JP2021087426A - インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 - Google Patents
インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021087426A JP2021087426A JP2021009946A JP2021009946A JP2021087426A JP 2021087426 A JP2021087426 A JP 2021087426A JP 2021009946 A JP2021009946 A JP 2021009946A JP 2021009946 A JP2021009946 A JP 2021009946A JP 2021087426 A JP2021087426 A JP 2021087426A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- antibody
- seq
- igg
- heavy chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 290
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 290
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 title claims abstract description 202
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 title claims abstract description 202
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 title abstract description 183
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 117
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 109
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 107
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 93
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 68
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 58
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 58
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 58
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 54
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 54
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 54
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 48
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 45
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 34
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 34
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 32
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 22
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 20
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 claims description 20
- 101001083151 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 17
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 13
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 12
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 12
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 claims description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 10
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 claims description 6
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 6
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 abstract description 16
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 5
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 182
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 81
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 34
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 29
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 25
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 22
- 230000006870 function Effects 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 21
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 20
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 19
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 19
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 17
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 14
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 108010072257 fibroblast activation protein alpha Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- -1 Invitrogen Chemical compound 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 10
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 10
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 10
- 238000012552 review Methods 0.000 description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 9
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 7
- 101000857304 Mus musculus Glomulin Proteins 0.000 description 7
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102100020788 Interleukin-10 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 6
- 101710199214 Interleukin-10 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 101710088083 Glomulin Proteins 0.000 description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 4
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102100023832 Prolyl endopeptidase FAP Human genes 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 4
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000272186 Falco columbarius Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101000617830 Homo sapiens Sterol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 101000697584 Streptomyces lavendulae Streptothricin acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008228 bacteriostatic water for injection Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100478232 Caenorhabditis elegans spr-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101001040800 Homo sapiens Integral membrane protein GPR180 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000635799 Homo sapiens Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 101000997835 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241001125831 Istiophoridae Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 101000933447 Mus musculus Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 101000905241 Mus musculus Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWLORMQUOWCQPO-UHFFFAOYSA-N benzyl-dimethyl-octadecylazanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 FWLORMQUOWCQPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012254 genetic linkage analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007085 granulocyte colony-stimulating factor production Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000019189 interleukin-1 beta production Effects 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 108040006870 interleukin-10 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000019079 negative regulation of cytokine secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2066—IL-10
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
【課題】公知の抗体断片に基づく(例えばscFv、ダイアボディ、Fab)IL−10融合タンパク質に対して、改善された生産しやすさ、安定性、血清半減期及び標的抗原との結合による生物活性の著しい増加を含むいくつかの利点を有する抗体とインターロイキン−10(IL−10)との融合タンパク質を提供する。【解決手段】IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質である。【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に、抗体とインターロイキン−10(IL−10)との融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、本発明の融合タンパク質を生成する方法及び疾患の治療において本発明の融合タンパク質を用いる方法に関する。
IL−10の生物学的機能
IL−10は、〜37kDaの非共有結合したホモ2量体として発現されるα−ヘリックスサイトカインである。IL−10は、寛容性の誘導及び維持において重要な役割を演じる。IL−10の優勢な抗炎症性の特性については、長い間知られている。IL−10は、TNFα、IL−1、IL−6、IL−12のような炎症誘発性サイトカイン並びにIL−2及びIFNγのようなTh1サイトカインの分泌を抑制し、マクロファージ、B細胞及びT細胞の分化及び増殖をコントロールする(Glocker, E.O.等, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011); Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); de Waal Malefyt, R.等, J. Exp. Med. 174, 915-924 (1991); Williams, L.M.等, Immunology 113, 281-292 (2004))。さらに、IL−10は、MHCII発現並びに同時刺激分子CD80及びCD86の上方制御を阻害する、抗原提示の阻害剤としての能力を有する(Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008))。
IL−10は、〜37kDaの非共有結合したホモ2量体として発現されるα−ヘリックスサイトカインである。IL−10は、寛容性の誘導及び維持において重要な役割を演じる。IL−10の優勢な抗炎症性の特性については、長い間知られている。IL−10は、TNFα、IL−1、IL−6、IL−12のような炎症誘発性サイトカイン並びにIL−2及びIFNγのようなTh1サイトカインの分泌を抑制し、マクロファージ、B細胞及びT細胞の分化及び増殖をコントロールする(Glocker, E.O.等, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011); Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); de Waal Malefyt, R.等, J. Exp. Med. 174, 915-924 (1991); Williams, L.M.等, Immunology 113, 281-292 (2004))。さらに、IL−10は、MHCII発現並びに同時刺激分子CD80及びCD86の上方制御を阻害する、抗原提示の阻害剤としての能力を有する(Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008))。
それにもかかわらず、免疫賦活特性も報告されている。IL−10は、B細胞活性化を同時刺激し、B細胞生存を引き延ばし、B細胞におけるクラススイッチに貢献できる。さらに、IL−10は、ナチュラルキラー(NK)細胞増殖及びサイトカイン生成を同時刺激し、CD8+T細胞のある種のサブセットの増殖を刺激する増殖因子として働くことができる(Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008); Cai, G.等, Eur. J. Immunol. 29, 2658-2665 (1999); Santin, A.D.等, J. Virol. 74, 4729-4737 (2000); Rowbottom, A.W.等, Immunology 98, 80-89 (1999); Groux, H.等, J. Immunol. 160, 3188-3193 (1998))。重要なことに、ヒトにおける高用量のIL−10(それぞれ20及び25μg/kg)は、IFNγの生成の増加を導くことができる(Lauw, F.N.等, J. Immunol. 165, 2783-2789 (2000); Tilg, H.等, Gut 50, 191-195 (2002))。
IL−10は、IL−10受容体1(IL−10R1)とIL−10R2とのそれぞれの2コピーからなる2受容体複合体を通じてシグナル伝達する。IL−10R1は、IL−10と比較的高い親和性(〜35−200pM)で結合し(Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001))、受容体複合体へのIL−10R2の動員は、リガンド結合に対してわずかな貢献だけをもたらす。しかし、この第2受容体が複合体と係合することにより、リガンド結合の後にシグナル伝達ができる。よって、機能的受容体は、IL−10R1とIL−10R2とのヘテロ2量体の2量体からなる。ほとんどの造血細胞は、低レベルのIL−10R1を構成的に発現し、受容体発現は、しばしば、様々な刺激因子により劇的に上方制御されることがある。線維芽細胞及び上皮細胞のような非造血細胞も、IL−10R1を上方制御することにより刺激因子に応答できる。対照的に、IL−10R2はほとんどの細胞上で発現される。IL−10が受容体複合体と結合することにより、IL−10R1及びIL−10R2とそれぞれ会合しているヤヌスチロシンキナーゼであるJAK1及びTyk2が活性化され、受容体の細胞質内尾部がリン酸化される。このことにより、STAT3がIL−10R1に動員される。STAT3のホモ2量体形成により、受容体からSTAT3が放出され、リン酸化されたSTATホモ2量体が核に移動して、様々な遺伝子のプロモーター中のSTAT3結合エレメントと結合する。これらの遺伝子の1つは、IL−10自体であり、これは、STAT3により正に制御される。STAT3は、STAT活性化の質及び量をコントロールするサイトカインシグナリング3(SOCS3)の抑制因子も活性化する。SOCS3は、IL−10により誘導され、様々なサイトカイン遺伝子に対して負の調節効果を発揮する(Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205.218 (2008))。
遺伝子連鎖解析及び候補遺伝子配列決定により、IL−10R1及びIL−10R2における変異と炎症性腸疾患(IBD)の一形態である早期発症型腸炎との間の直接的な関連が明らかになった(Glocker, E.O.等, N. Engl. J. Med. 361(21), 2033-2045 (2009))。最近のデータは、早期発症型IBDが一遺伝子によるものであり得ることさえ示唆している。IL−10サイトカイン又はその受容体の変異は、IL−10機能の喪失を導き、幼児及び小児において重度の腸炎を引き起こす(Glocker, E.O.等, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011))。さらに、重症形態のクローン病の患者は、全血細胞培養物及び単球由来樹状細胞においてIL−10生成が欠損している(Correa, I.等, J. Leukoc. Biol. 85(5), 896-903 (2009))。米国において約1.4百万人及び欧州において2.2百万人がIBDに罹患している(Carter, M.J.等, Gut 53 (Suppl. 5), V1-V16 (2004); Engel, M.A.及びNeurath, M.F., J. Gastroenterol. 45, 571-583 (2010))。
IL−10を用いる治療アプローチ
炎症性障害及び自己免疫疾患における組換えIL−10の治療上の利益は、様々な背景にて健常ボランティア及び特定の患者集団に静脈内又は皮下で投与した単回又は複数回用量の安全性、寛容性、薬物動態、薬力学、免疫学的及び血液学的効果を調べる第I相及び第II相の臨床試験において査定されている(Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E.等, J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995); Huhn, R.D.等, Blood 87, 699-705 (1996); Huhn, R.D.等, Clin. Pharmacol. Ther. 62, 171-180 (1997))。IL−10は、25μg/kgまでの用量では重度の副作用はなく良好な耐容性があり、軽度から中程度のインフルエンザ様症状だけが、100μg/kgまでの用量のレシピエントの一部分で観察された(Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E.等, J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995))。臨床上の改善に向けた傾向が、乾癬(編集された臨床研究は、Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)で見出すことができる)、クローン病(Van Deventer S.J.等, Gastroenterology 113, 383-389 (1997); Fedorak, R.N.等, Gastroenterology 119, 1473-1482 (2000); Schreiber, S.等, Gastroenterolotgy 119, 1461-1472 (2000); Colombel J.F.等, Gut 49, 42-46 (2001))及び関節リウマチ(Keystone, E.等, Rheum. Dis. Clin. N. Am. 24, 629-639 (1998); Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008))において最も頻繁に見られた。
炎症性障害及び自己免疫疾患における組換えIL−10の治療上の利益は、様々な背景にて健常ボランティア及び特定の患者集団に静脈内又は皮下で投与した単回又は複数回用量の安全性、寛容性、薬物動態、薬力学、免疫学的及び血液学的効果を調べる第I相及び第II相の臨床試験において査定されている(Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E.等, J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995); Huhn, R.D.等, Blood 87, 699-705 (1996); Huhn, R.D.等, Clin. Pharmacol. Ther. 62, 171-180 (1997))。IL−10は、25μg/kgまでの用量では重度の副作用はなく良好な耐容性があり、軽度から中程度のインフルエンザ様症状だけが、100μg/kgまでの用量のレシピエントの一部分で観察された(Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E.等, J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995))。臨床上の改善に向けた傾向が、乾癬(編集された臨床研究は、Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)で見出すことができる)、クローン病(Van Deventer S.J.等, Gastroenterology 113, 383-389 (1997); Fedorak, R.N.等, Gastroenterology 119, 1473-1482 (2000); Schreiber, S.等, Gastroenterolotgy 119, 1461-1472 (2000); Colombel J.F.等, Gut 49, 42-46 (2001))及び関節リウマチ(Keystone, E.等, Rheum. Dis. Clin. N. Am. 24, 629-639 (1998); Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008))において最も頻繁に見られた。
全体的に、臨床結果は満足できないものであり、アミノ末端のメチオニン残基以外は内因性ヒトIL−10と同一である組換えヒトIL−10(イロデカキン、TENOVIL、Schering−Plough Research Institute、Kenilworth、NJ)の臨床開発は、有効性の欠如により中止された。クローン病の寛解を導くための組換えヒトIL−10の有効性及び寛容性についての最近の系統的なレビューは、完全又は臨床寛解についてIL−10とプラセボとの間に統計的に有意な差を見出さず、IL−10で治療された患者は、プラセボと比べて、有害事象のために研究を取りやめる可能性が著しくより高かったと述べている(Buruiana, F.E.等, Cochrane Database Syst. Rev. 11, CD005109 (2010))。クローン病について、これらの満足できない結果についていくつかの理由が論じられている(Herfarth, H.及びScholmerich, J., Gut 50, 146-147 (2002)):1)持続的な抗炎症性効果を媒介するには低すぎる、腸における局所サイトカイン濃度、2)全身投与されるIL−10の用量の上昇が、副作用のために制限されたこと、3)B細胞並びにCD4+、CD8+及び/又はナチュラルキラー細胞によるIFNγ生成に対するIL−10の免疫賦活特性が、その免疫抑制特性を相殺すること(Asadullah, K.等, Pharmacol. Rev. 55, 241-269 (2003); Tilg, H.等, Gut 50, 191-195 (2002); Lauw, F.N.等, J. Immunol. 165, 2783-2789 (2000))。
IL−10は、〜37kDaの小さいサイズのために非常に短い血漿半減期を示し、このことは、迅速な腎臓クリアランスを導く。実際に、全身区画における半減期は、2.5時間であり、このことは、粘膜バイオアベイラビリティを制限する(Braat, H.等, Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 725-731 (2003))。循環時間、曝露、有効性を改善し、腎臓での取り込みを低減するために、このサイトカインをPEG化することがいくつかの出版物で報告されている(Mattos, A.等, J. Control Release 162, 84-91 (2012); Mumm, J.B.等, Cancer Cell 20(6), 781-796 (2011); Alvarez, H.M.等, Drug Metab. Dispos. 40(2), 360-373 (2012))。それでもやはり、PEG化非標的化IL−10の全身性半減期が長くなることにより、この分子の公知の有害事象が悪化することがある。
組換えヒトIL−10を用いる全身性治療は十分に効果的でなく、サイトカインの局所的送達に焦点を当てるべきであることが明白になってきている。この目標を達成するためのいくつかの方法がある:1)免疫細胞のIL−10遺伝子療法、2)遺伝子改変された非病原性IL−10発現細菌、及び3)サイトカインを標的にし、炎症組織においてサイトカインを蓄積するための抗体−IL−10融合タンパク質。
免疫細胞のIL−10遺伝子療法は、実験的大腸炎において効果を実証したが、臨床試験は、非致死性疾患についてのこのアプローチの安全性についての懸念により阻まれている(Braat, H.等, Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 725-731 (2003))。IL−10を発現するトランスジェニック細菌(ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis))は、代替の送達経路であり、クローン病における第I相試験の成績が発表され、粘膜区画への局所的送達による全身性副作用を回避し、生物学的に含有すべきであることが主張された(Braat, H.等, Gastroenterol. Hepatol. 4, 754-759 (2006); Steidler, L.等, Science 289, 1352-1355 (2000))。中度活動性潰瘍性大腸炎の患者におけるヒトIL−10を分泌する遺伝子改変ラクトコッカス・ラクチス(AG011、ActoGeniX)の安全性、寛容性、薬力学及び有効性を評価するための第IIa相無作為化プラセボコントロール二重盲検多施設用量漸増研究の寛容性は良好であり、安全であった。しかし、改変バロンスコア又はプラセボと比較したAG011を受けた患者における臨床症状により測定されるように、粘膜炎症の著しい改善はなかった(Vermeire, S.等, 2010年5月2日のNew OrleansでのDigestive Disease Week Annual Meetingで発表されたアブストラクト46)。
免疫サイトカインともよばれる抗体−サイトカイン融合タンパク質は、薬物送達及び薬物自体のフォーマットの点でいくつかの利点をもたらす。サイトカイン、例えばIL−10の局所送達は、適切な疾患マーカーに特異的な抗体又はその断片との融合により達成される。よって、全身性副作用を低減でき、炎症部位での化合物の局所的蓄積及び保持が達成できる。さらに、融合フォーマット及び用いる抗体又は抗体断片に依存して、血漿半減期、安定性及び発展性のような特性を改善できる。腫瘍学でのアプローチは既に確立されているが、炎症性障害及び自己免疫性を治療するために適合されたのはほんの最近のことであった。いくつかのサイトカイン(中でもIL−10)及び光増感剤を、フィブロネクチンのエクストラドメインBに特異的なscFv抗体断片との融合により、乾癬病巣を標的にさせた(Trachsel, E.等, J. Invest. Dermatol. 127(4), 881-886 (2007))。さらに、フィブロネクチンのエクストラドメインAに特異的な抗体断片(F8、DEKAVIL、Philogen SpA)−IL−10融合タンパク質が、確立されたコラーゲン誘導性関節炎(Trachsel, E.等, Arthritis Res. Ther. 9(1), R 9 (2007); Schwager, K.等, Arthritis Res. Ther. 11(5), R142 (2009))の進行を阻害するために前臨床的に用いられ、臨床試験に入った。最近では、同じF8−IL−10融合タンパク質が、同質遺伝子マウスモデルにおける子宮内膜症損傷を標的にするために用いられ、生理食塩水コントロール群と比較して損傷の平均サイズを低減した(Schwager, K.等, Hum. Reprod. 26(9), 2344-2352 (2011))。
本発明のIgG−IL−10融合タンパク質は、公知の抗体断片に基づく(例えばscFv、ダイアボディ、Fab)IL−10融合タンパク質に対して、改善された生産しやすさ、安定性、血清半減期及び驚くべきことに、標的抗原との結合による生物活性の著しい増加を含むいくつかの利点を有する。
一態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドのそれぞれは、IgGクラス抗体重鎖とIL−10単量体とを含む。より具体的な実施態様では、前記IL−10単量体は、そのN末端にて前記IgGクラス抗体重鎖のC末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドはそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、IL−10単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、IgGクラス抗体軽鎖を含む。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、IgGクラス抗体軽鎖から本質的になる。
いくつかの実施態様では、前記IL−10単量体は、天然IL−10単量体、特に天然ヒトIL−10単量体である。具体的な実施態様では、前記IL−10単量体は、配列番号1のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体は、機能的ホモ2量体IL−10分子を形成する。
他の実施態様では、前記IL−10単量体は、改変IL−10単量体、特に改変ヒトIL−10単量体である。一実施態様では、前記改変IL−10単量体は、pH7.0、37℃にて単量体形態で安定である。一実施態様では、前記改変IL−10単量体は、天然IL−10単量体と比較してpH7.0、37℃での安定性が改善されている。具体的な実施態様では、前記IL−10単量体は、配列番号5のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体は、互いにホモ2量体を形成しない。
一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、改変を有さない対応するIgGクラス抗体と比較して、Fc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む。具体的な実施態様では、前記Fc受容体は、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である。一実施態様では、前記Fc受容体は、活性化Fc受容体、特に活性化Fcγ受容体である。具体的な実施態様では、前記Fc受容体は、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)の群から選択される。さらにより具体的な実施態様では、前記Fc受容体は、FcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである。一実施態様では、前記改変は、IgGクラス抗体のエフェクター機能を低減する。具体的な実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。一実施態様では、前記改変は、前記IgGクラス抗体のFc領域中、特にCH2領域中にある。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖の329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、P329Gである。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖の234位及び235位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、L234A及びL235A(LALA)である。特定の実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含む。
