JP2022538139A - 変異体インターロイキン－２及び抗ｃｄ８抗体を含む免疫複合体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、概して、免疫複合体、特に、変異体インターロイキン－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体に関する。さらに、本発明は、免疫複合体をコードするポリヌクレオチド分子、並びにかかるポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は更に、変異体免疫複合体を製造するための方法、変異体免疫複合体を含む医薬組成物、及びその使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、概して、ＣＤ８＋細胞のみに対して強いシス標的化効果を有する免疫複合体、特に、変異体インターロイキン－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体に関する。加えて、本発明は、免疫複合体をコードするポリヌクレオチド分子、並びにかかるポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は更に、変異体免疫複合体を製造するための方法、変異体免疫複合体を含む医薬組成物、及びその使用に関する。
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）としても知られ、リンパ球の生成、生存及びホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす１５．５ｋＤａの球状糖タンパク質である。ＩＬ－２は、１３３アミノ酸長であり、その機能に必須の四次構造を形成する４つの平行ではない両親媒性αらせんからなる（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７、４１０－４１３（１９９２））。異なる種由来のＩＬ－２の配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ０００５７７（ヒト）、ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）又はＮＰ５１７４２５（チンパンジー）で見出される。
ＩＬ－２は、３個の個々のサブユニットからなるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することによって、その作用に媒介し、その異なる会合によって、ＩＬ－２に対する親和性が異なる受容体形態を生成し得る。α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）及びγ（γｃ、ＣＤ１３２）サブユニットの会合によって、ＩＬ－２のトリマー高親和性受容体が得られる。βサブユニット及びγサブユニットからなるダイマーＩＬ－２受容体は、中程度親和性ＩＬ－２Ｒと呼ばれる。αサブユニットは、モノマー低親和性ＩＬ－２受容体を形成する。ダイマー中程度親和性ＩＬ－２受容体は、トリマー高親和性受容体よりも約１００分の１低い親和性でＩＬ－２に結合するが、ダイマー及びトリマーのＩＬ－２受容体バリアントは、両方ともＩＬ－２に結合するとシグナルを伝達することができる（Ｍｉｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１、２４５－２６８（１９９３））。したがって、α－サブユニットＣＤ２５は、ＩＬ－２シグナル伝達に必須ではない。α－サブユニットは、その受容体に対して高い親和性結合を与え、一方、βサブユニットＣＤ１２２及びγサブユニットは、シグナル伝達にとって重要である（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。ＣＤ２５を含むトリマーＩＬ－２受容体は、（休止状態の）ＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって発現される。これらは、従来の活性化されたＴ細胞でも一時的に誘発され、一方、休止状態では、これらの細胞は、ダイマーＩＬ－２受容体のみを発現する。Ｔｒｅｇ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで一貫して最も高いレベルのＣＤ２５を発現する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５））。
ＩＬ－２は、活性化Ｔ細胞、特に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって主に合成される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成並びに末梢血リンパ球から細胞毒性細胞及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘発し、Ｔ細胞によるサイトカイン及び細胞溶解性分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖及び分化並びにＢ細胞による免疫グロブリンの合成を容易にし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生成、増殖及び活性化を刺激する（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，５９５－６０１（２００９）；Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｋａｓｐｒｚａｋ，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １４，ＲＡ１７９－８９（２００８）；Ｍａｌｅｋ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６，４５３－７９（２００８）にまとめられている）。
ＩＬ－２がリンパ球の集合をｉｎ ｖｉｖｏで拡張する能力と、これらの細胞のエフェクタ機能を増加させる能力は、ＩＬ－２に抗腫瘍効果を与え、ＩＬ－２免疫療法を、特定の転移性がんにとって魅力的な処置選択肢にしている。その結果、高用量ＩＬ－２処置は、転移性腎臓癌腫及び悪性黒色腫を有する患者において使用することが承認されてきた。
しかしながら、ＩＬ－２は、エフェクタ細胞の拡張及び活性を媒介するだけではなく、末梢免疫耐性の維持に大きく関わっているという点で、免疫応答において二重の機能を有する。
末梢自己耐性の根底にある主要な機構は、Ｔ細胞におけるＩＬ－２によって誘発された活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）である。ＡＩＣＤは、完全に活性化されたＴ細胞が、ＣＤ９５（Ｆａｓとも呼ばれる）等の細胞表面で発現するデス受容体又はＴＮＦ受容体の係合によって、プログラムされた細胞死を受けるプロセスである。高親和性ＩＬ－２受容体を発現する抗原活性化Ｔ細胞（ＩＬ－２に既に曝露した後）、増殖中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を介し、抗原による再刺激がされると、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及び／又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現が誘発され、細胞が、Ｆａｓ介在性アポトーシスに感受性となる。このプロセスは、ＩＬ－２依存性であり（Ｌｅｎａｒｄｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３，８５８－６１（１９９１）、ＳＴＡＴ５によって媒介される。Ｔリンパ球におけるＡＩＣＤのプロセスによって、耐性が、自己抗原に対して確立されるだけではなく、腫瘍抗原等の明確に宿主構成物の一部ではない持続性抗原に対しても確立され得る。
さらに、ＩＬ－２は、末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の管理にも関与する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５）；Ｄ’Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１５２－５９（２００５）；Ｍａｌｏｙ ａｎｄ Ｐｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１７１－７２（２００５））、これらは、サプレッサーＴ細胞としても知られる。これらは、エフェクタＴ細胞がその（自己の）標的を破壊するのを、細胞－細胞接触によってＴ細胞の補助及び活性化を阻害することによって、又はＩＬ－１０又はＴＧＦ－β等の免疫抑制性サイトカインの放出によって、抑制する。Ｔｒｅｇ細胞を消耗させると、ＩＬ－２によって誘発される抗腫瘍免疫が高まることが示された（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ９８，４１６－２３（２００７））。
したがって、ＩＬ－２存在下、生成したＣＴＬが、腫瘍を自身で認識し、ＡＩＣＤを受けるか、又は免疫応答が、ＩＬ－２依存性Ｔｒｅｇ細胞によって阻害されるため、ＩＬ－２は腫瘍成長の阻害のために最適とはいえない。
ＩＬ－２免疫療法に関連する更なる問題は、組換えヒトＩＬ－２処置によって生じる副作用である。高用量ＩＬ－２処置を受けている患者は、重篤な心血管、肺、腎臓、肝臓、胃腸、神経、皮膚、血液及び全身の有害事象を頻繁に経験し、集中的なモニタリングと入院患者管理が必要となる。これらの副作用の大部分は、いわゆる血管（又は毛細血管）漏出症候群（ＶＬＳ）の進行、複数の臓器における流体漏出を引き起こす血管透過性の病的な増加（例えば、肺及び皮膚の浮腫並びに肝細胞の損傷を引き起こす）、血管内の流体枯渇（血圧の低下、心拍の補償的増加を引き起こす）によって説明することができる。ＩＬ－２の除去以外のＶＬＳの処置は存在しない。低用量ＩＬ－２レジメンは、ＶＬＳを回避するために患者で試験されたが、最適とはいえない治療結果であった。ＶＬＳは、ＩＬ－２によって活性化されたＮＫ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α等の炎症性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられていたが、近年、ＩＬ－２によって誘発される肺浮腫が、低濃度から中程度の濃度の機能性αβγ ＩＬ－２受容体を発現する肺内皮細胞に対するＩＬ－２の直接的な結合によって生じることが示された（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７、１１９０６－１１（２０１０））。
ＩＬ－２免疫療法に関連するこれらの問題を克服するために、いくつかの手法が行われてきた。例えば、ＩＬ－２と特定の抗ＩＬ－２モノクローナル抗体との組合せは、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２の処置効果を高める（Ｋａｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７，３０６－１４（２００６）；Ｂｏｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１，１９２４－２７（２００６））。代替的な手法では、ＩＬ－２は、その毒性を下げ、及び／又はその有効性を高めるために、種々の様式で変異された。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ １０１、４８５３－４８６１（２００３）、米国特許出願公開第２００３／０１２４６７８号）は、ＩＬ－２の血管浸透活性をなくすために、ＩＬ－２の位置３８のアルギニン残基をトリプトファンで置換している。Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、１１９７－１２０２（２０００））は、ＮＫ細胞よりもＴ細胞に対する選択性を高めるために、アスパラギン８８からアルギニンに変異している。Ｈｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３、２５９７－６０２（１９９３）；米国特許第５，２２９，１０９号）は、ＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの分泌を減らすために、Ａｒｇ３８Ａｌａ及びＰｈｅ４２Ｌｙｓの２つの変異を導入した。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００７／００３６７５２号）は、ＶＬＳを減らすために、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性に寄与するＩＬ－２の３つの残基が置換されている（Ａｓｐ２０Ｔｈｒ、Ａｓｎ８８Ａｒｇ及びＧｌｎ１２６Ａｓｐ）。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２００８／００３４４７３号）も、有効性を高めるために、アミノ酸置換Ａｒｇ３８Ｔｒｐ及びＰｈｅ４２ＬｙｓによってＩＬ－２とＣＤ２５との界面を変異させ、ＣＤ２５との相互作用、及びＴｒｅｇ細胞の活性化を低下させた。同じ目的のため、Ｗｉｔｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２００９／０６１８５３号）は、ＣＤ２５に対する親和性を高めたが、受容体を活性化せず、アンタゴニストとして作用するＩＬ－２変異体を製造した。導入される変異は、受容体のβ－サブユニット及び／又はγ－サブユニットとの相互作用を破壊することを目的としたものであった。
ＩＬ－２免疫療法に関連する上述の問題（ＶＬＳの誘発によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘発によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制）を克服するために設計された特定の変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されている。位置４２のフェニルアラニン残基をアラニンに置換、位置４５のチロシン残基をアラニンに置換、ＩＬ－２の位置７２のロイシン残基をグリシンに置換すると、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニットに対するこの変異体ＩＬ－２ポリペプチドの結合が本質的になくなる。
上述の手法に更に、ＩＬ－２免疫療法は、例えば、腫瘍細胞で発現する抗原に結合する抗体を含む免疫複合体の形態で、腫瘍に対してＩＬ－２を選択的に標的化することによって高められてもよい。いくつかのかかる免疫複合体が記載されている（例えば、Ｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００４）２７，２３２－２３９；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１７）６（３），ｅ１２７７３０６を参照されたい）。
しかしながら、腫瘍は、抗体の標的抗原を削減し、変異させ、又はダウンレギュレーションすることによって、かかる標的化から逃避する場合がある。さらに、腫瘍を標的とするＩＬ－２は、リンパ球を能動的に除外する腫瘍微小環境において、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）等のエフェクタ細胞と最適な接触をしない場合がある。
したがって、ＩＬ－２免疫療法を更に改善することが依然として必要である。腫瘍標的化の問題を回避し得る手法は、エフェクタ細胞、特にＣＴＬに対してＩＬ－２を直接的に標的化することである。
Ｇｈａｓｅｍｉ ｅｔ ａｌ．は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のＮＫＧ２Ｄを有する細胞に対してＩＬ－２を標的化するための、ＩＬ－２とＮＫＧ２Ｄ結合タンパク質の融合タンパク質を記載している（Ｇｈａｓｈｅｍｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｃｏｍｍ（２０１６）７、１２８７８）。
腫瘍組織における免疫細胞の数、種類、及び空間的分布の特徴付けは、がんの診断、予後、治療選択、及び治療に対する応答に関する重要な情報を提供することができる。具体的には、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球は、様々ながんにおいて診断的及び予後的意義を有すると一貫して報告されている。ＣＤ８に結合する抗体が国際公開第２０１９／０３３０４３号Ａ２に開示されている。
本発明は、腫瘍細胞ではなく、免疫エフェクタ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球に対する直接的な免疫療法にとって有利な特性を有する、ＩＬ－２の変異体形態を標的とする新規な手法を提供する。免疫エフェクタ細胞に対する標的化は、ＣＤ８に結合する抗体に対する変異体ＩＬ－２分子の接合によって達成される。
本発明で使用されるＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２免疫療法に関連する問題、特に、ＶＬＳの誘発によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘発によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制を克服するために設計されてきた。上述の腫瘍標的化からの腫瘍の逃避を迂回することに加え、免疫エフェクタ細胞に対するＩＬ－２変異体の標的化によって、更に、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞よりもＣＴＬの優先的な活性化を増大させ得る。本明細書に開示されるＣＤ８に結合する抗体は、ＣＤ８＋細胞に対して強いシス標的化効果を有する。したがって、それらは、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）とペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）との相互作用を妨害しない。この点において、抗体は非機能的である。
第１の態様では、本発明は、変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含む変異体ＩＬ－２ポリペプチドである。
更なる態様では、本発明は、変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子であり、抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、及び配列番号６又は配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
別の態様では、本発明は、変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子であり、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号８又は配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
本発明の免疫複合体のいくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドが更に、アミノ酸置換Ｔ３Ａ及び／又はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む。
いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、１つ以下の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。いくつかのかかる実施形態では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかのかかる実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧクラス、特に、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメイン及び／又はヒトＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。
いくつかの実施形態では、免疫複合体がＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、該Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合によっては、位置３６６のトレオニン残基は、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つ（特に、Ｆｃの第１のサブユニット）のカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して融合する。１８．いくつかのかかる実施形態では、リンカーリンカーペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、免疫複合体がＦｃドメインを含み、該Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合、及び／又はエフェクタ機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかのかかる実施形態では、当該一又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスのナンバリング）の群から選択される一又は複数の位置にある。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスのナンバリング）を含む。
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、配列番号９又は配列番号３０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１又は配列番号１２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、配列番号９又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、配列番号９又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、リンカー配列によって連結された変異体ＩＬ－２ポリペプチド及びＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる。
本発明は、更に、本明細書に記載の本発明の免疫複合体をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチド（一又は複数）を含む一又は複数のベクター、特に発現ベクター、及び当該ポリヌクレオチド（一又は複数）又は当該ベクター（一又は複数）を含む宿主細胞を提供する。
変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む、免疫複合体を製造するための方法であって、（ａ）免疫複合体の発現に適した条件下、本発明の宿主細胞を培養すること、及び場合によっては、（ｂ）免疫複合体を回収することを含む、方法も提供される。また、本発明によって提供されるのは、この方法によって提供される、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む、免疫複合体である。
