JP2019033755A - インターロイキン−１０融合タンパク質及びその使用 - Google Patents

インターロイキン−１０融合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】抗体とインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）との融合タンパク質の提供。【解決手段】ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質。該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞。さらに、該融合タンパク質を生成する方法及び疾患の治療における融合タンパク質を用いる方法。【選択図】なし

Description

本発明は、一般的に、抗体とインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）との融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、本発明の融合タンパク質を生成する方法及び疾患の治療において本発明の融合タンパク質を用いる方法に関する。
ＩＬ−１０の生物学的機能
ＩＬ−１０は、〜３７ｋＤａの非共有結合したホモ２量体として発現されるα−ヘリックスサイトカインである。ＩＬ−１０は、寛容性の誘導及び維持において重要な役割を演じる。ＩＬ−１０の優勢な抗炎症性の特性については、長い間知られている。ＩＬ−１０は、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２のような炎症誘発性サイトカイン並びにＩＬ−２及びＩＦＮγのようなＴｈ１サイトカインの分泌を抑制し、マクロファージ、Ｂ細胞及びＴ細胞の分化及び増殖をコントロールする（Glocker, E.O.等, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011); Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); de Waal Malefyt, R.等, J. Exp. Med. 174, 915-924 (1991); Williams, L.M.等, Immunology 113, 281-292 (2004)）。さらに、ＩＬ−１０は、ＭＨＣＩＩ発現並びに同時刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御を阻害する、抗原提示の阻害剤としての能力を有する（Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)）。
それにもかかわらず、免疫賦活特性も報告されている。ＩＬ−１０は、Ｂ細胞活性化を同時刺激し、Ｂ細胞生存を引き延ばし、Ｂ細胞におけるクラススイッチに貢献できる。さらに、ＩＬ−１０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞増殖及びサイトカイン生成を同時刺激し、ＣＤ８＋Ｔ細胞のある種のサブセットの増殖を刺激する増殖因子として働くことができる（Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008); Cai, G.等, Eur. J. Immunol. 29, 2658-2665 (1999); Santin, A.D.等, J. Virol. 74, 4729-4737 (2000); Rowbottom, A.W.等, Immunology 98, 80-89 (1999); Groux, H.等, J. Immunol. 160, 3188-3193 (1998)）。重要なことに、ヒトにおける高用量のＩＬ−１０（それぞれ２０及び２５μｇ／ｋｇ）は、ＩＦＮγの生成の増加を導くことができる（Lauw, F.N.等, J. Immunol. 165, 2783-2789 (2000); Tilg, H.等, Gut 50, 191-195 (2002)）。
ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０受容体１（ＩＬ−１０Ｒ１）とＩＬ−１０Ｒ２とのそれぞれの２コピーからなる２受容体複合体を通じてシグナル伝達する。ＩＬ−１０Ｒ１は、ＩＬ−１０と比較的高い親和性（〜３５−２００ｐＭ）で結合し（Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001)）、受容体複合体へのＩＬ−１０Ｒ２の動員は、リガンド結合に対してわずかな貢献だけをもたらす。しかし、この第２受容体が複合体と係合することにより、リガンド結合の後にシグナル伝達ができる。よって、機能的受容体は、ＩＬ−１０Ｒ１とＩＬ−１０Ｒ２とのヘテロ２量体の２量体からなる。ほとんどの造血細胞は、低レベルのＩＬ−１０Ｒ１を構成的に発現し、受容体発現は、しばしば、様々な刺激因子により劇的に上方制御されることがある。線維芽細胞及び上皮細胞のような非造血細胞も、ＩＬ−１０Ｒ１を上方制御することにより刺激因子に応答できる。対照的に、ＩＬ−１０Ｒ２はほとんどの細胞上で発現される。ＩＬ−１０が受容体複合体と結合することにより、ＩＬ−１０Ｒ１及びＩＬ−１０Ｒ２とそれぞれ会合しているヤヌスチロシンキナーゼであるＪＡＫ１及びＴｙｋ２が活性化され、受容体の細胞質内尾部がリン酸化される。このことにより、ＳＴＡＴ３がＩＬ−１０Ｒ１に動員される。ＳＴＡＴ３のホモ２量体形成により、受容体からＳＴＡＴ３が放出され、リン酸化されたＳＴＡＴホモ２量体が核に移動して、様々な遺伝子のプロモーター中のＳＴＡＴ３結合エレメントと結合する。これらの遺伝子の１つは、ＩＬ−１０自体であり、これは、ＳＴＡＴ３により正に制御される。ＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴ活性化の質及び量をコントロールするサイトカインシグナリング３（ＳＯＣＳ３）の抑制因子も活性化する。ＳＯＣＳ３は、ＩＬ−１０により誘導され、様々なサイトカイン遺伝子に対して負の調節効果を発揮する（Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205.218 (2008)）。
遺伝子連鎖解析及び候補遺伝子配列決定により、ＩＬ−１０Ｒ１及びＩＬ−１０Ｒ２における変異と炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の一形態である早期発症型腸炎との間の直接的な関連が明らかになった（Glocker, E.O.等, N. Engl. J. Med. 361(21), 2033-2045 (2009)）。最近のデータは、早期発症型ＩＢＤが一遺伝子によるものであり得ることさえ示唆している。ＩＬ−１０サイトカイン又はその受容体の変異は、ＩＬ−１０機能の喪失を導き、幼児及び小児において重度の腸炎を引き起こす（Glocker, E.O.等, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011)）。さらに、重症形態のクローン病の患者は、全血細胞培養物及び単球由来樹状細胞においてＩＬ−１０生成が欠損している（Correa, I.等, J. Leukoc. Biol. 85(5), 896-903 (2009)）。米国において約１．４百万人及び欧州において２．２百万人がＩＢＤに罹患している（Carter, M.J.等, Gut 53 (Suppl. 5), V1-V16 (2004); Engel, M.A.及びNeurath, M.F., J. Gastroenterol. 45, 571-583 (2010)）。
ＩＬ−１０を用いる治療アプローチ
炎症性障害及び自己免疫疾患における組換えＩＬ−１０の治療上の利益は、様々な背景にて健常ボランティア及び特定の患者集団に静脈内又は皮下で投与した単回又は複数回用量の安全性、寛容性、薬物動態、薬力学、免疫学的及び血液学的効果を調べる第Ｉ相及び第ＩＩ相の臨床試験において査定されている（Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E.等, J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995); Huhn, R.D.等, Blood 87, 699-705 (1996); Huhn, R.D.等, Clin. Pharmacol. Ther. 62, 171-180 (1997)）。ＩＬ−１０は、２５μｇ／ｋｇまでの用量では重度の副作用はなく良好な耐容性があり、軽度から中程度のインフルエンザ様症状だけが、１００μｇ／ｋｇまでの用量のレシピエントの一部分で観察された（Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Chernoff, A.E.等, J. Immunol. 154, 5492-5499 (1995)）。臨床上の改善に向けた傾向が、乾癬（編集された臨床研究は、Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)で見出すことができる）、クローン病（Van Deventer S.J.等, Gastroenterology 113, 383-389 (1997); Fedorak, R.N.等, Gastroenterology 119, 1473-1482 (2000); Schreiber, S.等, Gastroenterolotgy 119, 1461-1472 (2000); Colombel J.F.等, Gut 49, 42-46 (2001)）及び関節リウマチ（Keystone, E.等, Rheum. Dis. Clin. N. Am. 24, 629-639 (1998); Mosser, D.M.及びYhang, X., Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)）において最も頻繁に見られた。
全体的に、臨床結果は満足できないものであり、アミノ末端のメチオニン残基以外は内因性ヒトＩＬ−１０と同一である組換えヒトＩＬ−１０（イロデカキン、ＴＥＮＯＶＩＬ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）の臨床開発は、有効性の欠如により中止された。クローン病の寛解を導くための組換えヒトＩＬ−１０の有効性及び寛容性についての最近の系統的なレビューは、完全又は臨床寛解についてＩＬ−１０とプラセボとの間に統計的に有意な差を見出さず、ＩＬ−１０で治療された患者は、プラセボと比べて、有害事象のために研究を取りやめる可能性が著しくより高かったと述べている（Buruiana, F.E.等, Cochrane Database Syst. Rev. 11, CD005109 (2010)）。クローン病について、これらの満足できない結果についていくつかの理由が論じられている（Herfarth, H.及びScholmerich, J., Gut 50, 146-147 (2002)）：１）持続的な抗炎症性効果を媒介するには低すぎる、腸における局所サイトカイン濃度、２）全身投与されるＩＬ−１０の用量の上昇が、副作用のために制限されたこと、３）Ｂ細胞並びにＣＤ４＋、ＣＤ８＋及び／又はナチュラルキラー細胞によるＩＦＮγ生成に対するＩＬ−１０の免疫賦活特性が、その免疫抑制特性を相殺すること（Asadullah, K.等, Pharmacol. Rev. 55, 241-269 (2003); Tilg, H.等, Gut 50, 191-195 (2002); Lauw, F.N.等, J. Immunol. 165, 2783-2789 (2000)）。
ＩＬ−１０は、〜３７ｋＤａの小さいサイズのために非常に短い血漿半減期を示し、このことは、迅速な腎臓クリアランスを導く。実際に、全身区画における半減期は、２．５時間であり、このことは、粘膜バイオアベイラビリティを制限する（Braat, H.等, Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 725-731 (2003)）。循環時間、曝露、有効性を改善し、腎臓での取り込みを低減するために、このサイトカインをＰＥＧ化することがいくつかの出版物で報告されている（Mattos, A.等, J. Control Release 162, 84-91 (2012); Mumm, J.B.等, Cancer Cell 20(6), 781-796 (2011); Alvarez, H.M.等, Drug Metab. Dispos. 40(2), 360-373 (2012)）。それでもやはり、ＰＥＧ化非標的化ＩＬ−１０の全身性半減期が長くなることにより、この分子の公知の有害事象が悪化することがある。
組換えヒトＩＬ−１０を用いる全身性治療は十分に効果的でなく、サイトカインの局所的送達に焦点を当てるべきであることが明白になってきている。この目標を達成するためのいくつかの方法がある：１）免疫細胞のＩＬ−１０遺伝子療法、２）遺伝子改変された非病原性ＩＬ−１０発現細菌、及び３）サイトカインを標的にし、炎症組織においてサイトカインを蓄積するための抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質。
免疫細胞のＩＬ−１０遺伝子療法は、実験的大腸炎において効果を実証したが、臨床試験は、非致死性疾患についてのこのアプローチの安全性についての懸念により阻まれている（Braat, H.等, Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 725-731 (2003)）。ＩＬ−１０を発現するトランスジェニック細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））は、代替の送達経路であり、クローン病における第Ｉ相試験の成績が発表され、粘膜区画への局所的送達による全身性副作用を回避し、生物学的に含有すべきであることが主張された（Braat, H.等, Gastroenterol. Hepatol. 4, 754-759 (2006); Steidler, L.等, Science 289, 1352-1355 (2000)）。中度活動性潰瘍性大腸炎の患者におけるヒトＩＬ−１０を分泌する遺伝子改変ラクトコッカス・ラクチス（ＡＧ０１１、ＡｃｔｏＧｅｎｉＸ）の安全性、寛容性、薬力学及び有効性を評価するための第ＩＩａ相無作為化プラセボコントロール二重盲検多施設用量漸増研究の寛容性は良好であり、安全であった。しかし、改変バロンスコア又はプラセボと比較したＡＧ０１１を受けた患者における臨床症状により測定されるように、粘膜炎症の著しい改善はなかった（Vermeire, S.等, 2010年5月2日のNew OrleansでのDigestive Disease Week Annual Meetingで発表されたアブストラクト46）。
免疫サイトカインともよばれる抗体−サイトカイン融合タンパク質は、薬物送達及び薬物自体のフォーマットの点でいくつかの利点をもたらす。サイトカイン、例えばＩＬ−１０の局所送達は、適切な疾患マーカーに特異的な抗体又はその断片との融合により達成される。よって、全身性副作用を低減でき、炎症部位での化合物の局所的蓄積及び保持が達成できる。さらに、融合フォーマット及び用いる抗体又は抗体断片に依存して、血漿半減期、安定性及び発展性のような特性を改善できる。腫瘍学でのアプローチは既に確立されているが、炎症性障害及び自己免疫性を治療するために適合されたのはほんの最近のことであった。いくつかのサイトカイン（中でもＩＬ−１０）及び光増感剤を、フィブロネクチンのエクストラドメインＢに特異的なｓｃＦｖ抗体断片との融合により、乾癬病巣を標的にさせた（Trachsel, E.等, J. Invest. Dermatol. 127(4), 881-886 (2007)）。さらに、フィブロネクチンのエクストラドメインＡに特異的な抗体断片（Ｆ８、ＤＥＫＡＶＩＬ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ ＳｐＡ）−ＩＬ−１０融合タンパク質が、確立されたコラーゲン誘導性関節炎（Trachsel, E.等, Arthritis Res. Ther. 9(1), R 9 (2007); Schwager, K.等, Arthritis Res. Ther. 11(5), R142 (2009)）の進行を阻害するために前臨床的に用いられ、臨床試験に入った。最近では、同じＦ８−ＩＬ−１０融合タンパク質が、同質遺伝子マウスモデルにおける子宮内膜症損傷を標的にするために用いられ、生理食塩水コントロール群と比較して損傷の平均サイズを低減した（Schwager, K.等, Hum. Reprod. 26(9), 2344-2352 (2011)）。
本発明のＩｇＧ−ＩＬ−１０融合タンパク質は、公知の抗体断片に基づく（例えばｓｃＦｖ、ダイアボディ、Ｆａｂ）ＩＬ−１０融合タンパク質に対して、改善された生産しやすさ、安定性、血清半減期及び驚くべきことに、標的抗原との結合による生物活性の著しい増加を含むいくつかの利点を有する。
一態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドのそれぞれは、ＩｇＧクラス抗体重鎖とＩＬ−１０単量体とを含む。より具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、そのＮ末端にて前記ＩｇＧクラス抗体重鎖のＣ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドはそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体重鎖と、ＩＬ−１０単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、ＩｇＧクラス抗体軽鎖を含む。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体軽鎖から本質的になる。
いくつかの実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、天然ＩＬ−１０単量体、特に天然ヒトＩＬ−１０単量体である。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、配列番号１のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体は、機能的ホモ２量体ＩＬ−１０分子を形成する。
他の実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、改変ＩＬ−１０単量体、特に改変ヒトＩＬ−１０単量体である。一実施態様では、前記改変ＩＬ−１０単量体は、ｐＨ７．０、３７℃にて単量体形態で安定である。一実施態様では、前記改変ＩＬ−１０単量体は、天然ＩＬ−１０単量体と比較してｐＨ７．０、３７℃での安定性が改善されている。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、配列番号５のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体は、互いにホモ２量体を形成しない。
一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、改変を有さない対応するＩｇＧクラス抗体と比較して、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である。一実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体、特に活性化Ｆｃγ受容体である。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される。さらにより具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＩＩＩａである。一実施態様では、前記改変は、ＩｇＧクラス抗体のエフェクター機能を低減する。具体的な実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施態様では、前記改変は、前記ＩｇＧクラス抗体のＦｃ領域中、特にＣＨ２領域中にある。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖の３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ｇである。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。
一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、ＩｇＧ１サブクラス抗体である。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、全長抗体である。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、ヒト抗体である。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と特異的に結合できる。具体的な実施態様では、融合タンパク質は、ＦＡＰと、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる。一実施態様では、前記ＦＡＰは、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰである。具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１と、配列番号４１のＨＣＤＲ２と、配列番号４９のＨＣＤＲ３と、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５７のＬＣＤＲ２と、配列番号６１のＬＣＤＲ３とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号６３の重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。別の特定の具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号３７のＨＣＤＲ１と、配列番号４３のＨＣＤＲ２と、配列番号４７のＨＣＤＲ３と、配列番号５１のＬＣＤＲ１と、配列番号５５のＬＣＤＲ２と、配列番号５９のＬＣＤＲ３とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号６７のＶＨと、配列番号６９のＶＬとを含む。
一実施態様では、融合タンパク質は、ＩＬ−１０受容体−１（ＩＬ−１０Ｒ１）と、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０Ｒ１は、ヒトＩＬ−１０Ｒ１である。一実施態様では、ＩＬ−１０Ｒ１との結合についての前記親和性定数（ＫＤ）は、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、ＦＡＰとの結合についての前記親和性定数（ＫＤ）とほぼ等しいか又はそれより大きい。具体的な実施態様では、ＩＬ−１０Ｒ１との結合についての前記ＫＤは、ＦＡＰとの結合についての前記ＫＤの約半分より大きい。
特定の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、融合タンパク質が、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含み、
（ｉ）前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１と、配列番号４３のＨＣＤＲ２と、配列番号４７のＨＣＤＲ３と、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５５のＬＣＤＲ２と、配列番号５９のＬＣＤＲ３とを含むか、又は配列番号６７の重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６９の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
（ｉｉ）前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含み、
（ｉｉｉ）前記ＩＬ−１０分子が、配列番号１の配列を含み、
（ｉｖ）前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体重鎖と、前記ＩｇＧクラス抗体重鎖のＣ末端にＮ末端にてペプチドリンカーを介して融合したＩＬ−１０単量体とを含む、
融合タンパク質を提供する。
別の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、融合タンパク質が、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含み、
（ｉ）前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１と、配列番号４１のＨＣＤＲ２と、配列番号４９のＨＣＤＲ３と、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５７のＬＣＤＲ２と、配列番号６１のＬＣＤＲ３とを含むか、又は配列番号６３の重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
（ｉｉ）前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含み、
（ｉｉｉ）前記ＩＬ−１０分子が、配列番号１の配列を含み、
（ｉｖ）前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体重鎖と、前記ＩｇＧクラス抗体重鎖のＣ末端にＮ末端にてペプチドリンカーを介して融合したＩＬ−１０単量体とを含む、
融合タンパク質を提供する。
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターがさらに提供される。別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、本発明の融合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、（ｉｉ）融合タンパク質を回収する工程とを含む方法も提供する。前記方法により生成される、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質も提供される。
一態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物は、医薬として用いるため、及び炎症性疾患、具体的には炎症性腸疾患又は関節リウマチ、最も具体的には炎症性腸疾患の治療又は予防に用いるためにも提供される。治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための本発明の融合タンパク質の使用、及び個体における疾患を治療するための方法であって、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法も提供される。一実施態様では、前記疾患は、炎症性疾患である。より具体的な実施態様では、前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチである。さらにより具体的な実施態様では、前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一実施態様では、前記個体は、哺乳動物、特にヒトである。
