CN1984931B - 抗-cd3抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于抗原CD3的抗体及这种抗体的使用。特别地，本发明提供了完全人单克隆CD3抗体。提供了编码重链和轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列，和包括重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列，尤其提供了包括重链和轻链免疫球蛋白分子的特殊序列，和对应重跨越骨架区和/或补体决定区(CDR’s)的邻接重链和轻链的特殊序列，具体提供了从FR1经FR4或从CDR1经CDR3的重链或轻链。也提供了表达这种免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂种瘤细胞或其他细胞株。

Description

抗-CD3抗体及其使用方法

技术领域

本发明主要关于完全人抗-CD3抗体及其使用方法。

背景介绍

人体免疫系统起到抵抗多种病症的作用，这些病症包括，例如，受伤、感染和肿瘤，并且人体免疫系统被两种独立但相互关联的系统介导，这种两种系统为细胞免疫系统和体液免疫系统。总的来说，被称作抗体或免疫球蛋白的可溶物介导体液系统，可溶物具有联合和中和被体系识别的外来物的能力。相反，细胞免疫系统包括某些细胞的动员，这些细胞被命名为T-细胞，起到了治疗作用。

人和动物的免疫系统包括两种主要类别的淋巴细胞：胸腺产生的细胞(T细胞)和骨髓产生的细胞(B细胞)。成熟的T细胞自胸腺和组织，淋巴腺和血流之间循环产生。T细胞显示出免疫学特性并直接包括在细胞介导免疫反应(如移植排斥)中。T细胞起到抵抗或适应多种外来组织(抗原)的作用。在许多情况下，这些外来抗原在宿主细胞上表达引起感染。然而，外来抗原也来自于被肿瘤形成或感染改变的宿主细胞。但是T细胞本身不分泌抗体，它们通常需要第二类的淋巴细胞，B细胞分泌抗体。

存在多种T细胞亚群，其一般由T细胞表面上发现的抗原决定簇，以及功能活性和外来抗原识别来确定。一些T细胞亚群，例如CD8⁺细胞，为致死/抑制细胞，其在免疫系统中起到调节作用，而另外的一些亚群，如CD4⁺细胞，起到促进炎性反应和体液反应的作用。

人外周血T淋巴细胞能受到多种试剂包括外源抗原、单克隆抗原和外源凝集素如植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白A的刺激进行有丝分裂。尽管活化大概通过有丝分裂原与细胞膜上的特殊位点结合而发生，但是对于这些受体的性质和它们活化机理并不十分了解。诱发的增殖仅为T细胞活化的一种显示。活化的另一种显示，定义为基底细胞或休眠细胞中的改变，包括增强的淋巴细胞因子生成和细胞毒细胞活性。

T细胞活化为一种复杂现象，依赖于在T细胞群上表达的多种细胞表面分子的参与。例如，抗原特异性T细胞受体(TcR)由包含两种克隆分布的二硫键异性双聚体和完整膜糖蛋白链组成，其中完整膜糖蛋白链，α和β，或γ和δ，非共价连接普遍指定为CD3(曾经统称为T3)的低分子量非变异蛋白的复合物。

TcRα和β链确定了抗原特异性。CD3结构代表附属分子，一经TcRαβ与其配体结合就引发，成为活化信号的转导元素。TcR的糖蛋白链既存在恒定区，又存在可变区(多态性)。多态TcR可变区确定了具有明显特异性的T细胞亚群。不同于识别作为抗原的全部或较小片段外源蛋白的抗体，TcR复合物仅与抗原的小肽相互作用，这些抗原的小肽一定存在于主要的组织相容性复合物(MHC)分子的环境中。这些MHC蛋白代表另外的随机分布该种类中的高度多态分子。因此，活化经常要求TcR与结合主要MHC蛋白的外源肽类抗原的三方相互作用。

发明内容

本发明提供了特异性定向抗CD3的完全人单克隆抗体。代表性单克隆抗体包括这里描述的28F11、27H5、23F10和15C3。可供选择地，单克隆抗体为结合28F11、27H5、23F10和15C3相同表位的抗体。这里分别提到的抗体为人CD3抗体。人CD3抗体具有一个或更多个下列特征：抗体结合CD3阳性细胞(CD3+)但不结合阴性细胞(CD3-)；人CD3抗体诱发抗原调变，该抗原调变包括细胞表面表达水平的改变(如，降低)，或CD3或T细胞受体r(TcR)活性的改变；人CD3抗体抑制小鼠抗人OKT3单克隆抗体结合T-淋巴细胞；或人CD3抗体结合CD3表位，该CD3表位全部或部分包括氨基酸序列EMGGITQTPYKVSISGT(序列号：21)。本发明的人CD3抗体与小鼠抗CD3抗体OKT3竞争结合CD3，并且与人CD3抗体接触在不影响CD2、CD4或CD8细胞表面表达的情况下，除去或掩蔽CD3和/或TcR。CD3和/或TcR的掩蔽导致T细胞活化的损失或减少，当发生无受控T细胞活化时，这种损失或减少是在自体免疫疾病中所期望的。与使用传统免抑制疫力药物如环孢菌素时所观察到的暂时抑制相比，CD3下调导致被延长的T细胞活化减少作用，例如，延长到至少几个月时间。

抗原调变是指对细胞如淋巴细胞表面上的CD3-T细胞受体复合物进行重新分配和清除。细胞表面表达水平的降低或细胞上TcR活性的降低意味着TcR数量或功能的减少。细胞表面表达水平或CD3活性的调变意味着细胞表面上CD3的数量或CD3的功能的改变，例如，减少。通过例如，用人CD3抗体接触细胞，或通过CD3或TcR的内化作用减少CD3的数量或在细胞血浆膜上表达的TcR。可供选择地，人CD3抗体一经接触细胞，CD3或TcR就被掩蔽。

抑制小鼠抗人OKT3单克隆抗体结合T淋巴细胞被定义为小鼠OKT3抗体形成具有T淋巴细胞表面上CD3的复合物能力的降低。

人CD3抗体包含具有序列号为：2、6、10或22氨基酸序列的可变区重链和具有序列号：4、8、16-20或25-26氨基酸序列的可变区轻链。优选地，三条重链CDRs包括氨基酸序列与选自由GYGMH(序列号：27)；VIWYDGSKKYYVDSVKG(序列号：28)；QMGYWHFDL(序列号：29)；SYGMH(序列号：33)；IIWYDGSKKNYADSVKG(序列号：34)；GTGYNWFDP(序列号：35)；和AIWYNGRKQD YADSVKG(序列号：44)组成组的序列有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多同源性，并且具有三条CDR的轻链包括氨基酸序列与选自由RASQSVSSYLA(序列号：30)；DASNRAT(序列号：31)；QQRSNWPPLT(序列号：32)；RASQS VSSS YLA(序列号：36)；GASSRAT(序列号：37)；QQYGSSPIT(序列号：38)；RASQGISSALA(序列号：39)；YASSLQS(序列号：40)；QQYYSTLT(序列号：41)；DASSLGS(序列号：42)；WASQGISSYLA(序列号：43)；QQRSNWPWT(序列号：45)；DASSLES(序列号：46)；和QQFNSYPIT(序列号：47)组成组的序列有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多同源性。抗体结合CD3。

本发明的人CD3抗体显示出至少两种或更多(例如，两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、八种或更多、九种或更多、十种或更多、十一种或更多)的下列特征：抗体包含由人DP50V_H胚系基因序列编码的重链可变区(V_H)，或与人DP50V_H胚系基因序列同源的核酸序列；抗体包含由人L6V_L胚系基因序列编码的轻链可变区(V_L)，或与人L6V_L胚系基因序列同源的核酸序列；抗体包含由人L4/18a V_L胚系基因序列编码的轻链可变区(V_L)；抗体包括V_HCDR1区域，该V_H CDR1区域包括氨基酸序列YGMH(序列号：58)；抗体包括V_H CDR2区域，该V_H CDR2区域包括氨基酸序列DSVKG(序列号：59)；抗体包括V_H CDR2区域，该V_H CDR2区域包括氨基酸序列IWYX1GX2X3X4X5Y X6DSVKG(序列号：60)；抗体包括V_H CDR3区域，该V_H CDR3区域包括氨基酸序列XAXBG YXCXDFDXE(序列号：61)；抗体包括V_H CDR3区域，该V_H CDR3区域包括氨基酸序列GTGYNWFDP(序列号：62)或氨基酸序列QMGYWHFDL(序列号：63)；抗体包括CDR3区域C末端处的氨基酸序列VTVSS(序列号：64)，其中该位置处在CDR3区域的C末端可变区；抗体包括CDR3区域C末端处的氨基酸序列GTLVTVSS(序列号：65)，其中该位置处在CDR3区域的C末端可变区；抗体包括CDR3区域C末端处的氨基酸序列WGRGTLVTVSS(序列号：66)，其中其中该位置处在CDR3区域的C末端可变区；抗体结合全部或部分包括氨基酸序列EMGGITQTPYKVSISGT(序列号：67)的表位；并且抗体包括在位点234、235、265、或297或其组合位点处的氨基酸残基重链中的突变，并且其中，跟不包括位点234、235、265、或297或其组合位点处氨基酸残基重链中突变的抗体的存在下而从T细胞中释放出的细胞因子相比较，在上述抗体存在下而从T细胞中释放出的细胞因子被减少。这里描述的重链残基的编号为EU index的编码(参见Kabat等人，″Proteins of Immunological Interest″，US Dept.of Health&Human Services(1983))，按照所示，例如在美国专利Nos.5,624,821和5,648,260种，其中的内容通过引证全部合并于本文中。

在一些方面中，人CD3抗体包含氨基酸突变。该突变在稳定区。突变导致改变效应功能的抗体。抗体的效应功能通过变化，即增强或减少抗体对效应分子如Fc受体或补体成分的亲合力而被改变。通过改变抗体的效应功能，可能控制多方面的免疫反应，如增强或抑制免疫系统的多种反应。例如，突变导致抗体能减少从T细胞中释放出细胞因子。例如，突变在氨基酸残基234、235、265、或297或其组合的重链中。优选地，突变产生了或者位于位点234、235、265、或者297处的丙氨酸残基，或者位于位点235处谷氨酸残基，或者它们的结合。术语“细胞因子”统指该领域中所知的所有人细胞因子，该人细胞因子结合细胞表面上表达的细胞外受体，从而调节细胞功能，其包括但不限于IL-2、IFN-γ、TNF-a、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-I0、和IL-13

释放细胞因子能导致周知的细胞因子释放综合症(CRS)的中毒情况，是使用抗T细胞抗体如ATG(抗胸腺细胞球蛋白)和OKT3(小鼠抗人CD3抗体)时发生的常见临床并发症。该综合症以细胞因子如TNF、IFN-γ和IL-2过度释放到循环中为特征。由于抗体同时结合CD3(经过抗体的可变区)和其他细胞上的Fc受体和/或补充受体(经抗体的恒定区)而发生CRS，从而活化T细胞释放细胞因子，产生以血压过低、发热和颤栗为特征的全身性炎性反应。CRS的症状包括发烧、寒战、恶心、呕吐、血压过低、和呼吸困难。因此，本发明的人CD3抗体包含一种或一种以上突变，该突变体内阻止一个或更多个细胞因子的重链恒定区介导释放。

本发明的完全人CD3抗体包括，如Fc区域内L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变，使得一经接触人CD3抗体细胞因子释放就显著性减少或消除(参见如图11A、11B)。如下面的实施例4种描述的，当人白细胞接触人CD3抗体时，本发明人CD3抗体的Fc区域内L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变减少或消除细胞因子释放，然而下面描述的突变保持了显著性的细胞因子释放能力。例如，细胞因子释放的显著性减少通过一经接触具有Fc区域内L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变的人CD3抗体而释放的细胞因子与一经接触具有一个或多个下面被描述的突变的另外抗人CD3抗体而释放细胞因子水平进行比较而被确定。Fc区域内其他突变包括，例如L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵、L²³⁵→E²³⁵、N²⁹⁷→A²⁹⁷、和D²⁶⁵→A²⁶⁵。

可供选择地，人CD3抗体由包括一个或更多个突变的核酸编码，该突变用胚系核酸残基替换核酸残基。“胚系核酸残基”是指天然发生在编码稳定区或可变区的胚系基因中的核酸残基。“胚系基因”为在生殖细胞(例如制定成为卵或在精液中的细胞)中发现的DNA。“胚系突变”统指特殊DNA的遗传改变，该特殊DNA存在于生殖细胞或单细胞阶段的受精卵中，当传给后代时，这种突变掺入到体内的每个细胞中。胚系突变与体细胞突变形成对比，该体细胞突变在单个体细胞中发生。在一些情况中，胚系DNA序列编码可变区中的核苷酸发生突变(例如，体细胞突变)并且被不用的核苷酸所取代。因此，本发明的抗体包括一个或更多个突变，该突变用胚系核酸残基替换核酸残基。胚系抗体基因包括，例如，DP50(存取编号：IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ：L06618)，L6(存取编号：IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ：X01668)和L4/18a(存取编号：EMBL/GenBank/DDBJ：Z00006)。

人CD3抗体重链源自生殖系V(可变)基因如，DP50胚系基因。DP50胚系基因的核酸和氨基酸序列包括，例如，下面所示核酸和氨基酸序列：

tgattcatgg agaaatagag agactgagtg tgagtgaaca tgagtgagaa aaactggatt

tgtgtggcat tttctgataa cggtgtcctt ctgtttgcag gtgtccagtg tcaggtgcag

ctggtggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca

gcgtctggat tcaccttcag tagctatggc atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag

gggctggagt gggtggcagt tatatggtat gatggaagta ataaatacta tgcagactcc

gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg

aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagagacac ag  (SEQ IDNO：68)

