐, 신장, 간, 심장 및 피부를 포함한 여러 상이한 기관에서 발생할 수 있다. 기관에 비의존성으로, 섬유화 반응은 염증, 변경된 상피-중간엽 상호작용 및 섬유모세포의 증식을 특징으로 한다. 섬유증의 특징 중 하나는 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 분화이며, 이는 ECM의 조절이상에 크게 기여한다. 그러나, 근섬유모세포는 또한 다른 세포 공급원 (예를 들어, 내피 세포, 상피 세포 및 중간엽 줄기 세포)으로부터 유래하는 것으로 제안되었다 (Kim, K.K. et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2017; Okabe, H. Histol. Histophathol., 2016, 31, 141-148; 및 Li, C et al., Nat Commun., 2016, 7, 11455). 더욱이, 면역 세포는 근섬유모세포의 분화를 촉진하고, ECM 침착을 자극하며, 추가의 면역 세포를 손상된 조직으로 동원하는 시토카인 및 케모카인을 분비함으로써 상기 과정에서 중요한 역할을 한다 (Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).
섬유화 조직과 유사하게, 암-연관 섬유모세포의 활성화는 종양 환경에서 발생할 수 있으며, 이는 과량의 ECM을 생산한다. ECM은 다른 세포 (예를 들어, 종양발생촉진 면역 세포)의 침윤을 위한 스캐폴드 및 세포 이동을 위한 기질을 제공한다. 다른 경우에, 과량의 ECM은 항종양발생 면역 세포에 대한 장벽으로서 작용할 수 있다.
TGFβ는 섬유화 반응의 중앙 조정자로서 인식된다. TGFβ는 근섬유모세포 분화를 촉진하고, 면역 세포를 동원하며, 상피 및 내피 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 특히, TGFβ는 ECM 및 기저막 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 오스테오폰틴, 테나신, 엘라스틴, 데코린의 생산을 상향조절한다. TGFβ-유도된 근섬유모세포 분화는 ECM 단백질의 추가의 침착, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 분비 및 근섬유모세포 증식으로 이어질 수 있다 (Fabregat et al., FEBS J. 2016, 283, 2219-2232; Meng et al., Nat. Rev. Nephrol. 2016, 12, 325-338; 및 Kulkarni et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2016, 54, 751-760). 추가적으로, TGFβ는 혈관 평활근 세포 (VSCM)에서 수축 단백질 및 콜라겐 I에 영향을 미치는 표현형 변화를 매개하고, 근섬유모세포 및 다른 기질 세포를 활성화시켜 콜라겐 가교 단백질, 예컨대 리실 옥시다제 (LOX) 패밀리의 매트릭스-재형성 효소의 합성을 증진시킬 수 있다 (Busnadiego et al., Mol. Cell. Biol. 2013, 33, 2388-2401). 더욱이, TGFβ는 섬유화유발 세포 유형, 예컨대 근섬유모세포 및 CAF의 분화에 기여하는 EMT 및 EndMT 둘 다를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, TGFβ는 상피 아폽토시스를 유도하여, 다른 조직들 중에서도 폐 및 간 섬유증을 촉진할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Barbas-Filho et al., J. Clin. Pathol. 2001, 54, 132-138; 및 Wang et al., Dev. Dyn. 2017, 247, 492-508).
선천적이든 동원되든, 대식세포는 조직 손상 및 복구에 반응하는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 그러나, 특정 신호시에 이들은 섬유화유발 상태가 될 수 있다. 다른 시토카인들 중에서도, TGFβ는 또한 염증유발성인 M2 대식세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 활성화시에, 이들 대식세포는 TGFβ, ECM 성분, 혈관신생 인자 및 화학주성 인자를 포함한 그 자신의 시토카인을 분비한다. M2 대식세포는 TGFβ-유도된 폐 섬유증에 필수적인 것으로 밝혀졌다 (Murray et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, 43, 154-162).
많은 유형의 섬유증에서 질환 진행에 대한 M2-유형 대식세포의 중요성을 가리키는 증가하는 증거에 비추어, LTBP1/3-연관 TGFβ1 단독의 콘텍스트-선택적 억제 (즉, TGFβ1 활성의 대식세포-연관, LRRC33-아암을 다루지 않으면서)가 생체내에서 강력한 항섬유화 효과를 생성하기에 충분할 수 있는지 여부에 대한 의문이 남아있었다. 그러나, 놀랍게도, 본원에 제시된 데이터는 매트릭스-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3-프로TGFβ1)을 선택적으로 표적화하는 것이, TGFβ1의 소위 콘텍스트-비의존성 억제제를 사용하여 모든 4종의 공지된 LLC (예를 들어, LTBP1/3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)를 표적화하는 것만큼, 다수의 전임상 모델에서 항섬유화 효과를 달성하는데 - 보다 우수하지는 않더라도 - 효과적인 것으로 보이고 (예를 들어, 도 19 및 20 참조), GARP-프로TGFβ1 억제를 통해 매개되는 T 세포 자극을 촉발하지 않으면서 그렇게 한다는 것을 시사한다. 더욱이, 이전에 개시된 LTBP1/3 복합체-선택적 항체는 전임상 (예를 들어, 설치류) 및 임상 (예를 들어, 인간) 사용 둘 다에 유리할 강건한 종 교차-반응성이 결여되었다. 이소형-선택성 및 콘텍스트-선택성 둘 다를 부여할 희귀 에피토프를 구하는 것이 또한 유리한 종 교차-반응성 프로파일을 가능하게 할지 여부는 명확하지 않았다. 유리하게는, 본원에 개시된 신규 항체는 이들 기준 모두를 소유한다.
본 발명에 따르면, 이소형-특이적 TGFβ1, 예컨대 본원에 기재된 것은 대상체에서 섬유증 (예를 들어, 섬유화 적응증, 섬유화 상태)의 치료에 사용된다. 본 발명을 수행하는데 적합한 억제제는 섬유증을 변경시키거나 호전시키는데 유용할 수 있는 본 개시내용에 따른 항체 및/또는 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 이러한 항체 및/또는 조성물은 다양한 유형의 제시 분자에 의해 제시된 TGFβ1을 표적화할 수 있는 TGFβ1의 선택적 길항제이다. TGFβ1은 섬유화 반응의 중앙 조정자로서 인식된다. TGFβ를 표적화하는 항체는 수많은 전임상 모델에서 섬유증을 감소시킨다. 이러한 항체 및/또는 항체-기반 화합물은 LY2382770 (일라이 릴리, 인디애나주 인디애나폴리스)을 포함한다. 또한, 미국 특허 번호 US 6,492,497, US 7,151,169, US 7,723,486 및 미국 출원 공개 번호 2011/0008364 (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것이 포함된다. 선행 기술 TGFβ 길항제는, 예를 들어 TGFβ의 인테그린-의존성 활성화를 표적화하고 차단하는 작용제를 포함한다.
그러나, 증거는 이러한 선행 기술 작용제가 이소형-특이적 억제를 매개하지 않을 수 있고, TGFβ2 및/또는 TGFβ3의 정상 기능을 의도치 않게 차단함으로써 원치않는 효과를 유발할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, 본원에 제시된 데이터는 이러한 개념을 지지한다. 정상 (비이환) 폐 조직은 비교적 낮으나 측정가능한 수준의 TGFβ2 및 TGFβ3을 함유하지만, 현저하게 더 적은 TGFβ1을 함유한다. 이와 비교하여, 특정 질환 상태, 예컨대 섬유증에서, TGFβ1은 다른 이소형에 비해 우선적으로 상향조절된다. 바람직하게는, 이러한 상태의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 길항제는 조직에서 장성 신호전달을 매개하도록 정상적으로 발현되는 다른 이소형의 기능을 보존하면서, 단지 질환-유도 또는 질환-연관 이소형에 대해서만 그의 억제 활성을 발휘한다. 선행 기술 억제제 (LY2109761, 소분자 TGFβ 수용체 길항제, 및 αVβ6 인테그린을 표적화하는 모노클로날 항체) 둘 다는 비-이환 래트 BAL에서 TGFβ 하류 장성 신호전달을 억제하여, 이들 억제제가 원치않는 부작용을 유발할 수 있는 가능성을 상승시키는 것으로 밝혀졌다. 대안적으로 또는 추가적으로, TGFβ의 인테그린-의존성 활성화를 표적화하고 차단하는 작용제는, 다양한 세포 유형에 의해 발현되고 발병기전에서 소정 역할을 하는 수많은 인테그린 유형 중에서, 질환-연관 TGFβ1 활성화를 담당하는 인테그린의 하위세트만을 차단할 수 있다. 추가로, 이러한 길항제가 TGFβ1 이소형의 인테그린-매개 활성화를 선택적으로 차단할 수 있는 경우에도, 이는 다른 방식, 예컨대 프로테아제-의존성 활성화에 의해 촉발되는 TGFβ1 활성화를 차단하는데 비효과적일 수 있다. 따라서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 이소형 선택성을 유지하면서 특정한 활성화 방식에 관계없이 TGFβ1의 활성화 단계를 방지하는 것을 목표로 한다.
세포-연관 항원 복합체에 비해 매트릭스-연관 항원 복합체를 우선적으로 억제하는 (즉, 콘텍스트-편향을 나타내는) 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 특정 임상 상황에서 치료 이점을 제공할 수 있는 것으로 추가로 고려된다 (예를 들어, 본원에 기재된 LTBP-특이적 억제제). 예를 들어, TGFβ1 콘텍스트-비의존성 억제제 (모든 4종의 항원 복합체를 표적화함)는 세포-연관 TGFβ1 (예를 들어, 조절 T 세포 상에서 발현되는 GARP-TGFβ1)의 표적화를 통해 면역 활성화를 증가시킬 수 있다. 면역 활성화는 특정 환자, 예를 들어 자가면역 질환을 갖거나 패혈증의 위험이 있는 환자에게 불리할 수 있다. 따라서, 콘텍스트-편향 항체는 면역 활성화를 최소화하면서 매트릭스-연관 TGFβ1 복합체와 연관된 질환 (예를 들어, 섬유증)을 치료하는데 유용할 수 있다.
이전에, 이소형-특이적 TGFβ3 억제제가 특정한 질환 상태에서 추가의 치료 이익을 제공할 수 있는 것으로 고려되었다. 예를 들어, TGFβ1 억제제로 치료될 특정 섬유화 질환은 또한 질환 조직 (예를 들어, 섬유화 조직)이 둘 다의 이소형을 발현하는 것을 특징으로 하는 TGFβ3-양성일 수 있다 (즉, TGFβ1+/TGFβ3+ 섬유화 조직). 따라서, 본 발명은 이러한 상태의 치료에서의 이소형-선택적 TGFβ3 억제제와 함께 이소형-선택적 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다.
본 개시내용의 항체 및/또는 조성물이 치료적으로 사용될 수 있는 섬유화 적응증은 폐 적응증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD), 알레르기성 천식, 급성 폐 손상, 호산구성 식도염, 폐동맥 고혈압 및 화학적 기체-손상), 신장 적응증 (예를 들어, 당뇨병성 사구체경화증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 만성 신장 질환 (CKD), 신장 이식 및 만성 거부와 연관된 섬유증, IgA 신병증, 및 용혈성 요독성 증후군), 간 섬유증 (예를 들어, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 만성 바이러스성 간염, 기생충혈증, 선천성 대사 이상, 독소-매개 섬유증, 예컨대 알콜 섬유증, 비-알콜성 지방간염-간세포성 암종 (NASH-HCC), 원발성 담즙성 간경변증, 및 경화성 담관염), 심혈관 섬유증 (예를 들어, 심근병증, 비대성 심근병증, 아테롬성동맥경화증 및 재협착), 전신 경화증, 피부 섬유증 (예를 들어, 전신 경화증에서의 피부 섬유증, 미만성 피부 전신 경화증, 경피증, 병리학적 피부 반흔형성, 켈로이드, 수술후 반흔형성, 반흔 교정 수술, 방사선-유도된 반흔형성 및 만성 상처), 눈-관련 상태, 예컨대 망막하 섬유증, 포도막염 증후군, 특발성 복막후 섬유증과 연관된 포도막염, 외안근 섬유증, 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 I) 또는 조직적합성 항원과 연관된 안질환, 황반 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)에서의 망막하 섬유증 및 암 또는 속발성 섬유증 (예를 들어, 골수섬유증, 두경부암, M7 급성 거핵모구성 백혈병 및 점막염)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 섬유증과 관련된 다른 질환, 장애 또는 상태 (변성 장애 포함)는 자궁선근증, 자궁내막증, 마르팡 증후군, 강직 피부 증후군, 경피증, 류마티스 관절염, 골수 섬유증, 크론병, 궤양성 결장염, 전신 홍반성 루푸스, 근육 이영양증 (예컨대 DMD), 파킨슨병, ALS, 듀피트렌 구축, 카무라티-엥겔만병, 신경 반흔형성, 치매, 증식성 유리체망막병증, 각막 손상, 녹내장 배액 수술 후의 합병증 및 다발성 경화증 (MS)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 많은 이러한 섬유화 적응증은 또한 이환 조직(들)의 염증과 연관되며, 이는 면역 성분의 관여를 나타낸다. 이러한 염증은 이상 면역 세포 집단, 예컨대 증가된 수의 Th17 세포, 감소된 수의 Treg 세포 및/또는 둘 다를 동반할 수 있다. 각각의 경우에, 이환된 환자는 증가된 Th17/Treg 세포 비를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 적응증은 기관 섬유증, 예컨대 폐의 섬유증 (예를 들어, IPF), 신장의 섬유증 (예를 들어, CKD와 연관된 섬유증), 간의 섬유증, 심장 또는 심장 조직의 섬유증, 피부의 섬유증 (예를 들어, 경피증), 자궁의 섬유증 (예를 들어, 자궁내막, 자궁근층), 및 골수의 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 환자에서 기관 이식에 대한 필요를 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.
IPF를 치료하기 위해, 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자는 가족성 IPF를 갖는 자 및 산발성 IPF를 갖는 자를 포함한다. 치료 유효량의 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 투여는 폐 조직에서 근섬유모세포 축적을 감소시키고, 콜라겐 침착을 감소시키고, IPF 증상을 감소시키고, 폐 기능을 개선시키거나 유지하고, 생존을 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 IPF의 섬유화 환경 내에서의 ECM-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1)의 활성화를 차단한다.
비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 단순 또는 고립성 지방증 또는 비알콜성 지방간 (NAFL)으로도 공지된 간의 단순 지방 침윤으로 시작되는 조직학적 변화의 스펙트럼을 포함하며, 이는 점진적으로, 때때로 수십년에 걸쳐, 만성 염증 (지방간염 또는 NASH), 섬유증 및 궁극적으로 간경변증의 발생으로 진행될 수 있다. NAFL 환자의 하위군만이 NASH 및 후속 간경변증으로 진행될 것이다. 현재, 이러한 환자 군을 확인하기 위한 명확한 기준은 없다. NAFLD는 북미에서 만성 간 질환의 가장 흔한 원인이다. 현재, NASH의 치료를 위한 승인된 약물은 없다. NASH의 높은 유병률, 연관된 이환율, 말기 간 질환의 증가하는 부담 및 기관 이식을 위한 간의 제한된 이용가능성을 고려하면, NASH 및 NAFLD의 진행을 늦추거나, 중단시키거나 또는 역전시킬 요법을 확인하는 것이 미충족 의료 필요를 해결해줄 것이다.
TGFβ가 간 섬유증에서 중추적 역할자라는 것에 의견이 일치한다 (예를 들어, 문헌 [Dewidar et al., Cells 2019, 8, 1419] (이의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 검토됨). 이소형-특이적 TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 제공된 것 (즉, LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 대해 선택적인 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제, 또는 "매트릭스-표적화" 억제제)은 간의 섬유화 상태, 예컨대 비알콜성 지방간 (NAFL) 및 지방간과 연관된 섬유증 (예를 들어, NASH)을 치료하는데 사용될 수 있다. 지방간은 염증이 발생할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 지방간으로 인한 간의 염증 (즉, 지방간염)은 반흔형성 (섬유증)으로 발달될 수 있으며, 이는 이어서 종종 간경변증 (간의 구조를 왜곡시키고 그의 기능을 손상시키는 반흔형성)으로 진행된다. 억제제는 따라서 이러한 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 간의 섬유화 환경 내에서의 ECM-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1)의 활성화를 차단한다. 이러한 상태를 갖는 대상체에서의 억제제의 투여는 억제제로 치료되지 않은 대조군 집단과 비교하여, 1종 이상의 증상을 감소시키고/거나, 질환의 진행을 방지 또는 지체시키고/거나, 간에서의 지방 축적을 감소 또는 안정화시키고/거나, 질환-연관 바이오마커 (예컨대 혈청 콜라겐 단편)를 감소시키고/거나, 간 반흔형성을 감소시키고/거나, 간 강직을 감소시키고/거나, 달리 억제제로 치료된 환자 집단에서 임상적으로 의미있는 결과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 NASH 환자에서 감소된 간 지방 및 감소된 섬유증 (예를 들어, 반흔형성) 둘 다를 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 NASH 환자에서 지방간염을 악화시키지 않으면서 섬유증의 적어도 하나의 병기만큼의 개선을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 NASH 환자에서 간부전 및/또는 간암의 발생률을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 대조군과 비교하여, 요법의 시작 후, 예를 들어 12-36주에 평가시, 다중 염증성 또는 섬유화 혈청 바이오마커의 수준을 정상화시킬 수 있다. NASH 환자에서의 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 NASH를 포함한 대사 증후군의 임상 징후를 갖는 환자에서 대사 조절을 일반적으로 증진시킬 수 있는 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 받은 환자에서 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, NASH 또는 NAFLD 환자에서, 이소형-특이적, 매트릭스-표적화, TGFβ1 억제제는 아세틸 CoA 카르복실라제 억제제 (ACCi) (예를 들어, 피르소코스타트 (일명 GS-0976) 또는 PF-05221304)를 받은 환자에서 투여될 수 있다. 본원에 기재된 개선된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제와 조합하는데 유용할 수 있는 다른 치료제는 GLP-1 수용체 효능제 또는 유사체 (예를 들어, 세마글루티드), 파르네소이드 X 수용체 (FXR) 효능제 (예를 들어, GS-9674; 일명 실로펙서), ASK1 억제제 (예를 들어, 세론세르팁); 오베티콜산, PPAR 효능제 (예를 들어, GFT505; 일명 엘라피브라노르); 니타족사니드, 케토헥소키나제 (KHK) 억제제 (예를 들어, PF-06835919); 미오스타틴 억제제 및/또는 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 2 (DGAT2) 억제제 (예를 들어, PF-06865571)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 치료제 중 임의의 1종 이상은 본 개시내용의 이소형 특이적 TGFβ1 억제제, 예를 들어 FXR 효능제, ACC 억제제 및/또는 GLP-1 유사체와 조합된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 대상체에서의 대사 간 질환, 예컨대 NASH 및 NAFLD 및 그와 연관된 간 섬유증의 치료에서 미오스타틴 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 대상체는 또한 제2형 당뇨병 및/또는 비만을 앓고 있을 수 있다. 사용되는 TGFβ 억제제는 바람직하게는 TGFβ1-선택적 억제제, 보다 바람직하게는 LTBP1/2-연관 TGFβ1을 표적화하는 콘텍스트-선택적 TGFβ1-선택적 억제제, 예컨대 본원에 개시된 것이다. 미오스타틴 억제제는 바람직하게는 미오스타틴-선택적 억제제, 예컨대 SRK-015 (예를 들어, WO2017/218592A1 참조) 및 트레보그루맙 또는 그의 임의의 변이체 또는 WO 2016/098357에 따른 항체이다.
일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 MRI-PDFF에 의해 측정시 간 지방을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 간 지방의 감소는 적어도 20%, 예를 들어 ≥ 20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45% 또는 ≥ 50%이다. 일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 혈청 ALT 및/또는 GGT를 적어도 20%, 예를 들어 ≥ 20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45% 또는 ≥ 50%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 담즙산 합성을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단독요법으로서 또는 1종 이상의 추가의 요법과 함께 (예를 들어, 조합 요법), 본 개시내용의 TGFβ1 억제제는 NASH를 치료하는데 유효할 수 있다. "유효 치료"는 간 지방증, 간 강직, 간 생화학 및 혈청 섬유증 마커에서의 개선을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 12-주 치료는 환자의 적어도 50%에서 기준선으로부터 12주까지 자기 공명 영상화-양성자 밀도 지방 분율 (MRI-PDFF)에 의해 측정시 간 지방의 적어도 30 퍼센트의 유의한 감소를 유발할 수 있다. 감소된 담즙산 합성의 마커와 함께 적어도 25%의 중앙 상대 감소의 혈청 ALT 및 적어도 25%의 GGT를 포함한 간 생화학 시험에서의 개선이 12주에 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, NASH 환자는 진행성 간 섬유증 (F3/F4기)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 F3기 진행성 간 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 간경변증을 특징으로 하는 F4기 간 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, NASH 환자는 간세포성 암종 및/또는 식도 정맥류가 발생하거나 발생할 위험이 있다.
비알콜성 지방간염 임상 연구 네트워크 병리학 위원회에 의해 유래된 분류에 따른 비-알콜성 지방간 질환에서의 섬유증 병기결정이 하기에 제공된다:
섬유증의 병기
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치료 이익은 또한 질환의 부담 및 환자-보고 결과에 의해 평가될 수 있다. NASH는 또한 환자-보고 결과 (PRO)를 통해 측정된, 병태를 가지고 살아가는 사람의 삶의 질에 영향을 미친다. PRO는 치료 전 (예를 들어, 기준선)에 만성 간 질환 설문지 (CLDQ-NASH)와 같은 도구, 특히 신체 건강-관련 점수와 관련된 것을 사용하여 평가될 수 있다.
TGFβ1 억제제 (예컨대 본원에 기재된 LTBP1/3 복합체-선택적 억제제)를 단독으로 (예를 들어, 단독요법) 또는 또 다른 요법과 조합하여 사용한 치료는 기준선과 비교하여 또는 집단 규준의 것과 비교하여 PRO를 개선시키는데 유효할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 신체 기능, 신체 통증, 전반적 건강 및 활력을 포함한 PRO에서의 장애와 연관될 수 있다. TGFβ1 억제제 (예컨대 본원에 기재된 LTBP1/3 복합체-선택적 억제제)를 단독으로 (예를 들어, 단독요법) 또는 또 다른 요법과 조합하여 사용한 치료는 당뇨병 (예를 들어, 제2형 당뇨병) 및/또는 비만을 갖는 대상체 중에서 신체 건강-관련 점수 (예컨대 PRO)를 개선시키는데 유효할 수 있다.
문헌에 공개된 연구는 조절 T 세포 (Treg)가 보다 큰 중증도를 갖는 후기 섬유증으로의 간 질환 진행에 소정 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, 장(Zhang) 등은 간 경변증의 지속이 섬유증 해소 과정을 억제하는 간내 조절 T 세포에 의해 유지된다는 것을 보고하였다 (Transl Res. 2016; 169: 67-79.e1-2). 코바야시(Kobayashi) 등은 Treg가 간암발생으로 지칭되는 과정인 간 섬유증의 간세포성 암종 (HCC)으로의 진행에 수반된다는 것을 시사하였다 (Clin Cancer Res. 2007; 13(3): 902-911).
따라서, 질환 유형 및 질환 진행 병기에 맞추어진 적합한 TGFβ 억제제의 주의깊은 선택이 특정한 환자 또는 환자 집단에 대한 치료 이익을 최대화하기 위해 고려되어야 하는 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 매트릭스-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1)을 표적화하는 TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제, 예컨대 본원에 개시된 것은 초기 간 질환, 예컨대 비알콜성 지방간 ("NAFL") 및 NASH와 연관된 비경변성 간 섬유증의 치료에 사용하기 위해 선택된다. 비경변성 간 섬유증은 1-3기의 간 섬유증을 포함한다. TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제는 질환을 치료하는데, 예를 들어 NAFL 및 비경변성 NASH의 진행을 늦추거나, 중단시키거나 또는 역전시키는데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 바람직하게는, 유효량은 간경변증 및 간경변증 합병증으로의 진행을 예방하고/거나, 간 이식에 대한 필요를 감소시키고/거나, 생존을 개선시키기에 충분하다. 일부 실시양태에서, 효능은, 예를 들어 염증 변화의 감소, 섬유증의 개선 또는 둘 다에 의해 제시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 대사 상태, 예컨대 비만, 제2형 당뇨병을 갖는다. 비경변성 NASH를 갖는 대상체는, 1기 섬유증보다 크지만 4기 섬유증보다 작은 NASH 임상 연구 네트워크 (CRN) 섬유증 점수와 함께, 염증 및 풍선화에서 각각 적어도 1점으로 4점 이상의 NASH 활성 점수 (NAS)를 갖는 자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 전체 조직병리학 판독시 지방간염의 해소를 달성하고, NASH CRN 섬유증 점수에서 간 섬유증을 악화시키지 않는다. 지방간염의 해소는 지방간 질환 부재 또는 지방간염이 없는 고립성 또는 단순 지방증 및 염증에 대해 0-1, 풍선화에 대해 0 및 지방증에 대해 임의의 값의 NAS 점수; 또는 1기 이상의 간 섬유증의 개선 (NASH CRN 섬유증 점수) 및 지방간염의 악화 부재 (풍선화, 염증 또는 지방증에 대해 NAS의 증가 부재로 정의됨); 또는 상기 정의된 바와 같은 지방간염의 해소 및 섬유증의 개선 둘 다로서 정의된다.
일부 실시양태에서, 매트릭스-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1)을 표적화하는 TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제, 예컨대 본원에 개시된 것은 대상성 간경변증을 동반한 NASH의 치료에 사용하기 위해 선택된다. NASH-연관 대상성 간경변증은 조직병리학에 의해 명백한 유의한 반흔 형성을 특징으로 하며, 여기서 간세포는 조밀한 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸인 결절로 클러스터링되어 있다. TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제는 섬유증의 진행을 중단 또는 늦추고/거나, 임상 대상부전을 예방하고/거나, 간 이식에 대한 필요를 감소시키고/거나, 생존을 개선시키는데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다.
비대상성 간경변증을 동반한 NASH는 하기 기준 중 1가지 이상을 특징으로 할 수 있다: 문맥 고혈압 (문맥 고혈압의 증거는 낮은 혈소판 수, 식도 정맥류, 복수, 간성 뇌병증의 병력, 비장비대를 포함할 수 있음); 상승된 빌리루빈; 또는 상승된 국제 정규화 비 또는 연장된 프로트롬빈 시간. 따라서, 대상성 간경변증을 동반한 NASH를 갖는 환자는 상기 언급된 비대상성 간경변증 기준 중 1가지 이상을 충족시키지 않는 환자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 매트릭스-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1)을 표적화하는 TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제, 예컨대 본원에 개시된 것은 비대상성 간경변증을 동반한 NASH 또는 간 섬유증과 연관된 HCC의 치료에 사용하기 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 간경변증 또는 HCC의 징후를 특징으로 하는 후기 또는 말기 간 질환으로의 질환 진행시에, TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제는 간 경변증 또는 HCC를 치료하는데 유효한 양의 매트릭스-연관 및 면역 세포-연관 TGFβ1 둘 다, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1를 표적화할 수 있는 TGFβ1-선택적, 콘텍스트-비의존성 억제제 (예를 들어, WO 2020/014473 참조)로 대체된다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-선택적, 콘텍스트-선택적 억제제 및/또는 TGFβ1-선택적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 단독요법으로서 또는 1종 이상의 추가의 요법과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 대조군과 비교하여, 요법의 시작 후, 예를 들어 12-36주에 평가시, 다중 염증성 또는 섬유화 혈청 바이오마커의 수준을 정상화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 염증성 또는 섬유화 바이오마커는 NAFLD의 중증도를 평가하고/거나 (간 지방증의 수준을 측정함으로써), 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 바이오마커 및 패널은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다:
i) 지방간 지수 (BMI, 허리 둘레, 혈청 트리글리세리드 및 감마-글루타밀트랜스퍼라제 (GGT));
ii) 간 지방증 지수 (혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST):알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 비, BMI, 성별 및 당뇨병의 존재);
i) NAFLD 간 지방 점수 (혈청 ALT, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드, 헤모글로빈 A1c 및 백혈구 수);
ii) 스테아토테스트(SteatoTest) (바이오프레딕티브(BioPredictive)) (총 빌리루빈, GGT, α2-마크로글로빈, 합토글로빈, ALT, 아포지단백질 AI, 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, 글루코스의 혈청 수준 (연령 및 성별에 대해 조정됨) 및 BMI); 및
iii) NAFLD 릿지 점수 (ALT, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드, 헤모글로빈 A1c의 혈청 수준, 백혈구 수 및 동반이환율 데이터 (및 고혈압의 존재)).
일부 실시양태에서, 영상화 바이오마커가 간 지방증의 수준을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 영상화 바이오마커는 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 초음파검사, 제어 감쇠 파라미터 (CAP), MRI-추정 양성자 밀도 지방 분율 (MRI-PDFF) 및 자기 공명 분광분석법 (MRS).
간 생검은 NASH 진단을 위한 현행 표준이지만, 병리학자들 사이의 변동성은 이러한 진단 방법의 유효성을 제한한다. 따라서, 지방간 진행 억제 (FLIP) 알고리즘 (조직학적 지방증, 활성 및 섬유증 점수를 포함함)의 사용이 생검에 의한 NASH 진단의 일관성을 개선시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 많은 비침습적 바이오마커가 또한 질환을 진단하고 모니터링하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 염증성 또는 섬유화 바이오마커는 NASH의 중증도를 평가하고/거나, 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 혈액 바이오마커는 다음을 포함할 수 있다:
i) 아폽토시스 마커, 예컨대 CK18 단편, 총 시토케라틴 및 sFAS;
ii) 염증성 마커, 예컨대 CRP, TNF, IL-8 및 CXCL10;
iii) 지질 산화 생성물, 예컨대 11-HETE, 9-HODE, 13-HODE, 12-옥소-ODE, LA-13-HODE (oxNASH점수) 및 11,12-디HETrE;
iv) 리소솜 효소, 예컨대 카텝신 D; 및
v) 조합 패널, 예컨대 NASH테스트 (바이오프레딕티브) 및 NASH 진단 패널 (당뇨병, 성별, BMI 및 트리글리세리드, CK18 단편 및 총 CK18의 혈청 수준을 포함함).
일부 실시양태에서, 바이오마커 및 관련 패널은 섬유증 및/또는 간경변증의 수준을 진단하고/거나, 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 간 섬유증 및 간경변증의 비침습적 시험은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: AST:ALT 비, AST:혈소판 비 지수, 섬유증-4 지수 (연령, AST, ALT 및 혈소판 수), NAFLD 섬유증 점수 (연령, BMI, 공복 글루코스 장애 및/또는 당뇨병, AST ALT, 혈소판 수 및 알부민), BARD 점수 (AST, ALT, BMI 및 당뇨병).
구체적 섬유증 마커 및 패널이 또한 유용할 수 있고, 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 히알루론산; PIIPNP; 프로-C3; TIMP1; 라미닌; 증진된 간 섬유증 (ELF) 패널 (PIINP, 히알루론산, TIMP1); 피브로테스트 (GGT, 총 빌리루빈, α2m, 아포지단백질 AI 및 합토글로빈); 및 피브로미터 NAFLD (체중, 프로트롬빈 지수, ALT, AST, 페리틴 및 공복 글루코스). 간 섬유증에 대한 영상화 바이오마커는 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 피브로스캔 (TE), 점 전단파 탄성측정법 (pSWE) (일명 음향 방사력 임펄스 (ARFI)), 2D-3D SWE, 자기 공명 탄성측정법 (MRE) 및 다중파라미터 MRI.