一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、IgG1サブクラス抗体である。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、全長抗体である。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、ヒト抗体である。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と特異的に結合できる。具体的な実施態様では、融合タンパク質は、FAPと、表面プラズモン共鳴(SPR)により25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる。一実施態様では、前記FAPは、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPである。具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含む。別の特定の具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号37のHCDR1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51のLCDR1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号67のVHと、配列番号69のVLとを含む。
一実施態様では、融合タンパク質は、IL−10受容体−1(IL−10R1)と、SPRにより25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる。具体的な実施態様では、前記IL−10R1は、ヒトIL−10R1である。一実施態様では、IL−10R1との結合についての前記親和性定数(KD)は、SPRにより25℃にて測定した場合に、FAPとの結合についての前記親和性定数(KD)とほぼ等しいか又はそれより大きい。具体的な実施態様では、IL−10R1との結合についての前記KDは、FAPとの結合についての前記KDの約半分より大きい。
特定の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、融合タンパク質が、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含み、
(i)前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含むか、又は配列番号67の重鎖可変領域(VH)と、配列番号69の軽鎖可変領域(VL)とを含み、
(ii)前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含み、
(iii)前記IL−10分子が、配列番号1の配列を含み、
(iv)前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、前記IgGクラス抗体重鎖のC末端にN末端にてペプチドリンカーを介して融合したIL−10単量体とを含む、
融合タンパク質を提供する。
(i)前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含むか、又は配列番号67の重鎖可変領域(VH)と、配列番号69の軽鎖可変領域(VL)とを含み、
(ii)前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含み、
(iii)前記IL−10分子が、配列番号1の配列を含み、
(iv)前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、前記IgGクラス抗体重鎖のC末端にN末端にてペプチドリンカーを介して融合したIL−10単量体とを含む、
融合タンパク質を提供する。
別の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、融合タンパク質が、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含み、
(i)前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含むか、又は配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含み、
(ii)前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含み、
(iii)前記IL−10分子が、配列番号1の配列を含み、
(iv)前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、前記IgGクラス抗体重鎖のC末端にN末端にてペプチドリンカーを介して融合したIL−10単量体とを含む、
融合タンパク質を提供する。
(i)前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含むか、又は配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含み、
(ii)前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含み、
(iii)前記IL−10分子が、配列番号1の配列を含み、
(iv)前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、前記IgGクラス抗体重鎖のC末端にN末端にてペプチドリンカーを介して融合したIL−10単量体とを含む、
融合タンパク質を提供する。
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターがさらに提供される。別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、本発明の融合タンパク質を生成する方法であって、(i)本発明の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、(ii)融合タンパク質を回収する工程とを含む方法も提供する。前記方法により生成される、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質も提供される。
一態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物は、医薬として用いるため、及び炎症性疾患、具体的には炎症性腸疾患又は関節リウマチ、最も具体的には炎症性腸疾患の治療又は予防に用いるためにも提供される。治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための本発明の融合タンパク質の使用、及び個体における疾患を治療するための方法であって、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法も提供される。一実施態様では、前記疾患は、炎症性疾患である。より具体的な実施態様では、前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチである。さらにより具体的な実施態様では、前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一実施態様では、前記個体は、哺乳動物、特にヒトである。
定義
用語は、以下にそうでないと定義しない限り、当該技術において一般的に用いられる通りに本明細書において用いる。
用語は、以下にそうでないと定義しない限り、当該技術において一般的に用いられる通りに本明細書において用いる。
FAPと省略され、セプラーゼ(EC3.4.21)としても知られる「線維芽細胞活性化タンパク質」は、そうでないと示さない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及びげっ歯類(例えばマウス及びラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からの任意の天然FAPのことをいう。この用語は、「全長」のプロセシングされていないFAP及び細胞でのプロセシングにより得られる任意の形のFAPを包含する。この用語は、FAPの自然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPと特異的に結合できる。ヒトFAPのアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号Q12884(バージョン128)又はNCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2に示される。ヒトFAPの細胞外ドメイン(ECD)は、アミノ酸26位から760位までにわたる。Hisタグ付加ヒトFAP ECDのアミノ酸及びヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号81及び82に示す。マウスFAPのアミノ酸配列は、UniProt受託番号P97321(バージョン107)又はNCBI RefSeq NP_032012.1に示される。マウスFAPの細胞外ドメイン(ECD)は、アミノ酸26位から761位までにわたる。配列番号83及び84は、Hisタグ付加マウスFAP ECDのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。配列番号85及び86は、Hisタグ付加カニクイザルFAP ECDのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
「ヒトIL−10R1」により、UniProt受託番号Q13651(バージョン115)に記載されるタンパク質、特に全長配列のアミノ酸22位からアミノ酸235位までにわたる前記タンパク質の細胞外ドメインを意味する。配列番号87及び88は、ヒトFc領域に融合したヒトIL−10R1 ECDのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
本明細書で用いる場合、用語「融合タンパク質」は、抗体とIL−10分子とを含む融合ポリペプチド分子であって、融合タンパク質の成分が、互いにペプチド結合により、直接又はペプチドリンカーにより結合されているポリペプチド分子のことをいう。明確にするために、融合タンパク質の抗体成分の個別のペプチド鎖は、例えばジスルフィド結合により非共有的に結合されることがある。
「融合した」とは、ペプチド結合により、直接又は1若しくは複数のペプチドリンカーを介して結合された成分のことをいう。
「特異的に結合する」により、結合が抗原について選択的であり、望まないか又は非特異的な相互作用とは区別できることを意味する。抗体が特異的抗原と結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)又は当業者が熟知するその他の技術、例えば表面プラズモン共鳴(SPR)技術(BIAcore装置で分析される)(Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000))及び伝統的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))のいずれかにより測定できる。一実施態様では、無関係なタンパク質と抗体が結合する程度は、例えばSPRにより測定して、抗原との抗体の結合の約10%未満である。ある種の実施態様では、抗原と結合する抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM又は≦0.001nM(例えば10−8M以下、例えば10−8Mから10−13Mまで、例えば10−9Mから10−13Mまで)の解離定数(KD)を有する。
「親和性」又は「結合親和性」は、ある分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有的相互作用の総計の強さのことをいう。そうでないと示さない限り、本明細書で用いる場合、「結合親和性」は、結合対(例えば抗体と抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性のことをいう。分子Xの、そのパートナーYについての親和性は、解離速度定数と会合速度定数(それぞれkoff及びkon)との比である解離定数(KD)により一般的に表すことができる。よって、同等の親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含むことがある。親和性は、本明細書に記載するものを含む、当該技術において公知の一般的な方法により測定できる。親和性を測定するための方法は、特に、表面プラズモン共鳴(SPR)である。
「結合の低減」、例えばFc受容体との結合の低減は、例えばSPRにより測定して、それぞれの相互作用についての親和性の減少のことをいう。明確にするために、この用語は、ゼロ(又は分析法の検出限界未満)までの親和性の低減、すなわち相互作用の完全な廃止も含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用についての結合親和性の増加のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「単鎖」は、ペプチド結合により直鎖状に結合されたアミノ酸単量体を含む分子のことをいう。
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば2重特異性抗体)及び所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子のことをいう。抗体断片としては、例えば、それらに限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)及び単一ドメイン抗体が挙げられる。ある種の抗体断片のレビューのために、Hudson等、Nat Med 9、129−134(2003)を参照されたい。scFv断片のレビューのために、例えばThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenburg及びMoore編、Springer−Verlag、New York、p.269−315(1994)中のPluckthun、並びに国際公開第93/16185号、並びに米国特許5571894号及び5587458号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、in vivo半減期が増加したFab及びF(ab’)2断片の考察について、米国特許5869046号を参照されたい。ダイアボディは、2価又は2重特異性であり得る2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えばEP404097、国際公開第1993/01161号、Hudson等、Nat Med 9、129−134(2003)及びHollinger等、Proc Natl Acad Sci USA 90、6444−6448(1993)を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Hudson等、Nat Med 9、129−134(2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全体若しくは一部を含む抗体断片である。ある種の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.、Waltham、MA;例えば米国特許6248516B1号を参照されたい)。抗体断片は、それらに限定されないが、本明細書に記載するようなインタクトな抗体のタンパク質消化及び組換え宿主細胞(例えば大腸菌(E.coli)又はファージ)を含む様々な技術により作製できる。
用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「抗体全体」は、本明細書において交換可能に用いて、天然抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体のことをいう。
「天然抗体」は、変動する構造を有する自然に存在する免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然IgGクラス抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖(これらはジスルフィド結合されている)から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ4量体糖タンパク質である。N末端からC末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインともよばれる可変領域(VH)と、続いて、重鎖定常領域ともよばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)とを有する。同様に、N末端からC末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインともよばれる可変領域(VL)と、続いて、軽鎖定常領域ともよばれる軽鎖定常ドメイン(CL)とを有する。抗体の重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)又はμ(IgM)とよばれる5つのタイプの1つに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、サブタイプ、例えばγ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及びα2(IgA2)にさらに分けることができる。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)とよばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。
本明細書で用いる場合、「Fab断片」は、VLドメイン及び軽鎖の定常ドメイン(CL)を含む軽鎖断片と、VHドメインと、重鎖の第1定常ドメイン(CH1)とを含む抗体断片のことをいう。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラス、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμとよばれる。
「IgGクラス抗体」は、自然に存在する免疫グロブリンG(IgG)分子の構造を有する抗体のことをいう。IgGクラス抗体の抗体重鎖は、ドメイン構造VH−CH1−CH2−CH3を有する。IgGクラス抗体の抗体軽鎖は、ドメイン構造VL−CLを有する。IgGクラス抗体は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して結合された2つのFab断片とFcドメインとから本質的になる。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原との抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインのことをいう。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と3つの超可変領域(HVR)とを含む。例えばKindt等、Kuby Immunology、第6版、W.H.Freeman and Co.、p.91(2007)を参照されたい。単一VH又はVLドメインは、抗原結合特異性を与えるために十分であり得る。
用語「超可変領域」又は「HVR」は、本明細書で用いる場合、配列が超可変性でありかつ/又は構造が規定されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれのことをいう。一般的に、天然4本鎖抗体は、6つのHVR、VH中に3つ(H1、H2、H3)及びVL中に3つ(L1、L2、L3)を含む。HVRは、一般的に、超可変ループから及び/又は相補性決定領域(CDR)(後者は、配列可変性が最も高く、かつ/又は抗原認識に関与する)からのアミノ酸残基を含む。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3)にある(Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987))。例示的なCDR(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2及びCDR−H3)は、L1のアミノ酸残基24−34、L2の50−56、L3の89−97、H1の31−35B、H2の50−65及びH3の95−102にある(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。VH中のCDR1を除いて、CDRは、超可変ループを形成するアミノ酸残基を一般的に含む。CDRは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「SDR」も含む。SDRは、短縮CDR又はa−CDRとよばれるCDRの領域内に含まれる。例示的なa−CDR(a−CDR−L1、a−CDR−L2、a−CDR−L3、a−CDR−H1、a−CDR−H2及びa−CDR−H3)は、L1のアミノ酸残基31−34、L2の50−55、L3の89−96、H1の31−35B、H2の50−58及びH3の95−102にある(Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)を参照されたい)。そうでないと示さない限り、HVR残基及び可変ドメイン中のその他の残基(例えばFR残基)は、本明細書において、Kabat等、既出(「Kabat番号付け」という)に従って番号付けする。
「フレームワーク」又は「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、一般的に、4つのFRドメイン、FR1、FR2、FR3及びFR4からなる。したがって、HVR及びFR配列は、一般的に、VH(又はVL)において以下の配列で現れる:FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により生成されるか又はヒト抗体レパートリー若しくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のものに相当するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体についてのこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体のことをいい、すなわち該集団を含む個別の抗体が同一であり、かつ/又は同じエピトープと結合する(但し、例えば自然に生じる変異を含有するか又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、可能性のあるバリアント抗体を除く(このようなバリアントは、一般的に、少量で存在する))。異なる決定基(エピトープ)を指向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物中の各モノクローナル抗体は、抗原の単一決定基を指向する。よって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれの特定の方法により抗体の生成を必要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、それらに限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法(このような方法及びモノクローナル抗体を作製するためのその他の例示的な方法は、本明細書に記載する)を含む様々な技術により作製してよい。
用語「Fcドメイン」又は「Fc領域」は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する抗体重鎖のC末端領域を定義するために用いる。この用語は、天然配列Fc領域及びバリアントFc領域を含む。IgG Fc領域は、IgG CH2及びIgG CH3ドメインを含む。ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」は、通常、約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基までにわたる。一実施態様では、糖鎖がCH2ドメインと結合する。CH2ドメインは、本明細書において、天然配列CH2ドメイン又はバリアントCH2ドメインであってよい。「CH3ドメイン」は、Fc領域中のCH2ドメインに対してC末端の残基のひと続きを含む(すなわちIgGの約341位のアミノ酸残基から約447位のアミノ酸残基まで)。CH3領域は、本明細書において、天然配列CH3ドメイン又はバリアントCH3ドメイン(例えば一方の鎖中に「突出」(「ノブ」)が導入され、他方の鎖に対応する「腔」(「ホール」)が導入されたCH3ドメイン、米国特許5821333号(出典明示により明らかに本明細書に援用されている)を参照されたい)であってよい。このようなバリアントCH3ドメインを用いて、本明細書に記載するように、2つの非同一抗体重鎖のヘテロ2量体形成を促進できる。一実施態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226又はPro230から重鎖のカルボキシル末端までにわたる。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書においてそうでないと明記しない限り、Fc領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、1991に記載される、EUインデックスともよばれるEU番号付けシステムに従う。
用語「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に帰することができる生物活性のことをいい、これは抗体アイソタイプによって変動する。抗体エフェクター機能としては、例えばC1q結合及び補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞性食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)の下方制御並びにB細胞活性化が挙げられる。
「活性化Fc受容体」は、抗体のFc領域と係合した後に、受容体を持つ細胞を刺激してエフェクター機能を実行させるシグナル伝達事象を引き出すFc受容体である。活性化Fc受容体は、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)を含む。特に、活性化Fc受容体は、ヒトFcγRIIIaである(UniProt受託番号P08637(バージョン141)を参照されたい)。
「野生型IL−10」ともよばれる「天然IL−10」は、自然に存在するIL−10を意味し、これは、自然に存在するIL−10から例えば安定性のような1又は複数の特性を変更するように改変された「改変IL−10」に対向する。改変IL−10分子は、例えば、アミノ酸配列中の改変、例えばアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むことがある。単量体形態で安定性が増加した特定の改変IL−10分子は、Josephson等(J Biol Chem 275, 13552-13557 (2000))により記載されている。
天然IL−10は、2つのαヘリックス単量体ドメインから構成されるホモ2量体である。天然ヒトIL−10単量体ドメインの配列を配列番号1に示す。よって、「IL−10単量体」は、天然IL−10の単量体ドメインと実質的に類似の配列及び/又は構造を有するタンパク質である。
タンパク質に関して用いる場合の「安定な」又は「安定性」は、タンパク質の構造完全性(例えばその2次構造)が保護されることを意味する。
タンパク質に関して用いる場合の「機能的」は、生物学的機能、特に天然に存在する対応するタンパク質(例えば天然IL−10)が媒介する生物学的機能をタンパク質が媒介できることを意味する。IL−10の場合、生物学的機能は、IL−10受容体シグナル伝達の活性化、TNFα、IL−1、IL−6、IL−12、IL−2及び/又はIFNγのような炎症誘発性サイトカインの分泌の抑制、MHCII発現の阻害並びにIL−10受容体を発現する細胞(例えば単球)でのCD80及び/又はCD86のような同時刺激分子の上方制御を含むことがある。
用語「ペプチドリンカー」は、1又は複数のアミノ酸、典型的に約2−20のアミノ酸を含むペプチドのことをいう。ペプチドリンカーは、当該技術において公知であるか、又は本明細書に記載する。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、(G4S)n、(SG4)n又はG4(SG4)nペプチドリンカーを含む。「n」は、一般的に1から10の間、典型的に2から4の間の数である。
「ノブ−イントゥ−ホール改変」は、CH3ドメイン中の2つの抗体重鎖間の界面での改変であって、i)一方の重鎖のCH3ドメイン中で、アミノ酸残基が、側鎖容積がより大きいアミノ酸残基で置き換えられることにより、他方の重鎖のCH3ドメイン中の界面内の腔(「ホール」)に置くことができる突出(「ノブ」)を一方の重鎖のCH3ドメイン中の界面内で作り出し、ii)他方の重鎖のCH3ドメイン中で、アミノ酸残基が、側鎖容積がより小さいアミノ酸残基で置き換えられることにより、第1のCH3ドメイン中の界面内の突出(「ノブ」)が置くことができる腔(「ホール」)を第2のCH3ドメイン中の界面内で作り出す改変のことをいう。一実施態様では、「ノブ−イントゥ−ホール改変」は、一方の抗体重鎖中のアミノ酸置換T366W及び任意選択的にアミノ酸置換S354Cと、他方の抗体重鎖中のアミノ酸置換T366S、L368A、Y407V及び任意選択的にY349Cとを含む。ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば米国特許5731168号、米国特許7695936号、Ridgway等、Prot Eng 9、617−621(1996)及びCarter、J Immunol Meth 248、7−15(2001)に記載されている。一般的に、この方法は、第1のポリペプチドの界面にて突出(「ノブ」)及び第2のポリペプチドの界面中に対応する腔(「ホール」)を導入して、ヘテロ2量体形成を促進し、ホモ2量体形成を妨げるべく突出が腔の中に置くことができるようにすることを含む。突出は、第1のポリペプチドの界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)で置き換えることにより構築される。突出と同一又は類似のサイズの相補的な腔は、第2のポリペプチドの界面中に、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(例えばアラニン又はトレオニン)で置き換えることにより創出される。それぞれS354位及びY349位に2つのシステイン残基を導入することにより、Fc領域中の2つの抗体重鎖間にジスルフィドブリッジが形成され、2量体がさらに安定化される(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
アミノ酸「置換」は、ポリペプチド中のあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることをいう。一実施態様では、アミノ酸は、類似の構造及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えられ、例えば保存的アミノ酸の置き換えである。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み、極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み、正電荷(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含み、負電荷(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。例えば、アミノ酸置換は、結果として、あるアミノ酸を、異なる構造及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばある群(例えば極性)からのアミノ酸を、異なる群(例えば塩基性)からの別のアミノ酸で置き換えることとなり得る。アミノ酸置換は、当該技術において周知の遺伝子的又は化学的方法を用いて作り出すことができる。遺伝子的方法は、部位特異的突然変異誘発、PCR、遺伝子合成などを含むことがある。化学的改変のような遺伝子工学以外の方法によりアミノ酸の側鎖群を変更する方法も有用であると期待できる。同じアミノ酸置換を示すために、様々な表記を本明細書において用いることがある。例えば、抗体重鎖の329位のプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329G又はPro329Glyと示すことができる。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と考えずに、配列を整列させて最大の配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義する。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当該技術における熟練の範囲内である様々な手段で、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアのような公共で利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成できる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大限の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含んで、配列を整列させるための適当なパラメータを決定できる。本明細書における目的のために、しかし、%アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて作り出される。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.により著され、ソースコードは、米国著作権局、Washington D.C.、20559においてユーザ文書とともにファイルされ、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムは、Genentech,Inc.、South San Francisco、Californiaから公共で入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルしてよい。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで用いるためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはALIGN−2プログラムにより設定され、変動しない。ALIGN−2をアミノ酸配列比較のために用いる場合、ある与えられたアミノ酸配列Bに対する(to/with/against)ある与えられたアミノ酸配列Aの%アミノ酸配列同一性(これは、代わりに、ある与えられたアミノ酸配列Bに対して(to/with/against)ある%アミノ酸配列同一性を有するか又は含む、ある与えられたアミノ酸配列Aということができる)は、以下のようにして算出する:
