CN102559696A - 一种重组人白细胞介素-15的高效可溶性表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人白细胞介素-15的高效可溶性表达方法，包含一种优化的重组人白细胞介素-15编码序列和一种重组表达载体pQE30/hIL-15，以及一种可表达可溶性重组人白细胞介素-15的工程细胞。

Description

一种重组人白细胞介素-15的高效可溶性表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种优化的重组人白细胞介素15的编码序列，相应的重组表达载体pQE30/hIL-15的构建以及高效表达可溶性重组人白细胞介素-15工程细胞的构建方法。

背景技术

1994年Grabstein等首先在猴肾表皮细胞系CV-1/EBVA上清中发现一种能维持IL-2依赖细胞系-T细胞系(CTLL)细胞增殖的因子，随后基因克隆获得成功并命名为白细胞介素-15(interleukin 15，IL-15)。人白细胞介素-15(hIL-15)基因定位于人染色体4q31位点，长32kb，有6个外显子，7个内含子，编码在同一区域的细胞因子还有表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)及IL-2基因等。hIL-15cDNA 5’非编码区有316bp，3’非编码区有400bp，开放阅读框由486bp组成，编码162个氨基酸，前导肽48个氨基酸，成熟蛋白由114个氨基酸组成，含有2个潜在N糖基化位点(N79，N112)。IL-15与IL-2在氨基酸的顺序上没有同源序列，但其立体结构相似，均属于螺旋细胞因子家族.并具有四级螺旋结构。IL-15的二级结构为在1-17和90-112氨基酸处形成超螺旋区，并由2个二硫键连接构成立体结构，其中的Cys24-Cys88的二硫键与IL-2的二硫键相类似。

由于IL-15与IL-2立体结构上的类似，IL-15具有与IL-2相似的生物学功能。IL-15通过与细胞表面的异三聚体受体(IL-15α链和IL-2或IL-15Rβ链和γ链)结合而发挥作用，IL-15是T、B、NK、LAK等细胞活化因子及诱导分泌细胞因子，诱导其增殖和分化；有刺激造血干细胞增殖和分化的作用；在天然免疫反应中，病毒或细菌感染后，宿主细胞产生I型干扰素(IFNα/β)，进而导致单核细胞产生IL-15，共刺激分子上调，而后IL-15选择性活化NK细胞、NK-T细胞、肠道γ/T(γ/IELs)和CD8+T细胞。

IL-15的这些生物学特性在机体免疫系统中具有重要的作用，越来越多的研究表明，IL-15与天然免疫反应、肿瘤、及炎症性疾病等发生发展密切相关。IL-15对慢性B淋巴细胞性白血病有增殖和抗凋亡作用，慢性B淋巴细胞性白血病的T细胞用IL-15预处理后发生很大变化，如T细胞活性明显增强、IFN-γ分泌、B-CLL细胞毒性明显增强；类风湿性关节炎(RA)患者发病前3个月滑液IL-15水平，早期RA患者滑液中的中性粒细胞凋亡水平显著低于非RA及非早期RA患者，可能与IL-15维持中性粒细胞存活、抗凋亡作用及提供RA发展所需微环境有关。IL-15在疾病发病机制作用可以指导临床应用，以IL-15为基础的治疗将有一个广泛的应用前景。

国内外对重组hIL-15的原核表达及纯化均有报道，但都为包涵体表达，其缺点为①表达量低，重组蛋白占菌体总蛋白5-10％；②纯化困难，包涵体需要变性复性，纯化步骤多且复杂；③活性低，由于均为包涵体表达，其蛋白未正确折叠，活性较低。本发明通过优化hIL-15的基因序列，自主构建pCSP-hIL-15重组质粒，获得hIL-15可溶性表达并通过后期纯化获得高产量，高活性的的目的蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种重组人白细胞介素15的高效可溶性表达方案，包括优化重组人白细胞介素15的编码序列，构建相应的重组表达载体pQE30/hIL-15以及构建高效表达可溶性重组人白细胞介素-15的工程细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种优化的编码重组人白细胞介素15蛋白的核苷酸序列，在不改变IL-15的氨基酸序列的情况下，通过基因编码序列的优化设计，获得优化的hIL-15的核苷酸序列。

以下为优化的hIL-15的核苷酸序列：

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在本发明的第二方面，提供了一种重组表达载体pQE30/hIL-15的构建方法，将上述优化后的hIL-15编码序列与pQE30质粒连接得到一种的重组表达载体，即pQE30/hIL-15。