様々な抗体−ＩＬ−１０融合フォーマットの模式図。パネル（Ａ）−（Ｄ）は、ＩｇＧ抗体に基づくフォーマットを示し、パネル（Ｅ）−（Ｇ）は、Ｆａｂ断片に基づくフォーマットを示す。（Ａ）「ＩｇＧ−ＩＬ−１０」、それぞれのＩｇＧ重鎖のＣ末端に融合した（両方の重鎖にあるＩＬ−１０分子は、同じＩｇＧ分子内で２量体を形成する）１つのＩＬ−１０分子（野生型ヒトＩＬ−１０サイトカイン配列）を有するヒトＩｇＧ（例えばアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ） Ｐ３２９Ｇにより、エフェクター機能を回避するための工学的に操作されたＦｃ領域を有する）。重鎖とＩＬ−１０との間の連結子：例えば（Ｇ４Ｓ）４２０マー。（Ｂ）「ＩｇＧ単鎖（ｓｃ）ＩＬ−１０」、ＩｇＧ重鎖の一方のＣ末端に融合した単鎖ＩＬ−１０ ２量体（ｓｃＩＬ−１０）を有するヒトＩｇＧ（エフェクター機能を回避するための工学的に操作されたＦｃ領域と、２つの間のヘテロ２量体形成を容易にするための１つの「ノブ」重鎖と１つの「ホール」重鎖との組み合わせとを有する）。重鎖と単鎖ＩＬ−１０との間の連結子：例えば（Ｇ４Ｓ）３１５マー。（Ｃ）「ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１」、ＩｇＧ重鎖の一方のＣ末端に融合した工学的に操作された単量体ＩＬ−１０分子を有するヒトＩｇＧ（エフェクター機能を回避するための工学的に操作されたＦｃ部分と、２つの間のヘテロ２量体形成を容易にするための１つの「ノブ」重鎖と１つの「ホール」重鎖との組み合わせとを有する）。重鎖と単量体ＩＬ−１０との間の連結子：例えば（Ｇ４Ｓ）３１５マー。（Ｄ）「ＩｇＧ−（ＩＬ−１０Ｍ１）２」、それぞれのＩｇＧ重鎖のＣ末端に融合した１つのＩＬ−１０単量体（両方の重鎖にある単量体ＩＬ−１０分子は、２量体を形成しない）を有するヒトＩｇＧ（エフェクター機能を回避するための工学的に操作されたＦｃ部分を有する）。重鎖とＩＬ−１０との間の連結子：例えば（Ｇ４Ｓ）３１５マーリンカー。（Ｅ）「Ｆａｂ−ＩＬ−１０」、Ｆａｂ重鎖のＣ末端に融合した１つのＩＬ−１０分子（野生型ヒトＩＬ−１０サイトカイン配列）を有するＦａｂ断片（これらの融合体のうちの２つは、ＩＬ−１０部分を介する２量体形成によりホモ２量体活性分子を形成する）。重鎖とＩＬ−１０との間の連結子：例えば（Ｇ４Ｓ）３１５マー。（Ｆ）「Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１０−Ｆａｂ」、単鎖ＩＬ−１０ ２量体が断続的に存在する直列Ｆａｂ断片（すなわち、２つのＩＬ−１０分子が、例えば（Ｇ４Ｓ）４２０マーリンカーにより連結され、第１のＦａｂ重鎖（ＨＣ１）のＣ末端と第２のＦａｂ重鎖（ＨＣ２）のＮ末端との間に挿入されて、ＨＣ１−ＩＬ−１０−ＩＬ−１０−ＨＣ２を含む単一ペプチド鎖をもたらす）。２つの軽鎖（これらは、他の構築物のために用いられるものと同一であり得る）は、これらの２つの重鎖と対形成する。（Ｇ）「Ｆａｂ−ＩＬ−１０Ｍ１−Ｆａｂ」、工学的に操作された単量体ＩＬ−１０分子が断続的に存在する直列Ｆａｂ断片。単量体ＩＬ−１０部分以外は、このフォーマットは（Ｆ）と同一である。 ＦＡＰ標的化４Ｂ９に基づくＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物（配列番号２５及び２７を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｃ）最終生成物の分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元（Ｒ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＯＰＳランニング緩衝液、非還元（ＮＲ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｒｉｓ−酢酸塩ランニング緩衝液）。Ｍ：サイズマーカー。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量９９．８％。 ＦＡＰ標的化４Ｇ８に基づくＩｇＧ−ｓｃＩＬ−１０構築物（配列番号７、１１及び１３を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル（所望の生成物を点線の四角で示す）。（Ｃ）最終生成物の分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元（Ｒ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＯＰＳランニング緩衝液、非還元（ＮＲ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｒｉｓ−酢酸塩ランニング緩衝液）、非還元ゲル上のさらなる低ＭＷバンドは、１つの重鎖と軽鎖とからなる半分子を表す可能性がある。（Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量８０．６％。 ＦＡＰ標的化４Ｇ８に基づくＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１構築物（配列番号７、１３及び１５を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｃ）最終生成物の分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元（Ｒ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＯＰＳランニング緩衝液、非還元（ＮＲ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｒｉｓ−酢酸塩ランニング緩衝液）。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量９８．２％。 ＦＡＰ標的化４Ｂ９に基づくＩｇＧ−（ＩＬ−１０Ｍ１）２構築物（配列番号２５及び２９を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｃ）最終生成物のＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ（Ｃａｌｉｐｅｒ）分析。（Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量１００％。 ＦＡＰ標的化４Ｂ９に基づくＦａｂ−ＩＬ−１０構築物（配列番号２５及び３１を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｃ）最終生成物の分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元（Ｒ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＯＰＳランニング緩衝液、非還元（ＮＲ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｒｉｓ−酢酸塩ランニング緩衝液）。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量９２．９％。 ＦＡＰ標的化４Ｇ８に基づくＦａｂ−ｓｃＩＬ−１０−Ｆａｂ構築物（配列番号７及び２１を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｃ）最終生成物の分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元（Ｒ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＯＰＳランニング緩衝液、非還元（ＮＲ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｒｉｓ−酢酸塩ランニング緩衝液）。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量１００％。 ＦＡＰ標的化４Ｇ８に基づくＦａｂ−ＩＬ−１０Ｍ１−Ｆａｂ融合体（配列番号７及び２３を参照されたい）の精製。（Ａ）プロテインＡ精製工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｃ）最終生成物の分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元（Ｒ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＯＰＳランニング緩衝液、非還元（ＮＲ）：ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｒｉｓ−酢酸塩ランニング緩衝液）。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでの最終生成物の分析サイズ排除クロマトグラフィー。単量体含量１００％。 ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６でのＳＰＲアッセイの構成。（Ａ）アミンカップリングによるＧＬＭチップ上への抗ペンタＨｉｓ ＩｇＧ（捕捉剤）の共有的固定化、及びその後のＦＡＰ（リガンド）の捕捉、及び抗ＦＡＰ抗体−ＩＬ−１０融合構築物（分析物）のその後の注入。（Ｂ）ニュートラアビジン誘導体化センサチップ（ＮＬＣ）へのビオチン化ヒトＩＬ−１０Ｒ１（リガンド）の固定化、及びその後の抗ＦＡＰ抗体−ＩＬ−１０融合構築物（分析物）の注入。 異なる抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質による、単球による炎症誘発性サイトカイン生成の抑制。（Ａ−Ｃ）４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０（配列番号７及び１９を参照されたい）又は４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０（配列番号７及び９を参照されたい）を、組換えヒトＦＡＰで被覆した細胞培養プレート上に固定化した後に、単球及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間加えた。上清中のＩＬ−６（Ａ）、ＩＬ−１β（Ｂ）及びＴＮＦα（Ｃ）の濃度を、その後、測定した（ｎ＝２）。（Ｄ−Ｆ）単球を、０−２００ｎＭ ４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０又は４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０（溶液中）及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと２４時間インキュベートした。上清中のＩＬ−６（Ｄ）、ＩＬ−１β（Ｅ）及びＴＮＦα（Ｆ）の濃度を、その後、測定した（ｎ＝２）。 ２名の異なる血液ドナーを用いる図１に示す結果の再現。（Ａ）４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０又は４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０を、組換えヒトＦＡＰで被覆した細胞培養プレート上に固定化した後に、単球及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間加えた。上清中のＩＬ−６（左）、ＩＬ−１β（真ん中）及びＴＮＦα（右）の濃度を、その後、測定した。（各列は、血液ドナーを表す）。 ２名の異なる血液ドナーを用いる図１に示す結果の再現。（Ｂ）単球を、０−２００ｎＭ ４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０、４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０又は野生型ヒトＩＬ−１０（溶液中）及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと２４時間インキュベートした。上清中のＩＬ−６（左）、ＩＬ−１β（真ん中）及びＴＮＦα（右）の濃度を、その後、測定した（各列は、血液ドナーを表す）。 異なる抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質による、単球によるＩＬ−６生成の抑制。（Ａ−Ｃ）４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０、４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０又は対応する非標的化構築物を、組換えヒトＦＡＰで被覆した細胞培養プレート上に固定化した後に、単球及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間加えた。上清中のＩＬ−６の濃度を、その後、測定した。（Ｄ−Ｆ）単球を、０−２００ｎＭ ４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０、４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０、対応する非標的化構築物又は野生型ヒトＩＬ−１０（溶液中）及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと２４時間インキュベートした。上清中のＩＬ−６の濃度を、その後、測定した。 異なる抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質による、単球によるＩＬ−６生成の抑制。（Ａ−Ｄ）４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０（下の列）又は４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０（上の列）を、異なる濃度の組換えヒトＦＡＰで被覆した細胞培養プレート上に固定化した後に、単球及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間加えた。上清中のＩＬ−６の濃度を、その後、測定した。 異なる抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質による、単球によるＩＬ−６生成の抑制。４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０（Ｂ）又は４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０（Ａ）を、異なる濃度の組換えヒトＦＡＰで被覆した細胞培養プレート上に固定化した後に、単球及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間加えた。上清中のＩＬ−６の濃度を、その後、測定した。図１３と同じデータを、異なる比較でプロットする。 異なる抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質による、単球によるＩＬ−６生成の抑制。（Ａ）４Ｂ９ Ｆａｂ−ＩＬ−１０（配列番号２５及び３１を参照されたい）又は４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−１０（配列番号２５及び２７を参照されたい）構築物を、組換えヒトＦＡＰで被覆した細胞培養プレート上に固定化した後に、単球及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間加えた。上清中のＩＬ−６の濃度を、その後、測定した。（Ｂ）単球を、０−２００ｎＭ ４Ｂ９ Ｆａｂ−ＩＬ−１０又は４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物（溶液中）及び刺激因子としての１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと２４時間インキュベートした。上清中のＩＬ−６の濃度を、その後、測定した。 Ｆａｂ−ＩＬ−１０及びＩｇＧ−ＩＬ−１０フォーマットのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルの比較。矢印は、所望の２量体生成物を示し、凝集物は、点線の円で示し、単量体は、実線の円で示す。Ｆａｂ−ＩＬ−１０フォーマットとは対照的に、ＩｇＧ−ＩＬ−１０フォーマットは、重鎖のジスルフィド連結共有的ホモ２量体形成により、単量体又は「半分子」を導かない。
定義
用語は、以下にそうでないと定義しない限り、当該技術において一般的に用いられる通りに本明細書において用いる。
ＦＡＰと省略され、セプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られる「線維芽細胞活性化タンパク質」は、そうでないと示さない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からの任意の天然ＦＡＰのことをいう。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ及び細胞でのプロセシングにより得られる任意の形のＦＡＰを包含する。この用語は、ＦＡＰの自然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰと特異的に結合できる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１２８８４（バージョン１２８）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２に示される。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸２６位から７６０位までにわたる。Ｈｉｓタグ付加ヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸及びヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号８１及び８２に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９７３２１（バージョン１０７）又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示される。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸２６位から７６１位までにわたる。配列番号８３及び８４は、Ｈｉｓタグ付加マウスＦＡＰ ＥＣＤのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。配列番号８５及び８６は、Ｈｉｓタグ付加カニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
「ヒトＩＬ−１０Ｒ１」により、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３６５１（バージョン１１５）に記載されるタンパク質、特に全長配列のアミノ酸２２位からアミノ酸２３５位までにわたる前記タンパク質の細胞外ドメインを意味する。配列番号８７及び８８は、ヒトＦｃ領域に融合したヒトＩＬ−１０Ｒ１ ＥＣＤのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
本明細書で用いる場合、用語「融合タンパク質」は、抗体とＩＬ−１０分子とを含む融合ポリペプチド分子であって、融合タンパク質の成分が、互いにペプチド結合により、直接又はペプチドリンカーにより結合されているポリペプチド分子のことをいう。明確にするために、融合タンパク質の抗体成分の個別のペプチド鎖は、例えばジスルフィド結合により非共有的に結合されることがある。
「融合した」とは、ペプチド結合により、直接又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して結合された成分のことをいう。
「特異的に結合する」により、結合が抗原について選択的であり、望まないか又は非特異的な相互作用とは区別できることを意味する。抗体が特異的抗原と結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者が熟知するその他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかにより測定できる。一実施態様では、無関係なタンパク質と抗体が結合する程度は、例えばＳＰＲにより測定して、抗原との抗体の結合の約１０％未満である。ある種の実施態様では、抗原と結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍまで、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍまで）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」又は「結合親和性」は、ある分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有的相互作用の総計の強さのことをいう。そうでないと示さない限り、本明細書で用いる場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性のことをいう。分子Ｘの、そのパートナーＹについての親和性は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）との比である解離定数（ＫＤ）により一般的に表すことができる。よって、同等の親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含むことがある。親和性は、本明細書に記載するものを含む、当該技術において公知の一般的な方法により測定できる。親和性を測定するための方法は、特に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の低減」、例えばＦｃ受容体との結合の低減は、例えばＳＰＲにより測定して、それぞれの相互作用についての親和性の減少のことをいう。明確にするために、この用語は、ゼロ（又は分析法の検出限界未満）までの親和性の低減、すなわち相互作用の完全な廃止も含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用についての結合親和性の増加のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「単鎖」は、ペプチド結合により直鎖状に結合されたアミノ酸単量体を含む分子のことをいう。
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば２重特異性抗体）及び所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子のことをいう。抗体断片としては、例えば、それらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）及び単一ドメイン抗体が挙げられる。ある種の抗体断片のレビューのために、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片のレビューのために、例えばＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６９−３１５（１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、並びに国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許５５７１８９４号及び５５８７４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察について、米国特許５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、２価又は２重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えばＥＰ４０４０９７、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９−１３４（２００３）及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０、６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全体若しくは一部を含む抗体断片である。ある種の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば米国特許６２４８５１６Ｂ１号を参照されたい）。抗体断片は、それらに限定されないが、本明細書に記載するようなインタクトな抗体のタンパク質消化及び組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）を含む様々な技術により作製できる。
用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「抗体全体」は、本明細書において交換可能に用いて、天然抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体のことをいう。
「天然抗体」は、変動する構造を有する自然に存在する免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖（これらはジスルフィド結合されている）から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインともよばれる可変領域（ＶＨ）と、続いて、重鎖定常領域ともよばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインともよばれる可変領域（ＶＬ）と、続いて、軽鎖定常領域ともよばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とを有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）とよばれる５つのタイプの１つに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、サブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けることができる。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）とよばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。
本明細書で用いる場合、「Ｆａｂ断片」は、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、ＶＨドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片のことをいう。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプのことをいう。抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμとよばれる。
「ＩｇＧクラス抗体」は、自然に存在する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子の構造を有する抗体のことをいう。ＩｇＧクラス抗体の抗体重鎖は、ドメイン構造ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を有する。ＩｇＧクラス抗体の抗体軽鎖は、ドメイン構造ＶＬ−ＣＬを有する。ＩｇＧクラス抗体は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとから本質的になる。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原との抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインのことをいう。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えばＫｉｎｄｔ等、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ｐ．９１（２００７）を参照されたい。単一ＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるために十分であり得る。
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、本明細書で用いる場合、配列が超可変性でありかつ／又は構造が規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれのことをいう。一般的に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲ、ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループから及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）（後者は、配列可変性が最も高く、かつ／又は抗原認識に関与する）からのアミノ酸残基を含む。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）にある（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５及びＨ３の９５−１０２にある（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、超可変ループを形成するアミノ酸残基を一般的に含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲとよばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２にある（Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)を参照されたい）。そうでないと示さない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン中のその他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔ等、既出（「Ｋａｂａｔ番号付け」という）に従って番号付けする。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により生成されるか又はヒト抗体レパートリー若しくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のものに相当するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体についてのこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体のことをいい、すなわち該集団を含む個別の抗体が同一であり、かつ／又は同じエピトープと結合する（但し、例えば自然に生じる変異を含有するか又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、可能性のあるバリアント抗体を除く（このようなバリアントは、一般的に、少量で存在する））。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物中の各モノクローナル抗体は、抗原の単一決定基を指向する。よって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれの特定の方法により抗体の生成を必要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、それらに限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法（このような方法及びモノクローナル抗体を作製するためのその他の例示的な方法は、本明細書に記載する）を含む様々な技術により作製してよい。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために用いる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基までにわたる。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインと結合する。ＣＨ２ドメインは、本明細書において、天然配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであってよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端の残基のひと続きを含む（すなわちＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。ＣＨ３領域は、本明細書において、天然配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメイン（例えば一方の鎖中に「突出」（「ノブ」）が導入され、他方の鎖に対応する「腔」（「ホール」）が導入されたＣＨ３ドメイン、米国特許５８２１３３３号（出典明示により明らかに本明細書に援用されている）を参照されたい）であってよい。このようなバリアントＣＨ３ドメインを用いて、本明細書に記載するように、２つの非同一抗体重鎖のヘテロ２量体形成を促進できる。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端までにわたる。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書においてそうでないと明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載される、ＥＵインデックスともよばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に帰することができる生物活性のことをいい、これは抗体アイソタイプによって変動する。抗体エフェクター機能としては、例えばＣ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域と係合した後に、受容体を持つ細胞を刺激してエフェクター機能を実行させるシグナル伝達事象を引き出すＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。特に、活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７（バージョン１４１）を参照されたい）。