分数X/Yの100倍
(式中、Xは、AとBのプログラムの整列における配列整列プログラムALIGN−2により同一マッチとして得点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識される。特にそうでないと述べない限り、本明細書で用いる全ての%アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前の段落において記載するようにして得られる。
分数X/Yの100倍
(式中、Xは、AとBのプログラムの整列における配列整列プログラムALIGN−2により同一マッチとして得点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識される。特にそうでないと述べない限り、本明細書で用いる全ての%アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前の段落において記載するようにして得られる。
本明細書において交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、DNA及びRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチド若しくは塩基及び/又はそれらの類似体、あるいはDNA若しくはRNAポリメラーゼにより又は合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドのような改変ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションのような合成後に作製される改変を含んでよい。
用語「改変」は、ペプチド骨格(例えばアミノ酸配列)の任意の操作又はポリペプチドの翻訳後改変(例えば糖鎖付加)のことをいう。
用語「ベクター」は、本明細書で用いる場合、結合された別の核酸を伝播できる核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及びベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を駆動できる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」という。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、交換可能に用いられ、外因性核酸が導入された細胞(このような細胞の子孫を含む)のことをいう。宿主細胞は、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫(継代の数に関係なく)を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてよいが、変異を含んでよい。元来の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が、本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の融合タンパク質を作り出すために用いることができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞は、少しだけ挙げれば、培養細胞、例えばCHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞又はハイブリドーマ細胞のような哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞、それにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内に含まれる細胞も含む。
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織において生理的変化をもたらすために必要な量のことをいう。
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療有効量」は、必要な投与量及び期間について、所望の治療的又は予防的結果を達成するために有効な量のことをいう。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の有害な効果を防止するか、減少させるか、遅延させるか、最小限にするか又は妨げる。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物は、それらに限定されないが、飼い馴らされた動物(例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類(例えばヒト及びサルのような非ヒト霊長類)、ウサギ及びげっ歯類(例えばマウス及びラット)を含む。特に、個体又は対象は、ヒトである。
用語「薬学的組成物」は、組成物に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性がある付加的成分を含有しない調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の薬学的組成物中の対象にとって毒性でない成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、それらに限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤又は保存剤を含む。
本明細書で用いる場合、「治療」(及び「治療する」又は「治療し」のような文法的変形を含む)は、治療される個体における疾患の自然な経過を変更しようとする試みにおける臨床的介入のことをいい、予防のため又は臨床病理の経過中のいずれかで行うことができる。治療の所望の効果は、それらに限定されないが、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の低減、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少すること、疾患状態の緩和又は一時的軽減、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発展を遅らせるため又は疾患の進行を遅くするために用いられる。
本発明の融合タンパク質
本発明は、生産しやすさ、安定性、結合親和性及び生物活性のような特に有利な特性を有する新規な抗体−IL−10融合タンパク質を提供する。
本発明は、生産しやすさ、安定性、結合親和性及び生物活性のような特に有利な特性を有する新規な抗体−IL−10融合タンパク質を提供する。
第1の態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドのそれぞれは、IgGクラス抗体重鎖とIL−10単量体とを含む。より具体的な実施態様では、前記IL−10単量体は、そのN末端にて前記IgGクラス抗体重鎖のC末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドはそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、IL−10単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、IgGクラス抗体軽鎖を含む。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、IgGクラス抗体軽鎖から本質的になる。抗体断片に基づく融合タンパク質と比較して、IgGクラス抗体の存在により、本発明の融合タンパク質は、長期の血清半減期(FcRnとの結合による再生利用と、腎臓ろ過についての閾値を優に上回る分子サイズのため)を含む好ましい薬物動態特性を得る。IgGクラス抗体の存在により、例えばプロテインA親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単純な精製も可能になる。驚くべきことに、本発明のIgGに基づくIgG−IL−10融合タンパク質とFab断片に基づく対応する融合タンパク質(Fab−IL−10)とを比較する実施例において示すように、IgGクラス抗体の存在により、標的抗原と結合した場合の融合タンパク質の生物活性も改善される。同一の重鎖(及び軽鎖)ポリペプチドを用いることにより、不要な副生成物の形成を回避し、ノブ−イントゥ−ホール改変のような非同一重鎖のヘテロ2量体形成を促進する改変の必要性をなくして、融合タンパク質の単純な生成が可能になる。
いくつかの実施態様では、前記IL−10単量体は、天然IL−10単量体、特に天然ヒトIL−10単量体である。具体的な実施態様では、前記IL−10単量体は、配列番号1のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体は、機能的ホモ2量体IL−10分子を形成する。この融合タンパク質フォーマットは、2つのIL−10単量体が完全に機能的で生物活性があるIL−10 2量体を形成するので特に有利である。さらに、抗体断片に基づく融合タンパク質とは対照的に、本発明の融合タンパク質では、2量体形成はIL−10単量体間で生じるだけでなく、単量体が融合している抗体重鎖間でも生じる。よって、例えば本明細書に記載するFab−IL−10融合タンパク質と比較して、本発明の融合タンパク質に含まれるIL−10 2量体が2つの単量体に解体される傾向が低減される(図16を参照されたい)。重要なことに、この融合タンパク質フォーマットは、生物活性の点でも本明細書に記載する他の融合タンパク質フォーマットよりも優れている。
他の実施態様では、前記IL−10単量体は、改変IL−10単量体、特に改変ヒトIL−10単量体である。一実施態様では、前記改変IL−10単量体は、pH7.0、37℃にて単量体形態で安定である。一実施態様では、前記改変IL−10単量体は、天然IL−10単量体と比較してpH7.0、37℃での安定性が改善されている。適切な改変IL−10単量体は、Josephson等、J Biol Chem 275、13552−13557(2000)に記載され、この文献は、IL−10単量体の安定性を測定する方法についても記載している。具体的な実施態様では、前記IL−10単量体は、配列番号5のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体は、互いにホモ2量体を形成しない。この融合タンパク質フォーマットは、IL−10 2量体ではなく、2つの別々の改変IL−10単量体を含む。実施例に示すように、この融合タンパク質フォーマットは、IL−10 2量体を含む融合タンパク質と同様のIL−10受容体1との結合親和性(アビディティー)を有する。さらに、これは、発現収率が高く、凝集傾向がほとんどなくて特に良好な生産しやすさを有する。
一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、IgG1サブクラス抗体である。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、ヒト抗体であり、すなわちこれはヒト可変及び定常領域を含む。ヒトIgG1重鎖及び軽鎖の定常領域の例示的な配列をそれぞれ配列番号79及び80に示す。一実施態様では、IgGクラス抗体は、ヒトFc領域、特にヒトIgG Fc領域、より特にはヒトIgG1 Fc領域を含む。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、全長抗体である。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、モノクローナル抗体である。
IgGクラス抗体のFcドメインは、標的組織における良好な蓄積と好ましい組織−血液分配比に貢献する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性を融合タンパク質に与えるが、これは、同時に、好ましい抗原を持つ細胞ではなくFc受容体を発現する細胞を不要に標的にするように融合タンパク質を導くことがある。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路の活性化は、サイトカイン放出を導くことがあり、これは、(炎症誘発性)サイトカイン受容体の活性化と全身投与による重度の副作用とをもたらす。よって、一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、改変を有さない対応するIgGクラス抗体と比較してFc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む。具体的な実施態様では、前記Fc受容体は、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である。Fc受容体との結合親和性は、例えばELISA、又はBIAcore装置(GE Healthcare)のような標準的な装置及び組換え発現により得ることができるようなFc受容体を用いる表面プラズモン共鳴(SPR)により容易に決定できる。結合親和性を測定するための具体的で例示的な実施態様を、以下に記載する。一実施態様によると、Fc受容体との結合親和性は、BIACORE(登録商標)T100機器(GE Healthcare)を25℃にて、CM5チップに固定化されたリガンド(Fc受容体)とともに用いる表面プラズモン共鳴により測定する。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ(CM5、GE Healthcare)を、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で、供給業者の使用説明に従って活性化する。組換えリガンドを、10mM酢酸ナトリウム、pH5.5で0.5−30μg/mlに希釈した後に、10μl/minの流速で注入して、およそ100−5000応答単位(RU)の結合タンパク質を達成する。リガンドの注入に続いて、1Mエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。速度論的測定のために、抗体の3倍から5倍の系列希釈(〜0.01nMから300nMの間の範囲)をHBS−EP+(GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%サーファクタントP20、pH7.4)に、25℃にておよそ30−50μl/minの流速で注入する。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)T100評価ソフトウェアバージョン1.1.1)を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として算出される。例えばChen等、J Mol Biol 293、865−881(1999)を参照されたい。代わりに、Fc受容体との結合親和性抗体は、FcγIIIa受容体を発現するNK細胞のような特定のFc受容体を発現することがわかっている細胞株を用いて評価してよい。
一実施態様では、改変は、Fc受容体との抗体の結合親和性を低減する1又は複数のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。典型的に、同じ1又は複数のアミノ酸変異が、2つの抗体重鎖のそれぞれに存在する。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、Fc受容体との抗体の結合親和性を、少なくとも2倍、少なくとも5倍又は少なくとも10倍低減する。Fc受容体との抗体の結合親和性を低減するアミノ酸変異が1つより多く存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせが、Fc受容体との抗体の結合親和性を、少なくとも10倍、少なくとも20倍又は少なくとも50倍にさえ低減する。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、改変を有さない対応するIgGクラス抗体と比較して、Fc受容体との結合親和性の20%未満、特に10%未満、より特には5%未満を示す。
一実施態様では、前記Fc受容体は、活性化Fc受容体である。具体的な実施態様では、前記Fc受容体は、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)の群から選択される。具体的な実施態様では、Fc受容体は、Fcγ受容体、より具体的にはFcγRIIIa、FcγRI又はFcγRIIa受容体である。好ましくは、これらの受容体それぞれとの結合親和性は、低下している。さらにより具体的な実施態様では、前記Fc受容体は、FcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである。いくつかの実施態様では、補体成分との結合親和性、特にC1qとの結合親和性も、低下している。一実施態様では、胎児性Fc受容体(FcRn)との結合親和性は、低下しない。実質的に同様のFcRnとの結合、すなわち前記受容体との抗体の結合親和性の保存は、FcRnとの未改変形の抗体の結合親和性の約70%より大きい親和性を抗体が示す場合に達成される。本発明の融合タンパク質に含まれるIgGクラス抗体は、このような親和性の約80%より大きく、約90%より大きい親和性さえ示すことがある。
一実施態様では、Fc受容体との抗体の結合親和性を低減する前記改変は、IgGクラス抗体のFc領域、特にCH2領域中にある。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖の329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、P329A又はP329G、特にP329Gである。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖の234位及び235位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、L234A及びL235A(LALA)である。一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖の329位(EU番号付け)にアミノ酸置換と、抗体重鎖の228位、233位、234位、235位、297位及び331位から選択される位置にさらなるアミノ酸置換とを含む。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D又はP331Sである。特定の実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖のP329位、L234位及びL235位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、前記IgGクラス抗体は、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(LALA P329G)を含む。このアミノ酸置換の組み合わせは、PCT国際公開第2012/130831号(その全体が出典明示により本明細書に援用されている)に記載されるように、ヒトIgGクラス抗体のFcγ受容体結合を特に効率的にほぼ廃止する。PCT国際公開第2012/130831号は、このような改変抗体を調製する方法及びFc受容体結合又はエフェクター機能のようなその特性を決定するための方法についても記載している。
抗体重鎖中に改変を含む抗体は、当該技術において周知の遺伝子的又は化学的方法を用いてアミノ酸欠失、置換、挿入又は改変により調製できる。遺伝子的方法は、コードDNA配列の部位特異的突然変異誘発、PCR、遺伝子合成などを含み得る。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定により確かめることができる。
Fc受容体結合を低減する改変を含む抗体は、一般的に、対応する未改変抗体と比較してエフェクター機能が低下し、特にADCCが低下している。よって、一実施態様では、Fc受容体とのIgGクラス抗体の結合親和性を低減する前記改変は、IgGクラス抗体のエフェクター機能を低減する。具体的な実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。一実施態様では、ADCCは、前記改変を有さない対応するIgGクラス抗体により誘導されるADCCの20%未満に低下する。抗体のエフェクター機能は、当該技術において公知の方法により測定できる。対象の分子のADCC活性を査定するためのin vitroアッセイの例は、米国特許5500362号、Hellstrom等Proc Natl Acad Sci USA 83、7059−7063(1986)及びHellstrom等、Proc Natl Acad Sci USA 82、1499−1502(1985)、米国特許5821337号、Bruggemann等、J Exp Med 166、1351−1361(1987)に記載されている。代わりに、非放射活性アッセイ法を用いてよい(例えばフローサイトメトリーのためのACTI(商標)非放射活性細胞傷害アッセイ(CellTechnology,Inc. Mountain View、CA)及びCytoTox 96(登録商標)非放射活性細胞傷害アッセイ(Promega、Madison、WI)を参照されたい)。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞を含む。代わりに又はさらに、対象の分子のADCC活性は、in vivoで、例えばClynes等、Proc Natl Acad Sci USA 95、652−656(1998)に開示されるような動物モデルにおいて査定してもよい。いくつかの実施態様では、補体成分、特にC1qとのIgGクラス抗体の結合も低下する。したがって、補体依存性細胞傷害(CDC)も低下することがある。C1q結合アッセイを行って、抗体がC1qと結合できるか、よってCDC活性を有するかを決定してよい。例えば国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号におけるC1q及びC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を査定するために、CDCアッセイを実行してよい(例えばGazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003);並びにCragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい)。
上記及びPCT国際公開第2012/130831号に記載されるIgGクラス抗体に加えて、Fc受容体結合及び/又はエフェクター機能が低下した抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327及び329の1又は複数の置換を有するものも含む(米国特許6737056号)。このようなFc変異体は、残基265及び297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc変異体を含んで、アミノ酸265位、269位、270位、297位及び327位の2つ以上にて置換を有するFc変異体を含む(米国特許7332581号)。
IgG4サブクラス抗体は、IgG1抗体と比較して、Fc受容体との結合親和性が低下し、エフェクター機能が低下している。よって、いくつかの実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる前記IgGクラス抗体は、IgG4サブクラス抗体、特にヒトIgG4サブクラス抗体である。一実施態様では、前記IgG4サブクラス抗体は、S228位にてFc領域中にアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換S228Pを含む。Fc受容体との結合親和性及び/又はエフェクター機能をさらに低減するために、一実施態様では、前記IgG4サブクラス抗体は、L235位にてアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換L235Eを含む。別の実施態様では、前記IgG4サブクラス抗体は、P329位にてアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換P329Gを含む。特定の実施態様では、前記IgG4サブクラス抗体は、S228位、L235位及びP329位にてアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換S228P、L235E及びP329Gを含む。このような改変IgG4サブクラス抗体及びそれらのFcγ受容体結合特性は、PCT国際公開第2012/130831号(その全体が出典明示により本明細書に援用されている)に記載されている。
本発明の抗体は、例えば治療用の特に有利ないくつかの特性を併せ持っている。
一実施態様では、前記IgGクラス抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と特異的に結合できる。FAPは、本発明の融合タンパク質を用いる炎症性疾患の治療のための適切な標的として同定されている。具体的な実施態様では、融合タンパク質は、FAPと、表面プラズモン共鳴(SPR)により25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる。SPRによりFAPとの結合親和性を測定するための方法は、本明細書に記載する。一実施態様では、融合タンパク質の親和性(KD)は、ProteOn XPR36装置(Biorad)を25℃にて、GLMチップと共有結合した抗His抗体により固定化されたHisタグ付加FAP抗原とともに用いてSPRにより測定する。例示的な方法では、標的タンパク質(FAP)を、そのH6タグを介して、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(sNHS)との新しく調製した混合物を用いて全てのチャネルを5分間同時に活性化し、その後に、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5中の15μg/ml抗ペンタHis IgG(Qiagen#34660、マウスモノクローナル抗体)を180秒間注入することにより、GLMチップの別々の垂直チャネルに30μl/minにて高レベル(〜5.000RUまで)で固定化された、共有的に固定化された抗ペンタHis IgGにより捕捉する。チャネルを、エタノールアミンを5分間注入することによりブロックする。His6タグ付加FAPを、垂直チャネルに沿って60秒間、30μl/minでランニング緩衝液中の5μg/mlの希釈物から捕捉し、〜250から600RUの間のリガンド密度を達成する。ワンショットカイネティックアッセイの構成(OSK)では、融合タンパク質を分析物として、水平チャネルに沿って、50から0.08nMまでの系列5倍希釈で、100μl/minにて注入する。会合段階は180秒間、解離段階は600秒間記録する。非常に遅いオフレートを示す相互作用の場合、オフレートの記録は、複合体の解離を観察するために1800秒まで延長する。ランニング緩衝液(PBST)を第6のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとする。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(ProteOnマネージャソフトウェアバージョン2.1)を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として算出する。
一実施態様では、前記FAPは、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPである。好ましくは、本発明の融合タンパク質に含まれるIgGクラス抗体は、ヒト並びにカニクイザル及び/又はマウスFAPと交差反応性であり、このことにより、例えばヒトでの使用の前にカニクイザル及び/又はマウスでin vivo研究ができる。
具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含む。別の特定の具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号37のHCDR1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51のLCDR1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号67のVHと、配列番号69のVLとを含む。実施例に示すように、これらの抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルFAPとの特に強い結合親和性/アビディティーを示す。
さらに具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号39のHCDR1と、配列番号45のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号71のVHと配列番号73のVLとを含む。別の具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号37のHCDR1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51のLCDR1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記IgGクラス抗体は、配列番号75のVHと、配列番号77のVLとを含む。
一実施態様では、融合タンパク質は、IL−10受容体−1(IL−10R1)と、SPRにより25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる。SPRによりIL−10R1との結合親和性を測定するための方法は、本明細書に記載する。一実施態様では、融合タンパク質の親和性(KD)は、ProteOn XPR36装置(Biorad)を25℃にて、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップに固定化したビオチン化IL−10R1とともに用いてSPRにより測定する。例示的な方法では、400から1600RUの間のIL−10R1が、垂直チャネルに沿って10μg/mlの濃度及び30μl/secの流速にて様々な接触時間でニュートラアビジン誘導体化チップマトリクスに捕捉される。ビオチン化IL10R1との結合は、6つの異なる分析物濃度(50、10、2、0.4、0.08、0nM)にて、水平方向への100μl/minでの注入により測定し、会合速度を180秒間、解離速度を600秒間記録する。ランニング緩衝液(PBST)は、第6のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとする。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(ProteOnマネージャソフトウェアバージョン2.1)を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として算出する。
具体的な実施態様では、前記IL−10R1は、ヒトIL−10R1である。一実施態様では、IL−10R1との結合についての前記親和性定数(KD)は、SPRにより25℃にて測定した場合に、FAPとの結合についての前記親和性定数(KD)とほぼ等しいか又はそれより大きい。具体的な実施態様では、IL−10R1との結合についての前記KDは、FAPとの結合についての前記KDの約半分より大きい。本発明の融合タンパク質のFAP及びIL−10R1との結合についてのKDの値の特定の比により、FAP発現組織へのIL−10の効率的な標的化のためにそれらが特に最適になる。理論に結び付けられることを望まないが、本発明の融合タンパク質は、FAPとの結合親和性がIL−10R1との結合親和性と少なくとも同等に高いので、FAP発現標的組織に到達する前に標的組織以外(例えば循環内)でIL−10R1発現細胞と結合する可能性が少ない。
特定の態様では、本発明は、FAPと特異的に結合でき、改変を有さない対応するヒトIgG1サブクラス抗体と比較してFc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含むヒトIgG1サブクラス抗体と、IL−10分子との融合タンパク質であって、
2つの同一の重鎖ポリペプチド(それぞれが、ヒトIgG1サブクラス抗体重鎖のC末端にN末端にて融合した天然IL−10単量体を含む)と2つの同一の軽鎖とを含む
融合タンパク質を提供する。
2つの同一の重鎖ポリペプチド(それぞれが、ヒトIgG1サブクラス抗体重鎖のC末端にN末端にて融合した天然IL−10単量体を含む)と2つの同一の軽鎖とを含む
融合タンパク質を提供する。
具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号9のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号7のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。別の具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号27のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号25のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。
さらなる態様では、本発明は、FAPと特異的に結合でき、改変を有さない対応するヒトIgG1サブクラス抗体と比較してFc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含むヒトIgG1サブクラス抗体と、IL−10分子との融合タンパク質であって、
2つの同一の重鎖ポリペプチド(それぞれが、ヒトIgG1サブクラス抗体重鎖のC末端にN末端にて融合した改変IL−10単量体を含む)と2つの同一の軽鎖とを含む
融合タンパク質を提供する。
2つの同一の重鎖ポリペプチド(それぞれが、ヒトIgG1サブクラス抗体重鎖のC末端にN末端にて融合した改変IL−10単量体を含む)と2つの同一の軽鎖とを含む
融合タンパク質を提供する。
具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号17のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号7のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。別の具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号29のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号25のポリペプチドと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載する融合体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載する融合体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号2、6、8、10、18、26、28、30、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78及び89に示す配列(その機能的断片又はバリアントを含む)と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるものを含む。
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数(例えば2以上)のポリヌクレオチドとして発現できる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又はその他の手段により会合して、機能的融合タンパク質を形成してよい。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによりコードされてよい。同時発現される場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、抗体を形成する。