VQCQVQLVES GGGVVQPGRS LRLSCAASGF TFSSYGMHWV RQAPGKGLEW VAVIWYDGSN

KYYADSVKGR FTISRDNSKN TLYLQMNSLR AEDTAVYYCA R  (SEQ ID NO：69)

本发明的人CD3抗体包括人DP50V_H胚系基因序列编码的重链可变区(V_H)。DP50V_H胚系基因序列如图5中的序列号：48中所示。本发明的人CD3抗体包括重链可变区(V_H)，编码该重链可变区(V_H)的核酸序列与DP50V_H胚系基因序列有至少80％的同源性。优选地，该核酸序列与DP50V_H胚系基因序列有至少90％、95％、96％、97％的同源性，并且更优选地，与DP50V_H胚系基因序列有至少98％、99％的同源性。人CD3抗体重链可变区(V_H)与由DP50VH胚系基因序列编码的重链可变区(V_H)氨基酸序列有至少80％的同源性。优选地，人CD3抗体重链可变区(V_H)氨基酸序列与由DP50V_H胚系基因序列编码的氨基酸序列有至少90％、95％、96％、97％的同源性，更优选地，与DP50V_H胚系基因序列编码的序列有至少98％、99％的同源性。

本发明的人CD3抗体也包括由人L6或L4/18a V_L胚系基因序列编码的轻链可变区(V_L)。人L6V_L胚系基因序列如图6中的序列号：74中所示，并且人L4/18a轻链可变区(V_L)胚系基因序列如图7中的序列号：53中所示。可供选择地，人CD3抗体包括轻链可变区(V_L)，编码该轻链可变区(V_L)的核酸序列与或者L6或者L4/18a V_L胚系基因序列有至少80％的同源性。优选地，核酸序列与或者L6或者L4/18a V_L胚系基因序列有至少90％、95％、96％、97％的同源性，并且更优选与或者L6或者L4/18a V_L胚系基因序列有至少98％、99％的同源性。

本发明的人CD3抗体具有例如，来自DP50胚系的部分保守氨基酸序列。例如，人CD3抗体CDR1区域具有至少邻接氨基酸序列YGMH(序列号：58)。

人CD3抗体的CDR2包括，如至少邻接氨基酸序列DSVKG(序列号：59)。例如，CDR2区域包括邻接氨基酸序列IWYX₁GX₂X₃X₄X₅YX₆DSVKG(序列号：60)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅和X₆代表一些氨基酸。例如，X₁、X₂、X₃和X₄是亲水性氨基酸。在一些本发明的人CD3抗体中，X₁为天冬酰胺酸或天冬氨酸，X₂为精氨酸或丝氨酸，X₃为赖氨酸或天冬酰胺酸，X₄为赖氨酸或谷氨酰胺，X₅为天冬氨酸、天冬酰胺酸或酪氨酸，和/或X₆为缬氨酸或丙胺酸。例如，VH CDR2区域包括选自由AIWYNGRKQDYADSVKG(序列号：69)，IIWYDGSKKNYADSVKG(序列号：70)、VIWYDGSKKYYVDSVKG(序列号：71)和VIWYDGS NKYY ADSVKG(序列号：72)组成组的氨基酸序列。

人CD3抗体的CDR3包含，例如，至少邻接氨基酸序列X_AX_BGYX_CX_DFDX_E(序列号：61)，X_A、X_B、X_c、X_D、和X_E代表一些氨基酸。在一些本发明的人CD3抗体中，X_A和X_B为中性氨基酸。例如，X_A为干氨酸或谷氨酰胺，X_D为芳香族氨基酸，和/或其中X_E为憎水性氨基酸。例如，X_A为干氨酸或谷氨酰胺，X_B为苏氨酸或蛋氨酸，X_c为天冬酰胺酸或色氨酸，X_D为色氨酸或组氨酸，和/或X_E为脯氨酸或亮氨酸。例如，CDR3区域包括或者邻接氨基酸序列GTGYNWFDP(序列号：62)或者邻接氨基酸序列QMGYWHFDL(序列号：63)。

人CD3抗体包括骨架区2(FRW2)，该骨架区2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWV(序列号：73)。本发明的人CD3抗体包括骨架区3(FRW3)，该骨架区3包含氨基酸序列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(序列号：74)。

一些人CD3抗体包括CDR3区C末端处邻接氨基酸序列VTVSS(序列号：64)。例如，抗体包含CDR3区C末端处邻接氨基酸序列GTLVTVSS(序列号：65)。其他的人CD3抗体包括CDR3区C末端处邻接氨基酸序列WGRGTLVTVSS(序列号：66)。序列号：66中的精氨酸残基在如，28F11人CD3抗体(序列号：2)和23F10人CD3抗体(序列号：6)的重链可变区(VH)序列中显示出。

在另一方面中，本发明提供了通过对主体进行人CD3抗体给药来治疗、预防或缓解免疫相关紊乱综合症的方法。任选地，进一步用第二种药物例如，但不限于，抗炎性化合物或免抑制疫力化合物对主体给药。例如，患有I型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病的主体也被施用第二种药物如，GLP-I或β细胞静息化合物(例如，减少或另外抑制胰岛素释放的化合物，例如钾离子通道开放剂)。

适宜的化合物包括，但不限于氨甲叶酸、环胞霉素A(包括，如环胞霉素微乳剂)、他克莫司(tacrolimus)、皮质类固醇、干扰素β、Remicade(英利昔单抗)、Enbrel(依坦西普)和Humira(阿达木单抗)。

主体正在经受或易于发展为免疫相关紊乱，如自体免疫疾病或炎性病症。

在其他方面，本发明提供了在器官或组织移植之前、期间和/或之后，对主体进行本发明的人CD3抗体给药。例如，本发明的人CD3抗体用于治疗或预防器官或组织移植后的排斥。

附图详述

图1为一系列人CD3抗体28F11的轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图1A描述了编码重链可变区的核苷酸序列，图1B表示编码图1A中所示核苷酸序列的氨基酸序列，其中CDRs用框符重点突出。图1C描述了编码轻链可变区的核苷酸序列，并且图1D表示由图1C中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中CDRs用框符进行说明。

图2为一系列人CD3抗体23F10的轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列，用图2A描述编码重链可变区的核苷酸序列，图2B描述了由图2A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图2C描述了编码轻链可变区的核苷酸序列，并且图2D描述了图2C中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

图3为一系列人CD3抗体27H5的轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图3A描述了编码重链可变区的核苷酸序列；图3B描述了由图3A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；图3C描述了编码27H5细胞系的轻链可变区的5个核苷酸序列；图3D描述了图3C中所示的核苷酸序列编码的5个氨基酸序列；并且图3E为细胞系27H5的5个轻链区队列，其中最后一排中的星号(^*)(标记KEY)表示那个纵队中的保守氨基酸；KEY排中的细胞系(：)表示保守突变；KEY排中的句点(.)表示半保守突变。

图4为一系列人CD3抗体15C3的轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列，用图4A表示编码重链可变区的核苷酸序列，图4B描述了由图4A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图4C描述了编码15C3细胞系得轻链可变区的两个核苷酸序列，并且图4D描述了图4C中所示的核苷酸序列编码的两个氨基酸序列。

图5为描述15C3、27H5和28F11人CD3抗体的重链可变区以及DP-50胚系序列，人重链连接5-02序列，和人重链连接2序列的队列。CDR区域对每个序列进行说明。

图6为描述15C3(轻链可变区1，例如″VL1″)和28F11人CD3抗体的V_KIII可变区，以及L6胚系序列，人κ连接4序列和人κ连接1序列的队列。CDR区对每个序列进行说明。

图7为描述15C3V_κI可变区(轻链可变区2，如″VL2″)和27H5VL2人CD3抗体，以及L4/18a胚系序列，人κ连接4序列和人κ连接5序列的队列。CDR区对每个序列进行说明。

图8为描述27H5VL1人CD3抗体和DPK22的V_KII可变区，以及人κ连接5序列的队列。CDR区对每个序列进行说明。

图9A为在Jurkat细胞表面，使用多种抗CD3抗体，包括本发明的28F11，27H5VL1，27H5VL2，15C3VL1和15C3VL2人CD3抗体，描述抗体结合CD3分子的曲线图。图9B为曲线图，其描述了多种抗CD3抗体，包括本发明的28F11，27H5VL1，27H5VL2，15C3VL1和15C3VL2人CD3抗体，抑制小鼠抗CD3抗体OKT3结合CD3阳性细胞的能力。图9C为曲线图，其描述了通过多种抗CD3抗体，包括本发明的28F11，27H5VL1，27H5VL2，15C3VL1和15C3VL2人CD3抗体，抗原性调制人外周血T细胞表面的CD3和TCR。图9D为曲线图，其描述了多种抗CD3抗体，包括本发明的28F11，27H5VL1，27H5VL2，15C3VL1和15C3VL2人CD3抗体，对T细胞增殖的影响。

图10为图例，其描述了源自CD3ε链的氨基酸序列的肽队列中完全人单克隆抗体28F11的结合模式。

图11为一系列曲线图，其描述了一经接触野生型28F11人CD3抗体(28F11WT)、具有L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变(28F11AA)的突变28F11人CD3抗体、和具有L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变(28F11AE)的突变28F11人CD3抗体后细胞因子的释放水平。图11A描述了一经接触这些抗体后TNF-α释放水平，并且11B描述了干扰素γ释放水平。

具体实施方式

本发明提供了特异性抗CD3ε链(CD3ε)的完全人单克隆抗体。这里，抗体统指人CD3抗体。

CD3为成熟的T淋巴细胞中至少5个膜结合多肽的复合物，该成熟的T淋巴细胞彼此并和T细胞受体非共价键结合。CD3复合物包括γ、δ、ε、ζ和η链(也统称亚群)。已经研发出抗这些链中的一些的非人单克隆抗体，例如大鼠抗体OKT3、SP34、UCHT1或64.1.(参见，如June等人的文献J.Immunol.136：3945-3952(1986)；Yang等人的文献J.Immunol.137：1097-1100(1986)；和Hayward等人的文献Immunol.64：87-92(1988))。

本发明的人CD3抗体通过对两种转基因小鼠HuMab^TM小鼠和KM^TM小鼠(Medarex，Princeton NJ)进行免疫处理制得。

本发明的人CD3抗体具有一个或更多个下面特征：人CD3抗体结合CD3阳性细胞(CD3+)但不结合CD3阴性细胞(CD3-)；人CD3抗体诱发抗原调变，该抗原调变涉及CD3或T细胞受体(TcR)的细胞表面表达水平的改变；或人CD3抗体抑制大鼠抗人OKT3单克隆抗体结合T-淋巴细胞；本发明的人CD3抗体与大鼠抗CD3抗体OKT3竞争结合CD3，和/或与人CD3抗体接触在不影响CD2、CD4或CD8细胞表面表达的情况下，除去或掩蔽CD3和/或TcR。CD3和/或TcR的屏蔽导致T细胞活化的损失或减少。

本发明的人CD3抗体结合CD3，该CD3全部或部分包括经过处理的人CD3ε亚群的27位点到43位点处氨基酸片段(例如，在无先导序列情况下)。人CD3ε亚群的氨基酸序列被列出，例如在GenBank登录号Nos.NP_000724；AAA52295；P07766；A32069；CAA27516；和AAH49847中被列出。例如，人CD3抗体结合CD3表位，该CD3表位完全或部分包括氨基酸序列EMGGITQTPYKVSISGT(序列号：67)。举例说明的人CD3单克隆抗体结合表位，该表位为这里描述的28F11。28F11抗体包括序列号：1中所示的核酸序列编码的重链可变区(序列号：2)，和序列号：3中所示的核酸序列编码的轻链可变区(序列号：4)(图1A-1D)。

氨基酸包括如Chothia等人在1989年，E.A.Kabat等人在1991年定义的互补决定区(CDR)，该互补决定区(CDR)用框符重点突出(参见图1B和1D和图5和6)。(参见Chothia，C，等人的文献Nature 342：877-883(1989)；Kabat，EA，等人的文献Sequences of Protein of immunological interest，Fifth Edition，USDepartment of Health和Human Services，US GovernmentPrintingOffice(1991))。28F11抗体的重链互补决定区(CDR)具有下列序列：GYGMH(序列号：27)VIWYDGSKK YYVDSVKG(序列号：28)和QMGYWHFDL(序列号：29)。28F11抗体的轻链互补决定区(CDR)具有下列序列：RASQSVSSYLA(序列号：30)DASNRAT(序列号：31)和QQRSNWPPLT(序列号：32)。

>28F11 VH核苷酸序列：(SEQ ID NO：1)

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCAAGTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG

CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAAGAAATAC

TATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT

GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAC

AAATGGGCTACTGGCACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA

>28F11VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：2)

>28F11VL核苷酸序列：(SEQ ID NO：3)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC

CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAC

CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCA

GCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA

GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTT

TCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>28F11VL氨基酸序列：(SEQ ID NO：4)

