CN115850477A - 一种抗人4-1bb单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，公开了一种抗人4‑1BB单克隆抗体及其应用。本发明中利用噬菌体展示技术，相较于杂交瘤技术，噬菌体展示技术可以呈现免疫动物的整个抗体库，省去细胞融合步骤，避免了因杂交瘤不稳定而反复亚克隆的繁琐程序，极大的提高库容量，从杂交瘤的几千个克隆升至109个。本发明筛选得到的抗人4‑1BB单克隆抗体在体外细胞水平验证中，明显增加细胞因子IFN‑γ的产生及提高TIL中CD8+细胞比例，具有较好的激活特性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗人4-1BB单克隆抗体及其应用。
背景技术
4-1BB又名CD137，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，由肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)基因编码，在活化后表达于多种免疫细胞上，包括T细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。通过4-1BB信号传导可诱导细胞因子诱导，防止活化诱导的细胞死亡，并上调细胞毒性T细胞活性；4-1BB也可能减少调节性T细胞对肿瘤的浸润。
现有的4-1BB抗体还未有上市的药物，目前多处于临床及临床前研究阶段，在结合抗原活性、激活T细胞下游信号等方面还有许多的不足。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种抗人4-1BB单克隆抗体，能够特异性的与4-1BB分子结合并表现对免疫细胞的激活特性，可通过免疫调节作用对多种癌症的治疗具有应用潜力。
本发明的第一个目的是提供了一种抗人4-1BB单克隆抗体，
(1)、所述抗人4-1BB单克隆抗体的重链可变区的三个CDR区：CDR1(GDSITSGY)、CDR2(KSYSGST)和CDR3(ARSLLWLGAMDY)的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、2和3所示；且
(2)、所述抗人4-1BB单克隆抗体的轻链可变区的三个CDR区：CDR1(QDVGTA)、CDR2(WAS)和CDR3(QQYSSYPYT)的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4、5和6所示。
进一步地，所述的抗人4-1BB单克隆抗体具有：
(3)、其重链具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列(QMQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWTWIRKFPGNRLEYMGFKSYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARSLLWLGAMDYWGQGTSVTVSS)，且
(4)、其轻链具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列(MADIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEMKR)。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的抗人4-1BB单克隆抗体的核酸分子。
本发明的第三个目的是提供一种表达载体，含有所述的核酸分子。
本发明的第四个目的是提供一种重组细胞，含有所述的核酸分子，或含有所述的表达载体。
进一步地，所述的重组细胞的宿主细胞为CHO细胞、HEK293细胞、酵母细胞或植物细胞。
宿主细胞用于抗体的瞬时表达和稳定细胞系的构建，实现所述抗体的科研和产业化生产。
本发明的第五个目的是提供所述的单克隆抗体在制备4-1BB介导的疾病的治疗和预防药物中的应用。
进一步地，所述的疾病为肿瘤。
进一步地，所述的肿瘤为肺癌、胃癌、肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌。
本发明的第六个目的是提供一种药物组合物，包含：
(1)所述的抗人4-1BB单克隆抗体；和，
(2)药学上可接受的载体。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明中利用噬菌体展示技术，相较于杂交瘤技术，噬菌体展示技术可以呈现免疫动物的整个抗体库，省去细胞融合步骤，避免了因杂交瘤不稳定而反复亚克隆的繁琐程序，极大的提高库容量，从杂交瘤的几千个克隆升至109个。本发明筛选得到的抗人4-1BB单克隆抗体在体外细胞水平验证中，明显增加细胞因子IFN-γ的产生及提高TIL中CD8+细胞比例，具有较好的激活特性。
上述说明仅是本发明技术方案和部分结果的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1、重组4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白的SDS-PAGE检测图谱；
图2、重组4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白的结合活性；
图3、重组4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白免疫小鼠效价检测；
图4、抗体轻、重链可变区基因的扩增；
图5、抗体scFv基因的扩增；
图6、ELISA检测4-1BB抗体亲和力；
图7、4-1BB抗体对PBMC刺激效果中IFN-γ分泌检测；
图8、4-1BB抗体在TIL细胞培养中对CD8+T细胞的增殖作用。
具体实施方式
本发明公开了抗人4-1BB单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语：
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。
“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。
抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。