本発明は更に、本発明の免疫複合体と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物、及び本発明の免疫複合体を使用する方法を提供する。
特に、本発明は、医薬として使用するための、また、疾患の処置に使用するための本発明に係る免疫複合体を包含する。特定の実施形態では、当該疾患は、がんである。
ある疾患の処置のための医薬の製造における本発明に係る免疫複合体の使用も、本発明に包含される。特定の実施形態では、当該疾患は、がんである。
個体において疾患を処置する方法であって、治療有効量の本発明に係る免疫複合体を含む組成物を薬学的に許容され得る形態で当該個体に投与することを含む、方法が更に提供される。特定の実施形態では、上記疾患は、がんである。
さらに、個体の免疫系を刺激する方法であって、有効量の本発明に係る免疫複合体を含む組成物を薬学的に許容され得る形態で当該個体に投与することを含む、方法が提供される。
定義
用語は、以下に他の意味であると定義されていない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、「インターロイキン－２」又は「ＩＬ－２」という用語は、特に示されていない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＩＬ－２を指す。この用語は、未処理のＩＬ－２と、細胞の処理から生じるＩＬ－２の任意の形態を包含する。この用語は、ＩＬ－２の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。未処理のヒトＩＬ－２は、更に、成熟ＩＬ－２分子には存在しない、配列番号１９の配列を有するＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ－２変異」又は「変異体ＩＬ－２ポリペプチド」という用語は、全長ＩＬ－２、ＩＬ－２の先端切断された形態、ＩＬ－２が融合又は化学的抱合等によって別の分子に連結した形態を含め、ＩＬ－２分子の種々の形態の任意の変異形態を包含することを企図している。「全長」は、ＩＬ－２を参照して使用される場合、成熟した天然の長さのＩＬ－２分子を意味することを企図している。例えば、全長ヒトＩＬ－２は、１３３個のアミノ酸を含む分子を指す（例えば、配列番号１３）。種々の形態のＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２とＣＤ２５との相互作用に影響を与える少なくとも１つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、その位置に通常配置される野生型アミノ酸残基の置換、欠失、先端切断又は修飾を含んでいてもよい。アミノ酸置換によって得られる変異体が好ましい。特に示されない限り、ＩＬ－２変異体を、本明細書では、変異体ＩＬ－２ペプチド配列、変異体ＩＬ－２ポリペプチド、変異体ＩＬ－２タンパク質又は変異体ＩＬ－２アナログと呼ぶ場合がある。
ＩＬ－２の種々の形態の命名は、本明細書では、配列番号１３に示される配列に対して行われる。同じ変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用する場合がある。例えば、位置４２でのフェニルアラニンからアラニンへの変異は、４２Ａ、Ａ４２、Ａ４２、Ｆ４２Ａ又はＰｈｅ４２Ａｌａとして示すことができる。
「ヒトＩＬ－２分子」とは、本明細書で使用される場合、配列番号１３のヒトＩＬ－２配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９６％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２分子を意味する。特に、配列同一性は、少なくとも約９５％、より詳しくは、少なくとも約９６％である。特定的な実施形態では、ヒトＩＬ－２分子は、全長ＩＬ－２分子である。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組合せは、最終構築物が、所望の特徴、例えば、ＣＤ２５に対する結合の低下を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。末端の欠失の一例は、全長ヒトＩＬ－２の位置１にあるアラニン残基の欠失である。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、ＩＬ－２ポリペプチドの結合特徴を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること）が特に好ましい。好ましいアミノ酸置換は、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸によって置き換えることを含む。アミノ酸の置換には、非天然アミノ酸による置き換え、又は２０種類の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝的方法とには、特定部位の変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学修飾も有用な場合があることが想定される。
本明細書で使用される場合、ＩＬ－２の「野生型」形態は、野生型形態が、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと同じＩＬ－２の形態である。例えば、ＩＬ－２変異体が、全長ＩＬ－２である（すなわち、ＩＬ－２が、任意の他の分子に融合又は接合していない）場合、この変異体の野生型形態は、全長ネイティブヒトＩＬ－２である。ＩＬ－２変異体が、ＩＬ－２とＩＬ－２の下流（例えば、抗体鎖）をコードする別のポリペプチドとの融合である場合、このＩＬ－２異性体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドに融合した、野生型アミノ酸配列を有するＩＬ－２である。さらに、ＩＬ－２変異体が、ＩＬ－２の先端切断された形態（ＩＬ－２の先端切断されていない部分の中の変異した形態又は修飾された形態）である場合、このＩＬ－２変異体の野生型形態は、同様に、野生型配列を有する先端切断されたＩＬ－２である。種々の形態のＩＬ－２変異体のＩＬ－２受容体結合親和性又は生体活性を、対応するＩＬ－２の野生型形態と比較する目的のために、野生型という用語は、天然に存在するネイティブＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２受容体結合に影響を与えない一又は複数のアミノ酸変異（例えば、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置のシステインをアラニンで置換）を含むＩＬ－２の形態を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の目的のための野生型ＩＬ－２は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む（配列番号２０を参照されたい）。本発明に係る特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２５」又は「ＩＬ－２受容体のα－サブユニット」という用語は、特に示されていない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ２５を指す。この用語は、「全長」の未処理のＣＤ２５と、細胞の処理から生じるＣＤ２５の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ２５の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。特定の実施形態では、ＣＤ２５は、ヒトＣＤ２５である。ヒトＣＤ２５のアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０１５８９（バージョン１８５）で見出される。
本明細書で使用される場合、「高親和性ＩＬ－２受容体」という用語は、受容体γ－サブユニット（共通のサイトカイン受容体γ－サブユニット、γｃ、又はＣＤ１３２、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１４７８４（バージョン１９２）を参照されたい）、受容体β－サブユニット（ＣＤ１２２又はｐ７０としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ３１７８５（バージョン１９７）を参照されたい）及び受容体α－サブユニット（ＣＤ２５又はｐ５５としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０１５８９（バージョン１８５）を参照されたい）からなる、ＩＬ－２受容体のヘテロトリマー形態を指す。「中程度親和性ＩＬ－２受容体」という用語は、対照的に、γ－サブユニット及びβ－サブユニットのみを含み、α－サブユニットを含まないＩＬ－２受容体を指す（総説としては、例えば、Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｋａｓｐｒｚａｋ、Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １４、ＲＡ１７９－１８９（２００８）を参照されたい）。
「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合対（例えば、リガンド）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの結合対Ｙに対する分子Ｘの親和性は概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
ＩＬ－２受容体の種々の形態についての変異体又は野生型のＩＬ－２ポリペプチドの親和性は、国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載する方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と、組換え発現によって得られ得るような受容体サブユニットとを用い、決定することができる（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、１１９７－１２０２（２０００）を参照されたい）。或いは、ＩＬ－２受容体の異なる形態に対するＩＬ－２変異体の結合親和性は、１つの又は他のかかる形態の受容体を発現することが知られている細胞株を用いて評価されてもよい。結合親和性を測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態を、本明細書で以下に記載する。
「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞とは、他のＴ細胞の応答を抑制し得る特殊な種類のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニット及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現によって特徴付けられ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２、５３１－６２（２００４））、腫瘍によって発現するものを含め、抗原に対する末梢自己耐性の導入及び維持に重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞は、その機能及び成長、その抑制特徴の誘発のために、ＩＬ－２を必要とする。
本明細書で使用される場合、「エフェクタ細胞」という用語は、ＩＬ－２の細胞毒性効果を媒介するリンパ球の集合を指す。エフェクタ細胞としては、エフェクタＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びマクロファージ／単球が挙げられる。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。抗体が特定の抗原（例えば、ＣＤ８）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７、３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８、２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗体の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。本明細書に記載の免疫複合体に含まれる抗体は、ＣＤ８に特異的に結合する。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線形に接続したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、又は相互に置き換え可能に使用されてもよい。「ポリペプチド」という用語も、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含め、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことを意図している。ポリペプチドは、天然の生物源から誘導されてもよく、又は組換え技術によって産生されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で生じてもよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有することができるが、ポリペプチドは、かかる構造を必ずしも有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると呼ばれ、規定の三次元構造を有していないがむしろ多数の異なる立体配座を採用することができるポリペプチドは、折りたたまれていないと呼ばれる。
「単離された」ポリペプチド又はそのバリアント、又はその誘導体は、その天然の環境にはないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その生来の環境又は天然環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって、分離され、分画され、又は部分的に若しくは実質的に精製された、ネイティブポリペプチド又は組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本発明の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム用い、又はその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて作成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）、「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって認定され、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に利用可能である。或いは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性パーセントは、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写産物と、陽性及び陰性の鎖形態と、二本鎖形態とを含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって産生されるかかる分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であってもよく、又は調節要素を含んでいてもよい。
「［例えば、本発明の免疫複合体］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖及び／又はＩＬ－２ポリペプチド（又はその断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、かかる核酸分子（一又は複数）が宿主細胞の一又は複数の位置に存在するかかるポリヌクレオチド分子（一又は複数）を含む。
「発現カセット」という用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、本発明の免疫複合体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、細胞に作動可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入し、指令するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質は、細胞内転写及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の免疫複合体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、互換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫も含まれる。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、変異を含んでもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか若しくは選択されるのと同じ機能、又は生物活性を有する変異型の後代が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の免疫複合体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物若しくは培養植物、又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性、すなわちＣＤ８（例えば、ヒトＣＤ８、カニクイザルＣＤ８及び／又はアカゲザルＣＤ８）への結合を示す限り、モノクローナル抗体、一価抗体（例えば、１アーム抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。かかるバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた（これらに限定されない）多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された（すなわち、その天然環境にはない）ものである。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離された抗体は、そのネイティブ環境又は天然環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現する組換え産生された抗体は、任意の適切な技術によって、分離され、分画され、又は部分的に若しくは実質的に精製された、ネイティブ又は組換え抗体と同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。このように、本発明の免疫複合体は、単離される。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％より大きく、又は９９％より大きくなるまで精製される。抗体精製の試験方法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及びシングルドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディとは、二価又は二重特異性であることができる、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインと、を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等の更なるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから本質的になる。
「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分な場合がある。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されるナンバリングシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔナンバリング」と呼ばれる。特定的には、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０ページを参照されたい）を、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１－７２３ページを参照されたい）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と言及することによって更に明確にしている。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。本発明の例示的なＨＶＲとして、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに、
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組合せ。
