CN109153725B - 一种多功能蛋白质 - Google Patents

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Abstract

一种多功能多肽链或蛋白质。一种多肽链X，包括抗原1结合域R1、辅肽链连接域R2和抗原2结合域R3；所述辅肽链连接域R2为细胞因子或细胞因子受体中的细胞因子结合域。一种蛋白质，由所述多肽链X作为主肽链与辅肽链Y组成异源二聚体。所述辅肽链Y包括抗原3结合域R4和主肽链X连接域R5，或所述辅肽链Y为主肽链连接域R5。多功能蛋白质通过其两个肿瘤相关抗原的抗原结合域与不同的肿瘤抗原结合，介导特异性的细胞杀伤；多功能蛋白质引入细胞因子与细胞因子受体复合物，可以发挥细胞因子的功能。

Description

一种多功能蛋白质
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种多功能蛋白质。
背景技术
双特异性抗体(bispecific antibody)，又称为双功能抗体或双价抗体，可以同时特异性结合2个不同的抗原，具有特异性和双功能性，在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。
双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工方法制备。目前制备双特异性抗体方法主要有化学缀合、杂交瘤技术、重组DNA技术等。
早在30年以前Medarex公司就已经开发出了双特异性抗体，并且在2001年进行了III期临床试验。但是由于临床试验失败并且受限于生产问题，该领域的研究归于沉寂。(Garber K，2014)2009年，Trion公司开发的双特异性抗体Catumaxomab被欧盟批准上市用于治疗EpCAM阳性肿瘤所引起的恶性腹水，但由于鼠源抗体的高免疫原性大大限制了其临床应用(Spasevska I，2014)。近些年，抗体工程技术迅猛发展，为双特异性抗体的开发带来了新的契机。
1、化学偶联合成双特异抗体。
Lum实验室使用商业化Herceptin和OKT3通过化学偶联获得Her2/CD3双特异性抗体可招募T细胞杀伤Her2阳性肿瘤细胞(Msen et al.，2001)。这种基于临床上广泛使用的抗体偶联物，显示出非常好的临床安全性及疗效，22名参与临床试验的转移性乳腺癌的病人中有5位在使用后的14.5星期内仍然维持稳定的病情(Lum et al.，2015)。
OKT3抗体还被用来和其他临床上使用的抗体通过化学偶联，用于杀伤具有相应靶点的肿瘤：包括E6FR阳性肿瘤(Reush U et al.，2006)，(MAD et al.，2015)CD20阳性肿瘤系(Lum et al.，2013)，B7-H3阳性肿瘤(MA et al.，2016)等。
2、杂交瘤技术生产双特异抗体
Lindnorer等用抗CD3抗体的大鼠杂交瘤与分泌抗EpCAM小鼠杂交瘤融合制备出可分泌多达11种由不同重链和轻链组成的抗体(lindnoer et al.，1995)，这种采用异源大鼠及小鼠杂交瘤制备出的双抗，不可避免地产生人抗鼠(HAMA)交叉反应。令人惊奇的是，这种抗药物反应反而与病人与该抗体反应效果呈正比，(OTT MG et al.，2012)其机制有待进一步探讨。2009年已经被批准在临床上使用(Carberk.，2014)。用同样平台开发出的Her/CD3抗体(Kiewe et al.，2006)，用于治疗复发B细胞淋巴瘤的抗CD20/CD3抗体已获准进入临床试验，并获得良好的安全记录和疗效(Buhmann et al.，2009)。抗CD2/CD3双抗已用于治疗黑色素瘤的实验研究(Ruf et al.，2004)。
3、重组表达双特异分子
Genentech科学家Shalaby等将人源化抗CD3抗体UCHT1的Fab片段与抗HER2抗体4D5通过接头肽连接，在大肠杆菌表达系统成功表达。这种双特异性抗体可特异性识别Her2高表达的乳腺癌细胞SK-BR-3，并可介导人外周血T细胞对该种肿瘤细胞系的杀伤(Shalabyet al.，1992)。随着合成生物分子及蛋白质重组技术的发展，通过基因工程制备出的招募T细胞靶向肿瘤的蛋白质分子后来居上，已成为这类药物的主流。
BiTE 2014年12月，FDA批准了一种新型工程化CD3靶向双特异性抗体分子-BiTE(Bispecific T-cell engager)用于治疗急性淋巴白血病。这种新型的小蛋白分子直接由OKT3的scFv与抗CD19的scFv通过一连接肽连接而成(Nagorsen D et al.，2012)(专利号申请：201180063222.2；201580009124.9)，仅需极低的浓度既可抑制非霍奇金淋巴瘤生长(Bargou R et al.，2008)。由于这种分子高效的招募T细胞杀伤靶细胞的能力，更多的基于BiTE平台的靶向不同肿瘤的产品已进入临床试验阶段。其中包括识别EpCAM，CEA，DSMA等多种BiTE分子(Thakur A et al.，2016)
TandAb将一对类似BiTE分子的双特异性分子用连接肽连接，形成称作TandAb的四聚体分子：160kD的分子量是BiTE的双倍，使得与CD3和CD19的亲和力更高(Reusch U etal.，2015)，同时，TandAb的药代动力学较之BiTE也显著改善，在血液中的半衰期达到20h左右。可介导杀伤非霍奇金淋巴瘤及急性淋巴白血病。
DART是将抗CD19与CD3的scFv通过含二硫键的连接肽连接而成，可招募T细胞杀伤肿瘤，并具有稳定及容易规模化制备的优点(Johnson S et al，2010；kuo SR et al.，2012)。
FcabFv是将OKT3的抗原识别部分，与经过CH3突变产生的具有识别Her2的功能的Fc(Wozniak G et al.，2010)相融合，表达出一种和普通抗体高度相似的新颖双特异性抗体，能有效地靶向Her2阳性肿瘤，并在动物体内抑制肿瘤生长(Wang L et al.，2013)。
TriKE是将IL15插入到CD33抗体的scFv和CD16抗体的scFv之间表达，中间通过两个连接肽连接，在有效地靶向肿瘤的同时，可促进体内NK细胞持久性的激活和生存，IL15的加入有利于于NK细胞治疗髓系恶性肿瘤或靶向实体瘤的抗原。(Szun Szun Tay et al.，2016；Vallera DA.et al.，2016)
目前，双特异性抗体已经成为药物研究领域中的新热点，至少有30多种双特异性抗体处于临床研究阶段(Garber K et al.，2014；Kontermann R E et al.2015)。
T细胞和NK细胞的培养基中都必须添加一定量的IL-2(Bodnar et al.，2008；Grund et al.，2005)。IL-15与IL-2功能类似，而且共用相同的βγ受体，研究表示IL-2或IL-15对于NK细胞和CD8+T细胞的存活和增殖是必须的(Boyman et al.，2007)。IL-15与IL-2虽然共用相同的βγ受体，但各自又有特异的α受体，研究发现IL-15Rα-sushi(IL-15受体α的sushi结构域)是IL-15的超级激动剂，可以极大的提高IL-15的功能(Han et al.，2011；Mortier et al.，2006)(专利申请号：201280037114.2，201510358540.1)，IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体可以完全替代IL-2在T/NK细胞中的作用(Peter S.Kim1，2016；Rosarioet al.，2016)，激活NK/CD8+T细胞并提高其杀伤肿瘤的细胞毒性。美国国立卫生研究院(NIH)国家癌症研究所指出，在治疗癌症的12种免疫治疗药物中，IL-15位列第一位。通过支持CD8+T细胞的生存能力，IL-15在T细胞长期免疫应答方面展现了很大的潜能。相比较于IL-2，IL-15更有前途，更具疗效，在肿瘤治疗中毒性更低，更可以刺激T细胞、NK细胞的抗肿瘤活性。在双特异分子中融合IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体或其他有功能的细胞因子与受体复合物是提高细胞免疫治疗疗效的一大方向。
PD-1(programmed death 1)和它的受体PD-L1，PD-L2是T细胞活性的重要调节因子(Okazaki and Honjo，2007)。T细胞表面的PD-1与其他细胞表面的PD-L1/2的结合造成T细胞的抑制，这在人体避免自体免疫病和产生免疫耐受的过程中起到重要作用，而肿瘤细胞利用PD1/PD-L1检查点这种免疫系统保护自我的调节机制，通过在肿瘤细胞自身或肿瘤微环境表达PD-L1/L2，于T细胞表面表达的PD1结合，传递负信号，导致T细胞功能衰退及耗竭，达到抑制免疫应答，肿瘤逃逸的目的。(Freeman et al.，2000；Keir et al.，2008；Parry et al.，2005)。因此研究者探索用PD-1或PD-L1的抗体去结合抗原，在T细胞靶向肿瘤的同时，阻断PD1检查点通路，结果显示此方法能够显著提高T细胞活性，增强机体对病原微生物和癌症的抵抗能力(Topalian et al.，2012；Yanan Guo et al.，2016)。已有多项临床试验证明了PD-1/PD-L1抗体对于黑色素瘤(Cho et al.，2016；Hamidet al.，2013)、多发性骨髓瘤(Badros et al.，2015)、白血病(Porkka et al.，2014)等癌症都有很好的治疗效果(专利申请号：200380109929.8，201310258289.2，201180019629.5)。
发明公开
本发明的一个目的是提供一种多肽链X。
本发明提供的多肽链X，包括抗原1结合域R1、辅肽链连接域R2和抗原2结合域R3；
所述辅肽链连接域R2为细胞因子或细胞因子受体中的细胞因子结合域。
上述的多肽链X中，
所述抗原2结合域R3为识别T细胞CD3的抗体或分子。
上述的多肽链X中，
所述抗原2结合域R3为识别NK细胞CD16的受体或抗体或其他分子。
上述的多肽链X中，
所述抗原1结合域R1所结合的抗原选自下述的癌症相关的抗原中任一种：脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和子宫癌。
上述的多肽链X中，
所述癌症相关抗原优选自下述抗原中任一种：CD123，CD19、CD20、CD22、CD37、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、BCMA、PSMA、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGEA3、β-人绒毛膜促性腺素、AFP、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、hsp70-2、M-CSF、PSA、PAP、LAGE-la、p53、Prostein、PSMA、Her2/neu、端粒酶、PCTA-1、MAGE、ELF2M、IGF-I、IGF-II、IGF-I受体、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR、GP100、Mart1、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、WT1、CD68、FGF-5、G250、EpCAM、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、p53、Ras、TPS、Epstein Barr病毒抗原EBVA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E7或MHC与上述抗原的短肽的复合物。
MHC与所述抗原的短肽的复合物中的所述抗原为上述癌症相关抗原中任一种。
上述的多肽链X中，
所述癌症相关抗原优选的选自下述抗原中任一种：CD19、CD20、CD22、CD123，CD33/IL3Ra、Her2、PDL1、GP100、Mart1，BCMA，WT-1和NY-ESO-1或MHC与上述抗原的短肽的复合物。
上述MHC与所述抗原的短肽的复合物中的所述抗原为所述癌症相关抗原优选的选自下述抗原中任一种。
上述的多肽链X中，
所述癌症相关抗原优选的选自下述抗原中任一种：CD19、CD20、CD22、Her2、PDL1、WT1、GP100、Mart1、BCMA和NY-ESO-1或MHC与上述抗原短肽的复合物。
上述的多肽链X中，
所述抗原1结合域R1为结合抗原的抗体、结合抗原的配体、结合抗原的受体或具有抗原结合功能的多肽。
上述的多肽链X中，
所述结合抗原的抗体是完整免疫球蛋白，抗体的Fc、抗体的Fab、抗体的VH、抗体的VL或scFv的全长肽链或部分肽段。
上述的多肽链X中，
所述结合抗原的配体或所述结合抗原的受体是全长肽链或部分肽段。
上述的多肽链X中，
所述抗原1结合域R1为具有抗原识别功能的TCR。
上述的多肽链X中，
所述抗原1结合域R1为具有抗原识别功能的TCR样抗体或其他分子。
本发明另一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，其为由权利要求1所述的肽链X作为主肽链与辅肽链Y组成异源二聚体；
所述辅肽链Y包括抗原3结合域R4和主肽链X连接域R5，
或所述辅肽链Y为主肽链连接域R5；
所述主肽链连接域R5与所述肽链X中的辅肽链连接域R2相互结合。
上述主肽链和辅肽链的各功能域之间通过多肽接头连接。这些多肽接头为富含甘氨酸和/或丝氨酸的序列或富含甘氨酸和/或丝氨酸的多个拷贝序列，多肽接头一般包括1-20个氨基酸残基。
主肽链连接域R5和细胞因子或细胞因子受体中的细胞因子结合域R2是一对具有相互结合功能的肽段。
上述辅肽链连接域(R2)和主肽链连接域(R5)互为细胞因子和受体亚基。主肽链(X)和辅肽链(Y)之间通过辅肽链连接域(R2)和主肽链连接域(R5)之间的结合形成异源二聚体。
上述蛋白中，
所述抗原3结合域R4所结合的抗原3选自下述的癌症相关的抗原中任一种：脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和子宫癌。
上述蛋白中，
所述癌症相关抗原3优选自下述抗原中任一种：CD123，CD19、CD20、CD22、CD37、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、BCMA、PSMA、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGEA3、β-人绒毛膜促性腺素、AFP、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、hsp70-2、M-CSF、PSA、PAP、LAGE-la、p53、Prostein、PSMA、Her2/neu、PDL1、端粒酶、PCTA-1、MAGE、ELF2M、IGF-I、IGF-II、IGF-I受体、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR、GP100、Mart1、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、CA19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、WT1、CD68、FGF-5、G250、EpCAM、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、p53、Ras、TPS、Epstein Barr病毒抗原EBVA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E7或MHC与上述抗原短肽的复合物。
上述MHC与所述抗原的短肽的复合物中的所述抗原为所述癌症相关抗原3优选自上述抗原中任一种。
上述蛋白中，
所述的癌症相关抗原优选的选自下述抗原中任一种：CD19、CD20、CD22、CD123，CD33/IL3Ra、Her2、PDL1、GP100、Mart1，BCMA，WT-1、NY_ESO-1或MHC与上述抗原短肽的复合物。
上述MHC与所述抗原的短肽的复合物中的所述抗原为CD19、CD20、CD22、CD123，CD33/IL3Ra、Her2、PDL1、GP100、Mart1，BCMA，WT-1和NY_ESO-1中任一种。
上述蛋白中，
所述癌症相关抗原优选的选自下述抗原中任一种：CD19、CD20、CD22、Her2、PDL1、WT1、GP100、Mart1、BCMA、NY_ESO-1或MHC与上述抗原短肽的复合物；上述MHC与所述抗原的短肽的复合物中的所述抗原为CD19、CD20、CD22、Her2、PDL1、WT1、GP100、Mart1、BCMA、NY_ESO-1中任一种。
上述中，
所述抗原1结合域R1和所述抗原2结合域R3的位置能互换。
上述中，
所述抗原1结合域R1和所述抗原3结合域R4的位置能互换。
上述中，
所述抗原2结合域R3和所述抗原3结合域R4的位置能互换。
上述中，
所述辅肽链连接域R2和所述主肽链连接域R5是一对具有相互结合功能的肽段。优选为一对可以相互结合γc细胞因子及其受体亚基。其最优的选择为IL15与IL15Rα和IL4与IL4Rα。IL15在维持T细胞、NK细胞和NKT细胞的稳态，细胞生长中起着不可或缺的作用，同时又能对B细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞、肥大细胞提供额外的生理功能。IL-15可支持CD8+T细胞的生存能力，较于IL-2更有前途，更具疗效，在肿瘤治疗中毒性更低，更可以刺激T细胞、NK细胞的抗肿瘤活性。
上述中，
所述辅肽链连接域R2和所述主肽链连接域R5是互为一对可以相互结合细胞因子及其受体亚基。
上述中，
所述细胞因子为γc家族细胞因子，
所述γc家族细胞因子为IL2、IL4、IL7、IL9、IL15或IL21。
上述中，
所述细胞因子和受体亚基最优选自IL15与IL15Rα或IL4与IL4Rα。
上述中，
所述多肽或蛋白的主肽链中各组分或辅肽链中各组分通过由1-20个氨基酸残基组成的多肽接头连接。
上述中，
所述多肽接头中富含甘氨酸和/或丝氨酸。
上述中，
所述抗原1结合域R1为antiCD19-ScFv或AntiMHC/GP100-VHH或AntiMHC/Mart1-VHH或anti MHC/WT1或PD1的胞外区或AntiCD22-ScFv或antiCD3-ScFv或antiCD16-ScFv；
