CN114539423B

CN114539423B - 一种三特异性融合蛋白及其用途

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Publication number: CN114539423B
Application number: CN202011357136.XA
Authority: CN
Inventors: 王建祥; 王敏; 陈曼玲; 饶青; 熊冬生; 廖晓龙; 徐颖茜; 邢海燕
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN114539423A

Abstract

本发明公开了一种三特异性融合蛋白，其包含：a)肿瘤表面抗原结合部分；b)共刺激分子；c)CD3结合部分；以及d)上述三部分的连接体。该蛋白能够有效地与B淋巴细胞白血病、淋巴瘤细胞特异性结合，与T细胞特异性结合，在体外能够有效地活化T细胞，促进T细胞增殖，介导T细胞杀伤肿瘤细胞。该融合蛋白用于临床，将对B淋巴细胞白血病、淋巴瘤具有治疗作用。

Description

一种三特异性融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种三特异性融合蛋白及其用途。

背景技术

肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应是机体清除肿瘤细胞的主要手段，在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应答。第一个信号是抗原特异性的，由T细胞受体(TCR)及结合特异性抗原的MHC-Ⅰ或Ⅱ类分子介导的，第二个信号是由抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子(如CD80分子)与T细胞表面分子(如CD28)反应介导的。肿瘤细胞通过下调参与T细胞识别及抗原反应的分子表达、降低免疫原性等途径逃逸机体的免疫监视。第二个信号缺失将导致T细胞产生“免疫无能”，从而阻止了肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)的克隆性扩增。

研究发现，肿瘤细胞表面共刺激分子CD80表达降低,这种共刺激分子信号的缺失可能是肿瘤细胞逃逸免疫监视、因而不能引起机体免疫应答及激活肿瘤特异性T细胞的机制，用转基因方法将CD80基因转入肿瘤细胞，可以提高肿瘤细胞的免疫原性，引起T细胞介导的免疫反应，使机体不仅可以清除CD80⁺肿瘤细胞，而且可以清除没有转染CD80的原代肿瘤细胞。有研究发现，肾肿瘤细胞系RCC-1不表达CD80、在体外不能刺激自身T细胞，转染CD80后的RCC-1细胞可以诱导很强的自身CTL反应。这些实验结果表明，CD80的表达具有诱导肿瘤特异性免疫反应及肿瘤免疫治疗的潜能。

以淋巴细胞白血病为例。急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)以及B细胞淋巴瘤的临床治疗，目前主要以化疗为主，但疗效较差，虽然可以取得暂时的缓解，然而生存期较短。因此，降低白血病的病死率，改善淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗方法是世界医学正在攻克的一个重点。ALL是恶性克隆增殖性疾病，可导致大量不成熟前体淋巴细胞体内积聚和浸润，占所有儿童急性白血病的85％和成人急性白血病的20％，在所有白血病中占25％，是一种十分常见的血液系统恶性肿瘤。根据白血病细胞的免疫表型，可将ALL患者分成B细胞ALL(B-ALL)或T细胞ALL(T-ALL)两类，其中B-ALL占全部ALL患者的70-80％。

近年来儿童ALL患者的临床预后得到了明显改善。但成人ALL患者的临床疗效仍然较差，大多数患者不能获得长期无病生存。

因此，除了临床常规疗法外，一些新的免疫疗法发展迅速，如CAR-T治疗、单克隆抗体、双特异性T细胞衔接器抗体等。CAR-T治疗取得了一定的效果，但其制备工艺复杂。而应用简便的抗体类药物如双特异性衔接器博纳吐单抗(Blincyto)较常规化学疗法有更好治疗效果，但该抗体只针对T细胞表面CD3受体复合物。因此需要找到一种新的治疗药物和手段来解决上述问题。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有肿瘤治疗方法中的化学疗法效果差、细胞疗法工艺复杂的缺点，提供了一种三特异性融合蛋白及其用途。

本发明提供的技术方案为：

一种三特异性融合蛋白，其包含：

a)肿瘤表面抗原结合部分；

b)共刺激分子；

c)CD3结合部分；以及

d)上述三部分的连接体。

在本发明的技术方案中，发明人从免疫疗法入手，利用例如，基因工程的方法构建、表达三特异性融合蛋白，利用肿瘤细胞表面抗原作为表面标记，将三特异性融合蛋白结合到肿瘤细胞表面，利用CD3表面抗原作为人T细胞的表面标记，通过结合三特异性融合蛋白中的CD3结合部分，将人T细胞与肿瘤细胞拉近，并且激活T细胞。同时利用三特异性融合蛋白中的共刺激分子与人T细胞上表面分子结合产生T细胞第二激活信号，全面激活T细胞，使其发挥肿瘤细胞杀伤作用。

更具体地，在本发明的一个实施方式中，发明人利用基因工程方法构建、表达了CD19scFv-CD80-CD3scFv三特异性融合蛋白(标记为19TriTE)，以实现上述目的。

在本发明中，作为优选，在本发明的一个实施方式中，a)中所述肿瘤表面抗原为实体瘤表面抗原或血液肿瘤表面抗原。

更优选地，在本发明的实施方式中，上述实体瘤表面抗原为EGFR和/或VEGF，上述血液肿瘤表面抗原为选自CD19、CD20、CD22中的一种或两种。。

当肿瘤表面抗原为多个时，上述肿瘤表面抗原结合部分可以为多个相互耦联，共同结合肿瘤细胞表面抗原的结合部分。例如，CD19和CD22双特异性抗体分子，其可以同时结合于B淋巴细胞表面，从而起到增强靶向性的作用。

进一步优选地，在本发明的一个实施方式中，上述肿瘤表面抗原结合部分为结合CD19的抗原结合部分。

上述结合CD19的抗原结合部分可以为任意合适的序列，其可以通过抗原抗体的结合、受体配体的结合等方式形成蛋白质-蛋白质复合物。

CD19是B淋巴细胞表面特有的抗原分子。CD19几乎表达于所有的B-ALL和淋巴瘤细胞表面，在B系正常造血细胞表面表达，而在正常非造血组织中没有表达，因此CD19是治疗B细胞血液肿瘤的重要靶点。

上述抗CD19的抗原结合部分可以为任意合适的形式，包括但不限于，Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体(scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述结合CD19的抗原结合部分为抗CD19scFv，所述抗CD19scFv的氨基酸序列为如SEQIDNo.3所示或与其具有80％以上同一性的序列。