本明細書で別途示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（上記参照されたい）に従って本明細書においてナンバリングされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。かかる可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復するか、又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット又はウサギに由来する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片もまた、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう規定されている。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から一又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい（本明細書で「開裂したバリアント重鎖」とも呼ばれる）。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリシン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリシン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施形態では、本発明に係る免疫複合体に含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本発明の一実施形態では、本発明に係る免疫複合体に含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本発明の組成物、例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、本発明の免疫複合体の集合を含む。免疫複合体の集合は、全長長鎖を含む分子と、開裂したバリアント重鎖を含む分子とを含んでいてもよい。免疫複合体の集合は、全長重鎖を有する分子と、開裂したバリアント重鎖を有する分子との混合物からなっていてもよく、免疫複合体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、開裂したバリアント重鎖を有する。本発明の一実施形態では、本発明の免疫複合体の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む免疫複合体を含む。本発明の一実施形態では、本発明の免疫複合体の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む免疫複合体を含む。本発明の一実施形態では、かかる組成物は、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子で構成される免疫複合体の集合を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照されたい）に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」とは、二量体のＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定した自己会合が可能なポリペプチドを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むペプチドと同一のポリペプチドとの会合を減らすか又は防ぐ、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）それぞれに対し、別個の修飾を含み、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補性である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合する更なる構成要素（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で、同一ではない場合がある。いくつかの実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、別個のアミノ酸変異、特定的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクタ機能」という用語は、抗体に言及しつつ使用される場合、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクタ機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクタ細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低下」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣの機構による、標的細胞を取り囲む培地中の所与の濃度の抗体で所与の時間に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構による、所与の時間に所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存の方法（当業者に知られている）を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生される同じ抗体によって媒介されるが、操作されていないＡＤＣＣと比較している。例えば、そのＦｃドメインを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下である、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号を参照されたい）。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる連結の後に、エフェクタ機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「操作する、操作される、操作すること」という用語は、天然に存在するか、又は組換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組合せを含む。
「結合の低下」、例えば、Ｆｃ受容体又はＣＤ２５に対する結合の低下は、例えばＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、この用語は、親和性がゼロまで低下する（又は分析方法の検出限界未満になる）こと、すなわち、相互作用が完全に失われることも含む。逆に、「結合上昇」は、個々の相互作用に対する結合親和性における上昇を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫複合体」という用語は、少なくとも１つのＩＬ－２分子と少なくとも１つの抗体とを含むポリペプチド分子を指す。ＩＬ－２分子は、種々の相互作用によって、本明細書に記載の種々の構成で、抗体に接続することができる。特定的な実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーを介して抗体に融合する。本発明に係る特定の免疫複合体は、一又は複数のリンカー配列によって接続する、１つのＩＬ－２分子と、抗体から本質的になる。
「融合する」とは、構成要素（例えば、抗体及びＩＬ－２分子）が、ペプチド結合によって直接的に、又は一又は複数のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。
本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインサブユニット等に関する「第１」及び「第２」の用語は、それぞれの種類の部分が１つより多く存在する場合に、区別するのが簡便なように使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、免疫複合体の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望な治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、組成物が投与される対象に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、対象にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「処置（ｔｒｅａｔ）する」又は「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）すること」）は、処置される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の免疫複合体を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
実施形態の詳細な説明
変異体ＩＬ－２ポリペプチド
本発明に係る免疫複合体は、免疫療法にとって有利な特性を有する変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。特に、毒性に寄与するが、ＩＬ－２の有効性にとって必須ではないＩＬ－２の薬理学的特性は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドでは除去される。かかる変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、その全体が本明細書に参考として組み込まれる国際公開第２０１２／１０７４１７号に詳細に記載される。上述のように、異なる形態のＩＬ－２受容体は、異なるサブユニットからなり、ＩＬ－２に対して異なる親和性を示す。中程度親和性ＩＬ－２受容体は、β及びγ受容体サブユニットからなり、休止状態のエフェクタ細胞で発現し、ＩＬ－２シグナル伝達にとって十分である。高親和性ＩＬ－２受容体は、受容体のα－サブユニットを更に含み、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞及び活性化されたエフェクタ細胞で主に発現し、ＩＬ－２による係合によって、それぞれ、Ｔｒｅｇ細胞が介在する免疫抑制又は活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を促進することができる。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対するＩＬ－２の親和性が低下するか、又はなくなると、制御性Ｔ細胞によるエフェクタ細胞機能のＩＬ－２によって誘発されるダウンレギュレーション、及びＡＩＣＤプロセスによる腫瘍耐性の進行が減るはずである。一方、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性の維持は、ＩＬ－２によるＮＫ細胞及びＴ細胞等のエフェクタ細胞の増殖及び活性化の誘発を保存すべきである。
本発明に係る免疫複合体に含まれる変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドは、それぞれの野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性をなくすか、又は減らし、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を保存する、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
ＣＤ２５に対する親和性が低下したヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）の変異体は、例えば、アミノ酸位置３５、３８、４２、４３、４５又は７２、又はこれらの組合せ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）でのアミノ酸置換によって作られてもよい。例示的なアミノ酸置換としては、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ及びＬ７２Ｋが挙げられる。本発明の免疫複合体で有用な特定のＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５又は７２に対応するアミノ酸位置、又はこれらの組合せにアミノ酸変異を含む。一実施形態では、当該アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換であり、より特定的には、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの群から選択されるアミノ酸置換である。これらの変異体は、中程度親和性ＩＬ－２受容体と実質的に同様の結合親和性を示し、ＩＬ－２変異体の野生型形態と比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニット及び高親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性がかなり低下している。
有用な変異体の他の特徴としては、ＩＬ－２受容体を含むＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖を誘発する能力、ＩＬ－２受容体を含むＴ細胞及び／又はＮＫ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を誘発する能力、ＮＫ細胞によって二次サイトカインとしてインターフェロン（ＩＦＮ）－γを生成する能力、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による二次サイトカイン（特に、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－α）の生成を誘発する能力の低下、制御性Ｔ細胞を活性化する能力の低下、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発する能力の低下、及びｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールの低下が挙げられ得る。
本発明に有用な特定の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性がないか、又は低いが、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を保存する３アミノ酸変異を含む。一実施形態では、当該３アミノ酸変異は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置にある。一実施形態では、当該３アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、当該３アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。具体的な実施形態では、当該３アミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）である。
特定の実施形態では、当該アミノ酸変異は、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を少なくとも５分の１、特定的には少なくとも１０分の１、より特定的には少なくとも２５分の１まで下げる。ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を下げる１つより多いアミノ酸変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸変異の組合せが、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を少なくとも３０分の１、少なくとも５０分の１、又は更に少なくとも１００分の１まで下げてもよい。一実施形態では、当該アミノ酸変異、又はアミノ酸変異の組合せは、表面プラズモン共鳴によって結合が検出可能ではないように、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性をなくす。
中程度親和性受容体に対して実質的に同様に結合すること（すなわち、当該受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性の保存）は、ＩＬ－２変異体が、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２変異体の野生型の親和性の約７０％より大きな親和性を示す場合に達成される。本発明のＩＬ－２変異体は、かかる親和性の約８０％より大きく、更には約９０％より大きい親和性を示してもよい。
ＩＬ－２のＯ－グリコシル化をなくすことと組み合わせて、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットについてのＩＬ－２の親和性を下げると、改良された特性を有するＩＬ－２タンパク質が得られる。例えば、Ｏ－グリコシル化部位がないと、変異体ＩＬ－２ポリペプチドがＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞等の哺乳動物細胞で発現するときに、より均一な産物が得られる。
したがって、特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置にＩＬ－２のＯ－グリコシル化部位がない更なるアミノ酸変異を含む。一実施形態では、ヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置にあるＩＬ－２のＯ－グリコシル化部位をなくす更なるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ及びＴ３Ｐが挙げられる。具体的な実施形態では、当該更なるアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｔ３Ａである。
特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、本質的に、全長ＩＬ－２分子である。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２分子である。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、上記変異のない配列番号１３を含むＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性をなくすか、又は減らすが、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を保存する少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号１３の配列を含む。別の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、上記変異のない配列番号１３を含むＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性をなくすか、又は減らすが、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を保存する少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号１３の配列を含む。
具体的な実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、活性化されたＴリンパ球細胞の増殖、活性化されたＴリンパ球細胞の分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化されたＢ細胞の増加、活性化されたＢ細胞の分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖、ＮＫ細胞の分化、活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、ＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される一又は複数の細胞応答を誘発することができる。
一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、制御性Ｔ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘発する能力が低下している。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｔ細胞における活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をほとんど誘発しない。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールが低下している。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、血清半減期が長くなっている。
本発明で有用な特定の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置に４つのアミノ酸置換を含む。具体的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。国際公開第２０１２／１０７４１７号に示されるように、当該四重変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＣＤ２５に対する検出可能な結合を示さず、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発する能力の低下、Ｔｒｅｇ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を誘発する能力の低下、及びｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールの低下を示す。しかしながら、エフェクタ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を活性化する能力、エフェクタ細胞の増殖を誘発する能力、ＮＫ細胞により二次サイトカインとしてＩＦＮ－γを生成する能力を保持している。
さらに、当該変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されるように、表面疎水性の低下、良好な安定性及び良好な発現収率等の更に有利な特性を有する。予想外に、当該変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較して、血清半減期も長くなっている。
本発明で有用なＩＬ－２変異体は、ＣＤ２５又はグリコシル化部位を有するＩＬ－２の界面を形成するＩＬ－２の領域に変異を有することに加え、これらの領域の外側のアミノ酸配列に一又は複数の変異を有していてもよい。ヒトＩＬ－２におけるかかる更なる変異は、発現又は安定性の増加等の更なる利点を与えてもよい。例えば、位置１２５のシステインは、セリン、アラニン、トレオニン又はバリン等の中性アミノ酸と置き換わっていてもよく、米国特許第４，５１８，５８４号に記載されるように、それぞれ、Ｃ１２５Ｓ ＩＬ－２、Ｃ１２５Ａ ＩＬ－２、Ｃ１２５Ｔ ＩＬ－２又はＣ１２５Ｖ ＩＬ－２が得られる。ここに記載されるように、ＩＬ－２のＮ末端アラニン残基を欠失すると、ｄｅｓ－Ａ１ Ｃ１２５Ｓ又はｄｅｓ－Ａ１ Ｃ１２５Ａ等の変異体が得られ得る。これに代えて、又はこれと組み合わせて、ＩＬ－２変異体は、変異を含んでいてもよく、それにより、野生型ヒトＩＬ－２の位置１０４に通常存在するメチオニンが、アラニン等の中性アミノ酸と置き換わっている（米国特許第５，２０６，３４４号を参照されたい）。得られる変異体、例えば、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ ＩＬ－２、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ－２、Ｍ１０４Ａ ＩＬ－２、Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ－２、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ－２又はＭ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ－２（これらの変異体及び他の変異体は、米国特許第５，１１６，９４３号及びＷｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０、２９５－３００（１９８９）に見出される）を、本発明の特定のＩＬ－２変異と組み合わせて使用してもよい。
したがって、特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置に、更なるアミノ酸変異を含む。一実施形態では、当該更なるアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。
当業者は、どの更なる変異が、本発明の目的にとって更なる利点を与え得るかを決定することができる。例えば、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２の親和性を下げるか、又はなくすＩＬ－２配列のアミノ酸変異、例えば、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｒ又はＱ１２６Ｄ（例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７５２号を参照されたい）は、本発明に係る変異体ＩＬ－２ポリペプチドに含むことが適切ではない場合があることを理解する。
一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－２配列、例えば、配列番号１３のヒトＩＬ－２配列と比較して、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下のアミノ酸変異を含む。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－２配列、例えば、配列番号１３のヒトＩＬ－２配列と比較して、５以下のアミノ酸変異を含む。