或，所述辅肽链连接域R2为IL15Rαsushi或IL4Rα-N-FN3或IL15或IL4；
或，所述抗原2结合域R3为antiCD3-ScFv或antiCD16-ScFv或antiCD19-ScFv或AntiMHC/GP100-VHH或AntiMHC/Mart1-VHH或antiWT1或PD1的胞外区或AntiCD22-ScFv；
或，所述抗原3结合域R4为PD1的胞外区或AntiMHC/GP100-VHH或AntiCD22-ScFv或antiCD19-ScFv或AntiMHC/Mart1-VHH或anti MHC/WT1或antiCD3-ScFv或antiCD16-ScFv；
或，所述主肽链连接域R5为IL15或IL4或IL15Rαsushi或IL4Rα-N-FN3。
上述中，
所述antiCD19-ScFv的氨基酸序列为序列1；
所述IL15Rαsushi的氨基酸序列为序列2；
所述antiCD3-ScFv的氨基酸序列为序列3；
所述PD1的胞外区的氨基酸序列为序列4；
所述IL15的氨基酸序列为序列5；
所述AntiMHC/GP100-VHH的氨基酸序列为序列10；
所述AntiMHC/Martl-VHH的氨基酸序列为序列11；
所述AntiMHC/WT1-VH的氨基酸序列为序列12；
所述IL4Rα的氨基酸序列为序列13；
所述AntiCD16-ScFv的氨基酸序列为序列14；
所述AntiCD22-ScFv的氨基酸序列为序列15；
所述IL4的氨基酸序列为序列16。
上述中，
所述多肽链X的氨基酸序列为序列8；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列17；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列19；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列21；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列22；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列23；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列27；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列29；
或所述多肽链X的氨基酸序列为序列30；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列8，辅肽链的氨基酸序列为序列9；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列17，辅肽链的氨基酸序列为序列9；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列17，辅肽链的氨基酸序列为序列18；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列19，辅肽链的氨基酸序列为序列9；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列8，辅肽链的氨基酸序列为序列20；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列21，辅肽链的氨基酸序列为序列9；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列22，辅肽链的氨基酸序列为序列9；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列23，辅肽链的氨基酸序列为序列24；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列25，辅肽链的氨基酸序列为序列26；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列27，辅肽链的氨基酸序列为序列28；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列29，辅肽链的氨基酸序列为序列9。
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列30，辅肽链的氨基酸序列为序列31；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列21，辅肽链的氨基酸序列为序列5；
或所述蛋白的主肽链的氨基酸序列为序列8，辅肽链的氨基酸序列为序列5。
本发明第三个目的是提供上述多肽或蛋白的编码核酸分子。
本发明提供上述多肽或蛋白的编码核酸分子，由编码所述主肽链的核酸分子或编码所述主肽链的核酸分子和编码所述辅肽链的核酸分子组成。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如，例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离，或者通过人工合成的方式合成多核苷酸。
含有上述的核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞也是本发明保护的范围。
上述重组载体中，所述重组载体为将上述的核酸分子中的编码所述主肽链的核酸分子或编码所述主肽链的核酸分子和编码所述辅肽链的核酸分子菌插入表达载体中，得到表达上述的蛋白的载体。
上述重组载体包含上述多核苷酸序列或组合。在一个实施方式中，可连接编码主肽链(X)或辅肽链(Y)的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码主肽链(X)或辅肽链(Y)的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。例如慢病毒载体是实现基因长期稳定遗传的适宜工具，因为它们可以将基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌反转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。本发明提供的多功能蛋白质包含两条肽链，可通过公知的方式使其表达于同一细胞中，包括但不限于共转染分别编码主肽链(X)和辅肽链(Y)的两种表达载体，或将编码主肽链(X)和辅肽链(Y)的核酸序列克隆至含有两套表达框架的的表达载体中，或者将编码主肽链(X)和辅肽链(Y)的核酸序列串联克隆至一个表达框架中，通过在主肽链(X)和辅肽链(Y)的核酸序列中间插入核糖体结合位点，2A肽实现两种肽链的共表达。
上述细胞中，所述目的细胞为原核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞；其中哺乳动物细胞优选为人类细胞。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述多肽链X或上述的蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。
上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在免疫治疗中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备免疫治疗产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在免疫细胞培养和/或促进免疫细胞扩增和/或免疫检测中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备免疫细胞培养和/或促进免疫细胞扩增和/或免疫检测产品中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在刺激T或NK细胞增殖中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备刺激T或NK细胞增殖产品中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在介导免疫细胞抑制或杀伤表达所述蛋白中抗原的靶细胞中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备介导免疫细胞抑制或杀伤表达所述蛋白中抗原的靶细胞产品中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在抑制或杀伤肿瘤细胞中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备抑制或杀伤肿瘤细胞产品中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在治疗或检测肿瘤中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备治疗或检测肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在抑制或杀伤表达所述蛋白中抗原的靶细胞中的应用也是本发明保护的范围。
或上述的多肽或蛋白、上述的核酸分子或上述的重组载体、表达盒、重组菌、细胞或重组病毒或试剂盒在制备抑制或杀伤表达所述蛋白中抗原的靶细胞产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述中，所述免疫治疗为通过免疫细胞抑制或杀伤肿瘤细胞；
或，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞等；
或，所述抗原为癌症相关抗原；
或所述抗原为脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌相关抗原或其任何组合；
或，所述肿瘤为脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌中任一种或任何组合；
或，所述靶细胞为原核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞；
或，所述哺乳动物细胞具体为人类细胞；
或，所述人类细胞具体为免疫细胞，
或，所述免疫细胞具体为T细胞或NK细胞。
上述多肽或蛋白中，所述主肽链的抗原结合域(R1/R3)、辅肽链抗原结合域(R4)具有结合抗原的功能。其抗原结合域其中一个为识别人T细胞的CD3的抗体或分子或识别NK细胞CD16的受体或抗体或其他分子，其他两个是选自下述的肿瘤相关的抗原。其抗原结合域所结合的肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合结构域的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的：
在一个实施方式中，本发明提及的肿瘤相关抗原也可以是选自下述的肿瘤相关的抗原：脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌和其任何组合。
具体而言：
在一个实施方式中，本发明提及的肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP 100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的靶标。
在一个实施方式中本发明中提及的肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以更高的水平进行表达。
TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一个实施方式中本发明中提及的肿瘤抗原可以使MHC与上述抗原肽段的复合物。包括但不限于HLA-GP100复合物，HLA-Mart1复合物，HLA-WT1复合物。
在一个实施方式中，其中所述主肽链中的抗原结合域(R1、R3)或辅肽链中的抗原结合域(R4)是可以与抗原结合的抗体、配体、受体、具有抗原结合能力的多肽或其任意组合。
抗体可以是Ig，Fab，scFv的完整肽链或部分肽段或其任意组合。配体或受体可以是其完整肽链、部分肽段或其任意组合。
其中所述辅肽链连接域(R2)和主肽链连接域(R5)是一对具有相互结合功能的肽段。
其中具有相互结合功能的肽段可以是一对可以相互结合的受体与配体或是一对可以相互结合的抗体与抗原。优选为一对可以相互结合γc细胞因子及其受体亚基，最优选择为IL15与IL15Rα，IL4与IL4R。
主肽链和辅肽链的各功能域之间通过多肽接头连接，这些多肽接头为富含甘氨酸和/或丝氨酸的序列或富含甘氨酸和/或丝氨酸的多个拷贝序列，多肽接头一般包括5-20个氨基酸残基。
附图说明
图1为多功能蛋白分子结构示意图。A：多功能蛋白分子由主肽链X和辅肽链Y组成，其中主肽链X包括抗原结合域R1、辅肽链连接域R2、抗原结合域R3，辅肽链Y包括抗原结合域R4、主肽链连接域R5；B：多功能蛋白分子由主肽链X和辅肽链Y组成，其中主肽链X包括抗原结合域R1、辅肽链连接域R2、抗原结合域R3，辅肽链Y包括主肽链连接域R5；C：多功能蛋白分子仅由主肽链X，其中主肽链X包括抗原结合域R1、辅肽链连接域R2、抗原结合域R3。
图2为多功能蛋白分子基因表达框架。
图3为多功能蛋白质分子多肽表达纯化SDS-PAGE图。泳道i：TiTE-1，主肽链约65KD，辅肽链约30KD；泳道2：TiTE-6，主肽链约65KD，辅肽链约30KD；泳道3：蛋白Marker，分子量自上至下依次为：160KD、120KD、100KD、70KD、50KD、40KD、30KD、25KD。
图4为TiTE-1、15、16、5多功能蛋白分子杀伤结果：A，阴性对照TiTE-6蛋白杀伤malme-3M-CD19-luc；B，TiTE-1蛋白杀伤malme-3M-CD19-luc；C，TiTE-15蛋白杀伤malme-3M-CD19-luc；D，TiTE-16蛋白杀伤malme-3M-CD19-luc；E，TiTE-5蛋白杀伤malme-3M-CD19-luc；F，TiTE-5蛋白杀伤malme-3M-CD22-luc。证明本发明所提供的多功能蛋白TiTE-1、15、16、5使用极低的浓度即可对肿瘤细胞进行体外杀伤，浓度为0.5-5ng/10E6个细胞时体外杀伤效果最好。
图5为TiTE-6、8、9、10、11、12、13、14多功能蛋白分子杀伤结果：A，阴性对照TiTE-2蛋白杀伤BV173-luc；B，TiTE-6蛋白杀伤BV173-luc；C，TiTE-8、9、10、11、12、13、14蛋白杀伤BV173-luc。证明本发明所提供的多功能蛋白TiTE-6、8、9、10、11、12、13、14对WT1阳性肿瘤细胞具有杀伤效果。
图6为TiTE-2、3、4多功能蛋白分子杀伤结果：A，阴性对照TiTE-6蛋白杀伤malme-3M-luc；B，TiTE-2蛋白杀伤malme-3M-luc；C，TiTE-3蛋白杀伤malme-3M-luc；D，TiTE-4蛋白杀伤malme-3M-luc。证明本发明所提供的多功能蛋白TiTE-2、3、4可对表达形影胞内抗原的肿瘤细胞进行体外杀伤
图7为多功能蛋白分子刺激NK细胞扩增结果。
Figure GPA0000260778350000191
为不加任何白介素因子刺激NK细胞扩增结果，5天后细胞几乎全部死亡；
Figure GPA0000260778350000192
为多功能蛋白分子刺激NK细胞扩增结果，本发明所提供的多功能蛋白可刺激NK细胞扩增，18天约扩增140倍。
图8为TiTE-1、6、8、9、10、11、12多功能蛋白分子的流式结果：A，T细胞阴性对照；B，TiTE-1 T细胞实验组；C，BV173阴性对照；D，TiTE-1 BV173实验组；E，BV173阴性对照；F，TiTE-6 BV173实验组；G，TiTE-8 BV173实验组；H，TiTE-9 BV173实验组；I，TiTE-10 BV173实验组；J，TiTE-11 BV173实验组；K，TiTE-12 BV173实验组；L，T细胞阴性对照；M，TiTE-6 T细胞实验组；N，TiTE-8 T细胞实验组；O，TiTE-9 T细胞实验组；P，TiTE-10 T细胞实验组；Q，TiTE-11 T细胞实验组；R，TiTE-12 T细胞实验组。实验证明多功能蛋白分子TiTE-1分别与CD3抗原和CD19抗原结合良好；TiTE-6、8、9、10、11、12的antiMHC/WT1和antiCD3分别与WT1胞内抗原和CD3抗原结合功能良好。
图9为TiTE-2、3、4多功能蛋白分子的流式结果：A，malme-3M阴性对照；B，TiTE-2malme-3M实验组；C，TiTE-3 malme-3M实验组；D，TiTE-4 malme-3M实验组；E，T细胞阴性对照；F，TiTE-2 T细胞实验组；G，TiTE-3 T细胞实验组；H，TiTE-4 T细胞实验组。从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-2、3分别与MHC/GP100抗原和CD3抗原结合良好，TiTE-4与MHC/Mart1抗原和CD3抗原结合良好。
图10为TiTE-15、16多功能蛋白分子的流式结果：A，BV173阴性对照；B，TiTE-15BV173实验组；C，TiTE-15 BV173实验组；D，T细胞阴性对照；E，TiTE-15 T细胞实验组；F，TiTE-16 T细胞实验组。从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-15、16分别与CD19抗原和CD3抗原结合良好。
图11为TiTE-5多功能蛋白分子的流式结果：A；malme-3M-CD19-Luc阴性对照；B，TiTE-5malme-3M-CD19-Luc实验组；C，malme-3M-CD22-Luc阴性对照；D，TiTE-5malme-3M-CD22-Luc实验组；E，T细胞阴性对照；F，TiTE-5 T细胞实验组；。从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-5分别与CD19抗原、CD20抗原和CD3抗原结合良好。
实施发明的最佳方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、表达多功能蛋白分子载体的构建