23F10抗体包括序列号：5中所示的核酸序列编码的重链可变区(序列号：6)，和序列号：7中所述的氨基酸序列编码的轻链可变区(序列号：8)。

氨基酸包括Chothia等人在1989年，E.A.Kabat等人在1991年定义的互补决定区(CDR)，该互补决定区(CDR)用框符重点突出(参见图2B和2D)。23F10抗体的重链互补决定区(CDR)具有下列序列：GYGMH(序列号：27)VIWYDGSKKYYVDSVKG(序列号：28)和QMGYWHFDL(序列号：29)。23F10抗体的轻链互补决定区(CDR)具有下列序列：RASQSVSSYLA(序列号：30)DASNRAT(序列号：31)和QQRSNWPPLT(序列号：32)。

>23F10 VH核苷酸序列：(SEQ ID NO：5)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGGGGAGGCGTGGTCCAGTCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCAAGTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG

CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAAGAAATAC

TATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT

GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAC

AAATGGGCTACTGGCACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA

>23F10 VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：6)

>23F10 VL nucleotide核苷酸序列：(SEQ ID NO：7)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC

CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAC

CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCA

GCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA

GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTT

TCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>23F10 VL氨基酸序列(SEQ ID NO：8)

27H5抗体包括序列号：9中所示的核酸序列编码的重链可变区(序列号：10)，和选自序列号：16-20中所示序列，并由序列号：11-15中所示的核酸序列编码的轻链可变区氨基酸序列。如这里描述的实施例2，源自

基因改造小鼠的单克隆杂种瘤细胞能为单一重链产生多重轻链。按照这里的实施例2中描述的，对产生的重链和轻链的每个组合的最佳机能进行测试。

氨基酸包括Chothia等人在1989年，E.A.Kabat等人在1991年定义的互补决定区(CDR)，该互补决定区(CDR)用框符重点突出(参见图3B、3D、5、和7-8)。27H5抗体的重链互补决定区(CDR)具有下列序列：SYGMH(序列号：33)IIWYDGSKKNYADSVKG(序列号：34)和GTGYNWFDP(序列号：35)。27H5抗体的轻链互补决定区(CDR)具有下列序列：RASQSVSSSYLA(序列号：36)；GASSRAT(序列号：37)；QQYGSSPIT(序列号：38)；RASQGISS ALA(序列号：39)；YASSLQS(序列号：40)；QQYYSTLT(序列号：41)；DASSLGS(序列号：42)；和WASQGISSYLA(序列号：43)。

>27H5 VH核苷酸序列(SEQ ID NO：9)

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGAAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG

CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATGGTATGATGGAAGTAAAAAAAAC

TATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT

GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAG

GAACTGGGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

>27H5 VH氨基酸序列(SEQ ID NO：10)

>27H5 VL1核苷酸序列：(SEQ ID NO：11)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCACGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC

CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGA

AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATC

CCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT

GGACCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCT

TCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

>27H5 VL2核苷酸序列：(SEQ ID NO：12)

GACATCCTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC

CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC

CAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCA

TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA

GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>27H5 VL3核苷酸序列：(SEQ ID NO：13)

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC

CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC

CAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGGAAGTGGGGTCCCA

TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA

GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>27H5 VL4核苷酸序列：(SEQ ID NO：14)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC

CATCACTTGCTGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAAC

CAGCAAAAGCCCCTAAGCTCTTCATCTATTATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCA

TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA

GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>27H5 VL5核苷酸序列：(SEQ ID NO：15)

GACATCGAGATGACCCAGTCTCCATTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC

CATCACTTGCTGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAAC

CAGCAAAAGCCCCTAAGCTCTTCATCTATTATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCA

TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA

GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>27H5 VL1氨基酸序列：(SEQ ID NO：16)

>27H5 VL2氨基酸序列：(SEQ ID NO：17)

>27H5 VL3氨基酸序列：(SEQ ID NO：18)

>27H5 VL4氨基酸序列：(SEQ ID NO：19)

>27H5 VL5氨基酸序列：(SEQ ID NO：20)

15C3抗体包括序列号：21中所示的核酸序列编码的重链可变区(序列号：22)，和选自序列号S：25-26中所示的氨基酸序列并由序列号：23-24中所示的核酸序列编码的的轻链可变区。如这里描述的实施例2，源自

基因改造小鼠的单克隆杂种瘤细胞能为单一重链产生多重轻链。按照这里的实施例2中描述的，对产生的重链和轻链的每个组合的最佳机能进行测试。

氨基酸包括Chothia等人在1989年，E.A.Kabat等人在1991年定义的互补决定区(CDR)，该互补决定区(CDR)用框符重点突出(参见图4B、4D、和5-7)。15C3抗体的重链互补决定区(CDR)具有下列序列：SYGMH(序列号：33)AIWYNGRKQD YADSVKG(序列号：44)和GTGYNWFDP(序列号：35)。15C3抗体的轻链互补决定区(CDR)具有下列序列：RASQS VSS YLA(序列号：30)；DASNRAT(序列号：31)；QQRSNWPWT(序列号：45)；RASQGISSALA(SEQ E)NO：39)；DASSLES(SEQ E)NO：46)；QQFNSYPIT(SEQ E)NO：47)。

>15C3 VH核苷酸序列：(SEQ ID NO：21)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCCGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGTAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG

CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGCTATATGGTATAATGGAAGAAAACAAGAC

TATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT

GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGGG

GAACTGGGTACAATTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

>15C3 VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：22)

>15C3 VL1核苷酸序列：(SEQ ID NO：23)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC

CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAC

CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCA

GCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA

GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCGTGGACGTTCG

GCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

>15C3 VL2核苷酸序列：(SEQ ID NO：24)

GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTATGAGACAGAGTCAC

CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC

CAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCA

TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA

GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCTATCACCTTCG

GCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

>15C3 VL1氨基酸序列：(SEQ ID NO：25)

>15C3 VL2氨基酸序列：(SEQ ID NO：26)

本发明的人CD3也包括抗体，该抗体包括至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多与序列号：2、6、10或22的氨基酸序列同源的重链可变氨基酸序列和/或至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多与序列号：4、8、16-20或25-26的氨基酸序列同源的轻链可变氨基酸序列。

可供选择地，单克隆抗体为与如28F11、27H5、23F10或15C3同一表位结合的抗体。

除非另外定义，与本发明有关的科技术语应具有本领域普通技术人员可普遍理解的意思。另外，除非本文另外要求，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。一般来说，这里描述的细胞和组织培养、分子生物、和蛋白质和寡核苷酸或多聚核苷酸化学和杂交相关术语和技术在本领域中众所周知并普遍使用的。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成、和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂(质)转染)。依据生产商的说明书或按照本领域中普遍成功的方法或这里描述的方法实施酶反应和纯化技术。先前技术和方法通常按照本领域中众所周知的传统方法和按照多种多样的一般或更特殊的文献中描述的方法进行实施，对该文献的引用和讨论贯穿于本说明书(参见如，Sambrook等人的文献：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。这里描述的分析化学、有机合成化学、和医学或制药化学的有关术语，实验方法和技术在本领域中是众所周知和普遍使用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配置、和输送和对患者的治疗。

如与本公开有关的下列术语，除非另外说明，应理解为具有下面意思：

如这里使用的，术语“抗体”统指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，免疫球蛋白分子包含抗原结合位的分子，该抗原结合位特异性结合(与抗原免疫反应)抗原。这种抗体包括，但不限于，多克隆的、单克隆的、嵌合的、单链、F_ab、F_ab′和F_(ab-)2片段、和F_ab表达文库。“特异性结合”或“免疫反应”是指抗体与一个或更多个预期抗原的抗原决定簇反应，并不与其他多肽反应(即，结合)或在很低亲合力(K_d＞10^-6)下与其他多肽结合。

众所周知，基础抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两个同样的多肽链组成，每一对具有一个“轻”(约25kDa)链和一个“重”(约50-70kDa)链。每个链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100到110或更多氨基酸。每个链的羧基末端部分确定了主要负责效应功能的恒定区。人轻链分为κ轻链和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε重链，并分别确定抗体的同形抗原为IgM、IgD、IgA、和IgE。在轻链和重链中，可变区和稳定区通过约12个或更多个氨基酸的″J″区连接起来，重链也包括约10以上氨基酸的″D″区。一般参见，基础免疫学第7章(Paul，W.，等人著，第二版.Raven Press，N.Y.(1989))。每个轻链/重链的可变区成对形成抗体结合位。

如这里描述的，术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体组合物”统指一群抗体分子，所述抗体分子仅包含一个分子类型的抗体分子，该抗体分子由独一无二的轻链基因产物和独一无二的重链基因产物组成。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDRs)与该群的所有分子相同。单克隆抗体(MAb)包含能与以独一无二的结合亲合力为特征抗原的特殊表位免疫反应的抗原结合位。

通常，抗体分子从与人相关的IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任意类中得到，这些抗体分子依据分子中的重链性质不同而彼此不相同。某些类型另外具有亚型，例如IgG1、IgG2、和其他的。此外，人的轻链可为κ链和λ链。

术语“抗原结合位”或“结合部分”统指参与免疫球蛋白分子抗原结合的部分。抗原结合位由重(″H″)链和轻(″L″)链的N-末端可变(″V″)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的可变区内的三个高度分枝统指“高变区”，该“高变区”被插入在多个与“骨架区”或″FRs″著称的保守侧枝之间。因此，术语″FR″统指在免疫球蛋白内的高变区之间、或与高变区邻接的天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间内彼此排列形成抗原结合表面。抗原结合表面补充结合抗原的三维表面，并且重链和轻链的三个高变区统称为“互补决定区”，或″CDRs″。每个结构域内的氨基酸的分配是依据免疫主体蛋白的Kabat序列定义(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk的文献J.MoI.Biol.196：901-917(1987)和Chothia等人的文献Nature 342：878-883(1989)中的定义。

如这里使用的，术语″表位″包括一些能特异性结合免疫球蛋白、scFv，或T-细胞受体的蛋白决定簇。术语“表位”包括一些能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的蛋白决定簇。蛋白决定簇通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面分组组成并且具有特殊的三维结构特征，以及特殊的充电特性。当电离常数＜1μM，优选＜100nM并最优选＜10nM时，抗体被认为特异性结合抗原。

这里使用的，术语“免疫结合”和“免疫结合性质”统指免疫球蛋白分子和对免疫球蛋白分子具有特异性的抗原之间的非共价相互作用。免疫结合的强度、或亲合力能依据相互作用的电离常数(K_d)进行表示，其中较小的K_d代表较大的亲合力。被选取的多肽的免疫结合性采用本领域中周知的方法进行定量。这种方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度，其中那些速度依赖于复合物配对的浓度、相互作用的亲合力、和在两个方向中相同影响速度的几何参数。因此，“反应速率常数”(K_on)和“解离速率常数”(K_off)能通过计算结合和解离的实际速度进行确定。(参见Nature 361：186-87(1993))。K_off/K_on比值能取消与亲合力无关的所有参数，并与解离常数K_d相等。(通常参见，Davies等人的文献(1990)Annual Rev Biochem 59：439-473)。当平衡结合常数(Ka)＜1μM，优选＜100nM，更优选＜10nM，最优选＜100pM到约1pM时，按照本领域中周知的测试如放射配体结合分析或类似分析进行测量，本发明的抗体被认为特异性结合CD3表位。

本领域的技术人员将意识到，在不需要超常规试验的情况下，就可以确定人单克隆抗体是否具有如本发明的人单克隆抗体(例如，单克隆抗体28F11、27H5，、23F10或15C3)的相同特异性，即通过确定前者是否抑制后者结合CD3抗原多肽，就可以测定出来。如果进行测试的人单克隆抗体与本发明的人单克隆抗体进行竞争，并表现为本发明人单克隆抗体结合的减少，那么两种单克隆抗体结合相同，或紧密相关的表位。测定人单克隆抗体是否具有本发明的人单克隆抗体的特异性的另一种途径是用正常活性的CD3抗原多肽预孵育本发明的人单克隆抗体，然后加入测试的人单克隆抗体来确定是否测试的人单克隆抗体的结合CD3抗原多肽的能力被抑制。在所有的可能性中，如果测试的人单克隆抗体被抑制了，它具有如同本发明的单克隆抗体的相同、或功能等同的表位特异性。

本领域内周知的多种方法用于制备定向抗蛋白质如CD3蛋白、或抗其衍生物、片段、类似物、同系物或直系同源的单克隆抗体。(参见，如Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow E，和Lane D，1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，通过引证并入本文中)。完全人抗体为其轻链和重链的全部序列，包括CDRs，都起源于人基因的抗体分子。这种抗体在这里被称为“人抗体”或“完全人抗体”。例如，采用实施例1种描述的方法制备出人单克隆抗体。人单克隆抗体也能通过trioma技术；人B细胞杂种瘤细胞技术(参见Kozbor，等人1983Immunol Today 4：72)；和EBV杂种瘤细胞技术来制备人单克隆抗体(参见Cole等人1985年的文献MONOCLONALANTIBODIES和CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)而得到。

采用众所周知的技术提纯抗体，例如采用蛋白A或蛋白G的亲和层析法，这种方法主要提供了免疫血清的IgG片段。随后，或可供选择地，特异性抗原可被固定在柱上通过免疫亲和层析来提纯免疫特异性抗体，该特异性抗原为免疫球蛋白寻找的靶标，或其表位。如，D.Wilkinson对免疫球蛋白的提纯进行了讨论(TheScientist，published by The Scientist，Inc.，Philadelphia PA，Vol.14，No.8(April17，2000)，pp.25-28)。