一実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号63、65、67、69、71、73、75又は77に示す可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号7、9、17、25、27又は29に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号2、6、8、10、18、26、28、30、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78又は89に示す核酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含むポリヌクレオチドにさらに向けられる。別の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号2、6、8、10、18、26、28、30、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78又は89に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号63、65、67、69、71、73、75又は77のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号7、9、17、25、27又は29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する配列番号63、65、67、69、71、73、75又は77の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する配列番号7、9、17、25、27又は29のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドも包含する。
ある種の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、DNAである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)の形のRNAである。本発明のRNAは、1本鎖又は2本鎖であってよい。
組換え方法
本発明の融合タンパク質は、例えば、固体状態のペプチド合成(例えばメリフィールド固相合成)又は組換え生成により得ることができる。組換え生成のために、例えば上記のような融合タンパク質(断片)をコードする1又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞でのさらなるクローニング及び/又は発現のための1又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定できる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの1又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、融合タンパク質(断片)のコード配列を適当な転写/翻訳コントロールシグナルとともに含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo組換え/遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis等、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);及びAusubel等、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であってよい。発現ベクターは、融合タンパク質(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわちコード領域)がプロモーター及び/又はその他の転写若しくは翻訳コントロールエレメントと作動可能に会合してクローニングされた発現カセットを含む。本明細書で用いる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」(TAG、TGA又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばコード領域の一部と考えることができるが、いずれのフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などは、コード領域の一部でない。2以上のコード領域は、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば単一ベクター、又は別々のポリヌクレオチド構築物中、例えば別々の(異なる)ベクターに存在できる。さらに、いずれのベクターも、単一コード領域を含有するか、又は2以上のコード領域を含んでよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質切断により最終タンパク質に翻訳後又は翻訳と同時に分けられる1又は複数のポリペプチドをコードしてよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の融合タンパク質(断片)又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか又は融合していない異種コード領域をコードしてよい。異種コード領域は、限定することなく、分泌シグナルペプチド又は異種機能的ドメインのような専門のエレメント又はモチーフを含む。作動可能な会合は、遺伝子生成物、例えばポリペプチドのコード領域が、1又は複数の調節配列と、遺伝子生成物の発現が調節配列の影響又はコントロールの下にあるように結合している場合である。2つのDNA断片(例えばポリペプチドコード領域とそれと会合するプロモーター)は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子生成物をコードするmRNAの転写をもたらし、2つのDNA断片の間の連結の性質が遺伝子生成物の発現を駆動する発現調節配列の能力に干渉せず、転写されるDNA鋳型の能力に干渉しないならば、「作動可能に会合」している。よって、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターが核酸の転写をもたらすことができたならば、作動可能に会合している可能性がある。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を駆動できる細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーター以外のその他の転写コントロールエレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を駆動するようにポリヌクレオチドと作動可能に会合できる。適切なプロモーター及びその他の転写コントロール領域は、本明細書に開示する。様々な転写コントロール領域が当業者に公知である。これらは、限定することなく、それらに限定されないが、サイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロンAと連携する最初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルス)のような脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域を含む。その他の転写コントロール領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa−グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、並びに真核生物細胞において遺伝子発現をコントロールできるその他の配列を含む。さらなる適切な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(テトラサイクリンを誘導できるプロモーター(promoters inducible tetracyclins))を含む。同様に、様々な翻訳コントロールエレメントが当業者に公知である。これらは、それらに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント(特に配列内リボソーム進入部位又はIRES、CITE配列ともよばれる)を含む。発現カセットは、複製起源、及び/又はレトロウイルス末端反復配列(LTR)若しくはアデノ随伴ウイルス(AAV)末端逆位配列(ITR)のような染色体組み込みエレメントのようなその他の特長も含んでよい。
本発明の融合タンパク質は、例えば、固体状態のペプチド合成(例えばメリフィールド固相合成)又は組換え生成により得ることができる。組換え生成のために、例えば上記のような融合タンパク質(断片)をコードする1又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞でのさらなるクローニング及び/又は発現のための1又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定できる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの1又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、融合タンパク質(断片)のコード配列を適当な転写/翻訳コントロールシグナルとともに含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo組換え/遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis等、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);及びAusubel等、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であってよい。発現ベクターは、融合タンパク質(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわちコード領域)がプロモーター及び/又はその他の転写若しくは翻訳コントロールエレメントと作動可能に会合してクローニングされた発現カセットを含む。本明細書で用いる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」(TAG、TGA又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばコード領域の一部と考えることができるが、いずれのフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などは、コード領域の一部でない。2以上のコード領域は、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば単一ベクター、又は別々のポリヌクレオチド構築物中、例えば別々の(異なる)ベクターに存在できる。さらに、いずれのベクターも、単一コード領域を含有するか、又は2以上のコード領域を含んでよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質切断により最終タンパク質に翻訳後又は翻訳と同時に分けられる1又は複数のポリペプチドをコードしてよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の融合タンパク質(断片)又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか又は融合していない異種コード領域をコードしてよい。異種コード領域は、限定することなく、分泌シグナルペプチド又は異種機能的ドメインのような専門のエレメント又はモチーフを含む。作動可能な会合は、遺伝子生成物、例えばポリペプチドのコード領域が、1又は複数の調節配列と、遺伝子生成物の発現が調節配列の影響又はコントロールの下にあるように結合している場合である。2つのDNA断片(例えばポリペプチドコード領域とそれと会合するプロモーター)は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子生成物をコードするmRNAの転写をもたらし、2つのDNA断片の間の連結の性質が遺伝子生成物の発現を駆動する発現調節配列の能力に干渉せず、転写されるDNA鋳型の能力に干渉しないならば、「作動可能に会合」している。よって、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターが核酸の転写をもたらすことができたならば、作動可能に会合している可能性がある。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を駆動できる細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーター以外のその他の転写コントロールエレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を駆動するようにポリヌクレオチドと作動可能に会合できる。適切なプロモーター及びその他の転写コントロール領域は、本明細書に開示する。様々な転写コントロール領域が当業者に公知である。これらは、限定することなく、それらに限定されないが、サイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロンAと連携する最初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルス)のような脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域を含む。その他の転写コントロール領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa−グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、並びに真核生物細胞において遺伝子発現をコントロールできるその他の配列を含む。さらなる適切な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(テトラサイクリンを誘導できるプロモーター(promoters inducible tetracyclins))を含む。同様に、様々な翻訳コントロールエレメントが当業者に公知である。これらは、それらに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント(特に配列内リボソーム進入部位又はIRES、CITE配列ともよばれる)を含む。発現カセットは、複製起源、及び/又はレトロウイルス末端反復配列(LTR)若しくはアデノ随伴ウイルス(AAV)末端逆位配列(ITR)のような染色体組み込みエレメントのようなその他の特長も含んでよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を駆動する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合してよい。例えば、融合体の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするDNAを、本発明の融合タンパク質をコードする核酸又はその断片の上流に置くことができる。シグナル仮説に従って、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、成長するタンパク質鎖が粗面小胞体を横切って一旦運び出され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有することを承知しており、これは、翻訳されたポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌又は「成熟」形を生成する。ある種の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド、又は作動可能に会合したポリペプチドの分泌を駆動する能力を保持するその配列の機能的誘導体を用いる。代わりに、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体を用いてよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター(TPA)又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してよい。例示的な分泌シグナルペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号35及び36に示す。
後工程での精製を容易にする(例えばヒスチジンタグ)か又は融合タンパク質の標識化を支援するために用いることができる短いタンパク質配列をコードするDNAを、融合タンパク質(断片)をコードするポリヌクレオチド内又はその端に含めてよい。
さらなる実施態様では、本発明の1又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある種の実施態様では、本発明の1又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関して本明細書に記載する任意の特長を、単独又は組み合わせで組み込むことができる。このような一実施態様では、宿主細胞は、本発明の融合タンパク質(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えばベクターで形質転換又はトランスフェクトされている)。本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を作り出すように工学的に操作できる任意の種類の細胞系のことをいう。融合タンパク質を複製し、その発現を支持するために適切な宿主細胞は、当該技術において周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターで適当であればトランスフェクト又は形質導入されてよく、大量のベクター含有細胞を、大規模発酵槽に播種するために成長させて、十分な量の臨床用の融合タンパク質を得ることができる。適切な宿主細胞は、大腸菌のような原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞のような様々な真核生物細胞などを含む。例えば、ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要でない場合に細菌で生成できる。発現後に、ポリペプチドを、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離して、さらに精製できる。原核生物に加えて、部分的又は完全にヒトの糖鎖付加パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす、糖鎖付加経路が「ヒト化」された真菌及び酵母菌株を含む糸状菌又は酵母のような真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross、Nat Biotech 22、1409−1414(2004)及びLi等、Nat Biotech 24、210−215(2006)を参照されたい。(糖鎖付加)ポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。特にヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのための、昆虫細胞と連携して用いることができる多くのバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば米国特許5959177号、6040498号、6420548号、7125978号及び6417429号(トランスジェニック植物における抗体の生成のためのPLANTIBODIES(商標)技術について記載している)を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として用いてよい。例えば懸濁物として成長するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1系統(COS−7);ヒト胚性腎臓系統(例えばGraham等, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されるような293又は293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されるようなTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76)、ヒト子宮頚癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(HepG2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT060562)、TRI細胞(例えばMather等, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載されるような)、MRC5細胞及びFS4細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、dhfr−CHO細胞(Urlaub等, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;並びにYO、NS0、P3X63及びSp2/0のような骨髄腫細胞株である。タンパク質生成に適切なある種の哺乳動物宿主細胞株のレビューのために、例えばYazaki及びWu、Methods in Molecular Biology、第248巻(B.K.C.Lo編、Humana Press、Totowa、NJ)、p.255−268(2003)を参照されたい。宿主細胞は、培養細胞、ほんの数例を挙げれば例えば哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、そしてトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞又はリンパ系細胞(例えばY0、NS0、Sp20細胞)のような哺乳動物細胞である。
これらの系において外来遺伝子を発現するための標準的な技術は、当該技術において公知である。抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を工学的に操作して、発現された生成物が重鎖と軽鎖の両方を有するように抗体鎖の他方も発現するようにしてよい。
一実施態様では、本発明による融合タンパク質を生成する方法であって、本明細書で提供する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養することと、融合タンパク質を宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から回収することとを含む方法が提供される。
本発明の融合タンパク質では、成分(IgGクラス抗体及びIL−10分子)は、互いに遺伝子的に融合されている。融合タンパク質は、その成分が互いに直接又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計できる。リンカーの組成及び長さは、当該技術において周知の方法に従って決定してよく、有効性について試験してよい。所望であれば融合タンパク質の個別の成分を分ける切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むようにさらなる配列を含んでもよい。
ある種の実施態様では、本発明の融合タンパク質は、FAPのような抗原と結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、自然に存在するか又は自然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成でき、それらに由来できる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術において周知である(例えばHarlow及びLane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい)。自然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成により構築できるか、組換えにより生成できるか(例えば米国特許4186567号に記載されるように)、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる(例えばMcCaffertyへの米国特許5969108号を参照されたい)。
任意の動物種の抗体を本発明において用いることができる。本発明において有用な非限定的な抗体は、マウス、霊長類又はヒトを起源とするものであり得る。抗体がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトからであるキメラ形の抗体を用いてよい。ヒト化又は完全にヒト形の抗体も、当該技術において周知の方法に従って調製できる(例えばWinterへの米国特許5565332号を参照されたい)。ヒト化は、それらに限定されないが、(a)重要なフレームワーク残基(例えば良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要なもの)を保持して又は保持せずに非ヒト(例えばドナー抗体)CDRをヒト(例えばレシピエント抗体)フレームワーク及び定常領域にグラフト化すること、(b)非ヒト特異性決定領域(SDR又はa−CDR;抗体−抗原相互作用のために重要な残基)だけをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト化すること、又は(c)非ヒト可変ドメイン全体を移すが、表面残基を置き換えることによりヒト様部分でそれらを「覆う」ことを含む様々な方法により達成してよい。ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えばAlmagro及びFransson、Front Biosci 13、1619−1633(2008)でレビューされ、例えばRiechmann等、Nature 332、323−329(1988);Queen等、Proc Natl Acad Sci USA 86、10029−10033(1989);米国特許5821337号、7527791号、6982321号及び7087409号;Jones等、Nature 321、522−525(1986);Morrison等、Proc Natl Acad Sci 81、6851−6855(1984);Morrison及びOi、Adv Immunol 44、65−92(1988);Verhoeyen等、Science 239、1534−1536(1988);Padlan、Molec Immun 31(3)、169−217(1994);Kashmiri等、Methods 36、25−34(2005)(SDR(a−CDR)グラフト化について記載);Padlan、Mol Immunol 28、489−498(1991)(「再表面形成」について記載);Dall’Acqua等、Methods 36、43−60(2005)(「FRシャッフリング」について記載);並びにOsbourn等、Methods 36、61−68(2005)及びKlimka等、Br J Cancer 83、252−260(2000)(FRシャッフリングのための「誘導選択」アプローチについて記載)にさらに記載されている。本発明による抗体は、特に、ヒト抗体である。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術において公知の様々な技術を用いて生成できる。ヒト抗体は、van Dijk及びvan de Winkel、Curr Opin Pharmacol 5、368−74(2001)並びにLonberg、Curr Opin Immunol 20、450−459(2008)に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成でき、該抗体から導くことができる(例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい)。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原での負荷に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製してもよい(例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい)。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択したFvクローン可変領域配列を単離することによっても作り出すことができる(例えばMethods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)中のHoogenboom等;及びMcCafferty等, Nature 348, 552-554;Clackson等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい)。ファージは、典型的に、単鎖Fv(scFv)断片として又はFab断片として抗体断片を提示する。ファージディスプレイによる抗体の調製についての詳細な記載は、国際公開第2012/020006号(これは、その全体が出典明示により本明細書に援用されている)に添付された実施例で見出すことができる。
ある種の実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる抗体は、例えばPCT国際公開第2012/020006号(親和性成熟に関する実施例を参照されたい)又は米国特許出願公開第2004/0132066号(これらの内容全体は、出典明示により本明細書に援用されている)に開示される方法に従って結合親和性を増進するように工学的に操作されている。特定の抗原決定基と結合する本発明の抗体の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)又は当業者が熟知しているその他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(Liljeblad,等, Glyco J 17, 323-329 (2000))及び伝統的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))のいずれかにより測定できる。競合アッセイを用いて、特定の抗原との結合について参照抗体と競合する抗体、例えばFAPとの結合について4G8抗体と競合する抗体を同定してよい。ある種の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合するのと同じエピトープ(例えば直鎖状又は立体構造エピトープ)と結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Methods in Molecular Biology第66巻(Humana Press, Totowa, NJ)中のMorris(1996)「Epitope Mapping Protocols」に示されている。例示的な競合アッセイでは、固定化抗原(例えばFAP)を、抗原と結合する第1の標識抗体(例えば4G8抗体)及び抗原との結合について第1の抗体と競合するその能力について試験される第2の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートする。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してよい。コントロールとして、固定化抗原を、第1の標識抗体を含むが第2の未標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第1抗体と抗原との結合を許容する条件下でのインキュベーションの後に、過剰の未結合抗体を除去し、固定化抗原と会合した標識の量を測定する。固定化抗原と会合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に低下するならば、このことは、第2の抗体が抗原との結合について第1の抗体と競合することを示す。Harlow及びLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照されたい。
本明細書に記載するようにして調製した融合タンパク質は、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどのような当該技術において公知の技術により精製してよい。特定のタンパク質を精製するために用いる実際の条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、融合タンパク質が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を用いることができる。例えば、本発明の融合タンパク質の親和性クロマトグラフィー精製のために、プロテインA又はプロテインGを有するマトリクスを用いてよい。プロテインA又はG親和性クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを連続的に用いて、実施例に本質的に記載するようにして融合タンパク質を単離できる。融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれによっても決定できる。例えば、実施例に記載するようにして発現させた融合タンパク質は、インタクトであり、還元及び非還元SDS−PAGEにより実証されるように(例えば図2、5を参照されたい)正しく組み立てられることが示された。
組成物、製剤及び投与の経路
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかで用いるための本明細書に記載する融合タンパク質のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供する融合タンパク質のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供する融合タンパク質のいずれかと、例えば以下に記載するような少なくとも1つのさらなる治療剤とを含む。
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかで用いるための本明細書に記載する融合タンパク質のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供する融合タンパク質のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供する融合タンパク質のいずれかと、例えば以下に記載するような少なくとも1つのさらなる治療剤とを含む。