1、构建靶向CD19阳性肿瘤细胞的新型多功能蛋白质TiTE-1
向CD19阳性肿瘤细胞的新型多功能蛋白质TiTE-1，其由主肽链X1和辅肽链Y1聚合得到蛋白(图1)；
主肽链X1包括抗原1结合域R1、细胞因子或细胞因子受体中的细胞因子结合域R2和抗原2结合域R3；
辅肽链Y1包括抗原3结合域R4和主肽链X连接域R5。
主肽链(X1)的抗原结合域(R1)选用antiCD19-ScFv(序列1)、辅肽链连接域(R2)选用IL15Rαsushi(序列2)、抗原结合域(R3)选用antiCD3-ScFv(序列3)；
辅肽链(Y1)的抗原结合域(R4)(a)选用PDL1与PDL2的受体PD1的胞外区(序列4)，主肽链连接域(R5)选用IL15(序列5)。
2、信号肽(氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP)，主肽链5’端添加HindIII酶切位点，主肽链的辅肽链连接域(R2：L15Rαsushi)和抗原结合域(R3：antiCD3-ScFv)之间连接的接头肽上含有BamHI酶切位点；在主肽链的3’端与辅肽链5’端添加P2A肽段(氨基酸序列为：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)；辅肽链3’端添加Xba I酶切位点。
3、PCR扩增antiCD19-IL15Rα sushi片段、antiCD3片段和P2A-PD1-IL15片段，进行核酸凝胶电泳；重叠PCR扩增antiCD3-P2A-PD1-IL15片段，进行核酸凝胶电泳；使用HindIII和BamHI切割antiCD19-IL15Rα sushi片段，使用BamHI和Xba I切割antiCD3-P2A-PD1-IL15；使用HindIII和Xba I切割载体PCDNA3.1(Invitrogen)。
4、切胶回收目的片段，将回收的三个片段进行连接，转化挑去单克隆并测序鉴定，最后得到目的质粒PCDNA3.1-TiTE-1。
重组载体PCDNA3.1-TiTE-1为将表达靶向CD19阳性肿瘤细胞的多功能蛋白质编码基因TiTE-1的表达盒(该表达盒的核苷酸序列由编码主肽链X1的核苷酸序列序列6和编码辅肽链Y1的核苷酸序列序列7组成，且序列6的最后一位核苷酸与序列7的第一位核苷酸紧邻)替换PCDNA3.1载体(invitrogen产品)的HindIII和Xba I酶切位点间片段，得到的重组载体，该载体表达由主肽链X1(氨基酸序列为序列8)和辅肽链Y1(氨基酸序列为序列9)组成的功能性多功能蛋白质TiTE-1。
5、按照上述步骤分别构建多功能蛋白质TiTE-2、TiTE-3、TiTE-4、TiTE-5、TiTE-6、TiTE-7、TiTE-8、TiTE-9、TiTE-10、TiTE-11、TiTE-12的表达载体，用类似的方法构建TiTE-13、TiTE-14、TiTE-15、TiTE-16的表达载体，其结构域如下表1所示，其表达框架见图2。
表1为多功能蛋白质组成结构
Figure GPA0000260778350000211
Figure GPA0000260778350000221
其中，AntiMHC/GP100-VHH的氨基酸序列为序列10；
AntiMHC/Mart1-VHH的氨基酸序列为序列11；
AntiMHC/WT1-VH的氨基酸序列为序列12；
IL4Rα-N-FN3的氨基酸序列为序列13；
AntiCD16-ScFv的氨基酸序列为序列14；
AntiCD22-ScFv的氨基酸序列为序列15；
IL4的氨基酸序列为序列16；
TiTE-2的主肽链氨基酸序列为序列17，辅肽链氨基酸序列为序列9；
TiTE-3的主肽链氨基酸序列为序列17，辅肽链氨基酸序列为序列18；
TiTE-4的主肽链氨基酸序列为序列19，辅肽链氨基酸序列为序列9；
TiTE-5的主肽链氨基酸序列为序列8，辅肽链氨基酸序列为序列20；
TiTE-6的主肽链氨基酸序列为序列21，辅肽链氨基酸序列为序列9；
TiTE-7的主肽链氨基酸序列为序列22，辅肽链氨基酸序列为序列9；
TiTE-8的主肽链氨基酸序列为序列23，辅肽链氨基酸序列为序列24；
TiTE-9的主肽链氨基酸序列为序列25，辅肽链氨基酸序列为序列26；
TiTE-10的主肽链氨基酸序列为序列27，辅肽链氨基酸序列为序列28；
TiTE-11的主肽链氨基酸序列为序列29，辅肽链氨基酸序列为序列9。
TiTE-12的主肽链氨基酸序列为序列30，辅肽链氨基酸序列为序列31。
TiTE-13为主肽链，该主肽链的氨基酸序列为序列21。
TiTE-14的主肽链氨基酸序列为序列21，辅肽链氨基酸序列为序列5。
TiTE-15为主肽链，该主肽链的氨基酸序列为序列8。
TiTE-16的主肽链氨基酸序列为序列8，辅肽链氨基酸序列为序列5。
表达TiTE-2的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列35，辅肽链编码核酸序列为序列7；
表达TiTE-3的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列35，辅肽链编码核酸序列为序列36；
表达TiTE-4的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列37，辅肽链编码核酸序列为序列7；
表达TiTE-5的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列6，辅肽链编码核酸序列为序列38；
表达TiTE-6的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列39，辅肽链编码核酸序列为序列7；
表达TiTE-7的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列40，辅肽链编码核酸序列为序列7；
表达TiTE-8的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列41，辅肽链编码核酸序列为序列42；
表达TiTE-9的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列43，辅肽链编码核酸序列为序列44；
表达TiTE-10的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列45，辅肽链编码核酸序列为序列46；
表达TiTE-11的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列47，辅肽链编码核酸序列为序列7；
表达TiTE-12的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列48，辅肽链编码核酸序列为序列49；
表达TiTE-13的编码核酸序列为序列39；
表达TiTE-14的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列39，辅肽链编码核酸序列为序列50；
表达TiTE-15的编码核酸序列为序列6；
表达TiTE-16的编码核酸由主肽链编码核酸和辅肽链编码核酸组成，且主肽链编码核酸的3’端末端最后一位碱基与辅肽链编码核酸5’末端第1位碱基相邻；其中，主肽链编码核酸序列为序列6，辅肽链编码核酸序列为序列50；
重组载体PCDNA3.1-TiTE-2至重组载体PCDNA3.1-TiTE-16分别为将表达TiTE-2的编码核酸至表达TiTE-16的编码核酸中对应核酸替换PCDNA3.1载体的HindIII和Xba I酶切位点间片段，得到的重组载体。
实施例2、多靶向功能性多功能蛋白质分子多肽表达纯化
1、37℃、8％CO2、120rpm培养293F(invitrogen)至细胞密度为1*10E6Cell/ml。
2、将实施例1中构建的载体PCDNA3.1-TiTE-1使用PEI转染到上述1的细胞中，转染质粒浓度为1mg/L，PEI浓度为3mg/L。37℃，8％CO2、120rpm培养5-6天。
3、4000rpm离心上述2的培养产物，收集培养基上清液，Protein/capto L beads纯化蛋白，500uLpH2.6-3.0 0.1MGly-HCL洗脱液洗脱，收集洗脱液。
4、SDS-PAGE检测收集蛋白(见图3)，可以看出，得到约65KD和30KD的目的蛋白，即为多功能蛋白分子TiTE-1的主肽链X和辅肽链Y。
5、使用相同的方法表达纯化TiTE-2、TiTE-3、TiTE-4、TiTE-5、TiTE-7、TiTE-8、TiTE-9、TiTE-10、TiTE-11、TiTE-12等多功能蛋白质。
实施例3、多功能蛋白分子TiTE-1、15、16介导T细胞体外杀伤CD19+靶细胞实验验证
1、将1*10E4靶细胞malme-3M-CD19-luc(将ATCC购买的Malme-3M中转染CD19抗原(其核酸序列为序列32)与Luc基因(其核酸序列为序列33)，使其表达CD19抗原与Luc基因，得到细胞malme-3M-CD19-luc)(50uL)铺中于96孔板内，37℃、5％CO2培养18-20h。
2、待细胞贴壁后吸取并弃去培养基，加入50uL新鲜培养基37℃、5％CO2培养1-3h。
3、逐级稀释实施例2得到的目的蛋白TiTE-1至浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/uL；
实验组：分别向50uL的1*10E5的T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激14天)中加入50、5、0.5、0.05、0.005ng实施例2得到的目的蛋白TiTE-137℃孵育1-2h，得到与抗体孵育好的T细胞。
阴性对照组：对该靶细胞无杀伤作用的双特异性对照抗体(TiTE-6)，向50uL的1*10E5的T细胞中分别加入50、5、0.5、0.05、0.005ng对照抗体37℃孵育1-2h。
4、将与抗体孵育好的T细胞50uL加入铺有靶细胞的96孔板中，37℃、5％CO2培养22-24h。
5、每孔加入100uL1％Triton裂解液，反复吹匀，静置3-5min，使细胞完全裂解，取50uL裂解液置于黑色96孔板中，加入50uL底物(300ug/mL Luc水溶液与2mg/mL ATP水溶液按照体积比为3∶1混和)吹吸混匀，迅速测其荧光值。
6.计算杀伤效率：杀伤效率＝{(阴性对照荧光值-实验组荧光值)/阴性对照荧光值}*100％。
结果如图4B所示。可以看出，与图4A中对照组相比本发明所提供的多功能蛋白TiTE-1使用极低的浓度即可对CD19阳性肿瘤细胞进行体外杀伤，浓度为0.5-5ng/10E6个细胞时体外杀伤效果最好。
7、用相同的方式，进行TiTE-15、16杀伤实验，验证使用极低的浓度的多功能蛋白质即可对肿瘤细胞进行杀伤。
结果如图4C、4D所示，可以看出，本发明所提供的多功能蛋白TiTE-15、16使用极低的浓度即可对肿瘤细胞进行体外杀伤，浓度为0.5-5ng/10E6个细胞时体外杀伤效果最好。
8、用相同的方式，进行TiTE-5杀伤实验，靶细胞分别使用malme-3M-CD19-luc和malme-3M-CD22-luc(将ATCC购买的Malme-3M中转染CD22抗原(其核酸序列为序列34)与Luc基因(其核酸序列为序列33)。结果如图4E、4F所示。可以看出，本发明所提供的多功能蛋白TiTE-5对CD19和CD22阳性细胞均有杀伤功能，且使用极低的浓度即可对肿瘤细胞进行体外杀伤，浓度为0.5-5ng/10E6个细胞时体外杀伤效果最好。
实施例4、多功能蛋白分子TiTE-6、8、9、10、11、12、13、14介导T细胞体外杀伤WT1+靶细胞实验验证
1、将1*10E4靶细胞BV173(50uL)(ATCC购买BV173转染Luc基因(其核酸序列为序列33))铺中于96孔板内，37℃、5％CO2培养1-2h。
2、逐级稀释实施例2得到的目的蛋白TiTE-6至浓度为50、5、0.5、0.05ng/uL；
实验组：分别向50uL的1*10E5的T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激14天)中加入50、5、0.5、0.05ng实施例2得到的目的蛋白TiTE-6 37℃孵育1-2h。
阴性对照组：对该靶细胞无杀伤作用的双特异性对照抗体(TiTE-2)，向50uL的1*10E5的T细胞中分别加入50、5、0.5、0.05ng对照抗体37℃孵育1-2h。
3、将与抗体孵育好的T细胞50uL加入铺有靶细胞的96孔板中，37℃、5％CO2培养22-24h。
4、每孔加入100uL1％Triton裂解液，反复吹匀，静置3-5min，使细胞完全裂解，取50uL裂解液置于黑色96孔板中，加入50uL底物(300ug/mL Luc水溶液与2mg/mL ATP水溶液按照体积比为3∶1混和)吹吸混匀，迅速测其荧光值。
5、计算杀伤效率：杀伤效率＝{(阴性对照荧光值-实验组荧光值)/阴性对照荧光值}*100％。
结果如图5B所示，可以看出，本发明所提供的多功能蛋白TiTE-6使用极低的浓度即可对肿瘤细胞进行杀伤。
6、用相同的方法，进行TiTE-8、9、10、11、12、13、14杀伤实验，效靶比为10∶1，抗体浓度为每个体系中加入5ng相应抗体。实验结果如图5C所示，可以看出，本发明所提供的多功能蛋白WT1阳性肿瘤细胞进行杀伤。
实施例5、多功能蛋白分子TiTE-2、3、4介导T细胞体外杀伤靶细胞实验
1、将1*10E4靶细胞malme-3M-luc(将ATCC购买的Malme-3M中转染Luc基因)(50uL)铺中于96孔板内，37℃、5％CO2培养18-20h。
2、待细胞贴壁后吸取并弃去培养基，加入50uL新鲜培养基37℃、5％CO2培养1-3h。
3、逐级稀释实施例2得到的目的蛋白TiTE-2、3、4至浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/uL；
实验组：分别向50uL的1*10E5的T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激14天)中加入50、5、0.5、0.05、0.005ng实施例2得到的目的蛋白TiTE-2、3、4，37℃孵育1-2h，得到与抗体孵育好的T细胞。
阴性对照组：对该靶细胞无杀伤作用的双特异性对照抗体(TiTE-6)，向50uL的1*10E5的T细胞中分别加入50、5、0.5、0.05、0.005ng对照抗体37℃孵育1-2h。
4、将与抗体孵育好的T细胞50uL加入铺有靶细胞的96孔板中，37℃、5％CO2培养22-24h。
5、每孔加入100uL1％Triton裂解液，反复吹匀，静置3-5min，使细胞完全裂解，取50uL裂解液置于黑色96孔板中，加入50uL底物(300ug/mL Luc水溶液与2mg/mL ATP水溶液按照体积比为3∶1混和)吹吸混匀，迅速测其荧光值。
6.计算杀伤效率：杀伤效率＝{(阴性对照荧光值-实验组荧光值)/阴性对照荧光值}*100％。
结果如图6所示。可以看出，本发明所提供的多功能蛋白TiTE-2、3、4使用极低的浓度即可对肿瘤细胞进行体外杀伤，浓度为0.5-5ng/10E6个细胞时体外杀伤效果最好。
实施例6、多功能蛋白分子TiTE-1刺激NK细胞扩增
1、将6*10E5的NK92细胞(中国典型培养物保藏中心)接种于2ML培养基(基础培养基Alpha medium，12.5％马血清，12.5％FBS，0.2mM肌醇，0.1mM巯基乙醇，0.02mM叶酸)中，添加40ng/mL的实施例2得到的TiTE-1多功能蛋白分子，37℃、5％CO2培养。
2、培养2-3d后，计细胞总数，传代继续培养至18d，每次传代调整细胞密度为3*10E5个细胞/mL，添加40ng/mL的TiTE-1多功能蛋白分子。
细胞生长曲线如图7所示，可以看出，本发明所提供的多功能蛋白TiTE-1能够刺激NK细胞扩增，具有IL15/IL15Rα sushi的功能。
TiTE2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15的IL15/IL15Rα sushi结构域与TiTE-1相同，其功能无显著差异
实施例7、多功能蛋白分子TiTE-1的antiCD19和antiCD3分别与CD19抗原和CD3抗原及TiTE-6、8、9、10、11、12的antiMHC/WT1和antiCD3分别与WT1胞内抗原和CD3抗原结合功能的流式验证
1、T细胞实验组和BV173细胞实验组：分别向3*10E5个T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激14天)和BV173细胞中加入5ug的TiTE-1、6、8、9、10、11、12多功能蛋白分子，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。加入2uLAPC Mouse anti-Human CD279(BD，货号558694)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。
T细胞阴性对照组和BV173细胞阴性对照组：分别向3*10E5个T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激12-14天)和BV173细胞(ATCC)中加入2uLAPC Mouse anti-Human CD279(BD，货号558694)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞，作为阴性对照。
2、进行流式分析如图8所示，从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-1分别与CD19抗原和CD3抗原结合良好；TiTE-6、8、9、10、11、12的antiMHC/WT1和antiCD3分别与WT1胞内抗原和CD3抗原结合功能良好。
实施例8、多功能蛋白分子TiTE-2、3中antiMHC/GP100和antiCD3与TiTE-4中antiMHC/Mart1和antiCD3抗原结合功能的流式验证
1、T细胞实验组和malme-3M-Luc将(ATCC购买的Malme-3M中转染Luc基因)细胞实验组：分别向3*10E5个T细胞和malme-3M-Luc细胞中加入5ug的TiTE-2、3、4多功能蛋白分子，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。加入2uL PE conjugatedanti-hIL-15(R&D，货号IC2471P)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。
