KR20150038012A - 인터루킨-10 융합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 항체와 인터루킨-10(IL-10)의 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 생산하는 방법 및 질환의 치료에 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

인터루킨-10 융합 단백질 및 그의 용도{INTERLEUKIN-10 FUSION PROTEINS AND USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 항체와 인터루킨-10(IL-10)의 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 생산하는 방법 및 질환의 치료에 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.
IL -10의 생물학적 기능
IL-10은 약 37 kDa의 비-공유적으로 연결된 동종이량체(homodimer)로서 발현되는 α-나선형 사이토카인이다. 이것은 내성의 유도 및 유지에 있어 핵심 역할을 한다. 그의 두드러진 소염 특성은 오랫동안 알려져 왔다. IL-10은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12 및 Th1 사이토카인, 예를 들면, IL-2 및 INFγ와 같은 전-염증(pro-inflammatory) 사이토카인의 분비를 억제하고, 대식세포, B-세포 및 T-세포의 분화 및 증식을 조절한다[Glocker, E.O. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011); Moore, K.W. et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); de Waal Malefyt, R. et al., J. Exp. Med. 174, 915-924 (1991); Williams, L.M. et al., Immunology 113, 281-292 (2004)]. 또한, IL-10은 MHC II 발현뿐 아니라, 동시-자극 분자 CD80 및 CD86의 상향조절을 억제하는, 항원 표출의 유효한 억제제이다[Mosser, D.M. & Yhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)].
그럼에도 불구하고, 면역자극 특성도 또한 보고되었다. IL-10은 B-세포 활성화를 동시자극하고, B-세포 생존을 지연시키고, B-세포에서 종류 변환에 기여한다. 또한, 이것은 자연 살해(natural killer, NK) 세포 증식 및 사이토카인 생성을 동시자극하고, CD8+ T 세포의 특정 부분집합의 증식을 자극하는 성장 인자로서 작용한다[Mosser, D.M. & Yhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008); Cai, G. et al., Eur. J. Immunol. 29, 2658-2665 (1999); Santin, A.D. et al., J. Virol. 74, 4729-4737 (2000); Rowbottom, A.W. et al., Immunology 98, 80-89 (1999); Groux, H. et al., J. Immunol. 160, 3188-3193 (1998)]. 중요하게, 인간에서 고용량의 IL-10(각각 20 및 25 ㎍/kg)은 INFγ의 증가된 생성을 유도할 수 있다[Lauw, F.N. et al., J. Immunol. 165, 2783-2789 (2000); Tilg, H. et al., Gut 50, 191-195 (2002)].
IL-10은 IL-10 수용체 1(IL-10R1) 및 IL-10R2의 2개 복사체 각각으로 이루어진 2-수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다, IL-10R1은 비교적 높은 친화도(약 35 내지 200 pM)하에 IL-10에 결합하고[Moore, K.W. et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001)], 수용체 복합체에 대한 IL-10R2의 유입은 리간드 결합에 미미한 기여만 할 뿐이다. 그러나, 복합체에 대한 상기 두번째 수용체의 결합은 리간드 결합후 신호 전환을 가능하게 한다. 따라서, 기능성 수용체는 IL-10R1 및 IL-10R2의 이종이량체(heterodimer)들의 이량체로 이루어진다. 대부분의 조혈 세포는 구성적으로 낮은 수준의 IL-10R1을 발현하며, 수용체 발현은 종종 다양한 자극에 의해 현저하게 상향조절될 수 있다. 섬유아세포 및 상피세포와 같은 비-조혈세포도 또한 IL-10R1을 상향조절시킴으로써 자극에 반응할 수 있다. 대조적으로, IL-10R2는 대부분의 세포상에서 발현된다. 수용체 복합체에 대한 IL-10의 결합은 IL-10R1 및 IL-10R2 각각과 결합된 야누스(Janus) 티로신 키나제, JAK1 및 Tyk2를 활성화시켜 수용체들의 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 포스포릴화시킨다. 이것은 IL-10R1에 대한 STAT3의 유입을 야기한다. STAT3의 동종이량체화(homodimeraization)는 수용체로부터 그의 방출 및 포스포릴화된 STAT 동종이량체의 핵내로의 전위를 야기하며, 상기 핵에서 상기 동종이량체는 다양한 유전자의 프로모터들중 STAT3-결합 요소들에 결합한다. 상기 유전자들 중 하나는 IL-10 자체로, 이것은 STAT3에 의해 유리하게 조절된다. STAT3은 또한, STAT 활성화의 질 및 양을 조절하는 사이토카인 신호전달 3의 억제유전자(suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)를 활성화시킨다. SOCS3은 IL-10에 의해 유도되고, 다양한 사이토카인 유전자에 대해 불리한 조절 효과를 나타낸다[Mosser, D.M. & Yhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)].
유전자 결합 분석 및 후보 유전자 서열분석은 IL-10R1 및 IL-10R2에서의 돌연변이와 염증성 장 질환(IBD)의 한 형태인 조기-발생형 전장염 사이의 직접적인 연관성을 밝혔다[Glocker, E.O. et al., N. Engl. J. Med. 361(21), 2033-2045 (2009)]. 최근의 데이터는 조기 발생형 IBD가 심지어 단일유전자성일 수 있음을 시사한다. IL-10 사이토카인 또는 그의 수용체에서의 돌연변이는 IL-10 기능의 손실을 유도하고 유아 및 소아에서 심각한 전장염을 야기한다Glocker, E.O. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011)]. 또한, 심각한 형태의 크론병(Crohn's disease)을 갖는 환자는 전혈 세포 배양물 및 단핵구-유도된 수지상 세포에서 불완전한 IL-10 생성을 나타낸다[Correa, I. et al., J. Leukoc. Biol. 85(5), 896-903 (2009)]. IBD는 미국에서 약 140만명 및 유럽에서 220만명의 사람에게 발생한다[Carter, M.J. et al., Gut 53 (Suppl. 5), V1-V16 (2004); Engel, M.A. & Neurath, M.F., J. Gastroenterol. 45, 571-583 (2010)].
IL -10을 사용한 치료 접근방법
염증 질환 및 자가면역 질환에서 재조합 IL-10의 치료 이점은 건강한 자원자뿐 아니라 특정 환자 집단에서 다양한 환경에서 정맥내 또는 피하 투여된 단일 또는 다중 용량의 안전성, 내성, 약동학, 약력학, 면역학적 및 혈액학적 효과를 연구하는 I상 및 II상 임상 시험에서 평가되었다[Moore, K.W. et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E. et al., J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995); Huhn, R.D. et al., Blood 87, 699-705 (1996); Huhn, R.D. et al., Clin. Pharmacol. Ther. 62, 171-180 (1997)]. IL-10은 25 ㎍/kg 이하의 용량에서 심각한 부작용없이 잘 허용되었고, 100 ㎍/kg까지의 용량에서는 수용자의 일부에서 단지 약한정도 내지 중간정도의 독감-유사 증상이 관찰되었다[Moore, K.W. et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E. et al., J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995)]. 임상적 개선에 대한 경향은 건선(임상 연구들에 대한 편집물은 문헌 [Mosser, D.M. & Yhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)]에서 찾을 수 있다), 크론병[Van Deventer S.J. et al, Gastroenterology 113, 383-389 (1997); Fedorak, R.N. et al., Gastroenterology 119, 1473-1482 (2000); Schreiber, S. et al., Gastroenterolotgy 119, 1461-1472 (2000); Colombel J.F. et al., Gut 49, 42-46 (2001)] 및 류마티스성 관절염[Keystone, E. et al., Rheum. Dis. Clin. N. Am. 24, 629-639 (1998); Mosser, D.M. & Yhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)]에서 가장 흔히 나타났다.
전체적으로, 임상 결과는 불만족스러웠으며, 아미노 말단에서의 메티오닌 잔기를 제외하고 외인성 인간 IL-10과 동일한 재조합 인간 IL-10(일로데카킨, 테노빌(TENOVIL), 쉐링-플라우 리서치 인스티튜트(Schering-Plough Research Institue), 뉴저지 케닐워스)의 임상 개발은 효능의 결여로 인해 중단되었다. 크론병에서 관해 유도를 위한 재조합 인간 IL-10의 효능 및 내약성(tolerability)에 대한 최근의 체계적 검토는 완전 또는 임상적 관해에 대해 IL-10과 위약 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 없음을 밝혔으며, IL-10으로 치료된 환자가 위약에 비해 이상 반응으로 인해 연구에서 빠질 가능성이 훨씬 더 컸음을 언급하였다[Buruiana, F.E. et al., Cochrane Database Syst. Rev. 11, CD005109 (2010)]. 크론병의 경우, 상기 불만족스러운 결과들에 대한 여러가지 이유들이 논의되었다[Herfarth, H. & Scholmerich, J., Gut 50, 146-147 (2002)]: 1) 지속적인 소염 효과를 매개하기에는 너무 낮은, 장내 국소 사이토카인 농도, 2) 전신 투여된 IL-10의 용량 증가가 부작용으로 인해 제한됨, 및 3) B 세포에 대한, 및 CD4+, CD8+ 및/또는 자연 살해 세포에 의한 INFγ 생성에 대한 IL-10의 면역자극 특성이 그의 면역억제 특성을 상쇄시킴[Asadullah, K. et al., Pharmacol. Rev. 55, 241-269 (2003); Tilg, H. et al., Gut 50, 191-195 (2002); Lauw, F.N. et al., J. Immunol. 165, 2783-2789 (2000)].
IL-10은 신속한 신장 청소를 유도하는 약 37 kDa의 작은 크기로 인해 매우 짧은 혈장 반감기를 나타낸다. 사실상, 전신 구획에서 그의 반감기는 2.5 시간으로, 이것은 점막 생체이용률을 제한한다[Braat, H. et al., Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 725-731 (2003)]. 순환 시간, 노출, 효능을 개선시키고 신장 흡수를 감소시키기 위해, 여러 출판물이 상기 사이토카인의 PEG화(PEGylation)를 보고하고 있다[Mattos, A. et al., J. Control Release 162, 84-91 (2012); Mumm, J.B. et al., Cancer Cell 20(6), 781-796 (2011); Alvarez, H.M. et al., Drug Metab. Dispos. 40(2), 360-373 (2012)]. 그럼에도 불구하고, PEG화된 비-표적화 IL-10의 더 긴 전신 반감기는 상기 분자의 알려진 이상 반응을 악화시킬 수 있다.
재조합 인간 IL-10을 사용한 전신 치료가 충분히 효과적이지 않으며 사이토카인의 국소 전달에 초점이 맞춰져야 함이 명백해졌다. 상기 목표를 달성하기 위한 여러가지 방법이 있다: 1) 면역 세포의 IL-10 유전자 치료, 2) 유전자 변형된, 비-병원성 IL-10 발현 세균, 및 3) 상기 사이토카인을 표적화하고 염증이 생긴 조직에 사이토카인을 축적하기 위한 항체-IL-10 융합 단백질.
면역 세포의 IL-10 유전자 치료는 실험적 대장염에서 입증된 효과를 갖지만, 임상 시험은 비-치명적 질환에 대한 상기 접근방법의 안전성에 관한 우려로 인해 방해를 받는다[Braat, H. et al., Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 725-731 (2003)]. IL-10을 발현하는 유전자전이 세균(락토코커스 락티스(Lactococcus lactis))은 대안적인 전달 경로를 나타내며, 점막 구획내로의 국소 전달로 인해 전신 부작용을 배제하고 생물학적으로 함유될 것을 주장하는, 크론병에서 I상 시험의 결과가 발표되었다[Braat, H. et al., Gastroenterol. Hepatol. 4, 754-759 (2006); Steidler, L. et al., Science 289, 1352-1355 (2000)]. 중간정도로 활성인 궤양성 대장염을 갖는 환자에서 인간 IL-10을 분비하는 유전자 변형된 락토코커 스 락티스(AG011, 악토제니엑스(ActoGeniX))의 안전성, 내약성, 약력학 및 효능을 평가하기 위한 IIa상 무작위 위약-조절 이중-맹검 다기관 용량 증가 연구가 잘 허용되고 안전하였다. 그러나, 바론(Baron) 점수, 또는 위약에 비해 AG011을 투여받은 환자에서의 임상 증상으로 측정할 때, 점막 염증의 의미있는 개선은 없었다[Vermeire, S. et al., abstract 46 presented at the Digestive Disease Week Annual Meeting in New Orleans 02 May 2010].
면역사이토카인으로도 불리는 항체-사이토카인 융합 단백질은 약물 전달 및 약물 자체의 포맷의 측면에서 여러 이점을 제공한다. 사이토카인, 예를 들면, IL-10의 국소 전달은 적절한 질환 마커에 특이적인 항체 또는 그의 단편에 대한 융합에 의해 달성된다. 따라서, 전신 부작용이 감소될 수 있고, 염증 부위에서 화합물의 국소 축적 및 정체가 달성될 수 있다. 또한, 융합 포맷 및 사용된 항체 또는 항체 단편에 따라서, 혈장 반감기, 안정성 및 개발성과 같은 성질이 개선될 수 있다. 종양학에서 이미 확립된 접근방법이긴 하지만, 상기 방법은 염증 질환 및 자가면역을 치료하기 위해 바로 최근에 응용되었다. 여러 사이토카인(특히 IL-10) 및 광감작제가 피브로넥틴의 엑스트라 도메인(extra doamin) B에 특이적인 scFv 항체 단편에 대한 융합에 의해 건선 병변에 표적화되었다[Trachsel, E. et al., J. Invest. Dermatol. 127(4), 881-886 (2007)]. 또한, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 A에 특이적인 항체 단편(F8, 데카빌(DEKAVIL), 필로겐(Philogen) SpA)-IL-10 융합 단백질을 확립된 콜라겐-유도성 관절염의 진행을 억제하기 위해 임상전에 사용하고[Trachsel, E. et al., Arthritis Res. Ther. 9(1), R 9 (2007); Schwager, K. et al., Arthritis Res. Ther. 11(5), R142 (2009)], 임상 시험에 들어갔다. 최근에, 동일한 F8-IL-10 융합 단백질이 동질유전자(syngeneic) 마우스 모델에서 자궁내막 병변을 표적화하기 위해 사용되었으며, 식염수 대조군에 비해 평균 병변 크기를 감소시켰다[Schwager, K. et al., Hum. Reprod. 26(9), 2344-2352 (2011)].
본 발명의 IgG-IL-10 융합 단백질은, 개선된 생산성, 안정성, 혈청 반감기, 및 놀랍게도, 표적 항원에 결합시 상당히 증가된 생물 활성을 포함하여, 공지된 항체 단편-기반(예를 들면, scFv, 디아바디(diabody), Fab) IL-10 융합 단백질에 비해 여러 이점을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은 IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질로서, 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드 각각은 IgG-클래스 항체 중쇄 및 IL-10 단량체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 그의 N-말단에서, 선택적으로 펩티드 링커를 통해, 상기 IgG-클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드는 각각 필수적으로 IgG-클래스 항체 중쇄, IL-10 단량체 및 선택적으로 펩티드 링커로 이루어진다. 한 태양에서, 상기 경쇄 폴리펩티드 각각은 IgG-클래스 항체 경쇄를 포함한다. 한 태양에서, 상기 경쇄 폴리펩티드는 각각 필수적으로 IgG-클래스 항체 경쇄로 이루어진다.
