CN102573922A - 靶向性免疫缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫缀合物。在具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一个单链效应器模块和两个或更多个抗原结合模块的免疫缀合物。另外，本发明涉及编码此类免疫缀合物的核酸分子、包含此类核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的免疫缀合物的方法，及在治疗疾病中使用这些免疫缀合物的方法。

Description

靶向性免疫缀合物
发明领域
一般地，本发明涉及用于选择性投递影响细胞活性的效应器模块的抗原特异性免疫缀合物。另外，本发明涉及编码此类免疫缀合物的核酸分子和包含此类核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的免疫缀合物的方法，及在治疗疾病中使用这些免疫缀合物的方法。
发明背景
对个别细胞或特定细胞类型的选择性破坏在许多临床背景中经常是期望的。例如，癌症疗法的主要目的是特异性破坏肿瘤细胞，而让健康细胞和组织保持完整且不受损伤。细胞中的许多信号转导途径与细胞存活和/或死亡相关联。因而，可以使用对涉及细胞存活或死亡的途径的因子的直接投递来促成细胞的维持或破坏。
细胞因子是参与免疫系统调节的细胞信号传导分子。在癌症疗法中使用时，细胞因子可以充当免疫调控剂，其具有抗肿瘤效果，并且其可以提高一些类型的肿瘤的免疫原性。然而，快速的血液清除和肿瘤特异性的缺乏需要高剂量细胞因子的系统性施用以达到在肿瘤部位足以激活免疫应答或具有抗肿瘤效果的细胞因子浓度。这些高水平的系统性细胞因子可以导致严重的毒性和不利的反应。
一种将信号转导途径的因子，诸如细胞因子投递至体内的特定部位(例如，肿瘤或肿瘤微环境)的方式是将该因子与对该部位特异性的免疫球蛋白缀合。早期策略针对将信号转导途径的因子，诸如细胞因子投递至体内的特定部位，包括与各种细胞因子，包括淋巴毒素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)缀合的免疫球蛋白重链。免疫球蛋白重链或是与细胞因子化学缀合或是免疫球蛋白-细胞因子缀合物以融合蛋白表达。见Nakamura K.和Kubo，A.Cancer Supplement80：2650-2655(1997)；Jun，L.等，Chin.Med.J.113：151-153(2000)；及BeckerJ.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7826-7831(1996)。研究人员观察到，它们不仅能够将细胞因子靶向至体内的特定部位，它们还能够利用如下的实情，即单克隆抗体比大多数其它蛋白质具有更长的血清半衰期。由于与高剂量的某些未缀合细胞因子，即IL-2有关的系统毒性，免疫球蛋白-细胞因子融合蛋白在较低剂量使肿瘤部位的免疫刺激活性最大化，而使系统副作用保持最小的能力让研究人员相信，免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物是最佳的治疗剂。然而，免疫球蛋白作为投递剂的临床效用中的主要限制之一是其不充分的摄取和肿瘤中的较差分布，这部分是由于免疫球蛋白分子较大所致。见Xiang，J.等，Immunol.Cell Biol.72：275-285(1994)。另外，已经提示了，免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物可以激活补体，并与Fc受体相互作用。已经不利地看待此固有的免疫球蛋白特征，因为治疗性免疫缀合物可以靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。
一种克服这些问题的方法是使用经工程化改造的免疫球蛋白片段。许多研究已经详述了免疫球蛋白片段-细胞因子免疫缀合物的特征。见Savage，P.等，Br.J.Cancer 67：304-310(1993)；Harvill，E.T.和Morrison S.L.，Immunotechnol.1：95-105(1995)；及Yang J.等，Mol.Immunol.32：873-881(1995)。一般地，存在着两种常见的免疫球蛋白片段-细胞因子融合蛋白构建体，即哺乳动物细胞中表达的F(ab’)2-细胞因子和大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的scFv-细胞因子。见Xiang，J.Hum.Antibodies 9：23-36(1999)。免疫球蛋白亲本分子的肿瘤结合反应性和细胞因子的功能性活性两者在大多数这些类型的免疫缀合物中得到维持。新近的临床前研究已经显示了，这些融合蛋白能够将细胞因子在体内靶向表达肿瘤相关抗原的肿瘤，并抑制免疫能力动物模型中的原发性和转移性肿瘤两者。
免疫球蛋白片段-细胞因子免疫缀合物的例子包括如PCT公开文本WO2001/062298A2中所列的scFv-IL-2免疫缀合物；如美国专利No.5,650,150中所列的免疫球蛋白重链片段-GM-CSF免疫缀合物；如PCT公开文本WO2006/119897A2中所列的免疫缀合物，其中scFv-IL-12第一亚基与IL-12第二亚基-scFv仅共享二硫键，和如PCT公开文本WO 99/29732A2中所描述的免疫缀合物，其中Ig重链片段-IL-12第一亚单位与Ig重链片段-IL-12第二亚单位仅共享二硫键。虽然与第一代免疫球蛋白-细胞因子缀合物相比，这些第二代免疫缀合物具有一些改善的特性，但是开发更多且甚至更安全的特异性治疗剂对于针对肿瘤细胞的更大效率和这些产品的副作用(例如，毒性、对非肿瘤细胞的破坏等)的数目和严重性降低是期望的。另外，期望鉴定在维持可接受的治疗活性水平的情况下进一步稳定免疫缀合物的方式。
本发明提供了相对于已知的免疫缀合物，展现出改善的功效、高的作用特异性、降低的毒性和血液中改善的稳定性的免疫缀合物。
发明概述
本发明的一方面涉及与已知的免疫缀合物相比，展现出改善的功效、高的作用特异性、降低的毒性和血液中改善的稳定性的免疫缀合物。可以使用本发明的免疫缀合物来将效应器模块选择性投递至体内的靶部位。在另一个实施方案中，免疫缀合物将细胞因子投递至靶部位，其中所述细胞因子可以施加局部生物学效应，诸如局部炎性应答、刺激T细胞生长和活化和/或活化B和/或NK细胞。
本发明的一方面涉及免疫缀合物，其包含至少第一效应器模块和至少第一和第二抗原结合模块，其独立选自下组：Fv和Fab，其中第一效应器模块与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，而第二抗原结合模块与i)所述第一效应器模块或ii)所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键
本发明的另一方面是免疫缀合物，其至少包含在其氨基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接的第一单链效应器模块，且其中所述第一单链效应器模块在其羧基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接。
本发明的另一方面是免疫缀合物，其包含至少第一单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块，其中第一和第二抗原结合模块之每个包含在其羧基端氨基酸处与包含免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域独立选自下组：IgG CH1、IgG Cκ和IgE CH4，且其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
本发明的另一方面是免疫缀合物，其包含至少第一单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块，其中第一和第二抗原结合模块之每个包含在其羧基端氨基酸处与IgG1 CH3域连接的scFv分子，且其中第一抗原结合模块在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
本发明的另一方面涉及免疫缀合物，其包含第一和第二单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块，其中每个抗原结合模块包含在其重或轻链羧基端氨基酸处与IgG1 CH3域连接的Fab分子，且其中每个IgG1 CH3域在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：95。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：104。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：105。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：106。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：107。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：96。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ IDNO：96和选自下组的多肽序列：SEQ ID NO：95和104-107。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含具有与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列的多肽：SEQ ID NO：95、96和104-107。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：108至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：108编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：117至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：117编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：118至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：118编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：119至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：119编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：120至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：120编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：109至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：109编码的多肽序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：15至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列和与序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16编码的重链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12编码的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：99至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：215至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：235至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQID NO：100至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列和与序列SEQ ID NO：101至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：215至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列和与序列SEQ ID NO：235至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：112至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：112编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：216至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：216编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：114或SEQ ID NO：236至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：114或SEQ ID NO：236编码的多肽序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：179，SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：187，SEQ IDNO：191，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：207。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：181，SEQ IDNO：185，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：205。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：179，SEQ ID NO：183，SEQID NO：187，SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：207和与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3，SEQID NO：5，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：205。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：180，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的多核苷酸序列编码的重链可变区序列：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：180，SEQ IDNO：184，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列：SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：206。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：198，SEQID NO：202和SEQ ID NO：206。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQID NO：239、SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：243。在另一个实施方案中，所述缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：249。在又一个实施方案中，所述免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：243，和与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：249。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：244。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：244。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248和SEQ ID NO：250。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248和SEQ ID NO：250。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：51，SEQ IDNO：69，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：127，SEQ IDNO：131，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：175。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：71，SEQ IDNO：75，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：133，SEQID NO：137，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：173。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：47，SEQ IDNO：51，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：123，SEQ IDNO：127，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：175，与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：153，SEQID NO：157，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：169和SEQ IDNO：173。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：52，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：124，SEQ IDNO：128，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：176。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的重链可变区序列：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：144，SEQID NO：148，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：176。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列：SEQID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：146，SEQID NO：150，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：174。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列：SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：68，SEQ IDNO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：130，SEQ IDNO：134，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：174。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQID NO：209，SEQ ID NO：211，SEQ ID NO：213，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：227。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：229，SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233和SEQ ID NO：237。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：211、SEQ IDNO：219和SEQ ID NO：221，和与序列SEQ ID NO：231至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：227，和与序列SEQ ID NO：229至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：213至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列，和与序列SEQ ID NO：233至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：217至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列，和与序列SEQ ID NO：237至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：214，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：224，SEQ ID NO：226和SEQID NO：228。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：214，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：224，SEQID NO：226和SEQ ID NO：228。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：232、SEQID NO：234和SEQ ID NO：238。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：238。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：257或SEQ IDNO：261至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQID NO：259或SEQ ID NO：271至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：257或SEQ ID NO：261至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的重链可变区序列，和与序列SEQ ID NO：259或SEQ ID NO：271至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO：258或SEQ IDNO：262至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：258或SEQ ID NO：262编码的重链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：272至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：272编码的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：251或SEQ IDNO：255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：265至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQID NO：251或SEQ ID NO：255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列，和与序列SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：265至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO：252或SEQ IDNO：256至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：256编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：254或SEQ ID NO：266至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：254或SEQ ID NO：266编码的多肽序列。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个效应器模块，其中所述效应器模块是细胞因子。在一个具体的实施方案中，效应器模块是选自下组的细胞因子：白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α(INF-α)、白介素-12(IL-12)、白介素-8(IL-8)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和转化生长因子-β(TGF-β)。在另一个实施方案中，至少一个抗原结合模块对下列一种抗原决定簇是特异性的：纤连蛋白的额外域B(EDB)、生腱蛋白的A1域(TNC-A1)、生腱蛋白的A2域(TNC-A2)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)；和黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物以比对照效应器模块的解离常数大至少约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的解离常数(KD)结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，免疫缀合物在施用期结束时在体内将肿瘤体积增加抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在另一个实施方案中，相对于对照效应器模块或“双抗体(diabody)”免疫缀合物(immunoconjugate)分子中的效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
本发明的另一方面涉及编码本发明的免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸。本发明的另一方面涉及包含含有本发明的多核苷酸序列的表达盒的表达载体。
本发明的另一方面涉及表达本发明的免疫缀合物或其片段的宿主细胞。
本发明的另一方面涉及用于生成本发明的免疫缀合物或其片段的方法，其中该方法包括在适合于其表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体编码本发明的免疫缀合物或片段。
本发明的另一方面涉及用于促进活化的T淋巴细胞细胞中的增殖和分化的方法，包括使活化的T淋巴细胞细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于促进活化的B淋巴细胞细胞中的增殖和分化的方法，包括使活化的B淋巴细胞细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于促进天然杀伤(NK)细胞中的增殖和分化的方法，包括使NK细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于促进粒细胞、单核细胞或树突细胞中的增殖和分化的方法，包括使粒细胞、单核细胞或树突细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分化的方法，包括使T淋巴细胞细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于抑制病毒复制的方法，包括使病毒感染的细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于上调主要组织相容性复合体I(MHC I)表达的方法，包括使靶细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。
本发明的另一方面涉及用于诱导细胞死亡的方法，包括对靶细胞施用有效量的本发明的免疫缀合物。
本发明的另一方面涉及用于诱导靶细胞中的趋化性的方法，包括对靶细胞施用有效量的本发明的免疫缀合物。
本发明的另一方面涉及用于治疗个体中的疾病的方法，包括对个体施用治疗有效量的包含本发明的免疫缀合物和药用载体的组合物的步骤。
附图简述
图1：各种免疫缀合物融合形式的示意图。图1中的所有构建体包含两个抗体scFv片段(在抗原结合模块(antigen binding moiety)中)和一个或两个与其连接的细胞因子分子(作为效应器模块(effector moiety))。小图A至E显示了抗原结合模块和效应器模块的不同连接和化学计量学。小图A)描绘了“双抗体(diabody)”-IL-2融合物。“双抗体”自两个相同的多肽链非共价装配。小图B显示了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含在其羧基端处与细胞因子融合的Fab分子的重链，所述细胞因子继而在其羧基端处与第二Fab重链融合。共表达轻链与重链Fab-细胞因子-重链Fab多肽以形成免疫缀合物。或者，可以将两条轻链与细胞因子融合，并共表达重链。在小图C中，彼此直接融合两个Fab重链。细胞因子与第二抗原结合模块重链共享氨基端肽键。小图B和C的两个分子形式可以改变为使得用scFv片段替换Fab链，如小图D和E中所显示的。
图2：包含两个抗原结合模块和至少一个或多个效应器模块的其它免疫缀合物的示意图。小图A显示了经由其羧基端与IgG CH3域融合的Fab分子。为了实现共价抗原结合模块同二聚化，可以在IgG CH3域的羧基端处引入人工二硫键(在小图A内右侧的免疫缀合物)。可以用IgE CH4域替换小图A中所显示的IgG1 CH3域。用小图B中的scFv片段替换小图A中的Fab模块。对于小图C的免疫缀合物，将天然的IgG铰链在Fab分子的C端融合。因为铰链的羧基端区可以对IgG铰链区C端融合的恒定域装配强加一些几何学约束，所以可以在铰链的羧基端区与IgG CH3域的氨基端间引入人工接头。也可以在scFv片段与免疫球蛋白恒定域间引入铰链区，如小图D中所显示的。在小图A至D中，使用IgG1 CH3或IgE CH4域来使构建体同二聚化。小图E描绘了一种免疫缀合物，其中经由CH1/Cκ异二聚化相互作用来实现二聚化。小图D的免疫缀合物可以具有每个免疫缀合物一个或两个细胞因子。
图3呈现了用对肿瘤基质基质特异性的两种不同白介素-2免疫缀合物分子形式的功效实验的结果。将F9畸胎瘤皮下注射入129SvEv小鼠中，并使用测径器来测量肿瘤大小。在两个不同浓度比较“双抗体”-IL-2分子与Fab-白介素-2-Fab(Fab-IL2-Fab)免疫缀合物，其中浓度反映相似数目的免疫缀合物分子。在图3中，Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“Fab-L19”，未偶联的白介素-2对照标记为“Unconj rIL-2”，“双抗体”-IL-2分子标记为“双抗体”。使用针对纤连蛋白的额外域B(EDB)的L19抗体来生成双抗体和Fab-L19免疫缀合物两者中的抗原结合模块。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μg计)。
图4呈现了用对肿瘤基质基质特异性的两种不同白介素-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人胃肿瘤细胞系LS174T脾内注射入SCID-米色小鼠中。在图4中，Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“Fab-L19”，未缀合的白介素-2对照标记为“Unconj rIL-2”，“双抗体”-IL-2分子标记为“双抗体”。使用抗-EDB抗体L19来生成双抗体和Fab-L19免疫缀合物两者中的抗原结合模块。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μg计)，并且反映免疫缀合物分子的相同数目。
图5显示了100X和400X放大率的人子宫组织的免疫组织化学图像。通过实施例3中所描述的方法生成的2B10可变区结合人生腱蛋白(tenascin)的A2域(TNC-A2)。融合Fab片段中的2B10可变区与FLAG片段(SHD2B10-FLAG)。制备健康的和癌性的人子宫组织样品以进行免疫组织化学染色。随后，将样品与SHD2B10-FLAG Fab片段一起温育。然后，将样品清洗，并与对FLAG表位特异性的荧光抗体一起温育。与健康组织样品相比，癌性组织样品展现出更高的TNC-A2表达水平。
图6显示了按％免疫荧光表面积计的各种人组织样品中的TNC-A2表达水平。将来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品与SHD2B10-FLAG Fab片段一起温育，如图5中所描述的。
图7显示了按％免疫荧光表面积计的各种人组织样品中的成纤维细胞激活蛋白(FAP)表达水平。将来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品与针对FAP的商业抗体(Abcam)一起温育。图上的每个柱形的顶部部分代表FAP的肿瘤表达，而图上的每个柱形的底部部分代表正常的FAP表达。
图8呈现了显示已知的IgG抗体L19对EDB的亲和力的BIACORE数据。
图9呈现了显示对EDB特异性的Fab-IL-2-Fab免疫缀合物的亲和力的BIACORE数据。免疫缀合物中的Fab片段自L19抗体衍生。
图10呈现了显示对EDB特异性的“双抗体”-IL2融合蛋白的亲和力的BIACORE数据。双抗体scFv片段自L19抗体衍生。“双抗体”-IL2融合蛋白包含位于scFv片段与IL-2分子间的8个氨基酸的接头。
图11呈现了显示对EDB特异性的“双抗体”-IL2融合蛋白的亲和力的BIACORE数据。双抗体scFv片段自L19抗体衍生。“双抗体”-IL2融合蛋白包含位于scFv片段与IL-2分子间的12个氨基酸的接头。
图12呈现了显示已知的IgG抗体F16对固定化的生腱蛋白域A1(TNC-A1)的亲和力的BIACORE数据。图12还呈现了显示F16抗体的Fab片段对TNC-A1的亲和力的BIACORE数据。图中标示了对F16IgG和Fab分子计算的解离常数(KD)。
图13呈现了显示IL-2对固定化的IL-2受体的亲和力的BIACORE数据。通过将相应的链与人IgG1Fc部分的“突出-入-穴”变体融合来实现IL-2R的β和γ链的异二聚化，如记载于Merchant，A.M.等，Nat.Biotech.16：677-681(1998)的。图中标示了自BIACORE数据计算的KD值。
图14呈现了显示“双抗体”-IL-2融合蛋白对TNC-A1和IL-2受体的亲和力的BIACORE数据。抗体中的scFv分子自F16抗体衍生。图中标示了自BIACORE数据计算的KD值。
图15呈现了显示Fab-IL-2-Fab免疫缀合物对TNC-A1和IL-2受体的亲和力的BIACORE数据。免疫缀合物中的Fab分子自F16抗体衍生。图中标示了自BIACORE数据计算的KD值。
图16呈现了显示scFv-IL-2-scFv免疫缀合物对TNC-A1和IL-2受体的亲和力的BIACORE数据。免疫缀合物中的scFv分子自F16抗体衍生。图中标示了自BIACORE数据计算的KD值。
图17是自图12-16中呈现的BIACORE研究获得的KD值的汇总表。
图18呈现了比较靶向纤连蛋白的EDB域的“双抗体”-IL-2分子与靶向生腱蛋白C A2域的Fab-白介素-2-Fab免疫缀合物(标记为“Fab-SH2B10”，其包含分别为SEQ ID NO：3和7的重和轻链可变区)的功效实验的结果。在图18中，未缀合的白介素-2对照标记为“Unconj rIL-2”，“双抗体”-IL-2分子标记为“L19双抗体”。使用抗EDB抗体L19来生成双抗体免疫缀合物中的抗原结合模块。将畸胎瘤细胞系F9皮下注射入129系的有免疫能力小鼠中。图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μg计)。在第6天开始处理，并总共实施5次注射，直至实验的第11天。
图19显示了与未缀合的人IL-2相比，抗FAP、或抗生腱蛋白C、Fab-IL2-Fab免疫缀合物(使用3F2、3D9、4B3(抗-FAP)、2F11和2B10构建体(抗生腱蛋白C)的VH和VL序列生成)对NK-92细胞增殖的诱导。在温育两天后使用CellTiter Glo系统来测量细胞增殖。
图20呈现了测量与未缀合的细胞因子，或在分开的分子中含有IL-12的p35和p40域的免疫缀合物相比，各种含有白介素12的免疫缀合物对IFN-γ生成的诱导的ELISA测定法的结果。小图A显示了经纤连蛋白包被的板上的结果。小图B显示了溶液中的结果。
图21显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于表面等离振子共振(SPR)的动力学分析。对结合人(hu)FAP(A)和鼠(mu)FAP(B)的克隆19G1，对结合hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆20G8及对结合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆4B9呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图22显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的动力学分析。对结合hu FAP(A)和mu FAP(B)的克隆5B8，对结合hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆5F1及对结合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆14B3呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图23显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的动力学分析。对结合hu FAP(A)和mu FAP(B)的克隆16F1，对结合hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆16F8及对结合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆O3C9呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图24显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的动力学分析。对结合hu FAP(A)和mu FAP(B)的克隆O2D7，对结合hu FAP(C)、mu FAP(D)、cyno FAP(E)的克隆28H1及对结合hu FAP(F)、mu FAP(G)和猕猴(cyno)FAP(H)的克隆22A3呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图25显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的动力学分析。对结合hu FAP(A)、mu FAP(B)、cyno FAP(C)的克隆29B11，及对结合FAP(D)、mu FAP(E)和cyno FAP(F)的克隆23C10呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图26显示了对亲和力成熟的结合人(hu)TNC A2的抗TNC A2Fab片段的基于SPR的动力学分析。对克隆2B10_C3B6(A)、克隆2B10_6A12(B)、克隆2B10_C3A6(C)、克隆2B10_O7D8(D)、克隆2B10_O1F7(E)和克隆2B10_6H10(F)呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图27给出了为了纯化基于3F2的Fab-IL2-Fab而实施的三个纯化步骤的概述。
图28显示了来自基于3F2的Fab-IL2-Fab的纯化的结果(A和B)和来自基于4G8的Fab-IL2-Fab的纯化的结果(C和D)。(A，C)4-12％Bis-Tris和3-8％Tris乙酸盐SDS-PAGE及纯化规程期间的级分和终产物。(B，D)三个应用的纯化步骤后的分析用大小排阻层析。
图29显示了来自2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的纯化的结果。(A)4-12％Bis-Tris SDS-PAGE及纯化规程期间的级分和终产物。B)三个应用的纯化步骤后的分析用大小排阻层析。
图30显示了基于抗纤连蛋白EDB L19的Fab-IL2-Fab的稳定性评估。将L19Fab-IL2-Fab以浓度6.3mg/ml在20mM盐酸组氨酸、140mM NaCl，pH6.0中配制，并于室温及于4℃贮存4周。每周通过UV分光术对样品分析(A)浓度(在离心以使潜在的沉淀物质沉淀后)并通过分析用大小排阻层析来测定(B)聚集物含量。
图31显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)FAP和人IL-2受体-β/γ(IL2R bg)的FAP靶向性3F2 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图32显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)FAP的FAP靶向性4G8Fab-IL2-Fab免疫缀合物的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图33显示了对针对人和鼠IL-2受体β/γ和α链的FAP靶向性4G8Fab-IL2-Fab构建体的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对两态反应模型的全局拟合。
图34显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)FAP和人IL-2受体-β/γ(IL2R bg)的FAP靶向性3D9 Fab-IL2-Fab构建体的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图35显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)嵌合TNC A2融合蛋白和人IL-2受体-β/γ(IL2R bg)的TNC A2靶向性2B10Fab-IL2-Fab构建体的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图36显示了与IL-2(Proleukin)和识别纤连蛋白-EDB的L19双抗体相比，识别TNC A2(2B10)或FAP(3F2和4G8)的靶向性IL-2Fab-IL2-Fab免疫缀合物在诱导NK92细胞增殖中的功效。相对于IL-2分子的数目对x-轴进行标准化，因为双抗体具有两个IL-2效应器模块，而Fab-IL2-Fab构建体仅含有一个IL-2效应器模块。在温育2天后使用CellTiter Glo系统来测量细胞增殖。
图37显示了在溶液中，与识别不同的效应器细胞群体上的FAP的FAP靶向性基于4G8的IL-2 Fab-IL2-Fab免疫缀合物(FAP-targeted 4G8-based IL-2Fab-IL2-Fab immunoconjugate)一起温育后，由于IL-2介导的IL-2受体信号传导所致的STAT5磷酸化诱导，所述不同的效应器细胞群体来自人PBMC，包括(A)CD56+NK细胞、(B)CD4+CD25-CD127+辅助T细胞、(C)CD3+，CD8+细胞毒性T细胞和(D)CD4+CD25+FOXP3+调节T细胞(Tregs)。
图38显示了在免疫缀合物存在于溶液中或者经由微量滴定板上包被的FAP或TNC A2固定化时，与IL-2相比识别TNC A1(2F11)、TNC A2(2B10)或FAP(3F2、4B3和3D9)的靶向性IL-2Fab-IL2-Fab免疫缀合物在诱导IFN-γ释放和NK92细胞增殖中的功效。
图39呈现了用对肿瘤基质特异性的两种不同IL-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人结肠肿瘤细胞系LS174T脾内注射入SCID小鼠中。TNCA2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“SH2B10”，未缀合的IL-2对照标记为“Proleukin”，纤连蛋白EDB靶向性双抗体-IL-2分子标记为“双抗体”。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μg计)，并且反映了免疫缀合物分子的相同数目。
图40呈现了用对肿瘤基质特异性的两种不同IL-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人肾细胞系ACHN肾内注射入SCID小鼠中。FAP靶向性3F2或4G8Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“FAP-3F2”和“FAP-4G8”，未缀合的IL-2对照标记为“Proleukin”，纤连蛋白EDB靶向性双抗体-IL-2分子标记为“双抗体”。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μg计)，并且反映免疫缀合物分子的相同数目。