염증성 또는 자가 염증성 요소를 갖는 임의의 RGFb-관련 질환은 조절 T 세포 기능을 보존하는 본 개시내용의 신규 억제제로부터 이익을 얻을 수 있다. 특히 간 질환, 예를 들어 대사 간 상태에서, 매트릭스-연관 TGFb1 신호전달을 선택적으로 표적화하는 TGFb 억제제를 선택하는 것이 유리할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 방법 및 조성물은 원발성 담즙성 담관염 (PBC)을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 한 실시양태에서, PBC를 갖는 대상체는 UDCA (우르소데옥시콜산) 치료에 비반응성이었다. 한 실시양태에서, 대상체는 UCDA에 대해 바르셀로나, 파리-I, 토론토, 로테르담 또는 파리-II 기준 불충분한 반응을 갖는다. 한 실시양태에서, PBC를 갖는 대상체는 표준 권장 용량 (10-15 mg/kg b.w./일)의 UDCA를 사용한 적어도 1년의 요법에도 불구하고 ALP≥2xULN (정상 상한치) 및 빌리루빈 >1xULN을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 방법 및 조성물은 원발성 경화성 담관염 (PSC)을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 한 실시양태에서, PSC를 갖는 대상체는 상승된 ALP, 비정상적 담관조영, 내시경 역행 담췌관조영 또는 경피 경간 담관조영을 갖는다. 한 실시양태에서, PSC를 갖는 대상체는 적어도 14의 말기 간 질환 모델 (MELD) 점수를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 방법 및 조성물은 NASH를 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 대상체는 섬유증 2기 NASH, 섬유증 3기 NASH 또는 섬유증 4기 NASH를 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 적어도 4 또는 적어도 5의 NAS (NAFLD 활성 점수)를 갖는다. 한 실시양태에서, NASH를 갖는 대상체는 NAS>4 및 섬유증 2기 또는 3기를 갖는다. 한 실시양태에서, NASH를 갖는 대상체는 NAS>5 및 섬유증 2기 또는 3기를 갖는다. 한 실시양태에서, NASH를 갖는 대상체는 적어도 14의 말기 간 질환 모델 (MELD) 점수를 갖는다.
이소형-특이적 TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 제공된 것은 신장의 섬유화 상태, 예를 들어 사구체 및 세관간질에서의 TGFβ의 유의하게 증가된 발현이 관찰된 세포외 매트릭스 축적을 특징으로 하는 질환 (IgA 신병증, 초점성 및 분절성 사구체경화증, 초승달 사구체신염, 루푸스 신염 및 당뇨병성 신병증)을 치료하는데 사용될 수 있다. TGFβ에 의해 유도된 2종의 매트릭스 성분인 피브로넥틴 EDA+ 및 PAI-1의 사구체 및 세관간질성 침착이 매트릭스 축적을 동반한 모든 질환에서 유의하게 상승하였지만, 상관관계 분석은 주로 TGFβ1 이소형과의 밀접한 관계를 밝혀냈다. 따라서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 TGFβ가 세포외 매트릭스의 병리학적 축적과 연관된 인간 사구체 장애의 스펙트럼을 위한 치료제로서 유용하다.
일부 실시양태에서, 신장의 섬유화 상태는 만성 신장 질환 (CKD)과 연관된다. CKD는 주로 고혈압 또는 당뇨병에 의해 유발되고, 매년 1백만명 초과의 생명을 앗아간다. CKD 환자는 엄격한 식이 및 의약으로부터 투석 및 이식에 이르는 평생의 의료 관리를 요구한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 억제제 요법은 투석 및/또는 이식에 대한 필요를 감소 또는 지연시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 다른 치료에 대한 필요 (예를 들어, 투여량, 빈도)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 일반적으로 CKD를 갖는 환자에서 대사 조절을 증진시킬 수 있는 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 받은 환자에서 투여될 수 있다.
본 개시내용의 TGFβ1 억제제로 치료될 수 있는 섬유화 상태는 섬유증 및/또는 만성 염증을 수반하는 상태를 포함한다. 이러한 상태는 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD) 및 다른 유전 장애, 예컨대 다발성 경화증 (MS) 및 낭성 섬유증 (CF)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경근육 장애일 수 있다. ECM- 및 면역 세포-연관 TGFβ1 아암 둘 다의 억제를 통해, TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 섬유화 진행을 억제하고 M1/M2 대식세포 분극화를 회복시키는 것으로 생각된다.
본원에 제공된 방법으로 치료될 수 있는 기관 섬유증은 심장 (예를 들어, 심혈관) 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 심장 섬유증은 심부전, 예를 들어 만성 심부전 (CHF)과 연관된다. 일부 실시양태에서, 심부전은 심근 질환 및/또는 대사 질환과 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 심장 섬유증 및 대사 장애를 수반하는 심장 기능장애를 갖는 환자에서 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 받은 환자에서 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 상태는 결합조직형성을 포함한다. 결합조직형성은 신생물 주위에서 발생하여, 종양 주위의 조밀한 섬유증 (예를 들어, 결합조직형성 기질), 또는 복부 수술 후 복부 내의 반흔 조직을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합조직형성은 악성 종양과 연관된다. 악성종양을 둘러싼 그의 조밀한 형성으로 인해, 통상적인 항암 치료제 (예를 들어, 화학요법)는 임상 효과를 위해 암성 세포에 도달하는데 효과적으로 침투하지 못할 수 있다. TGFβ1의 이소형-특이적 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것이 결합조직형성을 파괴하는데 사용되어, 섬유화 형성이 느슨해져 항암 요법의 효과를 보조할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 단독요법으로서 사용될 수 있다 (하기에 더 기재됨).
일부 실시양태에서, 환자는 섬유화 고형 종양 (예를 들어, 결합조직형성증)을 갖고, 외과적 후보 풀이거나 그로부터 배제되어, 섬유화 고형 종양이 절제불가능한 것으로 또는 수술불가능한 것으로 간주된다 (예를 들어, 외과적 개입의 위험이 그의 잠재적 이익을 능가함). 이러한 환자는 본 개시내용의 TGFβ1 억제 요법을 받기 위한 후보일 수 있다. 이러한 환자에게 투여되는 본 발명의 TGFβ1 억제 요법은 종양이 절제가능하게 되거나 또는 수술가능하게 되도록 하여 환자가 외과적 절제에 대한 후보가 될 수 있도록 할 수 있다.
섬유화 상태를 갖는 환자를 치료하기 위해, TGFβ1 이소형-특이적 억제제는 섬유증을 치료하는데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 이러한 항체의 유효량은 대상체에서 치료 효능 및 임상 안전성 둘 다를 달성하는데 유효한 양이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 ECM에 국재화된 (예를 들어, 테더링된) LTBP-매개 TGFβ1의 활성화를 차단할 수 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, LTBP는 LTBP1 및/또는 LTBP3이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 LTBP-특이적 억제제는 LRRC33-프로TGFβ의 억제제와 조합될 수 있다.
섬유증의 변경을 위한 본 개시내용의 항체 및/또는 조성물의 효능을 결정하는데 유용한 검정은 섬유모세포를 계수하기 위한 조직학적 검정 및 관련 기술분야에 공지된 기초 면역조직화학적 분석을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 순환 LAP 단편(들)은 섬유생성의 혈청 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 8,198,412를 참조하며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
섬유증을 연구하기 위해 개발된 많은 동물 모델이 있다. 예를 들어, 마우스에서의 특정 고 지방 식이는 인간 NAFLD의 조직병리학 및 발병기전 둘 다를 모방하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 일부 유전 모델은 인간 대사 증후군 및 NAFLD의 특색, 예컨대 db/db 및 ob/ob 마우스 모델을 또한 나타낸다. 또한 NASH의 연구를 위한 동물 모델이 존재하며, 이는 주로 메티오닌 및 콜린-결핍 식이 (MCD), 고-콜레스테롤 식이 (HCD), 콜린-결핍 고 지방 식이 (CDHFD), 콜린-결핍 L-아미노산-결핍 식이, 콜린-결핍 L-아미노산-결핍 식이 + 사염화탄소, 고-지방 식이 + 스트렙토조토신, 고 지방 + 고 콜레스테롤 식이 (HFHC), 고-프룩토스 식이 (HFD) 및 고-프룩토스 고 지방 식이 (HFHF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 식이-유도된 모델로 이루어진다. NASH의 연구를 위한 유전자 마우스 모델은 foz/foz 마우스, 간세포-특이적 PTEN-결핍 마우스, Db/db 마우스 + 디에틸니트로사민 (DEN) 및 db/db 마우스 + MCD를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 각각의 모델의 플러스 및 마이너스를 포함한 모든 이들 모델의 세부사항은 문헌 [Jennie Ka Ching Lau et al., J Pathol 2017; 241: 36-44]에 약술되어 있으며; 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
섬유증에서 TGFβ 억제제의 효능을 시험하는데 유용한 다른 모델은 사염화탄소 (CCL4)-유도된 간 섬유증 모델 및 아데닌-유도된 신장 섬유증 모델을 포함한다. 간 섬유증에서 이소형-특이적 TGFβ 억제제의 효능을 시험하는데 유용한 또 다른 모델은 담관 결찰 (BDL) 모델을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Tag et al., J Vis Exp. 2015; (96): 52438] 참조). 신장 섬유증의 유용한 유전 모델은 알포트 모델 (본원의 다른 곳에서 논의됨)을 포함한다.
임의의 이러한 전임상 모델에서, 섬유증에서의 효능 (예를 들어, 생체내 섬유화유발 또는 항섬유화 효과)은 임의의 적합한 방법, 예컨대 조직 절편 내 피크로시리우스 레드 (PSR)-양성 면적의 퍼센트; 조직 내 히드록시프롤린의 함량 (정량화); 및 조직 절편 상의 col1A 염색의 면역조직화학적 검출 및 정량화에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직병리학적 평가가 수행될 수 있으며, 여기서 섬유증 점수화 시스템이 사용될 수 있다. 시험 물품 (예를 들어, TGFβ 억제제)의 약리학적 효과는 적합한 약역학 (PD) 측정, 예컨대 하류 신호 전달 사건의 측정에 의해 조사될 수 있다. TGFβ 경로의 경우에, 예를 들어 적합한 PD 측정은 SMAD2/3의 상대 인산화를 포함한다.
섬유증과 연관된 근육 상태
축적되는 증거는 TGFβ가 근육 항상성, 복구 및 재생에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. LTBP-연관 TGFβ 신호전달을 선택적으로 조정하는 작용제, 예컨대 본원에 기재된 모노클로날 항체는 보다 광범위하게 작용하는 TGFβ 억제제와 연관된 독성 없이, 예컨대 만성/유전 근육 이영양증, 안구/안구외 근육의 선천성 섬유증 및 급성 근육 손상에서 손상된 근육 섬유를 치료하는데 효과적일 수 있다.
따라서, 본 발명은 생체내 TGFβ 효과의 하위세트 (모두는 아님)를 우선적으로 조정하는 작용제를 사용하여 손상된 근섬유를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 작용제는 특정한 콘텍스트에서, 즉 LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시되는 경우에 TGFβ1 신호전달을 선택적으로 조정할 수 있다 ("이소형-특이적 조정").
골격근에서, TGFβ는 증식 및 분화의 억제, 위축의 유도 및 섬유증의 발생을 포함한 다양한 역할을 한다. TGFβ는 위성 세포 증식을 감소시키고, (MyoD 및 미오게닌의 억제를 통해) 분화를 방지한다 (Allen, R.E. and L.K. J Cell Physiol, 1987. 133(3): p. 567-72; Brennan, T.J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(9): p. 3822-6; Massague, J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): p. 8206-10; Olson, E.N., et al., J Cell Biol, 1986. 103(5): p. 1799-805). TGFβ의 이소형 (즉, TGFβ1, 2 또는 3)은 이들 초기 논문에 명시되어 있지는 않지만, TGFβ1인 것으로 추정된다. TGFβ는 또한 근육 섬유증에 기여하며; 재조합 TGFβ1의 직접 주사는 골격근 섬유증을 유발하고, 범-TGFβ 억제는 급성 및 만성 손상 근육에서 섬유증을 감소시킨다 (Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Mendias, C.L., et al., Muscle Nerve, 2012. 45(1): p. 55-9; Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21). TGFβ1은 골격근 내의 근섬유, 대식세포, 조절 T 세포, 섬유모세포 및 섬유세포에 의해 발현되고 (Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Lemos, D.R., et al., Nat Med, 2015. 21(7): p. 786-94; Villalta, S.A., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(258): p. 258ra142; Wang, X., et al., J Immunol, 2016. 197(12): p. 4750-4761); 발현은 손상시 및 질환에서 증가된다 (Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21; Bernasconi, P., et al., J Clin Invest, 1995. 96(2): p. 1137-44; Ishitobi, M., et al., Neuroreport, 2000. 11(18): p. 4033-5). TGFβ2 및 TGFβ3은 또한 TGFβ1보다 더 적은 정도이긴 하지만, mdx 근육 (뒤시엔느 근육 이영양증의 마우스 모델)에서 (mRNA 수준에서) 상향조절된다 (Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21; Zhou, L., et al., Neuromuscul Disord, 2006. 16(1): p. 32-8). 페시나(Pessina) 등은 최근에 이영양성 근육 내의 다중 기원의 세포가 TGFβ-의존성 경로를 통해 섬유발생 운명을 채택한다는 것을 보여주기 위해 계통 추적 실험을 사용하였다 (Pessina, P., et al., Stem Cell Reports, 2015. 4(6): p. 1046-60).
TGFβ1은 인간 근육 이영양증에 연루되었다. 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)은 디스트로핀의 부재에 의해 유발되는 중증, 진행성 및 궁극적으로 치명적인 질환이다 (Bushby, K., et al., Lancet Neurol, 2010. 9(1): p. 77-93). 디스트로핀의 결여는 수축-유도된 손상에 대한 증가된 감수성을 유발하여, 계속적인 근육 변성으로 이어진다 (Petrof, B.J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(8): p. 3710-4; Dellorusso, C., et al., J Muscle Res Cell Motil, 2001. 22(5): p. 467-75; Pratt, S.J., et al., Cell Mol Life Sci, 2015. 72(1): p. 153-64). 반복 라운드의 복구는 만성 염증, 섬유증, 위성 세포 풀의 소진, 궁극적인 이동성 상실 및 사멸에 기여한다 (Bushby, K., et al., Lancet Neurol, 2010. 9(1): p. 77-93; McDonald, C.M., et al., Muscle Nerve, 2013. 48(3): p. 343-56). TGFβ1의 발현은 DMD를 갖는 환자에서 유의하게 증가되고, 이들 환자에서 관찰된 섬유증의 정도와 상관관계가 있다 (Bernasconi, P., et al., J Clin Invest, 1995. 96(2): p. 1137-44; Chen, Y.W., et al., Neurology, 2005. 65(6): p. 826-34). 과도한 ECM 침착은 근육의 수축 특성에 유해한 효과를 미치고, 근섬유가 그의 혈액 공급으로부터 고립되기 때문에 영양에의 접근을 제한할 수 있다 (Klingler, W., et al., Acta Myol, 2012. 31(3): p. 184-95). 최근에, 추가의 데이터는 근육 이영양증에 TGFβ1을 추가로 연루시켰다. LTBP4의 변이체가 마우스 및 인간에서 질환 중증도를 변형시키는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서, LTBP4의 변이체는 디스트로핀 또는 γ-사르코글리칸이 결여된 마우스에서 보호적이다 (Coley, W.D., et al., Hum Mol Genet, 2016. 25(1): p. 130-45; Heydemann, A., et al., J Clin Invest, 2009. 119(12): p. 3703-12). 인간에서, 2개의 군은 독립적으로 DMD에서 LTBP4의 변이체가 보호적이며, 보행 상실을 수년 지연시키는 것으로 확인하였다 (Flanigan, K.M., et al., Ann Neurol, 2013. 73(4): p. 481-8; van den Bergen, J.C., et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2015. 86(10): p. 1060-5).
마우스 및 인간에서의 유전자 변이체의 성질이 상이하지만, 둘 다의 종에서 보호적 변이체는 감소된 TGFβ 신호전달을 유발한다 (Heydemann, A., et al., J Clin Invest, 2009. 119(12): p. 3703-12); Ceco, E., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(259): p. 259ra144). 골격근 생물학에서의 TGFβ1의 많은 기능은 정제된 활성 성장 인자가 동물 내로 주사되거나 배양물 중 세포에 첨가된 실험으로부터 추론되었다 (Massague, J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): p. 8206-10; Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Mendias, C.L., et al., Muscle Nerve, 2012. 45(1): p. 55-9). TGFβ1의 특이적 기능에 대한 세포 콘텍스트의 중요성을 고려하면 (예를 들어, 문헌 [Hinck et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol, 2016. 8(12)] 참조), 이들 실험에서 관찰된 효과 중 일부가 생체내 시토카인의 내인성 역할(들)을 반영하지 않는 것이 가능하다. 예를 들어, 재조합 TGFβ1, 미오스타틴 또는 GDF11을 사용한 인간 피부 섬유모세포의 치료는 이들 세포에서 유전자 발현의 거의 동일한 변화를 유발하지만, 생체내에서 이들 단백질의 역할은 매우 상이하다 (Tanner, J.W., Khalil, A., Hill, J., Franti, M., MacDonnell, S.M., Growth Differentiation Factor 11 Potentiates Myofibroblast Activation, in Fibrosis: From Basic Mechanisms to Targeted therapies. 2016: Keystone, CO).
다수의 조사자가 생체내 성장 인자의 역할을 명확히 하기 위해 TGFβ의 억제제를 사용하였다. mdx 마우스를 범-TGFβ 중화 항체 1D11로 처리하는 것은 분명히 감소된 섬유증 (조직학 및 히드록시프롤린 함량에 의함), 감소된 근육 손상 (감소된 혈청 크레아틴 키나제 및 보다 큰 근섬유 밀도) 및 개선된 근육 기능 (혈류량측정, 고립성 EDL 근육의 힘 생성 및 증가된 앞다리 그립 강도에 의함)을 유발한다 (Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21; Andreetta, F., et al., J Neuroimmunol, 2006. 175(1-2): p. 77-86; Gumucio, J.P., et al., J Appl Physiol (1985), 2013. 115(4): p. 539-45). 추가로, 우성 음성 TGFβ 유형 II 수용체의 근섬유-특이적 발현은 심장독소 손상 후 및 δ-사르코글리칸-/- 마우스에서의 근육 손상을 보호한다 (Accornero, F., et al., Hum Mol Genet, 2014. 23(25): p. 6903-15). 골격근에 풍부하고 TGFβ 활성을 억제하는 프로테오글리칸 데코린은 mdx 마우스에서 및 열상 손상 후에 근육 섬유증을 감소시킨다 (Li, Y., et al., Mol Ther, 2007. 15(9): p. 1616-22; Gosselin, L.E., et al., Muscle Nerve, 2004. 30(5): p. 645-53). TGFβ 억제 활성을 갖는 다른 분자, 예컨대 수라민 (항신생물제) 및 로사르탄 (안지오텐신 수용체 차단제)은 손상, 마르팡 증후군 및 근육 이영양증의 마우스 모델에서 근육 병리상태를 개선시키고 섬유증을 감소시키는데 유효하였다 (Spurney, C.F., et al., J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2011. 16(1): p. 87-95; Taniguti, A.P., et al., Muscle Nerve, 2011. 43(1): p. 82-7; Bedair, H.S., et al., Am J Sports Med, 2008. 36(8): p. 1548-54; Cohn, R.D., et al., Nat Med, 2007. 13(2): p. 204-10). 상기 기재된 치료제 모두가 TGFβ1 또는 그의 신호전달을 억제하지만, 이들 중 어느 것도 TGFβ1 이소형에 대해 특이적이지 않다. 예를 들어, 1D11은 TGFβ1, 2 및 3 이소형에 결합하고 이를 억제한다 (Dasch, J.R., et al., J Immunol, 1989. 142(5): p. 1536-41). 수라민은 TGFβ1에 추가로 PDGF, FGF 및 EGF를 포함한 다수의 성장 인자가 그의 수용체에 결합하는 능력을 억제한다 (Hosang, M., J Cell Biochem, 1985. 29(3): p. 265-73; Olivier, S., et al., Eur J Cancer, 1990. 26(8): p. 867-71; Scher, H.I. and W.D. Heston, Cancer Treat Res, 1992. 59: p. 131-51). 데코린은 또한 직접 결합에 의해 및 미오스타틴 억제제인 폴리스타틴의 상향조절을 통해 둘 다로 미오스타틴 활성을 억제한다 (Miura, T., et al., Biochem Biophys Res Commun, 2006. 340(2): p. 675-80; Brandan, E., C. Cabello-Verrugio, and C. Vial, Matrix Biol, 2008. 27(8): p. 700-8; Zhu, J., et al., J Biol Chem, 2007. 282(35): p. 25852-63). 로사르탄은 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템에 대한 그의 효과를 통해, IGF-1/AKT/mTOR 경로를 포함한 추가의 신호전달 경로에 영향을 미친다 (Burks, T.N., et al., Sci Transl Med, 2011. 3(82): p. 82ra37; Sabharwal, R. and M.W. Chapleau, Exp Physiol, 2014. 99(4): p. 627-31; McIntyre, M., et al., Pharmacol Ther, 1997. 74(2): p. 181-94). 따라서, 이들 요법 모두는 독성뿐만 아니라 그의 치료 효과에 기여할 수 있는 추가의 분자를 억제한다.
만성 염증 외에도, DMD의 특징은 과도하고, 진행성인, 섬유증이다. 진행성 질환에서, 섬유증은 매우 중증이어서 실제로 개별 근섬유를 그의 혈액 공급으로부터 고립시킬 수 있다. 이는 또한 근육의 수축 특성을 변경시킨다. 인간 환자에서, TGFβ1 상향조절의 정도와 섬유증 사이에 강한 상관관계가 존재하고, 섬유증의 정도와 음성 이동성 결과 사이에 강한 연관성이 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, LTBP-프로TGFβ1 억제제는 섬유증의 예방 및/또는 감소를 위해 이영양성 환자에게 투여되어 질환에서 ECM-연관 TGFβ1 효과를 선택적으로 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 다양한 이소형- 및/또는 콘텍스트-선택적 작용제는 TGFβ1 신호전달의 억제를 달성하는데 사용되어 (예를 들어, GARP 또는 LRRC33을 통해) 면역계에 대해 원치않는 영향을 미치지 않으면서 섬유증을 예방하고 근발생을 촉진할 수 있다.
투여
본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 상기 기재된 제약 조성물이 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예를 들어 볼루스로서 또는 소정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 섬유증 및/또는 대사 상태의 치료에 사용되는 경우에, 바람직하게는 TGFβ 억제제는 피하로 투여된다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함한, 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 네뷸라이징될 수 있고, 동결건조된 분말은 재구성 후에 네뷸라이징될 수 있다. 대안적으로, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나 또는 동결건조 및 밀링된 분말로서 흡입될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 TGFβ-관련 적응증, 예컨대 상기 언급된 것을 갖거나, 그의 위험이 있거나 또는 그를 갖는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. TGFβ-관련 적응증을 갖는 대상체는 상용 의료 검사, 예를 들어 실험실 시험, 기관 기능 시험, CT 스캔 또는 초음파에 의해 확인될 수 있다. 임의의 이러한 적응증을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 적응증의 1종 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 적응증의 위험이 있는 대상체는 그 적응증에 대한 위험 인자 중 1가지 이상을 갖는 대상체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "유효 용량"은 그의 의도된 목적(들), 즉 허용되는 이익/위험 비로 조직 또는 대상체에서 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응을 충족시키기에 충분한 화합물 또는 조성물의 임의의 양 또는 용량을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서, 의도된 목적은 TGFβ-1 억제와 연관된 임상적으로 의미있는 결과를 달성하기 위해 생체내에서 TGFβ-1 활성화를 억제하는 것일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 유효량은 치료될 특정한 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 파라미터, 치료 지속기간, 공동 요법 (존재하는 경우)의 성질, 구체적 투여 경로 및 건강 진료의의 지식 및 전문지식 내의 기타 인자에 따라 달라진다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 상용 실험만으로 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자가 의학적 이유, 심리적 이유 또는 사실상 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 허용되는 용량을 고집할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실험적 고려사항, 예컨대 반감기는 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체는 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하는데 사용될 수 있다. 투여 빈도는 요법 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로 TGFβ-관련 적응증의 치료 및/또는 억제 및/또는 호전 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 통상의 기술자에게 분명할 것이고, 본 개시내용의 범주 내에 있다.
한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체에 대한 투여량은 억제제의 1회 이상의 투여(들)가 주어진 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체에게 억제제의 증분 투여량이 주어진다. 효능을 평가하기 위해, TGFβ-관련 적응증의 지표를 따를 수 있다. 예를 들어, 근섬유 손상, 근섬유 복구, 근육에서의 염증 수준 및/또는 근육에서의 섬유증 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명은 이소형-특이적 방식으로 및 콘텍스트-특이적 방식으로 TGFβ의 활성화 단계를 조정할 수 있는 작용제가 의약으로서 사용되는 경우에 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다는 인식을 포괄한다. 따라서, 본 발명은 TGFβ2 또는 TGFβ3이 아닌 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제함으로써, TGFβ2 및/또는 TGFβ3 신호전달에 영향을 미치는 것으로부터의 원치않는 부작용을 최소화하면서 생체내 TGFβ1 신호전달의 특이적 억제를 부여하는 억제제, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 LTBP1 및/또는 LTBP3에 의해 제시된 TGFβ1의 활성화를 선택적으로 억제하지만, GARP 또는 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ1은 그렇지 않음으로써, GARP-연관 TGFβ1 및/또는 LRRC33-연관 TGFβ1의 조정에 의해 유발된 원치않는 부작용을 최소화하면서 생체내 LTBP1/3-연관 TGFβ1 신호전달의 특이적 억제를 부여하는 억제제, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 대상체에게 투여되는 경우에 독성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 및 TGFβ2 둘 다에 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다에 결합하는 억제제와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하는 억제제와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다.
일반적으로, 본원에 기재된 임의의 억제제, 예를 들어 항체의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 용량당 약 0.5-30 mg/kg, 예를 들어 용량당 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg일 수 있다. 전형적으로, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물은 적합한 간격으로, 예컨대 1주 1회 또는 2회, 1-8주마다 등으로 인간 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는, 예를 들어 1주 2회, 1주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다 등으로 조정될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 mg/kg 내지 20 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라, 치료는 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 또는 TGFβ-관련 적응증 또는 그의 증상을 완화시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 지속된다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 대상체에게 0.1 내지 30 mg/kg, 0.5 내지 30 mg/kg, 1 내지 30 mg/kg, 5 내지 30 mg/kg, 10 내지 30 mg/kg, 15 내지 30 mg/kg, 20 내지 30 mg/kg, 25 내지 30 mg/kg, 0.1 내지 25 mg/kg, 0.5 내지 25 mg/kg, 1 내지 25 mg/kg, 5 내지 25 mg/kg, 10 내지 25 mg/kg, 15 내지 25 mg/kg, 20 내지 25 mg/kg, 0.1 내지 20 mg/kg, 0.5 내지 20 mg/kg, 1 내지 20 mg/kg, 5.0 내지 20 mg/kg, 10 내지 20 mg/kg, 15 내지 20 mg/kg, 0.1 내지 15 mg/kg, 0.5 내지 15 mg/kg, 1 내지 15 mg/kg, 5 내지 15 mg/kg, 10 내지 15 mg/kg, 5.0 내지 20 mg/kg, 10 내지 20 mg/kg, 15 내지 20 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg, 0.5 내지 10 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 5 내지 10 mg/kg의 투여량으로 투여되고, 임의로 여기서 대상체는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회 또는 격월로 투여된다.
예시적인 투여 요법은 약 2 mg/kg의 초기 용량에 이어서 1회 이상의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 초기 용량은 약 2 내지 30 mg/kg, 예를 들어 1주 1회 또는 1주 2회일 수 있다. 그 후, 유지 용량(들)은, 예를 들어 약 0.1 내지 20 mg/kg, 예를 들어 1주 1회, 격주, 1개월 1회 등을 따를 수 있다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 약동학 실험은 본원에 개시된 억제제, 예를 들어 항체 (예를 들어, SR-AB2)의 혈청 농도가 전임상 동물 모델 (예를 들어, 마우스 모델)에의 투여 후 적어도 7일 동안 안정하게 유지된다는 것을 제시하였다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 투여후 안정성은 항체가 투여되는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 임상적으로 유효한 혈청 농도를 유지하면서 항체가 덜 빈번하게 투여될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 1회; 또는 1개월마다, 2개월마다 또는 3개월마다 또는 그 초과마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용된 항체 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용에 따라 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 치료상 유효한 LTBP 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제제의 혈청 농도는 적어도 약 10 μg/mL, 예를 들어 약 10 μg/mL 내지 1.0 mg/mL일 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 항체의 유효량은 약 20-400 μg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 항체의 유효량은 약 100-800 μg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 억제제의 유효량은 적어도 약 20 μg/mL, 예를 들어 적어도 약 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL 또는 200 μg/mL이다. 바람직한 실시양태에서, 비-인간 영장류에서, 적어도 4주, 예를 들어 적어도 4주, 바람직하게는 적어도 8주, 보다 바람직하게는 적어도 12주 동안 약 2,000-3,000 μg/mL의 혈청 농도 수준을 유지한 후에 이러한 억제제와 연관된 관찰된 독성이 없다 (예를 들어: 심장독성, 증식증 및 염증, 치아 및 치은 소견이 없음). 따라서, 약 10-100배 치료 범위가 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자에 대해, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정한 투여 요법, 예를 들어 용량, 시기 및 반복은 특정한 개체 및 그 개체의 의료 병력, 뿐만 아니라 개별 작용제의 특성 (예컨대 작용제의 반감기 및 다른 관련 고려사항)에 좌우될 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, LTBP1-TGFβ 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적절한 투여량은 사용된 특이적 항체 (또는 그의 조성물), 적응증의 유형 및 중증도, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 억제제에 대한 반응 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 임상의는 목적하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체를 투여할 것이다. LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지 여부 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 예를 들어 TGFβ-관련 적응증의 발생 전, 그 동안 또는 그 후 일련의 이격된 용량일 수 있다.
TGFβ3을 억제하는 것이 섬유증에서 콜라겐 침착 또는 축적을 증가시킬 수 있다는 관찰에 기초하여, TGFβ1-선택적 억제제 (예컨대 본원에 개시된 신규 항체)를 포함하는 부가적 요법은 TGFβ3-억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1/2/3, TGFβ1/3 및 TGFβ3의 억제제로 치료되는 환자에 대해 고려될 수 있다. TGFβ3-억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제의 예는 TGFβ 수용체의 저분자량 길항제, 예를 들어 ALK5 길항제, 예컨대 갈루니세르팁 (LY2157299 1수화물); 모든 3종의 이소형을 억제하는 모노클로날 항체 (예컨대 중화 항체) ("범-억제제" 항체) (예를 들어, WO 2018/134681 참조); 3종의 이소형 중 2종을 우선적으로 억제하는 모노클로날 항체 (예를 들어, TGFβ1/3 (예를 들어 WO 2006/116002); 및 조작된 분자 (예를 들어, 융합 단백질), 예컨대 리간드 트랩 (예를 들어, WO 2018/029367; WO 2018/129331 및 WO 2018/158727)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 WO/2018/15872의 개시내용에 따른 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 WO 2018/029367; WO 2018/129331의 개시내용에 따른 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 M7824로 공지된 구축물이다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 AVID200으로 공지된 구축물이다. 일부 실시양태에서, 중화 범-TGFβ 항체는 GC1008 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 WO/2018/134681의 개시내용에 따른 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다에 특이적으로 결합하는 중화 항체이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 TGFβ3보다 TGFβ1에 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 항체는 WO/2006/116002의 개시내용에 따른 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 21D1이다.
부가적 요법은 TGFβ3 억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제를 받았거나 받고 있는 환자에서 TGFβ3 억제의 섬유화유발 효과에 대응하거나 그를 극복하는 것을 목표로 한다. 일부 실시양태에서, 환자는 섬유화 장애를 갖거나 섬유화 장애가 발생할 위험이 있다. 예를 들어, 환자는 간 섬유증 발생의 보다 높은 위험과 연관된 대사 상태를 앓고 있을 수 있다. 이러한 위험과 연관된 대사 상태는 비만, 제2형 당뇨병 및 NASH를 포함한다. 따라서, 본 발명은 TGFβ3 억제제로 치료된 대상체의 부가적 요법에 사용하기 위한 TGFβ1-선택적 억제제를, TGFβ3 억제제의 섬유화유발 효과를 감소시키기에 충분한 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 골수섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진행성 암, 예를 들어 전이성 또는 국부 진행성 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab31, Ab34, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab62, Ab63 및 Ab64 (임의로 Ab42 또는 Ab63), 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab42, 그의 변이체/유도체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab42 또는 그의 항원-결합 단편이다.