일부 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 천연 IL-10 단량체, 특히 천연 인간 IL-10 단량체이다. 특정 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드에 포함된 상기 IL-10 단량체는 기능성 동종이량체성 IL-10 분자를 형성한다.
다른 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 변형된 IL-10 단량체, 특히 변형된 인간 IL-10 단량체이다. 한 태양에서, 상기 변형된 IL-10 단량체는 단량체 형태로 pH 7.0, 37 ℃에서 안정하다. 한 태양에서, 상기 변형된 IL-10 단량체는 천연 IL-10 단량체에 비해 pH 7.0, 37 ℃에서 개선된 안정성을 갖는다. 특정 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드에 포함되는 상기 IL-10 단량체는 서로와 동종이량체화되지 않는다.
한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 변형을 갖지 않는 상응하는 IgG-클래스 항체에 비해, Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 특히 인간 Fcγ 수용체이다. 한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체, 특히 활성화 Fcγ 수용체이다. 특정 태양에서, 상기 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)의 군에서 선택된다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 FcγIIIa, 특히 인간 FcγIIIa이다. 한 태양에서, 상기 변형은 IgG-클래스 항체의 작동인자 기능을 감소시킨다. 특정 태양에서, 상기 작동인자 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)이다. 한 태양에서, 상기 변형은 상기 IgG-클래스 항체의 Fc 영역, 특히 CH2 영역에 존재한다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄의 위치 329(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 P329G이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄의 위치 234 및 235(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 번호체계)를 포함한다.
한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 IgG1-서브클래스 항체이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 전장(full-length) 항체이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 인간 항체이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 단클론성 항체이다.
한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 섬유아세포 활성화 단백질(Fibroblast Activation Protein, FAP)에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 태양에서, 융합 단백질은, 25 ℃에서 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)으로 측정할 때, 1 nM 미만, 특히 100 pM 미만의 친화도 상수(KD) 하에 FAP에 결합할 수 있다. 한 태양에서, 상기 FAP는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스(cynomolgus) FAP이다. 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 중쇄 CDR(HCDR) 1, 서열번호 41의 HCDR 2, 서열번호 49의 HCDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR(LCDR) 1, 서열번호 57의 LCDR 2, 및 서열번호 61의 LCDR 3을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 63의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 65의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 또 다른 특별한 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 HCDR 1, 서열번호 43의 HCDR 2, 서열번호 47의 HCDR 3, 서열번호 51의 LCDR 1, 서열번호 55의 LCDR 2, 및 서열번호 59의 LCDR 3을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 67의 VH 및 서열번호 69의 VL을 포함한다.
한 태양에서, 융합 단백질은, 25 ℃에서 SPR로 측정할 때, 1 nM 미만, 특히 100 pM 미만의 친화도 상수(KD)하에 IL-10 수용체-1(IL-10R1)에 결합할 수 있다. 특정 태양에서, 상기 IL-10R1은 인간 IL-10R1이다. 한 태양에서, IL-10R1 결합에 대한 상기 친화도 상수(KD)는, 25 ℃에서 SPR로 측정할 때, FAP 결합에 대한 상기 친화도 상수(KD)와 대략 동일하거나 더 크다. 특정 태양에서, IL-10R1 결합에 대한 상기 KD는 FAP 결합에 대한 상기 KD의 약 절반보다 크다.
특정 태양에서, 본 발명은 IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 융합 단백질은 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함하고; (i) 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 중쇄 CDR(HCDR) 1, 서열번호 43의 HCDR 2, 서열번호 47의 HCDR 3, 서열번호 51의 경쇄 CDR(LCDR) 1, 서열번호 55의 LCDR 2, 및 서열번호 59의 LCDR 3을 포함하거나, 또는 서열번호 67의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 69의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; (ii) 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 번호체계)를 포함하고; (iii) 상기 IL-10 분자는 서열번호 1의 서열을 포함하며; (iv) 상기 중쇄 폴리펩티드는 각각 IgG-클래스 항체 중쇄, 및 그의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 상기 IgG-클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 IL-10 분자를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 융합 단백질은 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함하고; (i) 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 중쇄 CDR(HCDR) 1, 서열번호 41의 HCDR 2, 서열번호 49의 HCDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR(LCDR) 1, 서열번호 57의 LCDR 2, 및 서열번호 61의 LCDR 3을 포함하거나, 또는 서열번호 63의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 65의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; (ii) 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 번호체계)를 포함하고; (iii) 상기 IL-10 분자는 서열번호 1의 서열을 포함하며; (iv) 상기 중쇄 폴리펩티드는 각각 IgG-클래스 항체 중쇄, 및 그의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 상기 IgG-클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 IL-10 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터가 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, (i) 본 발명의 숙주 세포를 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, (ii) 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 또한, 상기 방법에 의해 생성된, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질이 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약제로 사용하기 위한, 및 염증 질환, 특히 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염, 가장 특히는 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질 또는 약학 조성물이 또한 제공된다. 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 융합 단백질의 용도, 및 약학적으로 허용되는 형태의 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 질환을 치료하는 방법도 또한 제공된다. 한 태양에서, 상기 질환은 염증 질환이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 염증 질환은 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염이다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 염증 질환은 염증성 장 질환이다. 한 태양에서, 상기 개체는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1은 다양한 항체-IL-10 융합 포맷을 도식적으로 나타낸 것이다. 패널 (A) 내지 (D)는 IgG 항체를 기반으로 하는 포맷을 나타내고, 패널 (E) 내지 (G)는 Fab 단편을 기반으로 하는 포맷을 나타낸다. (A) "IgG-IL-10", 각각의 IgG 중쇄(두 중쇄 상의 IL-10 분자는 동일한 IgG 분자 내에서 이량체화된다)의 C-말단에 융합된 하나의 IL-10 분자(야생형 인간 IL-10 사이토카인 서열)를 갖는 인간 IgG(예를 들면, 아미노산 치환 L234A L235A(LALA) P329G에 의해, 작동인자 기능을 배제하기 위해 조작된 Fc-영역 포함). 중쇄와 IL-10 사이의 연결인자(connector): 예를 들면, (G4S)4 20량체. (B) "IgG-단일쇄(sc) IL-10", IgG 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합된 단일쇄 IL-10 이량체(scIL-10)를 갖는 인간 IgG(작동인자 기능을 배제하기 위해 조작된 Fc-영역, 및 하나의 "놉(knob)" 중쇄 및 하나의 "홀(hole)" 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위한 상기 하나의 "놉" 중쇄 및 하나의 "홀" 중쇄의 조합 포함). 중쇄와 단일쇄 IL-10 사이의 연결인자: 예를 들면, (G4S)3 15량체. (C) "IgG-IL-10M1", IgG 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합된 조작된 단량체 IL-10 분자를 갖는 인간 IgG(작동인자 기능을 배제하기 위해 조작된 Fc-부분, 및 하나의 "놉" 중쇄 및 하나의 "홀" 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위한 상기 하나의 "놉" 중쇄 및 하나의 "홀" 중쇄의 조합 포함). 중쇄와 단량체 IL-10 사이의 연결인자: 예를 들면, (G4S)3 15량체. (D) "IgG-(IL-10M1)2", 각각의 IgG 중쇄(어느 한 중쇄 상의 단량체성 IL-10 분자는 이량체화되지 않는다)의 C-말단에 융합된 하나의 IL-10 단량체를 갖는 인간 IgG(작동인자 기능을 배제하기 위해 조작된 Fc-부분 포함). 중쇄와 IL-10 사이의 연결인자: 예를 들면, (G4S)3 15량체 링커. (E) "Fab-IL-10", Fab 중쇄의 C-말단에 융합된 하나의 IL-10 분자(야생형 인간 IL-10 사이토카인 서열)를 갖는 Fab 단편(2개의 상기 융합체는 IL-10 부분을 통한 이량체화에 의해 동종이량체성 활성 분자를 형성한다). 중쇄와 IL-10 사이의 연결인자: 예를 들면, (G4S)3 15량체. (F) "Fab-scIL-10-Fab", 단일쇄 IL-10 이량체에 의해 단속된(intermitted) 종렬(tandem) Fab 단편(즉, 2개의 IL-10 분자가, 예를 들면, (G4S)4 20량체 링커에 의해 연결되고, 첫번째 Fab 중쇄(HC1)의 C-말단과 두번째 Fab 중쇄(HC2)의 N-말단 사이에 삽입되어 HC1-IL-10-IL-10-HC2를 포함하는 단일 펩티드 쇄를 생성하였다). 2개의 경쇄(다른 구조물들에 사용된 것들과 동일할 수 있다)는 상기 2개 중쇄와 쌍을 이룬다. (G) "Fab-IL-10M1-Fab", 조작된 단량체 IL-10 분자에 의해 단속된 종렬 Fab 단편. 단량체 IL-10 부분은 제외하고, 상기 포맷은 (F)와 동일하다.
도 2는 FAP-표적화 4B9-기반 IgG-IL-10 구조물(서열번호 25 및 27 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원(R): 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel), 인비트로겐(Invitrogen), MOPS 런닝 완충액, 비-환원(NR): 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 런닝 완충액). M: 크기 마커. (D) 최종 생성물의 슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 99.8%.
도 3은 FAP-표적화 4G8-기반 IgG-scIL-10 구조물(서열번호 7, 11 및 13 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필(목적 생성물은 점선 사각형으로 나타냄). (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원(R): 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 런닝 완충액, 비-환원(NR): 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 런닝 완충액); 비-환원 겔 상의 추가의 하부 MW-밴드는 하나의 중쇄 및 경쇄로 이루어진 1/2-분자를 나타낼 수 있다. (D) 최종 생성물의 TSK겔 G3000 SW XL 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 80.6%.
도 4는 FAP-표적화 4G8-기반 IgG-IL-10M1 구조물(서열번호 7, 13 및 15 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원(R): 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 런닝 완충액, 비-환원(NR): 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 런닝 완충액). (D) 최종 생성물의 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 98.2%.
도 5는 FAP-표적화 4B9-기반 IgG-(IL-10M1)2 구조물(서열번호 25 및 29 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (C) 최종 생성물의 랩칩(LabChip) GX(칼리퍼(Caliper)) 분석. (D) 최종 생성물의 TSK겔 G3000 SW XL 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 100%.
도 6은 FAP-표적화 4B9-기반 Fab-IL-10 구조물(서열번호 25 및 31 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원(R): 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 런닝 완충액, 비-환원(NR): 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 런닝 완충액). (D) 최종 생성물의 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 92.9%
도 7은 FAP-표적화 4G8-기반 Fab-scIL-10-Fab 구조물(서열번호 7 및 21 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원(R): 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 런닝 완충액, 비-환원(NR): 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 런닝 완충액). (D) 최종 생성물의 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 100%.
도 8은 FAP-표적화 4G8-기반 Fab-IL-10M1-Fab 융합물(서열번호 7 및 23 참조)의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 정제 단계의 용출 프로필. (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원(R): 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 런닝 완충액, 비-환원(NR): 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 런닝 완충액). (D) 최종 생성물의 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 단량체 함량 100%.
도 9는 프로테온(ProteOn) XPR36 상에서의 SPR 분석 구성을 나타낸 것이다. (A) 아민 커플링에 의한 GLM 칩 상에 항-펜타 His IgG(포획제)의 공유성 고정화 후 FAP(리간드)의 포획 및 항-FAP 항체-IL-10 융합 구조물(분석물)의 후속 주입. (B) 뉴트라비딘-유도체화 센서 칩(NLC) 상에 비오틴화 인간 IL-10R1(리간드)의 고정화 후 항-FAP 항체-IL-10 융합 구조물(분석물)의 주입.
도 10은 상이한 항체-IL-10 융합 단백질에 의한, 단핵구에 의한 전-염증 사이토카인 생성의 억제를 나타낸 것이다. (A-C) 4G8 Fab-IL-10(서열번호 7 및 19 참조) 또는 4G8 IgG-IL-10(서열번호 7 및 9 참조)을 단핵구 전에 재조합 인간 FAP로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 고정화시키고, 자극제로서 100 ng/ml LPS를 24 시간동안 첨가하였다. 그 후에, 상등액중 IL-6(A), IL-1β(B) 및 TNFα(C)의 농도를 측정하였다(n=2). (D-F) 단핵구를 0 내지 200 nM 4G8 Fab-IL-10 또는 4G8 IgG-IL-10(용액으로) 및 자극제로서 100 ng/ml LPS와 함께 24 시간동안 배양하였다. 그 후에, 상등액중 IL-6(D), IL-1β(E) 및 TNFα(F)의 농도를 측정하였다(n=2).
도 11은 2명의 상이한 혈액 공여자를 이용하여 도 1에 나타낸 결과를 재현한 것이다. (A) 4G8 Fab-IL-10 또는 4G8 IgG-IL-10을 단핵구 전에 재조합 인간 FAP로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 고정화시키고, 자극제로서 100 ng/ml LPS를 24 시간동안 첨가하였다. 그 후에, 상등액중 IL-6(좌), IL-1β(중앙) 및 TNFα(우)의 농도를 측정하였다(각 줄은 혈액 공여자를 나타낸다). (B) 단핵구를 0 내지 200 nM 4G8 Fab-IL-10, 4G8 IgG-IL-10 또는 야생형 인간 IL-10(용액으로) 및 자극제로서 100 ng/ml LPS와 함께 24 시간동안 배양하였다. 이어서, 상등액중 IL-6(왼쪽), IL-1β(중앙) 및 TNFα(오른쪽)의 농도를 측정하였다(각 열은 혈액 공여자를 나타낸다).
도 12는 상이한 항체-IL-10 융합 단백질에 의한, 단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제를 나타낸 것이다. (A-C) 4G8 Fab-IL-10, 4G8 IgG-IL-10 또는 상응하는 비표적화 구조물을 단핵구 전에 재조합 인간 FAP로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 고정화시키고, 자극제로서 100 ng/ml LPS를 24 시간동안 첨가하였다. 이어서, 상등액중 IL-6의 농도를 측정하였다. (D-F) 단핵구를 0 내지 200 nM 4G8 Fab-IL-10, 4G8 IgG-IL-10, 상응하는 비표적화 구조물 또는 야생형 IL-10(용액으로) 및 자극제로서 100 ng/ml LPS와 함께 24 시간동안 배양하였다. 이어서, 상등액중 IL-6의 농도를 측정하였다.
도 13은 상이한 항체-IL-10 융합 단백질에 의한, 단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제를 나타낸 것이다. (A-D) 4G8 Fab-IL-10(아랫줄) 또는 4G8 IgG-IL-10(윗줄)을 단핵구 전에 상이한 농도의 재조합 인간 FAP로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 고정화시키고, 자극제로서 100 ng/ml LPS를 24 시간동안 첨가하였다. 이어서, 상등액중 IL-6의 농도를 측정하였다.