「野生型ＩＬ−１０」ともよばれる「天然ＩＬ−１０」は、自然に存在するＩＬ−１０を意味し、これは、自然に存在するＩＬ−１０から例えば安定性のような１又は複数の特性を変更するように改変された「改変ＩＬ−１０」に対向する。改変ＩＬ−１０分子は、例えば、アミノ酸配列中の改変、例えばアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むことがある。単量体形態で安定性が増加した特定の改変ＩＬ−１０分子は、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ等（J Biol Chem 275, 13552-13557 (2000)）により記載されている。
天然ＩＬ−１０は、２つのαヘリックス単量体ドメインから構成されるホモ２量体である。天然ヒトＩＬ−１０単量体ドメインの配列を配列番号１に示す。よって、「ＩＬ−１０単量体」は、天然ＩＬ−１０の単量体ドメインと実質的に類似の配列及び／又は構造を有するタンパク質である。
タンパク質に関して用いる場合の「安定な」又は「安定性」は、タンパク質の構造完全性（例えばその２次構造）が保護されることを意味する。
タンパク質に関して用いる場合の「機能的」は、生物学的機能、特に天然に存在する対応するタンパク質（例えば天然ＩＬ−１０）が媒介する生物学的機能をタンパク質が媒介できることを意味する。ＩＬ−１０の場合、生物学的機能は、ＩＬ−１０受容体シグナル伝達の活性化、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮγのような炎症誘発性サイトカインの分泌の抑制、ＭＨＣＩＩ発現の阻害並びにＩＬ−１０受容体を発現する細胞（例えば単球）でのＣＤ８０及び／又はＣＤ８６のような同時刺激分子の上方制御を含むことがある。
用語「ペプチドリンカー」は、１又は複数のアミノ酸、典型的に約２−２０のアミノ酸を含むペプチドのことをいう。ペプチドリンカーは、当該技術において公知であるか、又は本明細書に記載する。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーを含む。「ｎ」は、一般的に１から１０の間、典型的に２から４の間の数である。
「ノブ−イントゥ−ホール改変」は、ＣＨ３ドメイン中の２つの抗体重鎖間の界面での改変であって、ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中で、アミノ酸残基が、側鎖容積がより大きいアミノ酸残基で置き換えられることにより、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内の腔（「ホール」）に置くことができる突出（「ノブ」）を一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面内で作り出し、ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中で、アミノ酸残基が、側鎖容積がより小さいアミノ酸残基で置き換えられることにより、第１のＣＨ３ドメイン中の界面内の突出（「ノブ」）が置くことができる腔（「ホール」）を第２のＣＨ３ドメイン中の界面内で作り出す改変のことをいう。一実施態様では、「ノブ−イントゥ−ホール改変」は、一方の抗体重鎖中のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ及び任意選択的にアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃと、他方の抗体重鎖中のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び任意選択的にＹ３４９Ｃとを含む。ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば米国特許５７３１１６８号、米国特許７６９５９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９、６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８、７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にて突出（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面中に対応する腔（「ホール」）を導入して、ヘテロ２量体形成を促進し、ホモ２量体形成を妨げるべく突出が腔の中に置くことができるようにすることを含む。突出は、第１のポリペプチドの界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。突出と同一又は類似のサイズの相補的な腔は、第２のポリペプチドの界面中に、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより創出される。それぞれＳ３５４位及びＹ３４９位に２つのシステイン残基を導入することにより、Ｆｃ領域中の２つの抗体重鎖間にジスルフィドブリッジが形成され、２量体がさらに安定化される（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
アミノ酸「置換」は、ポリペプチド中のあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることをいう。一実施態様では、アミノ酸は、類似の構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えられ、例えば保存的アミノ酸の置き換えである。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み、極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み、正電荷（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含み、負電荷（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。例えば、アミノ酸置換は、結果として、あるアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばある群（例えば極性）からのアミノ酸を、異なる群（例えば塩基性）からの別のアミノ酸で置き換えることとなり得る。アミノ酸置換は、当該技術において周知の遺伝子的又は化学的方法を用いて作り出すことができる。遺伝子的方法は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含むことがある。化学的改変のような遺伝子工学以外の方法によりアミノ酸の側鎖群を変更する方法も有用であると期待できる。同じアミノ酸置換を示すために、様々な表記を本明細書において用いることがある。例えば、抗体重鎖の３２９位のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と考えずに、配列を整列させて最大の配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義する。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当該技術における熟練の範囲内である様々な手段で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公共で利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成できる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大限の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含んで、配列を整列させるための適当なパラメータを決定できる。本明細書における目的のために、しかし、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作り出される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著され、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザ文書とともにファイルされ、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公共で入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルしてよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで用いるためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較のために用いる場合、ある与えられたアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ／ｗｉｔｈ／ａｇａｉｎｓｔ）ある与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（これは、代わりに、ある与えられたアミノ酸配列Ｂに対して（ｔｏ／ｗｉｔｈ／ａｇａｉｎｓｔ）ある％アミノ酸配列同一性を有するか又は含む、ある与えられたアミノ酸配列Ａということができる）は、以下のようにして算出する：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
（式中、Ｘは、ＡとＢのプログラムの整列における配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２により同一マッチとして得点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識される。特にそうでないと述べない限り、本明細書で用いる全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前の段落において記載するようにして得られる。
本明細書において交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチド若しくは塩基及び／又はそれらの類似体、あるいはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより又は合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドのような改変ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションのような合成後に作製される改変を含んでよい。
用語「改変」は、ペプチド骨格（例えばアミノ酸配列）の任意の操作又はポリペプチドの翻訳後改変（例えば糖鎖付加）のことをいう。
用語「ベクター」は、本明細書で用いる場合、結合された別の核酸を伝播できる核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及びベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を駆動できる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」という。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、交換可能に用いられ、外因性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫（継代の数に関係なく）を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてよいが、変異を含んでよい。元来の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が、本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の融合タンパク質を作り出すために用いることができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞は、少しだけ挙げれば、培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞のような哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞、それにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内に含まれる細胞も含む。
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織において生理的変化をもたらすために必要な量のことをいう。
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療有効量」は、必要な投与量及び期間について、所望の治療的又は予防的結果を達成するために有効な量のことをいう。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の有害な効果を防止するか、減少させるか、遅延させるか、最小限にするか又は妨げる。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物は、それらに限定されないが、飼い馴らされた動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えばヒト及びサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む。特に、個体又は対象は、ヒトである。
用語「薬学的組成物」は、組成物に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性がある付加的成分を含有しない調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の薬学的組成物中の対象にとって毒性でない成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、それらに限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤又は保存剤を含む。
本明細書で用いる場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療し」のような文法的変形を含む）は、治療される個体における疾患の自然な経過を変更しようとする試みにおける臨床的介入のことをいい、予防のため又は臨床病理の経過中のいずれかで行うことができる。治療の所望の効果は、それらに限定されないが、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の低減、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少すること、疾患状態の緩和又は一時的軽減、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発展を遅らせるため又は疾患の進行を遅くするために用いられる。
本発明の融合タンパク質
本発明は、生産しやすさ、安定性、結合親和性及び生物活性のような特に有利な特性を有する新規な抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質を提供する。
第１の態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドのそれぞれは、ＩｇＧクラス抗体重鎖とＩＬ−１０単量体とを含む。より具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、そのＮ末端にて前記ＩｇＧクラス抗体重鎖のＣ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドはそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体重鎖と、ＩＬ−１０単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、ＩｇＧクラス抗体軽鎖を含む。一実施態様では、前記軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体軽鎖から本質的になる。抗体断片に基づく融合タンパク質と比較して、ＩｇＧクラス抗体の存在により、本発明の融合タンパク質は、長期の血清半減期（ＦｃＲｎとの結合による再生利用と、腎臓ろ過についての閾値を優に上回る分子サイズのため）を含む好ましい薬物動態特性を得る。ＩｇＧクラス抗体の存在により、例えばプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単純な精製も可能になる。驚くべきことに、本発明のＩｇＧに基づくＩｇＧ−ＩＬ−１０融合タンパク質とＦａｂ断片に基づく対応する融合タンパク質（Ｆａｂ−ＩＬ−１０）とを比較する実施例において示すように、ＩｇＧクラス抗体の存在により、標的抗原と結合した場合の融合タンパク質の生物活性も改善される。同一の重鎖（及び軽鎖）ポリペプチドを用いることにより、不要な副生成物の形成を回避し、ノブ−イントゥ−ホール改変のような非同一重鎖のヘテロ２量体形成を促進する改変の必要性をなくして、融合タンパク質の単純な生成が可能になる。
いくつかの実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、天然ＩＬ−１０単量体、特に天然ヒトＩＬ−１０単量体である。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、配列番号１のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体は、機能的ホモ２量体ＩＬ−１０分子を形成する。この融合タンパク質フォーマットは、２つのＩＬ−１０単量体が完全に機能的で生物活性があるＩＬ−１０ ２量体を形成するので特に有利である。さらに、抗体断片に基づく融合タンパク質とは対照的に、本発明の融合タンパク質では、２量体形成はＩＬ−１０単量体間で生じるだけでなく、単量体が融合している抗体重鎖間でも生じる。よって、例えば本明細書に記載するＦａｂ−ＩＬ−１０融合タンパク質と比較して、本発明の融合タンパク質に含まれるＩＬ−１０ ２量体が２つの単量体に解体される傾向が低減される（図１６を参照されたい）。重要なことに、この融合タンパク質フォーマットは、生物活性の点でも本明細書に記載する他の融合タンパク質フォーマットよりも優れている。
他の実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、改変ＩＬ−１０単量体、特に改変ヒトＩＬ−１０単量体である。一実施態様では、前記改変ＩＬ−１０単量体は、ｐＨ７．０、３７℃にて単量体形態で安定である。一実施態様では、前記改変ＩＬ−１０単量体は、天然ＩＬ−１０単量体と比較してｐＨ７．０、３７℃での安定性が改善されている。適切な改変ＩＬ−１０単量体は、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５、１３５５２−１３５５７（２０００）に記載され、この文献は、ＩＬ−１０単量体の安定性を測定する方法についても記載している。具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０単量体は、配列番号５のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体は、互いにホモ２量体を形成しない。この融合タンパク質フォーマットは、ＩＬ−１０ ２量体ではなく、２つの別々の改変ＩＬ−１０単量体を含む。実施例に示すように、この融合タンパク質フォーマットは、ＩＬ−１０ ２量体を含む融合タンパク質と同様のＩＬ−１０受容体１との結合親和性（アビディティー）を有する。さらに、これは、発現収率が高く、凝集傾向がほとんどなくて特に良好な生産しやすさを有する。
一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、ＩｇＧ１サブクラス抗体である。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、ヒト抗体であり、すなわちこれはヒト可変及び定常領域を含む。ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖の定常領域の例示的な配列をそれぞれ配列番号７９及び８０に示す。一実施態様では、ＩｇＧクラス抗体は、ヒトＦｃ領域、特にヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、より特にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、全長抗体である。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、モノクローナル抗体である。
ＩｇＧクラス抗体のＦｃドメインは、標的組織における良好な蓄積と好ましい組織−血液分配比に貢献する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性を融合タンパク質に与えるが、これは、同時に、好ましい抗原を持つ細胞ではなくＦｃ受容体を発現する細胞を不要に標的にするように融合タンパク質を導くことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の活性化は、サイトカイン放出を導くことがあり、これは、（炎症誘発性）サイトカイン受容体の活性化と全身投与による重度の副作用とをもたらす。よって、一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、改変を有さない対応するＩｇＧクラス抗体と比較してＦｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である。Ｆｃ受容体との結合親和性は、例えばＥＬＩＳＡ、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的な装置及び組換え発現により得ることができるようなＦｃ受容体を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定できる。結合親和性を測定するための具体的で例示的な実施態様を、以下に記載する。一実施態様によると、Ｆｃ受容体との結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２５℃にて、ＣＭ５チップに固定化されたリガンド（Ｆｃ受容体）とともに用いる表面プラズモン共鳴により測定する。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で、供給業者の使用説明に従って活性化する。組換えリガンドを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈した後に、１０μｌ／ｍｉｎの流速で注入して、およそ１００−５０００応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。リガンドの注入に続いて、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。速度論的測定のために、抗体の３倍から５倍の系列希釈（〜０．０１ｎＭから３００ｎＭの間の範囲）をＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４）に、２５℃にておよそ３０−５０μｌ／ｍｉｎの流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出される。例えばＣｈｅｎ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３、８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。代わりに、Ｆｃ受容体との結合親和性抗体は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞のような特定のＦｃ受容体を発現することがわかっている細胞株を用いて評価してよい。
一実施態様では、改変は、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する１又は複数のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。典型的に、同じ１又は複数のアミノ酸変異が、２つの抗体重鎖のそれぞれに存在する。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍低減する。Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を低減するアミノ酸変異が１つより多く存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせが、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍にさえ低減する。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、改変を有さない対応するＩｇＧクラス抗体と比較して、Ｆｃ受容体との結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より特には５％未満を示す。
一実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、より具体的にはＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの受容体それぞれとの結合親和性は、低下している。さらにより具体的な実施態様では、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＩＩＩａである。いくつかの実施態様では、補体成分との結合親和性、特にＣ１ｑとの結合親和性も、低下している。一実施態様では、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性は、低下しない。実質的に同様のＦｃＲｎとの結合、すなわち前記受容体との抗体の結合親和性の保存は、ＦｃＲｎとの未改変形の抗体の結合親和性の約７０％より大きい親和性を抗体が示す場合に達成される。本発明の融合タンパク質に含まれるＩｇＧクラス抗体は、このような親和性の約８０％より大きく、約９０％より大きい親和性さえ示すことがある。