上述与其具有80％以上同一性的序列可以为至少与其具有80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％同一性的序列。

另外，在本发明中，可以对上述抗CD19scFv的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质、获得更好的表达效果，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。

在本发明中，b)所述的共刺激分子是为T细胞或B细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子及其配体，为T细胞的激活提供第二信号。

作为优选，在本发明的实施方式中，所述共刺激分子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有80％以上同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD80、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共刺激分子为如SEQIDNo.5所示的CD80的胞外区氨基酸序列或与其具有80％以上同一性的序列。

在本发明中，c)中所述的CD3结合部分可以为任意合适的能够结合CD3的序列，其可以通过抗原抗体的结合、受体配体的结合等方式形成蛋白质-蛋白质复合物。

上述CD3的结合部分可以为任意合适的形式，包括但不限于，Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体(scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述CD3结合部分为抗CD3scFv，所述CD3结合部分为抗CD3scFv，所述抗CD3scFv的氨基酸序列为如SEQIDNo.4所示或与其具有80％以上同一性的序列。

在本发明中，d)中所述连接体用于连接a)、b)、c)三个部分，除此之外，通过特殊的连接体，还可以增强融合蛋白的功能。常用的连接体(linker)例如，(GGGGS)₃序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述连接体为如SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或与其具有80％以上同一性的序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列为如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或与其具有80％以上同一性的序列。

在本发明中，所述CD19scFv及CD3scFv为鼠抗人CD19抗体轻链和重链、以及鼠抗人CD3抗体轻链和重链构成的scFv的氨基酸序列，可以对所述轻链和重链进行不同顺序的组合，其目的可以为，例如获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些抗体轻重链不同顺序组合而成的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。

另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。

进一步地，在本发明中，发明人发现，CD3scFv、CD19scFv及CD80的排列顺序对其组合后产生的杀伤肿瘤细胞的作用有很大影响。因此，作为优选，在本发明的实施方式中，所述a)肿瘤表面抗原结合部分、b)共刺激分子和c)CD3结合部分的连接顺序为：5’－a)－b)－c)－3’，5’－b)－a)－c)－3’，或5’－a)－c)－b)－3’。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤表面抗原结合部分为抗CD19scFv，所述抗CD19scFv的氨基酸序列为如SEQIDNo.3所示或与其具有80％以上同一性的序列；

所述CD3结合部分为抗CD3scFv，所述抗CD3scFv的氨基酸序列为如SEQIDNo.4所示或与其具有80％以上同一性的序列；

所述共刺激分子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有80％以上同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD80、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76，优选为如SEQIDNo.5所示的CD80的胞外区氨基酸序列或与其具有80％以上同一性的序列

另外，作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述a)肿瘤表面抗原结合部分为抗CD19scFv，所述c)CD3结合部分为抗CD3scFv，所述a)肿瘤表面抗原结合部分、b)共刺激分子和c)CD3结合部分的连接顺序为：5’－抗CD3scFv的轻链可变区V_L－抗CD19scFv的轻链可变区V_L－抗CD19scFv的重链可变区V_H－抗CD3scFv的重链可变区V_H－共刺激分子－3’。当CD3scFv、CD19scFv及CD80按照此顺序连接时，所表达的融合蛋白(LoopTriTE)具有较短的空间结构，折叠后的LoopTriTE中CD3scFv与CD19scFv理论长度仅221个氨基酸，更利于T细胞与靶细胞结合，同时与CD3scFvVH连接的CD80分子，与T细胞理论距离更接近，从而有效的给予T细胞第二活化信号。上述连接顺序如图9所示。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述抗CD19scFv中的重链可变区的氨基酸序列为如SEQIDNo.7所示或与其具有80％以上同一性的序列，所述抗CD19scFv中的轻链可变区的氨基酸序列为如SEQIDNo.8所示或与其具有80％以上同一性的序列；

所述抗CD3scFv中的重链可变区的氨基酸序列为如SEQIDNo.9所示或与其具有80％以上同一性的序列，所述抗CD3scFv中的轻链可变区的氨基酸序列为如SEQIDNo.10所示或与其具有80％以上同一性的序列；

所述共刺激分子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有80％以上同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD80、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76，优选为如SEQIDNo.5所示的CD80的胞外区氨基酸序列或与其具有80％以上同一性的序列。

进一步优选地，在本发明的一个实施方式中，上述融合蛋白的氨基酸序列为如SEQIDNo.1、11-13所示的氨基酸序列或与其具有80％以上同一性的序列。

作为优选，在本发明的实施方式中，所述融合蛋白是经修饰的融合蛋白，所述经修饰包括经交联的、经环化的、经缀合的、经酰化的、经羧基化的、经脂化的、经乙酰化的、经巯基乙酸酰胺化的、经烷基化的、经甲基化的、经聚苷氨酰化的、经糖基化的、经聚唾液酸化的、经磷酸化的、经腺苷酰化的或经PEG化中的一种或几种。

本发明的另一个方面，是提供了编码上述三特异性融合蛋白的核酸分子。

作为优选，在本发明的实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.14-16所示。

对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。

本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核苷酸序列。

在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。例如，细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。在本发明的一个实施方式中，上述载体包含KOZAK序列、Igκleader信号肽序列、6×His序列和在串联序列末尾加入的strep tagII标签序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述载体的基本结构来源于pcDNA3.4载体，通过NheI和HindⅢ双酶切插入目标基因序列。

本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞产生上述三特异性融合蛋白，上述核苷酸序列，或上述载体。

所述细胞为选自CHO细胞系及其不同品系，如FreeStyle CHO-S、ExpiHO-S、CHOK1SVGS-KO、CHODXB11等、其他真核系统表达体系细胞或者原核细胞。

本发明还提供了上述三特异性融合蛋白的制备方法，融合蛋白可以使用适当载体在宿主细胞中表达和从宿主细胞中分泌。例如，可以使用哺乳动物细胞或细菌细胞。在融合蛋白表达和分泌后可以使用现有技术中的方法进行分离和纯化，例如，亲和层析法。

本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述三特异性融合蛋白、上述核酸分子、上述载体或上述细胞，以及药学上可接受的载体。

本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。

同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，长春新碱、柔红霉素、门冬酰胺酶、环磷酰胺、泼尼松等。