도 14는 상이한 항체-IL-10 융합 단백질에 의한, 단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제를 나타낸 것이다. 4G8 Fab-IL-10(B) 또는 4G8 IgG-IL-10(A)을 단핵구 전에 상이한 농도의 재조합 인간 FAP로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 고정화시키고, 자극제로서 100 ng/ml LPS를 24 시간동안 첨가하였다. 이어서, 상등액중 IL-6의 농도를 측정하였다. 도 13에서와 동일한 데이터가 플로팅되어 있으나, 다른 비교를 위한 것이다.
도 15는 상이한 항체-IL-10 융합 단백질에 의한, 단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제를 나타낸 것이다. (A) 4B9 Fab-IL-10(서열번호 25 및 31 참조) 또는 4B9 IgG-IL-10(서열번호 25 및 27 참조)을 단핵구 전에 재조합 인간 FAP로 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 고정화시키고, 자극제로서 100 ng/ml LPS를 24 시간동안 첨가하였다. 이어서, 상등액중 IL-6의 농도를 측정하였다. (B) 단핵구를 0 내지 200 nM의 4B9 Fab-IL-10 또는 4B9 IgG-IL-10 구조물(용액으로) 및 자극제로서 100 ng/ml LPS와 함께 24 시간동안 배양하였다. 이어서, 상등액중 IL-6의 농도를 측정하였다.
도 16은 Fab-IL-10 및 IgG-IL-10 포맷의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필을 비교한 것이다. 화살표는 목적하는 이량체 생성물을 나타내고, 응집물은 점선 원으로 나타내었고 단량체는 실선 원으로 나타내었다. Fab-IL-10 포맷과 대조적으로, IgG-IL-10 포맷은 그 중쇄의 다이설파이드-결합된 공유성 동종이량체화로 인해 단량체 또는 "반-단량체"를 유도하지 못한다.
정의
하기에서 달리 정의되지 않는 한, 용어들은 본원에서 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 사용된다.
세프라제(Seprase)(EC 3.4.21)로도 알려져 있는, FAP로 약칭되는 "섬유아세포 활성화 단백질"은, 달리 언급되지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하여, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FAP를 말한다. 상기 용어는 "전장", 미처리 FAP 뿐 아니라, 세포에서의 처리로부터 비롯된 임의 형태의 FAP를 포함한다. 상기 용어는 또한 FAP의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 한 태양에서, 본 발명의 항체는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP에 특이적으로 결합할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯(UniProt)(www.uniprot.org) 등록 번호 Q12884(버전 128), 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에 나와있다. 인간 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 760까지 이어진다. His-표지된 인간 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 81 및 82에 나타나 있다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P97321(버전 107) 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에 나와있다. 마우스 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 761까지 이어진다. 서열번호 83 및 84는 His-표지된 마우스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 서열번호 85 및 86은 His-표지된 사이노몰구스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다.
"인간 IL-10R1"은 유니프롯 등록번호 Q13651(버전 115)에 기재된 단백질, 특히 전체 서열의 아미노산 위치 22에서 아미노산 위치 235까지 이어지는 상기 단백질의 세포외 도메인을 의미한다. 서열번호 87 및 88은 인간 Fc 영역에 융합된 인간 IL-10R1 ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 항체 및 IL-10 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드 분자를 말하며, 이때 상기 융합 단백질의 성분들은 펩티드-결합에 의해, 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다. 명확하게 하기 위해, 융합 단백질의 항체 성분의 개개 펩티드 쇄는, 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 비-공유적으로 연결될 수 있다.
"융합된"은 펩티드 결합에 의해, 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 성분들을 말한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이며 원치않거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원에 결합하는 항체의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 또는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨)[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)], 및 전통적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정될 수 있다. 한 태양에서, 비관련 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들면, SPR로 측정할 때 항원에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 태양에서, 항원에 결합하는 항체는 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화도"는 또는 "결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들면, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 따라서, 등가의 친화도들은 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한, 상이한 속도 상수들을 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들어, Fc 수용체에 대해 감소된 결합은, 예를 들면, SPR로 측정할 때, 각각의 상호작용에 대한 친화도의 감소를 말한다. 명확하게 하기 위해, 상기 용어는 또한 영(0)(또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지의 친화도의 감소, 즉, 상호작용의 완전한 제거를 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체들을 포함하는 분자를 말한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우의 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구조물을 포함한다.
"항체 단편"은 비손상 항체가 결합하는 항원과 결합하는 비손상 항체의 일부를 포함하는 비손상 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예, scFv), 및 단일-도메인 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토는, 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토는, 예를 들면, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; 또한 WO 93/16185 호; 및 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458 호를 참조하시오. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서는 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조하시오. 디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, EP 404,097 호; WO 1993/01161 호; 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조). 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 매사추세츠 월탐; 예를 들면, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조). 항체 단편은, 본원에 기술된 바와 같은, 비손상 항체의 단백질분해성 절단, 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
용어 "전장 항체", "비손상 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 말한다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG-클래스 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 중쇄는, α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)으로 불리는 5가지 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 아형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fab 단편"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 말한다.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"IgG-클래스 항체"는 천연 면역글로불린 G(IgG) 분자의 구조를 갖는 항체를 말한다. IgG-클래스 항체의 항체 중쇄는 도메인 구조 VH-CH1-CH2-CH3을 갖는다. IgG-클래스 항체의 항체 경쇄는 도메인 구조 VL-CL을 갖는다. IgG-클래스 항체는 필수적으로 면역글로불린 힌지(hinge) 영역에 의해 연결된, 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인으로 이루어진다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. 대표적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재한다[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)]. 대표적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에 존재한다[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. VH중 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축된-CDR로 불리는 CDR 또는 a-CDR의 영역들 내에 함유된다. 대표적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)] 참조). 달리 언급되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인중의 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 카밧(Kabat) 등의 상기 문헌에 따라 번호가 붙여진다("카밧 번호체계"로 언급됨).
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리(repertory) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 명확하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 이루는 개개 항체들은, 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론성 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해하지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자전이 동물을 이용하는 방법을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단클론성 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 대표적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 대략 위치 231에서의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340에서의 아미노산 잔기까지 이어진다. 한 태양에서, 탄수화물 쇄는 CH2 도메인에 결합된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인까지 C-말단 잔기들의 연장부(즉, IgG의 대략적 위치 341에서의 아미노산 잔기로부터 대략적 위치 447에서의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들면, 그의 한 쇄에 도입된 "돌출부"("놉") 및 그의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동(cavity)"("홀")을 갖는 CH3 도메인; 특별히 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,821,333 호 참조)일 수 있다. 상기 변이체 CH3 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 2개의 비-동일 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 한 태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys 226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은, EU 인덱스(EU index)로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
용어 "작동인자 기능"은 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 작동인자 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 후속 결합이 작동인자 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 결과를 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)가 포함된다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa(유니프롯 등록번호 P08637(버전 141) 참조)이다.
"야생형 IL-10"으로도 지칭되는 "천연 IL-10"은, 예를 들면, 안정성과 같은 그 성질들 중 하나 이상을 변화시키기 위해 천연 IL-10으로부터 변형된 "변형된 IL-10"과 반대로, 천연 IL-10을 말한다. 변형된 IL-10 분자는, 예를 들면, 아미노산 서열에 변형, 예를 들면, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 단량체 형태로 증가된 안정성을 갖는 특정한 변형된 IL-10 분자는 문헌 [Josephson et al., J Biol Chem 275, 13552-13557 (2000)]에 기술되었다.
천연 IL-10은 2개의 α-나선형 단량체성 도메인으로 이루어진 동종이량체이다. 천연 인간 IL-10 단량체성 도메인의 서열은 서열번호 1에 나타나 있다. 따라서, "IL-10 단량체"는 천연 IL-10의 단량체 도메인과 실질적으로 유사한 서열 및/또는 구조를 갖는 단백질이다.
"안정한" 또는 "안정성"은 단백질에 관해 사용될 때, 단백질의 구조적 완전성(예를 들면, 그의 2차 구조)이 보존되는 것을 의미한다.
"기능성"은 단백질에 관하여 사용될 때, 단백질이 생물학적 기능, 특히 천연에서 존재하는 상응하는 단백질(예를 들면, 천연 IL-10)이 매개하는 생물학적 기능을 매개할 수 있는 것을 의미한다. IL-10의 경우, 생물학적 기능은 IL-10 수용체 신호전달의 활성화, TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, IL-2 및/또는 INFγ와 같은 전-염증 사이토카인의 분비 억제, MHC II 발현의 억제, 및 IL-10 수용체를 발현하는 세포(예를 들면, 단핵구)에서 CD80 및/또는 CD86과 같은 동시-자극 분자의 상향조절을 포함할 수 있다.
용어 "펩티드 링커"는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 말한다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기술되어 있다. 적합한 비-면역원성 링커 펩티드로는, 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커가 포함된다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.
"놉-인투-홀 변형(knob-into-hole modification)"은, CH3 도메인에서 2개의 항체 중쇄 사이 계면 내에서의 변형을 말하는 것으로, 이때 i) 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면내 공동("홀")에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면내에 돌출부("놉")을 생성하고, ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어, 첫번째 CH3 도메인의 계면내 돌출부("놉")이 위치할 수 있는 두번째 CH3 도메인의 계면내에 공동("홀")을 생성한다. 한 태양에서, "놉-인투-홀 변형"은 항체 중쇄들중 하나에 아미노산 치환 T366W 및 선택적으로 아미노산 치환 S354C, 및 항체 중쇄중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V 및 선택적으로 Y349C를 포함한다. 놉-인투-홀 기술은, 예를 들면, US 5,731,168 호; US 7,695,936 호; 문헌 [Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록, 제 1 폴리펩티드의 계면에 돌출부("놉") 및 제 2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)으로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제 2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 위치 S354 및 Y349 각각에 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 항체 중쇄 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여 이량체를 더 안정화시킨다[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)].
아미노산 "치환"은 폴리펩티드에서 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환을 말한다. 한 태양에서, 아미노산은 유사한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산, 예를 들면, 보존적 아미노산 치환으로 치환된다. "보존적" 아미노산 치환은 수반되는 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질을 기준으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함되고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 비-보존적 치환은 상기 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 또한 한 아미노산을 상이한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것, 예를 들면, 한 군(예를 들면, 극성)으로부터의 아미노산을 상이한 군(예를 들면, 염기성)으로부터의 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 야기할 수 있다. 아미노산 치환은 당해 분야에 공지된 유전자 또는 화학적 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 유전자 방법은 부위-지향 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 다른 방법, 예를 들면, 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변화시키는 방법도 또한 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에서 동일한 아미노산 치환을 나타내기 위해 다양한 표시가 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체 중쇄의 위치 329에서 프롤린으로부터 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로 나타낼 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 창시되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 대중적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 다음과 같이 산출된다:
100 x 분수 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드들의 중합체를 말하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분들에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성후에 이루어진 변형, 예를 들면, 표지에 대한 접합을 포함할 수 있다.
용어 "변형"은 펩티드 주쇄(예를 들면, 아미노산 서열)의 임의의 조작 또는 폴리펩티드의 번역후 변형(예를 들면, 글리코실화)을 발한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 결합되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작용가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
약제의 "효과량"은 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기하기 위해 필요한 양을 말한다.
약제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량에서 필요한 시간 기간동안 효과적인 양을 말한다. 약제의 치료 효과량은, 예를 들면, 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나 또는 방지한다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 개체 또는 대상은 인간이다.
용어 "약학 조성물"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 그런 형태이며, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 조성물내 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 그의 문자적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 태양에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
본 발명의 융합 단백질
본 발명은 생산성, 안정성, 결합 친화도 및 생물 활성과 같은 특히 유리한 성질들을 갖는 신규 항체-IL-10 융합 단백질을 제공한다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 융합 단백질은 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드 각각은 IgG-클래스 항체 중쇄 및 IL-10 단량체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 그의 N-말단에서, 선택적으로 펩티드 링커를 통해, 상기 IgG-클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드는 각각 필수적으로 IgG-클래스 항체 중쇄, IL-10 단량체 및 선택적으로 펩티드 링커로 이루어진다. 한 태양에서, 상기 경쇄 폴리펩티드 각각은 IgG-클래스 항체 경쇄를 포함한다. 한 태양에서, 상기 경쇄 폴리펩티드는 각각 필수적으로 IgG-클래스 항체 경쇄로 이루어진다. 항체 단편을 기반으로 하는 융합 단백질에 비해, IgG-클래스 항체의 존재는 본 발명의 융합 단백질에 연장된 혈청 반감기(FcRn에 대한 결합을 통한 재순환, 및 신장 여과를 위한 임계치보다 훨씬 높은 분자 크기로 인해)를 포함하여 유리한 약동학적 성질을 제공한다. IgG-클래스 항체의 존재는 또한, 예를 들면, 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 간단한 정제를 가능하게 한다. 놀랍게도, 본 발명의 IgG-기반 IgG-IL-10 융합 단백질을 Fab 단편을 기반으로 하는 상응하는 융합 단백질(Fab-IL-10)과 비교하는 실시예에서 나타나듯이, IgG-클래스 항체의 존재는 또한 그 표적 항원에 결합될 때 융합 단백질의 생물 활성을 개선시킨다. 동일한 중쇄(및 경쇄) 폴리펩티드의 사용은 융합 단백질의 단순한 생산을 가능하게 하여, 바람직하지 않은 부산물의 생성을 배제하고, 놉-인투-홀 변형과 같은 비-동일 중쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형의 필요를 방지한다.
일부 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 천연 IL-10 단량체, 특히 천연 인간 IL-10 단량체이다. 특정 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드에 포함된 상기 IL-10 단량체는 기능성 동종이량체 IL-10 분자를 형성한다. 상기 융합 단백질 포맷은 2개의 IL-10 단량체가 충분히 기능성인 생물학적으로 활성인 IL-10 이량체를 생성한다는 점에서 특히 유리하다. 또한, 항체 단편을 기반으로 하는 융합 단백질에 반해, 본 발명의 융합 단백질에서는 IL-10 단량체 사이에서 뿐 아니라 단량체가 융합되는 항체 중쇄 사이에서도 이량체화가 일어나지 않는다. 그러므로, 본 발명의 융합 단백질을 구성하는 IL-10 이량체의 2개 단량체로 분해되는 경향이, 예를 들면, 본원에 기술된 Fab-IL-10 융합 단백질에 비해 감소된다(도 16 참조). 중요하게, 상기 융합 단백질 포맷은 또한 생물 활성의 측면에서 본원에 기술된 다른 융합 단백질 포맷보다 우수하다.
