JP7221213B2

JP7221213B2 - 多官能性タンパク質

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Publication number: JP7221213B2
Application number: JP2019556411A
Authority: JP
Inventors: ▲張▼▲鳳▼禹; 高斌; 王▲れい▼; ▲呉▼▲亞▼松; 魏▲卿▼
Original assignee: シェンチェンベイクバイオテクノロジーカンパニーリミテッド
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2023-02-13
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: EP3578570A1; CN109153725B; EP3578570A4; WO2018121605A1; CN108250302A; US11530264B2; US20220064289A1; JP2020504628A; CN109153725A

Description

本発明は、生物学の分野、特に多官能性タンパク質に関する。

二官能性抗体または二価抗体としても公知の二重特異的抗体は、特異性および二官能性により同時に２つの異なる抗原に特異的に結合することができ、腫瘍免疫療法および自己免疫性疾患等の分野において将来広い適用を有する。

二重特異的抗体は天然に見出されず、人工的な方法によってのみ調製することができる。現時点では、二重特異的抗体を調製する方法には、化学的コンジュゲーション、ハイブリドーマ技術および組換えＤＮＡ技術等が主に含まれる。

Ｍｅｄａｒｅｘは、３０年前という早い時期に二重特異的抗体を開発しており、２００１年にフェーズＩＩＩ臨床治験を実施している。しかし、臨床治験の失敗および製造上の問題のためにこの分野の研究は沈黙している（Garber K、２０１４年）。２００９年に、Ｔｒｉｏｎによって開発された二重特異的抗体カツマキソマブはＥｐＣＡＭ陽性の腫瘍によって引き起こされる悪性腹水の処置のために欧州連合によって承認されたが、その高い免疫原性はその臨床上の適用を大いに制限する（Spasevska I、２０１４年）。近年、抗体操作技術の急速な進歩は、二重特異的抗体の開発のための新しい機会をもたらしている。

１．化学的カップリングによる合成二重特異的抗体

Ｈｅｒ２陽性の腫瘍細胞を死滅させるためのＴ細胞を動員するために、ＬｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて市販のＨｅｒｃｅｐｔｉｎのＯＫＴ３との化学的カップリングによってＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異的抗体が得られた（Msenら、２００１年）。臨床的に広く使用されている抗体に基づくこの抗体コンジュゲートは、臨床上の安全性および有効性の非常に優れた記録を示した。臨床治験に参加した転移性乳がんの患者２２人のうちの５人は、使用後１４．５週まで安定病態状態のままだった（Lumら、２０１５年）。

ＯＫＴ３抗体は、ＥＧＦＲ陽性腫瘍（Reush Uら、２００６年；MADら、２０１５年）、ＣＤ２０陽性腫瘍系（Lumら、２０１３年）、Ｂ７－Ｈ３陽性腫瘍（MAら、２０１６年）などを含む、対応する標的を有する腫瘍を死滅させるために他の臨床的に使用される抗体と化学的にコンジュゲートするためにも使用されている。

２．ハイブリドーマ技術によって生成される二重特異的抗体

異なる重鎖および軽鎖からなる最大１１個の抗体を分泌することができるハイブリドーマを得るために、Ｌｉｎｄｎｏｒｅｒらは、抗ＣＤ３抗体を分泌するラットハイブリドーマを、抗ＥｐＣＡＭを分泌するマウスハイブリドーマに融合した（Lindnoerら、１９９５年）。異種のラットおよびマウスのハイブリドーマから調製された二重特異的抗体は、ヒト抗マウス（ＨＡＭＡ）交差反応性を必然的に生成する。驚くべきことに、この抗薬物応答は抗体への患者の応答の有効性に正比例し（OTT MGら、２０１２年）、その機構はさらに探究する必要性がある。それは、２００９年に臨床使用のために承認されている（Carberk、２０１４年）。Ｈｅｒ／ＣＤ３抗体（Kieweら、２００６年）は、同じプラットホームで開発された。再発したＢ細胞リンパ腫の処置のための抗ＣＤ２０／ＣＤ３抗体が臨床試験のために承認されており、優れた安全性記録および有効性を示す（Buhmannら、２００９年）。メラノーマの実験的研究では、抗ＣＤ２／ＣＤ３の二重特異的抗体が使用されている（Rufら、２００４年）。

３．組換え技術による二重特異的分子の発現

Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの科学者Ｓｈａｌａｂｙらは、リンカーペプチドを通してヒト化抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１のＦａｂ断片を抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系でのその発現に成功した。この二重特異的抗体は、ＨＥＲ２高発現乳がん細胞系ＳＫ－ＢＲ－３を特異的に認識し、ヒト末梢血Ｔ細胞によるこの腫瘍細胞系の死滅を媒介する（Shalabyら、１９９２年）。合成生体分子およびタンパク質組換え技術の発達により、標的腫瘍にＴ細胞を動員するために遺伝子操作によって調製されたタンパク質分子が注目され、そのような薬物の主流になっている。

ＢｉＴＥ：２０１４年１２月に、ＦＤＡは、急性リンパ芽球性白血病の処置のために、ＣＤ３を標的にする新しい操作された二重特異的抗体分子ＢｉＴＥ（二重特異的Ｔ細胞係合剤）を承認した。この新規の小さいタンパク質分子は、リンカーペプチドを通してＯＫＴ３のｓｃＦｖおよび抗ＣＤ１９ｓｃＦｖによって直接的に連結され（Nagorsen Dら、２０１２年）（特許第２０１１８００６３２２２．２号；２０１５８０００９１２４．９号）、非ホジキンリンパ腫の増殖を阻害するために非常に低い濃度しか必要としない（Bargou Rら、２００８年）。この分子にはＴ細胞を効率的に動員して標的細胞を死滅させる能力があるので、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡおよびＤＳＭＡ等を認識するいくつかのＢｉＴＥ分子を含む、ＢｉＴＥプラットホームに基づく異なる腫瘍を標的にするより多くの製品が臨床試験に入っている（Thakur Aら、２０１６年）。

ＴａｎｄＡｂはリンカーペプチドでＢｉＴＥ様二重特異的分子の対を接続して、ＢｉＴＥの分子量の２倍の１６０ｋＤの分子量を有するＴａｎｄＡｂと呼ばれる四量体分子を形成し、それをより高い親和性でＣＤ３およびＣＤ１９に結合させる（Reusch Uら、２０１５年）。同時に、ＴａｎｄＡｂの薬物動態もＢｉＴＥと比較して有意に向上し、血中半減期は約２０時間に到達する。それは、非ホジキンリンパ腫および急性リンパ芽球性白血病の死滅を媒介することができる。

ＤＡＲＴは、ジスルフィド含有リンカーペプチドを通した抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３ｓｃＦｖの組合せである。それは、腫瘍を死滅させるためにＴ細胞を動員することができ、安定して容易なスケール調製の利点を有する（Johnson Sら、２０１０年；kuo SRら、２０１２年）。

ＦｃａｂＦｖは、ＯＫＴ３の抗原認識断片を、変異したＦｃと融合し（Wozniak Gら、２０１０年）、それはＣＨ３変異によって生成されるＨｅｒ２を認識する機能を有し、従来の抗体に非常に類似した新規の二重特異的抗体を発現する。それは、Ｈｅｒ２陽性の腫瘍を有効に標的にすることができ、腫瘍増殖をｉｎｖｉｖｏで抑制することができる（Wang Lら、２０１３年）。

ＴｒｉＫＥはＣＤ３３抗体のｓｃＦｖとＣＤ１６抗体のｓｃＦｖとの間にＩＬ－１５を挿入し、２つの連結したペプチドによって連結される。それはＮＫ細胞の活性化および生存をｉｎｖｉｖｏで有効に促進することができ、一方で、腫瘍を効果的に標的にすることができる。骨髄性悪性疾患を処置するか、または固形腫瘍を標的にするために、ＮＫ細胞に有益であるＩＬ－１５を加えること（Szun Szun Tayら、２０１６年；Vallera DA.ら、２０１６年）。

現在では、二重特異的抗体は医薬研究の分野において新しいホットポットになっており、少なくとも３０種類の二重特異的抗体が臨床開発段階にある（Garber Kら、２０１４年；Kontermann R Eら、２０１５年）。

Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方の培養培地に、特定量のＩＬ－２を加えなければならない（Bodnarら、２００８年；Grundら、２００５年）。ＩＬ－１５はＩＬ－２に機能的に類似しており、同じβγ受容体を共有する。研究は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖のために、ＩＬ－２またはＩＬ－１５が要求されることを示す（Boymanら、２００７年）。ＩＬ－１５およびＩＬ－２は同じβγ受容体を共有するが、それらは特異的α受容体を各々有する。ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ（ＩＬ－１５受容体αのｓｕｓｈｉドメイン）がＩＬ－１５のスーパーアゴニストであることが判明した。アゴニストは、ＩＬ－１５の機能を大いに強化することができ（Hanら、２０１１年；Mortierら、２００６年）（特許出願第２０１２８００３７１１４．２号、２０１５１０３５８５４０．１号）、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉの複合体は、Ｔ／ＮＫ細胞においてＮＫ／ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、腫瘍に対するそれらの細胞傷害を増加させるＩＬ－２の役割を完全に置き換えることができる（Peter S. Kim1、２０１６年；Rosarioら、２０１６年）。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）米国がん研究所は、ＩＬ－１５をがん処置のための１２種の免疫療法薬の中で第１位の薬剤にランクした。ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存度を支持することによって、ＩＬ－１５はＴ細胞において長期免疫応答の維持の大きな潜在能力を実証している。ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－１５は腫瘍処置におけるより有望でより有効で毒性のより低い製品であり、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方の抗腫瘍活性を刺激することができる。二重特異的分子におけるＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ複合体または他の機能的サイトカインおよび受容体複合体の融合は、細胞免疫療法の有効性を向上させる主要な動向である。
ＰＤ－１（プログラム細胞死１）およびその受容体ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２は、Ｔ細胞活性の重要な調節因子である（OkazakiおよびHonjo、２００７年）。他の細胞の表面のＰＤ－Ｌ１／２へのＴ細胞の表面のＰＤ－１の結合はＴ細胞の阻害を引き起こし、それは、ヒトにおいて自己免疫性疾患を回避し、免疫寛容をもたらす過程で重要な役割を演ずる。対照的に、免疫応答、Ｔ細胞の表面でＰＤ１に結合するために腫瘍細胞それ自体において、または腫瘍微小環境においてＰＤ－Ｌ１／Ｌ２を発現させることによる腫瘍逃避を抑制する目的、負のシグナルを伝達し、Ｔ細胞機能の減退およびＴ細胞の消耗に導く目的を達成するために、腫瘍細胞はＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの自己調節機構を利用する（Freemanら、２０００年；Keirら、２００８年；Parryら、２００５年）。したがって、研究者らは、それぞれの抗原に結合するためのＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体の使用を探求し、腫瘍を標的にする間Ｔ細胞のＰＤ１チェックポイント経路を遮断した。結果は、この方法がＴ細胞活性を有意に増加させ、病原微生物がんへの体の抵抗性を強化することができることを示した（Topalianら、２０１２年；Yanan Guoら、２０１６年）。いくつかの臨床試験が、メラノーマ（Choら、２０１６年；Hamidら、２０１３年）、多発性骨髄腫（Badrosら、２０１５年）、白血病（Porkkaら、２０１４年）（特許出願第２００３８０１０９９２９．８号、２０１３１０２５８２８９．２号、２０１１８００１９６２９．５号）に対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体による優れた治療効果を実証している。

中国特許出願公開２００３８０１０９９２９号明細書中国特許出願公開２０１３１０２５８２８９号明細書中国特許出願公開２０１１８００１９６２９号明細書

本発明の目的の１つは、ポリペプチド鎖Ｘを提供することである。

本発明により提供されるポリペプチド鎖Ｘは、抗原１結合ドメインＲ１、補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２および抗原２結合ドメインＲ３を含む。

補助ペプチド連結ドメインＲ２は、サイトカインまたはサイトカイン受容体中のサイトカイン結合ドメインである。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原２結合ドメインＲ３は、Ｔ細胞のＣＤ３を認識する抗体または分子である。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原２結合ドメインＲ３は、ＮＫ細胞の上のＣＤ１６を認識する受容体または抗体または他の分子である。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原１結合ドメインＲ１が結合する抗原は、以下のがんに関連した抗原のいずれかから選択される：脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫および子宮がん。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

がん関連の抗原は、好ましくは以下の抗原のいずれか１つからのものである：ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（Ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＷＴ１、ＣＤ６８、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、ＥｐＣＡＭ、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＰＳ、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６、ヒトパピローマ毒性（ＨＰＶ）Ｅ７抗原または上記の抗原のいずれかに由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体。

上記のがん関連抗原のいずれか１つのものである短いペプチドとのＭＨＣの複合体中の抗原。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

がん関連の抗原は、好ましくは以下の抗原のいずれか１つから選択される：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＷＴ－１およびＮＹ－ＥＳＯ－１または上記の抗原のうちの１つの短いペプチドとのＭＨＣの複合体。

ＭＨＣおよび抗原の短いペプチドの複合体中の抗原は、好ましくはがん関連の抗原から選択される以下の抗原のいずれか１つである。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

がん関連の抗原は、好ましくは以下の抗原のいずれか１つから選択される：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＷＴ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡおよびＮＹ－ＥＳＯ－１または上記の抗原に由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原１結合ドメインＲ１は、抗原結合抗体、抗原結合リガンド、抗原結合受容体または抗原結合機能を有するポリペプチドである。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原結合抗体は、インタクトな免疫グロブリン、抗体Ｆｃ、抗体Ｆａｂ、抗体ＶＨ、抗体ＶＬ、またはｓｃＦｖの完全長ペプチド鎖もしくは部分的ペプチド鎖である。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原結合リガンドまたは抗原結合受容体は、完全長ペプチド鎖または部分的ペプチド鎖である。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原１結合ドメインＲ１は、抗原認識機能を有するＴＣＲである。

上記のポリペプチド鎖Ｘでは、

抗原１結合ドメインＲ１は、抗原認識機能を有するＴＣＲ様抗体または他の分子である。

本発明の別の目的は、タンパク質を提供することである。

本発明によって提供されるタンパク質は、主ペプチド鎖として請求項１のペプチド鎖Ｘと、補助ペプチド鎖Ｙとを含むヘテロダイマーである。

補助ペプチド鎖Ｙは、Ｒ４を抗原３結合ドメインとして、およびＲ５を主ペプチド鎖Ｘ連結ドメインとして含む。

または、補助ペプチド鎖Ｙは、主ペプチド鎖連結ドメインＲ５である。

主ペプチド鎖連結ドメインＲ５およびペプチド鎖Ｘの中の補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２は互いに結合する。

上の主ペプチド鎖および補助ペプチド鎖の機能的ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結される。これらのポリペプチドリンカーはグリシンおよび／もしくはセリンに富む配列または複数のコピーのグリシンおよび／もしくはセリンに富む配列であり、ポリペプチドリンカーは１から２０のアミノ酸残基を一般的に含む。

主ペプチド鎖連結ドメインＲ５およびサイトカインまたはサイトカイン受容体のサイトカイン結合ドメインＲ２は、相互結合機能を有するペプチドの対である。

上記の補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ２）および主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ５）は、サイトカインおよび受容体サブユニットであるかまたはその逆である。ヘテロダイマーは、補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ２）の主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ５）への結合によって、主ペプチド鎖（Ｘ）と補助ペプチド鎖（Ｙ）との間で形成される。

上記のタンパク質の間で、

抗原３結合ドメインＲ４が結合する抗原３は、以下のがんに関連した抗原のいずれかから選択される：脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫および子宮がん。

上記のタンパク質の間で、

がん関連の抗原３は、好ましくは以下の抗原のうちの１つである：ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＬ１、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＷＴ１、ＣＤ６８、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、ＥｐＣＡＭ、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＰＳ、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原複合体、または上記の抗原のうちの１つに由来するペプチドに会合したＭＨＣの複合体。

ＭＨＣ複合体中の抗原および由来する短いペプチドは、がん関連抗原３、好ましくは上記抗原のいずれかからのものである。

上記のタンパク質の間で、

がん関連の抗原は、好ましくは以下の抗原のいずれか１つから選択される：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＷＴ－１、ＮＹ＿ＥＳＯ－１、または上記の抗原に由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体。

ＭＨＣ複合体中の抗原および由来する短いペプチドは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＷＴ－１およびＮＹ＿ＥＳＯ－１のいずれか１つである。

上記のタンパク質の間で、

がん関連の抗原は、好ましくは以下の抗原のいずれか１つから選択される：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＷＴ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＮＹ＿ＥＳＯ－１、または上記の抗原に由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体。ＭＨＣおよび抗原の短いペプチドの複合体中の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＷＴ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＮＹ＿ＥＳＯ－１のいずれか１つである。