(a)本発明に従って融合タンパク質を得ることと、(b)融合タンパク質と少なくとも1つの薬学的に許容される担体とを処方することにより、融合タンパク質の調製物をin vivo投与用に処方することを含む、in vivo投与用に適切な形での本発明の融合タンパク質を生成する方法がさらに提供される。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散された治療有効量の1又は複数の融合タンパク質を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」との句は、用いる投与量及び濃度にてレシピエントにとって一般的に非毒性である、すなわち例えば適当であればヒトのような動物に投与した場合に有害な、アレルギー性の又はその他の不適当な反応を生じない分子体及び組成物のことをいう。少なくとも1つの融合タンパク質と任意選択的にさらなる活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990(出典明示により本明細書に援用されている)に例示されるように、本開示に鑑みて当業者に公知である。さらに、動物(例えばヒト)投与のために、調製物は、FDA生物学的製剤基準局又は他国での対応する機関により必要とされる無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の標準に合致すべきであることが理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水性溶液である。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるように(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company, 1990, p. 1289-1329(出典明示により本明細書に援用されている)を参照されたい)、任意のそして全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、重合体、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素などの材料及びそれらの組み合わせを含む。いずれかの慣習的な担体が活性成分と適合しないのでない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が期待される。
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾルの形で投与されるか、及びそれが注射のような投与の経路のために滅菌される必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含むことがある。本発明の融合タンパク質(及び任意のさらなる治療剤)は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、外用、局所、吸入(例えばエアロゾル吸入)により、注射、インフュージョン、連続インフュージョン、標的細胞に直接浴びせる局所的灌流、カテーテルを介して、洗浄により、クリーム中で、脂質組成物(例えばリポソーム)中で、又は当業者に公知のその他の方法又は上記のいずれかの組み合わせで投与できる(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company, 1990(出典明示により本明細書に援用されている)を参照されたい)。非経口投与、特に静脈内注射は、本発明の融合タンパク質のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に用いられている。
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射のために、本発明の融合タンパク質は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩緩衝液のような生理的に適合する緩衝液中で処方できる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤及び/又は分散剤のような調合剤を含有してよい。代わりに、融合タンパク質は、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で使用前に構成要素となるための粉末形であってよい。滅菌注射用溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を適当な溶媒中に、必要に応じて以下に挙げた様々なその他の成分とともに組み込むことにより調製される。無菌性は、例えば滅菌ろ過膜を通してろ過することにより容易に遂行できる。一般的に、分散体は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒及び/又はその他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁剤又はエマルジョンの調製用の滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と以前に滅菌ろ過されたその液状媒質からの任意のさらなる所望の成分との散剤を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液状媒質は、必要ならば適切に緩衝されるべきであり、液状希釈剤は、まず、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて注射の前に等張にされる。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。内毒素混入は、安全レベルにて最小限に、例えば0.5ng/mgタンパク質未満に保つべきであることが認識される。適切な薬学的に許容される担体は、それらに限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンのようなアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及びその他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖類;ナトリウムのような塩形成性対イオン;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);並びに/あるいはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン界面活性剤を含む。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどのような懸濁剤の粘度を増加させる化合物を含有してよい。任意選択的に、懸濁剤は、適当な安定化剤又は化合物の溶解性を増加させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有してよい。さらに、活性化合物の懸濁剤は、油性注射用懸濁剤として調整してよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、ごま油のような脂肪油又はエチルクリート(ethyl cleats)若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル又はリポソームを含む。
活性成分は、コロイド薬物送達系(例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョン中の、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに封入することができる。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版Mack Printing Company, 1990)に開示されている。持続放出調製物を調製してよい。持続放出調製物の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリクス(マトリクスは、成形体、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形である)を含む。特定の実施態様では、注射用組成物の長期の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせのような吸収遅延剤を組成物に用いることによりもたらすことができる。
以前に記載した組成物に加えて、融合タンパク質は、デポー調製物として処方してもよい。このような長期間作用性製剤は、植え込み(例えば皮下又は筋内)又は筋内注射により投与してよい。よって、例えば、融合タンパク質は、適切な重合体材料若しくは疎水性材料(例えば許容される油中のエマルジョンとして)又はイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として処方してよい。
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化、被包、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造してよい。薬学的組成物は、1又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は薬学的に用いることができる、タンパク質を調製物に容易に加工できるようにする佐剤を用いて、慣習的な様式で処方してよい。適した製剤は、選択する投与の経路に依存する。
融合タンパク質は、遊離の酸若しくは塩基、中性又は塩の形で組成物において処方してよい。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を本質的に保持する塩である。これらは、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基を用いて形成されるものあるいは例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸を用いて形成されるものを含む。遊離カルボキシ基を用いて形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは第二鉄のような無機塩基;又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基から導くことができる。薬学的な塩は、対応する遊離の塩基の形よりも、水性及びその他のプロトン性溶媒における溶解性がより高い傾向にある。
治療方法及び組成物
本明細書で提供するいずれの融合タンパク質も、治療方法において用いてよい。
治療方法での使用のために、本発明の融合タンパク質は、医薬品製造管理基準に適合した方式で処方、用量決定及び投与される。この文脈において考慮する因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤を送達する部位、投与方法、投与計画及び医療従事者に公知のその他の因子を含む。
本明細書で提供するいずれの融合タンパク質も、治療方法において用いてよい。
治療方法での使用のために、本発明の融合タンパク質は、医薬品製造管理基準に適合した方式で処方、用量決定及び投与される。この文脈において考慮する因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤を送達する部位、投与方法、投与計画及び医療従事者に公知のその他の因子を含む。
一態様では、医薬として用いるための本発明の融合タンパク質が提供される。さらなる態様では、疾患の治療用の本発明の融合タンパク質が提供される。ある種の実施態様では、治療方法で用いるための本発明の融合タンパク質が提供される。一実施態様では、本発明は、治療を必要とする個体における疾患の治療用の本明細書で記載する融合タンパク質を提供する。ある種の実施態様では、本発明は、個体に治療有効量の融合タンパク質を投与することを含む疾患を有する個体を治療する方法で用いるための融合タンパク質を提供する。ある種の実施態様では、治療される疾患は、炎症性疾患である。例示的な炎症性疾患は、炎症性腸疾患(例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎)及び関節リウマチを含む。特定の実施態様では、疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチ、特に炎症性腸疾患、より特にはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。ある種の実施態様では、方法は、個体に治療有効量の少なくとも1つのさらなる治療剤、例えば治療される疾患が炎症性疾患であるならば抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意の上記の実施態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造又は調製における本発明の融合タンパク質の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に治療有効量の医薬を投与することを含む疾患を治療する方法において用いるためである。ある種の実施態様では、治療される疾患は、炎症性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチ、特に炎症性腸疾患、より特にはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。一実施態様では、方法は、個体に治療有効量の少なくとも1つのさらなる治療剤、例えば治療される疾患が炎症性疾患であるならば抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意の上記の実施態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、個体に治療有効量の本発明の融合タンパク質を投与することを含む、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容される形で本発明の融合タンパク質を含む組成物を前記個体に投与する。ある種の実施態様では、治療される疾患は、炎症性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチ、特に炎症性腸疾患、より特にはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。ある種の実施態様では、方法は、個体に治療有効量の少なくとも1つのさらなる治療剤、例えば治療される疾患が炎症性疾患であるならば抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意の上記の実施態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
本発明の融合タンパク質は、診断薬としても有用である。抗原決定基との融合タンパク質の結合は、例えば融合タンパク質と結合した標識により又は本発明の融合タンパク質に特異的な標識2次抗体を用いることにより容易に検出できる。
いくつかの実施態様では、有効量の本発明の融合タンパク質を細胞に投与する。他の実施態様では、治療有効量の本発明の融合タンパク質を、疾患の治療のために個体に投与する。
疾患の防止又は治療のために、本発明の融合タンパク質の適当な投与量(単独又は1若しくは複数の他のさらなる治療剤との組み合わせで用いる場合)は、治療される疾患のタイプ、投与の経路、患者の体重、融合タンパク質のタイプ、疾患の重篤度及び経過、融合タンパク質が防止又は治療のいずれを目的として投与されるか、以前の又は現在の治療的介入、患者の臨床経歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに担当医師の慎重さに依存する。投与に責任を持つ医師は、いずれにしても、組成物中の活性成分の濃度及び個別の対象に対する適当な用量を決定する。本明細書において、それらに限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、急速投与及びパルスインフュージョンを含む様々な投与計画が期待される。
融合タンパク質は、1回又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重篤度に依存して、約1μg/kg−15mg/kg(例えば0.1mg/kg−10mg/kg)の融合タンパク質が、例えば1若しくは複数回の別々の投与又は連続インフュージョンのいずれによっても、患者への投与のための初期候補投与量であり得る。ある典型的な1日投与量は、上記の因子に依存して、約1μg/kgから100mg/kg以上までの範囲であり得る。状態に依存して数日以上にわたる反復投与のために、治療は、疾患症状が望ましく抑制されるまで、一般的に持続される。融合タンパク質のある例示的な投与量は、約0.005mg/kgから約10mg/kgまでの範囲である。その他の非限定的な例では、用量は、投与あたり約1μg/kg体重、約5μg/kg体重、約10μg/kg体重、約50μg/kg体重、約100μg/kg体重、約200μg/kg体重、約350μg/kg体重、約500μg/kg体重、約1mg/kg体重、約5mg/kg体重、約10mg/kg体重、約50mg/kg体重、約100mg/kg体重、約200mg/kg体重、約350mg/kg体重、約500mg/kg体重から約1000mg/kg体重以上まで、及びその中で導くことができる任意の範囲も含んでよい。本明細書で列挙する数から導くことができる範囲の非限定的な例では、上記の数に基づいて、約5mg/kg体重から約100mg/kg体重まで、約5μg/kg体重から約500mg/kg体重までなどの範囲を投与できる。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg又は10mg/kg(又は任意のそれらの組み合わせ)の1又は複数回の用量を患者に投与してよい。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は3週間ごとに投与してよい(例えば約2から約20又は例えば約6回の用量の融合タンパク質を患者が受けるように)。1又は複数回のより低い用量が後に続く初期のより高い負荷用量を投与してよい。しかし、他の投与計画が有用なことがある。この治療の進捗は、慣習的な技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
本発明の融合タンパク質は、一般的に、意図する目的を達成するために有効な量で用いられる。疾患状態を治療又は防止するために用いるために、本発明の融合タンパク質又はその薬学的組成物を、治療有効量で投与又は施用する。治療有効量の決定は、特に本明細書で提供する詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与のために、細胞培養アッセイのようなin vitroアッセイから治療有効量を初期に見積もることができる。次いで、動物モデルにおいて用量を処方して、細胞培養において決定されるIC50を含む循環濃度範囲を達成できる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をさらに精密に決定できる。
初期投与量は、当該技術において周知の技術を用いてin vivoデータ、例えば動物モデルから見積もることができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できる。
投与量及び間隔は、個別に調節して、治療効果を維持するために十分な融合タンパク質の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約0.1から50mg/kg/日まで、典型的に約0.5から1mg/kg/日までの範囲である。治療有効血漿レベルは、各日に複数回の用量を投与することにより達成してよい。血漿中のレベルは、例えばHPLCにより測定してよい。
局所投与又は選択的取り込みの場合、融合タンパク質の有効局所濃度は、血漿濃度と関係しないことがある。当業者は、過度の実験を行うことなく、治療有効局所投与量を最適化できる。
本明細書で記載する治療有効量の融合タンパク質は、一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療の利益をもたらす。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物において標準的な薬学的手順により決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究を用いてLD50(集団の50%にとって致死的な用量)及びED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これはLD50/ED50の比として表すことができる。大きい治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。一実施態様では、本発明による融合タンパク質は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータを、ヒトで用いるために適切な投与量の範囲を処方する場合に用いることができる。投与量は、ほとんど又は全く毒性がなくED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、この範囲内で、様々な因子、例えば用いる剤形、利用する投与の経路、対象の状態などに依存して変動してよい。厳密な製剤、投与の経路及び投与量は、患者の状態に鑑みて個別の医師が選択できる(例えばThe Pharmacological Basis of Therapeutics中のFingl等, 1975, Ch. 1, p. 1(その全体が出典明示により本明細書に援用されている)を参照されたい)。
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の担当医師は、毒性、臓器不全などにより、どのように、かついつ投与を終了、中断又は調節するかを分かっている。逆に、担当医師は、臨床応答が適正でない(毒性を除く)ならば治療をより高いレベルに調節することも分かっている。対象の障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与の経路などに応じて変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的に、標準的な予後評価方法により評価してよい。さらに、用量及びおそらく用量頻度も、個別の患者の年齢、体重及び応答により変動する。
その他の薬剤及び治療
本発明の融合タンパク質は、治療において1又は複数のその他の薬剤と組み合わせて投与してよい。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも1つのさらなる治療剤と同時投与してよい。用語「治療剤」は、治療を必要とする個体における症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療剤は、治療される特定の適応症に適切な任意の活性成分、好ましくは互いに不利に影響しない相補的な活性を有するものを含んでよい。ある種の実施態様では、さらなる治療剤は、抗炎症剤である。
本発明の融合タンパク質は、治療において1又は複数のその他の薬剤と組み合わせて投与してよい。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも1つのさらなる治療剤と同時投与してよい。用語「治療剤」は、治療を必要とする個体における症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療剤は、治療される特定の適応症に適切な任意の活性成分、好ましくは互いに不利に影響しない相補的な活性を有するものを含んでよい。ある種の実施態様では、さらなる治療剤は、抗炎症剤である。
このようなその他の薬剤は、意図する目的のために効果的な量で、組み合わせにおいて適切に存在する。このようなその他の薬剤の有効量は、用いる融合タンパク質の量、障害又は治療のタイプ及び上で論じたその他の因子に依存する。融合タンパク質は、本明細書に記載するものと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載する投与量の約1から99%まで、又は経験的/臨床的に適当であると決定される任意の投与量及び任意の経路で一般的に用いられる。
上記のこのような併用治療は、併用投与(2つ以上の治療剤が同じ又は別々の組成物に含まれる)、及び別々の投与(この場合、本発明の融合タンパク質は、さらなる治療剤及び/又は補助剤の投与の前、同時及び/又は後に投与できる)を包含する。
製品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、防止及び/又は診断のために有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器と、容器に貼付されたか又は付随する標識又は添付文書とを含む。適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バッグなどを含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、それ自体又は状態を治療、防止及び/又は診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌口を有してよい(例えば容器は、皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本発明の融合タンパク質である。標識又は添付文書は、選択した状態を治療するために組成物を用いることを示す。さらに、製品は、(a)本発明の融合タンパク質を含む組成物を含有する第1の容器と、(b)さらなる治療剤を含む組成物を含有する第2容器とを含んでよい。本発明のこの実施態様の製品は、組成物を用いて特定の状態を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。代わりに又はさらに、製品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(又は第3の)容器をさらに含んでよい。製品は、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及び注射器を含む、商業的な及びユーザの視点から望ましいその他の材料をさらに含んでよい。
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、防止及び/又は診断のために有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器と、容器に貼付されたか又は付随する標識又は添付文書とを含む。適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バッグなどを含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、それ自体又は状態を治療、防止及び/又は診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌口を有してよい(例えば容器は、皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本発明の融合タンパク質である。標識又は添付文書は、選択した状態を治療するために組成物を用いることを示す。さらに、製品は、(a)本発明の融合タンパク質を含む組成物を含有する第1の容器と、(b)さらなる治療剤を含む組成物を含有する第2容器とを含んでよい。本発明のこの実施態様の製品は、組成物を用いて特定の状態を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。代わりに又はさらに、製品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(又は第3の)容器をさらに含んでよい。製品は、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及び注射器を含む、商業的な及びユーザの視点から望ましいその他の材料をさらに含んでよい。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な記載に鑑みて、様々なその他の実施態様を実施できることが理解される。
組換えDNA技術
Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載されるような標準的な方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の使用説明に従って用いた。DNA配列は、2本鎖配列決定により決定した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列についての一般的な情報は、Kabat,E.A.等、(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH Publication No 91−3242に示されている。
Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載されるような標準的な方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の使用説明に従って用いた。DNA配列は、2本鎖配列決定により決定した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列についての一般的な情報は、Kabat,E.A.等、(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH Publication No 91−3242に示されている。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適当な鋳型を用いるPCRにより作り出したか、又はGeneart AG(Regensburg、Germany)にて合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物から自動化遺伝子合成により合成した。単数制限エンドヌクレアーゼ切断部位で挟まれた遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドDNAを、形質転換細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定により確認した。遺伝子セグメントは、適切な制限部位を有するように設計して、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。全ての構築物は、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的にするリーダーペプチド(MGWSCIILFLVATATGVHS)をコードする5’端DNA配列を有するように設計した。
所望の遺伝子セグメントは、適当な鋳型を用いるPCRにより作り出したか、又はGeneart AG(Regensburg、Germany)にて合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物から自動化遺伝子合成により合成した。単数制限エンドヌクレアーゼ切断部位で挟まれた遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドDNAを、形質転換細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定により確認した。遺伝子セグメントは、適切な制限部位を有するように設計して、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。全ての構築物は、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的にするリーダーペプチド(MGWSCIILFLVATATGVHS)をコードする5’端DNA配列を有するように設計した。
抗体−IL−10融合構築物のクローニング
重鎖及び軽鎖Vドメインの増幅DNA断片を、ヒトIgG1若しくはFab定常重鎖又はヒト定常軽鎖を含有するそれぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターのいずれかにインフレームで挿入した。重鎖及び軽鎖は、常に別々のプラスミド上にコードした。軽鎖をコードするプラスミドがIgGに基づくIL−10融合構築物及びFabに基づくIL−10融合構築物で同一であるが、Fabに基づく構築物についての重鎖をコードするプラスミドは、フォーマットに依存して、それぞれのIL−10部分とともに1又は2つのVH−CH1ドメインを含有する。Fab重鎖プラスミドが2つのVH−CH1ドメインを含む場合(単鎖IL−10 2量体又は工学的に操作された単量体IL−10が介在する直列Fab(Josephson等, J Biol Chem 275, 13552-7 (2000))、2つのVドメインは、それらのそれぞれについて異なる組み合わせの制限部位を用いて2ステップクローニング手順にて挿入されなければならなかった。これらの構築物のIL−10部分は、常に、それぞれFab又はIgG重鎖のC末端とサイトカインのN末端との間に(G4S)3 15マーリンカーを用いてこれらの抗体の重鎖とインフレームにクローニングした。IgG−IL−10フォーマット(図1A)だけは、IgG重鎖のC末端とサイトカインのN末端との間に(G4S)4 20マーリンカーを含む。IgG重鎖のC末端リジン残基は、連結子を付加する際に除去した。単鎖IL−10について、(G4S)4 20マーリンカーを、2つのIL−10鎖の間に挿入した。一方だけがIL−10に融合している2つの異なるIgG重鎖の場合、2つの重鎖プラスミドは、IgG CH3ドメイン中のノブ−イントゥ−ホール改変によりヘテロ2量体形成が促進されるように構築及びトランスフェクトされる必要があった。IL−10部分と接続された「ホール」重鎖は、CH3ドメイン中にY349C、T366S、L368A及びY407V変異を有し、融合されていない「ノブ」重鎖は、CH3ドメイン中にS354C及びT366W変異を有した(EU番号付け)。FcγR結合/エフェクター機能を廃止し、かつFcR同時活性化を防止するために、以下の変異をIgG重鎖のそれぞれのCH2ドメインに導入した:L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)。抗体−IL−10融合構築物の発現は、MPSVプロモーターにより行い、転写は、CDSの下流にある合成ポリAシグナル配列により終結させた。発現カセットに加えて、各ベクターは、EBV−EBNA発現細胞株における自己複製のためのEBV oriP配列を含有した。
重鎖及び軽鎖Vドメインの増幅DNA断片を、ヒトIgG1若しくはFab定常重鎖又はヒト定常軽鎖を含有するそれぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターのいずれかにインフレームで挿入した。重鎖及び軽鎖は、常に別々のプラスミド上にコードした。軽鎖をコードするプラスミドがIgGに基づくIL−10融合構築物及びFabに基づくIL−10融合構築物で同一であるが、Fabに基づく構築物についての重鎖をコードするプラスミドは、フォーマットに依存して、それぞれのIL−10部分とともに1又は2つのVH−CH1ドメインを含有する。Fab重鎖プラスミドが2つのVH−CH1ドメインを含む場合(単鎖IL−10 2量体又は工学的に操作された単量体IL−10が介在する直列Fab(Josephson等, J Biol Chem 275, 13552-7 (2000))、2つのVドメインは、それらのそれぞれについて異なる組み合わせの制限部位を用いて2ステップクローニング手順にて挿入されなければならなかった。これらの構築物のIL−10部分は、常に、それぞれFab又はIgG重鎖のC末端とサイトカインのN末端との間に(G4S)3 15マーリンカーを用いてこれらの抗体の重鎖とインフレームにクローニングした。IgG−IL−10フォーマット(図1A)だけは、IgG重鎖のC末端とサイトカインのN末端との間に(G4S)4 20マーリンカーを含む。IgG重鎖のC末端リジン残基は、連結子を付加する際に除去した。単鎖IL−10について、(G4S)4 20マーリンカーを、2つのIL−10鎖の間に挿入した。一方だけがIL−10に融合している2つの異なるIgG重鎖の場合、2つの重鎖プラスミドは、IgG CH3ドメイン中のノブ−イントゥ−ホール改変によりヘテロ2量体形成が促進されるように構築及びトランスフェクトされる必要があった。IL−10部分と接続された「ホール」重鎖は、CH3ドメイン中にY349C、T366S、L368A及びY407V変異を有し、融合されていない「ノブ」重鎖は、CH3ドメイン中にS354C及びT366W変異を有した(EU番号付け)。FcγR結合/エフェクター機能を廃止し、かつFcR同時活性化を防止するために、以下の変異をIgG重鎖のそれぞれのCH2ドメインに導入した:L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)。抗体−IL−10融合構築物の発現は、MPSVプロモーターにより行い、転写は、CDSの下流にある合成ポリAシグナル配列により終結させた。発現カセットに加えて、各ベクターは、EBV−EBNA発現細胞株における自己複製のためのEBV oriP配列を含有した。