希望修改本发明抗体的效应功能，使得增强，例如，治疗免疫相关疾病中使用的抗体效力。例如，半胱胺酸残基能被引入到Fc区域，从而使链内二硫键在该区域内形成。因此，生成的同型二聚体抗体能提高内化能力和/或增强补体介导细胞杀伤力和抗体依赖细胞的细胞毒作用(ADCC)。(参见Caron等人的文献J.Exp Med.，176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，148：2918-2922(1992))。可供选择地，抗体能被工程化，该抗体具有双Fc区域并从而能增强补体溶破和抗体依赖细胞的细胞毒作用(ADCC)capabilities。(参见Stevenson等人的文献Anti-CancerDrug Design，3：219-230(1989))。

本发明也包括F_v、F_ab、F_ab’、和F_(ab′)2人CD3片段，单链人CD3抗体、双特异性人CD3抗体和偶联物人CD3抗体。

双特异性抗体为具有对至少两种不同抗体具有结合特异性的抗体。在现在的情况下，结合特异性之一是针对CD3。第二个结合靶标为一些其它抗体，并且更有利的为细胞表面蛋白质或受体或受体亚单位。

制备双特异性抗体的方法为本领域中众所周知的。传统上说，双特异性抗体的重组制备是以两个免疫球蛋白重链/轻链对的串联表达为基础，两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂种瘤细胞(quadroma)生成十个不同抗体分子潜在混合物，其中仅一个具有正确的双特异性结构。通常采用亲和层析步骤成功提纯正确的分子。类似方法在1993年5月13日公布的第WO 93/08829号申请和Traunecker等人的文献EMBO J.，10：3655-3659(1991)中被公开。

具有预期结合特异性的抗体可变结构域能与免疫球蛋白稳定区序列融合。融合优选与免疫球蛋白重链稳定结构域进行，该免疫球蛋白重链稳定结构域包括至少部分铰链区、CH2、和CH3区域。优选具有第一个重链稳定区(CH1)，其包含对至少所有融合中的一个融合中存在的轻链结合所必须的位点。DNAs编码免疫球蛋白重链融合和，必要时，免疫球蛋白轻链被插入到分开的表达载体中，共同转染到适宜的宿主有机体中。为更详细的生成双特异性抗体参见，如，Suresh等人的文献Methods inEnzymology，121：210(1986)。

按照在WO 96/27011中描述的另一个方法，一对抗体分子间的界面能工程最大化异源二聚体百分比，该异源二聚体从重组细胞培养物而再生得到。优选的界面包括至少一对含有结构域的抗体的CH3区域。在该方法中，来自首个抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链所取代(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过用较小氨基酸侧链(例如，丙胺酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二个抗体分子接触面上制备出等同于或尺寸小于大侧链的代偿性空腔。这提供了一种增加异源二聚体产量的机制，使其产量超过其它不想得到的终产品的产量如同型二聚体。

双特异性抗体能制为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)₂双特异性抗体)。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已经在文献中进行了描述。例如，双特异性抗体能采用化学偶联制备得到。Brennan等人的文献Science 229：81(1985)中描述了一种方法，其中完整抗体为蛋白溶解切割而制得F_(ab′)2片段。这些片段在二硫醇复合物试剂亚砷酸钠存在下被还原从而稳定了邻近的二硫醇并阻止分子间二硫化物形成。然后，生成的Fab′片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物之一通过用半胱胺还原而转换为硫代Fab′并与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合而形成双特异性抗体。制成的双体异性抗体能用作选择性固定酶用药剂。

此外，F_ab′能直接由E.coli中收获得到并化学耦合形成双特异性抗体。Shalaby等人的文献J.Exp.Med.175：217-225(1992)中描述了完全人化的双特异性抗体F_(ab′)2分子。每个F_ab′片段分别由E.coli分泌出并经过体外定向化学耦合而形成双特异性抗体。因此，形成的双特异性抗体能结合细胞过度表达ErbB2受体和正常人T细胞，以及引发人细胞毒素的淋巴细胞抗乳房肿瘤靶标的细胞溶解酶活性。

制备双特异性抗体片段的多种方法也进行了描述。例如，双特异性抗体已经使用亮氨酸拉链制备出。Kostelny，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接到两个不同抗体的Fab′部分。抗体同型二聚体在铰链区被还原成单聚体，然后再氧化成抗体异源二聚体。这个方法也能用于抗体同型二聚体的制备。HollingerProc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双功能抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的选择性机理。片段包括通过铰链区连接轻链可变区(V_L)的重链可变区(V_H)，铰链区太短而不能在同一链上的两个结构域之间成对。因此，一个片段的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)被强制与另外片段的互补轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)成对，从而形成两个抗原结合位点。另外，通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的方案也已经被报道。参见Gruber等人的文献J.Immunol.152：5368(1994)。

考虑了大于两个化合价的抗体。例如，能制备出三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。

典型的双特异性抗体能结合两个不同表位，至少在本发明的蛋白抗原中出现的表位之一。可供选择地，免疫球蛋白分子的抗-抗原臂能与结合白细胞如T细胞受体分子(如，CD2、CD3、CD28、或B7)，或IgGFc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)上的促进分子结合以致细胞防御机理集中在细胞表达特殊抗原上。这些抗体拥有抗原结合臂并且该臂结合细胞毒素药剂或放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA。另外的主体双特异性性抗体结合这里描述的蛋白抗原并进一步结合组织因子(TF)。

偶联物抗体也在本发明范围内。偶联物抗体由两个共价键结合的抗体组成。这种抗体，例如，拟使免疫系统细胞以多余细胞为靶标(美国专利第4,676,980号)，并治疗HIV感染(WO91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。预期的是，抗体能体外使用包括包含交联药剂的合成蛋白化学中周知的方法制得。例如，免疫毒素能使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来进行构建。该目的的适宜反应物的实施例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺和如美国专利No.4,676,980中被公开的那些。

本发明也适合免疫偶联物，该免疫偶联物包括与细胞毒素药剂如毒素(如，细菌、真菌、植物、或动物类、或其片段的有酶活性毒素)，或放射性同位素(如，发射偶联物)偶联的抗体。

能使用的有酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒A链、相思子毒素A链、葫莲根毒素A链、α-sarcin、油桐蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、石硷草抑制剂、白树素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、restrictocin、酚(苯)霉素、依诺霉素、和镰刀菌毒素(tricothecenes)。多种放射原子核对生产放射偶联抗体是有效的。实施例包括²¹²Bi，¹³¹I，¹³¹In，⁹⁰Y，和¹⁸⁶Re。

采用多种双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸盐(SPDP)、巯醇亚胺(IT)，亚氨基酯的双功能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、二叠氮化物(例如，双(p-叠氮苯甲酰基)己二胺)，二重氮基衍生物(如双-(p-叠氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸苄酯)、和双活性氟化物(例如，1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的结合体。例如，按照Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中描述的方法能制得蓖麻毒素免疫毒素。C 14标记的1-异硫氰酸酯基苯基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于放射性核素螯合剂与抗体结合的典型螯合剂(参见WO94/11026)。

本领域的普通技术人员将意识到大多数可能基团能与得到的抗体或本发明的其他分子耦合。(参见，例如，″ConjugateVaccines″，Contributions to Microbiology和Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis，Jr(eds)，Carger Press，New York，(1989)，该文献在此通过引证全部并入本文)。

只要抗体和其他基团保持它们各自活性，采用任意化学反应成功实现耦合，将两个分子结合在一起。这种结合包括许多化学机理，例如共价结合、亲和性结合、插入物、配位结合和络合。

然而，优选的结合为共价结合。共价结合或者通过侧链的定向缩合或通过掺入外部桥接分子得到。相对于其他分子，许多二价或多价联接剂对耦合蛋白分子有效，例如对本发明的抗体有效。例如，代表性偶联剂能包括有机化合物如硫酯、碳化二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮基苯和己二胺。该列表目的不是为了毫无遗漏的例举本领域众周知的多种偶联剂，相反，更恰当地说是多种普通偶联剂的代表。(参见Killen和Lindstrom，Jour.Immun.133：1335-2549(1984)；Jansen等人的文献Immunological Reviews 62：185-216(1982)；和Vitetta等人的文献Science 238：1098(1987)。优选的连接肽在文献中进行了描述。(参见，例如，Ramakrishnan，S.等人的文献Cancer Res.44：201-208(1984)，其中描述了MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰-N-氢氧化琥珀酰亚胺酯)的使用。也参见，美国专利第5,030,719号，描述了通过低聚肽连接肽与抗体偶联的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。特殊优选的连接肽包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基乙氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(购自Pierce Chem.Co.，Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺-6[3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基]己酸酯(购自Pierce Chem.Co.，Cat#21651G)；(iv)硫代-LC-SPDP(硫代琥珀酰亚胺6[3-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酸酯(购自Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)与EDC结合的硫代-NHS(N-羟基硫代-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。

上述描述的连接肽包含具有不同特征的成分，因此导致不同的生理化学性质的偶联物。例如，硫代-NHS酯的烷基羧酸酯比硫代-NHS酯的芳基羧酸酯更稳定。含有连接肽的NHS酯比硫代-NHS酯溶解更少。另外，连接肽SMPT包含立体位阻二硫键，并能形成具有增强的稳定性的偶联物。一般来说，二硫键比其他键合稳定性差因为二硫键被体外切割，导致有效偶联物减少。特别的是，硫代-NHS能提高碳化二亚胺偶联剂的稳定性。当与硫代-NHS联合使用时，碳化二亚胺偶联剂(如EDC)加工制备酯比单独碳化二亚胺偶联反应更抗水解反应。

在这里使用的术语“分离的多聚核苷酸”应指染色体组、cDNA、或合成类或一些其组合的多聚核苷酸，依据其来源，“分离的多聚核苷酸”(1)与在自然中可找到该“分离的多聚核苷酸”于其中的多聚核苷酸的全部或部分无关，(2)可操作的连接多聚核苷酸，该多聚核苷酸在自然中并不与其连接，或(3)在自然中并不作为更大序列的某部分。

这里提到的术语“分离的蛋白”指cDNA、重组RNA、或合成类或一些其组合的蛋白，依据其来源，或衍生物来源，“分离的蛋白”(1)与在自然中可找到的蛋白无关，(2)无来自同一来源的蛋白，例如，无海洋生物蛋白，(3)由来自不同种类的细胞表达，或(4)在自然中不存在。

作为通用术语，术语“多肽”在这里用于统称天然蛋白质、片段、或多肽系列类似物。因此，天然蛋白片段、何类似物是多肽属的物种。依据本发明，优选的多肽包括图1B、2B、3B和4B表示的人重链免疫球蛋白分子和图1D、2D、3D和4D表示的人轻链免疫球蛋白分子，以及通过重链免疫球蛋白与轻链免疫球蛋白分子结合而形成抗体分子，如κ轻链免疫球蛋白分子，反之亦然，以及片段和其类似物。

用于一个对象的在这里使用的术语“天然存在”统指对象能在自然界中找到。例如，在有机体(包括病毒)内存在的多肽或多聚核苷酸序列能从自然资源中分离出并在实验室中没有被人为修改，否则就不为自然存在。

在这里使用的术语“可操作的链接”是指被描述的成分位点在允许它们以其指定方式行使其功能的关系。控制序列“可行链接”编码序列是以这种方式结合，编码序列的表达是在与控制序列相容的情况下得到的。

如在这里使用的术语“控制序列”是指多聚核苷酸，该多聚核苷酸对影响与它们相结合的编码序列的表达和处理是必要的。这种控制序列的性质区别依赖于原核生物中的宿主有机体而不同，这种控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点、和真核细胞中的转录终止序列，通常这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预计包括，最小量的所有成分，这些成分的存在对表达和处理是必需的，并且也包括附加成分，这些附加成分的存在是有利的，例如，先导序列和融合配对序列。如这里提到的术语“多聚核苷酸”是指至少长度为10个碱基对的核苷酸的聚合硼，或者核(糖核)苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的任一形式核苷酸。术语包括单链形式DNA和双链形式DNA。

这里提到的术语寡核苷酸包括自然存在的，和自然存在的链接的修饰核苷酸，和非自然存在的寡核苷酸链接。寡核苷酸为多聚核苷酸亚群，其通常包括长度为200个碱基对或更少。优选的寡核苷酸长度为10到60个碱基对并且最优选的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、或20到40个碱基对。寡核苷酸通常为单链，如，探针，尽管寡核苷酸可为双链，如，在构建基因突变中使用。本发明的寡核苷酸或者为正义寡核苷酸或者为反义寡核苷酸。

这里提到的术语“自然存在的核苷”包括脱氧核糖核苷和核糖核苷。这里提到的术语“修饰核苷”包括具有修饰或取代的糖基团的核苷酸和类似物。这里提到的术语“寡核苷酸链接”包括寡核苷酸链接如硫代磷酸(酯)键、二硫代磷酸酯键、硒代磷酸酯键、二硒代磷酸酯键、阿尼洛硫代磷酸酯键、磷酸缩苯胺酯、亚磷酰胺酯和类似物。参见如，LaPlanche等人的文献Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人的文献J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)，Stein等人的文献Nucl.Acids Res.16：3209(1988)，Zon等人的文献Anti Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等人的文献Oligonucleotides和Analogues：A Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，Oxford Engl和(1991))；Stec等人的美国专利第5,151,510号；Uhlmann和PeymanChemical Reviews 90：543(1990)。必要时，寡核苷酸可包括用于监测的标记物。