이론에 얽매이지는 않지만, 일부 실시양태에서, 항-TGFβ3 활성을 갖는 TGFβ 억제제의 보존은 고도로 전이성, 골수섬유화인 것으로 공지된 유형의 암으로 진단된 환자 및/또는 섬유화 상태를 갖거나 그가 발생할 위험이 있는 환자를 치료하는데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 본원의 개시내용은 암의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제를 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ3은 억제하지 않고, 여기서 환자는 전이성 암 또는 골수섬유증을 갖거나 또는 환자는 섬유화 상태를 갖거나 그가 발생할 위험이 있고, 여기서 임의로 섬유화 상태는 비-알콜성 지방간염 (NASH)이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 TGFβ-관련 적응증, 적응증의 증상 또는 적응증에 대한 소인을 갖는 대상체에게, 적응증, 적응증의 증상 또는 적응증에 대한 소인을 치유하거나, 낫게 하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경시키거나, 해소하거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 이에 영향을 미칠 목적으로 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체를 사용하여 TGFβ-관련 적응증을 완화시키는 것은 적응증의 발생 또는 진행을 지연시키거나 또는 적응증의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 적응증을 완화시키는 것은 반드시 치유적인 결과를 필요로 하지는 않는다. 본원에 사용된 TGFβ-관련 적응증과 연관된 적응증의 발생을 "지연시키는 것"은 적응증의 진행을 유예, 저해, 저속화, 지체, 안정화 및/또는 연기시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 적응증 및/또는 개체의 병력에 따라 시간 길이가 다양할 수 있다. 적응증의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나 또는 적응증의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여 주어진 시간 프레임에서 적응증의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로, 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용한 임상 연구에 기초한다.
섬유화 장애를 치료하기 위한 TGFβ 억제제의 선택
TGFβ의 억제제는 이소형-비-선택적 억제제 및 이소형-선택적 억제제를 포함하며, 전자가 대다수의 공지된 TGFβ 억제제/길항제이다. 이소형-비-선택적 억제제 중에는 범-억제제 (TGFβ1/2/3 억제제), TGFβ1/2 억제제 및 TGFβ1/3 억제제가 있다. 이소형-선택적 억제제는 하나의 이소형에 선택적으로 결합하는 중화 항체 및 잠복 프로TGFβ 복합체를 이소형-선택적 방식으로 표적화하는 활성화 억제제를 포함한다. 활성화 억제제의 부류는 콘텍스트-비의존성 및 콘텍스트-선택적 억제제를 포함한다. 예를 들어, LTBP1/3, GARP 또는 LRRC33에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1에 결합하고, 제시 분자 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제가 또한 기재되었다 (예를 들어, WO 2017/156500, WO 2020/014473 및 WO 2020/014460 참조). 각각의 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. GARP-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하고 GARP의 콘텍스트에서 제시된 TGFβ1의 활성화를 억제하는 콘텍스트-특이적 항체는 최근에 WO 2018/013939에 기재되었다.
본 발명은 ECM-연관 TGFβ1 활성화의 특이적 억제제, 예를 들어 LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하고 LTBP1 또는 LTBP3의 콘텍스트에서 제시된 TGFβ1의 활성화를 억제하는 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함한다. 본 개시내용은 특정 환자 집단에 맞추어진 상기 열거된 것 중 적합한 TGFβ 억제제의 선택 및 관련 치료 요법 둘 다에 관한 지침을 추가로 제공한다.
TGFβ3 억제가 사실상 ECM 조절이상을 악화시킬 수 있다는 것을 보여주는 놀라운 관찰 (본원에서 입증됨, 실시예 17; 도 22 참조)은 올바른 TGFβ 억제제를 선택하는 의사 결정 과정에 정보를 제공한다. 예를 들어, 섬유화 상태의 치료에 사용하기 위해, TGFβ3에 대한 억제 활성이 결여된 TGFβ 억제제를 선택하는 것이 유리할 수 있다. TGFβ3 억제에 반응한 섬유증 악화 (예를 들어, 섬유화유발 효과)의 관찰은 TGFβ3의 역할이 항상성을 넘어 확장될 가능성을 제기한다. 보다 더 중요하게는, 이는 섬유화 상태뿐만 아니라 다른 질환 콘텍스트에서도 관련될 수 있다. 충분한 증거는 ECM의 조절이상이 섬유증 및 암을 포함한 다수의 질환 상태에서 발견된다는 것을 시사한다. 실제로, 주요 섬유화유발 유전자 중 다수가 또한 다양한 암의 마커 중에서 인식된다. 이들 마커는, 예를 들어 col1A1, col3A1, PAI-1, CCL2, ACTA2, FN-1, CTGF 및 TGFB1을 포함한다. 따라서, TGFβ3의 차단이 섬유증 (예를 들어, 섬유화유발 효과를 가짐)에 유해한 것으로 보인다는 발견은 ECM 조절이상과 연관된 상태의 보다 넓은 범주에 적용가능할 수 있다.
본 발명은 특정 기준 및/또는 임상 양상을 갖는 질환 상태를 치료하기 위해 "올바른 환자"를 위한 "올바른 TGFβ 억제제"를 선택하는 것에 대한 통찰을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명은 섬유화 상태를 갖는 특정한 환자 집단에 적합한 바람직한 TGFβ1 억제제의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역억제로부터 이익을 얻는 대상체에서의 섬유화 상태의 치료에 있어서 LTBP1/LTBP3-프로TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. 이는 TGFβ1 활성의 적어도 하위세트가 GARP-연관 및/또는 LRRC33-연관 TGFβ1에 의해 매개되는 면역 조절을 수반한다는 개념에 기초한다. 따라서, 본 발명은 TGFβ1 효과의 면역 측면에 또한 영향을 미치는 TGFβ1 억제제의 사용이 면역자극에 의해 질환이 악화될 수 있는 섬유화 상태를 갖는 환자를 치료하는데 유해할 수 있다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 발명은 적어도 부분적으로 비-ECM 콘텍스트 (예를 들어, 세포 표면 상에 GARP 또는 LRRC33을 발현하는 면역 세포, 백혈구 등)와 연관된 TGFβ1 효과를 보존하면서 ECM 콘텍스트 (예를 들어, LTBP-연관) 내의 TGFβ1 효과를 선택적으로 억제하여 원치않는 면역자극을 방지하는 수단을 제공하는 것을 목표로 한다. 이러한 접근법은 초기 섬유증, 예컨대 비경변성 간 섬유증에서 특히 유리할 수 있다.
일부 실시양태에서, i) TGFβ1 신호전달의 억제 및 ii) 면역억제 둘 다로부터 이익을 얻는 환자 집단은 중증 또는 말기 기관 섬유증을 앓고 있고 동종이식편 기관 이식을 받을 환자를 포함한다. 중증 또는 말기 기관 섬유증은 IPF, CKD 및/또는 NASH와 연관될 수 있다. 이러한 환자는 섬유화 질환을 치료하기 위한 다른 요법을 이미 받았을 수 있지만, 이는 상태를 충분히 치료하거나 관리하지 못했을 수 있다. 담당 의사는 남아있는 치료 옵션이 동종이식편 이식을 포함할 수 있다고 결정할 수 있다. 이러한 환자는 이식에 이용가능한 기관에 대한 대기 목록에 넣을 수 있다. 이러한 환자는 면역억제제로 치료될 수 있다. GARP-제시된 TGFβ1 활성화를 억제하지 않는, LTBP1/LTBP3-제시된 TGFβ1 활성화의 선택적 억제제는 이펙터 T 세포에 의해 매개되는 면역자극을 촉발할 위험을 제기하지 않으면서 이러한 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 이식 후에, 이러한 환자는 기관 거부의 위험을 피하기 위해 LTBP1/LTBP3-제시된 TGFβ1 활성화의 선택적 억제제를 계속 받을 수 있다.
일부 실시양태에서, i) TGFβ1 신호전달의 억제 및 ii) 면역억제 둘 다로부터 이익을 얻는 환자 집단은 섬유화 장애를 앓고 있고 염증성 또는 자가면역 상태를 갖는 환자 집단을 포함한다.
일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단은 1종 이상의 자가면역 장애, 예컨대 무이완증; 애디슨병; 성인 스틸병; 무감마글로불린혈증; 원형 탈모증; 아밀로이드증; 강직성 척추염; 항-GBM/항-TBM 신염; 항인지질 증후군; 자가면역 혈관부종; 자가면역 자율신경실조증; 자가면역 뇌척수염; 자가면역 간염; 자가면역 내이 질환 (AIED); 자가면역 심근염; 자가면역 난소염; 자가면역 고환염; 자가면역 췌장염; 자가면역 망막병증; 자가면역 두드러기; 축삭 & 뉴런 신경병증 (AMAN); 발로병; 베체트병; 양성 점막 유천포창; 수포성 유천포창; 캐슬만병 (CD); 복강 질환; 샤가스병; 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP); 만성 재발성 다초점성 골수염 (CRMO); 처그-스트라우스 증후군 (CSS) 또는 호산구성 육아종증 (EGPA); 반흔성 유천포창; 코간 증후군; 저온 응집소 질환; 선천성 심장 차단; 콕사키 심근염; CREST 증후군; 크론병; 포진성 피부염; 피부근염; 데빅병 (시신경척수염); 원판상 루푸스; 드레슬러 증후군; 자궁내막증; 호산구성 식도염 (EoE); 호산구성 근막염; 결절성 홍반; 본태성 혼합 한랭글로불린혈증; 에반스 증후군; 섬유근육통; 섬유화 폐포염; 거대 세포 동맥염 (측두 동맥염); 거대 세포 심근염; 사구체신염; 굿패스쳐 증후군; 다발혈관염을 동반한 육아종증; 그레이브스병; 길랑-바레 증후군; 하시모토 갑상선염; 용혈성 빈혈; 헤노흐-쉔라인 자반증 (HSP); 임신성 포진 또는 임신성 유천포창 (PG); 화농성 한선염 (HS) (아크네 인버사); 저감마글로불린혈증; IgA 신병증; IgG4-관련 경화성 질환; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP); 봉입체 근염 (IBM); 간질성 방광염 (IC); 소아 관절염; 소아 당뇨병 (제1형 당뇨병); 소아 근염 (JM); 가와사키병; 램버트-이튼 증후군; 백혈구파괴성 혈관염; 편평 태선; 경화성 태선; 목질 결막염; 선상 IgA 질환 (LAD); 루푸스; 라임병 만성; 메니에르병; 현미경적 다발혈관염 (MPA); 혼합 결합 조직 질환 (MCTD); 무렌 궤양; 뮈샤-하버만병; 다초점성 운동 신경병증 (MMN) 또는 MMNCB; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 근염; 기면증; 신생아 루푸스; 시신경척수염; 호중구감소증; 안구 반흔성 유천포창; 시신경염; 회귀성 류마티즘 (PR); PANDAS; 부신생물성 소뇌 변성 (PCD); 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH); 패리 롬버그 증후군; 주변부 포도막염 (말초 포도막염); 파소네지-터너 증후군; 천포창; 말초 신경병증; 정맥주위 뇌척수염; 악성 빈혈 (PA); POEMS 증후군; 결절성 다발동맥염; 다선성 증후군 유형 I, II, III; 류마티스성 다발근육통; 다발근염; 심근경색후 증후군; 심막절개술후 증후군; 원발성 담즙성 간경변증; 원발성 경화성 담관염; 프로게스테론 피부염; 건선; 건선성 관절염; 순수 적혈구 무형성증 (PRCA); 괴저성 농피증; 레이노 현상; 반응성 관절염; 반사 교감신경 이영양증; 재발성 다발연골염; 하지 불안 증후군 (RLS); 복막후 섬유증; 류마티스성 열; 류마티스 관절염; 사르코이드증; 슈미트 증후군; 공막염; 경피증; 쇼그렌 증후군; 정자 & 고환 자가면역; 강직 인간 증후군 (SPS); 아급성 박테리아 심내막염 (SBE); 스삭 증후군; 교감신경성 안염 (SO); 다카야스 동맥염; 측두 동맥염/거대 세포; 동맥염 혈소판감소성 자반증 (TTP); 톨로사-헌트 증후군 (THS); 횡단성 척수염; 제1형 당뇨병; 궤양성 결장염 (UC); 미분화 결합 조직 질환 (UCTD); 포도막염; 혈관염; 백반증; 보그트-코야나기-하라다병을 갖거나 그가 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 염증성 또는 자가면역 상태는 섬유증과 연관된다. 섬유증과 연관된 염증성 또는 자가면역 상태의 비제한적 예는 근육 이영양증, 예컨대 DMD를 포함한다.
다른 실시양태에서, i) TGFβ1 신호전달의 억제 및 ii) 면역억제 둘 다로부터 이익을 얻는 환자 집단은 섬유화 질환을 앓고 있고, 섬유증과 직접 연관된 것이 아니라 오히려 별개의 장애인 염증성 또는 자가면역 상태를 갖는 환자 집단을 포함한다.
이러한 염증성 또는 자가면역 상태는, 기저 섬유화 질환 또는 개별 상태(들)와 직접적으로 연관되든 연관되지 않든, 인간 자가면역 질환에서의 조절 T 세포 (Treg)의 불균형에 의해 유발되거나 이와 연관될 수 있다. 예를 들어, Treg 조절이상과 연관된 이러한 장애는 소아 특발성 관절염; 류마티스 관절염 (RA); 척추관절염; 건선성 관절염; HCV 혼합 한랭글로불린혈증; 한랭글로불린혈증; 다발성 경화증; 자가면역 간 질환; 전신 홍반성 루푸스; 면역-매개 당뇨병; 중증 근무력증; 원발성 쇼그렌 증후군; 가와사키병; 및 염증성 장 질환 (IBD)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
따라서, TGFβ1 신호전달의 LTBP1/3-개별 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 섬유화 상태 및 염증성 또는 자가면역 상태, 예컨대 상기 열거된 장애 중 1종 이상을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서 사용되는 TGFβ1 신호전달의 LTBP1/3-개별 억제제는 면역-연관 TGFβ1 신호전달을 보존하면서 ECM에서 TGFβ1-의존성 섬유증을 치료 또는 완화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 관련 방법은 대상체에서 섬유화 장애의 임상 징후에 기초하여, 섬유화 장애를 치료하기 위한 적절한 TGFβ1 억제제를 선택하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 섬유화 장애의 치료를 위한 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 선택하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 섬유화 장애가 섬유증 및 염증, 면역 억제, 증식성 조절이상 및 동종이식편 이식에 대한 필요 중 1종 이상을 포함한 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 임상 제시에 기초하여 섬유화 장애의 치료를 위한 이소형-특이적, 콘텍스트-의존성 TGFβ1 억제제 또는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 선택하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 섬유화 장애를 갖는 대상체를 위한 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 포함하는 치료 요법을 선택하는 단계 및 대상체에게 선택된 치료 요법을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 선택은 (a) 섬유화 장애가 섬유증 및 하기: 염증, 면역 억제, 증식성 조절이상 및 동종이식편 이식에 대한 필요 중 1종 이상을 포함하는 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 임상 제시에 기초하여 이소형-특이적, 콘텍스트-의존성 TGFβ1 억제제 또는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 포함하는 치료 요법을 선택하는 단계를 포함하는 것인, 섬유화 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
섬유화 장애를 앓는 대상체는 섬유증에 추가로 광범위한 증상을 나타낼 수 있다. 대상체에서의 임상 징후의 구체적 조합은 적절한 TGFβ1-억제 치료 요법의 선택을 안내할 수 있다. 예를 들어, 콘텍스트-비의존성, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 대상체의 임상 징후가 TGFβ2 또는 TGFβ3의 활성을 조정하지 않으면서 TGFβ1의 억제에 대한 필요를 나타내는 경우에 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. LTBP 콘텍스트-특이적 억제제를 포함하는 치료 요법은 대상체의 임상 징후가 세포외 매트릭스에서의 TGFβ1의 억제가 유익할 것임을 나타내는 경우에 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. LTBP 콘텍스트-특이적 억제제는 또한 대상체의 임상 징후가 면역 이펙터 세포의 자극이 바람직하지 않다는 것을 나타내는 경우에 유리하다. GARP 콘텍스트-특이적 억제제는, 대상체의 임상 징후가 조절 T 세포 (Treg 세포) 상의 TGFβ1의 활성화/방출을 차단하는 것이, 예를 들어 Treg 세포가 이펙터 T 세포 활성을 억제하는 것을 방지하는데 유익할 것임을 나타내는 경우에, 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. LRRC33 콘텍스트-특이적 억제제는, 대상체의 임상 징후가 골수 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및/또는 소교세포 상의 TGFβ1의 활성화/방출을 차단하는 것이, 예를 들어 대상체에서 면역 억제를 역전시키거나 감소시키는데 유익할 것임을 나타내는 경우에, 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
예로서, 섬유화 장애를 갖는 대상체는 섬유증, 염증, 면역 억제 및 증식성 조절이상을 포함한 임상 징후를 나타낼 수 있다. 상기 증상의 조합과 함께 통상적으로 나타나는 섬유화 장애는, 예를 들어 골수섬유증을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제가 대상체를 치료하기 위해 선택될 수 있다.
섬유화 장애를 갖는 대상체는 섬유증, 염증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함한 임상 징후를 나타낼 수 있다. 상기 증상의 조합과 함께 통상적으로 나타나는 섬유화 장애는, 예를 들어 기관 섬유증, 예컨대 신장 섬유증 (예를 들어, 만성 신장 질환과 연관된 섬유증), 간 섬유증 (예를 들어, 비알콜성 지방간염 (NASH)과 연관된 섬유증), 또는 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF)과 연관된 섬유증)을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 LTBP1/3-특이적 억제제가 대상체를 치료하기 위해 선택된다.
또 다른 예에서, 섬유화 장애를 갖는 대상체는 섬유증 및 염증을 포함한 임상 징후를 나타낼 수 있다. 상기 증상의 조합과 함께 통상적으로 나타나는 섬유화 장애는, 예를 들어 경피증을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 LTBP1/3-특이적 억제제가 대상체를 치료하기 위해 선택된다. 상기 증상의 조합과 함께 통상적으로 나타나는 추가의 섬유화 장애는, 예를 들어 변성 질환, 예컨대 근육 이영양증, 예를 들어 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 LTBP1/3-특이적 억제제가 대상체를 치료하기 위해 선택된다.
섬유화 장애를 갖는 대상체는 면역 억제 및 증식성 조절이상을 포함한 임상 징후를 나타낼 수 있다. 상기 증상의 조합과 함께 통상적으로 나타나는 섬유화 장애는, 예를 들어 고형 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 악성 종양이다. 다른 실시양태에서, 고형 종양은 양성 종양이다. 예시적 실시양태에서, 대상체는 결합조직형성증 (예를 들어, 췌장 결합조직형성증)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 외과적 절제에 "수술불가능한" 또는 적합하지 않은 것으로 평가된 고형 종양을 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 환자는 종양의 외과적 절제에 대한 후보가 아니다. 그러나, 본 발명의 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제제를 포함하는 TGFβ1 억제 요법은 이러한 비-후보 환자를 수술을 받는데 보다 적합하도록 역전시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양을 갖는 대상체는 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, CAR-T 요법 및 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성이다 (예를 들어, 종양은 암 요법에 저항성임). 본 발명의 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제제를 포함하는 TGFβ1 억제 요법은 적어도 부분적으로 이러한 저항성을 역전시켜 환자가 암 요법에 보다 반응성이 되도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제 요법 및 암 요법 둘 다를 포함하는 조합 요법은 암을 상승작용적으로 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 요법과 함께 투여되는 콘텍스트-선택적 TGFβ1 억제 요법은 등가의 또는 개선된 임상 효과를 생성하기 위해 요구되는 암 요법의 투여량을 감소시킬 수 있다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 대상체는 유섬유종을 갖는다. 섬유화 장애가 면역 억제 및 증식성 조절이상을 포함한 임상 징후를 나타내는 상기 실시양태에서, 콘텍스트-특이적 LTBP1/3-특이적 억제제 및/또는 콘텍스트-특이적 GARP-특이적 억제제가 대상체를 치료하기 위해 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 섬유증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함한 임상 제시를 나타내는 섬유화 장애를 갖는 대상체를 선택하고, 대상체에게 유효량의 이소형-특이적, LTBP1/3-특이적 TGFβ1 억제제를 투여함으로써, 섬유화 장애를 갖는 대상체를 이소형-특이적, LTBP1/3 콘텍스트-특이적 TGFβ1 억제제로 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 섬유화 장애가 섬유증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함한 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. LTBP1/3-특이적 TGFβ1 억제제는 대상체가 섬유증 및 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함한 증상을 나타내는 경우에 대상체에게 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 섬유증, 면역 억제 및/또는 증식성 조절이상을 포함한 임상 제시를 나타내는 섬유화 장애를 갖는 대상체를 선택하고, 대상체에게 유효량의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 투여함으로써, 섬유화 장애를 갖는 대상체를 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제로 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 섬유화 장애가 섬유증, 면역 억제 및/또는 증식성 조절이상을 포함한 임상 제시를 나타내는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 대상체가 섬유증, 면역 억제 및/또는 증식성 조절이상을 포함한 증상을 억제하는 경우에 대상체에게 투여된다.
섬유화 장애를 갖는 대상체에서 염증, 면역 억제, 증식성 조절이상 및/또는 동종이식편 이식에 대한 필요를 포함한 임상 징후는 관련 기술분야에 공지된 방법 및 실무를 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 신체 검사 및 표준 진단 시험을 포함한다. 한 실시양태에서, 염증은 대상체가 혈장, 혈액 또는 혈청에서 염증성 바이오마커의 상승된 수준을 나타내는지를 결정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 염증성 바이오마커는, 예를 들어 C-반응성 단백질, 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 6 (IL-6), 종양 괴사 인자 α (TNF-α) 또는 그의 조합을 포함한다. 적혈구 침강 속도 (ESR) 및 혈장 점도 (PV)를 포함한 혈액 시험은 또한 섬유화 장애를 갖는 대상체에서 염증의 존재를 나타낼 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역 억제는 대상체의 혈액 세포, 예를 들어 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 대식세포 등의 수 및 조성을 결정함으로써 평가될 수 있다. 면역 억제는 또한 대상체가 면역억제제 의약을 투약받고 있거나 투약 이력을 갖는지를 결정하거나 또는 대상체가 면역 억제와 연관된 상태 (예를 들어, 혈액 악성종양, HIV/AIDS 등)를 갖는지를 결정함으로써 평가될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 증식성 조절이상은 혈액 시험, 생검 및/또는 영상화 절차, 예컨대 CT 스캔, 초음파 및 MRI를 포함한 표준 시험을 사용하여 평가될 수 있다. 암을 진단하기 위한 다른 표준 시험 (예를 들어, 바이오마커 시험 등)이 또한 증식성 조절이상을 평가하는데 사용될 수 있다. 동종이식편 이식에 대한 필요는 표준 절차를 사용하여 임상의에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 기관 기능의 상실 또는 부분적 상실 또는 기관 기능의 상실의 증가된 가능성은 이식에 대한 필요를 나타낸다.
언급된 바와 같이, 본 발명은 LTBP-제시된 TGFβ1 전구체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 사용에 의해 가능해진 ECM-연관 TGFβ1 복합체의 선택적 표적화를 제공한다. 본 발명의 일부 항체는 LTBP1- 및 LTBP3-연관 프로TGFβ1 복합체 둘 다에 결합하고 이를 억제할 수 있지만, 다른 것은 LTBP1-프로TGFβ1 또는 LTBP3-프로TGFβ1에만 결합한다는 점에서 훨씬 더 큰 선택성을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 특정 환자 집단이 TGFβ 신호전달의 면역 성분, 즉 GARP와 연관된 TGFβ에 또한 영향을 미치는 TGFβ 억제제에 비해, LTBP1/3-프로TGFβ1에 특이적인 콘텍스트-선택적 억제제를 포함하는 TGFβ1 억제 요법으로부터 이익을 얻을 수 있다는 인식을 포괄한다. 따라서, 자가면역 상태를 갖거나 자가면역 상태가 발생할 위험이 있는 대상체에서 TGFβ-관련 상태를 치료하기 위해, 매트릭스-연관 TGFβ를 선택적으로 억제하는 TGFβ 억제제 (예컨대 본원에 개시된 TGFβ1의 LTBP1/3 콘텍스트-선택적 억제제)는 면역계를 과자극할 위험을 최소화하면서 치료 이익을 제공할 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 이러한 대상체는 자가면역 장애, 예컨대 무이완증; 애디슨병; 성인 스틸병; 무감마글로불린혈증; 원형 탈모증; 아밀로이드증; 강직성 척추염; 항-GBM/항-TBM 신염; 항인지질 증후군; 자가면역 혈관부종; 자가면역 자율신경실조증; 자가면역 뇌척수염; 자가면역 간염; 자가면역 내이 질환 (AIED); 자가면역 심근염; 자가면역 난소염; 자가면역 고환염; 자가면역 췌장염; 자가면역 망막병증; 자가면역 두드러기; 축삭 & 뉴런 신경병증 (AMAN); 발로병; 베체트병; 양성 점막 유천포창; 수포성 유천포창; 캐슬만병 (CD); 복강 질환; 샤가스병; 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP); 만성 재발성 다초점성 골수염 (CRMO); 처그-스트라우스 증후군 (CSS) 또는 호산구성 육아종증 (EGPA); 반흔성 유천포창; 코간 증후군; 저온 응집소 질환; 선천성 심장 차단; 콕사키 심근염; CREST 증후군; 크론병; 포진성 피부염; 피부근염; 데빅병 (시신경척수염); 원판상 루푸스; 드레슬러 증후군; 자궁내막증; 호산구성 식도염 (EoE); 호산구성 근막염; 결절성 홍반; 본태성 혼합 한랭글로불린혈증; 에반스 증후군; 섬유근육통; 섬유화 폐포염; 거대 세포 동맥염 (측두 동맥염); 거대 세포 심근염; 사구체신염; 굿패스쳐 증후군; 다발혈관염을 동반한 육아종증; 그레이브스병; 길랑-바레 증후군; 하시모토 갑상선염; 용혈성 빈혈; 헤노흐-쉔라인 자반증 (HSP); 임신성 포진 또는 임신성 유천포창 (PG); 화농성 한선염 (HS) (아크네 인버사); 저감마글로불린혈증; IgA 신병증; IgG4-관련 경화성 질환; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP); 봉입체 근염 (IBM); 간질성 방광염 (IC); 소아 관절염; 소아 당뇨병 (제1형 당뇨병); 소아 근염 (JM); 가와사키병; 램버트-이튼 증후군; 백혈구파괴성 혈관염; 편평 태선; 경화성 태선; 목질 결막염; 선상 IgA 질환 (LAD); 루푸스; 라임병 만성; 메니에르병; 현미경적 다발혈관염 (MPA); 혼합 결합 조직 질환 (MCTD); 무렌 궤양; 뮈샤-하버만병; 다초점성 운동 신경병증 (MMN) 또는 MMNCB; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 근염; 기면증; 신생아 루푸스; 시신경척수염; 호중구감소증; 안구 반흔성 유천포창; 시신경염; 회귀성 류마티즘 (PR); PANDAS; 부신생물성 소뇌 변성 (PCD); 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH); 패리 롬버그 증후군; 주변부 포도막염 (말초 포도막염); 파소네지-터너 증후군; 천포창; 말초 신경병증; 정맥주위 뇌척수염; 악성 빈혈 (PA); POEMS 증후군; 결절성 다발동맥염; 다선성 증후군 유형 I, II, III; 류마티스성 다발근육통; 다발근염; 심근경색후 증후군; 심막절개술후 증후군; 원발성 담즙성 간경변증; 원발성 경화성 담관염; 프로게스테론 피부염; 건선; 건선성 관절염; 순수 적혈구 무형성증 (PRCA); 괴저성 농피증; 레이노 현상; 반응성 관절염; 반사 교감신경 이영양증; 재발성 다발연골염; 하지 불안 증후군 (RLS); 복막후 섬유증; 류마티스성 열; 류마티스 관절염; 사르코이드증; 슈미트 증후군; 공막염; 경피증; 쇼그렌 증후군; 정자 & 고환 자가면역; 강직 인간 증후군 (SPS); 아급성 박테리아 심내막염 (SBE); 스삭 증후군; 교감신경성 안염 (SO); 다카야스 동맥염; 측두 동맥염/거대 세포; 동맥염 혈소판감소성 자반증 (TTP); 톨로사-헌트 증후군 (THS); 횡단성 척수염; 제1형 당뇨병; 궤양성 결장염 (UC); 미분화 결합 조직 질환 (UCTD); 포도막염; 혈관염; 백반증; 보그트-코야나기-하라다병을 앓고 있을 수 있거나 그가 발생할 위험이 있을 수 있다.
LTBP1 및 LTBP3은 둘 다 ECM의 성분이며, 여기서 이들은 잠복 TGFβ 전구체 복합체를 디스플레이하거나 "제시"할 수 있다. 발현 연구로부터의 일부 관찰은 LTBP3의 결실, 제거 또는 기능적 억제가 특정 독성을 유발할 수 있다는 가능성을 제기한다. LTBP3-/- 마우스 (뿐만 아니라 일부 인간 돌연변이)는 저신장, 뿐만 아니라 골 및 치아 이상을 갖는다. 이들 표현형은 발생의 파괴와 연관될 가능성이 있지만, LTBP3이 성인에서 이들 조직의 항상성에서 소정 역할을 하는 것이 가능하다 (성인 골에서의 발현이 보고됨). 이들 관찰에 기초하여, 특정 임상 상황 (질환이 LTBP3을 발현하는 것으로 공지되고 독성과 연관된 조직에서 나타나는 경우)에서 또는 특정 환자 집단, 예컨대 여전히 활성적으로 발생 중인 소아 환자에서, LTBP3-관련 억제의 잠재적 독성을 피하는 것이 권장될 수 있다. LTBP1-/- KO 마우스는 간 섬유증 (담관 결찰에 의해 유도됨)에 대해 보호되기 때문에, LTBP1 기능의 상실은 섬유증의 적어도 일부 형태에 대해 보호하기에 충분한 것으로 보인다. 종합하면, 이들 데이터는 LTBP1-특이적 TGFβ1 억제가 특정 상황에서 LTBP1/3-TGFβ1 억제제와 비교하여 우수한 안전성 프로파일을 가질 수 있다는 가능성을 제기한다.
따라서, 본 발명의 LTBP1/3-선택적 억제제로부터 이익을 얻기에 적합하거나 그러할 가능성이 있는 환자 또는 환자 집단의 선택은 LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, GARP, LRRC33, 프로- 또는 성숙 TGFβ1, 프로- 또는 성숙 TGFβ2, 프로- 또는 성숙 TGFβ3 또는 그의 임의의 조합의 발현 프로파일을 평가하거나 확인하는 것을 수반할 수 있다. 발현 프로파일은 대상체 (예를 들어, 환자)로부터 수집된 생물학적 샘플로부터 적합한 검정에서 mRNA 및/또는 단백질의 존재/부재 또는 수준을 측정함으로써 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, LAP의 가용성 순환 단편(들)은 특정한 TGFβ 이소형의 발현에 대한 대용 마커로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 LAP 단편은 섬유생성의 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 8,198,412를 참조하며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
질환의 유전자 마커:
다양한 질환 상태에서의 TGFβ1 신호 전달 경로의 비정상적 활성화는 다수의 마커의 변경된 유전자 발현과 연관된 것으로 관찰되었다. 이들 유전자 발현 마커 (예를 들어, mRNA에 의해 측정시)는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 세르핀 1 (PAI-1을 코딩함), MCP-1 (CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF, ACTA2 (α-SMA를 코딩함), SNAI1 (E-카드헤린 (Cdh1)을 하향조절함으로써 섬유증 및 전이에서 EMT를 유도함), MMP2 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), MMP9 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), TIMP1 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), FOXP3 (Treg 유도의 마커), CDH1 (TGFβ에 의해 하향조절되는 E 카드헤린 (상피 세포의 마커)) 및 CDH2 (TGFβ에 의해 상향조절되는 N 카드헤린 (중간엽 세포의 마커)). 흥미롭게도, 이들 유전자 중 다수는 다양한 유형의 기관 섬유증을 포함한 다양한 세트의 질환 상태, 뿐만 아니라 골수섬유증을 포함한 많은 암에서 소정 역할을 하는데 연루된다. 실제로, 섬유화 상태와 비정상적 세포 증식, 종양발생 및 전이 사이의 병리생리학적 연관성이 시사되었다. 예를 들어, 문헌 [Cox and Erler (2014) Clinical Cancer Research 20(14): 3637-43 "Molecular pathways: connecting fibrosis and solid tumor metastasis"; Shiga et al. (2015) Cancers 7:2443-2458 "Cancer-associated fibroblasts: their characteristics and their roles in tumor growth"; Wynn and Barron (2010) Semin. Liver Dis. 30(3): 245-257 "Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis"]을 참조하며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용의 발명자들은 TGFβ1 신호전달 경로가 사실상 이들 광범위한 병리상태 사이의 주요 연결일 수 있다는 것을 고려한다.