T细胞阴性对照组和malme-3M-Luc细胞阴性对照组：分别向3*10E5个T细胞和malme-3M-Luc中加入2uLAPC Mouse anti-Human CD279(BD，货号558694)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞，作为阴性对照。
2、进行流式分析如图9所示，从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-2、3分别与MHC/GP100抗原和CD3抗原结合良好，TiTE-4与MHC/Mart1抗原和CD3抗原结合良好。
实施例9、多功能蛋白分子TiTE-15/16的antiCD19和antiCD3分别与CD19抗原和CD3抗原结合功能的流式验证
1、T细胞实验组和BV173细胞实验组：分别向3*10E5个T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激14天)和BV173细胞中加入5ug的TiTE-15、16多功能蛋白分子，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。加入2uL FITC-Labeled Recombinant Protein L(ACRO Biosystem，货号RPL-PF141)，冰上孵浴30min。离心去上清，500uLPBS洗涤两遍使用200uL的PBS重悬细胞。
T细胞阴性对照组和BV173细胞阴性对照组：分别向3*10E5个T细胞(正常人外周血密度梯度离心，取富含单个核细胞的白膜层，50ng/mLOKT3，300IU/mLIL2刺激12-14天)和BV173细胞(ATCC)中加入2uLAPC Mouse anti-Human CD279(BD，货号558694)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞，作为阴性对照。
2、进行流式分析如图10所示，从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-15、16分别与CD19抗原和CD3抗原结合良好。
实施例10、多功能蛋白分子TiTE-5中antiCD19、antiCD20和antiCD3与抗原结合功能的流式验证
1、T细胞实验组、malme-3M-CD19-Luc将((将ATCC购买的Malme-3M中转染CD19抗原基因与Luc基因)及malme-3M-CD22-Luc将((将ATCC购买的Malme-3M中转染CD22抗原与Luc基因)细胞实验组：分别向3*10E5个T细胞和malme-3M-Luc细胞中加入5ug的TiTE-5多功能蛋白分子，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。加入2uL PEconjugated anti-hIL-15(R&D，货号IC2471P)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞。
T细胞阴性对照组和malme-3M-CD19-Luc、malme-3M-CD22-Luc细胞阴性对照组：分别向3*10E5个T细胞和malme-3M-CD19-Luc、malme-3M-CD22-Luc中加入2uL PE conjugatedanti-hIL-15(R&D，货号IC2471P)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用200uL的PBS重悬细胞，作为阴性对照。
2、进行流式分析如图11所示，从图中可看出多功能蛋白分子TiTE-5分别与CD19抗原、CD20抗原和CD3抗原结合良好。
工业应用
本发明的实验证明，本发明的多功能蛋白质可通过其两个肿瘤相关抗原的抗原结合域与不同的肿瘤抗原结合，介导特异性的细胞杀伤，提高了靶向的精确性；若其中一个抗原结合域所结合的抗原为免疫筛查点相关抗原，可以将阻断免疫抑制信号，提高了杀伤肿瘤的能力；本发明的多功能蛋白质中引入了细胞因子与细胞因子受体复合物，它们可以发挥细胞因子的功能。
序列表
<110>深圳市北科生物科技有限公司
<120>一种多功能蛋白质
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 72
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 2
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln
65 70
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr
165 170 175
Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr
210 215 220
Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val
<210> 4
<211> 150
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 4
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val
145 150
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 5
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 6
<211> 1815
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 6
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggatatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggctcc acctctggct ccggcaagcc cggatctggc 420
gagggctcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480
tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540
agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600
gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660
aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720
tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc 780
tcagtcaccg tgagctcagg cggcggcgga tctatcacgt gccctccccc catgtccgtg 840
gaacacgcag acatctgggt caagagctac agcttgtact ccagggagcg gtacatttgt 900
aactctggtt tcaagcgtaa agccggcacg tccagcctga cggagtgcgt gttgaacaag 960
gccacgaatg tcgcccactg gacaaccccc agtctcaaat gcattagaga ccctgccctg 1020
gttcaccaaa gcggcggctc cgggggaggt ggatccggag gtggctccgg tggaggcgga 1080
agcctgcagg atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgctag cgtgggcgat 1140
agggtcacca tcacctgtcg tgccagtcag gacatccgta attatctcaa ctggtatcaa 1200
cagaaaccag gaaaagctcc gaaactactg atttactata cctcccgcct ggagtctgga 1260
gtcccttctc gcttctctgg ttctggttct gggacggatt acactctgac catcagcagt 1320
ctgcaaccgg aggacttcgc aacttattac tgtcagcaag gtaatactct gccgtggacg 1380
ttcggacagg gcaccaaggt ggagatcaaa ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct 1440
ggcggtggcg gatcggaggt tcagctggtg gagtctggcg gtggcctggt gcagccaggg 1500
ggctcactcc gtttgtcctg tgcagcttct ggctactcct ttaccggcta cactatgaac 1560
tgggtgcgtc aggccccagg taagggcctg gaatgggttg cactgattaa tccttataaa 1620
ggtgtttcca cctataacca gaaattcaag gatcgtttca cgatatccgt agataaatcc 1680
aaaaacacag cctacctgca aatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 1740
tgtgctagaa gcggatacta cggcgatagc gactggtatt ttgacgtctg gggtcaagga 1800
accctggtca ccgtc 1815
<210> 7
<211> 873
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 7
ggaagcggcg ccaccaactt ctccctgctg aagcaagctg gcgacgtgga agagaacccc 60
ggccccccag gatggttctt agactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc 120
ccagccctgc tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac 180
acatcggaga gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag 240
ctggccgcct tccccgagga ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca 300
caactgccca acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc 360
ggcacctacc tctgtggggc catctccctg gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg 420
cgggcagagc tcagggtgac agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc 480
tcacccaggc cagccggcca gttccaaacc ctggtgggcg gaggaggctc caactgggtg 540
aacgtcatct ccgacctcaa gaagatcgag gacctgatcc agagcatgca catcgacgcc 600
accctgtata ccgagagcga cgtgcacccc tcctgtaaag tgaccgccat gaagtgcttc 660
ctgctggagc tgcaggtgat cagcctggag agcggcgacg ccagcatcca tgacaccgtg 720
gagaacctga tcatcctggc caataacagc ctgagctcca acggcaacgt gaccgagagc 780
ggctgcaagg aatgcgagga gctggagaag aagaacatta aggagttcct gcagagcttc 840
gtccacatcg tgcagatgtt cattaacacc tcc 873
<210> 8
<211> 605
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
165 170 175
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
195 200 205
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
210 215 220
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
260 265 270
Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys
275 280 285
Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe
290 295 300
Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys
305 310 315 320
Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
325 330 335
Asp Pro Ala Leu Val His Gln Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ile Gln Met Thr
355 360 365
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
370 375 380
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
385 390 395 400
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg
405 410 415
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
420 425 430
Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
435 440 445
Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
450 455 460
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
485 490 495
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
500 505 510
Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
515 520 525
Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr
530 535 540
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
545 550 555 560
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
565 570 575
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp
580 585 590
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
595 600 605
<210> 9
<211> 269
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 9
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val
145 150 155 160
Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile
165 170 175
Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val
180 185 190
Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu
195 200 205
Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu
210 215 220
Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys
225 230 235 240
Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln
245 250 255
Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
260 265
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Asp
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Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Thr Arg Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ala Ile Tyr Trp Arg Gly Ser Tyr Tyr Thr Glu Gly Asn Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Met Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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35 40 45