一実施態様では、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する前記改変は、ＩｇＧクラス抗体のＦｃ領域、特にＣＨ２領域中にある。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖の３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖の３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換と、抗体重鎖の２２８位、２３３位、２３４位、２３５位、２９７位及び３３１位から選択される位置にさらなるアミノ酸置換とを含む。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖のＰ３２９位、Ｌ２３４位及びＬ２３５位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。このアミノ酸置換の組み合わせは、ＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号（その全体が出典明示により本明細書に援用されている）に記載されるように、ヒトＩｇＧクラス抗体のＦｃγ受容体結合を特に効率的にほぼ廃止する。ＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号は、このような改変抗体を調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能のようなその特性を決定するための方法についても記載している。
抗体重鎖中に改変を含む抗体は、当該技術において周知の遺伝子的又は化学的方法を用いてアミノ酸欠失、置換、挿入又は改変により調製できる。遺伝子的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定により確かめることができる。
Ｆｃ受容体結合を低減する改変を含む抗体は、一般的に、対応する未改変抗体と比較してエフェクター機能が低下し、特にＡＤＣＣが低下している。よって、一実施態様では、Ｆｃ受容体とのＩｇＧクラス抗体の結合親和性を低減する前記改変は、ＩｇＧクラス抗体のエフェクター機能を低減する。具体的な実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施態様では、ＡＤＣＣは、前記改変を有さない対応するＩｇＧクラス抗体により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満に低下する。抗体のエフェクター機能は、当該技術において公知の方法により測定できる。対象の分子のＡＤＣＣ活性を査定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許５５００３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３、７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２、１４９９−１５０２（１９８５）、米国特許５８２１３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６、１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。代わりに、非放射活性アッセイ法を用いてよい（例えばフローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射活性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射活性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代わりに又はさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて査定してもよい。いくつかの実施態様では、補体成分、特にＣ１ｑとのＩｇＧクラス抗体の結合も低下する。したがって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）も低下することがある。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑと結合できるか、よってＣＤＣ活性を有するかを決定してよい。例えば国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を査定するために、ＣＤＣアッセイを実行してよい（例えばGazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003);並びにCragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい）。
上記及びＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されるＩｇＧクラス抗体に加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１又は複数の置換を有するものも含む（米国特許６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含んで、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位の２つ以上にて置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許７３３２５８１号）。
ＩｇＧ４サブクラス抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体との結合親和性が低下し、エフェクター機能が低下している。よって、いくつかの実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる前記ＩｇＧクラス抗体は、ＩｇＧ４サブクラス抗体、特にヒトＩｇＧ４サブクラス抗体である。一実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラス抗体は、Ｓ２２８位にてＦｃ領域中にアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体との結合親和性及び／又はエフェクター機能をさらに低減するために、一実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラス抗体は、Ｌ２３５位にてアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラス抗体は、Ｐ３２９位にてアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、前記ＩｇＧ４サブクラス抗体は、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位にてアミノ酸置換、具体的にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このような改変ＩｇＧ４サブクラス抗体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、ＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号（その全体が出典明示により本明細書に援用されている）に記載されている。
本発明の抗体は、例えば治療用の特に有利ないくつかの特性を併せ持っている。
一実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と特異的に結合できる。ＦＡＰは、本発明の融合タンパク質を用いる炎症性疾患の治療のための適切な標的として同定されている。具体的な実施態様では、融合タンパク質は、ＦＡＰと、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる。ＳＰＲによりＦＡＰとの結合親和性を測定するための方法は、本明細書に記載する。一実施態様では、融合タンパク質の親和性（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を２５℃にて、ＧＬＭチップと共有結合した抗Ｈｉｓ抗体により固定化されたＨｉｓタグ付加ＦＡＰ抗原とともに用いてＳＰＲにより測定する。例示的な方法では、標的タンパク質（ＦＡＰ）を、そのＨ６タグを介して、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓＮＨＳ）との新しく調製した混合物を用いて全てのチャネルを５分間同時に活性化し、その後に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中の１５μｇ／ｍｌ抗ペンタＨｉｓ ＩｇＧ（Ｑｉａｇｅｎ＃３４６６０、マウスモノクローナル抗体）を１８０秒間注入することにより、ＧＬＭチップの別々の垂直チャネルに３０μｌ／ｍｉｎにて高レベル（〜５．０００ＲＵまで）で固定化された、共有的に固定化された抗ペンタＨｉｓ ＩｇＧにより捕捉する。チャネルを、エタノールアミンを５分間注入することによりブロックする。Ｈｉｓ６タグ付加ＦＡＰを、垂直チャネルに沿って６０秒間、３０μｌ／ｍｉｎでランニング緩衝液中の５μｇ／ｍｌの希釈物から捕捉し、〜２５０から６００ＲＵの間のリガンド密度を達成する。ワンショットカイネティックアッセイの構成（ＯＳＫ）では、融合タンパク質を分析物として、水平チャネルに沿って、５０から０．０８ｎＭまでの系列５倍希釈で、１００μｌ／ｍｉｎにて注入する。会合段階は１８０秒間、解離段階は６００秒間記録する。非常に遅いオフレートを示す相互作用の場合、オフレートの記録は、複合体の解離を観察するために１８００秒まで延長する。ランニング緩衝液（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとする。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎマネージャソフトウェアバージョン２．１）を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出する。
一実施態様では、前記ＦＡＰは、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰである。好ましくは、本発明の融合タンパク質に含まれるＩｇＧクラス抗体は、ヒト並びにカニクイザル及び／又はマウスＦＡＰと交差反応性であり、このことにより、例えばヒトでの使用の前にカニクイザル及び／又はマウスでｉｎ ｖｉｖｏ研究ができる。
具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１と、配列番号４１のＨＣＤＲ２と、配列番号４９のＨＣＤＲ３と、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５７のＬＣＤＲ２と、配列番号６１のＬＣＤＲ３とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号６３の重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。別の特定の具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号３７のＨＣＤＲ１と、配列番号４３のＨＣＤＲ２と、配列番号４７のＨＣＤＲ３と、配列番号５１のＬＣＤＲ１と、配列番号５５のＬＣＤＲ２と、配列番号５９のＬＣＤＲ３とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号６７のＶＨと、配列番号６９のＶＬとを含む。実施例に示すように、これらの抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＦＡＰとの特に強い結合親和性／アビディティーを示す。
さらに具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号３９のＨＣＤＲ１と、配列番号４５のＨＣＤＲ２と、配列番号４９のＨＣＤＲ３と、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５７のＬＣＤＲ２と、配列番号６１のＬＣＤＲ３とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号７１のＶＨと配列番号７３のＶＬとを含む。別の具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号３７のＨＣＤＲ１と、配列番号４１のＨＣＤＲ２と、配列番号４７のＨＣＤＲ３と、配列番号５１のＬＣＤＲ１と、配列番号５５のＬＣＤＲ２と、配列番号５９のＬＣＤＲ３とを含む。さらにより具体的な実施態様では、前記ＩｇＧクラス抗体は、配列番号７５のＶＨと、配列番号７７のＶＬとを含む。
一実施態様では、融合タンパク質は、ＩＬ−１０受容体−１（ＩＬ−１０Ｒ１）と、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる。ＳＰＲによりＩＬ−１０Ｒ１との結合親和性を測定するための方法は、本明細書に記載する。一実施態様では、融合タンパク質の親和性（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を２５℃にて、ニュートラアビジン捕捉によりＮＬＣチップに固定化したビオチン化ＩＬ−１０Ｒ１とともに用いてＳＰＲにより測定する。例示的な方法では、４００から１６００ＲＵの間のＩＬ−１０Ｒ１が、垂直チャネルに沿って１０μｇ／ｍｌの濃度及び３０μｌ／ｓｅｃの流速にて様々な接触時間でニュートラアビジン誘導体化チップマトリクスに捕捉される。ビオチン化ＩＬ１０Ｒ１との結合は、６つの異なる分析物濃度（５０、１０、２、０．４、０．０８、０ｎＭ）にて、水平方向への１００μｌ／ｍｉｎでの注入により測定し、会合速度を１８０秒間、解離速度を６００秒間記録する。ランニング緩衝液（ＰＢＳＴ）は、第６のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとする。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎマネージャソフトウェアバージョン２．１）を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出する。
具体的な実施態様では、前記ＩＬ−１０Ｒ１は、ヒトＩＬ−１０Ｒ１である。一実施態様では、ＩＬ−１０Ｒ１との結合についての前記親和性定数（ＫＤ）は、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、ＦＡＰとの結合についての前記親和性定数（ＫＤ）とほぼ等しいか又はそれより大きい。具体的な実施態様では、ＩＬ−１０Ｒ１との結合についての前記ＫＤは、ＦＡＰとの結合についての前記ＫＤの約半分より大きい。本発明の融合タンパク質のＦＡＰ及びＩＬ−１０Ｒ１との結合についてのＫＤの値の特定の比により、ＦＡＰ発現組織へのＩＬ−１０の効率的な標的化のためにそれらが特に最適になる。理論に結び付けられることを望まないが、本発明の融合タンパク質は、ＦＡＰとの結合親和性がＩＬ−１０Ｒ１との結合親和性と少なくとも同等に高いので、ＦＡＰ発現標的組織に到達する前に標的組織以外（例えば循環内）でＩＬ−１０Ｒ１発現細胞と結合する可能性が少ない。
特定の態様では、本発明は、ＦＡＰと特異的に結合でき、改変を有さない対応するヒトＩｇＧ１サブクラス抗体と比較してＦｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含むヒトＩｇＧ１サブクラス抗体と、ＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、
２つの同一の重鎖ポリペプチド（それぞれが、ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体重鎖のＣ末端にＮ末端にて融合した天然ＩＬ−１０単量体を含む）と２つの同一の軽鎖とを含む
融合タンパク質を提供する。
具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号９のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号７のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。別の具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号２７のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号２５のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰと特異的に結合でき、改変を有さない対応するヒトＩｇＧ１サブクラス抗体と比較してＦｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含むヒトＩｇＧ１サブクラス抗体と、ＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、
２つの同一の重鎖ポリペプチド（それぞれが、ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体重鎖のＣ末端にＮ末端にて融合した改変ＩＬ−１０単量体を含む）と２つの同一の軽鎖とを含む
融合タンパク質を提供する。
具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号１７のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号７のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。別の具体的な実施態様では、前記融合タンパク質は、配列番号２９のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖ポリペプチドと、配列番号２５のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖ポリペプチドとを含む。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載する融合体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、６、８、１０、１８、２６、２８、３０、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８及び８９に示す配列（その機能的断片又はバリアントを含む）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるものを含む。
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば２以上）のポリヌクレオチドとして発現できる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又はその他の手段により会合して、機能的融合タンパク質を形成してよい。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによりコードされてよい。同時発現される場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、抗体を形成する。
一実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５又は７７に示す可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号７、９、１７、２５、２７又は２９に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２、６、８、１０、１８、２６、２８、３０、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８又は８９に示す核酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含むポリヌクレオチドにさらに向けられる。別の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２、６、８、１０、１８、２６、２８、３０、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８又は８９に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５又は７７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。別の実施態様では、本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号７、９、１７、２５、２７又は２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５又は７７の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する配列番号７、９、１７、２５、２７又は２９のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドも包含する。
ある種の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、１本鎖又は２本鎖であってよい。
組換え方法
本発明の融合タンパク質は、例えば、固体状態のペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え生成により得ることができる。組換え生成のために、例えば上記のような融合タンパク質（断片）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞でのさらなるクローニング及び／又は発現のための１又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定できる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの１又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、融合タンパク質（断片）のコード配列を適当な転写／翻訳コントロールシグナルとともに含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であってよい。発現ベクターは、融合タンパク質（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）がプロモーター及び／又はその他の転写若しくは翻訳コントロールエレメントと作動可能に会合してクローニングされた発現カセットを含む。本明細書で用いる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばコード領域の一部と考えることができるが、いずれのフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などは、コード領域の一部でない。２以上のコード領域は、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば単一ベクター、又は別々のポリヌクレオチド構築物中、例えば別々の（異なる）ベクターに存在できる。さらに、いずれのベクターも、単一コード領域を含有するか、又は２以上のコード領域を含んでよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質切断により最終タンパク質に翻訳後又は翻訳と同時に分けられる１又は複数のポリペプチドをコードしてよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の融合タンパク質（断片）又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか又は融合していない異種コード領域をコードしてよい。異種コード領域は、限定することなく、分泌シグナルペプチド又は異種機能的ドメインのような専門のエレメント又はモチーフを含む。作動可能な会合は、遺伝子生成物、例えばポリペプチドのコード領域が、１又は複数の調節配列と、遺伝子生成物の発現が調節配列の影響又はコントロールの下にあるように結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコード領域とそれと会合するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片の間の連結の性質が遺伝子生成物の発現を駆動する発現調節配列の能力に干渉せず、転写されるＤＮＡ鋳型の能力に干渉しないならば、「作動可能に会合」している。よって、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターが核酸の転写をもたらすことができたならば、作動可能に会合している可能性がある。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を駆動できる細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーター以外のその他の転写コントロールエレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を駆動するようにポリヌクレオチドと作動可能に会合できる。適切なプロモーター及びその他の転写コントロール領域は、本明細書に開示する。様々な転写コントロール領域が当業者に公知である。これらは、限定することなく、それらに限定されないが、サイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロンＡと連携する最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）のような脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域を含む。その他の転写コントロール領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ−グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、並びに真核生物細胞において遺伝子発現をコントロールできるその他の配列を含む。さらなる適切な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（テトラサイクリンを誘導できるプロモーター(promoters inducible tetracyclins)）を含む。同様に、様々な翻訳コントロールエレメントが当業者に公知である。これらは、それらに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に配列内リボソーム進入部位又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列ともよばれる）を含む。発現カセットは、複製起源、及び／又はレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）のような染色体組み込みエレメントのようなその他の特長も含んでよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を駆動する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合してよい。例えば、融合体の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の融合タンパク質をコードする核酸又はその断片の上流に置くことができる。シグナル仮説に従って、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、成長するタンパク質鎖が粗面小胞体を横切って一旦運び出され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを承知しており、これは、翻訳されたポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌又は「成熟」形を生成する。ある種の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド、又は作動可能に会合したポリペプチドの分泌を駆動する能力を保持するその配列の機能的誘導体を用いる。代わりに、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体を用いてよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してよい。例示的な分泌シグナルペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号３５及び３６に示す。
後工程での精製を容易にする（例えばヒスチジンタグ）か又は融合タンパク質の標識化を支援するために用いることができる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、融合タンパク質（断片）をコードするポリヌクレオチド内又はその端に含めてよい。