“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。
“人源化抗体”是指一种抗体，其包含来源于非人源抗体的CDR区、并且该抗体分子的其他部分来源于一种(或几种)人抗体。而且，为了保留结合亲和力，可以修饰骨架(称为FR)区段的一些残基。
所述“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。
本文使用的“CDR区”或“CDR”是指抗体的重链和轻链的高变区。存在三个重链CDR和三个轻链CDR。根据情况，本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体展示技术可以直接得到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体。
本发明提供的抗人4-1BB单克隆抗体及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Human 4-1BB 24位至186位氨基酸序列与人IgG1 Fc区的融合蛋白(4-1BB-huIgG1 Fc)的表达载体构建与真核表达
1.Human 4-1BB 24位至186位氨基酸区间的基因序列的合成及4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白的表达载体的构建
通过化学合成的方式合成Human 4-1BB的第24位至第186位区间的基因序列。通过化学合成的方式合成人IgG1重链恒定区的第100位脯氨酸至第330位赖氨酸氨酸区间的基因序列。通过分子克隆，将Human 4-1BB基因片段与人IgG1 Fc基因片段进行拼接。拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1(Thermo)中。
2.重组4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白的表达与纯化
以此表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTA explorer 100(GE)纯化重组4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白。由于糖基化修饰等原因，重组4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约60k道尔顿。结果如图1所示。
实施例2：ELISA检测重组人4-1BB(4-1BB-huIgG1 Fc)与Biotinylated Human 4-1BB Ligand的结合
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测重组人4-1BB(4-1BB-huIgG1 Fc)与Biotinylated Human 4-1BB Ligand的结合，ELISA实验具体操作如下：微孔板中加入上文制备的4-1BB-huIgG1 Fc蛋白100ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。100ul PBS洗板后加入起始浓度50ng/孔梯度稀释的Biotinylated Human 4-1BB Ligand，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100ul 1:5000稀释的HRP-Streptavidin 37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。OD450数值可反映Biotinylated Human 4-1BB Ligand与重组人4-1BB的结合情况从而确定表达的重组人4-1BB可用于小鼠免疫。实验结果如图2。
实施例3：抗人4-1BB鼠源抗体的制备
1.免疫动物
将2mg/mL的4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白作为抗原与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合乳化，取5只6周大雌性Balb/c小鼠(进行皮下免疫，每只100ug抗原。在初次免疫后，每十天时间进行一次加强免疫，共执行四次皮下免疫，第五次免疫时直接用4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白进行脾脏冲击免疫。
2.血清效价检测
每次加强免疫前尾静脉取血50uL，离心去除细胞，保留血清。ELISA微孔板中加入4-1BB-his(ACRO Biosystems)50ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。加入梯度稀释的小鼠血清，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100ul 1:5000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(上海翊胜)37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。图3所示。
3.构建免疫文库
3.1小鼠脾细胞总cDNA获取
在用4-1BB-huIgG1 Fc融合蛋白直接进行腹腔注射方式进行冲击免疫后四天处死小鼠，取脾脏。用70微米细胞筛网研磨整个脾脏，获取脾脏细胞。用PBS冲洗两遍后，500g离心5分钟，获取脾脏细胞。使用Trizol RNA提取试剂盒抽提总RNA。以所述RNA为模板，使用SuperScriptTM IV First-Strand Synthesis System试剂盒合成第一链cDNA。
3.2抗体基因扩增与轻重链拼接
以所述cDNA为模板，参考文献所述的抗体扩增引物(Schaefer J.V.,HoneggerA.,Plückthun A.(2010)Construction of scFv Fragments from Hybridoma or SpleenCells by PCR Assembly.In:Kontermann R.,Dübel S.(eds)AntibodyEngineering.Springer Protocols Handbooks.Springer,Berlin,Heidelberg)，使用重链可变域上游引物和下游引物PCR扩增重链可变域基因，使用轻链可变域上游引物和下游引物引物PCR扩增卡帕链可变域基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL phusion mastermix(NEB)，上游引物2.5uL(25pmol)，下游引物2.5uL(25pmol)，1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。图4所示抗体轻、重链可变区基因的扩增。