一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１４の配列を含む。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１４の配列からなる。
免疫複合体
本明細書に記載の免疫複合体は、ＩＬ－分子及び抗体を含む。かかる免疫複合体は、ＩＬ－２を例えば腫瘍微小環境に直接的に標的化することによって、ＩＬ－２治療の有効性を顕著に高める。本発明によれば、免疫複合体に含まれる抗体は、全抗体又は免疫グロブリン、又は抗原特異的な結合親和性等の生物学的機能を有するこれらの一部又はバリアントであってもよい。
免疫複合体治療の一般的な利益は、容易に明らかである。例えば、免疫複合体に含まれる抗体は、腫瘍特異的なエピトープを認識し、腫瘍部位に対し、免疫複合体分子が標的化される。したがって、高濃度のＩＬ－２を腫瘍微小環境に送達することができ、それによって、未抱合ＩＬ－２で必要とされるよりもかなり少ない用量の免疫複合体を用い、本明細書に述べた種々の免疫エフェクタ細胞の活性化及び増殖が引き起こされる。さらに、免疫複合体の形態でＩＬ－２を適用すると、サイトカイン自体を低用量にすることが可能であるため、ＩＬ－２の望ましくない副作用の可能性が制限され、免疫複合体による身体の特定の部位へのＩＬ－２の標的化によっても、全身曝露量が減り、そのため、未抱合ＩＬ－２を用いて得られるよりも副作用が小さくなる。加えて、未抱合ＩＬ－２と比較して、免疫複合体の血中半減期が増加することは、免疫複合体の有効性に寄与する。しかしながら、ＩＬ－２免疫複合体のこの特徴は、ＩＬ－２分子の潜在的な副作用を再び悪化させる場合がある。血流中のＩＬ－２免疫複合体の血中半減期が、未抱合ＩＬ－２と比較して、顕著に長いため、ＩＬ－２又は融合タンパク質部分の他の部分が、血管系内に一般的に存在する構成要素を活性化する可能性が高まる。同じ問題を、Ｆｃ又はアルブミン等の別の部分に融合したＩＬ－２を含む他の融合タンパク質にも適用し、血中のＩＬ－２の半減期を長くする。したがって、ＩＬ－２の野生型形態と比較して毒性が低い、本明細書及び国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載される変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む免疫複合体は、特に有利である。
本明細書で上に記載したように、腫瘍細胞ではなく、免疫エフェクタ細胞に対してＩＬ－２を直接的に標的化することは、ＩＬ－２免疫療法にとって有利であり得る。
したがって、本発明は、本明細書中上に記載される変異体ＩＬ－２ポリペプチド、及びＣＤ８に結合する抗体を提供する。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと抗体とが融合タンパク質を形成し、すなわち、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは抗体とペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。具体的な実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して融合する。いくつかの実施形態では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は免疫グロブリン分子、より詳しくはＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、より具体的にはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である。かかる一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の１つと、アミノ末端ペプチド結合を共有している。ある特定の実施形態では、本抗体は、抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体はＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子である。一実施形態では、抗体はＦａｂ分子である。別の実施形態では、抗体はｓｃＦｖ分子である。免疫複合体はまた、２つ以上の抗体を含み得る。２つ以上の抗体が免疫複合体、例えば第１の抗体及び第２の抗体に含まれる場合、各抗体は、様々な形態の抗体及び抗体断片から独立して選択することができる。例えば、第１の抗体はＦａｂ分子であり得、第２の抗体はｓｃＦｖ分子であり得る。ある特定の実施形態では、上記第１の抗体及び上記第２の抗体の各々はｓｃＦｖ分子であるか、又は上記第１の抗体及び上記第２の抗体の各々はＦａｂ分子である。特定の実施形態では、上記第１の抗体及び上記第２の抗体はそれぞれ、Ｆａｂ分子である。一実施形態では、上記第１の抗体及び上記第２の抗体の各々はＣＤ８に結合する。
免疫複合体フォーマット
例示的な免疫複合体フォーマットは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１１／０２０７８３号に記載されている。これらの免疫複合体は、少なくとも２つの抗体を含む。したがって、一実施形態では、本発明に係る免疫複合体は、本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、少なくとも第１の抗体及び第２の抗体とを含む。特定の実施形態では、上記第１の抗体及び上記第２の抗体は、独立して、Ｆｖ分子（特に、ｓｃＦｖ分子）及びＦａｂ分子からなる群から選択される。具体的な実施形態では、当該変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、当該第１の抗体と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、当該第２の抗体は、（ｉ）変異体ＩＬ－２ポリペプチド又は（ｉｉ）第１の抗体と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、免疫複合体は、一又は複数のリンカー配列によって接続する、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、第１の抗体、特にＦａｂ分子及び第２の抗体、特にＦａｂ分子とから本質的になる。かかるフォーマットは、標的抗原（ＣＤ８）に対して高い親和性で結合するが、ＩＬ－２受容体に対するモノマー結合のみを与え、そのため、標的部位以外の他の位置にあるＩＬ－２受容体を生じる免疫細胞に対して免疫複合体が標的化するのを避けるという利点を有する。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１の抗体（特に第１のＦａｂ分子）と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗体（特に第２のＦａｂ分子）と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の抗体（特に第１のＦａｂ分子）は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗体（特に第２のＦａｂ分子）と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の抗体（特に第１のＦａｂ分子）は、第１の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗体（特に第２のＦａｂ分子）と、カルボキシ末端ペプチドを共有する。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１の重鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の重鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の軽鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合によって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに接続し、更に、アミノ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に接続する。別の実施形態では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合によって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに接続し、更に、カルボキシ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に接続する。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２のＦａｂ 重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。他の実施形態では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施形態では、免疫複合体は、一又は複数のｓｃＦＶ分子と、アミノ末端ペプチド結合を共有し、一又は複数のｓｃＦＶ分子と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。
しかしながら、本発明による免疫複合体のための特に好適なフォーマットは、抗体として免疫グロブリン分子を含む。かかる免疫複合体フォーマットは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、特定の実施形態では、免疫複合体は、本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より詳しくはＩｇＧ１分子とを含む。一実施形態では、免疫複合体は、１つ以下の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、ヒトである。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、ヒト定常領域、例えば、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含む。一実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、免疫グロブリン分子と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施形態では、免疫複合体は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、一又は複数のリンカー配列によって連結された免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より詳しくはＩｇＧ１分子とから本質的になる。具体的な実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、免疫グロブリン重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して融合する。
変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、抗体に直接的に、又は一又は複数のアミノ酸、典型的には、約２～２０アミノ酸を含むリンカーペプチドを介して融合していてもよい。リンカーペプチドは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎリンカーペプチドが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施形態では、リンカーペプチドは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施形態では、５～１００アミノ酸長、更なる実施形態では、１０～５０アミノ酸長を有する。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、１５アミノ酸長を有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、更なる実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝３である。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１５）である。一実施形態では、リンカーペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む（又は配列番号１５のアミノ酸配列からなる）。
特定の実施形態では、免疫複合体は、変異ＩＬ－２分子と、ＣＤ８に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリン分子とを含み、変異ＩＬ－２分子は、そのアミノ末端アミノ酸において、配列番号１５のリンカーペプチドを介して免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合されている。
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、変異ＩＬ－２分子と、ＣＤ８に結合する抗体とを含み、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、変異ＩＬ－２分子は、そのアミノ末端アミノ酸において、配列番号１５のリンカーペプチドを介してＦｃドメインのサブユニットの一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合されている。
ＣＤ８抗体
本発明の免疫複合体に含まれる抗体は、ＣＤ８、特にヒトＣＤ８に結合し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを、ＣＤ８が発現される標的部位、特に、例えば腫瘍に関連するＣＤ８を発現するＴ細胞に向けることができる。
本発明の免疫複合体に使用され得る好適なＣＤ８抗体は、ＰＣＴ国際公開第２０１９／０３３０４３号Ａ２に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の免疫複合体は、同一の又は異なる抗原に結合し得る２つ以上の抗体を含み得る。しかしながら、特定の実施形態では、これらの抗体の各々はＣＤ８に結合する。一実施形態では、本発明の免疫複合体に含まれる抗体は単一特異性である。特定の実施形態では、免疫複合体は、単一の単一特異性抗体、特に単一特異性免疫グロブリン分子を含む。
抗体は、ＣＤ８、特にヒトＣＤ８への特異的結合を保持する任意の種類の抗体又はその断片であり得る。抗体断片としては、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、特定の実施形態では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は免疫グロブリン、特にＩｇＧクラス、より詳しくはＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
機能特性
本明細書で提供される抗ＣＤ８抗体は、以下の特徴の一又は複数を有する：（ａ）抗体はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を阻害又は刺激しない；（ｂ）抗体はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導しない；（ｃ）抗体はＩＦＮγ産生を誘導しない；（ｄ）抗体はヒトＣＤ８に特異的に結合する；（ｅ）抗体はアカゲザルＣＤ８に特異的に結合する；（ｆ）抗体がカニクイザルＣＤ８に特異的に結合する；（ｇ）抗体はＣＤ４＋細胞に結合しない；（ｇ）抗体はＣＤ３－細胞に結合しない；（ｈ）抗体は循環からＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させない。かかる特徴は、周知の方法、例えばＰＣＴ国際公開第２０１９／０３３０４３号Ａ２で使用されている方法を使用して評価することができる。
抗ＣＤ８抗体は、十分な親和性及び特異性でＣＤ８に結合する抗体である。一定の実施形態では、抗ＣＤ８抗体は、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のいずれか１つのＫｎでヒトＣＤ８に結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む。一定の実施形態では、抗ＣＤ８抗体は、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のいずれか１つのＫｎでアカゲザルＣＤ８に結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む。一定の実施形態では、抗ＣＤ８抗体は、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のＫｎでカニクイザルＣＤ８に結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む。
特定の実施形態では、抗ＣＤ８抗体は、（ａ）ヒトＣＤ８に、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のＫｎで結合し、これらの値の間の任意の範囲を含み、これらの値の間の任意の範囲を含む；（ｂ）アカゲザルＣＤＳに、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のＫｎで結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む；並びに（ｃ）カニクイザルＣＤ８に、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－－１３Ｍ）のＫｎで結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む。ヒトＣＤ８、アカゲザルＣＤ８及び／又はカニクイザルＣＤ８について本明細書で提供される抗ＣＤ８抗体のＫｎは、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、放射免疫沈降（ＲＩＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。特定の実施形態では、ヒトＣＤ８、アカゲザルＣＤ８及び／又はカニクイザルＣＤ８について本明細書で提供される抗ＣＤ８抗体のＫｎは、ＳＰＲを介して決定される。特定の実施形態では、ヒトＣＤ８、アカゲザルＣＤ８及び／又はカニクイザルＣＤ８について本明細書で提供される抗ＣＤ８抗体のＫｎは、Ｆ ＡＣＳを介して決定される。
特定の実施形態では、本明細書中に提供される抗ＣＤ８抗体は、マウスＣＤ８に結合しない（例えば特異的に結合しない）。特定の実施形態では、抗ＣＤ８抗体はラットＣＤ８に結合しない（例えば特異的に結合しない）。特定の実施形態では、抗ＣＤＳ抗体は、例えば、ＳＰＲ及び／又はＦＡＣＳによって測定される場合、マウスＣＤ８又はラットＣＤ８のいずれにも結合しない（例えば特異的に結合しない）。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒト化可変領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒト化可変領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号２２及び２３（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号２４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２２又は配列番号２３のアミノ酸配列、特に配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されたようなＦｃドメインにおけるアミノ酸変異を含んでもよい。
Ｆｃドメイン
特定の実施形態では、本発明による免疫複合体に含まれる抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施形態では、本発明の免疫複合体は、１つ以下のＦｃドメインを含む。
一実施形態では、免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４ 抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。更により特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号２１で与えられる。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による免疫複合体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した変異体ＩＬ－２ポリペプチド、特に単一の（１つ以下の）変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には、２つの同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体化が、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組合せをもたらす。組換え産生における免疫複合体の収率及び純度を改善するため、抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、特定的な実施形態では、本発明に係る免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施形態では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾にいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのかかる手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインが、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）が、自身とホモ二量化せず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量化するように仕向けられている相補的な様式で操作されている（その結果、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間のホモ二量体は形成されない）。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様のサイズの代償的空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、特定の実施形態では、免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって、又はペプチド合成によって作成することができる。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメイン（「ホール」サブユニット）の第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なお更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成を生じ、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を更に含む。