图41呈现了用对肿瘤基质特异性的两种不同IL-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人NSCLC细胞系A549i.v注射入SCID小鼠中。TNC A2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“2B10”，纤连蛋白EDB靶向性双抗体-IL-2分子标记为“双抗体”。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μg计)，并且反映了免疫缀合物分子的相同数目。
图42呈现了(A)具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE(还原性、非还原性)。
图43呈现了比较GM-CSF与具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的纯化的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物对TF-T细胞的影响的GM-CSF依赖性增殖测定法的结果。
图44呈现了(A)具有4G8(FAP结合剂)作为Fab的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE(还原性、非还原性)。
图45呈现了测试IL-12诱导的IFN-γ释放，比较IL-12和具有4G8(FAP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的效果，使用自健康供体的新鲜人血液分离的PBMC的测定法的结果。
图46呈现了(A)具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的Fab-IFNα2-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的Fab-IFNα2-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE(还原性、非还原性)。
图47呈现了测试IFN-α诱导的对(A)Jurkat T细胞和(B)A549肿瘤细胞的增殖抑制比较IFN-α(Roferon A，Roche)和具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IFNα2-Fab免疫缀合物的效果的测定法的结果。
图48显示了(A)来自纯化MCSP靶向性基于MHLG的Fab-IL2-Fab的洗脱概况和(B)来自通过SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对相同Fab-IL2-Fab的分析表征的结果。
图49显示了(A)来自纯化MCSP靶向性基于MHLG1的Fab-IL2-Fab的洗脱概况和(B)来自通过SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对相同Fab-IL2-Fab的分析表征的结果。
图50呈现了测试IL-2诱导的IFN-γ释放，比较具有4G8(FAP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与具有MHLG KV9(MCSP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL2-Fab免疫缀合物的效果，使用IL-2饥饿的NK92细胞的测定法的结果。
图51呈现了测试IL-2诱导的IFN-γ释放，比较具有4G8(FAP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与具有MHLG1 KV9(MCSP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的效果，使用IL-2饥饿的NK92细胞的测定法的结果。
图52显示了MCSP靶向性MHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab免疫缀合物对Colo38细胞的结合，如通过流式细胞术测定的。显示了单独的二抗或仅细胞作为阴性对照。
图53呈现了(A)具有2B10(TNC A2结合剂)作为Fab的2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE(还原性，非还原性)。
发明详述
定义
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语一般与本领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。一般地，本文中所使用的命名和下文所描述的细胞培养、分子遗传学、核酸化学和杂交中的实验室规程是本领域中公知且通常采用的。标准技术和规程一般依照遍及本文件提供的本领域常规方法和各种一般参考文献(一般见Sambrook等Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，通过提及而将其收入本文)实施。
如本文中所使用的，术语“免疫缀合物”指包含至少一个效应器模块和至少一个抗原结合模块的多肽分子。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个单链效应器模块和至少两个抗原结合模块。抗原结合分子可以通过多种相互作用并以多种构象与效应器模块连接，如本文中所描述的。
如本文中所使用的，术语“效应器模块”指例如经由信号转导或其它细胞途径影响细胞活性的多肽，例如蛋白质或糖蛋白。因而，本发明的效应器模块可以与受体介导的信号传导关联，所述受体介导的信号传导自细胞膜外部转送信号以调控携带一种或多种效应器模块受体的细胞中的应答。在一个实施方案中，效应器模块可以引发携带一种或多种效应器模块受体的细胞中的细胞毒性应答。在另一个实施方案中，效应器模块可以引发携带一种或多种效应器模块受体的细胞中的增殖应答。在另一个实施方案中，效应器模块可以引发携带效应器模块受体的细胞中的分化。在另一个实施方案中，效应器模块可以改变携带效应器模块受体的细胞中的内源细胞蛋白质的表达(即，上调或下调)。效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。效应器模块可以以多种结构与抗原结合模块结合以形成免疫缀合物。
如本文中所使用的，术语“细胞因子”指介导和/或调节生物学或细胞功能或过程(例如，免疫、炎症和造血)的分子。如本文中所使用的，术语“细胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白介素”。有用的细胞因子的例子包括但不限于GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
如本文中所使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个实施方案中，效应器模块是单链效应器模块。单链效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。在效应器模块是细胞因子并且感兴趣的细胞因子在自然界中通常以多聚体找到时，多聚体细胞因子的每个亚基由效应器模块的单链序贯编码。因而，有用的单链效应器模块的非限制性例子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
如本文中所使用的，术语“对照效应器模块”指未缀合的效应器模块。例如，在比较本发明的IL-2免疫缀合物与对照效应器模块时，对照效应器模块是游离的、未缀合的IL-2。同样地，例如在比较本发明的IL-12免疫缀合物与对照效应器模块时，对照效应器模块是游离的、未缀合的IL-12(例如以异二聚体蛋白质存在，其中p40和p35亚基仅共享二硫键))。
如本文中所使用的，术语“效应器模块受体”指能够特异性结合效应器模块的多肽分子。例如，在IL-2是效应器模块的情况中，结合IL-2(例如，包含IL-2的免疫缀合物)的效应器模块受体是IL-2受体。相似地，例如在IL-12是免疫缀合物的效应器模块的情况中，效应器模块受体是IL-12受体。在效应器模块特异性结合超过一种受体的情况中，特异性结合效应器模块的所有受体是针对所述效应器模块的“效应器模块受体”。
如本文中所使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将其附着的实体(例如，效应器模块或第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如携带抗原决定簇的肿瘤细胞或肿瘤基质的特定类型。抗原结合模块包括抗体及其片段，如本文中进一步限定的。“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的，并且可以与不想要的或非特异性相互作用区别。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个具有恒定区的抗原结合模块，如本文中进一步限定的且在本领域中已知的。有用的重链恒定区包括5种同种型之任一：α、δ、ε、γ、或μ。有用的轻链恒定区包括2种同种型之任一：κ和λ。
如本文中所使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”是同义的，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如，氨基酸的连续区段或由不连续的氨基酸的不同区域构成的构象结构)。
如本文中所使用的，术语“对照抗原结合模块”指在其会存在时没有其它抗原结合模块和效应器模块的抗原结合模块。例如，在比较本发明的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与对照抗原结合模块时，对照抗原结合模块是游离的Fab，其中Fab-IL2-Fab免疫缀合物和游离的Fab分子都能特异性结合同一抗原决定簇。
如本文中所使用的，使用就抗原结合模块、效应器模块等而言的术语“第一”和“第二”以在存在超过一个每种类型的模块时方便区别。使用这些术语并不意图赋予免疫缀合物的特定次序或取向，除非明确如此规定。
在本领域内使用和/或接受的术语有两个或更多个定义的情况中，如本文中所使用的，术语的定义意图包括所有此类意义，除非明确相反地规定。一个具体的例子是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述重和轻多肽两者的可变区内找到的非连续抗原结合位点。此特定的区域已经由Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)及由Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)(通过提及而将它们收入本文)描述，其中该定义包括在彼此比较时氨基酸残基的交叠或子集。然而，任一个定义指抗体或其变体的CDR的应用意图在该术语的范围内，如本文中定义并使用的。涵盖如由上文所引用的每篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基在下文在表I中列出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目会随CDR的序列和大小而有所变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定的CDR。
表1：CDR定义1
  CDR   Kabat   Chothia   AbM2
  VH CDR1   31-35   26-32   26-35
  VH CDR2   50-65   52-58   50-58
  VH CDR3   95-102   95-102   95-102
  VL CDR1   24-34   26-32   24-34
  VL CDR2   50-56   50-52   50-56
  VL CDR3   89-97   91-96   89-97
1表1中的所有CDR定义的编号依照由Kabat等所列的编号约定(见下文)。
2如表1中所使用的具有小写字母“b”的“AbM”指如由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还限定了可应用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本发明普通技术人员可以将“Kabat编号方式”的此系统明确归入任何可变域序列，而不依赖于超出序列自身的任何实验数据。如本文中所使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequence ofProteins of Immunological Interest”(1983)所列的编号系统。除非另有规定，提及本发明的抗原结合模块中的特定氨基酸残基位置的编号是依照Kabat编号系统。序列表的多肽序列(即SEQ ID NOs：3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，96，97等)不依照Kabat编号系统编号。然而，完全在本领域技术人员的普通技术内的是，将序列表的序列编号转化成Kabat编号。
免疫缀合物
免疫缀合物是包含至少一个效应器模块和至少一个抗原结合模块的多肽分子。在一个实施方案中，效应器模块是单链效应器模块。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少两个抗原结合模块。本发明的抗原结合模块和效应器模块包括那些在上文和下文中及在附图中详细描述的。免疫缀合物的抗原结合模块可以针对多种靶分子(例如，肿瘤细胞或肿瘤基质上表达的蛋白质分子上的抗原决定簇)。本文中描述了抗原结合模块的非限制性例子。在一个实施方案中，至少一个抗原结合模块针对下文表5中所代表的一种或多种多肽的抗原决定簇。特别地与靶向相同抗原决定簇并携带相同效应器模块的不同结构的已知免疫缀合物相比，本发明的免疫缀合物通常展现出下列一项或多项特性：高的作用特异性、降低的毒性和/或改善的稳定性。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少第一效应器模块和至少第一和第二抗原结合模块。在一个优选的实施方案中，第一效应器模块是单链效应器模块。在一个优选的实施方案中，第一和第二抗原结合模块独特地选自下组：Fv和Fab。在一个具体的实施方案中，第一效应器模块与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，而第二抗原结合模块与i)第一效应器模块或ii)第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键。在另一个实施方案中，免疫缀合物基本上由第一单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块组成。
在一个实施方案中，第一效应器模块与第一抗原结合模块共享羧基端肽键，而且与第二抗原结合模块进一步共享氨基端肽键。在另一个实施方案中，第一抗原结合模块与第一效应器模块，优选地单链效应器模块共享羧基端肽键，而且与第二抗原结合模块进一步共享氨基端肽键。在另一个实施方案中，第一抗原结合模块与第一效应器模块，优选地单链效应器模块共享氨基端肽键，而且与第二抗原结合模块进一步共享羧基端肽。
在一个实施方案中，效应器模块，优选地单链效应器模块与第一重链可变区共享羧基端肽键，而且与第二重链可变区进一步共享氨基端肽键。在另一个实施方案中，效应器模块，优选地单链效应器模块与第一轻链可变区共享羧基端肽键，而且与第二轻链可变区进一步共享氨基端肽。在另一个实施方案中，第一重或轻链可变区通过羧基端肽键与第一效应器模块，优选地单链效应器模块连接，并且通过氨基端肽键与第二重或轻链可变区进一步连接。在另一个实施方案中，第一重或轻链可变区通过氨基端肽键与第一效应器模块，优选地单链效应器模块连接，并且通过羧基端肽键与第二重或轻链可变区进一步连接。
在一个实施方案中，效应器模块，优选地单链效应器模块与第一Fab重或轻链共享羧基端肽键，并且与第二Fab重或轻链进一步共享氨基端肽键。在另一个实施方案中，第一Fab重或轻链与第一单链效应器模块共享羧基端肽键，并且与第二Fab重或轻链进一步共享氨基端肽键。在其它实施方案中，第一Fab重或轻链与第一单链效应器模块共享氨基端肽键，并且与第二Fab重或轻链进一步共享羧基端肽键。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少第一效应器模块，其与一个或多个scFv分子共享氨基端肽键，且其中第一效应器模块与一个或多个scFv分子进一步共享羧基端肽键。在一个优选的实施方案中，效应器模块是单链效应器模块。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少第一效应器模块，优选地单链效应器模块，和第一和第二抗原结合模块，其中每个抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包括免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，且其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与第一效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。在一个优选的实施方案中，恒定区独立地选自下组：IgG CH1、IgG CH2、IgG CH3、IgG Cκ、IgG Cλ和IgE CH4域。在一个实施方案中，第一抗原结合模块的免疫球蛋白域经由二硫键与第二抗原结合模块的免疫球蛋白域共价连接。在一个实施方案中，至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的羧基端。在另一个实施方案中，至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基端。在另一个实施方案中，至少两个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基端。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块，其每个包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG CH1域的恒定区连接的scFv分子，其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与第一效应器模块，优选地单链效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块可以在其羧基端氨基酸处与第二效应器模块的氨基端氨基酸进一步连接。在一个实施方案中，第二效应器模块是单链效应器模块。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块，其每个包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG Cκ域的恒定区连接的scFv分子，其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与第一效应器模块，优选地单链效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块可以在其羧基端氨基酸处与第二效应器模块的氨基端氨基酸进一步连接。在一个实施方案中，第二效应器模块是单链效应器模块。
在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块，其每个包含在其羧基端氨基酸处与包含IgE CH4域的恒定区连接的scFv分子，其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与第一效应器模块，优选地单链效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块可以在其羧基端氨基酸处与第二效应器模块的氨基端氨基酸进一步连接。在一个实施方案中，第二效应器模块是单链效应器模块。
在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块，其每个包含在其羧基端氨基酸处与IgE CH3域连接的scFv分子，其中第一抗原结合模块在其羧基端氨基酸处与第一效应器模块，优选地单链效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块可以在其羧基端氨基酸处与第二效应器模块的氨基端氨基酸进一步连接。在一个实施方案中，第二效应器模块是单链效应器模块。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含第一和第二效应器模块，和第一和第二抗原结合模块，其中每个抗原结合模块包含在其重或轻链羧基端氨基酸处与IgG1 CH3域连接的Fab分子，且其中每个IgG1 CH3域在其相应羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二效应器模块是单链效应器模块。在又一个实施方案中，抗原结合模块的IgG1 CH3域可以通过二硫键连接。在另一个实施方案中，至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的IgG1 CH3域的羧基端。在另一个实施方案中，至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的IgG1 CH3域的氨基端。在另一个实施方案中，至少两个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的IgG1CH3域的氨基端。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含位于效应器模块与抗原结合模块间的一个或多个蛋白水解切割位点。
可以直接或者经由本文中所描述的或本领域中已知的各种接头(例如，包含一个或多个氨基酸，通常约2-10个氨基酸的肽接头)连接免疫缀合物的构件(例如，抗原结合模块和/或效应器模块)。
在一个具体的实施方案中，特别地与已知的免疫缀合物制备物相比，免疫缀合物在溶液中具有改善的稳定性。在一个实施方案中，免疫缀合物以比对照抗原结合模块的解离常数低至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25倍的解离常数(KD)结合抗原决定簇。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物以比对照抗原结合模块的KD低约10倍的KD结合抗原决定簇。在一个实施方案中，免疫缀合物以低于约10nM，低于约1nM，或低于约0.1nM的KD结合抗原决定簇。
在另一个实施方案中，与已知的免疫缀合物制备物相比，所述免疫缀合物具有卓越的安全性。优选地，所述免疫缀合物引发更少且不太严重的副作用，诸如毒性、对非肿瘤细胞的破坏等。副作用的降低可以归因于本发明的免疫缀合物对效应器模块受体的结合亲和力降低。在一个实施方案中，免疫缀合物以比对照效应器模块的KD大至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25倍的KD结合效应器模块受体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物以比对照效应器模块的KD大大约2倍的KD结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，免疫缀合物以比对照效应器模块的KD大大约10倍的KD结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，免疫缀合物以比“双抗体”免疫缀合物分子中的相应效应器模块的KD大至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍的KD结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，免疫缀合物以比“双抗体”免疫缀合物分子中的相应效应器模块的解离常数大大约10倍的解离常数KD结合效应器模块受体。
在另一个实施方案中，特别地与已知的免疫缀合物制备物相比，所述免疫缀合物具有卓越的功效。在一个实施方案中，免疫缀合物更好地能够抑制体内肿瘤体积增加和/或更好地能够延长患有恶性肿瘤的哺乳动物中的存活。在一个实施方案中，到约至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天的施用期结束，免疫缀合物将体内肿瘤体积增加抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％。在一个实施方案中，到13天施用期结束，免疫缀合物将体内肿瘤体积增加抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、或75％。在另一个实施方案中，相对于对照效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在另一个实施方案中，相对于对照效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少30％、32％或35％。在另一个实施方案中，相对于对照效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少约30％。在另一个实施方案中，相对于“双抗体”免疫缀合物分子中的效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在另一个实施方案中，相对于“双抗体”免疫缀合物分子中的效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少30％、32％、或35％。在另一个实施方案中，相对于“双抗体”免疫缀合物分子中的效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长约30％。在另一个实施方案中，相对于对照效应器模板或“双抗体”免疫缀合物分子中的效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时，免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少5％、10％或15％。
抗原结合模块
本发明的免疫缀合物的抗原结合模块一般是结合特定的抗原决定簇，并且能够将其附着的实体(例如效应器模板或第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如携带抗原决定簇的肿瘤细胞或肿瘤基质的特定类型的多肽分子。免疫缀合物可以结合例如在肿瘤细胞表面上，病毒感染细胞的表面上、其它患病细胞的表面上、在血液血清中游离和/或在胞外基质(ECM)中找到的抗原决定簇。
肿瘤抗原的非限制性例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠关联抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-zeta链、MAGE-肿瘤抗原家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3，、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE-肿瘤抗原家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-链蛋白、β-链蛋白和γ-链蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头瘤病毒蛋白、Smad肿瘤抗原家族、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7和c-erbB-2。
病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、埃巴病毒LMP-1、丙肝病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。
ECM抗原的非限制性例子包括粘结蛋白聚糖、类肝素酶、整联蛋白、骨桥蛋白、Link、钙粘着蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白EGF型、凝集素、纤连蛋白、Notch、生腱蛋白和基质蛋白酶。
本发明的免疫缀合物可以结合细胞表面抗原的下列特定的非限制性例子：FAP、Her2、EGFR、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR结合的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30(细胞因子受体)、CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、MCSP和PDGFβR(β血小板衍生的生长因子受体)。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合模块，其中每个这些抗原结合模块特异性结合同一抗原决定簇。在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合模块，其中每个这些抗原结合模块特异性结合不同抗原决定簇。
抗原结合模块可以是任何类型的抗体或其保留对抗原决定簇的特异性结合的片段。抗体片段包括但不限于VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体、双抗体、三抗体和四抗体(见例如Hudson和Souriau，Nature Med.9：129-134(2003))。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其对纤连蛋白的额外域B(EDB)是特异性的。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其可以与单克隆抗体L19竞争对EDB表位的结合。见例如PCT公开文本WO2007/128563A1(通过提及而将其完整收入本文)。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与IL-2分子共享羧基端肽键，所述IL-2分子继而与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与IL-12分子共享羧基端肽键，所述IL-12分子继而与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与IFN α分子共享羧基端肽键，所述IFN α分子继而与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与GM-CSF分子共享羧基端肽键，所述GM-CSF分子继而与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的第一scFv与IL-12分子共享羧基端肽键，所述IL-12分子继而与自L19单克隆抗体衍生的第二scFv共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：95或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含自L19单克隆抗体衍生的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：96至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：104至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：96至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：105至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：96至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：106至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ IDNO：106和SEQ ID NO：96至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：107至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：96至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，多肽通过例如二硫键共价连接。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其对生腱蛋白的A1域(TNC-A1)是特异性的。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其可以与单克隆抗体F16竞争对TNC-A1表位的结合。见例如PCT公开文本WO 2007/128563A1(通过提及而将其完整收入本文)。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其对生腱蛋白的A1和/或A4域(TNC-A1或TNC-A4或TNC-A1/A4)是特异性的。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对生腱蛋白的A1域特异性的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFN α分子或GM-CSF分子共享羧基端肽键，所述分子继而与对生腱蛋白的A1域特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对生腱蛋白的A1域特异性的第一Fab重链与IL-2分子共享羧基端肽键，所述IL-2分子继而与对生腱蛋白的A1域特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对生腱蛋白的A1域特异性的第一scFv与IL-2分子共享羧基端肽键，所述IL-2分子继而与对生腱蛋白的A1域特异性的第二scFv共享羧基端肽键。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：11至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由与SEQ ID NO：14或SEQ IDNO：16至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16编码。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12编码。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含与SEQ IDNO：99至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：215至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ IDNO：101或SEQ ID NO：235至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：112至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQID NO：112编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：216至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：216编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQID NO：114或SEQ ID NO：236至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：114或SEQ ID NO：236编码的多肽序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其对生腱蛋白的A2域(TNC-A2)是特异性的。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对生腱蛋白的A2域特异性的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFN α分子或GM-CSF分子共享羧基端肽键，所述分子继而与对生腱蛋白的A2域特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对生腱蛋白的A2域特异性的第一Fab重链与IL-2分子共享羧基端肽键，所述IL-2分子继而与对生腱蛋白的A2域特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：191、SEQID NO：195、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：207，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：205，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：199、SEQID NO：203和SEQ ID NO：207，或其保留功能性的变体，和与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：205，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：184、SEQ IDNO：188、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由与选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：194、SEQID NO：198、SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：206。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由与选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：198、SEQID NO：202和SEQ ID NO：206。在一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：243的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：249的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：243的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体，和与选自SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：249的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：239和SEQ ID NO：247或SEQ ID NO：249至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列，或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：245或SEQ ID NO：247至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：243和SEQ ID NO：245至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与选自SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：244的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242和SEQ IDNO：244。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248和SEQ ID NO：250。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248和SEQ ID NO：250。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其对成纤维细胞激活蛋白(FAP)是特异性的。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对FAP特异性的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共享羧基端肽键，所述分子继而与对FAP特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对FAP特异性的第一Fab重链与IL-2分子共享羧基端肽键，所述IL-2分子继而与对FAP特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对FAP特异性的第一Fab重链与IL-12分子共享羧基端肽键，所述IL-12分子继而与对FAP特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：73，SEQ IDNO：77，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：135，SEQID NO：139，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：175，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：67，SEQ IDNO：71，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：129，SEQ IDNO：133，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：173，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31，SEQID NO：35，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：127，SEQID NO：131，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：175，或其保留功能性的变体，和与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：91，SEQ IDNO：121，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：169和SEQID NO：173，或其保留功能性的变体，在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码：SEQID NO：22，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ IDNO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：148，SEQID NO：152，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：176。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ IDNO：132，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：176。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ IDNO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：142，SEQID NO：146，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：174。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：122，SEQ IDNO：126，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：174。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：209，SEQ ID NO：211，SEQ ID NO：213，SEQ ID NO：217，SEQID NO：219，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：225和SEQ IDNO：227，或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：231、SEQID NO：233和SEQ ID NO：237或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：221或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：231至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列：SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：223、SEQID NO：225和SEQ ID NO：227或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：229至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在一个别的具体实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：233至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：237至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：231至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：229至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：229至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在又一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：227和SEQ ID NO：229至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的两个多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：214，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：222，SEQID NO：224，SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：228。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ IDNO：210，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：214，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：224，SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：228。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234和SEQ IDNO：238。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：238。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个抗原结合模块，其对黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)是特异性的。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对MCSP特异性的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共享羧基端肽键，所述分子继而与对MCSP特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列，其中对MCSP特异性的第一Fab重链与IL-2分子共享羧基端肽键，所述IL-2分子继而与对MCSP特异性的第二Fab重链共享羧基端肽键。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与序列SEQ ID NO：257或SEQ ID NO：261至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与序列SEQ IDNO：259或SEQ ID NO：271至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与序列SEQ ID NO：257或SEQID NO：261至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体，和与序列SEQ ID NO：259或SEQ ID NO：271至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与序列SEQ ID NO：257至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与序列SEQ ID NO：259至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与序列SEQ ID NO：261至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与序列SEQ ID NO：259至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由与序列SEQ ID NO：258或SEQ ID NO：262至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：258或SEQ ID NO：262编码。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由与序列SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：272至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：260或SEQ IDNO：272编码。在一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ IDNO：251或SEQ ID NO：255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：265至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：251或SEQ ID NO：255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ IDNO：253或SEQ ID NO：265至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：251至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：253至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：253至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：256至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：256编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO：254或SEQ ID NO：266至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：254或SEQ ID NO：266编码的多肽序列。