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50 55 60
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Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser
260 265 270
Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
275 280 285
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp
305 310 315 320
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln
340 345 350
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355 360 365
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Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
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Ala Asn Phe Tyr Ser Glu Gln Pro Phe Gln Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Val Leu Gln
115 120 125
Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp
130 135 140
Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn
165 170 175
Asn Gly Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val
180 185 190
Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu
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Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro
210 215 220
Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr
225 230 235 240
Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr
245 250 255
Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile
260 265 270
Tyr Asn Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr
275 280 285
Leu Lys Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
325 330 335
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
340 345 350
Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
355 360 365
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro
370 375 380
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
385 390 395 400
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
420 425 430
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
450 455 460
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
485 490 495
Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
500 505 510
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
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Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
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50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
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130 135 140
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Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val
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Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
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<223>
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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ile Ser Ser Asp Asp Met
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50 55 60
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Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro
115 120 125
Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu
130 135 140
Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala
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Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val
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195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp
210 215 220
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225 230 235 240
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Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser
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Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr
165 170 175
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195 200 205
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Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
260 265 270
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
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Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020
ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080
ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140
ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200
ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260
tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320
aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380
tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440
cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggggtc ccagtcctat 1500
gaggatatga gaggaatcct gtatgcagcc ccccagctcc gctccattcg gggccagcct 1560
ggacccaatc atgaggaaga tgcagactct tatgagaaca tggataatcc cgatgggcca 1620
gacccagcct ggggaggagg gggccgcatg ggcacctgga gcaccaggtg a 1671
<210> 33
<211> 1773
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 33
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg aattctcacg gcttccctcc cgaggtggag 1680
gagcaggccg ccggcaccct gcccatgagc tgcgcccagg agagcggcat ggatagacac 1740
cctgctgctt gcgccagcgc caggatcaac gtc 1773
<210> 34
<211> 2544
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 34
atgcatctcc tcggcccctg gctcctgctc ctggttctag aatacttggc tttctctgac 60
tcaagtaaat gggtttttga gcaccctgaa accctctacg cctgggaggg ggcctgcgtc 120
tggatcccct gcacctacag agccctagat ggtgacctgg aaagcttcat cctgttccac 180
aatcctgagt ataacaagaa cacctcgaag tttgatggga caagactcta tgaaagcaca 240
aaggatggga aggttccttc tgagcagaaa agggtgcaat tcctgggaga caagaataag 300
aactgcacac tgagtatcca cccggtgcac ctcaatgaca gtggtcagct ggggctgagg 360
atggagtcca agactgagaa atggatggaa cgaatacacc tcaatgtctc tgaaaggcct 420
tttccacctc atatccagct ccctccagaa attcaagagt cccaggaagt cactctgacc 480
tgcttgctga atttctcctg ctatgggtat ccgatccaat tgcagtggct cctagagggg 540
gttccaatga ggcaggctgc tgtcacctcg acctccttga ccatcaagtc tgtcttcacc 600
cggagcgagc tcaagttctc cccacagtgg agtcaccatg ggaagattgt gacctgccag 660
cttcaggatg cagatgggaa gttcctctcc aatgacacgg tgcagctgaa cgtgaagcac 720
accccgaagt tggagatcaa ggtcactccc agtgatgcca tagtgaggga gggggactct 780
gtgaccatga cctgcgaggt cagcagcagc aacccggagt acacgacggt atcctggctc 840
aaggatggga cctcgctgaa gaagcagaat acattcacgc taaacctgcg cgaagtgacc 900
aaggaccaga gtgggaagta ctgctgtcag gtctccaatg acgtgggccc gggaaggtcg 960
gaagaagtgt tcctgcaagt gcagtatgcc ccggaacctt ccacggttca gatcctccac 1020
tcaccggctg tggagggaag tcaagtcgag tttctttgca tgtcactggc caatcctctt 1080
ccaacaaatt acacgtggta ccacaatggg aaagaaatgc agggaaggac agaggagaaa 1140
gtccacatcc caaagatcct cccctggcac gctgggactt attcctgtgt ggcagaaaac 1200
attcttggta ctggacagag gggcccggga gctgagctgg atgtccagta tcctcccaag 1260
aaggtgacca cagtgattca aaaccccatg ccgattcgag aaggagacac agtgaccctt 1320
tcctgtaact acaattccag taaccccagt gttacccggt atgaatggaa accccatggc 1380
gcctgggagg agccatcgct tggggtgctg aagatccaaa acgttggctg ggacaacaca 1440
accatcgcct gcgcagcttg taatagttgg tgctcgtggg cctcccctgt cgccctgaat 1500
gtccagtatg ccccccgaga cgtgagggtc cggaaaatca agcccctttc cgagattcac 1560
tctggaaact cggtcagcct ccaatgtgac ttctcaagca gccaccccaa agaagtccag 1620
ttcttctggg agaaaaatgg caggcttctg gggaaagaaa gccagctgaa ttttgactcc 1680
atctccccag aagatgctgg gagttacagc tgctgggtga acaactccat aggacagaca 1740
gcgtccaagg cctggacact tgaagtgctg tatgcaccca ggaggctgcg tgtgtccatg 1800
agcccggggg accaagtgat ggaggggaag agtgcaaccc tgacctgtga gagcgacgcc 1860
aaccctcccg tctcccacta cacctggttt gactggaata accaaagcct cccctaccac 1920
agccagaagc tgagattgga gccggtgaag gtccagcact cgggtgccta ctggtgccag 1980
gggaccaaca gtgtgggcaa gggccgttcg cctctcagca ccctcaccgt ctactatagc 2040
ccggagacca tcggcaggcg agtggctgtg ggactcgggt cctgcctcgc catcctcatc 2100
ctggcaatct gtgggctcaa gctccagcga cgttggaaga ggacacagag ccagcagggg 2160
cttcaggaga attccagcgg ccagagcttc tttgtgagga ataaaaaggt tagaagggcc 2220
cccctctctg aaggccccca ctccctggga tgctacaatc caatgatgga agatggcatt 2280
agctacacca ccctgcgctt tcccgagatg aacataccac gaactggaga tgcagagtcc 2340
tcagagatgc agagacctcc cccggactgc gatgacacgg tcacttattc agcattgcac 2400
aagcgccaag tgggcgacta tgagaacgtc attccagatt ttccagaaga tgaggggatt 2460
cattactcag agctgatcca gtttggggtc ggggagcggc ctcaggcaca agaaaatgtg 2520
