CN111909276A - 一种融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属医药领域，涉及一种新型融合蛋白，所述的融合蛋白通过与动脉粥样硬化斑块中沉积细胞表面的CD47分子结合，阻断其向巨噬细胞传递信号，解除其对巨噬细胞吞噬功能的抑制，促使巨噬细胞吞噬动脉粥样硬化斑块中的沉积细胞，延缓及逆转动脉粥样硬化病程进展。经动脉粥样硬化早期和中晚期模型小鼠动物实验证实，注射该融合蛋白后，实验小鼠主动脉全长、主动脉根部以及主动脉弓处的斑块面积显著下降。该融合蛋白能用于延缓及逆转动脉粥样硬化模型动物病程进展，以及减少其相关急性心血管事件发生，进一步制备临床治疗动脉粥样硬化的新药物。

Description

一种融合蛋白及其用途
技术领域
本发明属医药领域，涉及一种新型融合蛋白，本发明的融合蛋白通过与动脉粥样硬化斑块中沉积细胞表面的CD47分子结合，阻断其向巨噬细胞传递信号，解除其对巨噬细胞吞噬功能的抑制，促使巨噬细胞吞噬动脉粥样硬化斑块中的沉积细胞，延缓及逆转动脉粥样硬化病程进展。进一步用于制备临床治疗动脉粥样硬化的新药物。
背景技术
现有技术公开了动脉粥样硬化是最常见心血管疾病之一，同时也是导致急性心血管事件发生及导致死亡的病理基础。动脉粥样硬化的病理学表现是内皮下脂质沉积，引起巨噬细胞因吞噬脂质形成泡沫细胞，形成粥样斑块[1]。冠状动脉粥样硬化的形成会导致管腔狭窄，远端血管堵塞，引起相关的急性心血管事件如急性心肌梗死、不稳定心绞痛等的发生，从而严重威胁到患者的生命[2]。
研究显示，动脉粥样硬化的形成分为四个阶段[3]：首先是脂纹期，动脉血管内皮细胞受到各种有害刺激(高血压、高血糖、高血脂、氧化应激等)时被激活，内皮通透性增加，氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)在内皮下集聚，同时内皮细胞分泌粘附分子如ICAM-1等，促进单核细胞粘附，巨噬细胞通过表面的清道夫受体结合摄取ox-LDL，形成泡沫细胞，大量泡沫细胞聚集形成脂纹，内皮隆起变形；其次是纤维形成期，内皮细胞分泌的细胞因子和生长因子，诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移，伴随斑块表面胶原纤维不断生成、增厚，在斑块表面形成由纤维组织、平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞构成的纤维帽；再次是粥样斑块期，血管内膜表面隆起灰黄色斑块，斑块核心是富含脂质的主要由泡沫细胞组成的粥样物质；最终，斑块进入不稳定期，形成复合性病变，产生斑块内出血、斑块破裂和血栓形成等[4,5]。
目前，动脉粥样硬化发病的具体分子机制尚不明确，临床实践对动脉粥样硬化的治疗仍以他汀治疗为主，实践显示，所述药物只能起到控制、减缓病程的作用，对于已形成的斑块，临床上尚未显示有效果确切的治疗药物[6,7]。
有研究报道了SIRPα-CD47信号通路在动脉粥样硬化领域的应用；所述AS的斑块核心中堆积了大量吞噬了脂质而形态功能改变的泡沫细胞，主要来源于巨噬细胞、平滑肌细胞等；其本该被周围的巨噬细胞等固有免疫细胞吞噬清除，但巨噬细胞对其却“视而不见”[8,9]。所述斑块核心里的泡沫细胞积累会导致斑块扩大、血管狭窄、炎症恶化等，但是其积累的原因尚不完全明确。有研究指出，该类细胞表面高表达CD47蛋白是其阻断吞噬的重要原因之一[10,11]。
CD47是一种在多种细胞表面表达的跨膜糖蛋白，对免疫系统有重要的负调节作用[12]，尤其是对巨噬细胞的调控，CD47能和巨噬细胞上的SIRPα分子相互作用从而向巨噬细胞传导“Don’t eat me”的信号，最终抑制巨噬细胞的吞噬和其功能而CD47在癌症细胞和动脉粥样硬化斑块细胞的高表达，可以给巨噬细胞无法正常清除病变的斑块中的泡沫细胞，导致固有免疫的失效[13,14]。
Yoko kojima等研究证实[15]，抗CD47抗体可增强巨噬细胞对斑块中的病变细胞的清除能力，对动脉粥样硬化模型小鼠的动脉粥样硬化有显著治疗效果，但抗体尚存在一些问题，例如亲和位点可能与内源性配体不同，从而效果不佳；半衰期短，在体内不稳定，易被代谢清除等。所以选择内源性配体可能会有更好的效果，而SIRPα正是其重要的内源性配体。
SIRPα是在巨噬细胞和其他一些髓系免疫细胞表面表达的一种抑制性受体，可与CD47特异性结合，当CD47和SIRPα结合时，会引起SHP-1和SHP-2磷酸酶的激活，通过下游介质抑制巨噬细胞的吞噬作用。因此，SIRPα-CD47信号通路是通过免疫疗法治疗AS的关键通路[16]。
如拟阻断体内的SIRPα-CD47信号通路，可通过外源给药大量SIRPα，从而与体内巨噬细胞上的SIRPα竞争性结合CD47，阻断CD47的“不要吃我”信号，使巨噬细胞能够识别斑块中的受损细胞，并进行吞噬清除；而外源SIRPα在体内单独存在并不稳定，易被代谢消除，而与天然Igg的Fc段融合可以延长其半衰期，显著提升其药效；基于现有技术的现状，本发明人拟提供一种融合蛋白及其用途，采用SIRPα-Fc融合蛋白阻断CD47-SIRPα通路，对其治疗动脉粥样硬化的作用进行研究。迄今，尚未见有SIRPα-Fc融合蛋白治疗动脉粥样硬化的相关报道。
与本发明有关的参考文献：
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[5]
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发明内容