上記において、

抗原１結合ドメインＲ１および抗原２結合ドメインＲ３の位置は、交換可能である。

上記において、

抗原１結合ドメインＲ１および抗原３結合ドメインＲ４の位置は、交換可能である。

上記において、

抗原２結合ドメインＲ３および抗原３結合ドメインＲ４の位置は、交換可能である。

上記において、

補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２および主ペプチド鎖連結ドメインＲ５は、相互に結合する機能を有するペプチドの対である。好ましくは、γｃサイトカインおよびそれらの受容体サブユニットの対は、互いに結合することができる。最適な選択は、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒα、およびＩＬ４とＩＬ４Ｒαである。ＩＬ１５は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のホメオスタシスおよび増殖の維持において不可欠な役割をし、その一方で、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージおよび肥満細胞にさらなる生理学的機能を提供する。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２より有望的におよびより有効にＣＤ８＋Ｔ細胞の生存を支持することができる。それは腫瘍処置においてより低毒性であり、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の抗腫瘍活性を刺激することができる。

上記において、

補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２および主ペプチド鎖連結ドメインＲ５は、サイトカインおよび受容体サブユニットの対であり、相互に結合する。

上記において、

言及されたサイトカインは、γｃファミリーサイトカインである。

γｃファミリーサイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５またはＩＬ２１である。

上記において、

サイトカインおよび受容体サブユニットは、最適には、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαからなる群、ならびにＩＬ４およびＩＬ４Ｒαの群から選択される。

上記において、

ポリペプチドもしくはタンパク質の主ペプチド鎖の各構成成分または補助ペプチド鎖の構成成分は、１～２０のアミノ酸残基からなるポリペプチドリンカーによって連結される。

上記において、

ポリペプチドリンカーは、グリシンおよび／またはセリンに富む。

上記において、

抗原１結合ドメインＲ１は、抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖまたは抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨまたは抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨまたは抗ＭＨＣ／ＷＴ１であるか、またはＰＤ１の細胞外領域、または抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖ、または抗ＣＤ３－ＳｃＦｖまたは抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖである。

または、補助ペプチド連結ドメインＲ２は、ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉもしくはＩＬ４Ｒα－Ｎ－ＦＮ３もしくはＩＬ１５もしくはＩＬ４である。

または、抗原２結合ドメインＲ３は、抗ＣＤ３－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖ、もしくは抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨもしくは抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨもしくは抗ＷＴ１であるか、もしくはＰＤ１の細胞外領域もしくは抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖである。

または、抗原３結合ドメインＲ４は、ＰＤ１の細胞外ドメインもしくは抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨもしくは抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖ；もしくは抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨもしくは抗ＭＨＣ／ＷＴ１もしくは抗ＣＤ３－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖである。

あるいは、主ペプチド鎖連結ドメインＲ５は、ＩＬ１５またはＩＬ４またはＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉまたはＩＬ４Ｒα－Ｎ－ＦＮ３である。

上記において、

抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖのアミノ酸配列は、配列１である。

ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列は、配列２である。

抗ＣＤ３－ＳｃＦｖのアミノ酸配列は、配列３である。

ＰＤ１の細胞外領域のアミノ酸配列は、配列４である。

ＩＬ１５のアミノ酸配列は、配列５である。

抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列１０である。

抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列１１である。

抗ＭＨＣ／ＷＴ１－ＶＨのアミノ酸配列は、配列１２である。

ＩＬ４Ｒαのアミノ酸配列は、配列１３である。

抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖのアミノ酸配列は、配列１４である。

抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖのアミノ酸配列は、配列１５である。

ＩＬ４のアミノ酸配列は、配列１６である。

上記において、

ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列８である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列１７である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列１９である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列２１である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列２２である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列２３である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列２７である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列２９である。

または、ポリペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列は、配列３０である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列８であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列９である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列１７であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列９である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列１７であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列１８である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列１９であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列９である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列８であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２０である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２１であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列９である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２２であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列９である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２３であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２４である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２５であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２６である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２７であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２８である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２９であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列９である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列３０であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列３１である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２１であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列５である。

または、タンパク質の主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列８であり、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列５である。

本発明の第３の目的は、上記のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子を提供することである。

本発明は、主ペプチド鎖をコードする核酸分子または主ペプチド鎖をコードする核酸分子および補助ペプチド鎖をコードする核酸分子を含む、上記のポリペプチドまたはタンパク質のコード核酸分子を提供する。

所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが公知のベクターから遺伝子を得ることによって、もしくは遺伝子を含有する細胞および組織から遺伝子を直接的に単離することによって、または標準の方法による人工合成によってポリヌクレオチドを合成することによって得ることができる。

上記の核酸分子を含有する組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、組換えウイルスまたは細胞も、本発明の範囲内にある。

上記の組換えベクターでは、組換えベクターは、上記の核酸分子中の、主ペプチド鎖をコードする核酸分子、または主ペプチド鎖をコードする核酸分子および補助ペプチド鎖をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入することによって得られ、上記のタンパク質を発現するベクターが得られる。

上記の組換えベクターは、上記のポリヌクレオチド配列または組合せを含む。一実施形態では、主ペプチド鎖（Ｘ）または補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードする核酸はプロモーターにライゲーションすることができ、構築物は主ペプチド鎖（Ｘ）または補助ペプチド鎖（Ｙ）の発現を達成するために発現ベクターに組み込まれる。一般的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現をモジュレートするために使用することができる、転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。例えば、レンチウイルスベクターは、それらが娘細胞における遺伝子の長期の安定した組込みおよび増殖を可能にするので、遺伝子の長期の安定した遺伝を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、それらが肝細胞などの非分裂細胞に形質導入することができるので、マウスの白血病ウイルスなどの腫瘍形成レトロウイルスに由来するベクターに勝る追加の利点を有する。それらは、低い免疫原性のさらなる利点も有する。本発明により提供される多官能性タンパク質は、主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）をそれぞれコードする２つの遺伝子の共トランスフェクションを限定することなく含む、公知の技術によって同じ細胞において共発現させることができる２つのペプチド鎖を含む。発現ベクター、または主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードする核酸配列、または主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードするための２セットの発現フレームワークを含有する発現ベクターは、発現フレームの中にタンデムでライゲーションされ、主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）の核酸配列の間にリボソーム結合部位を挿入することによって共発現される。または、２つのポリペプチドの共発現のために２Ａペプチドが使用される。

上記の細胞では、目的の細胞は、原核細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞であり、ここで、哺乳動物細胞は好ましくはヒト細胞である。

本発明は、上記のポリペプチド鎖Ｘまたは上記のタンパク質、上記の核酸分子、または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、組換えウイルスもしくは細胞を含むキットも提供する。

免疫療法における上記のポリペプチドまたはタンパク質、上記の核酸分子または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスまたはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、免疫療法製品の調製のための上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の範囲内にある。

免疫細胞培養および／または免疫細胞拡大増殖の促進および／またはイムノアッセイにおける、上記のポリペプチドまたはタンパク質、上記の核酸分子または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスまたはキットの使用。本発明の保護の範囲。

または、免疫細胞培養の調製および／または免疫細胞拡大増殖の促進および／または免疫検出製品における、上記のポリペプチドまたはタンパク質、上記の核酸分子または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスまたはキットの使用も、本発明の範囲内にある。

または、ＴまたはＮＫ細胞増殖の刺激のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、ＴもしくはＮＫ細胞増殖を刺激するための製品の調製のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、免疫細胞の阻害を媒介するためのもしくはタンパク質において抗原を発現する標的細胞を死滅させるための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、免疫細胞の阻害もしくはタンパク質を発現する抗原の死滅を媒介する標的細胞製品を調製するための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の範囲内にある。

または、腫瘍細胞の阻害もしくは死滅のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の範囲内にある。

または、腫瘍細胞の阻害もしくは死滅のための製品の調製のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、腫瘍の処置もしくは検出のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、治療的もしくは腫瘍検出製品の調製のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明の保護の範囲内にある。

または、言及されたタンパク質に由来する抗原を発現する標的細胞の阻害もしくは死滅のための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明による保護の範囲内にある。

または、言及されたタンパク質に由来する抗原を発現する標的細胞の阻害もしくは死滅のための標的細胞製品を調製するための、上記のポリペプチドもしくはタンパク質、上記の核酸分子もしくは上記の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスもしくはキットの使用も、本発明による保護の範囲内にある。

上において、免疫療法は、免疫細胞によって腫瘍細胞を阻害するかまたは死滅させることである。

または、免疫細胞は、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞などである。

または、抗原は、がん関連抗原である。

または、抗原は、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がん等に関連した抗原もしくはその任意の組合せである。

あるいは、腫瘍は、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫である。卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がんのいずれか１つもしくは任意の組合せ、またはその任意の組合せ。