特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（場合によってはリンカーペプチドを介して）融合している。理論によって束縛されることを望まないが、Ｆｃドメインのノブを含有するサブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの融合は、２つの変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む免疫複合体の生成を（更に）最小化する（２つのノブを含有するポリペプチドの立体的な衝突）。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾についての他の技術が本発明の代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一実施形態では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の免疫複合体に含まれる抗体の１つの好ましい実施形態は、アミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＫ３７０Ｅ及びアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他の１つにおけるＥ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である。
別の実施形態では、本発明の免疫複合体に含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインに更なるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の実施形態では、本発明の免疫複合体に含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含む、又は当該抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）から選択されるアミノ酸変異を含む。
一実施形態では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２にある更なるアミノ酸変異、例えば、（ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、（ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、（ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、（ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、（ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、（ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量化手法が代わりに使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸修飾を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、上に記載するホールにノブを入れる技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量化手法が、代わりに使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、免疫複合体に含まれる抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。
代替的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましくなるように、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの界面での一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。かかる一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、又はこれに代えて、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）によるアミノ酸置換を含む。
なお更なる実施形態では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に別の実施形態では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用してもよい。
一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、免疫複合体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。しかしながら同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への免疫複合体の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化によって、サイトカインが放出され、ＩＬ－２ポリペプチドと、長い半減期の免疫複合体とが組み合わさり、全身投与すると、サイトカイン受容体が過剰に活性化し、重篤な副作用が起こる。これと一致して、従来のＩｇＧ－ＩＬ－２免疫複合体は、注入反応と関係があることが記載されている（例えば、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２、４４６３－４４７３（２００４）を参照されたい）。
したがって、特定の実施形態では、本発明による免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクタ機能の低減を示す。かかる一実施形態では、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む抗体）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より具体的には１０％未満、とりわけ５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に示す、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より具体的には１０％未満、とりわけ５％未満のエフェクタ機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメインドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクタ機能を誘導しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクタ機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の実施形態では、エフェクタ機能はＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む抗体）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体）の約７０％超、特に約８０％超、より詳しくは約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに示す場合に達成される。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクタ機能が低下するように操作される。特定の実施形態では、免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ一又は複数のアミノ酸変異が存在する。一実施形態では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低下させる。一実施形態では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低下させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる１つより多いアミノ酸変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸変異の組合せが、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は更に少なくとも５０分の１まで下げてもよい。一実施形態では、操作されたＦｃドメインを含む抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、より詳しくは５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に示す。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が低減される。いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する結合親和性（特定的にはＣ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち、当該受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は当該Ｆｃドメインの非操作形態を含む抗体）の約７０％超の結合親和性をＦｃＲｎに示す場合に達成される。Ｆｃドメイン又は当該Ｆｃドメインを含む本発明の免疫複合体に含まれる抗体は、かかる親和性の約８０％超、更には約９０％超を示すことができる。特定の実施形態では、免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクタ機能が低下するように操作される。エフェクタ機能の低減には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体との架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減の一又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、エフェクタ機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される一又は複数である。特定の実施形態では、低下したエフェクタ機能は、低下したＡＤＣＣである。一実施形態では、ＡＤＣＣの低減は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施形態では、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を低減するアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。かかる一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５のアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）。特定的には、特定的な実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）を含み、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３５Ａ）と置き換わっており、位置３２９のプロリン残基が、グリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）と置き換わっている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。かかる一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に、補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、かかる変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクタ機能の決定方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクタ機能の低減を示す。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の免疫複合体に含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。Ｆｃ受容体及び／又はそのエフェクタ機能に対する結合親和性を更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。別の実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。特定の実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、特異的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。かかるＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
特定の実施形態では、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び場合によってはＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び場合によってはＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は、除去されている。かかる一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸変異、特定的には、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本明細書上記及びＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能が低減されたＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。かかるＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む抗体のエフェクタ機能は、当該技術分野に既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。かかるアッセイに有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。
いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクタ機能を有するように操作されるいくつかの実施形態では、当該低減されたエフェクタ機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
本発明の特定の態様
一態様では、本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、
当該変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子であり、
特定の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一態様では、本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＣ１２５Ａ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子であり；
特定の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一態様では、本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
特定の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
本発明の上記態様のいずれかによる一実施形態では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリンであり、
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合によっては、位置３６６のトレオニン残基は、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換わっており（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスのナンバリング）を含む。
この実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、配列番号１５のリンカーペプチドを介し、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合する。
一態様では、免疫複合体は、配列番号９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含む２つのポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。
一態様では、免疫複合体は、配列番号９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。
更なる態様では、本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子である。（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＣ１２５Ａ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子である。（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体を提供し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
本発明の上記態様のいずれかによる一実施形態では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリンであり、
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合によっては、位置３６６のトレオニン残基は、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換わっており（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、更に、Ｆｃドメインの各々のサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
この実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、配列番号１５のリンカーペプチドを介し、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合する。
一態様では、免疫複合体は、配列番号３０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む２つのポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。
一態様では、免疫複合体は、配列番号３０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む免疫複合体を提供する。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の免疫複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施形態では、当該断片は、抗原結合断片である。
本発明の免疫複合体をコードするポリヌクレオチドは、完全な免疫複合体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な免疫複合体を形成してもよい。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む免疫複合体の一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫複合体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち１つと変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む免疫複合体の一部は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方を含む免疫複合体の一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、Ｆｃドメインサブユニットが会合し、Ｆｃドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る免疫複合体全体をコードする。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る免疫複合体に含まれるポリペプチドをコードする。
一実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、免疫複合体に含まれる抗体の重鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、免疫複合体に含まれる抗体の軽鎖をコードする。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明で有用な変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。この観点で、ネイティブＩＬ－２のヌクレオチド配列は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３０２，３０５－１０（１９８３））に記載されており、ヒトＩＬ－２をコードする核酸は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ロックビル、ＭＤ）等の公的な寄託機関から入手可能である。ネイティブヒトＩＬ－２の配列を配列番号１３に示す。置換又は挿入は、天然アミノ酸残基及び非天然アミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸修飾は、例えば、グリコシル化部位の付加又は炭水化物の接続等、化学修飾の周知の方法を含む。