这里提到的术语“选择性杂化”是指可被检测的和特定的结合。依照本发明，多聚核苷酸、寡核苷酸和其片段在杂交和洗涤情况下，选择性杂交核酸链，洗涤最小化可检测结合非特异性核酸的可测量。高度严格条件能用于得到本领域周知的并在这里讨论的选择性杂交条件。一般来说，在多聚核苷酸、寡核苷酸、和本发明的片段和主体核酸序列之间的核酸序列同源性至少为80％，并更典型的优选增加的同源性至少为85％、90％、95％、99％、和100％。如果在两个氨基酸序列之间部分或完全相同，那么这两个氨基酸序列是同源的。例如，85％同源意味着当排列两个序列进行最大限度匹配时，85％的氨基酸是相同的。在最大匹配时所允许的差异(两个匹配序列中的任意一个)序列长度优选为5或更少，更优选2或更少。可供选择地并优选地，如果采用具有突变数据矩阵和差异补偿为6或更多的程序ALIGN，它们具有大于5(标准差单位)的匹配度，则两个蛋白序列(或源自至少30个氨基酸长度的多肽序列)为同源的，如同在这里被使用的术语。参见Dayhoff，M.O.，in Atlas of Protein Sequence和Structure，pp.101-110(Volume 5，National Biomedical ResearchFoundation(1972))和Supplement 2 to this volume，pp.1-10。两个序列或其部分更优选为同源的，如果当使用ALIGN程序进行最佳排列时，它们相同的氨基酸大于或等于50％。这里使用的术语“对应于”是指多聚核苷酸序列是相对于全部或部分参考多聚核苷酸序列是同源的{例如，为等同的，不严格地进化上相关的}，或者多肽序列与参考多肽序列是同源的。在对照区别下，这里使用的术语“互补的”是指互补序列与所有或部分参考多聚核苷酸序列是同源的。为了进行说明，核苷酸序列″TATAC″对应于参考序列″TATAC″并且互补于参考序列″GTATA″。

下面的术语用于描述两个或多个多聚核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“对比序列”、“对比窗”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”、“大体上一致性”。“参考序列”为确定序列用作序列比对基础。参考序列可为较大序列的子集，例如，作为序列列表中给出的全长cDNA或基因序列的片断或可包括完全cDNA或基因序列。一般来说，参考文献至少为18个核苷酸或6个氨基酸长度，经常为至少24个核苷酸或8个氨基酸长度，并经常至少为48个核苷酸或16个氨基酸长度。既然两个多聚核苷酸或氨基酸序列可每个(1)包括两个分子间类似的序列(即，完全多聚核苷酸或氨基酸序列的一部分)，并且(2)可进一步包括两个多聚核苷酸或氨基酸序列间不同的序列，两个(或多个)分子间的序列对比一般通过“对比窗”上比对两个分子的序列来识别并比较局部区域的序列相似性。如这里使用的“对比窗”是指至少18个邻近核苷酸位点或6个氨基酸的概念上的片段，其中多聚核苷酸序列或氨基酸序列可与至少18个邻近核苷酸或6个氨基酸序列进行比较，并且其中为两个序列的最佳排列，对比窗中的多聚核苷酸序列部分与参考序列(不包括添加或缺失)对比，可包括20％或更少的添加、缺失、取代、和类似(例如，空隙)。通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源算法、Needleman和Wunsch J.MoI.Biol.48：443(1970)的同源排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的寻找相似性方法、这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，(Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks，或Mac Vector softwarepackages)、或通过观察可构建出配比对比窗用的序列的最佳排列，并且选择由多种方法生成最佳排列(例如，导致对比窗上同源的最高百分比)。

术语“序列一致性”是指两个多聚核苷酸或氨基酸序列在对比窗上是相同的(即，在一个接一个的核苷酸或一个接一个残基上)。术语“序列一致性的百分比”通过以下步骤计算得到：比对对比窗上的两个最佳排列序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或存在于两个序列中残基的数目而得到匹配位点的数目、在对比窗(例如，窗口尺寸)中将位点总量中划分出匹配位点数目，并将结果乘以100得到序列一致性的百分比。这里使用的术语“大体上的一致性”指出多聚核苷酸或氨基酸序列的特征，其中多聚核苷酸或氨基酸包括一个序列，在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位点的对比窗上，经常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位点的对比窗上，该序列与参考序列对比具有至少85％的序列一致性，优选至少90％到95％的序列一致性，更经常为至少99％的序列一致性，其中序列一致性的百分比经在对比窗上对比参考序列和该序列经计算得到，该序列可包括缺失或添加总计达20％或更少的参考序列。参考序列可为较大序列的亚群。

如同这里使用的，20个常规氨基酸和其缩写依据常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，编辑，Sinauer Associates，Sunderl和7 Mass.(1991))。20个常规氨基酸的立体异构体(如，D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-、α-二元取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，和其他非常规氨基酸也可为本发明多肽的可取代成分。非常规氨基酸的实施例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，和其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在这里使用的多肽符号中，依据标准用法和规定，左手方向为氨基末端方向并且右手方向为羧基末端方向。

类似地，除非另外规定，单链多聚核苷酸序列的左手末端为5′末端，双链多聚核苷酸序列的左手方向统指为5′方向。5′到3′方向增加的新生RNA转录统指为具有和RNA相同序列的DNA链上的转录方向序列，并且5′到5′末端的RNA转录序列统称为“上游序列”，具有和RNA相同序列的DNA链上的序列区并且3′到3′末端的RNA转录序列统称为“下游序列”。

如同用于多肽，术语“大体上一致性”意指两个肽序列，当最佳排列时，例如经程序GAP或BESTFIT，采用默认间隙量，拥有至少80％序列一致性，优选至少90％序列一致性，更优选至少95％的序列一致性，最优选至少99％序列一致性。

优选地，残基位点依据保守氨基酸取代的差异而不相同。

保守氨基酸取代统指具有类似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的基团为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸集团为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸基团为天冬酰胺酸和谷氨酰胺；具有芳基侧链的氨基酸基团为苯基丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸基团为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸基团为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯基丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天(门)冬氨酸、和天冬酰胺酸-谷氨酰胺。

如这里讨论的，可以预见的是本发明包括抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的较小变化，从而使氨基酸序列的变化维持在至少75％，更优选至少80％，90％，95％，更优选99％。尤其是，可以预见保守氨基酸取代。保守取代是在家族氨基酸内发生的，氨基酸家族在其侧链中是相关联的。遗传编码氨基酸通常分为两类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸，(4)不带电极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天门冬胺酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸。憎水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他家族氨基酸包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂肪族-羟基家族；(ii)天冬酰胺酸和谷氨酰胺，其为含酰胺家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂肪族；和(iv)苯基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸，其为芳香族。例如，我们合理的预期用异亮氨酸、缬氨酸单独取代亮氨酸，用谷氨酸盐取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关氨基酸相似取代氨基酸，该结构相关氨基酸不会对得到的分子的结合或性质产生影响，尤其如果取代不涉及在骨架位点内的氨基酸。是否氨基酸改变导致功能肽能很容易经过分析多肽衍生物的特异性活性进行测定。这里详细描述了测试方法。本领域的技术人员能制备出抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基-和羧基-末端存在于功能域边界附近。结构域和功能域能通过核苷酸和/或氨基酸序列与公共序列或固有序列数据库对比而被确定出。优选地，计算机化对比方法用于确定序列基序或预期的蛋白构形结构域，构形结构与存在已知结构和/或功能的其它蛋白质。确定蛋白序列的方法是众所周知的，该蛋白序列折叠成周知的三维结构。Bowie等人的文献Science 253：164(1991)。因此，先前实施例证明了本领域的技术人员能识别序列基序和结构构象，依据本发明，序列基序和结构构象可用于确定结构域和功能域。

优选的氨基酸取代为下面所述：(1)减少对蛋白质水解的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变结合亲合力形成蛋白复合物，(4)改变结合亲合力，并(4)赋予或修改该类似物的其他生理化学性质或功能性质。类似物可包括一个序列而非自然存在肽序列的多种突变蛋白。例如，单个氨基酸或多重氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)可在自然存在序列中(优选在形成分子内接触结构域外的多肽部分)制成。保守氨基酸取代不应实质上改变母序列的结构特征(例如，取代氨基酸不应趋向于打破母序列中存在的螺旋，或破坏表现母序列特征的其他类型的二级结构)。技术识别多肽二级和三级结构的是实力在蛋白质、结构和分子原理中进行了描述(Creighton，Ed.，W.H.Freeman和Company，NewYork(1984))；蛋白质结构入门(C.Br和en和J.Tooze，eds.，Garl和Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature354：105(1991)。

在这里使用的术语“多肽片段”统指具有氨基末端和/或羧基末端删除的多肽，但保留氨基酸序列与来自全长cDNA序列的推导的自然存在序列中的相应位置具有同源性。典型片段至少为5、6、8或10个氨基酸长，优选至少14个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，甚至更优选至少70个氨基酸长。这里使用的术语“类似物”统指多肽，该多肽由至少25个氨基酸的片段组成，该25个氨基酸的片段具有与部分推导氨基酸序列大体上同源性并且具有至少下列性质之一：(1)在适宜的结合条件下，特异性结合CD3，(2)能够阻滞适当的CD3结合，或(3)能够抑制CD3表达细胞在体外或体内的增长。典型地，多肽类似物包括自然存在序列的保守氨基酸取代(或增加或缺失)。类似物典型具有至少20个氨基酸长，优选至少50个氨基酸长或更长，并且通常能与全长自然存在多肽一样长。

肽类似物普遍用在制药工业中作为具有类似于模板肽性质的非多肽类药物。这些类型的非肽类化合物被称为“模拟肽”或“肽类似物”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)，Veber和Freidinger TINS ρ.392(1985)；和Evans等人.J.Med.Chem.30：1229(1987)。这种化合物经常在计算机化分子模型的帮助下生成。与治疗有效肽有相似结构的肽类似物可用于产生等效的治疗或预防功效。一般来说，肽类似物结构相似于多肽范例(例如，具有生物化学性质或药理活性的多肽)，例如人抗体，但具有一个或多个肽链接非必须地被选自由--CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂-CH₂--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH₂--、CH(OH)CH₂--、和-CH₂SO-组成的组的链接采用本领域中周知的方法所取代。用同一类型的D氨基酸(e.g.，D-赖氨酸取代L-赖氨酸)系统取代一致序列的一个或多个氨基酸可用于生成更稳定肽。此外，受约束序列变异可通过本领域中周知的方法生成(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992))；例如，通过添加能形成环化肽的分子内二硫桥键的体内半胱氨酸残基。

在这里使用的术语“药剂”是指化合物，化合物的混合物，生物大分子，或生物材料制得的提取物

在这里使用的术语“标记”或“被标记”统指加入一种可检测标记，例如通过加入放射标记氨基酸或附加到生物素部分的多肽上，生物素部分的多肽可被标记的抗生物素蛋白检测到(例如，含荧光标记的或酶活性的链霉亲和素能通过光学方法或量热法检测到)。在某些情况下，标记或标示物也可为治疗剂。标记多肽和糖蛋白的多种方法在本领域中是众所周知的并可被使用的。多肽标记物的实施例包括，但不限于，下列所示：放射性同位素或放射性核(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记物(例如，FITC、若丹明、镧系元素荧光剂)、酶标记物(例如，辣根过氧化物酶、对牛乳糖、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光物、生物素基团、由二级报告(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、附加表位)识别的预定多肽表位。在一些实施方案中，标记物被附上不同长度的间隔臂来减少潜在的空间位阻。如这里使用的术语“药剂或药物”通指在正确对患者给药时，能产生预期治疗效果的化合物或组合物。

这里的其他化学术语是按照本领域中常规用法来使用的，如McGraw-Hill化学术语词典(Parker，S.编辑，McGraw-Hill，SanFrancisco(1985))举出的范例。

在这里使用的术语“抗肿瘤药”统指具有抑制人体内瘤的形成或发展，尤其抑制恶性病变(癌)，如癌症、肉瘤、淋巴瘤、或白血病的功能性药物。抑制转移通常为抗肿瘤药的性质。

在这里使用的，“大体上纯净的”是指对象种类为存在的主要种类(例如，以摩尔计，超过组合物种的任何个别种类)，优选大体上纯化的片段为组合物，其中对象种类包括至少50％(以摩尔计)的存在的全部大分子种类

一般来说，大体纯净组合物将包括大于80％的组合物中存在的大分子种类，更优选大于85％、90％、95％、和99％。最优选地，对象种类被纯化为基本同源性(采用常规方法不能在组合物中检测出污染物种类)，其中组合物基本组成单一大分子种类。术语患者包括人和兽类主体。

人抗体和抗体的人源化

人CD3抗体通过如形成完全人抗体免疫异种老鼠(参见实施例1)制备得到。例如，通过改变基因改造小鼠产生的IgM抗CD3抗体而生成免疫球蛋白G人CD3抗体(参见实施例2)。可供选择地，例如采用仅含人序列的抗体经相位显示技术形成这种人CD3抗体。该方法在本领域中众所周知，例如在WO92/01047和美国专利第6,521,404号中进行了描述，并通过引述并合并于本文中。在这种方法中，采用CD3或其片段的自然资源或重组资源筛选出运载随机配对的轻链和重链的噬菌体的组合文库。

本发明包括通过一种方法生产人CD3抗体的方法，其中至少该方法的一个步骤包括使具有人CD3蛋白的基因改造的非人类动物致免疫。一些异种基因的非人类动物的内生重链和/或κ轻链位置已经被禁用，并不能请求重新排列来生成对应抗原的编码免疫球蛋白基因。此外，至少一个人重链位点和至少一个人轻链位点已经稳定转染到动物中。因此，对应被给药的抗原，人位置重排来提供对抗原具有免疫特异性的编码人可变区的基因。因此，一经免疫作用，转基因小鼠产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。