다른 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 변형된 IL-10 단량체, 특히 변형된 인간 IL-10 단량체이다. 한 태양에서, 상기 변형된 IL-10 단량체는 단량체 형태로 pH 7.0, 37 ℃에서 안정하다. 한 태양에서, 상기 변형된 IL-10 단량체는 천연 IL-10 단량체에 비해 pH 7.0, 37 ℃에서 개선된 안정성을 갖는다. 적합한 변형된 IL-10 단량체는 문헌 [Josephson et al., J Biol Chem 275, 13552-13557 (2000)]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 또한 IL-10 단량체의 안정성을 측정하는 방법을 기술하고 있다. 특정 태양에서, 상기 IL-10 단량체는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 폴리펩티드에 포함되는 상기 IL-10 단량체는 서로와 동종이량체화되지 않는다. 상기 융합 단백질 포맷은 IL-10 이량체가 아니라 2개의 별개의 변형된 IL-10 단량체를 포함한다. 실시예에서 보여지듯이, 상기 융합 단백질 포맷은 IL-10 이량체를 포함하는 융합 단백질과 유사한, IL-10 수용체 1에 대한 결합 친화도(결합활성)를 갖는다. 또한, 상기 포맷은 높은 발현 수율 및 낮은 응집 경향하에 특히 적절히 생산가능하다.
한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 IgG1-서브클래스 항체이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 인간 항체이다, 즉, 상기 항체는 인간 가변 및 불변 영역들을 포함한다. 대표적인 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 서열은 각각 서열번호 79 및 80에 나타내었다. 한 태양에서, IgG-클래스 항체는 인간 Fc 영역, 특히 인간 IgG Fc 영역, 보다 특히 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 전장 항체이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 단클론성 항체이다.
IgG-클래스 항체의 Fc 도메인은 융합 단백질에, 표적 조직에서 양호한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 유리한 조직-혈액 분포비를 포함하여 유리한 약동학적 성질을 제공하는 반면, 상기 도메인은 동시에 바람직한 항원-함유 세포로가 아니라 Fc 수용체를 발현하는 세포로의 융합 단백질의 바람직하지 않은 표적화를 유도할 수 있다. 또한, Fc 수용체 신호전달 경로의 활성화는 (전-염증) 사이토카인 수용체의 활성화 및 전신 투여시 심각한 부작용을 야기하는 사이토카인 방출을 유도할 수 있다. 그러므로, 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 변형을 갖지 않는 상응하는 IgG-클래스 항체에 비해, Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 특히 인간 Fcγ 수용체이다. Fc 수용체에 대한 결합은, 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 비아코어 기기(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))와 같은 표준 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있으며, Fc 수용체는 예를 들어 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 태양을 하기에 기술한다. 한 태양에 따르면, Fc 수용체에 대한 결합 친화도는 CM5 칩상에 고정화된 리간드(Fc 수용체)를 사용하여 25 ℃에서 비아코어(BIACORE, 등록상표) T100 기계(GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE 헬쓰케어)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 재조합 리간드를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.5)를 사용하여 0.5 내지 30 ㎍/ml로 희석한 후 10 ㎕/분의 유량에서 주입하여 약 100 내지 5000 반응 단위(response unit, RU)의 커플링된 단백질을 수득한다. 리간드의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 항체의 3- 내지 5-배 연속 희석물(약 0.01 내지 300 nM의 범위)을 25 ℃에서 약 30 내지 50 ㎕/분의 유량으로 HBS-EP+(GE 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 서펙턴트(Surfactant) P20, pH 7.4)중에 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화(fitting)시킴으로써 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 산출된다(예를 들면, 문헌 [Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)] 참조). 또는, Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도는 FcγIIIa 수용체를 발현하는 NK 세포와 같이 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
한 태양에서, 변형은 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 태양에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 전형적으로, 동일한 아미노산 돌연변이가 2개의 항체 중쇄 각각에 존재한다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이가 하나보다 많이 존재하는 태양에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상 감소시킬 수 있다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는, 상기 변형을 갖지 않는 상응하는 IgG-클래스 항체에 비해, 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 태양에서, 상기 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcγRI(CD89)의 군에서 선택된다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 보다 특히 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa 수용체이다. 바람직하게, 상기 수용체들 각각에 대한 결합 친화도는 감소된다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 FcγIIIa, 특히 인간 FcγIIIa이다. 일부 태양에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도도 또한 감소된다. 한 태양에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 유지는, 항체가 FcRn에 대한 항체의 비변형된 형태의 결합 친화도의 약 70% 이상을 나타낼 때 달성된다. 본 발명의 융합 단백질에 포함된 IgG-클래스 항체는 상기 친화도의 약 80% 이상, 심지어 약 90% 이상을 나타낼 수 있다.
한 태양에서, Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 상기 변형은 Ig-클래스 항체의 Fc 영역, 특히 CH2 영역에 존재한다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄의 위치 329(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄의 위치 234 및 235(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄의 위치 329(EU 번호체계)에 아미노산 치환 및 항체 중쇄의 위치 228, 233, 234, 235, 297 및 331로부터 선택된 위치에 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 상기 추가의 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 항체 중쇄의 위치 P329, L234 및 L235(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(LALA P329G)를 포함한다. 아미노산 치환의 상기 조합은, 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/130831 호에 기술된 바와 같이, 인간 IgG-클래스 항체의 Fcγ 수용체 결합을 거의 특히 효과적으로 제거한다. PCT 공개공보 WO 2012/130831 호는 또한 상기 변형된 항체를 제조하는 방법, 및 Fc 수용체 결합 또는 작동인자 기능과 같은 그의 성질을 측정하는 방법을 기술하고 있다.
항체 중쇄에 변형을 포함하는 항체는 당해 분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조할 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들면, 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체 결합을 감소시키는 변형을 포함하는 항체는 일반적으로 상응하는 비변형 항체에 비해 감소된 작동인자 기능, 특히 감소된 ADCC를 갖는다. 따라서, 한 태양에서, Fc 수용체에 대한 IgG-클래스 항체의 결합 친화도를 감소시키는 상기 변형은 IgG-클래스 항체의 작동인자 기능을 감소시킨다. 특정 태양에서, 상기 작동인가 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)이다. 한 태양에서, ADCC는 상기 변형을 갖지 않는 상응하는 IgG-클래스 항체에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만으로 감소된다. 항체의 작동인자 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 예는 미국 특허 제 5,500,362 호; 문헌 [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986); and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호; 문헌 [Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다(예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석법(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석법(프로메가(Promega), 위스콘신 매디슨) 참조). 상기 분석에 유용한 작동인자 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌 [Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 일부 태양에서, 보체 성분, 특히 C1q에 대한 IgG-클래스 항체의 결합도 또한 감소된다. 따라서, 보체-의존성 세포독성(CDC)도 또한 감소될 수 있다. C1q 결합 분석은 항체가 C1q에 결합할 수 있으며 따라서 CDC 활성을 갖는지 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다(예를 들면, WO 2006/029879 호 및 WO 2005/100402 호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); and Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
상기에서 및 PCT 공개공보 WO 2012/130831 호에 기술된 IgG-클래스 항체 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 작동인자 기능을 갖는 항체는 또한 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국 특허 제 7,332,581 호)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
IgG4-서브클래스 항체는 IgG1 항체에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 작동인자 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 태양에서, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 상기 IgG-클래스 항체는 IgG4-서브클래스 항체, 특히 인간 IgG4-서브클래스 항체이다. 한 태양에서, 상기 IgG4-서브클래스 항체는 위치 S228에서 Fc 영역에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화도 및/또는 그의 작동인자 기능을 더 감소시키기 위해, 한 태양에서, 상기 IgG4-서브클래스 항체는 위치 L235에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 다른 태양에서, 상기 IgG4-서브클래스 항체는 위치 P329에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 IgG4-서브클래스 항체는 위치 S228, L235 및 P329에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 상기 변형된 IgG4-서브클래스 항체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/130831 호에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들면, 치료 용도로 특히 유용한 많은 성질들을 겸하여 갖는다.
한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있다. FAP는 본 발명의 융합 단백질을 사용한 염증 질환의 치료에 적합한 표적으로서 확인되었다. 특정 태양에서, 상기 융합 단백질은, 25 ℃에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정할 때, 1 nM 미만, 특히 100 pM 미만의 친화도 상수(KD) 하에 FAP에 결합할 수 있다. SPR에 의해 FAP에 대한 결합 친화도를 측정하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 한 태양에서, 융합 단백질의 친화도(KD)는 25 ℃에서 GLM 칩에 공유적으로 커플링된 항-His 항체에 의해 고정화된 His-표지된 FAP 항원을 사용하여 프로테온 XPR36 기기(바이오래드(Biorad))를 이용하여 SPR에 의해 측정된다. 대표적인 방법에서, 표적 단백질(FAP)은, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(sNHS)의 새로 제조된 혼합물을 사용하여 5 분동안 모든 채널을 동시에 활성화시키고, 이어서 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.5) 중의 15 ㎍/ml 항-펜타 His IgG를 180 초동안 주입함으로써, GLM 칩의 별도의 수직 채널 위로 30 ㎕/분에서 높은 수준(약 5,000 RU까지)으로 고정화된, 공유적으로 고정화된 항-펜타 His IgG(키아겐(Qiagen) #34660, 마우스 단클론성 항체)에 의해 그의 H6-표지를 통해 포획된다. 채널들은 에탄올아민의 5-분 주입을 이용하여 차단된다. His6-표지된 FAP는 30 ㎕/분에서 60 초동안 수직 채널을 따라 런닝 완충액 중의 5 ㎍/ml 희석물로부터 포획되어 약 250 내지 600 RU의 리간드 밀도를 달성한다. 단일-시도(one-shot) 동적 분석 구성(OSK)에서, 융합 단백질은 100 ㎕/분으로 50 내지 0.08 nM 범위의 5-배 연속 희석물로 수평 채널을 따라 분석물로서 주입된다. 결합상은 180 초동안 기록되고 해리상은 600 초동안 기록된다. 매우 느린 오프-속도(off-rate)를 나타내는 상호작용의 경우, 오프-속도의 기록은 복합체의 해리를 관찰하기 위해 1800 초까지 연장된다. 런닝 완충액(PBST)은 참조를 위한 "인-라인(in-line)" 블랭크를 제공하도록 6번째 채널을 따라 주입된다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어 결합 모델(프로테온 매니저 소프트웨어 버전 2.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 산출된다.
한 태양에서, 상기 FAP는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP이다. 바람직하게, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 IgG-클래스 항체는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 및/또는 마우스 FAP에 대해 교차-반응성이며, 이것은, 예를 들면, 인간에 사용하기에 앞서 사이노몰구스 원숭이 및/또는 마우스에서의 생체내 연구를 가능하게 한다.
특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 중쇄 CDR(HCDR) 1, 서열번호 41의 HCDR 2, 서열번호 49의 HCDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR(LCDR) 1, 서열번호 57의 LCDR 2, 및 서열번호 61의 LCDR 3을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 63의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 65의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 또 다른 특별한 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 HCDR 1, 서열번호 43의 HCDR 2, 서열번호 47의 HCDR 3, 서열번호 51의 LCDR 1, 서열번호 55의 LCDR 2, 및 서열번호 59의 LCDR 3을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 67의 VH 및 서열번호 69의 VL을 포함한다. 실시예에서 보여지듯이, 상기 항체들은 인간, 마우스뿐 아니라 사이노몰구스 FAP에 대해 특히 강한 결합 친화도/결합활성을 나타낸다.
다른 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 39의 HCDR 1, 서열번호 45의 HCDR 2, 서열번호 49의 HCDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR(LCDR) 1, 서열번호 57의 LCDR 2, 및 서열번호 61의 LCDR 3을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 71의 VH 및 서열번호 73의 VL을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 37의 HCDR 1, 서열번호 41의 HCDR 2, 서열번호 47의 HCDR 3, 서열번호 51의 LCDR 1, 서열번호 55의 LCDR 2, 및 서열번호 59의 LCDR 3을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 IgG-클래스 항체는 서열번호 75의 VH 및 서열번호 77의 VL을 포함한다.
한 태양에서, 융합 단백질은, 25 ℃에서 SPR에 의해 측정할 때, 1 nM 미만, 특히 100 pM 미만의 친화도 상수(KD) 하에 IL-10 수용체-1(IL-10R1)에 결합할 수 있다. SPR에 의해 IL-10R1에 대한 결합 친화도를 측정하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 한 태양에서, 융합 단백질의 친화도(KD)는 25 ℃에서 뉴트라비딘 포획에 의해 NLC 칩상에 고정화된 비오틴화 IL-10R1을 사용하여 프로테온 XPR36 기기(바이오래드)를 이용하여 SPR에 의해 측정된다. 대표적인 방법에서, 400 내지 1600 RU의 IL-10R1이 다양한 접촉시간동안 10 ㎍/ml의 농도 및 30 ㎕/초의 유량에서 수직 채널을 따라 뉴트라비딘-유도체화된 칩 상에 포획된다. 비오틴화 IL10R1에 대한 결합은 6개의 상이한 분석물 농도(50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0 nM)에서 100 ㎕/분에서 수평 방향으로의 주입에 의해 측정하여, 180 초동안 결합 속도를, 600 초동안 해리 속도를 기록한다. 런닝 완충액(PBST)은 참조를 위한 "인-라인(in-line)" 블랭크를 제공하도록 6번째 채널을 따라 주입된다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어 결합 모델(프로테온 매니저 소프트웨어 버전 2.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 산출된다.
특정 태양에서, 상기 IL-10R1은 인간 IL-10R1이다. 한 태양에서, IL-10R1에 대한 결합에 대한 상기 친화도 상수(KD)는, 25 ℃에서 SPR로 측정할 때, FAP에 대한 결합에 대한 상기 친화도 상수(KD)와 대략 동일하거나 더 크다. 특정 태양에서, IL-10R1에 대한 결합에 대한 상기 KD는 FAP에 대한 결합에 대한 상기 KD의 약 절반보다 크다. FAP 및 IL-10R1에 대한 결합에 대한 본 발명의 융합 단백질의 KD 값의 특정 비는 이들을 FAP-발현 조직으로 IL-10을 효과적으로 표적화시키는데 특히 적합하게 한다. 이론에 결부시키고자 하는 것이 아니라, 본 발명의 융합 단백질은, IL-10R1에 대한 결합 친화도와 적어도 동등하게 높은 FAP에 대한 결합 친화도로 인해, FAP-발현 표적 조직에 도달하기 전에 표적 조직 외부의(예를 들면, 순환시) IL-10R1-발현 세포에 결합할 가능성이 더 적다.
특정 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있고, 변형을 갖지 않는 상응하는 인간 IgG1-서브클래스 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함하는 인간 IgG1-서브클래스 항체와, IL-10 분자의 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 융합 단백질은, 각각 N-말단에서 인간 IgG1-서브클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 천연 IL-10 단량체를 포함하는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 2개의 동일한 경쇄를 포함한다.
특정 태양에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 9의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 서열번호 7의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 27의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 서열번호 25의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있고, 변형을 갖지 않는 상응하는 인간 IgG1-서브클래스 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함하는 인간 IgG1-서브클래스 항체와, IL-10 분자의 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 융합 단백질은, 각각 N-말단에서 인간 IgG1-서브클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 변형된 IL-10 단량체를 포함하는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 2개의 동일한 경쇄를 포함한다.