さらなる実施態様では、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある種の実施態様では、本発明の１又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関して本明細書に記載する任意の特長を、単独又は組み合わせで組み込むことができる。このような一実施態様では、宿主細胞は、本発明の融合タンパク質（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を作り出すように工学的に操作できる任意の種類の細胞系のことをいう。融合タンパク質を複製し、その発現を支持するために適切な宿主細胞は、当該技術において周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターで適当であればトランスフェクト又は形質導入されてよく、大量のベクター含有細胞を、大規模発酵槽に播種するために成長させて、十分な量の臨床用の融合タンパク質を得ることができる。適切な宿主細胞は、大腸菌のような原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞のような様々な真核生物細胞などを含む。例えば、ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要でない場合に細菌で生成できる。発現後に、ポリペプチドを、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離して、さらに精製できる。原核生物に加えて、部分的又は完全にヒトの糖鎖付加パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす、糖鎖付加経路が「ヒト化」された真菌及び酵母菌株を含む糸状菌又は酵母のような真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２、１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４、２１０−２１５（２００６）を参照されたい。（糖鎖付加）ポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのための、昆虫細胞と連携して用いることができる多くのバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば米国特許５９５９１７７号、６０４０４９８号、６４２０５４８号、７１２５９７８号及び６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体の生成のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として用いてよい。例えば懸濁物として成長するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓系統（例えばGraham等, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されるような２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばMather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばMather等, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載されるような）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０のような骨髄腫細胞株である。タンパク質生成に適切なある種の哺乳動物宿主細胞株のレビューのために、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（B.K.C.Lo編、Humana Press、Totowa、NJ）、ｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞は、培養細胞、ほんの数例を挙げれば例えば哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、そしてトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）のような哺乳動物細胞である。
これらの系において外来遺伝子を発現するための標準的な技術は、当該技術において公知である。抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を工学的に操作して、発現された生成物が重鎖と軽鎖の両方を有するように抗体鎖の他方も発現するようにしてよい。
一実施態様では、本発明による融合タンパク質を生成する方法であって、本明細書で提供する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養することと、融合タンパク質を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することとを含む方法が提供される。
本発明の融合タンパク質では、成分（ＩｇＧクラス抗体及びＩＬ−１０分子）は、互いに遺伝子的に融合されている。融合タンパク質は、その成分が互いに直接又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計できる。リンカーの組成及び長さは、当該技術において周知の方法に従って決定してよく、有効性について試験してよい。所望であれば融合タンパク質の個別の成分を分ける切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むようにさらなる配列を含んでもよい。
ある種の実施態様では、本発明の融合タンパク質は、ＦＡＰのような抗原と結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、自然に存在するか又は自然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成でき、それらに由来できる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術において周知である（例えばHarlow及びLane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい）。自然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成により構築できるか、組換えにより生成できるか（例えば米国特許４１８６５６７号に記載されるように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許５９６９１０８号を参照されたい）。
任意の動物種の抗体を本発明において用いることができる。本発明において有用な非限定的な抗体は、マウス、霊長類又はヒトを起源とするものであり得る。抗体がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトからであるキメラ形の抗体を用いてよい。ヒト化又は完全にヒト形の抗体も、当該技術において周知の方法に従って調製できる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許５５６５３３２号を参照されたい）。ヒト化は、それらに限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要なもの）を保持して又は保持せずに非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲをヒト（例えばレシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域にグラフト化すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用のために重要な残基）だけをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト化すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移すが、表面残基を置き換えることによりヒト様部分でそれらを「覆う」ことを含む様々な方法により達成してよい。ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３、１６１９−１６３３（２００８）でレビューされ、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６、１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許５８２１３３７号、７５２７７９１号、６９８２３２１号及び７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１、６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４、６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３）、１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化について記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８、４８９−４９８（１９９１）（「再表面形成」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」について記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３、２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングのための「誘導選択」アプローチについて記載）にさらに記載されている。本発明による抗体は、特に、ヒト抗体である。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術において公知の様々な技術を用いて生成できる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０−４５９（２００８）に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成でき、該抗体から導くことができる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原での負荷に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製してもよい（例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても作り出すことができる（例えばMethods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)中のHoogenboom等；及びMcCafferty等, Nature 348, 552-554；Clackson等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい）。ファージは、典型的に、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片として抗体断片を提示する。ファージディスプレイによる抗体の調製についての詳細な記載は、国際公開第２０１２／０２０００６号（これは、その全体が出典明示により本明細書に援用されている）に添付された実施例で見出すことができる。
ある種の実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる抗体は、例えばＰＣＴ国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照されたい）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（これらの内容全体は、出典明示により本明細書に援用されている）に開示される方法に従って結合親和性を増進するように工学的に操作されている。特定の抗原決定基と結合する本発明の抗体の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者が熟知しているその他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかにより測定できる。競合アッセイを用いて、特定の抗原との結合について参照抗体と競合する抗体、例えばＦＡＰとの結合について４Ｇ８抗体と競合する抗体を同定してよい。ある種の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合するのと同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第６６巻（Humana Press, Totowa, NJ）中のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に示されている。例示的な競合アッセイでは、固定化抗原（例えばＦＡＰ）を、抗原と結合する第１の標識抗体（例えば４Ｇ８抗体）及び抗原との結合について第１の抗体と競合するその能力について試験される第２の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してよい。コントロールとして、固定化抗原を、第１の標識抗体を含むが第２の未標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１抗体と抗原との結合を許容する条件下でのインキュベーションの後に、過剰の未結合抗体を除去し、固定化抗原と会合した標識の量を測定する。固定化抗原と会合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に低下するならば、このことは、第２の抗体が抗原との結合について第１の抗体と競合することを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照されたい。
本明細書に記載するようにして調製した融合タンパク質は、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどのような当該技術において公知の技術により精製してよい。特定のタンパク質を精製するために用いる実際の条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、融合タンパク質が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を用いることができる。例えば、本発明の融合タンパク質の親和性クロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリクスを用いてよい。プロテインＡ又はＧ親和性クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを連続的に用いて、実施例に本質的に記載するようにして融合タンパク質を単離できる。融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれによっても決定できる。例えば、実施例に記載するようにして発現させた融合タンパク質は、インタクトであり、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実証されるように（例えば図２、５を参照されたい）正しく組み立てられることが示された。
組成物、製剤及び投与の経路
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかで用いるための本明細書に記載する融合タンパク質のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供する融合タンパク質のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供する融合タンパク質のいずれかと、例えば以下に記載するような少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
（ａ）本発明に従って融合タンパク質を得ることと、（ｂ）融合タンパク質と少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを処方することにより、融合タンパク質の調製物をｉｎ ｖｉｖｏ投与用に処方することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏ投与用に適切な形での本発明の融合タンパク質を生成する方法がさらに提供される。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散された治療有効量の１又は複数の融合タンパク質を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」との句は、用いる投与量及び濃度にてレシピエントにとって一般的に非毒性である、すなわち例えば適当であればヒトのような動物に投与した場合に有害な、アレルギー性の又はその他の不適当な反応を生じない分子体及び組成物のことをいう。少なくとも１つの融合タンパク質と任意選択的にさらなる活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０（出典明示により本明細書に援用されている）に例示されるように、本開示に鑑みて当業者に公知である。さらに、動物（例えばヒト）投与のために、調製物は、ＦＤＡ生物学的製剤基準局又は他国での対応する機関により必要とされる無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の標準に合致すべきであることが理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水性溶液である。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるように（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company, 1990, p. 1289-1329（出典明示により本明細書に援用されている）を参照されたい）、任意のそして全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、重合体、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素などの材料及びそれらの組み合わせを含む。いずれかの慣習的な担体が活性成分と適合しないのでない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が期待される。
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾルの形で投与されるか、及びそれが注射のような投与の経路のために滅菌される必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含むことがある。本発明の融合タンパク質（及び任意のさらなる治療剤）は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、外用、局所、吸入（例えばエアロゾル吸入）により、注射、インフュージョン、連続インフュージョン、標的細胞に直接浴びせる局所的灌流、カテーテルを介して、洗浄により、クリーム中で、脂質組成物（例えばリポソーム）中で、又は当業者に公知のその他の方法又は上記のいずれかの組み合わせで投与できる（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company, 1990（出典明示により本明細書に援用されている）を参照されたい）。非経口投与、特に静脈内注射は、本発明の融合タンパク質のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に用いられている。
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射のために、本発明の融合タンパク質は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩緩衝液のような生理的に適合する緩衝液中で処方できる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤のような調合剤を含有してよい。代わりに、融合タンパク質は、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で使用前に構成要素となるための粉末形であってよい。滅菌注射用溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を適当な溶媒中に、必要に応じて以下に挙げた様々なその他の成分とともに組み込むことにより調製される。無菌性は、例えば滅菌ろ過膜を通してろ過することにより容易に遂行できる。一般的に、分散体は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒及び／又はその他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁剤又はエマルジョンの調製用の滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と以前に滅菌ろ過されたその液状媒質からの任意のさらなる所望の成分との散剤を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液状媒質は、必要ならば適切に緩衝されるべきであり、液状希釈剤は、まず、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて注射の前に等張にされる。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。内毒素混入は、安全レベルにて最小限に、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保つべきであることが認識される。適切な薬学的に許容される担体は、それらに限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；並びに／あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン界面活性剤を含む。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどのような懸濁剤の粘度を増加させる化合物を含有してよい。任意選択的に、懸濁剤は、適当な安定化剤又は化合物の溶解性を増加させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有してよい。さらに、活性化合物の懸濁剤は、油性注射用懸濁剤として調整してよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、ごま油のような脂肪油又はエチルクリート（ethyl cleats）若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル又はリポソームを含む。
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中の、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第18版Mack Printing Company, 1990）に開示されている。持続放出調製物を調製してよい。持続放出調製物の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリクス（マトリクスは、成形体、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形である）を含む。特定の実施態様では、注射用組成物の長期の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせのような吸収遅延剤を組成物に用いることによりもたらすことができる。
以前に記載した組成物に加えて、融合タンパク質は、デポー調製物として処方してもよい。このような長期間作用性製剤は、植え込み（例えば皮下又は筋内）又は筋内注射により投与してよい。よって、例えば、融合タンパク質は、適切な重合体材料若しくは疎水性材料（例えば許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として処方してよい。
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化、被包、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造してよい。薬学的組成物は、１又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は薬学的に用いることができる、タンパク質を調製物に容易に加工できるようにする佐剤を用いて、慣習的な様式で処方してよい。適した製剤は、選択する投与の経路に依存する。
融合タンパク質は、遊離の酸若しくは塩基、中性又は塩の形で組成物において処方してよい。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を本質的に保持する塩である。これらは、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基を用いて形成されるものあるいは例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸を用いて形成されるものを含む。遊離カルボキシ基を用いて形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは第二鉄のような無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基から導くことができる。薬学的な塩は、対応する遊離の塩基の形よりも、水性及びその他のプロトン性溶媒における溶解性がより高い傾向にある。
治療方法及び組成物
本明細書で提供するいずれの融合タンパク質も、治療方法において用いてよい。
治療方法での使用のために、本発明の融合タンパク質は、医薬品製造管理基準に適合した方式で処方、用量決定及び投与される。この文脈において考慮する因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤を送達する部位、投与方法、投与計画及び医療従事者に公知のその他の因子を含む。
一態様では、医薬として用いるための本発明の融合タンパク質が提供される。さらなる態様では、疾患の治療用の本発明の融合タンパク質が提供される。ある種の実施態様では、治療方法で用いるための本発明の融合タンパク質が提供される。一実施態様では、本発明は、治療を必要とする個体における疾患の治療用の本明細書で記載する融合タンパク質を提供する。ある種の実施態様では、本発明は、個体に治療有効量の融合タンパク質を投与することを含む疾患を有する個体を治療する方法で用いるための融合タンパク質を提供する。ある種の実施態様では、治療される疾患は、炎症性疾患である。例示的な炎症性疾患は、炎症性腸疾患（例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎）及び関節リウマチを含む。特定の実施態様では、疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチ、特に炎症性腸疾患、より特にはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。ある種の実施態様では、方法は、個体に治療有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば治療される疾患が炎症性疾患であるならば抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意の上記の実施態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造又は調製における本発明の融合タンパク質の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に治療有効量の医薬を投与することを含む疾患を治療する方法において用いるためである。ある種の実施態様では、治療される疾患は、炎症性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチ、特に炎症性腸疾患、より特にはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。一実施態様では、方法は、個体に治療有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば治療される疾患が炎症性疾患であるならば抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意の上記の実施態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、個体に治療有効量の本発明の融合タンパク質を投与することを含む、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容される形で本発明の融合タンパク質を含む組成物を前記個体に投与する。ある種の実施態様では、治療される疾患は、炎症性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、炎症性腸疾患又は関節リウマチ、特に炎症性腸疾患、より特にはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。ある種の実施態様では、方法は、個体に治療有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば治療される疾患が炎症性疾患であるならば抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意の上記の実施態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
本発明の融合タンパク質は、診断薬としても有用である。抗原決定基との融合タンパク質の結合は、例えば融合タンパク質と結合した標識により又は本発明の融合タンパク質に特異的な標識２次抗体を用いることにより容易に検出できる。
いくつかの実施態様では、有効量の本発明の融合タンパク質を細胞に投与する。他の実施態様では、治療有効量の本発明の融合タンパク質を、疾患の治療のために個体に投与する。