손상 또는 질환 조직으로의 백혈구 동원 (예를 들어, 단핵구/대식세포)을 매개하는 화학주성 시토카인 (또는 케모카인)의 능력은 질환 진행에서 결정적인 결과를 갖는다. C-C 케모카인 패밀리의 구성원, 예컨대 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1) (CCL2로도 공지됨), 대식세포 염증성 단백질 1-알파 (MIP-1α) (CCL3으로도 공지됨) 및 MIP-1β (CCL4로도 공지됨)가 이 과정에 연루되었다.
예를 들어, MCP-1/CCL2는 섬유증 및 암 둘 다에서 소정 역할을 하는 것으로 생각된다. MCP-1/CCL2는 섬유화유발 케모카인으로서 특징화되고, 단핵구 화학유인물질이며, 증거는 암의 개시 및 진행 둘 다에 수반될 수 있다는 것을 시사한다. 섬유증에서, MCP-1/CCL2는 섬유증의 염증 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, MCP-1의 중화는 사구체 초승달형 형성 및 유형 I 콜라겐의 침착의 극적인 감소를 유발하였다. 유사하게, 항-MCP-1 또는 항-MIP-1 알파 항체를 사용한 수동 면역요법은 블레오마이신-챌린지된 마우스에서 단핵 식세포 축적을 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MIP-1 알파 및 MCP-1이 폐 염증 반응 동안 백혈구의 동원에 기여한다는 것을 시사한다 (Smith, Biol Signals. 1996 Jul-Aug;5(4):223-31, "Chemotactic cytokines mediate leukocyte recruitment in fibrotic lung disease"). 낭성 섬유증 및 다발성 골수종을 갖는 환자에서의 상승된 수준의 MIP-1알파가 보고되었으며 (예를 들어, 문헌 [Mrugacz et al., J Interferon Cytokine Res. 2007 Jun;27(6):491-5] 참조), 이는 MIP-1α가 국재화된 또는 전신 염증 반응과 연관된다는 개념을 지지한다.
일련의 증거는 종양 진행에서의 C-C 케모카인의 관여를 가리킨다. 예를 들어, 종양-유래 MCP-1/CCL2는 대식세포에서 "암-유발" 표현형을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 폐암에서, MCP-1/CCL2는 기질 세포에 의해 생산되고 전이를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 인간 췌장암에서, 종양은 CCL2를 분비하고, 면역억제 CCR2-양성 대식세포는 이들 종양에 침윤한다. 높은 CCL2 발현/낮은 CD8 T-세포 침윤을 나타내는 종양을 갖는 환자는 유의하게 감소된 생존을 갖는다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 손상 또는 이환 조직 환경으로 동원되는 단핵구는 후속적으로 국부 신호에 반응하여 (예컨대 종양-유래 시토카인에 반응하여) 분극화되어, 질환 진행에 추가로 기여할 수 있는 것으로 고려된다. 이들 M2-유사 대식세포는 이펙터 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 억제함으로써 면역 회피에 기여할 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 이 과정은 부분적으로 활성화된 대식세포에 의해 발현된 LRRC33-TGFβ1에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 방법은 부분적으로 Treg에 의해 발현된 GARP-TGFβ1에 의해 매개된다.
유사하게, PAI-1/세르핀1의 관여는 다양한 암, 혈관신생, 염증, 신경변성 질환 (예를 들어, 알츠하이머병)에 연루되었다. 종양 및/또는 혈청에서의 PAI-1의 상승된 발현은 다양한 암, 예컨대 유방암 및 방광암 (예를 들어, 이행 세포 암종) 뿐만 아니라 골수섬유증에서의 불량한 예후 (예를 들어, 보다 짧은 생존, 증가된 전이)와 상관관계가 있다. 섬유화 상태와 관련하여, PAI-1은 TGFβ1-유도된 섬유증의 중요한 하류 이펙터로서 인식되었고, 증가된 PAI-1 발현은 폐 섬유증 (예컨대 특발성 폐 섬유증 (IPF)), 신장 섬유증, 간 섬유증 및 경피증을 포함한 다양한 형태의 조직 섬유증에서 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 과정은 부분적으로 ECM-연관 TGFβ1에 의해, 예를 들어 LTBP1 및/또는 LTBP3을 통해 매개된다.
따라서, 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제 요법의 생체내 효과는 유전자 마커의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 적합한 마커는 TGFβ (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)를 포함한다. 적합한 마커는 또한 TGFβ (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)에 대한 1종 이상의 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP (또는 LRRC32) 및 LRRC33을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 마커는 중간엽 이행 유전자 (예를 들어, AXL, ROR2, WNT5A, LOXL2, TWIST2, TAGLN 및/또는 FAP), 면역억제 유전자 (예를 들어, IL10, VEGFA, VEGFC), 단핵구 및 대식세포 화학주성 유전자 (예를 들어, CCL2, CCL3, CCL4, CCL7, CCL8 및 CCL13), 및/또는 본원에 논의된 다양한 섬유화 마커를 포함한다. 바람직한 마커는 혈장 마커이다.
일부 실시양태에서, TGFβ1의 LTBP 복합체 억제제는 하기: PAI-1 (세르핀1에 의해 코딩됨), MMP2, MMP9, MCP-1 (CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF, α-SMA, ITGA11 및 ACTA2 중 1종 이상의 과다발현과 연관된 질환의 치료에 사용되며, 여기서 치료는 질환을 앓고 있는 대상체에게 질환을 치료하는데 유효한 양의 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 PAI-1, MCP-1/CCL2, CTGF 및/또는 α-SMA의 과다발현과 연관된 질환을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 질환은 골수섬유증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암, 예를 들어 고형 종양을 포함하는 암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 기관 섬유증, 예를 들어 간, 신장, 폐, 근육, 피부 및/또는 심장 또는 심혈관 조직의 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 알포트 증후군이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 하기 중 1종 이상의 발현을 감소시킨다: PAI-1 (세르핀1에 의해 코딩됨), MMP2, MMP9, MCP-1 (CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF, α-SMA, ITGA11 및 ACTA2.
TGFβ1 억제제 요법의 생체내 효과를 평가하는데 사용될 수 있는 또 다른 바이오마커는 혈액 우레아 질소 (BUN)이다. 우레아는 단백질 분해의 부산물로서 신체 내에서 자연적으로 형성된다. 우레아는 간에서 신장으로 이동하며, 여기서 혈액으로부터 여과/제거된다. 따라서, 환자의 신장이 적절하게 기능하지 않는 상황에서 BUN 수준이 증가할 수 있다. 예를 들어, 신장 섬유증을 갖는 환자는 증가된 BUN을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, BUN은 본원에 기재된 바와 같은 TGFβ1의 LTBP-특이적 억제제의 생체내 효과를 평가하기 위해 측정된다. 다른 실시양태에서, TGFβ1의 LTBP-특이적 억제제는 증가된 BUN과 연관된 질환 (예를 들어, 신장 섬유증 및/또는 급성 또는 만성 신장 질환, 손상 또는 부전)의 치료에 사용된다. 특정한 실시양태에서, 증가된 BUN과 연관된 질환은 알포트 증후군이다.
따라서, 본 개시내용은 TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 환자 (또는 환자 집단)로부터 수집된 생물학적 샘플, 예컨대 생검 샘플을 본원에 논의된 마커 중 1종 이상의 발현에 대해 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 유사하게, 이러한 유전자 마커(들)는 요법에 대한 환자의 반응성을 모니터링하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 모니터링은 환자로부터 수집된 2개 이상의 생물학적 샘플을, 예를 들어 요법의 투여 전 및 후에, 및 시간 경과에 따른 치료 요법의 과정 동안 시험하여, 치료 반응 또는 유효성을 나타내는 마커 중 1종 이상의 유전자 발현 수준의 변화를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택하는 방법은 유전자 마커(들), 예컨대 본원에 기재된 것에 대해 이전에 시험하였을 때 그의 이상 발현을 나타낸 환자 또는 환자 집단을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이상 마커 발현은 하기 중 적어도 1종의 상승된 수준을 포함한다: TGFβ1 (및/또는 TGFB1), LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3, CCL2, CCL3, PAI-1/세르핀1, MMP2, MMP9, Col1a1, Col3a1, FN1, CTGF, α-SMA, ITGA11 및 ACTA2. 일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단 (예를 들어, 그로부터 수집된 생물학적 샘플)은 상승된 TGFβ1 활성화, 포스포-Smad2/3 또는 그의 조합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단은 상승된 BUN을 나타낸다.
조합 요법
본 개시내용은 생체내 TGFβ1 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체를 치료하기 위한 조합 요법으로서 사용되는 제약 조성물 및 관련 방법을 추가로 포괄한다. 임의의 이들 실시양태에서, 이러한 대상체는 적어도 1종의 본원에 기재된 TGFβ1 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 제1 조성물을 동일하거나 중첩된 질환 또는 임상 상태를 치료하도록 의도된 적어도 1종의 추가의 치료제를 포함하는 제2 조성물과 함께 포함하는 조합 요법을 받을 수 있다. 제1 및 제2 조성물은 동일한 세포 표적 또는 별개의 세포 표적 둘 다에 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 조성물은 동일하거나 중첩된 세트의 질환 또는 임상 상태의 증상 또는 측면을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 조성물은 개별 세트의 질환 또는 임상 상태의 증상 또는 측면을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 한 예를 들자면, 제1 조성물은 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태를 치료할 수 있는 반면, 제2 조성물은 동일한 질환과 연관된 염증 또는 섬유증 등을 치료할 수 있다. 이러한 조합 요법은 서로 함께 투여될 수 있다. 조합 요법과 관련하여 어구 "와 함께"는 제1 요법의 치료 효과가 조합 요법을 받는 대상체에서 제2 요법의 치료 효과와 시간적으로 및/또는 공간적으로 중첩된다는 것을 의미한다. 따라서, 조합 요법은 요법의 공동 투여를 위한 단일 제제로서 또는 순차적 투여를 위한 개별 제제로서 제제화될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 조합 요법은 질환의 치료에서 상승작용적 효과를 생성한다. 용어 "상승작용적"은 총괄적으로 각각의 단독요법의 상가적 효과 (예를 들어, 보다 큰 효능)보다 더 큰 효과를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물을 포함하는 조합 요법은 또 다른 요법 (예컨대 제2 작용제의 단독요법)에 의해 생성되는 것과 전체적으로 등가의 효능을 생성하지만 제2 작용제의 단독요법과 비교하여 제2 작용제와 연관된 더 적은 원치않는 유해 효과 또는 덜 중증인 독성과 연관된다. 일부 실시양태에서, 이러한 조합 요법은 제2 작용제의 더 낮은 투여량을 가능하게 하지만, 전체 효능은 유지한다. 이러한 조합 요법은 장기간 치료가 필요하고/거나 소아 환자를 수반하는 환자 집단에 특히 적합할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은, TGFβ1 단백질 활성화의 감소 및 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 조합 요법에 사용하기 위한 제약 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 방법 또는 제약 조성물은 제2 요법을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 요법은 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 제2 요법은 표적 질환과 연관된 적어도 1종의 증상(들)을 감소시키거나 치료할 수 있다. 제1 및 제2 요법은 유사하거나 비관련된 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있거나; 또는 제1 및 제2 요법 중 하나 또는 둘 다는 다수의 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물은 각각의 기재된 실시양태에 대해 동일한 제약상 허용되는 담체 중에 또는 상이한 제약상 허용되는 담체 중에 제1 및 제2 요법을 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 제1 및 제2 요법은 기재된 실시양태 내에서 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
한 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 억제제, 예를 들어 항체는 TGFβ1 활성을 억제하는 또 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 제2 작용제는 또 다른 콘텍스트-특이적 TGFβ1 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 조합 요법은 (i) LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 및 (ii) GARP-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조합 요법은 (i) LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 및 (ii) LRRC33-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다. LRRC33-TGFβ1에 선택적으로 결합하는 콘텍스트-특이적 항체는, 예를 들어 US 62/503,785에 기재되어 있고, GARP-TGFβ1에 선택적으로 결합하는 콘텍스트-특이적 항체는 상기 기재되어 있다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 조합 요법은 (i) LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 및 (ii) 제시 분자 (예를 들어, LTBP1/3, GARP 및/또는 LRRC33)와의 복합체로 존재하는 프로/잠복 TGFβ1에 선택적으로 결합하는 콘텍스트-비의존성 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다. TGFβ1의 콘텍스트-비의존성 억제제는, 예를 들어 WO 2017/156500에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 1종 이상의 항-TGFβ1 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 1종 이상의 추가의 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 항-TGFβ 항체와 함께 사용될 수 있는 추가의 치료제의 예는 미오스타틴 억제제, VEGF 효능제, IGF1 효능제, FXR 효능제, CCR2 억제제, CCR5 억제제, 이중 CCR2/CCR5 억제제, 리실 옥시다제-유사-2 억제제, ASK1 억제제, 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC) 억제제, p38 키나제 억제제, 피르페니돈, 닌테다닙, 세론세르팁, 실로펙서, 피르소코스타트, 피르페니돈, 오베티콜산, 엘라피브라노르, 항-CD147 항체, 항-GP73 항체, 갈락틴-1 억제제, 세론세르팁, 카스파제 억제제 (엠리카산, IDN-6556, PF-03491390), GDF11 억제제, GDF8/미오스타틴 억제제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. GDF8/미오스타틴 억제제는 바람직하게는 미오스타틴-선택적 억제제 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)이다. 미오스타틴-선택적 억제제는 잠복 미오스타틴에 결합할 수 있다. 미오스타틴-선택적 억제제의 비제한적 예는 SRK-015 (예를 들어, WO2017/218592A1 참조) 및 트레보그루맙 또는 그의 임의의 변이체, 또는 WO 2016/098357에 따른 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 PD-1 길항제, PDL1 길항제, PD-L1 또는 PDL2 융합 단백질, CTLA4 길항제, GITR 효능제, 항-ICOS 항체, 항-ICOSL 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-OX40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD70 항체, 항-CD47 항체, 항-41BB 항체, 항-PD-1 항체, 종양용해 바이러스 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 추가의 요법은 방사선이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 탁솔이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 항염증제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 단핵구/대식세포 동원 및/또는 조직 침윤의 과정을 억제한다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 간 성상 세포 활성화의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 케모카인 수용체 길항제, 예를 들어 CCR2 길항제 및 CCR5 길항제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 케모카인 수용체 길항제는 이중 특이적 길항제, 예컨대 CCR2/CCR5 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법으로서 투여될 추가의 작용제는 성장 인자의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원 또는 그의 조절제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 GDF8/미오스타틴 및 GDF11의 조정제 (예를 들어, 억제제 및 활성화제)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 GDF8/미오스타틴 신호전달의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 프로/잠복 미오스타틴 복합체에 결합하고 미오스타틴의 활성화를 차단하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 프로/잠복 미오스타틴 복합체에 결합하고 미오스타틴의 활성화를 차단하는 모노클로날 항체는 유리, 성숙 미오스타틴에는 결합하지 않는다.
TGFβ 억제제 (예컨대 본원에 개시된 TGFβ1-선택적 억제제)를 포함하는 조합 요법은, 1종 이상의 추가의 요법과 함께, 다양한 간 질환을 치료하기 위해 고려될 수 있다. 간 질환의 비제한적 예는 다음을 포함할 수 있다: 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 예를 들어 비-알콜성 지방간 (NAFL) 및 비-알콜성 지방간염 (NASH), 이는 다음을 포함할 수 있다: 간 섬유증을 동반한 비경변성 NASH, 간 경변증, 대상성 간경변증을 동반한 NASH, 비대상성 간경변증을 동반한 NASH, 섬유증을 동반한 간 염증, 섬유증을 동반하지 않은 간 염증; 2기 및 3기 간 섬유증, 4기 섬유증 (NASH 간경변증 또는 섬유증을 동반한 경변성 NASH), 원발성 담즙성 담관염 (PBC) (이전에 원발성 담즙성 간경변증으로 공지됨), 및 원발성 경화성 담관염 (PSC).
하기 요법 중 1종 이상이 상기 열거된 것과 같은 간 질환의 치료를 위해 TGFβ 억제제 (예컨대 본원에 개시된 TGFβ1-선택적 억제제)와 함께 사용될 수 있다: 피오글리타존 (PPARγ 효능제); 엘라피브라노르 (PPARα/δ 효능제); 사로글리타자르 (PPARα/γ 효능제); 오베티콜산 (FXR 효능제); 리라글루티드 (GLP-1 수용체 효능제); 아람콜 (SCD 억제제); 볼릭시바트 (SHP-626) (ASBT 억제제); BMS-986036 (FGF-21 유사체); NGM-282 (FGF-19 유사체); 테사모렐린 (GHRH 유사체); NDI-010976 (ACC 억제제); GS-9674 (FXR 효능제); Dur-928 (황산화 옥시스테롤); AZD4076 (miR-103/107 길항제); 로수바스타틴 (HMG-CoA 리덕타제 억제제); INT-767 (FXR/TGR5 효능제); 세벨라머 (담즙산 격리제); 비타민 E (항산화제); 펜톡시필린 (PDE 억제제); 세니크리비록 (CCR2/CCR5 길항제); 엠리카산 (카스파제 억제제); GS-4997 (ASK1 억제제); 암렉사녹스 (IKKε/TBK1 억제제); PXS-4728A (VAP-1 억제제); 오를리스타트 (장 리파제 억제제); IMM-124e (IgG-풍부 소 초유); 솔리트로마이신 (항생제); 변 미생물 이식 (장 마이크로바이옴의 조정); 심투주맙 (LOXL2 항체); GR-MD-02 (갈렉틴-3 억제제); 트레보그루맙 (미오스타틴 억제제); 가레토스맙 (액티빈 A 억제제); 및 SRK-015 (미오스타틴 억제제).
이러한 조합 요법은 유리하게는 투여된 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용할 수 있고, 따라서 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체를 검출하기 위한 검정
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 대상체로부터 수득된 샘플에서 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 "대상체"는 개별 유기체, 예를 들어 개별 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 가금류, 고양이 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리 또는 선충류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연구용 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전자 조작된, 예를 들어 유전자 조작된 비-인간 대상체이다. 대상체는 어느 한 성별일 수 있고, 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자 또는 건강한 지원자이다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터 수득된 샘플에서 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체를 검출하는 방법은 (a) 항원이 샘플에 존재하는 경우에, 샘플을 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 항체와 항원에 대한 항체의 결합에 적합한 조건 하에 접촉시켜 결합 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 항원에 결합된 항체의 수준을 결정하는 단계 (예를 들어, 결합 복합체의 수준을 결정하는 단계)를 수반한다.
한 실시양태에서, 표면 상에 고정화된 비오티닐화 잠복 TGFβ1 복합체를 이용하는 스크리닝 검정이 이용되며, 이는 예를 들어 테더를 제공함으로써 인테그린에 의한 잠복 TGFβ의 활성화를 가능하게 한다. 다른 비-인테그린 활성화제가 또한 그 시스템에서 시험될 수 있다. 판독은 리포터 세포 또는 다른 TGFβ-의존성 세포 반응을 통해 측정될 수 있다.
TGFβ 활성화를 측정하기 위한 세포-기반 검정
TGFβ의 활성화 (및 TGFβ 시험 억제제, 예컨대 항체에 의한 그의 억제)는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, TGFβ의 인테그린-매개 활성화는 세포-기반 검정, 예컨대 본원에 보다 상세하게 기재된 "CAGA12" 루시페라제 검정에 이용될 수 있다. 이러한 검정 시스템은 하기 성분을 포함할 수 있다: i) TGFβ의 공급원 (재조합, 내인성 또는 형질감염됨); ii) 인테그린의 공급원 (재조합, 내인성 또는 형질감염됨); 및 iii) TGFβ 활성화에 반응하는 리포터 시스템, 예컨대 TGFβ에 반응하여 신호를 판독가능한 출력 (예를 들어, CAGA12 세포 또는 다른 리포터 세포주에서의 루시페라제 활성)으로 번역할 수 있는 TGFβ 수용체를 발현하는 세포. 일부 실시양태에서, 리포터 세포주는 TGFβ-반응성 프로모터 (예를 들어, PAI-1 프로모터)의 제어 하의 리포터 유전자 (예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감수성을 부여하는 특정 프로모터 요소는 리포터 시스템 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 프로모터 요소는 CAGA12 요소이다. 검정에 사용될 수 있는 리포터 세포주는, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Abe et al. (1994) Anal Biochem. 216(2): 276-84]에 기재되었다. 일부 실시양태에서, 각각의 상기 언급된 검정 성분은 동일한 공급원 (예를 들어, 동일한 세포)으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 검정 성분 중 2종은 동일한 공급원으로부터 제공되고, 제3 검정 성분은 상이한 공급원으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 모든 3종의 검정 성분은 상이한 공급원으로부터 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인테그린 및 잠복 TGFβ 복합체 (프로TGFβ 및 제시 분자)는 동일한 공급원 (예를 들어, 동일한 형질감염된 세포주)으로부터 검정을 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 및 TGF는 별개의 공급원 (예를 들어, 2종의 상이한 세포주, 정제된 인테그린 및 형질감염된 세포의 조합)으로부터 검정을 위해 제공된다. 세포가 검정 성분 중 1종 이상의 공급원으로서 사용되는 경우에, 검정의 이러한 성분은 세포에 대해 내인성이거나, 세포에서 안정하게 발현되거나, 일시적으로 형질감염되거나 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
통상의 기술자는 다양한 적합한 구성에 이러한 검정을 용이하게 적합화시킬 수 있다. 예를 들어, TGFβ의 다양한 공급원이 고려될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ의 공급원은 TGFβ를 발현하고 침착시키는 세포 (예를 들어, 1차 세포, 증식 세포, 불멸화 세포 또는 세포주 등)이다. 일부 실시양태에서, TGFβ의 공급원은 적합한 수단을 사용하여 검정 시스템에 고정화된 정제된 및/또는 재조합 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 검정 시스템에 고정화된 TGFβ는 탈세포화의 존재 또는 부재 하에, 검정 플레이트 상의 세포외 매트릭스 (ECM) 조성물 내에 제시되며, 이는 섬유모세포-유래 TGFβ를 모방한다. 일부 실시양태에서, TGFβ는 검정에 사용되는 세포의 세포 표면 상에 제시된다. 추가적으로, 선택된 제시 분자는 적합한 잠복-TGFβ 복합체를 제공하기 위해 검정 시스템에 포함될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어느 제시 분자(들)가 특정 세포 또는 세포 유형에 존재하거나 또는 발현될 수 있는지 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 검정 시스템을 사용하여, 시험 작용제 (예컨대 항체)의 존재 또는 부재 하의 TGFβ 활성화의 상대 변화가 시험관내 TGFβ 활성화에 대한 시험 작용제의 효과를 평가하기 위해 용이하게 측정될 수 있다.
이러한 세포-기반 검정은 연구될 TGFβ 이소형, 잠복 복합체 (예를 들어, 제시 분자)의 유형 등에 따라 다수의 방식으로 변형 또는 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ를 활성화시킬 수 있는 인테그린을 발현하는 것으로 공지된 세포는 검정에서 인테그린의 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 SW480/β6 세포 (예를 들어, 클론 1E7)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인테그린-발현 세포는 관심 제시 분자 (예컨대 GARP, LRRC33, LTBP (예를 들어, LTBP1 또는 LTBP3) 등)를 코딩하는 플라스미드 및 관심 TGFβ 이소형의 프로-형태 (예컨대 프로TGFβ1)를 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염될 수 있다. 형질감염 후, 세포를 형질감염된 유전자의 발현을 허용하기에 충분한 시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 인큐베이션하고, 세포를 세척하고, 시험 작용제 (예를 들어, 항체)의 연속 희석물과 함께 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 조직 배양 웰 또는 플레이트는 세포가 ECM 성분을 부착, 성장 및/또는 침착시킬 수 있는 유리한 기재를 제공하는 물질로 코팅될 수 있다. 이는 세포의 ECM 아키텍처, 조직화 또는 그에 대한 부착을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 하전된 물질, 예컨대 폴리-리신이 조직 배양 기재를 사전-코팅하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, ECM의 1종 이상의 성분, 예컨대 라미닌, 피브로넥틴 등이 코팅을 위한 기재로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 형질감염 전에 ECM 단백질-코팅된 웰/플레이트 상에 시딩된다. 일부 실시양태에서, 세포는 형질감염 후에 ECM 코팅된 웰/플레이트 상에 시딩된다. 일부 실시양태에서, 웰/플레이트는 피브로넥틴으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 웰/플레이트는 인간 피브로넥틴으로 코팅된다.
형질감염 (및 임의로 ECM 코팅된 웰/플레이트 상에 시딩) 후, 리포터 세포주 (예를 들어, CAGA12 세포)가 검정 시스템에 첨가되고, 이어서 적절한 인큐베이션 시간으로 TGFβ 신호전달을 허용한다. 시험 작용제의 첨가 후 인큐베이션 기간 (예를 들어, 약 18-20시간) 후에, 신호/판독 (예를 들어, 루시페라제 활성)이 적합한 수단을 사용하여 검출된다 (예를 들어, 루시페라제-발현 리포터 세포주의 경우, 브라이트-글로(Bright-Glo) 시약 (프로메가(Promega))이 사용될 수 있음). 일부 실시양태에서, 루시페라제 형광은 오토게인 세팅 하에 바이오텍(BioTek) (시너지(Synergy) H1) 플레이트 판독기를 사용하여 검출될 수 있다.
LTBP1/3-TGFβ와 연관된 질환/장애를 완화시키는데 사용하기 위한 키트
본 개시내용은 또한 TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환/장애를 완화시키는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 것에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 본원에 기재된 것과 같은 표적 질환을 치료하거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그를 완화시키기 위해 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 것에 대한 기재를 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 갖는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 기재를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지침서는 표적 질환의 위험이 있는 개체에게 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 것에 대한 기재를 포함한다.
LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 지침서 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 지침서)가 또한 허용된다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그를 완화시키는데 사용된다는 것을 나타낼 수 있다. 지침서는 본원에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위해 제공될 수 있다.
본 개시내용의 키트는 적합한 패키징으로 제공될 수 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 LTBP1-TGFβ1 복합체 및/또는 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
진단, 환자 선택, 모니터링
TGFβ1 억제 요법을 포함하는 치료 방법은 TGFβ1 적응증의 진단 및/또는 이러한 요법에 반응할 가능성이 있는 환자의 선택을 포함할 수 있다. 추가적으로, TGFβ1 억제제를 받은 환자는 치료의 치료 효과에 대해 모니터링될 수 있으며, 이는 전형적으로, 상태의 지표이자 치료 전 및 후에 측정 (예를 들어, 검정)될 수 있는 1종 이상의 적합한 파라미터를 측정하고, 파라미터에서의 치료-관련 변화를 평가하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 파라미터는 환자로부터 수집된 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 포함할 수 있다. 바이오마커는 RNA-기반, 단백질-기반, 세포-기반 및/또는 조직-기반일 수 있다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 과다발현되는 유전자는 질환 또는 요법에 대한 반응을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 질환-연관 세포 집단의 세포-표면 단백질은 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 이러한 방법은 특정한 질환의 정도를 나타내는 질환 파라미터의 직접 측정을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 샘플링 방법, 예컨대 혈청/혈액 샘플, 생검 및 영상화가 사용될 수 있다.
생검이 전통적으로 다양한 질환, 예컨대 섬유증 (예를 들어, 기관 섬유증) 및 증식성 장애 (예를 들어, 암)를 진단 및 모니터링하기 위한 표준이었지만, 덜 침습적인 대안이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 많은 비-침습적 생체내 영상화 기술이 치료를 위해 환자를 진단, 모니터링 및 선택하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자 또는 대상체에서 질환을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 생체내 영상화 기술의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 받고 있다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 받고 있다. 다른 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 사용한 치료를 위한 환자를 선택하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 기술은 환자가 요법, 예를 들어 TGFβ1 억제 요법에 반응하는지 또는 어떻게 반응하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
방법에 사용되는 예시적인 생체내 영상화 기술은 X선 방사선촬영, 자기 공명 영상화 (MRI), 의료 초음파검사 또는 초음파, 내시경검사, 탄성측정법, 촉각 영상화, 온도기록술, 의료 사진촬영을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 영상화 기술은 핵 의학 기능적 영상화, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 (PET) 및 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 포함한다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
암을 진단하고 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 비-침습적 영상화 기술은 자기 공명 영상화 (MRI), 컴퓨터 단층촬영 (CT), 초음파, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 형광 반사 영상화 (FRI) 및 형광 매개 단층촬영 (FMT)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하이브리드 영상화 플랫폼이 또한 암을 진단하고 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 기술은 PET-CT, FMT-CT, FMT-MRI 및 PET-MRI를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 동적 조영 증강 MRI (DCE-MRI)는 유방암을 검출하는데 통상적으로 사용되는 또 다른 영상화 기술이다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
섬유증을 진단 및 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 비-침습적 영상화 기술은 초음파 (예를 들어, 통상적인 또는 조영-증강 초음파), 초음파 탄성측정법 (예를 들어, 일시적 탄성측정법, 점 전단파 탄성측정법 및 2D-전단파 탄성측정법), CT 스캔 (예를 들어, 통상적인 CT 또는 CT 관류 영상화), 자기 공명 영상화 (MRI) (예를 들어, 통상적인 MRI, 자기 공명 탄성측정법, 확산 가중 자기 공명 영상화, 가독세트산 이나트륨 및 자기 공명 관류 영상화)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 간 섬유증 또는 간 지방증의 수준을 평가하기 위해 비-침습적 영상화 기술이 사용된다. 예를 들어, 간 섬유증을 평가하는데 특히 유용한 영상화 기술은 피브로스캔 (일시적 탄성측정법; TE), 점 전단파 탄성측정법 (pSWE; 일명 음향 방사선력 임펄스 (ARFI)), 2D-3D SWE, 자기 공명 탄성측정법 (MRE), 및 다중파라미터 MRI를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 간 지방증을 평가하는데 특히 유용한 영상화 기술은 초음파검사, 제어 감쇠 파라미터 (CAP) 탄성측정법, MRI-추정 양성자 밀도 지방 분율 (MRI-PDFF), 및 자기 공명 분광분석법 (MRS)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간 강직을 평가하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간내 트리글리세리드 수준을 검출 및 평가하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간 표면 결절형성 (LSN; 일명 "간 점수"), 간 강직 및/또는 간 절편 부피 비 (LSVR)를 평가하는데 사용되며, 이들은 모두 간 섬유증의 병기결정 및 간경변증의 하위-병기결정에 유익하다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
보다 최근에, 생체내 관심 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포, 대식세포 및 암 세포)의 검출을 가능하게 할 비-침습적 영상화 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, www.imaginab.com/technology/; 문헌 [Tavare et al. (2014) PNAS, 111(3): 1108-1113; Tavare et al. (2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264; Rashidian et al. (2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255; Beckford Vera et al. (2018) PLoS ONE 13(3): e0193832; 및 Tavare et al. (2015) Cancer Res 76(1): 73-82] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 소위 "T-세포 추적"은 생체내에서 항종양 이펙터 T-세포를 검출하고 국재화하는 것을 목표로 한다. 이는 고형 종양의 면역억제 표현형을 이해하는데 유용한 통찰을 제공할 수 있다. 세포독성 T 세포가 널리-침윤된 종양 ("염증발생" 또는 "핫" 종양)은 체크포인트 차단 요법 (CBT)과 같은 암 요법에 반응할 가능성이 있다. 다른 한편으로는, 면역억제 표현형을 갖는 종양은 항종양 면역 반응이 있는 경우에도 불량한 T-세포 침윤을 갖는 경향이 있다. 이들 소위 "면역 배제된" 종양은 CBT와 같은 암 요법에 반응하지 못할 가능성이 있다. T-세포 추적 기술은 이들 상이한 표현형을 밝혀낼 수 있고, 환자에게 유익할 가능성이 있는 치료 접근법을 안내하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, "면역 배제된" 종양을 갖는 환자는 면역억제 표현형을 역전시키는 것을 돕는 TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있다. 유사한 기술을 사용하여 다른 질환, 예를 들어 섬유증을 진단 및 모니터링할 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 검출 모이어티 (예를 들어, 방사성표지, 형광 등)로 조작된 항체 또는 항체-유사 분자는 환자 내로 주입될 수 있고, 이는 이어서 특정한 마커 (예를 들어 CD8+ 및 M2 대식세포)의 부위로 분포 및 국재화될 것이다.
비-침습적 생체내 영상화 기술은 환자를 진단하고/거나; TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 환자를 선택 또는 확인하고/거나; 치료시 치료 반응에 대해 환자를 모니터링하는 것을 목적으로 하는 다양한 적합한 방법에 적용될 수 있다. 공지된 세포-표면 마커를 갖는 임의의 세포는 세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유사한 분자를 사용함으로써 검출/국재화될 수 있다. 전형적으로, 이러한 기술의 사용에 의해 검출될 세포는 면역 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구, 조절 T 세포, MDSC, 질환-연관 대식세포 (M2 대식세포, 예컨대 TAM 및 FAM), NK 세포, 수지상 세포 및 호중구이다.