本发明的目的是提供一种新的融合蛋白及其用途，具体涉及一种治疗动脉粥样硬化的新型融合蛋白，该新型融合蛋白为一种用于延缓甚至逆转动脉粥样硬化模型动物病程进展的新型融合蛋白。
本发明提供了一种融合蛋白，包含但不限于SIRPα-Fc融合蛋白、SIRPαD1-Fc融合蛋白、SIRPα-HSA融合蛋白、SIRPα-XTEN融合蛋白。
本发明中优选融合蛋白为SIRPα-Fc融合蛋白；其基因序列如SEQ.01所示；其氨基酸序列如SEQ.02所示。
本发明中经动脉粥样硬化早期和中晚期模型小鼠动物实验证实，注射该融合蛋白后，实验小鼠主动脉全长、主动脉根部以及主动脉弓处的斑块面积显著下降。该融合蛋白能用于延缓及逆转动脉粥样硬化模型动物病程进展，以及减少其相关急性心血管事件发生，进一步用于制备临床治疗动脉粥样硬化的新药物。
更具体的，本发明的新型融合蛋白，能通过与动脉粥样硬化斑块中沉积细胞表面的CD47分子结合，阻断其向巨噬细胞传递“Don’t eat me”信号，从而解除其对巨噬细胞吞噬功能的抑制，招募巨噬细胞对斑块进行吞噬，促进巨噬细胞吞噬动脉粥样硬化斑块中的沉积细胞，从而从根本上缩小斑块面积，从而治疗动脉粥样硬化。
本发明提供了所述的融合蛋白在制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的用途。
所述的融合蛋白通过与动脉粥样硬化斑块中沉积细胞表面的CD47分子结合，阻断其向巨噬细胞传递“Don’t eat me”信号，解除其对巨噬细胞吞噬功能的抑制，招募巨噬细胞对斑块进行吞噬，促进巨噬细胞吞噬动脉粥样硬化斑块中的沉积细胞，缩小斑块面积。
本发明所述的动脉粥样硬化疾病是冠心病、不稳定心绞痛。
本发明还提供了所述的融合蛋白在制备检测动脉粥样硬化、冠心病、不稳定心绞痛病人血管及斑块微环境中CD47水平制剂中的应用。
本发明提供了一种治疗动脉粥样硬化的新型融合蛋白，该融合蛋白为可用于延缓甚至逆转动脉粥样硬化模型动物病程进展，以及减少其相关急性心血管事件发生的新型融合蛋白；所述新型融合蛋白通过与动脉粥样硬化斑块中沉积细胞表面的CD47分子结合，阻断其向巨噬细胞传递“Don’t eat me”信号，解除其对巨噬细胞吞噬功能的抑制，从而促使巨噬细胞吞噬动脉粥样硬化斑块中的沉积细胞，进而延缓甚至逆转动脉粥样硬化病程进展。本发明的动物实验中，给动脉粥样硬化早期和中晚期模型小鼠注射该融合蛋白后，相比于注射生理盐水或同型Igg的对照组，其主动脉全长、主动脉根部以及主动脉弓处的斑块面积显著下降。本发明所述新型融合蛋白经进一步制成临床治疗动脉粥样硬化的全新药物。
附图说明
图1显示了RAW264.7细胞和MOVAS细胞经过ox-LDL诱导后变为泡沫细胞。
图2显示了RAW264.7细胞核MOVAS细胞在转变为泡沫细胞的同时其表面CD47水平显著上升。
图3.显示了本发明所述新型融合蛋白SIRPα-Fc能激活巨噬细胞，使其吞噬泡沫细胞。
图4显示了本发明所述新型融合蛋白SIRPα-Fc能激活巨噬细胞对于泡沫细胞的胞葬效应。
图5显示了ApoE-/-早期动脉粥样硬化模型小鼠经新型融合蛋白治疗后其血管内斑块数量减少。
图6显示了ApoE-/-早期动脉粥样硬化模型小鼠经新型融合蛋白治疗后其主动脉及其根部的脂质沉积斑块面积显著缩小。
图7显示了ApoE-/-晚期动脉粥样硬化模型小鼠经新型融合蛋白治疗后其血管内斑块数量减少。
图8显示了ApoE-/-晚期动脉粥样硬化模型小鼠经新型融合蛋白治疗后其主动脉及其根部的脂质沉积斑块面积显著缩小。
具体实施方式
实施例1
细胞造模：
RAW264.7、MOVAS细胞处于对数生长期时，胰酶消化离心后，将细胞以3％血清重悬，以10000/ml的浓度种于6孔板，加入25、50、75μg/ml的氧化低密度脂蛋白24h后，油红O染色检验造模是否成功；结果如图1所示，在加入不同浓度的ox-LDL之后，细胞内油红O染色部分显著增加，并呈一定剂量依赖性；结果表明，所述造模方法能够诱导产生泡沫细胞，且在50μg/mL、75μg/mL的浓度下，造模率可达90％以上。
蛋白质印迹法(Western Blot)检测造模成功细胞的CD47表达：
将造模成功后的细胞用细胞刮刀刮下后收集并裂解，使用蛋白质印迹法(WesternBlot)进行检验；结果如图2所示，发现CD47在造模组均比Control组有一定上升，结果表明，CD47确实会在泡沫细胞中有一定升高，阻止其被吞噬，所述细胞模型适合用于检测所述融合蛋白药效。
胞葬实验检测融合蛋白SIRPα-Fc对巨噬细胞的促吞噬效果：
如图3所示，在造模后的RAW264.7细胞和MOVAS细胞里，SIRPα-Fc融合蛋白组ANA-1细胞对泡沫细胞的吞噬率(29％，38％)与对照组(8％，13％)相比显著上升；结果表明，SIRPα-Fc融合蛋白可能可以通过激活正常功能的巨噬细胞吞噬泡沫细胞来治疗动脉粥样硬化。
LDH释放实验对融合蛋白SIRPα-Fc对巨噬细胞的促吞噬效果进行佐证：
如图4所示，在造模后的RAW264.7细胞和MOVAS细胞里，SIRPα-Fc融合蛋白组在加入活化处理后的ANA-1细胞后，泡沫细胞的LDH释放与对照组相比都显著上升；结果表明，SIRPα-Fc融合蛋白可能可以通过激活正常功能的巨噬细胞吞噬泡沫细胞来治疗动脉粥样硬化。
融合蛋白SIRPα-Fc对动脉粥样硬化早期模型小鼠的治疗作用：
此外，对ApoE-/-小鼠喂食8周高脂饲料，并用SIRPα-Fc对其进行给药治疗，结果如图5所示，其主动脉弓处斑块相比对照组有显著降低；此外，对其主动脉全长进行了油红O染色并统计染色面积，结果如图6所示，SIRPα-Fc融合蛋白给药组的主动脉全长的油红O染色面积相比于对照组显著降低；同时，对主动脉根部的切片进行油红O染色，统计其狭窄情况；结果显示，SIRPα-Fc融合蛋白给药组的主动脉根部切片的油红O染色面积占主动脉根部总面积的比例相比于对照组显著降低；结果表明，所述融合蛋白SIRPα-Fc对动脉粥样硬化早期模型小鼠有治疗作用。