本发明的另一个方面，是提供了上述三特异性融合蛋白、上述核酸分子、上述载体、上述细胞或上述药物组合物在制备治疗肿瘤的产品中的用途。

上述肿瘤可以包括、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤为B细胞肿瘤或T细胞肿瘤，例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T型急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)或慢性骨髓细胞白血病(CML)。

更优选地，所述肿瘤为B淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤。

本发明的有益效果为：

本发明成功制备了三特异性融合基因工程蛋白。该蛋白能够有效地与B淋巴细胞白血病、淋巴瘤细胞特异性结合，与T细胞特异性结合，在体外能够有效地活化T细胞，促进T细胞增殖，介导T细胞杀伤肿瘤细胞。该融合蛋白用于临床，将对B淋巴细胞白血病、淋巴瘤具有治疗作用。

附图说明

图1为本发明实施例中载体构建的PCR结果图，其中，A为PCR扩增的抗CD19-scFv基因片段琼脂糖凝胶电泳图，B为PCR扩增CD80基因胞外区片段琼脂糖凝胶电泳图，C为PCR扩增的CD3-scFv基因片段琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例中CD19scFv-CD80-CD3scFv基因表达载体及核苷酸序列示意图；

图3为本发明实施例中表达蛋白19TriTE的鉴定结果图，其中，A为Western Blot分析结果图，B为10％SDS-PAGE电泳分析结果图；

图4为本发明实施例中表达蛋白19TriTE的结合活性及结合常数测定结果图，其中，A为19TriTE与Nalm6白血病细胞的结合曲线及结合常数分析结果图；B为19TriTE与T细胞的结合曲线及结合常数分析结果图，C为19TriTE与HIB19单克隆抗体的竞争结合实验分析结果图，D为19TriTE与HIT3a单克隆抗体的竞争结合实验分析结果图；

图5为本发明实施例中表达蛋白19TriTE的对T细胞增殖活性的影响结果图，其中，A为19TriTE介导的T细胞增殖的绝对计数分析结果图，B为19TriTE介导的T细胞增殖的CFSE实验分析结果图；

图6为本发明实施例中表达蛋白19TriTE的特异性结合活性测定及竞争抑制试验结果图，其中，A为19TriTE介导的T细胞活化早期标志CD69检测结果图，B为19TriTE介导的T细胞活化晚期标志CD25检测结果图；

图7为本发明实施例中表达蛋白19TriTE介导的T细胞脱颗粒分析结果图；

图8为本发明实施例中表达蛋白19TriTE介导的T细胞杀伤活性分析结果图；

图9为本发明实施例中表达蛋白LoopTriTE核苷酸序列示意图；

图10为本发明实施例中表达蛋白LoopTriTE对Nalm6白血病细胞的杀伤结果图；

图11为本发明实施例中表达蛋白80193TriTE及19380TriTE的核苷酸序列示意图。

序列说明

SEQIDNo.1为本发明三特异性融合蛋白的氨基酸序列；

SEQIDNo.2为本发明三特异性融合蛋白的核苷酸序列；

SEQIDNo.3为本发明实施例中抗CD19scFv的氨基酸序列；

SEQIDNo.4为本发明实施例中抗CD3scFv的氨基酸序列；

SEQIDNo.5为本发明实施例中共刺激分子的氨基酸序列；

SEQIDNo.6为本发明实施例中连接体的氨基酸序列；

SEQIDNo.7为本发明实施例中抗CD19scFv中的重链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.8为本发明实施例中抗CD19scFv中的轻链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.9为本发明实施例中抗CD3scFv中的重链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.10为本发明实施例中抗CD3scFv中的轻链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.11为本发明实施例中LoopTriTE的氨基酸序列；

SEQIDNo.12为本发明实施例中80193TriTE的氨基酸序列；

SEQIDNo.13为本发明实施例中19380TriTE的氨基酸序列；

SEQIDNo.14为本发明实施例中LoopTriTE的核苷酸序列；

SEQIDNo.15为本发明实施例中80193TriTE的核苷酸序列；

SEQIDNo.16为本发明实施例中19380TriTE的核苷酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种三特异性融合蛋白及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。以下对本发明中出现的部分术语作以解释。

术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质结构域的杂合多肽。一种蛋白质可位于融合蛋白的氨基端(N端)部分或羧基端(C端)蛋白处，从而分别形成“氨基端融合蛋白”或“羧基端融合蛋白”。融合蛋白可包含不同的结构域。

术语“共刺激”是指为免疫细胞激活免疫应答的次级信号事件；免疫细胞在抗原呈递细胞存在下依靠共刺激来激活免疫应答，对于T细胞，需要两个刺激才能完全激活其免疫应答，就是说在淋巴细胞活化过程中，共刺激通常对有效免疫应答的发展至关重要，除了来自其抗原受体的抗原特异性信号之外，还需要共刺激。第二个信号使活化的T细胞免于无反应性，使T细胞产生额外T细胞生长所必需的淋巴因子。

在本发明中，当提供一个数值的范围时，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确说明)也得到具体公开。在所述范围中的任何所述值或中间值与在所述范围中的任何其他所述值或中间值之间的各个较小范围也包含在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在该范围内或排除在该范围之外，并且其中任一、无一或两个界限均包含在较小范围内的每个范围也包含在本发明内，服从于所述范围中任何特定地排除在外的界限。当所述范围包含一个或两个界限时，除去任一或两个那些包含在内的界限的范围也包含在本发明中。

在本说明书中，对“一个实施方式”、“某些实施方式”、“各种实施方式”、“一个或多个实施方式”、或“实施方式”的引用意指与实施例相联系地描述的具体的特征、结构、材料、或特性是包括在本披露的至少一个实施例中的。因此，在本说明书中多个位置中出现的短语如“在一个或多个实施方式”中”、“在某些实施方式”中”、“在各种实施方式”中”、“在一个实施方式”中”、或“在实施方式”中”不一定是指本披露中的相同实施例。此外，在一个或多个实施例中，具体的特征、结构、材料、或特性可以是以任何适合的方式进行组合。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：融合蛋白表达序列的构建

用化学合成的方法获得CD19scFv基因序列、CD80胞外表达区基因序列、CD3scFv基因序列，并将三个基因序列依次串联连接。在串联序列起始加入KOZAK序列、Igκleader信号肽序列、6×His序列，在串联序列末尾加入strep tagII标签序列，重组蛋白中的不同基因序列用linker连接肽相连。

1、引物设计

1)扩增抗人CD19scFv的引物

F：5’GATATTGTGCTGACCCAGAG 3’