적합한 면역 세포 마커의 비제한적 예는 단핵구 마커, 대식세포 마커 (예를 들어, M1 및/또는 M2 대식세포 마커), CTL 마커, 억제성 면역 세포 마커, MDSC 마커 (예를 들어, G- 및/또는 M-MDSC에 대한 마커), 예컨대 비제한적으로: CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD206, CD68, CD14, CD15, CD66, CD34, CD25 및 CD47을 포함한다.
일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간 지방증, 간 트리글리세리드, 면역 세포 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같음) 및/또는 근섬유모세포를 측정한다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 트리글리세리드, 지방증, 간 표면 결절, 염증 및/또는 대식세포를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 선택된 환자는 간 부피의 >5.5%의 간내 트리글리세리드 함량을 가지며, 임의로 여기서 간내 트리글리세리드 함량은 간 부피의 >10%이다. 일부 실시양태에서, 치료는 간내 트리글리세리드 함량을 간 부피의 ≤ 5.5%로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 MDSC를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 대식세포를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 유효량은 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 임의로 3 mg/kg 내지 30 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 본원에 기재된 바와 같은 치료 반응 (예를 들어, 감소된 트리글리세리드, 감소된 지방증, 감소된 간 표면 결절, 감소된 염증, 감소된 대식세포 및/또는 감소된 간 점수)에 대해 모니터링하는 것을 추가로 포함한다.
스크리닝 과정; 제조
본 발명은 hLTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하고 그로부터 느린 속도로 해리되는 항체 또는 그의 단편의 스크리닝 방법, 생산 방법 및 제조 공정 및 그를 포함하는 제약 조성물 및 관련 키트를 포괄한다.
항체 (또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 구축물)를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법은 바람직한 속성을 갖는 이러한 항체의 확인 및 선택을 요구한다. 여기서, 본 발명은 낮은 kOFF 값을 갖는 항체가 이들 활성화 억제제의 작용 메카니즘을 반영하는 지속성을 제공할 수 있다는 인식을 포함하며, 이는 신속하게 내인성 수용체와 결합하는 것에 경쟁하는 능력에 의존하는 것이 아니라, 오히려 조직 내의 TGFβ1의 불활성 잠복 형태 상에 래칭함으로써 억제 효과를 발휘한다. 잠복 항원 복합체에 결합된 채로 머무르는 능력 (낮은 해리율에 상응함)은 생체내에서 지속적인 효력을 달성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 낮은 해리율 (예를 들어, ≤ 5 x 10-4 (1/s))로 인간 LLC에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계 및 항체를 대규모로 생산하는 단계를 포함하는, TGFβ1-선택적 활성화 억제제를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
유리한 오프 레이트 (낮은 해리)를 갖는 억제제의 선택은 1가 항체 (예를 들어, Fab 단편) 또는 전장 항체 (예를 들어, IgG)를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생산 단계는 250L 이상, 예를 들어 1000L, 2000L, 3000L, 4000L의 부피를 갖는 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 방법은 세포 배양물로부터 항체를 정제하는 단계 및 임의로 정제된 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 선택된 항체를 효능 및 안전성에 대해 적합한 전임상 모델에서 시험하는 단계 및 항체가 NOAEL에서 효과적인지를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 안전성 평가는 조직병리학 및 면역-지정 안전성 평가를 포함하는 생체내 독성학 연구, 예를 들어 시험관내 시토카인 방출 검정 및 혈소판 검정을 포함할 수 있다.
지속적인 억제 효과를 달성하기 위해, 10.0E-4 이하 (s-1) (예를 들어, 5.0E-4 이하, 1.0E-4 이하, 5.0E-5 이하)의 해리율 (예를 들어, 1가 해리율)을 갖는 항체가 본 개시내용에 따른 치료 용도 및/또는 대규모 제조를 위해 선택될 수 있다.
본 개시내용의 여러 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/거나 본원에 기재된 결과 및/또는 1가지 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 개시내용의 교시가 사용되는 구체적 적용 또는 적용들에 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 개시내용의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서, 개시내용은 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 각각의 개별 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법에 관한 것이다. 추가로, 2개 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우에, 본 개시내용의 범주 내에 포함된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원, 뿐만 아니라 도면의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1)은 전구-단백질로서 발현되며, 이는 C-말단 성장 인자 및 N-말단 프로도메인으로 단백질분해적으로 절단된다. 절단 후, 프로도메인은 성장 인자와 비공유적으로 회합된 채로 남아, 수용체 결합을 방지한다. 이러한 잠복 TGFβ1은 프로도메인을 제시 분자에 연결하는 디술피드 결합을 통해 대형 잠복 복합체 (LLC)를 형성하고, 이어서 이들 대형 잠복 복합체는 세포외 매트릭스 (ECM) 내로 침착되거나 또는 세포 표면에 이르게 된다. 이들 제시 분자는 특이적 αVβ 인테그린에 대한 앵커를 제공하여 잠복 TGFβ1 상에 견인력을 발휘한다. 4종의 TGFβ1 제시 단백질이 확인되었다: 잠복 TGFβ 결합 단백질-1 (LTBP1) 및 LTBP3은 세포외 매트릭스에 침착된 반면, 당단백질-A 반복 우세형 (GARP/LRRC32) 및 류신-풍부 반복부-함유 단백질 33 (LRRC33)은 면역 세포의 표면 상에 잠복 TGFβ1을 제시한다. TGFβ1은 조직 항상성 과정 및 면역 반응의 조절에 수반되고, 그의 활성화의 조절이상은 기관 섬유증, 암 및 자가면역의 주요 유도인자이다.
광범위하게 발현되는 TGFβ 성장 인자 및 수용체와 비교하여, 4종의 제시 분자-프로TGFβ 복합체, 즉 LTBP1-프로TGFβ, LTBP3-프로TGFβ, GARP-프로TGFβ 및 LRRC33-프로TGFβ는 보다 제한적 또는 선택적 (예를 들어, 조직-특이적) 발현 패턴을 나타내며, 이는 회합에 의해 TGFβ 활성의 기능적 구획화를 일으킨다. 따라서, 제시 분자-프로TGFβ 복합체는 제시 분자가 발현되는 조직 내에 TGFβ 신호전달의 별개의 "콘텍스트"를 제공한다. 이들 콘텍스트는 2개의 광범위한 카테고리로 나뉠 수 있다: i) ECM과 연관된 TGFβ 신호전달 (예를 들어, 매트릭스-연관 TGFβ 기능); 및 ii) 세포와 연관된 TGFβ 신호전달 (특히 특정 면역 세포 기능). LTBP1-프로TGFβ 및 LTBP3-프로TGFβ 복합체는 제1 카테고리에 속하는 반면, GARP-프로TGFβ 및 LRRC33-프로TGFβ 복합체는 제2 카테고리에 속한다.
치료 목적을 위한 TGFβ 활성의 비-선택적 표적화는 범-TGFβ 경로 억제제에 대해 보고된 용량-제한 독성, 뿐만 아니라 만성 TGFβ 억제를 통한 면역계 활성화로 인해 도전과제였다. TGFβ1 표적화에 대한 이소형- 및 콘텍스트-선택성 둘 다에 대한 이러한 치료 필요를 다루기 위한 노력으로, ECM과 연관된 TGFβ의 활성화를 선택적으로 억제할 수 있는 TGFβ의 억제제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 억제제는 또한 특정한 TGFβ 이소형 (예를 들어, 프로TGFβ1, 프로TGFβ2 및/또는 프로TGFβ3)에 대해 선택적이다. 이소형-특이적 모노클로날 항체는 잠복 TGFβ2 또는 TGFβ3에 대한 검출가능한 결합 없이 잠복 TGFβ1 프로도메인에 결합하고, 콘텍스트-선택성으로 시험관내 잠복 TGFβ1의 인테그린-매개 활성화를 억제한다. 항체 발견 및 특징화 노력을 용이하게 하기 위해, TGFβ1 활성화의 콘텍스트-의존성 세포-기반 검정을 개발하였다.
실시예 1: LTBP1/3-TGFβ1 복합체에 결합하는 콘텍스트-특이적 억제제의 개발
SR-AB1을 대조군으로서 사용하였다. SR-AB1은 제시 분자에 비의존성으로 잠복 TGFβ1에 결합한다 (도 2a 참조).
TGFβ1-함유 대형 잠복 복합체에 대해 선택적인 항체를 개발하였다. SR-AB2를 하기 실시예에 기재된 기능적 검정을 사용하는 추가의 분석을 위해 선택하였다. SR-AB2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 서열분석하였으며 (도 8); 상보성 결정 영역은 밑줄표시되어 있다. SR-AB2는 LTBP-제시된 잠복 TGFβ1 복합체에 결합하지만, GARP-TGFβ1 또는 프로TGFβ1 단독에는 결합하지 않는 것으로 입증되었다 (도 2b). 그러나, 하기 기재된 바와 같이, 이러한 선택적 결합의 기능적 효과는 공지되지 않았고, 신규 기능적 검정의 추가의 개발 없이 현재 공지된 기술을 사용하여서는 결정될 수 없었다.
실시예 2: 활성화된 재조합 잠복 TGFβ1의 억제를 검출하기 위한 기능적 검정
잠복 TGFβ2 또는 TGFβ3에 대한 검출가능한 결합 없이 잠복 TGFβ1 프로도메인에 결합하고 콘텍스트-의존성으로 시험관내 잠복 TGFβ1의 인테그린-매개 활성화를 억제하는 이소형-특이적 억제제를 확인하기 위해, 새로운 기능적 검정이 요구되었다. 본 발명 전에, LTBP에만 결합된 이소형-특이적 TGFβ1 항체를 검출할 수 있는 검정은 이용가능하지 않았다. 구체적으로, 이전의 검정 포맷은 내인성 제시 분자에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화와 외인성 LTBP에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화 사이를 구별할 수 없었다. 인테그린-발현 세포를 직접 형질감염시킴으로써, 본원에 개시된 신규 검정은 내인성 제시자-프로TGFβ1 활성과 외인성 LTBP-프로TGFβ1 활성 사이의 윈도우를 확립한다. LTBP-프로TGFβ1 복합체가 세포외 매트릭스에 포매되기 때문에, 검정 플레이트 코팅은 또한 검정의 중요한 성분이다. ECM 단백질인 피브로넥틴으로 코팅된 고 결합 플레이트의 사용은 LTBP 검정을 보다 강건하게 만들었다. 다시 말해서, 본 개시내용 전에, 프로TGFβ1 형질감염과 LTBP1/3 + 프로TGFβ1의 공동-형질감염 사이에 검정 윈도우는 없었다. 본 발명 전에, 유일한 이용가능한 검정 포맷은 삼중 공동-배양 시스템이었다: 형질감염체 (잠복 TGFβ 제시 세포) + 인테그린 발현 세포 (활성화제) + CAGA 세포 (리포터). 처음 2개의 세포 집단을 합하고, 인테그린 발현 세포를 TGFβ 및 제시 분자로 직접 형질감염시킴으로써, LTBP-프로TGFβ1 활성화에 대한 윈도우를 본원에서 확립하였다.
'벌크 형질감염' (즉, 검정 웰에 시딩하기 전 별개의 웰/플레이트/디쉬에서의 형질감염) 대 '직접 형질감염' (즉, 검정 웰에서의 형질감염) 프로토콜의 문제 및 LTBP 복합체에 대한 검정 윈도우가 관찰되는지의 여부는 일부 상황에서 세포 의존성인 것으로 보인다. 따라서, LTBP1/3-TGFβ1 억제제, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 부분의 발견 및 특징화는 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 콘텍스트-의존성 세포-기반 검정의 개발 없이는 가능하지 않았을 것이다 (또한 도 3a 및 3b 참조).
구체적으로, 실시예 1에서 개발된 항체가 기능적인지를 결정하기 위해, 각각의 공지된 제시 분자: LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33에 특이적인 TGFβ1 대형 잠복 복합체 (LLC)의 αVβ 인테그린 활성화의 세포-기반 검정을 개발하였다. 검정 개발 및 최적화의 과정을 통해, 피브로넥틴이 LTBP 제시된 TGFβ1 LLC의 인테그린-의존성 시험관내 활성화를 위한 중요한 ECM 단백질인 것으로 결정되었다. 콘텍스트-비의존성 및 LTBP 복합체-특이적 TGFβ1 LLC 항체를 또한 하기 검정을 사용하여 인테그린-의존성 활성화의 억제제로서 검증하였다. 따라서, 실시예 1에서 개발된 항체는 다음 2가지 부류로 나뉠 수 있다: 모든 TGFβ1 함유 복합체 (이소형-특이적 및 콘텍스트 비의존성)에 결합하는 항체 및 단지 LTBP 제시된 TGFβ1 LLC에만 결합하는 항체. 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본원에서 개발되고 기재된 검정 전에 확인될 수 없는 LTBP 복합체-특이적 부류의 억제제의 개발은 섬유화 적응증을 치료하기 위한 치료 접근법을 가능하게 하고, 면역 억제 세포의 TGFβ1 억제로 인한 면역계 활성화를 피하면서 만성 투여를 가능하게 할 수 있다.
검정 I. SW480/β6 세포를 사용한 잠복 TGFβ1의 활성화
도 3a에 도시된 검정을 위해, 하기 프로토콜을 개발하였다. 이 검정은 인테그린 세포에 의한 세포외 매트릭스 (LTBP 제시된) 활성화에 최적이다.
물질:
● MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)
● SW480/β6 세포 (클론 1E7) (αV 서브유닛은 높은 수준으로 내인성으로 발현되고; β6 서브유닛은 안정하게 과다발현됨)
● 코스타 백색 벽의 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903
● 그라이너 바이오-원 고 결합 백색 μ투명 96 웰 검정 플레이트 #655094
● 인간 피브로넥틴 (코닝(Corning) #354008)
● P200 다중채널 피펫
● 각각에 대해 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200 및 P1000 피펫
● 멸균 미세원심분리기 튜브 및 랙
● 멸균 시약 저장소
● 0.4% 트리판 블루
● 2 mL, 5 mL, 10 mL 및 25 mL 멸균 피펫
● 조직 배양 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트
● 70% 에탄올
● Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크(Life Tech) #31985-070)
● 리포펙타민 3000 (라이프 테크 #L3000015)
● 브라이트-글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가 #E2620)
● 0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA
● 프로TGFb1 발현 플라스미드, 인간 (SR005)
● LTBP1S 발현 플라스미드, 인간 (SR044)
● LTBP3 발현 플라스미드, 인간 (SR117)
● LRRC32 (GARP) 발현 플라스미드, 인간 (SR116)
● LRRC33 발현 플라스미드, 인간 (SR386)
장비:
● 바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기
● TC 후드
● 벤치 탑 원심분리기
● CO2 인큐베이터 37℃ 5% CO2
● 37℃ 물/비드 조
● 플랫폼 진탕기
● 현미경
● 혈구계/카운테스
정의:
● CAGA12 4A4 세포: CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염되어 루시페라제 유전자 발현을 유도하는 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체
● DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기초 배지는 DMEM (깁코(Gibco) Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙토마이신 및 4mM 글루타민을 함유함
● D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)
● SW480/β6 배지: D10 + 1000μg/mL G-418
● CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75 μg/mL 퓨로마이신
절차:
제0일에, 세포를 형질감염을 위해 시딩하였다. SW480/β6 (클론 1E7) 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 5.0e6개 세포/12ml/100mm TC 디쉬로 시딩하였다. CAGA12 세포의 경우, 세포를 T75 플라스크당 1.0백만개의 밀도로 계대배양하여 제3일에 검정을 위해 사용하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
제1일에, 인테그린-발현 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민 3000 시약으로의 형질감염에 대해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 하기를 OptiMEM I 중에 웰당 125μl로 희석하였다: 7.5μg DNA (제시 분자) + 7.5μg DNA (프로TGFβ1), 30μl P3000 및 OptiMEM I로 125μl까지. 웰을 DNA와 함께 피펫팅함으로써 혼합한 다음, OptiMEM을 첨가하였다. P3000을 첨가하고, 모든 것을 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. DNA 믹스에 첨가할 리포펙타민3000의 마스터 믹스를 LTBP1 검정의 경우: 웰당 15μl 리포펙타민3000, OptiMEM I 중 125μl까지; LTBP3 검정의 경우: 웰당 45μl 리포펙타민3000, OptiMEM I 중 125μl까지 제조하였다. 희석된 리포펙타민3000을 DNA에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액을 피펫팅에 의해 수회 혼합한 다음, 디쉬당 250μl의 DNA:리포펙타민3000 (2 x 125μl)을 적가하였다. 각각의 디쉬를 서서히 스월링하여 혼합하고, 디쉬를 조직 배양 인큐베이터로 ~24시간 동안 복귀시켰다.
제1일-제2일에, 검정 플레이트를 인간 피브로넥틴으로 코팅하였다. 구체적으로, 동결건조된 피브로넥틴을 초순수 증류수 (멸균) 중에 1mg/ml로 희석하였다. 1mg/ml 원액을 PBS (멸균) 중에 19.2μg/ml로 희석하였다. 이어서 50μl/웰을 검정 플레이트에 첨가하고 (고 결합), 조직 배양 인큐베이터 (37℃ 및 5% CO2)에서 밤새 인큐베이션하였다. 최종 농도는 3.0μg/cm2이었다.
제2일에, 형질감염된 세포를 검정 및 억제제 첨가를 위해 플레이팅하였다. 먼저, 이미 검정 플레이트 내에 있는 피브로넥틴 용액에 200μl/웰 PBS를 첨가함으로써 피브로넥틴 코팅을 세척하였다. 세척액을 다중채널 피펫으로 수동으로 제거하였다. 세척을 총 2회 세척으로 반복하였다. 플레이트를 세포 첨가 전에 뚜껑을 제거한 채 실온에서 건조되도록 하였다. 이어서, 세포를 트립신으로 탈착시켜 플레이팅하고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, 생존 세포를 ml당 계수하였다. LTBP1 검정을 위해, 세포를 0.10e6개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 5,000개 세포)로 시딩하였다. LTBP3 검정을 위해, 세포를 0.05e6개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 2,500개 세포)로 시딩하였다. 기능적 항체 희석물을 제조하기 위해, 항체를 비히클 중에 일관된 작업 농도로 사전-희석하였다. 스톡 항체를 비히클에 연속 희석하였다 (PBS가 최적이고, 시트르산나트륨 완충제는 피함). 각각의 포인트의 연속 희석물을 항체의 4X 최종 농도로 검정 배지 중에 희석하였다. 웰당 25μl의 4X 항체를 첨가하고, 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 ~24시간 동안 인큐베이션하였다.
제3일에, TGFβ 리포터 세포를 첨가하였다. 검정을 위한 CAGA12 (클론 4A4) 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.4e6개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 20,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다.
제4일에, 검정을 판독하였다 (항체 및/또는 리포터 세포 첨가 16-20시간 후). 판독 전에 브라이트-글로 시약 및 시험 플레이트를 실온이 되도록 하였다. 바이오텍 시너지 H1 상의 판독 세팅을 TMLC_std 프로토콜을 사용하여 설정하였다 - 이 방법은 오토-게인 세팅을 갖는다. 오토스케일 (높음)을 위해 양성 대조군 웰을 선택하였다. 웰당 100μL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 빛으로부터 보호하였다. 플레이트를 바이오텍 시너지 H1 상에서 판독하였다.
일부 실시양태에서, 내인성 제시 분자 (예를 들어, LTBP1/3)와 연관된 TGFβ 활성은 단지 프로TGFβ1만을 형질감염시킴으로써 (즉, LTBP1/3을 공동-형질감염시키지 않고) 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제시 분자 및 프로TGFβ DNA는 본질적으로 상기 기재된 바와 같은 개별 웰/디쉬/플레이트에서 세포를 형질감염시키기 보다는 (즉, "벌크 형질감염"), 검정 웰에 시딩된 SW480/β6 세포 내로 직접 형질감염시킬 수 있다 (즉, "직접 형질감염"). 또한, 직접 형질감염 프로토콜에 대해서는 하기 검정 II를 참조한다. 일부 실시양태에서, SW480/β6 세포는 본질적으로 하기 검정 II에 기재된 바와 같이 피브로넥틴이 없는 검정 웰에 시딩할 수 있다.
결과:
이 검정으로부터 생성된 데이터는 세포 상청액에서의 TGFβ 활성을 반영하였다 (도 3a). 구체적으로, SW480/β6 세포를 LTBP1/3 및 프로TGFβ1로 벌크 형질감염시키고, 상기 기재된 바와 같이 피브로넥틴 상에 시딩하였다. 미가공 데이터 단위는 상대 광 단위 (RLU)였다. 도 3a는 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1의 형질감염이 TGFβ 활성화 신호를 유도하지만, 프로TGFβ1 단독은 그렇지 않다는 것을 입증한다.
검정을 도 4에 제시된 바와 같이 추가로 최적화하였다. 구체적으로, 잠복 TGFβ1 활성화에 대한 제시 분자 및/또는 프로TGFβ1의 상대 기여를 결정하였다. 이 검정에서, SW480/β6 세포를 나타낸 DNA 분자로 벌크 형질감염시키고, 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 피브로넥틴으로 사전-코팅된 검정 웰 상에 시딩하였다. 도 4a에 제시된 바와 같이, 제시 분자 및 프로TGFβ1의 공동-형질감염시 잠복 TGFβ1 활성화의 유의한 증가가 관찰되었다. 도 4b는 제시 분자 및 프로TGFβ1에 대한 플라스미드 DNA의 비를 변화시키는 것에 의한 공동-형질감염의 최적화를 도시한다. 등가량의 각각의 플라스미드가 공동-형질감염에 최적인 것으로 밝혀졌다.
도 5는 피브로넥틴이 LTBP-제시된 잠복 TGFβ1의 인테그린 활성화를 촉진한다는 것을 입증한다. 이 검정에서, SW480/β6 세포를 나타낸 DNA 분자로 벌크 형질감염시키고, 인간 혈장으로부터 정제된 다양한 농도의 피브로넥틴으로 사전-코팅된 검정 웰 상에 시딩하였다. 피브로넥틴은 LTBP1 및 LTBP3에 의해 제시된 잠복 TGFβ의 활성화를 증가시켰다.
검정 II. LN229 세포를 사용한 잠복 TGFβ1의 활성화
도 3b에 도시된 검정을 위해, 하기 프로토콜을 개발하였다. 이 검정 또는 "직접-형질감염" 프로토콜은 인테그린 세포에 의한 세포-표면 제시된 TGFβ1 (GARP 또는 LRRC33 제시자) 활성화에 최적이다. LN229 세포는 인테그린 αVβ8을 발현한다 (αVβ6을 발현하도록 조작된 SW480b6 세포주와 대조적임).
이들 2종의 세포주는 2종의 가장 잘 검증된 TGFβ-활성화 인테그린 중 어느 하나에 의해 활성화된 잠복 TGFβ1에 대한 항체의 시험을 가능하게 한다.
물질:
● MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)
● LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린)
● 코스타 백색 벽의 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903
● 그라이너 바이오-원 고 결합 백색 μ투명 96 웰 검정 플레이트 #655094
● 인간 피브로넥틴 (코닝 #354008)
● P200 다중채널 피펫
● 각각에 대해 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200 및 P1000 피펫
● 멸균 미세원심분리기 튜브 및 랙
● 멸균 시약 저장소
● 0.4% 트리판 블루
● 2 mL, 5 mL, 10 mL 및 25 mL 멸균 피펫
● 조직 배양 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트
● 70% 에탄올
● Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크 #31985-070)
● 리포펙타민 3000 (라이프 테크 #L3000015)
● 브라이트-글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가 #E2620)
● 0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA
● 프로TGFb1 발현 플라스미드, 인간 (SR005)
● LTBP1S 발현 플라스미드, 인간 (SR044)
● LTBP3 발현 플라스미드, 인간 (SR117)
● LRRC32 (GARP) 발현 플라스미드, 인간 (SR116)
● LRRC33 발현 플라스미드, 인간 (SR386)
장비:
● 바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기
● TC 후드
● 벤치 탑 원심분리기
● CO2 인큐베이터 37℃ 5% CO2
● 37℃ 물/비드 조
● 플랫폼 진탕기
● 현미경
● 혈구계/카운테스
정의:
● CAGA12 4A4 세포: CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염되어 루시페라제 유전자 발현을 유도하는 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체
● DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기초 배지는 DMEM (깁코 Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙토마이신 및 4mM 글루타민을 함유함
● D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)
● CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75ug/mL 퓨로마이신
절차:
제0일에, 인테그린 발현 세포를 형질감염을 위해 시딩하였다. 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.1e6개 세포/ml로 희석하고, 검정 플레이트에 웰당 100μl (웰당 10,000개 세포)로 시딩하였다. CAGA12 세포의 경우, 제2일에서의 검정에 사용하기 위해, T75 플라스크당 1.5백만개의 밀도로 계대배양하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
제1일에, 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민 3000 시약으로의 형질감염에 대해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 하기를 OptiMEM I 중에 웰당 5μl로 희석하였다: 0.1μg DNA (제시 분자) + 0.1μg DNA (프로TGFβ1), 0.4μl P3000 및 OptiMEM I로 5μl까지. 웰을 DNA와 함께 피펫팅함으로써 혼합한 다음, OptiMEM을 첨가하였다. P3000을 첨가하고, 모든 것을 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. DNA 믹스에 첨가할 리포펙타민3000을 사용하여 다음 마스터 믹스를 제조하였다: 웰당 0.2μl 리포펙타민3000, OptiMEM I 중 5μl까지. 희석된 리포펙타민3000을 DNA에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 용액을 피펫팅에 의해 수회 혼합한 다음, 웰당 10μl의 DNA:리포펙타민3000 (2 x 5μl)을 첨가하였다. 세포 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 ~24시간 동안 복귀시켰다.
제2일에, 항체 및 TGFβ 리포터 세포를 첨가하였다. 기능적 항체 희석물을 제조하기 위해, 비히클 (PBS가 최적임) 중 스톡 항체를 연속 희석하였다. 이어서, 각각의 포인트를 항체의 2X 최종 농도로 검정 배지 중에 희석하였다. 항체를 제조한 후, 세포 플레이트를 흡인 (진공 흡인기)에 의해 검정 배지로 2회 세척하고, 이어서 웰당 100μl 검정 배지를 첨가하였다. 2차 세척 후에, 검정 배지를 웰당 50μl의 2X 항체로 대체하였다. 세포 플레이트를 ~15-20분 동안 인큐베이터로 복귀시켰다.
검정을 위한 CAGA12 (클론 4A4) 세포를 제조하기 위해, 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.3e6개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 15,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다.
제3일에, 항체 및/또는 리포터 세포 첨가 약 16-20시간 후에 검정을 판독하였다. 판독 전에 브라이트-글로 시약 및 시험 플레이트를 실온이 되도록 하였다. 바이오텍 시너지 H1 상의 판독 세팅은 TMLC_std 프로토콜을 사용하도록 설정하였다 - 이 방법은 오토-게인 세팅을 갖는다. 오토스케일 (높음)을 위해 양성 대조군 웰을 설정하였다. 웰당 100μL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 빛으로부터 보호하였다. 플레이트를 바이오텍 시너지 H1 상에서 판독하였다.
일부 실시양태에서, 내인성 제시 분자 (예를 들어, LTBP1/3)와 연관된 TGFβ 활성은 단지 프로TGFβ1만을 형질감염시킴으로써 (즉, LTBP1/3을 공동-형질감염시키지 않고) 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제시 분자 및 프로TGFβ DNA는 세포를 직접 형질감염시키는 것 (즉, "직접 형질감염")보다는, 본질적으로 상기 검정 I에 기재된 바와 같이 별개의 웰/디쉬/플레이트에서 LN229 세포 내로 벌크 형질감염시킬 수 있다 (즉, "벌크 형질감염"). 일부 실시양태에서, LN229 세포는 피브로넥틴과 함께 검정 웰에 시딩할 수 있다 (피브로넥틴 사전-코팅 프로토콜에 대해서는 검정 I 참조).
이 검정으로부터 생성된 데이터는 세포 상청액에서의 TGFβ1 활성을 반영한다 (도 3b). 구체적으로, LN229 세포를 피브로넥틴이 없는 검정 웰에 시딩하고, "직접 형질감염"에 의해 나타낸 DNA 분자로 형질감염시켰다. 미가공 데이터 단위는 상대 광 단위 (RLU)이다. 높은 RLU 값을 갖는 샘플은 높은 양의 유리 TGFβ를 함유하였고, 낮은 RLU 값을 갖는 샘플은 낮은 수준의 TGFβ를 함유하였다.
실시예 3. SR-AB1은 인테그린에 의한 TGFβ LLC 활성화의 콘텍스트-비의존성 억제제이다.
도 6은 SR-AB1이 인테그린에 의한 TGFβ1 대형 잠복 복합체 (LLC)의 콘텍스트-비의존성 억제제라는 것을 입증하는 그래프이다. 이 검정에서, SW480/β6 세포를 피브로넥틴이 없는 검정 웰에 시딩하고, 본질적으로 상기 실시예 2에서의 프로토콜에 기재된 바와 같이, 각각 GARP-프로TGFβ1 또는 LRRC33-프로TGFβ1로 직접 형질감염시켰다. LTBP1에 의한 TGFβ1의 활성화를 평가하기 위해, LN229 세포를 피브로넥틴으로 사전-코팅된 검정 웰에 시딩하고, 본질적으로 상기 실시예 2에서의 프로토콜에 기재된 바와 같이 LTBP1-프로TGFβ1로 직접 형질감염시켰다. SR-AB1은 제시 분자에 비의존성으로 TGFβ의 인테그린 활성화를 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 4. SR-AB2는 LTBP-프로TGFβ1의 복합체-특이적 억제제이다.
SR-AB2를 상이한 TGFβ 제시 분자에의 결합에 대한 특이성에 관해 추가로 분석 및 시험하기 위해 선택하였다. 먼저, ELISA 검정을 수행하여 하기와 같이 복합체-특이성을 시험하였다.
물질:
● 96-웰 플레이트의 뉴트라비딘 코팅 SOP로부터의 고체 백색 96-웰 플레이트
● 비오티닐화 항원
● 메인 바이오테크놀로지 서비시즈(Maine Biotechnology Services) 항-His 항체 MAB230P
● 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 퍼옥시다제 아피니퓨어 염소 α-인간 FCγ 단편 특이적 카탈로그 번호 109-035-008.
● 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈 아피니퓨어 염소 α-마우스 FCγ 단편 특이적 카탈로그 번호 115-035-008
● 퀀타블루 ELISA 기질 (피어스 바이오테크(Pierce Biotech) 카탈로그 번호 15162)
장비:
● 다중-채널 피펫
● P200 팁
● 테이블탑 초원심분리기
● 1.5 mL 원심분리 튜브
● 0.5 mL 원심분리 튜브
● P1000
● P1000 팁
● P200
● P10
● P10 팁
● 15 mL 팔콘 튜브
● 50 mL 팔콘 튜브
● 바이오텍 ELx 405 셀렉트 CW 플레이트 세척기
● 멀티드롭
● 바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기
정의:
● 세척 완충제: 0.05% 트윈-20을 함유하는 TBS (트리스-완충 염수; 50 mM 트리스-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.6). BSA는 점착성이고 자동화 플레이트 세척기 시스템과 함께 사용되지 않아야 하기 때문에 수동 (손) 세척을 위해 0.1% BSA를 첨가한다.
● 샘플 완충제: 0.05% 트윈-20 및 0.1% BSA를 함유하는 TBS (트리스-완충 염수; 50 mM 트리스-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.6).
● ELISA 3X 프로토콜: 바이오텍 ELx 405 셀렉트 CW 플레이트 세척기 상에서의 세척 프로토콜. 200μL의 세척 완충제로 세척한다. 세척을 추가로 2회 반복한다. 설명: 3 주기. 진탕하지 않는다. 웰당 200μL를 분배한다. 분배 유량 세팅 7 (범위 1 - 10). 분배 높이 15.24 mm. 수평 x 분배 위치 0mm. 수평 y 분배 위치 0 mm. 흡인 높이 3.048 mm. 수평 x 흡인 위치 1.372 mm. 수평 흡인 y 위치 0.452 mm. 흡인 속도 3.4 mm/초. 흡인 지연 0 밀리초. 최종 세척시 크로스와이어 흡인. 크로스와이어 높이 3.048 mm. 크로스와이어 수평 x 위치: -1.829 mm. 크로스와이어 수평 y 위치: -0.457 mm.