用于产生转基因非人类动物的多种技术在本领域中众所周知。例如，参见美国专利第6,075,181号和第6,150,584号。通过一个方案，转基因(人)重链和轻链免疫球蛋白基因被引入到宿主胚系(例如，精液或卵母细胞)中，并且在分离步骤中，相应的宿主基因采用同源重组通过灭活作用变成无功能的。人重链和轻链免疫球蛋白基因在适宜的真核或原核微生物中进行再造，并且生成的DNA片段被引入到适宜的宿主中，例如，受精小鼠卵母细胞或胚胎干细胞的前核中。通过宿主细胞内，尤其在胚胎干细胞活受精小鼠卵母细胞的前核内的同源重组产生适当位置的定向敲除从而得到内生宿主免疫球蛋白位置的灭活。定向敲除可涉及靶标位置内的引入病变或缺失，或伴随插入位点内在靶标位置内缺失，例如插入可选择的标示物。在胚胎干细胞的情况中，被制得的嵌合体动物部分源自修饰的胚胎干细胞并且能经胚系遗传基因修饰。带有被引入的人免疫球蛋白位点到具有灭活内生位点的链中的寄主的交配将生成抗体产生完全为异种的，例如，人。

在可供选择的方案中，至少部分人重链和轻链免疫球蛋白位点用于通过胚胎干细胞内同源重组来定向取代对应内生免疫球蛋白位点。这导致灭活和内生免疫球蛋白取代的同时发生。随即生成嵌合体动物，其中胚胎干细胞衍生细胞能有助于胚系。

例如，依据本领域内周知的不同方法，表达人抗CD3抗体的B细胞克隆能从异种非人类动物中除去并且为永生的。这种B细胞可直接来自动物血液或来自淋巴组织，包括但不限于脾、扁桃腺、淋巴结和骨髓。生成的、永生的B细胞可被扩大并体外培养产生大量临床用人CD3抗体。可供选择地，编码具有一个或多个人可变区免疫球蛋白的基因能再生并由不同细胞类型表达，包括但不限于哺乳动物细胞培养系统，为直接得到抗体或其单链，该基因由单链Fv分子组成。

此外，由异种非人类动物生成的整套完全人抗CD3抗体可被筛选类确定具有最佳特征的这样一种克隆。最佳特征包括，例如，对人CD3蛋白的结合亲合性，相互作用的稳定性以及同型完全人抗CD3抗体。为进一步操作产生具有这些特征的抗体，在可供选择的细胞系统中，使用常规重组或转基因技术，该整套的具有预期特征的克隆用作核苷酸序列编码预期可变区的来源。

对总方案连同1994年公开的首个XenoMouse^TM菌株进行了说明。参见Green等人的文献Nature Genetics 7：13-21(1994)。

该方法进一步在1990年1月12日提交的美国专利申请第07/466,008号，1990年11月8日提交的美国专利申请第07/610,515号，1992年7月24日提交的美国专利申请第07/919,297号，1992案7月30日提交的美国专利申请第07/922,649号，1993年3月15日提交的美国专利申请第08/031,801号，1993年8月27日提交的美国专利申请第08/112,848号，1994年4月28日提交的美国专利申请第08/234,145号，1995年6月5日提交的美国专利申请第08/463,191号，1995年6月5日提交的美国申请第08/462,837号，1995年6月5日提交的美国申请第08/486,853号，1995年6月5日提交的美国申请第08/486,857号，1995年6月5日提交的美国申请第08/486,859号，1995年6月5日提交的美国申请第08/462,513号，1996年10月2日提交的美国专利申请第08/724,752号，和1996年12月3日提交的美国专利申请第08/759,620号和美国专利申请第6,162,963号、6,150,584号，6,114,598号，6,075,181和5,939,598号以及日本专利第3068180B2号，3068506B2号和3068507B2号中进行了讨论和描述。也参见Mendez等人的文献Nature Genetics 15：146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.：188：483-495(1998)。也参见1996年6月12日授予公布的欧洲专利第EP 0463151B1号，1994年2月3日公布的国际专利申请第WO 96/34096号，1996年10月31日公布的国际专利申请第WO 96/34096号，1998年6月11日公布的国际专利申请第WO 98/24893号，2000年12月21日公布的国际专利第WO 00/76310号。

在一个可供选择的方法中，其他人已经利用了“微小基因座”方法。在一个微小基因座方法中，外生免疫球蛋白基因座通过来自免疫球蛋白基因座的内含物片段(单个基因)被模拟。因此，一个或多个VH基因，一个或多个D_H基因，一个或多个J_H基因，μ恒定区和第二个恒定区(优选的γ恒定区)被组成插入动物内的结构中。该方法在Surani等人提交的美国专利第5,545,807号和Lonberg和Kay提出的每个美国专利第5,545,806号，第5,625,825号，第5,625,126号，第5,633,425号，第5,661,016号，第5,770,429号，第5,789,650号，第5,814,318号，第5,877,397号，第5,874,299号，和第6,255,458号和Krimpenfort和Berns提交的美国专利第5,591,669号和第6,023,010号，Berns等人提交的美国专利第5,612,205号，第5,721,367号和第5,789,215，Choi和Dunn提交的美国专利第5,643,763号，以及1990年8月29日提交的GenPharm国际美国专利申请第07/574,748号，1990年8月31日提交的第07/575,962号，1991年12月17日提交的第07/810,279号，1992年3月18日提交的第07/853,408号，1992年6月23日提交的第07/904,068号，1992年12月6日提交的第07/990,860号，1993年4月26日提交的第08/053,131号，1993年7月22日提交的第08/096,762号，1993年11月18日提交的第08/155,301号，1993年12月3日提交的第081161,739号，1993年12月10日提第的第08/165,699号，1994年3月9日提交的第08/209,741号申请中进行了描述。也参见欧洲专利第0546073B1号、国际专利申请号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852、和WO 98/24884和美国专利第5,981,175号。另外参见Taylor等人1992年的文献，Chen等人1993年的文献，Tuaillon等人1993年的文献，Choi等人1993年的文献，Lonberg等人1994年的文献，Taylor等人1994年的文献，和Tuaillon等人1995年的文献和Fishwild等人(1996年的文献)。

微小基因座方法的一个优势是能迅速生成包括Ig基因座部分的结构并引入到动物体内。然而，理论上，微小基因座的显著性不利条件是引入少量的V、D、和J基因的内含物中多样性不足。事实上，公布的著作看起来支持这个观点。B细胞形成和采用微小基因座方法生产的动物抗体生产受到阻碍。因此，围绕本发明的研究直接针对引入大量Ig基因座为得到更大差异性并努力重建动物免疫系统。

Kirin也已经论证了小鼠中生成人抗体，其中经微细胞融合，大片染色体，或者整个染色体被引入。参见欧洲专利申请第773288号和第843961号。

人抗-小鼠抗体(HAMA)反应已经导致制备嵌合体或相反制备人抗体的工业化。虽然嵌合抗体具有人恒定区和免疫可变区，我们预期一些人抗嵌合抗体(HACA)反应将被观察到，尤其在慢性或多剂量用抗体中。因此，我们将预期提供抗CD3完全人抗体目的为破坏HAMA的关注和/或效应或HACA反应。

具有减少免疫原性的抗体生产也经人源化和适当的序列库展示技术成功实现。应了解小鼠抗体或来自其他种类的抗体能采用本领域众所周知的技术被人性化或灵长类动物化。参见，如Winter和Harris的文献Immunol Today 14：4346(1993)及Wright等人的文献Crit，Reviews in Immunol.12125-168(1992)。主体抗体可被重组DNA技术工程化来取代CH1、CH2、CH3、铰链区、和/或相应人序列的结构域。(参见WO 92102190和美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号、和第5,777,085号}。用于构建嵌合免疫球蛋白基因的Ig cDNA也是本领域中周知的(Liu等人的文献P.N.A.S.84：3439(1987)和J.Immunol.139：3521(1987))。将mRNA从杂种瘤细胞或产生抗体的细胞中分离出并用于生产cDNA。主体的cDNA可经聚合酶链反应采用特异引物进行扩增(美国专利第4,683,195号和第4,683,202号)。可供选择地，生成文库并进行筛选分离主体序列。编码抗体可变区的DNA序列被融合到人恒定区序列中。人恒定区基因序列可在Kabat等人的文献(1991)Sequences of Proteins of immunological Interest，N.I.H.publication no.91-3242中找到。人C区基因容易从已知克隆中得到。同型的选择将由预期效应子功能引导，例如补体结合的改良、或抗体依赖性细胞毒性中活性。优选同型为IgG1、IgG3和IgG4。可使用任一人轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。嵌合人性化抗体采用常规方法进行表达。

抗体片段，如F_v、F_(ab′)2和F_ab可经切割完整蛋白制得。可供选择地，设计出截断基因。例如，编码部分F_(ab′)2片段的嵌合基因将包括编码CH1结构域的DNA序列和H链铰链区，随即翻译终止密码子生成截断分子。

H和L J区的相同序列可用于设计寡核苷酸作为引物来引入有效限制位到J区内，随后联接V区部分和人C区部分。C区cDNA能通过位点变异发生进行修饰来将限制性位点置于人序列中的相似位置处。

表达载体包括质粒体、逆转录酶病毒、YACs、EBV衍生游离体，和类似物。具有适当工程化的限制性位点的简便载体为编码功能完整人CH或CL免疫球蛋白序列，使得任何VH或VL-31序列能便于被插入和表达。在这种载体中，剪接通常发生在插入J区内的供体位点和人C区前的剪接受体位点之间，并且在剪接区，发生在人CH外显子内。多聚腺苷酸和转录终止发生在编码区下游的初始染色体位。生成的嵌合抗体可与任何强启动子结合，该强启动子包括逆转录病毒LTRs，例如SV-40早期启动子，(Okayama等人.MoI.Cell.Bio.3：280(1983))，Rous肉瘤病毒LTR(Gorman等人.P.N.A.S.79：6777(1982))，和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人.Cell 41：885(1985))。应了解，初始Ig启动子和类似物也可被使用。

此外，人抗体或其他种类的抗体能通过展示技术，包括但不限于，噬菌体展示技术、逆转录病毒展示技术、核糖展示技术、和其他技术制得，使用本领域众所周知的技术，生成的分子能经受另外的成熟，例如亲和力成熟，该技术在本领域中众所周知。Wright和Harris，supra.，Hanes和Plucthau PEAS USA94：4937-4942(1997)(核糖展示技术)，Parmley和Smith Gene73：305-318(1988)(噬菌体展示技术)，Scott TIB517：241-245(1992)，Cwirla等人.PNAS USA 87：6378-6382(1990)，Russel等人.Nucl.Acids Research 21：1081-1085(1993)，Hoganboom等人.Immunol.Reviews 130：43-68(1992)，Chiswell和McCaffertyTIBTECH；10：80-8A(1992)，和美国专利第5,733,743号。如果展示技术用于生产抗体，而该抗体不是人抗体，这种抗体能按照上面描述的方法被人源化。

使用这些技术，抗体能被制成CD3表达细胞，CD3，CD3类型，表位或其肽，和表达文库(参见如，美国专利第5,703,057号)，随后筛选表达文库按照上面描述的用于活化。

其他治疗剂的设计和制备

依照本发明和基于抗体活性，能够制备并表征与CD3相关的抗体活性，便于设计抗体部分外的其他治疗剂形式。该形式包括，但不限于，先进的抗体治疗剂，如双特异性抗体，免疫毒素，和放射标记治疗剂，肽治疗剂的制备，基因治疗，特殊的体内基因治疗，反义治疗剂，和小分子。

例如，关于双特异性抗体，制备得到的双特异性抗体包括(i)两个抗体，一个对CD3具有特异性，另一个偶联第二个分子，(ii)具有一个链对CD3特异性的单一抗体和第二个链对第二个分子具有特异性，或(iii)对CD3和其他分子具有特异性的单一抗体。这种双特异性抗体能采用众所周知的方法制备得到，该方法关于(i)和(ii)参见，如Fanger等人.Immunol Methods 4：72-81(1994)和Wright和Harris，supra，关于(iii)，参见如，raunecker等人.Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992)。在每个情况中，第二个特异性能制成重链活化受体，包括，但不限于，CD 16或CD64(参见如，Deo等人.18：127(1997))或CD89(参见如，Valerius等人.Blood 90：4485-4492(1997))。依据先前所述的双特异性抗体将有可能杀死表达CD3细胞，尤其那些在本发明CD3抗体中有效的细胞。

关于免疫毒素，利用本领域众所周知的技术修饰抗体使之成为免疫毒素。参见如，Vitetta Immunol Today 14：252(1993)。参见美国专利No.5,194,594。关于放射标记抗体的制备，这种修饰抗体也能利用本领域众所周知的技术制备得到，参见如，Junghans等人在癌症的化学疗法和生物疗法(第二版，Chafher和Longo编辑Lippincott Raven(1996))第655-686页。也参见美国专利第4,681,581号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,102,990(RE35,500)号、第5,648,471号和第5,697,902号。每个免疫毒素和放射标记分子将可能杀死表达CD3的细胞，并且尤其在本发明的抗体中有效的那些细胞。