R：5’GCTGCTCACTGTCAGGGTGG 3’

2)扩增C80胞外区的引物

F：5’GTTATCCACGTGACCAAGGA 3’

R：5’GTTATCAGGAAAATGCTCTTG 3’

3)扩增抗人CD3scFv的引物

F：5’GCTGACATCGAGCTCACCCA 3’

R：5’TGAGGAGACGGTGACCGTGG 3’

2、连接短肽及标签

1)KOZAK序列

5’GCCACC 3’

2)Igκleader序列

5’ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC 3’

3)6×His序列

5’CACCACCACCACCACCAC 3’

4)strep tag II序列

5’TGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAG-3’

5)CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白之间连接肽

linker 1:

5’GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT 3’

linker 2:

5’GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT 3’

3、PCR扩增

50μL反应体系(于冰浴中混合各反应液)

反应条件：94℃预变性5min，变性94℃30sec、退火57℃1min、延伸72℃1min；30个循环：最后72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果如图1的A、B、C所示。

4、pcDNA3.4-CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白基因表达载体的构建

将pcDNA3.4空载体用NheI和HindⅢ双酶切并纯化。再将NheI-CD19scFv-CD80-CD3scFv-HindⅢPCR产物经NheI和HindⅢ双酶切后连入pcDNA3.4质粒的相应酶切位点，组装成pcDNA3.4-CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白基因表达载体。质粒图谱如图2所示。

实施例2：重组蛋白的表达

1、传代并扩增ExpiCHO-s^TM细胞，直至细胞密度达到4×10⁶-6×10⁶个活细胞/mL。

2、转染前一天，分种第1步中的ExpiCHO-s^TM培养物，最终密度为3×10⁶-4×10⁶个活细胞/mL，使细胞过夜生长。

3、次日，测定细胞密度和存活率。细胞密度应达到7×10⁶-10×10⁶活细胞/mL，存活率应为95％-99％，方可继续转染。

4、使用新鲜、预热至37℃的ExpiCHO-s^TM表达培养基将上述3的细胞稀释至终密度为6×10⁶活细胞/mL。轻轻晃动培养瓶，混匀细胞。

5、按下文所述，配制ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA复合物。

注：大多数蛋白质的转染总质粒DNA为0.5-1.0μg/mL培养物体积。

a)将ExpiFectamine^TMCHO试剂瓶轻轻上下颠倒4-5次，充分混匀。

b)使用OptiPRO^TM培养基稀释质粒DNA(见表1)。晃动或上下颠倒试管，混匀。

c)使用OptiPRO^TM培养基稀释ExpiFectamine^TMCHO试剂(见表1)。晃动或上下颠倒试管，混匀。

d)将稀释的ExpiFectamine^TMCHO试剂加入到稀释的DNA中。晃动或上下颠倒试管，混匀。

6、室温孵育ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA复合物(第5d步)1-5min，然后将溶液慢慢转移至第4步的培养瓶中，在添加过程中轻轻晃动培养瓶。

7、将细胞置于轨道摇床上(37℃培养箱含8％CO₂的湿化空气条件下)培养。

8、转染后次日，根据选择的实验方案添加ExpiFectamine^TMCHO增强剂及ExpiCHOTM辅料。

注：

-标准实验方案：添加ExpiFectamine^TMCHO增强剂及ExpiCHO^TM辅料至培养瓶，添加过程中轻轻晃动培养瓶。将培养瓶放回37℃培养箱含5％CO₂的湿化空气条件下振荡培养。

-高滴度实验方案：添加ExpiFectamine^TMCHO增强剂及ExpiCHO^TM辅料至培养瓶，添加过程中轻轻晃动培养瓶。将培养瓶放回32℃培养箱含5％CO₂的湿化空气条件下振荡培养。

-最大滴度实验方案：添加ExpiFectamine^TMCHO增强剂及ExpiCHO^TM辅料过程中轻轻晃动培养瓶。将培养瓶放回32℃培养箱含5％CO₂的湿化空气条件下振荡培养。

9、仅限最大滴度实验方案：在转染后的第5天，第二次添加ExpiCHO^TM辅料至培养瓶，将培养瓶立即放回32℃培养箱含5％CO₂的湿化空气条件下振荡培养。

10、根据不同实验方案收集细胞培养上清。

-标准实验方案：转染后8-10天

-高滴度实验方案：转染后10-12天

-最大滴度实验方案：转染后12-14天

不同转染方案实施条件见表1。

表1不同转染方案

实施例3：重组蛋白的纯化以及超滤浓缩

1、将收集的CHO细胞上清直接纯化或者冻于-80℃冰箱。

2、上清用0.45μm滤膜过滤，转移至新的容器中。

3、取出StrepTrap^TMXT纯化柱，连接到GE蛋白纯化仪上。

4、用5个柱体积去离子水冲洗柱子。

5、用5个柱体积结合缓冲液平衡柱子。

6、将样品上机器纯化。

7、用10个柱体积结合缓冲液进行洗脱柱子。

8、用6个柱体积洗脱缓冲液，洗脱柱子，收集洗脱液。

9、用去离子水和NaOH重生柱子，最后将柱子充满20％的乙醇，4℃保存。

10、收集的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白纯度。

11、将蛋白洗脱液用PBS稀释，通过30KD或者50KD蛋白超滤膜，进行稀释脱盐3次。

12、将浓缩的蛋白通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装并冻存与-20℃。

13、对纯化结果进行鉴定，结果如图3的A、B所示。

实施例4：CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白结合活性测定—结合常数的测定

1、取CD19表达阳性的白血病细胞系Nalm6细胞，用PBS洗一遍后重悬。

2、分别将CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白按照不同浓度进行倍比稀释。

3、每1×10⁵个Nalm6细胞中加入不同浓度蛋白。每孔蛋白的终浓度分别为100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM、0.4nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM，4℃孵育一小时。

4、1800rpm，10min离心，弃上清，用PBS洗细胞，然后用100μL(1:400)稀释后的anti-His抗体重悬Nalm6细胞，4℃孵育30min。

5、将孵育半小时后的Nalm6细胞，用PBS洗一次，然后用100μL(1:500)稀释后的APCanti-mouse IgG抗体重悬Nalm6细胞，4℃孵育30min。