在一个实施方案中，抗原结合模块至少包含能够结合抗原决定簇的可变区。可用于本发明的非限制性可变区可以是鼠、灵长类、或人起源的。人可变区可以自通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体衍生。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系已经由例如Kozbor等，J Immunol.133：3001-3005(1984)及Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，第51页-第63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)描述。也可以通过转基因动物(例如，小鼠)来生成人可变区，所述转基因动物在免疫后能够在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体全集。例如，已经描述了，嵌合和种系突变体小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致对内源抗体生成的完全抑制。一批人种系免疫球蛋白基因在此类种系突变体小鼠中的转移会导致抗原攻击后的人抗体生成。见例如Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)。
或者，可以使用噬菌体展示来从例如来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集在体外生成人抗体和人可变区。(McCafferty等，Nature348：552-554(1990))。在此技术的一个例子中，将抗体V域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体，诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上以功能性抗体片段展示。
因为丝状颗粒含有单链DNA拷贝的噬菌体基因组，所以基于抗体/抗体片段的功能特性的选择也导致编码展现出那些特性的抗体/抗体片段的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。可以以多种形式实施噬菌体展示。关于噬菌体展示形式的综述，见Hoogenboom等，Nucleic Acids Res.19：4133-4137(1991)。可以使用V基因区段的数个来源来进行噬菌体展示。Clackson等从自经免疫小鼠的脾衍生的V基因小型随机组合文库分离了一批不同的抗唑酮抗体。见Clackson等，Nature 352：624-628(1991)。可构建来自未免疫人供体的V基因全集，并且可分离针对一批不同抗原(包括自身抗原)的抗体，基本上遵循Marks等，J.Mol.Bio.222：581-597(1991)所记载的技术进行。在天然的免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高突变)。所引入的一些变化会赋予更高的亲和力，并且展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先在随后的抗原攻击期间复制和分化。此天然过程可以通过采用称为“链改组”的技术来模拟。见Marks等，Biotech.10：779-783(1992)。在此方法中，通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体或可变区的亲和力可以通过用自未免疫供体获得的天然存在的V域基因变体(全集)的全集序贯替换重和轻链V区基因而得到改善。此技术容许生成具有在nM范围中的亲和力的抗体和可变区。用于生成非常大的噬菌体抗体全集的策略已经由Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述，并且Griffith等，J.Cell.Bio.120：885-896(1993)已经报告了自此类大的噬菌体文库直接分离高亲和力人抗体。基因改组也可以用于自啮齿类抗体衍生人抗体和可变区，其中人抗体或可变区与起始啮齿类抗体或可变区具有相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，通过噬菌体展示技术获得的啮齿类抗体的重或轻链V域基因用人V域基因全集替换，创建啮齿类-人嵌合物。用抗原进行的选择导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位决定(印记，imprint)配偶的选择。在重复该过程以替换剩余的啮齿类V域时，获得人抗体(见PCT公开文本WO 93/06213)。与传统的啮齿类抗体的人源化不同，表位印记技术提供完全人的抗体或可变区，它们不含啮齿类起源的框架或CDR残基。
可以使用的可变区还包含已经灵长类化或人源化的鼠可变区序列或已经人源化的灵长类可变区序列。如本文中所使用的，术语“人源化的”指自非人抗体，例如，鼠抗体衍生的抗原结合模块可变区序列，其保留或基本上保留亲本分子的抗原结合特性，但是其在人中免疫原性较小。这可以通过多种方法来实现，包括(a)仅将非人CDR在保留或不保留至关重要的框架残基(例如，那些对于保留良好的抗原结合亲和力或抗原功能重要的残基)的情况中嫁接至人框架区上，和(b)通过替换表面残基用人样部分“掩盖”非人可变区。此类方法由Jones等，Morrison等，.Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)披露，通过提及而将它们都完整收入本文。抗体的每个重和轻链可变区中一般存在着3个互补决定区，或CDR，(CDR1、CDR2和CDR3)，其在抗体的每个重和轻链可变域中侧翼有四个框架亚区(即，FR1、FR2、FR3和FR4)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。具有人源化可变区的抗体的讨论可见美国专利No.6,632,927及公布的美国申请No.2003/0175269等，通过提及而将这两者都完整收入本文。
类似地，如本文中所使用的，术语“灵长类化的”用于指自非灵长类抗体，例如，鼠抗体衍生的抗原结合模块可变区，其保留或基本上保留亲本分子的抗原结合特性，但是其在灵长类中的免疫原性较小。
在生成人源化抗原结合模块中的人可变域(轻和重两者)的选择对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最佳拟合(best-fit)”方法，针对已知的人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗原结合模块可变区序列。然后，接受与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗原结合模块的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。选择人框架序列的另一种方法是将完全啮齿类框架(即FR1、FR2、FR3和FR4)的每个个别亚区或个别亚区(例如，FR1和FR2)的一些组合的序列针对与所述框架亚区对应的已知人可变区序列(例如，如由Kabat编号确定的)文库比较，并选择与啮齿类最接近的每个亚区或组合的人序列(美国专利申请公开文本No.2003/0040606A1)。另一种方法使用自轻或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。可以对几种不同人源化抗原结合模块使用相同框架(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
一般地，本发明的免疫缀合物的抗原结合模块保留针对特定抗原决定簇的高亲和力和其它有利的生物学特性。因而，使用亲本和人源化序列的三维模型通过分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化可变区。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且对于本领域技术人员是熟悉的。计算机程序是可获得的，其例示并展示选定的候选免疫球蛋白可变区序列的可能的三维构象结构。对这些展示的研究容许分析残基在候选免疫球蛋白可变区序列的运行中的可能作用，即分析影响候选可变区序列结合其抗原的能力的残基。这样，可以自接受和输入序列选择FR残基并组合，从而实现期望的抗原结合模块特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般地，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
在另一个实施方案中，依照例如美国专利申请公开文本No.2004/0132066(在此通过提及而收录其全部内容)中所披露的方法来工程化改造本发明的抗原结合分子以具有增强的结合亲和力。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等，Glyco.J.17：323-329(2000))，及传统的结合测定法(Heeley，R.P.，Endocr.Res.28：217-229(2002))来测量本发明的免疫缀合物结合效应器模块受体或特定抗原决定簇的能力。
效应器模块
一般地，本发明中使用的效应器模块是例如经由信号转导途径影响细胞活性的多肽。因而，本发明的免疫缀合物的效应器模块可以与受体介导的信号传导有关，所述受体介导的信号传导自细胞膜外部转送信号以调控细胞内的应答。例如，免疫缀合物的效应器模块可以是细胞因子。在一个具体的实施方案中，效应器模块是单链效应器模块，如本文中所限定的。在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物的一个或多个效应器模块，通常为单链效应器模块是选自下组的细胞因子：IL-2、GM-CSF、IFN-α和IL-12。在另一个实施方案中，免疫缀合物的一个或多个单链效应器模板是选自下组的细胞因子：IL-8、MIP-1α、MIP-1β和TGF-β。
在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是IL-2。在一个具体的实施方案中，IL-2效应器模块可以引起一种或多种选自下组的细胞应答：活化的T淋巴细胞细胞中的增殖、活化的T淋巴细胞细胞中的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化的B细胞中的增殖、活化的B细胞中的分化、天然杀伤(NK)细胞中的增殖、NK细胞中的分化和NK/淋巴细胞活化的杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是GM-CSF。在一个具体的实施方案中，GM-CSF效应器模块可以引发粒细胞、单核细胞或树突细胞中的增殖和/或分化。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是IFN-α。在一个具体的实施方案中，IFN-α效应器模块可以引发选自下组的一种或多种细胞应答：抑制病毒感染细胞中的病毒复制和上调主要组织相容性复合体I(MHC I)的表达。在另一个具体的实施方案中，IFNα效应器模块可以抑制肿瘤细胞中的增殖。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是IL-12。在一个具体的实施方案中，IL-12效应器模块可以引发选自下组的一种或多种细胞应答：NK细胞中的增殖、NK细胞中的分化、T细胞中的增殖和T细胞中的分化。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是IL-8。在一个具体的实施方案中，IL-8效应器模块可以引发嗜中性粒细胞中的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是MIP-1α。在一个具体的实施方案中，MIP-1α效应器模块可以引发单核细胞和T淋巴细胞细胞中的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是MIP-1β。在一个具体的实施方案中，MIP-1β效应器模块可以引发单核细胞和T淋巴细胞细胞中的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，优选地单链效应器模块是TGF-β。在一个具体的实施方案中，TGF-β效应器模块可以引发选自下组的一种或多种细胞应答：单核细胞中的趋化性、巨噬细胞中的趋化性、上调活化的巨噬细胞中的IL-1表达、及上调活化的B细胞中的IgA表达。
免疫缀合物多肽和多核苷酸
本发明的免疫缀合物包含多肽及其片段。如本文中所使用的，术语“多肽”意图涵盖单数个“多肽”及复数个“多肽”，并且指由通过酰胺键(又称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不指产物的特定长度。如此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其它术语包含在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以替换任何这些术语或与任何这些术语可互换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然生物来源衍生或者通过重组技术生成，但是不必自指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式，包括通过化学合成生成。
本发明的多肽可以具有约3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多、1,000或更多、或2,000或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定三维结构的多肽称为折叠的，而不拥有限定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽称为未折叠的。
“分离的”多肽或其变体或衍生物意指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以自其天然的或自然的环境取出。出于本发明的目的，认为宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质是分离的，已经通过任何合适的技术分开、分级，或部分或基础上纯化的天然或重组多肽亦然。
也作为本发明的多肽包括的是前述多肽的衍生物、类似物、或变体，及其任何组合。在提及本发明的多肽时，术语“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应的天然多肽的至少一些生物学、抗原、或免疫原性特性的任何多肽。本发明的多肽的变体包括由于氨基酸替代、删除、或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或者是非天然存在的。可以使用本领域已知的诱变技术来生成非天然存在的变体。变体多肽可以包含保守的或非保守的氨基酸替代、删除或添加。本发明的多肽衍生物是已经进行过改变，从而展现出天然多肽上没有找到的其它特征的多肽。例子包括融合蛋白。变体多肽在本文中又可以称为“多肽类似物”。如本文中所使用的，多肽的“衍生物”指具有通过功能性侧链基团的反应化学衍生的一个或多个残基的多肽。也作为“衍生物”包括的是那些含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，可以用4-羟基脯氨酸替换脯氨酸；可以用5-羟基赖氨酸替换赖氨酸；可以用3-甲基组氨酸替换组氨酸；可以用高丝氨酸替换丝氨酸；及用鸟氨酸替换赖氨酸。
或者，可以通过利用遗传密码中的“冗余”来合成或选择编码这些相同或相似多肽的重组变体。可以引入各种密码子替代，诸如生成各种限制性位点的沉默变化来优化对质粒或病毒载体的克隆或在特定原核或真核系统中的表达。可以在多肽或对多肽添加的其它肽的域中反映多核苷酸序列中的突变以修饰多肽的任何部分的特性，改变诸如配体结合亲和力、链间亲和力、或降解/周转速率等特征。
优选地，氨基酸“替代”是将一个氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换，即保守氨基酸替换的结果。“保守”氨基酸替代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质产生。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。优选地，“插入”或“删除”的范围为约1至约20个氨基酸，更优选地，1至10个氨基酸。可以通过使用重组DNA技术来系统性生成多肽分子中的氨基酸插入、删除、或替代，并对所得的重组变体测定活性来以实验确定所容许的变异。
具有与本发明的询问氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽意指主题多肽的氨基酸序列与询问序列相同，只是主题多肽序列可以按询问氨基酸序列的每100个氨基酸包含多至5处氨基酸变化。换言之，为了获得具有与询问氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可以将主题序列中的多至5％的氨基酸残基插入、删除、或用另一个氨基酸替换。参照序列的这些变化可以在参照氨基酸序列的氨基或羧基端位置或者在那些末端位置间的任何地方发生，个别地在参照序列中的残基间或在参照序列内的一个或多个连续组中散布。
实际上，可以使用已知的计算机程序来常规地测定任何特定的多肽是否与参照多肽至少80％、85％、90％、95％、96，％、97％、98％、或99％相同。可以使用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定用于测定询问序列(本发明的序列)与主题序列间的最好的总体匹配的优选方法(又称为全局序列比对)。在序列比对中，询问和主题序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果以百分比同一性计。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝PAM0，k-元组＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化组长度＝0，截留得分＝1，窗大小＝序列长度，缺口罚分＝5，缺口大小罚分-0.05，窗大小＝500或主题氨基酸序列的长度(无论哪个较短)。
若主题序列由于N或C端删除，不是由于内部删除而比询问序列短，则必须对结果做出手动改正。这是因为FASTDB程序在计算全局百分比同一性时不考虑主题序列的N和C端截短。对于在N和C端截短的主题序列，相对于询问序列，通过以占询问序列总碱基的百分比计算在主题序列的N和C端且不与相应的主题残基匹配/比对的询问序列残基的数目来改正百分比同一性。通过FASTDB序列比对的结果来测定残基是否得到匹配/比对。然后，自使用规定的参数通过上述FASTDB程序计算的百分比同一性扣除此百分比，以达到最终的百分比同一性得分。此最终的百分比同一性得分是出于本发明的目的使用的。为了手动调节百分比同一性得分，仅考虑在主题序列的N和C端且不与询问序列匹配/比对的残基。也就是说，仅仅主题序列的最远的N和C端残基外部的询问残基位置。
例如，比对90个氨基酸残基的主题序列与100个残基的询问序列以测定百分比同一性。在主题序列的N端发生删除，并且因此，FASTDB比对没有显示N端的前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基占序列的10％(不匹配的N和C端残基数目/询问序列中的残基总数)，因此自通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分扣除10％。若剩余的90个残基完全匹配，则最终的百分比同一性会是90％。在另一个例子中，比较90个残基的主题序列与100个残基的询问序列。这次，删除是内部删除，因此没有在主题序列的N或C端且不与询问物匹配/比对的残基。在此情况中，没有手动改正通过FASTDB计算的百分比同一性。再一次，仅仅手动改正在主题序列的N和C端末端外部(如FASTDB比对中展现的)且不与询问序列匹配/比对的残基位置。出于本发明的目的，不要做出其它手动改正。
本发明的多肽包括那些与下文表3和4中所列的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的多肽，包括其功能性片段或变体。本发明还涵盖包含表3或4的序列且具有保守氨基酸替代的多肽。
本发明的多肽可以由单一多核苷酸编码。或者，其可以由多个(例如，两个或更多个)多核苷酸编码，从而共表达多肽。自多个多核苷酸共表达的多肽可以经由例如二硫键或其它手段结合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗原结合模块的重链部分可以由与包含抗原结合模块的轻链部分和效应器模块的免疫缀合物部分的不同多核苷酸编码。在共表达时，重链多肽会与轻链多肽结合以形成抗原结合模块。或者，在另一个例子中，抗原结合模块的轻链部分可以由与包含抗原结合模块的重链部分和效应器模块的免疫缀合物部分的不同多核苷酸编码。
一般地，本发明的免疫缀合物及其片段由多核苷酸编码。术语“多核苷酸”意图涵盖单数个核酸及复数个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生的RNA、或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，诸如肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸”指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经自其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，认为载体中含有的编码治疗性多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的其它例子包括异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分或实质性)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，及本文中所公开的瘟病毒的正和负链形式，和双链形式。
依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或者可以包含调节元件，诸如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
如本文中所使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不被翻译成氨基酸，但是可以认为它是编码区的一部分(若存在的话)，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或者在分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载体可以编码一个或多个多蛋白质，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译地分开为最终的蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸、或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的免疫缀合物或其变体或衍生物的第一或第二核酸融合或未融合。异源编码区包含但不限于专门的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况中，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包含与一个或多个编码区可操作结合的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作结合指此时基因产物(例如多肽)的编码区以如下的方式与一个或多个调节序列结合，使得将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。若启动子功能的诱导导致编码期望基因产物的mRNA转录，且若两个DNA片段间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或者不干扰转录DNA模板的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其结合的启动子)是“可操作结合的”。如此，若启动子能够实现所述核酸的转录，则启动子区会与编码多肽的核酸可操作结合。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子外，其它转录控制元件，例如增强子、操纵基因、阻抑物和转录终止信号可以与多核苷酸可操作结合以指导细胞特异性转录。本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。
多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如，立即早期启动子，与内含子A一起)、猿病毒40(例如，早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因，诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔β-珠蛋白衍生的，及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子及淋巴因子诱导型启动子(例如，干扰素或白介素可诱导的启动子)。
类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和自病毒系统衍生的元件(特别地内部核糖体进入位点，或IRES，又称为CITE序列)。
在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，为信使RNA(mRNA)形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的别的编码区联合。所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽分泌。依照信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌信号序列，其在一旦已经启动生长中的蛋白质链穿过粗面内质网的输出便自成熟蛋白质切割。本领域普通技术人员知道，由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N端融合的信号肽，其自完整的或“全长”多肽切割以生成分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者所述序列的功能性衍生物，其保留指导与其可操作结合的多肽的分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽，或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替换。
术语“表达盒”指具有一系列容许特定核酸在靶细胞中转录的规定核酸元件的重组或合成生成的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒、或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子等。在一个实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“表达载体”与“表达构建体”同义，并且指用于对靶细胞引入与其可操作结合的特定基因并指导表达的DNA分子。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内部，细胞转录和/或翻译机器生成由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“人工的”指合成的，或非宿主细胞衍生的组成，例如，化学合成的寡核苷酸。
具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只是多核苷酸序列可以按参照核苷酸序列的每100个核苷酸包含多至5处点突变。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参照序列中的多至5％的核苷酸删除或用另一个核苷酸替换，或者可以将占参照序列中的总核苷酸的多至5％的核苷酸数目插入参照序列中。
实际上，可以使用已知的计算机程序来常规地测定任何特定的核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80％、85％、90％、95％、96，％、97％、98％、或99％相同。可以使用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定用于测定询问序列(本发明的序列)与主题序列间的最好的总体匹配的优选方法(又称为全局序列比对)。在序列比对中，询问和主题序列都是DNA序列。可以通过将U转化成T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以百分比同一性计。对DNA序列进行FASTDB比对以计算百分比同一性中使用的优选参数是：矩阵＝一元，k-元组＝4，错配罚分＝1，连接罚分-30，随机化组长度＝0，截留得分＝1，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗大小＝500或主题核苷酸序列的长度(无论哪个较短)。
若主题序列由于5’或3’删除，不是由于内部删除而比询问序列短，则必须对结果做出手动改正。这是因为FASTDB程序在计算全局百分比同一性时不考虑主题序列的5’和3’截短。对于在5’或3’端截短的主题序列，相对于询问序列，通过以占询问序列总碱基的百分比计算在主题序列的5’和3’且不匹配/比对的询问序列碱基的数目来改正百分比同一性。通过FASTDB序列比对的结果来测定是否匹配/比对核苷酸。然后，自使用规定的参数通过上述FASTDB程序计算的百分比同一性扣除此百分比，以达到最终的百分比同一性得分。此改正的得分是出于本发明的目的使用的。为了手动调节百分比同一性得分，仅计算在主题序列的5’和3’碱基外部(如通过FASTDB比对展示的)且不与询问序列匹配/比对的碱基。
例如，比对90个碱基的主题序列与100个碱基的询问序列以测定百分比同一性。在主题序列的5’端发生删除，并且因此，FASTDB比对没有显示5’端的前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基占序列的10％(不匹配的5’和3’端碱基数目/询问序列中的碱基总数)，因此自通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分扣除10％。若剩余的90个碱基完全匹配，则最终的百分比同一性会是90％。在另一个例子中，比较90个碱基的主题序列与100个碱基的询问序列。这次，删除是内部删除，从而没有在主题序列的5’或3’且不与询问物匹配/比对的碱基。在此情况中，没有手动改正通过FASTDB计算的百分比同一性。再一次，仅仅手动改正在主题序列的5’和3’且不与询问序列匹配/比对的碱基。出于本发明的目的，不要做出其它手动改正。
本发明的多核苷酸包括那些与下文表6和8中所列的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的，包括其功能性片段或变体。可以以编码整个免疫缀合物的单一多核苷酸或者以共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸表达多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段结合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗原结合模块的重链部分可以由与包含抗原结合模块的轻链部分和效应器模块的免疫缀合物部分的不同多核苷酸编码。在共表达时，重链多肽会与轻链多肽结合以形成抗原结合模块。或者，在另一个例子中，抗原结合模块的轻链部分可以由与包含抗原结合模块的重链部分和效应器模块的免疫缀合物部分的不同多核苷酸编码。
在一个具体的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含至少一个效应器模块，优选地单链效应器模块，和至少一个，优选地两个或更多个抗原结合模块的免疫缀合物片段，其中第一效应器模块与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，而第二抗原结合模块与第一效应器模块或第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键。在一个优选的实施方案中，抗原结合模块独立选自下组：Fv和Fab。在另一个具体的实施方案中，多核苷酸编码抗原结合模块中两个的重链和效应器模块之一。在另一个具体的实施方案中，多核苷酸编码抗原结合模块中两个的轻链和效应器模块之一。在另一个具体的实施方案中，多核苷酸编码来自抗原结合模块之一的一条轻链、来自第二抗原结合模块的一条重链和效应器模块之一。
在另一个具体的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码两个Fab分子的重链和效应器模块，优选地单链效应器模块。在另一个具体的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码两个Fab分子的轻链和效应器模块，优选地单链效应器模块。在另一个具体的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码一个Fab分子的重链、第Fab分子的轻链和效应器模块，优选地单链效应器模块。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含在其氨基和羧基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接的至少一个效应器模块，优选地单链效应器模块的免疫缀合物。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含至少一个效应器模块，优选地单链效应器模块和至少第一和第二抗原结合模块的免疫缀合物片段，其中每个抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域独立选自下组：IgG1CH1、IgG Cκ和IgE CH4，且其中抗原结合模块之一在其恒定区羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由二硫键共价连接。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码抗原结合模块之一和效应器模块，优选地单链效应器模块。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含第一和第二效应器模块和两个抗原结合模块的免疫缀合物片段，其中每个抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，且其中抗原结合模块之一在其恒定区羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第二抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与第二效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由二硫键共价连接。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二效应器模块是单链效应器模块。在一个优选的实施方案中，恒定域独立选自下组：IgG1 CH1、IgG Cκ和IgE CH4。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码抗原结合模块之一和效应器模块之一。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含至少一个效应器模块，优选地单链效应器模块，和至少第一和第二抗原结合模块的免疫缀合物片段，其中每个抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与IgG CH3域连接的scFv分子，且其中抗原结合模块之一在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由二硫键共价连接。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码抗原结合模块之一和效应器模块，优选地单链效应器模块。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含两个效应器模块和两个抗原结合模块的免疫缀合物片段，其中每个抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与IgG CH3域连接的scFv分子，且其中抗原结合模块之一在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第二抗原结合模块在其羧基端氨基酸处与第二效应器模块的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由二硫键共价连接。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二效应器模块是单链效应器模块。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码抗原结合模块之一和效应器模块之一，优选地单链效应器模块。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码包含两个效应器模块和两个抗原结合模块的免疫缀合物片段，其中每个抗原结合模块包含在其重或轻链羧基端氨基酸处与IgG1 CH3域连接的Fab分子，且其中每个IgG1 CH3域在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由二硫键共价连接。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二效应器模块是单链效应器模块。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码抗原结合模块之一的重链可变区和所述效应器模块之一，优选地单链模块的序列。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码抗原结合模块之一的轻链可变区和所述效应器模块之一，优选地单链效应器模块的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含编码如下文表3中所显示的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含编码如表4中所显示的多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的核酸，其中核酸包含与下文表6和8中所显示的核苷酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的核酸，其中核酸包含表6和8中所显示的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的核酸，其中核酸包含编码与表3中的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的核酸，其中核酸包含编码与表4中的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多肽序列的序列。本发明涵盖编码免疫缀合物或其片段的分离的核酸，其中该核酸包含编码具有保守氨基酸替代的表3所述可变区序列的序列。本发明还涵盖编码本发明免疫缀合物或其片段的分离的核酸，其中该核酸包含编码具有保守氨基酸替代的表4所述多肽序列的序列。
表2.