抗体−IL−10融合タンパク質の調製
FAPを指向する抗原結合部分の作製、親和性成熟及び特徴決定についての詳細は、PCT国際公開第2012/020006号(これは、その全体が出典明示により本明細書に援用されている)に添付された実施例(特に実施例2−6(調製)及び7−13(特徴決定))で見出すことができる。そこに記載されるように、以下の実施例で用いる4G8及び4B9と称するものを含む、FAPを指向する様々な抗原結合ドメインをファージディスプレイにより作り出した。
FAPを指向する抗原結合部分の作製、親和性成熟及び特徴決定についての詳細は、PCT国際公開第2012/020006号(これは、その全体が出典明示により本明細書に援用されている)に添付された実施例(特に実施例2−6(調製)及び7−13(特徴決定))で見出すことができる。そこに記載されるように、以下の実施例で用いる4G8及び4B9と称するものを含む、FAPを指向する様々な抗原結合ドメインをファージディスプレイにより作り出した。
実施例で用いる抗体IL−10融合構築物は、指数関数的に成長しているHEK293−EBNA細胞に、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて哺乳動物発現ベクターを同時トランスフェクトすることにより生成した。代わりに、懸濁状態で成長しているHEK293 EBNA細胞に、ポリエチレンイミン(PEI)により発現ベクターをトランスフェクトした。クローン4G8及び4B9に基づく全てのFAP標的化抗体−IL−10融合構築物は、プロテインAマトリクスを用いる親和性クロマトグラフィーにより精製できる。
簡単に述べると、IL−10、単鎖(sc)IL−10又はIL−10M1に融合したFAP標的化構築物は、1回の親和性クロマトグラフィー工程(プロテインA)とその後のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200、GE Healthcare)とで構成される方法により精製した。プロテインAカラムを20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウムpH7.5で平衡化し、上清を載せ、カラムを20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(任意選択的に500mM塩化ナトリウムを含むか又は含まない)、pH7.5で洗浄した後に、FBSが上清中に存在する場合に、13.3mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH5.45で洗浄した。10mM MES、50mM塩化ナトリウムpH5での3回目の洗浄は、任意選択的に実行した。融合構築物を、20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン、pH3で溶出した。溶出画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーにより最終処方緩衝液(これは、25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシンpH6.7又は20mMヒスチジン、140mM NaCl pH6.0のいずれかであった)中で仕上げた。
精製抗体−IL−10融合構築物のタンパク質濃度は、280nmでの光学密度(OD)を測定することにより、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて決定した。融合構築物の純度、完全性及び単量体状態は、還元剤(5mM 1,4−ジチオトレイトール)の存在下及び非存在下でのSDS−PAGEにより分析し、クーマシーブルー(SimpleBlue(商標)SafeStain、Invitrogen)で染色した。NuPAGE(登録商標)プレキャストゲルシステム(Invitrogen)を、製造者の使用説明に従って用いた(4−20%Tris−グリシンゲル又は3−12%Bis−Tris)。代わりに、還元又は非還元抗体−IL−10融合構築物を、製造者の仕様書に従ってLabChip GX(Caliper)を用いて分析した。免疫コンジュゲート試料の凝集物含量は、2mM MOPS、150mM NaCl、0.02%NaN3、pH7.3ランニング緩衝液を用いるSuperdex200 10/300GL分析サイズ排除カラム(GE Healthcare)、又は25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mMアルギニン、0.02%NaN3、pH6.7ランニング緩衝液中で25℃にてTSKgel G3000 SW XLカラムを用いて分析した。
異なる構築物の精製及びその後の分析の結果を、図2−8に示す。IgG−IL−10構築物は、その他のIL−10融合フォーマットよりもよいいくつかの生成の利点を示した。まず、Fab−IL−10フォーマットと比較して、IL−10ホモ2量体は、同じ抗体分子内に繋留される。その結果、生成の際に、2量体だけが所望の活性生成物であるのに単量体及び2量体のタンパク質種が親和性クロマトグラフィーの後に観察されるFab−IL−10フォーマットで見られるような単量体IL−10分子が生じることができない(図2Bと図6Bとを比較されたい)。第2に、ノブ−イントゥ−ホール改変を含むヘテロ2量体IgGに基づくフォーマット(例えばIgG−scIL−10及びIgG−IL−10M1)とは対照的に、IgG−IL−10構築物は、2つの同一の重鎖を含む。このことにより、ホール−ホール又はノブ−ノブのホモ2量体のような不要な副生成物が回避される。
SPRによる親和性決定
3つの異なる種(ヒト、マウス及びカニクイザル)からのFAPに対する及びヒトIL−10R1に対する抗体−IL−10融合構築物の速度定数(kon及びkoff)及び親和性(KD)を、PBSTランニング緩衝液(10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005%Tween20)とともにProteOn XPR36(BioRad)装置を25℃にて用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により測定した。FAPに対する親和性を決定するために、標的タンパク質を、共有結合により固定化した抗H6抗体により、そのH6タグを介して捕捉した(図9A)。簡単に述べると、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(sNHS)との新しく調製した混合物を用いて全てのチャネルを5分間同時に活性化し、その後に、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5中の15μg/ml抗ペンタHis IgG(Qiagen#34660、マウスモノクローナル抗体)を180秒間注入することにより、GLMチップの別々の垂直チャネルに30μl/分にて高レベルで(〜5,000RUまで)、抗ペンタHis IgGを固定化した。チャネルを、エタノールアミンを5分間注入することによりブロックした。異なる種からのH6タグ付加FAP(配列番号81、83及び85を参照されたい)を、30μl/分にて60秒間の垂直チャネルに沿うランニング緩衝液中の5μg/ml希釈物から捕捉して、〜250から600RUの間のリガンド密度を達成した。ワンショットカイネティックアッセイの構成(OSK)では、抗体−IL−10融合構築物を分析物として、水平チャネルに沿って、50から0.08nMまでの5倍系列希釈で、100μl/minにて注入した。会合段階は180秒間、解離段階は600秒間記録した。非常に遅いオフレートを示す相互作用の場合、オフレートの記録は、複合体の解離を観察するために1800秒まで延長した。しかし、いくつかの場合では、これらのオフレートのフィッティングはまだ可能でなかったので、KDの算出のために1×10−5 1/sの推定値を用いた。ランニング緩衝液(PBST)を第6のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとした。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(ProteOnマネージャソフトウェアバージョン2.1)を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として算出した。10mMグリシンpH1.5及び50mM NaOHを100μl/分にて30秒間、水平方向で2回パルスして、抗ペンタHis IgGを捕捉されたFAP及び結合した抗体−IL−10融合構築物から解離させることにより、再生を実行した。
3つの異なる種(ヒト、マウス及びカニクイザル)からのFAPに対する及びヒトIL−10R1に対する抗体−IL−10融合構築物の速度定数(kon及びkoff)及び親和性(KD)を、PBSTランニング緩衝液(10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005%Tween20)とともにProteOn XPR36(BioRad)装置を25℃にて用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により測定した。FAPに対する親和性を決定するために、標的タンパク質を、共有結合により固定化した抗H6抗体により、そのH6タグを介して捕捉した(図9A)。簡単に述べると、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(sNHS)との新しく調製した混合物を用いて全てのチャネルを5分間同時に活性化し、その後に、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5中の15μg/ml抗ペンタHis IgG(Qiagen#34660、マウスモノクローナル抗体)を180秒間注入することにより、GLMチップの別々の垂直チャネルに30μl/分にて高レベルで(〜5,000RUまで)、抗ペンタHis IgGを固定化した。チャネルを、エタノールアミンを5分間注入することによりブロックした。異なる種からのH6タグ付加FAP(配列番号81、83及び85を参照されたい)を、30μl/分にて60秒間の垂直チャネルに沿うランニング緩衝液中の5μg/ml希釈物から捕捉して、〜250から600RUの間のリガンド密度を達成した。ワンショットカイネティックアッセイの構成(OSK)では、抗体−IL−10融合構築物を分析物として、水平チャネルに沿って、50から0.08nMまでの5倍系列希釈で、100μl/minにて注入した。会合段階は180秒間、解離段階は600秒間記録した。非常に遅いオフレートを示す相互作用の場合、オフレートの記録は、複合体の解離を観察するために1800秒まで延長した。しかし、いくつかの場合では、これらのオフレートのフィッティングはまだ可能でなかったので、KDの算出のために1×10−5 1/sの推定値を用いた。ランニング緩衝液(PBST)を第6のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとした。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(ProteOnマネージャソフトウェアバージョン2.1)を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として算出した。10mMグリシンpH1.5及び50mM NaOHを100μl/分にて30秒間、水平方向で2回パルスして、抗ペンタHis IgGを捕捉されたFAP及び結合した抗体−IL−10融合構築物から解離させることにより、再生を実行した。
抗体−IL−10融合構築物とヒトIL−10R1との間の相互作用を測定するために、NLCチップを用いてビオチン化受容体を固定化した(図9B)。400から1600RUの間のヒトIL−10R1(配列番号87を参照されたい)を、10μg/mlの濃度及び様々な接触時間について30μl/秒の流速にて垂直チャネルに沿ってニュートラアビジン誘導体化チップマトリクス上に捕捉した。ビオチン化ヒトIL10R1との結合は、水平方向に100μl/分で注入し、会合速度を180秒間、解離速度を600秒間記録することにより6つの異なる分析物濃度(50、10、2、0.4、0.08、0nM)にて測定した。ランニング緩衝液(PBST)を第6のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとした。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(ProteOnマネージャソフトウェアバージョン2.1)を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として算出した。ヒトIL−10R1は活性を喪失することなく再生できなかったので、リガンド捕捉と分析物注入の後続の2工程は、相互作用ごとに新しく固定化したセンサチップ表面を用いてチャネルごとに実行した。
表1及び2は、異なる種からのFAP及びヒトIL−10R1と結合する、抗FAPクローン4G8又は4B9にそれぞれ基づく抗体−IL−10融合構築物についての速度定数及び平衡定数のまとめを示す。
表1.抗FAPクローン4G8に基づく抗体融合体についての速度定数及び平衡定数のまとめ。異なる種からのFAP及びヒトIL-10R1との結合。
表2.抗FAPクローン4B9に基づく抗体融合体についての速度定数及び平衡定数のまとめ。異なる種からのFAP及びヒトIL-10R1との結合。
表1.抗FAPクローン4G8に基づく抗体融合体についての速度定数及び平衡定数のまとめ。異なる種からのFAP及びヒトIL-10R1との結合。
表2.抗FAPクローン4B9に基づく抗体融合体についての速度定数及び平衡定数のまとめ。異なる種からのFAP及びヒトIL-10R1との結合。
我々が有する、抗体に融合していないがC末端にH6タグを有する野生型(wt)IL−10サイトカインは、ヒトIL−10R1について52pMのKDを示した(kon 2.5×106 1/Ms、koff 1.3×10−4 1/s)。2量体サイトカインに基づく抗体−IL−10融合構築物について、IL−10R1に対するアビディティーは、融合していないサイトカインと同等であり、これもまた2桁のpMであった(18から73pMまでの範囲)。このことは、このサイトカインが、ヒトIL−10R1に対するアビディティーを著しく喪失することなく、抗体又はその断片とのN末端融合に耐えることを示した。対照的に、単量体サイトカインに基づく抗体−IL−10融合構築物は、2量体IL−10融合体のアビディティー効果を示さず、よって、受容体に対するこれらの親和性は、3桁のpM又は1桁のnMの範囲であった(それぞれ815pM及び1.1nM)。FAPとの結合は、それぞれの抗体に依存し、クローン4B9はヒト及びカニクイザルFAPに対してより高い親和性/アビディティーを示すが、クローン4G8はマウスFAPに対してより高い親和性/アビディティーを示す。実際に、マウスFAPに対する4G8抗体のアビディティーはかなり強かったので、用いた条件下で複合体の解離速度を決定することが不可能であった。
IL−10とIL−10R1との間の相互作用の親和性(アビディティー)は、〜35−200pMの範囲で高い(Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001))。2量体IL−10部分又は2つの独立した単量体を含む構築物について、抗体との融合は、著しく親和性を変更しないことが見受けられる(〜19−73pM)。しかし、単量体IL−10融合構築物について、この結合の強さは劇的に低下した。これは、おそらく、同じIgGと結合した2量体サイトカイン又は2つの単量体について生じるようなアビディティー効果がないからである。理想的には、標的FAPに対する抗体−IL−10融合構築物の親和性は、FAPが発現されている組織を効率的に標的にするために、高親和性サイトカイン受容体IL−10R1に対するものよりも高いべきである。IL−10とIL−10R1との間の高い親和性にもかかわらず、IgG−IL−10フォーマットに基づく分子が示す標的FAPに対する親和性は、まだ高い:それぞれクローン4B9 IgG−IL−10(IL−10R1に対して48pM対ヒトFAPに対して11pM)及びクローン4G8(IL−10R1に対して25pM対マウスFAPに対して6pM)。IL−10R1及びFAPに対するこれらの親和性は、FAPを過剰発現する組織を効率的に標的にするために適切であると見られ、IL−10R1は、これらの分子のシンクを表すようには見受けられない。
初代単球による炎症誘発性サイトカインのLPS誘発生成の抑制
IgG又はFabに基づくFAP標的化IL−10構築物の間の機能的特徴決定及びこれらの区別のために、これらの分子の能力を異なるin vitroアッセイで査定した。例えば、初代単球による炎症誘発性サイトカインのLPS誘発生成を抑制する有効性を測定した。この実験のために、200mlのヘパリン処理した末梢血(健常提供者から得た、Medical Services department、Roche Diagnostics GmbH、Penzberg、Germany)をフィコールハイパック密度勾配により分離し、その後、単球をネガティブ単離した(Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach、Germany、#130−091−153)。精製単球を、96ウェルF細胞培養プレート(Costar/Corning Life Sciences、Amsterdam、The Netherlands;#3596)に、培地(10%ヒト血清、2mM L−グルタミン[Gibco、#25030]及びPen/Strepを補ったRPMI1640[Gibco/Invitrogen、Darmstadt、Germany、cat.no.#10509−24])中で5×104細胞/ウェルにて播種した。
IgG又はFabに基づくFAP標的化IL−10構築物の間の機能的特徴決定及びこれらの区別のために、これらの分子の能力を異なるin vitroアッセイで査定した。例えば、初代単球による炎症誘発性サイトカインのLPS誘発生成を抑制する有効性を測定した。この実験のために、200mlのヘパリン処理した末梢血(健常提供者から得た、Medical Services department、Roche Diagnostics GmbH、Penzberg、Germany)をフィコールハイパック密度勾配により分離し、その後、単球をネガティブ単離した(Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach、Germany、#130−091−153)。精製単球を、96ウェルF細胞培養プレート(Costar/Corning Life Sciences、Amsterdam、The Netherlands;#3596)に、培地(10%ヒト血清、2mM L−グルタミン[Gibco、#25030]及びPen/Strepを補ったRPMI1640[Gibco/Invitrogen、Darmstadt、Germany、cat.no.#10509−24])中で5×104細胞/ウェルにて播種した。
全ての抗体−IL−10融合タンパク質を、(a)溶液中及び(b)実験的背景で試験し、ここでは、組換えヒトFAP(cfin=1μg/ml)で4℃にて1晩(代わりに室温にて60−90分)プレートを被覆し、被覆されたFAPとの結合により抗体−IL−10融合タンパク質を固定化した。
構成(a)について、滴定した量(通常0−500nM)の示した抗体融合構築物又は陽性コントロールとしての組換え野生型ヒトIL−10の存在下又は非存在下で100ng/ml LPS(Sigma−Aldrich/Nunc、Taufkirchen、Germany、#L3129)とともに播種した後に、細胞を直接刺激した。構成(b)について、未結合のFAPを被覆の後に除去し、プレートを培地(上記を参照されたい)で室温にて1時間ブロックした後に、さらに1時間IL−10構築物とインキュベートした。その後、プレートを培地で洗浄し、その後、単球を適当な刺激物質(100ng/ml LPS)とともに培養に加えた。
全ての実験について、細胞を37℃及び5%CO2にて24時間インキュベートした。上清を採取し(任意選択的に−20/−80℃にて貯蔵)、IL−1β、IL−6、G−CSF及び/又はTNFαについてのCBAフレックスセット(BD Biosciences、Heidelberg、Germany、#558279、#558276、#558326及び#558299)を用いてサイトカイン生成について試験した。プレートをFACSアレイを用いて測定し、FCAPソフトウェア(ともにBDから購入)を用いて分析した。
図10に示すように、炎症誘発性サイトカインIL−1β、IL−6及びTNFαの抑制における4G8 Fab−IL−10及びIgG−IL−10のin vitro効力は、構成(a)において同等であった(図10D、E、F)。対照的に、構成(b)では、IgGに基づくフォーマットは、Fab−IL−10と比較して優れた効力を実証した(図10A、B、C)。対応するEC50値[nM]を表3に示す。構成(b)におけるIgG−IL−10構築物のEC50値は、組換えwtヒトIL−10のもの(これは構成(a)でのみ試験することができた)と同様であった。
表3.単球(ドナー1)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
表3.単球(ドナー1)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
この結果は、2名の異なる血液ドナーを用いる独立した実験において再現された(図11、A及びB、表4及び5)。この実験でも、IgGに基づく標的化IL−10構築物は、構成(b)において得られたEC50値により示されるように、試験した3つ全てのサイトカインの抑制においてFabに基づく分子よりも著しく優れていた。構成(a)では、全ての分子は同等であった。
表4.単球(ドナー2)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
表5.単球(ドナー3)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
表4.単球(ドナー2)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
表5.単球(ドナー3)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
さらなる実験では、単球によるIL−6生成の抑制におけるFab及びIgGに基づくIL−10構築物の効力を再び査定し、wt IL−10並びにFAPと結合しない非標的化Fab−IL−10及びIgG−IL−10構築物と比較した(図12及び表6)。ここでもまた、4G8−IgG−IL−10は、4G8−Fab−IL−10と比較して、実験的構成(b)においてIL−6生成をより効率的に抑制するが、非標的化構築物は、最高濃度でのみ抑制を引き起こしたことが見出された。対照的に、構成(a)では、全ての構築物の効力は同等であった。
表6.単球(ドナー4)によるIL-6生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
表6.単球(ドナー4)によるIL-6生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
以前のアッセイにおいて被覆のために用いた組換えヒトFAPの濃度は人工的又は非生理的条件を反映する可能性があるので、被覆FAPの量を滴定し(0.25から5μg/mlの間のcfin)、EC50値に対するその影響を、実験的構成(b)で査定した。
図13に示すように、全体的に、IgG及びFabに基づく構築物についてEC50値の比に劇的な差はない。全ての濃度にて、IgG−IL−10構築物は、IL−6誘導の阻害においてより効力が高かった(図13並びに表7及び8)。被覆FAPの濃度は、しかし、濃度が減少するとEC50値が一般的に増加したので、実験の成績に影響し、このことは、マイクロタイタープレート上に固定化された構築物の量を反映する可能性があった(表8;Fabに基づく構築物について、最低FAP濃度にてサイトカインの低下が観察されたが、EC50は算出できなかった)。興味深いことに、高いFAP濃度(5μg/ml)では、分泌IL−6の全量の増加が検出された(図14)。
表7.単球(ドナー5)によるIL-6生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及びヒト野生型IL-10(溶液)のEC50値。
表8.単球(ドナー5)によるIL-6生成の抑制についての、異なる濃度の被覆FAP上に固定化された4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
表7.単球(ドナー5)によるIL-6生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及びヒト野生型IL-10(溶液)のEC50値。
表8.単球(ドナー5)によるIL-6生成の抑制についての、異なる濃度の被覆FAP上に固定化された4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
さらなる実験では、異なるFAP標的化ドメインである親和性成熟抗FAP抗体バリアント4B9を含むIL−10融合構築物を試験した。ここでもまた、単球によるLPS誘発IL−6生成の抑制における構築物のin vitro効力を、実験的構成(a)及び(b)において査定した。
図15は、4B9に基づく構築物について、IgG−IL−10分子が、実験的構成(a)においてIL−6生成の抑制においてFab−IL−10構築物よりも優れていた(及び構成(b)において同等であった)ことを示す。対応するEC50値を表9に示す。一般的に、4B9及び4G8構築物は、同様の効力を実証した。
表9.単球(ドナー7)によるIL-6生成の抑制についての4G8及び4B9に基づくIgG-IL-10及びFab-IL-10のEC50値。
表9.単球(ドナー7)によるIL-6生成の抑制についての4G8及び4B9に基づくIgG-IL-10及びFab-IL-10のEC50値。
さらなる一連の実験では、4G8に基づくIgG−IL−10、Fab−IL−10、Fab−IL−10M1−Fab及びIgG−IL−10M1構築物を比較した。単球による炎症誘発性サイトカインIL−6、IL−1β及びTNFαのLPS誘発生成の抑制を、実験的構成(a)及び(b)において査定した。これらの実験の結果を、表10−12に示す(3名の異なるドナー)。以前の実験と同様に、IgG−IL−10が、特に実験的構成(b)において最も効力が高い構築物であった。
表10.単球(ドナー1)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
表11.単球(ドナー2)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
表12.単球(ドナー3)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
表10.単球(ドナー1)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
表11.単球(ドナー2)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
表12.単球(ドナー3)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
まださらなる一連の実験では、4G8に基づくFab−IL−10、Fab−scIL−10−Fab及びFab−IL−10M1−Fab構築物を比較した。単球によるIL−6、IL−1β、TNFα及びG−CSFのLPS誘発生成の抑制を、実験的構成(a)及び(b)において査定した。これらの実験の結果を、表13−17に示す(6名の異なるドナー)。結果は、2量体IL−10分子を含む構築物が、scIL−10又は単量体IL−10M1分子を含む構築物よりも効力が高いことを示す。
表13.単球によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表14.単球によるIL-6生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表15.単球によるIL-1β生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表16.単球によるG-CSF生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表17.単球によるTNFα生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表13.単球によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表14.単球によるIL-6生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表15.単球によるIL-1β生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表16.単球によるG-CSF生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
表17.単球によるTNFα生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
最後に、4B9及び4G8に基づくFab−IL−10及びIgG−(IL−10M1)2構築物を比較した。単球によるIL−6のLPS誘発生成の抑制を、実験的構成(a)及び(b)において査定した。この実験の結果を表19に示す。結果は、IgG−(IL−10M1)2を含む全ての構築物が、構成(a)よりも構成(b)においてよりよく実行することを示す。
表18.単球によるIL-6生成の抑制についての4B9 IgG-IL-10、4G8 IgG-IL-10及び4G8 IgG-(IL-10M1)2融合タンパク質のEC50値。
表18.単球によるIL-6生成の抑制についての4B9 IgG-IL-10、4G8 IgG-IL-10及び4G8 IgG-(IL-10M1)2融合タンパク質のEC50値。
初代単球上のMHC−II分子のIFNγ誘発上方制御の抑制
IgG及びFabに基づくFAP標的化IL−10構築物間の機能的特徴決定及びそれらの区別のために、単球でのIFNγ誘発MHC−II発現を抑制する能力を査定した。サイトカイン抑制アッセイと同様に、この実験は、溶液中にあるか(実験的構成(a);上を参照されたい)又は細胞培養プレートを被覆するFAPとの結合により固定化された(実験的構成(b);上を参照されたい)構築物を用いて実行した。原則として、単球を上記のようにして単離及び培養したが、250U/ml IFNγ(BD、#554616)で24時間刺激した。刺激の前に、細胞を、組換え野生型(wt)IL−10又は異なる抗体−IL−10融合構築物で任意選択的に処理した。インキュベーションの後に、細胞を、Accutase処理(PAA、#L11−007)により剥がし、3%ヒト血清(Sigma、#4522)を含有するPBS中の抗HLA−DR抗体(BD、#559866)で染色して、いずれの非特異的FcγR結合も回避し、その後、最終段階のFACS分析に供した。
IgG及びFabに基づくFAP標的化IL−10構築物間の機能的特徴決定及びそれらの区別のために、単球でのIFNγ誘発MHC−II発現を抑制する能力を査定した。サイトカイン抑制アッセイと同様に、この実験は、溶液中にあるか(実験的構成(a);上を参照されたい)又は細胞培養プレートを被覆するFAPとの結合により固定化された(実験的構成(b);上を参照されたい)構築物を用いて実行した。原則として、単球を上記のようにして単離及び培養したが、250U/ml IFNγ(BD、#554616)で24時間刺激した。刺激の前に、細胞を、組換え野生型(wt)IL−10又は異なる抗体−IL−10融合構築物で任意選択的に処理した。インキュベーションの後に、細胞を、Accutase処理(PAA、#L11−007)により剥がし、3%ヒト血清(Sigma、#4522)を含有するPBS中の抗HLA−DR抗体(BD、#559866)で染色して、いずれの非特異的FcγR結合も回避し、その後、最終段階のFACS分析に供した。
この実験の結果を表19に示し、この表は、4B9に基づく構築物について、IgG−IL−10分子が、実験的構成(b)において初代単球上のIFNγ誘発MHC−II発現の下方制御においてFab−IL−10構築物よりも優れていた(そして構成(a)では同等であった)ことを実証する。
表19.初代単球上でのIFNγ誘発MHC-II発現の下方制御についての4B9 IgG-IL-10及び4B9 Fab-IL-10のEC50値。
表19.初代単球上でのIFNγ誘発MHC-II発現の下方制御についての4B9 IgG-IL-10及び4B9 Fab-IL-10のEC50値。
単離初代単球におけるIL−10誘発STAT3リン酸化
IL−10Rシグナル伝達はSTAT3のリン酸化を導くので、いくつかの標的化IL−10構築物及びフォーマットを、新しく単離した血液単球を用いるpSTAT3アッセイにおいて機能的に評価した(Finbloom及びWinestock, J. Immunol. 1995; Moore等, Annu. Rev. Immunol. 2001; Mosser及びZhang, Immunological Reviews 2008)。簡単に述べると、CD14+単球を、上記のような健常ドナーのフィコール単離PBMCから手を付けずに分けた。典型的に、3−10×105細胞を、FACSチューブ中の300μlの培地(RPMI1640/10%FCS/L−グルタミン/pen/strep)中に移し、0−200/500nMのwtヒトIL−10又は示した抗体−IL−10融合タンパク質とともに、通常、37℃、5%CO2にて30分間インキュベートした。次いで、チューブあたり300μlの予め温めたFix緩衝液I(BD Biosciences、#557870)を加え、ボルテックスし、37℃にて10分間インキュベートした後に、細胞を2ml PBS/2%FCSで1回洗浄し、250×gにて10分間遠心分離した。その後、チューブあたり300μlの氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences、#558050)を細胞透過処理のために加え、氷上で30分間インキュベートした後に、細胞を上記のようにして再び洗浄した。最後に、細胞を100μl抗体希釈液(抗Stat−3.A647;BD Biosciences、#557815)中に再懸濁し、4℃にて30分間インキュベートした後に、細胞を洗浄し、FACS分析のために処理した。
IL−10Rシグナル伝達はSTAT3のリン酸化を導くので、いくつかの標的化IL−10構築物及びフォーマットを、新しく単離した血液単球を用いるpSTAT3アッセイにおいて機能的に評価した(Finbloom及びWinestock, J. Immunol. 1995; Moore等, Annu. Rev. Immunol. 2001; Mosser及びZhang, Immunological Reviews 2008)。簡単に述べると、CD14+単球を、上記のような健常ドナーのフィコール単離PBMCから手を付けずに分けた。典型的に、3−10×105細胞を、FACSチューブ中の300μlの培地(RPMI1640/10%FCS/L−グルタミン/pen/strep)中に移し、0−200/500nMのwtヒトIL−10又は示した抗体−IL−10融合タンパク質とともに、通常、37℃、5%CO2にて30分間インキュベートした。次いで、チューブあたり300μlの予め温めたFix緩衝液I(BD Biosciences、#557870)を加え、ボルテックスし、37℃にて10分間インキュベートした後に、細胞を2ml PBS/2%FCSで1回洗浄し、250×gにて10分間遠心分離した。その後、チューブあたり300μlの氷冷Perm緩衝液III(BD Biosciences、#558050)を細胞透過処理のために加え、氷上で30分間インキュベートした後に、細胞を上記のようにして再び洗浄した。最後に、細胞を100μl抗体希釈液(抗Stat−3.A647;BD Biosciences、#557815)中に再懸濁し、4℃にて30分間インキュベートした後に、細胞を洗浄し、FACS分析のために処理した。