특정 태양에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 17의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 서열번호 7의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 29의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 폴리펩티드, 및 서열번호 25의 폴리펩티드에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 융합물 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하여, 서열번호 2, 6, 8, 10, 18, 26, 28, 30, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 89에 나타낸 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 것들을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 융합 단백질을 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 동시-발현되는 다중(예를 들면, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 기능성 융합 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들면, 항체의 경쇄 부분은 항체의 중쇄 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 동시-발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합되어 항체를 형성할 것이다.
한 태양에서, 본 발명은 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 또는 77에 나타낸 바와 같은 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 7, 9, 17, 25, 27 또는 29에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 서열번호 2, 6, 8, 10, 18, 26, 28, 30, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 또는 89에 나타낸 핵산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 2, 6, 8, 10, 18, 26, 28, 30, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 또는 89에 나타낸 핵산 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 또는 77의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 7, 9, 17, 25, 27 또는 29의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 또는 77의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명은 또한, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 7, 9, 17, 25, 27 또는 29의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 태양에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 융합 단백질은, 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 상기 융합 단백질(단편)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 분리되고 서열화될 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 융합 단백질(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다(예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel at al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기술 참조). 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, 융합 단백질(단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)이 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작용가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 인접(flanking) 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조물에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구조물들에, 예를 들면, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 또는 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 번역후 또는 번역과 동시에(post- or co-translationally) 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 융합 단백질(단편) 또는 그의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 제한하지 않고 분화된(specialized) 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작용가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들면, 폴리펩티드 암호화 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작용가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작용가능하게 결합되는 것이다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 작동인자, 억제인자 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작용가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(예, 인트론-A와 함께, 즉시 조기발현(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(예, 조기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 단편(이로 한정되지는 않는다)이 포함된다. 다른 전사 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 a-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서, 및 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR), 또는 아데노-결합 바이러스(AAV)의 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징들을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합될 수 있다. 예를 들면, 융합물의 분비를 목적하는 경우, 신호서열을 암호화하는 DNA는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되면 성숙 단백질로부터 분리되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드는 번역된 폴리펩티드로부터 분리되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지할 것이다. 특정 태양에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작용가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 또는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다. 예시적인 분비 신호 펩티드의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 35 및 36에 나타내었다.
후속의 정제를 촉진하거나 또는 융합 단백질의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA(예를 들면, 히스티딘 표지)가 융합 단백질 (단편) 암호화 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그의 말단에 포함될 수 있다.
다른 태양에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 태양에서, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 상기 태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질(의 일부)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 말한다. 융합 단백질을 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 적절하게 형질감염 또는 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 융합 단백질을 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 분리될 수 있으며, 더 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균류 및 효모 균주를 포함하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004); and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조). (글리코실화) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, (유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 등록상표) 기술을 설명하고 있는) 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 호 참조). 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주가 포함된다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오. 숙주 세포로는 배양 세포, 몇가지만 예를 들면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 한 태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프종 세포(예, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 둘 다 갖는 항체이도록 항체 쇄 중 나머지 쇄를 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 태양에서, 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 융합 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 융합 단백질의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 융합 단백질에서, 성분들(IgG-클래스 항체 및 IL-10 분자)은 유전자에 의해 서로에 융합된다. 융합 단백질은, 그 성분들이 서로에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있으며, 효능에 대해 검사될 수 있다. 바람직한 경우, 융합 단백질의 개개 성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 혼입시키기 위해 추가의 서열, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열도 또한 포함될 수 있다.
특정 태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 적어도 FAP와 같은 항원에 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 그의 단편의 일부를 형성할 수 있고, 이로부터 유도될 수 있다. 다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] 참조). 비-천연 항체는 고상-펩티드 합성을 이용하여 구성될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들면, 미국 특허 제 4,186,567 호에 기술된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 검색함으로써(예를 들면, 맥카퍼티(McCafferty)의 미국 특허 제 5,969,108 호 참조) 수득될 수 있다.
임의의 동물 종의 항체를 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 비-제한적 항체는 뮤린, 영장류 또는 인간 기원을 가질 수 있다. 항체가 인간에 사용하기 위한 것인 경우, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유도된 항체의 키메라 형태를 사용할 수 있다. 항체의 인간화 또는 완전 인간 형태는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,565,332 호 참조). 인간화는, (a) 비-인간(예, 공여자 항체) CDR의 인간(예, 수용자 항체) 프레임워크, 및 핵심(critical) 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 갖거나 갖지 않는 불변 영역 상으로의 그라프팅, (b) 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)의 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 그라프팅, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 구획으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 다음 문헌들에 더 기술되어 있다: 문헌 [Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409 호; 문헌 [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)(SDR(a-CDR) 그라프팅을 기술하고 있음); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)("표면처리(resurfacing)"를 기술하고 있음); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)("FR 셔플링"을 기술하고 있음); and Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)]. 본 발명에 따른 특정 항체는 인간 항체이다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-374 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기술되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론성 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 이로부터 유도될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 자극에 반응하여 비손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 비손상 항체를 생성하도록 변형된 유전자전이 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 분리시킴으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and MaCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 파지 디스플레이에 의한 항체의 제조에 대한 상세한 설명은 본원에 전체로 참고로 인용된 WO 2012/020006 호에 첨부된 실시예에서 찾을 수 있다.
특정 태양에서, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 항체는, 예를 들면, 본원에 그 전체가 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/020006 호(친화도 증진(affinity maturation)에 관한 실시예 참조) 또는 미국 특허출원 공개공보 제 2004/0132066 호에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 항체의 능력은, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)] 및 전통적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석법을 이용하여, 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 예를 들면, FAP에 대한 결합에 대해 L4G8 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 태양에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프(예, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris, "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Human Press, Totowa, NJ) (1996)]에 제공되어 있다. 예시적인 경쟁 분석법에서는, 항원에 결합하는 제 1 표지화 항체(예, 4G8 항체) 및 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제 2의 비표지화 항체를 포함하는 용액중에서 고정화된 항원(예, FAP)을 배양한다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상등액중에 존재할 수 있다. 대조군으로, 제 1 표지화 항체는 포함하지만 제 2 비표지화 항체는 포함하지 않는 용액중에서 고정화 항체를 배양한다. 제 1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과잉 미결합 항체를 제거하고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화 항원과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제 2 항체가 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 것을 시사한다(문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
본원에 기술된 바와 같이 제조된 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하(net charge), 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 융합 단백질을 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 기본적으로 실시예에 기술된 바와 같이 융합 단백질을 분리할 수 있다. 융합 단백질의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이 발현된 융합 단백질은, 환원 빛 비-환원 SDS-PAGE에 의해 입증되듯이 비손상되고 적절히 구성된 것으로 나타났다(예를 들면, 도 2, 5 참조).
조성물, 제형 및 투여 경로
다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 태양에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 예를 들면, 하기 기술하는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또한, (a) 본 발명에 따른 융합 단백질을 수득하고, (b) 상기 융합 단백질을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화시킴으로써 융합 단백질의 제제가 생체내 투여를 위해 제형화되는 것을 포함하는, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 분산된 하나 이상의 융합 단백질을 치료 효과량 포함한다. "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉, 예를 들면, 인간과 같은 동물에 적절하게 투여될 때, 해롭거나, 알레르기성이거나 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 하나 이상의 융합 단백질 및 선택적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예, 인간) 투여의 경우, 제제들은 생물 표준에 대한 FDA 사무국(FDA Office of Biological Standards) 또는 다른 국가에서 상응하는 기관에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 함을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 임의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 방부제, 산화방지제, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 상기 유사 물질 및 그의 조합들을 포함한다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에 상기 활성성분의 사용이 고려된다.
조성물은, 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균되어야 하는지 여부에 따라서 다양한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질(및 임의의 추가 치료제)는 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 늑막내, 기관지내, 비강내, 안내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막하, 소포내, 점막에, 심막내, 제대내, 안구내, 경구적으로, 국부적으로, 국소적으로, 흡입(예, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포의 직접적 국소 관류욕, 카테터를 통해, 세척에 의해, 크림으로, 지질 조성물(예, 리포솜)로, 또는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 상기 경로들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)] 참조). 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 본 발명의 융합 단백질과 같은 폴리펩티드 분자를 투여하기 위해 가장 일반적으로 사용된다.
비경구 조성물로는 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 기관지내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 융합 단백질은 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예를 들어, 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 융합 단백질은 사용전에, 적당한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원-비함유수로 조성되기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 융합 단백질을, 필요에 따라, 하기에 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균성은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주사전에 충분한 식염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능케 하는 약제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절하게 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들면, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어, 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세리드 또는 리포솜이 포함된다.
활성 성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 거대유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 특정 태양에서, 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물중에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 그의 조합을 사용하여 이루어질 수 있다.
전술한 조성물 이외에, 융합 단백질은 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 상기 지효성(long acting) 제형은 주입(예를 들면, 피하 또는 근육내에)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 융합 단백질은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일중 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은, 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
융합 단백질은 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 중에 배합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들로는 산 부가염, 예를 들면, 단백성 조성물의 유리 아미노기에 의해 생성된 염, 또는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산에 의해 생성된 염이 포함된다. 유리 카복실기에 의해 생성된 염도 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 치료 방법에 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 융합 단백질은 우수한 의료 관행에 따른 방식으로 제형화되고 조제되고 투여된다. 이와 관련하여 고려될 요인으로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지되어 있는 기타 요인들이 포함된다.
한 양태에서, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 제공된다. 다른 양태에서, 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 제공된다. 특정 태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질이 제공된다. 한 태양에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 제공한다. 특정 태양에서, 본 발명은, 개체에게 치료 효과량의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 융합 단백질을 제공한다. 특정 태양에서, 치료될 질환은 염증 질환이다. 대표적인 염증 질환으로는 염증성 장 질환(예를 들면, 크론병 또는 궤양성 대장염)이 포함된다. 특정 태양에서, 상기 질환은 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염, 특히 염증성 장 질환, 보다 특히는 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 특정 태양에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 염증 질환인 경우 소염제를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 태양들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 제조하는데 있어서 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 한 태양에서, 상기 약제는 질환을 갖는 개체에게 치료 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 태양에서, 치료될 질환은 염증 질환이다. 특정 태양에서, 상기 질환은 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염, 특히 염증성 장 질환, 보다 특히는 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 한 태양에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 염증 질환인 경우 소염제를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 태양들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료 효과량의 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 태양에서, 본 발명의 융합 단백질을 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 태양에서, 치료될 질환은 염증 질환이다. 특정 태양에서, 상기 질환은 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염, 특히 염증성 장 질환, 보다 특히는 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 특정 태양에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 염증 질환인 경우 소염제를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 태양들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 융합 단백질은 또한 진단 시약으로도 유용하다. 항원 결정인자에 대한 융합 단백질의 결합은, 예를 들면, 융합 단백질에 결합된 표지에 의해, 또는 본 발명의 융합 단백질에 특이적인 표지화된 2차 항체를 사용하여 용이하게 검출될 수 있다.
일부 태양에서, 효과량의 본 발명의 융합 단백질을 세포에 투여한다. 다른 태양에서, 치료 효과량의 본 발명의 융합 단백질을 질환 치료를 위해 개체에게 투여한다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 융합 단백질의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 융합 단백질의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 병행 치료 개입, 환자의 병력 및 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 책임지는 의사는 아무튼 조성물 중 활성 성분의 농도 및 개개 대상에 적절한 용량을 결정할 것이다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
융합 단백질은 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예, 0.1 내지 10 mg/kg)의 융합 단백질이, 예를 들면, 하나 이상의 별개 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 한 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 융합 단백질의 한 대표적인 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 다른 비-제한 예로서, 용량은 또한 투여당, 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중, 약 1000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 비-제한 예로, 전술한 숫자에 준하여, 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 융합 단백질을 투여받도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 하나 이상의 저용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 융합 단백질은 일반적으로 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용된다. 질환 상태를 치료 또는 예방하기 위한 용도로, 본 발명의 융합 단백질, 또는 그의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 당해 분야에 숙련된 자의 능력에 속한다.
전신 투여의 경우, 치료 효과적인 용량은 초기에 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석으로부터 평가될 수 있다. 이어서, 세포 배양물에서 측정할 때 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 용량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 상기 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 평가될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 융합 단백질의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들면, HPLC로 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 융합 단백질의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수도 있다. 당해 분야에 기술을 가진 자는 과도한 실험없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 융합 단백질의 치료 효과적 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(한 개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(한 개체군의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수로서, 비 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 융합 단백질이 바람직하다. 한 태양에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 수득된 데이터를 인간에 사용하기에 적합한 범위의 투여량을 제형화하는데 사용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 든다. 상기 투여량은 다양한 요인들, 예를 들면, 사용되는 투여 형태, 사용되는 투여 경로, 대상의 상태 등에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개개 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 문헌 [Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 융합 단백질로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능부전 등으로 인해 투여를 어떻게 및 언제 종료하거나, 중단하거나 또는 조정할지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해하는 독성), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알 것이다. 해당 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료될 상태의 중증도에 따라, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상태의 중증도는, 예를 들면, 부분적으로 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 빈도도 또한 개개 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 약제 및 치료
본 발명의 융합 단백질은 치료에서 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 약제를 포함한다. 상기 추가의 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분들을 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 추가의 치료제는 소염제이다.
상기 다른 약제들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다. 상기 다른 약제들의 효과량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의한 기타 요인들에 따라 달라진다. 융합 단백질은 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 측정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급한 상기 병용 치료는 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별개의 조성물에 포함되는 경우) 및 별도의 투여를 포함하며, 별도의 투여의 경우, 본 발명의 융합 단백질의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 그에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입 입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 융합 단백질이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 태양에서의 제품은 또한 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 또한 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 태양들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다. DNA 서열은 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 문헌 [Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
유전자 합성
목적하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성하거나 또는 자동 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 제네아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르크)에서 합성하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 인접한 유전자 절편을 표준 클로닝/서열화 벡터 내에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터내에 서브클로닝시키기 위해 적당한 제한효소 부위를 갖는 유전자 절편을 설계하였다. 모든 구조물은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드(MGWSCIILFLVATATGVHS)를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계되었다.