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表3.
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表4.
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表5.
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表6.
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表7.
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表8.
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宿主细胞
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”指可以工程化改造为生成本发明的免疫缀合物或其片段的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化改造为容许生成免疫缀合物片段。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞、HEK、BHK细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，等等，而且还有转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含表达载体，其包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。本发明的宿主细胞可以是真核的或原核的。
免疫缀合物多肽及其片段的纯化
可以通过本领域已知的技术，诸如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等来纯化本发明的免疫缀合物或其片段。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如静电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员会是显而易见的。
对于亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。或者，对于亲和层析纯化，可以使用特异性结合免疫缀合物的单链效应器模块的任何抗体。对于抗体的生成，可以通过注射本发明的免疫缀合物或其片段来免疫各种宿主动物，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠等。可以依靠侧链功能团或附着于侧链功能团的接头来将免疫缀合物附着于合适的载体，诸如牛血清清蛋白(BSA)。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来提高免疫学应答，包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔
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血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人佐剂诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Cornyebacterium parvum)。因而，一个实施方案包括用于生成本发明的免疫缀合物的方法，其通过在适合于其表达的条件下培养包含表达载体的宿主细胞来进行，所述表达载体包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸。
使用免疫缀合物的方法
本发明的免疫缀合物可用于靶向特定的抗原决定簇，并引发靶标和募集细胞中的各种细胞应答。本发明的免疫缀合物作为诊断试剂也是有用的。可以通过使用对效应器模块特异性的二抗来容易地检测免疫缀合物对抗原决定簇的结合。在一个实施方案中，二抗和免疫缀合物便于检测免疫缀合物对位于细胞或组织表面上的抗原决定簇的结合。
在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明免疫缀合物。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明免疫缀合物以治疗疾病。如本文中所使用的，术语“有效量”定义为导致接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的本发明免疫缀合物的量。如本文中所使用的，术语“治疗有效量”定义为消除、降低、延迟、最小化或阻止疾病的不利影响的本发明免疫缀合物的量。
可以本身或者以药物组合物形式对受试者施用本发明的免疫缀合物。在一个实施方案中，疾病是增殖性病症，诸如癌症。增殖性病症的非限制性例子诸如癌症包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用本发明的免疫缀合物治疗的其它细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物：腹、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和周围)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸区和泌尿生殖系统。还包括癌前状况或病变和癌症转移。类似地，其它细胞增殖病症也可以通过本发明的免疫缀合物治疗。此类细胞增殖病症的例子包括但不限于：高丙球蛋白血症、淋巴增殖性病症、病变蛋白血、紫癜、结节病、塞扎里综合征、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血(Waldenstron’s Macroglobulinemia)、高歇(Gaucher)氏病、组织细胞增多症(histiocytosis)、及除新生物形成外位于上文所列的器官系统中的任何其它细胞增殖疾病。在另一个实施方案中，疾病涉及自身免疫、移植排斥、创伤后免疫应答和传染病(例如HIV)。更具体地，可以在消除免疫细胞介导的病症，包括淋巴瘤；自身免疫、移植排斥、移植物抗宿主疾病、缺血和中风中涉及的细胞中使用免疫缀合物。熟练技术人员容易认可，在许多情况中，免疫缀合物不能提供治愈，而是仅可以提供部分的益处。在一些实施方案中，也认为具有一些益处的生理学变化是治疗有益的。如此，在一些实施方案中，认为提供生理学变化的免疫缀合物量是“有效量”或“治疗有效量”。
需要治疗的受试者、患者、或个体通常是哺乳动物，更具体的是人。
组合物、配制剂、剂量和施用路径
本发明的药物组合物包含有效量的溶解或分散于药学可接受载体中的一种或多种免疫缀合物。短语“药用或药学可接受的”指在适当时对动物，诸如例如人施用时不产生不利的、过敏性的或其它不适当的反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，含有至少一种免疫缀合物和任选地别的活性成分的药物组合物的制备会是本领域技术人员已知的，如由Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company，1990(通过提及而将其收入本文)例示的。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解，制剂应当满足无菌度、致热原性、一般安全性和纯度标准，如由FDA生物标准部或其它国家的相应权力机构要求的。
如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂、缓冲液、分散介质、涂层材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料等物质及其组合，如本领域普通技术人员会知道的(见例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，第18版Mack Printing Company，1990，第1289页-第1329页，通过提及而收入本文)。除非任何常规的载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗剂或药物组合物中的使用。
免疫缀合物可以包含不同类型的载体，这取决于它是否要以固体、液体或气雾剂形式施用，及它对于诸如注射等施用路径是否需要是无菌的。可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、表面、局部、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸泡靶细胞的局部灌注、经由导管、通过灌洗、在乳剂中、在脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过其它方法或前述的任何组合施用本发明，如本领域普通技术人员会知道的(见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company，1990，通过提及而将其收入本文)。最常使用胃肠外施用，特别地静脉内注射来施用多肽分子诸如本发明的免疫缀合物。
对受试者施用的本发明组合物的实际剂量量可以由身体和生理学因素诸如体重、状况的严重性、所治疗疾病的类型、先前的或同时的治疗性干预、患者的自发病及根据施用路径确定。无论如何，负责施用的从业人员会为个体受试者决定组合物中的活性成分浓度和合适的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如，至少约0.1％的本发明的免疫缀合物。在其它实施方案中，免疫缀合物可以包含约2％至约75％间的单位重量，或约25％至约60％，例如，这其中的任何范围。在其它非限制性例子中，所述剂量还可以包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000mg/kg/体重或更多，及来源于其中的任何范围。在来自本文中所列的数目的可衍生范围的非限制性例子中，基于上文所描述的数目，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
在任何情况中，组合物可以包含延迟一种或多种组分氧化的各种抗氧化剂。另外，可以通过防腐剂，诸如各种抗细菌和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其组合来引起阻止微生物作用。
可以将免疫缀合物配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学可接受盐包括酸加成盐，例如，那些与蛋白质性组分的游离氨基基团形成的，或者与无机酸诸如例如，氢氯酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸形成的。与游离的羧基基团形成的盐也可以自无机碱诸如例如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因衍生。
在组合物为液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇，等等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可以例如通过使用涂层材料，诸如卵磷脂；通过在载体诸如例如液体多元醇或脂质中分散来维持需要的粒度；通过使用表面活性剂诸如例如羟丙基纤维素；或此类方法的组合来维持合适的流动性。在许多情况中，会优选的是，包含等张剂，诸如例如，糖、氯化钠或其组合，和/或缓冲剂以维持生理学可接受的pH值。
在其它实施方案中，可以在本发明中使用滴眼剂、鼻溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂。一般地，此类组合物设计为与靶组织类型相容。在一个非限制性例子中，鼻溶液通常是为了以滴剂或喷雾剂对鼻道施用而设计的水溶液。制备鼻溶液，使得它们在许多方面与鼻分泌物相似，从而维持正常的纤毛作用。如此，在一些实施方案中，鼻水溶液通常是等张的或略微缓冲的，以维持约5.5至约6.5的pH。另外，若需要的话，配制剂中可以包含抗微生物防腐剂，其与那些在眼制剂、药物、或合适的药物稳定剂中使用的类似。例如，各种商业鼻制剂是已知的，并且包含诸如抗生素或抗组胺剂等药物。
在某些实施方案中，制备免疫缀合物以通过诸如口服摄取等路径施用。在这些实施方案中，固体组合物可以包含例如，溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊(例如，硬或软壳明胶胶囊)、持续释放配制剂、含服组合物、锭剂、酏剂、悬浮液、糖浆剂、速溶片、或其组合。可以将口服组合物直接掺入饮食食物。口服施用的优选载体包含惰性稀释剂、可同化的食用载体或其组合。在本发明的其它方面，口服组合物可以作为糖浆剂或酏剂制备。糖浆剂或酏剂可以包含例如，至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、芳香剂、染料、防腐剂、或其组合。
在某些实施方案中，口服组合物可以包含一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、芳香剂、及其组合。在某些实施方案中，组合物可以包含下列一项或多项：粘合剂，诸如例如，黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如，磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、桔味剂等；或前述的组合。在剂量单位形式是胶囊时，在上述类型的材料外，它可以含有载体诸如液体载体。各种其它材料可以以涂层材料或者以其它方式修饰剂量单位的物理形式存在。例如，可以用紫胶、糖或这两者包被片剂、丸剂、或胶囊。
适合于其它施用模式的别的配制剂包括栓剂。栓剂是为了插入直肠、阴道或尿道的各种重量和形状的固体剂量形式，其通常加入药物。插入后，栓剂在腔流体中软化、融化或溶解。一般地，对于栓剂，传统的载体可以包括例如，聚亚烃基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，可以自含有例如范围为约0.5％至约10％，且优选地约1％至约2％的活性成分的混合物形成栓剂。
如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有上文所列举的各种其它成分的合适溶剂中掺入需要量的本发明的免疫缀合物，接着进行过滤灭菌。一般而言，分散体通过将各种经过灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中而制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在供制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳剂用的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其自先前经过无菌过滤的其液体介质产生含有活性成分加任何别的期望成分的粉末。若必要的话，液体介质应当是适当缓冲的，并且液体稀释剂首先给予等张，之后注射足够的盐水或葡萄糖。还涵盖直接注射的高度浓缩的组合物的制备，其中涵盖使用DMSO作为溶剂来产生极端快速的渗透，将高浓度的活性剂投递至小区域。
组合物在制造和贮存条件下必须是稳定的，而且针对微生物，诸如细菌和真菌的污染作用进行保存/防腐。应当领会，内毒素污染应当保持最低，使其处于安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。
在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，诸如例如，单硬脂酸铝、明胶或其组合来引起可注射组合物的吸收延迟。
可以依靠常规的混合、溶解、粒化、生成锭剂(dragee-making)、研细、乳化、装入胶囊、包封(entrapping)或冻干方法来制造包含本发明的免疫缀合物的药物组合物。可以使用一种或多种便于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规的方式配制药物组合物。合适的配制剂取决于所选择的施用路径。
对于表面施用，可以将本发明的免疫缀合物配制为溶液、凝胶、软膏剂、乳膏、悬浮液等，如本领域中公知的。
系统配制剂包括那些为了通过注射，例如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射的施用而设计的，及那些为了经皮、经粘膜、吸入、口服或肺部施用而设计的。
对于注射，可以将本发明的免疫缀合物在水溶液中，优选地在生物学相容的缓冲液诸如汉克斯(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液，或生理盐水缓冲液中配制。溶液可以含有配方剂，诸如悬浮、稳定和/或分散剂。
或者，免疫缀合物可以为使用前用合适的媒介物，例如无菌无热原水构成的粉末形式。
对于经粘膜施用，在配制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂一般是本领域中已知的。
对于口服施用，可以通过组合免疫缀合物与本领域中公知的药学可接受载体来容易地配制免疫缀合物。此类载体使本发明的免疫缀合物能够配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、栓剂等，以被要治疗的患者口服摄取。对于口服固体配制剂，诸如例如，粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂诸如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纤维素制品诸如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；粒化剂；和粘合剂。若想要的话，可以添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或褐藻酸或其盐，诸如褐藻酸钠。
若想要的话，固体剂量形式可以是使用标准技术经过糖包被或肠包被的。
对于口服液体制剂诸如例如，悬浮液、酏剂和溶液，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、二醇、油、醇等。另外，可以添加芳香剂、防腐剂、着色剂等。
对于含服施用，免疫缀合物可以采用以常规方式配制的片剂、锭剂等形式。
对于通过吸入的施用，依照本发明使用的免疫缀合物以气雾剂喷雾形式方便地投递，所述气雾剂从加压包装或喷雾器借助于合适的推进剂喷射，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其它合适气体。在加压气雾剂的情况中，通过提供阀来投递计量的量从而可以确定剂量单位。可以将吸入器或吹入器中使用的明胶的胶囊和药筒(cartridge)配制成装有免疫缀合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
免疫缀合物也可以配制成直肠或阴道组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，诸如可可油或其它甘油酯。
在先前所描述的配制剂外，免疫缀合物也可以配制为积存制剂(depotpreparation)。可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或者通过肌肉内注射来施用此类长效配制剂。如此，例如，可以用合适的聚合或疏水性材料(例如以可接受油中的乳剂)或离子交换树脂，或者以略溶性衍生物，例如，以略溶性盐配制免疫缀合物。
或者，可以采用其它药物投递系统。脂质体和乳剂是可以用于投递本发明的免疫缀合物的投递媒介物的公知例子。也可以采用某些有机溶剂诸如二甲亚砜，虽然通常代价为更大的毒性。另外，可以使用持续释放系统，诸如含有治疗剂的固体聚合物的半透性基质来投递免疫缀合物。已经建立了各种持续释放材料，并且它们是本领域技术人员公知的。根据其化学性质，持续释放胶囊可以将免疫缀合物释放几周多至超过100天。根据免疫缀合物的化学性质和生物学稳定性，可以采用免疫缀合物稳定化的其它策略。
因为本发明的免疫缀合物可以含有带电荷的侧链或末端，所以它们可以以游离酸或碱或以药学可接受盐包含在任何上文所描述的配制剂中。药学可接受盐是那些基本上保留游离碱的生物学活性，并且通过与无机酸反应制备的盐。药用盐趋向于在水性和其它质子溶剂中比相应的游离碱形式更可溶。
一般地，本发明的免疫缀合物会以有效实现预期目的的量使用。为了使用以治疗或预防疾病状况，以治疗有效量施用或应用本发明的免疫缀合物或其药物组合物。治疗有效量是有效改善或预防症状，或延长所治疗患者的存活的量。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力内，特别地根据本文中所提供的详细公开内容。
对于系统施用，治疗有效剂量最初可以自体外测定法评估。例如，可以将剂量在动物模型中配制以达到包括如在细胞培养物中测定的IC50的循环浓度范围。可以使用此类信息来更精确地测定人中有用的剂量。
也可以使用本领域公知的技术自体内数据，例如动物模型评估初始剂量。基于动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化对人的施用。
可以个别地调节剂量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的免疫缀合物的血浆水平。通过注射施用的常见患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天，通常为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多剂来实现治疗有效的血清水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中，免疫缀合物的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。本领域技术人员无需过度实验会能够优化治疗有效局部剂量。
当然，施用的免疫缀合物量会依赖于所治疗的受试者、受试者的重量、痛苦的严重性、施用方式和处方内科医生的判断。
可以在可检出症状时或者甚至在不能检出症状时进行间歇重复疗法。可以单独地或与其它药物组合提供疗法。在自身免疫性病症的情况中，可以与本发明的免疫缀合物组合使用的药物包括但不限于类固醇和非类固醇抗炎剂。
毒素
治疗有效剂量的本文中所描述的免疫缀合物一般会在不引起实质毒性的情况中提供治疗益处。可以测定免疫缀合物的毒性，其通过细胞培养物或实验动物中的标准药学规程，例如通过测定LD50(群体50％致死的剂量)或LD100(群体100％致死的剂量)来实现。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。在一个实施方案中，免疫缀合物展现出高治疗指数。可以在配制例如对人中使用没有毒性的剂量范围中使用自这些细胞培养测定法和动物研究获得的数据。优选地，本文中所描述的免疫缀合物的剂量位于循环浓度范围内，其包括具有少许毒性或没有毒性的有效剂量。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂量形式和所利用的施用路径。考虑到患者的状况，各内科医师医生可以选择准确的配方、施用路径和剂量。(见例如Fingl等，1975，于：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页)(通过提及而将其完整收入本文)。
其它药剂和治疗
涵盖的是，其它药剂可以与本发明联合使用以改善处理的治疗功效。这些别的药剂包括免疫调控剂、影响细胞表面受体和GAP接合上调的药剂、细胞抑制和分化剂、细胞粘着抑制剂、或提高超增殖性细胞对凋亡诱导物的敏感性的药剂。免疫调控剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。进一步涵盖的是，细胞表面受体或其配体诸如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调会通过对超增殖性细胞建立自分泌或旁分泌效果而加强本发明的凋亡诱导能力。通过提高GAP接合数目实现的胞间信号传导升高会提高对相邻的超增殖性细胞群体的抗超增殖效果。在其它实施方案中，细胞抑制或分化剂可以与本发明联合使用以改善治疗的抗超增殖功效。涵盖细胞粘着的抑制剂以改善本发明的功效。细胞粘着抑制剂的例子是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步涵盖的是，提高超增殖细胞对凋亡的敏感性的其它药剂，诸如抗体C225可以与本发明联合使用以改善治疗功效。
激素疗法也可以与本发明一起或与先前所描述的任何其它癌症疗法联合使用。可以在某些癌症诸如乳腺、前列腺、卵巢、或宫颈癌的治疗中采用激素的使用以降低某些激素诸如睾酮或雌激素的水平或阻断其效应。作为一种治疗选项或者为了降低转移风险，此处理经常与至少一种其它癌症疗法联合使用。
本发明的免疫缀合物也可以与化学疗法、放射疗法或其它免疫疗法一起施用。用于此类联合疗法的抗癌剂可以例如选自下组：微管破坏药物(例如，长春花生物碱诸如长春碱或长春新碱、紫杉烷诸如多西他赛(Docetaxel)或帕西他赛(paclitaxel)、埃博霉素(epothilones)诸如伊沙匹隆(ixabepilone))、抗代谢物(例如抗叶酸剂诸如甲氨蝶呤或氨基蝶呤、抗嘌呤诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤或6-硫鸟嘌呤、抗嘧啶诸如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)或吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea))、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、或鬼臼毒素(podophyllotoxin)诸如依托泊苷)、DNA插入剂(例如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin))、烷化剂(例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、亚硝基脲诸如卡莫司汀或尼莫司汀(nimustine)、链佐星(streptozocin)、白消安(busulfan)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、曲他胺(triethylenemelamine)、达卡巴嗪(dacarbazine))、激素疗法(例如糖皮质激素、芳香酶抑制剂诸如他莫昔芬(tamoxifene)、抗雄激素(antiandrogen)诸如氟他胺(flutamide)、促性腺激素释放激素(GnRH)类似物诸如亮丙瑞林(leuprolide))、抗生素、激酶抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib))、受体拮抗剂(例如，靶向已知促进致癌作用和肿瘤生长的细胞表面受体的抗体)、酶抑制剂(例如，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂)、氨基酸消减酶(例如门冬酰胺酶)、甲酰四氢叶酸、类视黄醇、肿瘤细胞凋亡的激活物和抗血管生成剂。
实施例
实施例1
在细胞因子的抗体介导的投递第一次由Harvill E.T.和Morrison S.L.Immunotech.1(2)：95-105(1995)实施时，构建体具有两个用于肿瘤抗原靶向的抗原结合模块和两个用于诱导淋巴细胞活化的细胞因子模块(IL-2分子与IgG3的每个重链C端融合)。细胞因子的亲和力一般对其受体较高。携带两个细胞因子单元的分子由于亲合力(或多价)效应而可以具有甚至更高的针对细胞因子受体的亲和力。因此，甚至在发生靶向肿瘤前，此类分子可以容易地活化血流中的淋巴细胞。此效应对于患者不会是期望的。相反，携带仅一个细胞因子模块和两个或更多个靶向域的免疫缀合物分子不太可能会活化循环中的淋巴细胞，并且可以将整个免疫缀合物分子引导至肿瘤，在那里可以以较低的速度发生淋巴细胞活化。因此，用白介素-2(IL-2)作为模型细胞因子构建如图1和2中所描绘的分子。所有生成的分子对于肿瘤抗原是二价的，而对于IL-2细胞因子是二价或单价的，如图中所标示的。使用L19抗体作为一个例子来对两种不同免疫缀合物形式比较针对抗原的亲和力。作为参照，将此抗体克隆入人IgG1形式、双抗体形式(图1A)和Fab-IL2-Fab融合物(图1B)中。在双抗体形式内测试一个变量，使得VH和VL间的接头肽长度为8或12个氨基酸。将纯化的抗原纤连蛋白额外域B(EDB)在BIACORE芯片上固定化，并使用抗体融合构建体作为可溶性分析物以进行亲和力测定。图8至11显示了此实验的结果。认为IgG是二价结合事件的理想情况。在这里，观察到260pM的亲和力常数。Fab-IL2-Fab融合构建体给出310pM的亲和力，其与IgG基本上相同。双抗体的两个变体(图10和11中所显示的)分别具有270pM和360pM的测量亲和力。因此，所有这些构建体都具有相似的针对抗原的亲和力。使用基于F16抗体序列的相似构建体来解决针对抗原和IL-2受体的亲和力(Brack，S.S.等，Clin.Canc.Res.12(10)：3200-3208(2006))。图12显示了在将TNC-A1域在BIACORE芯片上固定化时，F16IgG及其相应的单价Fab片段的BIACORE传感图。在这些特定的实验条件下，IgG分子显示2.6nM的亲和力常数，而Fab分子显示50nM的亲和力常数。在这里，促成二价的亲和力升高是20倍。双抗体、Fab-IL2-Fab和scFv-IL2-scFv免疫缀合物分别显示5nM、4.8nM和12nM的针对抗原的亲和力。因此，所有这些构建体都具有比Fab片段的单价性能更为类似IgG分子的二价特征的针对抗原的亲和力。
在考虑针对IL-2受体的亲和力时，差异更明显。为了研究IL-2受体结合亲和力，生成容许异二聚体IL-2受体表达的工具；将IL-2受体的β链与Fc分子融合，所述Fc分子使用“突出-入-穴”技术(Merchant，A.M.等，Nat.Biotech.16：677-681(1998))进行工程化改造以异二聚化(Fc(突出))。然后，将IL-2受体的γ链与Fc(穴)变体融合，所述Fc(穴)变体与Fc(突出)异二聚化，然后，使用此异二聚体Fc-融合蛋白作为底物来分析IL-2/IL-2受体相互作用。图13显示了在固定化的IL-2受体的情况中商品化IL-2(Proleukin)作为分析物的BIACORE传感图。约0.5nM的测量亲和力与先前发表的数值一致。图17中汇总了针对IL-2受体的各种构建体的亲和力。观察到的重要结果是双抗体(F16 dia IL2)(其就细胞因子而言是二价的)与Fab-IL2-Fab分子(其仅携带一个IL-2模块)间的差异。双抗体的IL-2受体结合亲和力(0.8nM)与未缀合的IL-2(Proleukin)的IL-2受体结合亲和力(0.5nM)相似，尽管双抗体为二价，而IL-2为单价。与双抗体相比，Fab-IL2-Fab融合物具有几乎降低10倍的IL-2受体结合亲和力，这在诱导NK92细胞增殖性能降低方面得到反映，如图19中所显示的。
实施例2
通用Fab文库的构建
使用下列V-域配对基于人种系基因构建Fab形式的通用抗体文库：Vk3_20κ轻链及VH3_23重链(对于DP47-3文库)和Vk1_17κ轻链及VH1_69重链(对于DP88-3文库)。见表2。将这两种文库在轻链(L3)的CDR3和重链(H3)的CDR3中随机化，并通过交叠延伸(SOE)PCR的剪接每个文库自3个片段装配。片段1包含包括随机化的L3的抗体基因5’端，片段2是自L3跨越至H3的中心恒定片段，而片段3包含随机化的H3和抗体基因的3’部分。
使用下列引物组合来生成DP47-3文库的文库片段：片段1(LMB3-LibL1b_new)、片段2(MS63-MS64)、片段3(Lib2H-fdseqlong)。见表9。使用下列引物组合来生成DP88-3文库的文库片段：片段1(LMB3-RJH_LIB3)、片段2(RJH31-RJH32)和片段3(LIB88_2-fdseqlong)。见表10。
表9.