この実験において異なる構築物について得られたEC50値を、表20及び21に示す。結果は、2量体IL−10分子(Fab又はIgGに基づく)を含む構築物が、scIL−10分子又は単量体IL−10M1分子を含む構築物よりも活性が高いことを示す。
表20.単離初代単球でのIL-10誘発STAT3リン酸化についての4G8に基づく抗体-IL-10融合タンパク質のEC50値。
表21.単離初代単球でのIL-10誘発STAT3リン酸化についての4B9に基づく抗体-IL-10融合タンパク質のEC50値。
表20.単離初代単球でのIL-10誘発STAT3リン酸化についての4G8に基づく抗体-IL-10融合タンパク質のEC50値。
表21.単離初代単球でのIL-10誘発STAT3リン酸化についての4B9に基づく抗体-IL-10融合タンパク質のEC50値。
FAP標的化及び非標的化抗体−IL−10融合タンパク質の体内分布
FAP標的化In−111標識4B9 IgG−IL−10、4G8 IgG−IL−10及び非標的化DP47GS IgG−IL10の組織体内分布を、マウスあたり50μgにて、予め決定した関節炎スコアが>3に達する(1回目の免疫化の28日後)コラーゲン誘発関節炎を有するDBA/1Jマウスにおいて決定した。体内分布は、群あたり5匹のマウスに放射性標識コンジュゲートをi.v.注射した72時間後に行った。
FAP標的化In−111標識4B9 IgG−IL−10、4G8 IgG−IL−10及び非標的化DP47GS IgG−IL10の組織体内分布を、マウスあたり50μgにて、予め決定した関節炎スコアが>3に達する(1回目の免疫化の28日後)コラーゲン誘発関節炎を有するDBA/1Jマウスにおいて決定した。体内分布は、群あたり5匹のマウスに放射性標識コンジュゲートをi.v.注射した72時間後に行った。
この実験の結果を表22に示す。炎症を起こした関節での非標的化抗体−IL−10融合タンパク質DP47GS IgG−IL−10の取り込みは、標的化IgG−IL−10融合タンパク質の取り込みよりも有意に低く(p<0.0001)、このことは、4B9 IgG−IL−10及び4G8 IgG−IL−10の取り込みがFAPにより媒介されることを示した。脾臓での取り込みは、IL−10により媒介される見込みが高い。なぜなら、3つ全ての構築物が同様のレベルの脾臓蓄積を示したからである。
表22.抗体構築物の取り込み(%注射用量/グラム組織)。
表22.抗体構築物の取り込み(%注射用量/グラム組織)。
IgG−IL−10の体内分布に与えるIL−10の影響を研究するために、第2の実験では、In−111標識4G8 IgG−IL−10の体内分布を、In−111標識4G8 IgGのものと比較した。
この実験の結果を表23に示す。4G8 IgGと4G8 IgG−IL−10との間で炎症を起こした関節での蓄積に有意な差はなく、このことは、lL−10が炎症部位への4G8 IgGの標的化に著しく影響しなかったことを示す。4G8 IgGI−IL−10の脾臓取り込みは、4G8 IgGのものよりも有意に高く(p<0.0001)、このことは、脾臓での取り込みが部分的にIL−10により媒介されることを示す。
表23.抗体構築物の取り込み(%注射用量/グラム組織)。
表23.抗体構築物の取り込み(%注射用量/グラム組織)。
明確な理解を目的として説明及び例示のために上記の発明をいくらか詳細に記載したが、上記の記載及び実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に引用する全ての特許及び科学文献の開示は、それらの全体が出典明示により本明細書に明示的に援用されている。
明確な理解を目的として説明及び例示のために上記の発明をいくらか詳細に記載したが、上記の記載及び実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に引用する全ての特許及び科学文献の開示は、それらの全体が出典明示により本明細書に明示的に援用されている。
<本発明の更なる実施態様>
[実施態様1]
IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
[実施態様2]
前記重鎖ポリペプチドのそれぞれが、IgGクラス抗体重鎖とIL−10単量体とを含む、実施態様1に記載の融合タンパク質。
[実施態様3]
前記IL−10単量体が、そのN末端にて前記IgGクラス抗体重鎖のC末端に融合し、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している、実施態様2に記載の融合タンパク質。
[実施態様4]
前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、IL−10単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる、実施態様1から3の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様5]
前記IL−10単量体が、天然IL−10単量体、特に天然ヒトIL−10単量体である、実施態様2から4の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様6]
前記IL−10単量体が、配列番号1のポリペプチド配列を含む、実施態様2から5の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様7]
前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体が、機能的ホモ2量体IL−10分子を形成する、実施態様2から5の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様8]
前記IL−10単量体が、改変IL−10単量体、特に改変ヒトIL−10単量体である、実施態様2から4の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様9]
前記改変IL−10単量体が、pH7.0、37℃にて単量体形態で安定である、実施態様8に記載の融合タンパク質。
[実施態様10]
前記IL−10単量体が、配列番号5のポリペプチド配列を含む、実施態様2から4、8及び9の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様11]
前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体が、互いにホモ2量体を形成しない、実施態様2から4及び8から10の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様12]
前記IgGクラス抗体が、改変を有さない対応するIgGクラス抗体と比較して、Fc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む、実施態様1から11の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様13]
前記Fc受容体が、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である、実施態様12に記載の融合タンパク質。
[実施態様14]
前記Fc受容体が、活性化Fc受容体である、実施態様12又は13に記載の融合タンパク質。
[実施態様15]
前記Fc受容体が、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)からなる群から選択される、実施態様12から14の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様16]
前記Fc受容体が、FcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである、実施態様12から15の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様17]
前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖の329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む、実施態様12から16の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様18]
前記アミノ酸置換が、P329Gである、実施態様17に記載の融合タンパク質。
[実施態様19]
前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖の234位及び235位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む、実施態様12から18の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様20]
前記アミノ酸置換が、L234A及びL235A(LALA)である、実施態様19に記載の融合タンパク質。
[実施態様21]
前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含む、実施態様12から20の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様22]
前記IgGクラス抗体が、IgG1サブクラス抗体である、実施態様1から21の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様23]
前記IgGクラス抗体が、全長抗体である、実施態様1から22の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様24]
前記IgGクラス抗体が、ヒト抗体である、実施態様1から23の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様25]
前記IgGクラス抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と特異的に結合できる、実施態様1から24の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様26]
融合タンパク質が、FAPと、表面プラズモン共鳴(SPR)により25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる、実施態様25に記載の融合タンパク質。
[実施態様27]
前記FAPが、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPである、実施態様25又は26に記載の融合タンパク質。
[実施態様28]
前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含む、実施態様25から27の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様29]
前記IgGクラス抗体が、配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含む、実施態様28に記載の融合タンパク質。
[実施態様30]
前記IgGクラス抗体が、配列番号37のHCDR1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51のLCDR1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含む、実施態様25から27の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様31]
前記IgGクラス抗体が、配列番号67のVHと、配列番号69のVLとを含む、実施態様30に記載の融合タンパク質。
[実施態様32]
融合タンパク質が、IL−10受容体−1(IL−10R1)と、SPRにより25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる、実施態様1から31の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様33]
前記IL−10R1が、ヒトIL−10R1である、実施態様32に記載の融合タンパク質。
[実施態様34]
IL−10R1との結合についての前記親和性定数(KD)が、SPRにより25℃にて測定した場合に、FAPとの結合についての前記親和性定数(KD)とほぼ等しいか又はそれより大きい、実施態様26に従属する場合の実施態様32に記載の融合タンパク質。
[実施態様35]
実施態様1から34の何れか一に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[実施態様36]
実施態様35に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
[実施態様37]
実施態様35に記載のポリヌクレオチド又は実施態様36に記載のベクターを含む宿主細胞。
[実施態様38]
実施態様1から34の何れか一に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、(i)実施態様37に記載の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、(ii)融合タンパク質を回収する工程とを含む方法。
[実施態様39]
実施態様38に記載の方法により生成される、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質。
[実施態様40]
実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
[実施態様41]
医薬として用いるための、実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質又は実施態様40に記載の薬学的組成物。
[実施態様42]
炎症性疾患の治療又は予防に用いるための、実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質又は実施態様40に記載の薬学的組成物。
[実施態様43]
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様42に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。
[実施態様44]
治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための、実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質の使用。
[実施態様45]
前記疾患が、炎症性疾患である、実施態様44に記載の使用。
[実施態様46]
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様45に記載の使用。
[実施態様47]
前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、実施態様44から46の何れか一に記載の使用。
[実施態様48]
個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
[実施態様49]
前記疾患が、炎症性疾患である、実施態様48に記載の方法。
[実施態様50]
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様49に記載の方法。
[実施態様51]
前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、実施態様48から50の何れか一に記載の方法。
[実施態様52]
本明細書で上に記載するとおりの発明。
<本発明の更なる実施態様>
[実施態様1]
IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
[実施態様2]
前記重鎖ポリペプチドのそれぞれが、IgGクラス抗体重鎖とIL−10単量体とを含む、実施態様1に記載の融合タンパク質。
[実施態様3]
前記IL−10単量体が、そのN末端にて前記IgGクラス抗体重鎖のC末端に融合し、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している、実施態様2に記載の融合タンパク質。
[実施態様4]
前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、IL−10単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる、実施態様1から3の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様5]
前記IL−10単量体が、天然IL−10単量体、特に天然ヒトIL−10単量体である、実施態様2から4の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様6]
前記IL−10単量体が、配列番号1のポリペプチド配列を含む、実施態様2から5の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様7]
前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体が、機能的ホモ2量体IL−10分子を形成する、実施態様2から5の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様8]
前記IL−10単量体が、改変IL−10単量体、特に改変ヒトIL−10単量体である、実施態様2から4の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様9]
前記改変IL−10単量体が、pH7.0、37℃にて単量体形態で安定である、実施態様8に記載の融合タンパク質。
[実施態様10]
前記IL−10単量体が、配列番号5のポリペプチド配列を含む、実施態様2から4、8及び9の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様11]
前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体が、互いにホモ2量体を形成しない、実施態様2から4及び8から10の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様12]
前記IgGクラス抗体が、改変を有さない対応するIgGクラス抗体と比較して、Fc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む、実施態様1から11の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様13]
前記Fc受容体が、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である、実施態様12に記載の融合タンパク質。
[実施態様14]
前記Fc受容体が、活性化Fc受容体である、実施態様12又は13に記載の融合タンパク質。
[実施態様15]
前記Fc受容体が、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)からなる群から選択される、実施態様12から14の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様16]
前記Fc受容体が、FcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである、実施態様12から15の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様17]
前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖の329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む、実施態様12から16の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様18]
前記アミノ酸置換が、P329Gである、実施態様17に記載の融合タンパク質。
[実施態様19]
前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖の234位及び235位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む、実施態様12から18の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様20]
前記アミノ酸置換が、L234A及びL235A(LALA)である、実施態様19に記載の融合タンパク質。
[実施態様21]
前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含む、実施態様12から20の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様22]
前記IgGクラス抗体が、IgG1サブクラス抗体である、実施態様1から21の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様23]
前記IgGクラス抗体が、全長抗体である、実施態様1から22の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様24]
前記IgGクラス抗体が、ヒト抗体である、実施態様1から23の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様25]
前記IgGクラス抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と特異的に結合できる、実施態様1から24の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様26]
融合タンパク質が、FAPと、表面プラズモン共鳴(SPR)により25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる、実施態様25に記載の融合タンパク質。
[実施態様27]
前記FAPが、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPである、実施態様25又は26に記載の融合タンパク質。
[実施態様28]
前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含む、実施態様25から27の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様29]
前記IgGクラス抗体が、配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含む、実施態様28に記載の融合タンパク質。
[実施態様30]
前記IgGクラス抗体が、配列番号37のHCDR1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51のLCDR1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含む、実施態様25から27の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様31]
前記IgGクラス抗体が、配列番号67のVHと、配列番号69のVLとを含む、実施態様30に記載の融合タンパク質。
[実施態様32]
融合タンパク質が、IL−10受容体−1(IL−10R1)と、SPRにより25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる、実施態様1から31の何れか一に記載の融合タンパク質。
[実施態様33]
前記IL−10R1が、ヒトIL−10R1である、実施態様32に記載の融合タンパク質。
[実施態様34]
IL−10R1との結合についての前記親和性定数(KD)が、SPRにより25℃にて測定した場合に、FAPとの結合についての前記親和性定数(KD)とほぼ等しいか又はそれより大きい、実施態様26に従属する場合の実施態様32に記載の融合タンパク質。
[実施態様35]
実施態様1から34の何れか一に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[実施態様36]
実施態様35に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
[実施態様37]
実施態様35に記載のポリヌクレオチド又は実施態様36に記載のベクターを含む宿主細胞。
[実施態様38]
実施態様1から34の何れか一に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、(i)実施態様37に記載の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、(ii)融合タンパク質を回収する工程とを含む方法。
[実施態様39]
実施態様38に記載の方法により生成される、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質。
[実施態様40]
実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
[実施態様41]
医薬として用いるための、実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質又は実施態様40に記載の薬学的組成物。
[実施態様42]
炎症性疾患の治療又は予防に用いるための、実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質又は実施態様40に記載の薬学的組成物。
[実施態様43]
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様42に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。
[実施態様44]
治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための、実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質の使用。
[実施態様45]
前記疾患が、炎症性疾患である、実施態様44に記載の使用。
[実施態様46]
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様45に記載の使用。
[実施態様47]
前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、実施態様44から46の何れか一に記載の使用。
[実施態様48]
個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の実施態様1から34及び39の何れか一に記載の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
[実施態様49]
前記疾患が、炎症性疾患である、実施態様48に記載の方法。
[実施態様50]
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様49に記載の方法。
[実施態様51]
前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、実施態様48から50の何れか一に記載の方法。
[実施態様52]
本明細書で上に記載するとおりの発明。
Claims (52)
- IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質であって、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
- 前記重鎖ポリペプチドのそれぞれが、IgGクラス抗体重鎖とIL−10単量体とを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記IL−10単量体が、そのN末端にて前記IgGクラス抗体重鎖のC末端に融合し、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、IgGクラス抗体重鎖と、IL−10単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる、請求項1から3の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IL−10単量体が、天然IL−10単量体、特に天然ヒトIL−10単量体である、請求項2から4の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IL−10単量体が、配列番号1のポリペプチド配列を含む、請求項2から5の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体が、機能的ホモ2量体IL−10分子を形成する、請求項2から5の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IL−10単量体が、改変IL−10単量体、特に改変ヒトIL−10単量体である、請求項2から4の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記改変IL−10単量体が、pH7.0、37℃にて単量体形態で安定である、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 前記IL−10単量体が、配列番号5のポリペプチド配列を含む、請求項2から4、8及び9の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記IL−10単量体が、互いにホモ2量体を形成しない、請求項2から4及び8から10の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、改変を有さない対応するIgGクラス抗体と比較して、Fc受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む、請求項1から11の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記Fc受容体が、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である、請求項12に記載の融合タンパク質。
- 前記Fc受容体が、活性化Fc受容体である、請求項12又は13に記載の融合タンパク質。
- 前記Fc受容体が、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)からなる群から選択される、請求項12から14の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記Fc受容体が、FcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである、請求項12から15の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖の329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む、請求項12から16の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記アミノ酸置換が、P329Gである、請求項17に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖の234位及び235位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含む、請求項12から18の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記アミノ酸置換が、L234A及びL235A(LALA)である、請求項19に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含む、請求項12から20の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、IgG1サブクラス抗体である、請求項1から21の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、全長抗体である、請求項1から22の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、ヒト抗体である、請求項1から23の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と特異的に結合できる、請求項1から24の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、FAPと、表面プラズモン共鳴(SPR)により25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる、請求項25に記載の融合タンパク質。
- 前記FAPが、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPである、請求項25又は26に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、配列番号37の重鎖CDR(HCDR)1と、配列番号41のHCDR2と、配列番号49のHCDR3と、配列番号53の軽鎖CDR(LCDR)1と、配列番号57のLCDR2と、配列番号61のLCDR3とを含む、請求項25から27の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、配列番号63の重鎖可変領域(VH)と、配列番号65の軽鎖可変領域(VL)とを含む、請求項28に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、配列番号37のHCDR1と、配列番号43のHCDR2と、配列番号47のHCDR3と、配列番号51のLCDR1と、配列番号55のLCDR2と、配列番号59のLCDR3とを含む、請求項25から27の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGクラス抗体が、配列番号67のVHと、配列番号69のVLとを含む、請求項30に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、IL−10受容体−1(IL−10R1)と、SPRにより25℃にて測定した場合に、1nMより小さく、特に100pMより小さい親和性定数(KD)で結合できる、請求項1から31の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IL−10R1が、ヒトIL−10R1である、請求項32に記載の融合タンパク質。
- IL−10R1との結合についての前記親和性定数(KD)が、SPRにより25℃にて測定した場合に、FAPとの結合についての前記親和性定数(KD)とほぼ等しいか又はそれより大きい、請求項26に従属する場合の請求項32に記載の融合タンパク質。
- 請求項1から34の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項35に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