6、用PBS洗两遍细胞，200μLPBS重悬细胞，FACS检测Nalm6细胞的荧光强度，统计Mean值。

7、GraphPad Prism8软件计算重组融合蛋白与Nalm6白血病细胞的结合常数Kd值。结果见图4的A。

8、同样方法检测CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白中CD3scFv与人T细胞的亲和常数。结果见图4的B。

结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白与Nalm6细胞的亲和常数为11.67nM，与人T细胞的亲和常数为19.21nM。

实施例5：CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白特异性结合活性测定—竞争抑制试验

取Nalm6细胞，制成1×10⁶个/ml细胞悬液，加样于1.5mLEP管，5×10⁵个细胞/管。阴性对照组加PBS，阳性对照组加抗CD19单克隆抗体PE-anti-CD19，实验组加CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白及抗人CD19单克隆抗体PE-anti-CD19。4℃孵育1h，3000rpm，10min离心，弃上清液，PBS洗细胞2次，三组细胞分别重悬于PBS中，FACS检测抗CD19单克隆抗体PE-anti-CD19与Nalm6细胞系结合的阳性率。结果见图4的C。

取人T细胞，制成1×106个细胞/ml细胞悬液，加样于1.5mL EP管，5×10⁵个细胞/管。阴性对照组加PBS，阳性对照组加抗CD3单克隆抗体APC/Cy7-anti-CD3，实验组加CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白及抗CD3单克隆抗体APC/Cy7-anti-CD3。4℃孵育1h，3000rpm，10min离心，弃上清液，PBS洗细胞2次，三组细胞分别重悬于PBS中，FACS检测抗CD3单克隆抗体APC/Cy7-anti-CD3与人T细胞结合的阳性率。结果见图4的D。

结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白可以特异性结合于Nalm6上的CD19抗原，同时也可以特异性结合于人T细胞上的CD3抗原。

实施例6：绝对计数法测定CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白对T细胞增殖活性的影响

1、从天津市中心血站取健康供者富含血小板白膜，按1mL血样加入50μL RisetteSep^TM人T细胞富集抗体混合物，混合均匀；

2、室温孵育20min；

3、加入相同体积的PBS+2％FBS,稀释上述样品，混合均匀；

4、将稀释后的样本沿离心管壁缓慢加入装有Ficoll分离液之上，注意不要破坏液面(可使用50mL离心管，30mL血和PBS的混合物加入到15mL Ficoll淋巴细胞分离液上)；

5、将离心机(Thermo Sorvall ST40 ST40R)升速和降速调至3，1200g，室温，离心20min；

6、离心结束后，吸取中间位置的白膜层，置于新的离心管中，加入PBS+2％FBS洗涤细胞2次，1500rpm，离心10min，弃去上清；

7、用T细胞全培养基重悬T细胞，调整T细胞密度为1×10⁶个/mL，24孔板中每孔加入1mL(1×10⁶)T细胞，实验组加入终浓度为10nM的CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白，对照组加入和重组蛋白同体积的PBS。

8、每隔2天计数T细胞数，观察重组蛋白对T增殖的影响。

结果见图5的A。结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白能够在体外刺激初始T细胞增殖，共培养12天，增殖约80倍。

实施例7：CFSE法测定CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白促进T细胞增殖活性

1、准备CFSE储存液，终浓度5mM；

2、从天津市中心血站取健康供者富含血小板白膜，并用Rosette Sep^TM试剂分离出人T细胞，调整细胞密度1×106个/mL；

3、取1mL PBS重悬的人T细胞至试管中，加入1μL CFSE储存液，避光，室温孵育20min；

4、加入5倍体积的培养基(含血清)至细胞中，孵育5min；

5、1500rpm，10min，离心去除上清及多余的染料溶液；

6、用PBS重悬T细胞，并调整细胞密度为1×10⁶个/mL；

7、将CFSE染料标记的T细胞加入96相同孔板中，每孔2×10⁵细胞/200μL；

8、分别在对照组加入PBS、实验组加入CD19scFv-CD80-CD3scFv，使其终浓度为10nM；

9、共培养5天，FACS检测其荧光强度变化；用Flowjo软件及GraphPad Prism8分析重组融合蛋白对T细胞的增殖作用。(该方法的原理是，经过CFSE染料染色的T细胞具有较强的绿色荧光，随着T细胞的分裂增殖，T细胞的绿色荧光会逐渐减弱，直至约5代增殖后，T细胞的CFSE荧光会减弱至消失。故融合蛋白与T细胞共培养后，经流式检测，荧光减弱越多，说明T细胞增殖越好)。

结果见图5的B。结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白能够在体外刺激初始T细胞增殖，共培养5天，CFSE荧光强度减弱约90％以上，说明T细胞增殖明显。

实施例8：FACS方法检测CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白对T细胞的活化作用

1、用PBS重悬T细胞，并调整细胞密度为1×10⁶个/mL；

2、将T细胞加入96孔板中，每孔2×10⁵细胞/200μL；

3、分别在对照组加入PBS、实验组加入不同浓度CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白，使其终浓度为10nM、2nM、0.4nM、0.08nM、0.016nM、0.0032nM；

4、共培养6h，从96孔板中取100μL细胞，标记APC-anti-CD69抗体，避光，室温20min；

5、1500rmp，10min，离心弃上清，PBS洗细胞一次；

6、FACS分析细胞荧光强度；结果见图6的A。结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白能够有效的促进T细胞早期活化Marker CD69的表达。

相同方法，检测T细胞与重组蛋白共培养3.5天后，CD25的表达。结果见图6的B。结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白能够有效的促进T细胞晚期活化Marker CD25的表达。

实施例9：CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白对T细胞脱颗粒水平的影响

1、取人T细胞及Nalm 6-RFP细胞，1500rpm，10min，离心，用完全培养基重悬，分别调整T细胞密度为1×10⁶/mL，Nalm6-RFP细胞密度为1×10⁵/mL；

2、取1×10⁵T细胞，1×10⁴Nalm6细胞于96孔板中，分别在对照组加入PBS，实验组加入不同浓度的CD19scFv-CD80-CD3scFv重组蛋白；

3、在96孔板所有孔中加入1μL PE/Cy7-anti-CD107a抗体及50IU的IL-2；

4、置于37℃、含有5％CO₂的孵箱中培养1h后，加入莫能霉素，使其终浓度为1μM/孔；

5、置于37℃、含有5％CO₂的孵箱中培养24h后，从孔板中吸出细胞至流式管中，加入1mL PBS洗抗体，1500rpm，10min离心后，弃上清，重悬细胞，流式细胞仪检测T细胞表面CD107a的表达；