または、標的細胞は、原核細胞、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である。

または、哺乳動物細胞は、具体的にはヒト細胞である。

または、ヒト細胞は、具体的には免疫細胞である。

あるいは、免疫細胞は、具体的にはＴ細胞またはＮＫ細胞である。

上記のポリペプチドまたはタンパク質では、主ペプチド鎖の抗原結合ドメイン（Ｒ１／Ｒ３）および補助ペプチド鎖抗原結合ドメイン（Ｒ４）は、抗原に結合する能力を有する。その抗原結合ドメインのうちの１つは、ヒトＴ細胞のＣＤ３もしくは受容体を認識する抗体または分子であるか、あるいはＮＫ細胞ＣＤ１６を認識する抗体または他の分子であり、他の２つは、以下の抗原からなる群より選択される腫瘍関連抗原を認識する抗体または分子である。抗原結合ドメインが結合する腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を導き出す腫瘍細胞によって生成されるタンパク質である。本発明の抗原結合ドメインの選択は、処置される特定のタイプのがんに依存することになる。腫瘍抗原は、当技術分野で周知である。

一実施形態では、本発明で言及する腫瘍関連抗原は、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がんおよびリンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がんおよびその任意の組合せからなる群より選択される腫瘍関連抗原であってもよい。

特に：

一実施形態では、本発明で言及する腫瘍抗原には、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、前立腺酵素、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体およびメソテリンが含まれる。

一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性疾患に関連した１つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として使用することができる多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、限定されないが、組織特異的抗原、例えばメラノーマにおけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が含まれる。他の標的分子は、オンコジーンＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原の他の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの胎児がん抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的な個々の遺伝子型免疫グロブリンが、個体の腫瘍に固有である真の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原のみを構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原のための他の候補である。これらの抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、個々の遺伝子型）のいくつかは、モノクローナル抗体を使用した受動免疫療法の標的として使用され、限定的な成功が得られている。

一実施形態では、本発明で言及する腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。ＴＳＡは腫瘍細胞に固有であり、体の他の細胞には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に固有でなく、反対に、それは、抗原への免疫寛容状態を誘導することができない条件下の正常な細胞でも発現される。腫瘍の上での抗原発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件の下で起こることができる。免疫系が未熟で応答不能であるとき、ＴＡＡは胚発生の間に正常細胞の上で発現される抗原であってよく、または、それらは、通常は正常な細胞の上に非常に低いレベルで存在するが、腫瘍細胞の上でより高いレベルで発現される抗原であってもよい。

それらに限定されないが、ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の例には、以下のものが含まれる：ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原；およびＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５などの腫瘍特異性系統抗原；ＣＥＡなどの過剰発現された胚性抗原；過剰発現されたオンコジーンおよび変異した腫瘍阻害性遺伝子（ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなど）；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなどの染色体転座によって生成される固有の腫瘍抗原；ならびに、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス抗原。タンパク質ベースの抗原の他の大きな群には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。

一実施形態では、本発明で言及する腫瘍抗原は、ＭＨＣと上記の抗原性ペプチドとの複合体であってよい。これらには、限定されないが、ＨＬＡ－ＧＰ１００複合体、ＨＬＡ－Ｍａｒｔ１複合体、ＨＬＡ－ＷＴ１複合体が含まれる。

一実施形態では、主ペプチド鎖の抗原結合ドメイン（Ｒ１、Ｒ３）または補助ペプチド鎖の抗原結合ドメイン（Ｒ４）は、抗体、リガンド、受容体、および抗原に結合することができるポリペプチドまたはその任意の組合せである。

抗体は、Ｉｇ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖもしくはその任意の組合せのインタクトなペプチド鎖または部分的ペプチドであってもよい。リガンドまたは受容体は、そのペプチド鎖全体、部分的なペプチドセグメントまたはその任意の組合せであってもよい。

ここで、補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ２）および主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ５）は、相互結合機能を有するポリペプチドの対である。

相互結合機能を有するポリペプチドは、互いに結合することができる受容体およびリガンドの対、または互いに結合することができる抗体および抗原の対であってもよい。好ましくは、γｃサイトカインおよびそれらの受容体サブユニットの対は互いに結合することができ、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒα、ＩＬ４とＩＬ４Ｒが好ましくは選択される。

主ペプチド鎖および補助ペプチド鎖の個々の機能的ドメインは、グリシンおよび／もしくはセリンに富む配列または複数のコピーのグリシンおよび／もしくはセリンに富む配列であるポリペプチドリンカーによって連結され、ポリペプチドリンカーは、５～２０のアミノ酸残基を一般的に含む。

図１は、多官能性タンパク質の分子構造を示す模式図である。Ａ：多官能性タンパク質分子は主ペプチド鎖Ｘおよび補助ペプチド鎖Ｙで構成され、ここで、主ペプチド鎖Ｘは抗原結合ドメインＲ１、補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２、抗原結合ドメインＲ３を含み、補助ペプチド鎖Ｙは抗原結合ドメインＲ４、主ペプチド鎖連結ドメインＲ５を含む；Ｂ：多官能性タンパク質分子は主ペプチド鎖Ｘおよび補助ペプチド鎖Ｙで構成され、ここで、主ペプチド鎖Ｘは抗原結合ドメインＲ１、補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２および抗原結合ドメインＲ３を含む。ペプチド鎖Ｙは、主ペプチド鎖連結ドメインＲ５を含む。Ｃ：多官能性タンパク質分子は主ペプチド鎖Ｘだけからなり、ここで、主ペプチド鎖Ｘは抗原結合ドメインＲ１、補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２および抗原結合ドメインＲ３を含む。

図２は、多官能性タンパク質分子の遺伝子発現フレームワークを示す。同上同上

図３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの上の、発現され、精製された多官能性タンパク質分子を示す。レーン１：ＴｉＴＥ－１、主ペプチド鎖約６５ＫＤ、補助ペプチド鎖約３０ＫＤ；レーン２：ＴｉＴＥ－６、主ペプチド鎖約６５ＫＤ、補助ペプチド鎖約３０ＫＤ；レーン３：タンパク質マーカー、上から下にかけて分子量はそれぞれ１６０ＫＤ、１２０ＫＤ、１００ＫＤ、７０ＫＤ、５０ＫＤ、４０ＫＤ、３０ＫＤ、２５ＫＤ。

図４は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－１、１５、１６および５の死滅結果を示す：Ａ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－６タンパク質の陰性対照；Ｂ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－１タンパク質；Ｃ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－１５タンパク質；Ｄ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－１６タンパク質；Ｅ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－５タンパク質；Ｆ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－５タンパク質。本発明により提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１、１５、１６および５は、非常に低い濃度でｉｎｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞を死滅させることができることが実証され、濃度が０．５～５ｎｇ／１０Ｅ^６細胞で使用されるときに最良の結果を示す。同上

図５は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－６、８、９、１０、１１、１２、１３および１４の死滅結果をそれぞれ示す：Ａ、ＢＶ１７３－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－２タンパク質の陰性対照；Ｂ、ＢＶ１７３－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－６タンパク質、Ｃ、ＢＶ１７３－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－８、９、１０、１１、１２、１３、１４タンパク質。本発明により提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－６、８、９、１０、１１、１２、１３および１４は、ＷＴ１陽性の腫瘍細胞の死滅能力を示すことが実証された。同上

図６は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－２、３、４の死滅結果を示す：Ａ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ｌｕｃの死滅に関する陰性対照ＴｉＴＥ－６タンパク質；Ｂ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－２タンパク質；Ｃ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－３タンパク質；Ｄ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ｌｕｃの死滅に関するＴｉＴＥ－４タンパク質。本発明により提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－２、３および４は、細胞内抗原を発現する腫瘍細胞をｉｎｖｉｔｒｏにおいて死滅させることができることが実証される。

図７は、多官能性タンパク質分子によるＮＫ細胞の刺激の結果を示す。ＮＫ細胞の拡大増殖がインターロイキンなしで刺激されたとき、ほとんど全ての細胞は５日後に死滅した。本発明によって提供される多官能性タンパク質の刺激によってＮＫ細胞の拡大増殖が得られ、ＮＫ細胞は１８日で約１４０倍に増幅した。

図８は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－１、６、８、９、１０、１１、１２によるＦＡＣＳ分析を示す：Ａ、Ｔ細胞だけによる陰性対照；Ｂ、ＴｉＴＥ－１によるＴ細胞の実験群；Ｃ、ＢＶ１７３だけによる陰性対照；Ｄ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－１の実験群；Ｅ、ＢＶ１７３による陰性対照；Ｆ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－６の実験群；Ｇ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－８の実験群；Ｈ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－９の実験群；Ｉ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－１０の実験群；Ｊ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－１１の実験群；Ｋ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－１２の実験群；Ｌ、Ｔ細胞陰性対照；Ｍ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－６の実験群；Ｎ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－８の実験群；Ｏ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－９の実験群；Ｐ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－１０の実験群；Ｑ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－１１の実験群；Ｒ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－１２の実験群。多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－１はＣＤ３抗原およびＣＤ１９抗原にそれぞれよく結合することを実験は実証した。ＴｉＴＥ－６、８、９、１０、１１、１２の抗ＭＨＣ／ＷＴ１および抗ＣＤ３は、細胞内抗原ＷＴ１およびＣＤ３抗原の両方にそれぞれ結合する能力を有する。