절차:
사전-코팅되고 사전-차단된 96-웰 플레이트를 4℃로부터 제거한다. 0.1% 트윈-20을 함유하는 1xPBS pH 7.4 1%BSA를 플레이트로부터 폐기하고, 종이 타월로 라이닝된 스티로폼 패드 상에서 플레이트를 강력하게 친다. 96-웰 플레이트가 아직 제조되지 않은 경우에, 96-웰 플레이트의 뉴트라비딘 코팅 프로토콜로 1개를 제조한다. 구체적으로, 1개의 뉴트라비딘 코팅된 플레이트에 대해, 1 mg/mL 뉴트라비딘 원액의 상단으로부터 5μL를 제거하고, 이를 10 mL의 1x 카르보네이트 완충제 pH 9.4 중에 희석한다. 팔콘 튜브를 뒤집어 혼합한다. 다중-채널 피펫을 사용하여, 100 μL를 코닝 고 결합 96-웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 넣고, 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 96-웰 플레이트를 웰당 200 μL의 세척 완충제로 세척하고, 이 단계를 추가로 2회 반복한다. 플레이트를 총 3회 세척해야 한다. 플레이트를 웰당 200 μL의 PBS pH 7.4 중 1% BSA로 차단하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션한다.
비오티닐화 항원을 샘플 완충제 중에 희석한다. 먼저 최적 포획 농도를 각각의 개별 단백질에 대한 적정에 의해 결정하여야 한다. 웰당 50 μl를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
플레이트를 세척 완충제가 구비된 플레이트 세척기를 사용하여 ELISA 3X 프로토콜을 사용하여 세척한다.
항체를 샘플 완충제 중에 희석한다. 항체의 스크리닝을 1 μg/mL에서 수행한다. α-His 코팅 대조군 항체 (메인 바이오테크놀로지 서비시즈 카탈로그 번호: MAB230P)를 샘플 완충제 중에 1μg/mL로 제조한다. 50 μL의 희석된 항체를 지정된 웰 상에 놓고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
플레이트를 세척 완충제가 구비된 플레이트 세척기를 사용하여 ELISA 3X 프로토콜을 사용하여 세척한다.
인간 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈 퍼옥시다제 아피니퓨어 염소 α-인간 FCγ 단편 특이적 카탈로그 번호 109-035-008)를 샘플 완충제 중에 1:10,000으로 희석한다. α-his 웰의 경우, 마우스 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈 아피니퓨어 염소 α-마우스 FCγ 단편 특이적 카탈로그 번호 115-035-008)를 샘플 완충제 중에 1:10,000으로 희석한다.
50μL의 희석된 항체를 지정된 웰 상에 놓는다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척 완충제가 구비된 플레이트 세척기를 사용하여 ELISA 3X 프로토콜을 사용하여 세척한다.
슈퍼시그널 ELISA 펨토 기질 (피어스 바이오테크 카탈로그 번호 15162) 작업 용액을 제조업체의 프로토콜에 따라 제조한다. 1개의 플레이트에 대해 10 mL이 필요할 것이다. 웰당 100 μL 퀀트블루 기질 작업 용액을 놓는다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
325nm의 여기 및 420nm의 방출로 플레이트 판독기 상에서 상대 형광 단위 (RFU)를 측정한다.
결과:
도 7a는 ELISA에 의해 SR-AB2가 LTBP-프로TGFβ1 복합체에만 결합하고; 프로TGFβ1 또는 LTBP1 단독에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다. 도 7a는 ELISA에 의해 SR-AB2가 GARP-프로TGFβ1에 결합하지 않는다는 것을 입증한다.
추가적으로, 세포-기반 검정에서 LTBP1/3-프로TGFβ1을 억제하는 SR-AB2의 능력을 또한 수행하였다. 본질적으로 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, LN229 세포를 피브로넥틴 사전-코팅된 검정 웰 상에 시딩하고, 나타낸 DNA 분자로 직접 형질감염시켰다. 도 7b는 SR-AB2가 LTBP1-프로TGFβ1 (인간 및 마우스 복합체)의 인테그린 활성화를 억제한다는 것을 도시한다. 도 7c는 SR-AB2가 LTBP3-프로TGFβ1의 인테그린 활성화를 억제한다는 것을 도시한다.
SR-AB2는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 프로TGFβ1:LTBP1 & 3 복합체에 특이적으로 결합하고, GARP-TGFβ1 또는 GARP-Lap 복합체에는 결합하지 않는 것으로 입증되었다 (도 9 참조).
상기 논의된 바와 같이, LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스에 침착되는 반면, GARP/LRRC32 및 LRRC33은 면역 세포의 표면 상에 잠복 TGFβ1을 제시한다. SR-AB2는 LTBP-프로TGFβ1 신호전달을 억제하지만, GARP-프로TGFβ1에는 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었다 (도 10a 및 도 10b). 도 10a는 SR-AB2가 내인성 LTBP1/3에 의해 제시된 LTBP-프로TGFβ를 억제한다는 것을 입증한다. 이 검정을 LN229 세포에서 수행하였으며, 세포를 피브로넥틴 사전-코팅된 웰 상에 시딩하고, 프로TGFβ1로 직접 형질감염시켰다. 도 10b는 SR-AB2가 GARP-프로TGFβ를 억제하지 않는다는 것을 입증한다. SR-AB1은 제시 분자에 비의존성으로 잠복 TGFβ1에 결합한다. 이 검정을 LN229 세포에서 수행하였으며, 세포를 피브로넥틴이 없는 검정 웰에 시딩하고, GARP-프로TGFβ1로 직접 형질감염시켰다.
SR-AB2에 의한 LTBP-프로TGFβ1의 억제는 또한 세포-기반 검정에서 LTBP1-제시된 TGFβ1의 αVβ6 인테그린-의존성 활성화에서 나타났다 (인간 및 마우스, 데이터는 제시되지 않음). SR-AB2는 과다발현된 LRRC33-프로TGFβ1에 대해 억제 효과를 나타내지 않았다.
실시예 5: LTBP1-프로TGFβ1 항체의 옥텟 비닝
500 nM의 인간 LTBP1-프로TGFb1 복합체를 1 μM의 각각의 시험 항체와 함께 사전-인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, LTBP1-프로TGFβ1+제1 항체를 67 nM로 항-인간 IgG Fc 포획 (AHC) 센서 팁에 고정화된 제2 항체에의 결합에 대해 시험하였다. 센서 팁을 음성 대조군 항체 (HuNeg)로 차단한 후, LTBP1-프로TGFβ1+제1 항체를 관찰하였다.
특이적 제2 항체에 대한 복합체의 결합을 비억제된 상호작용, 즉 TGFβ 복합체에 결합하지 않는 음성 대조군 항체 (HuNeg)의 존재 하의 복합체에 대해 정규화하였다. 비억제된 상호작용의 70% 미만 또는 0.7 미만의 정규화된 반응을 교차 차단하는 항체로 간주하였다. 1 초과의 반응은 두 항체가 동시에 결합되었다는 것을 나타냈다. 결과가 하기 표 7에 제시된다.
표 7:
Figure pct00039
표 7에 제시된 바와 같이, 항체 SR-AB13, SR-AB10, SR-AB2 및 SR-AB1은 서로 교차 차단하지 않고, 따라서 각각의 항체는 인간 LTBP1-프로TGFβ1의 표면 상의 별개의 에피토프를 점유한다.
실시예 6: 시험관내 결합 프로파일 및 친화도 데이터
결합 동역학의 파라미터를 결정하기 위한 시험관내 결합 검정에 적합한 방법은 생물층 간섭측정법 (BLI)-기반 검정, 예컨대 옥텟 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 검정, 예컨대 비아코어 시스템을 포함한다 (예를 들어, http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Biacore_assay_handbook.pdf 참조).
SR-AB10, SR-AB2 및 SR-AB13의 친화도를 옥텟 검정에 의해 측정하였다. 본원에 제공된 복합체에 대한 항체의 친화도를 측정하는데 사용된 프로토콜이 하기에 요약되어 있다.
물질:
● 96 웰 흑색 폴리프로필렌 플레이트
● AHC 옥텟 팁 (항-인간 IgG Fc 포획 팁) (포르테바이오)
● 10x 동역학 완충제 (포르테바이오) (PBS 중에 1x로 희석됨)
● 그라이너 바이오-원 96-웰 절반 면적 마이크로플레이트 (VWR cat# 82050-044)
절차:
주: 옥텟 실험 동안 각각의 웰 내의 부피는 100 uL이다.
1000 rpm의 진탕 속도를 모든 검정 단계에 사용한다.
팁 사전-습윤:
● 바이오센서는 실험을 시작하기 전에 적어도 10분 동안 1x 동역학 완충제 (1x KB) 중에서 사전-습윤되어야 한다. 이는 옥텟 내부에서 또는 벤치 상에서 수행될 수 있다.
로딩:
● 로딩 전에 1분 동안 1x KB 중에서 팁을 기준선화한다.
● AHC 팁에 항체를 1 μg/mL (~7 nM)의 농도로 3분 동안 로딩한다. 임의의 한 센서가 1 나노미터의 반응에 도달할 때 로딩이 정지되도록 한계를 설정한다.
● 로딩 후 1분 동안 완충제 중에서 팁을 기준선화한다. 항체는 이 시간 동안 팁으로부터 해리되지 않아야 한다.
항원 회합:
● 다양한 제시 분자와 복합체화된 TGFβ1을 1x KB 중 100 nM의 단일 농도로 고정화된 항체에 회합시켰다.
항체 해리:
● 1x KB 중에서의 해리를 3분 동안 수행하였다.
포르테바이오 데이터 분석 소프트웨어 8.2를 사용한 데이터 분석:
● 프로세싱: Y 축을 기준선의 마지막 5초에 정렬하고, 해리에 대해 정렬하면서 단계간 보정을 수행하고, 사비츠키-골레이 여과를 수행한다.
● 분석: 1:1 피팅 모델을 이용한다. 피팅은 국부적이고 완전하다 (국부는 각각의 항체가 개별적으로 평가된다는 것을 나타내고, 완전은 회합 및 해리 둘 다가 고려된다는 것을 나타냄). 곡선을 피팅한 다음, 보고를 저장하고/데이터를 내보낸다.
결과:
도 11은 LTBP 복합체-특이적 항체 SR-AB10, SR-AB2 및 SR-AB13에 대한 결합 프로파일 및 친화도 데이터를 제시한다. 특히, SR-AB13은 프로TGFβ1과 복합체화된 인간 LTBP1 및 인간 LTBP3 둘 다에 결합하는 반면, SR-AB2 및 SR-AB10은 TGFβ1과 복합체화된 인간 LTBP1에 특이적이다.
실시예 7: 최적화된 LTBP-복합체-특이적 항체의 개선된 효력
LTBP 복합체-특이적 항체 SR-AB10 및 SR-AB13을 초기 라운드의 친화도 성숙/최적화 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 H1/H2 CDR 셔플링/다양화)를 위해 선택하고, 특정한 자손 항체 (SR-AB14 및 SR-AB15)를 LN229 세포를 사용하여 TGFβ 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 도 12a 및 12b에 도시된 검정을 위해, 실시예 2에서의 검정 II의 변형된 버전인 하기 프로토콜을 사용하였다.
물질:
● MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)
● LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린)
● 코스타 백색 벽의 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903
● 그라이너 바이오-원 고 결합 백색 μ투명 96 웰 검정 플레이트 #655094
● 인간 피브로넥틴 (코닝 #354008)
● P200 다중채널 피펫
● 각각에 대해 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200 및 P1000 피펫
● 멸균 미세원심분리기 튜브 및 랙
● 멸균 시약 저장소
● 0.4% 트리판 블루
● 2 mL, 5 mL, 10 mL 및 25 mL 멸균 피펫
● 조직 배양 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트
● 70% 에탄올
● Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크 #31985-070)
● 리포펙타민 3000 (라이프 테크 #L3000015)
● 브라이트-글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가 #E2620)
● 0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA
● 프로TGFb1 발현 플라스미드, 인간
● LTBP1S 발현 플라스미드, 인간
장비:
● 퍼킨엘머(PerkinElmer) 엔비전 플레이트 판독기
● TC 후드
● 벤치 탑 원심분리기
● CO2 인큐베이터 37℃ 5% CO2
● 37℃ 물/비드 조
● 플랫폼 진탕기
● 현미경
● 혈구계/카운테스
정의:
● CAGA12 4A4 세포: CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염되어 루시페라제 유전자 발현을 유도하는 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체
● DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기초 배지는 DMEM (깁코 Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙토마이신 및 4mM 글루타민을 함유함
● D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)
● CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75ug/mL 퓨로마이신
절차:
● 항상 멸균 생물안전 캐비닛에서 작업하고, 항상 멸균 기술을 사용하여야 한다.
● 모든 배지를 제조하고, 모든 물질을 멸균하고, 시작 전에 물질을 생물안전 캐비닛 내로 이동시킨다.
● 성장 배지를 37℃로 가온하여야 한다.
● 이 검정 동안 거의 모든 단계에 대해 역 피펫팅 기술을 사용한다.
● 프로TGFβ1의 LTBP 제시에 의존하는 검정은 형질감염을 위한 세포를 시딩하기 전 4시간 동안 내지는 밤새 검정 플레이트를 피브로넥틴으로 사전-코팅하는 것을 요구한다.
제-1일에, 검정 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅하였다. 1mg/ml 피브로넥틴 원액을 초순수 (멸균) 중에서 제조하였다. 원액을 PBS 중에 19.2μg/ml 작업 용액으로 희석하고, 50 μl를 각각의 웰에 첨가하였다 (3 μg/cm2). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
제0일에, 세포 시딩 전, 검정 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅하였다 (LTBP 과다발현 검정만). 1mg/ml 피브로넥틴 원액을 초순수 (멸균) 중에서 제조하였다. 원액을 PBS 중에 19.2μg/ml 작업 용액으로 희석하고, 50 μl를 각각의 웰에 첨가하였다 (3 μg/cm2). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 코팅 후, 검정 플레이트를 200 μl/웰 PBS의 2회 세척을 위해 다중채널 피펫으로 수동으로 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 후드에서 뚜껑을 제거한 채 건조되도록 하였다. 이어서 LN229 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 동안 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.125e6개 세포/ml로 희석하고, 검정 플레이트에 웰당 100μl (웰당 12,500개 세포)로 시딩하였다. 제2일에 검정에 사용될 CAGA12 세포의 경우, 세포를 T75 플라스크당 1.5백만개의 밀도로 계대배양하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
제1일에, LN229 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민 3000 시약으로의 형질감염에 대해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 하기를 OptiMEM I 중에 웰당 5μl로 희석하였다: 0.1μg DNA (프로TGFβ1), 임의로 0.1μg LTBP1 DNA, 0.4μl P3000 및 OptiMEM I로 5μl까지. 도 12a의 경우, 0.1μg 프로TGFβ1 (인간) DNA를 단독으로 LTBP DNA 없이 형질감염시켜 내인성 제시 분자의 존재 하의 활성화를 측정하였다. 도 12b의 경우, 0.1μg LTBP1 (인간) DNA를 프로TGFβ1 (인간) DNA와 공동-형질감염시켜 과다발현된 LTBP1의 존재 하의 활성화를 측정하였다.
웰당 0.2μl 리포펙타민3000을 OptiMEM I 중에, OptiMEM I 중 5μl까지 희석함으로써 리포펙타민3000의 마스터 믹스를 제조하였다. 희석된 리포펙타민3000을 DNA 혼합물에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10μl의 DNA:리포펙타민3000 (2 x 5μl) 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 ~24시간 동안 조직 배양 인큐베이터로 복귀시켰다.
제2일에, 나타낸 항체 및 TGFβ 리포터 세포 (CAGA12)를 웰에 첨가하였다. 항체를 PBS 중에 연속 희석한 다음, 2x 최종 농도까지 검정 배지로 추가로 희석하였다. 플레이트를 흡인 (진공 흡인기)에 의해 검정 배지로 2회 세척하고, 이어서 웰당 100μl의 검정 배지를 첨가하였다. 제2 세척 후에, 검정 배지를 웰당 50 μl의 2X 항체로 대체하였다. 세포 플레이트를 ~15-20분 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. CAGA12 (클론 4A4) 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, 생존 세포를 계수하였다. 생존 세포를 0.3e6개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 15,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다.
제3일에, 항체 및/또는 리포터 세포 첨가 약 16-20시간 후에 검정을 판독하였다. 판독 전에 브라이트-글로 시약 및 시험 플레이트를 실온이 되도록 하였다. 바이오텍 시너지 H1 상의 판독 세팅은 TMLC_std 프로토콜을 사용하도록 설정하였다 - 이 방법은 오토-게인 세팅을 갖는다. 오토스케일 (높음)을 위해 양성 대조군 웰을 설정하였다. 웰당 100μL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 빛으로부터 보호하였다. 이어서 플레이트 판독기 상에서 발광을 검출하였다.
결과:
이 검정으로부터 생성된 데이터는 세포 상청액에서의 TGFβ 활성을 반영하였다. 도 12a는 TGFβ 활성에 의해 측정시 SR-AB14 (최적화된 SR-AB10)의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다. 특히, SR-AB14 활성은 콘텍스트-비의존성 항체 SR-AB1과 유사하다. 이 검정은 LTBP1 과다발현 없이 수행하였으며, 따라서 내인성 제시 분자의 존재 하의 TGFβ의 활성화를 측정한다. 도 12b는 TGFβ 활성에 의해 측정시 SR-AB15 (최적화된 SR-AB13)의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다. 이 검정은 과다발현된 인간 LTBP1-프로 TGFβ1의 존재 하에 수행하였다. 특히, SR-AB14 활성은 콘텍스트-비의존성 항체 SR-AB1과 유사하다.
도 12a 및 12b에 도시된 검정은 둘 다 낮은 LTBP1 mRNA, 높은 LTBP3 mRNA, 검출불가능한 GARP 및 검출불가능한 LRRC33을 발현하는 LN229 세포에서 수행하였다.
실시예 8: CDR-H3 돌연변이유발 후 최적화된 LTBP-프로TGFβ1-특이적 항체의 개선된 친화도
제1 라운드의 친화도 성숙/최적화로부터의 LTBP 복합체-특이적 항체 (SR-AB14, SR-AB16, SR-AB17, SR-AB18, SR-AB19)를 제2 라운드의 친화도 성숙/최적화 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 CDR-H3 돌연변이유발)를 위해 선택하고, 특정한 자손 항체 (SR-AB20, SR-AB21, SR-AB22, SR-AB23, SR-AB24, SR-AB25, SR-AB26, SR-AB27, SR-AB28 및 SR-AB29)를 다양한 프로TGFβ1 구축물에 결합하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 최적화된 항체의 결합 친화도를 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 인간 LTBP1-프로TGFβ1, 인간 LTBP3-프로TGFb1, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1, 마우스 LTBP3-프로TGFb1 및 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대해 옥텟에 의해 측정하였다. 간략하게, 시험 항체를 항-인간 Fc 포획 바이오센서 (AHC) (포르테바이오®)의 표면에 고정화시킨 다음, 100nM의 단일 농도의 다양한 TGFβ1 복합체에 대해 결합을 시험하여 결합 친화도를 평가하였다. 항원을 3분 동안 회합되도록 하고, 이어서 5분 해리시켰다. 동역학 완충제 (포르테바이오®)를 실험 전반에 걸쳐 사용하였고, KD를 각각의 항체 항원 쌍에 대한 1:1 피팅 모델을 사용하여 결정하였다.
표 8은 옥텟에 의해 결정된, 나타낸 LTBP 복합체-특이적 항체 (IgG1-agly)에 대한 결합 프로파일 및 친화도 데이터를 제시한다. 특히, 최적화된 항체 SR-AB20, SR-AB21, SR-AB22, SR-AB23, SR-AB24, SR-AB25, SR-AB26, SR-AB27, SR-AB28 및 SR-AB29는 프로TGFβ1과 복합체화된 인간 LTBP1 및 인간 LTBP3 둘 다에 대해 한 자릿수 nM 친화도를 나타낸다. 추가적으로, 항체 중 어떠한 것도 프로TGFβ1과 복합체화된 인간 GARP에는 결합하지 않았으며, 이는 항체가 LTBP 복합체에 특이적이라는 것을 나타낸다.
표 8:
Figure pct00040
P.F. = 불량한 피트
N.B. = 이 검정의 조건 하의 비-결합제
실시예 9: 경쇄 최적화 제3주기 후 최적화된 LTBP-복합체-특이적 항체의 개선된 친화도
제2 라운드의 친화도 성숙/최적화로부터의 LTBP 복합체-특이적 항체를 제3 라운드의 친화도 성숙/최적화 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 최적화)를 위해 선택하고, 특정한 자손 항체를 다양한 프로TGFβ1 구축물에 결합하는 그의 능력에 대해 평가하였다.
제3주기 항체는 경쇄 CDR3 전반에 걸쳐 돌연변이유발을 수행하고 경쇄 CDR1 및 CDR2에 대해 미리 제조된 서열의 셔플을 수행함으로써 생성하였다. 관심 항체를 양성 및 음성 선택 둘 다를 이용하는 효모 디스플레이를 통해 확인하고, 이어서 서열분석하였다.
최적화된 항체의 결합 친화도를 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 인간 LTBP1-프로TGFβ1, 인간 LTBP3-프로TGFβ1, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1, 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 및 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대해 옥텟에 의해 측정하였다. 간략하게, 시험 항체를 항-인간 Fc 포획 바이오센서 (AHC) (포르테바이오®)의 표면에 고정화시킨 다음, 100nM의 단일 농도의 다양한 TGFβ1 복합체에 대해 결합을 시험하여 결합 친화도를 평가하였다. 항원을 3분 동안 회합되도록 하고, 이어서 5분 해리시켰다. 동역학 완충제 (포르테바이오®)를 실험 전반에 걸쳐 사용하였고, KD를 각각의 항체 항원 쌍에 대한 1:1 피팅 모델을 사용하여 결정하였다.
표 9는 옥텟에 의해 결정된, 경쇄 최적화 제3주기로부터 확인된 나타낸 LTBP 복합체-특이적 항체 (IgG1-agly)에 대한 결합 프로파일 및 친화도 데이터를 제시한다. 특히, 여러 최적화된 항체는 인간 LTBP1 및 인간 LTBP3 복합체화된 프로TGFβ1 둘 다에 대해 한 자릿수 nM 친화도를 나타낸다. 추가적으로, 표 10에 제시된 바와 같이, 여러 항체는 동일한 검정 조건 하에 프로TGFβ1과 복합체화된 인간 GARP에는 결합하지 않았으며, 이는 항체가 LTBP 복합체에 특이적이라는 것을 나타낸다.
표 9: 제3주기 최적화된 항체에 대한 결합 프로파일 및 친화도 데이터 (N.B. = 이 검정의 조건 하의 비-결합제)
Figure pct00041
표 10:
Figure pct00042
N.B. = 이 검정의 조건 하의 비-결합제
도 15는 친화도 성숙 항체가 LTBP-프로TGFβ1 복합체에 대한 특이적 결합을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 실험은 200, 100, 50 및 25 nM 인간 GARP 프로TGFb1 및 인간 LTBP1 프로TGFb1에서 수행하였다. 도 15는 200 nM 값을 제시하며, 여기서 0.1nm 컷오프를 사용하여 의미있는 결합인 것과 아닌 것을 결정한다. 도 15에 제시된 바와 같이, 일부 항체의 경우, GARP-프로TGFβ1에 대한 결합은 매우 높은 농도 (200nM)에서만 의미있고, 일부 항체는 심지어 그 높은 농도에서도 GARP-프로TGFβ1에 대한 결합을 나타내지 않는다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 검정
비아코어 8K 시스템을 사용하여 시험 항체의 항원 결합에 대한 1가 결합 친화도 및 동역학 파라미터를 결정하였다. 항원 복합체에 대한 Fab 단편 SR-AB42-HuFab, SR-AB63-HuFab 및 SR-AB43-HuFab의 회합 및 해리 동역학을 측정하였으며, 생성된 ka, kd 및 KD가 하기에 제공된다. 간략하게, 결합 동역학을 비아코어 8K (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 비오티닐화 포획 항원을 칩에 고정화시켰다 (10nM, ~200 RU 로딩). 비오틴 포획 센서 칩을 사용하여 비오티닐화 항원을 포획하였다. 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.6nM 농도의 Fab를 포획된 항원 상에 주사하였다. 0 nM을 참조로서 사용하였다. GARP 및 LRRC33에 대한 LTBP 항체의 친화도는 더 높은 농도의 Fab (100, 50, 25, 12.5, 6.25 nM)를 사용하여 확인하였다. 0 nM을 참조로서 사용하였다. 다중-주기 동역학을 사용하였으며, 여기서 각각의 농도의 분석물을 개별 주기로 주사하고, 센서 칩 표면을 각각의 주기 후에 재생시켰다. 모든 검정은 새로 제조된 1x HBS-EP+ 완충제 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 트윈20, pH 7.4) 중에서 수행하였다. 데이터를 1:1 결합 모델에 전반적으로 피팅하여 동역학 파라미터를 수득하였다. 0 nM 농도의 분석물에 대한 센소그램을 참조로서 사용하였다.
결과가 하기 표 11-15에 제시되어 있다. 도 23 및 도 24는 각각 SR-AB63 및 SR-AB42 인간 Fab가 huLTBP1 프로TGFβ1 및 huLTBP3 프로TGFβ1에 대한 신규 항체의 콘텍스트-선택적 결합을 나타낸다는 것을 보여준다.
표 11
Figure pct00043
*5회 반복 실험의 평균
**4회 반복 실험의 평균
표 12
Figure pct00044
표 13
Figure pct00045
표 14
Figure pct00046
표 15
Figure pct00047
*2회 반복 실험의 평균
실시예 10: CDR-H3 돌연변이유발 후 최적화된 LTBP 복합체-특이적 항체의 개선된 효력
제1 라운드의 친화도 성숙/최적화로부터의 LTBP 복합체-특이적 항체 (즉, SR-AB14, SR-AB16, SR-AB17, SR-AB18, SR-AB19)를 제2 라운드의 친화도 성숙/최적화 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 CDR-H3 돌연변이유발)를 위해 선택하고, 특정한 자손 항체 (SR-AB20, SR-AB21, SR-AB22, SR-AB23, SR-AB24, SR-AB25, SR-AB26, SR-AB27, SR-AB28 및 SR-AB29)를 LN229 세포를 사용하여 TGFβ 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 도 13a, 13b, 14a 및 14b에 도시된 검정을 위해, 실시예 2에서의 검정 II의 변형된 버전인 하기 프로토콜을 사용하였다.
물질:
● MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)
● LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린)
● 코스타 백색 벽의 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903
● 그라이너 바이오-원 고 결합 백색 u투명 96 웰 검정 플레이트 #655094
● 인간 피브로넥틴 (코닝 #354008)
● P200 다중채널 피펫
● 각각에 대해 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200 및 P1000 피펫
● 멸균 미세원심분리기 튜브 및 랙
● 멸균 시약 저장소
● 0.4% 트리판 블루
● 2 mL, 5 mL, 10 mL 및 25 mL 멸균 피펫
● 조직 배양 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트
● 70% 에탄올
● Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크 #31985-070)
● 리포펙타민 3000 (라이프 테크 #L3000015)
● 브라이트-글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가 #E2620)
● 0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA
● 프로TGFb1 발현 플라스미드, 인간
● 프로TGFb1 발현 플라스미드, 마우스
● LTBP1S 발현 플라스미드, 마우스
장비:
● 퍼킨엘머 엔비전 플레이트 판독기
● TC 후드
● 벤치 탑 원심분리기
● CO2 인큐베이터 37℃ 5% CO2
● 37℃ 물/비드 조
● 플랫폼 진탕기
● 현미경
● 혈구계/카운테스
정의:
● CAGA12 4A4 세포: CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염되어 루시페라제 유전자 발현을 유도하는 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체
● DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기초 배지는 DMEM (깁코 Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙토마이신 및 4mM 글루타민을 함유함
● D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)
● CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75ug/mL 퓨로마이신
절차:
● 항상 멸균 생물안전 캐비닛에서 작업하고, 항상 멸균 기술을 사용하여야 한다.
● 모든 배지를 제조하고, 모든 물질을 멸균하고, 시작 전에 물질을 생물안전 캐비닛 내로 이동시킨다.
● 성장 배지를 37℃로 가온하여야 한다.
● 이 검정 동안 거의 모든 단계에 대해 역 피펫팅 기술을 사용한다.
제0일에, 세포 시딩 전, 검정 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅하였다 (LTBP 과다발현 검정만). 1mg/ml 피브로넥틴 원액을 초순수 (멸균) 중에서 제조하였다. 원액을 PBS 중에 19.2ug/ml 작업 용액으로 희석하고, 50μl를 각각의 웰에 첨가하였다 (3 ug/cm2). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 코팅 후, 검정 플레이트를 200 ul/웰 PBS의 2회 세척을 위해 다중채널 피펫으로 수동으로 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 후드에서 뚜껑을 제거한 채 건조되도록 하였다. 이어서 LN229 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 동안 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.125e6개 세포/ml로 희석하고, 검정 플레이트에 웰당 100μl (웰당 12,500개 세포)로 시딩하였다. 제2일에 검정에 사용될 CAGA12 세포의 경우, 세포를 T75 플라스크당 1.5백만개의 밀도로 계대배양하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
제1일에, LN229 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민 3000 시약으로의 형질감염에 대해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 하기를 OptiMEM I 중에 웰당 5μl로 희석하였다: 0.1μg 제시 분자 DNA와 조합된 0.1μg 프로TGFβ1 DNA, 및 0.4μl P3000, OptiMEM I로 5μl까지. 도 13a 및 도 14a의 경우, 0.1μg 인간 프로TGFβ1 DNA를 LTBP DNA 없이 0.1ug 공벡터로 형질감염시켜 내인성 제시 분자의 존재 하의 활성화를 측정하였다. 도 13b 및 도 14b의 경우, 0.1μg 마우스 LTBP1 DNA를 마우스 프로TGFβ1 DNA와 공동-형질감염시켜 과다발현된 LTBP1의 존재 하의 활성화를 측정하였다.
웰당 0.2μl 리포펙타민3000을 OptiMEM I 중에, OptiMEM I 중 5μl까지 희석함으로써 리포펙타민3000의 마스터 믹스를 제조하였다. 희석된 리포펙타민3000을 DNA 혼합물에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10μl의 DNA:리포펙타민3000 (2 x 5μl) 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 ~24시간 동안 조직 배양 인큐베이터로 복귀시켰다.
제2일에, 나타낸 항체 및 TGFβ 리포터 세포 (CAGA12)를 웰에 첨가하였다. 항체를 PBS 중에 연속 희석한 다음, 2x 최종 농도까지 검정 배지로 추가로 희석하였다. 플레이트를 흡인 (진공 흡인기)에 의해 검정 배지로 2회 세척하고, 이어서 웰당 100μl의 검정 배지를 첨가하였다. 제2 세척 후에, 검정 배지를 웰당 50 μl의 2X 항체로 대체하였다. 세포 플레이트를 ~15-20분 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. CAGA12 (클론 4A4) 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, 생존 세포를 계수하였다. 생존 세포를 0.3e6개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 15,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다.
제3일에, 항체 및/또는 리포터 세포 첨가 약 16-20시간 후에 검정을 판독하였다. 판독 전에 브라이트-글로 시약 및 시험 플레이트를 실온이 되도록 하였다. 웰당 100μL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 빛으로부터 보호하였다. 이어서 플레이트 판독기 상에서 발광을 검출하였다.
결과:
이 검정으로부터 생성된 데이터는 세포 상청액에서의 TGFβ 활성을 반영하였다. 도 13a 및 13b는 TGFβ 활성에 의해 측정시 항체 SR-AB20, SR-AB21, SR-AB22 및 SR-AB23 (SR-AB10 패밀리 항체)의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다. 도 13a 검정은 LTBP1 과다발현 없이 수행하였으며, 따라서 내인성 제시 분자의 존재 하의 TGFβ의 활성화를 측정한다. 도 13b 검정은 과다발현된 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1을 사용하여 수행하였다. 특히, 항체 SR-AB22 및 SR-AB23은 둘 다의 검정에서 콘텍스트-비의존성 항체 SR-AB1과 유사한 (또는 그보다 큰) 활성을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 TGFβ 활성에 의해 측정시 항체 SR-AB24, SR-AB25, SR-AB26, SR-AB27, SR-AB28 및 SR-AB29 (SR-AB13 패밀리 항체)의 개선된 효력을 보여주는 그래프이다. 도 14a 검정은 LTBP1 과다발현 없이 수행하였으며, 따라서 내인성 제시 분자의 존재 하의 TGFβ의 활성화를 측정한다. 도 14b 검정은 과다발현된 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1을 사용하여 수행하였다. 특히, 최적화된 항체는 LTBP1-프로TGFβ1 과다발현 세포 검정에서 콘텍스트-비의존성 항체 SR-AB1보다 더 큰 활성을 나타낸다 (도 14b).