Figure BDA0000153472770001291
表10.
Figure BDA0000153472770001292
用于生成文库片段的PCR方案包括：于94℃的5分钟初始变性；于94℃1分钟，于58℃1分钟，及于72℃1分钟的25个循环；及于72℃末端延长10分钟。对于装配，使用等摩尔比率的3个片段作为模板。装配PCR方案包括：于94℃的3分钟初始变性；及于94℃30秒、于58℃1分钟和于72℃2分钟的5个循环。在此阶段，添加与在片段1-3外部的序列互补的引物，并实施额外的20个循环，之后于72℃末端延长10分钟。
在足够量的全长随机化Fab构建体装配后，用NcoI/NotI(对于DP47-3文库)和用NcoI/NheI(对于DP88-3文库)消化Fab构建体，与经类似处理的接受噬菌粒载体一起。对于DP47-3文库，将22.8μg Fab文库与16.2μg噬菌粒载体连接。对于DP88-3文库，将30.6μg Fab文库与30.6μg噬菌粒载体连接。
分别使用纯化的连接物进行68次转化(对于DP47-3文库)和64次转化(对于DP88-3文库)以获得最终的文库大小4.2×1010(对于DP47-3)和3.3×109(对于DP88-3)。
将展现出Fab文库的噬菌粒颗粒拯救，并通过PEG/NaCl纯化来纯化以用于选择。
实施例3
抗TNC A2克隆2B10的选择
针对大肠杆菌表达的人TNC-A2实施选择，所述人TNC-A2在avi标签和6×his标签的5’亚克隆。见表5中的SEQ ID NO：57。将抗原在表达后在体内生物素化。已经依照以下方案在溶液中实施选择：(i)文库DP88-3的约1012个噬菌粒颗粒和100nM生物素化的人TNC A2在总体积1ml中结合0.5小时；(ii)通过添加5.4×107个经链霉亲合素包被的磁珠捕捉生物素化的人TNC-A2和附着的噬菌体达10分钟；(iii)使用5x1ml PBS/Tween20和5x1ml PBS清洗珠；(iv)通过添加1mL 100mM TEA(三乙胺)来洗脱噬菌体颗粒达10分钟，并通过添加500μL 1M Tris/HCl pH7.4来中和；及(v)对对数期大肠杆菌TG1细胞的再感染，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒以在随后的选择轮次中使用。
使用100nM的恒定抗原浓度在3个轮次里实施选择。在第2轮中，在替代链霉亲合素珠的中性亲合素(neutravidin)板上实施抗原：噬菌体复合物的捕获。如下通过ELISA鉴定特异性结合剂：将100μl 100nM生物素化的人TNC-A2在中性亲合素板的每孔中包被。
添加含有Fab的细菌上清液，并通过使用抗Flag/HRP二抗经由其Flag标签检测结合Fab。一旦鉴定，将克隆2B10在0.5升培养体积中以细菌表达，进行亲和纯化，并使用BIACORE T100通过SPR分析进一步表征。见表3的SEQ IDNO：3和7。
实施例4
抗TNC A1/A4克隆2F11的选择
针对大肠杆菌表达的人TNC A1实施选择，所述人TNC A1在avi标签和6×his标签的5’亚克隆。见表5中的SEQ ID NO：59。将抗原在表达后在体内生物素化。已经依照以下方案在溶液中实施选择：(i)文库DP47-3的约1012个噬菌粒颗粒和100nM生物素化的人TNC-A1在总体积1ml中结合0.5小时；(ii)通过添加5.4×107个经链霉亲合素包被的磁珠捕捉生物素化的人TNC-A1和附着的噬菌体达10分钟；(iii)使用5x1ml PBS/Tween20和5x1ml PBS清洗珠；(iv)通过添加1mL 100mM TEA(三乙胺)来洗脱噬菌体颗粒达10分钟，并通过添加500μL 1M Tris/HCl pH 7.4来中和；及(v)对对数期大肠杆菌TG1细胞的再感染，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒以在随后的选择轮次中使用。
使用100nM的恒定抗原浓度在3个轮次里实施选择。在第2轮中，在替代链霉亲合素珠的中性亲合素板上实施抗原：噬菌体复合物的捕获。
给所有结合反应补充100nM非生物素化的包含羧基端avi标签和6×his标签的人IgG CH3恒定域以竞争识别抗原标签的不想要的克隆。
在第一个筛选步骤中，如下通过ELISA鉴定特异性结合剂：将100μl100nM生物素化的人TNC-A1在每块中性亲合素板中包被。添加含有Fab的细菌上清液，并通过使用抗Flag/HRP二抗经由其Flag标签检测特异性结合人TNC-A1的Fab。
在第二个筛选步骤中，还使用鼠TNC-A1、人TNCA4和mu TNCA4作为抗原重复上述ELISA以测定交叉反应性。所有抗原包含其C端的相同avi标签和6×his标签，并且是体内生物素化的。见表5的SEQ ID NO：50和61。
一旦鉴定，将克隆2F11在0.5升培养体积中以细菌表达，进行亲和纯化，并使用BIACORE T100通过SPR分析进一步表征。见表3的SEQ ID NO：9和13。
实施例5
抗FAP克隆的选择(初步选择)
针对人或鼠成纤维细胞激活蛋白(FAP)的胞外域实施选择，所述胞外域在多聚赖氨酸和6×his标签上游克隆。见表5的SEQ ID NO：53和55。在选择前，根据选择的轮次，将抗原以10μg/ml或5μg/ml的浓度包被入免疫管中。依照以下方案实施选择：(i)文库DP47-3的约1012个噬菌粒颗粒结合固定化的人或鼠FAP达2小时；(ii)使用5×5mL PBS/Tween20和5×5ml PBS清洗免疫管；(iii)通过添加1mL 100mM TEA(三乙胺)来洗脱噬菌体颗粒达10分钟，并通过添加500μL 1M Tris/HCl pH7.4来中和；及(v)对对数期大肠杆菌TG1细胞的再感染，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒以在随后的选择轮次中使用。
已经使用降低抗原浓度的人FAP且在一些情况中在最终的选择轮次中使用5ug/ml的鼠FAP在3或4个轮次里实施选择。特异性结合剂定义为比背景高5×的信号，并且通过ELISA鉴定。用10ug/ml人或鼠FAP包被NUNC Maxisorp板，接着添加含有Fab的细菌上清液，并通过使用抗Flag/HRP二抗经由其Flag标签检测特异性结合Fab。
将ELISA阳性克隆在96孔形式中以1ml培养物细菌表达，并使用BIACORE T100将上清液进行动力学筛选实验。
实施例6
抗FAP亲和力成熟文库的构建
基于来自初步抗FAP选择的预选定抗体构建3个亲和力成熟的文库。更精确地，它们基于(i)抗人FAP克隆2D9(文库a.m.FAP2D9)(见表3的SEQ ID NO：67和69)，(ii)抗鼠FAP克隆4B8(文库a.m.FAP4B8)(见表3的SEQ ID NO：71和73)和(iii)交叉反应性克隆7A1、13B2、13C2、13E8、14C10和17A11(文库a.m.FAPpool)(见表3的SEQ ID NO：75和77，其对应于7A1可变区序列；表3的SEQ ID NO：79和81，其对应于13C2可变区序列；SEQ ID NO：83和85，其对应于13E8可变区序列；SEQ ID NO：87和89，其对应于14C10可变区序列；和SEQ ID NO：91和93，其对应于17A11可变区序列)。
每个这些文库由分别在轻链(L1/L2)的CDR1和CDR2或重链(H1/H2)的CDR1和CDR2中随机化的两个亚文库组成。将这些亚文库在转化后合并。通过四个随后的扩增和装配步骤来构建每个这些亚文库。
对于L1/L2文库，扩增和装配方案包括：(i)片段1(LMB3-DPK22_CDR1_rand_ba_opt)和片段2(DPK22_CDR1_fo  -DPK22_Ck_BsiWI_ba)的扩增；(ii)使用外部引物LMB3和DPK22_Ck_BsiWI_ba装配片段1和2以创建片段3的模板；(iii)扩增片段3(LMB3-DPK22_CDR2_rand_ba)和片段4(DPK22_CDR2_fo-DPK22_Ck_BsiWI_ba)；并(iv)使用与上文相同的外部引物最终装配片段3和4。见关于引物序列的表11。
表11.
Figure BDA0000153472770001331
粗体：60％初始碱基和40％随机化为M
下划线：60％初始碱基和40％随机化为N
对于H1/H2文库，扩增和装配方案包括：(i)扩增片段1(RJH53-DP47_CDR1_rand_ba_opt)和片段2(DP47_CDR1_fo-MS52)；(ii)使用外部引物RJH53和MS52来装配片段1和2以创建片段3的模板；(iii)扩增片段3(RJH53-DP47_CDR2_rand_ba)和片段4(DP47_CDR2_fo-MS52)；及(iv)使用与上文相同的外部引物最终装配片段3和4。见关于引物序列的表12。
表12.
Figure BDA0000153472770001332
粗体：60％初始碱基和40％随机化为M
下划线：60％初始碱基和40％随机化为N
已经分别用NcoI/BsiWI(对于a.m.FAP2D9和a.m.FAP4B8的L1/L2亚文库)、用MunI和NheI(对于a.m.FAP2D9和a.m.FAP4B8的H1/H2亚文库)和用NcoI/BamHI(对于a.m.FAPpool的L1/L2文库)及用BspEI/PstI(对于a.m.FAPpool的H1/H2文库)消化最终的装配产物，分别与经相似处理的基于克隆2D9、4B8或克隆7A1、13B2、13C2、13E8、14C10和17A11的等摩尔混合物的质粒制备物的接受载体一起。对于相应的文库(μg V-域/μg载体)连接以下量的经消化的随机化(部分)V域和经消化的接受载体：a.m.FAP2D9L1/L2亚文库(5.7/21.5)、a.m.FAP2D9H1/H2亚文库(4.1/15.5)、a.m.FAP4B8L1/L2亚文库(6.5/24.5)、a.m.FAP4B8H1/H2亚文库(5.7/21.5)、a.m.FAPpoolL1/L2亚文库(4.4/20)、a.m.FAPpool H1/H2亚文库(3.4/15.5)。
将纯化的L1/L2和H1/H2亚文库连接物合并，并用于60次转化(对于3个亲和力成熟文库之每个)，以获得最终文库大小6.2×109(对于a.m.FAP2D9)、9.9×109(对于a.m.FAP4B8)和2.2×109(对于a.m.FAPpool)。
将展现出这些Fab文库的噬菌粒颗粒拯救，并通过PEG/NaCl纯化来纯化以用于二次选择。
实施例7
亲和力成熟的抗FAP克隆的选择
针对人或鼠成纤维细胞激活蛋白(FAP)的胞外域实施选择，所述胞外域在多聚赖氨酸和6×his标签的5’克隆。见表5的SEQ ID NO：53和55。在选择前，根据文库和选择的轮次，将抗原以10μg/mL、5μg/mL或0.2μg/mL的浓度包被入免疫管中。依照以下方案实施选择：(i)文库a.m.FAP2D9、a.m.FAP4B8或a.m.FAPpoo的约1012个噬菌粒颗粒结合固定化的人或鼠FAP达2小时；(ii)使用10-20×5mL PBS/Tween20和10-20×5mL PBS(根据文库和选择轮次)清洗免疫管；(iii)通过添加1mL 100mM TEA(三乙胺)来洗脱噬菌体颗粒达10分钟，并通过添加500μL 1M Tris/HCl pH 7.4来中和；及(v)对对数期大肠杆菌TG1细胞的再感染，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒以在随后的选择轮次中使用。
在2个轮次里实施选择，并个别地针对3个文库之每个调节条件。详细地，选择参数是：a.m.FAP2D9(对于第1轮为5μg/mL人FAP和总共20次清洗，对于第2轮为1μg/mL人FAP和总共30次清洗)、a.m.FAP4B8(对于第1轮为1μg/mL鼠FAP和总共30次清洗，对于第2轮为0.2μg/mL人FAP和总共40次清洗)和a.m.FAPpool(对于第1轮为5μg/mL人FAP和总共30次清洗，对于第2轮为5μg/mL鼠FAP和总共30次清洗)。特异性结合剂定义为比背景高5×的信号，并且通过ELISA鉴定。用1μg/mL或0.2μg/mL人或鼠FAP包被NUNCMaxisorp板，接着添加含有Fab的细菌上清液，并通过使用抗Flag/HRP二抗经由其Flag标签检测特异性结合Fab。
将ELISA阳性克隆在96孔形式中以1ml培养物细菌表达，并使用BIACORE T100将上清液进行动力学筛选实验。
实施例8
不同形式的靶向性IL-2的功效研究
使用对肿瘤基质特异性的两种不同白介素-2免疫缀合物分子形式来实施功效实验。将F9畸胎瘤皮下注射入129SvEv小鼠中，并使用测径器测量肿瘤大小。在两个不同浓度比较“双抗体”-IL-2分子与Fab-白介素-2-Fab(Fab-IL2-Fab)免疫缀合物，其中浓度反映相似数目的免疫缀合物分子。图3中显示了结果。Fab-IL2-Fab免疫缀合物显示了显著的肿瘤生长抑制，并且比两个不同浓度的双抗体形式好且比对照好。
还检查用对肿瘤基质特异性的两个不同白介素-2免疫缀合物分子形式处理的小鼠的存活。将人胃肿瘤细胞系LS174T脾内注射入SCID-米色小鼠中。在两个不同浓度比较“双抗体”-IL-2分子与Fab-IL-2-Fab免疫缀合物，其中浓度反映相似数目的免疫缀合物分子。图4中显示了结果。与双抗体形式和对照相比，Fab-IL-2-ab形式导致更高的百分比存活。
实施例9
重组DNA技术
使用标准的方法来操作DNA，如记载于Sambrook，J.等，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989的。依照制造商的指令使用分子生物学试剂。
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息见：Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH出版号91-3242。
DNA测序
通过双链测序来测定DNA序列。
基因合成
期望的基因区段由Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成的寡核苷酸和PCR产物制备。将侧翼有单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入pGA18(ampR)质粒中。自经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术来测定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆的基因片段的DNA序列。用合适的限制性位点设计基因区段以容许亚克隆入相应的表达载体中。用编码前导肽的5’端DNA序列设计所有构建体，所述前导肽靶向真核细胞中分泌的蛋白质。表13和14分别给出了例示性的前导肽和编码它们的多核苷酸序列。
表13.
供分泌用的前导序列：多肽序列
  多肽序列  SEQ ID NO
  MDWTWRILFLVAAATGAHS  273
  MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC  276
  MGWSCIILFLVATATGVHS   278
表14.
供分泌用的前导序列：多核苷酸序列
Figure BDA0000153472770001361
免疫缀合物的制备
将所得的DNA序列在MPSV启动子控制下且在合成的多聚A位点上游亚克隆入哺乳动物表达载体(一个用于轻链，而一个用于重链/融合蛋白)中，每个载体携带EBV OriP序列。
通过使用磷酸钙转染来用哺乳动物表达载体共转染指数生长的HEK293-EBNA细胞，从而生成如下文实施例中应用的免疫缀合物。或者，通过聚乙烯亚胺(PEI)用表达载体转染悬浮液中生长的HEK293细胞，或使用经稳定转染的CHO细胞集合。虽然可以通过使用蛋白A基质的亲和层析来纯化基于3F2和4G8的FAP靶向性Fab-IL2-Fab构建体，但是必须通过在蛋白G基质上的亲和层析来纯化基于2B10的TNC A2靶向性Fab-IL2-Fab构建体。
简言之，通过一个亲和步骤(蛋白G)，接着进行大小排阻层析(Superdex200，GE Healthcare)自上清液纯化TNC A2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab。将蛋白G柱在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5中平衡，加载上清液，并用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠，pH7.5清洗该柱。用8.8mM甲酸pH3洗脱Fab-IL2-Fab。将洗脱的级分合并，并通过大小排阻层析在最终的配制剂缓冲液中精制(polish)：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH6.7。图53显示了来自纯化和分析的例示性结果。
通过相似的方法来纯化FAP靶向性3F2 Fab-IL2-Fab或4G8 Fab-IL2-Fab，所述方法包括一个亲和步骤(蛋白A)，接着进行大小排阻层析(Superdex 200，GE Healthcare)。将蛋白A柱在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5中平衡，加载上清液，并用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠，pH7.5清洗该柱，接着用13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠，pH5.45清洗。任选地，用10mM MES、50mM氯化钠pH5实施第三次清洗。用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH3洗脱Fab-IL2-Fab。将洗脱的级分合并，并通过大小排阻层析在最终的配制剂缓冲液中精制：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH6.7。
实施例10
别的抗FAP亲和力成熟文库(基于克隆3F2、3D9、4G8、4B3和2C6)的构建
基于来自抗FAP抗体的第一次亲和力成熟活动的预选的交叉反应性抗体，即克隆3F2、3D9、4G8、4B3和2C6(见表3的SEQ ID NO：17和21，其对应于3F2可变区序列；表3的SEQ ID NO：23和25，其对应于3D9可变区序列；表3的SEQ ID NO：33和35，其对应于4B3可变区序列；表3的SEQ ID NO：41和43，其对应于2C6可变区序列)来构建四个别的亲和力成熟文库。更精确地，四个文库基于1)抗FAP克隆3F2、4G8和4B3(可变重链的CDR1和2中随机化的VH文库，即H1/H2文库)，2)抗FAP克隆3D9和2C6(可变轻链的CDR1和2中随机化的VL文库，即L1/L2文库)，3)抗FAP克隆3F2(在轻链CDR3中具有软随机化的L3文库，即L3文库)和4)抗FAP克隆3F2(在重链CDR3中具有软随机化的H3文库，即H3文库)。对于L1/L2和H1/H2文库，分别以对抗FAP抗体的第一次亲和力成熟活动所概述完全相同的方式构建前两个文库。相反，对于基于克隆3F2的L3和H3亲和力成熟文库，使用两个新的引物来引入亲本克隆的L3(AM_3F2_DPK22_L3_ba：CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT    CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC，其中加下划线的碱基是60％的给定碱基和40％混合物N(四种核苷酸A、C、G和T的混合物))和H3(AM_3F2_DP47_H3_fo：GGCCGTATATTACTGTGCG  A
Figure BDA0000153472770001381
A GGG TGGTT
Figure BDA0000153472770001382
GGT GGT TTT
Figure BDA0000153472770001383
AC TACTGGGGCCAAGGAAC，其中加下划线的碱基是60％给定碱基和40％混合物N，斜体的碱基是60％给定碱基和40％G，以及斜体的加下划线碱基是60％给定碱基和40％混合物K(两种核苷酸G和T的混合物))中的软随机化。文库大小如下：H1/H2文库(1.13×1010)、L1/L2文库(5.6×109)、L3文库(2.3×1010)和H3文库(2.64×1010)。
实施例11
亲和力成熟的抗FAP克隆的选择
针对人和鼠成纤维细胞激活蛋白(FAP)的胞外域实施选择，所述胞外域在6x-赖氨酸和6x-his标签(见表5的SEQ ID NO：53和55)上游克隆。在选择前，根据文库和选择的轮次，将抗原以1μg/ml、0.2μg/ml或0.02μg/ml的浓度包被入免疫管中。如对抗FAP抗体的第一次亲和力成熟活动所描述的，实施选择和基于ELISA的筛选。使用ProteOn XPR36生物传感器(Biorad)来实施二次筛选，并在同一仪器上分析亲和力纯化的Fab制备物，测定动力学速率常数和亲和力。鉴定下列亲和力成熟的克隆：19G1(见表3的SEQ ID NO：121和123)、20G8(见表3的SEQ ID NO：125和127)、4B9(见表3的SEQ ID NO：129和131)、5B8(见表3的SEQ ID NO：133和135)、5F1(见表3的SEQ ID NO：137和139)、14B3(见表3的SEQ ID NO：141和143)、16F1(见表3的SEQ IDNO：145和147)、16F8(见表3的SEQ ID NO：149和151)、O3C9(见表3的SEQID NO：153和155)、22A3(见表3的SEQ ID NO：165和167)和29B11(见表3的SEQ ID NO：169和171)(所有这些克隆都自H1/H2文库选择，并自亲本克隆3F2衍生)、O2D7(见表3的SEQ ID NO：157和159)(选自基于亲本克隆3F2的L3文库)和28H1(见表3的SEQ ID NO：161和163)和23C10(见表3的SEQID NO：173和175)(这两个克隆自H1/H2文库选择，并自亲本克隆4G8衍生)。
图21-25显示了选定的亲和力成熟的针对FAP的Fab的表面等离振子共振传感图，而表15给出了相应的亲和力。选定的Fab跨越pM至nM范围的高亲和力范围，并且对于人(hu)和鼠(mu)FAP及猕猴(cyno)FAP是交叉反应性的，如对选定克隆测定的。将亲和力成熟的抗FAP Fab转化为Fab-IL2-Fab形式。根据缺乏对作为HEK293或CHO细胞上表达的FAP的相似同系物的DPPIV的结合，显示结合特异性。
表15.