항체- IL -10 융합 구조물의 클로닝
중쇄 및 경쇄 V-도메인의 증폭된 DNA 단편을 프레임으로(in frame) 인간 IgG1 또는 Fab 불변 중쇄 또는 인간 불변 경쇄 함유 수용 포유동물 발현 벡터 각각에 삽입시켰다. 중쇄 및 경쇄는 항상 별개의 플라스미드 상에서 암호화되었다. 경쇄를 암호화하는 플라스미드는 IgG-기반 및 Fab-기반 IL-10 융합 구조물에 동일한 반면, Fab-기반 구조물에 대한 중쇄를 암호화하는 플라스미드는, 포맷에 따라서, 각각의 IL-10 부분과 함께 1 또는 2개의 VH-CH1 도메인을 함유한다. Fab 중쇄 플라스미드가 2개의 VH-CH1 도메인(단일쇄 IL-10 이량체에 의해 또는 조작된 단량체 IL-10에 의해 단속된 종렬 Fab[Josephson et al., J Biol Chem 275, 13552-13557 (2000)])을 함유하는 경우, 상기 2개의 V-도메인은 이들 각각에 대한 제한효소 부위의 상이한 조합을 이용하여 2-단계 클로닝 절차로 삽입되어야 했다. 상기 구조물들의 IL-10 부분은 항상 Fab 또는 IgG 중쇄의 C-말단과 사이토카인의 N-말단 각각의 사이에 (G4S)3 15량체 링커를 사용하여 상기 항체들의 중쇄를 갖는 프레임으로 클로닝되었다. IgG-IL-10 포맷(도 1A)만이 IgG 중쇄의 C-말단과 사이토카인의 N-말단 사이에 (G4S)4 20량체 링커를 포함한다. IgG 중쇄의 C-말단 라이신 잔기는 연결인자의 부가시에 제거되었다. 단일쇄 IL-10의 경우, (G4S)4 20량체 링커가 2개의 IL-10 쇄 사이에 삽입되었다. IL-10에 융합된 이들 중 1개만을 갖는 2개의 상이한 IgG 중쇄의 경우, IgG CH3 도메인에서의 놉-인투-홀 변형에 의해 촉진된 이종이량체화를 위해 2개의 중쇄 플라스미드를 구성하고 형질감염시켜야 했다. IL-10 부분에 연결된 "홀" 중쇄는 CH3 도메인에 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 반면, 비융합 "놉" 중쇄는 CH3 도메인에 S354C 및 T366W 돌연변이를 함유하였다(EU 번호체계). FcγR 결합/작동인자 기능을 파괴하고 FcR 동시-활성화를 방지하기 위해, 하기의 돌연변이를 IgG 중쇄의 각각의 CH2 도메인내에 도입시켰다: L234A, L235A 및 P329G(EU 번호체계). 항체-IL-10 융합 구조물의 발현은 MPSV 프로모터에 의해 유도되었으며, 전사는 CDS의 하류에 위치한 합성 폴리A 신호 서열에 의해 종료되었다. 발현 카세트 이외에, 각각의 벡터는 EBV-EBNA 발현 세포주에서의 자율 복제를 위한 EBV oriP 서열을 함유하였다.
항체- IL -10 융합 단백질의 제조
FAP에 대해 유도된 항원 결합 잔기의 생성, 친화도 증진 및 특성화에 대한 세부사항은 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2012/020006 호에 첨부된 실시예(특히 실시예 2 내지 6(제조) 및 7 내지 13(특성화))에서 찾을 수 있다. 상기 공개공보에 기술된 바와 같이, 하기 실시예에 사용된 4G8 및 4B9로 지칭된 것들을 포함하여, FAP에 대해 유도된 다양한 항원 결합 도메인이 파지 디스플레이에 의해 제작되었다.
실시예에서 사용된 바와 같은 항체 IL-10 융합 구조물은 지수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 칼슘 포스페이트-형질감염을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시킴으로써 제조하였다. 또는, 현탁액중에 성장하는 HEK293 EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 발현 벡터로 형질감염시켰다. 클론 4G8 및 4B9를 기반으로 하는 모든 FAP-표적화 항체-IL-10 융합 구조물은 단백질 A 매트릭스를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
간략하게, IL-10, 단일쇄(sc) IL-10 또는 IL-10M1에 융합된 FAP-표적화 구조물은 한 단계의 친화성 크로마토그래피(단백질 A)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200, GE 헬쓰케어)로 이루어진 방법에 의해 정제하였다. 단백질 A 컬럼을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 (pH 7.5)에서 평형화시키고, 상등액을 부하하고, 컬럼을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트(선택적으로 500 mM 염화나트륨 함유 또는 비함유)(pH 7.5)으로 세척한 후, FBS가 상등액에 존재하는 경우 13.3 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 500 mM 염화나트륨(pH 5.45)으로 세척하였다. 10 mM MES, 50 mM 염화나트륨(pH 5)에 의한 3번째 세척은 선택적으로 수행하였다. 융합 구조물을 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 3)으로 용출시켰다. 용출된 분획들을 취합하고, 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 6.7) 또는 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)인 최종 배합 완충액중에서 크기 배제 크로마토그래피로 마무리처리하였다.
정제된 항체-IL-10 융합 구조물의 단백질 농도는, 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 결정하였다. 융합 구조물의 순도, 보전성 및 단량체 상태는 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE로 분석하였으며, 쿠마시 블루(Coomassie blue)(심플블루(SimpleBlue, 등록상표) 세이프스테인(SafeStain), 인비트로겐)로 염색하였다. 뉴페이지(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다(4 내지 20% 트리스-글리신 겔 또는 3 내지 12% 비스-트리스). 또는, 환원 및 비-환원 항체-IL-10 융합 구조물은 랩칩 GX(칼리퍼)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 분석하였다. 면역접합체 샘플의 응집체 함량은 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3(pH 7.3) 런닝 완충액을 사용하여 슈퍼덱스 200 10/300GL 분석용 크기-배제 컬럼(GE 헬쓰케어)을 이용하여, 또는 25 ℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM 아르기닌, 0.02% NaN3(pH 6.7) 런닝 완충액 중에서 TSK겔 G3000 SW XL 컬럼을 이용하여 분석하였다.
정제 및 상이한 구조물에 대한 후속 분석의 결과는 도 2 내지 8에 나타내었다. IgG-IL-10 구조물은 다른 IL-10 융합 포맷에 비해 여러 생산 이점을 나타내었다. 첫째, Fab-IL-10 포맷에 비해, IL-10 동종이량체는 동일한 항체 분자내에 고정된다. 결과적으로, 생산시에, 친화성 크로마토그래피후 단량체 및 이량체 단백질 종이 관찰된 Fab-IL-10 포맷의 경우(이량체만이 목적하는 활성 생성물임)에 보여지는 바와 같은 단량체 IL-10 분자가 발생하지 않을 수 있다(도 2B와 도 6B 비교). 둘째, 놉-인투-홀 변형을 포함하는 이종이량체 IgG-기반 포맷(예를 들면, IgG-scIL-10 및 IgG-IL-10M1)과 대조적으로, IgG-IL-10 구조물은 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 이것은 홀-홀 또는 놉-놉 동종이량체와 같은 바람직하지 않은 부산물을 배제한다.
SPR 에 의한 친화도-측정
3가지 상이한 종(인간, 뮤린 및 사이노몰구스)으로부터의 FAP, 및 인간 IL-10R1에 대한 항체-IL-10 융합 구조물의 반응 속도 상수(kon 및 koff) 및 친화도(KD)는 25 ℃에서 PBST 런닝 완충액(10 mM 포스페이트, 150 mM 염화나트륨(pH 7.4), 0.005% 트윈 20)을 사용하여 프로테온 XPR36(바이오래드) 기기를 이용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. FAP에 대한 친화도를 측정하기 위해, 표적 단백질을 공유적으로 고정화된 항-H6 항체에 의해 그의 H6-표지를 통해 포획하였다(도 9A). 간략하게, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(sNHS)의 새로 제조된 혼합물을 사용하여 5 분동안 모든 채널을 동시에 활성화시키고, 이어서 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.5) 중의 15 ㎍/ml 항-펜타 His IgG를 180 초동안 주입함으로써 GLM 칩의 별개의 수직 채널들 위로 30 ㎕/분에서 높은 수준(약 5,000 RU까지)으로 항-펜타 His IgG(키아겐 #34660, 마우스 단클론성 항체)를 고정화시켰다. 채널들은 에탄올아민의 5-분 주입을 이용하여 차단하였다. 상이한 종들로부터의 H6-표지된 FAP(서열번호 81, 83 및 85 참조)를 30 ㎕/분에서 60 초동안 수직 채널을 따라 런닝 완충액 중의 5 ㎍/ml 희석물로부터 포획시켜 약 250 내지 600 RU의 리간드 밀도를 달성하였다. 단일-시도 동적 분석 구성(OSK)에서, 항체-IL-10 융합 구조물을 100 ㎕/분에서 50 내지 0.08 nM 범위의 5-배 연속 희석물로 수평 채널을 따라 분석물로서 주입하였다. 결합상은 180 초동안, 해리상은 600 초동안 기록하였다. 매우 느린 오프-속도를 나타내는 상호작용의 경우, 오프-속도의 기록은 복합체의 해리를 관찰하기 위해 1800 초까지 연장되었다. 그러나, 일부 경우에서, 상기 오프-속도의 적합화는 여전히 가능하지 않아서 1 x 10-5 l/s의 추정치를 KD 계산에 이용하였다. 런닝 완충액(PBST)은 참조를 위한 "인-라인" 블랭크를 제공하도록 6번째 채널을 따라 주입하였다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어 결합 모델(프로테온 매니저 소프트웨어 버전 2.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 산출하였다. 100 ㎕/분에서 수평 방향으로 30 초동안 10 mM 글리신(pH 1.5) 및 50 mM NaOH의 2개 펄스에 의해 재생을 수행하여 포획된 FAP 및 결합된 항체-IL-10 융합 구조물로부터 항-펜타 His IgG를 해리시켰다.
항체-IL-10 융합 구조물과 인간 IL-10R1 사이의 상호작용을 측정하기 위해, NLC 칩을 비오틴화 수용체의 고정화에 사용하였다(도 9B). 400 내지 1600 RU의 인간 IL-10R1(서열번호 87 참조)을 다양한 접촉시간동안 10 ㎍/ml의 농도 및 30 ㎕/초의 유량에서 수직 채널을 따라 뉴트라비딘-유도체화된 칩 매트릭스 상에 포획하였다. 비오틴화 인간 IL10R1에 대한 결합을 6개의 상이한 분석물 농도(50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0 nM)에서, 100 ㎕/분에서 수평 방향으로의 주입에 의해 측정하여, 180 초동안 결합 속도를, 600 초동안 해리 속도를 기록하였다. 런닝 완충액(PBST)은 참조를 위한 "인-라인" 블랭크를 제공하도록 6번째 채널을 따라 주입하였다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어 결합 모델(프로테온 매니저 소프트웨어 버전 2.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon으로서 산출하였다. 인간 IL-10R1은 활성의 손실없이 재생될 수 없으므로, 모든 상호작용에 대해 새로 고정화된 센서칩 표면을 이용하여 채널당 리간드 포획 및 분석물 주입의 연속되는 두 단계를 수행하였다.
표 1 및 2는 상이한 종들로부터의 FAP 및 인간 IL-10R1에 대해 결합하는, 항-FAP 클론 4G8 또는 4B9를 각각 기반으로 하는 항체-IL-10 융합 구조물에 대한 반응 속도 및 평형 상수의 요약을 나타낸 것이다.
[표 1]
항-FAP 클론 4G8을 기반으로 하는 항체 융합물에 대한 반응 속도 및 평형 상수의 요약. 상이한 종들로부터의 FAP 및 인간 IL-10R1에 대한 결합.
Figure pct00001

[표 2]
항-FAP 클론 4B9를 기반으로 하는 항체 융합물에 대한 반응 속도 및 평형 상수의 요약. 상이한 종들로부터의 FAP 및 인간 IL-10R1에 대한 결합.
Figure pct00002
본 출원인 수중의, 항체에는 융합되지 않고 C-말단에서 H6-표지된 야생형(wt) IL-10 사이토카인은 인간 IL-10R1에 대해 52 pM의 KD를 나타내었다(kon 2.5 x 106 l/Ms, koff 1.3 x 10-4 l/s). 이량체 사이토카인을 기반으로 하는 항체-IL-10 융합 구조물의 경우, IL-10R1에 대한 결합활성은 비융합 사이토카인에 필적하였으며, 또한 2-자릿수 pM(18 내지 73 pM의 범위)이었다. 이것은 상기 사이토카인이 인간 IL-10R1에 대해 결합활성의 큰 손실없이 항체 또는 그 단편에 대한 N-말단 융합을 허용함을 나타내었다. 대조적으로, 단량체 사이토카인을 기반으로 하는 항체-IL-10 융합 구조물은 이량체 IL-10 융합물의 결합활성 효과를 나타내지 않았으므로, 수용체에 대한 그의 친화도는 3-자릿수 pM 또는 1-자릿수 nM 범위(각각 815 pM 및 1.1 nM)이었다. FAP에 대한 결합은 각각의 항체에 따라 달라지는데, 클론 4B9는 인간 및 사이노몰구스 FAP에 대해 더 높은 친화도/결합활성을 나타내는 반면, 클론 4G8은 뮤린 FAP에 대해 더 높은 친화도/결합활성을 나타낸다. 사실상, 뮤린 FAP에 대한 4G8 항체의 결합활성은 매우 강해서 적용된 조건하에서 복합체의 해리 속도를 측정하는 것이 불가능하였다.
IL-10과 IL-10R1 사이의 상호작용은 약 35 내지 200 pM 범위의 높은 친화도(결합활성)를 갖는다[Moore, K.W. et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001)]. 이량체 IL-10 부분 또는 2개의 독립적인 단량체를 포함하는 구조물의 경우, 항체에 대한 융합은 친화도를 크게 변화시키지 않는 것으로 보인다(약 19 내지 73 pM). 그러나, 단량체성 IL-10 융합 구조물의 경우, 상기 결합 강도는 현저하게 감소하였는데, 아마도 동일한 IgG에 융합된 이량체 사이토카인 또는 2개의 단량체에 대해 발생하는 바와 같은 결합활성 효과가 없기 때문이다. 이상적으로, 표적 FAP에 대한 항체-IL-10 융합 구조물의 친화도는, FAP가 발현되는 조직으로의 효과적인 표적화를 달성하기 위해 고친화도 사이토카인 수용체 IL-10R1에 대한 것보다 더 높아야 한다. IL-10과 IL-10R1 사이의 높은 친화도에도 불구하고, IgG-IL-10 포맷을 기반으로 하는 분자에 의해 나타난 표적 FAP에 대한 친화도는 여전히 더 높다: 각각 클론 4B9 IgG-IL-10(IL-10R1에 대한 48 pM 대 인간 FAP에 대한 11 pM) 및 클론 4G8(IL-10R1에 대한 25 pM 대 뮤린 FAP에 대한 6 pM). IL-10R1 및 FAP에 대한 상기 친화도들은 FAP-과발현 조직으로의 효과적인 표적화를 달성하기에 적합한 것으로 보이며, IL-10R1은 상기 분자들에 대한 싱크(sink)를 나타내는 것으로 보이지 않는다.
1차 단핵구에 의한 전-염증 사이토카인의 LPS -유도된 생성의 억제
IgG 또는 Fab 기반 FAp-표적화 IL-10 구조물들 사이의 기능 특성화 및 차별화를 위해, 상기 분자들의 효능을 상이한 시험관내 분석법에서 평가하였다. 예를 들면, 1차 단핵구에 의한 전-염증 사이토카인의 LPS-유도된 생성을 억제하는 효능을 측정하였다. 이 실험을 위해, 200 ml의 헤파린화 말초혈(건강한 자원자로부터 수득, 메디칼 서비스 디파트먼트(Medical Services department), 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) GmbH, 독일 펜츠베르크)을 피콜 하이패크(Ficoll Hypaque) 밀도 구배에 이어 단핵구의 음성적 분리(밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec) GmbH, 독일 베르기슈 글라트바흐, #130-091-153)에 의해 분리하였다. 정제된 단핵구를 96-웰 F 세포 배양 플레이트(코스타/코닝 라이프 사이언시즈(Costar/Corning Life Sciences), 네덜란드 암스테르담; #3596)에서 배지(10% 인간 혈청, 2 mM L-글루타민[깁코, #25030] 및 펜/스트렙(Pen/Strep)으로 보충된 RPMI 1640[깁코/인비트로겐, 독일 다름스타트, cat. no. #10509-24]) 중에 5 x 104 세포/웰로 접종하였다.