도 13a, 도 13b, 도 14a 및 도 14b에 도시된 검정은 모두 낮은 LTBP1 mRNA, 높은 LTBP3 mRNA, 검출불가능한 GARP 및 검출불가능한 LRRC33을 발현하는 LN229 세포에서 수행하였다.
실시예 11: 경쇄 돌연변이유발 후 최적화된 LTBP 복합체-특이적 항체의 개선된 효력
제3 및 제4 라운드의 친화도 성숙/최적화로부터의 LTBP 복합체-특이적 항체를 LN229 세포를 사용하여 TGFβ 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 검정을 실시예 10에 기재된 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
억제 효력 (IC50) 값을 계산하기 위해, 미가공 발광 값을 PBS 단독으로 처리된 웰 (비히클)에 대해 정규화하였다. 정규화된 값을 프리즘(PRISM)® 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하고, 값을 3-포인트 비-선형 회귀를 사용하여 계산하였다. 하기 표는 2가지 상이한 검정 포맷: 내인성 인간 LTBP (hLTBP) 검정 및 마우스 LTBP 검정 (mLTBP)에서의 이소형-특이적 항체에 대한 IC50 값 (nM)을 제시한다. IC50 값을 표 16-19에 제시된 4종의 상이한 항체 계통: SR-AB22, SR-AB23, SR-AB24 및 SR-AB26에 대해 2가지 검정 포맷에서 결정하였다.
표 16: SR-AB22 계통
Figure pct00048
표 17: SR-AB23 계통
Figure pct00049
표 18: SR-AB24 계통
Figure pct00050
표 19: SR-AB26 계통
Figure pct00051
이 검정으로부터 생성된 데이터는 세포 상청액에서의 TGFβ 활성을 반영하였다. 도 16에 제시된 바와 같이, LTBP 복합체 특이적 항체의 기능적 활성 (효력)은 친화도 성숙의 각각의 주기에서 개선되었다. 도 16에 제시된 바와 같이, 친화도 성숙의 각각의 주기로부터의 개선은 잠복 TGFβ1의 강력한 콘텍스트-비의존성 억제제인 콘텍스트-비의존성 참조 항체 (Ref Ab)를 초과하는 활성을 유발하였다. 상기 기재된 검정은 모두 뮤린 LTBP1 및 뮤린 프로TGFβ1로 일시적으로 형질감염된 LN229 세포에서 수행하였다.
표 20에 제시된 결과의 경우, 실시예 10에 기재된 프로토콜을 사용하여 검정을 수행하였지만, 이 검정에서는 Fab를 이용하였다.
표 20
Figure pct00052
실시예 12: 개발가능성
유리한 생물물리학적 특성을 나타내는 항체는 개발시 증가된 성공률을 갖는다. 제3 및 제4 라운드의 친화도 성숙/최적화로부터의 LTBP 복합체-특이적 항체를 응집 경향 및 다중특이성에 대해 평가하였다. 도 17은 바큘로바이러스 (BV) 입자에 대한 SR-AB 결합을 보여주는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)의 결과를 보여준다. 도 18은 친화도-포획 자기-상호작용 나노입자 분광분석법 (AC-SINS) 검정의 결과를 보여준다. 이 검정은 항체가 그 자체와 상호작용할 가능성이 어느 정도인지 시험한다. 이는 항-Fc 항체로 코팅된 금 나노입자를 사용한다. 항체의 희석 용액을 첨가하는 경우에, 이들은 Fc-코팅된 금 비드 상에 신속하게 고정화된다. 이들 항체가 후속적으로 서로 상호작용하는 경우에, 이는 보다 짧은 원자간 거리 및 플라즈몬 파장의 증가를 유도하며, 이는 분광분석법에 의해 검출될 수 있다.
이들 결과는 AC-SINS 검정에서 5 nM 미만의 플라즈몬 이동 및 음성 대조군의 5배 미만의 BV ELISA 신호에 의해 입증된 바와 같이 후보 항체가 유리한 개발가능성 특성을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 13: 마우스 NASH의 콜린-결핍 고 지방 식이 (CDHFD) 모델에서 LTBP 복합체-특이적 항체에 의한 TGFβ 신호전달의 억제
콜린 결핍 고 지방 식이 (CDHFD)는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 확립된 식이-유도된 모델이다. 이 모델에서, 수컷 C57BL/6J 마우스에게 콜린 결핍, 0.1% 메티오닌, 고 지방 식이를 12주 동안 공급한다. CDHFD의 시작 3 내지 6주 후에, 섬유화유발 과정의 활성화는 간 성상 세포의 활성화에 대한 마커인 α-평활근 액틴 (α-SMA) 단백질의 증가된 발현, 및 증가된 콜라겐 합성 및 침착을 반영하는 상승된 조직 히드록시프롤린 함량을 통해 검출될 수 있다 (Matsumoto et al., Int J Exp Pathol. 2013 Apr;94(2):93-103).
LTBP 복합체-특이적 항체를 하기와 같이 CDHFD 모델의 마우스에서 간 섬유증을 억제하고/거나 간 섬유증의 정도를 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 연구의 개요가 하기 표 21에 제시되어 있다.
표 21
Figure pct00053
시험 코호트의 동물은 연구 지속기간 동안 CDHFD를 받았다. 마우스의 별개 코호트 (군 1)에게 연구 대조군으로서 정기적 사료 식이를 투여하였다. 항체 SR-AB42 및 SR-AB31을 CDHFD 시작 4주 후에 시작하여 복강내 (i.p.) 주사에 의해 마우스에게 투여하였다. 동물에게 시험 농도 15mg/kg의 항체를 8주의 시험 지속기간 (즉, 제4주 내지 제12주) 동안 1주 2회 (즉, 30 mg/kg/주) 투여하였다. 마우스 IgG1 이소형 항체를 15mg/kg으로 매주 2회 (즉, 30 mg/kg/주) 음성 대조군으로서 사용하였다. Ref Ab는 TGFβ1의 강력한 콘텍스트-비의존성 억제제이기 때문에 그를 참조 항체로서 사용하였다. 투여 8주 후, 동물을 희생시키고, 분석을 위해 간을 수집하였다. 종점 판독은 히드록시프롤린 함량이었다.
CDHFD 간 섬유증 모델에서의 히드록시프롤린 함량
아미노산 프롤린의 히드록실화에 의해 생산된 히드록시프롤린은 원섬유성 콜라겐의 주요 성분에 대한 시그너쳐 아미노산이고, 단백질의 대략 13.5%를 구성한다. 히드록시프롤린은 섬유증의 중증도의 중요한 진단 지표로서 작용한다. CDHFD를 공급받은 동물은 간 조직에서 히드록시프롤린 (HYP)의 증가를 나타낸다. 도 19에 제시된 바와 같이, SR-AB42 및 SR-AB31로의 처리는 CDHFD를 받은 동물의 간 조직에서 HYP (μg/mg 조직)의 증가를 억제하였다.
실시예 14: 알포트 증후군의 유전 모델에서 LTBP 복합체-특이적 항체에 의한 TGFβ 신호전달의 억제
뮤린 Col4a3-/- 모델은 상염색체 열성 알포트 증후군의 확립된 유전 모델이다. 알포트 마우스는 기능적 콜라겐 4A3 유전자가 결여되어 있고 (Col4A3-/-), 따라서α3, α4 및 α5 쇄가 요구되는 정상 유형 IV 콜라겐 삼량체를 형성할 수 없다. Col4a3-/- 마우스에서는 간질성 섬유증 및 세관 위축을 포함한 인간 환자에서의 신장 섬유증과 일치하는 신장에서의 섬유증이 발생하고, Col4a3-/- 마우스에서는 마우스의 유전적 배경에 따라 8 내지 30주령에 말기 신질환 (ESRD)이 발생한다. Col4a3-/- 마우스에서의 신장 병리상태의 구조적 및 기능적 징후는 ESRD로의 진행과 조합되어 Col4a3-/- 마우스를 신장 섬유증을 이해하기에 이상적인 모델로 만든다. 이전의 보고는 이 과정에서 TGFβ 신호전달 경로의 중요성을 가리키고, TGFβ1 및 TGFβ3의 공지된 활성화제인 αVβ6 인테그린의 억제제 또는 TGFβ 리간드 트랩으로의 처리는 알포트 마우스에서 신장 섬유증 및 염증을 예방하는 것으로 보고되었다 (Hahm et al. (2007) The American Journal of Pathology, 170(1): 110-125).
LTBP 복합체-특이적 항체를 하기와 같이 알포트 마우스에서 신장 섬유증을 억제 및/또는 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 연구의 개요가 하기 표 22에 제시되어 있다.
표 22
Figure pct00054
C57BL/6 유전적 배경의 Col4a3+/- 암컷과 교배된 129/Sv 유전적 배경의 Col4a3+/- 수컷으로부터의 F1 자손을 연구에 사용하였다. 이들 마우스는 전형적으로 4-5주령까지 단백뇨를 나타내고, 전형적으로 13-15주령까지 ESRD로 진행되어, 치료의 효능을 시험하기 위한 우수한 치료 범위를 제공한다. 11주령 Col4a3-/- 마우스에게 동물 희생 및 신장 수집 48시간 전에 30 mg/kg SR-AB42 및 SR-AB63을 복강내로 (i.p.) 투여하였다. Ref Ab는 TGFβ1 활성화의 강력한 콘텍스트-비의존성 억제제이기 때문에 그를 참조 항체로서 사용하였다.
알포트 신장 모델에서의 pSMAD 분석
TGFβ 수용체 활성화가 Smad2/3의 인산화를 포함한 세포내 사건의 하류 신호전달 캐스케이드로 이어진다는 것은 널리 기록되어 있다. 따라서, TGFβ 신호전달을 억제하는 SR-AB42 및 SR-AB63 처리의 능력을 신장 용해물 샘플에서 ELISA (셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies))에 의해 제조업체의 지침서에 따라 검정하여 Smad2/3의 상대 인산화 수준을 측정함으로써 평가하였다. 도 20a는 알포트 마우스 모델에서 인산화 대 총 (인산화 및 비인산화) Smad2/3 (pSMAD2/3:tSMAD2/3)의 상대비를 보여주는 그래프이다. 도 20b는 ELISA에 의해 결정시 인산화 SMAD2/3 (pSMAD2/3)의 양을 보여주는 그래프이고, 도 20c는 ELISA에 의해 결정시 총 SMAD2/3 (tSMAD2/3) 단백질의 양을 보여주는 그래프이다. 도 20b 및 도 20c에 제시된 바와 같이, pSMAD의 감소는 도 20a에 제시된 비의 변화에 기여한다. SR-AB42 또는 SR-AB63의 단일 용량은 전체 신장 용해물에서 pSmad2/3 신호전달을 유의하게 억제하기에 충분하였으며, 이는 SR-AB42 및 SR-AB63에 의한 효율적인 표적 결속 및 알포트 모델에서의 LTBP 복합체-특이적 억제가 pSmad 수준을 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 15. 프로TGβ1 C4S 결합의 결정
프로-도메인의 위치 4에서의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 변형된 프로TGFβ1 복합체 (프로TGFβ1 C4S) (WO 2014/182676에 기재됨)를 사용하여 C4S 항원에 대한 항체 결합을 옥텟에 의해 평가하였다. 제2주기 항체를 고정화시키고, 3종의 항원에 대해 시험하였다. 하기 표에 제시된 바와 같이, LTBP-1 프로TGFβ1 항원 (표 23) 및 프로TGFβ1C4S 항원에 대한 강건한 항체 결합이 관찰된 반면 (표 24), LRRC33 프로TGFβ1 항원에 대한 결합은 관찰되지 않았다 (표 25).
표 23: 인간 LTBP-1 프로TGFb1에 대한 결합
Figure pct00055
표 24: 인간 TGFb1 C4S에 대한 결합
Figure pct00056
표 25: 인간 LRRC33 프로TGFb1에 대한 결합
Figure pct00057
실시예 16. 제3주기 리드 항체는 TGFβ3 검정에서 억제를 나타내지 않는다.
도 21은 리드 제3주기 항체가 LTBP-TGFβ3 검정에서 억제를 나타내지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다. TGFβ3 검정을 실시예 10에서의 검정과 유사하게 수행하지만, 프로TGFβ3을 프로TGFβ1 대신에 형질감염시킨다. 이 검정은 LN229 세포주에서 내인성 제시 분자에 의존하기 때문에 LTBP 구축물을 형질감염시키지 않는다.
실시예 17: 간 섬유증 모델에서 TGFβ3-선택적 활성화 억제제의 섬유화유발 효과
간은 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현한다. CDHFD 모델에서 이소형 둘 다의 억제가 간의 섬유증을 추가로 완화시킬 것인지 여부를 조사하기 위해, CDHFD 마우스를 강력한 TGFβ1-선택적 활성화 억제제 (이는 인간 LTBP1 및 LTBP3 복합체의 콘텍스트에서의 TGFβ1의 활성화를 억제함) 및 TGFβ3-선택적 활성화 억제제를 단독으로 또는 조합으로 사용하여 처리하였다. TGFβ3 억제제로 처리된 마우스에서, PSR 분석 및 추가의 조직병리학 분석에 의해 입증된 바와 같이 질환의 악화가 관찰되었다 (도 22). 12주, 예를 들어 연구의 종료시에, TGFβ1-선택적 활성화 억제제를 받은 동물은 IgG-처리된 동물 (음성 대조군)과 비교하여 유의하게 더 적은 섬유증을 나타냈다. 대조적으로, TGFβ3-선택적 억제제로 처리된 동물은 대략 12% PSR 양성 면적으로 유의하게 더 많은 섬유증을 나타냈다. TGFβ3-선택적 억제제 및 TGFβ1-선택적 억제제 둘 다의 조합을 받은 동물은 중간 수준의 섬유증을 나타냈으며, 이는 TGFβ1-선택적 활성화 억제제의 항섬유화 효과가 TGFβ3 억제에 의해 완화된다는 것을 나타낸다.
실시예 18: 경쇄 최적화 제4주기 후 최적화된 LTBP-복합체-특이적 항체의 개선된 친화도
제3 라운드의 친화도 성숙/최적화로부터의 LTBP 복합체-특이적 항체를 제4 라운드의 친화도 성숙/최적화 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 최적화)를 위해 선택하고, 특정한 자손 항체를 다양한 프로TGFβ1 구축물에 결합하는 그의 능력에 대해 평가하였다.
물질:
● 96 웰 플레이트 - 그라이너 바이오-원 REF 650101
● 마이크로플레이트 호일 - 지이 헬스케어 - CAT# 28-9758-16
● 비오틴 포획 키트 지이 헬스케어 제품 번호 28920233
● 비아코어 구동 완충제 - 밀리-큐 물 중에 희석된 20x 용액으로서 공급됨, 테크노바(TEKnova) CAT# H8022
방법:
이들 실험은 비아코어 8K를 사용하여 방법 "비오틴 포획 키트를 사용하는 다중-주기 동역학/친화도"를 사용하여 수행하였다.
데이터 수집 속도를 10 Hz로 설정하고, 비오틴 포획 단계를 300초 동안 2 μL/분의 유량으로 수행하였다. 비오틴 포획 시약을 1x 비아코어 구동 완충제 중에 1:5 희석한 후 사용하였다. 비오티닐화 리간드 (TGFβ1의 다양한 복합체)를 10 nM의 농도로 이용하고, 센서 칩에 180초 동안 10 μL/분의 유량으로 고정화시켰다. 각각의 Fab인 분석물을 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.625 nM에서 시험하고, 0 nM 대조군을 포함시켰다. 분석물 접촉 시간은 120초이고, 해리 시간은 900초였다. 이용된 재생 주기는 120초이고, 유량은 10 μL/분이었다.
사용된 평가 방법은 "포획을 사용하는 다중-주기 친화도"였고, 1:1 결합 모델을 사용하였다. 주어진 비오티닐화 항원에 대해 시험된 모든 Fab에 대해, 유의하게 더 느린 결합 오프-레이트를 갖고 따라서 동일한 실험에서 동일한 항원에 대해 더 높은 친화도 결합을 갖는 참조 Ab의 친화도-성숙 버전의 Rmax와 동일하도록 Rmax를 설정하였다. 전반적 피트를 모든 KD 결정에 이용하였다. KD 값이 하기 표 26에 제시되어 있다.
표 26
Figure pct00058
표 27은 1가 절반-결합-시간 (T½)을 나타낸다. 1가 절반-결합-시간 (T½) 값은 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대해 적어도 45분이었다. SPR에 의해 측정시, 1가 T½ 값은 각각의 hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 5분 미만이었다.
표 27: 1가 절반-결합 시간 (T1/2)
Figure pct00059
실시양태
본 발명은 다양한 실시양태를 포괄한다. 비제한적 예가 하기에 열거된다:
1. 하기 6개의 CDR:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 94, 단 임의로:
i. 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나;
vi. 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나;
vii. 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 95;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 96;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 97;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 98; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 99
중 적어도 3개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
2. 실시양태 1에 있어서, 하기 6개의 CDR:
a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 (X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 V 또는 S이고; X2는 S 또는 G이고; X3은 F 또는 L인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 (X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, V, G 또는 K이고; X3은 R, H 또는 L이고; X4는 I, V 또는 G이고; X5는 A, S 또는 L이고; X6은 A 또는 V이고; X7은 F 또는 Y이고; X8은 D, G, R 또는 S이고; X9는 Y, G, R, L, V, A 또는 K인 CDR-H3;
d) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
e) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
f) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3
중 적어도 3개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
3. 실시양태 2에 있어서,
a) CDR-H2 내에서: X2가 S이고;
b) CDR-H3 내에서: X1이 A이고; X2가 R 또는 V이고; X3이 R이고; X4가 I이고; X5가 A 또는 L이고; X6이 A이고; X7이 F이고; X8이 G이고; X9 및 Y인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
3.1. 실시양태 3에 있어서, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 1개 이상이 CDR 다양화 및/또는 돌연변이유발에 의해 친화도 성숙되고/거나 최적화된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열식별번호: 88에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/거나,
항체가 서열식별번호: 89에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
5. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
서열식별번호: 88에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 89에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
6. 하기 6개의 CDR:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 100, 단 임의로
i. 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 101, 단 임의로
i. 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 102;
d) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105
중 적어도 3개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
7. 실시양태 6에 있어서, 하기 6개의 CDR 중:
g) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 P이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1;
h) 아미노산 서열 SISYSA(X1)TYYNPSLKS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 T인 CDR-H2;
i) 아미노산 서열 (X1)(X2)D(X3)(X4)Y(X5)(X6)(X7)(X8)G(X9)(X10)(X11)을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, S 또는 G이고, X3은 P, Y, R, V, I, H, T 또는 E이고; X4는 S, D, E 또는 N이고; X5는 D, A 또는 T이고; X6은 S, G, T 또는 A이고; X7은 I, A, R, Q 또는 V이고; X8은 A, E, K, G 또는 T이고; X9는 M 또는 I이고; X10은 D, L, Q, V, N 또는 G이고; X11은 V, R, N, E 또는 K인 CDR-H3;
j) CDR-L1: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
k) CDR-L2: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
l) CDR-L3: 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105
중 적어도 3개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
8. 실시양태 7에 있어서,
g) CDR-H1 내에서: X2가 H 또는 R이고; X3이 S이고; X4가 G, I 또는 N이고;
h) CDR-H3 내에서: X1이 A이고; X3이 P 또는 V이고; X4가 S이고; X5가 D이고; X6이 S 또는 A이고; X7이 A, R, I 또는 V이고; X8이 A이고; X9가 M이고; X10이 D, Q 또는 G이고; X11이 V 또는 R인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
8.1 실시양태 8에 있어서, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 1개 이상이 CDR 다양화 및/또는 돌연변이유발에 의해 친화도 성숙되고/거나 최적화된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
9. 실시양태 6-8.1 중 어느 하나에 있어서, 하기:
CDR-H1: 서열식별번호: 100;
CDR-H2: 서열식별번호: 101;
CDR-H3: 서열식별번호: 102;
CDR-L1: 서열식별번호: 103;
CDR-L2: 서열식별번호: 104; 및
CDR-L3: 서열식별번호: 105
로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
10. 실시양태 6-9 중 어느 하나에 있어서, 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 포함하며, 여기서
i) 가변 중쇄 영역은 서열식별번호: 106에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나;
ii) 가변 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
11. 실시양태 6-9 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분이
i) 서열식별번호: 106에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역; 및
ii) 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 모든 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.1 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 1개의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.2 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 2개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.3 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.4 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 4개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.5 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 5개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.6 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 6개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.7 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 아미노산 변화가 7개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
12.8 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CDR 중 어느 하나가 아미노산 변화를 포함하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
13. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
16. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
17. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
18. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 완전 인간 또는 인간화 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
19. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
20. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 항체 SR-Ab1, SR-Ab2 또는 SR-Ab13 중 어느 하나와 경쟁하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
21. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 항체 SR-Ab1, SR-Ab2 또는 SR-Ab10 중 어느 하나와 경쟁하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
22. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, IgG4 또는 IgG1 하위유형인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
23. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
24. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
25. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
26. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 GARP-TGFβ1 복합체 또는 GARP-TGFβ3 복합체에 결합하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
27. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
28. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
29. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
30. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
31. 실시양태 27-30 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
32. 실시양태 27-30 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
33. 실시양태 27-30 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 둘 다와 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
34. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
35. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
36. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
37. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
38. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, LTBP1/3과 연관된 TGFβ1에 선택적으로 결합하고 이의 활성화를 억제한다는 점에서 이소형-특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
39. 실시양태 38에 있어서, GARP-TGFβ1에 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
40. 하기 6개의 CDR:
a) 아미노산 서열 FTFRSYVMH를 포함하는 CDR-H1;
b) 아미노산 서열 VISHEGS(X1)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 X1은 L 또는 G인 CDR-H2;
c) 아미노산 서열 A(X1)PRIAARRGGFG(X2)를 포함하며, 여기서 X1은 V, R 또는 L이고; X2는 Y, S 또는 T인 CDR-H3;
d) 아미노산 서열 TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 H이고; X2는 N, L, S 또는 A이고; X3은 N, D 또는 Y인 CDR-L1;
e) 아미노산 서열 ED(X1)(X2)RPS를 포함하며, 여기서 X1은 N, F 또는 A이고; X2는 Q, I 또는 V인 CDR-L2; 및
f) 아미노산 서열 Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 S, F, Y, D, H 또는 W이고; X3은 N, D 또는 S이고; X4는 N, A, L, E 또는 T이고; X5는 G, R, A 또는 L인 CDR-L3
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
41. 실시양태 40에 있어서, CDR-H3 내에서: X1이 R 또는 L인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
42. 실시양태 41에 있어서, CDR-L3 내에서: X2가 Y인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
43. 실시양태 42에 있어서, CDR-L3 내에서: X3이 D이고; X4가 T인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
44. 실시양태 42에 있어서, CDR-L3 내에서: X3이 D이고; X4가 N이고; X5가 A인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
45. 실시양태 41에 있어서,
CDR-L1 내에서: X1이 S 또는 H이고; X2가 N 또는 A이고; X3이 N, D 또는 Y이고;
CDR-L2 내에서: X1이 N 또는 F이고; X2가 Q 또는 V이고;
CDR-L3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 S, Y, D 또는 W이고; X3이 D 또는 S이고; X4가 N, L 또는 T이고; X5가 G, R, A 또는 L인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
46. 실시양태 45에 있어서,
CDR-L1 내에서: X1이 S이고; X2가 N이고; X3이 N 또는 Y이고;
CDR-L2 내에서: X1이 N이고; X2가 Q 또는 V이고;
CDR-L3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 S, Y 또는 W이고; X3이 D이고; X4가 N 또는 T이고; X5가 G, R 또는 A인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
47. 실시양태 46에 있어서, CDR-L3 내에서: X1이 S이고; X2가 S 또는 Y이고; X3이 D이고; X4가 N 또는 T이고; X5가 G, R 또는 A인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
48. 실시양태 47에 있어서, CDR-L3 내에서: X1이 S이고; X2가 Y이고; X3이 D이고; X4가 N 또는 T이고; X5가 G 또는 A인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
49. 실시양태 48에 있어서, CDR-L3 내에서: X1이 S이고; X2가 Y이고; X3이 D이고; X4가 T이고; X5가 G인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
50. 실시양태 45-49 중 어느 하나에 있어서,
a) CDR-H1이 서열식별번호: 166의 아미노산 서열을 포함하고;
b) CDR-H2가 서열식별번호: 167의 아미노산 서열을 포함하고;
c) CDR-H3이 서열식별번호: 168의 아미노산 서열을 포함하고;
d) CDR-L1이 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하고;
e) CDR-L2가 서열식별번호: 170의 아미노산 서열을 포함하고;
f) CDR-L3이 서열식별번호: 171의 아미노산 서열을 포함하는 것인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
51. 실시양태 40-50 중 어느 하나에 있어서,
서열식별번호: 318에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 319에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
52. 실시양태 40-51 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 318에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
53. 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하고, 서열식별번호: 318에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
54. 하기 6개의 CDR:
g) 아미노산 서열 G(X1)I(X2)S(X3)SYYW(X4)를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S이고; X2는 S, H 또는 R이고; X3은 S 또는 G이고; X4는 G, I, N 또는 V인 CDR-H1;
h) 아미노산 서열 SISYS(X1)(X2)TYY를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 G 또는 A이고; X2는 S 또는 T인 CDR-H2;
i) 아미노산 서열 A(X1)DPSYDS(X2)AGM(X3)V를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 R, S 또는 G이고; X2는 A 또는 I이고; X3은 D 또는 Q인 CDR-H3;
j) 아미노산 서열 RAS(X1)(X2)IS(X3)YLN을 포함하며, 여기서 임의로 X1은 K 또는 Q이고; X2는 V 또는 S이고; X3은 S 또는 Y인 CDR-L1;
k) 아미노산 서열 (X1)AS(X2)(X3)QS를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 Y, A 또는 S이고; X2는 S 또는 N이고; X3은 L 또는 R인 CDR-L2;
l) 아미노산 서열 QQ(X1)(X2)D(X3)P(X4)T를 포함하며, 여기서 임의로 X1은 S 또는 G이고; X2는 F 또는 N이고; X3은 W 또는 F이고; X4는 F 또는 L인 CDR-L3
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
55. 실시양태 54에 있어서,
a) CDR-H1 내에서: X1이 S이고; X2가 S 또는 R이고; X3이 S이고; X4가 G이고;
b) CDR-H2 내에서: X1이 G 또는 A이고; X2가 S 또는 T이고;
c) CDR-H3 내에서: X1이 R, S 또는 G이고; X2가 A 또는 I이고; X3이 D 또는 Q이고;
d) CDR-L1 내에서: X1이 K 또는 Q이고; X2가 V 또는 S이고; X3이 S 또는 Y이고;
e) CDR-L2 내에서: X1이 Y, A 또는 S이고; X2가 S 또는 N이고; X3이 L 또는 R이고;
f) CDR-L3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 F 또는 N이고; X3이 W 또는 F이고; X4가 F 또는 L인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
56. 실시양태 55에 있어서,
a) CDR-H1이 아미노산 서열 GSIRSSSYYWG를 포함하고;
b) CDR-H2가 아미노산 서열 SISYSATTYY를 포함하고;
c) CDR-H3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 A 또는 I이고; X3이 D 또는 Q이고;
d) CDR-L1 내에서: X1이 K 또는 Q이고; X2가 V 또는 S이고; X3이 S 또는 Y이고;
e) CDR-L2 내에서: X1이 Y, A 또는 S이고; X2가 S 또는 N이고; X3이 L 또는 R이고;
f) CDR-L3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 F 또는 N이고; X3이 W 또는 F이고; X4가 F 또는 L인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
57. 실시양태 56에 있어서,
g) CDR-H1이 서열식별번호: 292의 아미노산 서열을 포함하고;
h) CDR-H2가 서열식별번호: 293의 아미노산 서열을 포함하고;
i) CDR-H3이 서열식별번호: 294의 아미노산 서열을 포함하고;
j) CDR-L1이 서열식별번호: 295의 아미노산 서열을 포함하고;
k) CDR-L2가 서열식별번호: 296의 아미노산 서열을 포함하고;
l) CDR-L3이 서열식별번호: 297의 아미노산 서열을 포함하는 것인
항체 또는 그의 항원-결합 단편.
58. 실시양태 54-57 중 어느 하나에 있어서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
59. 실시양태 54-58 중 어느 하나에 있어서,
서열식별번호: 360에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 361에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
60. 실시양태 54-59 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 360에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 361에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
61. 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하고, 서열식별번호: 360에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 361에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
62. 실시양태 40-61 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
63. 실시양태 40-62 중 어느 하나에 있어서, 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
64. 실시양태 40-63 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
65. 실시양태 40-64 중 어느 하나에 있어서, SPR에 의해 측정시, 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대해 적어도 45분의 1가 절반-결합-시간 (t½)을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
66. 실시양태 65에 있어서, SPR에 의해 측정시, 각각의 hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 5분 미만의 1가 t½을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
67. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 5 nM, 임의로 < 1 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
68. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
69. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
70. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
71. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
72. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 및 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체와 각각 < 5 nM, 임의로 < 1 nM의 KD로 교차-반응하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
73. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 IgG4 또는 IgG1 하위유형인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
74. 실시양태 73에 있어서, 항체가 인간 IgG4 하위유형이고, 임의로 항체가 IgG1-유사 힌지를 생성하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
75. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
76. 실시양태 75에 있어서, 정맥내 투여 또는 피하 투여를 위해 제조된 제약 조성물.
77. 실시양태 75 또는 76의 제약 조성물을 함유하는 다중-용량 바이알을 포함하는 조성물.
78. 실시양태 75 또는 76의 제약 조성물을 함유하는 단일-용량 시린지를 포함하며, 임의로 여기서 시린지는 일회용 시린지인 조성물.
79. 실시양태 75 또는 78에 있어서, 인간 대상체에서의 섬유화 상태의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물이며, 여기서 치료는 대상체에게 섬유화 장애의 치료에 유효한 양의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
80. 실시양태 79에 있어서, 섬유화 장애가 기관 섬유증인 조성물.
81. 실시양태 80에 있어서, 기관 섬유증이 진행성 기관 섬유증인 조성물.
82. 실시양태 80 또는 81에 있어서, 기관 섬유증이 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 경피증, 근육 섬유증, 자궁 섬유증 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
83. 실시양태 82에 있어서,
a) 섬유화 장애가 만성 염증을 포함하고/거나;
b) 대상체가 면역 억제로부터 이익을 얻고/거나;
c) 대상체가 자가면역 질환을 갖거나 자가면역 질환이 발생할 위험이 있고/거나;
d) 대상체가 동종이식편 이식에 대한 후보이고/거나;
e) 대상체가 동종이식편 이식을 받은 것인
조성물.
84. 실시양태 79에 있어서, 만성 염증을 포함하는 섬유화 장애가 근육 이영양증, 다발성 경화증 (MS) 또는 낭성 섬유증 (CF)인 조성물.
85. 실시양태 84에 있어서, 근육 이영양증이 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)인 조성물.
86. 실시양태 84에 있어서, MS가 혈관주위 섬유증을 포함하는 것인 조성물.
87. 실시양태 82에 있어서, 폐 섬유증이 특발성 폐 섬유증 (IPF)인 조성물.
88. 실시양태 82에 있어서, 대상체가 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 것인 조성물.
89. 실시양태 82에 있어서, 대상체가 비알콜성 지방간염 (NASH) 또는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)과 연관된 간 섬유증을 갖는 것인 조성물.
90. 실시양태 89에 있어서, 대상체가 NASH와 연관된 간경변증 또는 간세포성 암종을 갖는 것인 조성물.
91. 실시양태 90에 있어서, 대상체가 대사 상태 (예를 들어, 비만, 제2형 당뇨병)를 앓고 있는 것인 조성물.
92. 실시양태 89-91 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 미오스타틴 억제제로 추가로 치료되고, 여기서 임의로 미오스타틴 억제제는 미오스타틴-선택적 억제제이고, 여기서 추가로 임의로 미오스타틴-선택적 억제제는 SRK-015, 트레보그루맙 또는 그의 임의의 변이체, 또는 WO 2016/098357에 따른 항체인 조성물.