在本发明的第三方面，提供了一种高效表达可溶性重组人白细胞介素-15的工程细胞的构建方法，将所述重组表达载体pQE30/hIL-15转化大肠杆菌，筛选获得高表达工程细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，整合有上述的表达载体。所述的工程细胞是大肠杆菌。

本发明经过深入研究，优化IL-15的编码序列，将基因克隆入pQE30质粒，转化大肠杆菌M15，经过表达筛选获得重组IL-15高效可溶性表达工程细胞。

本发明根据人白细胞介素-15的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏好密码子原则，在不改变氨基酸序列的条件下，优化IL-15编码序列，人工合成基因序列，将该基因克隆至pUC57中测序验证。

本发明构建了pQE30/hIL-15表达质粒，转化大肠杆菌M15，通过抗生素筛选得到转化细胞，再通过表达筛选获得高效可溶性表达工程细胞。

研究表明，低温下蛋白的缓慢表达增加了其正确折叠，使大部分的表达蛋白为可溶状态，进而提升了蛋白的天然活性，减少了终产物的内毒素。本发明的优点在于：

(1)优化后的IL-15非常适合在大肠杆菌中表达，具有高表达，高稳定的特点。

(2)采用25℃低温诱导表达的IL-15具有天然的折叠结构，可溶性高，活性强，成本低廉。

附图说明

图1：优化的人白细胞介素15编码序列。

图2：重组人白细胞介素15的酶切鉴定。M：DNA分子量标准(DL2000)，1：pQE30空载体，2：双酶切的pQE30/hIL-15重组载体。

图3：hIL-15诱导表达前后SDS-PAGE凝胶电泳。M：低分子量蛋白标准，1：工程细胞诱导前菌体总蛋白，2：工程细胞诱导后菌体总蛋白。

图4：hIL-15诱导表达前后Western Blot结果。1：工程细胞诱导前，2：工程细胞诱导后。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，列入分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

1、重组表达载体pQE30/hIL-15的构建

首先对人白介素15编码序列进行大肠杆菌偏好密码子的优化并突变部分序列，同时在其3’和5’端加上BamHI，SalI的酶切位点，即CGCGGATCC和ACGCGTCGAC。将带有酶切位点的序列进行全基因合成，转入pUC57质粒进行测序验证。将带有全长hIL-15的pUC57及pQE30质粒分别进行BamHI，SalI双酶切，将两个片段用T4连接酶进行连接，得到pQE30/hIL-15质粒。将连接产物转化DH5α工程菌，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切及测序鉴定筛选阳性克隆。

2、高效可溶性表达工程细胞的获得、筛选及鉴定。

(1)获得的重组质粒转化进入宿主菌M15，即本发明的工程菌。

(2)在固体M9琼脂培养基平板挑选单克隆，于含氨苄青霉素100ug/ml的4mLM9液体培养基中37℃，200转/分，摇菌过夜。

(3)接种1％的菌液至含氨苄青霉素100ug/ml的M9培养液里，37℃摇菌至OD＝0.5，加入ImM终浓度的IPTG诱导，25℃摇菌过夜，回收菌体。

(4)重悬菌体于上样缓冲液中，100℃煮沸5分钟，SDS-PAGE分析蛋白表达量。对照诱导前后菌体蛋白的变化，筛选目的蛋白高效表达的工程细胞。

(5)目的蛋白的Western-Blot鉴定。诱导前后的菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜，用hIL-15单克隆抗体鉴定目的蛋白。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种优化的编码重组人白细胞介素15蛋白的核苷酸序列，其特征在于如下：

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2.一种高效可溶性表达重组人白细胞介素-15的工程细胞的构建以及其在大肠杆菌宿主内表达的方法，其特征在于，它包括步骤：

a)获得优化的重组人白细胞介素-15的编码序列；

b)构建重组表达载体pQE30/hIL-15；

c)转化大肠杆菌宿主细胞，筛选获得高表达的工程细胞；

d)诱导表达重组人白细胞介素-15。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的表达质粒为权力要求2中所述的优化的重组人白细胞介素-15DNA序列克隆至pQE30质粒中得到一种全新的重组表达载体即pQE30/hIL-15。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的工程细胞，含有权利要求3所述的重组表达载体或权利要求2所述的编码重组人白细胞介素-15的DNA序列。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(d)中所述的利用权利要求4所述的工程细胞在25℃低温诱导表达重组人白细胞介素-15。

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