図９は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－２、３および４のＦＡＣＳ結果を示す：Ａ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ陰性対照；Ｂ、ｍａｌｍｅ－３Ｍに関するＴｉＴＥ－２の実験群；Ｃ、ｍａｌｍｅ－３Ｍに関するＴｉＴＥ－3の実験群；Ｄ、ｍａｌｍｅ－３Ｍに関するＴｉＴＥ－４の実験群；Ｅ、Ｔ細胞陰性対照；Ｆ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－２の実験群；Ｇ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－３の実験群；Ｈ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－４の実験群。図から、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－２、３がＭＨＣ／ＧＰ１００抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合すること、ならびにＴｉＴＥ－４がＭＨＣ／Ｍａｒｔ１抗原およびＣＤ３抗原によく結合することがわかる。同上

図１０は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－１５、１６のＦＡＣＳ結果を示す：Ａ、ＢＶ１７３陰性対照；Ｂ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－１５の実験群；Ｃ、ＢＶ１７３に関するＴｉＴＥ－１６の実験群；Ｄ、Ｔ細胞陰性対照；Ｅ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－１５の実験群；Ｆ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－１６の実験群。図から、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－１５、１６がＣＤ１９抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合することがわかる。

図１１は、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－５のＦＡＣＳ結果を示す：Ａ；ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃ陰性対照；Ｂ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－Ｌｕｃに関するＴｉＴＥ－５の実験群；Ｃ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－Ｌｕｃによる陰性対照；Ｄ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－Ｌｕｃに関するＴｉＴＥ－５の実験群；Ｅ、Ｔ細胞陰性対照；Ｆ、Ｔ細胞に関するＴｉＴＥ－５の実験群。図から、多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－５がＣＤ１９抗原、ＣＤ２０抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合することがわかる。

以下の実施例で使用する実験方法は、特に明記しない限り従来の方法である。

以下の実施例で使用する材料、試薬などは、特に明記しない限り市販されている。

（実施例１多官能性タンパク質分子を発現するベクターの構築）

１．ＣＤ１９陽性腫瘍細胞を標的にする新規多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１の構築

タンパク質を得るために主ペプチド鎖Ｘ１によって補助ペプチド鎖Ｙ１に融合させた、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞を標的にする新規多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１（図１）；

主ペプチド鎖Ｘ１は、抗原１結合ドメインＲ１、サイトカインまたはサイトカイン受容体Ｒ２のサイトカイン結合ドメインおよび抗原２結合ドメインＲ３を含んでいた。

補助ペプチド鎖Ｙ１は、抗原３結合ドメインＲ４および主ペプチド鎖Ｘ連結ドメインＲ５を含んでいた。

主ペプチド鎖（Ｘ１）の抗原結合ドメイン（Ｒ１）は、抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖ（配列１）から選択され、補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｒ２）はＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉ（配列２）から選択され、抗原結合ドメイン（Ｒ３）は抗ＣＤ３－ＳｃＦｖ（配列３）から選択される。

補助ペプチド鎖（Ｙ１）の抗原結合ドメイン（Ｒ４）としてＰＤＬ１およびＰＤＬ２の受容体ＰＤ１の細胞外ドメイン（配列４）を選択し、主ペプチド鎖ドメイン（Ｒ５）としてＩＬ１５（配列５）を選択した。

２．シグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ）、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を主ペプチド鎖の５’末端に加え、主ペプチド鎖の補助ペプチド鎖ドメイン（Ｒ２：Ｌ１５Ｒαｓｕｓｈｉ）と抗原結合ドメイン（Ｒ３：抗ＣＤ３－ＳｃＦｖ）との間のリンカーペプチドはＢａｍＨＩ制限部位を含有した；Ｐ２Ａペプチドを主ペプチド鎖の３’末端と補助ペプチド鎖の５’末端との間に加えた（アミノ酸配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）；制限部位のＸｂａＩを、補助ペプチド鎖の３’末端に加えた。

３、抗ＣＤ１９－ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉ断片、抗ＣＤ３断片およびＰ２Ａ－ＰＤ１－ＩＬ１５断片をＰＣＲ増幅し、核酸ゲル電気泳動に流した；重複ＰＣＲは、核酸ゲル電気泳動で抗ＣＤ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ１－ＩＬ１５断片を増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを使用して、抗ＣＤ１９－ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉ断片を切断した。抗ＣＤ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ１－ＩＬ１５は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを使用して切断した；ベクターＰＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用して切断した。

４．標的断片をゲル電気泳動によって回収し、回収された３つの断片をライゲーションし、形質転換させ、クローンを選択して配列決定し、最後に、標的プラスミドＰＣＤＮＡ３．１－ＴｉＴＥ－１が得られた。

組換えベクターＰＣＤＮＡ３．１－ＴｉＴＥ－１は、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞を標的にする多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１の発現のための発現カセットであり（発現カセットのヌクレオチド配列は、主ペプチド鎖Ｘ１をコードするヌクレオチド配列（配列６）および補助ペプチド鎖Ｙ１をコードするヌクレオチド配列（配列７）で構成され、配列６の最後のヌクレオチドは配列７の最初のヌクレオチドに直接隣接する）、ＰＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩとの間の断片を置き換え、主ペプチド鎖Ｘ１（配列８）および補助ペプチド鎖Ｙ１（配列９）からなる機能的多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１を発現させるために、生じた組換えベクターを得た。

５．上記のステップにより、多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－２、ＴｉＴＥ－３、ＴｉＴＥ－４、ＴｉＴＥ－５、ＴｉＴＥ－６、ＴｉＴＥ－７、ＴｉＴＥ－８、ＴｉＴＥ－９、ＴｉＴＥ－１０、ＴｉＴＥ－１１、ＴｉＴＥ－１２のために発現ベクターを構築した。ＴｉＴＥ－１３、ＴｉＴＥ－１４、ＴｉＴＥ－１５およびＴｉＴＥ－１６の発現ベクターを同様の方式で構築し、その構造を下の表１に示し、発現フレームワークを図２に示す。

ここで、抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列１０である。

ＩＬ４Ｒα－Ｎ－ＦＮ３のアミノ酸配列は、配列１３である。

ＩＬ４のアミノ酸配列は、配列１６である。

ＴｉＴＥ－２の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列１７であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列９である。

ＴｉＴＥ－３の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列１７であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列１８である。

ＴｉＴＥ－４の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列１９であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列９である。

ＴｉＴＥ－５の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列８であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２０である。

ＴｉＴＥ－６の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２１であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列９である。

ＴｉＴＥ－７の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２２であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列９である。

ＴｉＴＥ－８の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２３であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２４である。

ＴｉＴＥ－９の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２５であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２６である。

ＴｉＴＥ－１０の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２７であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２８である。

ＴｉＴＥ－１１の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２９であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列９である。

ＴｉＴＥ－１２の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列３０であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列３１である。

ＴｉＴＥ－１３は主ペプチド鎖であり、主ペプチド鎖のアミノ酸配列は配列２１である。

ＴｉＴＥ－１４の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列２１であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列５である。

ＴｉＴＥ－１５は主ペプチド鎖であり、そのアミノ酸配列は配列８である。

ＴｉＴＥ－１６の主ペプチド鎖アミノ酸配列は配列８であり、補助ペプチド鎖アミノ酸配列は配列５である。

ＴｉＴＥ－２を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列３５であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列７である。

ＴｉＴＥ－３を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列３５であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列３６である。

ＴｉＴＥ－４を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列３７であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列７である。

ＴｉＴＥ－５を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列６であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列３８である。

ＴｉＴＥ－６を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列３９であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列７である。

ＴｉＴＥ－７を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列４０であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列７である。

ＴｉＴＥ－８を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列４１であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列４２である。

ＴｉＴＥ－９を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列４３であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列４４である。

ＴｉＴＥ－１０を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列４５であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列４６である。

ＴｉＴＥ－１１を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列４７であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列７である。

ＴｉＴＥ－１２を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列４８であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列４９である。

ＴｉＴＥ－１３を発現するコード核酸配列は、配列３９である。

ＴｉＴＥ－１４を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列３９であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列５０である。

ＴｉＴＥ－１５をコードする核酸配列は、配列６である。

ＴｉＴＥ－１６を発現するコード核酸配列は、主ペプチド鎖コード核酸配列および補助ペプチド鎖コード核酸配列で構成され、主ペプチド鎖コード核酸配列の３’末端の最後の塩基は、補助ペプチド鎖コード核酸配列の５’末端の最初の塩基の隣にあり；ここで、主ペプチド鎖コード核酸配列は配列６であり、補助ペプチド鎖コード核酸配列は配列５０である。