gactatgtga tcctcaaaca ttga 2544
<210> 35
<211> 1446
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 35
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccgacgtc 60
caactgcaag ctagcggggg aggcttggtg cagcctgggg ggtctctgag actctcctgt 120
gcagcctctg gacgcacctt caatgtcgat gctatggctt ggttccgcca gactcgcggg 180
aaggagcgtg agtttgtagc agctattagc cggagtggtg gtagcacgta ctatgcagac 240
tccgtgaagg gccgattcag catctccaaa gacaacgcca aaaacacgat gtatctgcaa 300
atgaacagcc tcaaacctga ggacacggcc atttattact gtgcagctgc aatctactgg 360
cgtggtagtt actacactga aggcaactat gactactggg gccagaggac ccaggtcacc 420
gtctcgagcg gcggcggcgg atctatcacg tgccctcccc ccatgtccgt ggaacacgca 480
gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac tccagggagc ggtacatttg taactctggt 540
ttcaagcgta aagccggcac gtccagcctg acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat 600
gtcgcccact ggacaacccc cagtctcaaa tgcattagag accctgccct ggttcaccaa 660
agcggcggct ccgggggagg tggatccgga ggtggctccg gtggaggcgg aagcctgcag 720
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcta gcgtgggcga tagggtcacc 780
atcacctgtc gtgccagtca ggacatccgt aattatctca actggtatca acagaaacca 840
ggaaaagctc cgaaactact gatttactat acctcccgcc tggagtctgg agtcccttct 900
cgcttctctg gttctggttc tgggacggat tacactctga ccatcagcag tctgcaaccg 960
gaggacttcg caacttatta ctgtcagcaa ggtaatactc tgccgtggac gttcggacag 1020
ggcaccaagg tggagatcaa aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 1080
ggatcggagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 1140
cgtttgtcct gtgcagcttc tggctactcc tttaccggct acactatgaa ctgggtgcgt 1200
caggccccag gtaagggcct ggaatgggtt gcactgatta atccttataa aggtgtttcc 1260
acctataacc agaaattcaa ggatcgtttc acgatatccg tagataaatc caaaaacaca 1320
gcctacctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 1380
agcggatact acggcgatag cgactggtat tttgacgtct ggggtcaagg aaccctggtc 1440
accgtc 1446
<210> 36
<211> 732
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 36
gacgtccaac tgcaagctag cgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcaat gtcgatgcta tggcttggtt ccgccagact 120
cgcgggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagccgga gtggtggtag cacgtactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcagcatc tccaaagaca acgccaaaaa cacgatgtat 240
ctgcaaatga acagcctcaa acctgaggac acggccattt attactgtgc agctgcaatc 300
tactggcgtg gtagttacta cactgaaggc aactatgact actggggcca gaggacccag 360
gtcaccgtct cctcaggcgg aggaggctcc aactgggtga acgtcatctc cgacctcaag 420
aagatcgagg acctgatcca gagcatgcac atcgacgcca ccctgtatac cgagagcgac 480
gtgcacccct cctgtaaagt gaccgccatg aagtgcttcc tgctggagct gcaggtgatc 540
agcctggaga gcggcgacgc cagcatccat gacaccgtgg agaacctgat catcctggcc 600
aataacagcc tgagctccaa cggcaacgtg accgagagcg gctgcaagga atgcgaggag 660
ctggagaaga agaacattaa ggagttcctg cagagcttcg tccacatcgt gcagatgttc 720
attaacacct cc 732
<210> 37
<211> 1422
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 37
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccgatgtg 60
cagctgcaag ctagcggagg cggcctggtg caagctggag actccctgag gctgagctgc 120
gccgctagcg gaaggacctt cagcacctac aacatgggct ggttcaggca ggcccccgga 180
aaggacaggg agttcgtggc cgccattatg tggtccggcg gcagcaccta ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac aatctccaag gacaacgcca agaacaccgt gtacctgcag 300
atgaactccc tgaagcccga ggatacagcc gtgtacttct gctggagcac cgatgattac 360
ggagtcgaca gctggggcca gggaacccag gtgaccgtga gctccggcgg cggcggatct 420
atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc 480
ttgtactcca gggagcggta catttgtaac tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc 540
agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc acgaatgtcg cccactggac aacccccagt 600
ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt caccaaagcg gcggctccgg gggaggtgga 660
tccggaggtg gctccggtgg aggcggaagc ctgcaggata tccagatgac ccagtccccg 720
agctccctgt ccgctagcgt gggcgatagg gtcaccatca cctgtcgtgc cagtcaggac 780
atccgtaatt atctcaactg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt 840
tactatacct cccgcctgga gtctggagtc ccttctcgct tctctggttc tggttctggg 900
acggattaca ctctgaccat cagcagtctg caaccggagg acttcgcaac ttattactgt 960
cagcaaggta atactctgcc gtggacgttc ggacagggca ccaaggtgga gatcaaaggt 1020
ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggaggttca gctggtggag 1080
tctggcggtg gcctggtgca gccagggggc tcactccgtt tgtcctgtgc agcttctggc 1140
tactccttta ccggctacac tatgaactgg gtgcgtcagg ccccaggtaa gggcctggaa 1200
tgggttgcac tgattaatcc ttataaaggt gtttccacct ataaccagaa attcaaggat 1260
cgtttcacga tatccgtaga taaatccaaa aacacagcct acctgcaaat gaacagcctg 1320
cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt gctagaagcg gatactacgg cgatagcgac 1380
tggtattttg acgtctgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tc 1422
<210> 38
<211>1104
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 38
caggtgcagc tgcaacagag cggccctgga ctggtgaagc ccagccagac actgagcctc 60
acctgcgcca ttagcggcga cagcgtgagc tccaattccg ccgcctggaa ttggatcaga 120
cagagcacaa gcaggggcct ggagtggctg ggcaggacct actacaggag caagtggtac 180
aacgactacg ccgtgtccgt gaagagcagg atcacaatca accccgacac cagcaagaac 240
cagttcagcc tgcagctcaa cagcgtcacc cccgaagaca ccgccgtgta ctactgcgcc 300
agagaggtga ccggcgacct ggaggacgcc ttcgacatct ggggccaagg caccatggtg 360
accgtgagct ccggctccac aagcggaagc ggcaaacctg gctccggcga gggttctacc 420
aaaggcgaca tccagatgac ccagagccct tcctccctga gcgccagcgt gggcgataga 480
gtgacaatta cctgcagggc cagccagacc atctggagct acctgaactg gtaccagcag 540
aggcccggaa aggcccccaa cctgctgatc tacgccgctt ccagcctgca gagcggcgtg 600
cctagcaggt tctccggcag aggcagcggc accgatttca ccctgacaat cagcagcctg 660
caggccgaag attttgccac ctactactgc cagcagagct acagcatccc ccagaccttc 720
ggccagggca ccaaactgga gatcaagggc ggaggaggct ccaactgggt gaacgtcatc 780
tccgacctca agaagatcga ggacctgatc cagagcatgc acatcgacgc caccctgtat 840
accgagagcg acgtgcaccc ctcctgtaaa gtgaccgcca tgaagtgctt cctgctggag 900
ctgcaggtga tcagcctgga gagcggcgac gccagcatcc atgacaccgt ggagaacctg 960
atcatcctgg ccaataacag cctgagctcc aacggcaacg tgaccgagag cggctgcaag 1020
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gtgcagatgt tcattaacac ctcc 1104
<210> 39
<211> 1431
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 39
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattct 60
cagctgttgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgcg tctctcctgt 120
gcagcctccg gatataggat tagctctgac gatatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aagggtctag agtgggtatc aaccatttat gagacagacg gtagcacata ctacgcagac 240
tccgtgaagg gccggttcac catctcccgt gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300
atgaacagcc tgcgtgccga ggacaccgcg gtatattatt gcgcgagagc taatttttat 360
agtgagcagc ccttccagtt ttggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggcggc 420
ggcggatcta tcacgtgccc tccccccatg tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag 480
agctacagct tgtactccag ggagcggtac atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc 540
ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca 600
acccccagtc tcaaatgcat tagagaccct gccctggttc accaaagcgg cggctccggg 660
ggaggtggat ccggaggtgg ctccggtgga ggcggaagcc tgcaggatat ccagatgacc 720
cagtccccga gctccctgtc cgctagcgtg ggcgataggg tcaccatcac ctgtcgtgcc 780
agtcaggaca tccgtaatta tctcaactgg tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaaa 840
ctactgattt actatacctc ccgcctggag tctggagtcc cttctcgctt ctctggttct 900
ggttctggga cggattacac tctgaccatc agcagtctgc aaccggagga cttcgcaact 960
tattactgtc agcaaggtaa tactctgccg tggacgttcg gacagggcac caaggtggag 1020
atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggaggttcag 1080
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gcttctggct actcctttac cggctacact atgaactggg tgcgtcaggc cccaggtaag 1200
ggcctggaat gggttgcact gattaatcct tataaaggtg tttccaccta taaccagaaa 1260
ttcaaggatc gtttcacgat atccgtagat aaatccaaaa acacagccta cctgcaaatg 1320
aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc tattattgtg ctagaagcgg atactacggc 1380
gatagcgact ggtattttga cgtctggggt caaggaaccc tggtcaccgt c 1431
<210> 40
<211>1425
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 40