本発明の免疫複合体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生について、免疫複合体（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチド、例えば、上述のものは、更なるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、一又は複数のベクターに挿入される。かかるポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。一実施形態では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、免疫複合体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、免疫複合体（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写要素又は翻訳制御要素と共に操作可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、一又は複数のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、異種コード領域をコードし、本発明の免疫複合体をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント又は誘導体に融合するか、又は融合しなくてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列（一又は複数）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、一又は複数の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサ、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）等の他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。例えば、ヒトＩＬ－２は、ポリペプチドのＮ末端にある２０アミノ酸シグナル配列を用いて翻訳され、その後、開裂して、成熟１３３アミノ酸ヒトＩＬ－２を生成する。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えばＩＬ－２ シグナルペプチド又は免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするために使用可能な（例えば、ヒスチジンタグ）、又は免疫複合体を標識するのに役立つ短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする免疫複合体（断片）の末端に、又は末端の中に含まれていてもよい。
更なる実施形態では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。かかる一実施形態では、宿主細胞は、本発明の免疫複合体をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクターを含む（例えば、形質転換されるか、又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の免疫複合体又はその断片を生成するように操作することが可能任意の種類の細胞系を指す。免疫複合体を複製し、免疫複合体の発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。かかる細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の免疫複合体を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組合せて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を製造するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ：ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳がん細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；並びにＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかに融合する変異体ＩＬ－２ポリペプチドを発現する細胞は、発現した変異体ＩＬ－２の融合産物が、重鎖と軽鎖の両方を含む抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように操作されてもよい。
一実施形態では、本発明に係る免疫複合体を製造するための方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるように、免疫複合体の発現に適した条件下、免疫複合体をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、場合によっては、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から免疫複合体を回収することとを含む。
本発明の免疫複合体では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、抗体に遺伝的に融合されていてもよく、又は抗体に化学的に抱合されていてもよい。抗体に対するＩＬ－２ポリペプチドの遺伝的融合は、ＩＬ－２配列が、ポリペプチドに直接的に融合するか、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。特定のリンカーペプチドは、本明細書に記載される。また、望ましい場合、更なる配列が、開裂部位を組み込み、融合の個々の構成要素を分離するために含まれていてもよい（例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。これに加え、ＩＬ－２融合タンパク質は、当該技術分野で周知であるように、ポリペプチド合成方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）を用い、化学的に合成されてもよい。変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、周知の化学抱合方法を用い、他の分子（例えば抗体）に化学的に抱合されてもよい。二官能架橋試薬（例えば、当該技術分野で周知のホモ官能性及びヘテロ官能性架橋試薬）をこの目的で使用することができる。使用する架橋試薬の種類は、ＩＬ－２にカップリングする分子の性質に依存し、当業者なら容易に特定することができる。これに代えて、又はこれに加え、変異体ＩＬ－２及び／又は抱合されることを意図した分子は、これも当該技術分野で周知なように、これら２つを別個の反応で抱合することができるように化学的に誘導体化されてもよい。
本発明の免疫複合体は、抗体を含む。抗体を製造するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって製造することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい）構築することができる。免疫複合体、抗体、及びこれらを製造するための方法も、例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１１／０２０７８３号、国際公開第２０１２／１０７４１７号及び国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されている。
任意の動物種の抗体を、本発明の免疫複合体に使用することができる。本発明において有用な非限定的な抗体は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。免疫複合体がヒトへの使用を意図したものである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化された抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説され、更に以下に記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択アプローチを記載する）。ヒト化に用い得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）；並びにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト抗体は、免疫原を、インタクトなヒト抗体又は抗原性チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に投与することによって調製されてもよい。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に修飾されてもよい。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体はまた、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリからの単離によって作られてもよい。
本発明に有用な抗体は、所望の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離されてもよい。コンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）におけるＬｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．等において総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。かかる方法は、例えば、ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）におけるＦｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．及びＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）におけるＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．と並んで、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）におけるＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）におけるＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙに見られる。
ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別にクローニングされ、ファージライブラリにおいて無作為に組換えられており、次いで、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）におけるＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．において説明されたように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を与える。あるいはまた、ナイーブなレパートリーをクローン化し（例えば、ヒトから）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．のＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、免疫化することなく、非自己から自己抗原までの広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最終的に、生来のライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ ＷｉｎｔｅｒのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）によって説明されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再整列を達成することによって、合成により作成することができる。ヒト抗体ファージライブラリを説明する特許刊行物には、例えば、以下が含まれる：米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号。所望の活性又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための当該技術分野で知られている方法の更なる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイの方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）において、及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）において、並びにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）において見られる。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．のＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。
本発明の免疫複合体の更なる化学修飾が望ましい場合がある。例えば、免疫原性及び半減期の問題は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）等の実質的に直鎖のポリマーへの抱合によって改良され得る（例えば、国際公開第８７／０００５６号を参照されたい）。
本明細書で記載するように調製される免疫複合体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の当該技術分野で既知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性等の因子に依存し、当業者には明らかである。抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製について、リガンド受容体又は抗原を、免疫複合体が結合するものに対して使用してもよい。例えば、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用してもよい。本発明の免疫複合体のアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はＧを含むマトリックスを使用してもよい。例えば、連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用し、本質的に実施例に記載されるように、免疫複合体を単離することができる。免疫複合体の純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等の任意の種々の周知の分析方法によって決定することができる。
組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、以下のいずれかの治療方法で使用するための、本明細書に記載の免疫複合体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書で与えられるいずれかの免疫複合体と、薬学的に許容され得る担体とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される免疫複合体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。
更に提供されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与に適した形態で本発明の免疫複合体を製造するための方法であって、この方法は、（ａ）本発明に係る免疫複合体を得ること、及び（ｂ）免疫複合体と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体とを配合し、それによって、免疫複合体の製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために配合することを含む、方法である。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体に溶解又は分散した治療有効量の免疫複合体を含む。「薬学的又は薬理学的に許容され得る」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。免疫複合体と、場合によっては、更なる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、本明細書に参考として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当該技術分野で既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって必要とされるような滅菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、当業者には知られているように（例えば、本明細書に参照により組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）、任意及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダ、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、かかる類似の材料及びこれらの組合せを含む。任意の従来の担体が、有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物又は医薬組成物における使用が想定される。
本発明の免疫複合体（及び任意の更なる治療剤）は、非経口、肺内、鼻内を含む任意の適切な手段によって投与されてもよく、所望な場合、局所処置では、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によるものであり得る。
非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の免疫複合体は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。又は、免疫複合体は、適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いて使用前に構築するための粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の免疫複合体を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。場合によっては、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組合せ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
既に記載した組成物に加え、免疫複合体は、デポー製剤として配合されてもよい。かかる長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、免疫複合体は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の免疫複合体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。医薬組成物は、一又は複数の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
免疫複合体は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第２鉄等の無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
治療方法及び組成物
本明細書で与えられるいずれかの免疫複合体を治療方法に使用してもよい。本発明の免疫複合体は、例えば、がんの処置において、免疫治療剤として使用されてもよい。
治療方法で使用するために、本発明の免疫複合体は、良好な医療での実施に一致した様式で配合され、用量に分けられ、投与される。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
本発明の免疫複合体は、宿主の免疫系の刺激が有益である疾患状態、特に、高められた細胞免疫応答が望ましい状態を処置する際に特に有用であり得る。これらは、宿主免疫応答が不十分であるか、又は不足している疾患状態を含んでいてもよい。本発明の免疫複合体が投与され得る疾患状態は、例えば、細胞免疫応答が、特定の免疫にとって重大な機構である腫瘍又は感染を含む。本発明の免疫複合体は、そのまま投与されてもよく、又は任意の適切な医薬組成物で投与されてもよい。
一態様では、医薬として使用するための本発明の免疫複合体が提供される。更なる態様では、疾患の処置に使用するための本発明の免疫複合体が提供される。特定の実施形態では、処置方法に使用するための本発明の免疫複合体が提供される。一実施形態では、本発明は、疾患の処置を必要とする個体に、疾患の処置に使用するための本明細書に記載の免疫複合体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、個体に治療有効量の免疫複合体を投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法で使用するための免疫複合体を提供する。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、処置される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。更なる実施形態では、本発明は、免疫系を刺激するのに使用するための免疫複合体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、個体に有効量の免疫複合体を投与し、免疫系を刺激することを含む、個体において免疫系を刺激するための方法で使用するための免疫複合体を提供する。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。上のいずれかの実施形態に係る「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうち任意の一又は複数を含んでいてもよい。
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の免疫複合体の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、疾患の処置を必要とする個体において、疾患の処置のためのものである。一実施形態では、医薬は、疾患を有する個体に、治療有効量の医薬を投与することを含む、疾患を処置する方法で使用するためのものである。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。一実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、処置される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。更なる実施形態では、医薬は、免疫系を刺激するためのものである。更なる実施形態では、医薬は、個体に有効量の医薬を投与し、免疫系を刺激することを含む、個体において免疫系を刺激するための方法で使用するためのものである。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。上のいずれかの実施形態に係る「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうち任意の一又は複数を含んでいてもよい。