亲和力成熟的抗FAP抗体作为Fab片段(单价结合)的动力学平衡常数(KD)的汇总
Figure BDA0000153472770001391
实施例12
抗TNC A2亲和力成熟文库(基于克隆2B10)的构建
基于来自初步TNC A2选择的预选抗体来构建亲和力成熟文库。更精确地，它基于亲本克隆2B10，并且由两个亚文库组成：1)轻链CDR1和CDR2(L1/L2)中随机化的VL亚文库和2)重链CDR1和CDR2(H1/H2)中随机化的VH亚文库。在转化后合并这些亚文库。通过四个随后的扩增和装配步骤来构建每个这些亚文库。对于L1/L2文库：1)扩增片段1(LMB3-AM_Vk1A30_L1_ba)和片段2(RJH50(Vk1A30_L1/L2_fo)-RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba))，2)使用外部引物LMB3和RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba)来装配片段1和2以创建模板，3)扩增片段3(LMB3-AM_Vk1A30_L2_ba)和片段4(RJH52(Vk1A30_L2/L3)-RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba))，并4)使用与上文相同的外部引物来最终装配片段3和4。对于H1/H2文库：1)扩增片段1(RJH53-AM_DP88_H1_ba_opt)和片段2(RJH54(DP88_H1/H2_fo)-MS52)，2)使用外部引物RJH53和MS52来装配片段1和2以创建模板，3)扩增片段3(RJH53-AM_DP88_H2_ba)和片段4(RJH55(DP88_H2H3_fo)-MS52)，并4)使用与上文相同的外部引物来最终装配片段3和4。已经用NcoI/BsiWI(对于VL亚文库)及MunI和NheI(对于VH亚文库)消化最终的装配产物，并将其在经类似消化的接受载体中克隆。文库大小生成1.16×1010个独立的克隆。
表16.
Figure BDA0000153472770001401
下划线：60％初始碱基和40％随机化为V
粗体：60％初始碱基和40％随机化为N
表17.
Figure BDA0000153472770001402
加下划线：60％初始碱基和40％随机化为V
粗体：60％初始碱基和40％随机化为N
实施例13
亲和力成熟的抗TNC A2克隆的选择
针对大肠杆菌表达的人TNC A2实施选择，所述人TNC A2在avi标签和6×his标签(见表5的SEQ ID NO：57)上游克隆。将抗原在表达后在体内生物素化。已经使用范围为100至2nM的降低浓度的人TNC A2来在溶液中实施选择，如对初步TNC A2选择所描述的。通过ELISA鉴定亲和力成熟的克隆后，使用ProteOn XPR36生物传感器(Biorad)来实施二次筛选，并在同一仪器上分析亲和力纯化的Fab制备物，测定动力学速率常数和亲和力。鉴定下列亲和力成熟的克隆：2B10_O1F7(见表3的SEQ ID NO：201和203)、2B10_6H10(见表3的SEQ ID NO：205和207)、2B10_C3A6(见表3的SEQ ID NO：185和187)、2B10_D1A2(见表3的SEQ ID NO：189和191)和2B10_O7D8(见表3的SEQ ID NO：197和199)(所有这些都自VL亚文库衍生)，及2B10_C3B6(见表3的SEQ ID NO：177和179)和2B10_6A12(见表3的SEQ ID NO：181和183)(这两种克隆自VH亚文库衍生)。此外，对于克隆2B10_D1A2，生成V32D突变体(见表3的SEQ ID NO：193和195)(依照Kabat的编号)。
图26显示了选定的亲和力成熟的针对TNC A2的Fab的表面等离振子共振传感图，而表18给出了相应的亲和力。选定的Fab跨越pM范围中的高亲和力范围。
表18.
亲和力成熟的抗TNC A2抗体作为Fab片段(单价结合)的动力学平衡常数(KD)的汇总。
Figure BDA0000153472770001411
实施例14
基于2B10、3F2和4G8的Fab-IL2-Fab构建体的制备
为基于2B10、3F2和4G8的Fab-IL2-Fab构建体开发出另一种纯化方法(在实施例9中所描述的方法外)。虽然可以通过使用蛋白A基质(例如MabSelectSure)的亲和层析来纯化基于3F2和4G8的Fab-IL2-Fab构建体，但是必须通过在蛋白G基质上的亲和层析来纯化基于2B10的Fab-IL2-Fab构建体。纯化规程基于下列四个步骤：
1.用MabSelect Sure或蛋白G的亲和层析
2.为了逆转录病毒灭活而保持低pH
3.阴离子交换层析-CaptoQ层析，以除去DNA
4.阳离子交换层析-SP Sepharose FF层析，以除去聚集体
为了除去小规模的聚集体，可以备选地使用Superdex 200柱(GEHealthcare)上的大小排阻层析。
随后，对基于3F2的Fab-IL2-Fab给出纯化规程的一个例子。在第一步中，将来自Freestyle培养基(Invitrogen)中的经瞬时PEI转染的HEK293细胞的上清液调节至pH7，并应用于MabSelect蛋白A柱(GE Healthcare)，用100mMNaPO4、250mM NaCl pH 7清洗，并用8.8mM甲酸钠pH3洗脱。将选定的级分在清洗缓冲液中更换，并应用于CaptoQ柱(GE Healthcare)，用10mMNaPO4，40mM NaCl pH6.5清洗，并用2M NaCl洗脱。将流过物调节至pH5，并应用于SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)，用25mM乙酸钠、25mM NaCl，pH5清洗，并用25mM乙酸钠、300mM NaCl pH5洗脱。将级分更换入最终的配制剂缓冲液中。图27显示了纯化规程的概述。
纯化的基于3F2的Fab-IL2-Fab在纯化后是纯的(图28A)，并且不含聚集体(图28B)。将所描述的纯化规程应用于基于4G8的Fab-IL2-Fab。基于4G8的Fab-IL2-Fab与基于3F2的Fab-IL2-Fab类似地运转。纯化的材料在纯化后是纯的，并且不含聚集体(图28，C-D)。
对具有2B10(TNC A2结合剂)作为Fab片段的Fab-IL2-Fab形式实施纯化。在第一步中，将来自Freestyle培养基(Invitrogen)中的经瞬时PEI转染的HEK293细胞的上清液调节至pH7，并应用于蛋白G柱(GE Healthcare)，用100mM NaPO4、250mM NaCl pH7清洗，并用8.8mM甲酸钠pH3洗脱。将选定的级分在清洗缓冲液中更换，并应用于CaptoQ柱(GE Healthcare)，用10mMNaPO4，40mM NaCl pH6.5清洗，并用2M NaCl洗脱。将流过物调节至pH5，并应用于SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)，用25mM乙酸钠、25mM NaCl，pH 5清洗，并用25mM乙酸钠、300mM NaCl pH5洗脱。将级分更换入最终的配制剂缓冲液中。
图29显示了来自(A)通过SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对产物的分析表征和(B)三个纯化步骤之每个后的产物的分析用大小排阻层析的结果。在终产物中检出2.3％聚集体。
实施例15
稳定性测试
对具有纤连蛋白胞外域-B结合剂L19作为Fab片段的Fab-IL2-Fab形式实施稳定性测试。对于稳定性测试，通过蛋白A亲和层析及于pH3的洗脱步骤，接着在Superdex 200柱(GE Healthcare)上进行大小排阻层析来纯化Fab-IL2-Fab构建体，如描述的。测试三种不同缓冲液，并将20mM盐酸组氨酸、140mM NaCl，pH6.0鉴定为合适的缓冲液。随后，将L19Fab-IL2-Fab以6.3mg/ml的浓度在20mM盐酸组氨酸、140mM NaCl，pH6.0中配制，并于室温及于4℃贮存4周。图30显示了例示性的稳定性数据：通过UV分光术每周对探针分析浓度(图30A)(在离心以沉淀潜在的沉淀物质后)并通过在Superdex 200柱上的分析用大小排阻层析来分析聚集体含量(图30B)。结果显示在将构建体于4℃或于室温贮存28天时以及在6mg/ml浓度在冷冻/融化循环后，没有发生聚集和降解。这些数据显示了，Fab-IL2-Fab形式是高度稳定的，并且与IgG抗体表现相当。
实施例16
通过表面等离振子共振(Biacore)得到的FAP靶向性Fab-IL2-Fab结合亲和力
通过表面等离振子共振来测定三种FAP靶向性构建体3F2 Fab-IL2-Fab、4G8 Fab-IL2-Fab和3D9 Fab-IL2-Fab的结合亲和力。
为了测定FAP结合，通过固定化的抗His抗体(Penta His，Qiagen#34660)捕获FAP，并使用构建体作为分析物。分析温度是25℃，并将Fab-IL2-Fab构建体以1∶5稀释，自10nM至3.2pM。应用下列测量参数：结合时间180秒，解离900秒，流动90μl/分钟。用10mM甘氨酸pH 2将芯片再生60秒。将曲线以1∶1模型拟合以得到KD值(Rmax局部，RI＝0)。
为了测定针对IL-2受体(IL-2R)链的亲和力，将IL-2R的β和γ链(b/g；突出-入-穴构建体)或α链(a)在芯片上固定化，并使用Fab-IL2-Fab构建体作为分析物。分析温度是25℃。将Fab-IL2-Fab构建体3F2和3D9以1∶2稀释，自25nM至0.78nM，并应用下列测量参数：结合时间100秒，解离180秒，流动90μl/分钟。用10mM甘氨酸pH1.5将芯片再生20秒。将Fab-IL2-Fab构建体4G8自100nM稀释至3.125nM，并应用下列测量参数：结合时间180秒，解离180秒，流动40μl/分钟。用3M MgCl2再生30秒。
表19给出了3F2Fab-IL2-Fab、4G8Fab-IL2-Fab和3D9Fab-IL2-Fab免疫缀合物的结合亲和力的汇总。皮摩尔亲和力数值达到Biacore检测的限度。图31-34显示了相应的Biacore传感图和亲和力。
表19.
如通过表面等离振子共振测定的针对来自不同物种的FAP和IL-2受体的FAP靶向性Fab-IL2-Fab构建体的动力学平衡常数(KD)的汇总
Figure BDA0000153472770001441
实施例17
通过表面等离振子共振(Biacore)得到的TNC A2靶向性Fab-IL2-Fab结合亲和力
为了测定TNC A2结合，将生物素化的抗原(TNC fn5-A1-A2-A3域，融合在一起，在大肠杆菌中表达。虽然fn5和A3域总是人起源的，但是A1和A2域是人、鼠或猕猴的)在链霉亲合素芯片上固定，并使用免疫缀合物构建体作为分析物。分析温度是25℃。将Fab-IL2-Fab以1∶2稀释，自25nM至0.39nM，并应用下列测量参数：结合时间180秒，解离180秒，流动50μl/分钟。用10mM甘氨酸pH1.5再生60秒。将曲线以1∶1模型拟合以得到KD值。作为阴性对照，应用HEK细胞中生成的TNC域1至8(TNC 1-8HEK)。
为了测定针对IL-2受体(IL-2R)β和γ链(b/g；突出-入-穴构建体)的亲和力，将IL-2R构建体在芯片上固定，并使用Fab-IL2-Fab免疫缀合物作为分析物。分析温度是25℃。将Fab-IL2-Fab免疫缀合物以1∶2稀释，自25nM至0.78nM，并应用下列测量参数：结合时间100秒，解离180秒，流动90μl/分钟。用10mM甘氨酸pH1.5完成再生20秒。将Fab-IL2-Fab构建体稀释，自100nM至3.125nM，并应用下列测量参数：结合时间180秒，解离180秒，流动40μl/分钟。用3M MgCl2再生30秒。表20给出了2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的结合亲和力的汇总，图35显示了相应的Biacore传感图和亲和力。
表20.
如通过表面等离振子共振测定的针对来自不同物种的TNC A2和IL-2受体-β/γ的TNC A2靶向性Fab-IL2-Fab构建体的动力学平衡常数(KD)的汇总
Figure BDA0000153472770001451
实施例18
用靶向性IL-2 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的生物学活性测定法
与IL-2(Proleukin)相比，在数个细胞测定法中研究靶向性IL-2Fab-IL2-Fab免疫缀合物的生物学活性。
对NK92细胞增殖的诱导
与IL-2(Proleukin)和识别纤连蛋白-EDB的IL-2L19双抗体相比，对识别TNC A2(2B10)或FAP(3F2和4G8)的靶向性IL-2 Fab-IL2-Fab分子调查其诱导NK92细胞增殖的潜力。
将2μg/ml人生腱蛋白、FAP或纤连蛋白于4℃在96孔平底ELISA板中包被过夜。封闭平板后，将Fab-IL2-Fab构建体或双抗体滴定入平板中，并于室温(RT)温育90分钟以进行结合。强烈清洗以除去未结合的构建体后，添加IL-2饥饿的NK92细胞(10000个细胞/孔)。作为阳性对照，将Proleukin在溶液中添加至一些孔。将细胞于37℃在湿润的培养箱(具有5％CO2)中温育2天，之后裂解细胞以使用CellTiter Glo试剂盒(Promega)通过ATP测量来测定增殖。
图36中的结果显示了所有Fab-IL2-Fab构建体都能够激活NK92细胞上的IL-2R信号传导，并刺激其增殖。由于针对信号传导需要的IL-2R β/γ异二聚体的结合亲和力降低，与IL-2(Proleukin)相比，诱导细胞生长的效力降低约10倍或更多。然而，较高剂量的总体功效得到保留并且与IL-2(Proleukin)相当。
STAT5磷酸化的诱导
在另一个实验中，我们在溶液中测试了在不同效应器细胞群体，包括来自人PBMC的A)CD56+NK细胞、B)CD4+CD25-CD127+辅助T细胞、C)CD3+，CD8+细胞毒性T细胞和D)CD4+CD25+FOXP3+调节T细胞(Tregs)上测试了在与识别FAP的IL-2 Fab-IL2-Fab分子(基于4G8)一起温育后由于IL-2介导的IL-2受体信号传导所致的STAT5磷酸化诱导。
用不同浓度的Proleukin或Fab-IL2-Fab来将自健康供体血液分离的PBMC处理20分钟，之后将它们固定/透化，并用抗磷酸STAT5抗体(Becton Dickinson)依照供应商的指令将它们染色。在磷酸化的STAT5及FOXP3的胞内染色后，对表面标志物(CD3、CD4、CD8、CD56和CD127)染色以通过流式细胞术(FACS Canto II)测定不同亚群。
图37中的结果确认来自图36的发现，并且显示了4G8Fab-IL2-Fab构建体能够对各种IL-2R阳性效应器细胞激活IL-2R信号传导，并且诱导IL-2R下游信号传导和STAT5磷酸化。由于针对信号传导需要的IL-2R β/γ异二聚体的结合亲和力降低，与IL-2(Proleukin)相比，诱导STAT5磷酸化的效力降低约10倍或更多。然而，较高剂量的总体功效得到保留并且与IL-2(Proleukin)相当。
在溶液中及在固定化后的IFN-γ释放和增殖诱导
在另一个实验中，我们旨在模拟肿瘤中会发生的情况，其中将靶向性IL-2免疫缀合物结合，并在肿瘤细胞或肿瘤基质上固定化，并且其可以活化效应器细胞。为了完成这点，我们实施用NK92细胞的IFN-γ释放测定法以及用溶液中的免疫缀合物的增殖测定法或者我们用TNC或FAP抗原包被微量滴定板，使得靶向性IL-2免疫缀合物在结合TNC或FAP后固定化。
将2μg/ml人生腱蛋白或FAP于4℃在96孔平底ELISA板中包被过夜。封闭平板后，将Fab-IL2-Fab构建体滴定入平板中，并于RT温育90分钟以进行结合。强烈清洗以除去未结合的构建体后，添加IL-2饥饿的NK92细胞(10000个细胞/孔)。作为阳性对照，将Proleukin在溶液中添加至一些孔。为了测定增殖，将细胞于37℃在湿润的培养箱(具有5％CO2)中温育2天，之后裂解细胞以使用CellTiter Glo试剂盒(Promega)通过ATP测量来测定增殖。在不同方法中在与细胞上清液中的Fab-IL-2-Fab温育24小时后用来自BectonDickinson的人IFN-γELISA试剂盒测量IFN-γ的释放。
结果确认靶向FAP、TNC A1或TNC A2的所有Fab-IL2-Fab构建体能够激活NK92细胞上的IL-2R信号传导，并且在存在于溶液中时诱导细胞增殖(图38A)及IFN-γ分泌(图38C)。由于针对信号传导需要的IL-2R β/γ异二聚体的结合亲和力降低，与IL-2(Proleukin)相比，诱导IFN-γ释放的效力降低约10倍或更多。然而，较高剂量的总体功效得到保留并且与IL-2(Proleukin)相当。若用FAP或TNC包被微量滴定板，并将构建体在平板上固定化，则靶向FAP、TNC A1或TNC A2的所有Fab-IL2-Fab构建体仍能够激活NK92细胞上的IL-2R信号传导，并诱导细胞生长(图38B)和IFN-γ释放(图38D)。与溶液中实施的测定法相比，未包被的IL-2(Proleukin)与固定化的Fab-IL2-Fab构建体间的功效差异高一个数量级，然而，较高剂量的总体功效得到保留并且与IL-2(Proleukin)相当。
这些数据强烈支持制备具有低系统暴露，但是在它们介导其功能的疾病部位积累的靶向性免疫缀合物的想法。
在以下实施例中，我们调查这些体外特性是否转化为异种移植物模型中的卓越体内功效。
实施例19
针对FAP和TNC A2的靶向性Fab-IL2-Fab免疫缀合物在人肿瘤细胞系的异种移植物中的体内功效
在数种异种移植物模型中对针对FAP和TNC A2的靶向性Fab-IL2-Fab免疫缀合物测试其抗肿瘤功效。
LS174T异种移植物模型
在脾内注射入SCID小鼠中的人直肠结肠LS174T细胞系中测试TNC A2靶向性2B10Fab-IL2-Fab免疫缀合物。
LS174T细胞(人结肠癌细胞)最初获自ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture))，并在扩充后保藏于Glycart内部细胞库中。将LS174T在含有10％FCS(PAA Laboratories，Austria)、1％Glutamax和1％MEM非必需氨基酸(Sigma)的MEM Eagle氏培养基中培养。将细胞于37℃在水饱和的气氛中于5％CO2培养。使用体外第15代来进行脾内注射，存活力为92.8％。在麻醉的SCID/米色小鼠的左腹部部位产生小切口。经由刚刚在脾被膜下的腹壁注射50微升(在AimV培养基中的3x106个LS174T细胞)细胞悬浮液。使用夹子(clamp)闭合皮肤伤口。
将雌性SCID小鼠(在实验开始时年龄为8-9周)(购自Taconics，Denmark)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的准则(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验研究方案得到地方政府审阅并批准(P2008016)。到达后，将动物维持一周以适应新环境，并进行观察。定期实施连续健康监测。
在研究第0天给小鼠脾内注射3x106个LS174T细胞，将其随机化，并称重。肿瘤细胞注射后1周，每周两次给小鼠i.v注射TNC A2靶向性2B10Fab-IL2-Fab (Fab-IL2-Fab-SH2B10)、纤连蛋白-EDB靶向性L19IL-2-双抗体、或Proleukin达三周。
给所有小鼠i.v注射200μl合适的溶液。给媒介物组中的小鼠注射PBS，给处理组注射Fab-IL2-Fab构建体、双抗体、或Proleukin。为了获得每200μl合适量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。
图39显示了与裸IL-2(Proleukin)和靶向纤连蛋白-EDB的IL-2双抗体分子相比，TNC A2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物(TNC A2 targeted 2B10Fab-IL2-Fab immunoconjugate)就延长的中值存活而言有卓越的功效。
表21.
Figure BDA0000153472770001481
ACHN异种移植物模型
在肾内注射入SCID小鼠中的人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性3F2或4G8 Fab-IL2-Fab免疫缀合物。
ACHN细胞(人肾腺癌细胞)最初获自ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))，并在扩充后保藏于Glycart内部细胞库中。将ACHN在含有10％FCS的DMEM中培养。将细胞于37℃在水饱和的气氛中于5％CO2培养。使用体外第9代来进行肾内注射，存活力为97.7％。在麻醉的SCID小鼠的右体侧和腹壁产生小切口(2cm)。在肾中囊下2mm注射50μl(AimV培养基中的1x106个ACHN细胞)细胞悬浮液。使用夹子闭合皮肤伤口和腹壁。
将雌性SCID小鼠(在实验开始时年龄为8-9周)(购自Charles River，Sulzfeld，Germany)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的准则(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验研究方案得到地方政府审阅并批准(P2008016)。到达后，将动物维持一周以适应新环境，并进行观察。定期实施连续健康监测。
在研究第0天给小鼠肾内注射1x106个ACHN细胞，将其随机化，并称重。肿瘤细胞注射后1周，每周两次给小鼠i.v注射Proleukin、L19IL-2双抗体或FAP靶向性4G8或3F2Fab-IL2-Fab免疫缀合物达三周。
给所有小鼠i.v注射200μl合适的溶液。给媒介物组中的小鼠注射PBS，给处理组注射Proleukin、L19IL-2双抗体或FAP靶向性4G8或3F2Fab-IL2-Fab免疫缀合物。为了获得每200μl合适量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。
图40显示了与裸IL-2(Proleukin)和靶向纤连蛋白-EDB的IL-2双抗体分子相比，FAP靶向性3F2和4G8 Fab-IL2-Fab免疫缀合物就延长的中值存活而言有卓越的功效。基于4G8的Fab-IL2-Fab(其具有较高的针对鼠FAP的亲和力)比基于3F2的Fab-IL2-Fab，介导卓越的功效。
表22.