6、Fowjo软件及GraphPad Prism8软件分析T细胞脱颗粒水平。

结果见图7。结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白能够有效刺激初始T细胞的脱颗粒，并随着蛋白浓度增加，脱颗粒水平也随之增加。

实施例10：CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白对白血病细胞的杀伤活性(CTL活性)

1、取人T细胞及Nalm6-RFP细胞，1500rpm，10min，离心，用完全培养基重悬，分别调整T细胞密度2×10⁶/mL，Nalm6-RFP细胞密度为2×10⁵/mL；

2、将T细胞及Nalm6-RFP细胞按效靶比10:1加入96孔板中，即每孔2×10⁵个T细胞，2×10⁴个Nalm6-RFP细胞。

3、分别在对照组加入PBS、实验组加入不同浓度CD19scFv-CD80-CD3scFv重组融合蛋白；

4、共培养24h，从96孔板中取出细胞，1500rmp，10min，离心弃上清，PBS洗细胞一次；

5、FACS分析靶细胞Nalm6-RFP残留，用Flowjo软件及GraphPad Prism8分析CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白介导T细胞对靶细胞的杀伤作用。

结果见图8。结果表明，CD19scFv-CD80-CD3scFv融合蛋白能够有效的介导初始T细胞杀伤Nalm6靶细胞作用，并随着蛋白浓度增加，杀伤靶细胞作用也随之增加，其中在10nM融合蛋白浓度，效靶比为10/1时，靶细胞残留约50％。

实施例11：LoopTriTE结构杀伤实验

利用与实施例1-3中相同的方法构建loopTriTE表达载体并进行表达、分离、纯化。其核苷酸序列示意图如图9所示。序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.14所示。

利用与实施例10中相同的方法对loopTriTE结构融合蛋白的杀伤活性进行检测。10nM浓度LoopTriTE蛋白与Nalm6细胞共培养，24h，不同效靶比杀伤作用，靶细胞残留。结果如图10所示。结果表明，在10nM浓度下，效靶比10/1时，LoopTriTE融合蛋白介导T细胞杀伤，几乎无靶细胞残留，即使效靶比降至1/1时，靶细胞也只残留约15％，说明此结构融合蛋白有更加出色的功能。

实施例12：80193TriTE及19380TriTE结构杀伤实验

利用与实施例1-3中相同的方法构建80193TriTE及19380TriTE表达载体并进行表达、分离、纯化。其核苷酸序列示意图如图11所示。序列如SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示。

利用与实施例10中相同的方法对80193TriTE或19380TriTE结构融合蛋白的杀伤活性进行检测。不同浓度的80193TriTE或19380TriTE蛋白与Nalm6细胞共培养24h，效靶比10/1时，最高浓度10nM的80193TriTE或19380TriTE介导T细胞杀伤时，靶细胞残留约50％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 一种三特异性融合蛋白及其用途

<130> None

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 778

<212> PRT

<213> Mouse+Human

<400> 1

Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp His His His His His His Leu Glu Asp

20 25 30

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp

35 40 45

Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val

50 55 60

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser

85 90 95

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys

100 105 110

Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln

145 150 155 160

Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys

165 170 175

Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys

180 185 190

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly

195 200 205

Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu

210 215 220

Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu

225 230 235 240

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser

245 250 255

Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

260 265 270

Thr Val Ser Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ile His Val Thr Lys

290 295 300

Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val

305 310 315 320

Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met

325 330 335

Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys

340 345 350

Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu

355 360 365

Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys

370 375 380

Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu

385 390 395 400

Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile

405 410 415

Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe

420 425 430

Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala

435 440 445

Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val

450 455 460

Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys

465 470 475 480

Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn

485 490 495

Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly

500 505 510

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp

515 520 525

Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro

530 535 540

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

545 550 555 560

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile

565 570 575

Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

580 585 590

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala

595 600 605

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe

610 615 620

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly

625 630 635 640

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln

645 650 655

Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser

660 665 670

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val

675 680 685

Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro

690 695 700

Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr

705 710 715 720

Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Thr Arg

725 730 735

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp

740 745 750

Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

755 760 765

Ser Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

770 775

<210> 2

<211> 2337

<212> DNA

<213> Mouse+Human

<400> 2

gccaccatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggtgacc accaccacca ccaccacctc gaggatattg tgctgaccca gagccccaag 120

ttcatgagca ccagcgtggg cgatagagtg agcgtgacct gcaaggcaag ccagaacgtg 180

ggaacaaacg tggcctggta ccaacagaaa cccggccaaa gccctaagcc cctgatttac 240

agcgccacct acagaaatag cggcgtgccc gacagattta caggaagcgg cagcggaacc 300

gatttcacac tgaccatcac caacgtgcag agcaaagacc tggccgacta cttctgccag 360

cagtacaaca gataccccta caccagcgga ggaggaacaa agctggagat caagagaggt 420

ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctcaagtgca actgcaacag 480

agcggagccg aactggtgag acccggaagc agcgtgaaga tcagctgcaa ggcttccggc 540

tacgccttta gcagctactg gatgaactgg gtgaagcaga gacctggaca gggactggaa 600

tggatcggcc agatttaccc tggagacggc gacacaaact acaacggcaa gttcaagggc 660

caagctacac tgaccgccga caaaagcagc agcaccgcct atatgcagct gagcggactg 720

accagcgaag atagcgctgt gtacttctgc gccagaaaga ccatcagcag cgtggtggac 780

ttctacttcg actactgggg acaaggcacc accctgacag tgagcagcga attcggtggt 840

ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctgttatc 900

cacgtgacca aggaagtgaa agaagtggca acgctgtcct gtggtcacaa tgtttctgtt 960

gaagagctgg cacaaactcg catctactgg caaaaggaga agaaaatggt gctgactatg 1020

atgtctgggg acatgaatat atggcccgag tacaagaacc ggaccatctt tgatatcact 1080

aataacctct ccattgtgat cctggctctg cgcccatctg acgagggcac atacgagtgt 1140

gttgttctga agtatgaaaa agacgctttc aagcgggaac acctggctga agtgacgtta 1200

tcagtcaaag ctgacttccc tacacctagt atatctgact ttgaaattcc aacttctaat 1260

attagaagga taatttgctc aacctctgga ggttttccag agcctcacct ctcctggttg 1320

gaaaatggag aagaattaaa tgccatcaac acaacagttt cccaagatcc tgaaactgag 1380

ctctatgctg ttagcagcaa actggatttc aatatgacaa ccaaccacag cttcatgtgt 1440

ctcatcaagt atggacattt aagagtgaat cagaccttca actggaatac aaccaagcaa 1500

gagcattttc ctgataacgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt 1560

tctggtggtg gtggttctgt cgacgctgac atcgagctca cccagtctcc agcaatcatg 1620

tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac 1680

atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 1740

aaactggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 1800

ctcacaatca gcggcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcagtggagt 1860