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattct 60
cagctgttgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgcg tctctcctgt 120
gcagcctccg gatataggat tagctctgac gatatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
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tccgtgaagg gccggttcac catctcccgt gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300
atgaacagcc tgcgtgccga ggacaccgcg gtatattatt gcgcgagagc taatttttat 360
agtgagcagc ccttccagtt ttggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggcggc 420
ggcggatcta tcacgtgccc tccccccatg tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag 480
agctacagct tgtactccag ggagcggtac atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc 540
ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca 600
acccccagtc tcaaatgcat tagagaccct gccctggttc accaaagcgg cggctccggg 660
ggaggtggat ccggaggtgg ctccggtgga ggcggaagcc tgcaggaagt gcagctggtg 720
gaaagcggcg gcggcgtggt gcgtccgggc ggcagcctgc gtctgagctg cgcggcgagc 780
ggctttacct ttgatgatta tggcatgagc tgggtgcgtc aggcgccggg caaaggcctg 840
gaatgggtga gcggcattaa ctggaacggc ggcagcaccg gctatgcgga tagcgtgaaa 900
ggccgtttta ccattagccg tgataacgcg aaaaacagcc tgtatctgca gatgaacagc 960
ctgcgtgcgg aagataccgc ggtgtattat tgcgcgcgtg gccgtagcct gctgtttgat 1020
tattggggcc agggcaccct ggtgaccgtg agccgtggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1080
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agcggcattc cggatcgttt tagcggcagc agcagcggca acaccgcgag cctgaccatt 1320
accggcgcgc aggcggaaga tgaagcggat tattattgca acagccgtga tagcagcggc 1380
aaccatgtgg tgtttggcgg cggcaccaaa ctgaccgtgg gcggc 1425
<210> 41
<211> 1761
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 41
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattct 60
cagctgttgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgcg tctctcctgt 120
gcagcctccg gatataggat tagctctgac gatatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aagggtctag agtgggtatc aaccatttat gagacagacg gtagcacata ctacgcagac 240
tccgtgaagg gccggttcac catctcccgt gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300
atgaacagcc tgcgtgccga ggacaccgcg gtatattatt gcgcgagagc taatttttat 360
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cagctggttt ttctgctctc cgaagcccac acgtgtatcc ctgagaacaa cggaggcgcg 600
gggtgcgtgt gccacctgct catggatgac gtggtcagtg cggataacta tacactggac 660
ctgtgggctg ggcagcagct gctgtggaag ggctccttca agcccagcga gcatgtgaaa 720
cccagggccc caggaaacct gacagttcac accaatgtct ccgacactct gctgctgacc 780
tggagcaacc cgtatccccc tgacaattac ctgtataatc atctcaccta tgcagtcaac 840
atttggagtg aaaacgaccc ggcagatttc agaatctata acgtgaccta cctagaaccc 900
tccctccgca tcgcagccag caccctgaag tctgggattt cctacagggc acgggtgagg 960
gcctgggctc agtgcagcgg cggctccggg ggaggtggat ccggaggtgg ctccggtgga 1020
ggcggaagcc tgcaggatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgctagcgtg 1080
ggcgataggg tcaccatcac ctgtcgtgcc agtcaggaca tccgtaatta tctcaactgg 1140
tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaaa ctactgattt actatacctc ccgcctggag 1200
tctggagtcc cttctcgctt ctctggttct ggttctggga cggattacac tctgaccatc 1260
agcagtctgc aaccggagga cttcgcaact tattactgtc agcaaggtaa tactctgccg 1320
tggacgttcg gacagggcac caaggtggag atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 1380
ggctctggcg gtggcggatc ggaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag 1440
ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct actcctttac cggctacact 1500
atgaactggg tgcgtcaggc cccaggtaag ggcctggaat gggttgcact gattaatcct 1560
tataaaggtg tttccaccta taaccagaaa ttcaaggatc gtttcacgat atccgtagat 1620
aaatccaaaa acacagccta cctgcaaatg aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc 1680
tattattgtg ctagaagcgg atactacggc gatagcgact ggtattttga cgtctggggt 1740
caaggaaccc tggtcaccgt c 1761
<210> 42
<211> 852
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 42
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ggcggaggag gctcccacaa gtgcgatatc 480
accttacagg agatcatcaa aactttgaac agcctcacag agcagaagac tctgtgcacc 540
gagttgaccg taacagacat ctttgctgcc tccaagaaca caactgagaa ggaaaccttc 600
tgcagggctg cgactgtgct ccggcagttc tacagccacc atgagaagga cactcgctgc 660
ctgggtgcga ctgcacagca gttccacagg cacaagcagc tgatccgact cctgaaacgg 720
ctcgacagga acctctgggg cctggcgggc ttgaattcct gtcctgtgaa ggaagccaac 780
cagagtacgt tggaaaactt cttggaaagg ctaaagacga tcatgagaga gaaatattca 840
aagtgttcga gc 852
<210> 43
<211>1155
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 43
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattct 60
cagctgttgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgcg tctctcctgt 120
gcagcctccg gatataggat tagctctgac gatatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aagggtctag agtgggtatc aaccatttat gagacagacg gtagcacata ctacgcagac 240
tccgtgaagg gccggttcac catctcccgt gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300
atgaacagcc tgcgtgccga ggacaccgcg gtatattatt gcgcgagagc taatttttat 360
agtgagcagc ccttccagtt ttggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggcggc 420
ggcggatcta tcacgtgccc tccccccatg tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag 480
agctacagct tgtactccag ggagcggtac atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc 540
ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca 600
acccccagtc tcaaatgcat tagagaccct gccctggttc accaaagcgg cggctccggg 660
ggaggtggat ccggaggtgg ctccggtgga ggcggaagcc tgcagccagg atggttctta 720
gactccccag acaggccctg gaaccccccc accttctccc cagccctgct cgtggtgacc 780
gaaggggaca acgccacctt cacctgcagc ttctccaaca catcggagag cttcgtgcta 840
aactggtacc gcatgagccc cagcaaccag acggacaagc tggccgcctt ccccgaggac 900
cgcagccagc ccggccagga ctgccgcttc cgtgtcacac aactgcccaa cgggcgtgac 960
ttccacatga gcgtggtcag ggcccggcgc aatgacagcg gcacctacct ctgtggggcc 1020
atctccctgg cccccaaggc gcagatcaaa gagagcctgc gggcagagct cagggtgaca 1080
gagagaaggg cagaagtgcc cacagcccac cccagcccct cacccaggcc agccggccag 1140
ttccaaaccc tggtg 1155
<210> 44
<211> 1083
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 44
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcta gcgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgtc gtgccagtca ggacatccgt aattatctca actggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaaactact gatttactat acctcccgcc tggagtctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gttctggttc tgggacggat tacactctga ccatcagcag tctgcaaccg 240
gaggacttcg caacttatta ctgtcagcaa ggtaatactc tgccgtggac gttcggacag 300
ggcaccaagg tggagatcaa aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 360
ggatcggagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 420
cgtttgtcct gtgcagcttc tggctactcc tttaccggct acactatgaa ctgggtgcgt 480
caggccccag gtaagggcct ggaatgggtt gcactgatta atccttataa aggtgtttcc 540
acctataacc agaaattcaa ggatcgtttc acgatatccg tagataaatc caaaaacaca 600
gcctacctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 660
agcggatact acggcgatag cgactggtat tttgacgtct ggggtcaagg aaccctggtc 720
accgtcggcg gaggaggctc caactgggtg aacgtcatct ccgacctcaa gaagatcgag 780
gacctgatcc agagcatgca catcgacgcc accctgtata ccgagagcga cgtgcacccc 840
tcctgtaaag tgaccgccat gaagtgcttc ctgctggagc tgcaggtgat cagcctggag 900
agcggcgacg ccagcatcca tgacaccgtg gagaacctga tcatcctggc caataacagc 960
ctgagctcca acggcaacgt gaccgagagc ggctgcaagg aatgcgagga gctggagaag 1020
aagaacatta aggagttcct gcagagcttc gtccacatcg tgcagatgtt cattaacacc 1080
tcc 1083
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<211> 1521
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 45
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgccagga 60
tggttcttag actccccaga caggccctgg aaccccccca ccttctcccc agccctgctc 120
gtggtgaccg aaggggacaa cgccaccttc acctgcagct tctccaacac atcggagagc 180
ttcgtgctaa actggtaccg catgagcccc agcaaccaga cggacaagct ggccgccttc 240
cccgaggacc gcagccagcc cggccaggac tgccgcttcc gtgtcacaca actgcccaac 300
gggcgtgact tccacatgag cgtggtcagg gcccggcgca atgacagcgg cacctacctc 360
tgtggggcca tctccctggc ccccaaggcg cagatcaaag agagcctgcg ggcagagctc 420
agggtgacag agagaagggc agaagtgccc acagcccacc ccagcccctc acccaggcca 480