使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的VH基因和VL基因。将等量的VH基因和VL基因混合后为模板，利用上游引物scFv-F和下游引物scFv-R通过重叠PCR扩增scFv基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL phusion master mix，上游引物2.5uL(25pmol)，下游引物2.5uL(25pmol)，1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的scFv基因片段。图5抗体scFv基因的扩增所示。
3.3构建免疫文库
分别使用SfiI DNA内切酶消化scFv基因片段和pcomb3XTT载体(美国Scripps研究所)。在50uL反应体系中，分别加入SfiI 2uL，10x缓冲液5uL，DNA 3ug，加ddH2O至50uL。充分混匀后，50℃孵育3小时。
使用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的scFv基因片段和pcomb3XTT载体。使用T4连接酶环化酶切后的scFv基因片段和酶切后的pcomb3XTT载体。在50uL反应体系中，分别加入T4连接酶1uL，10x缓冲液5uL，scFv基因100ng，pComb3XTT载体500ng，加ddH2O至50uL。充分混匀后，4℃孵育16小时。取少量产物通过琼脂糖凝胶电泳验证连接效率。
将10uL上述连接环化产物加入自制的TG1电转化感受态中，然后通过电转仪进行电击转化。取出10ul电转化后的细菌通过合理的稀释并在含有氨苄青霉素的平板上划线，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌加入含100ug/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT培养基，置于加热培养箱培养。培养结束后在4℃以4000G离心10分钟，在沉淀菌中补充适量甘油储存于-80℃作为抗体菌种库。通过多次电转化积累获得超过2E9库容的scFv免疫文库。
4.鼠源免疫抗体噬菌体文库的筛选与鉴定
4.1生物淘选
以Biotinylated Human 4-1BB Protein,His,AvitagTM(ACROBiosystems)融合蛋白为目标蛋白应用生物淘选，对上述鼠源免疫抗体文库进行生物淘选获得与4-1BB结合的抗体。从抗体菌种库中取100OD细菌以起始OD600＝0.1密度复苏并生长至对数期后应用M13KO7辅助噬菌体挽救抗体文库，离心后用含有氨苄青霉素和卡那霉素的2xYT培养基重悬并在30℃过夜扩增。PEG/NaCl沉淀噬菌体，用甘油/PBST溶解噬菌体沉淀获得免疫库噬菌体悬液。将收集到的噬菌体悬液投入酪蛋白封闭的Biotinylated Human 4-1BB Protein和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，用PBST清洗磁珠去除无法与4-1BB结合的噬菌体。在适当的洗脱条件下洗脱。留取10ul洗脱的噬菌体溶液用于测定输出噬菌体总量，剩余噬菌体溶液用于感染对数增长的TG1，过夜扩增后视为下一轮淘选使用的抗体文库。生物淘选共执行三轮。
4.2初筛克隆鉴定
将第三轮生物淘选结束后获得的抗体文库进行稀释涂布于含有氨苄青霉素的平板上获得单克隆，挑选单克隆在深孔板中过夜培养。次日将深孔板进行反复三次冻融，离心上清用于后续两类ELISA反应。
检测结合活性的ELISA反应：利用100ng 4-1BB-his过夜包被，PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍后加入100ul离心上清37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100ul 1:5000稀释的HRP偶联的山羊抗鼠IgG(Fab特异性的)(Thermo)。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。将候选克隆进行测序，获取抗体轻链可变域和重链可变域序列命名为GT1C8。结果表1所示。
表1
| OD450 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 0.1329 | 0.2328 | 0.0227 | 0.0231 | 0.0339 | 0.0213 | 0.0232 | 0.0191 | 0.0239 | 0.028 | 0.0228 | 0.0618 |
| B | 0.0341 | 0.3204 | 0.0218 | 0.0143 | 0.0211 | 0.0152 | 0.0223 | 0.0607 | 0.2248 | 0.0169 | 0.0156 | 1.4981 |
| C | 0.0485 | 0.2199 | 0.2726 | 0.2216 | 1.0348 | 0.2136 | 0.2129 | 1.1248 | 0.016 | 0.4981 | 0.0162 | 0.0874 |
| D | 0.0332 | 0.0159 | 0.0171 | 0.0198 | 0.0207 | 0.017 | 0.0165 | 0.1248 | 0.0152 | 0.1248 | 0.0178 | 0.0902 |
| E | 0.2021 | 0.0202 | 0.0156 | 0.0176 | 0.0253 | 0.0396 | 0.0328 | 0.024 | 0.0179 | 0.9018 | 0.0158 | 0.08 |
| F | 0.0295 | 0.0199 | 1.0837 | 1.2021 | 0.0564 | 0.0428 | 0.0349 | 0.0196 | 0.0428 | 0.0169 | 0.0271 | 0.092 |