更なる態様では、本発明は、個体において疾患を処置するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、かかる疾患を有する個体に、治療有効量の本発明の免疫複合体を投与することを含む。一実施形態では、本発明の免疫複合体を薬学的に許容され得る形態で含む組成物が、当該個体に投与される。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、処置される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。更なる態様では、本発明は、個体に有効量の免疫複合体を投与し、免疫系を刺激することを含む、個体において免疫系を刺激するための方法を提供する。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。上のいずれかの実施形態に係る「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうち任意の一又は複数を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、脳腫瘍、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平細胞がん腫、骨がん及び腎臓がんが挙げられる。本発明の免疫複合体を用いて処置可能な他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施形態では、がんは、腎臓がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、前立腺がん及び膀胱がんからなる群から選択される。当業者は、多くの場合に、免疫複合体が、治癒を与えないが、部分的な利益のみを与える場合があることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、いくつかの利益を有する生理学的変化も、治療利益であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、生理学的変化を与える免疫複合体の量は、「有効量」又は「治療有効量」と考えられる。処置が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より具体的には、ヒトである。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明の免疫複合体が細胞に投与される。他の実施形態では、治療有効量の本発明の免疫複合体が、疾患を処置するために個体に投与される。
疾患の予防又は処置のために、本発明の免疫複合体の適切な投薬量（単独で使用される場合、又は一又は複数の他の更なる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、処置される疾患の種類、投与経路、患者の体重、分子の種類（例えば、Ｆｃドメインを含むか、又は含まないか）、疾患の重篤度及び経過、免疫複合体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び免疫複合体に対する応答、及び主治医の判断によって変わる。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分（一又は複数）の濃度、個々の対象に適切な用量（一又は複数）を決定する。限定されないが、種々の時間点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む種々の投薬計画が本明細書で想定される。
免疫複合体は、一度に、又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の免疫複合体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための初期の候補投薬量であってもよい。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。免疫複合体の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の非限定的な例では、投薬量はまた、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重までを含んでいてもよく、又は投与あたり更に多くてもよく、これらから誘導される任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等が、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１回以上の用量を患者に投与してもよい。かかる投薬量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の免疫複合体の投薬を受ける）。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
本発明の免疫複合体は、一般的に、意図した目的を達成するのに効果的な量で使用される。疾患状態を処置又は予防するための使用のために、本発明の免疫複合体、又はその医薬組成物が、治療有効量で投与されるか、又は塗布される。治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。かかる情報を使用し、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定することができる。
初期投薬量も、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物データに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
治療効果を維持するのに十分な免疫複合体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は、個々に調節されてもよい。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定することができる。
局所投与又は選択的な取り込みの場合には、免疫複合体の有効な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化することができる。
本明細書に記載の免疫複合体の治療に有効な投薬量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、一般的に治療利益を与える。免疫複合体の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す免疫複合体が好ましい。一実施形態では、本発明に係る免疫複合体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を決定する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態等の種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。実際の製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照されたい）。
本発明の免疫複合体で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全等に起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、処置をより高レベルにするように調整することも知っているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、処置される状態の重篤度、投与経路等に伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む免疫複合体の最大治療用量は、野生型ＩＬ－２を含む免疫複合体に使用するものから増加してもよい。
他の薬剤及び処置
本発明に係る免疫複合体は、治療において、一又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の免疫複合体は、少なくとも１つの更なる治療剤と一緒に投与されてもよい。「治療剤」という用語は、かかる処置が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。かかる更なる治療剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。特定の実施形態では、更なる治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。
かかる他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。かかる他の薬剤の有効量は、使用される免疫複合体の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。免疫複合体は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上述のかかる併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の免疫複合体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。また、本発明の免疫複合体を、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。
製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組み合わせで、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液袋又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の免疫複合体である。ラベル又はパッケージ添付文書は、その組成物が、選択した条件を処置するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が、本発明の免疫複合体を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物が、更なる細胞毒性剤又はその他の治療剤を含む、第２の容器とを備えていてもよい。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を処置するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得るバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含むＩｇＧ－ＩＬ－２免疫複合体フォーマットの模式図。（図１Ａ）２アーム型抗ＣＤ８；（図２Ａ）１アーム型抗ＣＤ８。 静止期ＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞への、抗ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ（ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ）と比較した、２アーム型抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ）及び１アーム型抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ）の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて分子を検出した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＢＭＣのＣＤ３及びＣＤ８染色を使用して同定した。 静止期ＰＢＭＣをＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ及びＦＡＰ－ＩＬ２ｖで処置したときのＣＤ８ Ｔ細胞（図３Ａ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（図３Ｃ）、制御性Ｔ細胞（図３Ｄ）及びＮＫ細胞（図３Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化をフローサイトメトリーによって決定した。 ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ及びＦＡＰ－ＩＬ２ｖによるＰＢＭＣ内のＮＫ細胞（図４Ｃ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（図４Ｂ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（図４Ｃ）の増殖をフローサイトメトリーによって決定した。 静止期ＰＢＭＣをＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡ及びＦＡＰ－ＩＬ２ｖで処置したときのＣＤ８ Ｔ細胞（図５Ａ）、ＮＫ細胞（図５Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（図５Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（図５Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化をフローサイトメトリーによって決定した。
Figure 2022538139000002
Figure 2022538139000003
Figure 2022538139000004
Figure 2022538139000005
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
実施例１
実施例１．１ヒトＣＤ８を標的とする抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ複合体及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ複合体の生成
略語「ＴＡ」は、本明細書では「２アーム型」を表す。略語「ＯＡ」は、本明細書では「１アーム型」を表す。「抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ」及び「ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ」及び「ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
全ての遺伝子の発現は、ヒトＣＭＶプロモーター－イントロンＡ－５’ＵＴＲカセットの制御下にある。遺伝子の下流には、ＢＧＨポリアデニル化シグナルが位置する。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における使用のため、ベクターは、プラスミドの安定なエピソーム維持のためのｏｒｉＰエレメントを含有する。
実施例１．２ ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生
ＩｇＧ－ＩＬ２を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡについては、細胞を１：１：２の対応する発現ベクターでトランスフェクトする（「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＩＬ２ｖ）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」）。抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡについては、細胞を１：１：１の対応する発現ベクターでトランスフェクトする（「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター重鎖（ＣＨ２－ＣＨ３－ＩＬ２ｖ）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」）。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充液（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
実施例１．３ ＩｇＧ様タンパク質の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養物上清から精製した（平衡化緩衝液：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム，２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム，１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ グリシン ｐＨ３．０）。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いてサンプルをすぐにｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
実施例１．４ ＩｇＧ様タンパク質の分析
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下、及び不在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。
両方のＩｇＧ－ＩＬ２ｖ構築物を、９８％を超えるサイズ排除クロマトグラフィーによって決定されたモノマー含有量で同等かつ良好な品質で精製した。主ピーク（ＣＥ－ＳＤＳによって決定された）のパーセンテージは９２％超であった。精製後の収率（Ｌ単位で生成された上清の体積で割ったｍｇ単位で精製された量）は、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡについては２．１ｍｇ／Ｌ、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡについては７．８ｍｇ／Ｌであった。
抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡは、配列番号９のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドと、配列番号１０のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドと、配列番号１１のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドとからなる（フォーマット：Ａ２ＨＫ）。抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡは、配列番号９のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドと、配列番号１０のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドと、配列番号１２のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドとからなる（フォーマット：ＡＨＫ）。
抗ＣＤ８（ＯＫＴ８．ｖ１１）－ＩＬ２ｖ ＴＡは、配列番号３０のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドと、配列番号１０のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドと、配列番号１１のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドとからなる（フォーマット：Ａ２ＨＫ）。「抗ＣＤ８（ＯＫＴ８．ｖ１１）－ＩＬ２ｖ ＴＡ」、「抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡ」及び「ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。抗ＣＤ８（ＯＫＴ８．ｖ１１）－ＩＬ２ｖ ＯＡは、配列番号３０のアミノ酸配列を有する一方のポリペプチドと、配列番号１０のアミノ酸配列を有する一方のポリペプチドと、配列番号１２のアミノ酸配列を有する一方のポリペプチドとからなる（フォーマット：ＡＨＫ）。「抗ＣＤ８（ＯＫＴ８．ｖ１１）－ＩＬ２ｖ ＯＡ」、「抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＯＡ」及び「ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＯＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
この実施例で調製した複合体を以下の実施例で更に使用した。
実施例２
ＣＤ８ Ｔ細胞への抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡの結合
健康なドナーから新たに単離されたＰＢＭＣを計数し、９６ウェル丸底プレート（１００’０００細胞／ウェル）に移した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％ＮａＮ３）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の指定の分子３０μｌで４℃で３０分間染色した。その後、細胞をＦＡＣＳ 緩衝液で２回洗浄して、非結合色素を除去した。次いで、ＣＤ８ Ｔ細胞を検出するためのＣＤ３ ＰＥ抗体（３４４８０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ８ ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（５５７８３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に２０μｌの希釈ＦＩＴＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（１：５０希釈、１０９－０９６－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。最後に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８ Ｔ細胞）に対するＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａゲーティングを使用して測定した。
抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ分子を、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ（例えば、参照により組み込まれる国際公開第２０１２１０７４１７号Ａ１に開示されているように、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖは、配列番号２５、２６及び２７によるポリペプチドを含む）と比較して、ＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞に結合するそれらの能力について評価した。図２に示されるように、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡはＣＤ８ Ｔ細胞に対して非常に強い結合を示し、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡはＣＤ８ Ｔ細胞に対して弱く結合したが、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖよりもまだはるかに強い。これは、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡはＣＤ８に一価でのみ結合することができるが、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡはＣＤ８に二価で結合することができ、後者のＣＤ８に対するより高い結合活性をもたらすという事実と一致している。静止期ＣＤ８ Ｔ細胞のＩＬ２Ｒβ／γ発現はＣＤ８発現と比較して低いので（図２）、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖで見られるＣＤ８ Ｔ細胞への結合に対するＩＬ２ｖの寄与は最小に過ぎない。