93. 실시양태 79-92 중 어느 하나에 있어서, 항체가 대상체에게 0.1 내지 30 mg/kg의 투여량으로 투여되는 것인 조성물.
94. 실시양태 93에 있어서, 항체가 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월 1회, 6주마다 1회 또는 격월로 투여되는 것인 조성물.
95. 실시양태 93에 있어서, 치료 요법이 요법의 초기 단계 및 요법의 후속 단계를 포함하며,
여기서 대상체는 초기 단계 동안 부하 용량을 받고, 이어서 후속 단계 동안 유지 용량을 받는 것인 조성물.
96. 실시양태 95에 있어서, 부하 용량이 2-30 mg/kg이고, 유지 용량이 0.1-20 mg/kg인 조성물.
97. 실시양태 95 또는 96에 있어서, 부하 용량이 대상체에게 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 또는 3주마다 1회 투여되는 것인 조성물.
98. 실시양태 95-97 중 어느 하나에 있어서, 유지 용량이 대상체에게 2-12주마다 1회 투여되는 것인 조성물.
99. 실시양태 95-97 중 어느 하나에 있어서, 유지 용량이 대상체에게 필요에 따라 투여되는 것인 조성물.
100. 실시양태 79-99 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플에서 TGFβ1, LTBP1 또는 LTBP3의 발현을 시험하거나 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
101. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않으며, TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 또는 TGFβ3은 억제하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 실시양태 75-78 중 어느 하나에 따른 조성물의 제조 방법이며,
i) LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1을 포함하는 적어도 1종의 항원을 제공하는 단계;
ii) 단계 (i)의 적어도 1종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편의 제1 풀을 선택하여 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1의 특이적 결합제를 제공하는 단계;
iii) TGFβ1의 활성화를 억제하는 항체 또는 단편의 제2 풀을 선택하여 TGFβ1 활성화의 특이적 억제제를 생성하는 단계; 및
iv) 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편을 제약 조성물로 제제화하여 항체 또는 단편을 포함하는 조성물을 제조하는 단계
를 포함하는 방법.
102. 실시양태 101에 있어서, 항체 또는 단편의 제1 풀로부터, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1, 성숙 TGFβ1, GARP-프로TGFβ2, LRRC33-프로TGFβ2, 성숙 TGFβ2, GARP-프로TGFβ3, LRRC33-프로TGFβ3, 성숙 TGFβ3 또는 그의 임의의 조합에 결합하는 임의의 항체 또는 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
103. 실시양태 101 또는 102에 있어서, 단계 (ii) 및/또는 (iii)에서 선택된 항체 또는 단편의 이소형-특이성을 결정하거나 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
104. 실시양태 101-103 중 어느 하나에 있어서, 인간 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성인 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
105. 실시양태 101-104 중 어느 하나에 있어서, 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편의 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 단편을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
106. 실시양태 101-105 중 어느 하나에 있어서, 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
107. 실시양태 101-106 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화가 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 경쇄 셔플링에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
108. 실시양태 101-107 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화가 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 CDR H1/H2 다양화에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
109. 실시양태 101-108 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화가 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 CDR-H3 돌연변이유발에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
110. 실시양태 101-109 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화가 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 경쇄 CDR 돌연변이유발에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
111. 실시양태 101-110 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화가 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 경쇄 CDR L1/L2 다양화에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
112. 실시양태 101-111 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
113. 실시양태 101-112에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
114. 실시양태 101-113에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
115. 실시양태 101-114에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
116. 실시양태 101-115 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
117. 실시양태 101-116 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 항체의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
118. 실시양태 117에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
119. 실시양태 117에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
120. 실시양태 117에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
121. 실시양태 117에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 > 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
122. 실시양태 101-121 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하지 않는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
123. 실시양태 101-122 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, 적합한 기능적 시험관내 세포-기반 검정에 의해 측정하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 IC50을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
124. 실시양태 123에 있어서, 적합한 기능적 시험관내 세포-기반 검정이 caga 검정인 방법.
125. 실시양태 123 또는 124에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, > 100 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
126. 실시양태 123 또는 124에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, > 50 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
127. 실시양태 123 또는 124에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, > 25 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
128. 실시양태 123 또는 124에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, > 10 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
129. 실시양태 123 또는 124에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 및/또는 제2 풀로부터, > 5 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
130. 실시양태 124-129 중 어느 하나에 있어서, caga 검정이 내인성 LTBP caga 검정인 방법.
131. 실시양태 124-129 중 어느 하나에 있어서, caga 검정이 인간 LTBP 과다발현 caga 검정인 방법.
132. 실시양태 124-129 중 어느 하나에 있어서, caga 검정이 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정인 방법.
133. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법이며,
면역 세포-연관 TGFβ1보다 매트릭스-연관 TGFβ1을 우선적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계;
항체를 발현하는 세포를 포함하는 세포 배양물에서 항체를 생산하며, 여기서 세포 배양물은 250L 이상의 부피를 갖는 것인 단계를 포함하고,
임의로 세포 배양물로부터 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하고;
임의로 정제된 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
134. 제133항에 있어서, 제약 조성물이 피하 투여를 위해 제제화되는 것인 방법.
135. 제133항에 있어서, 선택 단계가 SPR에 의해 측정시, 각각의 인간 LTBP1-프로TGFβ 및 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 대해 45분 이상의 t½ 및 임의로 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에 대해 5분 이하의 t½을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
136. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 94, (CDR-H2) 서열식별번호: 95 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 96의 적어도 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
137. 실시양태 136에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 (CDR-L1) 서열식별번호: 97, (CDR-L2) 서열식별번호: 98 및 (CDR-L3) 서열식별번호: 99의 경쇄 CDR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
138. 실시양태 136 또는 137에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 88에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
139. 실시양태 136-138 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 89에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
140. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 100, (CDR-H2) 서열식별번호: 101 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 102의 적어도 3개의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
141. 실시양태 140에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 (CDR-L1) 서열식별번호: 103, (CDR-L2) 서열식별번호: 104 및 (CDR-L3) 서열식별번호: 105의 경쇄 CDR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
142. 실시양태 140 또는 141에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 106에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
143. 실시양태 140-142 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 107에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
144. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 108, (CDR-H2) 서열식별번호: 109 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 110의 적어도 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
145. 실시양태 144에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 (CDR-L1) 서열식별번호: 111, (CDR-L2) 서열식별번호: 112 및 (CDR-L3) 서열식별번호: 113의 경쇄 CDR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
146. 실시양태 144 또는 145에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 114에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
147. 실시양태 144-146 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 115에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
148. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 116, (CDR-H2) 서열식별번호: 117 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 118의 적어도 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
149. 실시양태 148에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 (CDR-L1) 서열식별번호: 119, (CDR-L2) 서열식별번호: 120 및 (CDR-L3) 서열식별번호: 121의 경쇄 CDR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
150. 실시양태 148 또는 149에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 122에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
151. 실시양태 148-150 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 단편이 서열식별번호: 123에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
152. 실시양태 136-151 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)가 경쇄 셔플링을 포함하는 것인 방법.
153. 실시양태 136-152 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)가 CDR-H1/H2 다양화를 포함하는 것인 방법.
154. 실시양태 136-153 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)가 CDR-L1/L2 다양화를 포함하는 것인 방법.
155. 실시양태 136-154 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)가 CDR, 가변 영역 및/또는 불변 영역 중 어느 하나 내에서의 돌연변이유발을 포함하는 것인 방법.
156. 실시양태 155에 있어서, 돌연변이유발이 CDR 내에서의 것인 방법.
157. 실시양태 155 및 156 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이유발이 CDR-H3 내에서의 것인 방법.
158. 실시양태 155-157 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이유발이 CDR-L1 내에서의 것인 방법.
159. 실시양태 155-158 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이유발이 CDR-L2 내에서의 것인 방법.
160. 실시양태 155-159 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이유발이 CDR-L3 내에서의 것인 방법.
161. 실시양태 155에 있어서, 돌연변이유발이 가변 영역 내에서의 것인 방법.
162. 실시양태 155에 있어서, 돌연변이유발이 불변 영역 내에서의 것인 방법.
163. 실시양태 136-162 중 어느 하나에 있어서, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1, 성숙 TGFβ1, GARP-프로TGFβ2, LRRC33-프로TGFβ2, 성숙 TGFβ2, GARP-프로TGFβ3, LRRC33-프로TGFβ3, 성숙 TGFβ3 또는 그의 임의의 조합에 결합하지 않는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
164. 실시양태 136-163 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편의 이소형-특이성을 결정하거나 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
165. 실시양태 136-164 중 어느 하나에 있어서, 인간 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성인 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
166. 실시양태 136-165 중 어느 하나에 있어서, 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편의 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 단편을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
167. 실시양태 136-166 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
168. 실시양태 136-167 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 100 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
169. 실시양태 136-168 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 50 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
170. 실시양태 136-169 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 25 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
171. 실시양태 136-170에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
172. 실시양태 136-171 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 대한 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
173. 실시양태 136-172에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 100 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
174. 실시양태 136-173에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 50 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
175. 실시양태 136-174에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 25 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
176. 실시양태 136-175 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
177. 실시양태 136-176 중 어느 하나에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 마우스 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하지 않는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
178. 실시양태 136-177 중 어느 하나에 있어서, 적합한 기능적 시험관내 세포-기반 검정에 의해 측정하여, 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편의 IC50을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
179. 실시양태 178에 있어서, 적합한 기능적 시험관내 세포-기반 검정이 caga 검정인 방법.
180. 실시양태 136-179 중 어느 하나에 있어서, < 100 nM의 IC50을 갖는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
181. 실시양태 136-179 중 어느 하나에 있어서, < 50 nM의 IC50을 갖는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
182. 실시양태 136-179 중 어느 하나에 있어서, < 25 nM의 IC50을 갖는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
183. 실시양태 136-179에 있어서, < 10 nM의 IC50을 갖는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
184. 실시양태 136-179에 있어서, < 5 nM의 IC50을 갖는 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
185. 실시양태 179-184 중 어느 하나에 있어서, caga 검정이 내인성 LTBP caga 검정인 방법.
186. 실시양태 179-184 중 어느 하나에 있어서, caga 검정이 인간 LTBP 과다발현 caga 검정인 방법.
187. 실시양태 179-184 중 어느 하나에 있어서, caga 검정이 뮤린 LTBP 과다발현 caga 검정인 방법.
188. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서,
a) 하기 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 서열 또는 그의 변이체:
i) 가변 중쇄 서열 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS 또는 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISHEGSLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRIAARRGGFGYWGQGTLVTVSS (여기서 임의로 변이체는 상응하는 가변 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 동일, 90% 동일 또는 95% 동일함);
ii) 가변 경쇄 서열 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL 또는 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGNIDNNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSDNQGVVFGGGTKLTVL (여기서 임의로 변이체는 상응하는 가변 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 동일, 90% 동일 또는 95% 동일함)
을 포함하고/거나;
b) 하기 가변 중쇄 CDR 서열 또는 그의 변이체:
i) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 FTFRSYVMH의 CDR-H1;
ii) 1개 이상의 아미노산 변화를 임의로 포함하는 VISHEGSLKYYADSVKG의 CDR-H2; 및/또는
iii) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 AVPRIAARRGGFGY 또는 ARPRIAARRGGFGY의 CDR-H3
을 갖고/거나;
c) 하기 가변 경쇄 CDR 서열 또는 그의 변이체:
i) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 TRSSGNIDNNYVQ의 CDR1-L1;
ii) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 EDNQRPS의 CDR-L2; 및/또는
iii) 임의로 1개 이상의 아미노산 변화를 포함하는 QSYDSDNQGVV의 CDR-L3
을 갖는 항체 또는 그의 단편, 용도 또는 그의 관련 방법.
A1. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
여기서 항체는 하기:
CDR-H1: 서열식별번호: 100;
CDR-H2: 서열식별번호: 101;
CDR-H3: 서열식별번호: 102;
CDR-L1: 서열식별번호: 103;
CDR-L2: 서열식별번호: 104; 및
CDR-L3: 서열식별번호: 105
로부터 선택된 적어도 3개의 CDR을 포함하고, 임의로 각각의 CDR에 대해 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인
단리된 항체.
A1.1. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
여기서 항체는 하기 6개의 CDR:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 100, 단
i. 서열식별번호: 100의 위치 4에서의 세린 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 100의 위치 7에서의 세린 잔기가 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 100의 위치 11에서의 글리신 잔기가 트레오닌, 세린, 히스티딘, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 101, 단
i. 서열식별번호: 101의 위치 3에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 101의 위치 6에서의 글리신 잔기가 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 101의 위치 7에서의 세린 잔기가 트레오닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 102;
d) CDR-L1: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 103;
e) CDR-L2: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 104; 및
f) CDR-L3: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 105
중 적어도 3개를 포함하는 것인
단리된 항체.
A2. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고/거나;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고/거나;
여기서 항체는 서열식별번호: 106에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/거나;
여기서 항체는 서열식별번호: 107에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인
단리된 항체.
A3. 실시양태 A2에 있어서,
서열식별번호: 106에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 107에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체.
A3.1. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
여기서 항체는 하기 6개의 CDR:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 94, 단
i. 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나;
vi. 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나;
vii. 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 임의로 6개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 95;
c) CDR-H3: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 96;
d) CDR-L1: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 97;
e) CDR-L2: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 98; 및
f) CDR-L3: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 99
중 적어도 3개를 포함하는 것인
단리된 항체.
A3.2. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고/거나;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고/거나;
여기서 항체는 서열식별번호: 88에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/거나;
여기서 항체는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인
단리된 항체.
A3.3. 실시양태 A3.2에 있어서,
서열식별번호: 88에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 89에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체.
A3.4. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
여기서 항체는 하기 6개의 CDR:
a) CDR-H1: 서열식별번호: 1, 단
i. 서열식별번호: 1의 위치 4에서의 트레오닌 잔기가 히스티딘, 리신, 페닐알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 1의 위치 5에서의 세린 잔기가 류신으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 1의 위치 9에서의 세린 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있음;
b) CDR-H2: 서열식별번호: 2, 단
i. 서열식별번호: 2의 위치 3에서의 세린 잔기가 아스파르테이트 또는 아스파라긴으로 치환될 수 있고/거나;
ii. 서열식별번호: 2의 위치 5에서의 티로신 잔기가 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
iii. 서열식별번호: 2의 위치 6에서의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환될 수 있고/거나;
iv. 서열식별번호: 2의 위치 8에서의 아스파라긴 잔기가 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 티로신, 아스파르테이트 또는 세린으로 치환될 수 있고/거나;
v. 서열식별번호: 2의 위치 10에서의 아스파라긴 잔기가 아스파르테이트 또는 알라닌으로 치환될 수 있음;
c) CDR-H3: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 3;
d) CDR-L1: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 4;
e) CDR-L2: 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 5; 및
f) 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 CDR-L3: 서열식별번호: 6
중 적어도 3개를 포함하는 것인
단리된 항체.
A3.5. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고/거나;
여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고/거나;
여기서 항체는 서열식별번호: 7에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/거나;
여기서 항체는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인
단리된 항체.
A3.6. 실시양태 A3.5에 있어서,
서열식별번호: 7에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 8에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체.
A4. 실시양태 A1-A3.6 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 항체 SR-Ab1, SR-Ab2 또는 SR-Ab10 중 어느 하나와 경쟁하지 않는 항체.
A5. 실시양태 A1-A4 중 어느 하나에 있어서, IgG4 또는 IgG1 하위유형인 항체.
A5.1 실시양태 A1-A5 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체.
A5.2 실시양태 A1-A5.1 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체.
A5.3 실시양태 A1-A5.2 중 어느 하나에 있어서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체.
A5.4 실시양태 A1-A5.3 중 어느 하나에 있어서, 인간 GARP-TGFβ1 복합체 또는 GARP-TGFβ3 복합체에 결합하지 않는 항체.
A6. 실시양태 A1-A5.4 중 어느 하나의 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
A7. 실시양태 A6에 있어서, 정맥내 투여 또는 피하 투여를 위해 제조된 제약 조성물.
A8. 실시양태 A6 또는 A7의 제약 조성물을 함유하는 다중-용량 바이알을 포함하는 조성물.
A9. 실시양태 A6 또는 A7의 제약 조성물을 함유하는 단일-용량 시린지를 포함하며, 임의로 여기서 시린지는 일회용 시린지인 조성물.
A10. 실시양태 A6-A9 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체에서의 섬유화 상태의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물이며, 여기서 치료는 대상체에게 섬유화 장애의 치료에 유효한 양의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
A11. 실시양태 A10에 있어서, 섬유화 장애가 기관 섬유증인 조성물.
A12. 실시양태 A11에 있어서, 기관 섬유증이 진행성 기관 섬유증인 조성물.
A13. 실시양태 A10 또는 A11에 있어서, 기관 섬유증이 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 경피증, 근육 섬유증, 자궁 섬유증 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
A14. 실시양태 A10에 있어서,
a) 섬유화 장애가 만성 염증을 포함하고/거나;
b) 대상체가 면역 억제로부터 이익을 얻고/거나;
c) 대상체가 자가면역 질환을 갖거나 자가면역 질환이 발생할 위험이 있고/거나;
d) 대상체가 동종이식편 이식에 대한 후보이고/거나;
e) 대상체가 동종이식편 이식을 받은 것인
조성물.
A15. 실시양태 A10에 있어서, 만성 염증을 포함하는 섬유화 장애가 근육 이영양증, 다발성 경화증 (MS) 또는 낭성 섬유증 (CF)인 조성물.
A16. 실시양태 A15에 있어서, 근육 이영양증이 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)인 조성물.
A17. 실시양태 A15에 있어서, MS가 혈관주위 섬유증을 포함하는 것인 조성물.
A18. 실시양태 A13에 있어서, 폐 섬유증이 특발성 폐 섬유증 (IPF)인 조성물.
A19. 실시양태 A13에 있어서, 대상체가 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 것인 조성물.
A20. 실시양태 A13에 있어서, 대상체가 비알콜성 지방간염 (NASH)을 갖는 것인 조성물.
A21. 실시양태 A10-A20 중 어느 하나에 있어서, 항체가 대상체에게 0.1 내지 30 mg/kg의 투여량으로 투여되는 것인 조성물.
A22. 실시양태 A21에 있어서, 항체가 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회 또는 격월로 투여되는 것인 조성물.
A23. 실시양태 A21에 있어서, 치료 요법이 요법의 초기 단계 및 요법의 후속 단계를 포함하며,
여기서 대상체는 초기 단계 동안 부하 용량을 받고, 이어서 후속 단계 동안 유지 용량을 받는 것인 조성물.
A24. 실시양태 A21에 있어서, 부하 용량이 2-30 mg/kg이고, 유지 용량이 0.1-20 mg/kg인 조성물.
A25. 실시양태 A21에 있어서, 부하 용량이 대상체에게 1주 2회 또는 1주 1회 투여되는 것인 조성물.
A26. 실시양태 A21에 있어서, 유지 용량이 대상체에게 2-8주마다 1회 투여되는 것인 조성물.
A27. 실시양태 A10-A26 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플에서 TGFβ1, LTBP1 또는 LTBP3의 발현을 시험하거나 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
A28. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않으며, TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 또는 TGFβ3은 억제하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 실시양태 A6-A9 중 어느 하나에 따른 조성물의 제조 방법이며,
i) LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1을 포함하는 적어도 1종의 항원을 제공하는 단계;
ii) 단계 (i)의 적어도 1종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편의 제1 풀을 선택하여 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1의 특이적 결합제를 제공하는 단계;
iii) TGFβ1의 활성화를 억제하는 항체 또는 단편의 제2 풀을 선택하여 TGFβ1 활성화의 특이적 억제제를 생성하는 단계; 및
iv) 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편을 제약 조성물로 제제화하여 항체 또는 단편을 포함하는 조성물을 제조하는 단계
를 포함하는 방법.
A29. 실시양태 A28에 있어서, 항체 또는 단편의 제1 풀로부터, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1, 성숙 TGFβ1, GARP-프로TGFβ2, LRRC33-프로TGFβ2, 성숙 TGFβ2, GARP-프로TGFβ3, LRRC33-프로TGFβ3, 성숙 TGFβ3 또는 그의 임의의 조합에 결합하는 임의의 항체 또는 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A30. 실시양태 A28 또는 A29에 있어서, 단계 (ii) 및/또는 (iii)에서 선택된 항체 또는 단편의 이소형-특이성을 결정하거나 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A31. 실시양태 A28-A30 중 어느 하나에 있어서, 인간 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성인 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A32. 실시양태 A28-A31 중 어느 하나에 있어서, 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편의 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 단편을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A33. 실시양태 A28-A32 중 어느 하나에 있어서, 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A34. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 1, (CDR-H2) 서열식별번호: 2 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 3의 적어도 3개의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
A35. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 94, (CDR-H2) 서열식별번호: 95 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 96의 적어도 3개의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
A36. i) (CDR-H1) 서열식별번호: 100, (CDR-H2) 서열식별번호: 101 및 (CDR-H3) 서열식별번호: 102의 적어도 3개의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
A37. i) 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
A38. i) 서열식별번호: 88에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
A39. i) 서열식별번호: 106에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 제공하는 단계; 및
ii) 단계 (i)의 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
A40. 실시양태 A34-A39 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)가 돌연변이유발을 포함하는 것인 방법.
A41. 실시양태 A40에 있어서, 돌연변이유발이 CDR 내에서의 것인 방법.
A42. 실시양태 A40에 있어서, 돌연변이유발이 가변 영역 내에서의 것인 방법.
A43. 실시양태 A40에 있어서, 돌연변이유발이 불변 영역 내에서의 것인 방법.
A44. 실시양태 A34-A43 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)가 경쇄 셔플링을 포함하는 것인 방법.
SEQUENCE LISTING <110> SCHOLAR ROCK, INC. <120> LTBP COMPLEX-SPECIFIC INHIBITORS OF TGFBETA AND USES THEREOF <130> 127036-03020 <140> PCT/US2020/015915 <141> 2020-01-30 <150> 62/798,927 <151> 2019-01-30 <160> 401 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ala Arg Ala Pro Leu Gly Asn Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Val" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Ser" or "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Tyr" or "Arg" or "Val" or "Ile" or "His" or "Thr" or "Glu" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Asp" or "Glu" or "Asn" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Ala" or "Thr" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace="Gly" or "Thr" or "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace="Ala" or "Arg" or "Gln" or "Val" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="Glu" or "Lys" or "Gly" or "Thr" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace="Ile" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace="Leu" or "Gln" or "Val" or "Asn" or "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace="Arg" or "Asn" or "Glu" or "Lys" <220> <221> SITE <222> (1)..(14) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 397 Ala Arg Asp Pro Ser Tyr Asp Ser Ile Ala Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 398 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="Ala" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Thr" <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 398 Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 399 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Ala" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Ala" or "Tyr" or "Asp" or "Ser" or "Arg" or "His" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Gln" or "Ser" or "Gly" or "Lys" or "Glu" 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residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 400 Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 401 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Ala" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="Ala" or "Ser" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Thr" <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 401 Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 1 5 10

Claims (59)

  1. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
    여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고;
    여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    여기서 항체는 하기 6개의 CDR:
    a) CDR-H1: 서열식별번호: 94, 단
    i. 서열식별번호: 94의 위치 2에서의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환될 수 있고/거나;
    ii. 서열식별번호: 94의 위치 4에서의 아스파라긴 잔기가 알라닌, 티로신, 아스파르테이트, 세린, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
    iii. 서열식별번호: 94의 위치 5에서의 아스파라긴 잔기가 글루타민, 세린, 글리신, 리신, 글루타메이트, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있고/거나;
    iv. 서열식별번호: 94의 위치 6에서의 티로신 잔기가 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나;
    v. 서열식별번호: 94의 위치 7에서의 프롤린 잔기가 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 아스파라긴, 발린, 아스파르테이트 또는 글루타민으로 치환될 수 있고/거나;
    vi. 서열식별번호: 94의 위치 8에서의 이소류신 잔기가 메티오닌 또는 류신으로 치환될 수 있고/거나;
    vii. 서열식별번호: 94의 위치 9에서의 히스티딘 잔기가 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 또는 세린으로 치환될 수 있음;
    b) CDR-H2: 6개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 95;
    c) CDR-H3: 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 96;
    d) CDR-L1: 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 97;
    e) CDR-L2: 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 98; 및
    f) CDR-L3: 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 서열식별번호: 99
    중 적어도 3개를 포함하는 것인
    단리된 항체.
  2. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하고, 인간 GARP-프로TGFβ 복합체에는 결합하지 않는 단리된 항체이며,
    여기서 항체는 성숙 TGFβ1, 성숙 TGFβ2 또는 성숙 TGFβ3에는 결합하지 않고/거나;
    여기서 항체는 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고/거나;
    여기서 항체는 서열식별번호: 88에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/거나;
    여기서 항체는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인
    단리된 항체.
  3. 하기 6개의 CDR:
    a) 아미노산 서열 FTF(X1)(X2)YVMH를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 R이고; X2는 G 또는 S인 CDR-H1;
    b) 아미노산 서열 (X1)ISHEG(X2)(X3)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 S이고; X2는 S 또는 G이고; X3은 F 또는 L인 CDR-H2;
    c) 아미노산 서열 (X1)(X2)P(X3)(X4)(X5)(X6)RRGG(X7)(X8)(X9)를 포함하며, 여기서 X1은 A 또는 V이고; X2는 R, V, G 또는 K이고; X3은 R, H 또는 L이고; X4는 I, V 또는 G이고; X5는 A, S 또는 L이고; X6은 A 또는 V이고; X7은 F 또는 Y이고; X8은 D, G, R 또는 S이고; X9는 Y, G, R, L, V, A 또는 K인 CDR-H3;
    d) 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 CDR-L1;
    e) 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 CDR-L2; 및
    f) 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는, 서열식별번호: 99에 제시된 바와 같은 CDR-L3
    중 적어도 3개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    b) CDR-H2 내에서: X2가 S이고;
    c) CDR-H3 내에서: X1이 A이고; X2가 R 또는 V이고; X3이 R이고; X4가 I이고; X5가 A 또는 L이고; X6이 A이고; X7이 F이고; X8이 G이고; X9가 Y인
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 88에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열식별번호: 89에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이하의 아미노산 변화가 2개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 특이적인 항체.
  11. 하기 6개의 CDR:
    a) 아미노산 서열 FTFRSYVMH를 포함하는 CDR-H1;
    b) 아미노산 서열 VISHEGS(X1)KYYADSVKG를 포함하며, 여기서 X1은 L 또는 G인 CDR-H2;
    c) 아미노산 서열 A(X1)PRIAARRGGFG(X2)를 포함하며, 여기서 X1은 V, R 또는 L이고; X2는 Y, S 또는 T인 CDR-H3;
    d) 아미노산 서열 TRS(X1)G(X2)ID(X3)NYVQ를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 H이고; X2는 N, L, S 또는 A이고; X3은 N, D 또는 Y인 CDR-L1;
    e) 아미노산 서열 ED(X1)(X2)RPS를 포함하며, 여기서 X1은 N, F 또는 A이고; X2는 Q, I 또는 V인 CDR-L2; 및
    f) 아미노산 서열 Q(X1)YD(X2)(X3)(X4)Q(X5)VV를 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 S, F, Y, D, H 또는 W이고; X3은 N, D 또는 S이고; X4는 N, A, L, E 또는 T이고; X5는 G, R, A 또는 L인 CDR-L3
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, CDR-H3 내에서: X1이 R 또는 L인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, CDR-L3 내에서: X2가 Y인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, CDR-L3 내에서: X3이 D이고; X4가 T인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제13항에 있어서, CDR-L3 내에서: X3이 D이고; X4가 N이고; X5가 A인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제12항에 있어서,
    CDR-L1 내에서: X1이 S 또는 H이고; X2가 N 또는 A이고; X3이 N, D 또는 Y이고;
    CDR-L2 내에서: X1이 N 또는 F이고; X2가 Q 또는 V이고;
    CDR-L3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 S, Y, D 또는 W이고; X3이 D 또는 S이고; X4가 N, L 또는 T이고; X5가 G, R, A 또는 L인
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    CDR-L1 내에서: X1이 S이고; X2가 N이고; X3이 N 또는 Y이고;
    CDR-L2 내에서: X1이 N이고; X2가 Q 또는 V이고;
    CDR-L3 내에서: X1이 S 또는 G이고; X2가 S, Y 또는 W이고; X3이 D이고; X4가 N 또는 T이고; X5가 G, R 또는 A인
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, CDR-L3 내에서: X1이 S이고; X2가 S 또는 Y이고; X3이 D이고; X4가 N 또는 T이고; X5가 G, R 또는 A인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, CDR-L3 내에서: X1이 S이고; X2가 Y이고; X3이 D이고; X4가 N 또는 T이고; X5가 G 또는 A인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, CDR-L3 내에서: X1이 S이고; X2가 Y이고; X3이 D이고; X4가 T이고; X5가 G인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) CDR-H1이 서열식별번호: 166의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) CDR-H2가 서열식별번호: 167의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) CDR-H3이 서열식별번호: 168의 아미노산 서열을 포함하고;
    d) CDR-L1이 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하고;
    e) CDR-L2가 서열식별번호: 170의 아미노산 서열을 포함하고;
    f) CDR-L3이 서열식별번호: 171의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 318에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열식별번호: 319에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 318에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 인간 LTBP1-TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하고, 서열식별번호: 318에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 319에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 검정 조건 하에 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우의 KD보다 적어도 50배 더 낮은 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및/또는 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  27. 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 대한 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 검정 조건 하에 BLI에 의해 측정시, LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  28. 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, SPR에 의해 측정시, 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대해 적어도 45분의 1가 절반-결합-시간 (t½)을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  29. 제28항에 있어서, SPR에 의해 측정시, 각각의 hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 5분 미만의 1가 t½을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 5 nM, 임의로 < 1 nM의 KD로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 인간 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 LTBP1-프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 LTBP3-프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정시 < 10 nM의 KD로 마우스 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 및 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체와 각각 < 5 nM 또는 임의로 < 1 nM의 KD로 교차-반응하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG4 또는 IgG1 하위유형이고, 임의로 항체가 인간 IgG4 하위유형이고, IgG1-유사 힌지를 생성하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 정맥내 투여 또는 피하 투여를 위해 제조된 제약 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항의 제약 조성물을 함유하는 다중-용량 바이알을 포함하는 조성물.
  40. 제37항 또는 제38항의 제약 조성물을 함유하는 단일-용량 시린지를 포함하며, 임의로 여기서 시린지는 일회용 시린지인 조성물.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체에서의 섬유화 상태의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물이며, 여기서 치료는 대상체에게 섬유화 장애의 치료에 유효한 양의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 섬유화 장애가 기관 섬유증인 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 기관 섬유증이 진행성 기관 섬유증인 조성물.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 기관 섬유증이 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 경피증, 근육 섬유증, 자궁 섬유증 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 폐 섬유증이 특발성 폐 섬유증 (IPF)인 조성물.
  46. 제44항에 있어서, 대상체가 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 것인 조성물.
  47. 제44항에 있어서, 간 섬유증이 비알콜성 지방간염 (NASH)과 연관된 것인 조성물.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체에게 0.1 내지 30 mg/kg의 투여량으로 투여되는 것인 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 항체가 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회 또는 격월로 투여되는 것인 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 치료 요법이 요법의 초기 단계 및 요법의 후속 단계를 포함하며, 여기서 대상체는 초기 단계 동안 부하 용량을 받고, 이어서 후속 단계 동안 유지 용량을 받는 것인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 부하 용량이 2-30 mg/kg이고, 유지 용량이 0.1-20 mg/kg인 조성물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 부하 용량이 대상체에게 1주 2회 또는 1주 1회 투여되는 것인 조성물.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 유지 용량이 대상체에게 2-8주마다 1회 투여되는 것인 조성물.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플에서 TGFβ1, LTBP1 또는 LTBP3의 발현을 시험하거나 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  55. 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조성물의 제조 방법이며,
    i) 적어도 45분의 t½로 인간 LTBP1-프로TGFβ 복합체 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ 복합체로부터 해리되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계, 및
    ii) 항체 또는 단편을 제약 조성물로 제제화하여 항체 또는 단편을 포함하는 조성물을 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 세포-기반 검정에 의해 측정시 < 5 nM, 임의로 < 2 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 생체내 전임상 모델에서 효능을 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 임의로 전임상 모델은 간 섬유증 모델, 신장 섬유증 모델 또는 심장 섬유증 모델인 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성인 항체 또는 단편을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 제1 풀 및 항체의 제2 풀에 존재하는 항체 또는 단편을 친화도 성숙 및/또는 최적화에 적용하여 친화도 성숙 및/또는 최적화된 항체 또는 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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