agtaacccat tcacgttcgg ctcggggacc aagctggagc tgaaacgggg tggtggtggt 1920

tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctcaggtgc agctgcagca gtctggggct 1980

gaactggcaa gacctggggc ctcagtaaag atgtcctgca aggcttctgg ctacaccttt 2040

actaggtaca cgatgcactg ggtaaaacag aggcctggac agggtctgga atggattgga 2100

tacattaatc ctagccgtgg ttatactaat tacaatcaga agttcaagga caaggccaca 2160

ttgactacag acaaatcctc cagcacagcc tatatggagc tcactaggct gacatctgag 2220

gactctgcag tctattactg tgcaagatat tacgatgatc attacagcct tgactactgg 2280

ggccaaggca ccacggtcac cgtctcctca tggagccacc cccagttcga gaagtga 2337

<210> 3

<211> 245

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

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gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt 180

gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat 240

gacacatcca aactggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 300

tcttactctc tcacaatcag cggcatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccag 360

cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc tcggggacca agctggagct gaaacggggc 420

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caacagaaac ccggccaaag ccctaagccc ctgatttaca gcgccaccta cagaaatagc 600

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cctggatctg gcgagggctc taccaagggc caagtgcaac tgcaacagag cggagccgaa 840

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accgccgaca aaagcagcag caccgcctat atgcagctga gcggactgac cagcgaagat 1080

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ctgcagcagt ctggggctga actggcaaga cctggggcct cagtaaagat gtcctgcaag 1260

gcttctggct acacctttac taggtacacg atgcactggg taaaacagag gcctggacag 1320

ggtctggaat ggattggata cattaatcct agccgtggtt atactaatta caatcagaag 1380

ttcaaggaca aggccacatt gactacagac aaatcctcca gcacagccta tatggagctc 1440

actaggctga catctgagga ctctgcagtc tattactgtg caagatatta cgatgatcat 1500

tacagccttg actactgggg ccaaggcacc acggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt 1560

tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctgt tatccacgtg 1620

accaaggaag tgaaagaagt ggcaacgctg tcctgtggtc acaatgtttc tgttgaagag 1680

ctggcacaaa ctcgcatcta ctggcaaaag gagaagaaaa tggtgctgac tatgatgtct 1740

ggggacatga atatatggcc cgagtacaag aaccggacca tctttgatat cactaataac 1800

ctctccattg tgatcctggc tctgcgccca tctgacgagg gcacatacga gtgtgttgtt 1860

ctgaagtatg aaaaagacgc tttcaagcgg gaacacctgg ctgaagtgac gttatcagtc 1920

aaagctgact tccctacacc tagtatatct gactttgaaa ttccaacttc taatattaga 1980

aggataattt gctcaacctc tggaggtttt ccagagcctc acctctcctg gttggaaaat 2040

ggagaagaat taaatgccat caacacaaca gtttcccaag atcctgaaac tgagctctat 2100

gctgttagca gcaaactgga tttcaatatg acaaccaacc acagcttcat gtgtctcatc 2160

aagtatggac atttaagagt gaatcagacc ttcaactgga atacaaccaa gcaagagcat 2220

tttcctgata accaccacca ccaccaccac tga 2253

<210> 15

<211> 2328

<212> DNA

<213> Mouse+Human

<400> 15

gccaccatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggtgacc accaccacca ccaccacctc gaggttatcc acgtgaccaa ggaagtgaaa 120

gaagtggcaa cgctgtcctg tggtcacaat gtttctgttg aagagctggc acaaactcgc 180

atctactggc aaaaggagaa gaaaatggtg ctgactatga tgtctgggga catgaatata 240

tggcccgagt acaagaaccg gaccatcttt gatatcacta ataacctctc cattgtgatc 300

ctggctctgc gcccatctga cgagggcaca tacgagtgtg ttgttctgaa gtatgaaaaa 360

gacgctttca agcgggaaca cctggctgaa gtgacgttat cagtcaaagc tgacttccct 420

acacctagta tatctgactt tgaaattcca acttctaata ttagaaggat aatttgctca 480

acctctggag gttttccaga gcctcacctc tcctggttgg aaaatggaga agaattaaat 540

gccatcaaca caacagtttc ccaagatcct gaaactgagc tctatgctgt tagcagcaaa 600

ctggatttca atatgacaac caaccacagc ttcatgtgtc tcatcaagta tggacattta 660

agagtgaatc agaccttcaa ctggaataca accaagcaag agcattttcc tgataacgga 720

tcccagaatg cgctattagt tcgttacacc aagaaagtac cccaagtgtc aactgaattc 780

gatattgtgc tgacccagag ccccaagttc atgagcacca gcgtgggcga tagagtgagc 840

gtgacctgca aggcaagcca gaacgtggga acaaacgtgg cctggtacca acagaaaccc 900

ggccaaagcc ctaagcccct gatttacagc gccacctaca gaaatagcgg cgtgcccgac 960

agatttacag gaagcggcag cggaaccgat ttcacactga ccatcaccaa cgtgcagagc 1020

aaagacctgg ccgactactt ctgccagcag tacaacagat acccctacac cagcggagga 1080

ggaacaaagc tggagatcaa gagaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt 1140

ggtggttctc aagtgcaact gcaacagagc ggagccgaac tggtgagacc cggaagcagc 1200

gtgaagatca gctgcaaggc ttccggctac gcctttagca gctactggat gaactgggtg 1260

aagcagagac ctggacaggg actggaatgg atcggccaga tttaccctgg agacggcgac 1320

acaaactaca acggcaagtt caagggccaa gctacactga ccgccgacaa aagcagcagc 1380

accgcctata tgcagctgag cggactgacc agcgaagata gcgctgtgta cttctgcgcc 1440

agaaagacca tcagcagcgt ggtggacttc tacttcgact actggggaca aggcaccacc 1500

ctgacagtga gcagccccag cgggcaggcg ggggcggccg ccagcgagtc cctcttcgtc 1560

tccaaccacg cctacgctga catcgagctc acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct 1620