Figure BDA0000153472770001491
Figure BDA0000153472770001501
A549异种移植物模型
在i.v注射入SCID-人FcγRIII转基因小鼠中的人NSCLC细胞系A549中测试TNC A2靶向性2B 10Fab-IL2-Fab免疫缀合物。
A549非小细胞肺癌细胞最初获自ATCC(CCL-185)，并在扩充后保藏于Glycart内部细胞库中。将肿瘤细胞系在含有10％FCS(Gibco)的DMEM中于37℃在水饱和的气氛中于5％CO2常规培养。使用第2代来进行移植，存活力为98％。将每只动物2x106个细胞在200μl Aim V细胞培养基(Gibco)中i.v注射入尾静脉中
将雌性SCID-FcγRIII小鼠(GLYCART-RCC)(在实验开始时年龄为8-9周)(在RCC，Switzerland饲养)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的准则(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验研究方案得到地方政府审阅并批准(P2008016)。到达后，将动物维持一周以适应新环境，并进行观察。定期实施连续健康监测。
在研究第0天给小鼠i.v注射5x106个A549细胞，将其随机化，并称重。肿瘤细胞注射后1周，每周两次给小鼠i.v注射2B10 Fab-IL2-Fab或L19IL-2双抗体达三周。
给所有小鼠i.v注射200μl合适的溶液。给媒介物组中的小鼠注射PBS，给处理组注射2B10 Fab-IL2-Fab构建体或L19 IL-2双抗体。为了获得每200μl合适量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。
图41显示了与靶向纤连蛋白-EDB的IL-2双抗体分子相比，TNC A2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物就延长的中值存活而言介导卓越的功效。
表23.
Figure BDA0000153472770001502
Figure BDA0000153472770001511
实施例20
靶向性GM-CSF Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的纯化
自经瞬时转染的HEK 293 EBNA细胞的上清液实施具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab片段的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的初始纯化。简言之，通过蛋白A，接着进行大小排阻层析来纯化Fab-GM-CSF-Fab。将蛋白A柱在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5中平衡。加载上清液，并首先用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5，接着用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠，pH7.5清洗该柱。将靶向性GM-CSF用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH3洗脱，随后将其中和。对于配制剂，应用以下缓冲液：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸pH6.7。
图42显示了来自纯化的洗脱概况和来自通过SDS-PAGE(NuPAGENovex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对产物的分析表征的结果。收率是4.8mg/L。
实施例21
用靶向性GM-CSF Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的生物学活性测定法
随后，在GM-CSF依赖性增殖测定法中分析具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的纯化的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物。简言之，将TF-1细胞(其依赖GM-CSF生长)在过夜饥饿后以10000个细胞/孔接种入96孔平底板中。将人重组GM-CSF(Miltenyi#130-093-862)或Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物滴定入溶液中的细胞中。于37℃在湿润的培养箱中在5％CO2的情况中增殖2天后，将细胞裂解，并用来自Promega的CellTiter Glo测定法测量ATP含量。为了计算，将未用GM-CSF处理的细胞设置为0％生长。图43中的结果显示了Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物诱导TF-1细胞的强烈增殖。
实施例22
靶向性IL-12 Fab-IL 12-Fab免疫缀合物的纯化
自经瞬时转染的HEK 293 EBNA细胞的上清液实施具有4G8(FAP结合剂)作为Fab片段的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的初始纯化。简言之，通过蛋白A，接着进行大小排阻层析来纯化Fab-IL12-Fab。将蛋白A柱用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡。加载上清液，并用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠pH7.5清洗该柱。用13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠，pH5.45实施第二次清洗。在用10mM MES、50mM氯化钠pH5第三次清洗后，用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH3洗脱靶向性IL-12，随后将其中和。对于配制剂，应用以下缓冲液：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸pH6.7。
图44显示了来自纯化的洗脱概况和来自通过SDS-PAGE(NuPAGENovex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对产物的分析表征的结果。收率是43mg/L。
实施例23
用靶向性IL-12 Fab-IL12-Fab免疫缀合物的生物学活性测定法
随后，使用自健康供体的新鲜人血液分离的PBMC对具有4G8(FAP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL12-Fab免疫缀合物分析IL-12诱导的IFN-γ释放，比较IL-12和纯化的4G8Fab-IL12-Fab免疫缀合物的效果。
简言之，自健康供体的新鲜人血液分离PBMC，并在96孔U底面板(1.5x105个细胞/孔)中在AIM V培养基中接种。将恒定浓度10ng/ml hu IL-2(Peprotech)添加至所有孔。将Fab-IL12-Fab构建体在培养基中稀释，并滴定至PBMC上。在约20小时后收集上清液以使用来自Becton Dickinson(#550612)的hu IFN-γELISA试剂盒II来测定IFN-γ浓度。
图45中的结果显示了A)选定量的单独的人(hu)IL-2及单独的IL-12不能诱导显著的人PBMC的IFN-γ释放，而这两种细胞因子的组合导致显著的PBMC的IFN-γ释放。B)Fab-IL-12-Fab构建体在存在10ng/ml人IL-2的情况下以浓度依赖性方式诱导人PBMC的IFN-γ释放。
实施例24
靶向性IFN-αFab-IFNα2-Fab免疫缀合物的纯化
自经瞬时转染的HEK 293 EBNA细胞的上清液实施具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab片段的Fab-IFNα2-Fab免疫缀合物的初始纯化。简言之，通过蛋白A，接着进行大小排阻层析来纯化Fab-IFNα2-Fab。将蛋白A柱用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡。加载上清液，并首先用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5，接着用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠，pH7.5清洗该柱。将Fab-IFNα2-Fab用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH3洗脱，随后将其中和。对于配制剂，应用以下缓冲液：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸pH6.7。
图46显示了来自纯化的洗脱概况和来自通过SDS-PAGE(NuPAGENovex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对产物的分析表征的结果。收率是8.4mg/L。
实施例25
用IFN-αFab-IFNα2-Fab免疫缀合物的生物学活性测定法
随后，对具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IFNα2-Fab免疫缀合物分析IFN-α诱导的对Jurkat T细胞和A549肿瘤细胞的增殖抑制，比较IFN-α(Roferon A，Roche)和纯化的L19 Fab-IFNα2-Fab免疫缀合物的效果。简言之，将对IFN-α诱导的增殖抑制易感的A549和Jurkat T细胞以5000个细胞/孔(A549)或10000个细胞/孔(Jurkat)接种入96孔平底板中。将合适的细胞培养基中的Roferon A(Roche)或Fab-IFNα2-Fab稀释物滴定至溶液中的细胞上。于37℃在湿润的培养箱中在5％CO2的情况中增殖2天后，将细胞裂解，并用来自Promega的CellTiter Glo测定法测量ATP含量。为了计算，将未用IFN-α处理的细胞设置为0％生长。
图47中的结果显示了，Fab-IFNα2-Fab构建体以与IFN-α(RoferonA)相当的浓度依赖性方式抑制A)Jurkat T细胞和B)A549细胞的增殖。
实施例26
MCSP靶向性Fab-IL2-Fab免疫缀合物的制备
生成人源化的抗MCSP MHLG抗体，如记载于WO 2006/100582的(具体见其中的实施例1)(通过提及而将其全部内容收入本文)，并将其转化成Fab-IL2-Fab形式(见SEQ ID NO：255、256、261、262)。
如下生成人源化的抗MCSP MHLG1抗体：将抗MCSP抗体225.28的鼠氨基酸序列(轻链和重链，见下文)与人种系抗体V基因的集合比对，并依照序列同一性和同源性分类。
225.28轻链；GenBank登录号CAA65007(SEQ ID 267)：
DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK
225.28重链；无GenBank登录号(SEQ ID 268)：
QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS
基于高的总体同源性和已经在接受序列中正确的规范残基的存在来选择潜在的接受序列。选择人种系序列IGHV3-15(IMGT登录号X92216)作为重链的接受体，并选择序列IGKV1-9(IMGT登录号Z00013)作为轻链的接受体。人源化的构建体表示为M-KV1(见SEQ ID NO：263、264、269、270)、7(SEQ ID NO：265、266、271、272)和9(SEQ ID NO：253、254、259、260)(对于轻链)和MHLG1(见SEQ ID NO：251、252、257、258)(对于重链)。
通过常规的PCR技术来生成那些设计的抗体序列的基因，并与人IgG1和κ恒定域融合以构建表达质粒。
将抗体以IgG或以Fab-IL2-Fab融合蛋白在哺乳动物细胞培养系统，如HEK或CHO中表达，并经由蛋白A和大小排阻层析来纯化。轻链变体M-KV1与M-KV7的结合数据的比较揭示Kabat第46位的脯氨酸残基对于对抗原的功能性结合是至关重要的。采用两种不同方法来确保此氨基酸的存在：A)将所谓的回复突变引入IGKV1-9的人框架中。并且B)为了避免回复突变的存在，将整个框架2区(Kabat第35位至第49位)通过具有GenBank条目AAA17574的人抗体的相应区域替换。此抗体天然具有第46位的脯氨酸残基。
通过上文(实施例9)所描述的方法来纯化MCSP靶向性MHLG或MHLG1KV9 Fab-IL2-Fab，所述方法包括一个亲和步骤(蛋白A)，接着进行大小排阻层析(Superdex 200，GE Healthcare)。将蛋白A柱在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH 7.5中平衡，加载上清液，并用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠，pH7.5清洗该柱，接着用13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠，pH5.45清洗。任选地，包括用10mM MES、50mM氯化钠，pH 5的第三次清洗。用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH3洗脱Fab-IL2-Fab。将洗脱级分合并，并通过大小排阻层析在如下最终的配制剂缓冲液中精制：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸pH6.7。
图48(对于MHLG Fab-IL2-Fab)和图49(对于MHLG1 Fab-IL2-Fab)显示了(A)来自纯化的洗脱概况和(B)来自通过SDS-PAGE(NuPAGE NovexBis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，还原性和非还原性)对MCSP靶向性MHLG或MHLG1 Fab-IL2-Fab的分析表征的结果。
实施例27
用MCSP靶向性Fab-IL2-Fab免疫缀合物的生物学活性测定法
随后，对具有MHLG KV9或MHLG1 KV9(MCSP结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IL2-Fab免疫缀合物分析IL-2诱导的IFN-γ释放，比较纯化的4G8Fab-IL2-Fab(FAP结合剂)和MHLG或MHLG1 Fab-IL2-Fab对NK92细胞的影响。
将IL-2饥饿的NK92细胞(在没有IL-2的情况中预温育2小时)在96孔U底板(105个细胞/孔)中在NK细胞培养基(MEMa+10％FCS+10％马血清+0.1mM 2-巯基乙醇+0.2mM肌醇+0.02mM叶酸)中接种。将MCSP靶向性Fab-IL-2-Fab免疫缀合物在NK细胞培养基中稀释，并滴定至NK92细胞上，与FAP靶向性的基于4G8的Fab-IL2-Fab免疫缀合物直接比较。在22至24小时后收集上清液以使用来自Becton Dickinson(#550612)的人IFN-γELISA试剂盒II来测定IFN-γ浓度。
图50(对于MHLG KV9 Fab-IL2-Fab)和图51(对于MHLG1 KV9Fab-IL2-Fab)中的结果显示了靶向MCSP或FAP的所有Fab-IL2-Fab免疫缀合物以浓度依赖性方式在NK92细胞中诱导相当的IFN-γ分泌，不依赖于所使用的抗原结合模块。
实施例28
用MCSP靶向性MHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的细胞结合测定法
通过流式细胞术对纯化的MCSP靶向性MHLG1-KV9 Fab-IL2-Fab免疫缀合物测试对表达人MCSP的Colo38黑素瘤细胞的结合。简言之，将细胞收获，计数，并检查存活力。将细胞调节至PBS/0.1％BSA中的1.112x106个(活)细胞/ml，并在圆底96孔板中等分成180μl/孔(200’000个细胞/孔)。将20μlMHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab免疫细胞因子(不同稀释)添加至含有细胞的孔，并于4℃温育30分钟。随后，通过离心(4分钟，400xg)收集细胞，用150μl/孔PBS/0.1％BSA清洗，重悬，并于4℃与12μl/孔二抗(经FITC缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人F(ab’)2(Jackson Immuno Research Lab#109-096-097)，在1.5ml 1∶1水和甘油混合物中溶解＝储备溶液)一起温育30分钟，在PBS/0.1％BSA中以1∶20稀释。随后，将细胞在150μl/孔PBS/0.1％BSA中清洗，接着是PBS中的清洗步骤，通过离心(4分钟，400xg)收集，并用200μl/孔PBS/0.1％BSA(其含有碘化丙锭(PI))重悬。使用FACSCantoII机(Software FACS Diva)进行测量。图52中呈现了结果，其显示了MCSP靶向性MHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab免疫缀合物以剂量依赖方式非常好地结合Colo38细胞。
***
应当领会，发明详述部分，而不是发明概述和摘要部分意图用于解释权利要求书。发明概述和摘要部分可以列出一个或多个，但是不是本发明的所有例示性的实施方案，如本发明人预期的，并且如此，并不意图以任何方式限制本发明和所附权利要求书。
借助于例示执行规定功能及其关系的功能性构成部分，上文已经描述了本发明。为了方便描述，这些功能性构成部分的边界在本文中已经任意限定。可以限定交替的边界，使得规定的功能及其关系得到适当地实施。
具体实施方案的以上描述会如此完整地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以无需过度实验在不背离本发明一般想法的前提下，通过应用本领域技术内的知识，为了各种应用而容易地修饰和/或改编此类具体实施方案。因此，基于本文中所呈现的教导和指导，此类改编和修饰意图在所公开实施方案的等同方案的意义和范围内。应当理解，本文中的措词或术语是为了描述，而不是限制，从而熟练技术人员根据教导和指导，应当解读本说明书的术语或措词。
本发明的宽度和范围不应受到上文所描述的任何例示性实施方案限制，而是应当仅依照所附权利要求书及其等同方案限定。
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Claims (202)

1.一种免疫缀合物，其包含：
(a)至少第一单链效应器模块；和
(b)第一和第二抗原结合模块，其独立选自下组：Fv和Fab，
其中所述第一效应器模块与所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键；且
其中所述第二抗原结合模块与i)所述第一效应器模块或ii)所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键。
2.权利要求1的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物基本上由通过一个或多个接头序列连接的第一效应器模块和第一和第二抗原结合模块组成。
3.权利要求1或2的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块之每个是Fab分子。
4.权利要求3的免疫缀合物，其中所述第一Fab分子在其重或轻链羧基端氨基酸处与所述第二Fab分子的重或轻链的氨基端氨基酸连接。
5.权利要求4的免疫缀合物，其中所述第二Fab分子在其重或轻链羧基端氨基酸处与所述效应器模块的氨基端氨基酸连接。
6.权利要求4的免疫缀合物，其中所述效应器模块在其羧基端氨基酸处与所述第一Fab分子的氨基端氨基酸连接。
7.权利要求3的免疫缀合物，其中所述第一Fab分子在其重或轻链羧基端与所述效应器模块的氨基端氨基酸连接。
8.权利要求7的免疫缀合物，其中所述效应器模块在其羧基端氨基酸处与所述第二Fab分子的重或轻链的末端氨基酸连接。
9.一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含在其氨基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接的第一单链效应器模块，且
其中所述第一单链效应器模块在其羧基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接。
10.一种免疫缀合物，其包含：
a)至少第一单链效应器模块；和
b)第一和第二抗原结合模块，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域独立选自下组：IgG CH1、IgG Cκ和IgE CH4；
其中所述第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与所述第一效应器模块的氨基端氨基酸连接；且
其中所述第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
11.权利要求10的免疫缀合物，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG CH1域的恒定区连接的scFv分子。
12.权利要求10的免疫缀合物，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgE CH4域的恒定区连接的scFv分子。
13.权利要求10的免疫缀合物，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG Cκ域的恒定区连接的scFv分子。
14.权利要求10的免疫缀合物，其中所述第一抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG CH1域的恒定区连接的scFv分子，且其中所述第二抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG Cκ域的恒定区连接的scFv分子。
15.一种免疫缀合物，其包含：
a)至少第一单链效应器模块；和
b)第一和第二抗原结合模块，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与IgG CH3域连接的scFv分子；
其中所述第一抗原结合模块在其羧基端氨基酸处与所述第一效应器模块的氨基端氨基酸连接；且
其中所述第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
16.权利要求10-15中任一项的免疫缀合物，其中所述第一抗原结合模块的恒定区经由至少一个二硫键与所述第二抗原结合模块的恒定区共价连接。
17.权利要求16的免疫缀合物，其中所述第一抗原结合模块的免疫球蛋白域经由二硫键与所述第二抗原结合模块的免疫球蛋白域共价连接。
18.权利要求16的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的羧基端。
19.权利要求16的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基端。
20.权利要求19的免疫缀合物，其中至少两个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基端。
21.权利要求10的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含第二效应器模块，且其中所述第二抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与所述第二效应器模块的氨基端氨基酸连接。
22.一种免疫缀合物，其包含：
a)第一和第二单链效应器模块；和
b)第一和第二抗原结合模块，其中每个所述抗原结合模块包含在其重或轻链羧基端氨基酸处与IgG1 CH3域连接的Fab分子；
其中每个所述IgG1 CH3域在其羧基端氨基酸处与所述效应器模块之一的氨基端氨基酸连接；且
其中所述第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
23.权利要求22的免疫缀合物，其中所述IgG1 CH3域通过单一二硫键连接。
24.权利要求22或权利要求23的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的所述IgG1 CH3域的羧基端。
25.权利要求22或权利要求23的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的所述IgG1 CH3域的氨基端。
26.权利要求25的免疫缀合物，其中至少两个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的所述IgG1 CH3域的氨基端。
27.权利要求1-26中任一项的免疫缀合物，其中蛋白水解切割位点位于所述抗原结合模块和所述效应器模块间。
28.权利要求1-26中任一项的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块的可变区对同一抗原是特异性的。
29.权利要求1-26中任一项的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块的可变区对不同抗原是特异性的。
30.权利要求28的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块对纤连蛋白的额外域B(EDB)是特异性的。
31.权利要求29的免疫缀合物，其中所述第一或所述第二抗原结合模块对纤连蛋白的额外域B(EDB)是特异性的。
32.权利要求30或权利要求31的免疫缀合物，其中对EDB特异性的所述一个或两个抗原结合模块与单克隆抗体L19竞争对EDB表位的结合。
33.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：95。
34.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：108具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
35.权利要求34的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：108编码的多肽序列。
36.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：104。
37.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：117具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
38.权利要求37的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：117编码的多肽序列。
39.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：105。
40.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：118具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
41.权利要求40的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：118编码的多肽序列。
42.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：106。
43.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：119具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
44.权利要求43的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：119编码的多肽序列。
45.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：107。
46.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：120具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
47.权利要求46的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：120编码的多肽序列。
48.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：96。
49.权利要求30至32中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：109具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
50.权利要求49的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：109编码的多肽序列。
51.权利要求33-47中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含多肽序列SEQ ID NO：96。
52.权利要求28的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块对生腱蛋白的A1域(TNC-A1)是特异性的。
53.权利要求29的免疫缀合物，其中所述第一或所述第二抗原结合模块对生腱蛋白的A1域(TNC-A1)是特异性的。
54.权利要求52或53的免疫缀合物，其中对TNC-A1特异性的所述一个或两个抗原结合模块与单克隆抗体F16竞争对TNC-A1表位的结合。
55.权利要求52或权利要求54的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：99。
56.权利要求52或权利要求54的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：112具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
57.权利要求56的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：112编码的多肽序列。
58.权利要求52或权利要求54的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：100。
59.权利要求52或权利要求54的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：113具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
60.权利要求59的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：113编码的多肽序列。
61.权利要求52至54中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：101。
62.权利要求52至54中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：114具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
63.权利要求62的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：114编码的多肽序列。
64.权利要求58至60中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含多肽序列SEQ ID NO：101。
65.权利要求52的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ IDNO：215。
66.权利要求52的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：216具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
67.权利要求66的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：216编码的多肽序列。
68.权利要求52或53的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQID NO：235。
69.权利要求52或53的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ IDNO：236具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
70.权利要求69的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：236编码的多肽序列。
71.权利要求65至67中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含多肽序列SEQ ID NO：235。
72.权利要求52或权利要求53的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含重链可变区序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15。
73.权利要求52或权利要求53的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含轻链可变区序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11。
74.权利要求72的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含轻链可变区序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11。
75.权利要求72的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码。
76.权利要求75的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16编码。
77.权利要求73的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码。
78.权利要求77的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12编码。
79.权利要求28的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块对生腱蛋白的A2域(TNC-A2)是特异性的。
80.权利要求29的免疫缀合物，其中所述第一或所述第二抗原结合模块对生腱蛋白的A2域(TNC-A2)是特异性的。
81.权利要求79或80的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的重链可变区序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：179，SEQ ID NO：183，SEQID NO：187，SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：199，SEQ IDNO：203和SEQ ID NO：207。
82.权利要求79或80的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：177，SEQ IDNO：181，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：193，SEQ IDNO：197，SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：205。
83.权利要求81的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含选自下组的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：177，SEQID NO：181，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：193，SEQ IDNO：197，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：205。
84.权利要求81的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：180，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：208。
85.权利要求84的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：180，SEQ ID NO：184，SEQID NO：188，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：200，SEQ IDNO：204和SEQ ID NO：208。
86.权利要求82的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：206。
87.权利要求86的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：178，SEQ IDNO：182，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：194，SEQ IDNO：198，SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：206。
88.权利要求79的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO：SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：243。
89.权利要求79的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸编码的多肽序列：SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：244。
90.权利要求89的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242和SEQ IDNO：244。
91.权利要求79或80的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：249。
92.权利要求79或80的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸编码的多肽序列：SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248和SEQ ID NO：250。
93.权利要求92的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248和SEQ IDNO：250。
94.权利要求88至90中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247和SEQ IDNO：249。
95.权利要求28的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块对成纤维细胞激活蛋白(FAP)是特异性的。
96.权利要求29的免疫缀合物，其中所述第一或所述第二抗原结合模块对成纤维细胞激活蛋白(FAP)是特异性的。
97.权利要求95或96的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的重链可变区序列：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：77，SEQID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：175。
98.权利要求95或96的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的轻链可变区序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75，SEQID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：173。
99.权利要求97的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含选自下组的轻链可变区序列：SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：23，SEQID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：91，SEQID NO：121，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：133，SEQ IDNO：137，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：153，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：165，SEQ IDNO：169和SEQ ID NO：173。
100.权利要求97的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：70，SEQID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：176。
101.权利要求100的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQID NO：32，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：136，SEQ IDNO：140，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：152，SEQ IDNO：156，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：168，SEQ IDNO：172和SEQ ID NO：176。
102.权利要求98的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：68，SEQID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：174。
103.权利要求102的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：24，SEQID NO：30，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQID NO：122，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：134，SEQ IDNO：138，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：150，SEQ IDNO：154，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：166，SEQ IDNO：170和SEQ ID NO：174。