疾患の防止又は治療のために、本発明の融合タンパク質の適当な投与量（単独又は１若しくは複数の他のさらなる治療剤との組み合わせで用いる場合）は、治療される疾患のタイプ、投与の経路、患者の体重、融合タンパク質のタイプ、疾患の重篤度及び経過、融合タンパク質が防止又は治療のいずれを目的として投与されるか、以前の又は現在の治療的介入、患者の臨床経歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに担当医師の慎重さに依存する。投与に責任を持つ医師は、いずれにしても、組成物中の活性成分の濃度及び個別の対象に対する適当な用量を決定する。本明細書において、それらに限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、急速投与及びパルスインフュージョンを含む様々な投与計画が期待される。
融合タンパク質は、１回又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の融合タンパク質が、例えば１若しくは複数回の別々の投与又は連続インフュージョンのいずれによっても、患者への投与のための初期候補投与量であり得る。ある典型的な１日投与量は、上記の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。状態に依存して数日以上にわたる反復投与のために、治療は、疾患症状が望ましく抑制されるまで、一般的に持続される。融合タンパク質のある例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。その他の非限定的な例では、用量は、投与あたり約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重以上まで、及びその中で導くことができる任意の範囲も含んでよい。本明細書で列挙する数から導くことができる範囲の非限定的な例では、上記の数に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重まで、約５μｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重までなどの範囲を投与できる。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のそれらの組み合わせ）の１又は複数回の用量を患者に投与してよい。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週間ごとに投与してよい（例えば約２から約２０又は例えば約６回の用量の融合タンパク質を患者が受けるように）。１又は複数回のより低い用量が後に続く初期のより高い負荷用量を投与してよい。しかし、他の投与計画が有用なことがある。この治療の進捗は、慣習的な技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
本発明の融合タンパク質は、一般的に、意図する目的を達成するために有効な量で用いられる。疾患状態を治療又は防止するために用いるために、本発明の融合タンパク質又はその薬学的組成物を、治療有効量で投与又は施用する。治療有効量の決定は、特に本明細書で提供する詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与のために、細胞培養アッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから治療有効量を初期に見積もることができる。次いで、動物モデルにおいて用量を処方して、細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成できる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をさらに精密に決定できる。
初期投与量は、当該技術において周知の技術を用いてｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから見積もることができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できる。
投与量及び間隔は、個別に調節して、治療効果を維持するために十分な融合タンパク質の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日まで、典型的に約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲である。治療有効血漿レベルは、各日に複数回の用量を投与することにより達成してよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定してよい。
局所投与又は選択的取り込みの場合、融合タンパク質の有効局所濃度は、血漿濃度と関係しないことがある。当業者は、過度の実験を行うことなく、治療有効局所投与量を最適化できる。
本明細書で記載する治療有効量の融合タンパク質は、一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療の利益をもたらす。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物において標準的な薬学的手順により決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究を用いてＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きい治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。一実施態様では、本発明による融合タンパク質は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータを、ヒトで用いるために適切な投与量の範囲を処方する場合に用いることができる。投与量は、ほとんど又は全く毒性がなくＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、この範囲内で、様々な因子、例えば用いる剤形、利用する投与の経路、対象の状態などに依存して変動してよい。厳密な製剤、投与の経路及び投与量は、患者の状態に鑑みて個別の医師が選択できる（例えばThe Pharmacological Basis of Therapeutics中のFingl等, 1975, Ch. 1, p. 1（その全体が出典明示により本明細書に援用されている）を参照されたい）。
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の担当医師は、毒性、臓器不全などにより、どのように、かついつ投与を終了、中断又は調節するかを分かっている。逆に、担当医師は、臨床応答が適正でない（毒性を除く）ならば治療をより高いレベルに調節することも分かっている。対象の障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与の経路などに応じて変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的に、標準的な予後評価方法により評価してよい。さらに、用量及びおそらく用量頻度も、個別の患者の年齢、体重及び応答により変動する。
その他の薬剤及び治療
本発明の融合タンパク質は、治療において１又は複数のその他の薬剤と組み合わせて投与してよい。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与してよい。用語「治療剤」は、治療を必要とする個体における症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療剤は、治療される特定の適応症に適切な任意の活性成分、好ましくは互いに不利に影響しない相補的な活性を有するものを含んでよい。ある種の実施態様では、さらなる治療剤は、抗炎症剤である。
このようなその他の薬剤は、意図する目的のために効果的な量で、組み合わせにおいて適切に存在する。このようなその他の薬剤の有効量は、用いる融合タンパク質の量、障害又は治療のタイプ及び上で論じたその他の因子に依存する。融合タンパク質は、本明細書に記載するものと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載する投与量の約１から９９％まで、又は経験的／臨床的に適当であると決定される任意の投与量及び任意の経路で一般的に用いられる。
上記のこのような併用治療は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別々の組成物に含まれる）、及び別々の投与（この場合、本発明の融合タンパク質は、さらなる治療剤及び／又は補助剤の投与の前、同時及び／又は後に投与できる）を包含する。
製品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、防止及び／又は診断のために有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器と、容器に貼付されたか又は付随する標識又は添付文書とを含む。適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、それ自体又は状態を治療、防止及び／又は診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌口を有してよい（例えば容器は、皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の融合タンパク質である。標識又は添付文書は、選択した状態を治療するために組成物を用いることを示す。さらに、製品は、（ａ）本発明の融合タンパク質を含む組成物を含有する第１の容器と、（ｂ）さらなる治療剤を含む組成物を含有する第２容器とを含んでよい。本発明のこの実施態様の製品は、組成物を用いて特定の状態を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。代わりに又はさらに、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでよい。製品は、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及び注射器を含む、商業的な及びユーザの視点から望ましいその他の材料をさらに含んでよい。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な記載に鑑みて、様々なその他の実施態様を実施できることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されるような標準的な方法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の使用説明に従って用いた。ＤＮＡ配列は、２本鎖配列決定により決定した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列についての一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２に示されている。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適当な鋳型を用いるＰＣＲにより作り出したか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物から自動化遺伝子合成により合成した。単数制限エンドヌクレアーゼ切断部位で挟まれた遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを、形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。遺伝子セグメントは、適切な制限部位を有するように設計して、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。全ての構築物は、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的にするリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’端ＤＮＡ配列を有するように設計した。
抗体−ＩＬ−１０融合構築物のクローニング
重鎖及び軽鎖Ｖドメインの増幅ＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１若しくはＦａｂ定常重鎖又はヒト定常軽鎖を含有するそれぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターのいずれかにインフレームで挿入した。重鎖及び軽鎖は、常に別々のプラスミド上にコードした。軽鎖をコードするプラスミドがＩｇＧに基づくＩＬ−１０融合構築物及びＦａｂに基づくＩＬ−１０融合構築物で同一であるが、Ｆａｂに基づく構築物についての重鎖をコードするプラスミドは、フォーマットに依存して、それぞれのＩＬ−１０部分とともに１又は２つのＶＨ−ＣＨ１ドメインを含有する。Ｆａｂ重鎖プラスミドが２つのＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む場合（単鎖ＩＬ−１０ ２量体又は工学的に操作された単量体ＩＬ−１０が介在する直列Ｆａｂ（Josephson等, J Biol Chem 275, 13552-7 (2000)）、２つのＶドメインは、それらのそれぞれについて異なる組み合わせの制限部位を用いて２ステップクローニング手順にて挿入されなければならなかった。これらの構築物のＩＬ−１０部分は、常に、それぞれＦａｂ又はＩｇＧ重鎖のＣ末端とサイトカインのＮ末端との間に（Ｇ４Ｓ）３ １５マーリンカーを用いてこれらの抗体の重鎖とインフレームにクローニングした。ＩｇＧ−ＩＬ−１０フォーマット（図１Ａ）だけは、ＩｇＧ重鎖のＣ末端とサイトカインのＮ末端との間に（Ｇ４Ｓ）４ ２０マーリンカーを含む。ＩｇＧ重鎖のＣ末端リジン残基は、連結子を付加する際に除去した。単鎖ＩＬ−１０について、（Ｇ４Ｓ）４ ２０マーリンカーを、２つのＩＬ−１０鎖の間に挿入した。一方だけがＩＬ−１０に融合している２つの異なるＩｇＧ重鎖の場合、２つの重鎖プラスミドは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメイン中のノブ−イントゥ−ホール改変によりヘテロ２量体形成が促進されるように構築及びトランスフェクトされる必要があった。ＩＬ−１０部分と接続された「ホール」重鎖は、ＣＨ３ドメイン中にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を有し、融合されていない「ノブ」重鎖は、ＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を有した（ＥＵ番号付け）。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を廃止し、かつＦｃＲ同時活性化を防止するために、以下の変異をＩｇＧ重鎖のそれぞれのＣＨ２ドメインに導入した：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）。抗体−ＩＬ−１０融合構築物の発現は、ＭＰＳＶプロモーターにより行い、転写は、ＣＤＳの下流にある合成ポリＡシグナル配列により終結させた。発現カセットに加えて、各ベクターは、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ発現細胞株における自己複製のためのＥＢＶ ｏｒｉＰ配列を含有した。
抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質の調製
ＦＡＰを指向する抗原結合部分の作製、親和性成熟及び特徴決定についての詳細は、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０２０００６号（これは、その全体が出典明示により本明細書に援用されている）に添付された実施例（特に実施例２−６（調製）及び７−１３（特徴決定））で見出すことができる。そこに記載されるように、以下の実施例で用いる４Ｇ８及び４Ｂ９と称するものを含む、ＦＡＰを指向する様々な抗原結合ドメインをファージディスプレイにより作り出した。
実施例で用いる抗体ＩＬ−１０融合構築物は、指数関数的に成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて哺乳動物発現ベクターを同時トランスフェクトすることにより生成した。代わりに、懸濁状態で成長しているＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）により発現ベクターをトランスフェクトした。クローン４Ｇ８及び４Ｂ９に基づく全てのＦＡＰ標的化抗体−ＩＬ−１０融合構築物は、プロテインＡマトリクスを用いる親和性クロマトグラフィーにより精製できる。
簡単に述べると、ＩＬ−１０、単鎖（ｓｃ）ＩＬ−１０又はＩＬ−１０Ｍ１に融合したＦＡＰ標的化構築物は、１回の親和性クロマトグラフィー工程（プロテインＡ）とその後のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とで構成される方法により精製した。プロテインＡカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５で平衡化し、上清を載せ、カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（任意選択的に５００ｍＭ塩化ナトリウムを含むか又は含まない）、ｐＨ７．５で洗浄した後に、ＦＢＳが上清中に存在する場合に、１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５で洗浄した。１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５での３回目の洗浄は、任意選択的に実行した。融合構築物を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３で溶出した。溶出画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーにより最終処方緩衝液（これは、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシンｐＨ６．７又は２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０のいずれかであった）中で仕上げた。
精製抗体−ＩＬ−１０融合構築物のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて決定した。融合構築物の純度、完全性及び単量体状態は、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブルー（ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の使用説明に従って用いた（４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル又は３−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）。代わりに、還元又は非還元抗体−ＩＬ−１０融合構築物を、製造者の仕様書に従ってＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて分析した。免疫コンジュゲート試料の凝集物含量は、２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７．３ランニング緩衝液を用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ分析サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、又は２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭアルギニン、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ６．７ランニング緩衝液中で２５℃にてＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラムを用いて分析した。
異なる構築物の精製及びその後の分析の結果を、図２−８に示す。ＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物は、その他のＩＬ−１０融合フォーマットよりもよいいくつかの生成の利点を示した。まず、Ｆａｂ−ＩＬ−１０フォーマットと比較して、ＩＬ−１０ホモ２量体は、同じ抗体分子内に繋留される。その結果、生成の際に、２量体だけが所望の活性生成物であるのに単量体及び２量体のタンパク質種が親和性クロマトグラフィーの後に観察されるＦａｂ−ＩＬ−１０フォーマットで見られるような単量体ＩＬ−１０分子が生じることができない（図２Ｂと図６Ｂとを比較されたい）。第２に、ノブ−イントゥ−ホール改変を含むヘテロ２量体ＩｇＧに基づくフォーマット（例えばＩｇＧ−ｓｃＩＬ−１０及びＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１）とは対照的に、ＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物は、２つの同一の重鎖を含む。このことにより、ホール−ホール又はノブ−ノブのホモ２量体のような不要な副生成物が回避される。
ＳＰＲによる親和性決定
３つの異なる種（ヒト、マウス及びカニクイザル）からのＦＡＰに対する及びヒトＩＬ−１０Ｒ１に対する抗体−ＩＬ−１０融合構築物の速度定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）及び親和性（ＫＤ）を、ＰＢＳＴランニング緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）とともにＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）装置を２５℃にて用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。ＦＡＰに対する親和性を決定するために、標的タンパク質を、共有結合により固定化した抗Ｈ６抗体により、そのＨ６タグを介して捕捉した（図９Ａ）。簡単に述べると、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓＮＨＳ）との新しく調製した混合物を用いて全てのチャネルを５分間同時に活性化し、その後に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中の１５μｇ／ｍｌ抗ペンタＨｉｓ ＩｇＧ（Ｑｉａｇｅｎ＃３４６６０、マウスモノクローナル抗体）を１８０秒間注入することにより、ＧＬＭチップの別々の垂直チャネルに３０μｌ／分にて高レベルで（〜５，０００ＲＵまで）、抗ペンタＨｉｓ ＩｇＧを固定化した。チャネルを、エタノールアミンを５分間注入することによりブロックした。異なる種からのＨ６タグ付加ＦＡＰ（配列番号８１、８３及び８５を参照されたい）を、３０μｌ／分にて６０秒間の垂直チャネルに沿うランニング緩衝液中の５μｇ／ｍｌ希釈物から捕捉して、〜２５０から６００ＲＵの間のリガンド密度を達成した。ワンショットカイネティックアッセイの構成（ＯＳＫ）では、抗体−ＩＬ−１０融合構築物を分析物として、水平チャネルに沿って、５０から０．０８ｎＭまでの５倍系列希釈で、１００μｌ／ｍｉｎにて注入した。会合段階は１８０秒間、解離段階は６００秒間記録した。非常に遅いオフレートを示す相互作用の場合、オフレートの記録は、複合体の解離を観察するために１８００秒まで延長した。しかし、いくつかの場合では、これらのオフレートのフィッティングはまだ可能でなかったので、ＫＤの算出のために１×１０−５ １／ｓの推定値を用いた。ランニング緩衝液（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとした。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎマネージャソフトウェアバージョン２．１）を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５及び５０ｍＭ ＮａＯＨを１００μｌ／分にて３０秒間、水平方向で２回パルスして、抗ペンタＨｉｓ ＩｇＧを捕捉されたＦＡＰ及び結合した抗体−ＩＬ−１０融合構築物から解離させることにより、再生を実行した。
抗体−ＩＬ−１０融合構築物とヒトＩＬ−１０Ｒ１との間の相互作用を測定するために、ＮＬＣチップを用いてビオチン化受容体を固定化した（図９Ｂ）。４００から１６００ＲＵの間のヒトＩＬ−１０Ｒ１（配列番号８７を参照されたい）を、１０μｇ／ｍｌの濃度及び様々な接触時間について３０μｌ／秒の流速にて垂直チャネルに沿ってニュートラアビジン誘導体化チップマトリクス上に捕捉した。ビオチン化ヒトＩＬ１０Ｒ１との結合は、水平方向に１００μｌ／分で注入し、会合速度を１８０秒間、解離速度を６００秒間記録することにより６つの異なる分析物濃度（５０、１０、２、０．４、０．０８、０ｎＭ）にて測定した。ランニング緩衝液（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルに沿って注入して、参照のための「列内」ブランクとした。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎマネージャソフトウェアバージョン２．１）を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出した。ヒトＩＬ−１０Ｒ１は活性を喪失することなく再生できなかったので、リガンド捕捉と分析物注入の後続の２工程は、相互作用ごとに新しく固定化したセンサチップ表面を用いてチャネルごとに実行した。
表１及び２は、異なる種からのＦＡＰ及びヒトＩＬ−１０Ｒ１と結合する、抗ＦＡＰクローン４Ｇ８又は４Ｂ９にそれぞれ基づく抗体−ＩＬ−１０融合構築物についての速度定数及び平衡定数のまとめを示す。
表1.抗FAPクローン4G8に基づく抗体融合体についての速度定数及び平衡定数のまとめ。異なる種からのFAP及びヒトIL-10R1との結合。
Figure 2019033755
表2.抗FAPクローン4B9に基づく抗体融合体についての速度定数及び平衡定数のまとめ。異なる種からのFAP及びヒトIL-10R1との結合。
Figure 2019033755
我々が有する、抗体に融合していないがＣ末端にＨ６タグを有する野生型（ｗｔ）ＩＬ−１０サイトカインは、ヒトＩＬ−１０Ｒ１について５２ｐＭのＫＤを示した（ｋｏｎ ２．５×１０６ １／Ｍｓ、ｋｏｆｆ １．３×１０−４ １／ｓ）。２量体サイトカインに基づく抗体−ＩＬ−１０融合構築物について、ＩＬ−１０Ｒ１に対するアビディティーは、融合していないサイトカインと同等であり、これもまた２桁のｐＭであった（１８から７３ｐＭまでの範囲）。このことは、このサイトカインが、ヒトＩＬ−１０Ｒ１に対するアビディティーを著しく喪失することなく、抗体又はその断片とのＮ末端融合に耐えることを示した。対照的に、単量体サイトカインに基づく抗体−ＩＬ−１０融合構築物は、２量体ＩＬ−１０融合体のアビディティー効果を示さず、よって、受容体に対するこれらの親和性は、３桁のｐＭ又は１桁のｎＭの範囲であった（それぞれ８１５ｐＭ及び１．１ｎＭ）。ＦＡＰとの結合は、それぞれの抗体に依存し、クローン４Ｂ９はヒト及びカニクイザルＦＡＰに対してより高い親和性／アビディティーを示すが、クローン４Ｇ８はマウスＦＡＰに対してより高い親和性／アビディティーを示す。実際に、マウスＦＡＰに対する４Ｇ８抗体のアビディティーはかなり強かったので、用いた条件下で複合体の解離速度を決定することが不可能であった。
ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒ１との間の相互作用の親和性（アビディティー）は、〜３５−２００ｐＭの範囲で高い（Moore, K.W.等, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001)）。２量体ＩＬ−１０部分又は２つの独立した単量体を含む構築物について、抗体との融合は、著しく親和性を変更しないことが見受けられる（〜１９−７３ｐＭ）。しかし、単量体ＩＬ−１０融合構築物について、この結合の強さは劇的に低下した。これは、おそらく、同じＩｇＧと結合した２量体サイトカイン又は２つの単量体について生じるようなアビディティー効果がないからである。理想的には、標的ＦＡＰに対する抗体−ＩＬ−１０融合構築物の親和性は、ＦＡＰが発現されている組織を効率的に標的にするために、高親和性サイトカイン受容体ＩＬ−１０Ｒ１に対するものよりも高いべきである。ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒ１との間の高い親和性にもかかわらず、ＩｇＧ−ＩＬ−１０フォーマットに基づく分子が示す標的ＦＡＰに対する親和性は、まだ高い：それぞれクローン４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−１０（ＩＬ−１０Ｒ１に対して４８ｐＭ対ヒトＦＡＰに対して１１ｐＭ）及びクローン４Ｇ８（ＩＬ−１０Ｒ１に対して２５ｐＭ対マウスＦＡＰに対して６ｐＭ）。ＩＬ−１０Ｒ１及びＦＡＰに対するこれらの親和性は、ＦＡＰを過剰発現する組織を効率的に標的にするために適切であると見られ、ＩＬ−１０Ｒ１は、これらの分子のシンクを表すようには見受けられない。
初代単球による炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ誘発生成の抑制