ＰＣＤＮＡ３．１－ＴｉＴＥ－２からＰＣＤＮＡ３．１－ＴｉＴＥ－１６までの組換えベクターを作製するために、ＰＣＤＮＡ３．１ベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ＴｉＴＥ－２からＴｉＴＥ－１６までを発現する核酸配列からの対応する核酸配列をそれぞれＰＣＤＮＡ３．１に挿入する。

（実施例２多標的官能性タンパク質の発現および精製）

１．細胞密度が１×１０Ｅ^６細胞／ｍｌに到達するまで、２９３Ｆ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで培養した。

２．実施例１で構築されたベクターＰＣＤＮＡ３．１－ＴｉＴＥ－１を、ＰＥＩを使用して上記１の細胞にトランスフェクトし、使用したプラスミドの濃度は１ｍｇ／Ｌであって、ＰＥＩ濃度は３ｍｇ／Ｌであった。細胞を、３７℃、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで５～６日間、インキュベートした。

３．上記２の培養培地を４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を採集し、タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ／ｃａｐｔｏＬビーズに結合させ、５００μＬの０．１ＭＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ２．６～３．０で溶出し、最後に溶出液を採集した。

４．タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出した（図３）。多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－１の主ペプチド鎖Ｘおよび補助ペプチド鎖Ｙを表す、約６５ＫＤおよび３０ＫＤの標的タンパク質が得られたことがわかる。

５．ＴｉＴＥ－２、ＴｉＴＥ－３、ＴｉＴＥ－４、ＴｉＴＥ－５、ＴｉＴＥ－７、ＴｉＴＥ－８、ＴｉＴＥ－９、ＴｉＴＥ－１０、ＴｉＴＥ－１１、ＴｉＴＥ－１２等の多官能性タンパク質を発現させ、精製するために、同じ方法を使用した。

（実施例３ｉｎｖｉｔｒｏでＣＤ１９＋標的細胞の、多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１、１５、１６により媒介されるＴ細胞による死滅）

１．５０μＬ中の１×１０Ｅ^４個の標的細胞、ＣＤ１９抗原およびＬｕｃタンパク質を発現させるためにＣＤ１９抗原遺伝子（核酸配列は配列３２である）およびＬｕｃ遺伝子（核酸配列は配列３３である）をＡＴＣＣから購入したＭａｌｍｅ－３Ｍにトランスフェクトすることによって得られたｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃを、９６ウェルプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ_２で１８～２０時間培養した。

２．細胞が壁に付着した後、培地を吸引して廃棄し、新鮮な培地５０μＬを加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１～３時間培養した。

３、実施例２で得られた標的タンパク質ＴｉＴＥ－１を、それぞれ５０、５、０．５、０．０５、０．００５ｎｇ／μＬの異なる濃度に段階希釈した。

実験群で：密度勾配遠心法によって正常なヒト末梢血の単核細胞に富む白色膜層から得られ、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（３００ＩＵ／ｍＬ）によって１４日間刺激した１×１０Ｅ^５個のＴ細胞５０μＬを、５０、５、０．５、０．０５および０．００５ｎｇの、実施例２で得られた標的タンパク質であるＴｉＴｅ－１に加え、３７℃で１～２時間さらにインキュベートして、抗体とインキュベートしたＴ細胞を得た。

陰性対照群で：標的細胞に対する死滅作用のない５０、５、０．５、０．０５、０．００５ｎｇの二重特異的対照抗体（ＴｉＴＥ－６）を、１×１０Ｅ^５個のＴ細胞５０μＬにそれぞれ加え、３７℃で１～２時間インキュベートした。

４．抗体とインキュベートしたＴ細胞５０μＬを、標的細胞を含む９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２２～２４時間インキュベートした。

５、１％Ｔｒｉｔｏｎ溶解物１００μＬを各ウェルに加え、細胞を繰り返しブローし、３～５分間静置させ、細胞を完全に溶解した。溶解物５０μＬを黒色の９６ウェルプレートに加え、５０μＬの基質（３００μｇ／ｍＬＬｕｃおよび２ｍｇ／ｍＬＡＴＰを３：１の容量比で混合した）を加え、各ウェルでの蛍光値を速やかに測定した。

６．死滅効率は以下の通りに計算した：死滅効率＝｛（陰性対照蛍光値－実験群蛍光値）／陰性対照蛍光値｝×１００％。

結果を、図４Ｂに示す。本発明による多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１は、図４Ａの対照群と比較して非常に低い濃度でｉｎｖｉｔｒｏにおいてＣＤ１９陽性腫瘍細胞を死滅させることができることがわかる。ｉｎｖｉｔｒｏでの最適な死滅作用は、０．５～５ｎｇ／１０Ｅ^６個の細胞の濃度で得ることができる。

７．同様に、非常に低い濃度の多官能性タンパク質を使用して腫瘍細胞が死滅したことを検証するために、ＴｉＴＥ－１５およびＴｉＴＥ－１６死滅実験を実行した。

結果を、図４Ｃおよび４Ｄに示す。本発明による多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１５および１６は、非常に低い濃度でｉｎｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞を死滅させることができることがわかり、最適濃度は０．５～５ｎｇ／１０Ｅ^６個の細胞であった。

８．同じ方式で、ＴｉＴＥ－５死滅実験を実行した。ＡＴＣＣから購入したＭａｌｍｅ－３ＭのゲノムへのＣＤ２２抗原遺伝子（配列３４）およびＬｕｃ遺伝子（配列３３）のトランスフェクションによるｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－ｌｕｃおよびｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－ｌｕｃを、標的細胞として使用した。結果を、図４Ｅおよび４Ｆに示す。本発明により提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－５は、ＣＤ１９およびＣＤ２２陽性細胞に対する死滅能力を有することがわかる。非常に低い濃度で腫瘍細胞をｉｎｖｉｔｒｏで死滅させることができ、濃度が０．５～５ｎｇ／１０Ｅ^６個の細胞であるときに最適な死滅作用が得られた。

（実施例４多官能性タンパク質分子ＴｉＴＥ－６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４はｉｎｖｉｔｒｏでＷＴ１陽性標的細胞のＴ細胞による死滅を媒介する）

１．５０μＬ中の１×１０Ｅ^４個の標的細胞ＢＶ１７３（Ｌｕｃ遺伝子（配列３３）によってトランスフェクトしたＡＴＣＣ購入ＢＶ１７３）を９６ウェルプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ_２で１～２時間培養した。

２、実施例２で得られた標的タンパク質ＴｉＴＥ－６を、５０、５、０．５、０．０５ｎｇ／μＬの異なる濃度に段階希釈した。

実験群で：密度勾配遠心法によって正常なヒト末梢血の単核細胞に富む白色膜層から得られ、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（３００ＩＵ／ｍＬ）によって１４日間刺激した１×１０Ｅ^５個のＴ細胞５０μＬを、５０、５、０．５、０．０５および０．００５ｎｇの、実施例２で得られた標的タンパク質であるＴｉＴｅ－６に加え、３７℃で１～２時間さらにインキュベートして、抗体とインキュベートしたＴ細胞を得た。

陰性対照群で：標的細胞に対して死滅作用のない、５０、５、０．５、０．０５、０．００５ｎｇの二重特異的対照抗体（ＴｉＴＥ－２）を、１×１０Ｅ^５個のＴ細胞５０μＬにそれぞれ加え、３７℃で１～２時間インキュベートした。

３．抗体とインキュベートしたＴ細胞５０μＬを、標的細胞を含む９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２２～２４時間インキュベートした。

４．１％Ｔｒｉｔｏｎ溶解物１００μＬを各ウェルに加え、細胞を繰り返しブローし、３～５分間静置させ、細胞を完全に溶解した。溶解物５０μＬを黒色の９６ウェルプレートに加え、５０μＬの基質（３００μｇ／ｍＬＬｕｃおよび２ｍｇ／ｍＬＡＴＰを３：１の容量比で混合した）を加え、各ウェルでの蛍光値を速やかに測定した。

５．死滅効率を以下の通りに計算した：死滅効率＝｛（陰性対照蛍光値－実験群蛍光値）／陰性対照蛍光値｝×１００％。

結果を、図５Ｂに示す。本発明により提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－６が、腫瘍細胞を非常に低い濃度で死滅させることができることがわかる。

６．ＴｉＴＥ－８、９、１０、１１、１２、１３および１４の死滅実験を同じ方式で実行し、有効な標的比は１０：１であって、抗体濃度は各場合において対応する抗体の５ｎｇであった。実験結果を、図５Ｃに示す。本発明によって提供される多官能性タンパク質によってＷＴ１陽性の腫瘍細胞を死滅させることができることがわかる。