gccggccagt tccaaaccct ggtgggcggc ggcggatcta tcacgtgccc tccccccatg 540
tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag agctacagct tgtactccag ggagcggtac 600
atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg 660
aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca acccccagtc tcaaatgcat tagagaccct 720
gccctggttc accaaagcgg cggctccggg ggaggtggat ccggaggtgg ctccggtgga 780
ggcggaagcc tgcaggatat ccagatgacc cagtccccga gctccctgtc cgctagcgtg 840
ggcgataggg tcaccatcac ctgtcgtgcc agtcaggaca tccgtaatta tctcaactgg 900
tatcaacaga aaccaggaaa agctccgaaa ctactgattt actatacctc ccgcctggag 960
tctggagtcc cttctcgctt ctctggttct ggttctggga cggattacac tctgaccatc 1020
agcagtctgc aaccggagga cttcgcaact tattactgtc agcaaggtaa tactctgccg 1080
tggacgttcg gacagggcac caaggtggag atcaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 1140
ggctctggcg gtggcggatc ggaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag 1200
ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct actcctttac cggctacact 1260
atgaactggg tgcgtcaggc cccaggtaag ggcctggaat gggttgcact gattaatcct 1320
tataaaggtg tttccaccta taaccagaaa ttcaaggatc gtttcacgat atccgtagat 1380
aaatccaaaa acacagccta cctgcaaatg aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc 1440
tattattgtg ctagaagcgg atactacggc gatagcgact ggtattttga cgtctggggt 1500
caaggaaccc tggtcaccgt c 1521
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<212> DNA
<213>Artificial sequence
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<223>
<400> 46
aattctcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggata taggattagc tctgacgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtatcaacc atttatgaga cagacggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc gagagctaat 300
ttttatagtg agcagccctt ccagttttgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
ggcggaggag gctccaactg ggtgaacgtc atctccgacc tcaagaagat cgaggacctg 420
atccagagca tgcacatcga cgccaccctg tataccgaga gcgacgtgca cccctcctgt 480
aaagtgaccg ccatgaagtg cttcctgctg gagctgcagg tgatcagcct ggagagcggc 540
gacgccagca tccatgacac cgtggagaac ctgatcatcc tggccaataa cagcctgagc 600
tccaacggca acgtgaccga gagcggctgc aaggaatgcg aggagctgga gaagaagaac 660
attaaggagt tcctgcagag cttcgtccac atcgtgcaga tgttcattaa cacctcc 717
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<212> DNA
<213>Artificial sequence
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<223>
<400> 47
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattct 60
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcta gcgtgggcga tagggtcacc 120
atcacctgtc gtgccagtca ggacatccgt aattatctca actggtatca acagaaacca 180
ggaaaagctc cgaaactact gatttactat acctcccgcc tggagtctgg agtcccttct 240
cgcttctctg gttctggttc tgggacggat tacactctga ccatcagcag tctgcaaccg 300
gaggacttcg caacttatta ctgtcagcaa ggtaatactc tgccgtggac gttcggacag 360
ggcaccaagg tggagatcaa aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcggagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 480
cgtttgtcct gtgcagcttc tggctactcc tttaccggct acactatgaa ctgggtgcgt 540
caggccccag gtaagggcct ggaatgggtt gcactgatta atccttataa aggtgtttcc 600
acctataacc agaaattcaa ggatcgtttc acgatatccg tagataaatc caaaaacaca 660
gcctacctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 720
agcggatact acggcgatag cgactggtat tttgacgtct ggggtcaagg aaccctggtc 780
accgtcggcg gcggcggatc tatcacgtgc cctcccccca tgtccgtgga acacgcagac 840
atctgggtca agagctacag cttgtactcc agggagcggt acatttgtaa ctctggtttc 900
aagcgtaaag ccggcacgtc cagcctgacg gagtgcgtgt tgaacaaggc cacgaatgtc 960
gcccactgga caacccccag tctcaaatgc attagagacc ctgccctggt tcaccaaagc 1020
ggcggctccg ggggaggtgg atccggaggt ggctccggtg gaggcggaag cctgcagcag 1080
ctgttggagt ctgggggagg cttggtacag cctggggggt ccctgcgtct ctcctgtgca 1140
gcctccggat ataggattag ctctgacgat atgagctggg tccgccaggc tccagggaag 1200
ggtctagagt gggtatcaac catttatgag acagacggta gcacatacta cgcagactcc 1260
gtgaagggcc ggttcaccat ctcccgtgac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg 1320
aacagcctgc gtgccgagga caccgcggta tattattgcg cgagagctaa tttttatagt 1380
gagcagccct tccagttttg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 1431
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<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 48
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattct 60
cagctgttgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgcg tctctcctgt 120
gcagcctccg gatataggat tagctctgac gatatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aagggtctag agtgggtatc aaccatttat gagacagacg gtagcacata ctacgcagac 240
tccgtgaagg gccggttcac catctcccgt gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300
atgaacagcc tgcgtgccga ggacaccgcg gtatattatt gcgcgagagc taatttttat 360
agtgagcagc ccttccagtt ttggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggcggc 420
ggcggatcta actgggtgaa cgtcatctcc gacctcaaga agatcgagga cctgatccag 480
agcatgcaca tcgacgccac cctgtatacc gagagcgacg tgcacccctc ctgtaaagtg 540
accgccatga agtgcttcct gctggagctg caggtgatca gcctggagag cggcgacgcc 600
agcatccatg acaccgtgga gaacctgatc atcctggcca ataacagcct gagctccaac 660
ggcaacgtga ccgagagcgg ctgcaaggaa tgcgaggagc tggagaagaa gaacattaag 720
gagttcctgc agagcttcgt ccacatcgtg cagatgttca ttaacacctc cagcggcggc 780
tccgggggag gtggatccgg aggtggctcc ggtggaggcg gaagcctgca ggatatccag 840
atgacccagt ccccgagctc cctgtccgct agcgtgggcg atagggtcac catcacctgt 900
cgtgccagtc aggacatccg taattatctc aactggtatc aacagaaacc aggaaaagct 960
ccgaaactac tgatttacta tacctcccgc ctggagtctg gagtcccttc tcgcttctct 1020
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gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 1260
tgtgcagctt ctggctactc ctttaccggc tacactatga actgggtgcg tcaggcccca 1320
ggtaagggcc tggaatgggt tgcactgatt aatccttata aaggtgtttc cacctataac 1380
cagaaattca aggatcgttt cacgatatcc gtagataaat ccaaaaacac agcctacctg 1440
caaatgaaca gcctgcgtgc tgaggacact gccgtctatt attgtgctag aagcggatac 1500
tacggcgata gcgactggta ttttgacgtc tggggtcaag gaaccctggt caccgtc 1557
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<211> 681
<212> DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 49
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ggcggaggag gctccatcac gtgccctccc 480
cccatgtccg tggaacacgc agacatctgg gtcaagagct acagcttgta ctccagggag 540
cggtacattt gtaactctgg tttcaagcgt aaagccggca cgtccagcct gacggagtgc 600
gtgttgaaca aggccacgaa tgtcgcccac tggacaaccc ccagtctcaa atgcattaga 660
gaccctgccc tggttcacca a 681
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<211>342
<212> DNA
<213>Artificial sequence
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<223>
<400> 50
aactgggtga acgtcatctc cgacctcaag aagatcgagg acctgatcca gagcatgcac 60
atcgacgcca ccctgtatac cgagagcgac gtgcacccct cctgtaaagt gaccgccatg 120
aagtgcttcc tgctggagct gcaggtgatc agcctggaga gcggcgacgc cagcatccat 180
gacaccgtgg agaacctgat catcctggcc aataacagcc tgagctccaa cggcaacgtg 240
accgagagcg gctgcaagga atgcgaggag ctggagaaga agaacattaa ggagttcctg 300
cagagcttcg tccacatcgt gcagatgttc attaacacct cc 342

Claims (11)

1.一种多肽链X，其氨基酸序列为序列8。
2.一种蛋白质，其为由权利要求1所述的肽链X作为主肽链与辅肽链Y组成异源二聚体；
所述蛋白质的主肽链的氨基酸序列为序列8，辅肽链的氨基酸序列为序列20；
或所述蛋白质的主肽链的氨基酸序列为序列8，辅肽链的氨基酸序列为序列5。
3.权利要求1所述多肽链X或权利要求2所述的蛋白质的编码核酸分子，由编码所述主肽链的核酸分子或编码所述主肽链的核酸分子和编码所述辅肽链的核酸分子组成。
4.含有权利要求3所述的核酸分子的重组载体、表达盒、重组病毒或细胞。
5.含有权利要求3所述的核酸分子的重组菌。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求3所述的核酸分子中的编码所述主肽链的核酸分子或编码所述主肽链的核酸分子和编码所述辅肽链的核酸分子菌插入表达载体中，得到表达权利要求1所述多肽链X或权利要求2所述的蛋白质的载体。
7.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于：所述目的细胞为原核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
8.一种试剂盒，其包括权利要求1所述多肽链X或权利要求2所述的蛋白质、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组病毒或细胞。
9.一种试剂盒，其包括权利要求5所述重组菌。
10.权利要求1所述多肽链X或权利要求2所述的蛋白质、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、细胞或重组病毒或权利要求8所述的试剂盒在制备抑制或杀伤表达所述蛋白质中抗原的靶细胞产品中的应用；
或权利要求1所述多肽链X或权利要求2所述的蛋白质、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、细胞或重组病毒或权利要求8所述的试剂盒在制备介导免疫细胞抑制或杀伤表达所述蛋白质中抗原的靶细胞产品中的应用；
所述靶细胞为CD19+靶细胞；
所述免疫细胞为T细胞。
11.权利要求5所述重组菌在制备抑制或杀伤表达所述蛋白质中抗原的靶细胞产品中的应用；
或权利要求5所述重组菌在制备介导免疫细胞抑制或杀伤表达所述蛋白质中抗原的靶细胞产品中的应用；
所述靶细胞为CD19+靶细胞；
所述免疫细胞为T细胞。
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