ＩｇＧ又はＦａｂに基づくＦＡＰ標的化ＩＬ−１０構築物の間の機能的特徴決定及びこれらの区別のために、これらの分子の能力を異なるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで査定した。例えば、初代単球による炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ誘発生成を抑制する有効性を測定した。この実験のために、２００ｍｌのヘパリン処理した末梢血（健常提供者から得た、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をフィコールハイパック密度勾配により分離し、その後、単球をネガティブ単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＃１３０−０９１−１５３）。精製単球を、９６ウェルＦ細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；＃３５９６）に、培地（１０％ヒト血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン［Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０］及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補ったＲＰＭＩ１６４０［Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ．ｎｏ．＃１０５０９−２４］）中で５×１０４細胞／ウェルにて播種した。
全ての抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質を、（ａ）溶液中及び（ｂ）実験的背景で試験し、ここでは、組換えヒトＦＡＰ（ｃｆｉｎ＝１μｇ／ｍｌ）で４℃にて１晩（代わりに室温にて６０−９０分）プレートを被覆し、被覆されたＦＡＰとの結合により抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質を固定化した。
構成（ａ）について、滴定した量（通常０−５００ｎＭ）の示した抗体融合構築物又は陽性コントロールとしての組換え野生型ヒトＩＬ−１０の存在下又は非存在下で１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｎｕｎｃ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＃Ｌ３１２９）とともに播種した後に、細胞を直接刺激した。構成（ｂ）について、未結合のＦＡＰを被覆の後に除去し、プレートを培地（上記を参照されたい）で室温にて１時間ブロックした後に、さらに１時間ＩＬ−１０構築物とインキュベートした。その後、プレートを培地で洗浄し、その後、単球を適当な刺激物質（１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ）とともに培養に加えた。
全ての実験について、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。上清を採取し（任意選択的に−２０／−８０℃にて貯蔵）、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ及び／又はＴＮＦαについてのＣＢＡフレックスセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＃５５８２７９、＃５５８２７６、＃５５８３２６及び＃５５８２９９）を用いてサイトカイン生成について試験した。プレートをＦＡＣＳアレイを用いて測定し、ＦＣＡＰソフトウェア（ともにＢＤから購入）を用いて分析した。
図１０に示すように、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαの抑制における４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ−１０及びＩｇＧ−ＩＬ−１０のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は、構成（ａ）において同等であった（図１０Ｄ、Ｅ、Ｆ）。対照的に、構成（ｂ）では、ＩｇＧに基づくフォーマットは、Ｆａｂ−ＩＬ−１０と比較して優れた効力を実証した（図１０Ａ、Ｂ、Ｃ）。対応するＥＣ５０値［ｎＭ］を表３に示す。構成（ｂ）におけるＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物のＥＣ５０値は、組換えｗｔヒトＩＬ−１０のもの（これは構成（ａ）でのみ試験することができた）と同様であった。
表3.単球(ドナー1)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
この結果は、２名の異なる血液ドナーを用いる独立した実験において再現された（図１１、Ａ及びＢ、表４及び５）。この実験でも、ＩｇＧに基づく標的化ＩＬ−１０構築物は、構成（ｂ）において得られたＥＣ５０値により示されるように、試験した３つ全てのサイトカインの抑制においてＦａｂに基づく分子よりも著しく優れていた。構成（ａ）では、全ての分子は同等であった。
表4.単球(ドナー2)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
表5.単球(ドナー3)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
さらなる実験では、単球によるＩＬ−６生成の抑制におけるＦａｂ及びＩｇＧに基づくＩＬ−１０構築物の効力を再び査定し、ｗｔ ＩＬ−１０並びにＦＡＰと結合しない非標的化Ｆａｂ−ＩＬ−１０及びＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物と比較した（図１２及び表６）。ここでもまた、４Ｇ８−ＩｇＧ−ＩＬ−１０は、４Ｇ８−Ｆａｂ−ＩＬ−１０と比較して、実験的構成（ｂ）においてＩＬ−６生成をより効率的に抑制するが、非標的化構築物は、最高濃度でのみ抑制を引き起こしたことが見出された。対照的に、構成（ａ）では、全ての構築物の効力は同等であった。
表6.単球(ドナー4)によるIL-6生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
以前のアッセイにおいて被覆のために用いた組換えヒトＦＡＰの濃度は人工的又は非生理的条件を反映する可能性があるので、被覆ＦＡＰの量を滴定し（０．２５から５μｇ／ｍｌの間のｃｆｉｎ）、ＥＣ５０値に対するその影響を、実験的構成（ｂ）で査定した。
図１３に示すように、全体的に、ＩｇＧ及びＦａｂに基づく構築物についてＥＣ５０値の比に劇的な差はない。全ての濃度にて、ＩｇＧ−ＩＬ−１０構築物は、ＩＬ−６誘導の阻害においてより効力が高かった（図１３並びに表７及び８）。被覆ＦＡＰの濃度は、しかし、濃度が減少するとＥＣ５０値が一般的に増加したので、実験の成績に影響し、このことは、マイクロタイタープレート上に固定化された構築物の量を反映する可能性があった（表８；Ｆａｂに基づく構築物について、最低ＦＡＰ濃度にてサイトカインの低下が観察されたが、ＥＣ５０は算出できなかった）。興味深いことに、高いＦＡＰ濃度（５μｇ／ｍｌ）では、分泌ＩＬ−６の全量の増加が検出された（図１４）。
表7.単球(ドナー5)によるIL-6生成の抑制についての4G8-IgG-IL-10及びヒト野生型IL-10(溶液)のEC50値。
Figure 2019033755
表8.単球(ドナー5)によるIL-6生成の抑制についての、異なる濃度の被覆FAP上に固定化された4G8-IgG-IL-10及び4G8-Fab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
さらなる実験では、異なるＦＡＰ標的化ドメインである親和性成熟抗ＦＡＰ抗体バリアント４Ｂ９を含むＩＬ−１０融合構築物を試験した。ここでもまた、単球によるＬＰＳ誘発ＩＬ−６生成の抑制における構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を、実験的構成（ａ）及び（ｂ）において査定した。
図１５は、４Ｂ９に基づく構築物について、ＩｇＧ−ＩＬ−１０分子が、実験的構成（ａ）においてＩＬ−６生成の抑制においてＦａｂ−ＩＬ−１０構築物よりも優れていた（及び構成（ｂ）において同等であった）ことを示す。対応するＥＣ５０値を表９に示す。一般的に、４Ｂ９及び４Ｇ８構築物は、同様の効力を実証した。
表9.単球(ドナー7)によるIL-6生成の抑制についての4G8及び4B9に基づくIgG-IL-10及びFab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
さらなる一連の実験では、４Ｇ８に基づくＩｇＧ−ＩＬ−１０、Ｆａｂ−ＩＬ−１０、Ｆａｂ−ＩＬ−１０Ｍ１−Ｆａｂ及びＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１構築物を比較した。単球による炎症誘発性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦαのＬＰＳ誘発生成の抑制を、実験的構成（ａ）及び（ｂ）において査定した。これらの実験の結果を、表１０−１２に示す（３名の異なるドナー）。以前の実験と同様に、ＩｇＧ−ＩＬ−１０が、特に実験的構成（ｂ）において最も効力が高い構築物であった。
表10.単球(ドナー1)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表11.単球(ドナー2)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表12.単球(ドナー3)によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 IgG-IL-10、4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-IL-10M1-Fab及び4G8 IgG-IL-10M1融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
まださらなる一連の実験では、４Ｇ８に基づくＦａｂ−ＩＬ−１０、Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１０−Ｆａｂ及びＦａｂ−ＩＬ−１０Ｍ１−Ｆａｂ構築物を比較した。単球によるＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＧ−ＣＳＦのＬＰＳ誘発生成の抑制を、実験的構成（ａ）及び（ｂ）において査定した。これらの実験の結果を、表１３−１７に示す（６名の異なるドナー）。結果は、２量体ＩＬ−１０分子を含む構築物が、ｓｃＩＬ−１０又は単量体ＩＬ−１０Ｍ１分子を含む構築物よりも効力が高いことを示す。
表13.単球によるサイトカイン生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表14.単球によるIL-6生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表15.単球によるIL-1β生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表16.単球によるG-CSF生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表17.単球によるTNFα生成の抑制についての4G8 Fab-IL-10、4G8 Fab-scIL-10-Fab及び4G8 Fab-IL-10M1-Fab融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
最後に、４Ｂ９及び４Ｇ８に基づくＦａｂ−ＩＬ−１０及びＩｇＧ−（ＩＬ−１０Ｍ１）２構築物を比較した。単球によるＩＬ−６のＬＰＳ誘発生成の抑制を、実験的構成（ａ）及び（ｂ）において査定した。この実験の結果を表１９に示す。結果は、ＩｇＧ−（ＩＬ−１０Ｍ１）２を含む全ての構築物が、構成（ａ）よりも構成（ｂ）においてよりよく実行することを示す。
表18.単球によるIL-6生成の抑制についての4B9 IgG-IL-10、4G8 IgG-IL-10及び4G8 IgG-(IL-10M1)2融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
初代単球上のＭＨＣ−ＩＩ分子のＩＦＮγ誘発上方制御の抑制
ＩｇＧ及びＦａｂに基づくＦＡＰ標的化ＩＬ−１０構築物間の機能的特徴決定及びそれらの区別のために、単球でのＩＦＮγ誘発ＭＨＣ−ＩＩ発現を抑制する能力を査定した。サイトカイン抑制アッセイと同様に、この実験は、溶液中にあるか（実験的構成（ａ）；上を参照されたい）又は細胞培養プレートを被覆するＦＡＰとの結合により固定化された（実験的構成（ｂ）；上を参照されたい）構築物を用いて実行した。原則として、単球を上記のようにして単離及び培養したが、２５０Ｕ／ｍｌ ＩＦＮγ（ＢＤ、＃５５４６１６）で２４時間刺激した。刺激の前に、細胞を、組換え野生型（ｗｔ）ＩＬ−１０又は異なる抗体−ＩＬ−１０融合構築物で任意選択的に処理した。インキュベーションの後に、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理（ＰＡＡ、＃Ｌ１１−００７）により剥がし、３％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、＃４５２２）を含有するＰＢＳ中の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＢＤ、＃５５９８６６）で染色して、いずれの非特異的ＦｃγＲ結合も回避し、その後、最終段階のＦＡＣＳ分析に供した。
この実験の結果を表１９に示し、この表は、４Ｂ９に基づく構築物について、ＩｇＧ−ＩＬ−１０分子が、実験的構成（ｂ）において初代単球上のＩＦＮγ誘発ＭＨＣ−ＩＩ発現の下方制御においてＦａｂ−ＩＬ−１０構築物よりも優れていた（そして構成（ａ）では同等であった）ことを実証する。
表19.初代単球上でのIFNγ誘発MHC-II発現の下方制御についての4B9 IgG-IL-10及び4B9 Fab-IL-10のEC50値。
Figure 2019033755
単離初代単球におけるＩＬ−１０誘発ＳＴＡＴ３リン酸化
ＩＬ−１０Ｒシグナル伝達はＳＴＡＴ３のリン酸化を導くので、いくつかの標的化ＩＬ−１０構築物及びフォーマットを、新しく単離した血液単球を用いるｐＳＴＡＴ３アッセイにおいて機能的に評価した（Finbloom及びWinestock, J. Immunol. 1995; Moore等, Annu. Rev. Immunol. 2001; Mosser及びZhang, Immunological Reviews 2008）。簡単に述べると、ＣＤ１４＋単球を、上記のような健常ドナーのフィコール単離ＰＢＭＣから手を付けずに分けた。典型的に、３−１０×１０５細胞を、ＦＡＣＳチューブ中の３００μｌの培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／Ｌ−グルタミン／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中に移し、０−２００／５００ｎＭのｗｔヒトＩＬ−１０又は示した抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質とともに、通常、３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベートした。次いで、チューブあたり３００μｌの予め温めたＦｉｘ緩衝液Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５７８７０）を加え、ボルテックスし、３７℃にて１０分間インキュベートした後に、細胞を２ｍｌ ＰＢＳ／２％ＦＣＳで１回洗浄し、２５０×ｇにて１０分間遠心分離した。その後、チューブあたり３００μｌの氷冷Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５８０５０）を細胞透過処理のために加え、氷上で３０分間インキュベートした後に、細胞を上記のようにして再び洗浄した。最後に、細胞を１００μｌ抗体希釈液（抗Ｓｔａｔ−３．Ａ６４７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５７８１５）中に再懸濁し、４℃にて３０分間インキュベートした後に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために処理した。
この実験において異なる構築物について得られたＥＣ５０値を、表２０及び２１に示す。結果は、２量体ＩＬ−１０分子（Ｆａｂ又はＩｇＧに基づく）を含む構築物が、ｓｃＩＬ−１０分子又は単量体ＩＬ−１０Ｍ１分子を含む構築物よりも活性が高いことを示す。
表20.単離初代単球でのIL-10誘発STAT3リン酸化についての4G8に基づく抗体-IL-10融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
表21.単離初代単球でのIL-10誘発STAT3リン酸化についての4B9に基づく抗体-IL-10融合タンパク質のEC50値。
Figure 2019033755
ＦＡＰ標的化及び非標的化抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質の体内分布
ＦＡＰ標的化Ｉｎ−１１１標識４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−１０、４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０及び非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ１０の組織体内分布を、マウスあたり５０μｇにて、予め決定した関節炎スコアが＞３に達する（１回目の免疫化の２８日後）コラーゲン誘発関節炎を有するＤＢＡ／１Ｊマウスにおいて決定した。体内分布は、群あたり５匹のマウスに放射性標識コンジュゲートをｉ．ｖ．注射した７２時間後に行った。
この実験の結果を表２２に示す。炎症を起こした関節での非標的化抗体−ＩＬ−１０融合タンパク質ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−１０の取り込みは、標的化ＩｇＧ−ＩＬ−１０融合タンパク質の取り込みよりも有意に低く（ｐ＜０．０００１）、このことは、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−１０及び４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０の取り込みがＦＡＰにより媒介されることを示した。脾臓での取り込みは、ＩＬ−１０により媒介される見込みが高い。なぜなら、３つ全ての構築物が同様のレベルの脾臓蓄積を示したからである。
表22.抗体構築物の取り込み(%注射用量/グラム組織)。
Figure 2019033755
ＩｇＧ−ＩＬ−１０の体内分布に与えるＩＬ−１０の影響を研究するために、第２の実験では、Ｉｎ−１１１標識４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０の体内分布を、Ｉｎ−１１１標識４Ｇ８ ＩｇＧのものと比較した。
この実験の結果を表２３に示す。４Ｇ８ ＩｇＧと４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０との間で炎症を起こした関節での蓄積に有意な差はなく、このことは、ｌＬ−１０が炎症部位への４Ｇ８ ＩｇＧの標的化に著しく影響しなかったことを示す。４Ｇ８ ＩｇＧＩ−ＩＬ−１０の脾臓取り込みは、４Ｇ８ ＩｇＧのものよりも有意に高く（ｐ＜０．０００１）、このことは、脾臓での取り込みが部分的にＩＬ−１０により媒介されることを示す。
表23.抗体構築物の取り込み(%注射用量/グラム組織)。
Figure 2019033755
明確な理解を目的として説明及び例示のために上記の発明をいくらか詳細に記載したが、上記の記載及び実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に引用する全ての特許及び科学文献の開示は、それらの全体が出典明示により本明細書に明示的に援用されている。
明確な理解を目的として説明及び例示のために上記の発明をいくらか詳細に記載したが、上記の記載及び実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に引用する全ての特許及び科学文献の開示は、それらの全体が出典明示により本明細書に明示的に援用されている。
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］
ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
［実施態様２］
前記重鎖ポリペプチドのそれぞれが、ＩｇＧクラス抗体重鎖とＩＬ−１０単量体とを含む、実施態様１に記載の融合タンパク質。
［実施態様３］
前記ＩＬ−１０単量体が、そのＮ末端にて前記ＩｇＧクラス抗体重鎖のＣ末端に融合し、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している、実施態様２に記載の融合タンパク質。
［実施態様４］
前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体重鎖と、ＩＬ−１０単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる、実施態様１から３の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様５］
前記ＩＬ−１０単量体が、天然ＩＬ−１０単量体、特に天然ヒトＩＬ−１０単量体である、実施態様２から４の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様６］
前記ＩＬ−１０単量体が、配列番号１のポリペプチド配列を含む、実施態様２から５の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様７］
前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体が、機能的ホモ２量体ＩＬ−１０分子を形成する、実施態様２から５の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様８］
前記ＩＬ−１０単量体が、改変ＩＬ−１０単量体、特に改変ヒトＩＬ−１０単量体である、実施態様２から４の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様９］
前記改変ＩＬ−１０単量体が、ｐＨ７．０、３７℃にて単量体形態で安定である、実施態様８に記載の融合タンパク質。
［実施態様１０］
前記ＩＬ−１０単量体が、配列番号５のポリペプチド配列を含む、実施態様２から４、８及び９の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様１１］
前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体が、互いにホモ２量体を形成しない、実施態様２から４及び８から１０の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様１２］
前記ＩｇＧクラス抗体が、改変を有さない対応するＩｇＧクラス抗体と比較して、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む、実施態様１から１１の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様１３］
前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である、実施態様１２に記載の融合タンパク質。
［実施態様１４］
前記Ｆｃ受容体が、活性化Ｆｃ受容体である、実施態様１２又は１３に記載の融合タンパク質。
［実施態様１５］
前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）からなる群から選択される、実施態様１２から１４の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様１６］
前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＩＩＩａである、実施態様１２から１５の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様１７］
前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖の３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む、実施態様１２から１６の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様１８］
前記アミノ酸置換が、Ｐ３２９Ｇである、実施態様１７に記載の融合タンパク質。
［実施態様１９］
前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む、実施態様１２から１８の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２０］
前記アミノ酸置換が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である、実施態様１９に記載の融合タンパク質。
［実施態様２１］
前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む、実施態様１２から２０の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２２］
前記ＩｇＧクラス抗体が、ＩｇＧ１サブクラス抗体である、実施態様１から２１の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２３］
前記ＩｇＧクラス抗体が、全長抗体である、実施態様１から２２の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２４］
前記ＩｇＧクラス抗体が、ヒト抗体である、実施態様１から２３の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２５］
前記ＩｇＧクラス抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と特異的に結合できる、実施態様１から２４の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２６］
融合タンパク質が、ＦＡＰと、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる、実施態様２５に記載の融合タンパク質。
［実施態様２７］
前記ＦＡＰが、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰである、実施態様２５又は２６に記載の融合タンパク質。
［実施態様２８］
前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１と、配列番号４１のＨＣＤＲ２と、配列番号４９のＨＣＤＲ３と、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５７のＬＣＤＲ２と、配列番号６１のＬＣＤＲ３とを含む、実施態様２５から２７の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様２９］
前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号６３の重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、実施態様２８に記載の融合タンパク質。
［実施態様３０］
前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号３７のＨＣＤＲ１と、配列番号４３のＨＣＤＲ２と、配列番号４７のＨＣＤＲ３と、配列番号５１のＬＣＤＲ１と、配列番号５５のＬＣＤＲ２と、配列番号５９のＬＣＤＲ３とを含む、実施態様２５から２７の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様３１］
前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号６７のＶＨと、配列番号６９のＶＬとを含む、実施態様３０に記載の融合タンパク質。
［実施態様３２］
融合タンパク質が、ＩＬ−１０受容体−１（ＩＬ−１０Ｒ１）と、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる、実施態様１から３１の何れか一に記載の融合タンパク質。
［実施態様３３］
前記ＩＬ−１０Ｒ１が、ヒトＩＬ−１０Ｒ１である、実施態様３２に記載の融合タンパク質。
［実施態様３４］
ＩＬ−１０Ｒ１との結合についての前記親和性定数（ＫＤ）が、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、ＦＡＰとの結合についての前記親和性定数（ＫＤ）とほぼ等しいか又はそれより大きい、実施態様２６に従属する場合の実施態様３２に記載の融合タンパク質。
［実施態様３５］
実施態様１から３４の何れか一に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［実施態様３６］
実施態様３５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
［実施態様３７］