- 請求項35に記載のポリヌクレオチド又は請求項36に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から34の何れか一項に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、(i)請求項37に記載の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、(ii)融合タンパク質を回収する工程とを含む方法。
- 請求項38に記載の方法により生成される、IgGクラス抗体とIL−10分子との融合タンパク質。
- 請求項1から34及び39の何れか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 医薬として用いるための、請求項1から34及び39の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項40に記載の薬学的組成物。
- 炎症性疾患の治療又は予防に用いるための、請求項1から34及び39の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項40に記載の薬学的組成物。
- 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、請求項42に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。
- 治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための、請求項1から34及び39の何れか一項に記載の融合タンパク質の使用。
- 前記疾患が、炎症性疾患である、請求項44に記載の使用。
- 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、請求項45に記載の使用。
- 前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、請求項44から46の何れか一項に記載の使用。
- 個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の請求項1から34及び39の何れか一項に記載の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
- 前記疾患が、炎症性疾患である、請求項48に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、請求項49に記載の方法。
- 前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、請求項48から50の何れか一項に記載の方法。
- 本明細書で上に記載するとおりの発明。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12179709.6 | 2012-08-08 | ||
EP12179709 | 2012-08-08 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018190250A Division JP6985232B2 (ja) | 2012-08-08 | 2018-10-05 | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021087426A true JP2021087426A (ja) | 2021-06-10 |
Family
ID=48917543
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015525845A Pending JP2015530983A (ja) | 2012-08-08 | 2013-08-05 | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 |
JP2018190250A Active JP6985232B2 (ja) | 2012-08-08 | 2018-10-05 | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 |
JP2021009946A Withdrawn JP2021087426A (ja) | 2012-08-08 | 2021-01-26 | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015525845A Pending JP2015530983A (ja) | 2012-08-08 | 2013-08-05 | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 |
JP2018190250A Active JP6985232B2 (ja) | 2012-08-08 | 2018-10-05 | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9346872B2 (ja) |
EP (1) | EP2882774B1 (ja) |
JP (3) | JP2015530983A (ja) |
KR (1) | KR20150038012A (ja) |
CN (1) | CN104540848B (ja) |
AR (1) | AR092050A1 (ja) |
AU (1) | AU2013301656A1 (ja) |
BR (1) | BR112015002085A2 (ja) |
CA (1) | CA2876285A1 (ja) |
CL (1) | CL2014003605A1 (ja) |
CO (1) | CO7151522A2 (ja) |
CR (1) | CR20140565A (ja) |
EA (1) | EA201500208A1 (ja) |
HK (1) | HK1209439A1 (ja) |
IL (1) | IL236809A0 (ja) |
MA (1) | MA20150232A1 (ja) |
MX (1) | MX2015001675A (ja) |
PE (1) | PE20150645A1 (ja) |
PH (1) | PH12015500284A1 (ja) |
SG (1) | SG11201408526SA (ja) |
TW (1) | TW201418283A (ja) |
WO (1) | WO2014023673A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201409304B (ja) |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG187746A1 (en) | 2010-08-13 | 2013-03-28 | Roche Glycart Ag | Anti-fap antibodies and methods of use |
KR101852245B1 (ko) | 2011-02-10 | 2018-04-25 | 로슈 글리카트 아게 | 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 |
CA2862516C (en) | 2012-03-27 | 2023-02-14 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
RU2704285C2 (ru) | 2013-01-30 | 2019-10-25 | Нгм Байофармасьютикалз, Инк. | Композиции и способы применения для лечения метаболических расстройств |
US9161966B2 (en) | 2013-01-30 | 2015-10-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | GDF15 mutein polypeptides |
UA118028C2 (uk) | 2013-04-03 | 2018-11-12 | Рош Глікарт Аг | Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування |
KR20160083884A (ko) | 2013-11-01 | 2016-07-12 | 스페리움 바이오메드 에스.엘. | 치료제 및 미용제의 경피 전달을 위한 봉입체 |
BR112016016658A2 (pt) * | 2014-02-06 | 2018-01-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | proteína de fusão de um anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, métodos para produzir uma proteína de fusão e de tratamento de uma doença em um indivíduo e uso da proteína de fusão |
JP6836500B2 (ja) | 2014-05-16 | 2021-03-03 | ベイラー リサーチ インスティテュートBaylor Research Institute | 自己免疫状態および炎症状態を治療するための方法および組成物 |
EP3174894B1 (en) | 2014-07-30 | 2021-06-23 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
MY186702A (en) | 2014-10-31 | 2021-08-11 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
CN108064237B (zh) | 2014-11-14 | 2022-02-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子 |
EP3233920B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-08-26 | Alkermes, Inc. | Single chain fc fusion proteins |
EP3973980A1 (en) | 2015-03-31 | 2022-03-30 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand |
AR106188A1 (es) | 2015-10-01 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización |
US10526413B2 (en) | 2015-10-02 | 2020-01-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific antibodies specific for OX40 |
US11219645B2 (en) | 2015-11-18 | 2022-01-11 | Duke University | Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer |
PE20181358A1 (es) * | 2015-12-04 | 2018-08-22 | Novartis Ag | Composiciones de anticuerpo injertado con citoquina y metodos para su uso en inmunorregulacion |
CN106349393B (zh) * | 2015-12-21 | 2020-10-30 | 合肥立方制药股份有限公司 | 一种增强抗体药物稳定性的结构 |
CA3016035A1 (en) | 2016-03-31 | 2017-10-05 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
EP3474884A4 (en) | 2016-06-22 | 2020-08-19 | Alkermes, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE IMMUNOSTIMULANT AND ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES OF IL-10 |
CN108948207B (zh) * | 2017-05-22 | 2020-11-13 | 杭州博虎生物科技有限公司 | 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用 |
BR112019024556A2 (pt) | 2017-05-24 | 2020-06-23 | Novartis Ag | Proteínas enxertadas com citocina de anticorpo e métodos para uso no tratamento de câncer |
JOP20190271A1 (ar) | 2017-05-24 | 2019-11-21 | Novartis Ag | بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة |
EP3688023A4 (en) * | 2017-09-25 | 2021-06-30 | Dingfu Biotarget Co., Ltd | PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT |
WO2019057180A1 (en) * | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Dingfu Biotarget Co., Ltd. | PROTEIN HETÉRODIMÈRE AND USE THEREOF |
WO2020047462A2 (en) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
JP7397874B2 (ja) | 2018-08-30 | 2023-12-13 | エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド | 多鎖キメラポリペプチドおよびその使用 |
CN113365663A (zh) | 2018-08-30 | 2021-09-07 | Hcw生物科技公司 | 单链嵌合多肽和其用途 |
WO2020108426A1 (zh) * | 2018-11-26 | 2020-06-04 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种人白细胞介素10变体及其衍生物 |
US11084857B2 (en) | 2018-12-05 | 2021-08-10 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Nsp-interleukin-10 proteins and uses thereof |
WO2020160244A1 (en) * | 2019-02-01 | 2020-08-06 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for il10 signaling antagonism |
EP3927728A2 (en) | 2019-02-21 | 2021-12-29 | Xencor, Inc. | Untargeted and targeted il-10 fc-fusion proteins |
KR20210139312A (ko) | 2019-03-06 | 2021-11-22 | 데카 바이오사이언시즈, 인크. | Il-10 변이체 분자, 및 염증 질환 및 종양학의 치료 방법 |
CN111909276A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-11-10 | 复旦大学 | 一种融合蛋白及其用途 |
KR20220020879A (ko) | 2019-06-12 | 2022-02-21 | 에스크진 파마, 아이엔씨. | 새로운 il-15 프로드럭 및 이를 사용하는 방법 |
KR20220035394A (ko) | 2019-06-21 | 2022-03-22 | 에이치씨더블유 바이올로직스, 인크. | 다중-사슬 키메라 폴리펩티드 및 이의 용도 |
EP3998282A4 (en) * | 2019-07-08 | 2023-08-09 | Progen Co., Ltd. | NEW FUSION PROTEIN AND ITS USE |
KR20210006300A (ko) * | 2019-07-08 | 2021-01-18 | 주식회사 프로젠 | 신규 알러지 질환 치료용 약학적 조성물 |
JP7497417B2 (ja) * | 2019-07-08 | 2024-06-10 | プロジェン・カンパニー・リミテッド | 新規il-10変異体タンパク質及びその用途 |
CN112625137B (zh) * | 2019-10-08 | 2021-10-08 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其医药用途 |
CN112618698B (zh) * | 2019-10-08 | 2021-10-08 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂 |
BR112022009938A2 (pt) | 2019-11-25 | 2022-09-13 | Alkermes Inc | Compostos macrocíclicos substituídos e métodos de tratamento relacionados |
EP4103599A1 (en) | 2020-02-11 | 2022-12-21 | HCW Biologics, Inc. | Methods of activating regulatory t cells |
IL295077A (en) | 2020-02-11 | 2022-09-01 | Hcw Biologics Inc | Methods for treating age-related and inflammatory diseases |
JP2023519106A (ja) | 2020-02-11 | 2023-05-10 | エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド | クロマトグラフィー樹脂およびその使用 |
CN115836087A (zh) | 2020-04-29 | 2023-03-21 | Hcw生物科技公司 | 抗cd26蛋白及其用途 |
KR20230009430A (ko) | 2020-05-12 | 2023-01-17 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 신규 il10 효능제 및 그의 사용 방법 |
WO2021230705A1 (ko) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | 주식회사 프로젠 | 신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도 |
US12024545B2 (en) | 2020-06-01 | 2024-07-02 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
WO2021247003A1 (en) | 2020-06-01 | 2021-12-09 | HCW Biologics, Inc. | Methods of treating aging-related disorders |
JP2023527869A (ja) | 2020-06-01 | 2023-06-30 | エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド | 加齢関連障害の治療法 |
AU2020459746A1 (en) * | 2020-07-20 | 2023-03-16 | Deka Biosciences, Inc. | Dual cytokine fusion proteins comprising IL-10 |
US20230279092A1 (en) * | 2020-07-20 | 2023-09-07 | Viela Bio, Inc. | Immunocytokines for treatment of autoimmune and inflammatory conditions |
WO2022124950A1 (en) * | 2020-12-10 | 2022-06-16 | Joint Stock Company "Biocad" | Immunocytokine for activating human il-10ra receptor and use thereof |
KR20220099656A (ko) * | 2021-01-07 | 2022-07-14 | 주식회사 프로젠 | 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도 |
US20240076331A1 (en) * | 2021-02-01 | 2024-03-07 | AskGene Pharma, Inc. | Chimeric Molecules Comprising an IL-10 or TGF-Beta Agonist Polypeptide |
CN116063570A (zh) * | 2021-11-02 | 2023-05-05 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | Il10单体融合蛋白及其应用 |
AU2023228683A1 (en) | 2022-03-02 | 2024-09-19 | Immunitybio, Inc. | Method of treating pancreatic cancer |
WO2024131864A1 (zh) * | 2022-12-21 | 2024-06-27 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | 一种il-10单体融合蛋白 |
WO2024144336A1 (ko) * | 2022-12-30 | 2024-07-04 | 주식회사 프로젠 | 신규 이중 특이성 융합단백질 및 그의 용도 |
WO2024146463A1 (zh) * | 2023-01-03 | 2024-07-11 | 深圳先进技术研究院 | 分泌白介素-10的细菌 |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1096187A (en) | 1977-04-18 | 1981-02-24 | Souhei Monden | Ornament adapted to be fixed by permanent magnets |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
DE68913658T3 (de) | 1988-11-11 | 2005-07-21 | Stratagene, La Jolla | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
JP4124480B2 (ja) | 1991-06-14 | 2008-07-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫グロブリン変異体 |
GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
ATE503496T1 (de) | 1992-02-06 | 2011-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
JP4460155B2 (ja) | 1997-12-05 | 2010-05-12 | ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート | マウス抗体のヒト化 |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
AU782626B2 (en) | 1999-10-04 | 2005-08-18 | Medicago Inc. | Method for regulating transcription of foreign genes |
US7432063B2 (en) | 2002-02-14 | 2008-10-07 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Methods for affinity maturation |
JP5128935B2 (ja) | 2004-03-31 | 2013-01-23 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ヒト化抗TGF−β抗体 |
WO2005100402A1 (en) | 2004-04-13 | 2005-10-27 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Anti-p-selectin antibodies |
ES2530340T3 (es) | 2004-07-15 | 2015-03-02 | Xencor Inc | Variantes de Fc optimizadas |
TWI309240B (en) | 2004-09-17 | 2009-05-01 | Hoffmann La Roche | Anti-ox40l antibodies |
CA2648484A1 (en) | 2006-05-08 | 2007-11-15 | Philogen Spa | Antibody-targeted cytokines for therapy |
DK2209805T3 (en) * | 2007-10-30 | 2017-10-16 | Philogen Spa | Antigen associated with rheumatoid arthritis |
EP2310417A4 (en) * | 2008-07-11 | 2012-01-11 | Forskarpatent I Syd Ab | FOR OXIDIZED LDL SPECIFIC ANTIBODY FUSION AND CONJUGATED PROTEINS |
AR077879A1 (es) | 2009-08-17 | 2011-09-28 | Roche Glycart Ag | Inmunoconjugados dirigidos |
SG187746A1 (en) | 2010-08-13 | 2013-03-28 | Roche Glycart Ag | Anti-fap antibodies and methods of use |
CN103476795B (zh) | 2011-03-29 | 2016-07-06 | 罗切格利卡特公司 | 抗体Fc变体 |
EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
BR112016016658A2 (pt) | 2014-02-06 | 2018-01-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | proteína de fusão de um anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, métodos para produzir uma proteína de fusão e de tratamento de uma doença em um indivíduo e uso da proteína de fusão |
-
2013
- 2013-08-05 CA CA2876285A patent/CA2876285A1/en not_active Abandoned
- 2013-08-05 BR BR112015002085A patent/BR112015002085A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-08-05 CN CN201380041222.1A patent/CN104540848B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-08-05 SG SG11201408526SA patent/SG11201408526SA/en unknown
- 2013-08-05 WO PCT/EP2013/066342 patent/WO2014023673A1/en active Application Filing
- 2013-08-05 US US13/959,051 patent/US9346872B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-08-05 EP EP13745407.0A patent/EP2882774B1/en active Active
- 2013-08-05 JP JP2015525845A patent/JP2015530983A/ja active Pending
- 2013-08-05 AU AU2013301656A patent/AU2013301656A1/en not_active Abandoned
- 2013-08-05 MA MA37793A patent/MA20150232A1/fr unknown
- 2013-08-05 EA EA201500208A patent/EA201500208A1/ru unknown
- 2013-08-05 MX MX2015001675A patent/MX2015001675A/es unknown
- 2013-08-05 PE PE2015000169A patent/PE20150645A1/es not_active Application Discontinuation
- 2013-08-05 KR KR1020157003225A patent/KR20150038012A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-08-06 AR ARP130102781A patent/AR092050A1/es unknown
- 2013-08-07 TW TW102128385A patent/TW201418283A/zh unknown
-
2014
- 2014-12-05 CR CR20140565A patent/CR20140565A/es unknown
- 2014-12-12 CO CO14273530A patent/CO7151522A2/es unknown
- 2014-12-17 ZA ZA2014/09304A patent/ZA201409304B/en unknown
- 2014-12-31 CL CL2014003605A patent/CL2014003605A1/es unknown
-
2015
- 2015-01-19 IL IL236809A patent/IL236809A0/en unknown
- 2015-02-09 PH PH12015500284A patent/PH12015500284A1/en unknown
- 2015-10-20 HK HK15110298.1A patent/HK1209439A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-04-27 US US15/140,414 patent/US10040843B2/en active Active
-
2018
- 2018-10-05 JP JP2018190250A patent/JP6985232B2/ja active Active
-
2021
- 2021-01-26 JP JP2021009946A patent/JP2021087426A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20140044674A1 (en) | 2014-02-13 |
JP2019033755A (ja) | 2019-03-07 |
ZA201409304B (en) | 2017-09-27 |
MA20150232A1 (fr) | 2015-07-31 |
US20160340413A1 (en) | 2016-11-24 |
JP2015530983A (ja) | 2015-10-29 |
EA201500208A1 (ru) | 2015-07-30 |
CO7151522A2 (es) | 2014-12-29 |
SG11201408526SA (en) | 2015-03-30 |
EP2882774A1 (en) | 2015-06-17 |
HK1209439A1 (en) | 2016-04-01 |
BR112015002085A2 (pt) | 2017-12-19 |
WO2014023673A1 (en) | 2014-02-13 |
IL236809A0 (en) | 2015-03-31 |
MX2015001675A (es) | 2015-04-10 |
JP6985232B2 (ja) | 2021-12-22 |
CN104540848A (zh) | 2015-04-22 |
CR20140565A (es) | 2015-02-12 |
CN104540848B (zh) | 2019-05-31 |
CL2014003605A1 (es) | 2015-04-06 |
EP2882774B1 (en) | 2018-10-03 |
TW201418283A (zh) | 2014-05-16 |
AR092050A1 (es) | 2015-03-18 |
US9346872B2 (en) | 2016-05-24 |
PE20150645A1 (es) | 2015-05-11 |
CA2876285A1 (en) | 2014-02-13 |
AU2013301656A1 (en) | 2015-01-15 |
KR20150038012A (ko) | 2015-04-08 |
US10040843B2 (en) | 2018-08-07 |
PH12015500284A1 (en) | 2015-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6985232B2 (ja) | インターロイキン−10融合タンパク質及びその使用 | |
JP2022095643A (ja) | インターロイキン-10イムノコンジュゲート | |
US11365232B2 (en) | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof | |
US20230312710A1 (en) | Anti-human cd19 antibodies with high affinity | |
TWI818387B (zh) | 結合cd3之抗體 | |
JP2018046823A (ja) | Fap及びdr5に特異的な二重特異性抗体、dr5に特異的な抗体並びに使用の方法 | |
TW202116806A (zh) | 結合nkg2d之抗體 | |
TW202208436A (zh) | 與cd3及cd19結合之抗體 | |
TW202428614A (zh) | 結合cd3之抗體 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210224 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210224 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20211129 |