実施例３
抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡによる処置時の免疫細胞のＳＴＡＴ５リン酸化
健康なドナーから新しく単離したＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート（２００，０００細胞／ウェル）内の温かい培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン）に接種した。プレートを３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞を、ＩＬ２ｖ複合体を含有する１００μｌの培地に再懸濁し、３７℃で２０分間刺激した。リン酸化状態を保存するために、等量の予め温めたＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（５５４６５５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３７℃で１０分間刺激した後、細胞を直ちに固定した。その後、プレートを３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。細胞内染色を可能にするために、細胞を２００μｌのＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で４℃にて３０分間透過処理した。次いで、細胞を１５０μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、９６ウェル丸底プレート２枚に分割し、それぞれ２０μｌの抗体ミックスＩ又はＩＩで冷蔵庫内で６０分間染色した。抗体ミックスＩを使用し、ＣＤ４ Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５を染色し、抗体ミックスＩＩを使用し、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞のｐＳＴＡＴ５を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり２％のＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー２００μｌで再懸濁した。分析は、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋）及びＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）をゲーティングするＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して行った。
Figure 2022538139000006
Figure 2022538139000007
ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡの機能的活性を、ＰＢＭＣ内の異なる免疫細胞サブセットに対するＦＡＰ－ＩＬ２ｖの機能的活性と比較した。ＳＴＡＴ５リン酸化をＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒ）活性化のマーカーとして使用した。図３に示すように、ＣＤ４ Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）では、試験した３つの分子は全て、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において同じ活性を有していた。ＣＤ８ Ｔ細胞上では、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡはＳＴＡＴ５リン酸化の誘導においてはるかに高い効力を有し、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡは抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡよりもわずかに強力であった。ＮＫ細胞では、抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及び抗ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡは、おそらくＣＤ８陽性のＮＫ細胞の割合のため、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖよりもわずかに強力であった。これらのデータは、ＣＤ８ Ｔ細胞へのＩＬ２ｖの標的化がＩＬ２ｖを介したＩＬ２ Ｒの活性化を強く増強することができ、ＣＤ８陰性Ｔ細胞上のＩＬ２ Ｒの活性化が増加しなかったため、この効果はシスにおいてのみ媒介されたことを示している（図３）。
実施例４
ＣＤ８－ＩＬ２ｖ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡによる処置時の免疫細胞の増殖
健康なドナーから新たに単離したＰＢＭＣをＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル、２１８８８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。簡潔には、３０００万個のＰＢＭＣをＰＢＳで一回洗浄した。並行して、ＣＳＦＥストック溶液（ＤＭＳＯ中２ｍＭ）をＰＢＳ中で１：２０に希釈した。ＰＢＭＣを予熱したＰＢＳ ３０ｍｌに再懸濁し、ＣＦＳＥ溶液３０μｌを添加し、細胞を直ちに混合した。最適な標識化のために、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、予熱した培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ、１％グルタミン）１０ｍｌを添加して標識反応を停止させた。細胞を４００ｇで１０分間スピンダウンし、２０ｍｌの新鮮な培地に再懸濁し、３７℃で更に３０分間インキュベートした。最後に、細胞を培地で一回洗浄し、１ｍｌあたり細胞１００万個で新鮮な培地に再懸濁した。標識されたＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート（１００’０００細胞／ウェル）に播種し、指定の分子で５日間処置した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中のＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７（５５７８３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＡＰＣ（クローンＳＫ１、３４４７２２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＰＥ（３００５０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ５６ ＢＶ４２１（３１８３２８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物２０μｌで４℃で３０分間染色した。その後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液中１％ＰＦＡで固定し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで蛍光を測定した。増殖は、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）及びＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）のＣＦＳＥ希釈を測定することによって決定した。
ＣＤ８－ＩＬ２ｖ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡを、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖと比較して、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について試験した。図４に示すように、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡは、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を誘導するＦＡＰ－ＩＬ２ｖと同様の活性を有していた。対照的に、ＣＤ８ Ｔ細胞では、ＣＤ８を介したこれらの細胞への分子の直接的な標的化のために、両方の分子がＦＡＰ－ＩＬ２ｖよりもはるかに強力に増殖を誘導した。ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡは約１３００倍強力であり、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡは約２００倍強力であった。これは、ＣＤ８ Ｔ細胞上の結合及びＳＴＡＴ５リン酸化において観察された違いと一致している。
実施例４
ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡによる処置時の免疫細胞のＳＴＡＴ５リン酸化
健康なドナーから新しく単離したＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート（２００，０００細胞／ウェル）内の温かい培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン）に接種した。プレートを３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞を、ＩＬ２ｖ分子を含有する１００μｌの培地に再懸濁し、３７℃で２０分間刺激した。リン酸化状態を保存するために、等量の予め温めたＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（５５４６５５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３７℃で１０分間刺激した後、細胞を直ちに固定した。その後、プレートを３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。細胞内染色を可能にするために、細胞を２００μｌのＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で４℃にて３０分間透過処理した。次いで、細胞を１５０μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、９６ウェル丸底プレート２枚に分割し、それぞれ２０μｌの抗体ミックスＩ又はＩＩで冷蔵庫内で６０分間染色した。抗体ミックスＩを使用し、ＣＤ４ Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５を染色し、抗体ミックスＩＩを使用し、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞のｐＳＴＡＴ５を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり２％のＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー２００μｌで再懸濁した。分析は、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋）及びＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）をゲーティングするＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して行った。
Figure 2022538139000008
Figure 2022538139000009
ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導するＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡの機能的活性を、ＰＢＭＣ内の異なる免疫細胞サブセットに対するＦＡＰ－ＩＬ２ｖの機能的活性と比較した。ＳＴＡＴ５リン酸化をＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒ）活性化のマーカーとして使用した。ＣＤ４ Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）では、試験した３つの分子は全て、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において同じ活性を示した。ＣＤ８ Ｔ細胞では、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡは、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導においてはるかに高い効力を示したが、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡとＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡとの間で活性化に差はなかった。ＮＫ細胞では、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＴＡ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＫＴ８．ｖ１１ ＴＡは、おそらくＣＤ８陽性のＮＫ細胞の割合のため、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖよりもわずかに強力であった。これらのデータは、ＣＤ８ Ｔ細胞へのＩＬ２ｖの標的化がＩＬ２ｖを介したＩＬ２ Ｒの活性化を強く増強することができ、ＣＤ８陰性Ｔ細胞上のＩＬ２ Ｒの活性化が増加しなかったため、この効果はシスにおいてのみ媒介されたことを示している（図５）。
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、その記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

Claims (38)

  1. 変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体であって、前記ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含む変異体ＩＬ－２ポリペプチドである、免疫複合体。
  2. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、前記アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子であり、
    前記抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号６又は配列番号２８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  3. 前記ＩＬ－２ポリペプチドが変異体ＩＬ－２ポリペプチドであり、
    前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、前記アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列、配列番号１３、に対するナンバリング）を含むヒトＩＬ－２分子であり、
    前記抗体が、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号８又は配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  4. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが更に、アミノ酸置換Ｔ３Ａ及び／又はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  5. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１４の配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  6. 前記免疫複合体が、１つ以下の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  7. 前記抗体が、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  8. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである、請求項７に記載の免疫複合体。
  9. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項７又は８に記載の免疫複合体。
  10. 前記抗体がＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  11. 前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  12. 前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、前記第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な前記第１のサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットの前記ＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、前記第２のサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、前記第１のサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内の前記突起が位置決め可能である、請求項７から１１のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  13. 前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合によっては、位置３６６のトレオニン残基は、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、請求項９～１２のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  14. 前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、請求項１３に記載の免疫複合体。
  15. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、前記Ｆｃドメインの前記サブユニットの１つ、特に、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して融合している、請求項９から１４のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  16. 前記リンカーペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の免疫複合体。
  17. 前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合及び／又はエフェクタ機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  18. 前記一又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスのナンバリング）の群から選択される一又は複数の位置にある、請求項１７に記載の免疫複合体。
  19. 前記Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスのナンバリング）を含む、請求項９から１８のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  20. 配列番号９又は配列番号３０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１又は配列番号１２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  21. 配列番号９又は配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  22. 配列番号９又は配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  23. リンカー配列によって連結された、変異体ＩＬ－２ポリペプチド及びＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の免疫複合体をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
  25. 請求項２４に記載のポリヌクレオチド（一又は複数）を含む、一又は複数のベクター、特に、発現ベクター。
  26. 請求項２４に記載のポリヌクレオチド（一又は複数）又は請求項２５に記載のベクター（一又は複数）を含む宿主細胞。
  27. 変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む免疫複合体の製造方法であって、（ａ）請求項２５に記載の宿主細胞を、前記免疫複合体の発現に適した条件下で培養すること、及び場合によっては、（ｂ）前記免疫複合体を回収することを含む、方法。
  28. 請求項２７に記載の方法によって製造される、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８に結合する抗体とを含む、免疫複合体。
  29. 請求項１から２３、又は２８のいずれか一項に記載の免疫複合体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  30. 医薬として使用するための請求項１から２３、又は２８のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  31. 疾患の処置に使用するための請求項１から２３、又は２８のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  32. 前記疾患ががんである、請求項３１に記載の疾患の処置に使用するための免疫複合体。
  33. 疾患の処置のための医薬の製造における請求項１から２３、又は２８のいずれか一項に記載の免疫複合体の使用。
  34. 前記疾患ががんである、請求項３３に記載の使用。
  35. 個体において疾患を処置する方法であって、治療有効量の請求項１から２３、又は２８のいずれか一項に記載の免疫複合体を含む組成物を薬学的に許容され得る形態で前記個体に投与することを含む、方法。
  36. 前記疾患ががんである、請求項３５に記載の方法。
  37. 個体の免疫系を刺激する方法であって、有効量の、請求項１から２３、又は２８のいずれか一項に記載の免疫複合体を含む組成物を薬学的に許容され得る形態で前記個体に投与することを含む、方法。
  38. 上述の発明。
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