実施態様３５に記載のポリヌクレオチド又は実施態様３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
［実施態様３８］
実施態様１から３４の何れか一に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）実施態様３７に記載の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、（ｉｉ）融合タンパク質を回収する工程とを含む方法。
［実施態様３９］
実施態様３８に記載の方法により生成される、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質。
［実施態様４０］
実施態様１から３４及び３９の何れか一に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
［実施態様４１］
医薬として用いるための、実施態様１から３４及び３９の何れか一に記載の融合タンパク質又は実施態様４０に記載の薬学的組成物。
［実施態様４２］
炎症性疾患の治療又は予防に用いるための、実施態様１から３４及び３９の何れか一に記載の融合タンパク質又は実施態様４０に記載の薬学的組成物。
［実施態様４３］
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様４２に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。
［実施態様４４］
治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための、実施態様１から３４及び３９の何れか一に記載の融合タンパク質の使用。
［実施態様４５］
前記疾患が、炎症性疾患である、実施態様４４に記載の使用。
［実施態様４６］
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様４５に記載の使用。
［実施態様４７］
前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、実施態様４４から４６の何れか一に記載の使用。
［実施態様４８］
個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の実施態様１から３４及び３９の何れか一に記載の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
［実施態様４９］
前記疾患が、炎症性疾患である、実施態様４８に記載の方法。
［実施態様５０］
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、実施態様４９に記載の方法。
［実施態様５１］
前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、実施態様４８から５０の何れか一に記載の方法。
［実施態様５２］
本明細書で上に記載するとおりの発明。

Claims (52)

  1. ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質であって、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
  2. 前記重鎖ポリペプチドのそれぞれが、ＩｇＧクラス抗体重鎖とＩＬ−１０単量体とを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記ＩＬ−１０単量体が、そのＮ末端にて前記ＩｇＧクラス抗体重鎖のＣ末端に融合し、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記重鎖ポリペプチドがそれぞれ、ＩｇＧクラス抗体重鎖と、ＩＬ−１０単量体と、任意選択的にペプチドリンカーとから本質的になる、請求項１から３の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記ＩＬ−１０単量体が、天然ＩＬ−１０単量体、特に天然ヒトＩＬ−１０単量体である、請求項２から４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ＩＬ−１０単量体が、配列番号１のポリペプチド配列を含む、請求項２から５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体が、機能的ホモ２量体ＩＬ−１０分子を形成する、請求項２から５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ＩＬ−１０単量体が、改変ＩＬ−１０単量体、特に改変ヒトＩＬ−１０単量体である、請求項２から４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記改変ＩＬ−１０単量体が、ｐＨ７．０、３７℃にて単量体形態で安定である、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＩＬ−１０単量体が、配列番号５のポリペプチド配列を含む、請求項２から４、８及び９の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 前記重鎖ポリペプチドに含まれる前記ＩＬ−１０単量体が、互いにホモ２量体を形成しない、請求項２から４及び８から１０の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  12. 前記ＩｇＧクラス抗体が、改変を有さない対応するＩｇＧクラス抗体と比較して、Ｆｃ受容体との抗体の結合親和性を低減する改変を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  13. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記Ｆｃ受容体が、活性化Ｆｃ受容体である、請求項１２又は１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）からなる群から選択される、請求項１２から１４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＩＩＩａである、請求項１２から１５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖の３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む、請求項１２から１６の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 前記アミノ酸置換が、Ｐ３２９Ｇである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む、請求項１２から１８の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 前記アミノ酸置換が、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 前記ＩｇＧクラス抗体が、抗体重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む、請求項１２から２０の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  22. 前記ＩｇＧクラス抗体が、ＩｇＧ１サブクラス抗体である、請求項１から２１の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  23. 前記ＩｇＧクラス抗体が、全長抗体である、請求項１から２２の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  24. 前記ＩｇＧクラス抗体が、ヒト抗体である、請求項１から２３の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  25. 前記ＩｇＧクラス抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）と特異的に結合できる、請求項１から２４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  26. 融合タンパク質が、ＦＡＰと、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる、請求項２５に記載の融合タンパク質。
  27. 前記ＦＡＰが、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰである、請求項２５又は２６に記載の融合タンパク質。
  28. 前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１と、配列番号４１のＨＣＤＲ２と、配列番号４９のＨＣＤＲ３と、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１と、配列番号５７のＬＣＤＲ２と、配列番号６１のＬＣＤＲ３とを含む、請求項２５から２７の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  29. 前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号６３の重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
  30. 前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号３７のＨＣＤＲ１と、配列番号４３のＨＣＤＲ２と、配列番号４７のＨＣＤＲ３と、配列番号５１のＬＣＤＲ１と、配列番号５５のＬＣＤＲ２と、配列番号５９のＬＣＤＲ３とを含む、請求項２５から２７の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  31. 前記ＩｇＧクラス抗体が、配列番号６７のＶＨと、配列番号６９のＶＬとを含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
  32. 融合タンパク質が、ＩＬ−１０受容体−１（ＩＬ−１０Ｒ１）と、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、１ｎＭより小さく、特に１００ｐＭより小さい親和性定数（ＫＤ）で結合できる、請求項１から３１の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  33. 前記ＩＬ−１０Ｒ１が、ヒトＩＬ−１０Ｒ１である、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  34. ＩＬ−１０Ｒ１との結合についての前記親和性定数（ＫＤ）が、ＳＰＲにより２５℃にて測定した場合に、ＦＡＰとの結合についての前記親和性定数（ＫＤ）とほぼ等しいか又はそれより大きい、請求項２６に従属する場合の請求項３２に記載の融合タンパク質。
  35. 請求項１から３４の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  36. 請求項３５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
  37. 請求項３５に記載のポリヌクレオチド又は請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
  38. 請求項１から３４の何れか一項に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）請求項３７に記載の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程と、（ｉｉ）融合タンパク質を回収する工程とを含む方法。
  39. 請求項３８に記載の方法により生成される、ＩｇＧクラス抗体とＩＬ−１０分子との融合タンパク質。
  40. 請求項１から３４及び３９の何れか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
  41. 医薬として用いるための、請求項１から３４及び３９の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項４０に記載の薬学的組成物。
  42. 炎症性疾患の治療又は予防に用いるための、請求項１から３４及び３９の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項４０に記載の薬学的組成物。
  43. 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、請求項４２に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。
  44. 治療を必要とする個体における疾患の治療用の医薬の製造のための、請求項１から３４及び３９の何れか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  45. 前記疾患が、炎症性疾患である、請求項４４に記載の使用。
  46. 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、請求項４５に記載の使用。
  47. 前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、請求項４４から４６の何れか一項に記載の使用。
  48. 個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の請求項１から３４及び３９の何れか一項に記載の融合タンパク質を含む、治療有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
  49. 前記疾患が、炎症性疾患である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患又は関節リウマチである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記個体が、哺乳動物、特にヒトである、請求項４８から５０の何れか一項に記載の方法。
  52. 本明細書で上に記載するとおりの発明。
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Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9011847B2 (en) 2010-08-13 2015-04-21 Roche Glycart, AG Anti-FAP antibodies and methods of use
SI2673294T1 (sl) 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
WO2013148117A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
KR101993714B1 (ko) 2013-01-30 2019-06-28 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
KR20160083884A (ko) 2013-11-01 2016-07-12 스페리움 바이오메드 에스.엘. 치료제 및 미용제의 경피 전달을 위한 봉입체
CN106061997A (zh) * 2014-02-06 2016-10-26 豪夫迈·罗氏有限公司 白介素‑10免疫缀合物
CA3185180A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating autoimmune and inflammatory conditions
MD20170020A2 (ro) 2014-07-30 2017-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compoziţii şi metode utilizate pentru tratamentul tulburărilor metabolice
CN115043945A (zh) 2014-10-31 2022-09-13 Ngm生物制药有限公司 用于治疗代谢病症的组合物和方法
EP3489256B1 (en) 2014-11-14 2021-03-17 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
JP6621478B2 (ja) 2014-12-19 2019-12-18 アルカーメス，インコーポレイテッド 一本鎖Ｆｃ融合タンパク質
CN114751989A (zh) 2015-03-31 2022-07-15 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
MA43017A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
US11219645B2 (en) 2015-11-18 2022-01-11 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
KR20210016479A (ko) 2015-12-04 2021-02-15 노파르티스 아게 항체 시토카인 그라프트된 조성물 및 면역조절을 위한 사용 방법
CN106349393B (zh) * 2015-12-21 2020-10-30 合肥立方制药股份有限公司 一种增强抗体药物稳定性的结构
US10174119B2 (en) 2016-03-31 2019-01-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
WO2018005226A2 (en) * 2016-06-22 2018-01-04 Alkermes, Inc. Compositions and methods for modulating il-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties
CN108948207B (zh) * 2017-05-22 2020-11-13 杭州博虎生物科技有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
EP3688036A4 (en) * 2017-09-25 2021-06-23 Dingfu Biotarget Co., Ltd PROTEINOUS HETERODIMER AND USE OF IT
CN111132998B (zh) * 2017-09-25 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 用于癌症治疗的方法和组合物
CN112888445A (zh) 2018-08-30 2021-06-01 Hcw生物科技公司 治疗老年化相关病症的方法
CN112996805A (zh) 2018-08-30 2021-06-18 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
JP7407822B2 (ja) 2018-08-30 2024-01-04 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 単鎖キメラポリペプチドおよびその使用
WO2020108426A1 (zh) * 2018-11-26 2020-06-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素10变体及其衍生物
US11084857B2 (en) 2018-12-05 2021-08-10 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Nsp-interleukin-10 proteins and uses thereof
US20220144911A1 (en) * 2019-02-01 2022-05-12 Uab Research Foundation Methods and compositions for il10 signaling antagonism
JP2022524018A (ja) 2019-03-06 2022-04-27 デカ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｉｌ－１０バリアント分子ならびに炎症性疾患および腫瘍を処置する方法
CN111909276A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 复旦大学 一种融合蛋白及其用途
EP3983432A1 (en) 2019-06-12 2022-04-20 Askgene Pharma, Inc. Novel il-15 prodrugs and methods of use thereof
WO2020257639A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
WO2021006605A1 (ko) * 2019-07-08 2021-01-14 주식회사 프로젠 신규 il-10 변이체 단백질 및 그의 용도
KR20210006300A (ko) * 2019-07-08 2021-01-18 주식회사 프로젠 신규 알러지 질환 치료용 약학적 조성물
KR20210006301A (ko) * 2019-07-08 2021-01-18 주식회사 프로젠 신규 융합단백질 및 그의 용도
CN112618698B (zh) * 2019-10-08 2021-10-08 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂
CN112625137B (zh) * 2019-10-08 2021-10-08 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其医药用途
IL295084A (en) 2020-02-11 2022-09-01 Hcw Biologics Inc Chromatography resin and its uses
AU2021220870A1 (en) 2020-02-11 2022-08-04 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
IL295083A (en) 2020-02-11 2022-09-01 Hcw Biologics Inc Methods for activating regulatory t cells
CN115836087A (zh) 2020-04-29 2023-03-21 Hcw生物科技公司 抗cd26蛋白及其用途
US11673930B2 (en) 2020-05-12 2023-06-13 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. IL10 agonists and methods of use thereof
KR20210141406A (ko) * 2020-05-14 2021-11-23 주식회사 프로젠 신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도
IL298608A (en) 2020-06-01 2023-01-01 Hcw Biologics Inc Methods for treating disorders related to aging
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2022020324A1 (en) * 2020-07-20 2022-01-27 Viela Bio, Inc. Immunocytokines for treatment of autoimmune and inflammatory conditions
KR20230096959A (ko) 2020-07-20 2023-06-30 데카 바이오사이언시즈, 인크. Il-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질
MX2023006830A (es) * 2020-12-10 2023-07-06 Biocad Joint Stock Co Inmunocitoquina para activar el receptor il-10ra humano y su uso.
KR20220099656A (ko) * 2021-01-07 2022-07-14 주식회사 프로젠 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도
US20240076331A1 (en) * 2021-02-01 2024-03-07 AskGene Pharma, Inc. Chimeric Molecules Comprising an IL-10 or TGF-Beta Agonist Polypeptide
WO2023078245A1 (zh) * 2021-11-02 2023-05-11 广东菲鹏制药股份有限公司 Il10单体融合蛋白及其应用
WO2023168363A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 HCW Biologics, Inc. Method of treating pancreatic cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008505174A (ja) * 2004-07-15 2008-02-21 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体
WO2010005389A1 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Forskarpatent I Syd Ab Oxidized ldl specific antibody-fusion and conjugated proteins
JP2011502137A (ja) * 2007-10-30 2011-01-20 フィロゲン エスピーエー 関節リウマチと関連する抗原

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7802170A (nl) 1977-04-18 1978-10-20 Hitachi Metals Ltd Sierraad.
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
IL136544A0 (en) 1997-12-05 2001-06-14 Scripps Research Inst Humanization of murine antibody
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2007128563A1 (en) * 2006-05-08 2007-11-15 Philogen Spa Antibody-targeted cytokines for therapy
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
US9011847B2 (en) 2010-08-13 2015-04-21 Roche Glycart, AG Anti-FAP antibodies and methods of use
ES2692268T3 (es) 2011-03-29 2018-12-03 Roche Glycart Ag Variantes de Fc de anticuerpo
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CN106061997A (zh) 2014-02-06 2016-10-26 豪夫迈·罗氏有限公司 白介素‑10免疫缀合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008505174A (ja) * 2004-07-15 2008-02-21 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体
JP2011502137A (ja) * 2007-10-30 2011-01-20 フィロゲン エスピーエー 関節リウマチと関連する抗原
WO2010005389A1 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Forskarpatent I Syd Ab Oxidized ldl specific antibody-fusion and conjugated proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUMAN ANTIBODIES, vol. V8 N3, JPN5015008709, 1 January 1997 (1997-01-01), NL, pages 106 - 118, ISSN: 0004495557 *
IMMUNOLOGY LETTERS, vol. V39 N1, JPN5015008710, 1 December 1993 (1993-12-01), NL, pages 91 - 99, ISSN: 0004495558 *
THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. V158 N9, JPN5015008711, 1 May 1997 (1997-05-01), US, pages 4507 - 4513, ISSN: 0004495556 *

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