| G | 0.028 | 0.0327 | 0.0837 | 0.0187 | 0.2221 | 0.0446 | 0.0168 | 0.2251 | 0.2187 | 0.0172 | 0.0195 | 0.0348 |
| H | 0.0491 | 0.0262 | 0.049 | 0.2295 | 0.0265 | 0.2295 | 0.0313 | 0.0308 | 0.0311 | 0.026 | 0.0275 | 0.0772 |
4.3表达GT1C8克隆hIgG1形式抗体
分别将GT1C8的重链可变区序列克隆至pFUSEss-CHIg-hG1中。分别将GT1C8轻链可变区序列克隆至pFUSE2ss-CLIg-hK中。分别以此双质粒1:1比例共转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTA explorer 100(GE)纯化6H6抗体。GT1C8抗体经非还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约150k道尔顿。
实施例4：抗4-1BB鼠抗的初步体外评价
1.huIgG1型4-1BB抗体体外结合试验
利用ELISA进行4-1BB抗体亲和力测定，验证GT1C8的huIgG1抗体的亲和力：四度过夜包被Human 4-1BB/TNFRSF9 Protein，His Tag(ACRO Biosystems)1ug/ml 100ul每孔，洗板拍干后利用1％BSA in PBS 200ul/well 37℃孵育1小时进行封闭。0.1％PBST洗板3次拍干后用加入GT1C8 huIgG1型抗体室温孵育1小时(从10ug/ml起始两倍梯度稀释，共15个梯度)。0.1％PBST洗板3次，加入Goat anti-Mouse IgG F(ab')2Secondary Antibody,HRP(Thermo)(1:10000稀释)室温孵育1小时。0.1％PBST洗板6次后加入TMB显色液100ul每孔室温孵育10分钟，加入终止液100ul每孔后利用酶标仪进行OD450读数。对数据进行分析处理，计算得GT1C8的huIgG1抗体与4-1BB结合的EC50为0.1018ug/ml，如图6所示。
2.体外验证GT1C8抗体的激动活性
将人的全血使用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，将分好的PBMC用anti-CD3抗体(1μg/mL)活化培养三天。将4-1BB抗体用PBS稀释至20ug/ml、10ug/ml、1ug/ml 50ul/well四度过夜包被。对照组加入等量的50ul/well的huIgG1同型对照(与4-1BB抗体具有相同种属来源、相同亚型、相同剂量免疫球蛋白IgG，与4-1BB靶点不会有反应)。PBMC活化后与不同浓度的4-1BB抗体，培养过夜经ELISA的方法测定IFN-γ分泌量，通过IFN-γ分泌的测定间接反应抗体对PBMC细胞的激活活性。结果如图7所示，GT1C8对不同的供着的PBMC刺激效果中IFN-γ分泌量较同型对照均有提高，显示出较强的激动活性。
实施例5：4-1BB抗体在TIL细胞培养中对CD8+T细胞的增殖作用
从液氮或干冰中取出冻存的preREP donor(0614/1003)，于37℃水浴中复苏，化冻后迅速将细胞转移至预热的培养基中，离心500g，5min。离心后弃上清，使用1mL培养基吹吸混匀细胞，补充培养基至适当体积以便计数，取样细胞悬液计数细胞，根据计数结果补充培养基调节细胞密度至1E6个/mL，1mL/24well分别加入CD3抗体30ng/mL溶解，IL-2 3000IU/mL，加入不同浓度4-1BB抗体及同型对照抗体，培养48h后添加PBMC feeder，均按照活化时细胞数添加feeder比例为1:200，调整feeder细胞密度为1E7/ml，培养两周后细胞计数及流式检测，实验结果如图8所示，加入4-1BB抗体后明显细胞增值数目高于对照组，并且细胞中CD8+T细胞比例增加，且4-1BB抗体浓度10ug/ml组明显好于1ug/ml组。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种抗人4-1BB单克隆抗体，其特征在于，
(1)、所述抗人4-1BB单克隆抗体的重链可变区的三个CDR区：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、2和3所示；且
(2)、所述抗人4-1BB单克隆抗体的轻链可变区的三个CDR区：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4、5和6所示。
2.根据权利要求1所述的抗人4-1BB单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人4-1BB单克隆抗体具有：
(3)、其重链具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列，且
(4)、其轻链具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核酸分子。
4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸分子。
5.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸分子，或含有权利要求4所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞的宿主细胞为CHO细胞、HEK293细胞、酵母细胞或植物细胞。
7.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备4-1BB介导的疾病的治疗和预防药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肿瘤。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌、胃癌、肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含：
(1)权利要求1或2所述的抗人4-1BB单克隆抗体；和，
(2)药学上可接受的载体。
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