104.权利要求95的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO：209，SEQ ID NO：211，SEQ ID NO：213，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：227。
105.权利要求95的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸编码的多肽序列：SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：214，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：224，SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：228。
106.权利要求105的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：212，SEQ IDNO：214，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：222，SEQ IDNO：224，SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：228。
107.权利要求95或96的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233和SEQ IDNO：237。
108.权利要求95或96的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与选自下组的序列具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ IDNO：230、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：238。
109.权利要求108的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：232、SEQ IDNO：234和SEQ ID NO：238。
110.权利要求95的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自由SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：221组成的组的多肽序列，以及多肽序列SEQ ID NO：231。
111.权利要求95的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含选自由SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：227组成的组的多肽序列，以及多肽序列SEQ ID NO：229。
112.权利要求95的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ IDNO：213和多肽序列SEQ ID NO：233。
113.权利要求95的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ IDNO：217和多肽序列SEQ ID NO：237。
114.权利要求28的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块对黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)是特异性的。
115.权利要求29的免疫缀合物，其中所述第一或所述第二抗原结合模块对黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)是特异性的。
116.权利要求114或115的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含重链可变区序列SEQ ID NO：257或SEQ ID NO：261。
117.权利要求114或115的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含轻链可变区序列SEQ ID NO：259或SEQ ID NO：271。
118.权利要求116的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含轻链可变区序列SEQ ID NO：259或SEQ ID NO：271。
119.权利要求116的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由与序列SEQ IDNO：258或SEQ ID NO：262具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码。
120.权利要求119的免疫缀合物，其中所述重链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：258或SEQ ID NO：262编码。
121.权利要求117的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由与序列SEQ IDNO：260或SEQ ID NO：272具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码。
122.权利要求121的免疫缀合物，其中所述轻链可变区序列由多核苷酸序列SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：272编码。
123.权利要求114的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ IDNO：251或SEQ ID NO：255。
124.权利要求114的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：256具有至少80％同一性的多核苷酸编码的多肽序列。
125.权利要求124的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：256编码的多肽序列。
126.权利要求114或115的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：265。
127.权利要求114或115的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQ IDNO：254或SEQ ID NO：266具有至少80％同一性的多核苷酸编码的多肽序列。
128.权利要求127的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：254或SEQ ID NO：266编码的多肽序列。
129.权利要求123-125中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含多肽序列SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：265。
130.权利要求1-28中任一项的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块的可变区对癌细胞或病毒感染的细胞的细胞表面抗原或对肿瘤中表达的ECM分子是特异性的。
131.权利要求130的免疫缀合物，其中所述细胞表面抗原是肿瘤相关抗原或病毒抗原。
132.权利要求1-20中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物仅具有一个效应器模块；且其中所述效应器模块是细胞因子。
133.权利要求132的免疫缀合物，其中所述细胞因子选自下组：白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α(INF-α)和白介素-12(IL-12)。
134.权利要求133的免疫缀合物，其中所述细胞因子是IL-2。
135.权利要求133的免疫缀合物，其中所述细胞因子是IL-12。
136.权利要求132-135中任一项的免疫缀合物，其中所述细胞因子引发携带所述细胞因子受体的细胞的细胞毒性应答。
137.权利要求132-135中任一项的免疫缀合物，其中所述细胞因子引发携带所述细胞因子受体的细胞的增殖应答。
138.权利要求1或10-26中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有两个效应器模块；且其中所述效应器模块是细胞因子。
139.权利要求138的免疫缀合物，其中每个所述细胞因子独立选自下组：IL-2、GM-CSF、INF-α和IL-12。
140.权利要求139的免疫缀合物，其中所述细胞因子两者都是IL-2。
141.权利要求139的免疫缀合物，其中所述细胞因子两者都是IL-12。
142.权利要求138-141中任一项的免疫缀合物，其中所述细胞因子引发携带所述细胞因子受体的细胞的细胞毒性应答。
143.权利要求138-141中任一项的免疫缀合物，其中所述细胞因子引发携带所述细胞因子受体的细胞的增殖应答。
144.权利要求1-143中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物以比对照效应器模块的解离常数大至少2倍的解离常数(KD)结合效应器模块受体。
145.权利要求1-144中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物在施用期结束时在体内将肿瘤体积增加抑制至少30％。
146.一种编码权利要求1或2的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码所述第一和第二抗原结合模块的重链和所述第一效应器模块。
147.一种编码权利要求1或2的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码所述第一和第二抗原结合模块的轻链和所述第一效应器模块。
148.一种编码权利要求1或2的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码来自所述第一抗原结合模块的一条轻链、来自所述第二抗原结合模块的一条重链和所述第一效应器模块。
149.一种编码权利要求3-8中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码所述第一和第二Fab分子两者的重链和所述效应器模块。
150.一种编码权利要求3-8中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码所述第一和第二Fab分子两者的轻链和所述效应器模块。
151.一种编码权利要求3-8中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码来自所述第一Fab分子的一条轻链、来自所述第二Fab分子的一条重链和所述效应器模块。
152.编码权利要求9的免疫缀合物的分离的多核苷酸。
153.一种编码权利要求10-20中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述免疫缀合物仅具有一个效应器模块；且其中所述多核苷酸编码所述抗原结合模块之一和所述效应器模块。
154.一种编码权利要求10-21中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述免疫缀合物具有两个效应器模块；且其中所述多核苷酸编码所述抗原结合模块之一和所述效应器模块之一。
155.一种编码权利要求22-26中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码所述第一抗原结合模块的重链可变区和所述第一效应器模块的序列。
156.一种编码权利要求22-26中任一项的免疫缀合物的片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码所述第一抗原结合模块的轻链可变区和所述第一效应器模块的序列。
157.一种表达盒，其包含权利要求146-156中任一项的多核苷酸序列。
158.一种表达载体，其包含权利要求157的表达盒。
159.一种宿主细胞，其包含权利要求158的表达载体。
160.权利要求159的宿主细胞，其进一步限定为原核宿主细胞。
161.权利要求159的宿主细胞，其进一步限定为真核宿主细胞。
162.一种生成权利要求1-145中任一项的免疫缀合物的方法，其中该方法包括在适合于表达所述免疫缀合物的条件下培养权利要求159-161中任一项的宿主细胞。
163.一种用于促进活化的T淋巴细胞细胞中的增殖和分化的方法，包括使活化的T淋巴细胞与有效量的权利要求1-145中任一项的免疫缀合物接触。
164.权利要求163的方法，其中所述免疫缀合物诱导细胞毒性T细胞(CTL)活性。
165.一种用于促进活化的B淋巴细胞细胞中的增殖和分化的方法，包括使活化的B淋巴细胞细胞与有效量的权利要求1-134、136-140、或142-145中任一项的免疫缀合物接触。
166.一种用于促进天然杀伤(NK)细胞中的增殖和分化的方法，包括使NK细胞与有效量的权利要求1-145中任一项的免疫缀合物接触。
167.权利要求166的方法，其中所述免疫缀合物诱导NK/淋巴细胞活化的杀伤细胞(LAK)的抗肿瘤细胞毒性。
168.权利要求163-167中任一项的方法，其中所述免疫缀合物的至少一个效应器模块是IL-2。
169.一种用于促进粒细胞、单核细胞或树突细胞中的增殖和分化的方法，包括使粒细胞、单核细胞或树突细胞与有效量的权利要求1-133、137-139、或143-145中任一项的免疫缀合物接触。
170.权利要求169的方法，其中所述免疫缀合物的至少一个效应器模块是GM-CSF。
171.一种用于促进T淋巴细胞分化的方法，包括使T淋巴细胞细胞与有效量的权利要求1-145中任一项的免疫缀合物接触。
172.权利要求163、166或171中任一项的方法，其中所述免疫缀合物的至少一个效应器模块是IL-12。
173.一种抑制病毒复制的方法，包括使病毒感染的细胞与有效量的权利要求1-133、138、139、144、或145中任一项的免疫缀合物接触。
174.一种上调主要组织相容性复合体I(MHC I)表达的方法，包括使细胞与有效量的权利要求1-133、138、139、144、或145中任一项的免疫缀合物接触。
175.权利要求173或174中任一项的方法，其中所述免疫缀合物的至少一个效应器模块是IFN-α。
176.一种诱导细胞死亡的方法，包括对细胞施用有效量的权利要求1-132、136、138、142、144、或145中任一项的免疫缀合物。
177.权利要求176的方法，其中所述免疫缀合物对EDB是特异性的。
178.权利要求176的方法，其中所述免疫缀合物对TNC-A1是特异性的。
179.权利要求176的方法，其中所述免疫缀合物对TNC-A2是特异性的。
180.权利要求176的方法，其中所述免疫缀合物对MCSP是特异性的。
181.权利要求176的方法，其中所述免疫缀合物的所述效应器模块选自下组：IL-2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)。
182.权利要求181的方法，其中所述效应器模块是IL-2。
183.一种诱导靶细胞中的趋化性的方法，包括对靶细胞施用有效量的权利要求1-132、138、144、或145中任一项的免疫缀合物。
184.权利要求183的方法，其中所述免疫缀合物的所述效应器模块选自下组：白介素-8(IL-8)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和转化生长因子-β(TGF-β)。
185.权利要求163-184中任一项的方法，其中所述细胞在体内。
186.一种治疗个体中的疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的包含权利要求1-145中任一项的免疫缀合物的组合物的步骤。
187.权利要求186的方法，其中所述疾病是癌症。
188.权利要求186或187的方法，其中所述免疫缀合物对EDB是特异性的。
189.权利要求186或187的方法，其中所述免疫缀合物对TNC-A1是特异性的。
190.权利要求186或187的方法，其中所述免疫缀合物对TNC-A2是特异性的。
191.权利要求186或187的方法，其中所述免疫缀合物对FAP是特异性的。
192.权利要求186或187的方法，其中所述免疫缀合物对MCSP是特异性的。
193.权利要求186至192中任一项的方法，其中所述免疫缀合物包含IL-2。
194.权利要求186至193中任一项的方法，其中静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、颅内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、表面、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接浸泡靶细胞的局部灌注、经由导管、通过灌洗、在乳剂中、或在脂质组合物中施用所述组合物。
195.一种组合物，其包含权利要求1-145中任一项的免疫缀合物和药用载体。
196.权利要求1-145中任一项的免疫缀合物或权利要求195的组合物，其在制造用于治疗有此需要的患者中的疾病的药物中使用。
197.权利要求196的免疫缀合物，其中所述疾病是癌症。
198.权利要求1-145中任一项的免疫缀合物或权利要求195的组合物用于制造用于治疗有此需要的患者中的疾病的药物中的用途。
199.权利要求198的用途，其中所述疾病是癌症。
200.权利要求1-145中任一项的免疫缀合物，其用于治疗有此需要的患者中的疾病。
201.权利要求200的免疫缀合物，其中所述疾病是癌症。
202.如上文所描述的发明。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105612180A (zh) * 2013-07-19 2016-05-25 弗拉芒区生物技术研究所 经靶向修饰的il-1家族成员
CN106349393A (zh) * 2015-12-21 2017-01-25 合肥立方制药股份有限公司 一种增强抗体药物稳定性的结构
CN107207579A (zh) * 2015-03-31 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
WO2018121605A1 (zh) * 2016-12-29 2018-07-05 天津天锐生物科技有限公司 一种多功能蛋白质
CN109563141A (zh) * 2016-05-13 2019-04-02 奥里尼斯生物科学公司 对非细胞结构的治疗性靶向
CN110573172A (zh) * 2017-02-06 2019-12-13 奥里尼斯生物科学有限公司 靶向的工程化干扰素及其用途
CN112513276A (zh) * 2018-07-30 2021-03-16 张晋宇 蛋白质异二聚体及其用途

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
WO2011040973A2 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Tnf-immunoconjugates with fibroblast activation protein antibodies and methods and uses thereof
AU2015213405B2 (en) * 2010-08-13 2017-08-03 Roche Glycart Ag Anti-FAP antibodies and methods of use
MY175341A (en) * 2010-08-13 2020-06-19 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
JP5841149B2 (ja) 2010-08-13 2016-01-13 ロシュ グリクアート アーゲー 抗テネイシンｃａ２抗体及び使用の方法
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
CA2824252A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US9309306B2 (en) 2011-08-23 2016-04-12 Roche Glycart Ag Anti-MCSP antibodies
AU2012314860B2 (en) * 2011-09-26 2017-02-23 Philogen S.P.A. Immunocytokine combination therapy
EP2804877B1 (en) 2012-01-20 2018-08-22 VIB vzw Targeted mutant alpha-helical bundle cytokines
US20140079636A1 (en) * 2012-04-16 2014-03-20 Dinesh U. Chimmanamada Targeted therapeutics
CN104662045B (zh) * 2012-08-07 2019-04-05 罗切格利卡特公司 包含两种工程化改造成具有降低的和升高的效应器功能的抗体的组合物改进的免疫疗法
KR20150038012A (ko) 2012-08-08 2015-04-08 로슈 글리카트 아게 인터루킨-10 융합 단백질 및 그의 용도
MX2015001678A (es) 2012-08-09 2015-08-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos asgpr y sus usos.
US9561275B2 (en) 2012-09-14 2017-02-07 The Johns Hopkins University Compositions and methods for rendering tumor cells susceptible to CD8+ T cell-mediated killing
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014172448A2 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against activin receptor type ii (actrii)
CN110835376B (zh) 2013-07-18 2023-08-04 弗拉芒区生物技术研究所 涉及具有强烈降低的受体结合亲和力的细胞因子的融合因子
ES2686668T3 (es) 2013-07-19 2018-10-19 Vib Vzw Miembros de la familia TNF modificados dirigidos
KR102305608B1 (ko) 2013-07-19 2021-09-28 브이아이비 브이지더블유 사이토카인 길항제의 표적화
EP3035938B1 (en) 2013-09-10 2020-08-19 Madrigal Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutics
WO2015066053A2 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 Synta Pharmaceuticals Corp. Targeted therapeutics
JP2017505777A (ja) 2014-01-29 2017-02-23 シンタ ファーマスーティカルズ コーポレーション 標的化治療薬
MA39481A (fr) * 2014-03-03 2015-09-11 Synta Pharmaceuticals Corp Thérapies ciblées
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
WO2015143004A1 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Synta Pharmaceuticals Corp. Targeted therapeutics
WO2015168474A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion proteins for treating cancer and related methods
CR20170194A (es) 2014-11-14 2017-07-10 Hoffmann La Roche Moleculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf
GB201500875D0 (en) * 2015-01-19 2015-03-04 Philogen Spa Antibodies for treatment and diagnosis
EP3256484B1 (en) * 2015-02-13 2021-06-23 Agency For Science, Technology And Research Non-membrane disruptive p53 activating stapled peptides
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
BR112018002570A2 (pt) * 2015-10-02 2018-10-16 Hoffmann La Roche molécula de ligação ao antígeno biespecífica, anticorpo biespecífico, polinucleotídeos, anticorpo que se liga especificamente ao ox40, composição farmacêutica e método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo
CA3003969A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
UY37003A (es) 2015-12-04 2017-06-30 Novartis Ag Composiciones de anticuerpo injertado con citoquina y métodos para su uso en inmunorregulacion
JP6991979B2 (ja) 2016-02-05 2022-03-04 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ Ｃｄ８結合物質
US11661455B2 (en) 2016-02-05 2023-05-30 Orionis Biosciences BV Chimeric protein comprising an interferon alpha 2mutant and a PD-L1 binding moiety
US11248057B2 (en) 2016-03-07 2022-02-15 Vib Vzw CD20 binding single domain antibodies
EP3454887B1 (en) 2016-05-13 2021-01-20 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
SG11201901071TA (en) 2016-08-10 2019-03-28 Univ Ajou Ind Academic Coop Found Cytokine fused to immunoglobulin fc heterodimer and pharmaceutical composition comprising same
WO2018057727A1 (en) * 2016-09-21 2018-03-29 David Weiner Optimized synthetic consensus inmunogenic compositions targeting fibroblast activation protein
AU2017344440B2 (en) 2016-10-17 2020-07-30 Pfizer Inc. Anti-EDB antibodies and antibody-drug conjugates
CA3040802A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-gamma and uses thereof
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
CN110177875B (zh) 2016-11-28 2023-11-28 中外制药株式会社 包含抗原结合结构域和运送部分的多肽
MX2019009255A (es) 2017-02-06 2019-11-05 Orionis Biosciences Nv Proteínas quiméricas dirigidas y sus usos.
US11246911B2 (en) 2017-02-07 2022-02-15 Vib Vzw Immune-cell targeted bispecific chimeric proteins and uses thereof
BR112019017329A2 (pt) 2017-04-03 2020-04-14 Hoffmann La Roche imunoconjugados, um ou mais polinucleotídeos e vetores, métodos para a produção de um imunoconjugado, tratamento de uma doença e para a estimulação do sistema imunológico, composição, uso do imunoconjugado, invenção e usos da composição
WO2018184965A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
MX2019012187A (es) 2017-04-13 2019-11-25 Hoffmann La Roche Un inmunoconjugado de interleuquina-2, un agonista de cd40 y opcionalmente un antagonista de union al eje pd-1 para uso en metodos para tratar cancer.
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
IL299893A (en) 2017-06-20 2023-03-01 Madrigal Pharmaceuticals Inc prescribed medications
CN110799194A (zh) 2017-06-20 2020-02-14 马德里加尔制药公司 包含靶向治疗剂的联合疗法
HUE058233T2 (hu) 2017-08-03 2022-07-28 Amgen Inc Interleukin-21-muteinek és kezelési eljárások
JP7423511B2 (ja) 2017-08-09 2024-01-29 オリオンズ バイオサイエンス インコーポレイテッド Ｐｄ－１およびｐｄ－ｌ１結合物質
WO2019032661A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Orionis Biosciences Inc. CD8 LIAISON AGENTS
CR20200330A (es) 2018-01-12 2020-12-23 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y métodos de tratamiento
TW201934136A (zh) * 2018-02-09 2019-09-01 義大利商費洛根公司 靶向edb之il-12組合物
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
EP3847242A4 (en) * 2018-09-07 2022-06-08 NantBio, Inc. TARGETED IL-12 TREATMENTS AND METHODS TO STIMULATE HANK AND NK92MI CELLS
CN113286808A (zh) 2018-10-23 2021-08-20 蜻蜓疗法股份有限公司 异二聚体Fc融合蛋白
RU2708558C1 (ru) * 2018-12-13 2019-12-09 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4
US11440943B2 (en) 2019-03-28 2022-09-13 Orionis Biosciences, Inc. Therapeutic interferon alpha 1 proteins
US20220227837A1 (en) * 2019-05-24 2022-07-21 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
JP2022538139A (ja) 2019-07-02 2022-08-31 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 変異体インターロイキン－２及び抗ｃｄ８抗体を含む免疫複合体
PE20220299A1 (es) 2019-08-15 2022-03-07 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para fragmentos variables de cadena unica mejorados
CR20220512A (es) 2020-04-15 2022-11-07 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados
CA3177843A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 John Thomas MULLIGAN Compositions of protein complexes and methods of use thereof
EP4255923A2 (en) 2020-12-04 2023-10-11 F. Hoffmann-La Roche AG Ph-dependent mutant interleukin-2 polypeptides
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
WO2022189380A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies
TW202246358A (zh) 2021-03-09 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｐｄ－１靶向ｉｌ－２變體免疫結合物及ｆａｐ／４－１ｂｂ結合分子的組合療法
CA3234731A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag New interleukin-7 immunoconjugates
WO2023062048A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer
WO2023094569A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
WO2023131611A1 (en) * 2022-01-04 2023-07-13 Philogen S.P.A. Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101258162A (zh) * 2005-05-11 2008-09-03 菲罗根股份公司 抗纤连蛋白ed-b和白细胞介素12的抗体l19的融合蛋白

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
ATE207366T1 (de) * 1993-12-24 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
ATE433998T1 (de) * 1997-03-05 2009-07-15 Us Health Divalent anti-t-zellen immuntoxinen und deren verwendung
CA2312188C (en) * 1997-12-08 2010-06-29 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
ATE333900T1 (de) 2000-02-24 2006-08-15 Philogen Spa Zusamensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen
CA2403998A1 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Dyax Corp. Mucin-1 specific binding members and methods of use thereof
BR0112111A (pt) * 2000-06-29 2003-05-06 Merck Patent Gmbh Realce de respostas imunes mediadas por proteìna de fusão de anticorpo-citocina por tratamento combinado com agentes de realce de captação de imunocitocina
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US8491896B2 (en) * 2002-06-14 2013-07-23 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
WO2006100582A1 (en) * 2005-03-25 2006-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
US8744844B2 (en) * 2007-07-06 2014-06-03 Audience, Inc. System and method for adaptive intelligent noise suppression
MX2008013575A (es) 2006-05-08 2008-11-04 Philogen Spa Citoquinas dirigidas a anticuerpos para terapia.
EP2187971A2 (en) * 2007-08-01 2010-05-26 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101258162A (zh) * 2005-05-11 2008-09-03 菲罗根股份公司 抗纤连蛋白ed-b和白细胞介素12的抗体l19的融合蛋白

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105612180B (zh) * 2013-07-19 2019-11-12 弗拉芒区生物技术研究所 经靶向修饰的il-1家族成员
CN105612180A (zh) * 2013-07-19 2016-05-25 弗拉芒区生物技术研究所 经靶向修饰的il-1家族成员
CN107207579A (zh) * 2015-03-31 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
CN107207579B (zh) * 2015-03-31 2022-02-25 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
CN106349393A (zh) * 2015-12-21 2017-01-25 合肥立方制药股份有限公司 一种增强抗体药物稳定性的结构
CN109563141A (zh) * 2016-05-13 2019-04-02 奥里尼斯生物科学公司 对非细胞结构的治疗性靶向
WO2018121605A1 (zh) * 2016-12-29 2018-07-05 天津天锐生物科技有限公司 一种多功能蛋白质
CN109153725B (zh) * 2016-12-29 2022-02-11 深圳市北科生物科技有限公司 一种多功能蛋白质
CN109153725A (zh) * 2016-12-29 2019-01-04 天津天锐生物科技有限公司 一种多功能蛋白质
US11530264B2 (en) 2016-12-29 2022-12-20 Shenzhen Beike Biotechnology Co., Ltd Multifunctional protein
CN110573172A (zh) * 2017-02-06 2019-12-13 奥里尼斯生物科学有限公司 靶向的工程化干扰素及其用途
CN112513276A (zh) * 2018-07-30 2021-03-16 张晋宇 蛋白质异二聚体及其用途
CN112513276B (zh) * 2018-07-30 2024-03-15 张晋宇 蛋白质异二聚体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR101588598B1 (ko) 2016-01-29
MA33717B1 (fr) 2012-11-01
WO2011020783A2 (en) 2011-02-24
US8945571B2 (en) 2015-02-03
AU2010285071A1 (en) 2012-02-02
IL217844A0 (en) 2012-03-29
CA2769619C (en) 2019-04-30
TW201119672A (en) 2011-06-16
KR20120053042A (ko) 2012-05-24
CO6430436A2 (es) 2012-04-30
ES2534085T3 (es) 2015-04-17
AR077879A1 (es) 2011-09-28
CA2769619A1 (en) 2011-02-24
WO2011020783A3 (en) 2011-04-28
SG178443A1 (en) 2012-04-27
EP2467165A2 (en) 2012-06-27
JP5764127B2 (ja) 2015-08-12
CN102573922B (zh) 2015-08-05
HK1169318A1 (zh) 2013-01-25
MX2012002014A (es) 2012-06-13
ECSP12011685A (es) 2012-03-30
EP2467165B1 (en) 2015-01-07
PE20120630A1 (es) 2012-05-26
US20110064751A1 (en) 2011-03-17
RU2012110127A (ru) 2013-09-27
CR20120042A (es) 2012-03-22
RU2583876C2 (ru) 2016-05-10
JP2013502209A (ja) 2013-01-24
ZA201200767B (en) 2014-07-30
KR20150088328A (ko) 2015-07-31

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