（実施例５ｉｎｖｉｔｒｏにおいて多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－２、３、４は標的細胞のＴ細胞による死滅を媒介する）

１．１×１０Ｅ^４個の標的細胞ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ｌｕｃ（ＡＴＣＣによって購入したｍａｌｍｅ－３ＭへのＬｕｃ遺伝子のトランスフェクションによって得た）５０μＬを９６ウェルプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ_２で１８～２０時間培養した。

２．細胞が壁に付着した後、培地を吸引して廃棄し、新鮮な培地５０μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ_２で１～３時間インキュベートした。

３、実施例２で得られたＴｉＴＥ－２、３、４を、５０、５、０．５、０．０５、０．００５ｎｇ／μＬの異なる濃度に段階希釈した。

実験群で：密度勾配遠心法によって正常なヒト末梢血の単核細胞に富む白色膜層から得られ、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（３００ＩＵ／ｍＬ）によって１４日間刺激した１×１０Ｅ^５個のＴ細胞５０μＬを、５０、５、０．５、０．０５および０．００５ｎｇの、実施例２で得られた標的タンパク質であるＴｉＴｅ－２、３、４に加えた。細胞とタンパク質を３７℃で１～２時間さらにインキュベートして、抗体とインキュベートしたＴ細胞を得た。

４．抗体とインキュベートしたＴ細胞５０μＬを、標的細胞を平板培養した９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２２～２４時間インキュベートした。

６．死滅効率を以下の通りに計算した：死滅効率＝｛（陰性対照蛍光値－実験群蛍光値）／陰性対照蛍光値｝×１００％。

結果を、図６に示す。本発明によって提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－２、３および４は、非常に低い濃度でｉｎｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞を死滅させることができることがわかり、最良の死滅作用のための最適濃度は０．５～５ｎｇ／１０Ｅ^６個の細胞である。

（実施例６多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１は、ＮＫ細胞の拡大増殖を刺激する）

１．６×１０Ｅ５個のＮＫ９２細胞（中国典型培養物保蔵中心）を、２ｍＬ培地（Ａｌｐｈａ基礎培地、１２．５％ウマ血清、１２．５％ＦＢＳ、０．２ｍＭイノシトール、０．１ｍＭメルカプトエタノール、０．０２ｍＭ葉酸）において、４０ｎｇ／ｍＬの実施例２で得られた多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１と一緒に３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

２．２～３日の培養後、細胞の総数を数え、１８日間連続培養し、細胞密度を各継代について３×１０Ｅ５個の細胞／ｍＬに調整し、４０ｎｇ／ｍＬの多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１を維持した。

細胞増殖曲線を、図７に示す。本発明により提供される多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１が、ＮＫ細胞の拡大増殖を刺激することができ、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉの機能を有することがわかる。

ＴｉＴＥ２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３および１５のＩＬ１５／ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉドメインはＴｉＴＥ－１と同一であり、それらの機能は有意に異ならない。

（実施例７多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１および抗ＭＨＣ／ＷＴ１のＣＤ１９およびＣＤ３抗原結合、ならびに細胞内抗原ＷＴ１およびＣＤ３への結合についてのＴｉＴＥ－６、８、９、１０、１１、１２の抗ＣＤ３のそれぞれのＦＡＣＳ検証。）

１．Ｔ細胞実験群およびＢＶ１７３実験群：多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１、６、８、９、１０、１１、１２のそれぞれ５μｇを、ＢＶ１７３細胞と、密度勾配遠心法によって正常なヒト末梢血の単核細胞に富む白色膜層から得られ、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（３００ＩＵ／ｍＬ）によって１４日間刺激した３×１０Ｅ５個のＴ細胞との混合物に加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。２μＬのＡＰＣで標識したマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＢＤ、カタログＮｏ．５５８６９４）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。

Ｔ細胞陰性対照群およびＢＶ１７３細胞陰性対照群：ＢＶ１７３細胞（ＡＴＣＣ）を、密度勾配遠心法によって正常なヒト末梢血の単核細胞に富む白色膜層から得られ、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（３００ＩＵ／ｍＬ）によって１４日間刺激した３×１０Ｅ５個のＴ細胞と混合し、２μＬのＡＰＣで標識したマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＢＤ、カタログＮｏ．５５８６９４）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、陰性対照とした。

２．フローサイトメトリーの結果を、図８に示す。図から、多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１がＣＤ１９抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合したこと；ＴｉＴＥ－６、８、９、１０、１１および１２の抗ＭＨＣ／ＷＴ１および抗ＣＤ３が、細胞内抗原ＷＴ１およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合したことがわかる。

（実施例８ＭＨＣ／ＧＰ１００およびＣＤ３抗原についてのＴｉＴＥ－２、３の結合機能ならびにＭＨＣ／Ｍａｒｔ１およびＣＤ３抗原についてのＴｉＴＥ－４の結合機能それぞれのＦＡＣＳ検証。）

１．Ｔ細胞およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－Ｌｕｃ（ＡＴＣＣによって購入したＭａｌｍｅ－３Ｍへのｌｕｃ遺伝子のトランスフェクションによる）の実験群：多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－２、３、４のそれぞれ５μｇを３×１０Ｅ５個のＴ細胞およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－Ｌｕｃ細胞にそれぞれ加え、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。ＰＥコンジュゲート抗ｈＩＬ－１５（Ｒ＆Ｄ、ＩＣ２４７１Ｐ）２μＬを加え、氷上で３０分間保持した。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。

Ｔ細胞群およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－Ｌｕｃ細胞陰性対照群：２μＬのＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＢＤ、Ｎｏ．５５８６９４）を３×１０Ｅ５個のＴ細胞およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－Ｌｕｃにそれぞれ加え、細胞と抗体を氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、陰性対照とした。

２．フローサイトメトリー分析の結果を、図９に示す。図から、多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－２および３がＭＨＣ／ＧＰ１００抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合すること、ＴｉＴＥ－４がＭＨＣ／Ｍａｒｔ１抗原およびＣＤ３抗原によく結合することがわかる。

（実施例９ＣＤ１９抗原およびＣＤ３抗原への多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１５、１６の抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３の結合機能それぞれのＦＡＣＳ検証）

１．Ｔ細胞およびＢＶ１７３細胞実験群：５μｇの多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１５、１６を、ＢＶ１７３細胞と、密度勾配遠心法によって正常なヒト末梢血の単核細胞に富む白色膜層から得られ、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（３００ＩＵ／ｍＬ）によって１４日間刺激した３×１０Ｅ５個のＴ細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。ＦＩＴＣ標識組換えタンパク質Ｌ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＲＰＬ－ＰＦ１４１）２μＬを加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。

Ｔ細胞およびＢＶ１７３細胞陰性対照群：３×１０Ｅ５Ｔ細胞（５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２で刺激したＰＢＭＣ）を先ずＢＶ１７３細胞（ＡＴＣＣ）とそれぞれ混合し、２μＬのＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＢＤ、カタログＮｏ．５５８６９４）を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、陰性対照とした。

２．フローサイトメトリー分析の結果を、図１０に示す。図から、多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－１５および１６がＣＤ１９抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合することがわかる。

（実施例１０それぞれの抗原への多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－５の抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３の結合機能のＦＡＣＳ検証）

１．Ｔ細胞およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－Ｌｕｃ／ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－Ｌｕｃ実験群。細胞実験群：５μｇの多官能タンパク質ＴｉＴＥ－５を、３×１０Ｅ５個のＴ細胞およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－Ｌｕｃ細胞（ＡＴＣＣにより購入したＭａｌｍｅ－３ＭへのＣＤ１９抗原遺伝子およびＬｕｃ遺伝子のトランスフェクションによる）およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－Ｌｕｃ（ＡＴＣＣにより購入したＭａｌｍｅ－３ＭへのＣＤ２２抗原遺伝子およびＬｕｃ遺伝子のトランスフェクションによる）に加え、氷上で３０分間インキュベートした。上清を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。２μＬのＰＥコンジュゲート抗ｈＩＬ－１５（Ｒ＆Ｄ、ＩＣ２４７１Ｐ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。上清を遠心分離し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。

Ｔ細胞およびｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－Ｌｕｃ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－Ｌｕｃ細胞陰性対照群。３×１０Ｅ５個のＴ細胞を、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ１９－Ｌｕｃ、ｍａｌｍｅ－３Ｍ－ＣＤ２２－Ｌｕｃとそれぞれ混合した。２μＬのＰＥコンジュゲート抗ｈＩＬ－１５（Ｒ＆Ｄ、品番ＩＣ２４７１Ｐ）を各群に加え、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、陰性対照とした。

２．フローサイトメトリー分析の結果を、図１１に示す。図から、多官能性タンパク質ＴｉＴＥ－５がＣＤ１９抗原、ＣＤ２０抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれよく結合することがわかる。