ccaggggaga aggtcaccat gacctgcagt gccagctcaa gtgtaagtta catgaactgg 1680

taccagcaga agtcaggcac ctcccccaaa agatggattt atgacacatc caaactggct 1740

tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 1800

agcggcatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag tagtaaccca 1860

ttcacgttcg gctcggggac caagctggag ctgaaacggg gtggtggtgg ttctggcggc 1920

ggcggctccg gtggtggtgg ttctcaggtg cagctgcagc agtctggggc tgaactggca 1980

agacctgggg cctcagtaaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacctt tactaggtac 2040

acgatgcact gggtaaaaca gaggcctgga cagggtctgg aatggattgg atacattaat 2100

cctagccgtg gttatactaa ttacaatcag aagttcaagg acaaggccac attgactaca 2160

gacaaatcct ccagcacagc ctatatggag ctcactaggc tgacatctga ggactctgca 2220

gtctattact gtgcaagata ttacgatgat cattacagcc ttgactactg gggccaaggc 2280

accacggtca ccgtctcctc atggagccac ccccagttcg agaagtag 2328

<210> 16

<211> 2325

<212> DNA

<213> Mouse+Human

<400> 16

gccaccatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggtgacc accaccacca ccaccacctc gaggatattg tgctgaccca gagccccaag 120

ttcatgagca ccagcgtggg cgatagagtg agcgtgacct gcaaggcaag ccagaacgtg 180

ggaacaaacg tggcctggta ccaacagaaa cccggccaaa gccctaagcc cctgatttac 240

agcgccacct acagaaatag cggcgtgccc gacagattta caggaagcgg cagcggaacc 300

gatttcacac tgaccatcac caacgtgcag agcaaagacc tggccgacta cttctgccag 360

cagtacaaca gataccccta caccagcgga ggaggaacaa agctggagat caagagaggt 420

ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctcaagtgca actgcaacag 480

agcggagccg aactggtgag acccggaagc agcgtgaaga tcagctgcaa ggcttccggc 540

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tggatcggcc agatttaccc tggagacggc gacacaaact acaacggcaa gttcaagggc 660

caagctacac tgaccgccga caaaagcagc agcaccgcct atatgcagct gagcggactg 720

accagcgaag atagcgctgt gtacttctgc gccagaaaga ccatcagcag cgtggtggac 780

ttctacttcg actactgggg acaaggcacc accctgacag tgagcagccc cagcgggcag 840

gcgggggcgg ccgccagcga gtccctcttc gtctccaacc acgcctacgc tgacatcgag 900

ctcacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc 960

agtgccagct caagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc 1020

aaaagatgga tttatgacac atccaaactg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 1080

agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca atcagcggca tggaggctga agatgctgcc 1140

acttattact gccagcagtg gagtagtaac ccattcacgt tcggctcggg gaccaagctg 1200

gagctgaaac ggggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg tggttctcag 1260

gtgcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gcaagacctg gggcctcagt aaagatgtcc 1320

tgcaaggctt ctggctacac ctttactagg tacacgatgc actgggtaaa acagaggcct 1380

ggacagggtc tggaatggat tggatacatt aatcctagcc gtggttatac taattacaat 1440

cagaagttca aggacaaggc cacattgact acagacaaat cctccagcac agcctatatg 1500

gagctcacta ggctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag atattacgat 1560

gatcattaca gccttgacta ctggggccaa ggcaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt 1620

ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctgttatc 1680

cacgtgacca aggaagtgaa agaagtggca acgctgtcct gtggtcacaa tgtttctgtt 1740

gaagagctgg cacaaactcg catctactgg caaaaggaga agaaaatggt gctgactatg 1800

atgtctgggg acatgaatat atggcccgag tacaagaacc ggaccatctt tgatatcact 1860

aataacctct ccattgtgat cctggctctg cgcccatctg acgagggcac atacgagtgt 1920

gttgttctga agtatgaaaa agacgctttc aagcgggaac acctggctga agtgacgtta 1980

tcagtcaaag ctgacttccc tacacctagt atatctgact ttgaaattcc aacttctaat 2040

attagaagga taatttgctc aacctctgga ggttttccag agcctcacct ctcctggttg 2100

gaaaatggag aagaattaaa tgccatcaac acaacagttt cccaagatcc tgaaactgag 2160

ctctatgctg ttagcagcaa actggatttc aatatgacaa ccaaccacag cttcatgtgt 2220

ctcatcaagt atggacattt aagagtgaat cagaccttca actggaatac aaccaagcaa 2280

gagcattttc ctgataactg gagccacccc cagttcgaga agtga 2325

Claims

1.一种三特异性融合蛋白，其特征在于，其包含：

a）肿瘤表面抗原结合部分；

b）共刺激分子；

c）CD3结合部分；以及

d）上述三部分的连接体；

其中，所述a）肿瘤表面抗原结合部分为抗CD19scFv，所述c）CD3结合部分为抗CD3scFv，所述a）肿瘤表面抗原结合部分、b）共刺激分子和c）CD3结合部分的连接顺序为：5’－抗CD3scFv的轻链可变区VL－抗CD19scFv的轻链可变区VL－抗CD19scFv的重链可变区VH－抗CD3scFv的重链可变区VH－共刺激分子－3’；

所述抗CD19scFv中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示，所述抗CD19scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示，所述抗CD3scFv中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示，所述抗CD3scFv中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo. 10所示；

所述共刺激分子为如SEQ ID No. 5所示的CD80的胞外区氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接体为如SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列。

4.编码如权利要求1-3任意一项中所述的融合蛋白的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNo. 14所示。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求4-5所述的核酸分子。

7.一种细胞，其特征在于，所述细胞产生如权利要求1-3任意一项中所述的三特异性融合蛋白，如权利要求4-5所述的核酸分子，或如权利要求6所述的载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-3任意一项中所述的三特异性融合蛋白、如权利要求4或5中所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体或如权利要求7所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

9.如权利要求1-3任意一项中所述的三特异性融合蛋白、如权利要求4或5中所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体、如权利要求7所述的细胞或如权利要求8所述的药物组合物在制备治疗B淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤的产品中的用途。