모든 항체-IL-10 융합 단백질은 (a) 용액으로, 및 (b) 재조합 인간 FAP(cfin = 1 ㎍/ml)를 4 ℃에서 밤새 플레이트 위에 코팅하고(또는, 실온에서 60 내지 90 분) 항체-IL-10 융합 단백질을 코팅된 FAP에 결합시켜 고정화시킨, 실험 세팅에서 시험하였다.
구성 (a)의 경우, 접종후에, 적정된 양(통상적으로 0 내지 500 nM)의 나타낸 항체-융합 구조물 또는 양성 대조군으로서 재조합 야생형 인간 IL-10의 존재 또는 부재하에서 100 ng/ml LPS(시그마-알드리치/눈크(Sigma-Aldrich/Nunc), 독일 타우프키르헨, #L3129)로 세포를 직접 자극시켰다. 구성 (b)의 경우, 미결합 FAP를 코팅후에 제거하고, 플레이트를 실온에서 1 시간동안 배지(상기 참조)로 차단한 후, 1시간동안 더 IL-10 구조물과 함께 배양하였다. 그 후에, 플레이트를 배지로 세척한 후, 단핵구를 적절한 자극제(100 ng/ml LPS)와 함께 배양물에 첨가하였다.
모든 실험에서, 세포는 37 ℃ 및 5% CO2에서 24 시간동안 배양하였다. 상등액을 수집하고(선택적으로 -20/-80 ℃에서 저장), IL-1β, IL-6, G-CSF 및/또는 TNFα에 대한 CBA 플렉스 세트(Flex Set)(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 독일 하이델베르그, #558279, #558276, #558326 및 #558299)를 사용하여 사이토카인 생성에 대해 시험하였다. 플레이트는 FACS 어레이를 사용하여 측정하였으며, FCAP 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(둘 다 BD로부터 구입).
도 10에서 보이듯이, 전-염증 사이토카인 IL-1β, IL-6 및/또는 TNFα의 억제에 있어서 4G8 Fab-IL-10 및 IgG-IL-10의 시험관내 효능은 구성 (a)에서 필적하였다(도 10D, E, F). 대조적으로, 구성 (b)에서는, IgG-기반 포맷이 Fab-IL-10에 비해 우수한 효능을 나타내었다(도 10A, B, C). 상응하는 EC50 값[nM]은 표 3에 나타내었다. 구성 (b)에서 IgG-IL-10 구조물의 EC50 값은 재조합 wt 인간 IL-10(구성 (a)에서만 시험할 수 있었음)의 값들과 유사하였다.
[표 3]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8-IgG-IL-10 및 4G8-Fab-IL-10의 EC50 값(공여자 1).
Figure pct00003
상기 결과는 2명의 상이한 혈액 공여자를 이용하여, 독립적인 실험에서 재현되었다(도 11A 및 B, 표 4 및 5). 이 실험에서는, 구성 (b)에서 수득된 EC50 값에 의해 시사되듯이, 또한 IgG-기반 표적화 IL-10 구조물이 시험된 3개 사이토카인 모두의 억제에 있어 Fab-기반 분자보다 훨씬 우수하였다. 구성 (a)에서는 모든 분자들이 필적하였다.
[표 4]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8-IgG-IL-10 및 4G8-Fab-IL-10의 EC50 값(공여자 2).
Figure pct00004
[표 5]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8-IgG-IL-10 및 4G8-Fab-IL-10의 EC50 값(공여자 3).
Figure pct00005
다른 실험에서, 단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 있어 Fab 및 IgG 기반 IL-10 구조물의 효능을 다시 평가하였으며, wt IL-10 뿐 아니라, FAP에 결합하지 않는 비표적화 Fab-IL-10 및 IgG-IL-10 구조물과 비교하였다(도 12 및 표 6). 또한, 4G8-IgG-IL-10은 4G8-Fab-IL-10에 비해 실험 구성 (b)에서 IL-6 생성의 억제에 더 효과적인 것으로 밝혀진 반면, 비표적화 구조물은 최고 농도에서만 억제를 야기하였다. 대조적으로, 구성 (a)에서는, 모든 구조물의 효능이 필적하였다.
[표 6]
단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 대한 4G8-IgG-IL-10 및 4G8-Fab-IL-10의 EC50 값(공여자 4).
Figure pct00006
이전 분석에서 코팅에 사용된 재조합 인간 FAP의 농도는 인공적 또는 비-생리학적 조건을 반영할 수 있으므로, 코팅된 FAP의 양을 적정하고(0.25 내지 5 ㎍/ml의 cfin), EC50 값에 대한 그의 영향을 실험 구성 (b)에서 평가하였다. 도 13에서 보이듯이, 전체적으로 IgG- 및 Fab-기반 구조물에 대한 EC50 값의 비에 현저한 차이는 없다. 모든 농도에서, IgG-IL-10 구조물이 IL-6 유도 억제에 더 효과적이었다(도 13 및 표 7 및 8). 그러나, 감소하는 농도에 따라 EC50값은 일반적으로 증가되었기 때문에 코팅된 FAP의 농도는 실험 결과에 영향을 미쳤으며, 이것은 미세적정 플레이트상에 고정화된 구조물의 양을 반영할 수 있다(표 8: Fab-기반 구조물의 경우 사이토카인 감소가 최저 FAP 농도에서 관찰되었지만, EC50은 산출할 수 없었다). 흥미롭게, 높은 FAP 농도(5 ㎍/ml)에서, 분비된 IL-6의 총량에 증가가 검출되었다(도 14).
[표 7]
단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 대한 4G8-IgG-IL-10 및 인간 야생형 IL-10(용액으로)의 EC50 값(공여자 5).
Figure pct00007
[표 8]
단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 대한, 상이한 농도의 코팅된 FAP에 고정화된 4G8-IgG-IL-10 및 4G8-Fab-IL-10의 EC50 값(공여자 5).
Figure pct00008
다른 실험에서, 상이한 FAP 표적화 도메인을 포함하는 IL-10 융합 구조물인 친화도-증진된 항-FAP 항체 변이체 4B9를 시험하였다. 또한, 단핵구에 의한 LPS-유도된 IL-6 생성의 억제에서 구조물의 시험관내 효능을 실험 구성 (a) 및 (b)에서 평가하였다.
도 15는 4B9-기반 구조물의 경우 IgG-IL-10 분자가 실험 구성 (a)에서 IL-6 생성의 억제에 있어 Fab-IL-10 구조물보다 우수하였음(및 구성 (b)에서는 필적하였음)을 보여준다. 상응하는 EC50 값을 표 9에 나타내었다. 일반적으로, 4B9 및 4G8 구조물은 유사한 효능을 나타내었다.
[표 9]
단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 대한, 4G8 및 4B9-기반 IgG-IL-10 및 Fab-IL-10의 EC50 값(공여자 7).
Figure pct00009
다른 일련의 실험에서, 4G8-기반 IgG-IL-10, Fab-IL-10, Fab-IL-10M1-Fab 및 IgG-IL-10M1 구조물을 비교하였다. 단핵구에 의한 전-염증 사이토카인 IL-6, IL-1β 및 TNFα의 LPS-유도된 생성의 억제를 실험 구성 (a) 및 (b)에서 평가하였다. 상기 실험들의 결과는 표 10 내지 12(3명의 상이한 공여자)에 나타내었다. 이전 실험에서와 같이, IgG-IL-10이, 특히 실험 구성 (b)에서, 가장 효과적인 구조물이었다.
[표 10]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8 IgG-IL-10, 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 및 4G8 IgG-IL-10M1 융합 단백질의 EC50 값(공여자 1).
Figure pct00010
[표 11]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8 IgG-IL-10, 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 및 4G8 IgG-IL-10M1 융합 단백질의 EC50 값(공여자 2).
Figure pct00011
[표 12]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8 IgG-IL-10, 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 및 4G8 IgG-IL-10M1 융합 단백질의 EC50 값(공여자 3).
Figure pct00012
또 다른 일련의 실험에서, 4G8-기반 Fab-IL-10, Fab-scIL-10-Fab 및 Fab-IL-10M1-Fab 구조물을 비교하였다. 단핵구에 의한 IL-6, IL-1β, TNFα 및 G-CSF의 LPS-유도된 생성의 억제를 실험 구성 (a) 및 (b)에서 평가하였다. 상기 실험들의 결과는 표 13 내지 17(6명의 상이한 공여자)에 나타내었다. 결과는 이량체 IL-10 분자를 포함하는 구조물이 scIL-10 또는 단량체 IL-10M1 분자를 갖는 구조물보다 더 효과적임을 보여준다.
[표 13]
단핵구에 의한 사이토카인 생성의 억제에 대한 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-scIL-10-Fab 및 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00013
[표 14]
단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 대한 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-scIL-10-Fab 및 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00014
[표 15]
단핵구에 의한 IL-1β 생성의 억제에 대한 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-scIL-10-Fab 및 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00015
[표 16]
단핵구에 의한 G-CSF 생성의 억제에 대한 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-scIL-10-Fab 및 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00016
[표 17]
단핵구에 의한 TNFα 생성의 억제에 대한 4G8 Fab-IL-10, 4G8 Fab-scIL-10-Fab 및 4G8 Fab-IL-10M1-Fab 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00017
마지막으로, 4B9 및 4G8-기반 Fab-IL-10 및 IgG-(IL-19M1)2 구조물을 비교하였다. 단핵구에 의한 IL-6의 LPS-유도된 생성의 억제를 실험 구성 (a) 및 (b)에서 평가하였다. 상기 실험들의 결과는 표 19에 나타내었다. 결과는 IgG-(IL-10M1)2를 포함하는 모든 구조물이 구성 (a)에서보다 구성 (b)에서 더 적절하게 작용함을 보여준다.
[표 18]
단핵구에 의한 IL-6 생성의 억제에 대한 4B9 IgG-IL-10, 4G8 IgG-IL-10 및 4G8 IgG-(IL-10M1)2 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00018
1차 단핵구 상에서의 MHC - II 분자의 IFN γ-유도된 상향조절의 억제
IgG 및 Fab 기반 FAP-표적화 IL-10 구조물 사이의 기능 특성화 및 차별화를 위해, 단핵구에서 IFNγ-유도된 MHC-II 발현을 억제하는 그들의 능력을 평가하였다. 사이토카인 억제 분석과 유사하게, 본 실험은 용액으로(실험 구성 (a); 상기 참조) 또는 세포 배양 플레이트 상에 코팅된 FAP에 결합시킴으로써 고정화된(실험 구성 (b); 상기 참조) 구성물을 사용하여 수행하였다. 원칙적으로, 단핵구는 전술한 바와 같이 분리하고 배양하였으나, 250 U/ml IFNγ(BD, #554616)로 24 시간동안 자극하였다. 자극하기 전에, 세포를 선택적으로 재조합 야생형(wt) IL-10 또는 상이한 항체-IL-10 융합 구조물로 처리하였다. 배양후에, 세포를 어큐타제(Accutase) 처리(PAA, #L11-007)에 의해 분리하고, 최종 FACS 분석에 적용하기 전에 임의의 비특이적 FcγR 결합을 배제하기 위해 3% 인간 혈청(시그마, #4522)을 함유하는 PBS 중에서 항-HLA-DR 항체(BD, #559866)로 염색하였다.
상기 실험의 결과는 표 19에 나타내었으며, 4B9-기반 구조물의 경우 IgG-IL-10 분자가 실험 구성 (b)에서 1차 단핵구 상에서의 IFNγ-유도된 MHC-II 발현의 하향조절에 있어 Fab-IL-10 구조물보다 우수하였음(및 구성 (a)에서는 필적하였음)을 보여준다.
[표 19]
1차 단핵구 상에서 IFNγ-유도된 MHC-II 발현의 하향조절에 대한 4B9 IgG-IL-10 및 4B9 Fab-IL-10의 EC50 값.
Figure pct00019
분리된 1차 단핵구에서 IL -10 유도된 STAT3 포스포릴화
IL-10R 신호전달이 STAT3의 포스포릴화를 유발하기 때문에, 여러 표적화된 IL-10 구조물 및 포맷을 새로 분리한 혈액 단핵구를 사용하여 pSTAT3 분석에서 기능적으로 평가하였다[Finbloom & Winestock, J. Immunol. 1995; Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 2001; Mosser & Zhang, Immunological Reviews 2008]. 간략하게, 전술한 바와 같이 건강한 공여자의 피콜-분리된 PBMC로부터 CD14+ 단핵구를 본래 그대로 분리하였다. 전형적으로, 3 내지 10 x 105 세포를 300 ㎕ 배지(RPMI1640/10% FCS/L-글루타민/펜/스트렙) 중에서 FACS 튜브로 옮기고, 37 ℃, 5% CO2에서 0 내지 200/500 nM의 wt 인간 IL-10 또는 지시된 항체-IL-10 융합 단백질과 함께 30 분동안 통상적으로 배양하였다. 이어서, 튜브당 300 ㎕의 예열된 픽스(Fix) 완충액 I(BD 바이오사이언시즈, #557870)을 가하고, 볼텍싱하고, 37 ℃에서 10 분동안 배양한 후, 세포를 2 ml PBS/2% FCS로 1회 세척하고 250 x g에서 10 분동안 원심분리하였다. 이어서, 세포 투과화를 위해 튜브당 300 ㎕ 얼음-냉각시킨 펌(Perm) 완충액 III(BD 바이오사이언시즈, #558050)을 가하고, 얼음상에서 30 분간 배양한 후 세포를 다시 전술한 바와 같이 세척하였다. 최종적으로, 세포를 100 ㎕ 항체 희석액(항-Stat-3.A647; BD 바이오사이언시즈, #557815)에 재현탁시키고 4 ℃에서 30 분동안 배양한 후 세포를 세척하고 FACS 분석을 위해 처리하였다.
상기 실험에서 상이한 구조물들에 대해 수득된 EC50 값은 표 20 및 21에 나타내었다. 결과는 이량체 IL-10 분자를 포함하는 구조물(Fab- 또는 IgG-기반)이 scIL-10 분자 또는 단량체 IL-10M1 분자를 포함하는 구조물보다 더 활성임을 나타낸다.
[표 20]
분리된 1차 단핵구에서 IL-10 유도된 STAT3 포스포릴화에 대한 4G8-기반 항체-IL-10 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00020
[표 21]
분리된 1차 단핵구에서 IL-10 유도된 STAT3 포스포릴화에 대한 4B9-기반 항체-IL-10 융합 단백질의 EC50 값.