融合蛋白SIRPα-Fc对动脉粥样硬化中晚期模型小鼠的治疗作用：
给ApoE-/-小鼠喂食12周高脂饲料，并用SIRPα-Fc对其进行给药治疗，结果如图7所示，其主动脉弓处斑块相比对照组同样也是显著降低的；随后，对其主动脉全长进行油红O染色并统计染色面积，结果如图8所示，SIRPα-Fc融合蛋白给药组的主动脉全长的油红O染色面积相比于对照组显著降低；同时，对主动脉根部的切片进行油红O染色，统计其狭窄情况；SIRPα-Fc融合蛋白给药组的主动脉根部切片的油红O染色面积占主动脉根部总面积的比例相比于对照组显著降低；上述结果表明，所述融合蛋白SIRPα-Fc对动脉粥样硬化中晚期模型小鼠同样也具有治疗作用。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种融合蛋白及其用途
<130> 20190510
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1782
<212> DNA
<213> SIRPα-Fc
<400> 1
atgggctgga gctgcatcat cctgttcctc gtggccacag ctacaggagt gcacagcgaa 60
gaggagctgc aggtcatcca gccagacaag agcgtgctgg tggcagcagg agaaacagct 120
accctccgct gtaccgccac cagtctgatt cccgtgggcc caatccagtg gtttagagga 180
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accgtgtccg acctgaccaa gcggaacaac atggacttca gcatccggat cggcaacatc 300
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agcaggaccc cagaagtgac ttgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga ccctgaagtg 1260
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ctaagaccaa gcccagggag 1320
gagcagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 1380
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ctctgccagc ccctatcgag 1440
aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct agagagcctc aggtgtacac cctgcctcct 1500
tctcgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tccctgactt gcctcgtgaa gggcttctac 1560
cctagcgaca tcgccgtcga gtgggaatct aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1620
acacctccag tgctggatag cgacggaagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1680
aaaagccgct ggcagcaggg caacgtgttt tcttgcagcg tgatgcacga ggctctgcac 1740
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tctccaggca ag 1782
<210> 2
<211> 604
<212> PRT
<213> SIRPα-Fc
<400> 2
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser
35 40 45
Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly
50 55 60
Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg
85 90 95
Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu
145 150 155 160
Ser His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn
165 170 175
Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu
180 185 190
Ser Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg
195 200 205
Glu Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu
210 215 220
Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg
225 230 235 240
Val Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn
245 250 255
Gln Val Asn Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu
260 265 270
Gln Leu Thr Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala
275 280 285
Ser Thr Val Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp
290 295 300
Leu Leu Val Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys
305 310 315 320
Gln Val Glu His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu
325 330 335
Lys Val Ser Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu
340 345 350
Asn Thr Gly Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Gly
355 360 365
Ser Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
370 375 380
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
385 390 395 400
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
405 410 415
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
420 425 430
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
435 440 445
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
450 455 460
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
465 470 475 480
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
485 490 495
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
500 505 510
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
515 520 525
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
530 535 540
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
545 550 555 560
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
565 570 575
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
580 585 590
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600

Claims (7)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含但不限于SIRPα-Fc融合蛋白、SIRPαD1-Fc融合蛋白、SIRPα-HSA融合蛋白、SIRPα-XTEN融合蛋白。
2.按权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为SIRPα-Fc融合蛋白。
3.按权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPα-Fc融合蛋白的基因序列如SEQ.01所示；其氨基酸序列如SEQ.02所示。
4.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的用途。
5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的融合蛋白通过与动脉粥样硬化斑块中沉积细胞表面的CD47分子结合，阻断其向巨噬细胞传递“Don’t eat me”信号，解除其对巨噬细胞吞噬功能的抑制，招募巨噬细胞对斑块进行吞噬，促进巨噬细胞吞噬动脉粥样硬化斑块中的沉积细胞，缩小斑块面积。
6.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的动脉粥样硬化疾病是冠心病、不稳定心绞痛。
7.权利要求1所述的融合蛋白在制备检测动脉粥样硬化、冠心病、不稳定心绞痛病人血管及斑块微环境中CD47水平制剂中的应用。
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