关于治疗肽的生成，经利用结构信息相关CD3和抗体，例如本发明的抗体或肽文库的筛选，生成的治疗肽能定向抗CD3。肽治疗剂的设计和筛选在Houghten等人.Biotechniques 13：412-421(1992)，Houghten PNAS USA 82：5131-5135(1985)，Pinalla等人.Biotechniques 13：901-905(1992)，Blake和Litzi-DavisBioConjugate Chem.3：510-513(1992)中进行了讨论。免疫毒素和放射标记分子与如上述讨论的关于抗体的肽类基团也能用类似的方式制备得到。假设CD3分子(或形式，如剪接异构体或互变形式)在患疾病过程中具有功能活性，也可能经常规方法设计基因和反义治疗剂。这种方法能用于调节CD3功能。本发明的抗体方便了相关功能试验的设计和使用。反义治疗剂的设计和方案在国际专利申请第WO 94/29444号中进行了详细讨论。基因治疗的设计和方案是众所周知的。然而，特别地，涉及体内基因治疗技术的使用证明具有显著优势。参见如，Chen等人.HumanGene Therapy 5：595-601(1994)和Marasco Gene Therapy 4：11-15(1997)。基因治疗剂的通常设计和注意事项在国际专利申请No.WO 97/38137中进行了讨论。

CD3分子结构和其与依据本发明的其他分子(例如本发明抗体)的相互作用的了解和其他方面能用于合理设计附加治疗方法。在这点上，合理药物设计技术如X射线晶体学，计算机辅助(或辅助的)分子模型(CAMM)、定量或定性结构-活性关系(QSAR)，和类似技术能用于进行药物研发。合理设计允许预测蛋白质或合成结构，该合成结构与分子或其特殊形式相互作用，合成结构用于修饰或调节CD3活性。这种结构能经化学合成制备出或生物系统中表达。该方法已经在Capsey等人.GeneticallyEngineered Human Therapeutic Drugs(Stockton Press，NY(1988))中进行了综述。另外，组合文库能被设计并合成，在筛选程序中使用，例如，大规模筛选研究。

治疗剂给药和配方

应了解，依照本发明，治疗剂实体将与载体、赋形剂、和加入到制剂中的其他药剂一起给药来提高传递、输送、耐受性等等。在药剂师处方手册中能找到大量合适配方：Remington′sPharmaceutical Sciences(15th ed，Mack Publishing Company，Easton，PA(1975))，尤其，其中Blaug，Seymour编写的87章。这些制剂包括，如粉末、贴剂、膏剂、凝胶剂、石蜡、油类、脂类、阳离子或阴离子油粒体(如Lipofectin^TM)、DNA偶联剂、无水吸收贴剂、水包油型乳化液和油包水型乳化液、聚乙二醇乳化剂(不同分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶、和含聚乙二醇的半固态混合物。依据本发明，一些先前的混合物在处理和治疗中是适宜的，但是制剂中的活性成分经配制不失活并且制剂是生理兼容并且与给药路线可以耐受。也参见Baldrick P.″药用赋形剂的发展：临床前指导的需要.″Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，Wang W.″动感法和固体蛋白药物的发展.″Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman WN″脂质体，亲脂性药物和口服药物释放系统概念.″J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)，Powell等人.″肠胃外制剂用赋形剂使用纲要″PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)和这里引用的关于药剂师周知的制剂、赋形剂和载体附加信息。

本发明的治疗剂用于治疗或缓解免疫相关疾病相关综合症，如，自体免疫疾病或炎性疾病，该治疗剂包括本发明的人CD3抗体。

自体免疫疾病包括，例如，获得性免疫力缺陷综合征(AIDS，为自体免疫组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自体免疫爱迪生疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、心肌病、乳糜泻-泡疹状皮肤炎；慢性疲劳免疫功能障碍症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克朗氏病、恶性萎缩性丘疹病、少年型皮肤肌炎、盘状红斑、原发性冷凝球蛋白症、纤维肌痛-纤维组织炎、突眼性甲状腺肿、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年慢性关节炎(Still病)、幼年型类风湿性关节炎、梅尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性免疫缺陷病、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、银屑病关节炎、雷诺现象、莱特氏症候群、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化病(PSS)、也如已知的系统性硬化(SS))、干燥综合征、僵人综合征、全身红斑性狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格内氏肉芽肿病。

炎性紊乱包括，如，慢性和急性炎性紊乱。炎性紊乱的实施例包括阿兹海默症、哮喘、异位反应性敏感、过敏、动脉硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病视网膜病变和呼吸器导致之肺损伤。

在一个实施方案中，本发明的人CD3抗体组合物与第二药剂如，GLP-1或β细胞静息化合物(例如，减少及其抑制胰岛素释放的化合物，如钾通道开放剂。适宜的GLP-1化合物的实施例在如发表的申请第20040037826号中进行了描述，适宜的β细胞静息化合物在发表的申请第20030235583号中进行了描述，每个通过全文引述并合并于本文中。

在另一个实施方案中，用于治疗免疫相关紊乱的人CD3抗体组合物联合多种已知的抗-炎性和/或免疫抑制化合物中的任何一种进行给药。适宜的已知化合物包括，但不限于甲氨蝶呤、环胞霉素A(包括，如环胞霉素微乳液)、他克莫司、皮质类固醇、降胆固醇类药物、β-干扰素、Remicade(英利昔单抗)、Enbrel(依坦西普)和Humira(阿达木单抗)。

例如，在风湿性关节炎的治疗中，本发明的人CD3抗体能与皮质类固醇、甲氨蝶呤、环胞霉素A、降胆固醇类药物、Remicade(英利昔单抗)、Enbrel(依坦西普)和/或Humira(阿达木单抗)一起联合给药。

在葡萄膜炎的治疗中，人CD3抗体组合物能联合如皮质类固醇、甲氨蝶呤、环胞霉素A、环磷酰胺和/或降胆固醇类药物一起给药。同样地。患有如克朗氏病或牛皮癣疾病的患者能采用本发明的人CD3抗体组合物和Remicaid(英利昔单抗)、和/或Humira(阿达木单抗)组合进行治疗。

患有多发性硬化症的患者能采用本发明的CD3抗体组合物联合如，醋酸格拉默(Copaxone)、β-La干扰素(Avonex)、β-La干扰素(Rebif)、干扰素-β-1b(Betaseron或Betaferon)、米托蒽醌(Novantrone)、地塞米松(Decadron)、甲基泼尼松龙(Depo-Medrol)、和/或泼尼松(Deltasone)和/或降胆固醇类药物组合进行治疗。

本发明也提供了治疗或缓解免疫相关疾病相关综合征或器官移植排斥相关综合征。例如，本发明的组合物用于治疗或缓解自体免疫疾病和这里描述的炎性疾病的任意一种的综合征。

本发明的治疗组合物也用作器官或组织移植的免疫抑制剂。依据这里使用的，“免疫抑制剂”统指作用于免疫系统导致即刻或延迟减少至少涉及免疫反应的一个通路活性，不论该反应是自然存在或人工诱发的，不论该反应作为先天性免疫系统、适应性免疫系统、或两者的一部分，这些免疫抑制人CD3抗体组合物在器官或组织移植之前、期间和/或之后对主体给药。例如，本发明的人CD3抗体用于治疗或预防器官或组织移植后的排斥。

在一个实施方案中，免疫抑制人CD3抗体组合物联合第二药剂如，GLP-1或β细胞休止化合物，按照上面描述的进行给药。

在另一个实施方案中，这些免疫抑制人CD3抗体组合物联合多种已知抗-炎性化合物和/或免疫抑制化合物的任何一种进行给药。与本发明的人CD3抗体一起使用的适宜抗炎性和/或免疫抑制化合物包括，但不限于，甲氨蝶呤、环胞霉素A(包括，如环胞霉素微乳液)、他克莫司、皮质类固醇、降胆固醇类药物。

而在本发明的另一个实施方案中，一检测到人体内存在自身反应性抗体就对人个体进行人CD3抗体给药。这种自身反应性抗体为本领域中已知的对人个体体内内原性表达的一个或一个以上蛋白具有结合亲和力的抗体。在本发明的一个方面中，测试人个体内自身反应性抗体的存在，该自身反应性抗体涉及本领域中众所周知的一个或一个以上自体免疫疾病。在一个具体实施方案中，测试人患者体内抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和/或IA-2蛋白抗体的存在并且随后一经阳性检测一个或一个以上这种自身反应性抗体就进行人CD3抗体给药。

在本发明的另一个实施方案中，对人主体进行人CD3抗体给药来阻止、减少或降低免疫细胞循环进入人组织内。对患者进行人CD3抗体给药来阻止和治疗循环进入人体疾病组织内的异常免疫细胞或不受调节免疫细胞相关的病症。

在本发明的另一个实施方案中，对人主体进行人CD3抗体给药来预防、减少或降低进入人体组织的免疫细胞的溢出物和血球渗出。因此，进行本发明的人CD3抗体给药来预防和/或治疗渗入人体疾病组织内的异常免疫细胞或不受调节免疫细胞相关的病症。

在本发明的另一个实施方案中，对人主体进行人CD3抗体给药来预防、减少或降低人体内释放细胞因子介导功效。术语“细胞因子”统指本领域中已知的所有人细胞因子，人细胞因子在细胞表面上结合细胞外受体从而调节细胞功能，包括但不限于IL-2、IFN-g、TNF-a、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、和IL-13。

释放细胞因子能导致周知的中毒症如细胞因子释放综合症(CRS)，使用如抗-T细胞抗体如ATG(抗胸腺细胞球蛋白)和OKT3(小鼠抗人CD3抗体)发生的普通临床性并发症。该综合症是以细胞因子如TNF、IFN-γ和IL-2过渡释放到循环中为特征。CRS为抗体对CD3(经抗体可变区)和Fc受体和/或其他细胞上补体受体(经抗体恒定区)的同时结合的结果，因此活化T细胞来释放细胞因子，该细胞因子产生以血压过低、发热和寒颤症状的全身性炎性反应。CRS综合症包括发烧、寒颤、恶心、呕吐、血压过低、和呼吸困难。因此，本发明的人CD3抗体包含设计预防一个或一个以上细胞因子体内异常释放和产生的一个或一个以上突变。

在本发明的另一个实施方案中，对人主体进行人CD3抗体给药来预防、减少或降低人体内释放细胞因子受体介导的功效。术语“细胞因子受体”统指本领域中的所有人细胞因子受体，人细胞因子受体结合一个或一个以上这里定义的细胞因子，人细胞因子受体包括但不限于前述细胞因子的受体。因此，实施本发明的人CD3抗体给药来治疗和/或预防经人体内异常活化、结合或连接一个或一个以上细胞因子受体介导的病症。进一步设想，体内实施人CD3抗体给药将耗尽该人主体内细胞因子受体介导的细胞内信号。

在本发明的一个方面中，一旦胰腺β细胞功能降低就对人个体实施人CD3抗体给药。在一个实施方案中，测试个体的β细胞功能、胰岛素分泌或本领域中已知的C肽水平。随后，一旦观察到任一指示剂的足够减少，就对人个体实施足够剂量方案的人CD3抗体给药来预防β细胞功能的自体免疫进一步破坏。

诊断和预防性制剂

本发明的完全人抗CD3MAbs用在诊断和预防性制剂中。在一个实施方案中，对患者实施本发明的人CD3MAbs给药，所述患者具有形成上述一种自体免疫疾病的风险。采用遗传型标记物、血清标记物或生物化学标记物能确定患有一种或一种以上前述自体免疫疾病的患者的患病因素。例如，独特HLA亚类型和血清抗体(抗胰岛素、GAD65和IA-2)的存在是I型糖尿病的特征。

在本发明的另一个实施方案中，对诊断患有一个或一个以上前述自体免疫疾病的人个体实施人CD3抗体给药。经诊断，实施人CD3抗体给药来减轻或逆转自体免疫功效。在这种实施例中，对诊断患有I型糖尿病的人个体实施足够剂量的人CD3抗体给药来恢复胰腺功能并最小化进入胰腺内的自体免疫渗入物造成的损害。在另一个实施方案中，对诊断患有风湿性关节炎的人个体实施人CD3抗体给药来减少进入关节内的免疫细胞渗入物和对关节的破坏。

本发明的抗体也对检测患者样本中的CD3有效并因此有助于诊断。例如，本发明的人抗CD3抗体用在体外测试中，如ELISA，来检测患者样本中CD3水平。

在一个实施方案中，本发明的人CD3抗体被固定在固体支撑物上(例如，微量滴定板的孔中)。固定抗体作为可测试验样本中存在的任意一种CD3的捕获抗体。用患者样本接触固定抗体之前，漂洗固定支撑物并用阻滞剂如水貂蛋白质或白蛋白处理固定支撑物来阻止分析物的非特异性吸收。

随后，用怀疑含有抗原的测试样本处理孔槽，或者用含有标准用量的抗原处理孔槽。这种样本可为，如，来自怀疑具有循环抗原的主体血清样本，该循环抗原被认为具有病理学诊断作用。漂洗测试样本或标准器后，用被可监测标记的第二抗体处理固体支撑物。标记的第二抗体作为检测抗体。测量监测标记水平，测试样本中的CD3抗原浓度通过与标准样本得到的标准曲线对比进行确定。

应了解的，基于体外诊断测试中采用本发明的人CD3抗体得到的结果，基于CD3抗原的表达水平，分级主体体内疾病是可能的。对于给定疾病，从疾病发展不同阶段诊断主体取得血液样本，和/或在疾病治疗的不同程度下诊断主体取得血液样本。使用一群样本，这些样本提供了进展或治疗每个阶段的统计显著性结果，可指定具有每个阶段特征的抗原浓度范围。