Figure pct00021
FAP - 표적화 및 비표적화 항체- IL -10 융합 단백질의 생체분포
FAP-표적화 In-111-표지화된 4B9 IgG-IL-10, 4G8 IgG-IL-10 및 비표적화 DP47GS IgG-IL 10의 조직 생체분포를, 미리-결정된 관절염 스코어 >3에 이르는 콜라겐-유도성 관절염을 갖는 DBA/1J 마우스에서 마우스당 50 ㎍에서 측정하였다(첫 면역접종 28일후). 생체분포는 군당 5마리 마우스에서 방사성표지된 접합체의 정맥내 주사 72 시간후에 수행하였다.
상기 실험 결과는 표 22에 나타내었다. 염증이 있는 관절에서 비표적화 항체-IL-10 융합 단백질 DP47GS IgG-IL-10의 흡수는 표적화 IgG-IL-10 융합 단백질의 흡수보다 훨씬 더 낮아서(p<0.0001), 4B9 IgG-IL-10 및 4G8 IgG-IL-10의 흡수가 FAP-매개됨을 시사하였다. 비장 흡수는 아마도 IL-10 매개되는 듯 한데, 그 이유는 3개 구조물 모두 유사한 수준의 비장 축적을 나타내었기 때문이다.
[표 22]
항체 구조물의 흡수(주입 용량 %/조직 g)
Figure pct00022
IgG-IL-10의 생체분포에 대힌 IL-10의 영향을 연구하기 위해, 두번째 실험에서 IN-111-표지화 4G8 IgG-IL-10의 생체분포를 In-111-표지화 4G8 IgG와 비교하였다.
상기 실험의 결과는 표 23에 나타내었다. 4G8 IgG와 4G8 IgG-IL-10 사이에 염증이 있는 관절에서의 축적에 큰 차이는 없어서, IL-10이 염증이 있는 부위로의 4G8 IgG의 표적화에 크게 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 4G8 IgGI-IL-10의 비장 흡수는 4G8 IgG(p<0.0001)보다 훨씬 더 높아서, 비장에서의 흡수가 부분적으로 IL-10 매개됨을 시사하였다.
[표 23]
항체 구조물의 흡수(주입 용량%/조직 g)
Figure pct00023
상기 본 발명은 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예로써 다소 상세하게 설명하였지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용들은 명확히 전체로 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof <130> 31135 <140> PCT/EP2013/066342 <141> 2013-08-05 <150> EP 12179709.6 <151> 2012-08-08 <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 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acccacatga cgcacttcct caagcaatgc ttttctttat cagacggcaa aaagaaaaag 2220 aaaaagggcc accaccatca ccatcac 2247 <210> 85 <211> 748 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cynomolgus FAP ectodomain+poly-lys-tag+his6-tag <400> 85 Arg Pro Pro Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe 20 25 30 Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn 35 40 45 Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu 50 55 60 Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser 65 70 75 80 Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp 85 90 95 Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly 100 105 110 Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys 115 120 125 Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile 130 135 140 Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn 145 150 155 160 Gly Arg Glu Asn Lys 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Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr 370 375 380 Ser Ser Asn Glu Phe Glu Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg 385 390 395 400 Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His 405 410 415 Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr 420 425 430 Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser 435 440 445 Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu 450 455 460 Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu 465 470 475 480 Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met 485 490 495 Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile 500 505 510 Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala 515 520 525 Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala 530 535 540 Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr 545 550 555 560 Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr 565 570 575 Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile 580 585 590 Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu 595 600 605 Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val 610 615 620 Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly 625 630 635 640 Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val 645 650 655 Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His 660 665 670 Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala 675 680 685 Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser 690 695 700 Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr 705 710 715 720 His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys 725 730 735 Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His 740 745 <210> 86 <211> 2244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cynomolgus FAP ectodomain+poly-lys-tag+his6-tag (DNA) <400> 86 cgccctccaa gagttcataa ctctgaagaa aatacaatga gagcactcac actgaaggat 60 attttaaatg ggacattttc ttataaaaca ttttttccaa actggatttc aggacaagaa 120 tatcttcatc aatctgcaga taacaatata gtactttata atattgaaac aggacaatca 180 tataccattt tgagtaacag aaccatgaaa agtgtgaatg cttcaaatta tggcttatca 240 cctgatcggc aatttgtata tctagaaagt gattattcaa agctttggag atactcttac 300 acagcaacat attacatcta tgaccttagc aatggagaat ttgtaagagg aaatgagctt 360 cctcgtccaa ttcagtattt atgctggtcg cctgttggga gtaaattagc atatgtctat 420 caaaacaata tctatttgaa acaaagacca ggagatccac cttttcaaat aacatttaat 480 ggaagagaaa ataaaatatt taatggaatc ccagactggg tttatgaaga ggaaatgctt 540 gctacaaaat atgctctctg gtggtctcct aatggaaaat ttttggcata tgcggaattt 600 aatgatacag atataccagt tattgcctat tcctattatg gcgatgaaca atatcccaga 660 acaataaata ttccataccc aaaggccgga gctaagaatc cttttgttcg gatatttatt 720 atcgatacca cttaccctgc gtatgtaggt ccccaggaag tgcctgttcc agcaatgata 780 gcctcaagtg attattattt cagttggctc acgtgggtta ctgatgaacg agtatgtttg 840 cagtggctaa aaagagtcca gaatgtttcg gtcttgtcta tatgtgattt cagggaagac 900 tggcagacat gggattgtcc aaagacccag gagcatatag aagaaagcag aactggatgg 960 gctggtggat tctttgtttc aacaccagtt ttcagctatg atgccatttc atactacaaa 1020 atatttagtg acaaggatgg ctacaaacat attcactata tcaaagacac tgtggaaaat 1080 gctattcaaa ttacaagtgg caagtgggag gccataaata tattcagagt aacacaggat 1140 tcactgtttt attctagcaa tgaatttgaa gattaccctg gaagaagaaa catctacaga 1200 attagcattg gaagctatcc tccaagcaag aagtgtgtta cttgccatct aaggaaagaa 1260 aggtgccaat attacacagc aagtttcagc gactacgcca agtactatgc acttgtctgc 1320 tatggcccag gcatccccat ttccaccctt catgacggac gcactgatca agaaattaaa 1380 atcctggaag aaaacaagga attggaaaat gctttgaaaa atatccagct gcctaaagag 1440 gaaattaaga aacttgaagt agatgaaatt actttatggt acaagatgat tcttcctcct 1500 caatttgaca gatcaaagaa gtatcccttg ctaattcaag tgtatggtgg tccctgcagt 1560 cagagtgtaa ggtctgtatt tgctgttaat tggatatctt atcttgcaag taaggaaggg 1620 atggtcattg ccttggtgga tggtcgggga acagctttcc aaggtgacaa actcctgtat 1680 gcagtgtatc gaaagctggg tgtttatgaa gttgaagacc agattacagc tgtcagaaaa 1740 ttcatagaaa tgggtttcat tgatgaaaaa agaatagcca tatggggctg gtcctatgga 1800 ggatatgttt catcactggc ccttgcatct ggaactggtc ttttcaaatg tgggatagca 1860 gtggctccag tctccagctg ggaatattac gcgtctgtct acacagagag attcatgggt 1920 ctcccaacaa aggatgataa tcttgagcac tataagaatt caactgtgat ggcaagagca 1980 gaatatttca gaaatgtaga ctatcttctc atccacggaa cagcagatga taatgtgcac 2040 tttcaaaact cagcacagat tgctaaagct ctggttaatg cacaagtgga tttccaggca 2100 atgtggtact ctgaccagaa ccacggctta tccggcctgt ccacgaacca cttatacacc 2160 cacatgaccc acttcctaaa gcagtgtttc tctttgtcag acggcaaaaa gaaaaagaaa 2220 aagggccacc accatcacca tcac 2244 <210> 87 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IL-10R1-Fc fusion + Avi-tag <400> 87 His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp Phe Glu Ala Glu 1 5 10 15 Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro Asn Gln Ser Glu 20 25 30 Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ile Glu Ser Trp 35 40 45 Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr Asp Leu Thr Ala 50 55 60 Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg Ala Arg Val Arg 65 70 75 80 Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val Thr Asn Thr Arg 85 90 95 Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser Val Asn Leu Glu 100 105 110 Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu Pro Arg Pro Lys 115 120 125 Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe Ser His Phe Arg 130 135 140 Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn Phe Thr Phe Thr 145 150 155 160 His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu Thr Ser Gly Glu 165 170 175 Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val Ala Ser Arg Ser 180 185 190 Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser Leu Thr Arg Gln 195 200 205 Tyr Phe Thr Val Thr Asn Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly 210 215 220 Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile 450 455 460 Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 465 470 <210> 88 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IL-10R1-Fc fusion + Avi-tag <400> 88 catgggacag agctgcccag ccctccgtct gtgtggtttg aagcagaatt tttccaccac 60 atcctccact ggacacccat cccaaatcag tctgaaagta cctgctatga agtggcactc 120 ctgaggtatg gaatagagtc ctggaactcc atctccaact gtagccagac cctgtcctat 180 gaccttaccg cagtgacctt ggacctgtac cacagcaatg gctaccgggc cagagtgcgg 240 gctgtggacg gcagccggca ctccaactgg accgtcacca acacccgctt ctctgtggat 300 gaagtgactc tgacagttgg cagtgtgaac ctagagatcc acaatggctt catcctcggg 360 aagattcagc tacccaggcc caagatggcc cccgcaaatg acacatatga aagcatcttc 420 agtcacttcc gagagtatga gattgccatt cgcaaggtgc cgggaaactt cacgttcaca 480 cacaagaaag taaaacatga aaacttcagc ctcctaacct ctggagaagt gggagagttc 540 tgtgtccagg tgaaaccatc tgtcgcttcc cgaagtaaca aggggatgtg gtctaaagag 600 gagtgcatct ccctcaccag gcagtatttc accgtgacca acgtcgacga acagttatat 660 tttcagggcg gctcacccaa atctgcagac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtggcgg gtccggaggc 1380 ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagatt gaatggcacg ag 1422 <210> 89 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR Kabat (1) <400> 89 agctacgcca tgagc 15

Claims (52)

  1. 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함하는, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 중쇄 폴리펩티드 각각이 IgG-클래스 항체 중쇄 및 IL-10 단량체를 포함하는 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 IL-10 단량체가 그의 N-말단에서, 선택적으로 펩티드 링커를 통해, 상기 IgG-클래스 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 폴리펩티드가 각각 필수적으로 IgG-클래스 항체 중쇄, IL-10 단량체 및 선택적으로 펩티드 링커로 이루어진 융합 단백질.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-10 단량체가 천연 IL-10 단량체, 특히 천연 인간 IL-10 단량체인 융합 단백질.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-10 단량체가 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질.
  7. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 폴리펩티드에 포함된 상기 IL-10 단량체가 기능성 동종이량체성 IL-10 분자를 형성하는 융합 단백질.
  8. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-10 단량체가 변형된 IL-10 단량체, 특히 변형된 인간 IL-10 단량체인 융합 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 변형된 IL-10 단량체가 단량체 형태로 pH 7.0, 37 ℃에서 안정한 융합 단백질.
  10. 제 2 항 내지 제 4 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-10 단량체가 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질.
  11. 제 2 항 내지 제 4 항 및 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 폴리펩티드에 포함된 IL-10 단량체가 서로와 동종이량체화되지 않는 융합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 변형을 갖지 않는 상응하는 IgG-클래스 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 변형을 포함하는 융합 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 Fc 수용체가 Fcγ 수용체, 특히 인간 Fcγ 수용체인 융합 단백질.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 Fc 수용체가 활성화 Fc 수용체인 융합 단백질.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 수용체가 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)의 군에서 선택되는 융합 단백질.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 수용체가 FcγIIIa, 특히 인간 FcγIIIa인 융합 단백질.
  17. 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 항체 중쇄의 위치 329(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함하는 융합 단백질.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 아미노산 치환이 P329G인 융합 단백질.
  19. 제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 항체 중쇄의 위치 234 및 235(EU 번호체계)에 아미노산 치환을 포함하는 융합 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 아미노산 치환이 L234A 및 L235A(LALA)인 융합 단백질.
  21. 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 항체 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 번호체계)를 포함하는 융합 단백질.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 IgG1-서브클래스 항체인 융합 단백질.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 전장 항체인 융합 단백질.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 인간 항체인 융합 단백질.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질.
  26. 제 25 항에 있어서,
    25 ℃에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정할 때, 1 nM 미만, 특히 100 pM 미만의 친화도 상수(KD)하에 FAP에 결합할 수 있는 융합 단백질.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    상기 FAP가 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP인 융합 단백질.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 서열번호 37의 중쇄 CDR(HCDR) 1, 서열번호 41의 HCDR 2, 서열번호 49의 HCDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR(LCDR) 1, 서열번호 57의 LCDR 2, 및 서열번호 61의 LCDR 3을 포함하는 융합 단백질.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 서열번호 63의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 65의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 융합 단백질.
  30. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 서열번호 37의 HCDR 1, 서열번호 43의 HCDR 2, 서열번호 47의 HCDR 3, 서열번호 51의 LCDR 1, 서열번호 55의 LCDR 2, 및 서열번호 59의 LCDR 3을 포함하는 융합 단백질.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 IgG-클래스 항체가 서열번호 67의 VH 및 서열번호 69의 VL을 포함하는 융합 단백질.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    25 ℃에서 SPR에 의해 측정할 때, 1 nM 미만, 특히 100 pM 미만의 친화도 상수(KD)하에 IL-10 수용체-1(IL-10R1)에 결합할 수 있는 융합 단백질.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 IL-10R1이 인간 IL-10R1인 융합 단백질.
  34. 제 32 항에 있어서,
    제 26 항에 종속될 때,
    IL-10R1에 대한 결합에 대한 상기 친화도 상수(KD)가, 25 ℃에서 SPR로 측정할 때, FAP에 대한 결합에 대한 상기 친화도 상수(KD)와 대략 동일하거나 더 큰 융합 단백질.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  36. 제 35 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  37. 제 31 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 36 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. (i) 제 37 항의 숙주 세포를 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및 (ii) 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 제조 방법.
  39. 제 38 항의 방법에 의해 생성된, IgG-클래스 항체와 IL-10 분자의 융합 단백질.
  40. 제 1 항 내지 제 34 항 및 제 39 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  41. 약제로서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 34 항 및 제 39 항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 제 40 항의 약학 조성물.
  42. 염증 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 34 항 및 제 39 항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 제 40 항의 약학 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 염증 질환이 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염인 융합 단백질 또는 약학 조성물.
  44. 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 34 항 및 제 39 항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 질환이 염증 질환인 용도.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 염증 질환이 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염인 용도.
  47. 제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 포유동물, 특히 인간인 용도.
  48. 약학적으로 허용되는 형태의, 제 1 항 내지 제 34 항 및 제 39 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 조성물 치료 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 질환을 치료하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 질환이 염증 질환인 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 염증 질환이 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염인 방법.
  51. 제 48 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 포유동물, 특히 인간인 방법.
  52. 전술한 바와 같은 본 발명.
KR1020157003225A 2012-08-08 2013-08-05 인터루킨-10 융합 단백질 및 그의 용도 KR20150038012A (ko)

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