本発明の実験は、本発明の多官能性タンパク質が、腫瘍関連抗原に結合すること、特異的細胞死滅を媒介すること、および標的化の精度を向上させることができる２つの抗原結合ドメインを通して、異なる腫瘍抗原に結合することができることを実証する。抗原結合ドメインのうちの１つが免疫チェックポイント関連の抗原である場合、それは免疫抑制シグナルを遮断することおよび腫瘍を死滅させる能力を向上させることができる。本発明の多官能性タンパク質は、それがサイトカインおよびサイトカイン受容体複合体を含有するので、サイトカインの役割を演ずることができる。

Claims

主ペプチド鎖としてのポリペプチド鎖Ｘと補助ペプチド鎖Ｙを含むヘテロダイマーであるタンパク質であって、
前記補助ペプチド鎖Ｙは、抗原３結合ドメインＲ４と、主ペプチド鎖Ｘ連結ドメインＲ５とを含むか、または、前記補助ペプチド鎖Ｙは、主ペプチド鎖連結ドメインＲ５であり；
前記ポリペプチド鎖Ｘは、抗原１結合ドメインＲ１、補助ペプチド連結ドメインＲ２、および抗原２結合ドメインＲ３を含み；
前記補助ペプチド連結ドメインＲ２は、サイトカイン、またはサイトカイン受容体のサイトカイン結合ドメインであり；
前記主ペプチド鎖連結ドメインＲ５は、前記ペプチド鎖Ｘの中の補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２と互いに結合し；
前記抗原２結合ドメインＲ３は、Ｔ細胞のＣＤ３を認識する受容体または抗体であるか、または、前記抗原２結合ドメインＲ３は、ＮＫ細胞のＣＤ１６を認識する受容体または抗体である、
タンパク質。
前記抗原１結合ドメインＲ１の位置および前記抗原２結合ドメインＲ３の位置が交換可能であり、または、
前記抗原１結合ドメインＲ１の位置および前記抗原３結合ドメインＲ４の位置が交換可能であり、または、
前記抗原２結合ドメインＲ３の位置および前記抗原３結合ドメインＲ４の位置が交換可能である、
請求項１に記載のタンパク質。
前記補助ペプチド鎖連結ドメインＲ２および前記主ペプチド鎖連結ドメインＲ５が、相互にサイトカインおよびそれらの受容体サブユニットの対である、請求項１または２に記載のタンパク質。
前記サイトカインがγｃファミリーサイトカインであり、前記γｃファミリーサイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５またはＩＬ２１である、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記サイトカインおよびその受容体サブユニットが、ＩＬ１５およびＩＬ１５ＲαまたはＩＬ４およびＩＬ４Ｒαからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記抗原３結合ドメインＲ４が結合する抗原３は、以下のがん：脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および子宮がんに関連した抗原のいずれか１つから選択され；
前記抗原１結合ドメインＲ１が結合する抗原は、以下のがん：脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および子宮がんに関連した抗原のいずれか１つから選択される、
請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記がんに関連した抗原は、以下の抗原：ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＷＴ１、ＣＤ６８、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、ＥｐＣＡＭ、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＰＳ、エプスタインバー疾患抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、または上記抗原に由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体のうちの１つである、
請求項６に記載のタンパク質。
前記がんに関連した抗原が、以下の抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＷＴ－１、ＮＹ＿ＥＳＯ－１、または上記抗原に由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体のうちのいずれか１つから選択される、請求項７に記載のタンパク質。
前記がんに関連した抗原が、以下の抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＷＴ－１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＢＣＭＡ、ＮＹ＿ＥＳＯ－１、または上記抗原に由来する短いペプチドとのＭＨＣの複合体のうちのいずれか１つから選択される、請求項８に記載のタンパク質。
前記抗原１結合ドメインＲ１が、抗原結合抗体、抗原結合リガンド、抗原結合受容体または抗原結合機能を有するペプチドであり、
前記抗原結合抗体が、インタクトな免疫グロブリン、抗体Ｆｃ、抗体Ｆａｂ、抗体ＶＨもしくはＶＨＨ、抗体ＶＬ、またはｓｃＦｖのうちいずれかの完全長ペプチド鎖もしくは部分的ペプチド鎖であり、
前記抗原結合リガンドまたは前記抗原結合受容体が、受容体またはリガンドのうちいずれかの完全長ペプチド鎖もしくは部分的ペプチドである、請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記ポリペプチド鎖Ｘの各構成成分または前記タンパク質の主ペプチド鎖の各構成成分または補助ペプチド鎖の各構成成分が、１～２０のアミノ酸残基からなるポリペプチドリンカーによって連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記ポリペプチドリンカーがグリシンおよび／またはセリンに富む、請求項１１に記載のタンパク質。
前記抗原１結合ドメインＲ１が、抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖもしくは抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨもしくは抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨもしくは抗ＭＨＣ／ＷＴ１、もしくはＰＤ１の細胞外領域、もしくは抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖ、もしくは抗ＣＤ３－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖであり；または、
前記補助ペプチド連結ドメインＲ２が、ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉもしくはＩＬ４Ｒα－Ｎ－ＦＮ３もしくはＩＬ１５もしくはＩＬ４であり；または、
前記抗原２結合ドメインＲ３が抗ＣＤ３－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖもしくは抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨもしくは抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨもしくは抗ＷＴ１もしくはＰＤ１の細胞外領域もしくは抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖであり；または、
前記抗原３結合ドメインＲ４が、ＰＤ１の細胞外ドメインもしくは抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨもしくは抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖもしくは抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨもしくは抗ＭＨＣ／ＷＴ１もしくは抗ＣＤ３－ＳｃＦｖもしくは抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖであり；または、
前記主ペプチド鎖連結ドメインＲ５が、ＩＬ１５もしくはＩＬ４もしくはＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉもしくはＩＬ４Ｒα－Ｎ－ＦＮ３であり、
抗ＣＤ１９－ＳｃＦｖのアミノ酸配列が配列１であり、前記ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列が配列２であり、前記抗ＣＤ３－ＳｃＦｖのアミノ酸配列が配列３であり、ＰＤ１の細胞外領域のアミノ酸配列が配列４であり、ＩＬ１５のアミノ酸配列が配列５であり、抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨのアミノ酸配列が配列１０であり、抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１－ＶＨＨのアミノ酸配列が配列１１であり、抗ＭＨＣ／ＷＴ１－ＶＨのアミノ酸配列が配列１２であり、ＩＬ４Ｒα－Ｎ－ＦＮ３のアミノ酸配列が配列１３であり、抗ＣＤ１６－ＳｃＦｖのアミノ酸配列が配列１４であり、抗ＣＤ２２－ＳｃＦｖのアミノ酸配列が配列１５であり、ＩＬ４のアミノ酸配列が配列１６である、
請求項１２に記載のタンパク質。
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列８であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列９であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列１７であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列９であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列１７であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列１８であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列１９であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列９であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列８であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２０であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２１であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列９であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２２であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列９であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２３であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２４であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２５であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２６であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２７であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２８であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２９であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列９であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列３０であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列３１であり；または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列２１であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列５であり、または
前記タンパク質の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列８であり、前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が配列５である、請求項１３に記載のタンパク質。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸分子であって、主ペプチド鎖をコードする核酸分子および補助ペプチド鎖をコードする核酸分子を含む核酸分子。
請求項１５に記載の核酸分子を含有する組換えベクター。
請求項１５に記載の核酸分子を含有する発現カセット。
請求項１５に記載の核酸分子を含有する組換え微生物株。
請求項１５に記載の核酸分子を含有する組換えウイルス。
請求項１５に記載の核酸分子を含有する細胞。
前記細胞が、原核細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
前記タンパク質の抗原を発現する標的細胞の、免疫細胞による阻害または死滅を媒介する製品を調製するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
前記タンパク質の抗原を発現する標的細胞の、免疫細胞による阻害または死滅を媒介する製品を調製するための、請求項１５に記載の核酸分子の使用。
前記タンパク質の抗原を発現する標的細胞の、免疫細胞による阻害または死滅を媒介する製品を調製するための、請求項１６に記載の組換えベクターの使用。
前記タンパク質の抗原を発現する標的細胞の、免疫細胞による阻害または死滅を媒介する製品を調製するための、請求項１８に記載の組換え微生物株の使用。
前記タンパク質の抗原を発現する標的細胞の、免疫細胞による阻害または死滅を媒介する製品を調製するための、請求項１９に記載の組換えウイルスの使用。
前記タンパク質の抗原を発現する標的細胞の、免疫細胞による阻害または死滅を媒介する製品を調製するための、請求項２０または２１に記載の細胞の使用。
前記免疫細胞が、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞である、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の使用。