这里引用的所有出版物和专利文献通过引述全部并入本文中，就如同每个出版物或文献都进行了明确地逐个地说明，从而通过引证全部并入本文中。引用的出版物和专利文献并不表明其是现有技术文献，也不表明对其内容或日期的认可。本发明已经通过书面描述的方式进行了描述，本领域中的技术人员将认识到本发明能在多种实施方案中实施，并且先前描述和下面的实施例的目的为举例说明而不是对所附权利要求的限制。

实施例

下列实施例，包括进行的实验和得到的结果，仅以说明为目的而提供并不用于限制本发明。

实施例1：人CD3抗体的生成

免疫策略：为生成全人huCD3抗体，采用两个种类的转基因老鼠，老鼠和KMTM老鼠(Medarex，Princeton NJ)。初始致免疫方案紧接着生成小鼠抗体的文献中得到的论据充分的方案(参见如，Kung P，等人，Science；206(4416)：347-9(1979)；Kung PC，等人，Transplant Pr oc.(3 Suppl 1)：141-6(1980)；KungPC，等人，Int J Immunopharmacol.3(3)u75-81(1981))。本领域中周知的标准方案不能在

或KM^TM老鼠体内产生全人抗-CD3抗体。例如，下列免疫策略是失败的并在任一或KM^TM老鼠体内不产生功能抗体：

-仅采用胸腺细胞或仅采用T细胞免疫

-仅采用重组人CD3物质免疫

-采用弗氏佐剂中重组CD3物质免疫

-采用弗氏佐剂中细胞免疫

-采用与可溶CD3联合给药的胸腺细胞或T细胞免疫

-采用与重组CD3表达细胞联合给药的胸腺细胞或T细胞免疫

当这些现有技术免疫策略被用在BALB/c老鼠而不是或KM^TM小鼠中时，这些策略生成老鼠抗CD3抗体而不是人抗CD3抗体。

因此，通过改变下列参数形成新的免疫策略：

-采用的免疫原类型

-采用注射型佐剂的频率

-采用共刺激技术的类型

-采用的致免疫路线

-用于融合的二级淋巴组织的类型

形成的一系列新颖的免疫策略包括如，(i)采用仅表达CD3的病毒颗粒，和(ii)采用共刺激信号(例如，CD40、CD27或其组合)与T细胞、胸腺细胞，或与被转染表达重组CD3的细胞致免疫。

在第一个新颖方案中，这里统称为“超促进方案”，小鼠(Medarex，Inc.，Princeton，NJ)或KM^TM小鼠(Medarex，Inc.，Kirin)通过首次注射人细胞，如胸腺细胞或T细胞致免疫。在胸腺细胞或T细胞注射后的1到8周范围内时间点，对老鼠实施一个或一个以上“超促进”注射。超促进注射包括，例如可溶CD3蛋白(例如，重组可溶CD3蛋白)，胸腺细胞或T细胞的附加注射、CD3转染细胞、表达高水平CD3的病毒颗粒、和其组合。例如，超促进注射包含可溶CD3和CD3转染细胞的组合。

优选地，在超促进免疫方案中，在淋巴结和/或脾融合前6天和3天，对致免疫老鼠进行两个最终超促进注射。例如，在KM^TM小鼠体内，融合组织来自脾，并且在小鼠体内，融合组织来自淋巴结和/或脾组织。

在超促进免疫方案的一个实施例中，分别在第0天，第7天和第28天，采用人胸腺细胞(～10⁶个细胞)对一个HuMAb^TM小鼠致免疫三次。用编码人CD3δ和ε链(CHO/CD3，～10⁶个细胞)的cDNA转染的中国人卵巢癌细胞株在第47天和65天被注射。在第79天另外加量表达高水平CD3δε的病毒颗粒。最后，在第127天淋巴结融合前的第121天和第124天，用可溶重组人CD3δε给小鼠注射。

全部免疫皮下进行并采用Ribi(Corixa Corp.，Seattle WA)作为佐剂。总共8.5×10⁶个细胞被融合。筛选出的470个杂种瘤细胞中仅有7个产生完全人抗CD3抗体，并且所有完全人抗CD3抗体为IgM分子。这些抗CD3抗体中的两个被选作临床候选治疗剂(图1-3)。

在超促进免疫方案的第二个实施例中，在第0天和第25天，采用可溶重组人CD3δε对一个KM^TM小鼠致免疫两次。在第40天、第49天、第56天，人胸腺细胞(～10⁶个细胞)用于加强免疫。第70天、第77天、第84天和第91天，将可溶重组CD3δε注射两次。用编码人CD3δ和ε链(CHO/CD3，～10⁶个细胞)的cDNA转染的小鼠T细胞株在第98天被注射。最后，在第104天，脾融合前的第101天，对小鼠注射可溶重组人CD3δε。除了在第70天使用Ribi佐剂外，采用Alum作为佐剂进行腹膜内给药达到致免疫。在第0天、第25天、第84天和第91天，CpG被用作共刺激药剂。全部1.27×10⁸细胞被融合。筛选出的743个杂种瘤细胞中仅有5个产生完全人抗CD3抗体，并且所有完全人抗CD3抗体为IgG分子。这些完全人抗CD3抗体中的一个被选作临床候选治疗剂(图4)。

筛选标准：临床候选治疗剂采用下列标准选出。首先，分析结合CD3阳性细胞抗体对比结合CD3阴性细胞抗体。为此，采用不同抗体培养Jurkat CD3阳性细胞(J+)和Jurkat阴性细胞(J-)并且通过流式细胞仪评估结合(图9A)。第二，候选抗体抑制小鼠抗人OKT3单克隆抗体结合CD3阳性细胞的能力中的竞争测试，采用J+细胞进行评价，并且通过流式细胞仪评估竞争(图9B)。下一个，CD3抗原调节和人外周血T细胞表面的TCR采用流式细胞仪进行评估(图9C)。最后，采用经CFSE染色的人外周血T细胞实施T细胞增殖试验并经流式细胞仪评估细胞分裂(图9D)。

实施例2：人抗CD3抗体的同型交换

采用实施例1中描述的新颖方案制备得到的一些人CD3抗体为IgM抗体。这些IgM抗体被转变为IgG抗体，优选转变为IgG1抗体。例如，IgM抗体经克隆方法被转变，其中编码IgM抗体的基因的VDJ区被克隆到IgG1重链基因上，该IgG 1重链基因从含有编码同种抗原免疫球蛋白Fγ1的介质中得到。为轻链的转变，IgM序列被克隆到含有κ区的介质中。在Medarex老鼠体内，如

小鼠体内，由于缺少等位基因排除，生成多发性轻链。

依据制造商实施指南，采用FuGENE 6(Roche Diagnostics)转染药剂，每个重链和轻链的组合被转染到293T细胞中。采用实施例1中描述的筛选标准，测试分泌得到的单克隆抗体的最佳机能，例如，靶标抗原结合。

实施例3：采用人CD3抗体实施抗原调制作用

本发明的人CD3抗体具有抗原调节能力，被定义为经抗体结合诱发的CD3-TCR复合物的重新分配和清除。T细胞上其他分子的细胞表面表达，包括，如CD4经接触本发明的抗CD3抗体没有被改变(图9C)。

实施例4：人CD3抗体产生的减少毒性细胞因子释放综合症

优选地，本发明的人CD3抗体包括Fc区内的突变，使得突变改变了细胞因子释放综合症。如上面描述的，细胞因子释放综合症(CRS)为普通立即并发症，立即并发症与抗T细胞抗体，如ATG(抗-胸腺细胞免疫球蛋白)和OKT3(小鼠抗CD3抗体)一起使用而发生。该综合症是以细胞因子如TNF、IFN-γ和IL-2过渡释放到循环中为特征。活化T细胞来释放的细胞因子产生全身性炎性反应，该全身性炎性反应类似于以血压过低、发热和寒颤症状的严重感染中发现的全身性炎性反应。CRS综合症包括发烧、寒颤、恶心、呕吐、血压过低、和呼吸困难。

本发明的人CD3抗体包含一个或一个以上突变，该突变阻止重链轻链恒定区介导体内释放一个或一个以上细胞因子。在一个实施方案中，本发明的人CD3抗体为具有修饰IgGγ1骨架：“γ1N297A”中一个或多个下列突变的IgG分子，其中297位点的天冬酰胺残基由丙氨酸残基取代；“γ1 L234/A，L235/A”，其中位点234和235的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代；“γ1 L234/A；L235/E”，其中位点234的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代，然而位点235的亮氨酸残基由谷氨酸残基取代；“γ1 L235/E”，其中位点235的亮氨酸残基由谷氨酸残基取代；并且“γ1 D265/A”，其中位点265的天冬氨酸残基由丙氨酸残基取代。这里描述的重链残基的编号方式为EU index(参见Kabat等人的文献″具有免疫影响的蛋白质″，美国健康和公共事业部(1983))，按照如在美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中所示，所述文献通过引证全部并入本文中。

其他的在本发明的人CD3抗体中使用的IgGγ1骨架修饰包括，如″A330/S″，其中位点330的丙氨酸残基由丝氨酸残基取代，和/或“P331/S”，其中331位点的脯氨酸残基由丝氨酸残基取代。

Fc区域内L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变的本发明的完全人CD3抗体具有独一无二的功能-在完全人CD3抗体存在下清除细胞因子释放。现有研究实际上远离L→E的使用(参见，如Xu等人.，Cellular Immunology，200，pp.16-26(2000)，at p.23)。然而，位点234和235处的这些独特的两个突变(例如，L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵)清除了细胞因子释放综合症，按照体外测定系统评估的外周人血液单核细胞(图11A，11B)。在这个试验中，采用Ficoll密度梯度法分离外周人血液单核细胞，用CFSE进行标记，然后把CFSE标记细胞置于96孔培养板内。向不同的稀释液中加入不同的单克隆抗体，在37℃下孵育72个小时。6个小时后，取出50μl上层清液，采用ELISA方法来评估TNF释放。48小时后，取出50μl上层清液，采用ELISA方法来评估IFN-γ释放。72小时后，收集细胞并采用CFSE标记强度，经FACS方法评估增殖。

因此，相对于野生型重链，和相对于已经描述的一系列其他突变(例如，TolerX(糖基化突变)、Bluestone(L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变)(参见如，美国专利第5,885,573号))，所有保持了显著性水平的细胞因子释放功效，本发明的人CD3抗体的L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵突变不显示细胞因子释放现象。保持细胞因子释放功效的水平相对野生型Fc为100％，相对Bluestone(L²³⁴L²³⁵→A²³⁴E²³⁵)为约50 to 60％，相对这里描述的Ala/Glu Fc突变检测不到(图11A，11B)。

实施例5：人CD3抗体结合表位的肽阵列鉴别

大量肽的合成和ELISA筛选已经用于确定氨基酸残基，所述氨基酸残基包括不同单克隆抗体表位。(参见，如Geysen等人，J Immunol Methods，vol.102(2)：259-74(1987))。在这里描述的实施方案中，来自CD3ε链的氨基酸序列的重叠肽阵列购于Jerini(柏林，德国)并且随后经本发明的完全人CD3mAbs测试结合形式

采用用在膜支撑体上定向化学合成的“SPOT合成”技术制备阵列中的肽(参见，Frank和Overwin，Meth MoI Biol，vol.66：149-169(1996)；Kramer和Schneider-Mergener，Meth MoIBiol，vol.87：25-39(1998))。直线型14-mer肽C末端与Whatman 50纤维素载体共价结合，剩下游离的N末端(例如，非结合的)。采用标准蛋白质分子印迹技术，这些固相结合肽显示出28F11单克隆抗体识别邻近N末端的重叠组氨基酸(图.10)。

其他等同物

本发明通过前面的详细描述而被描述了，先前描述目的在于说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围是由附加的权利要求所界定的。本发明其他的方面、优势、和修改都在所附权利要求范围内。

Claims (5)

1.一种分离的完全人单克隆抗体，其中所述抗体具有三个互补决定区(CDR)的重链区和三个CDR的轻链，其中，所述CDR的重链区包括氨基酸序列为GYGMH(序列号：27)的VH  CDR1、氨基酸序列为VIWYDGSKKYYVDSVKG(序列号：28)的VH CDR2和氨基酸序列为QMGYWHFDL(序列号：29)的VH CDR3；所述CDR的轻链包括氨基酸序列为RASQSVSSYLA(序列号：30)的VL CDR1、氨基酸序列为DASNRAT(序列号：31)的VL CDR2和氨基酸序列为QQRSNWPPLT(序列号：32)的VL CDR3；并且，其中所述抗体结合CD3。

2.一种分离的完全人单克隆抗体，其中所述抗体包括序列号2的氨基酸序列的重链可变区和序列号4的氨基酸序列组成的轻链可变区，以及其中所述抗体结合CD3。

3.根据权利要求1所述的分离的完全人单克隆抗体，其中上述抗体进一步包括序列号2的氨基酸序列的重链可变区和序列号4的氨基酸序列组成的轻链可变区。

4.根据权利要求1所述的分离的完全人单克隆抗体，其中所述抗体是IgG1型，其中所述抗体进一步包括由氨基酸序列号2组成的重链可变区和由氨基酸序列号4组成的轻链可变区，并且，其中所述抗体包括在重链中位点234和235位点处的氨基酸残基的突变，其中，所述突变在位点234处产生丙氨酸在位点235处产生丙氨酸或谷氨酸，并且其中，跟在不包括重链中位点234和235处氨基酸残基突变抗体的条件下从T细胞中释放出的细胞因子相比较，在上述抗体存在下从T细胞中释放出的细胞因子有所减少。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的分离的完全人单克隆抗体，其中所述抗体是IgG1型。

Images